CN106754755A - 一种西门利克森林病毒复制子及其在稀疏或精细神经元标记中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种西门利克森林病毒复制子及其在稀疏或精细神经元标记中的应用。利用SEQ ID NO.8所述的复制子成功制备出携带绿色荧光蛋白基因且具有单次感染性的SFV病毒，且该病毒感染宿主的效率可以进行控制，可实现鼠脑神经细胞的精细标记。本发明成功获得携带绿色荧光蛋白基因且具有单次感染性的SFV病毒，在细胞精细形态的描绘、神经环路标记、非人灵长类神经细胞的标记、药物筛选平台的建立、药物抑制病毒作用机制、病毒疫苗和诊断试剂的研发、动物模型的建立、病毒复制和致病机制的分析等方面具有广泛的应用价值。

Description

一种西门利克森林病毒复制子及其在稀疏或精细神经元标记中的应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，更具体涉及一种西门利克森林病毒复制子及其在稀疏或精细神经元标记中的应用。

背景技术

人脑是自然界中最为复杂的系统之一,而神经网络是大脑行使功能的基础，神经网络的正常连接，使得机体产生正常的生理活动，如认知、学习、记忆和恐惧等；神经网络的异常往往导致神经疾病的出现，尚无有效手段来治疗这些神经疾病。目前，正常生理活动和致病机制均不清楚，主要的原因在于脑神经网络连接信息的缺乏。因此，开展脑神经环路的研究而绘制高精度的脑功能连接图谱，对于了解人的生理活动和致病机制具有重要的意义。

西门利克森林病毒(Semliki forest virus，SFV)属于披膜病毒科甲病毒属，其基因组为单股正链RNA，长度约为12kb。基因组编码的多聚蛋白可切割成4个结构蛋白(C、P62、6K和E1)和4个非结构蛋白(nsP1、nsP2、nsP3和nsP4)。塞姆利基森林病毒具有广泛的宿主范围，包括：人、鼠、猴等，能够感染神经系统，一方面不利于人类的健康和农业生产，另一方面，这种感染特性可以使得其成为介导外源基因到宿主体内的载体，另外，西门利克森林病毒感染脑神经系统的特性使其成为具备解析神经环路的能力。但是因为存在一系列工艺和技术改造方面的问题，所以目前其还没有应用到细胞精细形态的描绘、灵长类神经环路的标记等方面。而本发明通过一系列的条件优化、系统的改造和升级，获得了一种高效且稳定的具有单次感染特性的表达绿色荧光蛋白的SFV系统，明确了其在非人灵长类神经环路应用方面的效果，为开展脑科学研究提供了良好的工具系统。

随着分子生物学的不断发展，科学家已经能够通过反向遗传学的手段来定向改造病毒，为深入开展相关的病毒学研究提供了良好的工具。因此，本发明分别采用不同的技术途径获得了一种高效且稳定的具有单次感染特性的表达绿色荧光蛋白的SFV系统。将在神经细胞和非神经细胞精细形态的描绘、灵长类和非灵长类解析脑神经环路、病毒抗原表位分析和药物(如抗体药物)筛选、疫苗和诊断试剂的研发、动物模型的建立和病毒复制与致病机制的分析等方面具有广泛的应用价值和前景。

发明内容

本发明的目的在于提供了一种西门利克森林病毒复制子，该复制子为含有荧光蛋白基因和SEQ ID NO.4所示序列的pSFV-replicon。该复制子可用于西门利克森林病毒类病毒颗粒的制备。

本发明还有一个目的在于提供了一种西门利克森林病毒复制子的应用，包括利用该复制子制备西门利克森林病毒类病毒颗粒，或利用制备出的病毒样颗粒在稀疏或精细标记神经元中的应用，同时，该复制子还可用于蛋白表达、基因治疗、神经细胞精细形态的描绘、神经环路的解析、灵长类神经细胞的标记、神经环路稀疏标记、病毒抗原表位分析和药物(如抗体药物)筛选、疫苗和诊断试剂的研发、动物模型的建立和病毒复制与致病机制的分析等方面具有广泛的应用价值。

为了实现以上目的，本发明采用如下技术方案：

一种用于在体稀疏精细标记神经元的西门利克森林病毒复制子，该复制子为含有荧光蛋白基因和SEQ ID NO.4所示序列的pSFV-replicon。

优选的，使用BamHI+XhoI酶切pSFV-replicon(Lundstrom,K et al.,(2003)Mol.Ther.7,202-209.)，然后采用Vazyme同源重组试剂盒将SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:4片段插入到pSFV-replicon，将重组产物转化感受态HB101，PCR鉴定为阳性的克隆进行培养并抽提质粒进行测序，测序正确的克隆命名为pSFV-replicon-EGFP，其序列为SEQ ID NO:8所示。一种用于在体稀疏精细标记神经元的西门利克森林病毒复制子的应用，包括：

1.西门利克森林病毒复制子制备表达绿色荧光蛋白的单次感染性的西门利克森林病毒类病毒颗粒，包括制备出的激活的西门利克森林病毒类病毒颗粒或未激活的西门利克森林病毒类病毒颗粒。

2.西门利克森林病毒复制子制备出的病毒样颗粒在制备稀疏或精细标记神经元中药物的应用，所述的病毒样颗粒在鼠脑中的有效感染数目为1-50个，优选感染数目为1-15个。

所述应用特别适用于鼠脑神经细胞中的稀疏或精细标记。

本发明提供的一种在体稀疏精细标记神经元的西门利克森林病毒复制子的制备方法也适合于与西门利克森林病毒同科的病毒的构建，例如委内瑞拉马脑炎病毒(Venezuelanequine encephalitis virus,VEEV)和辛德毕斯病毒(Sindbis virus,SINV)。西门利克森林病毒复制子或其制备出的病毒样颗粒不仅可用于在体稀疏精细标记神经元，还可用于非人灵长类神经细胞的快速标记，蛋白表达、基因治疗、神经环路的解析、神经环路稀疏标记、病毒抗原表位分析和药物(如抗体药物)筛选、疫苗和诊断试剂的研发、动物模型的建立和病毒复制与致病机制的分析。

本发明与现有技术相比，具有以下优点和效果：

1.本发明提供了一种高效、便捷的表达外源蛋白的类西门利克森林病毒的颗粒，该平台制备的病毒具有可视化的特点，便于开展相关的研究。

2.本发明对于开展在体稀疏且精细标记神经元具有重要价值，同时对于其他应用性研究(如蛋白表达、基因治疗、非人灵长类神经细胞的标记、神经环路标记、药物筛选、抗原表位分析、新型疫苗和诊断试剂等)和基础性研究(如复制、包装和致病机制等)具有重要的现实意义和广泛的应用价值。

3.本发明对于开展在fMOST进行全脑成像方面具有重要价值。

4.本发明制备的类病毒颗粒能够在数天的时间内快速标记鼠神经细胞。

5.解析神经环路结构是开展脑科学研究的基础，良好用于神经环路标记的工具对于解析神经环路的结构具有重要意义。SFV能够感染人和鼠等动物的神经细胞，具有作为神经环路标记的潜力。本发明不仅能够用于非灵长类动物，而且还能用于灵长类动物的脑科学研究。

附图说明

图1为一种携带EGFP基因的西门利克森林病毒类病毒颗粒的构建和制备示意图。

A：一种携带EGFP基因的西门利克森林病毒复制子的构建示意图；

B：一种携带EGFP基因的西门利克森林病毒类病毒颗粒的制备示意图。

图2为一种携带EGFP基因的西门利克森林病毒类病毒颗粒表达荧光示意图。

A：未转染RNA的细胞；

B：共转染pSFV-replicon-EGFP和pSFV-helper的RNA的BHK21细胞表达绿色荧光蛋白。

图3为一种携带EGFP基因的西门利克森林病毒类病毒颗粒单次感染细胞。

A：未激活的类病毒颗粒感染BHK21细胞后表达绿色荧光蛋白；

B：未激活的类病毒颗粒感染BHK21细胞后收集的上清感染BHK21细胞，没有荧光蛋白的表达，即没有病毒产生；

C：激活的类病毒颗粒感染BHK21细胞后表达绿色荧光蛋白；

D：激活的类病毒颗粒感染BHK21细胞后收集的上清感染BHK21细胞，没有荧光蛋白的表达，即没有病毒产生。

图4为一种携带EGFP基因的西门利克森林病毒类病毒颗粒生长曲线。

A：未激活的类病毒颗粒感染BHK21细胞后表达绿色荧光蛋白；

B：不同时间收集的未激活的类病毒颗粒的滴度分析；

A：激活的类病毒颗粒感染BHK21细胞后表达绿色荧光蛋白；

B：不同时间收集激活的类病毒颗粒的滴度分析。

图5为一种携带EGFP基因的西门利克森林病毒类病毒颗粒在鼠脑内不同时间的标记情况。

A：未激活的类病毒颗粒注射到鼠脑后3、6、12和24小时的表达情况；

B：激活的类病毒颗粒注射到鼠脑后3、6、12和24小时的表达情况。

图6为一种携带EGFP基因的西门利克森林病毒类病毒颗粒在鼠脑内稀疏标记神经元的情况。

A：不同剂量的未激活类病毒颗粒注射到鼠脑后稀疏标记神经元；

B：不同剂量的激活类病毒颗粒注射到鼠脑后稀疏标记神经元。

图7为一种携带EGFP基因的西门利克森林病毒类病毒颗粒在鼠脑内标记神经元的精细形态。

A：未激活的类病毒颗粒注射到鼠脑后标记神经元的精细形态；

B：激活的类病毒颗粒注射到鼠脑后标记神经元的精细形态。

图8为一种携带EGFP基因的西门利克森林病毒类病毒颗粒在标记鼠脑后在fMOST成像系统中的应用。

A：未激活的类病毒颗粒注射到鼠脑后能够达到fMOST成像的要求，可以清晰的显示神经元的形态；

B：激活的类病毒颗粒注射到鼠脑后能够达到fMOST成像的要求，可以清晰的显示神经元的形态。

具体实施方式

本发明所述技术方案，如未特别说明，均为本领域的常规技术。

实施例1：

一种西门利克森林病毒复制子，通过下述步骤制备得到：

①以pEGFP-N2(Invitrogen公司)为模板扩增EGFP基因，其序列为SEQ ID NO:1，使用SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:3所示引物扩增片段SEQ ID NO:1；以pSFV-replicon(Lundstrom,K etal.,(2003)Mol.Ther.7,202-209.)为模板扩增capsid的N端102bp(即C34)，其序列为SEQ IDNO:4，使用SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6所示引物扩增片段SEQ ID NO:4；按常规方式检测回收扩增出的DNA片段。C34和EGFP之间通过F2A连接，其序列为SEQ ID NO:7，其序列包含在引物SEQ ID NO:6和SEQ ID NO:2中。

PCR的反应体系均为50μl：5×Reaction Buffer：10μl，10mM dNTPs：1μl，10μM ForwardPrimer：2.5μl，10μM Reverse Primer：2.5μl，Template DNA：0.5μl，DNA Polymerase：0.5μl，Nuclease-Free Water：33μl。扩增条件为：98℃60s，98℃10s，55℃15s，72℃60s，72℃10min，16℃10min，30个循环；

使用BamHI和XhoI酶切pSFV-replicon(Lundstrom,K et al.,(2003)Mol.Ther.7,202-209.)，然后采用Vazyme同源重组试剂盒将SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:4片段插入到SFV复制子质粒Ubc-SFV-replicon，将重组产物转化感受态HB101，PCR鉴定为阳性的克隆进行培养并抽提质粒进行测序，测序正确的克隆命名为pSFV-replicon-EGFP，其序列为SEQ ID NO:8所示。

实施例2：

一种西门利克森林病毒复制子在制备表达绿色荧光蛋白的单次感染性的西门利克森林病毒类病毒颗粒中的应用：

用NruI分别酶切pSFV-replicon-EGFP和pSFV-helper(Berglund,P et al.,(1993)Biotechnology 11,916-920.)，使用MEGAscript SP6Transcription Kit分别体外转录酶切后的pSFV-replicon-EGFP和pSFV-helper为RNA，并转染BHK21细胞，37℃，5％(v/v)CO₂培养箱中培养，通过倒置荧光显微镜观察细胞状态和荧光表达，在感染后的不同时间收集病毒上清。

图2中A：没有转染RNA的BHK21细胞，作为实验的对照；

图2中B：共转染pSFV-replicon-EGFP和pSFV-helper的RNA的BHK21细胞，1天后即可产生绿色的荧光信号，表明依赖于西门利克森林病毒复制子能高效快速表达外源蛋白。

收集的病毒上清的一部分分装后，-80保存备用(即为未激活的西门利克森林病毒类病毒颗粒)用于以下实验；

另一部分，使用终浓度为500μg/ml的α-chymotrypsin(Sigma)在37度处理收集的上清30min，然后加入终浓度为250μg/ml aprotinin(Sigma)，-80度保存备用(激活的西门利克森林病毒类病毒颗粒)。检测不同时间点收集病毒的滴度，选择滴度最高的病毒用于以下实验。

实施例3：

西门利克森林病毒复制子制备出的西门利克森林病毒类病毒颗粒具有单次感染性：

分别分析激活和未激活的西门利克森林病毒类病毒颗粒的单次感染的特性，一方面，取10μl未激活的类病毒颗粒感染BHK21细胞，在感染后1天观察绿色荧光的表达情况，并收集培养基上清。取收集的培养基上清100μl感染BHK21细胞，感染后不同时间观察荧光的表达情况；另一方面，取1μl类病毒颗粒感染BHK21细胞，在感染后1天观察绿色荧光的表达情况，并收集培养基上清。取收集的培养基上清100μl感染BHK21细胞，感染后不同时间观察荧光的表达情况。

图3中A：携带EGFP基因的未激活的西门利克森林病毒类病毒颗粒感染BHK21细胞后表达绿色荧光蛋白，表明本发明能够用于体外表达外源蛋白，具有在体内的应用价值，但是表达绿色荧光蛋白的细胞数目较少。

图3中B：将图3中A的感染BHK21细胞后收集的上清再次感染新制备的BHK21细胞，不同时间观察,无荧光信号，表明该病毒样颗粒具有单次感染细胞的特点。

图3中C：携带EGFP基因的激活的西门利克森林病毒类病毒颗粒感染BHK21细胞后表达绿色荧光蛋白，表明本发明能够用于体外表达外源蛋白，具有在体内的应用价值，表达绿色荧光蛋白的细胞数目很多。

图3中D：将图3中C的感染BHK21细胞后收集的上清再次感染新制备的BHK21细胞，不同时间观察，无荧光信号，表明该病毒样颗粒具有单次感染细胞的特点。

实施例4：

西门利克森林病毒复制子制备出的西门利克森林病毒类病毒颗粒生长曲线分析：

分别取不同时间点收集的未激活和激活的类病毒颗粒10μl感染BHK21细胞(进行10倍比的西施)，在感染后2天观察绿色荧光的表达情况，并计数荧光细胞的数量，计算病毒的滴度。

图4中A：携带EGFP基因的未激活的西门利克森林病毒类病毒颗粒感染BHK21细胞后表达绿色荧光蛋白。不同时间收集的病毒均能感染BHK21细胞，并表达绿色荧光蛋白，表明本发明能够用于体外表达外源蛋白，具有在体内的应用价值。

图4中B：携带EGFP基因的未激活的西门利克森林病毒类病毒颗粒在BHK21细胞中的生长曲线。在将pSFV-replicon-EGFP和pSFV-helper的RNA共转染BHK21细胞后1天，病毒滴度即达到5×10²FFU/ml，而后逐渐升高，转染后3天，滴度到达3.5×10⁴FFU/ml。该数据对于选择最佳的时间收集携带EGFP的西门利克森林病毒类病毒颗粒具有重要意义。

图4中C：携带EGFP基因的激活的西门利克森林病毒类病毒颗粒感染BHK21细胞后表达绿色荧光蛋白。不同时间收集的病毒均能感染BHK21细胞，并表达绿色荧光蛋白，表明本发明能够用于体外表达外源蛋白，具有在体内的应用价值。

图4中D：携带EGFP基因的激活的西门利克森林病毒类病毒颗粒在BHK21细胞中的生长曲线。在将pSFV-replicon-EGFP和pSFV-helper的RNA共转染BHK21细胞后1天，病毒滴度即达到7×10⁶FFU/ml，而后逐渐升高，转染后3天，滴度到达1.8×10⁸FFU/ml。该数据对于选择最佳的时间收集携带EGFP的西门利克森林病毒类病毒颗粒具有重要意义。

实施例5：

携带EGFP基因的西门利克森林病毒类病毒颗粒快速标记鼠脑神经元(不同时间标记神经元的情况)：

取2μl未激活的西门利克森林病毒类病毒颗粒(病毒滴度是3.5×10⁴FFU/ml)定位注射到鼠(2月龄)丘脑腹后内侧核，感染后3、6、12和24小时后麻醉动物，分别用0.9％(V/V)生理盐水灌流，然后用4％(V/V)多聚甲醛固定，取出脑组织浸泡于4％(V/V)多聚甲醛液中，然后将脑组织先置于20％(V/V)蔗糖溶液中1天，然后置于30％(V/V)蔗糖溶液中2天；将脑组织底部切平，置于底座上包埋冰冻1h后切片；取脑片后使用荧光显微镜观察。未激活的类病毒颗粒注射到丘脑腹后内侧核6h后即可观察到明显的荧光信号，表明未激活的类病毒颗粒能够在鼠脑内感染神经元并能表达表达绿色荧光蛋白，随着时间的延长(12和24h)，荧光的表达数量增加(图5中A)。

取0.1μl激活的西门利克森林病毒类病毒颗粒(病毒滴度是1.8×10⁸FFU/ml)定位注射到鼠(2月龄)丘脑腹后内侧核，感染后3、6、12和24小时后麻醉动物，分别用0.9％(V/V)生理盐水灌流，然后用4％(V/V)多聚甲醛固定，取出脑组织浸泡于4％(V/V)多聚甲醛液中，然后将脑组织先置于20％(V/V)蔗糖溶液中1天，然后置于30％(V/V)蔗糖溶液中2天；将脑组织底部切平，置于底座上包埋冰冻1h后切片；取脑片后使用荧光显微镜观察。激活的类病毒颗粒注射到丘脑腹后内侧核6h后即可观察到明显的荧光信号，表明激活的类病毒颗粒能够在鼠脑内感染神经元并能表达表达绿色荧光蛋白，随着时间的延长(12和24h)，荧光的表达数量增加(图5中B)。

实施例6：

携带EGFP基因的西门利克森林病毒类病毒颗粒在鼠脑内稀疏标记神经元的精细形态：

取0.1、0.5和1μl未激活的西门利克森林病毒类病毒颗粒(病毒滴度是3.5×10⁴FFU/ml)定位注射到鼠(2月龄)丘脑腹后内侧核，感染后24小时后麻醉动物，分别用0.9％(V/V)生理盐水灌流，然后用4％(V/V)多聚甲醛固定，取出脑组织浸泡于4％(V/V)多聚甲醛液中，然后将脑组织先置于20％(V/V)蔗糖溶液中1天，然后置于30％(V/V)蔗糖溶液中2天；将脑组织底部切平，置于底座上包埋冰冻1小时后切片；取脑片后使用荧光显微镜观察。未激活的类病毒颗粒注射到丘脑腹后内侧核24小时后即可见明显的荧光信号，表明未激活的类病毒颗粒能够在鼠脑内感染神经元并能表达表达绿色荧光蛋白。随着注射剂量的减少，标记的神经元的数目逐渐减少，呈现出稀疏标记的状态(图6中A)，能够标记神经元的精细形态(图7中A)。

取0.3μl经过1:20000稀释的激活的西门利克森林病毒类病毒颗粒(稀释前病毒滴度是1.8×10⁸FFU/ml)定位注射到鼠(2月龄)丘脑腹后内侧核，感染后24小时后麻醉动物，分别用0.9％(V/V)生理盐水灌流，然后用4％(V/V)多聚甲醛固定，取出脑组织浸泡于4％(V/V)多聚甲醛液中，然后将脑组织先置于20％(V/V)蔗糖溶液中1天，然后置于30％(V/V)蔗糖溶液中2天；将脑组织底部切平，置于底座上包埋冰冻1小时后切片；取脑片后使用荧光显微镜观察。激活的类病毒颗粒注射到丘脑腹后内侧核24小时后可见明显的荧光信号，表明激活的类病毒颗粒能够在鼠脑内感染神经元并能表达表达绿色荧光蛋白。病毒标记的状态为稀疏标记(图6中B)，能够标记神经元的精细形态(图7中B)。

1月龄～12月龄的鼠脑，无论是激活还是未激活的病毒颗粒，只要鼠脑中有效感染的病毒粒为1-50个，均能产生上述相同的精细标记的效果。

实施例7：

携带EGFP基因的西门利克森林病毒类病毒颗粒在标记鼠脑后满足fMOST成像要求：

取0.5μl未激活的西门利克森林病毒类病毒颗粒(病毒滴度是3.5×10⁴FFU/ml)定位注射到鼠(2月龄)皮层，感染后48小时后麻醉动物，分别用0.9％(V/V)生理盐水灌流，然后用4％(V/V)多聚甲醛固定，取出脑组织浸泡于4％(V/V)多聚甲醛液中，然后将脑组织先置于20％(V/V)蔗糖溶液中1天，然后置于30％(V/V)蔗糖溶液中2天。取脑组织使用fMOST仪器观察荧光蛋白的情况。荧光的亮度能够满足fMOST的成像要求(图8中A)。

取0.3μl经过1:20000稀释的激活的西门利克森林病毒类病毒颗粒(稀释前病毒滴度是1.8×10⁸FFU/ml)定位注射到鼠皮层，感染后48小时后麻醉动物，分别用0.9％(V/V)生理盐水灌流，然后用4％(V/V)多聚甲醛固定，取出脑组织浸泡于4％(V/V)多聚甲醛液中，然后将脑组织先置于20％(V/V)蔗糖溶液中1天，然后置于30％(V/V)蔗糖溶液中2天。取脑组织使用fMOST仪器观察荧光蛋白的情况。荧光的亮度能够满足fMOST的成像要求(图8中B)。

最后，还需要注意的是，上述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，并且以上列举的仅是本发明的若干个具体实施例。显然，本发明不限于以上实施例，还可以有许多变形。本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容直接导出或联想到的所有变形，均应认为是本发明的保护范围。

SEQUENCE LISTING

<110> 中国科学院武汉物理与数学研究所

<120> 一种西门利克森林病毒复制子及其在稀疏或精细神经元标记中的应用

<130> 一种西门利克森林病毒复制子及其在稀疏或精细神经元标记中的应用

<160> 8

<170> PatentIn version 3.1

<210> 1

<211> 717

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

atggtgagca agggcgagga gctgttcacc ggggtggtgc ccatcctggt cgagctggac 60

ggcgacgtaa acggccacaa gttcagcgtg tccggcgagg gcgagggcga tgccacctac 120

ggcaagctga ccctgaagtt catctgcacc accggcaagc tgcccgtgcc ctggcccacc 180

ctcgtgacca ccctgaccta cggcgtgcag tgcttcagcc gctaccccga ccacatgaag 240

cagcacgact tcttcaagtc cgccatgccc gaaggctacg tccaggagcg caccatcttc 300

ttcaaggacg acggcaacta caagacccgc gccgaggtga agttcgaggg cgacaccctg 360

gtgaaccgca tcgagctgaa gggcatcgac ttcaaggagg acggcaacat cctggggcac 420

aagctggagt acaactacaa cagccacaac gtctatatca tggccgacaa gcagaagaac 480

ggcatcaagg tgaacttcaa gatccgccac aacatcgagg acggcagcgt gcagctcgcc 540

gaccactacc agcagaacac ccccatcggc gacggccccg tgctgctgcc cgacaaccac 600

tacctgagca cccagtccgc cctgagcaaa gaccccaacg agaagcgcga tcacatggtc 660

ctgctggagt tcgtgaccgc cgccgggatc actctcggca tggacgagct gtacaag 717

<210> 2

<211> 59

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

ccttctcaag ctggcgggag acgtcgagtc caaccctggg ccaatggtga gcaagggcg 59

<210> 3

<211> 45

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

ggatcgacta gtgaactcga gttacttgta cagctcgtcc atgcc 45

<210> 4

<211> 102

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

atgaattaca tccctacgca aacgttttac ggccgccggt ggcgcccgcg cccggcggcc 60

cgtccctggc cgttgcaggc cactccggtg gctcccgtcg tc 102

<210> 5

<211> 50

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

aatacacaga attctgattg gatccaccat gaattacatc cctacgcaaa 50

<210> 6

<211> 59

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

ctcccgccag cttgagaagg tcaaaattca acagctgccc ggggacgacg ggagccacc 59

<210> 7

<211> 60

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 7

cagctgttga attttgacct tctcaagctg gcgggagacg tcgagtccaa ccctgggcca 60

<210> 8

<211> 11471

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 8

gatggcggat gtgtgacata cacgacgcca aaagattttg ttccagctcc tgccacctcc 60

gctacgcgag agattaacca cccacgatgg ccgccaaagt gcatgttgat attgaggctg 120

acagcccatt catcaagtct ttgcagaagg catttccgtc gttcgaggtg gagtcattgc 180

aggtcacacc aaatgaccat gcaaatgcca gagcattttc gcacctggct accaaattga 240

tcgagcagga gactgacaaa gacacactca tcttggatat cggcagtgcg ccttccagga 300

gaatgatgtc tacgcacaaa taccactgcg tatgccctat gcgcagcgca gaagaccccg 360

aaaggctcgt atgctacgca aagaaactgg cagcggcctc cgggaaggtg ctggatagag 420

agatcgcagg aaaaatcacc gacctgcaga ccgtcatggc tacgccagac gctgaatctc 480

ctaccttttg cctgcataca gacgtcacgt gtcgtacggc agccgaagtg gccgtatacc 540

aggacgtgta tgctgtacat gcaccaacat cgctgtacca tcaggcgatg aaaggtgtca 600

gaacggcgta ttggattggg tttgacacca ccccgtttat gtttgacgcg ctagcaggcg 660

cgtatccaac ctacgccaca aactgggccg acgagcaggt gttacaggcc aggaacatag 720

gactgtgtgc agcatccttg actgagggaa gactcggcaa actgtccatt ctccgcaaga 780

agcaattgaa accttgcgac acagtcatgt tctcggtagg atctacattg tacactgaga 840

gcagaaagct actgaggagc tggcacttac cctccgtatt ccacctgaaa ggtaaacaat 900

cctttacctg taggtgcgat accatcgtat catgtgaagg gtacgtagtt aagaaaatca 960

ctatgtgccc cggcctgtac ggtaaaacgg tagggtacgc cgtgacgtat cacgcggagg 1020

gattcctagt gtgcaagacc acagacactg tcaaaggaga aagagtctca ttccctgtat 1080

gcacctacgt cccctcaacc atctgtgatc aaatgactgg catactagcg accgacgtca 1140

caccggagga cgcacagaag ttgttagtgg gattgaatca gaggatagtt gtgaacggaa 1200

gaacacagcg aaacactaac acgatgaaga actatctgct tccgattgtg gccgtcgcat 1260

ttagcaagtg ggcgagggaa tacaaggcag accttgatga tgaaaaacct ctgggtgtcc 1320

gagagaggtc acttacttgc tgctgcttgt gggcatttaa aacgaggaag atgcacacca 1380

tgtacaagaa accagacacc cagacaatag tgaaggtgcc ttcagagttt aactcgttcg 1440

tcatcccgag cctatggtct acaggcctcg caatcccagt cagatcacgc attaagatgc 1500

ttttggccaa gaagaccaag cgagagttaa tacctgttct cgacgcgtcg tcagccaggg 1560

atgctgaaca agaggagaag gagaggttgg aggccgagct gactagagaa gccttaccac 1620

ccctcgtccc catcgcgccg gcggagacgg gagtcgtcga cgtcgacgtt gaagaactag 1680

agtatcacgc aggtgcaggg gtcgtggaaa cacctcgcag cgcgttgaaa gtcaccgcac 1740

agccgaacga cgtactacta ggaaattacg tagttctgtc cccgcagacc gtgctcaaga 1800

gctccaagtt ggcccccgtg caccctctag cagagcaggt gaaaataata acacataacg 1860

ggagggccgg ccgttaccag gtcgacggat atgacggcag ggtcctacta ccatgtggat 1920

cggccattcc ggtccctgag tttcaggctt tgagcgagag cgccactatg gtgtacaacg 1980

aaagggagtt cgtcaacagg aaactatacc atattgccgt tcacggaccc tcgctgaaca 2040

ccgacgagga gaactacgag aaagtcagag ctgaaagaac tgacgccgag tacgtgttcg 2100

acgtagataa aaaatgctgc gtcaagagag aggaagcgtc gggtttggtg ttggtgggag 2160

agctaaccaa ccccccgttc catgaattcg cctacgaagg gctgaagatc aggccgtcgg 2220

caccatataa gactacagta gtaggagtct ttggggttcc gggatcaggc aagtctgcta 2280

ttattaagag cctcgtgacc aaacacgatc tggtcaccag cggcaagaag gagaactgcc 2340

aggaaatagt caacgacgtg aagaagcacc gcggactgga catccaggca aaaacagtgg 2400

actccatcct gctaaacggg tgtcgtcgtg ccgtggacat cctatatgtg gacgaggctt 2460

tcgcttgcca tcccggtact ctgctagccc taattgctct tgttaaacct cggagcaaag 2520

tggtgttatg cggagacccc aagcaatgcg gattcttcaa tatgatgcag cttaaggtga 2580

acttcaacca caacatctgc actgaagtat gtcataaaag tatatccaga cgttgcacgc 2640

gtccagtcac ggccatcgtg tctacgttgc actacggagg caagatgcgc acgaccaacc 2700

cgtgcaacaa acccataatc atagacacca caggacagac caagcccaag ccaggagaca 2760

tcgtgttaac atgcttccga ggctgggtaa agcagctgca gttggactac cgtggacacg 2820

aagtcatgac agcagcagca tctcagggcc tcacccgcaa aggggtatac gccgtaaggc 2880

agaaggtgaa tgaaaatccc ttgtatgccc ctgcgtcgga gcacgtgaat gtactgctga 2940

cgcgcactga ggataggctg gtgtggaaaa cgctggccgg cgatccctgg attaaggtcc 3000

tatcaaacat tccacagggt aactttacgg ccacattgga agaatggcaa gaagaacacg 3060

acaaaataat gaaggtgatt gaaggaccgg ctgcgcctgt ggacgcgttc cagaacaaag 3120

cgaacgtgtg ttgggcgaaa agcctggtgc ctgtcctgga cactgccgga atcagattga 3180

cagcagagga gtggagcacc ataattacag catttaagga ggacagagct tactctccag 3240

tggtggcctt gaatgaaatt tgcaccaagt actatggagt tgacctggac agtggcctgt 3300

tttctgcccc gaaggtgtcc ctgtattacg agaacaacca ctgggataac agacctggtg 3360

gaaggatgta tggattcaat gccgcaacag ctgccaggct ggaagctaga cataccttcc 3420

tgaaggggca gtggcatacg ggcaagcagg cagttatcgc agaaagaaaa atccaaccgc 3480

tttctgtgct ggacaatgta attcctatca accgcaggct gccgcacgcc ctggtggctg 3540

agtacaagac ggttaaaggc agtagggttg agtggctggt caataaagta agagggtacc 3600

acgtcctgct ggtgagtgag tacaacctgg ctttgcctcg acgcgacgtc acttggttgt 3660

caccgctgaa tgtcacaggc gccgataggt gctacgacct aagtttagga ctgccggctg 3720

acgccggcag gttcgacttg gtctttgtga acattcacac ggaattcaga atccaccact 3780

accagcagtg tgtcgaccac gccatgaagc tgcagatgct tgggggagat gcgctacgac 3840

tgctaaaacc cggcggcagc ctcttgatga gagcttacgg atacgccgat aaaatcagcg 3900

aagccgttgt ttcctcctta agcagaaagt tctcgtctgc aagagtgttg cgcccggatt 3960

gtgtcaccag caatacagaa gtgttcttgc tgttctccaa ctttgacaac ggaaagagac 4020

cctctacgct acaccagatg aataccaagc tgagtgccgt gtatgccgga gaagccatgc 4080

acacggccgg gtgtgcacca tcctacagag ttaagagagc agacatagcc acgtgcacag 4140

aagcggctgt ggttaacgca gctaacgccc gtggaactgt aggggatggc gtatgcaggg 4200

ccgtggcgaa gaaatggccg tcagccttta agggagaagc aacaccagtg ggcacaatta 4260

aaacagtcat gtgcggctcg taccccgtca tccacgctgt agcgcctaat ttctctgcca 4320

cgactgaagc ggaaggggac cgcgaattgg ccgctgtcta ccgggcagtg gccgccgaag 4380

taaacagact gtcactgagc agcgtagcca tcccgctgct gtccacagga gtgttcagcg 4440

gcggaagaga taggctgcag caatccctca accatctatt cacagcaatg gacgccacgg 4500

acgctgacgt gaccatctac tgcagagaca aaagttggga gaagaaaatc caggaagcca 4560

tagacatgag gacggctgtg gagttgctca atgatgacgt ggagctgacc acagacttgg 4620

tgagagtgca cccggacagc agcctggtgg gtcgtaaggg ctacagtacc actgacgggt 4680

cgctgtactc gtactttgaa ggtacgaaat tcaaccaggc tgctattgat atggcagaga 4740

tactgacgtt gtggcccaga ctgcaagagg caaacgaaca gatatgccta tacgcgctgg 4800

gcgaaacaat ggacaacatc agatccaaat gtccggtgaa cgattccgat tcatcaacac 4860

ctcccaggac agtgccctgc ctgtgccgct acgcaatgac agcagaacgg atcgcccgcc 4920

ttaggtcaca ccaagttaaa agcatggtgg tttgctcatc ttttcccctc ccgaaatacc 4980

atgtagatgg ggtgcagaag gtaaagtgcg agaaggttct cctgttcgac ccgacggtac 5040

cttcagtggt tagtccgcgg aagtatgccg catctacgac ggaccactca gatcggtcgt 5100

tacgagggtt tgacttggac tggaccaccg actcgtcttc cactgccagc gataccatgt 5160

cgctacccag tttgcagtcg tgtgacatcg actcgatcta cgagccaatg gctcccatag 5220

tagtgacggc tgacgtacac cctgaacccg caggcatcgc ggacctggcg gcagatgtgc 5280

atcctgaacc cgcagaccat gtggacctgg agaacccgat tcctccaccg cgcccgaaga 5340

gagctgcata ccttgcctcc cgcgcggcgg agcgaccggt gccggcgccg agaaagccga 5400

cgcctgcccc aaggactgcg tttaggaaca agctgccttt gacgttcggc gactttgacg 5460

agcacgaggt cgatgcgttg gcctccggga ttactttcgg agacttcgac gacgtcctgc 5520

gactaggccg cgcgggtgca tatattttct cctcggacac tggcagcgga catttacaac 5580

aaaaatccgt taggcagcac aatctccagt gcgcacaact ggatgcggtc gaggaggaga 5640

aaatgtaccc gccaaaattg gatactgaga gggagaagct gttgctgctg aaaatgcaga 5700

tgcacccatc ggaggctaat aagagtcgat accagtctcg caaagtggag aacatgaaag 5760

ccacggtggt ggacaggctc acatcggggg ccagattgta cacgggagcg gacgtaggcc 5820

gcataccaac atacgcggtt cggtaccccc gccccgtgta ctcccctacc gtgatcgaaa 5880

gattctcaag ccccgatgta gcaatcgcag cgtgcaacga atacctatcc agaaattacc 5940

caacagtggc gtcgtaccag ataacagatg aatacgacgc atacttggac atggttgacg 6000

ggtcggatag ttgcttggac agagcgacat tctgcccggc gaagctccgg tgctacccga 6060

aacatcatgc gtaccaccag ccgactgtac gcagtgccgt cccgtcaccc tttcagaaca 6120

cactacagaa cgtgctagcg gctgccacca agagaaactg caacgtcacg caaatgcgag 6180

aactacccac catggactcg gcagtgttca acgtggagtg cttcaagcgc tatgcctgct 6240

ccggagaata ttgggaagaa tatgctaaac aacctatccg gataaccact gagaacatca 6300

ctacctatgt gaccaaattg aaaggcccga aagctgctgc cttgttcgct aagacccaca 6360

acttggttcc gctgcaggag gttcccatgg acagattcac ggtcgacatg aaacgagatg 6420

tcaaagtcac tccagggacg aaacacacag aggaaagacc caaagtccag gtaattcaag 6480

cagcggagcc attggcgacc gcttacctgt gcggcatcca cagggaatta gtaaggagac 6540

taaatgctgt gttacgccct aacgtgcaca cattgtttga tatgtcggcc gaagactttg 6600

acgcgatcat cgcctctcac ttccacccag gagacccggt tctagagacg gacattgcat 6660

cattcgacaa aagccaggac gactccttgg ctcttacagg tttaatgatc ctcgaagatc 6720

taggggtgga tcagtacctg ctggacttga tcgaggcagc ctttggggaa atatccagct 6780

gtcacctacc aactggcacg cgcttcaagt tcggagctat gatgaaatcg ggcatgtttc 6840

tgactttgtt tattaacact gttttgaaca tcaccatagc aagcagggta ctggagcaga 6900

gactcactga ctccgcctgt gcggccttca tcggcgacga caacatcgtt cacggagtga 6960

tctccgacaa gctgatggcg gagaggtgcg cgtcgtgggt caacatggag gtgaagatca 7020

ttgacgctgt catgggcgaa aaacccccat atttttgtgg gggattcata gtttttgaca 7080

gcgtcacaca gaccgcctgc cgtgtttcag acccacttaa gcgcctgttc aagttgggta 7140

agccgctaac agctgaagac aagcaggacg aagacaggcg acgagcactg agtgacgagg 7200

ttagcaagtg gttccggaca ggcttggggg ccgaactgga ggtggcacta acatctaggt 7260

atgaggtaga gggctgcaaa agtatcctca tagccatggc caccttggcg agggacatta 7320

aggcgtttaa gaaattgaga ggacctgtta tacacctcta cggcggtcct agattggtgc 7380

gttaatacac agaattctga ttggatccac catgaattac atccctacgc aaacgtttta 7440

cggccgccgg tggcgcccgc gcccggcggc ccgtccctgg ccgttgcagg ccactccggt 7500

ggctcccgtc gtccccgggc agctgttgaa ttttgacctt ctcaagctgg cgggagacgt 7560

cgagtccaac cctgggccaa tggtgagcaa gggcgaggag ctgttcaccg gggtggtgcc 7620

catcctggtc gagctggacg gcgacgtaaa cggccacaag ttcagcgtgt ccggcgaggg 7680

cgagggcgat gccacctacg gcaagctgac cctgaagttc atctgcacca ccggcaagct 7740

gcccgtgccc tggcccaccc tcgtgaccac cctgacctac ggcgtgcagt gcttcagccg 7800

ctaccccgac cacatgaagc agcacgactt cttcaagtcc gccatgcccg aaggctacgt 7860

ccaggagcgc accatcttct tcaaggacga cggcaactac aagacccgcg ccgaggtgaa 7920

gttcgagggc gacaccctgg tgaaccgcat cgagctgaag ggcatcgact tcaaggagga 7980

cggcaacatc ctggggcaca agctggagta caactacaac agccacaacg tctatatcat 8040

ggccgacaag cagaagaacg gcatcaaggt gaacttcaag atccgccaca acatcgagga 8100

cggcagcgtg cagctcgccg accactacca gcagaacacc cccatcggcg acggccccgt 8160

gctgctgccc gacaaccact acctgagcac ccagtccgcc ctgagcaaag accccaacga 8220

gaagcgcgat cacatggtcc tgctggagtt cgtgaccgcc gccgggatca ctctcggcat 8280

ggacgagctg tacaagtaac tcgagttcac tagtcgatcc cgcggccgct ttcgaaccta 8340

ggcaagcatg cgggcccagt gggtaattaa ttgaattaca tccctacgca aacgttttac 8400

ggccgccggt ggcgcccgcg cccggcggcc cgtccctggc cgttgcaggc cactccggtg 8460

gctcccgtcg tccccgactt ccaggcccag cagatgcagc aactcatcag cgccgtaaat 8520

gcgctgacaa tgagacagaa cgcaattgct cctgctagga gcttaattcg acgaataatt 8580

ggatttttat tttattttgc aattggtttt taatatttcc aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 8640

aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaactaga aatcgcgatt 8700

tctagtctgc attaatgaat cggccaacgc gcggggagag gcggtttgcg tattgggcgc 8760

tcttccgctt cctcgctcac tgactcgctg cgctcggtcg ttcggctgcg gcgagcggta 8820

tcagctcact caaaggcggt aatacggtta tccacagaat caggggataa cgcaggaaag 8880

aacatgtgag caaaaggcca gcaaaaggcc aggaaccgta aaaaggccgc gttgctggcg 8940

tttttccata ggctccgccc ccctgacgag catcacaaaa atcgaccctc aagtcaaagg 9000

gggcgaaacc cgacaggact ataaaaatac caggcgtttc cccctggaag ctccctcggg 9060

cgctctcctg ttccaaccct gccgcttacc ggatacctgt ccccctttct cccttcggga 9120

agcggggcgc tttctcatag ctcacgctgt aggtatctca gttcggtgta ggtcgttcgc 9180

tccaagctgg gctgtgtgca caaacccccc gttcagcccg accgctgcgc cttatccggt 9240

aactatcgtc ttgagtccaa cccggtaaga cacgacttat cgccactggc agcagccact 9300

ggtaacagga ttagcagagc gaggtatgta ggcggtgcta cagagttctt gaagtggtgg 9360

cctaactacg gctacactag aagaacagta tttggtatct gcgctctgct gaagccagtt 9420

accttcggaa aaagagttgg tagctcttga tccggcaaac aaaccaccgc tggtagcggt 9480

ggtttttttg tttgcaagca gcagattacg cgcagaaaaa aaggatctca agaagatcct 9540

ttgatctttt ctacggggtc tgacgctcag tggaacgaaa actcacgtta agggattttg 9600

gtcatgagat tatcaaaaag gatcttcacc tagatccttt taaattaaaa atgaagtttt 9660

aaatcaatct aaagtatata tgagtaaact tggtctgaca gttaccaatg cttaatcagt 9720

gaggcaccta tctcagcgat ctgtctattt cgttcatcca tagttgcctg actccccgtc 9780

gtgtagataa ctacgatacg ggagggctta ccatctggcc ccagtgctgc aatgataccg 9840

cgagacccac gctcaccggc tccagattta tcagcaataa accagccagc cggaagggcc 9900

gagcgcagaa gtggtcctgc aactttatcc gcctccatcc agtctattaa ttgttgccgg 9960

gaagctagag taagtagttc gccagttaat agtttgcgca acgttgttgc cattgctaca 10020

ggcatcgtgg tgtcacgctc gtcgtttggt atggcttcat tcagctccgg ttcccaacga 10080

tcaaggcgag ttacatgatc ccccatgttg tgcaaaaaag cggttagctc cttcggtcct 10140

ccgatcgttg tcagaagtaa gttggccgca gtgttatcac tcatggttat ggcagcactg 10200

cataattctc ttactgtcat gccatccgta agatgctttt ctgtgactgg tgagtactca 10260

accaagtcat tctgagaata gtgtatgcgg cgaccgagtt gctcttgccc ggcgtcaata 10320

cgggataata ccgcgccaca tagcagaact ttaaaagtgc tcatcattgg aaaacgttct 10380

tcggggcgaa aactctcaag gatcttaccg ctgttgagat ccagttcgat gtaacccact 10440

cgtgcaccca actgatcttc agcatctttt actttcacca gcgtttctgg gtgagcaaaa 10500

acaggaaggc aaaatgccgc aaaaaaggga ataagggcga cacggaaatg ttgaatactc 10560

atactcttcc tttttcaata ttattgaagc atttatcagg gttattgtct catgagcgga 10620

tacatatttg aatgtattta gaaaaataaa caaatagggg ttccgcgcac atttccccga 10680

aaagtgccac ctgacgtcta agaaaccatt attatcatga cattaaccta taaaaatagg 10740

cgtatcacga ggccctttcg tctcgcgcgt ttcggtgatg acggtgaaaa cctctgacac 10800

atgcagctcc cggagacggt cacagcttgt ctgtaagcgg atgccgggag cagacaagcc 10860

cgtcagggcg cgtcagcggg tgttggcggg tgtcggggct ggcttaacta tgcggcatca 10920

gagcagattg tactgagagt gcaccattcg acgctctccc ttatgcgact cctgcattag 10980

gaagcagccc agtagtaggt tgaggccgtt gagcaccgcc gccgcaagga atggtgcatg 11040

caaggagatg gcgcccaaca gtcccccggc cacggggcct gccaccatac ccacgccgaa 11100

acaagcgctc atgagcccga agtggcgagc ccgatcttcc ccatcggtga tgtcggcgat 11160

ataggcgcca gcaaccgcac ctgtggcgcc ggtgatgccg gccacgatgc gtccggcgta 11220

gaggatctgg ctagcgatga ccctgctgat tggttcgctg accatttccg ggtgcgggac 11280

ggcgttacca gaaactcaga aggttcgtcc aaccaaaccg actctgacgg cagtttacga 11340

gagagatgat agggtctgct tcagtaagcc agatgctaca caattaggct tgtacatatt 11400

gtcgttagaa cgcggctaca attaatacat aaccttatgt atcatacaca tacgatttag 11460

gtgacactat a 11471

Claims (9)

1.一种西门利克森林病毒复制子，为含有荧光蛋白基因和SEQ ID NO.4所示序列的pSFV-replicon。

2.权利要求1所述的复制子制备的西门利克森林病毒类病毒颗粒。

3.一种用于在体稀疏精细标记神经元的西门利克森林病毒复制子，其序列为SEQ ID NO.8所示。

4.权利要求1所述的复制子或权利要求2所述的病毒类病毒颗粒在制备稀疏标记神经元药物中的应用。

5.权利要求1所述的复制子或权利要求2所述的病毒类病毒颗粒在制备精细标记神经元药物中的应用。

6.权利要求1所述的复制子或权利要求2所述的病毒类病毒颗粒在制备快速标记神经元药物中的应用。

7.根据权利要求4或5或6所述的应用，所述药物在脑中的有效感染的病毒颗粒为1-50个。

8.权利要求1所述的复制子或权利要求2所述的病毒类病毒颗粒在标记神经元后用于fMOST成像中的应用。

9.根据权利要求7所述的应用，所述的脑为鼠脑。