CN101589150A - 病毒载体及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及在编码Semliki森林病毒(SFV)复制酶的亚基nsp2的核苷酸序列中含有SFV突变的复制子的病毒载体。所述病毒载体可用于产生能够组成型地表达目的异源产物的稳定细胞系。

Description

病毒载体及其应用

发明领域

本发明属于基因工程领域。本发明特别涉及突变的病毒载体及其应用，特别是在体外产生稳定的细胞系和以组成型方式产生蛋白方面的应用。

发明背景

已从包括辛德毕斯病毒(SIN)(34)、Semliki森林病毒(SFV)(18)以及委内瑞拉马脑炎病毒(VEE)(25)的不同病毒研发了α病毒(alphavirus)表达载体。α病毒载体通常基于RNA复制子，在该复制子中结构基因已经被异源基因替换。

α病毒复制子在其5’末端含有编码病毒复制酶(Rep)的ORF，当RNA被转染到真核细胞时，该ORF得到翻译。Rep以多蛋白(polyprotein)表达，其随后被加工成4个亚基(nsps 1-4)(30)。未加工的Rep可以以负链RNA复制RNA载体，该过程仅发生于转染或感染后的头3-4小时内。一旦得以加工，Rep将利用负链RNA作为模板合成更多复制子分子。加工后的Rep也可以识别负链RNA中的内部序列或亚基因组启动子(subgenomicpromoter)，由所述内部序列或亚基因组启动子，其将合成对应于复制子3’末端的亚基因组正链RNA。这种亚基因组RNA将被翻译，产生大量异源蛋白。通过用可提供反式病毒结构蛋白的一种或多种辅助RNA共转染细胞(2，4，8，25，29)，或通过利用稳定包装的细胞系(24)，也可以将复制子RNA包装成病毒颗粒。

由于还未完全了解的机制，α病毒载体的复制在大多数哺乳动物细胞中是致细胞病变的(3，9，13)。这些载体诱发的致细胞病变效应受不依赖p53的细胞凋亡的介导，并且通常发生于转染或感染后48小时至72小时。据怀疑，nsp2，病毒复制酶的4个组分之一，可能在凋亡诱导中起重要作用(11，12)。

致细胞病变的α病毒载体已经用于一系列的应用中，包括体外蛋白的产生和表征(33)，以及用于有关接种的研究和癌症的基因治疗中(19，26)。然而，此类野生型病毒的重要缺陷在于，它们不能用于期望转基因长久表达的应用中。

为了克服这个缺陷，几个小组已经鉴定了α病毒复制酶中可将这些致细胞病变的病毒载体转变为非致细胞病变的病毒载体的一系列突变，从而使病毒载体表达的重组产物可以更长久地表达。这些研究已经产生了衍生于SIN(7，22)、SFV(20-22)且更近期衍生于VEE和EEE(东部马脑炎病毒)(23)的非致细胞病变载体。

已经将在α病毒中检测到的大多数非致细胞病变突变定位于Rep亚基nsp2中。这种蛋白含有位于氨基末端的解旋酶结构域和位于羧基末端的蛋白水解结构域，后者与Rep的四个亚基的加工有关(30)。已经证明，所述nsp2的非致细胞病变突变影响nsp2的蛋白水解结构域，或者影响接近nsp1/2或nsp2/3之间切割位点的位置，从而改变Rep的加工。

在SIN中分离的非致细胞病变突变体，在nsp2的位置726处含有单氨基酸变化(用P换L)(nsp2的P726L SIN载体)，这表现出Rep的超加工(hyperprocessing)(7)。这种突变体能够在BHK细胞中有效地连续复制。在这种突变体的相同位置引入不同的氨基酸变化表明，在RNA复制水平和载体的致细胞病变性之间存在强正相关性。这种非致细胞病变SIN载体已经在体外广泛利用，因为它可以提供长久的具有良好稳定水平的转基因表达，而其表达水平为用(野生型(wt))原始SIN载体所获得的表达水平的约4％(1)。然而，尽管所述载体是非致细胞病变的，但缺少产生具有高表达水平的稳定细胞系的能力。事实上，在用携带LacZ基因的P726LSIN载体产生的细胞系中，传代5代后，45％的转染细胞丧失了转基因表达，且表达的稳定性仅通过选择个体克隆实现(1)，这不可忽视地延迟了获得大量可有效表达转基因的细胞。即便如此，这些细胞系维持了低表达水平(为用wt SIN载体获得的水平的4％)。

此外，已经描述了在亚基nsp2中含有突变P718T和R649H(R649H/p718T)、表达嘌呤霉素抗性pac基因的非致细胞病变SFV载体，尽管其产生高表达的稳定细胞系的能力尚未记载(Smerdou，C.et al.2004.Seventh International Symposium on Positive Strand RNA Viruses(第7次正链RNA病毒国际讨论会)，S.Franciso，USA)。

对于Perri等(22)描述的非致细胞病变的SFV突变体，包括突变体SF2A(nsp2中的突变L10T)和SF2C(nsp2中的突变L713P)，以及

等(21)描述的双突变体PD(nsp2中的S259P和R650D)，事实是，它们可以表达与野生型病毒相似的、甚至高于野生型病毒的蛋白水平(突变体PD)，但是，在所有的情况下，这些突变体仍然是致细胞病变的(参阅本说明书的实施例8)，并且尚未记载基于所述病毒载体产生表达异源蛋白的稳定细胞系。与SFV-PD载体致细胞病变的作用相关的数据还受到

等(20)随后所公布结果的支持，所述结果表明，在感染了携带LacZ或GFP作为标志物基因的SFV-PD载体的BHK细胞中，β-gal或GFP的表达如何在48小时后达到最大值，并且稍后在接下来的3-4天内显著降低，这表明，致细胞病变作用发生于细胞内(参阅所提到的参考文献的图2)。

因此，尽管已经描述了编码α病毒SIN和SFV的nsp2蛋白的基因中的点突变体，并且尽管这些突变体的致细胞病变性已经降低，但是没有一个所述突变体表现出产生具有高表达水平的稳定细胞系的能力。

因此，仍然需要研发可替换的非致细胞病变病毒α病毒载体，用于产生稳定的细胞系，所述细胞系在选择存在的情况下能稳定地产生异源蛋白。

发明概述

α病毒载体可在不同类型的细胞中表达高重组蛋白水平。然而，这种表达由于病毒复制的致细胞病变特性是瞬时的。为了使这些载体适应长期研究，已经分离了辛德毕斯病毒(SIN)、Semliki森林病毒(SFV)以及委内瑞拉马脑炎病毒(VEE)的非致细胞病变突变体。这些突变体中的大多数含有在nsp2中的变化，而nsp2是病毒复制酶的亚基。

为了产生新的非致细胞病变SFV载体，已将所述用于产生非致细胞病变SIN载体的突变引入SFV中的保守位置。足以好奇的是，发现在nsp2中含有突变P718T并携带LacZ基因作为异源基因的SFV复制子(SFV-LacZ)产生非致细胞病变变体，所述变体形成在没有施加选择下表达β-半乳糖苷酶(β-gal)的集落，尽管事实上它显然不能在这些细胞中的大多数中复制。建立的假设是非致细胞病变变体是由于次级适应性突变(secondary adaptive mutations)。为了分离这些变体，将嘌呤霉素N-乙酰基转移酶(pac)基因(选择基因)导入突变体SFV-P718T中，并且选择嘌呤霉素抗性的BHK细胞克隆。从一个所选择的克隆中，拯救含有nsp2核定位信号中的另一突变、具体地突变R649H的非致细胞病变复制子。这种双突变体，在本说明书中鉴定为SFV-S2-9，在nsp2中含有突变R649H和P718T，以比野生型SFV载体低60倍的水平复制，该事实与用在nsp2中含有双突变R649H/P718T的SFV载体转染的细胞中的致细胞病变性的缺失有关。在用SFV-S2-9-LacZ和SFV-LacZ转染后24小时的转染细胞中观察到相似的β-gal表达水平，该水平的范围为约15pg/细胞(图6)。

足以令人惊讶的是，基于在nsp2中含有双突变R649H/P718T的所述双SFV突变体(SFV-S2-9)的非致细胞病变病毒载体，能产生稳定的细胞系，该细胞系在培养的至少10代中能表达β-gal(在每一代中通过X-gal染色测定的表达β-gal细胞的百分比，根据传代在70％至90％变动，但在第10代，高于85％，这表明在选择存在时，转基因表达的极好稳定性，这可从图7中观察到)，而且是组成型表达，因为其在转染了SFV-S2-9-LacZ的细胞中随着时间而增加，在转染后48小时，稳定在约30pg β-gal/细胞。换句话说，通过用非致细胞病变的双突变体SFV载体(R649H/P718T)转染，表达在数量上达到了当用野生型SFV载体转染细胞24小时后所实现的表达的2倍。

所述非致细胞病变双突变体SFV载体(R649H/P718T)也能产生能组成型地表达目的异源蛋白如大鼠心脏营养素-1(rCT)和人胰岛素样生长因子(IGF-I)的稳定的细胞系，其表达水平与用野生型SFV载体获得的水平相似。

实际上，所述双突变体SFV载体(R649H/P718T)能产生能以与用野生型SFV载体获得的水平相似的水平组成型地表达rCT的稳定的细胞系，所述水平为约4.3pg/细胞(实施例9)。尽管在所分析的细胞系中观察到载体的高稳定性，但在由2个独立的亚基因组启动子表达rCT和pac的细胞系中，观察到较用LacZ基因低的稳定性，rCT的表达从第6代开始减少，到第11代时基本上消失(图16)。然而，利用编码口蹄疫病毒(FMDV)自身蛋白酶2A的核苷酸序列作为连接子(linker)而融合的rCT和pac基因可产生稳定的细胞系，其中rCT的表达稳定性在无变异的情况下保持至少10代(图17)。

同样，所述双突变体SFV载体(R649H/P718T)也能产生能以用野生型SFV载体获得的水平相当的水平表达IGF-I的稳定的细胞系(图19)，所述水平为约50pg/细胞(实施例10)。由2个独立亚基因组启动子表达IGF-I和pac的细胞系表现出多少低于野生型SFV载体的IGF-I表达水平(在第1代中低约2倍)，还表现出比用LacZ基因更低的稳定性，表达从第5代开始降低，且在第1代至第10代降低了约80倍(图20)。利用编码FMDV自身蛋白酶2A的核苷酸序列作为连接子而融合pac和IGF-I基因可产生稳定的细胞系，在该细胞系中，第1代中IGF-I的表达更接近野生型SFV载体的表达，且在该细胞系中，IGF-I表达的稳定性仅具有小量变化，直到第10代(在第10代中，仅比第一代中所观察到的稳定性低4倍)(图20)。

另外，如实施例8所能证实的，本发明克服了现有技术中已确立的偏见，因为其证明，现有技术中存在且限定为非致细胞病变的突变的SFV载体保持致细胞病变性特征。

如本发明所述，术语“稳定细胞系”指这样的细胞系，即在该细胞系中，在第10代表达异源产物(如肽或异源蛋白等)的细胞的百分比高于85％，所述的百分比能在连续或随后的传代中得以维持或超越。

如本文所用，术语“组成型表达”指令人足够惊讶地，上述稳定细胞系所具有的其他能力，从而以在数量上的高水平(高于当用野生型载体转导细胞时，转导后24小时获得的表达水平的50％)表达异源产物。

同样，如现有技术所知的，“RNA复制子”是利用互补RNA作为中间体单式复制的核苷酸序列，所述中间体可用作产生更多原始RNA分子的模板。为此目的，在RNA末端的特异性序列通常是必须的。本发明提供的病毒载体中包含的复制子，含有SFV复制所需的5’末端、编码在nsp2区域具有突变P718T和R649H的SFV复制酶的序列、至少一个病毒SFV亚基因组启动子、含有选择基因的多核苷酸、含有编码目的异源产物的核苷酸序列的多核苷酸以及含有聚腺嘌呤(Poly A)末端序列的、SFV复制所需的3’末端。在特定实施方案中，将含有选择基因的所述多核苷酸以及所述含有编码目的异源产物的核苷酸序列的多核苷酸置于2个独立的亚基因组启动子的下游，并可操作地连接于所述启动子(即，将一个所述多核苷酸置于亚基因组启动子的下游并可操作地与之连接，而将另一个多核苷酸置于另一个亚基因组启动子的下游并与之可操作连接)。在另一个特定的实施方案中，将所述含有选择基因的多核苷酸以及所述含有编码目的异源产物的核苷酸序列的多核苷酸有利地通过含有编码翻译后蛋白水解切割位点(有利的翻译后自身蛋白水解切割位点)的核苷酸序列的多核苷酸彼此融合，并放置于单个亚基因组启动子的下游并可操作地与之连接。

因此，本发明一方面涉及含有Semliki森林病毒(SFV)复制子的病毒载体(本发明的病毒载体)，其中所述复制子含有(i)编码在nsp2亚基中具有突变P718T和R649H的SFV复制酶的核苷酸序列，(ii)含有选择基因的多核苷酸，以及(iii)含有编码目的异源产物的核苷酸序列的多核苷酸。

本发明另一方面涉及本发明的病毒载体体外产生能组成型地表达目的异源产物的稳定细胞系的用途。

本发明另一方面涉及能组成型地表达目的异源产物的稳定细胞系，其中所述细胞系是用本发明的病毒载体转染的细胞系。

本发明另一方面涉及体外产生能组成型地表达目的异源产物的所述稳定细胞系的方法。

本发明另一方面涉及所述稳定细胞系体外产生目的异源产物的用途。

本发明另一方面涉及体外产生目的异源产物的方法，其包括在一定条件下培养所述稳定细胞系，所述条件为使用来产生所述稳定细胞系的病毒载体所含目的异源产物表达的条件。

附图简要说明

图1.携带SIN衍生的突变的SFV载体的致细胞病变性评估。如实施例所述，构建在nsp2中含有突变P718T(pSFV-S2-LacZ)和P718F(pSFV-S3-LacZ)的质粒pSFV-LacZ。由这些质粒的每一个以及由原始pSFV3-LacZ体外转录RNA，并在BHK细胞中电穿孔，所述细胞以低汇合度接种于直径35mm的平板，并在培养了指定的时间后，用X-gal染色。在SFV-S2-LacZ或SFV-S3-LacZ的情况下，培养96小时(h)后，将用所述载体转染的细胞1∶5传代。每个载体RNA的示意图显示于每组图像的上方。Cap：载体左末端的环，nsp：非结构蛋白；水平箭头：SFV亚基因组启动子；An：PolyA。

图2.在用不同的RNAs电穿孔后选择的嘌呤霉素抗性BHK细胞。在有所示的SFV RNA载体或无RNA(无RNA)的情况下，将BHK细胞电穿孔，将其接种于直径35mm的平板上，在加入5μg/ml的嘌呤霉素前，使之恢复24小时。转染后，在所示的时间内，用甲基紫染色平板。

图3.nsp2在用SFV RNA转染的细胞中的细胞内定位。将BHK细胞用SFV RNA载体或无RNA的载体(无RNA)电穿孔，并在转染后24小，通过免疫荧光分析。用对细胞核(αnsp2-n)或细胞质(αnsp2-c)形式的nsp2具特异性的鼠单克隆抗体作为一抗，用对FITC偶联的鼠IgGs具有特异性的多克隆兔血清作为二抗。用UV滤波器(Dapi)观察相同细胞的Dapi染色的细胞核。

图4.转染的BHK细胞中SFV RNA分析。从复制子SFV-S2-9-pac电穿孔和用嘌呤霉素选择后(泳道1)获得的稳定BHK细胞系或从用SFV-S2-9-pac(泳道2-4)、SFV-pac(泳道5)、SFV-LacZ(泳道6)电穿孔或用复制子SFV-S2-9-pac和SFV-pac(泳道7)共电穿孔获得的BHK细胞中提取总RNA，并在电穿孔后24小时(泳道2、5-7)、48小时(泳道3)或72小时(泳道4)后分析。用对SFV亚基因组启动子具特异性的³²P-标记的寡核苷酸，通过Northern印迹，分析基因组(g)SFV RNAs和亚基因组(sg)SFVRANs的存在。在凝胶下方的数字表示每种情况下亚基因组RNA/基因组RNA(sg/g)的比。在泳道7中，它们分别表示SFV-S2-9-pac(pac)或SFV-LacZ(LacZ)sg/g的比。将凝胶的左侧暴露72小时，而右侧部分暴露1小时。

图5.非结构蛋白的体外和体内表达。A)在[³⁵S]-甲硫氨酸和[³⁵S]-半胱氨酸存在时，在兔网织红细胞裂解物中翻译原始SFV-pac RNA(野生型)或含有所示突变的SFV-pac RNA，并在8％的凝胶中通过SDS-PAGE分析，稍后进行放射自显影。将含有相同样品的两种凝胶运行不同的时间，以便获得具有高分子量条带(上面的凝胶，最长迁移)的较好分离，并检测具有较小分子量的单体nsp1和3(较下方的凝胶，最短的迁移)。B)转染的细胞中复制酶表达分析。利用对nsp2(上面的凝胶)或nsp3(中间的凝胶)具特异性的多克隆兔抗血清，通过免疫印迹，分析对照BHK细胞的裂解物、用复制子SFV-S2-9-pac电穿孔以及用嘌呤霉素选择后(S2-9)获得的稳定BHK细胞的裂解物或用原始SFV-pac RNA(野生型)电穿孔的细胞的裂解物或用突变体SFV-RHR-pac(RHR)的裂解物。用β肌动蛋白特异性抗体作为内部对照分析相同样品。

图6.β-gal表达分析。用所示RNAs电穿孔BHK细胞，并在电穿孔后所示的时间，测定每个细胞的β-gal表达水平。x轴表示以小时表示的转染后时间，y轴表示pgβ-gal/细胞。

图7.在用载体SFV-S2-9-LacZ-pac转染的细胞中，β-gal的表达稳定性。用SFV-S2-9-LacZ-pac RNA对BHK细胞进行电穿孔，在存在5μg/ml嘌呤霉素时对其进行选择。在存在或不存在嘌呤霉素的情况下，每隔2-3天，对所选择的细胞传代，通过X-gal染色，测定每次传代中表达β-gal的细胞的百分比。数据对应于三次不同实验的平均值，显示了标准偏差。该图显示含有载体SFV-S2-9-LacZ-pac的BHK细胞的典型视界，所述细胞在嘌呤霉素存在下传代10次，并用X-gal染色。x轴表示传代数，y轴表示染上蓝色的细胞的百分比。

图8.RNA形式的、用于产生稳定细胞系和产生稳定蛋白的病毒载体的2个实施方案示意图。SFV复制子的侧翼为SFV复制所需的5’和3’序列，其中，3’序列合并了聚腺嘌呤(PolyA)末端序列。具有亚基nsp1-nsp4的复制酶以及与nsp4重叠的SFV亚基因组启动子(SG1)包括于复制子内。为载体复制酶特点的突变R649H和P718T显示于nsp2中。复制子也合并了选择基因(PAC)和编码重组蛋白的目的基因(GOI)，所述蛋白是组成型地产生的。在实施例A和C中，复制子也合并了第二亚基因组启动子(SG2)，以致PAC和GOI的表达受不同SG启动子、SG1或SG2的控制，而无根据所选择的A或C构建体的区别。在实施例B中，PAC和GOI的表达受相同SG1启动子的控制，从而产生在插入PAC和GOI之间的特异性位点受蛋白酶切割的杂交蛋白。Cap：cap结构。

图9.SFV-LacZ致细胞病变作用的评估。由质粒pSFV-LacZ(野生型载体)体外转录RNA，并在BHK细胞中进行电穿孔。将细胞以低汇合度分布于35mm平板中，固定，并用X-gal在所示时间(d，天)染色。

图10.SFV-SF2A-LacZ致细胞病变作用评估。由质粒pSFV-SF2A-LacZ体外转录RNA，并在BHK细胞中进行电穿孔。将细胞以低汇合度分布于35mm平板中，固定，并用x-gal在所示时间(d，天)染色。转染后4天，将细胞1∶5传代。

图11.SFV-SF2C-LacZ致细胞病变作用评估。由pSFV-SF2C-LacZ体外转录RNA，并在BHK细胞中进行电穿孔。将细胞以低汇合度分布于35mm平板中，固定，并用x-gal在所示时间(d，天)染色。转染后4天，将细胞1∶5传代。

图12.SFV-PD-LacZ致细胞病变作用评估。由质粒pSFV-PD-LacZ体外转录RNA，并在BHK细胞中进行电穿孔。将细胞以低汇合度分布于35mm平板中，固定，并用x-gal在所示时间(d，天)染色。

图13.SFV-S2-LacZ致细胞病变作用评估。由质粒SFV-S2-LacZ体外转录RNA，并在BHK细胞中进行电穿孔。将细胞以低汇合度分布于35mm平板中，固定，并用x-gal在所示时间(d，天)染色。转染后4天，将细胞1∶5传代。这种突变体S2能使表达β-gal的细胞的集落形成。

图14.携带突变P718T和R649H的载体SFV-S2-9-LacZ的致细胞病变作用评估。由质粒pSFV-S2-9-LacZ、pSFV-S2-LacZ或pSFV-LacZ体外转录RNA，并在BHK细胞中进行电穿孔。将细胞以低汇合度分布于35mm平板中，固定，并用x-gal在所示时间(d，天)染色。

图15.大鼠心脏营养素-1(rCT)表达分析。A)携带pac基因和rCT基因的2种非致细胞病变SFV载体的图示。sg Pr，亚基因组启动子；2A，编码口蹄疫病毒(FMDV)自身蛋白酶2A的核苷酸序列。B)rCT表达分析。用SFV-S2-9-rCT-pac(rCT-pac)、SFV-S2-9-pac2A-rCT(pac-2A-rCT)或SFV-S2-9-pac(S2-9-pac)作为阴性对照的RNA，电穿孔BHK细胞，并在5μg/ml的嘌呤霉素存在下选择。将经选择的细胞裂解，利用对心脏营养素(rCT)具特异性的抗体，通过免疫印迹，分析rCT表达(上面的凝胶)。作为数量对照，用抗肌动蛋白的抗体分析相同的样品(较下方的凝胶)。wtCT，转染后24小时获得的用SFV-rCT转染的BHK细胞的裂解物，并用作阳性对照。M，分子量标志物(kDa)。

图16.在来自载体SFV-S2-9-rCT-pac的BHK细胞中rCT表达稳定性分析。将BHK细胞用SFV-S2-9-rCT-pac RNA电穿孔，并在5μg/ml嘌呤霉素存在的情况下进行选择。每2-3天将所选择的细胞1∶5传代，最多连续11代(p1-p11)，通过用对心脏营养素具特异性的抗体(上面的凝胶)和对作为加样对照的肌动蛋白具特异性的抗体(较下方的凝胶)进行免疫印迹，分析在每次传代中细胞裂解物中rCT的表达。用数个量的纯化的重组rCT(recCT)作为数量对照。显示了代表产生相似表达和稳定性结果的两个进行的实验的一个实验。S2-9-pac，用载体SFV-S2-9-pac电穿孔的细胞的阴性对照。M表示分子量标志物(kDa)。

图17.来自载体SFV-S2-9-pac2A-rCT的BHK细胞中rCT表达稳定性分析。将BHK细胞用SFV-S2-9-pac2A-rCT RNA电穿孔，并在5μg/ml嘌呤霉素存在的情况下进行选择。每2-3天将所选择的细胞1∶5传代，最多连续10代(p1-p10)，通过用对心脏营养素具特异性的抗体(上面的凝胶)和对作为加样对照的肌动蛋白具特异性的抗体(较下方的凝胶)进行免疫印迹，分析在每次传代中细胞裂解物中rCT的表达。用数个量的纯化的rCT(recCT)作为数量对照。显示了代表产生相似表达和稳定性结果的四个进行的实验的一个实验。S2-9-pac，用载体SFV-S2-9-pac电穿孔的细胞的阴性对照。M表示分子量标志物(kDa)。

图18.携带pac基因和IGF-I基因的非致细胞病变SFV载体的图示。携带独立病毒亚基因组启动子(sg Pr)控制下的pac基因和IGF-I基因的载体SFV-S2-9-IGF-pac，其中，利用编码FMDV自身蛋白酶2A(2A)的核苷酸序列作为连接子，已经将IGF-I基因与SFV衣壳翻译增强子(b1)融合。载体SFV-S2-9-pac2A-IGF携带利用序列2A作为连接子与IGF-I基因融合的pac基因。

图19.IGF-I表达分析。用SFV-S2-9-IGF-pac、SFV-S2-9-pac2A-IGF或SFV-S2-9-pac(阴性对照)的RNA对BHK细胞进行电穿孔，并在5μg/ml嘌呤霉素存在的情况下进行选择。将所选择的细胞传代一次(第1代)，在将它们接种后24、48或72小时，收集上清液。通过对人IGF-I具特异性的ELISA，分析每个上清液中IGF-I的表达。SFV-IGF-I，用野生型载体SFV-IGF-I RNA转染的BHK细胞的上清液，其是在转染后24小时获得的，并用作阳性对照。

图20.来自不同载体的BHK细胞中IGF-I表达稳定性分析。将BHK细胞用SFV-S2-9-IGF-pac或SFV-S2-9-pac2A-IGF RNA进行电穿孔，并在5μg/ml嘌呤霉素存在的情况下进行选择。每2-3天将所选择的细胞进行传代，最多10次连续传代，将其接种后24小时，收集每次传代的上清液。通过对人IGF-I具特异性的ELISA，分析每次传代的上清液中IGF-I的表达。SFV-IGF-I，用载体SFV-IGF-I的RNA转染的BHK细胞的上清液，其是在转染24小时后获得的，并用作阳性对照。

发明详述

本发明的解说

α病毒载体具有几个优势，如高转基因表达水平、广泛的嗜性和便于操作。这些载体在大多数脊椎动物细胞中引起的致细胞病变性，在某些应用中可以是有利的，如接种和癌症的基因治疗，其中，转导细胞的凋亡可导致能被免疫细胞摄取的抗原的释放，这有利于分别针对表达的重组抗原或针对肿瘤抗原的免疫应答(19)。然而，这些载体在需要长久的转基因表达的应用中的使用，受到其致细胞病变特性的阻碍。

不同的实验室已经研究了使α病毒载体适应长期表达的可能性，这导致SIN、SFV、VEE和EEE非致细胞病变变体的分离(7，20-23)。在大多数情况下，利用携带异源基因的载体，已经分离了非致细胞病变突变，所述异源基因编码赋予抗生素如嘌呤霉素或G418抗性的蛋白。当将用这种类型的载体转染的细胞在存在抗生素的情况下孵育时，仅选择含有表达抗性基因的非致细胞病变突变体复制子的那些细胞。

尽管已经描述的大多数α病毒突变体在nsp2中携带突变，但这些突变在不同病毒中改变不同的蛋白残基，虽然在不同的α病毒间存在高程度的序列同源性。以这种同源性序列作为基础，在SFV环境中，研究了良好表征的SIN突变的作用，所述突变影响SIN中nsp2的残基726。突变P726L和P726T已分别由Frolov等(7)和Perri等(22)描述为非致细胞病变。在第一项研究中，残基726也可以突变为所有其他可能的氨基酸，其产生了具有不同致细胞病变性程度的SIN突变体的集合。Frolov等能在RNA复制水平和致细胞病变性之间建立相关性，由此可得出如下结论：nsp2残基726的变化将RNA水平减少为少于野生型载体中所观察的水平的5％，该变化产生非致细胞病变表型(7)。

选择两种不同的变化P726T和P726F，该变化已经能将SIN中RNA的水平分别减少为野生型水平的5.1％和1.6％，并将对应的突变引入SFVnsp2的718位，产生被本发明人分别鉴定为S2和S3的突变体。这些变化均不能在SFV中独自产生非致细胞病变表型。用已并入LacZ报告基因的那些SFV突变体(S2和S3)转染BHK细胞而进行的研究证明，仅小百分比的转染的细胞能维持载体的复制。突变体S2(P718T)看起来比S3(P718F)更稳定，并且在缺少选择时产生大集落的表达β-gal的细胞。因此可知这些集落含有具有其他适应性突变的复制子。为了选择这些集落并鉴定存在于复制子中的可能的次级突变(secondary mutation)，将N-乙酰基转移酶基因(pac)克隆于SFV突变体S2中，并分离在嘌呤霉素存在的情况下培养的细胞集落。在所分析的一个集落中，在nsp2的位置649发现了另一突变(R649H)，该突变联合突变P718T，能基于该双SFV突变体(P718T/R649H)为SFV载体提供非致细胞病变表型。本发明人将该双SFV突变体(P718T/R649H)称为突变体S2-9，其在本说明书中以突变体SFV-S2-9或简单地以S2-9无区分地出现。

突变R649H影响SFV核定位信号⁶⁴⁸RRR，⁶⁴⁸RRR负责nsp2向细胞核的部分转运已有记载(27)。位置649的Arg变为Hys构成了非常保守的变化，这可解释既没在双突变体S2-9(P718T/R649H)也未在简单突变体(R469H)中观察到对nsp2向细胞核的转运的明显作用。当与野生型SFV载体相比时，后者、突变体(R469H)未显示致细胞病变性的任何降低，这表示，位置649和718突变这两者对消除致细胞病变作用是必须的。Fazakerley等描述了位置649中的更激烈变化(R649D)，该变化导致完整病毒基因组下SFV神经毒力的衰减(6)。在此情况下，尽管突变R649D不抑制病毒对BHK细胞的致细胞病变作用，但却完全打断了nsp2向细胞核的运输。所有这些数据表明，nsp2的序列⁶⁴⁸RR可能与SFV的致细胞病变性有关。

突变体S2-9含有双突变P718T/R649H，它能以比野生型SFV载体所观察到的水平低约60倍的水平复制，这可解释所述突变体S2-9致细胞病变性的缺失。突变体S2-9中亚基因组RNA的水平仅比野生型SFV载体的低30倍，这表明，在非致细胞病变突变体S2-9中，亚基因组RNA/基因组RNA的比增加了约2倍。转染后短时间内，这个比甚至更大，这表明，非致细胞病变载体中基因组RNA的合成与亚基因组RNA的合成相比，受到延迟。所观察的突变体S2-9RNA量的减少和亚基因组RNA/基因组RNA比值的增加两者，均与对SIN载体描述的那些相似，所述SIN载体在nsp2位置726中含有非致细胞病变突变(7，22)。然而，这些结果与Perri等所述的非致细胞病变SFV突变体的结果矛盾，其中突变体RNA的量大于野生型病毒RNA的量，并且其中亚基因组RNA/基因组RNA的比也降低了(22)，这表明建立该组分离的SFV突变体的长久复制可能与不同的机制有关。突变体S2-9中较低的RNA复制水平不是由于RNA序列中存在的突变的顺式作用，因为野生型SFV载体反式提供的野生型复制酶允许将突变体S2-9的基因组RNA和亚基因组RNA水平恢复至接近野生型SFV载体的值。用α病毒突变体进行的几项研究已证明，nsp2中的非致细胞病变突变能改变这种蛋白的蛋白水解活性，这导致复制酶的超加工(7)或导致这种多蛋白的较慢加工(22)。在本发明中，无论通过体外翻译方式还是通过免疫印迹分析方式，均未观察到突变体S2-9和野生型SFV载体之间在复制酶加工上有明显差异。

尽管突变体S2-9复制水平低，但转染24小时后，载体SFV-S2-9-LacZ(基于SFV突变体S2-9的病毒载体)产生的β-半乳糖苷酶(β-gal)的量与用表达相同转基因的野生型SFV载体获得的量非常相似。在转染后的稍后时间，载体S2-9的表达水平增加了约2倍，这与观察到的RNA水平的增加有关。其他描述的非致细胞病变载体中，重组蛋白表达水平显示了很大的变化性，范围为从SIN突变体P726L情况下，野生型表达的仅4％(1)到在

等(21)研发的双突变体SFV-PD情况下的1.000％。然而，当同样的作者表示，在用携带LacZ或GFP作为标志物基因的SFV-PD载体感染的BHK细胞中，β-gal或GFP的表达在48小时后达到最大，稍后在随后的3-4天内显著降低(20)时，这种载体的非致细胞病变特性值得怀疑。对此，加上本说明书的实施例8是值得的，实施例8克服现有技术的偏见，因为其证明，等(21)研发的SFV-PD载体是致细胞病变的。这个小组描述的含有热敏感突变的一些其他突变体也能表达高水平的重组蛋白，但仅在允许的温度下(20，21)。突变体S2-9可能比具有低的多的RNA水平的野生型SFV载体表达更大量的重组蛋白的原因，可能与后一载体诱导的强蛋白合成抑制有关。两篇最近的出版物表明，eIF2α磷酸化是α病毒在感染中的稍后时间在宿主细胞内诱导翻译抑制的机制(15，31)。同时，这些作者证明，存在于衣壳基因5’末端的翻译增强子元件能在磷酸化的eIF2α存在的情况下，有效翻译病毒结构多蛋白。已经证明，当衣壳翻译增强子协调地融合于SFV或SIN载体中重组蛋白的氨基末端时，其使重组蛋白表达水平增加了8倍(10，28)。在SFV突变体S2-9衍生的病毒载体背景下，未观察到这种作用，这可能是因为经由eIF2α磷酸化的翻译在转染了该载体的细胞中未被抑制。在用衍生于SFV突变体S2-9的病毒载体转染的细胞中，蛋白合成抑制的缺失可能是用比以野生型SFV载体所达到水平低的RNA水平产生高表达水平的原因。

衍生于SFV突变体S2-9的病毒载体的包装效率比携带相同转基因的野生型SFV载体低约6个对数单位。这可能归因于低RNA复制水平或者归因于双SFV突变体(S2-9)包装的缺乏。借助与野生型SFV载体共转染细胞的包装实验仅能使S2-9病毒颗粒效价增加15倍，在所述包装实验中，衍生于双SFV突变体S2-9的所述病毒载体的RNA以几乎正常的水平复制，这表明低RNA水平仅是这种载体低包装效率的部分原因。仅含有突变R649H的SFV载体以与野生型SFV载体相似的水平进行包装，而仅含有突变P718T的SFV载体(SFV-S2)不充分地进行包装。尽管载体SFV-S2在大多数转染的细胞中不能复制这一事实可能是形成这种低包装效率的因素，但是一切均显示这种突变单独或者与突变R649H联合，影响病毒颗粒中SFV RNA的衣壳化。在含有核苷酸2767-2824的基因组区域中，已经绘制了SFV包装信号的基因图谱(32)，并且其不与存在于突变体S2-9中、位于位置3643(R649H)和3849-51(P718T)的任何突变重叠。然而，不能抛弃的是，这些突变可影响基因组RNA的二级结构，从而改变包装信号的可接近性。为确定序列在SFV包装中的确切功能，需要更多的突变形成研究。

已经证明，衍生于突变体S2-9的病毒载体能有效地用于产生组成型地表达重组蛋白的BHK细胞的稳定细胞系，而无需分离克隆。为此，除了突变P718T和R649H外，载体必须含有期望的转基因和用于选择已经被有效转导的细胞的选择基因(如编码赋予抗生素抗性的蛋白的基因等)。利用LacZ作为报道转基因并利用pac基因作为选择基因，产生表现出非常高的稳定性和与野生型SFV载体相似的表达水平的细胞系，所述稳定性为在培养10代后，约85％的细胞表达β-gal。这与用非致细胞病变的SIN载体产生的类似细胞系中的观察结果形成对比，所述非致细胞病变SIN载体携带在nsp2中的突变P726L和作为报道基因的LacZ基因，并以比野生SIN载体低约25倍的水平表达β-gal(1)。在后一个情况中，尽管如果细胞系衍生于表达β-gal的细胞的克隆群，用这种系统可实现更高的稳定性，但5次传代后，45％的细胞丧失LacZ表达。

衍生于突变体S2-9的病毒载体能产生组成型地表达大鼠心脏营养素-1(rCT)的稳定细胞系。在此情况下，含有2个亚基因组启动子的载体(SFV-S2-9-rCT-pac)中rCT和pac的表达引起细胞系的产生，在所述细胞系中，表达在最初5代中保持稳定，从第5代起逐渐丧失(图16)。然而，载体SFV-S2-9-pac2A-rCT导致非常稳定的细胞系的产生，在所述载体SFV-S2-9-pac2A-rCT中，利用编码FMDV自身蛋白酶2A的核苷酸序列作为连接子，将pac基因和编码rCT的基因协调地融合，所述非常稳定的细胞系维持与用野生型SFV载体获得的表达相似的高rCT表达，并且所述表达在培养中持续至少10代(图17)。

同样，衍生于突变体S2-9的病毒载体也能产生表达胰岛素样生长因子I(IGF-I)的稳定细胞系。在此情况下，含有2个亚基因组启动子的载体(SFV-S2-9-IGF-pac)中IGF-I和pac的表达引起细胞系的产生，在该细胞系中，表达在最初的4-5代中保持稳定，从第5代起逐渐丧失，并到第10代时降低80倍(图20)。然而，载体SFV-S2-9-pac2A-IGF引起较高稳定性的细胞系产生，在所述载体中，利用编码FMDV自身蛋白酶2A的核苷酸序列作为连接子，将pac基因和编码IGF-I的基因协调地融合，而所述细胞系维持了与用野生型SFV载体所获得的表达相似的高IGF-I表达，以及在培养10代后降低仅约4倍(图20)。后一个载体(SFV-S2-9-pac2A-IGF)还在早期传代中表现出IGF-I表达水平，所述表达水平为用载体SFV-S2-9-IGF-pac所观察到的表达水平的约2倍多。

载体SFV-S2-9-pac可因此用于快速地产生可大量产生目的异源产物如重组蛋白的稳定的哺乳动物细胞系。

本发明的病毒载体

本发明一方面涉及基于Semliki森林病毒(SFV)的病毒载体，在下文中称为本发明的病毒载体，其含有Semliki森林病毒(SFV)的复制子，其中所述复制子含有(i)编码在亚基nsp2中具有突变P718T和R649H的SFV复制酶的核苷酸序列，(ii)含有选择基因的多核苷酸，(iii)含有编码目的异源产物的核苷酸序列的多核苷酸。

本发明的病毒载体含有SFV复制子，所述复制子含有编码SFV复制酶的核苷酸序列，所述SFV复制酶在亚基nsp2中含有突变P718T和R649H。这些突变中的每一个突变都影响核苷酸的三联子，两者都位于编码病毒复制酶亚基或非结构性蛋白nsp2的序列中。突变P718T表示，位于野生型SFV编码的蛋白nsp2的氨基酸序列位置718处的脯氨酸(P)，被突变的载体(本发明的病毒载体)编码的蛋白nsp2的苏氨酸(T)替换。同样，突变R649H表示，位于野生型SFV编码的亚基nsp2的氨基酸序列的位置649处的精氨酸(R)，被突变的载体(本发明的病毒载体)编码的亚基nsp2的组氨酸(H)替换。两个位置718和649都涉及亚基nsp2的已经经切割和加工的序列中替换的氨基酸的位置。

在本发明具体的实施方案中，存在于本发明病毒载体中的SFV复制子含有SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2：

●SEQ ID NO：1包括SFV复制所需的5’末端、编码在nsp2中具有突变P718T和R649H的SFV复制酶并与该复制酶重叠的序列、病毒SFV亚基因组启动子；以及

●SEQ ID NO：2包括SFV复制所需的3’末端，所述3’末端含有聚腺嘌呤(Poly A)的末端序列。

这两条序列一起形成载体的骨架，并且含有选择基因的多核苷酸和含有编码目的异源产物的核苷酸序列的多核苷酸置于所述两条序列之间。

含有选择基因的多核苷酸的表达以及含有编码目的异源产物的核苷酸序列的多核苷酸的表达可以受控于两个独立的SFV亚基因组启动子或单个亚基因组启动子，其控制融合蛋白形式的含有选择基因的多核苷酸的表达以及含有编码目的异源产物的核苷酸序列的多核苷酸的表达。

因此，在特定实施方案中，本发明的病毒载体含有：

a)含有编码目的异源产物的核苷酸序列的多核苷酸，所述多核苷酸的表达受第一SFV亚基因组启动子(SG1)的控制；以及

b)含有选择基因的多核苷酸，所述多核苷酸的表达受第二SFV亚基因组启动子(SG2)的控制。

所述第一和第二SFV亚基因组启动子可以相同或不同。在具体的实施方案中，选择基因的表达和目的异源产物的表达受两个相同或不同的独立SFV亚基因组启动子的控制。

如图8所示，含有编码目的异源产物的核苷酸序列的多核苷酸和含有选择基因的多核苷酸位于SFV复制子内，并介于复制酶中重叠的亚基因组启动子与SFV复制所需的3’末端之间。

在特定实施方案中，含有编码目的异源产物(GOI，目的基因)的核苷酸序列的多核苷酸位于在复制酶中重叠的亚基因组启动子(SG1)的下游，并且其表达受控于所述启动子SG1。另一个亚基因组启动子SG2控制含有选择基因的多核苷酸的表达，所述含有选择基因的多核苷酸位于SG2的下游，随后并入，其表达受控于所述启动子SG2(图8A)。如上文所提到的，亚基因组启动子SG1和SG2可以相同或不同。

在另一个特定实施方案中，本发明的病毒载体也用相同的2个亚基因组启动子(SG1和SG2)进行构建，但交换了含有编码目的异源产物(GOI)的核苷酸序列的多核苷酸和含有选择基因的多核苷酸的位置，以便SG1控制含有选择基因的多核苷酸的表达，SG2控制含有编码目的异源产物(GOI)的核苷酸序列的多核苷酸的表达(图8C)。如上文所提到的，亚基因组启动子SG1和SG2可以相同或不同。

在另一个可选的特定实施方案中，本发明的病毒载体含有，亚基因组启动子(如SG1)下游的构建体，所述构建体包含含有选择基因的多核苷酸和含有编码目的异源产物的核苷酸序列的多核苷酸，所述多核苷酸通过多核苷酸连接子协调地融合；有利的是，所述连接子是含有编码翻译后(自身)蛋白水解切割位点的核苷酸序列的多核苷酸。

事实上，编码翻译后(自身)蛋白水解切割位点的任何核苷酸序列，以及相应地所述核苷酸序列编码的(自身)蛋白酶或氨基酸或肽序列都可以用于本发明中。

在特定实施方案中，所述连接子是含有编码(自身)蛋白酶的核苷酸序列的多核苷酸，所述(自身)蛋白酶在由选择基因翻译产生的蛋白和编码目的异源产物的核苷酸序列翻译产生的蛋白间顺式作用，即在特定实施方案中，所述连接子是含有核苷酸序列的多核苷酸，当其被翻译时，提供切割位点，由此表达的融合蛋白或多蛋白在形成所述融合蛋白或多蛋白的蛋白中被翻译后加工。因此，为了简洁，本说明书偶尔使用措辞“编码蛋白酶的核苷酸序列”，作为措辞“编码翻译后(自身)蛋白水解切割位点的核苷酸序列”的同义词。通过非限制性的说明，编码在由选择基因的翻译和编码目的异源产物的核苷酸序列的翻译产生的蛋白间顺式作用的(自身)蛋白酶的核苷酸序列来自病毒，例如细小核糖核酸病毒、α病毒等。在特定实施方案中，所述连接子含有编码口蹄疫病毒(FMDV)多蛋白的区域2A或FMDV自身蛋白酶2A的核苷酸序列。在另一个特定实施方案中，所述连接子含有编码具有蛋白水解活性的SFV衣壳羧基末端结构域的核苷酸序列。这种可选的特定实施方案的示意图显示于图8B中，在该图中，显示了亚基因组启动子(如SG1)控制所述构建体的表达，所述构建体包含含有选择基因的多核苷酸和含有编码目的异源产物(GOI)的核苷酸序列的多核苷酸，所述多核苷酸通过所述连接子协调地融合。两个基因(选择基因和GOI)的共翻译(联合翻译)因此发生于单个多蛋白中，翻译后，所述多蛋白通过在(自身)蛋白水解切割位点断裂的方式迅速得以切割，产生选择蛋白和目的异源产物。欧洲专利申请EP736099和Ryan和Drew(35)以前曾记载过这些翻译后(自身)蛋白水解断裂位点的用途，特别是编码FMDV多蛋白的区域2A(FMDV自身蛋白酶2A)的序列的用途，将其全部内容通过引用并入。

可选地，在另一个特定实施方案中，所述连接子是含有编码反式作用的蛋白酶的切割位点的核苷酸序列的多核苷酸；在此情况下，可以天然地或重组地用本发明病毒载体转染的细胞表达所述蛋白酶，或可选地可以外源地添加所述蛋白酶，以便释放含有选择蛋白和目的异源产物的融合蛋白的目的异源产物。事实上，编码反式作用的蛋白酶的切割位点的任何核苷酸序列，以及相应地所述序列编码的氨基酸序列，都可以用于本发明。通过非限制性的说明，所述编码反式作用的蛋白酶的切割位点的核苷酸序列，可以是编码可被肽链内切酶切割的氨基酸序列的核苷酸序列等。通过非限制性的说明，编码反式作用的蛋白酶的切割位点的所述核苷酸序列，是编码病毒蛋白酶切割位点的核苷酸序列，所述病毒如马铃薯Y病毒属(Potyvirus)的病毒，如烟草蚀纹病毒(Etch Tobacco Virus，ETV)等，且所述蛋白酶可以被用本发明的病毒载体转染的细胞表达(或天然地，或因为其已经进行了适宜的转化)等。

可选地，在另一个特定实施方案中，所述连接子是含有编码切割位点的核苷酸序列的多核苷酸，所述切割位点可以被化学试剂识别，如在甲硫氨酸残基中切割的溴化氰等。

在包含含有选择基因的多核苷酸的所述构建体中，所述多核苷酸与含有编码目的异源产物的核苷酸序列的多核苷酸协调地融合，含有选择基因的多核苷酸的3’末端可以通过所述连接子协调地融合于含有编码目的异源产物(GOI)的核苷酸序列的多核苷酸的5’末端。可选地，含有编码目的异源产物(GOI)的核苷酸序列的多核苷酸的3’末端，可以通过所述连接子协调地融合于含有选择基因的多核苷酸的5’末端。

当载体细胞(carrier cells)表达选择基因时，存在于本发明病毒载体中的选择基因允许从还未被转染的细胞或已经丧失它的细胞中选择携带本发明病毒载体的细胞。事实上，允许选择携带本发明病毒载体的细胞的任何选择基因均可用于实施本发明。通过非限制性说明，所述选择基因可以是其表达赋予抗生素抗性的基因、允许合成培养基中遗漏的必须营养素的基因、提供转染的细胞选择优势的基因等。在特定实施方案中，所述选择基因是其表达赋予抗生素抗性的基因，所述抗生素例如哺乳动物细胞的毒性抗生素，所述基因如赋予潮霉素抗性(hph)的基因、赋予新霉素抗性(neoR)的基因、编码嘌呤霉素N-乙酰基转移酶(pac)的基因等，所述编码嘌呤霉素N-乙酰基转移酶(pac)的基因的表达赋予携带本发明病毒载体的细胞对嘌呤霉素抗生素的抗性。pac基因的使用，允许从已经被转染或者已经丧失本发明病毒载体的细胞中选择携带本发明病毒载体的细胞，允许将嘌呤霉素添加到培养基。

目的异源产物事实上可以是任何目的蛋白或肽，如报道蛋白或肽(β-gal等)；或具有治疗或诊断用途的肽、蛋白或抗体(或其功能片段)；或任何重组的目的蛋白或肽。如本文所用，术语“异源的”还包括“重组的”，即它看起来不是天然的。目的异源产物的说明性的非限制性实例包括，具有治疗用途的肽和蛋白，如胰岛素样生长因子I(IGF-I)、心脏营养素-1(CT1)、制瘤素M(OSM)、α干扰素(如IFNa5)、双调蛋白(AR)、神经胶质细胞衍生的神经营养因子(GDNF)、内皮细胞蛋白C/激活的蛋白C受体(EPCR)、目的或治疗或诊断用途的抗体(或其功能片段)等。因此，存在于本发明病毒载体中的含有编码目的异源产物的核苷酸序列的多核苷酸，包含编码目的异源产物的序列。

“突变的SFV复制酶基因-GOI-选择基因”组件，或可选地，“突变的SFV复制酶基因-选择基因-GOI”组件的侧翼为复制所需的5’和3’序列，形成可以在细胞内自我扩增的RNA复制子。

本发明的病毒载体可以以RNA形式使用，也可以以DNA形式使用。

当以RNA形式使用时，本发明的病毒载体通过在其5’末端加入帽子结构而完成。

当以DNA形式使用时，完整的载体可以包含真核细胞中的功能启动子，例如巨细胞病毒(CMV)启动子，任何之前限定的实施方案中的SFV复制子序列，以及转录终止信号序列，例如衍生于SV40的信号序列。载体因此在转染的细胞内被转录为RNA，在所述细胞内，其将自我扩增。

任选地，如果需要，本发明的病毒载体可以含有基因转录或翻译增强子，即，可以与激活剂如转录因子结合的核酸，以便增加基因转录或翻译水平；正如所知道的，所述增强子可以邻近或远离其作用的基因。如本说明书所用，术语“增强子”包括基因转录增强子和基因翻译增强子两者，包括称为IRES(核糖体内部进入位点)的区域，该区域，正如所知道的，是促进翻译起始的区域。如果需要，所述增强子，连同(之前限定的)含有编码翻译后(自身)蛋白水解切割位点的核苷酸序列的多核苷酸连接子，可以以盒形成。事实上，任何适宜的基因转录或翻译增强子都可以用于本发明。通过说明，所述增强子可以是SFV最小的翻译增强子“b1”，其含有编码SFV衣壳的最初34个氨基酸的核苷酸序列。在特定实施方案中，本发明的病毒载体包含含有编码目的异源产物的核苷酸序列的多核苷酸，所述多核苷酸在其5’末端融合于增强子，或可选地，融合于含有所述增强子和多核苷酸连接子的盒，所述多核苷酸连接子含有编码(之前限定的)翻译后(自身)蛋白水解切割位点的核苷酸序列。在具体的实施方案中，本发明的病毒载体含有人IGF-I前体序列(IFG-IB)，所述人IGF-I前体序列在其5’末端与盒融合，所述盒含有SFV衣壳的最小翻译增强子(“b1”)，其后接编码FMDV自身蛋白酶2A的核苷酸序列(pSFVb12A-IGF-IB，实施例10)。

用于制备本发明病毒载体的RNA或DNA构建体，可通过包括于普通实验室手册内的常规分子生物学方法获得，如包括于“Molecular cloning：a laboratory manual(分子克隆：实验室手册)”(Joseph Sambrook，David W.Russel Eds.2001，3^a ed.Cold Spring Harbor，New York)或“Current protocolsin molecular biology(最新分子生物学实验方法汇编)”(F.M.Ausubel，R.Brent，R.E.Kingston，D.D.Moore，J.A.Smith，J.G.Seidman and K.StruhlEds，vol.2.Greene Publishing Associates and Wiley Interscience，New York，N.Y.，更新至2006年9月)的常规分子生物学方法。

本发明的病毒载体，衍生于SFV S2-9(P718T/R649H)中分离的非致细胞病变双突变体，表现出与野生型SFV载体非常相似的表达水平。

本发明的病毒载体可用于体外产生可组成型地表达目的异源产物的稳定细胞系。所述本发明的病毒载体体外产生可组成型地表达目的异源产物的用途，构成了本发明的另一方面。

本发明的稳定细胞系

本发明的病毒载体可用于体外产生可组成型地表达目的异源产物的稳定细胞系。

因此，本发明的另一方面涉及可组成型地表达目的异源产物的稳定细胞系，即下文的本发明的稳定细胞系，其中所述细胞系是用含有SFV复制子的本发明的病毒载体转染的细胞系，其中所述复制子含有(i)编码在亚基nsp2中具有突变P718T和R649H的SFV复制酶的核苷酸序列，(ii)含有选择基因的多核苷酸，以及(iii)含有编码目的异源产物的核苷酸序列的多核苷酸。

如上文所述，根据本发明，当第10代中表达目的异源产物的细胞的百分比大于85％时，细胞系是“稳定的”，所述百分比在连续或随后的传代中可以得以维持或被超过。同样，当上文提到的稳定的细胞系可以在数量上高水平(与当细胞用野生型载体转导时，转导后24小时获得的水平相比，大于50％)地进一步表达异源产物时，表达是“组成型的”。

在特定实施方案中，本发明的稳定细胞系是用本发明的病毒载体转染的稳定细胞系，所述本发明的病毒载体的SFV复制子含有序列SEQ IDNO：1和SEQ ID NO：2。

在另一个特定实施方案中，本发明的稳定的细胞系是用本发明的病毒载体转染的稳定的细胞系，所述本发明的病毒载体含有：

a)含有编码目的异源产物的核苷酸序列的多核苷酸，其表达受第一SFV亚基因组启动子(SG1)的控制；以及

b)含有选择基因的多核苷酸，其表达受第二SFV亚基因组启动子(SG2)的控制。

所述第一和第二SFV亚基因组启动子可以相同或不同。

在另一个特定实施方案中，本发明的稳定的细胞系是用本发明的病毒载体转染的稳定的细胞系，在所述本发明的病毒载体中，含有编码目的异源产物的核苷酸序列的多核苷酸位于在复制酶中重叠的第一亚基因组启动子(SG1)的下游，并且其表达受所述启动子SG1的控制，以及，含有选择基因的多核苷酸位于控制所述含有选择基因的多核苷酸的表达的第二亚基因组启动子(SG2)的下游。所述亚基因组启动子SG1和SG2可以相同或不同。根据有关本发明病毒载体的上文所述，两个多核苷酸间的相对位置可以变化。

在另一个特定实施方案中，本发明的稳定的细胞系是用本发明的病毒载体转染的稳定的细胞系，所述本发明的病毒载体含有亚基因组启动子(如SG1)下游的构建体，所述构建体包含含有选择基因的多核苷酸和含有编码目的异源产物的核苷酸序列的多核苷酸，所述多核苷酸通过多核苷酸连接子协调地融合；所述连接子有利地是含有编码翻译后(自身)蛋白水解切割位点的核苷酸序列的多核苷酸。关于本发明的病毒载体，上文已经提到所述连接子的特征。在特定实施方案中，所述连接子含有编码在由选择基因的翻译和编码目的异源产物的核苷酸序列的翻译产生的蛋白间顺式作用的(自身)蛋白酶的核苷酸序列，如编码口蹄疫病毒(FMDV)多蛋白的区域2A或FMDV自身蛋白酶2A的核苷酸序列，或编码SFV衣壳的羧基末端结构域的核苷酸序列等。在另一个特定实施方案中，所述连接子是含有编码反式作用蛋白酶切割位点的核苷酸序列的多核苷酸，如编码病毒蛋白酶如ETV蛋白酶切割位点的核苷酸序列等，在此情况下，本发明的细胞系可以表达所述的蛋白酶，或可选地，所述蛋白酶可以以外源的方式加入。在另一个特定实施方案中，如上文所述，所述连接子是含有编码切割位点的核苷酸序列的多核苷酸，所述切割位点可以被化学试剂识别，如上述于甲硫氨酸残基切割的溴化氰等。

在本发明稳定的细胞系的本特定实施方案中，使用本发明的病毒载体，其含有亚基因组启动子下游的构建体，所述构建体包含含有选择基因的多核苷酸和含有编码目的异源产物的核苷酸序列的多核苷酸，所述多核苷酸通过多核苷酸连接子协调地融合，亚基因组启动子(如SG1)控制所述构建体的表达，所述构建体包含含有选择基因的多核苷酸和含有编码目的异源产物的核苷酸序列的多核苷酸，所述多核苷酸通过多核苷酸连接子协调地融合，两个基因(选择基因和目的基因)的共翻译发生于单个多蛋白中，所述单个多蛋白，在翻译后，通过(自身)蛋白水解切割位点断裂的方式迅速地得以切割，从而产生选择蛋白和目的异源产物。根据有关本发明病毒载体的上文所述，在上述构建体中两个多核苷酸间的相对位置可以变化，即在所述构建体中，含有选择基因的多核苷酸的3’末端，可以通过所述连接子协调地融合于含有编码目的异源产物的核苷酸序列的多核苷酸的5’末端，或反之亦然，含有编码目的异源产物的核苷酸序列的多核苷酸的3’末端，可以通过所述连接子协调地融合于含有选择基因的多核苷酸的5’末端。本发明人进行的数个分析已经表明，本发明的这种类型的病毒载体，产生维持与用野生型SFV载体获得的表达相似的目的异源产物高表达的非常稳定的细胞系，所述病毒载体含有亚基因组启动子下游的构建体，所述构建体包含含有选择基因的多核苷酸和含有编码目的异源产物的核苷酸序列的多核苷酸，所述多核苷酸通过包含DNA序列的连接子协调地融合。

对于本发明病毒载体，上文已经提到选择基因的特征和含有编码目的异源产物的核苷酸序列的多核苷酸的特征两者。

在特定实施方案中，存在于用于产生本发明稳定细胞系的本发明病毒载体中的选择基因，是其表达赋予抗生素抗性的基因、允许合成培养基中遗漏的必须营养素的基因、赋予转染的细胞选择优势的基因，例如，赋予潮霉素抗性(hph)的基因，赋予新霉素抗性(neoR)的基因，编码嘌呤霉素N-乙酰基转移酶(pac)的基因等，所述编码嘌呤霉素N-乙酰基转移酶基因的表达，赋予携带本发明病毒载体的细胞对嘌呤霉素抗生素的抗性。

同样，在特定实施方案中，本发明稳定的细胞系表达的目的异源产物，是报道蛋白(β-gal等)；或具有治疗或诊断用途的蛋白、肽或抗体(或其片段)；或任何的另外的目的重组蛋白或肽；所述目的异源产物的示例性非限制性实例包括，具有治疗用途的肽和蛋白，如IGF-I、CT1、OSM、IFN、AR、GDNF、EPCR、目的或具有治疗或诊断用途的抗体等。

在特定实施方案中，本发明的稳定的细胞系是组成型地表达大鼠心脏营养素-1(rCT)的稳定的细胞系。通过利用本发明两种不同的病毒载体，产生两种类型的细胞系。一种情况是，含有2个亚基因组启动子的本发明病毒载体(SFV-S2-9-rCT-pac)中rCT和pac的表达，使这样的细胞系产生，即在该细胞系中，表达保持稳定至少头5代，从第5代起逐渐丧失(图16)。然而，另一种情况是，当使用鉴定为SFV-S2-9-pac2A-rCT的本发明的病毒载体时，其中，利用编码FMDV自身蛋白酶2A的核苷酸序列作为连接子，将pac基因和编码rCT的基因协调地融合，获得非常稳定的细胞系，在培养中，所述细胞系维持高rCT表达达至少10代，所述高rCT表达与用野生型SFV载体获得的相似(图17)。

在另一个特定实施方案中，本发明稳定的细胞系是表达胰岛素样生长因子I(IGF-I)的稳定的细胞系。通过本发明的两种不同的病毒载体，产生两种类型的细胞系。一种情况是，含有2个亚基因组启动子的本发明的病毒载体(SFV-S2-9-IGF-pac)中IGF-I和pac的表达，使这样的细胞系产生，即在该细胞系中，表达保持稳定至少最初4-5代，从第5代起逐渐丧失，并且到达10代时降低80倍(图20)。然而，当使用鉴定为SFV-S2-9-pac2A-IGF的本发明的病毒载体时，其中，利用编码FMDV自身蛋白酶2A的核苷酸序列作为连接子，将pac基因和编码IGF-I的基因协调地融合，产生具有更高稳定性的细胞系，所述细胞系维持与用野生型SFV载体获得的表达相似的高IGF-I表达，在培养10代后，仅有约4倍的降低(图20)。后一个载体(SFV-S2-9-pac2A-IGF)还在早期传代中表现出IGF-I表达水平，所述表达水平高于用载体SFV-S2-9-IGF-pac所观察到的约2倍。

本发明的稳定细胞系，可通过包括于普通实验室手册中的常规分子生物学方法获得，如通过用本发明的病毒载体转染适宜的细胞或细胞系获得，所述普通实验室手册，如“Molecular cloning：a laboratory manual(分子克隆：实验室手册)”(Joseph Sambrook，David W.Russel Eds.2001，3rded.Cold Spring Harbor，New York)或“Current protocols in molecularbiology(最新分子生物学实验方法汇编)”(F.M.Ausubel，R.Brent，R.E.Kingston，D.D.Moore，J.A.Smith，J.G.Seidman and K.Struhl Eds，vol.2.Greene Publishing Associates and Wiley Interscience，New York，N.Y.，更新至2006年9月)。

事实上，待转染的细胞可以是允许本发明的病毒载体复制的任何真核细胞或细胞系。所述细胞或细胞系可以是来自哺乳动物的系。在特定实施方案中，待转染的所述细胞或细胞系是衍生于仓鼠肾成纤维细胞的细胞系，如BHK-21细胞系。

通过允许将本发明的病毒载体导入细胞的常规的物理或化学方法，进行细胞的转染，如通过电穿孔或通过遗传材料与阳离子脂质的结合。这些方法将用于将本发明的病毒载体作为或者RNA或者DNA进行转染。在特定实施方案中，转染通过电穿孔进行(“Current protocols in molecularbiology(最新分子生物学实验方法汇编)”；Ausubel FM et al.；同上)。

体外产生本发明稳定细胞系的方法

本发明另一个其他的方法涉及体外产生能组成型地表达目的异源产物的本发明的稳定细胞系的方法，在下文中，产生本发明稳定细胞系的方法包括：

I.用含有SFV复制子的本发明的病毒载体转染细胞，其中所述复制子含有(i)编码在亚基nsp2中具有突变P718T和R649H的SFV复制酶的核苷酸序列，(ii)含有选择基因的多核苷酸，以及(iii)含有编码目的异源产物的核苷酸序列的多核苷酸；

II.选择步骤I中产生的稳定的细胞；以及

III.培养并维持稳定的细胞。

如上文所提到的，待转染的细胞事实上可以是允许本发明的病毒载体复制的任何真核细胞或细胞系。通过非限制性的说明，所述待转染的细胞或细胞系是来自哺乳动物的系。在特定实施方案中，所述待转染的细胞或细胞系是衍生于仓鼠肾成纤维细胞的细胞系，如BHK-21细胞系。

之前已经提到本发明病毒载体的特征。本发明的病毒载体可以以RNA形式或可选地以DNA形式使用。当以RNA的形式使用时，本发明的病毒载体通过在其5’末端加入帽结构而完成。当以DNA的形式使用时，完整的载体包括真核细胞中的功能启动子、之前限定有关本发明病毒载体的任何实施方案中的SFV复制子序列和转录终止信号序列，所述启动子如巨细胞病毒(CMV)启动子，所述转录终止信号序列如衍生自SV40的信号序列。

细胞可以通过允许将本发明的病毒载体导入细胞的任何常规物理或化学方法转染，例如通过电穿孔或通过遗传材料与阳离子脂质的结合。这些方法将用于将本发明的病毒载体作为RNA或作为DNA进行转染。在特定实施方案中，通过电穿孔进行转染(“Current protocols in molecularbiology(最新分子生物学实验方法汇编)”；Ausubel FM et al.；如上文所述)。

根据并入由此细胞得以转染的本发明病毒载体的选择基因，以不同的方式选择稳定的细胞。如上文所解释的，选择基因的表达赋予转染的细胞允许它们被选择的优势。使细胞经历对转染细胞的选择条件便足够了。当用pac基因作为选择基因时，其在转染的细胞中的表达使转染的细胞是嘌呤霉素抗性的。在此情况下，向培养基中加入嘌呤霉素便足以除去非转染的细胞或已经丧失本发明病毒载体的细胞。

根据转染的细胞的类型，将稳定的细胞培养于和维持于常规的培养基和条件中，并将它们维持于转染的细胞的选择性刺激物下(例如存在嘌呤霉素)。当细胞是BHK-21时，将它们培养于已描述的条件下(“Currentprotocols in molecular biology(最新分子生物学实验方法汇编)”；AusubelFM et al.；如前述)。

体外产生目的异源产物的方法

本发明的稳定的细胞系可用于体外产生目的异源产物。结果，所述本发明的稳定的细胞系体外产生目的异源产物的用途，形成了本发明的其他方法。

因此，本发明另一方面涉及体外产生目的异源产物的方法，其包括将本发明的稳定的细胞系在允许包含于本发明的病毒载体中的目的异源产物表达的条件下培养，本发明的病毒载体用于产生本发明的稳定的细胞系。

更具体来说，体外产生目的异源产物的方法包括：

I.用含有SFV复制子的本发明的病毒载体转染细胞，其中所述复制子含有(i)编码在亚基nsp2中具有突变P718T和R649H的SFV复制酶的核苷酸序列，(ii)含有选择基因的多核苷酸，以及(iii)含有编码目的异源产物的核苷酸序列的多核苷酸；

II.选择步骤I中产生的稳定的细胞(本发明的稳定的细胞系)；

III.培养并维持所述稳定的细胞(本发明的细胞系)；以及如果需要，

IV.提取目的异源产物。

步骤I、II和III实际上对应于产生组成型地表达目的异源产物的本发明的稳定的细胞系。在此情况下，细胞将用本发明的病毒载体转染，所述本发明的病毒载体包含含有编码待产生的目的异源产物的核苷酸序列的多核苷酸。如上文所述，将所述含有编码目的异源产物的核苷酸序列的多核苷酸插入本发明病毒载体的一位置，以致其表达受SFV亚基因组启动子的控制。

如上文提到的，目的异源产物可以是任何目的蛋白或肽，如报道蛋白(β-gal等)；或具有治疗或诊断用途的蛋白、肽或抗体(或其片段)；或任何的另外的目的重组蛋白或肽。目的异源产物的示例性、非限制性的实例包括具有治疗用途的肽和蛋白，如胰岛素样生长因子I(IGF-I)、心脏营养素-1(CT1)、制瘤素M(OSM)、α干扰素(如IFNa5)、双调蛋白(AR)、神经胶质细胞衍生的神经营养因子(GDNF)、内皮细胞蛋白C/激活的蛋白C受体(EPCR)、目的或治疗或诊断用途的抗体(或其功能片段)等。

如之前产生本发明稳定细胞系的方法中所述的，实施产生本发明的稳定细胞系的步骤。

有时候可以使用处于培养基中即未被分离或纯化的目的异源产物；然而，有时候提取(分离)并任选地纯化目的异源产物可以是有利的。在此情况下，当目的异源产物是细胞内的(其不能被分泌至培养基中)时，目的异源产物的提取可以对细胞的裂解物进行，或者当目的异源产物可以分泌至周围的培养基中时，目的异源产物的提取可以对稳定细胞的上清液进行。

取决于产物的特性，适合待产生的具体目的异源产物的、用于提取和纯化肽和蛋白的任何常规方法，都可以用于提取。此类方法的示例性、非限制性实例包括，基于通过大小和/或电荷的分离(硫酸铵沉淀、凝胶过滤、超离心、电泳、电聚焦等)、通过免疫纯化的分离(亲和柱、免疫沉淀等)和通过与特异配体结合的分离的方法等。

下列实施例的目的是说明本发明，而非意图限制本发明。

本发明的实施例

材料和方法

质粒构建

质粒pSFV-1和pSFV3-LacZ由

博士(Karolinska Institute，Stockholm)(18)惠赠，之前已有描述。为了构建质粒pSFV-S2和pSFV-S3，用SacI/XhoI从pSFV-1中提取待诱变处理的、含有nsp2区域的3.5kb片段，并亚克隆至用相同的酶消化的质粒pBluescript SK(Stratagene，LaJolla，USA)中，产生质粒Blu-nsp2。通过交换PCR(crossover PCR)，将突变P718T和P718F导入该质粒的nsp2。将外部引物SF3669-VS(SEQ IDNO：3)和SF4096-RS(SEQ ID NO：4)顺序地与经设计引入各自突变的寡核苷酸对组合。对于S2，所用的内部寡核苷酸对是mutS2-VS(SEQ ID NO：5)和mutS2-RS(SEQ ID NO：6)，其重叠25个核苷酸，并且其中编码nsp2中的Pro 718的密码子CCC已经突变为编码Thr的ACG(加有下划线)。对于S3，所用的内部寡核苷酸是mutS3-RS(SEQ ID NO：7)和mutS3-RS(SEQ ID NO：8)，其重叠25个核苷酸，且其中编码nsp2的Pro 718的密码子CCC已经突变为编码Phe的TTT(加有下划线)。用Pfu进行交换PCR，产生430bp的DNA片段，将该片段用EagI/NarI消化，并在用EagI部分消化和用NarI完全消化后克隆于Blu-nsp2中，分别产生质粒Blu-nsp2-S2或Blu-nsp2-S3。通过测序，证实突变S2或S3在这些质粒中存在。最后，从Blu-nsp2-S2或Blu-nsp2-S3中提取含有突变的nsp2的SacI/XhoI 3.5kb片段，并亚克隆于用相同的酶消化的pSFV-1中，分别产生质粒pSFV-S2和pSFV-S3。为了将LacZ克隆至这些质粒中，用pSFV3-LacZ的XbaI/XmaI提取含有该基因的3.86kb的DNA片段，并将其克隆于用相同的酶消化的pSFV-S2或pSFV-S3中，分别产生质粒pSFV-S2-LacZ和pSFV-S3-LacZ。

为了产生质粒pSFV-pac，通过用NotI和HpaI消化，从质粒pBSpac(5)(J.Ortin博士惠赠，CNB，Madrid，Spain)中提取含有嘌呤霉素N-乙酰基转移酶(pac)基因的0.95kb的DNA片段。在用Klenow使NotI末端变平后，将该片段克隆于用SmaI消化的pSFV-1中，产生pSFV-pac。通过将pSFV-pac中含有大部分nsp2的3.5kb的SacI/XhoI片段替换为从含有突变S2的Blu-nsp2-S2中获得的相同片段，产生质粒pSFV-S2-pac。

通过将pSFV3-LacZ中3.2kb的RsrII/XhoI片段替换成从涵盖含有nsp2的突变P718T和R649H的复制酶区域的pSFV-S2-9-pac中获得的相同片段，产生质粒pSFV-S2-9-LacZ。为了产生双载体pSFV-S2-9-LacZ-pac，用MscI/SpeI从pSFV-pac中提取含有后接pac基因的SFV亚基因组启动子的1.9kb的盒，将其克隆至用SmaI/SpeI消化的pSFV-S2-9-LacZ中。

为了产生pSFV-RHR-pac，首先，通过PCR，将nsp2的第一突变R649H引入Blu-nps2中。简而言之，利用pSFV-1作为模板，用Pfu和寡核苷酸SF 1947-VS(SEQ ID NO：9)和SF3623-S29-RS(SEQ ID NO：10)获得1.67kb的PCR片段。在后一个寡核苷酸中，密码子CGC已被CAC取代，这导致nsp2中的突变R649H(加有下划线；观察到引物含有反向序列)。这种寡核苷酸的序列含有邻近突变R649H的nsp2的NarI位点(以斜体表示)。用BstEII/NarI消化PCR片段，产生1.36kb的DNA片段，将该片段克隆至用相同的酶消化的Blu-nsp2中，由此产生Blu-nsp2-RHR。最后，从Blu-nsp2-RHR中提取含有突变的nsp2的3.5kb的SacI/XhoI片段，并亚克隆至用相同的酶消化的pSFV-pac，产生质粒pSFV-RHR-pac。

RNA转录和转染

通过用SpeI消化，将纯化的质粒DNA制备成线性的，并利用SP6聚合酶(Amersham-Pharmacia)，在存在帽类似物(New England Biolabs，USA)的情况下，进行转录。通过以前所述的电穿孔(17)，在BHK-21细胞中转染体外合成的RNA。

复制子的包装

如所述(29)，通过用重组RNA和用辅助SFV助体-S2和助体-C-S219ARNA共电穿孔BHK-21细胞，进行病毒颗粒(vp)中SFV重组RNA的包装。通过X-gal染色用病毒的系列稀释物感染的BHK-21细胞，滴定携带LacZ作为指示基因的SFV颗粒。对于携带pac基因的SFV颗粒而言，通过对用一抗SFV nsp2特异性多克隆兔抗血清感染的BHK-21细胞的间接免疫荧光，进行滴定(E.Casales，结果还未公布)。

嘌呤霉素抗性细胞系的选择和传代

制备溶解于MEM的1mg/ml嘌呤霉素(Sigma，St.Louis，USA)溶液，过滤、等分试样并贮藏于-20℃。在用携带pac基因的SFV重组RNAs转染BHK细胞后，使细胞恢复24小时，然后加入5μg/ml的嘌呤霉素。为了选择嘌呤霉素抗性细胞，每2-3天，用含有嘌呤霉素的新培养基替换所述培养基。选择后，细胞的传代总是在存在所示浓度的嘌呤霉素的情况下进行。如果细胞用SFV-S2-pac转染，克隆单个座位，扩增并冷冻贮藏于液氮中。用于培养细胞的培养基是补充了5％胎牛血清、10％磷酸胰蛋白培养基(Invitrogene，USA)、2mM谷酰胺、20mM HEPES、100μg/ml链霉素和100IU/ml青霉素的BHK-21 Glasgow MEM(Invitrogene，USA)(完全BHK培养基)。

适应性突变的作图

用RNeasy试剂盒(Qiagen，Germany)，分离用SFV-S2-pac RNA转染后获得的嘌呤霉素抗性细胞的总细胞RNA。利用与SFV核苷酸4977-5010互补的反义寡核苷酸(SEQ ID NO：11)作为引物，用每个克隆的5μg RNA和M-MLV反转录酶(Promega，Madison，USA)合成cDNA。反转录后，通过用Taq Plus Long(Stratagene，La Jolla，USA)，用相同的反义引物和与SFV核苷酸1040-1074互补的正义寡核苷酸(SEQ ID NO：12)，进行30个循环的PCR，扩增cDNAs。用BcII(1106)和Bsu36I(4916)消化所得的3971bp的片段，并克隆于相应的pSFV-pac位点中。使来自每个单个克隆的质粒DNA线性化，并用作模板体外合成RNA，随后将合成的RNA转染至BHK-21细胞，以便测定其赋予嘌呤霉素抗性的能力。当包含于位置1106-4916之间的亚区(subregion)能允许细胞在嘌呤霉素存在的情况下存活和分裂，如克隆S2-9的情况一样，对来自两个独立质粒克隆的亚区进行完全测序。

RNA分析

用RNeasy小量试剂盒(Qiagen，Germany)，从转染的细胞或从某些细胞系中提取总RNA，并通过Northern印迹分析。将3μg总RNA在具有甲醛的1.2％琼脂糖凝胶上进行大小分级，将其转移至硝酸纤维素膜(Hybond-N+，Amersham)上，并与³²P标记的SFV亚基因组启动子特异性寡核苷酸(SEQ ID NO：13)杂交。利用PhosphorImager(Cyclone，Packard，USA)和Optiquant软件(4.0版，Packard)，测定基因组SFV RNA和亚基因组SFV RNA的相对量。

表达和复制酶加工分析

对于体外翻译实验，首先如以前所述体外转录SFV RNAs，根据制造商的说明书，用RNeasy试剂盒(Qiagen，Germany)纯化，在存在[³⁵S]-甲硫氨酸和[³⁵S]-半胱氨酸(Amersham，USA)混合物的情况下，与用核酸酶(Promega)处理的兔网织红细胞裂解物混合，并在30℃下孵育90分钟。每个翻译反应含有2.3μg纯化的转录RNA。加入Laemmli加样缓冲液终止翻译反应，并在8％的聚丙烯酰胺凝胶上通过SDS-PAGE及随后的放射自显影来分析。从用SFV载体转染的BHK-21细胞获得裂解物，用于免疫印迹分析实验，所述实验借助在缓冲液中的孵育，所述缓冲液含有1％Igepal(Sigma，USA)、50mM Tris HCl、pH 7.6的150mM NaCl、2mMEDTA和1μg/ml PMSF(Sigma，St.Louis，USA)，通过在冷冻微离心机中以6000rmp离心6分钟使其澄清，并通过Bradford分析进行定量。在8％的聚丙烯酰胺凝胶上通过SDS-PAGE分析裂解物，转移至硝酸纤维素膜上，并与作为一抗的、分别对SFV nsp3和nsp2(E.Casales，结果未公布)或肌动蛋白(Sigma，St.Louis，USA)具有特异性的多克隆兔抗血清一起孵育。用HRP偶联的兔疫球蛋白特异性绵羊抗血清作为二抗。根据制造商的说明书，利用蛋白印迹增强型化学发光试剂(Perkin Elmer Life Sciences，USA)观察蛋白。对于细胞核定位研究，利用对细胞质SFV nsp2具有特异性的Acm(由W.Bodemer惠赠)或对细胞核SFV nsp2具特异性的Acm(由L.Kaariainen博士惠赠)(16)作为一抗，进行转染细胞的间接免疫荧光(16)。

β-gal表达分析

如上文所述，裂解转染的细胞，如所述(17)，测量裂解物中β-gal的总活性，或在指示的时间用X-gal将它们染色。以每个平板中转染的细胞的平均量除每个平板检测到的β-gal的平均量，获得每个细胞产生的蛋白的量。

实施例1

携带衍生于SIN的非致细胞病变突变的SFV载体的构建和表征

产生新的非致细胞病变α病毒载体的可能方法是，利用该属不同病毒共有的序列同源性，将前述突变导入其他的α病毒中。根据这种方法，评估了在SIN病毒载体中所述的非致细胞病变突变在衍生于SFV的表达载体中的作用。之前已经证明，影响SIN Rep亚基nsp2的残基726的突变，相当大地减少了这种病毒的致细胞病变性，这一事实与突变体中较低的RNA复制水平相关(7，22)。影响这种残基的两种突变，即P726T和P726F，之前描述为对SIN分别是部分致细胞病变的和非致细胞病变的，将它们引入载体pSFV-1中的nsp2的同源残基中，产生分别携带nsp2中的突变P718T或P718F的突变体pSFV-S2和pSFV-S3。为了评估这些新载体的致细胞病变性，随后从病毒亚基因组启动子中克隆LacZ报道基因，产生载体pSFV-S2-LacZ和pSFV-S3-LacZ。体外合成这些质粒中每个质粒的RNA，并在BHK-21细胞中进行电穿孔，培养所述细胞，且在该细胞中，通过转染后在不同时间进行X-gal染色，分析β-gal的表达(图1)。与用对照SFV-LacZ RNA电穿孔的细胞不同(在该细胞中转染后24小时，多于95％的细胞表达β-gal并表现出致细胞病变表型)，用SFV-S2-LacZRNAs或SFV-S3-LacZ RNAs转染的细胞，在转染后24小时，仅有小百分比的细胞表达β-gal，且未显示致细胞病变形态。在SFV-S2-LacZ的情况中，阳性细胞的数量随着时间而增加，在电穿孔后5天，能形成表达β-gal细胞的大集落。这种作用在SFV-S3-LacZ中相当地少，用所述SFV-S3-LacZ，在X-gal染色的第5天，观察不到蓝色集落。该数据表明，突变P718T和P718F可以阻断病毒复制或转基因表达，但它们引起具有相对高频率的非致细胞病变变体，这可能是SFV体外转录或复制过程中次级适应性突变的结果。

实施例2

衍生于含有新适应性突变的SFV-S2的复制子的选择和作图

为了选择含有非致细胞病变SFV复制子的细胞群，用编码赋予嘌呤霉素抗性的嘌呤霉素N-乙酰基转移酶(pac)显性选择标志物的基因替换质粒pSFV-S2-LacZ中的LacZ报道基因，产生质粒pSFV-S2-pac。利用这种质粒作为模板，体外合成RNA，并在BHK-21细胞中进行电穿孔。电穿孔后24小时，加入5μg/ml的嘌呤霉素，选择对嘌呤霉素具有抗性的集落，随后扩增所述集落。为了鉴定所选择的细胞的复制子中可能的适应性突变，从单个克隆中提取总RNA，用特异性引物通过RT-PCR，扩增含有完全nsp2序列的SFV复制酶的3.9kb片段。之所以扩增复制酶的nsp2区域，是因为在α病毒中描述的大多数非致细胞病变突变已经在该区域进行了作图。将从每个克隆拯救的cDNA片段亚克隆至原始的质粒pSFV-pac中，替换野生型nsp2序列。为了检测非致细胞病变突变是否已经被拯救，体外合成每个新质粒的RNA，并用于对BHK-21细胞进行电穿孔。转染后24小时，加入5μg/ml的嘌呤霉素，并用甲基紫在不同的时间染色细胞，以便将它们的生长与在用最初的突变体SFV-S2-pac或用原始的SFV-pac转染的细胞中所观察到的进行比较。克隆之一，SFV-S2-9-pac，表现出明显的非致细胞病变表型，因为其赋予大多数转染的细胞嘌呤霉素抗性(图2)。其他检测的克隆表现出与SFV-S2相似的模式，在这项研究中并未进一步分析。用原始的SFV-pac转染的细胞表现出明显的致细胞病变作用，并且它们中的大多数在4天前死亡。pSFV-S2-9-pac的nsp2片段的测序结果表明，除了原始的突变P718T外，在nsp2的位置649存在另一适应性突变，在该位置，Arg已被Hys替换。这种新突变作用SFV nsp2的细胞核定位信号⁶⁴⁸RRR(27)，所述定位信号在SFV-S2-9中变为⁶⁴⁸RHR。

实施例3

突变R649H对致细胞病变性和对nsp的细胞核定位的作用

为了检查突变R649H单独对SFV致细胞病变性的作用，将这种突变引入质粒pSFV-pac中，因而产生质粒pSFV-RHR-pac。转录这种质粒的RNA，并在BHK-21中进行电穿孔，使所述细胞恢复24小时。随后加入5μg/ml的嘌呤霉素，如上文所述，通过用甲基紫染色细胞，在不同的时间分析细胞的生长(图2，右栏)。SFV-RHR-pac表现出与原始的载体SFV-pac中所观察到的模式非常相似模式，其诱发导致大多数细胞在第4天前死亡的强烈而早期的致细胞病变作用。这些结果表明，载体SFV-S2-9致细胞病变性的缺失，归因于突变P718T和R649H的组合。为了检查突变R649H对nsp2的细胞核定位的作用，用含有这种突变的载体(SFV-S2-9-pac和SFV-RHR-pac)的RNA或用不含有它们的载体(SFV-pac和SFV-S2-pac)转染BHK-21细胞，并用分别对细胞核形式或细胞质形式的SFV nsp2具特异性的单克隆抗体，通过免疫荧光，进行分析(图3)。在所有的情况下，在转染的细胞的细胞核和细胞质中，都检测到了nsp2，这表明，突变RHR未影响这种蛋白向细胞核的转运。

实施例4

用SFV-S2-9-pac转染的细胞中的RNA复制

为了测定非致细胞病变SFV双突变体的RNA复制水平，用SFV-S2-9-pac RNA对BHK-21细胞进行电穿孔，转染后24小时、48小时以及72小时，提取总RNA，并用对SFV亚基因组启动子的序列具特异性的³²P标记的寡核苷酸通过Northern印迹进行分析，其既存在于基因组RNA又存在于亚基因组RNA中(图4，泳道2-4)。将基因组和亚基因组SFV-S2-9-pac RNAs的量，以及两者间的比例，与用SFV-pac RNA转染的细胞在电穿孔后24小时所获得的进行比较(图4，泳道5)。基因组和亚基因组SFV-S2-9-pac RNAs随着时间而增加，并且看起来在转染后48小时达到高峰。在用载体SFV-S2-9-pac获得的嘌呤霉素抗性BHK细胞中观察到相似RNA水平(图4，泳道1)。在所有的情况下，产生的SFV-S2-9RNAs比在用原始的SFV-pac RNA转染的细胞中获得的量低得多(注意泳道5所受暴露比泳道1-4多72倍)。在用SFV-S2-9-pac转染并用嘌呤霉素选择的细胞中所观察到的亚基因组RNA/基因组RNA的比，比在用SFV-pac转染的细胞中所观察到的大约1.5倍(图4，下方数字)。然而，在用SFV-S2-9-pac转染但未被选择的细胞中，这种比值较大得相当可观，特别是转染后24小时，但随着时间而降低，这表明，与亚基因组RNA相比，双突变体中基因组RNA的合成可以被延迟。在用SFV-S2-9-pac转染的细胞中，也检测到在基因组和亚基因组RNA之间具有中间大小的两条另外的RNA条带(图4，泳道1-4)。未表征这些条带，但它们可能对应于可以在双SFV突变体复制过程中出现的缺损干扰RNA(defective-interfering RNAs)。最后，为了测定SFV-S2-9-pac RNA的低复制水平是否可以用反式供应的野生型复制酶恢复，将BHK-21细胞用SFV-S2-9-pac和SFV-LacZ RNAs(野生载体)同时电穿孔。24小时后，从共电穿孔的细胞中提取总RNA，并通过Northern印迹分析(图4，泳道7)。在相同的凝胶中，分析用原始SFV-pac电穿孔的细胞的RNA(图4，泳道5)和用SFV-LacZ电穿孔的细胞的RNA(图4，泳道6)，并用作每个基因组和亚基因组RNAs的分子大小标志物。在将凝胶暴露1小时后，在电穿孔的细胞中，很容易地检测到基因组和亚基因组SFV-LacZ和SFV-S2-9-pacRNAs，这表明野生型复制酶也能至少部分地恢复双突变体的复制。然而，尽管两种亚基因组RNA的量非常相似，但产生的基因组SFV-LacZ RNA的水平比突变体SV2-S2-9-pac所产生的多约2-3倍。

实施例5

突变体SFV-S2-9中复制酶的加工

在用SFV-S2-9-pac复制子转染的细胞中检测到较小量RNA，可能是由于复制酶加工过程中的变化。以多蛋白nsp1234合成SFV复制酶，其随后通过存在于nsp2羧基末端结构域中的蛋白酶活性，切割成成熟的单体组分(30)，其中已经对突变P718T和R649H进行了作图。为了检查这些突变对复制酶加工的作用，在存在[³⁵S]-甲硫氨酸和[³⁵S]-半胱氨酸的情况下，通过与兔网织红细胞裂解物一起孵育，翻译体外合成的SFV-S2-9-pac RNAs、SFV-RHR-pac RNAs和SFV-S2-pac RNAs。通过SDS-PAGE以及随后进行的放射自显影，将这些突变体中复制酶的加工模式与用原始SFV-pac RNA获得的复制酶加工模式进行比较(图5A)。在三种分析的突变体和野生型复制酶之间未在复制酶的加工上观察到差异，这使nsp单体在所有的情况中相似地聚积。为了测定复制酶加工是否在体内受到影响，用分别对nsp2(图5B，上图)或对nsp3(图5B，中央图)具特异性的兔抗血清作为一抗，通过免疫印迹，分析携带载体SFV-S2-9-pac的嘌呤霉素抗性BHK-21细胞系的裂解物，或者分析用原始SFV-pac RNA或用SFV-RHR-pac RNA转染的BHK-21细胞在电穿孔后24小时获得的裂解物。在两种情况下，衍生自SFV-pac和衍生自SFV-RHR-pac的样品都表现出非常相似的模式，因为它们表达可比量的nsp2和nsp3单体。嘌呤霉素抗性BHK-SFV-S2-9-pac细胞系中nsp2和nsp3的量低约1.5倍，这可能是由于这种载体较低的复制。即使在所分析的样品中检测到仅非显著量的高分子量产物，也可以使用抗nsp2抗血清在SFV-S2-9和两种其他载体间观察到差异条带，这可以说明S2-9复制酶的体内加工发生了小的改变。

实施例6

转基因的表达和SFV-S2-9复制子的包装

为了测定突变体SFV-S2-9中异源基因的表达水平，将SFV亚基因组启动子之后的Lac-Z报道基因克隆至该载体，产生质粒pSFV-S2-9-Lac-Z。由这种质粒体外合成RNA，并用于对BHK-21细胞进行电穿孔，电穿孔后，在不同的时间分析该细胞β-gal的表达。也用原始载体SFV-LacZ的RNA转染细胞，但由于这种载体诱发的致细胞病变作用，仅在电穿孔后24小时分析它们。转染24小时后，在用SFV-S2-9-LacZ和SFV-LacZ转染的细胞中观察到相似的β-gal表达水平，其为约15pg/细胞(图6)。这种表达水平在用SFV-S2-9-LacZ转染的细胞中随着时间而增加，转染后48小时，稳定在约30pgβ-gal/细胞。为了测定双突变体SFV-S2-9的包装效率，如所述(29)，用SFV-S2-9-LacZ RNA以及辅助SFV-助体-S2和SFV助体-C-S219A RNAs，对BHK-21细胞进行共电穿孔。电穿孔后24小时，收集细胞的上清液，并通过X-gal染色，对BHK-21细胞的单细胞层进行滴定。SFV-S2-9-LacZ RNA被相当低效地包装，其提供了7×10³pv/ml的效价，这比原始SFV-LacZ所获得的效价(5×10⁹pv/ml)低得多。为了比较野生型复制酶的存在是否可增加双突变体S2-9的包装效率，用SFV-S2-9-LacZ的RNA、SFV-pac和两种SFV辅助RNAs，对BHK-21细胞进行共电穿孔。在此情况下，观察到原始载体SFV能适度增加SFV-S2-9-LacZ颗粒的产生，电穿孔后24小时，其达到1×10⁵pv/ml的效价，所述效价是通过X-gal染色感染的BHK细胞而测定的。与SFV-pac被单独包装时获得效价(1.2×10⁹pv/ml)相比(所述效价是利用对SFV nsp2具特异性的多克隆兔抗血清作为一抗，通过感染的细胞的间接免疫荧光测定的)，原始SFV-pac RNA的包装在用SFV-S2-9-LacZ和这种载体进行共电穿孔的细胞中降低了约5倍(2.6×10⁸pv/ml)。为了测定存在于SFV-S2-9中的两个单独突变中的每一个突变具有的对包装的影响，用辅助SFV RNAs和用SFV-RHR-pac RNAs或SFV-S2-pac RNAs两者，对BHK-21细胞进行共电穿孔，如上文所述，滴定SFV-pac病毒颗粒。SFV-RHR-pac被高效价(6.5×10⁸pv/ml)包装，而SFV-S2-pac表现出非常低的包装效率(2×10⁴pv/ml)。

实施例7

利用载体SFV-S2-9产生表达LacZ的稳定细胞系

正如本研究所指出的，载体SFV-S2-9-pac可用于选择在嘌呤霉素存在的情况下可以保持复制子的细胞。为了研究是否有可能利用这种类型的载体产生表达其他转基因的稳定细胞系，将LacZ报道基因引入pSFV-S2-9-pac，产生质粒pSFV-S2-9-LacZ-pac，在该质粒中，pac和LacZ基因位于独立的亚基因组启动子的下游。体外合成这种质粒的RNA，并在BHK-21细胞中进行电穿孔。电穿孔后24小时，加入5μg/ml嘌呤霉素，且当所选择的细胞达到汇合时，在抗生素存在的情况下，进行10次传代，达30天的时期。表达β-gal的细胞的百分比，通过X-gal染色在每一代中测定，其依据传代，在70％至90％变动，但在第10代中高于85％，这表示在选择存在的情况下转基因表达的高稳定性(图7)。在无嘌呤霉素的情况下对所选择的细胞进行传代时，表达β-gal的细胞的百分比降低的很快，在第3代后低于5％。第6代和8代后，测定用嘌呤霉素选择的细胞中β-gal的表达水平，其分别达到13pg/细胞和18pg/细胞。这些数值与在用原始载体SFV-LacZ转染的细胞在转染后24小时所获得的非常相似，这表示用载体SFV-S2-9产生的细胞系可用于大量表达重组蛋白。

实施例8

其他之前限定的非致细胞病变SFV突变体的评估

将之前限定为非致细胞病变的SFV突变引入含有载体序列的质粒pSFV-1中SFV复制酶亚基nsp2的基因。这些突变包括：

-L10T(TTG变为ACC)：突变体SF2A(22)，

-L713P(CTA变为CCT)：突变体SF2C(22)。

此外，含有在nsp2中具有突变S259P和R650D的SFV载体序列的质粒pSFV-PD是由K.

博士惠赠(21)。

因此产生(或获得)质粒pSFV-SF2A、pSFV-SF2C和pSFV-PD，在病毒亚基因组启动子的控制下，将LacZ基因克隆于所述质粒中，分别获得质粒pSFV-SF2A-LacZ、pSFV-SF2C-LacZ和pSFV-PD-LacZ。

用这些质粒体外合成RNA，将所述RNA在BHK-21细胞中进行电穿孔。电穿孔后，将细胞分配于不同的平板上，在转染后的不同时间固定并用X-gal染色。X-gal染色在由LacZ基因表达β-gal的细胞中产生蓝色，这允许检测携带载体和已在不同的时间存活的细胞的数量，以及分析其形态，其为致细胞病变性指示剂。在这个实验中，将对BHK细胞致细胞病变的用SFV-LacZ RNA电穿孔的细胞，作为阴性对照使用。同样，将SFV-S2-LacZ RNA用作阳性对照，其在nsp2中携带突变P718T并在一定百分比的细胞中引起非致细胞病变表型。

在图10和图12中可以看出，突变体SFV-SF2A和SFV-PD表现出的表型与野生型SFV载体的非常相似，在转染的细胞中诱发强烈的致细胞病变作用，这表现为从第三天开始出现大量凋亡小体以及长时间(7天)后表达几乎全部缺失。与SFV-PD载体的致细胞病变特性有关的数据，还得到由K.

自己公布的结果的支持，该结果表明，在感染了携带LacZ或GFP作为报道基因的SFV-PD载体的BHK细胞中，β-gal或GFP的表达在48小时后如何达到最大，以及在接下来的3-4天显著降低(20，参阅该参考文献的图2)。突变体SFV-SF2C多少表现出较少的致细胞病变表型，但在第3天，出现许多凋亡小体，以及，尽管显然在第4天，存在高表达水平，但是，这在第7天几乎完全消失，表明这种突变体比野生型载体可能多少允许更加延长的表达，但并未终止致细胞病变。载体SFV-S2是不引起凋亡小体出现以及允许维持表达至少7天以致出现集落的唯一载体。从用SFV-S2获得的集落中的一个集落中选择携带突变P718T和R649H的载体SFV-S2-9，这是在所述载体中的LacZ基因被pac基因替换的情况下进行。图14包括用载体SFV-S2-9-LacZ RNA转染并用X-gal在不同时间染色的细胞的照片。载体S2-9未在转染的细胞中产生致细胞病变作用，所述细胞能分裂。

实施例9

利用载体SFV-S2-9获得产生心脏营养素1的稳定细胞系

在两种不同的环境下，将大鼠心脏营养素(rCT)基因引入pSFV-S2-9-pac中，产生质粒，用该质粒产生表达rCT的细胞系。出于鉴定表达rCT的稳定细胞系的目的，随后分析rCT的表达以及rCT表达的稳定性两者。

9.1质粒构建

为了产生表达心脏营养素的细胞系，根据两种不同的实施方案，引入大鼠心脏营养素(rCT)基因，产生基于pSFV-S2-9-pac的质粒：

-质粒pSFV-S2-9-rCT-pac，在该质粒中，pac和rCT基因被置于独立的亚基因组启动子的下游(图15A)；以及

-质粒pSFV-S2-9-pac2A-rCT，根据图8B所述的大体结构构建，含有在单个亚基因组启动子下游融合的pac基因和rCT基因(图15A)；在该实施方案中，将FMDV自身蛋白酶2A序列(SEQ ID NO：14)(35)引入这两个基因间，以便允许心脏营养素从融合蛋白中释放(图15A)。

为了构建质粒pSFV-S2-9-rCT-pac，事先产生克隆载体pSFV-S2-9-mcs-pac，其包含SFV-S2-9复制酶、后接多克隆位点的第一亚基因组启动子以及后接pac基因的第二亚基因组启动子。

简而言之，使寡核苷酸SEQ ID NO：15和SEQ ID NO：16杂交，产生合成的DNA片段，其具有BamHI相容的、突出的5’末端，并且该DNA片段的序列含有具有酶AvrII、ApaI、NruI和BstBI的靶标的多克隆位点，在三个可能的阅读阶段中的三个翻译终止密码子，以及SFV亚基因组启动子序列。将这个片段克隆至pSFV-S2-9-pac的BamH I位点，产生质粒pSFV-S2-9-mcs-pac。

在第二步中，利用分别与rCT基因的起始端和末端杂交且为使克隆更容易而在末端含有BamH I位点的寡核苷酸SEQ ID NO：17和SEQ IDNO：18，由质粒pRSET-rCT(36)合成含有大鼠心脏营养素基因的645bp的PCR片段。用BamH I消化PCR片段，并克隆至pSFV-S2-9-mcs-pac的BamH I位点，获得质粒pSFV-S2-9-rCT-pac。以相似的方式将相同的PCR片段克隆至用BamH I消化的pSFV-1中，产生质粒pSFV-rCT。

为了构建pSFV-S2-9-pac2A-rCT质粒，事先产生克隆载体pSFV-S2-9-pac2A，该克隆载体含有载体SFV-S2-9-pac的序列并且在该序列末端含有克隆位点SmaI/XmaI，在SFV-S2-9-pac的序列中，pac基因在其3’末端与编码FMDV自身蛋白酶2A的核苷酸序列协调地融合(35)。简而言之，利用质粒pSFV-S2-9-pac作为模板，用外部寡核苷酸SEQ ID NO：19和SEQID NO：20以及内部寡核苷酸SEQ ID NO：21和SEQ ID NO：22，进行交换PCR，产生842bp的DNA片段，用BamH I和Xma I消化该DNA片段，并克隆至用相同的酶消化的pSFV-S2-9-pac中，由此获得质粒pSFV-S2-9-pac2A。出于在pac基因的3’末端引入序列2A-XmaI以及同时除去存在于该基因内的XmaI位点的双重目的，进行交换PCR。

最后，为了产生质粒pSFV-S2-9-pac2A-rCT，利用分别与rCT基因的起始端和末端杂交且为使克隆更容易而在末端含有Xma I位点的寡核苷酸SEQ ID NO：23和SEQ ID NO：24，由质粒pRSET-rCT(36)产生含有大鼠心脏营养素基因的645bp的PCR片段。用Xma I消化PCR片段，并克隆至pSFV-S2-9-pac2A的Xma I位点，获得质粒pSFV-S2-9-pac2A-rCT。

9.2获得产生心脏营养素的稳定的细胞系以及心脏营养素的表达分析

将体外合成的每种质粒的RNA(9.1节)在BHK-21细胞中进行电穿孔。电穿孔24小时后，加入5μg/ml的嘌呤霉素，且当所选择的细胞达到汇合时，用对心脏营养素具特异性的抗体，通过免疫印迹，分析细胞裂解物中心脏营养素的表达(图15B)。

对于通过免疫印迹进行的分析实验，通过与含有1％Igepal(Sigma，USA)、50mM Tris HCl，pH 7.6、150mM NaCl、2mM EDTA和1μg/mlPMSF(Sigma，St.Louis，USA)的缓冲液一起孵育，获得用SFV的SFV载体转染的BHK-21细胞的裂解物，通过在冷冻微离心机中以6000rmp离心6分钟，使所述裂解物澄清，并通过Bradford分析对其定量。通过在12％聚丙烯酰胺凝胶上进行SDS-PAGE，分析裂解物，将它们转移至硝酸纤维素膜上，并与作为一抗的、分别抗鼠心脏营养素CT-1(R&D Systems)或肌动蛋白(Sigma，St.Louis，USA)的多克隆抗血清一起温育。将分别对大鼠或兔免疫球蛋白具特异性的山羊或绵羊抗血清与HRP偶联，作为二抗使用。根据制造商的说明书，利用蛋白印迹增强型化学发光试剂(PerkinElmer Life Sciences，USA)，观察蛋白。为了对rCT的水平进行定量，为此目的，利用Imagequant TL程序(Amersham)，通过免疫印迹分析表达rCT的细胞的不同量的裂解物，并与已知量的重组心脏营养素进行比较。

在用每一种载体产生的细胞系中，心脏营养素表达水平与用具有野生型复制酶SFV-rCT的载体RNA电穿孔的细胞获得的表达水平相似(图15B)。在所选择的细胞系中rCT的表达为约4.3pg/细胞。在用载体SFV-S2-9-pac2A-rCT产生的细胞系中，虽然存在也被免疫印迹检测到的未消化的组分，但是观察到大多数rCT已经从融合蛋白中释放。

为了分析这些载体在转染的细胞中的稳定性，在嘌呤霉素存在的情况下，将含有它们的细胞连续传代10次，达约20天，并通过免疫印迹，测定细胞裂解物中每代的rCT表达。如果细胞系是用载体SFV-S2-9-rCT-pac产生的，观察到表达维持到第5代，从第5代开始，表达逐渐显著减低，在第11代实质上消失(图16)。然而，这种稳定性的丧失未发生于含有载体SFV-S2-9-pac2A-rCT的细胞系中，在该细胞系中，表达维持恒定达至少10代(图17)，这表明转基因(rCT基因)与pac基因利用编码FMDV自身蛋白酶2A协调地融合相当程度地增加了由载体SFV-S2-9产生的细胞系中异源蛋白表达的稳定性。

实施例10

利用载体SFV-S2-9获得产生人胰岛素样生长因子(IGF-I)的稳定细胞系

通过在两种不同的环境中将人胰岛素样生长因子(IGF-I)基因引入pSFV-S2-9-pac中，产生质粒，并用该质粒产生表达IGF-I的细胞系。随后出于鉴定表达IGF-I的稳定细胞系的目的，分析IGF-I的表达和IGF-I表达的稳定性两者。

10.1质粒构建

为了产生表达IGF-I的细胞系，根据两种不同的实施方案，通过引入IGF-I基因，产生基于SFV-S2-9-pac的质粒：

-质粒SFV-S2-9-pac，在该质粒中，将pac和IGF-I基因置于独立的亚基因组启动子的下游(图18)；在这种质粒中，利用编码FMDV自身蛋白酶2A的核苷酸序列作为连接子，将IGF-I基因与SFV衣壳翻译增强子融合，因为这种策略已经在相当程度上增加了野生型SFV载体中的异源蛋白的表达(37)；以及

-质粒pSFV-S2-9-pac2A-IGF，根据图8B所述的大体结构构建，含有在单个亚基因组启动子下游融合的pac基因和IGF-I基因(图18)；在这种实施方案中，将编码FMDV自身蛋白酶2A的核苷酸序列(SEQ IDNO：14)(35)引入两个基因间，以便允许从融合蛋白释放心脏营养素(图18)。

为了构建质粒pSFV-S2-9-IGF-pac，用BglII+Klenow和SpeI消化质粒pSFVb12A-IGF-IB(38)，获得2.3kb的片段，将该片段与从用BsmI+T4pol和SpeI消化的pSFV-S2-9-pac中获得的11.1kb的片段连接。质粒pSFVb12A-IGF-IB含有在其5’末端与盒融合的人IGF-I前体序列(IGF-IB)，所述盒含有后接编码FMDV自身蛋白酶2A的核苷酸序列的、编码SFV衣壳最初34个氨基酸的序列(最小的翻译增强子或“b1”)。前体IGF-IB编码195个氨基酸的前蛋白(preprotein)，其包含IGF-I基因的结构域II、B、C、A、D、D、E、Ea、Eb和6。这种蛋白加工成分泌的成熟形式的IGF-I，丧失氨基末端II结构域和羧基末端结构域E、Ea、Eb和6(39)。

为了构建质粒pSFV-S2-9-pac2A-IGF，用XmaI消化质粒pSFVb12A-IGF-I(38)，获得含有IGF-IB序列的0.59kb片段，将该片段与事先用XmaI消化的pSFV-S2-9-pac2A(有关质粒pSFV-S2-9-pac2A-rCT的构建，其特征以及获得方式在实施例9.1中做了描述)连接。随后选择已经以正确的方向引入0.59kb片段的克隆。

10.2获得产生IGF-I的稳定的细胞系并分析IGF-I的表达

将体外合成的每种质粒的RNA(10.1节)在BHK-21细胞中进行电穿孔。电穿孔后24小时，加入5μg/ml的嘌呤霉素，当所选择的细胞达到汇合时，通过对人IGF-I具特异性的ELISA，分析不同时间收集的细胞上清液中IGF-I的表达(图19)。

利用特异测量游离的人IGF-I(游离的IGF-I，货号DSL-10-9400，Diag-nostic Systems laboratories，Webster，Texas，USA)的ELISA试剂盒，分析细胞上清液中IGF-I的表达。对于每个所分析的传代，每孔接种5×10⁵个细胞，等待4个小时，以便细胞附着，并通过加入1ml具有5％胎牛血清(37)和5μg/ml嘌呤霉素的Glasgow-MEM培养基，使培养基发生改变。24、48或72小时后，收集上清液，将其在冷冻微离心机中以6,000rpm离心5分钟，以便除去细胞残余物，并贮存于-80℃，直到分析，出于控制存在于每个样品中的细胞的量的目的，从已经收集了上清液的相同孔中收集BHK细胞，通过在含有1％Igepal(Sigma，USA)、50mM Tris HCl，pH7.6、150mM NaCl、2mM EDTA以及1μg/ml PMSF(Sigma，St.Louis，USA)的缓冲液中孵育，将其裂解，通过在冷冻微离心机中以6000rmp离心，使其澄清，并通过Bradford分析，对它们进行定量。通过Bradford获得的蛋白量的值与所有分析的样品中的值非常相似。

获得的有关收集到的细胞上清液中IGF-I表达的结果表明，数小时后，在用每种非致细胞病变载体产生的细胞系的上清液中IGF-I的表达水平，仅比用野生型载体SFV-IGF-I的RNA电穿孔的细胞中获得的表达水平低约1.5-2倍(图19)。相比在用SFV-S2-9-IGF-pac选择的细胞系中的表达(21.3pg/细胞)，在用载体SFV-S2-9-pac2A-IGF获得的细胞系中的表达(34.5pg/细胞)多少较大。对更长的时间取得的上清液中IGF-I的表达分析证明，IGF-I可以聚积，在载体SFV-S2-9-pac2A-IGF和SFV-S2-9-IGF-pac中分别多达67pg/细胞和34pg/细胞的最大值。这些结果表明，IGF-I被分泌至细胞外培养基中，这表示正确的多蛋白加工。

为了分析这些载体在转染的细胞中的稳定性，在存在嘌呤霉素的情况下使含有它们的细胞进行10次连续传代，达约20天的时期，通过对人IGF-I具特异性的ELISA，测定每次传代24小时后收集的细胞上清液中IGF-I的表达。当细胞系是用载体SFV-S2-9-IGF-pac产生时，观察到表达维持到第4代，从第4代开始，表达开始显著降低，达到在第10代低80倍的水平(图20)。这种稳定性的丧失不是如此显著地发生在含有载体SFV-S2-9-pac2A-IGF的细胞系中，在该细胞系内，表达几乎保持恒定，第1代至第10代降低4倍(图20)。该结果证实，转基因与pac基因利用编码FMDV自身蛋白酶2A的核苷酸序列协调地融合，相当地增加了用载体SFV-S2-9产生的细胞系中异源蛋白表达的稳定性。

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序列表

<110>西玛生物医学信息公司

<120>病毒载体及其应用

<130>P3499PC00

<140>ES P200603036

<141>2006-11-28

<140>ES P200700882

<141>2007-04-07

<160>24

<170>PatentIn version 3.3

<210>1

<211>7382

<212>DNA

<213>Semliki森林病毒

<220>

<221>5′UTR

<222>(1)..(86)

<223>非翻译的5′UTR末端，包括复制所需的序列

<220>

<221>misc_feature

<222>(87)..(89)

<223>复制酶翻译起始三联子

<220>

<221>misc_feature

<222>(3642)..(3644)

<223>对应于突变R649H的三联子

<220>

<221>misc_feature

<222>(3849)..(3851)

<223>对应于突变P718T的三联子

<220>

<221>misc_feature

<222>(7351)..(7374)

<223>重叠的病毒亚基因组启动子

<220>

<221>misc_feature

<222>(7380)..(7382)

<223>复制酶翻译终止三联子

<400>1

gatggcggat gtgtgacata cacgacgcca aaagattttg ttccagctcc tgccacctcc    60

gctacgcgag agattaacca cccacgatgg ccgccaaagt gcatgttgat attgaggctg    120

acagcccatt catcaagtct ttgcagaagg catttccgtc gttcgaggtg gagtcattgc    180

aggtcacacc aaatgaccat gcaaatgcca gagcattttc gcacctggct accaaattga    240

tcgagcagga gactgacaaa gacacactca tcttggatat cggcagtgcg ccttccagga    300

gaatgatgtc tacgcacaaa taccactgcg tatgccctat gcgcagcgca gaagaccccg    360

aaaggctcga tagctacgca aagaaactgg cagcggcctc cgggaaggtg ctggatagag    420

agatcgcagg aaaaatcacc gacctgcaga ccgtcatggc tacgccagac gctgaatctc    480

ctaccttttg cctgcataca gacgtcacgt gtcgtacggc agccgaagtg gccgtatacc    540

aggacgtgta tgctgtacat gcaccaacat cgctgtacca tcaggcgatg aaaggtgtca    600

gaacggcgta ttggattggg tttgacacca ccccgtttat gtttgacgcg ctagcaggcg    660

cgtatccaac ctacgccaca aactgggccg acgagcaggt gttacaggcc aggaacatag    720

gactgtgtgc agcatccttg actgagggaa gactcggcaa actgtccatt ctccgcaaga    780

agcaattgaa accttgcgac acagtcatgt tctcggtagg atctacattg tacactgaga    840

gcagaaagct actgaggagc tggcacttac cctccgtatt ccacctgaaa ggtaaacaat    900

cctttacctg taggtgcgat accatcgtat catgtgaagg gtacgtagtt aagaaaatca    960

ctatgtgccc cggcctgtac ggtaaaacgg tagggtacgc cgtgacgtat cacgcggagg    1020

gattcctagt gtgcaagacc acagacactg tcaaaggaga aagagtctca ttccctgtat    1080

gcacctacgt cccctcaacc atctgtgatc aaatgactgg catactagcg accgacgtca    1140

caccggagga cgcacagaag ttgttagtgg gattgaatca gaggatagtt gtgaacggaa    1200

gaacacagcg aaacactaac acgatgaaga actatctgct tccgattgtg gccgtcgcat    1260

ttagcaagtg ggcgagggaa tacaaggcag accttgatga tgaaaaacct ctgggtgtcc    1320

gagagaggtc acttacttgc tgctgcttgt gggcatttaa aacgaggaag atgcacacca    1380

tgtacaagaa accagacacc cagacaatag tgaaggtgcc ttcagagttt aactcgttcg    1440

tcatcccgag cctatggtct acaggcctcg caatcccagt cagatcacgc attaagatgc    1500

ttttggccaa gaagaccaag cgagagttaa tacctgttct cgacgcgtcg tcagccaggg    1560

atgctgaaca agaggagaag gagaggttgg aggccgagct gactagagaa gccttaccac    1620

ccctcgtccc catcgcgccg gcggagacgg gagtcgtcga cgtcgacgtt gaagaactag    1680

agtatcacgc aggtgcaggg gtcgtggaaa cacctcgcag cgcgttgaaa gtcaccgcac    1740

agccgaacga cgtactacta ggaaattacg tagttctgtc cccgcagacc gtgctcaaga    1800

gctccaagtt ggcccccgtg caccctctag cagagcaggt gaaaataata acacataacg    1860

ggagggccgg cggttaccag gtcgacggat atgacggcag ggtcctacta ccatgtggat    1920

cggccattcc ggtccctgag tttcaagctt tgagcgagag cgccactatg gtgtacaacg    1980

aaagggagtt cgtcaacagg aaactatacc atattgccgt tcacggaccg tcgctgaaca    2040

ccgacgagga gaactacgag aaagtcagag ctgaaagaac tgacgccgag tacgtgttcg    2100

acgtagataa aaaatgctgc gtcaagagag aggaagcgtc gggtttggtg ttggtgggag    2160

agctaaccaa ccccccgttc catgaattcg cctacgaagg gctgaagatc aggccgtcgg    2220

caccatataa gactacagta gtaggagtct ttggggttcc gggatcaggc aagtctgcta    2280

ttattaagag cctcgtgacc aaacacgatc tggtcaccag cggcaagaag gagaactgcc    2340

aggaaatagt taacgacgtg aagaagcacc gcgggaaggg gacaagtagg gaaaacagtg    2400

actccatcct gctaaacggg tgtcgtcgtg ccgtggacat cctatatgtg gacgaggctt    2460

tcgcttgcca ttccggtact ctgctggccc taattgctct tgttaaacct cggagcaaag    2520

tggtgttatg cggagacccc aagcaatgcg gattcttcaa tatgatgcag cttaaggtga    2580

acttcaacca caacatctgc actgaagtat gtcataaaag tatatccaga cgttgcacgc    2640

gtccagtcac ggccatcgtg tctacgttgc actacggagg caagatgcgc acgaccaacc    2700

cgtgcaacaa acccataatc atagacacca caggacagac caagcccaag ccaggagaca    2760

tcgtgttaac atgcttccga ggctgggcaa agcagctgca gttggactac cgtggacacg    2820

aagtcatgac agcagcagca tctcagggcc tcacccgcaa aggggtatac gccgtaaggc    2880

agaaggtgaa tgaaaatccc ttgtatgccc ctgcgtcgga gcacgtgaat gtactgctga    2940

cgcgcactga ggataggctg gtgtggaaaa cgctggccgg cgatccctgg attaaggtcc    3000

tatcaaacat tccacagggt aactttacgg ccacattgga agaatggcaa gaagaacacg    3060

acaaaataat gaaggtgatt gaaggaccgg ctgcgcctgt ggacgcgttc cagaacaaag    3120

cgaacgtgtg ttgggcgaaa agcctggtgc ctgtcctgga cactgccgga atcagattga    3180

cagcagagga gtggagcacc ataattacag catttaagga ggacagagct tactctccag    3240

tggtggcctt gaatgaaatt tgcaccaagt actatggagt tgacctggac agtggcctgt    3300

tttctgcccc gaaggtgtcc ctgtattacg agaacaacca ctgggataac agacctggtg    3360

gaaggatgta tggattcaat gccgcaacag ctgccaggct ggaagctaga cataccttcc    3420

tgaaggggca gtggcatacg ggcaagcagg cagttatcgc agaaagaaaa atccaaccgc    3480

tttctgtgct ggacaatgta attcctatca accgcaggct gccgcacgcc ctggtggctg    3540

agtacaagac ggttaaaggc agtagggttg agtggctggt caataaagta agagggtacc    3600

acgtcctgct ggtgagtgag tacaacctgg ctttgcctcg acacagggtc acttggttgt    3660

caccgctgaa tgtcacaggc gccgataggt gctacgacct aagtttagga ctgccggctg    3720

acgccggcag gttcgacttg gtctttgtga acattcacac ggaattcaga atccaccact    3780

accagcagtg tgtcgaccac gccatgaagc tgcagatgct tgggggagat gcgctacgac    3840

tgctaaaaac gggcggcatc ttgatgagag cttacggata cgccgataaa atcagcgaag    3900

ccgttgtttc ctccttaagc agaaagttct cgtctgcaag agtgttgcgc ccggattgtg    3960

tcaccagcaa tacagaagtg ttcttgctgt tctccaactt tgacaacgga aagagaccct    4020

ctacgctaca ccagatgaat accaagctga gtgccgtgta tgccggagaa gccatgcaca    4080

cggccgggtg tgcaccatcc tacagagtta agagagcaga catagccacg tgcacagaag    4140

cggctgtggt taacgcagct aacgcccgtg gaactgtagg ggatggcgta tgcagggccg    4200

tggcgaagaa atggccgtca gcctttaagg gagcagcaac accagtgggc acaattaaaa    4260

cagtcatgtg cggctcgtac cccgtcatcc acgctgtagc gcctaatttc tctgccacga    4320

ctgaagcgga aggggaccgc gaattggccg ctgtctaccg ggcagtggcc gccgaagtaa    4380

acagactgtc actgagcagc gtagccatcc cgctgctgtc cacaggagtg ttcagcggcg    4440

gaagagatag gctgcagcaa tccctcaacc atctattcac agcaatggac gccacggacg    4500

ctgacgtgac catctactgc agagacaaaa gttgggagaa gaaaatccag gaagccattg    4560

acatgaggac ggctgtggag ttgctcaatg atgacgtgga gctgaccaca gacttggtga    4620

gagtgcaccc ggacagcagc ctggtgggtc gtaagggcta cagtaccact gacgggtcgc    4680

tgtactcgta ctttgaaggt acgaaattca accaggctgc tattgatatg gcagagatac    4740

tgacgttgtg gcccagactg caagaggcaa acgaacagat atgcctatac gcgctgggcg    4800

aaacaatgga caacatcaga tccaaatgtc cggtgaacga ttccgattca tcaacacctc    4860

ccaggacagt gccctgcctg tgccgctacg caatgacagc agaacggatc gcccgcctta    4920

ggtcacacca agttaaaagc atggtggttt gctcatcttt tcccctcccg aaataccatg    4980

tagatggggt gcagaaggta aagtgcgaga aggttctcct gttcgacccg acggtacctt    5040

cagtggttag tccgcggaag tatgccgcat ctacgacgga ccactcagat cggtcgttac    5100

gagggtttga cttggactgg accaccgact cgtcttccac tgccagcgat accatgtcgc    5160

tacccagttt gcagtcgtgt gacatcgact cgatctacga gccaatggct cccatagtag    5220

tgacggctga cgtacaccct gaacccgcag gcatcgcgga cctggcggca gatgtgcacc    5280

ctgaacccgc agaccatgtg gacctcgaga acccgattcc tccaccgcgc ccgaagagag    5340

ctgcatacct tgcctcccgc gcggcggagc gaccggtgcc ggcgccgaga aagccgacgc    5400

ctgccccaag gactgcgttt aggaacaagc tgcctttgac gttcggcgac tttgacgagc    5460

acgaggtcga tgcgttggcc tccgggatta ctttcggaga cttcgacgac gtcctgcgac    5520

taggccgcgc gggtgcatat attttctcct cggacactgg cagcggacat ttacaacaaa    5580

aatccgttag gcagcacaat ctccagtgcg cacaactgga tgcggtccag gaggagaaaa    5640

tgtacccgcc aaaattggat actgagaggg agaagctgtt gctgctgaaa atgcagatgc    5700

acccatcgga ggctaataag agtcgatacc agtctcgcaa agtggagaac atgaaagcca    5760

cggtggtgga caggctcaca tcgggggcca gattgtacac gggagcggac gtaggccgca    5820

taccaacata cgcggttcgg tacccccgcc ccgtgtactc ccctaccgtg atcgaaagat    5880

tctcaagccc cgatgtagca atcgcagcgt gcaacgaata cctatccaga aattacccaa    5940

cagtggcgtc gtaccagata acagatgaat acgacgcata cttggacatg gttgacgggt    6000

cggatagttg cttggacaga gcgacattct gcccggcgaa gctccggtgc tacccgaaac    6060

atcatgcgta ccaccagccg actgtacgca gtgccgtccc gtcacccttt cagaacacac    6120

tacagaacgt gctagcggcc gccaccaaga gaaactgcaa cgtcacgcaa atgcgagaac    6180

tacccaccat ggactcggca gtgttcaacg tggagtgctt caagcgctat gcctgctccg    6240

gagaatattg ggaagaatat gctaaacaac ctatccggat aaccactgag aacatcacta    6300

cctatgtgac caaattgaaa ggcccgaaag ctgctgcctt gttcgctaag acccacaact    6360

tggttccgct gcaggaggtt cccatggaca gattcacggt cgacatgaaa cgagatgtca    6420

aagtcactcc agggacgaaa cacacagagg aaagacccaa agtccaggta attcaagcag    6480

cggagccatt ggcgaccgct tacctgtgcg gcatccacag ggaattagta aggagactaa    6540

atgctgtgtt acgccctaac gtgcacacat tgtttgatat gtcggccgaa gactttgacg    6600

cgatcatcgc ctctcacttc cacccaggag acccggttct agagacggac attgcatcat    6660

tcgacaaaag ccaggacgac tccttggctc ttacaggttt aatgatcctc gaagatctag    6720

gggtggatca gtacctgctg gacttgatcg aggcagcctt tggggaaata tccagctgtc    6780

acctaccaac tggcacgcgc ttcaagttcg gagctatgat gaaatcgggc atgtttctga    6840

ctttgtttat taacactgtt ttgaacatca ccatagcaag cagggtactg gagcagagac    6900

tcactgactc cgcctgtgcg gccttcatcg gcgacgacaa catcgttcac ggagtgatct    6960

ccgacaagct gatggcggag aggtgcgcgt cgtgggtcaa catggaggtg aagatcattg    7020

acgctgtcat gggcgaaaaa cccccatatt tttgtggggg attcatagtt tttgacagcg    7080

tcacacagac cgcctgccgt gtttcagacc cacttaagcg cctgttcaag ttgggtaagc    7140

cgctaacagc tgaagacaag caggacgaag acaggcgacg agcactgagt gacgaggtta    7200

gcaagtggtt ccggacaggc ttgggggccg aactggaggt ggcactaaca tctaggtatg    7260

aggtagaggg ctgcaaaagt atcctcatag ccatggccac cttggcgagg gacattaagg    7320

cgtttaagaa attgagagga cctgttatac acctctacgg cggtcctaga ttggtgcgtt    7380

aa                                                                   7382

<210>2

<211>841

<212>DNA

<213>Semliki森林病毒

<220>

<221>3′UTR

<222>(1)..(841)

<223>非翻译的SFV3′末端，包括复制所需的序列

<220>

<221>misc_feature

<222>(772)..(841)

<223>聚腺嘌呤(Poly A)尾

<400>2

attacatccc tacgcaaacg ttttacggcc gccggtggcg cccgcgcccg gcggcccgtc    60

cttggccgtt gcaggccact ccggtggctc ccgtcgtccc cgacttccag gcccagcaga    120

tgcagcaact catcagcgcc gtaaatgcgc tgacaatgag acagaacgca attgctcctg    180

ctaggcctcc caaaccaaag aagaagaaga caaccaaacc aaagccgaaa acgcagccca    240

agaagatcaa cggaaaaacg cagcagcaaa agaagaaaga caagcaagcc gacaagaaga    300

agaagaaacc cggaaaaaga gaaagaatgt gcatgaagat tgaaaatgac tgtatcttcg    360

tatgcggcta gccacagtaa cgtagtgttt ccagacatgt cgggcaccgc actatcatgg    420

gtgcagaaaa tctcgggtgg tctgggggcc ttcgcaatcg gcgctatcct ggtgctggtt    480

gtggtcactt gcattgggct ccgcagataa gttagggtag gcaatggcat tgatatagca    540

agaaaattga aaacagaaaa agttagggta agcaatggca tataaccata actgtataac    600

ttgtaacaaa gcgcaacaag acctgcgcaa ttggccccgt ggtccgcctc acggaaactc    660

ggggcaactc atattgacac attaattggc aataattgga agcttacata agcttaattc    720

gacgaataat tggattttta ttttattttg caattggttt ttaatatttc caaaaaaaaa    780

aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa    840

a                                                                    841

<210>3

<211>21

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>引物SF3669-VS

<400>3

aatgtcacag gcgccgatag g                                              21

<210>4

<211>21

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>引物SF4096-RS

<400>4

ggtgcacacc cggccgtgtg c                        21

<210>5

<211>37

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>引物mutS2-VS

<400>5

gactgctaaa aacgggcggc agcctcttga tgagagc       37

<210>6

<211>38

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>引物mutS2-RS

<400>6

aagaggctgc cgcccgtttt tagcagtcgt agcgcatc      38

<210>7

<211>37

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>引物mutS3-VS

<400>7

gactgctaaa atttggcggc agcctcttga tgagagc       37

<210>8

<211>38

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>引物mutS3-RS

<400>8

aagaggctgc cgccaaattt tagcagtcgt agcgcatc      38

<210>9

<211>18

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>引物SF1947-VS

<400>9

cggtccctga gtttcaag                                                  18

<210>10

<211>71

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>引物SF3623-S29-RS

<400>10

agcacctatc ggcgcctgtg acattcagcg gtgacaacca agtgaccctg tgtcgaggca    60

aagccaggtt g                                                         71

<210>11

<211>34

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>引物

<400>11

tctcgcactt taccttctgc accccatcta catg                                34

<210>12

<211>35

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>引物

<400>12

cacagacact gtcaaaggag aaagagtctc attcc                               35

<210>13

<211>21

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>引物

<400>13

gaattctgtg tattaacgca c                                              21

<210>14

<211>51

<212>DNA

<213>口疮病毒

<400>14

aattttgacc ttcttaagct tgcgggagac gtcgagtcca accctgggcc c             51

<210>15

<211>92

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>引物

<400>15

gatcctaggg ccctcgcgat tcgaataatt gattaattat acacctctac ggcggtccta    60

gattggtgcg ttaatacaca gaattctgat tc                                  92

<210>16

<211>92

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>引物

<400>16

gatcgaatca gaattctgtg tattaacgca ccaatctagg accgccgtag aggtgtataa    60

ttaatcaatt attcgaatcg cgagggccct ag                                  92

<210>17

<211>36

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>引物

<400>17

gggggatcct agcaccatga gccagaggga gggaag                              36

<210>18

<211>34

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>引物

<400>18

gggggatcca catatgtcag gcaacgcccc ctgg                                34

<210>19

<211>20

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>引物

<400>19

ttggcgaggg acattaaggc                                                20

<210>20

<211>91

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>引物

<400>20

cactggatat ctcacccggg cccagggttg gactcgacgt ctcccgcaag cttaagaagg    60

tcaaaattgg caccgggctt gcgggtcatg c                                   91

<210>21

<211>41

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>引物

<400>21

ggcgagggtg cgtacggccc gcgggacgtc gtcgcgggtg g                        41

<210>22

<211>40

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>引物

<400>22

gccacccgcg acgacgtccc gcgggccgta cgcaccctcg                          40

<210>23

<211>36

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>引物

<400>23

cgtatacgta cccgggatga gccagaggga gggaag                              36

<210>24

<211>34

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>引物

<400>24

cgtatacgta cccgggtcag gcaacgcccc ctgg    34

Claims (27)

1.含有Semliki森林病毒(SFV)复制子的病毒载体，其中所述复制子含有(i)编码在亚基nsp2中具有突变P718T和R649H的SFV复制酶的核苷酸序列，(ii)含有选择基因的多核苷酸，以及(iii)含有编码目的异源产物的核苷酸序列的多核苷酸。

2.如权利要求1所述的病毒载体，含有SEQ ID NO：1和SEQ IDNO：2。

3.如权利要求1所述的病毒载体，含有：

a)含有编码目的异源产物的核苷酸序列的多核苷酸，其表达受第一SFV亚基因组启动子(SG1)的控制；以及

b)含有选择基因的多核苷酸，其表达受第二SFV亚基因组启动子(SG2)的控制。

4.如权利要求3所述的病毒载体，其中所述第一和第二SFV亚基因组启动子是相同的。

5.如权利要求3所述的病毒载体，其中所述第一和第二SFV亚基因组启动子是不同的。

6.如权利要求1所述的病毒载体，含有处于亚基因组启动子下游的构建体，所述构建体包含所述含有选择基因的多核苷酸和所述含有编码目的异源产物的核苷酸序列的多核苷酸，上述多核苷酸协调地融合。

7.如权利要求6所述的病毒载体，其中所述含有选择基因的多核苷酸通过多核苷酸连接子与所述含有编码目的异源产物的核苷酸序列的多核苷酸协调地融合。

8.如权利要求7所述的病毒载体，其中所述连接子是含有编码翻译后(自身)蛋白水解切割位点的核苷酸序列的多核苷酸。

9.如权利要求8所述的病毒载体，其中所述连接子是含有编码(自身)蛋白酶的核苷酸序列的多核苷酸，所述蛋白酶在由所述选择基因的翻译和所述编码目的异源产物的核苷酸序列的翻译产生的蛋白间发挥顺式作用。

10.如权利要求9所述的病毒载体，其中所述(自身)蛋白酶是口蹄疫病毒(FMDV)自身蛋白酶2A。

11.如权利要求8所述的病毒载体，其中所述连接子是含有编码反式作用蛋白酶的切割位点的核苷酸序列的多核苷酸。

12.如权利要求11所述的病毒载体，其中所述反式作用蛋白酶是烟草蚀纹病毒(ETV)蛋白酶。

13.如权利要求8所述的病毒载体，其中所述连接子是含有编码能被化学试剂识别的切割位点的核苷酸序列的多核苷酸。

14.如权利要求6所述的病毒载体，其中所述含有选择基因的多核苷酸的3’末端，与所述含有编码目的异源产物的核苷酸序列的多核苷酸的5’末端协调地融合。

15.如权利要求6所述的病毒载体，其中所述含有编码目的异源产物的核苷酸序列的多核苷酸的3’末端，与所述含有选择基因的多核苷酸的5’末端协调地融合。

16.如权利要求1所述的病毒载体，其中所述选择基因是其表达赋予抗生素抗性的基因、允许合成培养基中遗漏的必需营养素的基因或赋予用所述病毒载体转染的细胞选择优势的基因。

17.如权利要求16所述的病毒载体，其中所述选择基因是其表达赋予潮霉素抗性(hph)的基因、其表达赋予新霉素抗性(neoR)的基因或编码嘌呤霉素N-乙酰基转移酶(pac)的基因，所述编码嘌呤霉素N-乙酰基转移酶(pac)的基因的表达赋予嘌呤霉素抗性。

18.如权利要求1所述的病毒载体，其中所述目的异源产物是报道蛋白或肽；具有治疗或诊断用途的肽、蛋白或抗体或所述抗体的片段；或重组蛋白或肽。

19.如权利要求18所述的病毒载体，其中所述目的异源产物选自胰岛素样生长因子I(IGF-I)、心脏营养素-1、制瘤素M(OSM)、α干扰素、双调蛋白(AR)、神经胶质细胞衍生的神经营养因子(GDNF)、内皮细胞蛋白C/激活的蛋白C受体(EPCR)和目的或者治疗或诊断用途的抗体或其功能片段。

20.如权利要求1-19中任一项所述的病毒载体在体外产生可组成型地表达目的异源产物的稳定细胞系中的用途。

21.可组成型地表达目的异源产物的稳定细胞系，其中它是用如权利要求1-19中任一项所述的病毒载体转染的细胞系。

22.体外产生权利要求21所述的可组成型地表达目的异源产物的稳定细胞系的方法，包括：

I.用权利要求1-19中任一项所述的病毒载体转染细胞；

II.选择步骤I中产生的稳定细胞；以及

III.培养并维持所述稳定细胞。

23.如权利要求22所述的方法，其中待转染的所述细胞是真核细胞或真核细胞系，其优选来自哺乳动物。

24.如权利要求22所述的方法，其中待转染的所述细胞通过电穿孔或通过所述遗传材料与阳离子脂质的结合而转染。

25.如权利要求21所述的稳定细胞系在体外产生目的异源产物中的用途。

26.体外产生目的异源产物的方法，包括培养如权利要求21所述的稳定细胞系，所述培养在允许目的异源产物表达的条件下进行，所述目的异源产物为用来产生所述稳定细胞系的病毒载体所含有。

27.如权利要求26所述的方法，包括：

I.用权利要求1-19中任一项所述的病毒载体转染细胞；

II.选择步骤I中产生的稳定细胞；

III.培养并维持所述稳定细胞；以及，如果需要，

IV.提取所述目的异源产物。

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