CN114959110A - 基于PCR-CRISPR-Cas13a检测乙型肝炎病毒前基因组RNA的试剂盒 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种基于PCR‑CRISPR‑Cas13a检测乙型肝炎病毒前基因组RNA的试剂盒。本发明提供了核酸分子组合物，由引物HR‑RT、引物F、引物R和特异crRNA组成；引物HR‑RT为SEQ ID No.1所示的单链DNA分子；引物F为SEQ ID No.2所示的单链DNA分子；引物R为SEQ ID No.3所示的单链DNA分子；特异crRNA为SEQ IDNo.4所示的单链RNA分子。本发明还保护一种检测乙型肝炎病毒的方法：(1)提取受试者血液样本的总RNA，采用引物HR‑RT进行逆转录，得到cDNA；(2)采用引物F和引物R组成的引物对进行PCR扩增；(3)采用特异crRNA进行基于CRISPR‑Cas13a系统的可视化检测。本发明具有非常重要的临床应用前景和开发价值。

Description

基于PCR-CRISPR-Cas13a检测乙型肝炎病毒前基因组RNA的试 剂盒

技术领域

本发明属于病毒检测领域，具体涉及基于PCR-CRISPR-Cas13a检测乙型肝炎病毒前基因组RNA的试剂盒。

背景技术

乙型肝炎病毒(hepatitis B virus，HBV)属于嗜肝DNA病毒科，是一种小的DNA包膜病毒。HBV的基因组长约3200bp，为部分双链环状DNA。慢性HBV的感染是一个全球性的健康问题，可以导致多种严重的肝脏疾病，包括慢性肝炎、肝硬化、肝癌等。HBV进入肝细胞后，病毒的松弛环状DNA(rcDNA)被转运至细胞核，rcDNA在细胞核中形成超螺旋结构的共价闭合环状DNA(cccDNA)。cccDNA作为转录模板,利用宿主细胞的RNA聚合酶转录成不同功能的mRNA，包括3.5kb的前基因组RNA(pgRNA)。pgRNA作为HBV的逆转录模板，一方面指导病毒的衣壳与聚合酶蛋白的翻译；另一方面反转录形成细胞质中装配了病毒衣壳的新rcDNA。在乙肝病毒颗粒的成熟和释放中发挥了关键作用。

近期研究表明，血清HBV pgRNA的水平与多种病毒标志物有很好的相关性。(1)在治疗初期的感染者中，血清HBV pgRNA水平与HBV的病毒载量呈现了很好的相关性；(2)由于HBV pgRNA是由HBV cccDNA转录而来，血清HBV pgRNA的持续存在很好的反映了肝细胞中cccDNA的活性；HBeAg的血清学转换被视为乙肝患者的治疗终点，在抗病毒药物治疗后，HBVpgRNA水平的下降能够比较强的预测HBeAg的血清学转化，对指导临床用药具有重要的意义。

早在1966年，有学者首次提出在血清中检测到了HBV pgRNA的存在。目前常用的检测HBV RNA的技术主要包括：(1)实时荧光定量PCR技术，通过设计特异性的引物和探针，提高了检测的灵敏性与特异性，但是需要构建质粒标准品，绘制标准曲线，才可以达到相对定量；(2)微滴数字PCR：与荧光定量PCR相比，检测方法的灵敏性得到了进一步的提高，可以绝对定量HBV RNA的水平，但其成本相对较高，不利于广泛的推广。

CRISPR-Cas13a检测技术结合重组酶聚合酶扩增技术由张峰实验室首先提出，该技术灵敏度高达单个碱基的核酸检测，并且检测成本低，速度快。

发明内容

本发明的目的是提供一种基于PCR-CRISPR-Cas13a检测乙型肝炎病毒前基因组RNA的试剂盒。

本发明提供了一种核酸分子组合物，由引物F、引物R和特异crRNA组成；

引物F为SEQ ID No.2所示的单链DNA分子；

引物R为SEQ ID No.3所示的单链DNA分子；

特异crRNA为SEQ ID No.4所示的单链RNA分子。

本发明还提供了一种核酸分子组合物，由引物HR-RT、引物F、引物R和特异crRNA组成；

引物HR-RT为SEQ ID No.1所示的单链DNA分子；

引物F为SEQ ID No.2所示的单链DNA分子；

引物R为SEQ ID No.3所示的单链DNA分子；

特异crRNA为SEQ ID No.4所示的单链RNA分子。

所述核酸分子组合物用于检测乙型肝炎病毒。

所述核酸分子组合物用于检测乙型肝炎病毒前基因组RNA。

本发明还提供了一种用于检测乙型肝炎病毒的试剂盒，包括以上任一所述核酸分子组合物。

本发明还提供了一种用于检测乙型肝炎病毒的试剂盒，包括特异crRNA；特异crRNA为SEQ ID No.4所示的单链RNA分子。

以上任一所述试剂盒还包括LwCas13a蛋白。

以上任一所述试剂盒还包括T7 RNA聚合酶。

以上任一所述试剂盒还包括RNA酶抑制剂。

以上任一所述试剂盒还包括报告RNA。

以上任一所述试剂盒为检测乙型肝炎病毒前基因组RNA的试剂盒。

以上任一所述试剂盒还包括记载有下述方法的载体。

本发明还保护一种检测乙型肝炎病毒的方法，包括如下步骤：

(1)提取受试者血液样本的总RNA，采用引物HR-RT进行逆转录，得到cDNA；

(2)以步骤(1)得到的cDNA为模板，采用引物F和引物R组成的引物对进行PCR扩增；

(3)取步骤(2)的产物溶液，进行基于CRISPR-Cas13a系统的可视化检测；所述CRISPR-Cas13a系统中的crRNA如SEQ ID No.4所示。

所述血液样本具体可为血清样本。

PCR扩增的反应体系：2μl模板(DNA含量约为10ng)，10μl 2×Taq mix，引物F溶液(10μM)1μl，引物R溶液(10μM)1μl，加水至20μl。

PCR扩增的反应条件：95℃预变性10min；95℃30s、60℃30s、72℃30s，循环30次；72℃延伸10min。

基于CRISPR-Cas13a系统的可视化检测的反应体系(25μl)：5μl步骤(2)的产物溶液、1μl Cas13蛋白溶液(含125ng蛋白)、2.5μl NTPmix、0.4μl T7 RNA聚合酶(含20U)、1μlRNA酶抑制剂、1μl crRNA(含45ng)、1.6μl报告RNA、2.5μl10×buffer，余量为无RNA酶水。

基于CRISPR-Cas13a系统的可视化检测的反应条件：37℃，每2min为一个循环(读取荧光值)，循环30次。

基于CRISPR-Cas13a系统的可视化检测通过荧光信号判断受试者血液样本中是否含有乙型肝炎病毒。荧光信号越强说明乙型肝炎病毒的含量越高。

基于CRISPR-Cas13a系统的可视化检测通过荧光信号判断受试者血液样本中是否含有乙型肝炎病毒前基因组RNA。荧光信号越强说明乙型肝炎病毒前基因组RNA的含量越高。

LwCas13a蛋白如SEQ ID No.6第151-1302位氨基酸残基所示。

本发明还保护以上任一所述核酸分子组合物在检测乙型肝炎病毒中的应用。

本发明还保护以上任一所述试剂盒在检测乙型肝炎病毒中的应用。

所述检测乙型肝炎病毒为检测乙型肝炎病毒前基因组RNA。

由于HBV pgRNA是由HBV cccDNA转录而来，血清HBV pgRNA的持续存在很好的反映了肝细胞中cccDNA的活性。HBeAg的血清学转换被视为乙肝患者的治疗终点，在抗病毒药物治疗后，HBV pgRNA水平的下降能够比较强的预测HBeAg的血清学转化，对指导临床用药具有重要的意义。本发明中的引物F和引物R的靶序列为乙型肝炎病毒前基因组RNA的特异区段的编码序列。本发明采用PCR技术联合CRISPR-Cas13a技术检测HBV pgRNA，并开发了试剂盒。本发明提供的试剂盒可检测HBV pgRNA，并具有良好的特异性和灵敏性，稳定性高，能够实现对HBV pgRNA水平的稳定检测，从而可用于解决评价药物的治疗效果，改善乙肝患者的抗病毒治疗，疗效评估，预后监测等方面的问题，为实现乙肝的个体化治疗奠定坚实的基础。本发明具有非常重要的临床应用前景和开发价值。

附图说明

图1为实施例2中的微滴散点图。

图2为实施例2中的CRISPR-cas13a检测结果。

图3为实施例3中的微滴散点图。

图4为实施例3中的灵敏度结果。

图5为实施例3中的特异性结果。

具体实施方式

下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。以下提供的实施例可作为本技术领域普通技术人员进行进一步改进的指南，并不以任何方式构成对本发明的限制。

下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。2×Taq mix：博迈德公司，货号MT211-02。

如无特殊说明，以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。

实施例1、基于PCR-CRISPR-cas13a检测乙型肝炎病毒前基因组RNA

本发明所提供的基于PCR-CRISPR-cas13a检测乙型肝炎病毒前基因组RNA的方法的基本原理：提取生物材料(通常为受试者的血清)的总RNA，首先通过逆转录形成cDNA，然后通过PCR进行特异性扩增(所述特异性扩增的靶序列为乙型肝炎病毒前基因组RNA的特异区段的编码序列)，随后转录得到单链RNA，再通过CRISPR的crRNA特异性结合目的片段(目的片段即前述乙型肝炎病毒前基因组RNA的特异区段)，最后利用Cas13a蛋白酶切带有荧光信号的报告RNA，通过荧光信号来判断生物材料中是否含有乙型肝炎病毒前基因组RNA。

一、引物的设计

通过大量筛选和预实验，获得效果最佳的引物。

逆转录引物如下(SEQ ID No.1)：

引物HR-RT：5’-GTAGTCAGCCTTACAGACGAGACAGGCGAGGGAGTTCTTCTTCTA-3'。

针对HBV pgRNA的cDNA正链上游的特异性PCR扩增引物如下(SEQ ID No.2)：

引物F：5’-AGACCACCAAATGCCCCT-3’；

针对HBV pgRNA的cDNA正链下游的特异性PCR扩增引物如下(SEQ ID No.3)：

引物R：5’-AATTCTAATACGACTCACTATAGGGAGTCAGCCTTACAGACGAGAC-3’。

引物R中，下划线标记T7启动子序列。

二、方法的建立

1、提取总RNA并反转录得到cDNA。

(1)取待测血清，采用病毒RNA提取试剂盒(Virus RNA Miniprep Kit)(BIOMIGA公司，R6620-01)提取RNA。

(2)进行DNaseI消化。

反应体系(10μl)：步骤(1)的产物溶液7.5μl、DNase I 1μl、10×Reaction Buffer1μl、RiboLock RNase Inhibitor 0.5μl。

反应条件：37℃，孵育30min。

DNaseI(1U/μl)：Thermo Fisher Scientific,Waltham,MA,USA。10×ReactionBuffer为DNaseI的配套缓冲液。RiboLock RNase Inhibitor：Thermo Fisher Scientific，EO0381。

(3)取步骤(2)的产物溶液，加入1μl 50mM EDTA溶液和1μl 10μM引物HR-RT溶液，65℃孵育10min。

(4)取步骤(3)的产物溶液，采用RevertAid First Strand DNA Synthesis Kit(Thermo Fisher Scientific,Waltham,MA,USA)进行逆转录，得到cDNA。

反应体系：步骤(3)的产物溶液12μl，5X Reaction Buffer 4μl，dNTP Mix(10mM)2μl，RiboLock RNase Inhibitor 1μl，Reverse Transcriptase 1μl。5X Reaction Buffer、dNTP Mix、Reverse Transcriptase均为RevertAid First Strand DNA Synthesis Kit中的组件。

反应条件：25℃5分钟，42℃60分钟，70℃5分钟。

2、以步骤1得到的cDNA为模板，采用引物F和引物R组成的引物对进行PCR扩增。

PCR扩增的反应体系：2μl模板(DNA含量约为10ng)，10μl 2×Taq mix，引物F溶液(10μM)1μl，引物R溶液(10μM)1μl，加水至20μl。

PCR扩增的反应条件：95℃预变性10min；95℃30s、60℃30s、72℃30s，循环30次；72℃延伸10min。

3、转录及CRISPR-Cas13a检测

反应体系(25μl)：5μl步骤2的产物溶液、1μl Cas13蛋白溶液(含125ng蛋白)、2.5μl NTPmix、0.4μl T7 RNA聚合酶(含20U)、1μl RNA酶抑制剂、1μl crRNA(含45ng)、1.6μl报告RNA、2.5μl 10×buffer，余量为无RNA酶水。

报告RNA为RNaseAlert^TM QC System v2中的

Substrate v2。RNaseAlert^TM QC System v2：Invitrogen^TM公司，货号4479769。

T7 RNA聚合酶为HiScribe T7快速高效RNA合成试剂盒中的T7 RNA聚合酶混合液。NTPmix为HiScribe T7快速高效RNA合成试剂盒中的NTP缓冲液混合液。HiScribe T7快速高效RNA合成试剂盒：NEB产品，货号E2050S。

RNA酶抑制剂为小鼠RNase抑制剂(规格为40000units/ml)：NEB产品，货号M0314S。

Cas13a蛋白溶液，又称为LwCas13a蛋白溶液，制备方法见实施例5。

10×buffer(pH7.3)：含400mM Tris-HCl、600mM氯化钠、60mM MgCl₂，余量为水。

反应条件：37℃，每2min为一个循环(读取荧光值)，循环30次。

实施例2、标准品的制备以及crRNA的筛选

一、标准品的制备

1、取三甲医院已确诊的HBV患者的血清，提取总RNA。

2、取步骤1得到的总RNA，采用引物HR-RT进行逆转录，得到cDNA。

3、取步骤2得到的cDNA,采用微滴式数字PCR进行定量。

微滴式数字PCR采用的引物和探针如下：

D-F：5’-AGACCACCAAATGCCCCT-3’

D-R：5’-AGTCAGCCTTACAGACGAGAC-3’；

D-P：5’-FAM-CAACACTTCCGGARACTACTGTTGTTAGACG-BHQ1-3’。

微滴散点图见图1。横坐标代表微滴数，纵坐标代表荧光强度，阴性微滴以灰色显示，阳性微滴以蓝色显示，按泊松分布95％置信度计算HBV RNA浓度。图1表明，该血清的HBVRNA浓度为36687.6copies/μl。

二、crRNA的筛选

供试crRNA分别为如下：

crRNA1：

crRNA2：

crRNA3(SEQ ID No.4)：

crRNA序列中，粗体标注的39nt为与LwCas13a蛋白结合的区域，也就是scaford序列。

取步骤一的血清，按照实施例1的步骤二的方法进行检测。分别采用三种供试crRNA。

结果见图2(纵坐标为荧光强度，横坐标为循环数)。crRNA3的效果最优。

实施例3、本发明方法的灵敏度、特异性和稳定性实验

一、灵敏度检测

取三甲医院已确诊的HBV患者的血清，按照实施例2的步骤一的方法检测HBV RNA浓度，微滴散点图见图3，为25765copies/μl。

供试样本：用无菌水对上述血清进行稀释，得到HBV RNA浓度分别为10⁴copy/μl、10³copy/μl、10²copy/μl、10¹copy/μl的10⁰copy/μl的血清稀释液，作为供试样本；阴性对照为无菌水。

取供试样本，采用crRNA3(SEQ ID No.4所示)，按照实施例1的步骤二的方法进行检测。

结果见图4(纵坐标为荧光强度，横坐标为循环数)。在1copy/μl时，检测20min时，即可与阴性对照的荧光值发生显著差异，提示本发明方法的灵敏度良好，可低至1copy/μl。

二、特异性试验

6份临床HBV阳性样本(三甲医院已确诊的6位HBV患者的血清)。1份临床HBV阴性样本(健康体检者的血清)。阴性对照为无菌水。

采用crRNA3(SEQ ID No.4所示)，按照实施例1的步骤二的方法进行检测。

结果见图5(纵坐标为荧光强度，横坐标为循环数)。样本-2为所述阴性样本，其他6个样本为6份HBV阳性样本。阴性对照与临床阴性样本检测结果均为阴性，6份HBV阳性样本检测结果均为阳性。结果表明，本发明的方法具有良好特异性。

三、稳定性实验

1、以步骤一中的血清稀释液为供试样本，每个供试样本分别进行6次重复实验。采用crRNA3(SEQ ID No.4所示)，按照实施例1的步骤二的方法进行检测。组间组内无显著性差异(p<0.05)。

2、以步骤二中的6份临床HBV阳性样本为供试样本，每个供试样本分别进行4次重复检测。采用crRNA3(SEQ ID No.4所示)，按照实施例1的步骤二的方法进行检测。组间组内无显著性差异(p<0.05)。

结果表明，本发明方法稳定性及可重复性较好。

实施例5、LwCas13a蛋白的制备

一、制备重组菌

将质粒pC013-Twinstrep-SUMO-huLwCas13a导入TransB(DE3)ChemicallyComptent Cell，得到重组菌。

质粒pC013-Twinstrep-SUMO-huLwCas13a：Addgene，产品ID为90097；https://www.addgene.org/browse/sequence/181127/。

质粒pC013-Twinstrep-SUMO-huLwCas13a如SEQ ID No.5所示。SEQ ID No.5中，第2751-6659位核苷酸的反向互补序列编码融合蛋白。融合蛋白如SEQ ID No.6所示。SEQ IDNo.6中，第5-10位氨基酸残基组成His₆标签，第24-51位氨基酸残基组成Strep标签，第52-148位氨基酸残基组成SUMO蛋白，第151-1302位氨基酸残基组成LwCas13a蛋白。在SUMO蛋白酶的作用下，融合蛋白被切割并释放LwCas13a蛋白。

TransB(DE3)Chemically Comptent Cell即TransB(DE3)化学感受态细胞。

二、制备Cas13a蛋白

1、采用液体LB培养基培养步骤一制备的重组菌，直至培养体系的OD_600nm值＝0.6，然后加入IPTG并使其在体系中的浓度为500μM，然后18℃、200-220rpm诱导培养16h，然后5200g离心15min，收集菌体，

2、取步骤1得到的菌体，加入裂解液(裂解液：含20mM Tris-HCl、500mM氯化钠、1mM二硫苏糖醇，余量为水)，然后进行超声破碎(超声5s，停10s，总时间为1.5h)，然后4℃、12000rpm离心10min，收集上清液。

3、取步骤2得到的上清液，加入咪唑并使其浓度为10mM，然后采用0.22μm滤膜过滤，收集滤液。

4、取步骤3得到的滤液，采用镍柱(HisTrap HP column)分离纯化具有His₆标签的融合蛋白。

5、收集步骤4得到的过柱后溶液，转移到透析袋中，将透析袋放入SUMO缓冲液中进行透析(4℃搅拌，约1h换液一次，换液3次)。SUMO缓冲液：含30mM Tris-HCl、500mM氯化钠、1mM二硫苏糖醇、0.15％NP-40，余量为水。

6、完成步骤5后，收集透析袋内的液体，采用SUMO蛋白酶进行酶切。

SUMO蛋白酶：索莱宝公司，货号P2070。

7、完成步骤6后，取酶切产物溶液，进行离子交换层析。

离子交换层析柱：UniGel-50SP(Nano-Micro Tech)。

离子交换柱平衡后上样酶切产物溶液，依次用200mM氯化钠水溶液、500mM氯化钠水溶液、1M氯化钠水溶液和0.5M NaOH水溶液洗脱，收集各个蛋白峰对应的过柱后溶液并进行电泳检测(LwCas13a蛋白的预期分子量为138.5kDa)。

以上对本发明进行了详述。对于本领域技术人员来说，在不脱离本发明的宗旨和范围，以及无需进行不必要的实验情况下，可在等同参数、浓度和条件下，在较宽范围内实施本发明。虽然本发明给出了特殊的实施例，应该理解为，可以对本发明作进一步的改进。总之，按本发明的原理，本申请欲包括任何变更、用途或对本发明的改进，包括脱离了本申请中已公开范围，而用本领域已知的常规技术进行的改变。按以下附带的权利要求的范围，可以进行一些基本特征的应用。

序列表

<110> 首都医科大学附属北京佑安医院

<120> 基于PCR-CRISPR-Cas13a检测乙型肝炎病毒前基因组RNA的试剂盒

<130> GNCYX210444

<160> 6

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 45

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

gtagtcagcc ttacagacga gacaggcgag ggagttcttc ttcta 45

<210> 2

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

agaccaccaa atgcccct 18

<210> 3

<211> 46

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

aattctaata cgactcacta tagggagtca gccttacaga cgagac 46

<210> 4

<211> 67

<212> RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

ggggauuuag acuaccccaa aaacgaaggg gacuaaaacc uuccggaaac uacuguuguu 60

agacgac 67

<210> 5

<211> 9542

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

aaaccgccct taacatggcc cgctttatca gaagccagac attaacgctt ctggagaaac 60

tcaacgagct ggacgcggat gaacaggcag acatctgtga atcgcttcac gaccacgctg 120

atgagcttta ccgcagctgc ctcgcgcgtt tcggtgatga cggtgaaaac ctctgacaca 180

tgcagctccc ggagacggtc acagcttgtc tgtaagcgga tgccgggagc agacaagccc 240

gtcagggcgc gtcagcgggt gttggcgggt gtcggggcgc agccatgacc cagtcacgta 300

gcgatagcgg agtgtatact ggcttaacta tgcggcatca gagcagattg tactgagagt 360

gcaccattgc ggtgtgaaat accgcacaga tgcgtaagga gaaaataccg catcaggcgc 420

tcttccgctt cctcgctcac tgactcgctg cgctcggtcg ttcggctgcg gcgagcggta 480

tcagctcact caaaggcggt aatacggtta tccacagaat caggggataa cgcaggaaag 540

aacatgtgag caaaaggcca gcaaaaggcc aggaaccgta aaaaggccgc gttgctggcg 600

tttttccata ggctccgccc ccctgacgag catcacaaaa atcgacgctc aagtcagagg 660

tggcgaaacc cgacaggact ataaagatac caggcgtttc cccctggaag ctccctcgtg 720

cgctctcctg ttccgaccct gccgcttacc ggatacctgt ccgcctttct cccttcggga 780

agcgtggcgc tttctcatag ctcacgctgt aggtatctca gttcggtgta ggtcgttcgc 840

tccaagctgg gctgtgtgca cgaacccccc gttcagcccg accgctgcgc cttatccggt 900

aactatcgtc ttgagtccaa cccggtaaga cacgacttat cgccactggc agcagccact 960

ggtaacagga ttagcagagc gaggtatgta ggcggtgcta cagagttctt gaagtggtgg 1020

cctaactacg gctacactag aaggacagta tttggtatct gcgctctgct gaagccagtt 1080

accttcggaa aaagagttgg tagctcttga tccggcaaac aaaccaccgc tggtagcggt 1140

ggtttttttg tttgcaagca gcagattacg cgcagaaaaa aaggatctca agaagatcct 1200

ttgatctttt ctacggggtc tgacgctcag tggaacgaaa actcacgtta agggattttg 1260

gtcatgagat tatcaaaaag gatcttcacc tagatccttt taaattaaaa atgaagtttt 1320

aaatcaatct aaagtatata tgagtaaact tggtctgaca gttaccaatg cttaatcagt 1380

gaggcaccta tctcagcgat ctgtctattt cgttcatcca tagttgcctg actccccgtc 1440

gtgtagataa ctacgatacg ggagggctta ccatctggcc ccagtgctgc aatgataccg 1500

cgagacccac gctcaccggc tccagattta tcagcaataa accagccagc cggaagggcc 1560

gagcgcagaa gtggtcctgc aactttatcc gcctccatcc agtctattaa ttgttgccgg 1620

gaagctagag taagtagttc gccagttaat agtttgcgca acgttgttgc cattgctgca 1680

ggcatcgtgg tgtcacgctc gtcgtttggt atggcttcat tcagctccgg ttcccaacga 1740

tcaaggcgag ttacatgatc ccccatgttg tgcaaaaaag cggttagctc cttcggtcct 1800

ccgatcgttg tcagaagtaa gttggccgca gtgttatcac tcatggttat ggcagcactg 1860

cataattctc ttactgtcat gccatccgta agatgctttt ctgtgactgg tgagtactca 1920

accaagtcat tctgagaata gtgtatgcgg cgaccgagtt gctcttgccc ggcgtcaaca 1980

cgggataata ccgcgccaca tagcagaact ttaaaagtgc tcatcattgg aaaacgttct 2040

tcggggcgaa aactctcaag gatcttaccg ctgttgagat ccagttcgat gtaacccact 2100

cgtgcaccca actgatcttc agcatctttt actttcacca gcgtttctgg gtgagcaaaa 2160

acaggaaggc aaaatgccgc aaaaaaggga ataagggcga cacggaaatg ttgaatactc 2220

atactcttcc tttttcaata ttattgaagc atttatcagg gttattgtct catgagcgga 2280

tacatatttg aatgtattta gaaaaataaa caaatagggg ttccgcgcac atttccccga 2340

aaagtgccac ctgacgtcta agaaaccatt attatcatga cattaaccta taaaaatagg 2400

cgtatcacga ggccctttcg tcttcaagaa ttctcatgtt tgacagctta tcatcgataa 2460

gctttaatgc ggtagtttat cacagttaaa ttgctaacgc agtcaggcac cgtgtatgaa 2520

atctaacaat gcgctcatcg tcatcctcgg caccgtcacc ctggatgctg taggcatagg 2580

cttggttatg ccggtactgc cgggcctctt gcgggatatc cggatatagt tcctcctttc 2640

agcaaaaaac ccctcaagac ccgtttagag gccccaaggg gttatgctag ttattgctca 2700

gcggtggcag cagccaactc agcttccttt cgggcctcga gtgcggccgc ttattccagg 2760

gccttgtact cgaacatgac tttcacgagt tcgcacagtt cctcgctgtt ccggtcggtc 2820

atcagtttct ttttcttcag attcttcagg tgcacgatct tctctgattc cagggtctgg 2880

atttcgatct tcttgtcagc gccgatcttg aaggtggcca cgaagccgta ttctttcaga 2940

atgtccacga tggacttcat gatggcgttc ttcagcttcc ggtcgtagga cagcagcttc 3000

cgcaggtttt ccagcacttc cagcaggcta atctcggcgt gggggatgta gttgaagtgg 3060

gcaatgtagt tccggatgta caggtccttt ttttcctgct tcagtttctt cactttcttg 3120

tcggagtaga tgctccgctt ttccacattg tccttgtaca gttctttgta gaagttgata 3180

tacttttcca cgatctggcc gcttttgtac ttcacattct tggagttgtc gaaattgaaa 3240

atttcctcga tgtagtggtt ctcgggaaac tcgcccttca gccggaatct caggtcccgc 3300

tcccagatgc tggtgtagcc cacgagccgg tgcaggatct tcagcagcag gccctgcagc 3360

aggttcagct cattgaattc caccttgttc ttcaggtggg tgtacttctg gatgttgccg 3420

atggccttct catactcttt gtagtcctcg tcgttgaact tttcgtcctt cttgggtctg 3480

gcgtacttcc ggtgcaggtt ctgctgcatg gtgtagttct tttcaatctc attcttcttg 3540

ttgctgtact ctttcagttc tttcaggctg atcttatact tggccttatc ggcgatcttt 3600

tccagcagat tcagcatgcc gtatttcttg atattgtaga aggcccggtg cttgatgatg 3660

ttctcgccgt cgaaatagat cttgttggtg tcgaactttt tcagctcttt ccggtccttg 3720

attttgtttt cgttgaagtc caggaacttg ccgatctcgt tggcttccag ctcgaagtcc 3780

tcggtcactc tgttgttgtc caggttcagc aggttgatca gttccagctc gtcgctgaag 3840

gtttcttctt tgttggcgga ctggtacttt tccaggctgc ccttcaggtt ggtcagctct 3900

ttgtggttca gcagcttcag gatcaggtaa aacatgttca gattctcggt gtacttcaga 3960

atcttcccca gcttgatctc gcgcacgaac tcattgatct cgtgagggat ttctttgttc 4020

cgattgtgct tctcatagtt cttcaggatc ttgtcgtact tctctttgtt atcctttttg 4080

atcttgatct tggagaagat gtcgttgttg tcattgttgt tgttgctctc gatatacttc 4140

agattgttct tgttcaggta gtcgatgaag cccttcagga aaatctgctg aataaagtcg 4200

atgtaggtat tcttttcctc tttgtcctgg ttgttgatca tctctctgct ctggatgatg 4260

gccaggtatt ccacgggcac ggttttctcg atgttctcga acttctgata cttgtagtgg 4320

ccggttttct ggttccgctg cttgttaatc ttgatcactt cattggtgat cttaaagaac 4380

accttggagt ttttcacgaa cttgttcagg aactcgccgt agtagatatt cttcagcagg 4440

tagatctggg cgtccttctc ttctttgtcc ttgggcacgc tccaaaaaaa cttcagggta 4500

ttccgcaggt cctcaatctt gttgtacagc ttggtgaagc tgggcacgaa ggggatgttt 4560

ttgttcacga agttgaactt ggtattcttc aggtacttga tgatcacatc cttctcgtag 4620

tagttgaaca cgttggcgct gttcagctgc ttgaagattt tcagcttcag cttcttttcg 4680

ttgatttcgt tctgaaacat cttcttggag atctcgctgg gggcgatatt cttgaaggcg 4740

aagatgtcct tgccttccag ttccaggttg aagtgcacga tgccgtgtct gatgctgctg 4800

atggcctcgt cgatgttggc gaagaagtcc tcgatctcgt tcttgttgtc catgttgaag 4860

tcgtagctgt agaacatctt cagattttct ttcacttcgt tctgcttgtt ctcattgtag 4920

atcttgtcca cctcgccgga cacgtatttc tcttcgccct tgttgttctt cacggtcttg 4980

ccccgcatcc ggccggtgat atcgttctcg ttctcggttt ccaggatgtt cctcaggctg 5040

aagtaggcca cgctggacac gccgatgatg tttctcagga aggcctcgtt ctgccggttc 5100

cgggcgataa agtcggaggt ggcgatctcg cccacttgca gatagtagtt gtacttgccg 5160

cagttccgca cgtaggtgtc cagcttgttc agcagtttgt tttcgatcag ctttttcaga 5220

ttctggtact cgaagatccg cttgatctta tcgttgctga tgttgctcag ccgcttgtac 5280

acgtagtttt tcagcagctg ggacatctcg atttccacga agtggcagaa ggcgtactta 5340

atattcttgt cgttcagttc ctctttgtcc aggtagtact tgtagaacac ctggcttttc 5400

ttcagctcag acatgtcggg gatcttctca atcagctctt tgatgttgtt cacgttctgg 5460

atctcttcgt agataatctt ggcgaagttc tctttgtcgt tcttccggcc gatgatcttg 5520

tgatagtact cgcggatctt gtacttctcg tgcttcttgc tgttctcgat caggaaaaac 5580

agtttctcga tatcctcttt cttatacagc ttgtcgaagg cttcctgcac gttgttgatg 5640

tagtcgttgc gcttggcgct ctctctgtag tagtcgtaga tgatgttccg cttgctcttg 5700

ccgcccactt tttccacgtt gttctcgttg atcttctggt agttggcctt gttctcttcg 5760

aagctgtact tcaggctgtt gatcttgttc agcttggctt ccacgtcctt ccgaaagatt 5820

tccagttcct cagagttcac gtcctcgttc agcaggatct tcttcagcac ggagaagctg 5880

ttcttgtttt tcaggtcgta ctcgctgatg tcctcttcgc tatagttctt gtcctgcacg 5940

gcgttctttt ctttccggtt cttcagatac agcacgctgt ccttcaggtg cagcaccttg 6000

ttgctaaaga acttcttcag gttctctctt ctgatccggt tctcttcctc ggaggcgttg 6060

tcggggttct tgatgtagat gtccagccgg atgctcagca gctcgctcag tctctcgctg 6120

gtccggtttt cctcgctggt ggacttcacg agcttgccct cttcgatgta cttcttgtgg 6180

ctgatgccgt cgaccttggt cactttcatg gatccaccaa tctgttctct gtgagcctca 6240

ataatatcgt tatcctccat gtccaaatct tcaggggtct gatcagcttg gattctaata 6300

ccgtcgtaca agaatcttaa ggagtccatt tccttaccct gtcttttagc gaacgcttcc 6360

atcagccttc ttaaaggagt ggtctttttg atcttgaaga agatctctga agatccatcg 6420

gacaccttta aattgatgtg agtctcaggc ttgacttctg gcttgacctc tggcttagct 6480

tcttgattga cttctgagtc cgacattttc tcaaactgag ggtgtgacca tgcactacca 6540

cctgaaccac caccgctacc accacctttt tcaaactgcg gatggctcca gctagccata 6600

tggctgccgc gcggcaccag gccgctgctg tgatgatgat gatgatggct gctgcccatg 6660

gtatatctcc ttcttaaagt taaacaaaat tatttctaga ggggaattgt tatccgctca 6720

caattcccct atagtgagtc gtattaattt cgcgggatcg agatctcgat cctctacgcc 6780

ggacgcatcg tggccggcat caccggcgcc acaggtgcgg ttgctggcgc ctatatcgcc 6840

gacatcaccg atggggaaga tcgggctcgc cacttcgggc tcatgagcgc ttgtttcggc 6900

gtgggtatgg tggcaggccc cgtggccggg ggactgttgg gcgccatctc cttgcatgca 6960

ccattccttg cggcggcggt gctcaacggc ctcaacctac tactgggctg cttcctaatg 7020

caggagtcgc ataagggaga gcgtcgagat cccggacacc atcgaatggc gcaaaacctt 7080

tcgcggtatg gcatgatagc gcccggaaga gagtcaattc agggtggtga atgtgaaacc 7140

agtaacgtta tacgatgtcg cagagtatgc cggtgtctct tatcagaccg tttcccgcgt 7200

ggtgaaccag gccagccacg tttctgcgaa aacgcgggaa aaagtggaag cggcgatggc 7260

ggagctgaat tacattccca accgcgtggc acaacaactg gcgggcaaac agtcgttgct 7320

gattggcgtt gccacctcca gtctggccct gcacgcgccg tcgcaaattg tcgcggcgat 7380

taaatctcgc gccgatcaac tgggtgccag cgtggtggtg tcgatggtag aacgaagcgg 7440

cgtcgaagcc tgtaaagcgg cggtgcacaa tcttctcgcg caacgcgtca gtgggctgat 7500

cattaactat ccgctggatg accaggatgc cattgctgtg gaagctgcct gcactaatgt 7560

tccggcgtta tttcttgatg tctctgacca gacacccatc aacagtatta ttttctccca 7620

tgaagacggt acgcgactgg gcgtggagca tctggtcgca ttgggtcacc agcaaatcgc 7680

gctgttagcg ggcccattaa gttctgtctc ggcgcgtctg cgtctggctg gctggcataa 7740

atatctcact cgcaatcaaa ttcagccgat agcggaacgg gaaggcgact ggagtgccat 7800

gtccggtttt caacaaacca tgcaaatgct gaatgagggc atcgttccca ctgcgatgct 7860

ggttgccaac gatcagatgg cgctgggcgc aatgcgcgcc attaccgagt ccgggctgcg 7920

cgttggtgcg gatatctcgg tagtgggata cgacgatacc gaagacagct catgttatat 7980

cccgccgtta accaccatca aacaggattt tcgcctgctg gggcaaacca gcgtggaccg 8040

cttgctgcaa ctctctcagg gccaggcggt gaagggcaat cagctgttgc ccgtctcact 8100

ggtgaaaaga aaaaccaccc tggcgcccaa tacgcaaacc gcctctcccc gcgcgttggc 8160

cgattcatta atgcagctgg cacgacaggt ttcccgactg gaaagcgggc agtgagcgca 8220

acgcaattaa tgtaagttag ctcactcatt aggcaccggg atctcgaccg atgcccttga 8280

gagccttcaa cccagtcagc tccttccggt gggcgcgggg catgactatc gtcgccgcac 8340

ttatgactgt cttctttatc atgcaactcg taggacaggt gccggcagcg ctctgggtca 8400

ttttcggcga ggaccgcttt cgctggagcg cgacgatgat cggcctgtcg cttgcggtat 8460

tcggaatctt gcacgccctc gctcaagcct tcgtcactgg tcccgccacc aaacgtttcg 8520

gcgagaagca ggccattatc gccggcatgg cggccgacgc gctgggctac gtcttgctgg 8580

cgttcgcgac gcgaggctgg atggccttcc ccattatgat tcttctcgct tccggcggca 8640

tcgggatgcc cgcgttgcag gccatgctgt ccaggcaggt agatgacgac catcagggac 8700

agcttcaagg atcgctcgcg gctcttacca gcctaacttc gatcattgga ccgctgatcg 8760

tcacggcgat ttatgccgcc tcggcgagca catggaacgg gttggcatgg attgtaggcg 8820

ccgccctata ccttgtctgc ctccccgcgt tgcgtcgcgg tgcatggagc cgggccacct 8880

cgacctgaat ggaagccggc ggcacctcgc taacggattc accactccaa gaattggagc 8940

caatcaattc ttgcggagaa ctgtgaatgc gcaaaccaac ccttggcaga acatatccat 9000

cgcgtccgcc atctccagca gccgcacgcg gcgcatctcg ggcagcgttg ggtcctggcc 9060

acgggtgcgc atgatcgtgc tcctgtcgtt gaggacccgg ctaggctggc ggggttgcct 9120

tactggttag cagaatgaat caccgatacg cgagcgaacg tgaagcgact gctgctgcaa 9180

aacgtctgcg acctgagcaa caacatgaat ggtcttcggt ttccgtgttt cgtaaagtct 9240

ggaaacgcgg aagtcagcgc cctgcaccat tatgttccgg atctgcatcg caggatgctg 9300

ctggctaccc tgtggaacac ctacatctgt attaacgaag cgctggcatt gaccctgagt 9360

gatttttctc tggtcccgcc gcatccatac cgccagttgt ttaccctcac aacgttccag 9420

taaccgggca tgttcatcat cagtaacccg tatcgtgagc atcctctctc gtttcatcgg 9480

tatcattacc cccatgaaca gaaatccccc ttacacggag gcatcagtga ccaaacagga 9540

aa 9542

<210> 6

<211> 1302

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

Met Gly Ser Ser His His His His His His Ser Ser Gly Leu Val Pro

1 5 10 15

Arg Gly Ser His Met Ala Ser Trp Ser His Pro Gln Phe Glu Lys Gly

20 25 30

Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Ser Ala Trp Ser His Pro Gln

35 40 45

Phe Glu Lys Met Ser Asp Ser Glu Val Asn Gln Glu Ala Lys Pro Glu

50 55 60

Val Lys Pro Glu Val Lys Pro Glu Thr His Ile Asn Leu Lys Val Ser

65 70 75 80

Asp Gly Ser Ser Glu Ile Phe Phe Lys Ile Lys Lys Thr Thr Pro Leu

85 90 95

Arg Arg Leu Met Glu Ala Phe Ala Lys Arg Gln Gly Lys Glu Met Asp

100 105 110

Ser Leu Arg Phe Leu Tyr Asp Gly Ile Arg Ile Gln Ala Asp Gln Thr

115 120 125

Pro Glu Asp Leu Asp Met Glu Asp Asn Asp Ile Ile Glu Ala His Arg

130 135 140

Glu Gln Ile Gly Gly Ser Met Lys Val Thr Lys Val Asp Gly Ile Ser

145 150 155 160

His Lys Lys Tyr Ile Glu Glu Gly Lys Leu Val Lys Ser Thr Ser Glu

165 170 175

Glu Asn Arg Thr Ser Glu Arg Leu Ser Glu Leu Leu Ser Ile Arg Leu

180 185 190

Asp Ile Tyr Ile Lys Asn Pro Asp Asn Ala Ser Glu Glu Glu Asn Arg

195 200 205

Ile Arg Arg Glu Asn Leu Lys Lys Phe Phe Ser Asn Lys Val Leu His

210 215 220

Leu Lys Asp Ser Val Leu Tyr Leu Lys Asn Arg Lys Glu Lys Asn Ala

225 230 235 240

Val Gln Asp Lys Asn Tyr Ser Glu Glu Asp Ile Ser Glu Tyr Asp Leu

245 250 255

Lys Asn Lys Asn Ser Phe Ser Val Leu Lys Lys Ile Leu Leu Asn Glu

260 265 270

Asp Val Asn Ser Glu Glu Leu Glu Ile Phe Arg Lys Asp Val Glu Ala

275 280 285

Lys Leu Asn Lys Ile Asn Ser Leu Lys Tyr Ser Phe Glu Glu Asn Lys

290 295 300

Ala Asn Tyr Gln Lys Ile Asn Glu Asn Asn Val Glu Lys Val Gly Gly

305 310 315 320

Lys Ser Lys Arg Asn Ile Ile Tyr Asp Tyr Tyr Arg Glu Ser Ala Lys

325 330 335

Arg Asn Asp Tyr Ile Asn Asn Val Gln Glu Ala Phe Asp Lys Leu Tyr

340 345 350

Lys Lys Glu Asp Ile Glu Lys Leu Phe Phe Leu Ile Glu Asn Ser Lys

355 360 365

Lys His Glu Lys Tyr Lys Ile Arg Glu Tyr Tyr His Lys Ile Ile Gly

370 375 380

Arg Lys Asn Asp Lys Glu Asn Phe Ala Lys Ile Ile Tyr Glu Glu Ile

385 390 395 400

Gln Asn Val Asn Asn Ile Lys Glu Leu Ile Glu Lys Ile Pro Asp Met

405 410 415

Ser Glu Leu Lys Lys Ser Gln Val Phe Tyr Lys Tyr Tyr Leu Asp Lys

420 425 430

Glu Glu Leu Asn Asp Lys Asn Ile Lys Tyr Ala Phe Cys His Phe Val

435 440 445

Glu Ile Glu Met Ser Gln Leu Leu Lys Asn Tyr Val Tyr Lys Arg Leu

450 455 460

Ser Asn Ile Ser Asn Asp Lys Ile Lys Arg Ile Phe Glu Tyr Gln Asn

465 470 475 480

Leu Lys Lys Leu Ile Glu Asn Lys Leu Leu Asn Lys Leu Asp Thr Tyr

485 490 495

Val Arg Asn Cys Gly Lys Tyr Asn Tyr Tyr Leu Gln Val Gly Glu Ile

500 505 510

Ala Thr Ser Asp Phe Ile Ala Arg Asn Arg Gln Asn Glu Ala Phe Leu

515 520 525

Arg Asn Ile Ile Gly Val Ser Ser Val Ala Tyr Phe Ser Leu Arg Asn

530 535 540

Ile Leu Glu Thr Glu Asn Glu Asn Asp Ile Thr Gly Arg Met Arg Gly

545 550 555 560

Lys Thr Val Lys Asn Asn Lys Gly Glu Glu Lys Tyr Val Ser Gly Glu

565 570 575

Val Asp Lys Ile Tyr Asn Glu Asn Lys Gln Asn Glu Val Lys Glu Asn

580 585 590

Leu Lys Met Phe Tyr Ser Tyr Asp Phe Asn Met Asp Asn Lys Asn Glu

595 600 605

Ile Glu Asp Phe Phe Ala Asn Ile Asp Glu Ala Ile Ser Ser Ile Arg

610 615 620

His Gly Ile Val His Phe Asn Leu Glu Leu Glu Gly Lys Asp Ile Phe

625 630 635 640

Ala Phe Lys Asn Ile Ala Pro Ser Glu Ile Ser Lys Lys Met Phe Gln

645 650 655

Asn Glu Ile Asn Glu Lys Lys Leu Lys Leu Lys Ile Phe Lys Gln Leu

660 665 670

Asn Ser Ala Asn Val Phe Asn Tyr Tyr Glu Lys Asp Val Ile Ile Lys

675 680 685

Tyr Leu Lys Asn Thr Lys Phe Asn Phe Val Asn Lys Asn Ile Pro Phe

690 695 700

Val Pro Ser Phe Thr Lys Leu Tyr Asn Lys Ile Glu Asp Leu Arg Asn

705 710 715 720

Thr Leu Lys Phe Phe Trp Ser Val Pro Lys Asp Lys Glu Glu Lys Asp

725 730 735

Ala Gln Ile Tyr Leu Leu Lys Asn Ile Tyr Tyr Gly Glu Phe Leu Asn

740 745 750

Lys Phe Val Lys Asn Ser Lys Val Phe Phe Lys Ile Thr Asn Glu Val

755 760 765

Ile Lys Ile Asn Lys Gln Arg Asn Gln Lys Thr Gly His Tyr Lys Tyr

770 775 780

Gln Lys Phe Glu Asn Ile Glu Lys Thr Val Pro Val Glu Tyr Leu Ala

785 790 795 800

Ile Ile Gln Ser Arg Glu Met Ile Asn Asn Gln Asp Lys Glu Glu Lys

805 810 815

Asn Thr Tyr Ile Asp Phe Ile Gln Gln Ile Phe Leu Lys Gly Phe Ile

820 825 830

Asp Tyr Leu Asn Lys Asn Asn Leu Lys Tyr Ile Glu Ser Asn Asn Asn

835 840 845

Asn Asp Asn Asn Asp Ile Phe Ser Lys Ile Lys Ile Lys Lys Asp Asn

850 855 860

Lys Glu Lys Tyr Asp Lys Ile Leu Lys Asn Tyr Glu Lys His Asn Arg

865 870 875 880

Asn Lys Glu Ile Pro His Glu Ile Asn Glu Phe Val Arg Glu Ile Lys

885 890 895

Leu Gly Lys Ile Leu Lys Tyr Thr Glu Asn Leu Asn Met Phe Tyr Leu

900 905 910

Ile Leu Lys Leu Leu Asn His Lys Glu Leu Thr Asn Leu Lys Gly Ser

915 920 925

Leu Glu Lys Tyr Gln Ser Ala Asn Lys Glu Glu Thr Phe Ser Asp Glu

930 935 940

Leu Glu Leu Ile Asn Leu Leu Asn Leu Asp Asn Asn Arg Val Thr Glu

945 950 955 960

Asp Phe Glu Leu Glu Ala Asn Glu Ile Gly Lys Phe Leu Asp Phe Asn

965 970 975

Glu Asn Lys Ile Lys Asp Arg Lys Glu Leu Lys Lys Phe Asp Thr Asn

980 985 990

Lys Ile Tyr Phe Asp Gly Glu Asn Ile Ile Lys His Arg Ala Phe Tyr

995 1000 1005

Asn Ile Lys Lys Tyr Gly Met Leu Asn Leu Leu Glu Lys Ile Ala Asp

1010 1015 1020

Lys Ala Lys Tyr Lys Ile Ser Leu Lys Glu Leu Lys Glu Tyr Ser Asn

1025 1030 1035 1040

Lys Lys Asn Glu Ile Glu Lys Asn Tyr Thr Met Gln Gln Asn Leu His

1045 1050 1055

Arg Lys Tyr Ala Arg Pro Lys Lys Asp Glu Lys Phe Asn Asp Glu Asp

1060 1065 1070

Tyr Lys Glu Tyr Glu Lys Ala Ile Gly Asn Ile Gln Lys Tyr Thr His

1075 1080 1085

Leu Lys Asn Lys Val Glu Phe Asn Glu Leu Asn Leu Leu Gln Gly Leu

1090 1095 1100

Leu Leu Lys Ile Leu His Arg Leu Val Gly Tyr Thr Ser Ile Trp Glu

1105 1110 1115 1120

Arg Asp Leu Arg Phe Arg Leu Lys Gly Glu Phe Pro Glu Asn His Tyr

1125 1130 1135

Ile Glu Glu Ile Phe Asn Phe Asp Asn Ser Lys Asn Val Lys Tyr Lys

1140 1145 1150

Ser Gly Gln Ile Val Glu Lys Tyr Ile Asn Phe Tyr Lys Glu Leu Tyr

1155 1160 1165

Lys Asp Asn Val Glu Lys Arg Ser Ile Tyr Ser Asp Lys Lys Val Lys

1170 1175 1180

Lys Leu Lys Gln Glu Lys Lys Asp Leu Tyr Ile Arg Asn Tyr Ile Ala

1185 1190 1195 1200

His Phe Asn Tyr Ile Pro His Ala Glu Ile Ser Leu Leu Glu Val Leu

1205 1210 1215

Glu Asn Leu Arg Lys Leu Leu Ser Tyr Asp Arg Lys Leu Lys Asn Ala

1220 1225 1230

Ile Met Lys Ser Ile Val Asp Ile Leu Lys Glu Tyr Gly Phe Val Ala

1235 1240 1245

Thr Phe Lys Ile Gly Ala Asp Lys Lys Ile Glu Ile Gln Thr Leu Glu

1250 1255 1260

Ser Glu Lys Ile Val His Leu Lys Asn Leu Lys Lys Lys Lys Leu Met

1265 1270 1275 1280

Thr Asp Arg Asn Ser Glu Glu Leu Cys Glu Leu Val Lys Val Met Phe

1285 1290 1295

Glu Tyr Lys Ala Leu Glu

1300

Claims (10)

1.一种核酸分子组合物，由引物F、引物R和特异crRNA组成；

引物F为SEQ ID No.2所示的单链DNA分子；

引物R为SEQ ID No.3所示的单链DNA分子；

特异crRNA为SEQ ID No.4所示的单链RNA分子。

2.一种核酸分子组合物，由引物HR-RT、引物F、引物R和特异crRNA组成；

引物HR-RT为SEQ ID No.1所示的单链DNA分子；

引物F为SEQ ID No.2所示的单链DNA分子；

引物R为SEQ ID No.3所示的单链DNA分子；

特异crRNA为SEQ ID No.4所示的单链RNA分子。

3.一种用于检测乙型肝炎病毒的试剂盒，包括权利要求1或2所述的核酸分子组合物。

4.一种用于检测乙型肝炎病毒的试剂盒，包括特异crRNA；特异crRNA为SEQ ID No.4所示的单链RNA分子。

5.如权利要求3或4所述的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒还包括LwCas13a蛋白。

6.如权利要求3或4或5所述的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒还包括T7 RNA聚合酶。

7.如权利要求3所述的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒还包括记载有权利要求8所述方法的载体。

8.一种检测乙型肝炎病毒的方法，包括如下步骤：

(1)提取受试者血液样本的总RNA，采用引物HR-RT进行逆转录，得到cDNA；引物HR-RT为SEQ ID No.1所示的单链DNA分子；

(2)以步骤(1)得到的cDNA为模板，采用引物F和引物R组成的引物对进行PCR扩增；引物F为SEQ ID No.2所示的单链DNA分子；引物R为SEQ ID No.3所示的单链DNA分子；

(3)取步骤(2)的产物溶液，进行基于CRISPR-Cas13a系统的可视化检测；所述CRISPR-Cas13a系统中的crRNA如SEQ ID No.4所示。

9.权利要求1或2所述的核酸分子组合物在检测乙型肝炎病毒中的应用。

10.权利要求3至7中任一所述试剂盒在检测乙型肝炎病毒中的应用。

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