JP7053053B2 - 初代細胞のためのトランスポゾンに基づく転移システム - Google Patents

初代細胞のためのトランスポゾンに基づく転移システム Download PDF

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Description

本発明は、遺伝子工学に関し、特に、トランスポザーゼをコードするｍＲＮＡ又は該トランスポザーゼをコードするｍＲＮＡを生成するための試薬とトランスポゾンを含むミニサークルＤＮＡとを含み、Ｔ細胞等の細胞株及び初代細胞のトランスフェクションに適するトランスポゾンに基づくトランスフェクションキットに関する。また、本発明は、トランスポゾンを含む核酸、好ましくは、ＤＮＡミニサークルに関し、該トランスポゾンは少なくとも１つのタンパク質及び少なくとも１つのｍｉＲＮＡをコードし、ｍｉＲＮＡをコードする配列はイントロンに配置され、タンパク質及びｍｉＲＮＡの発現は同一のプロモーターにより制御されている。また、本発明は、本発明の方法を用いて得られる細胞群を提供する。また、トランスフェクションの方法が提供され、また、例えば免疫療法、特にＴ細胞受容体（ＴＣＲ）遺伝子改変Ｔ細胞（ＴＣＲ遺伝子療法）又はキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）遺伝子改変Ｔ細胞（ＣＡＲ遺伝子療法）を用いた養子Ｔ細胞療法といった医学的用途を提供する。
養子Ｔ細胞療法（ＡＴＴ）は、癌、慢性感染及び自己免疫疾患を治療するための有望な免疫療法の戦略である。ＡＴＴは、疾患細胞を認識及び根絶する多数の抗原特異性Ｔ細胞の調製を必要とする。ＡＴＴは、一方で、疾患を治療するために患者内への天然起源の抗原特異性Ｔ細胞の単離、拡大及び自己輸血を含む。しかしながら、癌に関して、ほとんどの患者は、天然起源の抗原特異性Ｔ細胞（腫瘍浸潤リンパ球、ＴＩＬ）の最適な量を有しておらず、さらに、これらの細胞は多くの腫瘍自体から単離することが困難である。従って、ＡＴＴは他方で宿主細胞を用い、それは、新たな抗原特異性を細胞に与えるように抗原受容体遺伝子（ＴＣＲ、ＣＡＲ）で改変されている。ＣＡＲ及びＴＣＲ改変Ｔ細胞を用いたＡＴＴは、他の治療では難治の癌及びウィルス関連疾患を治療するのに成功裏に用いられている(Vonderheide et al., 2014; Robbins et al., 2015)。
ＴＣＲ及びＣＡＲ遺伝子療法は、多数のヒト初代Ｔ細胞の遺伝子操作を必要とする。これは、ウィルスベクターシステムを用いて効率的に行われ得る。しかしながら、その技術は、面倒であり、時間がかかり、コストもかかる。これに対して、プラスミドＤＮＡベースのトランスポゾンベクターシステムの使用は、いくつかの利点を提供する。ＧＭＰグレードのベクターの生成（特に大規模ベクター生成）は、より早く、多くの人手を要せず、コストを抑え、官僚的な負荷を低減する。さらに、トランスポゾンベクターの導入遺伝子容量は、ウィルスベクターと比較して大きく、いくつかのトランスポゾンは、活性遺伝子の好み無くランダムな組み込みパターンを示す。
初代細胞の遺伝子改変のための２つのＤＮＡプラスミドからなる従来のトランスポゾンベクターシステム（図１Ａ）を用いる主要な欠点は、ＤＮＡのトランスフェクションにより誘導される高い細胞死亡率であり（図２Ａ）、それは、トランスフェクションされた細胞の急速な拡大を妨げ、基本的な最適化を必要とする。この欠点にもかかわらず、トランスポゾンに基づく方法は、例えばＴ細胞の初代細胞の遺伝子改変に成功裏に適用されている。しかしながら、従来の方法は、Ｔ細胞のほとんどがトランスフェクション後に死亡し、少ない割合の生存細胞のみが導入遺伝子を発現するので、効率的でない。細胞が従来の方法を用いてトランスフェクションされた後に、２つの方法が、治療のために必要な数の遺伝子改変されたＴ細胞を得るのに適用される。第１に、細胞は、導入された抗原受容体の特定のリガンドを有する刺激細胞株の助けにより選択的に拡大される(Singh et al., 2013)。結果として、新規の特異性を有する抗原受容体に対する新規の刺激細胞株の生成が必要とされる。さらに、改変細胞のそのような選択的成長は、導入された抗原受容体の特異性が不明である又はトランスポゾンが抗原受容体をコードしない場合には誘導できない。第２の方法は、ドランスフェクションされた細胞を、特異的抗体の助けにより導入されたＴＣＲの表面発現でソートすることである。その後、ソートされた細胞はアロ刺激を用いて拡大される(Deninger et al., 2016)。この方法は、ヒトに対して免疫原性である全長マウス定常領域及び臨床プロトコールにおいて承認されている抗体と共にＴＣＲのトランスフェクションを必要とする。さらに、ソートされたＴ細胞は、このプロトコールにおいてそれらの内在性ＴＣＲを通して刺激される。内在性ＴＣＲが完全に導入されたＴＣＲに置換された細胞は、この方法で拡大できない。従って、同種異型の刺激は、それらの表面に導入ＴＣＲができるだけ発現した治療用細胞を生成する目的と本質的に両立しない。結局、選択的拡大もトランスフェクションされた細胞のソーティングも、低いトランスフェクションの割合及び高い細胞死亡率の問題を直接に解決しない。結論として、そのような細胞、特に初代細胞及び理にかなった有効性でトランスフェクションをすることが困難な他の細胞の遺伝子改変のためのより効率的な方法及びキットを提供することについて、高い必要性がある。
この問題は、本発明、特に特許請求の範囲の主題により解決される。
本発明は、
ａ）トランスポゾンを移動可能なトランスポザーゼをコードする核酸と、
ｂ）プロモーターにより発現が制御されたタンパク質及び／又はｍｉＲＮＡをコードする前記トランスポゾンを含むミニサークルＤＮＡとを含み、
前記核酸は、
（ｉ）前記トランスポザーゼをコードするｍＲＮＡ、又は、
（ｉｉ）プロモーターに機能的に連結された前記トランスポザーゼをコードするＤＮＡ、を含む群から選択され、
任意に、リボヌクレオチド三リン酸、転写に適する緩衝液及び転写に適するＲＮＡポリメラーゼを含むインビトロの転写に適する試薬をさらに含む、キットを提供する。
本発明において、「ａ」は排他的に「１つ」を意味するのではなく、「２つ以上」も含む。従って、トランスポゾンは、一つ以上のタンパク質及び／又は一つ以上のｍｉＲＮＡをコードしてもよい。例えば、トランスポゾンは、２つのタンパク質及び１つのｍｉＲＮＡをコードしてもよい。好ましくは、それは１つのタンパク質及び２つ（以上）のｍｉＲＮＡをコードする。当然に、２つのタンパク質及び２つのｍｉＲＮＡをコードしてもよい。
一実施形態において、ａ）の核酸は、インビトロで転写されたｍＲＮＡ、すなわちｉｖｔＲＮＡである（図１Ｂ）。また、精製されたＲＮＡが用いられてもよい。ＲＮＡは、例えば通常得られるｉｖｔＲＮＡと同等の高い品質及び高い濃度とするべきである。品質は、（ａ）５’キャップアナログ、（ｂ）ポリ（Ａ）テイル及び（ｃ）ＲＮＡの純度を含んで形成されたｍＲＮＡの量により決定される。
本発明者らは、トランスポザーゼをコードするｉｖｔＲＮＡを含む本発明のキットの使用が、トランスポザーゼをコードするＤＮＡと比較して高いトランスフェクション効率（図３）、及びヒトＴ細胞の改善された生存性（図４）を引き起こすことを示すことができた。
代替的実施形態において、トランスポザーゼをコードする核酸は、インビトロトランスフェクションに適するＤＮＡである。好ましくは、その実施形態において、キットは、５’キャップアナログを含むリボヌクレオチド三リン酸、転写に適する緩衝液、及び、例えばＴ７ＲＮＡポリメラーゼのようなインビトロ転写に適するＲＮＡポリメラーゼ等のインビトロ転写のための試薬及び任意に説明書を含む。ＤＮＡは、例えばｐｃＤＮＡ３．１＋（ｈｙｇｒｏ）(Thermo Fisher Scientific, Waltham, USA)といったＲＮＡ生成のためのベクターであってもよい。キットは、ウサギ網状赤血球のライセートを含んでもよく、それは、インビトロ転写のための全ての試薬を含む。そのようなキットは、ｉｖｔＲＮＡを生成するのに用いられ、そして本発明に従ってトランスフェクションされた細胞、特にトランスフェクションされた初代細胞、好ましくは初代Ｔ細胞又は幹細胞を調製するのに用いられる。そのような細胞は、トランスフェクションすることが本質的に困難であると知られている。
核酸によりコードされたトランスポザーゼは、脊椎動物細胞、特にヒト細胞において機能的なトランスポザーゼであってもよい。それは、Ｓｌｅｅｐｉｎｇ Ｂｅａｕｔｙトランスポザーゼ、ＦｒｏｇＰｒｉｎｃｅ、ｐｉｇｇｙＢａｃ、Ｔｏｌ２及び他のＴｃ１／ｍａｒｉｎｅｒ型トランスポザーゼを含むクラスＩＩ転移可能エレメントの群から選択され、好ましくは例えばIvics et al., 1997に開示されるようにＳｌｅｅｐｉｎｇ Ｂｅａｕｔｙトランスポザーゼであり、最も好ましくはＳＢ１００Ｘ(Mates et al., 2009)である。
本発明のキットは、第２の核酸として、トランスポザーゼにより移動可能なトランスポゾンを含むミニサークルＤＮＡをさらに含む（図１Ｃ）。本発明において、トランスポゾンはトランスポザーゼ自体をコードしない。トランスポゾンは、タンパク質及び／又はｍｉＲＮＡをコードし、そのタンパク質及び／又はｍｉＲＮＡの発現はプロモーターにより制御される。ミニサークルは、非本質的原核生物ベクター部分からほとんど又は完全に分離された小分子環状プラスミド誘導体である。特に、ミニサークルは、抗生物質耐性遺伝子又はＯＲＩ等のバクテリア配列をコードするＤＮＡを含まない。
本発明のミニサークルＤＮＡは、好ましくは５ｋｂ未満、より好ましくは４ｋｂ未満、３ｋｂ未満又は２ｋｂ未満である。本発明者らは、最小限のサイズのＤＮＡミニサークルが効率を改善することを発見した。ミニサークルは、プロモーター、イントロン及びポリ（Ａ）シグナル、並びにトランスポゾンのＴＩＲ（末端逆向き反復配列）及びスペーサーを含む発現カセットをコードし、それは全部で約１．７５ｋｂである。ミニサークルの最終サイズはコード領域のサイズに依存する。
Ｓｌｅｅｐｉｎｇ Ｂｅａｕｔｙトランスポザーゼと組み合わせられるミニサークル及びそれらの使用は、DE 10 2011 118 018 A1又はGarrels et al., 2016に記載されている。
本発明者らは、トランスポゾンを含むミニサークルＤＮＡと組み合わせられるトランスポザーゼをコードするｍＲＮＡを含む本発明のキットの使用が、驚くべきことに高いトランスフェクション効率及び細胞生存性の両方を引き起こすことを示すことができた（図５）。これは、Ｔ細胞、Ｂ細胞、幹細胞及び多くの他の細胞タイプ、特に初代細胞等のトランスフェクションに対して弱い又はトランスフェクションが困難な細胞に特に重要である（図１２）。
また、本発明は、高いトランスフェクション効率及び高い生存率で、トランスフェクションされた細胞、特にトランスフェクションされた初代細胞又は幹細胞、好ましくはヒト初代Ｔ細胞等の初代Ｔ細胞を生成する方法を提供する。高い又は改善された生存率は、好ましくは３０％以上、より好ましくは３５％以上又は４０％以上である。生存率は、例えばトランスフェクション後４日目に評価されてもよい。高いトランスフェクション効率は、生存細胞の好ましくは５０％以上、より好ましくは６０％以上である。上記方法は、本発明のキットの使用を含む。特に、それは、細胞を、
ａ）トランスポゾンを移動可能なトランスポザーゼ、好ましくはＳｌｅｅｐｉｎｇ ＢｅａｕｔｙをコードするｍＲＮＡ、
ｂ）上記トランスポゾンを含むミニサークルＤＮＡ、と接触するステップを含み、
該トランスポゾンは、少なくとも１つのタンパク質及び／又は少なくとも１つのｍｉＲＮＡをコードし、上記タンパク質及び／又はｍｉＲＮＡの発現はプロモーターにより制御される。好ましくは、トランスポゾンはタンパク質及び少なくとも１つ、好ましくは２つのｍｉＲＮＡをコードし、タンパク質及びｍｉＲＮＡの発現は同一のプロモーターにより制御される。
好ましくは、上記接触は、エレクトロポレーションを含む。
本発明の好ましい実施形態において、トランスポゾンはタンパク質及びｍｉＲＮＡをコードする（図１Ｄ）。好ましくは、タンパク質をコードするトランスポゾンは、ｍｉＲＮＡをコードする配列を含むイントロンを含み、タンパク質及びｍｉＲＮＡの発現は同一プロモーターにより制御される（図６Ａ）。好ましい実施形態において、タンパク質をコードするトランスポゾンは、少なくとも２つのｍｉＲＮＡをコードする配列を含むイントロンを含み、そのタンパク質及びｍｉＲＮＡの発現は同一プロモーターにより制御される。
また、本発明は、トランスポゾンを含む核酸を提供し、該トランスポゾンは少なくとも１つのタンパク質及び少なくとも１つのｍｉＲＮＡをコードし、該タンパク質をコードする核酸は、ｍｉＲＮＡをコードする配列を含むイントロンを含み、タンパク質及びｍｉＲＮＡの発現は同一プロモーターにより制御される。核酸は、プラスミド又はミニサークルＤＮＡを含む群から選択され、好ましくはミニサークルＤＮＡである。核酸がミニサークルＤＮＡでは無い場合、それは、ミニサークルの生成に適する特定の細菌株、例えばＺＹＣＹ１０Ｐ３Ｓ２Ｔ(System Biosciences, Mountain View, USA) (Kay et al., 2010)で増殖する際にミニサークルベクターの生成を可能とする組込みカセットの外の組換え部位を含むので、ミニサークルＤＮＡの生成に適する。そのような株は、例えばＰｈｉ３１インテグラーゼ及びＩ－ＳｃｅＩエンドヌクレアーゼを発現できる。上記核酸は、例えば本発明のキットの生成において中間生成物となり得る。
本発明のトランスポゾンに用いられる好ましいイントロンは、例えばUS20070190617に開示のように、ヒトβグロブリン遺伝子の第１イントロンからの５’スプライスドナー部位、及びイムノグロブリン遺伝子重鎖可変領域からの３’スプライスアクセプター部位を含むキメライントロンである。イントロンの好ましい機能は、ｐＣＩ及びｐＳＩ哺乳動物発現ベクターPromega 7/09のデータシートに記載されており、好ましくは上記ベクターに含まれるイントロンが用いられる。Choi et al., 2014, Mol Brain 7:17は、上記イントロンを含むベクターの配列を示す。
最先端技術において、ｍｉＲＮＡは、通常異なるプロモーターから発現され、又は導入遺伝子の３'若しくは５’に配置される。イントロンにおけるｍｉＲＮＡの組込みは、導入遺伝子の発現を改善することが示されている(Chung et al., 2006)。特に、ウィルスベクターは、有効なイントロンの適用を可能としない。本発明のトランスポゾンを用いることで、本発明者らは、複数のｍｉＲＮＡを組み込むことにより標的細胞のいくつかの細胞因子を抑制することと、高い導入遺伝子の発現レベルを獲得することとを同時に可能とした。γレトロウィルスベクターに組み込まれた類似遺伝子を抑制するアプローチは、導入遺伝子発現レベルを低減する結果となるであろう。
ウィルスベクターに対するトランスポゾンの更なる利点は、トランスポゾンについて本発明によると、同一のｍｉＲＮＡ骨格を含み、例えば同一の完全ｍｉＲＮＡ配列を有していたとしても、２つ以上のｍｉＲＮＡは安定性を妥協することなく用いられ得る。これは、配列の最適化を必要とせずに標的のダウンレギュレートの効率を増大する（図８）。これに対して、Amendola at al., 2009は、ウィルスベクターに同一のｍｉＲＮＡを２度用いることがそのベクターの不安定性及び再編成を引き起こすことを示した。従って、ウィルスシステムにおいて、ｍｉＲＮＡ骨格と標的配列との相互作用に依存するｍｉＲＮＡの最適効率と、同一又は類似のｍｉＲＮＡ間の組換えの防止の必要性との間の妥協点を見つけることが必要となる。これに対して、本発明にかかるトランスポゾンシステムにおいては、そのような妥協点を見つける必要は無い。
本発明は、さらに、トランスポゾンを含む核酸を提供し、該トランスポゾンは少なくとも１つのタンパク質及び２つ以上のｍｉＲＮＡ、好ましくは３つ以上のｍｉＲＮＡ、４つ以上のｍｉＲＮＡ、５つ以上のｍｉＲＮＡ又は６つ以上のｍｉＲＮＡをコードし、該タンパク質をコードする核酸は、ｍｉＲＮＡをコードする配列を含むイントロンを含み、該タンパク質及びｍｉＲＮＡの発現は同一のプロモーターにより制御される。任意に、該ｍｉＲＮＡのうちの２つ以上のｍｉＲＮＡ、好ましくは３つ以上のｍｉＲＮＡ、４つ以上のｍｉＲＮＡ、５つ以上のｍｉＲＮＡ又は６つ以上のｍｉＲＮＡ、例えば全てのｍｉＲＮＡは、同一の骨格を含む。
好ましくは、ＡＴＴに用いるために、トランスポゾンによりコードされたタンパク質は、ＴＣＲ又はＣＡＲコンストラクトである。ＴＣＲコンストラクトは、１つのＴＣＲα鎖コンストラクト及び１つのＴＣＲβ鎖コンストラクト、又は一本鎖のＴＣＲコンストラクト若しくはＣＡＲコンストラクトを含んでもよい。好ましくは、ＣＡＲコンストラクトは、抗体の一本鎖可変領域（ｓｃＦｖ）コンストラクト、スペーサー領域コンストラクト及びシグナリング領域コンストラクトを含む。
任意に、ＴＣＲα鎖コンストラクト及びＴＣＲβ鎖コンストラクトのコドンの使用は、組換えＴ細胞におけるＴＣＲの発現を増強するために最適化されてもよい。ヒト可変領域は、マウス定常領域(Cohen et al., 2006)、又は最小マウス定常領域、すなわちマウス定常領域の所定のアミノ酸のみを含むヒト定常領域(Sommermeyer et al., 2010; Bialer et al., 2010)、及び追加的に、トランスジェニックＴＣＲ鎖の互いの好適な結合を増大し、レシピエントＴ細胞により発現された内在性ＴＣＲ鎖との結合を低減する追加のシステインブリッジ(Cohen et al., 2007; Kuball et al., 2007)と組合せられてもよい。本発明者らは、ＴＣＲコンストラクトが互いの結合が最適化されたＴＣＲα鎖及びＴＣＲβ鎖を含み、ＴＣＲα及びβ鎖コンストラクトがそれぞれ好適に、（ａ）天然ヒトＴＣＲに対して追加のＣｙｓ残基と、（ｂ）定常領域にマウスアミノ酸配列を含み、さもなければＴＣＲ鎖はヒト由来のものであることを証明した。好ましい実施形態において、ＴＣＲコンストラクトは配列番号２３を含む。
一本鎖（ｓｃ）ＴＣＲコンストラクトは、ヘテロ二量体ＴＣＲコンストラクトと同様に含まれている。ｓｃＴＣＲは、第１ＴＣＲ鎖コンストラクト（例えばα鎖）の可変領域及び完全（全長）の第２ＴＣＲ鎖（例えばβ鎖）、又はその逆を含み得る。さらに、ｓｃＴＣＲは、任意に、２つ以上のポリペプチドをつなぐ１つ以上のリンカーを含み得る。リンカーは、例えば２つの一本鎖をつなぐペプチドであってもよい。サイトカイン、例えばＩＬ－２、ＩＬ－７、ＩＬ－１５又はＩＬ－２１等のヒトサイトカインと融合したｓｃＴＣＲがコードされてもよい。
さらに、可溶性受容体分子及び融合タンパク質は、ＴＣＲα及びＴＣＲβ鎖遺伝子の可変領域、並びに例えば抗体ドメインを含むように生成されてもよい。これらは、Ｉｇドメイン、例えばＩｇＧ定常ドメインであってもよい。また、ＴＣＲ鎖の可変領域は、例えば細胞表面におけるそれぞれのペプチド主要組織適合性複合体（ｐＭＨＣ）を発現し、例えば標的細胞にエフェクター機能を提供する抗ＣＤ３標的ドメインを介してＴ細胞に関与する悪性細胞を標的とする可溶性モノクローナルＴＣＲ試薬を提供するために、例えば本発明の融合タンパク質における抗ＣＤ３抗体ドメインに融合されてもよい(Liddy et al., 2012)。
ＴＣＲコンストラクトは、抗原に特異的に結合できる能力があり、好ましくは、癌細胞及び／又はウィルスに感染された細胞、並びに自己免疫疾患に関連する細胞に特異的に発現若しくは過剰発現された抗原に特異的に結合できる能力がある。所定の抗原に対して「特異的に結合できる能力」、「認識する」又は「特異的」の用語は、本明細書において、ＴＣＲコンストラクトが、好ましくは高い親和性で且つその可変ドメインを通して、エピトープに特異的に結合できる及びエピトープを免疫学的に認識できることを意味する。親和性は、当業者に周知の方法、例えばＢｉａＣｏｒｅによって分析できる。
好ましい実施形態において、トランスポゾンは、さらに、少なくとも２つのｍｉＲＮＡ、任意に３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つ、９つ、１０個又はそれ以上のｍｉＲＮＡをコードする（図６Ａ、Ｂ）。ＴＣＲコンストラクト又はＣＡＲコンストラクトであるコードされたタンパク質との組合せにおいて、トランスポゾンによりコードされるｍｉＲＮＡは、ＴＣＲα及び／又はＴＣＲβ鎖、特にＴ細胞の両方の内在性ＴＣＲ鎖の発現を抑制できることが好ましい。従って、ＴＣＲ鎖の誤対合が防止される。しかしながら、コードされたタンパク質の発現は、サイレンシングされず、特にｍｉＲＮＡは、トランスポゾンによりコードされたＴＣＲ鎖又はＴＣＲコンストラクト又はＣＡＲの発現をサイレンシングできない。好ましくは、トランスポゾンにコードされたＴＣＲ鎖又はＴＣＲコンストラクトは、コドンが最適化されており、従って配列が内在性ＴＣＲ配列と顕著に異なる。トランスポゾンによりコードされたｍｉＲＮＡはＴＣＲα及び／又はＴＣＲβの発現を抑制でき、特にＴ細胞の両方の内在性ＴＣＲ鎖は、例えばＧｖＨＤ（移植片対宿主病）の予防又はＧｖＨＤの抑制において興味深い（US 9,181,527を参照）。
本発明者らは、本発明のミニサークルＤＮＡトランスポゾンコンストラクトは、導入遺伝子の発現を無効にすることなく、導入遺伝子及び複数のｍｉＲＮＡの共発現に適することを示すことができた。内在性ＴＣＲの発現の抑制は、一つの内在性ＴＣＲ鎖及び一つのトランスジェニックＴＣＲ鎖からなる潜在的に内在性混合ＴＣＲの生成を低減する。また、内在性ＴＣＲのサイレンシング（図６Ｃ）は、表面発現のために細胞性補助因子を必要とするトランスジェニックの治療的ＴＣＲの発現を促進する。従って、本発明のトランスポゾンに基づくベクターは、機能的ＴＣＲの効率的な発現（図６Ｄ、図７Ａ、Ｂ）と重要な安定性との両方を提供する。
トランスポゾンは、好ましくはＴＣＲα鎖及びＴＣＲβ鎖の発現をサイレンシングできる２つのｍｉＲＮＡをコードする。ｍｉＲＮＡは、遺伝子的に改変されるためのＴ細胞の内在性ＴＣＲ鎖の発現を典型的にサイレンシングできる。ｍｉＲＮＡをコードする適切な例示的配列は、配列番号１５及び配列番号１６、又は配列番号１９に示される。
一実施形態において、トランスポゾンは２つ以上のｍｉＲＮＡ、好ましくは同一の骨格配列を有する２つのｍｉＲＮＡ、又は同一の配列を有する２つ以上のｍｉＲＮＡをコードする。
代替的又は追加的に、トランスポゾンによりコードされたｍｉＲＮＡは、導入された細胞の治療効率を制限できるタンパク質の発現をサイレンシングできる。癌又はウィルス関連疾患の免疫療法の場合において、エフェクターの機能及び／又はＴ細胞の増殖をダウンレギュレートできるタンパク質は、ＣＴＬＡ４、ＰＤＣＤ１、ＬＡＧ３、ＨＡＶＣＲ２及びＴＩＧＩＴを含む阻害性表面受容体の群、ＣＢＬＢ、ＣＩＳＨ、ＤＧＫ及びＴＮＦＡＩＰ３を含むＴＣＲ若しくは共刺激経路を負に制御する細胞内タンパク質の群、ＳＰＲＹ２及びＣＲＥＭを含むサイトカイン生成を制限する細胞内タンパク質の群、又はＭＡＦ、ＥＧＲ３、ＮＤＲＧ１及びＤＴＸ１を含む機能不全Ｔ細胞表現型を安定化するタンパク質の群から選択される。
ＡＴＴに関して、タンパク質及び／又はｍｉＲＮＡの発現を制御するプロモーターは、Ｔ細胞における発現に機能的である。好ましくは、ＭＰＳＶプロモーターは、Ｔ細胞改変のために用いられ得る。代替のプロモーターは、ＥＦ１ａ、ＰＧＫ、ＣＭＶ、ＣＡＧ等である。
一実施形態において、本発明は、ｐＳＢ－ｍｉＲ－Ｔ１３６７（配列番号２２）、又は配列番号１４に従った本発明のミニサークルの生成のための元のプラスミドを提供する。当然に、プラスミド又はミニサークルは異なるＴＣＲコンストラクトを代替的にコードしてもよい。
本発明の好ましい実施形態において、トランスポゾンはその左側及び右側の逆向き反復配列／直列反復配列（ＩＲ／ＤＲ）に隣接されたカーゴ核酸を含み、
（ｉ）上記トランスポゾンは、Ｓｌｅｅｐｉｎｇ Ｂｅａｕｔｙトランスポザーゼタンパク質により移動可能であり、
（ｉｉ）左側のＩＲ／ＤＲは外側の左側ＤＲモチーフ及び内側の左側ＤＲモチーフを含み、外側の左側ＤＲモチーフは配列番号１のヌクレオチド配列を含み、内側の左側ＤＲモチーフは配列番号２のヌクレオチド配列を含み、
（ｉｉｉ）右側のＩＲ／ＤＲは外側の右側ＤＲモチーフ及び内側の右側ＤＲモチーフを含み、外側の右側ＤＲモチーフは配列番号１のヌクレオチド配列の逆方向配列を含み、内側の右側ＤＲモチーフは配列番号２のヌクレオチド配列の逆方向配列を含む。
カーゴ核酸は、本発明の少なくとも１つのタンパク質及び少なくとも１つのｍｉＲＮＡを含む。好ましくは、上記外側の左側ＤＲモチーフは配列番号３のヌクレオチド配列を含む、及び／又は上記外側の右側ＤＲモチーフは配列番号４のヌクレオチド配列の逆向き配列を含む。好ましくは、内側の左側ＤＲモチーフは配列番号５のヌクレオチド配列を含む、及び／又は内側の右側ＤＲモチーフは配列番号６のヌクレオチド配列の逆向き配列を含む。好ましくは、左側ＩＲ／ＤＲは、外側ＤＲと内側ＤＲとの間に配列番号７のヌクレオチド配列を含むエンハンサーとして機能できるＨＤＲ領域を含み、任意に、右側ＩＲ／ＤＲも該ＨＤＲ領域の逆相補鎖を含む。好ましくは、左側ＩＲ／ＤＲは、配列番号８及び配列番号９からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含む。好ましくは、右側ＩＲ／ＤＲは、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２及び配列番号１３からなる群から選択される逆相補鎖ヌクレオチド配列を含む。ｐＴ４又はｐＴ５トランスポゾンと示されるそのようなトランスポゾンは、高い転移効率を有し、本発明において有利に用いられ得る。
（表１）
表１：好ましいＩＲ／ＤＲ配列
ＨＤＲを含むｐＴ４の左側ＩＲ／ＤＲ
Figure 0007053053000001
配列番号8
TACAGTTGAAGTCGGAAGTTTACATACACYTWAGTTGGAGTCATTAAAACTCGTTTTTCAACTACTCCACAAATTTCTTGTTAACAAACAATAGTTTTGGCAAGTCAGTTAGGACATCTACTTTGTGCATGACACAAGTCATTTTTCCAACAATTGTKTACAKACASDTTATTTCACTTATAATTCACTGTATCACAATYCCAGTGGGTCAGAAGTGTACATACACGVKCT

ＨＤＲを含むｐＴ５の左側ＩＲ／ＤＲ
Figure 0007053053000002
配列番号9
TATACAGTTGAAGTCGGAAGTTTACATACACYTWAGTTGGAGTCATTAAAACTCGTTTTTCAACTACTCCACAAATTTCTTGTTAACAAACAATAGTTTTGGCAAGTCAGTTAGGACATCTACTTTGTGCATGACACAAGTCATTTTTCCAACAATTGTKTACAKACASDTTATTTCACTTATAATTCACTGTATCACAATYCCAGTGGGTCAGAAGTGTACATACACGVKCT

ＨＤＲを含まないｐＴ４の右側ＩＲ／ＤＲ（右側ＩＲ／ＤＲは所定の配列の逆相補鎖を含む）：
Figure 0007053053000003
配列番号10
TACAGTTGAAGTCGGAAGTTTACATACACYTWAGCCAAATACATTTAAACTCACTTTTTCACAATTCCTGACATTTAATCCGAGTAAAGATTCCCTGTCTTAAGGTCAGTTAGGATCACCACTTTATTTTAAGAATGTGAAATATCAGAATAATAGTAGAGAGAATGATTCATTTCAGCTTTTATTTCTTTCATCACATTYCCAGTGGGTCAGAAGTGTACATACACGVKCT

ＨＤＲを含まないｐＴ５の右側ＩＲ／ＤＲ（右側ＩＲ／ＤＲは所定の配列の逆相補鎖を含む）：
Figure 0007053053000004
配列番号11
TATACAGTTGAAGTCGGAAGTTTACATACACYTWAGCCAAATACATTTAAACTCACTTTTTCACAATTCCTGACATTTAATCCTAGTAAAAATTCCCTGTCTTAGGTCAGTTAGGATCACCACTTTATTTTAAGAATGTGAAATATCAGAATAATAGTAGAGAGAATGATTCATTTCAGCTTTTATTTCTTTCATCACATTYCCAGTGGGTCAGAAGTGTACATACACGVKCT

ＨＤＲを含むｐＴ４の右側ＩＲ／ＤＲ（右側ＩＲ／ＤＲは所定の配列の逆相補鎖を含む）：
Figure 0007053053000005
配列番号12
TACAGTTGAAGTCGGAAGTTTACATACACYTWAGCCAAATACATTTAAACTCACTTTTTCACAATTCCTGACATTTAATCCGAGTAAAGATTCCCTGTCTTAAGGTCAGTTAGGATCACCACTTTATTTTAAGAATGTGAAATATCAGAATAATAGTAGAGAGAATGATGTKTACAKACASDTCATTTCAGCTTTTATTTCTTTCATCACATTYCCAGTGGGTCAGAAGTGTACATACACGVKCT

ＨＤＲを含むｐＴ５の右側ＩＲ／ＤＲ（右側ＩＲ／ＤＲは所定の配列の逆相補鎖を含む）：
Figure 0007053053000006
配列番号13
TATACAGTTGAAGTCGGAAGTTTACATACACYTWAGCCAAATACATTTAAACTCACTTTTTCACAATTCCTGACATTTAATCCTAGTAAAAATTCCCTGTCTTAGGTCAGTTAGGATCACCACTTTATTTTAAGAATGTGAAATATCAGAATAATAGTAGAGAGAATGATGTKTACAKACASDTCATTTCAGCTTTTATTTCTTTCATCACATTYCCAGTGGGTCAGAAGTGTACATACACGVKCT

Ｙ＝Ｃ／Ｔ、好ましくは、Ｙは左側ＤＲにおいてＴであり、右側ＤＲにおいてＣである。
Ｗ＝Ａ／Ｔ、好ましくは、Ｗは左側ＤＲにおいてＡであり、右側ＤＲにおいてＴである。
Ｖ＝Ａ／Ｇ／Ｃ、好ましくは、ＶはＣである。
Ｋ＝Ｇ／Ｔ、好ましくは、ＫはＧである。
Ｓ＝Ｃ／Ｇ、
Ｄ＝Ａ／Ｔ／Ｇ。
最も好ましくは、Ｙは左側ＤＲにおいてＴであり、右側ＤＲにおいてＣであり、Ｗは左側ＤＲにおいてＡであり、右側ＤＲにおいてＴであり、ＶはＣであり、ＳはＣであり、ＤはＧであり、ＫはＧである。
トランスポゾンの好ましい実施形態において、左側ＩＲ／ＤＲは配列番号８のヌクレオチド配列を含み、右側ＩＲ／ＤＲは配列番号１０又は配列番号１２の逆相補鎖ヌクレオチド配列を含む。これらのポリヌクレオチドにおいて、フレームワーク領域はｐＴに対応し、本発明のポリヌクレオチドは示されたｐＴ４である。
他の好ましい実施形態において、左側ＩＲ／ＤＲは配列番号９のヌクレオチド配列を含み、右側ＩＲ／ＤＲは配列番号１１又は配列番号１３の逆相補鎖ヌクレオチド配列を含む。これらのポリヌクレオチドにおいて、フレームワーク領域はｐＴ２に対応し、本発明のポリヌクレオチドではｐＴ５と示される。
例えば上記及び実施例で記載されるようなトランスポゾンを含むミニサークルは、好ましくは本発明のキットに含まれる。
また、本発明は、トランスフェクションされた細胞を調製するための方法を含み、トランスフェクションされた細胞は好ましくは初代細胞であり、最も好ましくは初代Ｔ細胞であり、当該方法は、本発明のキットの核酸を細胞にトランスフェクションすることを含み、当該核酸は、ａ）トランスポゾンを移動可能なトランスポザーゼをコードするｍＲＮＡと、ｂ）当該トランスポゾンを含むミニサークルとを含み、当該トランスポゾンはタンパク質及び／又はｍｉＲＮＡをコードし、タンパク質及び／又はｍｉＲＮＡの発現は１つのプロモーターにより制御される。
好ましくは、細胞はエレクトロポレーションによりトランスフェクションされ、しかしながら例えば細胞圧搾、ソノポレーション（sonoporation）、流体力学的輸送等の物理的方法、リン酸カルシウム、デンドリマー、リポソーム若しくは陽イオンポリマーを用いた化学ベースのトランスフェクション方法、又は遺伝子銃を用いる等の粒子ベースの方法等の他の非ウィルストランスフェクション方法であってもよい。
本発明の方法において、好ましくは、例えばエレクトロポレーションによりトランスフェクションされた細胞は、患者から単離されたヒト初代Ｔ細胞である。この場合、その方法は、任意にさらに、抗ＣＤ３抗体、抗ＣＤ２８抗体、抗ＣＤ１３７抗体、抗ＣＤ１３４抗体、抗ＣＤ３５７抗体、ＩＬ－２、ＩＬ－７、ＩＬ－１５及びＩＬ－２１を含む群から選択された１つ以上の刺激によりＴ細胞を刺激することを含む。しかしながら、本発明者らは、本発明の方法においてそのような刺激がなくともトランスフェクションされたＴ細胞が生存し、増殖できることを示すことができた。
一実施形態において、本発明の方法はトランスフェクションされた細胞の選択及び／又は濃縮を含まない。
また、本発明の方法は、増強された生存能力を有するトランスフェクションされた細胞を調製するための方法を構成する。内在性ＴＣＲ鎖の発現をダウンレギュレートできるＴＣＲコンストラクト及びｍｉＲＮＡをコードする本発明の好ましいトランスポゾンを用いるので、本発明の方法は、低減された内在性ＴＣＲ鎖の発現能を有するトランスフェクションされたＴＣＲトランスジェニック細胞を調製する、及び／又はトランスジェニックＴＣＲ鎖及び内在性ＴＣＲ鎖の対合を抑制するのに特に適する。
本発明のキット及び方法を用いて、主要組織適合遺伝子複合体（ＭＨＣ）に存在する所定の抗原のエピトープに特異的なＴ細胞は、ＴＣＲコンストラクトをコードする核酸を発現することにより生成され得る。そのようなＴ細胞が患者の治療を目的とする場合、自己Ｔ細胞を用いることが好ましい。代替的に免疫抑制を用いて同種異系の細胞を利用することも可能である。
また、本発明は、少なくとも１つのタンパク質及び少なくとも１つのｍｉＲＮＡをコードする上記又は実施例に記載したトランスポゾンを含む例えばＴ細胞等の遺伝子改変細胞群を提供し、そのタンパク質をコードする核酸はｍｉＲＮＡをコードする配列を含むイントロンを含み、そのタンパク質及びｍｉＲＮＡの発現は同一のプロモーターにより制御される。上記遺伝子改変細胞群は、好ましくは本発明の方法により得られる。
また、本発明は、少なくとも１つのタンパク質及び少なくとも１つのｍｉＲＮＡをコードする例えば上記又は実施例に記載されたトランスポゾンを含む上記遺伝子改変細胞群を含む医薬組成物を提供し、そのタンパク質をコードする核酸はｍｉＲＮＡをコードする配列を含むイントロンを含み、そのタンパク質及びｍｉＲＮＡの発現は同一のプロモーターにより制御される。好ましくは、上記医薬組成物は、養子Ｔ細胞療法により患者を治療するのに用いるためのものであり、患者は、癌患者、及び／又はウィルス若しくは細菌性病原体に感染された患者、及び／又は自己免疫疾患の患者を含む群から選択され、細胞はＴＣＲ若しくはＣＡＲコンストラクト、好ましくはＴ細胞内在性ＴＣＲの発現を抑制するｍｉＲＮＡを発現するＴ細胞を含む。医薬組成物は、例えばＣＭＶ、ＥＢＶ、ＨＩＶ又はＨＰＶといったウィルス等の病原体の感染の予防又は抑制のために用いられるものであってもよく、適切なＴＣＲ又はＣＡＲコンストラクトが用いられる。
また、本発明は、本発明の適切な医薬組成物を治療が必要な（例えばウィルスに感染された、又は例えばウィルス関連癌等の癌を患う、例えば自己免疫疾患を患う）患者に投与することを含む患者の治療、又はウィルスの感染若しくは該感染の症状を抑制する方法を教示する。
本発明において、Ｔ細胞は、ＣＤ８＋又はＣＤ４＋Ｔ細胞であってもよく、好ましくはＣＤ８＋細胞又は制御性Ｔ細胞であってもよい。また、医薬組成物は、トランスジェニックＣＤ４＋及びＣＤ８＋Ｔ細胞の両方を含んでもよく、それぞれのＴＣＲは同一抗原の異なるエピトープを標的とすることが好ましい。好ましくは、Ｔ細胞はヒトＴ細胞であり、治療される患者はヒト患者である。
さらに、本発明は以下の実施例により説明され、実施例は本発明の例示を目的とし、その範囲を制限することを目的とするものではない。本明細書において引用される全ての参考文献は、ここに完全に組み込まれる。本明細書に開示された本発明の全ての実施形態は組み合わせられ得る。
本発明に適用されるＳｌｅｅｐｉｎｇ Ｂｅａｕｔｙトランスポゾンに基づく遺伝子移送システムの改善の概要を示す図である。（Ａ）従来のＳｌｅｅｐｉｎｇ Ｂｅａｕｔｙ移送システム、（Ｂ）Ｓｌｅｅｐｉｎｇ ＢｅａｕｔｙトランスポザーゼをコードするｍＲＮＡ（ｉｖｔＲＮＡ）を含む本発明のキット、（Ｃ）導入遺伝子をコードするトランスポゾンを含むミニサークルＤＮＡ、及び（Ｄ）例えばＴＣＲ等の効率的な導入遺伝子の発現及び治療効果を阻害する内在性遺伝子をサイレンシングするｍｉＲＮＡの対比を示す。 ヒトＴ細胞へのプラスミドＤＮＡのトランスフェクションが濃度依存的にＴ細胞の死亡を引き起こすことを示す。（Ａ）ＧＦＰをコードするプラスミドＤＮＡ（ｐＳＢ－ＧＦＰ）をトランスフェクションされたヒトＴ細胞が濃度依存的に死亡することを示す一方で、類似量のＧＦＰ－ｍＲＮＡがトランスフェクションされた場合はＴ細胞の数がわずかに減少するのみであることを示す。（Ｂ）ＧＦＰ－ｉｖｔＲＮＡのトランスフェクションは、ｐＳＢ－ＧＦＰのトランスフェクションと比較してより効率がよく、より多くのＧＦＰ＋Ｔ細胞を生じる。さらに、高いＤＮＡ量（＞１０μｇ）のトランスフェクションは、トランスフェクションから３日後から４日後においてＧＦＰ＋Ｔ細胞の減少を引き起こす。 ｉｖｔＲＮＡとして輸送されるトランスポザーゼ、及びトランスポザーゼをコードするプラスミドで、類似の遺伝子移送効率が得られることを示す。ＤＮＡプラスミドとしてのトランスポザーゼを輸送する従来のＳｌｅｅｐｉｎｇ Ｂｅａｕｔｙトランスポゾンに基づく遺伝子移送システム（ＳＢＴＳ－ｃｏ）と、ｉｖｔＲＮＡとしてのトランスポザーゼを輸送する本発明のＳｌｅｅｐｉｎｇ Ｂｅａｕｔｙトランスポゾンに基づく遺伝子移送システム（ＳＢＴＳ－ｉＲ）とを用いたヒトＴ細胞におけるＧＦＰ発現の比較を示す。１日目（一過性発現）及び１２日目（安定発現）でのＧＦＰ＋ＣＤ３＋Ｔ細胞の割合を示す。 ｉｖｔＲＮＡとしてのトランスポザーゼを輸送するＳｌｅｅｐｉｎｇ Ｂｅａｕｔｙトランスポゾンに基づく遺伝子移送が細胞生存能を増大することを示す。図２に示すようにＳＢＴＳ－ｃｏ及びＳＢＴＳ－ｉＲは、ＧＦＰをコードするトランスポゾンをヒトＴ細胞にトランスフェクションするために用いられる。異なる量のトランスポゾンプラスミドとＤＮＡトランスポザーゼ又はｉｖｔＲＮＡトランスポザーゼのいずれかとを用いてトランスフェクションした２４時間後における生存するＴ細胞の割合を示す。 ミニサークルＤＮＡトランスポゾンを用いたＳｌｅｅｐｉｎｇ Ｂｅａｕｔｙトランスポゾンに基づく遺伝子移送は、トランスフェクション効率を増大することを示す。（Ａ）ｉｖｔＲＮＡをコードするトランスポザーゼと、いずれもＧＦＰをコードするトランスポゾンプラスミドＤＮＡ（ｐＳＢ）又はトランスポゾンミニサークルＤＮＡ（ｍＳＢ）とを含むＳｌｅｅｐｉｎｇ Ｂｅａｕｔｙトランスポゾンに基づく遺伝子移送システムの対比を示す。（Ｂ）平均蛍光強度を示す。（Ｃ）ＧＦＰ＋ヒトＴ細胞の割合を示す。ｐｍａｘ－ＧＦＰは、ｉｖｔＲＮＡトランスポザーゼを含まない一過性トランスフェクションの参照であり、ｎｏｎ－ＴＦは核酸を用いていないトランスフェクション条件である。 内在性ＴＣＲをサイレンシングする改変ＴＣＲ及びｍｉＲＮＡミニサークルトランスポゾンＤＮＡを輸送するＳｌｅｅｐｉｎｇ Ｂｅａｕｔｙトランスポゾンに基づく遺伝子移送システムが治療的ＴＣＲの発現を改善させることを示す。（Ａ）ｍｉＲＮＡ（ｍｉＲ）を含むミニサークルトランスポゾンベクター及び、ＭＡＧＥ－Ａ１反応性ＴＣＲＴ１３６７配列における改変を示す。（Ｂ）種々の改変がされたＴＣＲ Ｔ１３６７を含むミニサークルトランスポゾンベクターを示す。１：ＴＣＲのコドン最適化、２：１にｍｉＲＮＡカセット（ｍｉＲ）を加えた、３：ＴＣＲのコドン最適化、追加のシステインボンド、最小のマウス化Ｃ領域（ｏｐｔ）、４：３にｍｉＲＮＡカセット（ｍｉＲ）を加えた。（Ｃ）ｍｉＲＮＡの発現が治療的ＴＣＲ鎖と内在性ＴＣＲ鎖との間に形成された誤対合ＴＣＲの形成を低減することを示す。（Ｄ）ｍｉＲＮＡの発現は、ＭＨＣ多量体結合により測定されるようにＴＣＲ改変ヒトＴ細胞の機能性を増大することを示す。 十分に最適化されたＳｌｅｅｐｉｎｇ Ｂｅａｕｔｙトランスポゾンに基づく遺伝子移送システムで改変されたヒトＴ細胞が改善された機能性を示す。ヒトＴ細胞が十分に最適化されたＳｌｅｅｐｉｎｇ Ｂｅａｕｔｙトランスポゾンに基づく遺伝子移送システム（トランスポザーゼをコードするｉｖｔＲＮＡ、内在性ＴＣＲの発現をノックダウンするｍｉＲＮＡを含むミニサークルトランスポゾンＤＮＡ、最適化された治療的ＴＣＲ）でトランスフェクションされ、（Ａ）ペプチド負荷指標細胞に反応して改善されたＩＦＮ－γの放出性を示し、（Ｂ）ＭＡＧＥ－Ａ１＋ＨＬＡ－Ａ＊０２：０１＋（ＭＡＧＥ－Ａ１＋，Ａ２＋）主要細胞株で改善されたＩＦＮ－γの放出性を示し、一方、Ａ２－及びＭＡＧＥ－Ａ１－細胞株では認められなかった。 １つのベクターにおける同一のｍｉＲＮＡの組合せ（２×同一のｍｉＲＮＡ）は、本発明のシステムを用いることが可能である。Ｊｕｒｋａｔ細胞に、トランスポザーゼプラスミドと、ＧＦＰ、及びヒトＴＣＲα鎖に特異的な（Ｂ）１つの若しくは（Ｃ）２つの同一のｍｉＲＮＡ（ＴＲをコードするＳＢトランスポゾンプラスミドとをエレクトロポレーションし、又は（Ａ）ではｍｉＲＮＡは無しとして、８日後にＣＤ３表面発現をフローサイトメトリーにより分析した。ノックダウン率は、１つのｍｉＲＮＡカセットでは７４％であり、トランスポゾンベクターに同一のｍｉＲＮＡカセットを２度組み込んだ場合では８４％であった。 ヒト初代Ｔ細胞（ＨＴＣ）：プラスミド（ｐ）対ミニサークル（ｍｃ）を示す。ヒト初代Ｔ細胞に１５μｇのＳＢトランスポザーゼＲＮＡ、及びプラスミド又はミニサークルのいずれかとしての２．５μｇのＳＢトランスポゾンベクターをエレクトロポレーションし、４日後にフローサイトメトリーにより分析した。従来のプラスミドの代わりにミニサークルとしてのＳＢトランスポゾンを用いることで、（Ａ）Ｔ細胞の生存能を妥協することなく、（Ｂ）トランスフェクション効率を実質的に増大する。 ヒト初代Ｔ細胞（ＨＴＣ）：ＳＢＲＮＡ対ＳＢプラスミドを示す。ヒト初代Ｔ細胞にＧＦＰをコードする２．５μｇのＳＢトランスポゾンミニサークル、及びインビトロ転写されたＲＮＡ（ＳＢＲＮＡ）又はプラスミド（ＳＢプラスミド）としての１５μｇのＳＢトランスポザーゼをエレクトロポレーションし、４日後にフローサイトメトリーにより分析した。（Ａ）プラスミドＤＮＡの代わりにＲＮＡとしてのＳＢトランスポザーゼを用いることで、トランスフェクション後のＴ細胞の死亡を低減し、すなわちＴ細胞の生存率を増大する。（Ｂ）また、それはトランスフェクション効率を増大する。 ヒト初代Ｔ細胞（ＨＴＣ）：従来の２つのプラスミド（ｐ）システム対ミニサークル（ｍｃ）／ＲＮＡを示す。ヒト初代Ｔ細胞に２．５μｇトランスポゾンベクター及び２．５μｇのトランスポザーゼベクターを用いた従来のＳＢ２つのプラスミドシステム、又は２．５μｇトランスポゾンミニサークル及び１５μｇＳＢＲＮＡを用いてエレクトロポレーションし、４日後にフローサイトメトリーにより分析した。従来の２つのプラスミドシステムの代わりにミニサークル及びＲＮＡの適用は、（Ａ）Ｔ細胞の生存率を妥協することなく、（Ｂ）トランスフェクション効率を実質的に増大する。 Ｊｕｒｋａｔ細胞とヒト初代Ｔ細胞（ＨＴＣ）との比較：従来の２つのプラスミド（ｐ）システム対ミニサークル（ｍｃ）／ＲＮＡを示す。代替的アプローチは、類似の効率を達成するために多量のプラスミドＤＮＡを用いる。しかしながら、これら多量のプラスミドＤＮＡの使用は、臨床適用のためのＴ細胞の大規模生成を妨げる多くの細胞死を引き起こす。このアプローチは、細胞株のトランスフェクションでは有効である一方、初代Ｔ細胞では多量のＤＮＡを用いたトランスフェクションでは稀にしか生存しない。さらに、ＤＮＡトランスフェクションされた初代Ｔ細胞は、Ｔ細胞の活性の遅延を示し、増殖するのは困難である。ここで、我々は、多量のプラスミドＤＮＡを用いた従来のアプローチと、トランスポゾンミニサークル及びトランスポザーゼＲＮＡを用いた我々のアプローチとを比較した。（Ａ）初代Ｔ細胞又は（Ｂ）Ｊｕｒｋａｔ細胞株に、高いトランスフェクション効率を達成することが報告されている多量のＤＮＡ（１０μｇ／１０μｇ又は２０μｇ／１０μｇ）を用いた従来のＳＢ２つのプラスミドシステム、又は我々のミニサークル／ＲＮＡアプローチを用いてエレクトロポレーションし、４日後にフローサイトメトリーにより分析した。Ｊｕｒｋａｔ細胞は多量のＤＮＡを許容する一方、初代Ｔ細胞は２０μｇ又は３０μｇの総ＤＮＡの適用においてほとんど生存しない。しかしながら、我々のミニサークル／ＲＮＡアプローチは、エレクトロポレーション後に生存可能なＴ細胞を保証する初代Ｔ細胞の効率的なトランスフェクションを可能とする（３０～４０％の生存率）。
［実施例１］
（従来のＳｌｅｅｐｉｎｇ Ｂｅａｕｔｙ遺伝子移送システム（ＳＢＴＳ－ｃｏ）の生成）
Ｓｌｅｅｐｉｎｇ Ｂｅａｕｔｙ ｐＴ２／ＨＢトランスポゾンプラスミド(Cui et al., 2002)をＭＰ７１レトロウィルスベクターのＭＰＳＶプロモーター(Engels et al., 2003)、キメライントロン及びｐｓｉＣＨＥＣＫ２(Promega,Madison, USA)のポリＡシグナルを含むように改変した。増強型緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）及びＭＡＧＥ－Ａ１特異的ヒトＴＣＲ Ｔ１３６７導入遺伝子(Obenaus et al., 2015)をそれぞれ、ｐＳＢ－ＧＦＰを得るための改変型ｐＴ２ベクター及びｐＳＢ－Ｔ１３６７にクローニングした。
効率的なＴＣＲ発現のために、ＴＣＲ Ｔ１３６７配列をコドン最適化し(Geneart, Darmstadt, Germany)、ＴＣＲα鎖及びＴＣＲβ鎖を、ＰＣＲによってブタのテッショウウィルスの２Ａエレメント（Ｐ２Ａ）を介して連結した(Leisegang et al., 2008)。ＴＣＲ Ｔ１３６７ヒト定常領域を、追加のシステインブリッジを含む(Kuball et al., 2007; Rosenberg et al., 2008)最低限のマウス化がされたカウンターパート(Sommermeyer and Uckert, 2010)により置換した(T1367opt)。最終のＴＣＲコンストラクトは、配列番号２３に対応する(特許 WO2014118236 A2, コンストラクトを認識する抗アビディティ抗原)。トランスポゾンプラスミドＤＮＡ(ｐＳＢ－ＧＦＰ、ｐＳＢ－Ｔ１３６７)を、ＥｎｄｏＦｒｅｅ Ｐｌａｓｍｉｄ Ｍａｘｉ Ｋｉｔ (Qiagen,Hilden, Germany)を用いて生成した。トランスポゾンプラスミドを、エレクトロポレーションによりヒトＴ細胞にトランスフェクションするために、ＤＮＡプラスミドとして輸送されるＳｌｅｅｐｉｎｇ ＢｅａｕｔｙＳＢ１００Ｘトランスポザーゼ(Mates et al., 2009)と共に用いた。
［実施例２］
（インビトロで転写された（ｉｖｔ）ＲＮＡトランスポザーゼ（ＳＢＴＳ－ｉＲ）を用いたＳｌｅｅｐｉｎｇ Ｂｅａｕｔｙ遺伝子移送システムの生成）
Ｓｌｅｅｐｉｎｇ Ｂｅａｕｔｙ ＳＢ１００Ｘトランスポザーゼ又はＧＦＰをコードするｉｖｔＲＮＡを、ｍＭＥＳＳＡＧＥ ｍＭＡＣＨＩＮＥ Ｔ７ ｋｉｔ (ThermoFischer, Waltham, USA)を用いて、製造者の説明書に従って、ｐｃＤＮＡ３．１／Ｈｙｇｒｏ（＋）(Invitrogen, Carlsbad, USA)から調製した。ポリ（Ａ）テイルをＰｏｌｙ（Ａ）－ｔａｉｌｉｎｇ ｋｉｔ(ThermoFischer, Waltham, USA)を用いて追加し、ＲＮＡをＲＮｅａｓｙ Ｋｉｔ(Qiagen)を用いてカラムで精製した。ｉｖｔＲＮＡトランスポザーゼを、エレクトロポレーションによりヒトＴ細胞にトランスフェクションするために、改変型Ｓｌｅｅｐｉｎｇ Ｂｅａｕｔｙ ｐＴ２／ＨＢトランスポゾンプラスミド（実施例１）と共に用いた。
［実施例３］
（Ｓｌｅｅｐｉｎｇ ＢｅａｕｔｙトランスポゾンミニサークルＤＮＡの生成）
親ベクターの生成のために、プロモーター、イントロン、導入遺伝子及びポリＡシグナルを含むカセットを、ＢａｍＨＩ制限酵素部位でプラスミドｐＭＣ．ＢＥＳＰＸ－ＭＣＳ２(System Biosciences, Mountain View, USA)に挿入した。２１０ｂｐスペーサーをミニサークル組換えサイトａｔｔＢと左側の逆向き反復配列との間に挿入した。最終プラスミドは配列番号１４に対応する。Ｓｌｅｅｐｉｎｇ ＢｅａｕｔｙトランスポゾンミニサークルＤＮＡ（ｍＳＢ－ＧＦＰ、ｍＳＢ－Ｔ１３６７）を、ＭＣ－Ｅａｓｙ Ｍｉｎｉｃｉｒｃｌｅ ＤＮＡ Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｋｉｔ (System Biosciences, Palo Alto, USA)及びＥｎｄｏＦｒｅｅ Ｐｌａｓｍｉｄ Ｍｅｇａ Ｋｉｔ(Qiagen)を用い、製造者の説明書に従って生成した。ポリ（Ａ）テイルをＰｏｌｙ（Ａ）－ｔａｉｌｉｎｇ ｋｉｔ(ThermoFischer, Waltham, USA)を用いて追加し、ＲＮＡをＲＮｅａｓｙ Ｋｉｔ(Qiagen)を用いてカラムで精製した。トランスポゾンミニサークルＤＮＡを、エレクトロポレーションによりヒトＴ細胞にトランスフェクションするために、ｉｖｔＲＮＡトランスポザーゼ（実施例２）と共に用いた。
［実施例４］
（内在性ＴＣＲのサイレンシングのためのマイクロ（ｍｉ）ＲＮＡの生成）
ヒトＴＣＲ特異的ｍｉＲＮＡカセットを、マウスＴＣＲの場合に我々が説明したように(Bunse et al., 2014)設計した。ＴＣＲα特異的アンチセンス配列TGAAAG TTT AGG TTC GTA TCT G（配列番号１５）、及びＴＣＲβ特異的アンチセンス配列TCTGAT GGC TCA AAC ACA GCG A（配列番号１６）を、それぞれ配列番号１７のｍｉＲＮＡ環境ｍｉＲ－１５５(Chung et al., 2006)、及び配列番号１８の人工ｍｉＲＮＡ(Satromet al., 2006)に組込み、配列番号１９を得た。
その後、そのｍｉＲＮＡをＴＣＲトランスポゾンプラスミドのイントロンに挿入し、ｐＳＢ－ｍｉＲ－Ｔ１３６７ｃｏを得た（配列番号２２）。
［実施例５］
（Ｔ細胞の単離及びエレクトロポレーション、並びにＪｕｒｋａｔ細胞のエレクトロポレーション）
Ｔ細胞をＢｉｏｃｏｌｌ(Biochrom, Berlin, Germany)に基づく遠心分離処理により新鮮な単離ＰＢＭＣから調製し、その後ＥａｓｙＳｅｐ Ｈｕｍａｎ Ｔ Ｃｅｌｌ Ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ Ｋｉｔ(STEMCELL Technologies, Koln, Germany)を用いて濃縮した。ＴＣＲ移送の場合、Ｖβ３陽性細胞を、ＰＥ標識化抗Ｖβ３抗体(クローンJovi-3, Ancell, Bayport, USA)と共にインキュベーションし、その後、抗ＰＥビーズ(STEMCELL Technologies, Vancouver, Kanada)を用いて選択することにより細胞分画から除いた。
エレクトロポレーションを、Ｔ細胞に対してはＡｍａｘａ ｈｕｍａｎ Ｔ ｃｅｌｌ Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ Ｋｉｔ(Lonza, Basel, Schweiz)を用い、Ｊｕｒｋａｔ細胞に対してはＡｍａｘａ Ｃｅｌｌ Ｌｉｎｅ Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ Ｋｉｔ Ｖを用いて、製造者の説明書に従って行った。６～１０×１０６のＴ細胞又は５～１０×１０６のＪｕｒｋａｔ細胞を、１００μｌのｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｉｏｎバッファー及び１．２５μｇから２０μｇのトランスポゾンべくたーＤＮＡに懸濁し、キュベットに移した。その後、Ｔ細胞に対してはプログラムＵ－１４を適用し、Ｊｕｒｋａｔ細胞に対してはプログラムＸ－０１を適用し、細胞に２ｍｌのＴ細胞培地（ＴＣＭ：ＲＰＭＩ１６４０、１０％ウシ胎児血清、１ｍＭピルビン酸ナトリウム、１×非必須アミノ酸）を迅速に供給し、一晩中培養した。エレクトロポレーションの１日後、Ｔ細胞を、４００Ｕ／ｍｌの組換えヒトインターロイキン‐２(ＩＬ－２, Chiron, Marburg, Germany)が添加された２ｍｌの新鮮なＴＣＭに再懸濁し、それらを抗ＣＤ３（クローンＯＫＴ３、５μｇ／ｍｌ）及び抗ＣＤ２８（クローンＣＤ２８．２、１μｇ／ｍｌ）抗体でコーティングされた２４ウェルプレートに播種することにより活性化させた。その後、細胞を１８日目まで増大させた。機能的分析の前の３から４日前に、ＩＬ－２の濃度を４０Ｕ／ｍｌに低減した。
［実施例６］
（分析的測定）
＜フローサイトメトリー＞
Ｔ細胞表面染色を、ＣＤ８（ＨＩＴ８α）、Ｖβ３（Ｊｏｖｉ－３、Ａｎｃｅｌｌ）、ＣＤ２５ （ＢＣ９６）、ＣＤ２８及びＣＤ３（ＵＣＨＴ１）に対するｍＡｂを用いて、４℃で３０分間、５０μｌのＰＢＳ中で行った。抗体は、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ(San Diego, USA)、ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、ＢＤ又はＢｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒから購入した。ＭＡＧＥ－Ａ１／ＨＬＡ－Ａ２多量体(MBL International, Woburn, USA)染色を、４℃で３０分間行った。Ｔ細胞の生存率は、ＳＹＴＯＸ Ｂｌｕｅ (Life Technologies, Carlsbad, USA)を用いた死細胞の染色、及びＦＳＣ／ＳＳＣリンパ球ゲートにより決定した。データは、ＦＡＣＳ ＣａｎｔｏＩＩ(BD)又はＭＡＣＳ Ｑｕａｎｔ(Miltenyi Biotec, BergischGladbach, Germany)で得て、ＦｌｏｗＪｏソフトウェア(Tree Star, Ashland,USA)を用いて分析した。ＭＡＧＥ－Ａ１２７８特異的ペプチド(KVLEYVIKV、配列番号２０)及び無関係のチロシナーゼ特異的参照ペプチドＴｙｒ３６９(YMDGTMSQV、配列番号２１)を、Ｂｉｏｓｙｎｔａｎ(Berlin, Germany)により生成した。
＜サイトカイン放出アッセイ＞
分泌されたサイトカインの検出のために、ＴＣＲ改変Ｔ細胞を、ＭＡＧＥ－Ａ１２７８負荷Ｔ２細胞又は腫瘍細胞株と共に、エフェクター：標的（Ｅ：Ｔ）比を１：１にして９６ウェル丸底プレート（１０４／ウェル）に播種した。２４時間後に上清を回収し、ＥＬＩＳＡ又はｃｙｔｏｍｅｔｒｉｃ ｂｅａｄ ａｒｒａｙ（ともにＢＤ）のいずれかにより分析した。
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Claims (10)

  1. 初代細胞に、エレクトロポレーションで、トランスポゾンを含むミニサークルＤＮＡと、トランスポゾンを移動可能なトランスポザーゼをコードするｍＲＮＡとをトランスフェクションすることを含み、
    前記トランスポゾンは、ＴＣＲコンストラクトと、ＴＣＲα及びＴＣＲβ鎖の発現をサイレンシングできる２つのｍｉＲＮＡとをコードし、
    前記２つのｍｉＲＮＡは、トランスポゾンによりコードされたＴＣＲ鎖の発現をサイレンシングできず、
    ＴＣＲをコードする核酸は、２つのｍｉＲＮＡをコードする配列を含むイントロンを含み、
    前記ＴＣＲコンストラクト及び前記ｍｉＲＮＡの発現は、同一のプロモーターにより制御され、
    前記ｍＲＮＡは、ｉｖｔＲＮＡである、トランスフェクション初代細胞を調製する方法。
  2. 前記ミニサークルＤＮＡは、５ｋｂ未満である請求項１に記載の方法。
  3. 前記ＴＣＲコンストラクトは、１つのＴＣＲα鎖コンストラクト及び１つのＴＣＲβ鎖コンストラクト、並びに一本鎖ＴＣＲコンストラクト又はキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を含む群から選択される、請求項１又は２に記載の方法。
  4. 前記ＴＣＲコンストラクトは、互いに対合するように最適化されたＴＣＲα鎖コンストラクト及びＴＣＲβ鎖コンストラクトを含み、
    前記ＴＣＲα鎖及びＴＣＲβ鎖は、
    （ａ）天然ヒトＴＣＲに対して追加のＣｙｓ残基、及び／又は、
    （ｂ）ＴＣＲ鎖がヒト由来である場合においても定常領域にマウスアミノ酸配列を含む、請求項１～３のいずれか１項に記載の方法。
  5. 前記トランスポゾンは、左側及び右側の逆向き反復配列／直列反復配列（ＩＲ／ＤＲ）に隣接されたカーゴ核酸を含み、
    （ｉ）前記トランスポゾンは、Ｓｌｅｅｐｉｎｇ Ｂｅａｕｔｙトランスポザーゼタンパク質により移動可能であり、
    （ｉｉ）前記左側のＩＲ／ＤＲは、外側の左側ＤＲモチーフ及び内側の左側ＤＲモチーフを含み、外側の左側ＤＲモチーフは配列番号１のヌクレオチド配列を含み、内側の左側ＤＲモチーフは配列番号２のヌクレオチド配列を含み、
    （ｉｉｉ）前記右側のＩＲ／ＤＲは、外側の右側ＤＲモチーフ及び内側の右側ＤＲモチーフを含み、外側の右側ＤＲモチーフは配列番号１のヌクレオチド配列の逆方向配列を含み、内側の右側ＤＲモチーフは配列番号２のヌクレオチド配列の逆方向配列を含む、請求項１～４のいずれか１項に記載の方法。
  6. 前記トランスポザーゼは、ｐｉｇｇｙＢａｃ、Ｔｏｌ２、並びにＦｒｏｇ Ｐｒｉｎｃｅ及びＳｌｅｅｐｉｎｇ Ｂｅａｕｔｙトランスポザーゼを含むＴｃ１／ｍａｒｉｎｅｒ型トランスポゾンを含むクラスＩＩ転移可能エレメントの群から選択される、請求項１～５のいずれか１項に記載の方法。
  7. 前記トランスポザーゼは、Ｓｌｅｅｐｉｎｇ Ｂｅａｕｔｙトランスポザーゼである請求項６に記載の方法。
  8. 抗ＣＤ３抗体、抗ＣＤ２８抗体、抗ＣＤ１３７抗体、抗ＣＤ１３４抗体、抗ＣＤ３５７抗体、ＩＬ－２、ＩＬ－７、ＩＬ－１５及びＩＬ－２１を含む群から選択された１つ以上の刺激でＴ細胞を刺激することをさらに含む、請求項１～７のいずれか１項に記載の方法。
  9. 請求項１～８のいずれか１項に記載の方法により得られた遺伝子改変された細胞群。
  10. 請求項９に記載の遺伝子改変された細胞群を含む医薬組成物であって、
    前記細胞は、養子Ｔ細胞療法によって患者を治療するために用いられ、
    前記患者は、癌患者及び／又はウィルス若しくは細菌性病原体に感染された患者を含む群から選択され、
    前記細胞はＴＣＲコンストラクトを発現するＴ細胞を含む、医薬組成物。
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