JP2018529327A - 抗メソテリン完全ヒト抗体およびメソテリンを標的とする免疫エフェクター細胞 - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、腫瘍免疫治療または診断の分野に属し、より具体的に、抗メソテリン完全ヒト抗体およびメソテリンを標的とする免疫エフェクター細胞に関する。
免疫エフェクター細胞の腫瘍の免疫応答における作用は重要視されてきた。免疫エフェクター細胞に基づいた養子免疫療法は一部の腫瘍においてある程度の効果が得られ、しかもこのような免疫治療法は抗体治療の上記欠点を克服することができるが、大半の腫瘍における治療効果は満足できるものと言えない[Grupp SAら Adoptive cellular therapy. Curr Top Microbiol Immunol. 2011, 344:149-72.]。近年、細胞毒性Tリンパ球(cytotoxic lymphocyte、CTL)の標的細胞に対する認識特異性はT細胞受容体(T Cell Receptor、TCR)に依存するという発見に基づき、腫瘍細胞関連抗原に対する抗体のscFvをT細胞受容体のCD3ζまたはFcεRIγなどの細胞内シグナルの活性化モチーフと融合させてキメラ抗原受容体(Chimeric antigen receptor、CAR)とし、そしてそれをたとえばレンチウイルス感染などの方法によってT細胞の表面に遺伝子的に修飾する。このようなCAR T細胞は主要組織適合遺伝子複合体(Major Histocompatibility Complex、MHC)に制限されない様態で選択的にTリンパ球の標的を腫瘍細胞に変えて特異的に腫瘍を殺傷することができる。CAR T細胞は腫瘍免疫治療の分野における一つの新たな免疫治療策略である。CAR修飾NK細胞またはNKT細胞も前臨床研究において抗腫瘍活性を示した。
本発明の目的は抗メソテリン完全ヒト抗体およびメソテリンを標的とする免疫エフェクター細胞を提供することにある。
(a) 配列番号54で示されるアミノ酸配列を含むCDR1、配列番号55で示されるアミノ酸配列を含むCDR2、配列番号56で示されるアミノ酸配列を含むCDR3を有する重鎖可変領域を含む抗体、
(b) 配列番号51で示されるアミノ酸配列を含むCDR1、配列番号52で示されるアミノ酸配列を含むCDR2、配列番号53で示されるアミノ酸配列を含むCDR3を有する軽鎖可変領域を含む抗体、
(c) (a)に記載の抗体の重鎖可変領域および(b)に記載の抗体の軽鎖可変領域を含む抗体、
(d) 配列番号60で示されるアミノ酸配列を含むCDR1、配列番号61で示されるアミノ酸配列を含むCDR2、配列番号62で示されるアミノ酸配列を含むCDR3を有する重鎖可変領域を含む抗体、
(e) 配列番号57で示されるアミノ酸配列を含むCDR1、配列番号58で示されるアミノ酸配列を含むCDR2、配列番号59で示されるアミノ酸配列を含むCDR3を有する軽鎖可変領域を含む抗体、
(f) (d)に記載の抗体の重鎖可変領域および(e)に記載の抗体の軽鎖可変領域を含む抗体、
(g) (a)〜(f)のうちいずれか1つに記載の抗体によって認識される抗原決定基と同様の抗原決定基を認識する抗体
から選択される完全ヒト抗体を提供する。
当該完全ヒト抗体は、アミノ酸配列が配列番号8の1〜124番目に示される重鎖可変領域、およびアミノ酸配列が配列番号8の140〜247番目に示される軽鎖可変領域を含む。
もう一つの好適な例において、前記の特異的にメソテリンと結合する完全ヒト抗体は、一本鎖抗体(scFV)、モノクローナル抗体、ドメイン抗体、Fab断片、Fd断片、Fv断片、F(ab’)2断片およびその誘導体、あるいはほかの形態の抗体でもよく、好ましくは一本鎖抗体である。
本発明のもう一つの側面では、前記の核酸を含む発現ベクターを提供する。
本発明のもう一つの側面では、前記の発現ベクターを含むか、あるいは前記の核酸がゲノム中に組み込まれた宿主細胞を提供する。
本発明のもう一つの側面では、メソテリンを発現する腫瘍細胞を特異的に標的とする標的薬物、抗体薬物抱合体または多機能抗体の製造における、あるいはメソテリンを発現する腫瘍を診断する試薬の製造における、あるいはキメラ抗原受容体で修飾された免疫細胞の製造における、前記の抗体の使用を提供する。
一つの好適な例において、前記の細胞内シグナル領域は、CD3ζ、FcεRIγ、CD27、CD28、CD137、CD134、MyD88、CD40の細胞内シグナル領域、またはこれらの組み合わせから選択される。
一つの好適な例において、前記の膜貫通領域はCD8またはCD28の膜貫通領域を含む。
前記の抗体、CD8およびCD3ζ、
前記の抗体、CD8、CD137およびCD3ζ、
前記の抗体、CD28分子の膜貫通領域、CD28分子の細胞内シグナル領域およびCD3ζ、あるいは
前記の抗体、CD28分子の膜貫通領域、CD28分子の細胞内シグナル領域、CD137およびCD3ζを含む。
もう一つの好適な例において、前記のキメラ抗原受容体は、
配列番号41、またはその22〜353番目に示されるアミノ酸配列、
配列番号42、またはその22〜454番目に示されるアミノ酸配列、
配列番号43、またはその22〜498番目に示されるアミノ酸配列、
配列番号44、またはその22〜501番目に示されるアミノ酸配列、
配列番号45、またはその22〜543番目に示されるアミノ酸配列、
配列番号46、またはその22〜346番目に示されるアミノ酸配列、
配列番号47、またはその22〜447番目に示されるアミノ酸配列、
配列番号48、またはその22〜491番目に示されるアミノ酸配列、
配列番号49、またはその22〜494番目に示されるアミノ酸配列、あるいは
配列番号50、またはその22〜536番目に示されるアミノ酸配列、
を有する。
もう一つの好適な例において、前記のキメラ抗原受容体をコードする核酸は、
配列番号31、またはその473〜1468番目に示されるヌクレオチド配列、
配列番号32、またはその473〜1771番目に示されるヌクレオチド配列、
配列番号33、またはその473〜1903番目に示されるヌクレオチド配列、
配列番号34、またはその473〜1912番目に示されるヌクレオチド配列、
配列番号35、またはその473〜2038番目に示されるヌクレオチド配列、
配列番号36、またはその473〜1447番目に示されるヌクレオチド配列、
配列番号37、またはその473〜1750番目に示されるヌクレオチド配列、
配列番号38、またはその473〜1882番目に示されるヌクレオチド配列、
配列番号39、またはその473〜1891番目に示されるヌクレオチド配列、
配列番号40、またはその473〜2017番目に示されるヌクレオチド配列、
を有する。
もう一つの好適な例において、前記の発現ベクターはレンチウイルスプラスミドpWPT(またはpWPT-eGFP)由来のものである。
本発明のもう一つの側面では、前記ベクターを含むウイルスを提供する。
本発明のもう一つの側面では、メソテリンを発現する腫瘍細胞を標的とする遺伝子修飾された免疫細胞の製造における、前記のキメラ抗原受容体、または前記の核酸、または前記の発現ベクター、または前記のウイルスの使用を提供する。
一つの好適な例において、前記のメソテリンを発現する腫瘍は膵臓がん、卵巣がん、胸腺中皮腫を含むが、これらに限定されない。
一つの好適な例において、前記の免疫細胞は、さらに、外因性サイトカインのコード配列を担持する。好ましくは、前記のサイトカインは、IL-12、IL-15またはIL-21を含む。
もう一つの好適な例において、前記の免疫細胞はさらにもう1種類のキメラ抗原受容体を発現し、当該受容体はCD3ζを含まないが、CD28の細胞内シグナルドメイン、CD137の細胞内シグナルドメインまたはこの両者の組み合わせを含む。
もう一つの好適な例において、前記の免疫細胞はさらにPD-1の発現を低下させるsiRNAまたはPD-L1を遮断するタンパク質を発現する。
もう一つの好適な例において、前記の免疫細胞はさらに安全スイッチを発現する。好ましくは、前記の安全スイッチは誘導性カスパーゼ9(iCaspase-9)、短縮型EGFR(Truancated EGFR)またはRQR8を含む。
もう一つの好適な例において、前記の免疫細胞は、T細胞、NK細胞またはNKT細胞を含む。
本発明のもう一つの側面では、前記の抗体と、それと結合(共役結合、カップリング、付着、吸着を含む)した、腫瘍表面マーカーを標的とする分子、腫瘍を抑制する分子、免疫細胞の表面マーカーを標的とする分子または検出可能な標識物から選択される機能性分子とを含む、多機能免疫複合体を提供する。
一つの好適な例において、前記の多機能免疫複合体では、前記の腫瘍表面マーカーを標的とする分子は腫瘍表面マーカーと結合する抗体または配位子であるか、前記の腫瘍を抑制する分子は抗腫瘍サイトカインまたは抗腫瘍毒素で、好ましくは、前記のサイトカインはIL-12、IL-15、IFN-β、TNF-αを含むが、これらに限定されない。
もう一つの好適な例において、前記の多機能免疫複合体では、前記の腫瘍表面マーカーと結合する抗体は、メソテリン以外のほかの抗原を認識する抗体で、前記のほかの抗原は、EGFR、EGFRvIII、メソテリン、HER2、EphA2、Her3、EpCAM、MUC1、MUC16、CEA、クローディン18.2、葉酸受容体、クローディン6、CD3、WT1、NY-ESO-1、MAGE 3、ASGPR1またはCDH16を含む。
もう一つの好適な例において、前記の多機能免疫複合体では、前記の免疫細胞の表面マーカーを標的とする分子は、T細胞の表面マーカーと結合する抗体であり、前記の抗体とT細胞が関与する二重機能抗体(Bispecific T cell engager、BiTE)を形成する。
もう一つの好適な例において、前記の抗CD3抗体は、一本鎖抗体(scFV)、モノクローナル抗体、Fab断片、Fd断片、Fv断片、F(ab’)2断片およびその誘導体、あるいはほかの形態の抗体で、好ましくは一本鎖抗体である。
もう一つの好適な例において、前記の抗CD3抗体はヒト化のもの、キメラのもの、完全ヒト由来のものまたはネズミ由来のものである。
もう一つの好適な例において、前記の多機能免疫複合体は融合ポリペプチドで、本発明に係る抗体およびそれと連結した機能性分子の間に、さらに連結ペプチド(リンカー)が含まれている。
もう一つの好適な例において、前記の多機能免疫複合体はポリペプチド投与または遺伝子投与の形態を使用する。
本発明のもう一つの側面では、前記の多機能免疫複合体をコードする核酸を提供する。
本発明のもう一つの側面では、
前記の抗体または当該抗体をコードする核酸、あるいは
前記の免疫複合体または当該複合体をコードする核酸、あるいは
前記のキメラ抗原受容体または当該キメラ抗原受容体をコードする核酸、あるいは
前記の遺伝子修飾された免疫細胞、
を含む医薬組成物(医薬または診断試薬を含む)を提供する。
本発明のもう一つの側面では、配列番号66で示されるメソテリンエピトープと結合する抗体を提供する。一つの好適な例において、配列番号72で示されるメソテリンエピトープと結合する抗体を提供する。
本発明の他の主旨は、本文の公開される内容によって、この分野の技術者にとっては明らかになっている。
本発明者らは、初期で多くの腫瘍特異的遺伝子を考察したところ、このような遺伝子のうち、相当な部分が一部の組織の正常細胞でも発現され、キメラ抗原受容体で修飾された免疫エフェクター細胞技術への応用が困難である。一部の腫瘍特異的遺伝子は優れた腫瘍特異的発現特性を有するが、それに基づいて設計されるCAR修飾免疫エフェクター細胞は腫瘍細胞に対する殺傷活性がないか活性が低く、これは当該標的が腫瘍細胞による免疫エフェクター細胞に対して抑制作用を果たす因子、たとえばPD-L1の分泌を引き起こすためかもしれない。
考察と選別を繰り返したところ、本発明者らは多くの候補分子からCARを設計する標的としてメソテリンを見つけた。本発明者らは、研究によって、メソテリン抗体に基づいて製造されたCAR修飾T細胞は確実に選択的にメソテリン陽性の腫瘍細胞を標的とし、かつ腫瘍細胞に対して強い細胞毒性を有することを証明した。本発明者らは、相応するCAR修飾免疫エフェクター細胞、特にT細胞は人体腫瘍の治療に使用することができると考える。
本発明者らは、完全ヒト由来抗体ライブラリーから選別してメソテリン結合性能が良好で遺伝子修飾された免疫エフェクター細胞の製造に適する特異的抗体を得、そしてその結合性能を発揮する重要なCDR領域を発見した。
本発明の抗体は完全な免疫グロブリン分子でもよく、抗原結合断片でもよく、Fab断片、Fd断片、Fv断片、F(ab')2断片、相補性決定領域(CDR)断片、一本鎖抗体(scFv)、ドメイン抗体、2価一本鎖抗体、一本鎖ファージ抗体、二重特異性二本鎖抗体、三本鎖抗体、四本鎖抗体を含むが、これらに限定されない。
本発明の抗体は様々な標的抗腫瘍薬および腫瘍の診断薬の製造、特にメソテリンを標的とする免疫エフェクター細胞の製造に使用することができる。
本発明は、免疫エフェクター細胞(免疫細胞)の表面に発現されるキメラ抗原受容体であって、順に連結した細胞外結合領域、膜貫通領域および細胞内シグナル領域を含み、中では、前記細胞外結合領域は本発明の抗体を含む受容体を提供する。当該キメラ抗原受容体を免疫エフェクター細胞の表面に発現させることによって、免疫エフェクター細胞がメソテリンを発現する腫瘍細胞に対して高度特異性の細胞毒性作用を有するようにすることができる。
本明細書で用いられるように、前記の「免疫細胞」と「免疫エフェクター細胞」は入れ替えて使用することができ、T細胞、NK細胞またはNKT細胞を含む。
本発明には、前記キメラ抗原受容体をコードする核酸も含まれる。本発明は、さらに、本発明と同じアミノ酸配列を有するポリペプチドまたはポリペプチドの断片、類似物および誘導体をコードする上記ポリヌクレオチドの変異体に関する。
本発明の抗体、CD8およびCD3ζ、
本発明の抗体、CD8、CD137およびCD3ζ、
本発明の抗体、CD28分子の膜貫通領域、CD28分子の細胞内シグナル領域およびCD3ζ、あるいは
本発明の抗体、CD28分子の膜貫通領域、CD28分子の細胞内シグナル領域、CD137およびCD3ζ、
のような順で連結することができる。
およびこれらの組み合わせ、ここで、関連キメラ抗原受容体タンパク質におけるCD28aはCD28分子の膜貫通領域を、CD28bはCD28分子の細胞内シグナル領域を表す。上記各キメラ抗原受容体はscFv(メソテリン)-CARと総称される。
本発明に係る免疫細胞は上記キメラ抗原受容体以外のもう1種類のキメラ抗原受容体を発現してもよいが、当該受容体はCD3ζを含まないが、CD28の細胞内シグナルドメイン、CD137の細胞内シグナルドメインまたはこの両者の組み合わせを含む。
本発明に係る免疫細胞はPD-1の発現を低下させるsiRNAまたはPD-L1を遮断するタンパク質を発現してもよい。当業者には、競合的にPD-L1とその受容体PD1の相互作用を遮断し、抗腫瘍T細胞反応の回復に有利であるため、腫瘍の生長を抑制することがわかる。
本発明に係る免疫細胞は安全スイッチを発現してもよい。好ましくは、前記の安全スイッチは誘導性カスパーゼ9(iCaspase-9)、短縮型EGFR(Truancated EGFR)またはRQR8を含む。
また、本発明は、本明細書に記載の抗体および少なくとも1つのほかの種類の機能性分子を含む多機能免疫複合体を提供する。前記の機能性分子は、腫瘍表面マーカーを標的とする分子、腫瘍を抑制する分子、免疫細胞の表面マーカーを標的とする分子または検出可能な標識物から選ばれる機能性分子とを含むが、これらに限定されない。前記抗体と前記機能性分子は共役結合、カップリング、付着、架橋などの形態で複合体を構成してもよい。
本発明の抗体、当該抗体を含む免疫複合体および遺伝子修飾された免疫細胞は医薬組成物または診断試薬の製造に使用することができる。前記の組成物は、有効量の前記抗体、免疫複合体または免疫細胞以外、薬学的に許容される担体を含んでもよい。用語「薬学的に允許される」とは、分子自体と組成物を適当に動物或いはヒトに投与する場合、不利な反応、アレルギー反応或いは他の不良反応が生じないことを指す。
1.1 プラスミドベクターの構築
本実施例で使用されたベクターシステムは、第三世代の自己不活性化レンチウイルスベクターシステムに属し、当該システムは計3つのプラスミド、すなわちタンパク質Gag/Pol、VSV-Gタンパク質をコードするパッケージングプラスミドPMD2.Gおよび空ベクターpPWT(Addgene社から購入)に基づいた目的遺伝子のヒトメソテリンの細胞外領域と膜貫通領域をコードする組換えベクターpWPT-MSLNを有する。
6〜10代目まで培養した293T細胞(ATCC:CRL-11268)を10 cmシャーレに6×106の密度で接種し、37℃、5% CO2で一晩培養し、トランスフェクションへの使用に備えた。培地は10%牛胎児血清(Sigma社)含有DMEM(Invitrogen社)で、翌日、トランスフェクションの約2時間前に、培養液を無血清DMEMに変えた。
1) 5 μgの目的遺伝子プラスミドpWPT-MSLNを、それぞれ7.5 μgのパッケージングプラスミドPAX2および2.5 μgのエンベローププラスミドpMD2.Gとともに500 μLのMillQ水に溶解させ、均一に混合した。
2) 62 μLの2.5M CaCl2(Sigma社)を一滴ずつ入れ、1200 rpm/minで均一に渦流混合した。
3) 最後に500 μLの 2×HBS(280mM NaCl、10mM KCl、1.5mM Na2HPO4-、12mMブドウ糖、50mM Hepes(Sigma 社)、pH 7.05、0.22 μMろ過除菌)を一滴ずつ入れ、1200 rpm/minで10s振とうして均一に混合した。
4) 直ちにシャーレに一滴ずつ入れ、軽く均一に振とうし、37℃、5% CO2で4〜6 h培養した後、10%牛胎児血清含有DMEMに変えた。
形質移入から48 hまたは72 h後、遠心で細胞破片を除去した後、0.45 μmフィルター(Millipore社)でろ過してウイルスを収集した。
上記収集されたウイルス液を濃縮して滴定した後、それぞれ6 cmの平皿に敷いたPANC-1細胞(ATCCから購入)に感染させた。感染3日後、細胞を収集し、一部を取ってクローンを混合し、細胞分解液で分解させた後、40 μgの細胞のタンパク質を取ってSDS-PAGEゲル電気泳動を行った後、電気泳動ゲルに対してイムノブロットを行い、かつマウス抗フラッグタグ抗体で染色した。PBSで洗浄した後、西洋ワサビペルオキシダーゼ標識ヒツジ抗マウス抗体でインキュベートし、洗浄後ECL試薬で呈色させ、最後に現像した。ウェスタンブロッティングの結果から、ヒトメソテリンMSLNに感染したPANC-1細胞(すなわちPANC-1-MSLN)では分子量の大きさが約38 kDaのバンドが検出され、未感染の空細胞では相応するバンドが検出されなかったことが示された。ほかの細胞を増幅培養した後、一部を冷凍保存し、そして次の実験に使用した。
Genbank登録番号NM_005823に準じ、ブリッジPCRに基づいた遺伝子合成方法を使用し、ヒトメソテリンの遺伝子断片(配列番号1の88〜942番目(ヌクレオチド)、配列番号12の30〜314番目(アミノ酸))を合成し、かつPCR増幅を行った。増幅産物をNheI/BglIIでプラスミドベクターpCMV-V5(当該ベクターはマルチクローニングサイトの下流に発現6Hisタグが融合され、上海鋭勁生物技術有限公司から購入)に挿入し、かつ宿主菌TOP10に形質転換し、クローンを選択してPCRで陽性クローンを同定して配列決定で確認し、組換え発現プラスミドそれぞれV5-MSLNを得た。
3.1 ファージディスプレイに基づいたヒトメソテリンと特異的に結合する抗体の選別
ファージディスプレイ技術によって、完全ヒト由来抗体ライブラリーからヒトメソテリン特異的抗体を選別した。この目的のために、400 mlの2×YT/アンピシリン培地にファージディスプレイ完全ヒト由来一本鎖抗体天然ライブラリーのグリセロールストック(上海鋭勁生物技術有限公司から購入)を接種し、細胞密度をOD600 = 0.1にし、37℃および200 rpmの条件で細胞密度がOD600 = 0.5になるように振とう培養した。 1012 pfuのM13KO7補助ファージ(Invitrogenから購入)で感染させ、30℃および50 rpmの条件で30分間培養した。50 mg/lのカナマイシンを入れた後、37℃および200 rpmの条件で30分間振とう培養した後、遠心(15分間、1600×g、4℃)で分離して沈殿させ、400 mlの2×YT/アンピシリン/カナマイシン培地に再懸濁させ、37℃および200 rpmの条件で16時間振とう培養した。最後に、細胞を遠心(20分間、5000×g、4℃)で分離して沈殿させてから除去し、上清を規格0.45 μmのろ膜でろ過した後、1/4体積20%(w/v)PEG8000、2.5 M NaCl溶液を入れて氷浴で1時間保温してファージ顆粒を沈殿させた。その後、遠心して沈殿させ(20分間、8000×g、4℃)、上清を捨て、ファージを25 mlの予め冷やしたPBS(137 mM NaCl、2.7 mM KCl、8 mM Na2HPO4、2 mM KH2PO4)に再懸濁させ、遠心した(5分間、20000×g、4℃)。上清液に1/4体積20%(w/v)PEG8000、2.5 M NaCl溶液を入れ、かつ氷浴で30分間ファージ顆粒を再沈殿させた。遠心して沈殿させ(30分間、20000×g、4℃)、再びファージ沈殿を2 mlの予め冷やしたPBSに再懸濁させ、氷上に30分間置いて遠心した(30分間、17000×g、4℃)。上清液を含4%(w/v)BSA含有PBS溶液と1:1で混合させ、回転混合器に置き、室温で30分間保温した後、そのまま選別に使用した。
4回目の選別で得られたクローンからランダムに96個を選択し、かつ単一ファージELISA(酵素結合免疫吸着実験)によってそのヒトメソテリンとの結合能力を分析した。この目的のために、96ウェルディープウェルプレートにおいて各単一集落を300 μlの2×YT/アンピシリン培地(2%ブドウ糖含有)に接種し、かつ37℃および250 rpmで16時間振とう培養した。20 μlの培養物を500 μlの2×YT/アンピシリン培地(0.1%ブドウ糖含有)に接種し、37℃および250 rpmで1.5時間振とう培養した。補助ファージ溶液を用意し、75 μlのM13KO7(力価:3×1012 pfu/ml)を取って15 mlの2×YT培地に混合し、50 μl/ウェルでプレートに入れた。37℃および150 rpmの条件で30分間培養した後、用意されたカナマイシン溶液を50 μl/ウェルで入れ(180 μlの50 mg/mlカナマイシンを取って、15 mlの2×YT培地に入れた)、37℃および250 rpmで16時間振とう培養した。最後に、細胞を遠心して沈殿させ(30分間、5000×g、4℃)、上清を新しい96ウェルディープウェルプレートに移した。
caggtacagctggaacagtcaggtctaggactggtgaagccctcgcagaccctctctctcacctgtgccatctccggggacactgtctctagcgacagtgctgcttggaactggatcaggcagtccccatcgagaggccttgagtggctgggaaggacatactacaggtccaagtggtttaatgattatgcagtatctgtgaaaggtcgaataaccatcaactcagacacatccaagaaccagttctccctgcagttgaactctgtgactcccgaggacacggctgtgtattattgtgcaagaagtaatagttactactactacgctatggacgtctggggccaaggcaccctggtcaccgtctcgagtggtggaggcggttcaggcggaggtggttctggcggtggcggatcgcaggctgtgctgactcagccgtcttccctctctgcatctcctggagcatcagccagtctcacctgcaccttgcgcagtggcatcaatgttggtatctacaggatatactggtaccaacagaggccagggagtcctccccagattctcctgacttacaaatcagactcagataagtaccagggctctggagtccccagtcgcttctctggatccaaagatgcttcggccaatgcagggattttactcatctctgggctccagtctgaagatgaggctgactattactgcatgatttggcacagcggcggttgggtgttcggcggagggaccaaggtcaccgtcctaggt
QVQLEQSGLGLVKPSQTLSLTCAISGDTVSSDSAAWNWIRQSPSRGLEWLGRTYYRSKWFNDYAVSVKGRITINSDTSKNQFSLQLNSVTPEDTAVYYCARSNSYYYYAMDVWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSQAVLTQPSSLSASPGASASLTCTLRSGINVGIYRIYWYQQRPGSPPQILLTYKSDSDKYQGSGVPSRFSGSKDASANAGILLISGLQSEDEADYYCMIWHSGGWVFGGGTKVTVLG
ここで、重鎖可変領域のアミノ酸配列は配列番号6のうちの1〜123番目で示され、その軽鎖可変領域のアミノ酸配列は配列番号6のうちの139〜254番目で示される。
cagatgcagctagtgcagtctggggctgaggtgaagaagcctggggcctcagtgaaggtttcctgcaaggcatctggatacaccttcaccagctactatatgcactgggtgcgacaggcccctggacaagggcttgagtggatgggaataatcaaccctagtggtggtagcacaagctacgcacagaagttccagggcagagtcaccatgaccagggacacgtccacgagcacagtctacatggagctgagcagcctgagatctgaggacacggccgtgtattactgtgcgagtagtcggagtgggactacggtggtaaatcatgatgcttttgatatctgggggaaagggaccacggtcaccgtctcgagtggtggaggcggttcaggcggaggtggttctggcggtggcggatcggacatccagttgacccagtctccatcctccctgtctgcgtctgtaggagacagagtcaccatcacttgccgggcaagccaggtcattagccgtgctttagcctggtatcaacaaacaccagggaaacctcctaaactcctgatctatgatgcctccaatttgcagagtggggtcccatcaaggttcagcggcagtggatctgggacagatttcactctcaccatcagccgcctgcagcctgaagattttgcaacttattactgtcaacagtttaatagttaccctctcactttcggcggagggaccaagctggagatcaaacgt
QMQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYYMHWVRQAPGQGLEWMGIINPSGGSTSYAQKFQGRVTMTRDTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCASSRSGTTVVNHDAFDIWGKGTTVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSDIQLTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQVISRALAWYQQTPGKPPKLLIYDASNLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISRLQPEDFATYYCQQFNSYPLTFGGGTKLEIKR
ここで、重鎖可変領域のアミノ酸配列は配列番号8のうちの1〜124番目で示され、その軽鎖可変領域のアミノ酸配列は配列番号8のうちの140〜247番目で示される。
4.1.ヒトメソテリン一本鎖抗体の製造
プライマー対のV5-P1A6E-F(配列番号9)およびV5-P1A6E-R(配列番号10)で得られたクローンからscFv-P1A6E断片を増幅し、プライマー対のV5-P3F2-F(配列番号11)およびV5-P3F2-R(配列番号12)でscFv-P3F2断片を増幅し、NheI/BamHIで二重酵素切断し、T4 DNAリガーゼで同様にNheI/BamHIで二重酵素切断されたベクタープラスミドpCMV-V5-Fc(当該ベクターはマルチクローニングサイトの下流にヒト抗体IgG1を発現するFc断片が融合され、以下V5-Fcと略し、上海鋭勁生物技術有限公司から購入)と連結し、かつ宿主菌TOP10に形質転換し、クローンを選択してPCRで陽性クローンを同定して配列決定で確認し、それぞれV5-scFv-P1A6E-FcおよびV5-scFv-P3F2-Fc真核発現プラスミドを得た。
配列番号10:TTGTCGGATCCACCTAGGACGGTGACC;
配列番号11:ACAGTGCTAGCACAGATGCAGCTAGTGC;
配列番号12:TTGTCGGATCCACGTTTGATCTCCAGC。
上記発現プラスミドをそれぞれ良好に生長するHEK-293F細胞に形質移入し、37℃、5%CO2、125rpmでシェーカーで7日連続培養し、4000rpmで10min遠心し、沈殿を除去し、上清を収集し、かつ0.45 μmろ膜でろ過し、処理されたサンプルをprotein A(GEから購入)親和カラムによって親和精製し、最終的に精製された抗体-Fc融合タンパク質としてscFv-P1A6E-FcおよびscFv-P3F2-Fcを得たが、同定結果を図3に示す。
本実施例において、モノクローナル抗体の発現は二プラスミド系を使用し、それぞれ抗体の重鎖可変領域の遺伝子をヒトIgG1 CH遺伝子を含むpIHプラスミドに、抗体の軽鎖可変領域の遺伝子をヒトIgG1 CL遺伝子を含むpIKプラスミドに構築した(プラスミドは上海鋭勁生物技術有限公司から購入)。
P7D4系列の抗体とヒトメソテリンの結合を定量的に分析するために、Biacore T200システム(GEから購入)で捕獲法によってそれぞれP1A6EとP3F2の一本鎖抗体およびモノクローナル抗体の親和性および動態学のパラメーターを測定した。メーカーの説明に従い、NHS/EDCカップリングで第1級アミノ基によって抗ヒトIgG(Fc)の抗体(GEから購入)をセンサーチップCM5のカルボキシメチルグルカンの表面にカップリングした。測定は25℃、30μl/min、 1×HBS-EP+使用緩衝液において行われ、再生条件は3 M MgCl2、10μl/minで30秒作用するものである。各測定サイクルにおいて、測定される抗体はまずチップに捕獲され、所定濃度の分析物(ヒトメソテリン)にチップの表面を通させ、SPRシグナルが発生するため、ヒトメソテリンと捕獲された抗体の相互作用が検出される。検出シグナルはレゾナンスユニット(RU)と定義され、時間(単位:秒)に対してプロットし、相応する結合曲線および解離曲線を得ることができた。別の測定サイクルにおいて、ヒトメソテリンの濃度はそれぞれ10nM、20nM、40nM、80nMおよび160nMであった。Biacore T200 evaluation softwareによって得られた作用曲線を評価し、かつ親和性のKD値を計算した。図5および図6はそれぞれモノクローナル抗体P1A6EとP3F2のBiacore親和性測定実験における動態学曲線を示す。P1A6EとP3F2の一本鎖抗体とモノクローナル抗体のそれぞれのヒトメソテリンに対する結合のデータを表1にまとめた。
蛍光活性化細胞選別装置(FACS) (Guava 8HT、Millipore社によって提供)によって抗体scFv-P1A6E-FcおよびscFv-P3F2-Fcのそれぞれの細胞表面のメソテリンとの結合能力を分析した。
1) 対数増殖期の細胞PANC-1-MSLNおよびPANC-1をそれぞれ6 cmシャーレに接種し、接種の細胞密度が約90%で、37℃のインキュベーターで一晩培養した。
2) 10 mMのEDTAで細胞を消化し、200 g×5 minで遠心して細胞を収集した。1×106〜1×107/mLの濃度で1%ウシ胎児血清含有リン酸塩緩衝液(NBS PBS)に再懸濁させ、100 μl/管の量でフローサイトメーター専用管に入れた。
3) 200 g×5 minで遠心し、上清を捨てた。
4) 2つの実験群はそれぞれ被験抗体P1A6EおよびP3F2を入れ、同時に2つの陽性対照群は抗体ssおよびC10(上海鋭勁生物技術有限公司から購入)を陽性対照として入れ、もう1つの対照群は抗体が入っていないPBSブランク対照である。各抗体の最終濃度はいずれも20 μg/mlで、各管に100ulずつ入れた。氷浴で45分間置いた。
5) 各管に1%NBS/PBSを2mlずつ入れ、200 g×5 minで遠心し、計二回行った。
6) 上清を捨て、1:100で希釈したヒツジ抗ヒト抗体-FITC(上海業力生物科技有限公司から)を各管に100 μlずつ入れた。氷浴で45分間置いた。
7) 各管に1%NBS/PBSを2mlずつ入れ、200 g×5 minで遠心し、計二回行った。
8) 上清を捨て、300 μlの1%NBS PBSに最懸濁させ、フローサイトメーターで検出した。
9) フローサイトメーターのデータ解析ソフトFlowjo7.6でデータを解析した。
キメラ抗原受容体を構築し、本発明で例示されたキメラ抗原受容体の各部分の連結順は表2に示す。
(2) 目的CAR断片の獲得:それぞれ前記で得られたV5-scFv- P1A6E -FcおよびV5-scFv- P3F2-Fcを鋳型として利用し、プライマーP1A6E-F(配列番号27、5’-ctcctgccgctggccttgctgctccacgccgccaggccgcaggtacagc tggaaca-3’)およびプライマーの配列番号28のP1A6E-R(5’-gcggcgctggcgtcgtggtacctaggacggtgacc-3’)、プライマーP3F2-F (配列番号29、5’ ctcctgccgctggccttgctgctccacgccgccaggccgcagatgcagctagt gca-3’)およびP3F2-R (配列番号30、5’ gcggcgctggcgtcgtggtacgtttgatctccag-3’)で、目的CAR断片のP1A6E部分およびP3F2部分を増幅した。
(3) PCRによるCARの第一世代、第二世代、第三世代の共有配列および陰性対照配列の獲得:それぞれ特許201310164725.XにおけるpWPT-eGFP-F2A-GPC3-δZ、 pWPT-eGFP-F2A-GPC3-Z、pWPT-eGFP-F2A-GPC3-28Z、pWPT-eGFP-F2A-GPC3-28BBZを鋳型とし、プライマーHF(配列番号63、5’ accacgacgccagcgccgcgaccac)およびプライマーpwpxlR(配列番号64、5’- tagcgtaaaaggagcaacatag)で、それぞれ断片CD8-CD3δ ゼータ(δZ)、CD8-CD3 ゼータ(Z)、CD28a-CD28b-CD3 ゼータ(28Z)およびCD28a-CD28b-CD137-CD3 ゼータ(28BBZ)の配列を得た。
(4) 特許US 8,911,993 B2(COMPOSITIONS FOR TREATMENT OF CANCER)におけるBBZ配列を参照し、ブリッジPCRに基づいた遺伝子合成方法を使用し、共有配列CD8-CD137-CD3 ゼータ(BBZ)断片の部分を合成した。
P1A6E-δZ (配列番号31)、
P1A6E-Z (配列番号32)、
P1A6E-BBZ (配列番号33)、
P1A6E-28Z (配列番号34)、
P1A6E-28BBZ (配列番号35)、
P3F2-δZ (配列番号36)、
P3F2-Z (配列番号37)、
P3F2-BBZ (配列番号38)、
P3F2-28Z (配列番号39)、
P3F2-28BBZ (配列番号40)という。
得られた各目的CARを含有するベクターは以下の通りである。
pRRLSIN-EF1α-P1A6E-δZ、
pRRLSIN-EF1α-P1A6E-Z、
pRRLSIN-EF1α-P1A6E-BBZ、
pRRLSIN-EF1α-P1A6E-28Z、
pRRLSIN-EF1α-P1A6E-28BBZ、
pRRLSIN-EF1α- P3F2-δZ、
pRRLSIN-EF1α- P3F2-Z、
pRRLSIN-EF1α- P3F2-BBZ、
pRRLSIN-EF1α- P3F2-28Z、
pRRLSIN-EF1α- P3F2-28BB。
以上の構築によって、それぞれ10のCARポリペプチド配列を得たが、
P1A6E-δZ (配列番号41)、
P1A6E-Z (配列番号42)、
P1A6E-BBZ (配列番号43)、
P1A6E-28Z (配列番号44)、
P1A6E-28BBZ (配列番号45)、
P3F2-δZ (配列番号46)、
P3F2-Z (配列番号47)、
P3F2-BBZ (配列番号48)、
P3F2-28Z (配列番号49)、
P3F2-28BBZ (配列番号50)という。
6〜10代目まで培養したHEK-293T細胞(ATCC:CRL-11268)を10 cmシャーレに6×106の密度で接種し、37℃、5% CO2で一晩培養し、形質移入への使用に備えた。培地は10%牛胎児血清含有DMEMである。
形質移入の手順は以下の通りである。
A液の調製:10 μgの目的遺伝子プラスミドpRRLSIN-cPPT.EF-1α-CAR (pRRLSIN-EF1α-P1A6E-δZ 、pRRLSIN-EF1α-P1A6E-Z、pRRLSIN-EF1α-P1A6E-BBZ、pRRLSIN-EF1α-P1A6E-28Z、pRRLSIN-EF1α-P1A6E-28BBZ;pRRLSIN-EF1α- P3F2-Z、pRRLSIN-EF1α- P3F2-BBZ、pRRLSIN-EF1α- P3F2-28Z、pRRLSIN-EF1α- P3F2-28BBZから選ばれる)を、それぞれ7.5 μgのパッケージングプラスミドpMDLg RREとpRSV-REV、および3 μgのエンベローププラスミドpCMV-VSV-Gとともに、800 μLの無血清DMEM培養液に溶解させ、均一に混合した。
B液の調製:60μgのPEI(ポリエチレンイミン、Polysciencesから購入)を800μLの無血清DMEM培養液に溶解させ、軽く均一に混合し、室温で5minインキュベートした。
1.6mLの形質移入複合体をHEK-293T細胞に滴下し、4〜5時間後、2%FBSのDMEM培地で形質移入の293T細胞の液置換を行った。
形質移入から72 h後、0.45 μmのフィルターでろ過してウイルスを収集し、その後Beckman Optima L-100XP超遠心機で28000 rpm、4℃で2時間遠心し、遠心上清を捨て、遠心で得られた沈殿を原液体積の1/10〜1/50のAIM-V培養液(Invitrogen社から購入)で再懸濁させ、100 μL/管で分注して-80℃で凍結保存し、ウイルスの滴定またはT細胞への感染に備えた。
健常者の末梢血から密度勾配遠心法によりヒト末梢血単核球(上海市血液センターから提供)を得、末梢血単核球からCTL細胞磁気ビーズ(Stem Cell Technologiesから購入)ネガティブ分離方法によってCTLを得、分離されたCTL細胞に対してフローサイトメトリーによってCTL細胞の純度を検出し、CTL細胞の陽性率≧95%のものが好適で、次の操作に進めた。Quantum 007リンパ球培地液(PAA社から購入)を約1×106/mLの密度で入れて培養し、且つ細胞:磁気ビーズの比率が1:1になるように抗CD3およびCD28抗体の両者で覆われた磁気ビーズ(Invitrogen社)と、最終濃度300 U/mLの組換えヒトIL-2(上海華新生物高技術有限公司から購入)を入れ、24 h刺激培養した。その後、MOI≒5になるように上記組換えレンチウイルスでCTLに感染させた。感染された細胞を一日おきに5×105/mLの密度で継代するとともに、リンパ球培養液に最終濃度300 U/mLの組換えヒトIL-2を追加した。
体外毒性実験で使用された材料は以下の通りである。
表4に示されたメソテリン陰性膵臓がん細胞系(PANC-1)およびメソテリン遺伝子を形質移入されたPANC-1(PANC-1-MSLN)細胞系を標的細胞とし、エフェクター細胞は実施例4で検証された体外で12日間培養され、FACSによってキメラ抗原受容体の発現が検出された陽性細胞をキメラ抗原受容体陽性(CAR+)のCTLと記し、エフェクター細胞対標的細胞比は場合によってそれぞれ3:1、1:1および1:3とし、標的細胞数は10000個/ウェルとし、異なるエフェクター細胞対標的細胞比でエフェクター細胞を対応させた。各群ではいずれも重複ウェルを5つとし、5つの重複ウェルの平均値を取った。検出時間は18hであった。
各実験群:各標的細胞+異なるキメラ抗原受容体を発現するCTL。
コントロール群1:標的細胞最大放出LDH。
コントロール群2:標的細胞自発放出LDH。
対照群3:LDH自発放出のエフェクター細胞。
検出方法:CytoTox 96非放射性細胞毒性検出キット(Promega社)で行われた。当該方法は比色法に基づいた検出方法で、51Cr放出法の代わりとして使用することができる。CytoTox 96R検出で定量的に乳酸脱水素酵素(LDH)を測定した。LDHは安定した細胞質酵素で、細胞が溶解する時に放出され、その放出形態は放射性解析における51Crの放出形態と基本的に同様である。放出されたLDH培地上清において、30分間カップリングする酵素反応によって検出することができ、酵素反応においてLDHは一種のテトラゾリド(INT)を赤色のホルマザン(formazan)に変換させることができる。生成した赤色産物の量は分解した細胞数に正比例した。具体的には、CytoTox 96非放射性細胞毒性検出キットの取扱説明書を参照する。
PCRによって配列番号1からヒトメソテリン遺伝子断片を増幅し、NheI/BamHIで二重酵素切断し、ヒトメソテリン遺伝子断片をネズミFc断片を含有する真核発現ベクターpCMV-V5-muFcに連結した。実施例4を参照してHEK-293F細胞に一過性形質移入を行い、細胞培養上清を処理した後protein G(GEから購入)親和カラムによって親和精製し、最終的に精製されたヒトメソテリン断片-muFc融合タンパク質を得た後、ELISAによって抗体scFv-P1A6E-FcおよびscFv- P3F2-Fcの結合を同定した。Genbank登録番号NP_001170826.1(配列番号65)を参照し、成熟のヒトメソテリンを領域R1(E296-T390、配列番号66)、領域R2(S391-Q486、配列番号67)、領域R3(N487-G581、配列番号68)と3つの領域に分け、ELISA結果から抗体scFv-P1A6E-FcおよびscFv- P3F2-Fcのいずれも領域1(E296-T390)だけと結合したことが示された。さらに領域1を5つの小さい断片に分け、それぞれmuFcと融合発現させた。領域R1A(296E-337D、配列番号69)、領域R1B(328D-369I、配列番号70)、領域R1C(360Y-405T、配列番号71)、領域R1AB(296E-359L、配列番号72)、R1BC(328D-405T、配列番号73)。ELISA結果は図9および図10に示すように、中では、抗体scFv-P1A6E-FcおよびscFv- P3F2-Fcは領域R1ABと顕著な結合があり、領域R1Aと弱い結合があり、領域R1Bと結合しなかった。
Claims (37)
- 特異的にメソテリンと結合する完全ヒト抗体であって、
(a) 配列番号54で示されるアミノ酸配列を含むCDR1、配列番号55で示されるアミノ酸配列を含むCDR2、配列番号56で示されるアミノ酸配列を含むCDR3を有する重鎖可変領域を含む抗体、
(b) 配列番号51で示されるアミノ酸配列を含むCDR1、配列番号52で示されるアミノ酸配列を含むCDR2、配列番号53で示されるアミノ酸配列を含むCDR3を有する軽鎖可変領域を含む抗体、
(c) (a)に記載の抗体の重鎖可変領域および(b)に記載の抗体の軽鎖可変領域を含む抗体、
(d) 配列番号60で示されるアミノ酸配列を含むCDR1、配列番号61で示されるアミノ酸配列を含むCDR2、配列番号62で示されるアミノ酸配列を含むCDR3を有する重鎖可変領域を含む抗体、
(e) 配列番号57で示されるアミノ酸配列を含むCDR1、配列番号58で示されるアミノ酸配列を含むCDR2、配列番号59で示されるアミノ酸配列を含むCDR3を有する軽鎖可変領域を含む抗体、
(f) (d)に記載の抗体の重鎖可変領域および(e)に記載の抗体の軽鎖可変領域を含む抗体、
(g) (a)〜(f)のうちいずれか1つに記載の抗体によって認識される抗原決定基と同様の抗原決定基を認識する抗体
からなる群から選択される、前記完全ヒト抗体。 - 完全ヒト抗体が、重鎖可変領域および軽鎖可変領域を含み、
重鎖可変領域のアミノ酸配列が、配列番号6の1〜123番目で示され、および軽鎖可変領域のアミノ酸配列が、配列番号6の139〜254番目で示されるか、または
重鎖可変領域のアミノ酸配列が、配列番号8の1〜124番目で示され、および軽鎖可変領域のアミノ酸配列が、配列番号8の140〜247番目で示される、
請求項1に記載の完全ヒト抗体。 - 請求項1または2に記載の抗体をコードする、核酸。
- 請求項3に記載の核酸を含む、発現ベクター。
- 請求項4に記載の発現ベクターを含むか、または請求項3に記載の核酸がゲノム中に組み込まれた、宿主細胞。
- メソテリンを発現する腫瘍細胞を特異的に標的とする標的薬物、抗体薬物抱合体または多機能抗体の製造における、または
メソテリンを発現する腫瘍を診断するための試薬の製造における、または
キメラ抗原受容体で修飾された免疫細胞の製造における、
請求項1または2に記載の抗体の使用。 - 請求項1または2に記載の抗体、膜貫通領域および細胞内シグナル領域がこの順に連結されたものを含む、キメラ抗原受容体。
- 細胞内シグナル領域が、CD3ζ、FcεRIγ、CD27、CD28、CD137、CD134、MyD88、CD40の細胞内シグナル領域からなる群から選択されるか、またはこれらの組み合わせである、請求項7に記載のキメラ抗原受容体。
- 膜貫通領域が、CD8またはCD28の膜貫通領域を含む、請求項7に記載のキメラ抗原受容体。
- 1キメラ抗原受容体が、以下の抗体、膜貫通領域および細胞内シグナル領域がこの順で結合したもの:
請求項1または2に記載の抗体、CD8およびCD3ζ、
請求項1または2に記載の抗体、CD8、CD137およびCD3ζ、
請求項1または2に記載の抗体、CD28分子の膜貫通領域、CD28分子の細胞内シグナル領域およびCD3ζ、あるいは
請求項1または2に記載の抗体、CD28分子の膜貫通領域、CD28分子の細胞内シグナル領域、CD137およびCD3ζ、
を含む、請求項7に記載のキメラ抗原受容体。 - 1抗体が、一本鎖抗体またはドメイン抗体である、請求項7に記載のキメラ抗原受容体。
- キメラ抗原受容体が、
配列番号41、またはその22〜353番目に示されるアミノ酸配列、
配列番号42、またはその22〜454番目に示されるアミノ酸配列、
配列番号43、またはその22〜498番目に示されるアミノ酸配列、
配列番号44、またはその22〜501番目に示されるアミノ酸配列、
配列番号45、またはその22〜543番目に示されるアミノ酸配列、
配列番号46、またはその22〜346番目に示されるアミノ酸配列、
配列番号47、またはその22〜447番目に示されるアミノ酸配列、
配列番号48、またはその22〜491番目に示されるアミノ酸配列、
配列番号49、またはその22〜494番目に示されるアミノ酸配列、あるいは
配列番号50、またはその22〜536番目に示されるアミノ酸配列
を有する、請求項7に記載のキメラ抗原受容体。 - 1請求項7〜12のいずれか一項に記載のキメラ抗原受容体をコードする、核酸。
別の好適な例において、前記のキメラ抗原受容体をコードする核酸は、
配列番号31、またはその473〜1468番目に示されるヌクレオチド配列、
配列番号32、またはその473〜1771番目に示されるヌクレオチド配列、
配列番号33、またはその473〜1903番目に示されるヌクレオチド配列、
配列番号34、またはその473〜1912番目に示されるヌクレオチド配列、
配列番号35、またはその473〜2038番目に示されるヌクレオチド配列、
配列番号36、またはその473〜1447番目に示されるヌクレオチド配列、
配列番号37、またはその473〜1750番目に示されるヌクレオチド配列、
配列番号38、またはその473〜1882番目に示されるヌクレオチド配列、
配列番号39、またはその473〜1891番目に示されるヌクレオチド配列、
配列番号40、またはその473〜2017番目に示されるヌクレオチド配列
を有する。 - 請求項13に記載の核酸を含む、発現ベクター。
- 請求項14に記載のベクターを含む、ウイルス。
- メソテリンを発現する腫瘍細胞を標的とする遺伝子修飾された免疫細胞の製造における、請求項7〜12のいずれか一項に記載のキメラ抗原受容体、または請求項13に記載の核酸、または請求項14に記載の発現ベクター、または請求項15に記載のウイルスの使用。
- メソテリンを発現する腫瘍が、膵臓がん、卵巣がん、胸腺中皮腫を含む、請求項16に記載のキメラ抗原受容体。
- 請求項13に記載の核酸、または請求項14に記載の発現ベクターまたは請求項15に記載のウイルスが形質導入されているか、または
表面に請求項7〜12のいずれか一項に記載のキメラ抗原受容体がその表面に発現されている、遺伝子修飾された免疫細胞。 - 外因性サイトカインのコード配列をさらに担持し、好ましくは前記サイトカインが、IL-12、IL-15またはIL-21を含む、請求項18に記載の免疫細胞。
- 別のキメラ抗原受容体をも発現し、前記受容体が、CD3ζは含まないが、CD28の細胞内シグナルドメイン、CD137の細胞内シグナルドメインまたはこの両者の組み合わせを含む、請求項18に記載の免疫細胞。
- ケモカイン受容体をさらに発現し、好ましくは、前記ケモカイン受容体が、CCR2を含む、請求項18に記載の免疫細胞。
- PD-1の発現を低下させるsiRNAまたはPD-L1を遮断するタンパク質をさらに発現する、請求項18に記載の免疫細胞。
- 安全スイッチをさらに発現し、好ましくは、前記安全スイッチが、誘導性カスパーゼ9、短縮型EGFRまたはRQR8を含む、請求項18に記載の免疫細胞。
- 免疫細胞が、T細胞、NK細胞またはNKT細胞を含む、請求項18に記載の免疫細胞。
- 腫瘍を阻害する薬物の製造における、請求項18〜24のいずれか一項に記載の遺伝子修飾された免疫細胞の使用であって、前記腫瘍が、メソテリンを発現する腫瘍である、前記使用。
- 請求項1または2に記載の抗体、および
それと連結した機能性分子
を含む多機能免疫複合体であって、
前記機能性分子が、腫瘍表面マーカーを標的とする分子、腫瘍を抑制する分子、免疫細胞の表面マーカーを標的とする分子、または検出可能な標識物から選択される、前記多機能免疫複合体。 - 腫瘍表面マーカーを標的とする分子が、腫瘍表面マーカーと結合する抗体または配位子であるか、または
腫瘍を抑制する分子が、抗腫瘍サイトカインまたは抗腫瘍毒素であり、好ましくは、前記サイトカインが、IL-12、IL-15、IFN-β、TNF-αを含む、請求項26に記載の多機能免疫複合体。 - 検出可能な標識物が、蛍光標識物、呈色標識物を含む、請求項26に記載の多機能免疫複合体。
- 腫瘍表面マーカーと結合する抗体が、メソテリン以外の抗原を認識する抗体を指し、前記抗原が、EGFR、EGFRvIII、メソテリン、HER2、EphA2、Her3、EpCAM、MUC1、MUC16、CEA、クローディン18.2、葉酸受容体、クローディン6、CD3、WT1、NY-ESO-1、MAGE 3、ASGPR1またはCDH16を含む、請求項27に記載の多機能免疫複合体。
- 免疫細胞の表面マーカーを標的とする分子が、T細胞の表面マーカーと結合する抗体であり、T細胞を結合させる二重機能抗体を請求項1または2に記載の抗体とともに形成する、請求項26に記載の多機能免疫複合体。
- T細胞の表面マーカーと結合する抗体が、抗CD3抗体である、請求項30に記載の多機能免疫複合体。
- 融合ポリペプチドであり、請求項1または2に記載の抗体とそれと連結した機能性分子との間に連結ペプチドをさらに含む、請求項31に記載の多機能免疫複合体。
- 請求項26〜32のいずれか一項に記載の多機能免疫複合体をコードする、核酸。
- であって、
抗腫瘍薬、またははメソテリンを発現する腫瘍を診断する薬剤の製造における、あるいは
キメラ抗原受容体で修飾された免疫細胞の製造における、
請求項26〜32のいずれか一項に記載の多機能免疫複合体の使用であって、好ましくは、前記免疫細胞が、T細胞、NK細胞またはNKT細胞を含む、前記使用。 - 請求項1または2に記載の抗体または前記抗体をコードする核酸、あるいは
請求項26〜32のいずれか一項に記載の免疫複合体または前記複合体をコードする核酸、あるいは
請求項7〜12のいずれか一項に記載のキメラ抗原受容体または前記キメラ抗原受容体をコードする核酸、あるいは
請求項18〜24のいずれか一項に記載の遺伝子修飾された免疫細胞
を含む、医薬組成物。 - 請求項1または2に記載の抗体と競合してメソテリンに結合することが可能な抗体。
- 配列番号66に示されるメソテリンエピトープと結合することが可能な抗体であり、好ましくは、前記抗体が、配列番号72に示されるメソテリンエピトープと結合し得る、前記抗体。
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