CN108347916A - 一种减少冰晶形成的组合物及其方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了能够在低于0℃的温度下减少或抑制冰晶形成的类肽聚合物。同时提供了包含此类类肽聚合物的类肽‑肽杂合物。本发明提供的类肽聚合物和类肽‑肽杂合物可用于制备冷冻保护液。本发明提供的类肽聚合物，类肽‑肽杂合物及冷冻保护液可用于制备防冻液，冷冻食品和化妆护理产品。本发明还提供了使用本发明所述的组合物来保存组织，器官，细胞或任一种生物大分子的方法。

Description

一种减少冰晶形成的组合物及其方法
相关申请的交叉引用
本申请案主张2015年10月14日申请之美国临时专利申请案第62/241,588号之权利，该案之全文以引用的方式并入本文中
发明背景
冷冻保护剂(CPAs)是一种在温度低于0℃温度溶液中存在时可降低或抑制溶液中的冰晶形成的化合物。目前的冷冻保护剂包括小分子(通常被称为渗透性CPAs)，经人工合成的聚合物和防冻蛋白。
目前基于生存期，生活质量和成本效益方面的考虑，器官移植是最佳的用于末期器官衰竭的治疗方法。不幸的是，器官移植的供需之间存在巨大的差距，并且病人等待过程中不得不长期遭受低生活质量的折磨。器官的明显缺乏主要是由于缺乏可靠稳定的保存方法造成的。实际上，因此超过50％的肺，胰腺和心脏仍然未从死者供体中收集。
为了妥善保存器官，必须用保存液冲洗以除去血液并稳定器官。即使一旦在保存溶液中稳定的器官，再从供体取出后用于器官分配，运输和移植的时间也是非常有限的(大约6-12小时)。极短的移植时效致使大多数器官只能供给当地患者，对于远程患者则无能为力。由于这种短缺，尽管几乎所有国家都出台了禁止买卖自己的器官的法律，但这也导致非法器官交易和人口贩运等犯罪活动的猖獗，牟取暴利，以供应这种高需求器官移植的需要。
目前用于器官保存的渗透性CPA通常包括乙二醇，1,2-丙二醇，二甲基亚砜，甲酰胺，甘油，蔗糖，乳糖和D-甘露醇等。为了减少或抑制器官保存温度下的冰晶生长，所需渗透性CPA有效浓度往往很高(通常需要≥60％)。在如此高的浓度下，这些化合物可能对保存的组织具有毒性，并且在移植前大量移除CPA会往往会导致不可逆转的细胞死亡。
其他的用于减少或抑制冰晶形成的冷冻保护剂包括人工合成聚合物和抗冻蛋白。类似于渗透型的冷冻保护剂，各有其缺点。例如，大分子聚合物不能渗透细胞膜，因此合成聚合物CPA只能控制细胞外冰的形成。而为了有效保存生物样品，必须同时控制细胞内外冰晶的形成。天然存在的抗冻蛋白质，如从鱼类，植物或昆虫中分离出来的抗冻蛋白质，在预防结冰方面非常有效，但现有的抗冻蛋白质分离纯度较低，而且非常昂贵。另外，使用抗冻蛋白保存生物样品引入了潜在的免疫原性。
因此，本领域迫切需要新型无毒化合物来有效地降低或抑制低于0℃和低温温度下的冰晶形成。本案满足了这种需要并且还提供了其他优点。
发明内容
在一些方面，本发明提供的类肽聚合物如图(I)所示：
包括其互变异构体或其立体异构体，
其中：
R1选自下述基团中的任意一种，包括氢，任选取代的C1-18烷基，任选取代的C2-18烯基，任选取代的C2-18炔基，任选取代的C1-18羟烷基，任选取代的烷氧基，任选取代的C1-18烷基氨基，任选取代的C1-18烷硫基，任选取代的羧烷基，C3-10环烷基，杂环烷基，芳基，杂芳基，(C3-10环烷基)烷基，(杂环烷基)烷基，芳烷基和杂芳烷基；
其中R1的至少一个是C1-18羟烷基，和
其中所述环烷基，杂环烷基，芳基和杂芳基基团中的任一个可以任选且独立地被一个或多个R3基团取代；
R2选自下述基团中的任意一种，包括氢，任选取代的C1-18烷基，任选取代的C2-18烯基，任选取代的C2-18炔基，任选取代的C1-18羟烷基，任选取代的C1-18烷基氨基，任选取代的C1-18烷硫基和任选取代的羧烷基；
每个R3独立地选自卤素，氧代基，硫代基，羟基，巯基，氨基，C1-8烷基，C1-8羟烷基，C1-8烷氨基和C1-8烷硫基；
X和Y独立地选自下述含有氢的基团，包括任选取代的C1-8烷氨基，羧基，巯基，羧基，任选取代的C1-8羟烷基；或者
可选的X和Y一起形成共价键；以及
下标n代表聚合物中单体数目的在2和50之间；
条件是当n在3和7之间时，R1的所有情况都不是乙基羟基。
在一些实施方案中，类肽聚合物中的R1的每个实例选自如下基团，包括：
其中：
m在1和8之间；以及
R3选自含有H的基团，C1-8烷基，羟基，巯基，硝基，氨，氧代基和硫代基。
在一些实施方案中，类肽聚合物中的R1的每个实例选自如下基团，包括：
在一些实施方案中，类肽聚合物中的R1的每个实例都是C1-18羟烷基。在一些实施方案中，每个R1的实例是C1-6羟烷基。在一些实施方案中，R1的每个实例是相同的C1-6羟烷基。在一些实施例中，R1的每个实例是：
在一些实施例中，R2的每个实例是H。
在一些实施方案中，类肽聚合物的序列长度n在3和25之间。在一些实施方案中，类肽聚合物的序列长度n在5和25之间。在一些实施方案中，类肽的序列长度聚合物n在8和50之间。在一些实施方案中，类肽聚合物的序列长度n在8和20之间。
在一些实施方案中，X和Y是H，任选取代的C1-8烷氨基，羧基，巯基，羧基，任选取代的C1-8羟基烷基，任选取代的C1-8烷氨基，任选取代的C2-8烷硫基，或卤素。
在一些实施方案中，类肽聚合物的X和Y一起形成共价键。
在一些实施方案中，类肽聚合物的序列长度n为10，并且类肽聚合物包含：3个Nhp单体和7个Nsb单体，4个Nhp单体和6个Nsb单体，5个Nhp单体和5个Nsb单体，6个Nhp单体和4个Nsb单体，7个Nhp单体和3个Nsb单体，8个Nhp单体和2个Nsb单体或10个Nhp单体。
在一些实施方案中，类肽聚合物具有序列Nhp-Nhp-Nhp-Nhp-Nhp-Nhp-Nhp-Nhp-Nhp-Nhp(SEQ ID NO：2)，并且X是H或C1-8酰基，并且Y是羟基或氨基或C1-8烷基。在一些实施方案中，类肽聚合物具有序列Nsb-Nsb-Nhp-Nsb-Nsb-Nhp-Nsb-Nsb-Nhp-Nsb(SEQ ID NO：1)，并且X是H或C1-8酰基并且Y是羟基或氨基或C1-8烷基。在一些实施方案中，类肽聚合物具有序列Nsb-Nhp-Nhp-Nhp-Nsb-Nhp-Nhp-Nhp-Nsb-Nhp(SEQ ID NO：7)，并且X是H或C1-8酰基，并且Y是羟基或氨基或C1-8烷基。在一些实施方案中，类肽聚合物具有序列Nsb-Nsb-Nhp-Nhp-Nsb-Nsb-Nhp-Nhp-Nsb-Nsb(SEQ ID NO：8)，并且X是H或C1-8酰基并且Y是羟基或氨基或C1-8烷基。在一些实施方案中，类肽聚合物具有序列Nsb-Nhp-Nhp-Nhp-Nhp-Nhp-Nsb-Nhp-Nhp-Nhp(SEQ ID NO：9)，并且X是H或C1-8酰基并且Y是羟基或氨基或C1-8烷基。
在一些实施方案中，类肽聚合物的序列长度n为10，并且类肽聚合物包含：3个Nhp单体和7个Nme单体，4个Nhp单体和6个Nme单体，5个Nhp单体和5个Nme单体，6个Nhp单体和4个Nme单体，7个Nhp单体和3个Nme单体，或8个Nhp单体和2个Nme单体。
在一些实施方案中，类肽聚合物的序列长度n为10，并且类肽聚合物包含：5个Nhe单体和5个Nsb单体或5个Nhp单体和5个Nbu单体。
在一些实施方案中，类肽聚合物的序列长度n为10，并且类肽聚合物包含：4个Nhp单体和6个Nib单体，4个Nhp单体和6个Nbu单体，4个Nhp单体和6个Npr单体或4个Nhp单体和6Nip单体。
在一些实施方案中，类肽聚合物的序列长度n为14，并且类肽聚合物包含：6个Nhp单体和8个Nsb单体，7个Nhp单体和7个Nsb单体，8个Nhp单体和6个Nsb单体，10个Nhp单体和4个Nsb单体或14个Nhp单体。
在一些实施方案中，类肽聚合物的序列长度n为14，并且类肽聚合物包含：6个Nhp单体和8个Nib单体，7个Nhp单体和7个Nib单体，8个Nhp单体和6个Nib单体，10个Nhp单体和4个Nib单体，或14个Nhp单体。
在一些实施方案中，类肽聚合物的序列长度n为16，并且类肽聚合物包含：5个Nhp单体和11个Nsb单体，7个Nhp单体和9个Nsb单体，8个Nhp单体和8个Nsb单体，10个Nhp单体和6个Nsb单体，12个Nhp单体和4个Nsb单体或16个Nhp单体。
在一些实施方案中，类肽聚合物的序列长度n为22，并且类肽聚合物包含：7个Nhp单体和15个Nsb单体，10个Nhp单体和12个Nsb单体，11个Nhp单体和11个Nsb单体，14个Nhp单体和8个Nsb单体，17个Nhp单体和5个Nsb单体或22个Nhp单体。
在一些实施方案中，聚合物选自表2，表3，表4，表5，表6，表7，表8或表9中列出的聚合物。
在一些实施方案中，本发明所述的类肽聚合物形成螺旋结构。
在一些实施方案中，类肽聚合物在约0℃至约-20℃的温度下削减或抑制冰晶形成。在其他实施方案中，类肽聚合物在约-20℃至约-40℃的温度下削减或抑制冰晶形成。在一些实施方案中，类肽聚合物在约-20℃下削减或抑制冰晶形成。在其他实施方案中，类肽聚合物在约-40℃至约-200℃(例如-196℃)的温度下削减或抑制冰晶形成。在某些实施方案中，类肽聚合物(例如，存在于组合物，制剂或产品如冷冻保护液，防冻溶液，冷冻食品或化妆品护理产品中)的浓度在约100nM至约100mM之间。在特定的实施方案中，类肽聚合物的浓度在约1和10mM之间(例如约1,2,3,4,5,6,7,8,9或10mM)。
另一方面，本发明提供了包含所述类肽聚合物和一个或多个氨基酸组成的类肽-肽杂合物，其中所述一个或多个氨基酸位于类肽聚合物的一端或两端和/或一个或多个类肽单体之间。在一些实施方案中，所述一种或多种氨基酸选自丙氨酸，半胱氨酸，天冬氨酸，谷氨酸，苯丙氨酸，甘氨酸，组氨酸，异亮氨酸，精氨酸，赖氨酸，亮氨酸，甲硫氨酸，天冬酰胺，脯氨酸，谷氨酰胺，丝氨酸，苏氨酸，缬氨酸，色氨酸，酪氨酸及其组合。在特定的实施方案中，所述一种或多种氨基酸选自异亮氨酸，亮氨酸，丝氨酸，苏氨酸，丙氨酸，缬氨酸，精氨酸及其组合。
另一方面，本发明提供包含所述类肽聚合物，类肽-肽杂合物或其组合的冷冻保护液。在一些实施方案中，所述冷冻保护液还包含选自离子，渗透性冷冻保护剂，非渗透性冷冻保护剂，抗氧化剂，细胞膜稳定化合物，水通道蛋白或其他可形成跨膜通道的化合物，醇，糖及其衍生物，非离子表面活性剂，蛋白质，二甲基亚砜(DMSO)，聚乙二醇(PEG)，聚乙烯吡咯烷酮，聚乙烯醇，透明质酸，甲酰胺，天然或合成水凝胶及其组合。
在一些情况下，所述冷冻保护液还包含选自丙二醇，乙二醇，甘油，甲醇，丁二醇，阿杜醇，乙醇，1,3-丙二醇，二甘醇，聚环氧乙烷，赤藓糖醇，山梨醇，木糖醇，聚丙烯醇，2-甲基-2,4-戊二醇(MPD)，甘露醇，肌醇，二硫醇，1,2-丙二醇及其组合。
在一些情况下，所述冷冻保护液还包含选自由单糖，二糖，多糖及其组合组成的糖。在一些情况下，糖是选自葡萄糖，半乳糖，阿拉伯糖，果糖，木糖，甘露糖，3-O-甲基-D-吡喃葡萄糖及其组合的单糖。在其他情况下，糖是选自蔗糖，海藻糖，乳糖，麦芽糖及其组合的二糖。在其他情况下，糖是选自棉子糖，葡聚糖及其组合的多糖。
在其他情况下，所述冷冻保护液还包含平均分子量小于约1,000g/mol的PEG。在特定情况下，PEG具有约200至400g/mol的平均分子量。
在一些情况下，所述冷冻保护液还包含选自由牛血清白蛋白，人血清白蛋白，明胶及其组合组成的蛋白质。在其他情况下，所述冷冻保护液还包含天然或合成水凝胶，包括壳聚糖，透明质酸或其组合。在其他情况下，所述冷冻保护液还包含选自聚氧乙烯月桂基醚，聚山梨酯80及其组合的非离子表面活性剂。
另一方面，本发明提供了用于保存组织，器官或细胞的方法。该方法包括使组织，器官或细胞与所述类肽聚合物，类肽-肽杂合物，冷冻保护液或其组合相互接触。在一些实施方案中，组织是生物工程组织。在一些实施方案中，组织，器官或细胞选自心脏，肝，肺，肾，胰腺，肠，胸腺，角膜，神经细胞，血小板，精细胞，卵细胞，胚胎细胞，干细胞(例如人多能干细胞，造血干细胞)，淋巴细胞，粒细胞，免疫系统细胞，骨细胞，类器官及其组合。
在一些实施方案中，类肽聚合物，类肽-肽杂合物，冷冻保护液或其组合的含量在约0℃至-20℃的温度下足以削减或抑制冰晶形成。在其他实施方案中，类肽聚合物，类肽-肽杂合物，冷冻保护液或其组合的含量在约-20℃至-40℃的温度下足以削减或抑制冰晶形成。在一些实施方案中，类肽聚合物，类肽-肽杂合物，冷冻保护液或其组合的含量在约-20℃的温度下足以减少或抑制冰晶形成。在其他实施方案中，类肽聚合物，类肽-肽杂合物，冷冻保护液或其组合的含量在约-40℃至-200℃的温度下足以减少或抑制冰晶形成(例如，-196℃)。在某些实施方案中，冷冻保护液中类肽聚合物和/或类肽-肽杂交化合物的浓度在约100nM和约100mM之间。在特定的实施方案中，冷冻保护液中类肽聚合物和/或类肽-肽杂合物的浓度在约1和10mM之间(例如，约1,2,3,4,5,6,7,8,9或10mM)。
在又一方面，本发明提供了一种用于保存生物大分子的方法。该方法包括使生物大分子与所述的类肽聚合物，类肽-肽杂合物，冷冻保护液或其组合接触。在一些实施方案中，生物大分子选自由核酸，氨基酸，蛋白质，分离的蛋白质，肽，脂质，复合物结构及其它们的组合。
另一方面，本发明提供了包含所述类肽聚合物，类肽-肽杂合物，冷冻保护液或其组合的成分的化妆品及皮肤护理产品。
另一方面，本发明提供了一种防冻产品，例如包含本发明所述类肽聚合物，类肽-肽杂合物，冷冻保护液或其组合的除冰或抑冰产品。在一些实施方案中，防冻产品用于防止，抑制或延迟冰在物体上的形成，这些物体包括但不限于飞机或其零件，气体管道，窗户，电气设备，无人机，电缆(例如电力线)，机械设备(例如，汽车发动机，齿轮系统，制动系统等)等。
又一方面，本发明提供了包含本发明所述类肽聚合物，类肽-肽杂合物，冷冻保护液或其组合成分的冷冻食品的相关产品。在一些实施方案中，冷冻食品选自冰淇淋，酸奶，海鲜，水果和肉制品。
从下面的详细描述和附图中，本发明的其他用途，特征和优点对于本领域技术人员将是显而易见的。
附图的简要说明
图1说明了使用“亚单体”方法合成类肽低聚物的一般合成方案。
图2A和2B显示了在-20℃下进行的毛细管冷冻测定的结果。图2A展示了化合物1(1当量)和10(1当量)溶解在MilliQ超纯水中在零下温度结晶情况。与单独用水和乙二醇(EG)(18当量)的溶液作为对照组的测定结果进行了比较。图2B显示了图2A中均值归一化测定结果。
图3A-3D显示X射线衍射(XRD)晶体学数据。图3A显示含有5mM化合物12和17.5％(v/v)乙二醇(EG)的溶液的XRD数据。图3B显示了含有30％(v/v)EG的溶液的XRD数据。图3C显示了含有17.5％(v/v)EG的溶液的XRD数据。3D显示了溶液含有EG，化合物2(标记为“B”；SEQ ID NO：10)，化合物12(标记为“D”；SEQ ID NO：8)和/或化合物8(标记为“E”；SEQ IDNO：9)情况下的冰衍射环评分结果。对于每种不同溶液进行了两次独立实验。
图4A-4G显示含有5mg/mL化合物10，化合物12，化合物8，化合物13，化合物11和化合物58的溶液的X射线衍射(XRD)晶体学数据与乙二醇(EG)对比照。每种溶液含有300mMNaCl，100mM HEPES，15％(v/v)乙二醇，pH＝7.2。图4A：化合物10XRD晶体学图(左)和光谱图(右)。图4B：化合物12XRD晶像图(左)和谱图(右)。图4C：化合物8XRD晶像图(左)和谱图(右)。图4D：化合物13XRD晶像图(左)和谱图(右)。图4E：化合物11XRD晶像图(左)和谱图(右)。图4F：化合物58XRD(左)晶像图和谱图(右)。图4G：EG控制XRD晶像图(左)和谱图(右)。对于XRD谱图，以强度对角度(2θ度)的函数进行绘制。
图5A-5G显示含有1mg/mL化合物10，化合物12，化合物8，化合物13，化合物11和化合物58的溶液的X-射线衍射(XRD)晶体学数据与乙二醇(EG)对比照。每种溶液还含有300mMNaCl，100mM HEPES，17.5％(v/v)乙二醇，pH＝7.2。图5A：化合物10XRD晶像图(左)和谱图(右)。图5B：化合物12XRD晶像图(左)和谱图(右)。图5C：化合物8XRD晶像图(左)和谱图(右)。图5D：化合物13XRD晶像图(左)和谱图(右)。图5E：化合物11XRD晶像图(左)和谱图(右)。图5F：化合物58XRD晶像图(左)和谱图(右)。图5G：EG对照组XRD晶像图(左)和谱图(右)。对于XRD谱图，以强度对角度(2θ度)的函数进行绘制。
图6A-6C显示了两种溶液在快速降温至液氮温度，加热复温至37℃，并随后重新冷冻的结晶状态比较。对照溶液含有22.5％(v/v)乙二醇(EG)，而测试溶液含有22.5％EG和5mg/mL(0.5％(w/v))化合物12。图6A显示在液氮中快速冷冻期间，含有化合物12的溶液呈现玻璃态(非结晶固体)而对照溶液完全结冰。图6B显示在37℃复温期间，含有化合物12的溶液呈现非冻结状态(在两秒钟内)而对照保持冷冻状态。图6C显示在-20℃冰箱中放置12小时(过夜)后，与对照组不同，化合物12溶液保持非冻结状态。
图7显示了在向细胞培养基中加入化合物12(正方形)或DMSO(圆形)的HEK293细胞细胞毒性结果。对照实验为未添加化合物12或DMSO的样品(“培养基”(三角形)。进行连续稀释以测试不同浓度的化合物12和DMSO的毒性。
图8显示了在HEK293细胞上进行的冷冻保存测定的结果，并将含有乙二醇(EG)的溶液与含有EG和化合物12的溶液进行了比较。在解冻后12小时测量细胞存活率。
图9显示了在HEK293细胞上进行的冷冻保存测定的结果，并将含有5mg/mL化合物12以及二醇，二糖和一般缓冲液的混合物溶液与含有VS2E或M22的溶液进行了比较。在解冻后16小时测量细胞存活率。细胞溶液用液氮(LN2)玻璃化。
发明详述
I.简介
低温下冷冻保存细胞和组织对于许多生物产品和应用都是至关重要的，然而在冷冻保存后成功完全恢复这些具有重要治疗价值的细胞，组织和器官仍然是个难题。冷冻保存过程中通常需要使用冷冻保护剂(CPAs)，这些冷冻保护剂是重要的化学添加剂，如二甲基亚砜(DMSO)，牛血清白蛋白(BSA)等。CPAs通过防止冰晶成核和抑制其生长来改善冷冻保存的生物系统在解冻后的生存活力。但是，这些物质在其有效浓度下往往表现出不同程度的细胞毒性，因此极大地限制了冷冻保存，生物银行和高级再生医学应用方面的冷冻复苏成功率。由于缺乏有效且安全的新型冷冻保护液，这些毒性大的冷冻保护液仍然被广泛应用。除了生物产品和应用之外，防止结冰仍然也是各种行业和技术部门面临的重要问题。
本发明部分基于N-取代的仿生氨基酸聚合物(类肽)和类肽-肽杂合物具有冰结晶抑制性质的令人惊讶的发现。本发明提供了一种能够减少或抑制低于0℃和低温温度下的冰晶形成的聚合物。这些聚合物可用于制造冷冻保护液。本文还提供了使用包含所述类肽聚合物的冷冻保护液来保存组织，器官或细胞的方法。另外，本发明还提供了所述类肽聚合物在美容护理，除冰和具有防冻性能的冷冻食品方面的应用。在阅读详细描述之后，本领域的普通技术人员将认识到从发明得到的其他方面的优点。
II.缩略语和定义
除非另外定义，本发明使用的缩写是常规的。使用以下缩写来表示类肽聚合物的单体单元：Nsb(2-(仲丁基氨基)乙酸)，Nib(2-(异丁基氨基)乙酸)，Nbu(2-丁基氨基)乙酸)，(2-丙基氨基)乙酸，Nip(2-(异丙基氨基)乙酸)，Nme(2-(甲基氨基)乙酸)，Nhp(2-((2-羟丙基)氨基)乙酸)，Nhe(2-((1-羟基乙基)氨基)乙酸)，Ndp(2-((2,3-二羟基丙基)氨基)乙酸，Nyp(2-((1-羟基丙-2-基)氨基)，Nep(2-((1-(4-羟基苯基)乙基)氨基)乙酸，Ndh(2-((1,3-二羟基丙-2-基)氨基)乙酸和Nop(2-(N，N'-二甲基甲酰胺)，DIEA(二异丙基乙胺，DIC(N，N'-二甲基乙酰胺)ACN(乙腈)，DCM(二氯甲烷)，HFIP(六氟异丙醇)；Fmoc(9-芴基甲氧基羰基)。
“一个“，“这个”在此不仅仅指单个代表(单数名词)，同时包含符合此条件的多个代表(复数名词)。
“约”在此定义为在后面数词的范围附近的值。如果“X”是一个数值，那么“约X”表示从0.9X到1.1X，更适用从0.95X到1.05X。所以，在此，“约X”表示至少如下特定值X,0.95X,0.96X,0.97X,0.98X,0.99X,1.01X,1.02X,1.03X,1.04X,和1.05X.所以“约X”在此特用以省略表达专利权利要求中系列值，例如“0.98X”。
“烷基”是指具有指定碳原子数的直链或支链饱和脂肪族基团。烷基可以包括任意数量的碳，比如C1-2,C1-3,C1-4,C1-5,C1-6,C1-7,C1-8,C1-9,C1-10,C2-3,C2-4,C2-5,C2-6,C3-4,C3-5,C3-6,C4-5,C4-6和C5-6。例如，C 1-6烷基包括但不限于甲基，乙基，丙基，异丙基，丁基，异丁基，仲丁基，叔丁基，戊基，异戊基，己基等。烷基还可以指具有至多30个碳原子的烷基，例如但不限于庚基，辛基，壬基，癸基等。烷基可以是取代的或未取代的。烷基可以任选地被一个或多个选自卤素，羟基，氨基，巯基，烷基氨基，烷氧基，卤代烷基，羧基，酰氨基，硝基，氧代基，硫代基和氰基的取代。
“烯基”是指具有至少2个碳原子和至少一个双键的直链或支链烃。烯基可以包括任何数量的碳，例如C2,C2-3,C2-4,C2-5,C2-6,C2-7,C2-8,C2-9,C2-10,C3,C3-4,C3-5,C3-6,C4,C4-5,C4-6,C5,C5-6,和C6，但不限于1,2,3,4,5或更多的碳。烯基的实例包括但不限于乙烯基(乙烯基)，丙烯基，异丙烯基，1-丁烯基，2-丁烯基，异戊烯基，丁二烯基，1-戊烯基，2-戊烯基，异戊烯基，1,3-戊二烯基，1,4-戊二烯基，1己烯基，己烯基，3-己烯基，1,3-己二烯基，1,4-己二烯基，1,5-己二烯基，2,4-己二烯基或1,3-，5-己三烯基。烯基可以是取代烯基或未被取代烯基。链烯基可以任意地被一个或多个选自卤素，羟基，氨基，巯基，烷氨基，烷氧基，卤代烷基，羧基，酰氨基，硝基，氧代，硫代和氰基的基团取代。
“炔基”是指具有至少2个碳原子和至少一个三键的直链或支链烃。炔基可以包括任何数量的碳，例如C2,C2-3,C2-4,C2-5,C2-6,C2-7,C2-8,C2-9,C2-10,C3,C3-4,C3-5,C3-6,C4,C4-5,C4-6,C5,C5-6,和C6。炔基的实例包括但不限于乙炔基，丙炔基，丁炔基，丁炔基，异丁炔基，仲丁炔基，丁二炔基，1-戊炔基，2-戊炔基，异戊炔基，1,3-戊二炔基，1,4-戊二炔基，2己炔基，3己炔基，1,3己二炔基，1,4己二炔基，1,5-己二炔基，2,4己二炔基或1,3,5-己三炔基。炔基可以被取代或未被取代。炔基可以任选地被一个或多个选自卤素，羟基，氨基，巯基，烷氨基，烷氧基，卤代烷基，羧基，酰氨基，硝基，氧代基，硫代基和氰基的基团取代。
“亚烷基”是指具有指定碳原子数并且连接至少两个其他基团的直链或支链饱和脂肪族基团，即二价烃基的烷基。与亚烷基连接的两个基团可以与亚烷基的同一个原子或者不同的原子连接。例如，直链亚烷基可以是二价-(CH2)n-基团，其中n是任何适合数目的碳原子个数。代表性的亚烷基包括但不限于亚甲基，亚乙基，亚丙基，异亚丙基，亚丁基，异亚丁基，仲亚丁基，亚戊基和亚己基。亚烷基可以被取代或未被取代。亚烷基可以任选地被一个或多个选自卤素，羟基，氨基，巯基，烷氨基，烷氧基，卤代烷基，羧基，酰氨基，硝基，氧代基，硫代基和氰基的基团取代。
“亚烯基”是连接至少连接两个其它基团的如上所定义的链烯基，即二价烃基的烯基。连接至亚烯基的两个部分可以连接至亚烯基的相同原子或不同原子。亚烯基包括但不限于亚乙烯基，亚丙烯基，异亚丙烯基，亚丁烯基，亚异丁烯基，仲亚丁烯基，亚戊烯基和亚己烯基。烯基可以被取代或未被取代。亚烯基可以任选地被一个或多个选自卤素，羟基，氨基，巯基，烷氨基，烷氧基，卤代烷基，羧基，酰氨基，硝基，氧代基，硫代基和氰基的基团取代。
“亚炔基”是连接至少两个其它基团的如上定义的炔基，即二价烃基的炔基。连接至亚炔基的两个部分可以连接至亚炔基的相同原子或不同原子。亚炔基包括但不限于亚乙炔基，亚丙炔基，异亚丙基，亚丁炔基，仲丁炔基，亚戊炔基和亚己炔基。亚炔基可以被取代或未被取代。亚炔基可以任选地被一个或多个选自卤素，羟基，氨基，巯基，烷基氨基，烷氧基，卤代烷基，羧基，酰氨基，硝基，氧代基，硫代基和氰基的基团取代。
“卤素”是指氟，氯，溴和碘。
“胺”或“氨基”是指-N(R)2基团，其中R基团可以是氢，烷基，烯基，炔基，环烷基，杂环烷基，芳基或杂芳基等的。R基团可以相同或不同。氨基可以是伯(每个R基团都是氢)，仲(一个R基团是氢)或叔(每个R基团都不是氢)。烷基，烯基，炔基，环烷基，杂环烷基，芳基或杂芳基可以任选地被一个或多个选自卤素，羟基，氨基，巯基，烷氨基，烷氧基，卤代烷基，羧基，酰氨基，硝基，氧代基，硫代基和氰基的基团取代。
“羟基”是指-OH基团。羟基可以连在任何合适的碳原子上。
“巯基”是指-SH基团。巯基可以连在任何合适的碳原子上。
“氧代基”是指双键O基团(＝O，-C(O)-)。氧代基团可以连在任何合适的碳原子上。
“硫代基”是指双键S基团(＝S)。硫代基团可以连在任何合适的碳原子上。
“硝基”是指–NO2基团。硝基可以在任何合适的碳原子上。
“羧基”是指如式-C(O)OH or-CO2H的羧酸基团。
“环烷基”是指含有3至12个环原子或指定原子数目的饱和或部分不饱和的单环，稠合二环或桥接多环集合基团。环烷基可以包括任何数量的碳，如C3-6,C4-6,C5-6,C3-8,C4-8,C5-8,C6-8,C3-9,C3-10,C3-11,和C3-12，例如环丙基，环丁基，环戊基，环己基和环辛基。饱和的二环和多环环烷基环包括，例如降冰片，[2.2.2]二环辛烷，十氢化萘和金刚烷。环烷基也可以是部分不饱和的，在环中具有一个或多个双键或三键。部分不饱和的代表性环烷基包括但不限于环丁烯，环戊烯，环己烯，环己二烯(1,3-和1,4-异构体)，环庚烯，环庚二烯，环辛烯，环辛二烯(1,3-，4-和1,5-异构体)，降冰片烯和降冰片二烯。当环烷基为饱和的单环环烷基时，示例性的基团包括但不限于环丙基，环丁基，环戊基，环己基，环庚基和环辛基。当环烷基为饱和的单环C3-6环烷基时，示例性的基团包括但不限于环丙基，环丁基，环戊基和环己基。环烷基可以被取代或未被取代。环烷基可以任选地被一个或多个选自烷基，烯基，炔基，卤素，羟基，氨基，烷基氨基，烷氧基，卤代烷基，羧基，酰氨基，巯基，硝基，氧代基，硫代基和氰基的基团取代。例如，环烷基可以被C1-6烷基或氧代(＝O)等取代。
“杂环烷基”是指具有3至12个环成员和1至4个N，O和S杂原子的饱和环系统。也可以有另外的杂原子，包括但不限于B，Al，Si和P。该杂原子也可以被氧化，例如但不限于-S(O)-和-S(O)2-。杂环烷基可以包括任何数量的环原子，例如3至6,4至6,5至6,3至8,4至8,5至8,6至8,3至9,3至10,3到11个，或3到12个环成员。杂环烷基中可包括任何合适数目的杂原子，例如1,2,3或4，或1至2,1至3,1至4,2至3,2至4或3至4。杂环烷基可以包括诸如氮丙啶，氮杂环丁烷，吡咯烷，哌啶，氮杂环庚烷，偶氮烷，奎宁环，吡唑烷，咪唑烷，哌嗪(1,2-，1,3-和1,4-异构体)，环氧乙烷，氧杂环丁烷，四氢呋喃(四氢吡喃)，氧杂环庚烷，硫杂环戊烷，硫杂环丁烷，硫杂环戊烷(四氢噻吩)，噻烷(四氢噻喃)，恶唑烷，异恶唑烷，噻唑烷，异噻唑烷，二氧戊环，二硫戊环，吗啉，硫代吗啉，二恶烷或二噻烷。杂环烷基还可以与芳族或非芳族环系统稠合以形成包括但不限于二氢吲哚的成员。杂环烷基可以未被取代或被取代。杂环烷基可以任选地被一个或多个选自烷基，烯基，炔基，卤素，羟基，氨基，巯基，烷基氨基，烷氧基，卤代烷基，羧基，酰氨基，硝基，氧代，硫代和氰基的基团取代。例如，杂环烷基可以被C1-6烷基或氧代(＝O)等取代。
杂环烷基可以通过环上的任何位置连接。例如，氮丙啶可以是1-或2-氮丙啶，氮杂环丁烷可以是1-或2-氮杂环丁烷，吡咯烷可以是1-，2-或3-吡咯烷，哌啶可以是1-，2-，3-或4-哌啶，吡唑烷可以是1-，2-，3-或4-吡唑烷，咪唑烷可以是1-，2-，3-或4-咪唑烷，哌嗪可以是1-，2-，3-或4-哌嗪，四氢呋喃可以是1-或2-四氢呋喃，恶唑烷可以是2-，3-，4-或5-恶唑烷，异恶唑烷可以是2-，3-，4-或5-异恶唑烷，噻唑烷可以是2-，3-，4-或5-噻唑烷，异噻唑烷可以是2-，3-，4-或5-异噻唑烷，吗啉可以是2-，3-或4-吗啉。
杂环烷基可以包括3-8个环成员和1-3个杂原子，代表性成员包括但不限于吡咯烷，哌啶，四氢呋喃，恶烷，四氢噻吩，噻烷，吡唑烷，咪唑烷，哌嗪，恶唑烷，异恶唑烷，噻唑烷，异噻唑烷，吗啉，硫代吗啉，二恶烷和二噻烷。杂环烷基还可以形成具有5至6个环成员和1至2个杂原子的环，代表性成员包括但不限于吡咯烷，哌啶，四氢呋喃，四氢噻吩，吡唑烷，咪唑烷，哌嗪，恶唑烷，异恶唑烷，噻唑烷，异噻唑烷，和吗啉。
“芳基”是指具有任何合适数量的环原子和任何合适数量的环的芳族环系。芳基可以包括任何合适数量的环原子，例如6,7,8,9,10,11,12,13,14,15或16个环原子，以及6至10,6至12，或6至14个环成员。芳基可以是单环的，稠合形成双环或三环基团，或通过键连接形成联芳基。代表性的芳基包括苯基，萘基和联苯基。其他芳基包括具有亚甲基连接基团的苄基。一些芳基具有6至12个环成员，例如苯基，萘基或联苯。其他芳基具有6至10个环成员，例如苯基或萘基。一些其他芳基具有6个环成员，例如苯基。芳基可以被取代或未被取代。芳基可以任选地被一个或多个选自烷基，烯基，炔基，卤素，羟基，氨基，巯基，烷氨基，烷氧基，卤代烷基，羧基，酰氨基，硝基，氧代基，硫代基和氰基的基团取代。
“杂芳基”是指含有5至16个环原子的单环，稠合双环或三环芳族环集合，其中1至5个环原子是杂原子如N，O或S，也可以是另外的杂原子，包括但不限于，B，Al，Si和P。杂原子也可以被氧化，例如但不限于S(O)和S(O)2。杂芳基可以包括任何数量的环原子，例如3至6,4至6,5至6,3至8,4至8,5至8,6至8,3至9,3至10,3到11个，或3到12个环成员。杂芳基中可以包括任何合适数目的杂原子，例如1,2,3,4或5，或1至2,1至3,1至4,1至5,2至3,2至4，2至5,3至4或3至5。杂芳基可以具有5至8个环成员和1至4个杂原子，或5至8个环成员和1至3个杂原子，或5至6个环成员和1至4个杂原子，或5至6个环成员和1至3个杂原子。杂芳基可以包括诸如吡咯，吡啶，咪唑，吡唑，三唑，四唑，吡嗪，嘧啶，哒嗪，三嗪(1,2,3-，1,2,4-和1,3,5-异构体)，噻吩，呋喃，噻唑，异噻唑，恶唑和异恶唑。杂芳基还可以稠合至芳环体系，例如苯环以形成包括但不限于苯并吡咯如吲哚和异吲哚，苯并吡啶如喹啉和异喹啉，苯并吡嗪(喹喔啉)，苯并嘧啶(喹唑啉)，苯并哒嗪如酞嗪和噌啉，苯并噻吩和苯并呋喃。其他杂芳基包括通过键连接的杂芳基环，例如联吡啶。杂芳基可以被取代或未被取代。杂芳基可以任选地被一个或多个选自烷基，烯基，炔基，卤素，羟基，氨基，巯基，烷氨基，烷氧基，卤代烷基，羧基，酰氨基，硝基，氧代基，硫代基和氰基的基团取代。
杂芳基可以通过环上的任何位置连接。例如，吡咯包括1-，2-和3-吡咯，吡啶包括2-，3-和4-吡啶，咪唑包括1-，2-，4-和5-咪唑，吡唑包括1-，3-，4-和5-吡唑，三唑包括1-，4-和5-三唑，四唑包括1-和5-四唑，嘧啶包括2-，4-，5-和6-嘧啶，哒嗪包括3-和4-三唑，哒嗪，1,2,3-三嗪包括4-和5-三嗪，1,2,4-三嗪包括3-，5-和6-三嗪，1,3,5-三嗪包括2-三嗪，噻吩包括2-和3-噻吩，呋喃包括2-和3-呋喃，噻唑包括2-，4-和5-噻唑，异噻唑包括3-，4-和5-异噻唑，恶唑包括2-，4-和5-恶唑异唑包括3-，4-和5-异恶唑，吲哚包括1-，2-和3-吲哚，异吲哚包括1-和2-异吲哚，喹啉包括2-，3-和4-喹啉，异喹啉包括1-，3-和4-异喹啉，喹唑啉包括2-和4-喹唑啉，噌啉包括3-和4-噌啉，苯并噻吩包括2-和3-苯并噻吩，苯并呋喃包括2-和3-苯并呋喃。
一些杂芳基包括具有5至10个环成员和1至3个包括N，O或S的环原子的那些基团，例如吡咯，吡啶，咪唑，吡唑，三唑，吡嗪，嘧啶，哒嗪，三嗪噻吩，呋喃，噻唑，异噻唑，恶唑，异恶唑，吲哚，异吲哚，喹啉，异喹啉，喹喔啉，喹唑啉，酞嗪，噌啉，苯并噻吩和苯并呋喃。其它杂芳基包括具有5-8个环成员和1-3个杂原子的那些，例如吡咯，吡啶，咪唑，吡唑，三唑，吡嗪，嘧啶，哒嗪，三嗪(1,2,3-，4-和1,3,5-异构体)，噻吩，呋喃，噻唑，异噻唑，恶唑和异恶唑。一些其他杂芳基包括具有9至12个环成员和1至3个杂原子的那些，例如吲哚，异吲哚，喹啉，异喹啉，喹喔啉，喹唑啉，酞嗪，噌啉，苯并噻吩，苯并呋喃和联吡啶。其他杂芳基包括具有5至6个环成员和1至2个包括N，O或S的环原子的那些，例如吡咯，吡啶，咪唑，吡唑，吡嗪，嘧啶，哒嗪，噻吩，呋喃，噻唑，异噻唑，恶唑和异恶唑。
“(环烷基)烷基”是指具有烷基组分和环烷基组分的基团，其中环烷基连到烷基上形成的基团。烷基组分如上所定义，除了至少是二价的亚烷基的烷基组分连接至环烷基组分和连接点上。烷基组分可以包括任意数量的碳，例如C1-6,C1-2,C1-3,C1-4,C1-5,C2-3,C2-4,C2-5,C2-6,C3-4,C3-5,C3-6,C4-5,C4-6和C5-6。环烷基组分如上所定义。示例性(环烷基)烷基包括但不限于甲基-环丙基，甲基-环丁基，甲基-环戊基和甲基-环己基。
“(杂环烷基)烷基”是指具有烷基组分和杂环烷基组分的基团，其中烷基组分将杂环烷基组分连接到连接点上。烷基组分如上所定义，除了烷基组分至少是二价的亚烷基以连接杂环烷基组分和连接点。烷基组分可以包括任何数量的碳，例如C0-6,C1-2,C1-3,C1-4,C1-5,C1-6,C2-3,C2-4,C2-5,C2-6,C3-4,C3-5,C3-6,C4-5,C4-6和C5-6。杂环烷基组分如上所定义。(杂环烷基)烷基可以被取代或未被取代。
“芳烷基”是指具有烷基组分和芳基组分的基团，其中烷基组分将芳基组分连接到连接点上。烷基组分如上所定义，除了烷基组分至少是二价的亚烷基同时连到芳基和连接点上。烷基组分可以包括任何数量的碳，例如C0-6,C1-2,C1-3,C1-4,C1-5,C1-6,C2-3,C2-4,C2-5,C2-6,C3-4,C3-5,C3-6,C4-5,C4-6和C5-6。芳基组分如上所定义。芳烷基的实例包括但不限于苄基和乙基-苯。芳基烷基可以被取代或未被取代。
“杂芳烷基”是指具有烷基组分和杂芳基组分的基团，其中烷基组分将杂芳基组分连接到连接点。烷基组分如上所定义，除了烷基组分是至少二价的亚烷基以连接杂芳基组分和连接点。烷基组分可以包括任何数量的碳，例如C0-6,C1-2,C1-3,C1-4,C1-5,C1-6,C2-3,C2-4,C2-5,C2-6,C3-4,C3-5,C3-6,C4-5,C4-6和C5-6.杂芳基组分如上所定义。杂芳烷基可以被取代或未被取代。
“羧烷基”是指与烷基连接的羧基，如上所述，并且通常具有式–C1-8alkyl-C(O)OH的形式。烷基可以是任何合适的烷基链。羧基烷基可以任选地被一个或多个选自卤素，羟基，氨基，巯基，烷氨基，烷氧基，卤代烷基，羧基，酰氨基，硝基，氧代基，硫代基和氰基基团取代。
“酰基”是指在连接点处含有氧代取代的碳的烷基(-C(O)–C1-8烷基)。烷基可以是任何合适的烷基链。酰基可以任选地被一个或多个选自卤素，羟基，氨基，巯基，烷氨基，烷氧基，卤代烷基，羧基，酰氨基，硝基，氧代基，硫代基和氰基的基团取代。
“羟烷基”指其中至少一个氢原子被羟基替代的如上定义的烷基。羟烷基中的烷基可以具有任何合适数量的碳原子，例如C1-6。示例性的羟烷基包括但不限于羟甲基，羟乙基(其中羟基在1或2位)，羟基丙基(其中羟基在1,2或3位)，羟基丁基(其中羟基在1,2,3或4位)，羟基戊基(其中羟基在1,2,3,4或5位)5位)，羟己基(其中羟基在1,2,3,4,5或6位)，1,2-二羟基乙基等。羟烷基可以任选地被一个或多个选自卤素，硫醇，氨基，烷氨基，烷氧基，卤代烷基，羧基，酰氨基，硝基，氧代基，硫基代和氰基的基团取代。同时其他羟烷基也可用于本发明。
“烷氧基”是指具有至少一个桥氧原子的烷基。桥氧原子可以在烷基链(烷基-O-烷基)内的任何位置，或桥氧原子可以将烷基连接到连接点(烷基-O-)。在一些情况下，烷氧基含有1,2,3,4或5个桥氧原子。至于烷基，烷氧基可具有任何合适数目的碳原子，例如C1-2,C1-4,和C1-6。烷氧基包括例如甲氧基，乙氧基，丙氧基，异丙氧基，甲氧基-乙氧基-乙基(C1-O-C2-O-C2-)等。烷氧基的一个例子是聚乙二醇(PEG)，其中聚乙二醇链可包含2至20个乙二醇单体。烷氧基可以任选地被一个或多个选自卤素，羟基，氨基，巯基，烷基氨基，卤代烷基，羧基，酰氨基，硝基，氧代基，硫代基和氰基的基团取代。烷氧基可以被取代或未被取代。
“烷氨基”是指具有一个或多个氨基的如上定义的烷基。氨基可以是伯，仲或叔。可用于本发明的烷基氨基包括但不限于乙基胺，丙基胺，异丙基胺，乙二胺和乙醇胺。氨基可以将烷基氨基连接到与化合物其余部分的连接点上，可以在烷基的任何位置上，或者将烷基的至少两个碳原子连接在一起。烷基氨基可以任选地被一个或多个选自卤素，羟基，巯基，烷氨基，烷氧基，卤代烷基，羧基，酰氨基，硝基，氧代基，硫代基和氰基的基团取代。同样其他烷氨基也可用于本发明。
“烷硫基”是指具有一个或多个硫醇基的如上定义的烷基。可用于本发明的烷硫基包括但不限于乙基硫醇，丙基硫醇和异丙基硫醇。巯基可以将烷硫基连接到与化合物其余部分的连接点上，可以位于烷基的任何位置，或将烷基的至少两个碳原子连接在一起。烷硫基可以任选地被一个或多个选自卤素，羟基，氨基，烷氨基，烷氧基，卤代烷基，羧基，酰氨基，硝基，氧代基，硫代基和氰基的基团取代。同样其他烷硫基可用于本发明。
术语“波浪线”表示取代基与分子其余部分的连接点。当波浪线没有被描述为特别附加到特定的环原子时，连接点可以是取代基的任何合适的原子。例如，以下结构中的波浪线：:
旨在包括任何可替代的原子作为连接点。
术语“再生医学”是指处理替换，改造或再生人体细胞，组织或器官以恢复或建立其正常功能的医学分支。在一些实施例中，再生医学包括在实验室中生长组织和器官，并且在当身体不能自我愈合时将其安全移植。
术语“生物组织工程”是指以再生医学目的而创建的一种或多种合成产生的细胞，组织或器官。在一些实施方案中，生物工程化组织是指在实验室中开发的细胞，组织或器官。在一些实施方案中，生物工程化组织指实验室衍生的心脏，肝脏，肺，肾，胰腺，肠，胸腺，角膜，干细胞(例如人多能干细胞，造血干细胞)，淋巴细胞，粒细胞，免疫系统细胞，细胞，类器官，胚胎细胞，卵细胞，精细胞，血小板，神经细胞或其组合。
术语“冷冻保护液”是指用于减少或防止由冰晶形成引起的冷冻损伤的溶液。在一些实施方案中，该冷冻保护液包含一种或多种本发明所述的类肽聚合物。在其他实施方案中，该冷冻保护液包含一种或多种类肽聚合物和一种或多种本发明所述的类肽-肽杂合物。在一些实施方案中，该冷冻保护液保护生物样品免受冻害。在一些实施方案中，冷冻保护液抑制非生物样品中冰晶的形成。在一些实施方案中，与生物样品未暴露于降低的温度下相比，保存于冷冻保护液的生物样品保留的时间更长。.
术语“玻璃化”是指将物质转化成玻璃态(即，非结晶无定形固体)。对于水来说，和普通的冷冻形成冰晶相反，玻璃化是指将水转变成玻璃态而不形成冰晶。通常通过非常快速的冷却和/或引入抑制冰晶形成的试剂来实现玻璃化。另一方面，“去玻璃化”是指在之前无结晶(无定形)的玻璃态的结晶过程。在冰水的情况下，由于先前的非结晶无定形固体将经历熔化，去玻璃化可能意味着冰晶的形成。
术语“类肽”是指约2至1,000(例如，约2至1,000,2至950,2至900,2至850,2至800,2至750,2至700,2至650,2至600,2至550,2至500,2至450,2至400,2至350,2至300,2至250,2至200,2至150,2至100,2至90，2至80,2至70,2至60,2至50，2至40，2至30，2至20，2至10，2至9，2至8，2至7，2至6，2至5，2至4或2至3)在酰胺氮原子上具有取代基“R1”的单元的聚酰胺。任选地，第二个独立选择的取代基“R2”可以连接到羰基α-的碳原子上(即连接到α-碳原子上)。R2可以是但不限于H原子。在特定情况下，类肽是肽的合成类似物，其中侧链不是连接到α-碳原子反而连接到酰胺氮原子上。类肽是具有受控序列和长度的合成聚合物，其可通过自动化固相有机合成仪制备包括具有不同化学功能的多种侧链的类肽。类肽中的酰胺氮原子键合的R1基团可以包括但不限于H，任选取代的C1-18烷基，任选取代的C2-18烯基，任选取代的C2-18炔基，任选取代的C1-18羟基烷基，(C3-10环烷基)烷基，(杂环烷基)烷基，芳基烷基和杂芳基烷基。其中任何环烷基，杂环烷基，芳基或杂芳基基团可以任选和独立地被一个或多个“R3”基团取代。每个R3基团可以独立地选自卤素，氧代，硫代，OH，SH，氨基，C1-8烷基，C1-8羟基烷基，C1-8烷基氨基或C1-8烷硫基。此外，R1基团可以包含并不仅限于任何如下氨基酸的侧链基团，例如丙氨酸(Ala)，半胱氨酸(Cys)，天冬氨酸(Asp)，谷氨酸(Glu)，苯丙氨酸(Phe)，甘氨酸(Gly)，组氨酸(His)，异亮氨酸(Ile)，精氨酸(Arg)，赖氨酸(Lys)，亮氨酸(Leu)，蛋氨酸(Met)，天冬酰胺(Asn)，脯氨酸(Pro)，谷氨酰胺(Gln)，丝氨酸(Ser)，苏氨酸)，缬氨酸(Val)，色氨酸(Trp)或酪氨酸(Tyr)。
术语“类肽-肽杂合物”是指由类肽单体单元和α氨基酸(即，肽单元)组成的寡聚体。
术语“多肽”，“肽”和“蛋白质”在本文中可互换使用以指氨基酸残基的聚合物或氨基酸残基的多种聚合物的组合。
术语“氨基酸”包括但不限于天然存在的α-氨基酸及其立体异构体。氨基酸的“立体异构体”是指氨基酸的镜像异构体，例如L-氨基酸或D-氨基酸。例如，天然存在的氨基酸的立体异构体是指天然存在的氨基酸(即D-氨基酸)的镜像异构体。
天然存在的氨基酸是由遗传密码编码的氨基酸，以及稍后修饰的那些氨基酸(例如羟脯氨酸，γ-羧基谷氨酸和O-磷酸丝氨酸)。天然存在的α-氨基酸包括但不限于丙氨酸(Ala)，半胱氨酸(Cys)，天冬氨酸(Asp)，谷氨酸(Glu)，苯丙氨酸(Phe)，甘氨酸(Gly)，组氨酸(His)，异亮氨酸(Ile)，精氨酸(Arg)，赖氨酸(Lys)，亮氨酸(Leu)，甲硫氨酸(Met)，天冬酰胺(Asn)，脯氨酸(Pro)，谷氨酰胺(Gln)，丝氨酸(Ser)，苏氨酸(Thr)(Val)，色氨酸(Trp)，酪氨酸(Tyr)及其组合。天然存在的α-氨基酸的立体异构体包括但不限于D-丙氨酸(D-Ala)，D-半胱氨酸(D-Cys)，D-天冬氨酸(D-Asp)，D-谷氨酸(D-Glu)，D-苯丙氨酸(D-Phe)，D-组氨酸(D-His)，D-异亮氨酸(D-Ile)，D-精氨酸(D-Arg)，D-赖氨酸(D-Lys)亮氨酸(D-Leu)，D-蛋氨酸(D-Met)，D-天冬酰胺(D-Asn)，D-脯氨酸(D-Pro)，D-谷氨酰胺(D-Gln)，D-丝氨酸)，D-苏氨酸(D-Thr)，D-缬氨酸(D-Val)，D-色氨酸(D-Trp)，D-酪氨酸(D-Tyr)及其组合。
氨基酸在本发明中可以通过其公认的三字母符号或由IUPAC-IUB生物化学命名委员会推荐的单字母符号来提及。例如，本发明可以通过其公认的三字母符号(例如Arg代表L-精氨酸)或大写单字母氨基酸符号(例如R代表L-精氨酸)代表L-氨基酸。本发明可以通过其公认的三字母符号(例如D-精氨酸的D-Arg)或小写的单字母氨基酸符号(例如r代表D-精氨酸)来表示D-氨基酸。
III.实施方案详细描述
本发明提供了一种类肽聚合物在0℃温度和低温温度条件下减少或抑制的冰晶形成的方法。
A.类肽聚合物
在一些方面，本发明中所述类肽聚合物结构如下图所示：
其互变异构体或其立体异构体，
其中：
每个R1独立地选自H，任选取代的C1-18烷基，任选取代的C2-18烯基，任选取代的C2-18炔基，任选取代的C1-18羟烷基，任选取代的烷氧基，任选取代的C1-18烷基氨基(C3-10环烷基)烷基，(杂环烷基)烷基，芳基烷基和杂芳基烷基，任选取代的C 1-18烷硫基，任选取代的羧基、烷基，C3-10环烷基，
其中R1的至少一个是C1-18羟烷基，并且
其中所述环烷基，杂环烷基，芳基和杂芳基基团中的任一个任选且独立地能够被一个或多个R3基团取代：
每个R2独立地选自H，任选取代的C1-18烷基，任选取代的C2-18烯基，任选取代的C2-18炔基，任选取代的C1-18羟烷基，任选取代的C1-18烷氨基，任选取代的C1-18烷硫基和任选取代的羧烷基；
每个R3独立地选自卤素，氧代基，硫代基，羟基，巯基，氨基，C1-8烷基，C1-8羟烷基，C1-8烷氨基和C1-8烷硫基；
X和Y独立地选自H，任选取代的C1-8烷基，任选取代的C1-8酰基，任选取代的C1-8烷氨基，羟基，巯基，氨基，羧基，任选取代的C1-8羟烷基，任选取代的C1-8烷氨基，任选取代的C2-8烷硫基，任选取代的C1-8羧烷基和卤素，或者
可选的X和Y一起形成共价键；并且
代表聚合物中单体数目的下标n在2和50之间；
条件是当n在3和7之间时，R1的所有情况都不是羟乙基。
在一些实施方案中，类肽聚合物中的R1的每个实例选自：
其中：m在1和8之间；并且R3选自H，C1-8烷基，羟基，巯基，硝基，氨基，氧代基和硫代基。在一些实施方案中，重复单元m可以在1和2,1和3,1和4,1和5,1和6或1和7之间。在一些实施方案中，重复单元m是1,2,3,4,5,6,7或8。
在一些实施方案中，一种或多种R1单体具有根据R1a的结构：
在一些实施方案中，每个R1a基团独立地选自在一些实施方案中，选择两种立体异构体的混合物。在一些实施方案中，仅选择单体的R立体异构体。在一些实施方案中，仅选择该单体的S立体异构体。
在一些实施方案中，一种或多种R1单体具有根据R1b的结构：
在一些实施方案中，每个R1b基团独立地选自在一些实施方案中，选择两种立体异构体的混合物。在一些实施方案中，仅选择单体的R立体异构体。在一些实施方案中，仅选择该单体的S立体异构体。
在一些实施方案中，一种或多种R1单体具有根据R1c的结构：
在一些实施方案中，每个R1c基团独立地选自在一些实施方案中，选择两种立体异构体的混合物。在一些实施方案中，仅选择单体的R立体异构体。在一些实施方案中，仅选择该单体的S立体异构体。
在一些实施方案中，一种或多种R1单体具有根据R1d的结构：
在一些实施方案中，每个R1d基团独立地选自在一些实施方案中，选择两种立体异构体的混合物。在一些实施方案中，仅选择单体的R立体异构体。在一些实施方案中，仅选择该单体的S立体异构体。
在一些实施方案中，一种或多种R1单体具有根据R1e的结构：
在一些实施方案中，每个R1e基团独立地选自在一些实施方案中，选择两种立体异构体的混合物。在一些实施方案中，仅选择单体的R立体异构体。在一些实施方案中，仅选择该单体的S立体异构体。
本发明中的任何单体如果未指明其立体化学，则可以使用其任何的立体异构体。在一些实施方案中，选择两种立体异构体的混合物。在包含立体异构体混合物的实施方案中，类肽聚合物中单体的R与S立体异构体的比例可以为约95：5至约90:10，约90:10至约85:15，约85:15至约80:20，约80:20至约75:25，约75:25至约70:30，约70:30至约65:35，约65:35至约60:40，约60:40至约55:45，约55:45至约50:50，约50:50至约45:55，约45:55至约40:60，约40:60至约35:65，约35:65至约30:70，约30:70至约25:75，约25:75至约20:80，约20:80至约15:85，约15:85至约10:90，或约10:90至约5:95。在一些实施方案中，仅选择单体的R立体异构体。在一些实施方案中，仅选择单体的S立体异构体。
本发明中一旦用楔形或虚线显示单体特定的立体化学，则该单体基本上不含其他立体异构体。在一些实施方案中，基本不含有意味着至少70％的纯度。在一些实施例中，基本不含有意味着至少80％纯度。在一些实施例中，基本不含有意味着至少90％纯度。在一些实施方案中，基本不含有意味着至少95％纯度。在一些实施例中，基本不含有意味着至少99％的纯度。在一些实施例中，基本不含有意味着99.9％的纯度。
在一些实施方案中，类肽聚合物中的R1的每个实例选自：
在一些实施方案中，至少2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17,18,19,20或更多的R1类肽聚合物是独立选择的C1-18羟烷基(例如独立选择的C1-6羟烷基)。在一些实施方案中，类肽聚合物中的每个R1都是C1-18羟烷基。在一些实施方案中，每个R1都是C1-6羟烷基。在一些实施方案中，R1的每个实例是相同的C1-6羟烷基。在一些实施方案中，R1的每个实例为羟烷基，其中每个羟烷基中的烷基的长度为1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17,18或更多个碳原子。在一些实施方案中，羟烷基包含1,2,3,4,5,6,7或8个羟基取代。在一些实施例中，R1的每个实例是：
在一些实施方案中，R2是H。在一些实施方案中，至少一个R2是卤素。
在一些实施方案中，类肽聚合物的序列长度n在3和25之间。在一些实施方案中，类肽聚合物的序列长度n在5和25之间。在一些实施方案中，类肽的序列长度聚合物n在8和50之间。在一些实施方案中，类肽聚合物的序列长度n在8和25之间。在一些实施方案中，类肽聚合物的序列长度n在8和20之间。在一些实施方案中，类肽聚合物的序列长度n可以为约10至28，约12至26，约14至24，约16至22或18至约在一些实施方案中，类肽聚合物的序列长度n可以为约8至约50，约8至45，约8至40，约8至35，约8至30，约10至25，约10至20或约10至15。在一些实施方案中，序列类肽聚合物的长度n可以是2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17,18,19,20,2122,23,24,25,26,27,28,29,30,31,32,33,34,35,36,37,38,39,40,41,42,43,44,45,46，47,48,49或50。
在一些实施方案中，X和Y是H，任选取代的C 1-8烷氨基，烷氨基，羟基，巯基，氨基，羧基，任选取代的C 1-8羟烷基，任选取代的C 1-8烷氨基，任选取代的C 2-8烷硫基，任选取代的羧烷基，或卤素。
在一些实施方案中，类肽聚合物的X和Y一起形成共价键。如下所示，X和Y之间共价键的形成导致其中末端NR1基团和末端C＝O基团连接的类肽聚合物的环化。
在一些实施方案中，类肽聚合物由选自表1中列出的单体单元组成。本领域普通技术人员都会认识到本发明的范围不局限于表1中列出的单体，并且任何有用的N-取代的取代基都可以用作N-取代的类肽单体。在一些实施方案中，N-取代的类肽单体上的N-取代的取代基是氨基酸丙氨酸(Ala)，半胱氨酸(Cys)，天冬氨酸(Asp)，谷氨酸(Glu)，苯丙氨酸(Phe)，甘氨酸(Gly)，组氨酸(His)，异亮氨酸(Ile)，精氨酸(Arg)，赖氨酸(Lys)，亮氨酸(Leu)，蛋氨酸(Met)，天冬酰胺(Asn)，脯氨酸(Pro)，谷氨酰胺Gln)，丝氨酸(Ser)，苏氨酸(Thr)，缬氨酸(Val)，色氨酸(Trp)或酪氨酸(Tyr)。
在一些实施方案中，类肽聚合物如表2，表3，表4，表5，表6，表7，表8或表9中列出的类肽聚合物所示。
在一些实施方案中，类肽聚合物的序列长度n为10，类肽聚合物包含：10个Nsb单体，1个Nhp单体和9个Nsb单体，2个Nhp单体和8个Nsb单体，3个Nhp单体和7个Nsb单体，4个Nhp单体和6个Nsb单体，5个Nhp单体和5个Nsb单体，6个Nhp单体和4个Nsb单体，7个Nhp单体和3个Nsb单体，8个Nhp单体和2个Nsb单体，9个Nhp单体和1个Nsb单体，或者10个Nhp单体。
在一些实施方案中，类肽聚合物具有序列Nhp-Nhp-Nhp-Nhp-Nhp-Nhp-Nhp-Nhp-Nhp-Nhp(SEQ ID NO：2)，其中X是H或C1-8酰基并且Y是-OH或-NH2或C1-8烷基。在一些实施方案中，类肽聚合物具有序列Nsb-Nsb-Nhp-Nsb-Nsb-Nhp-Nsb-Nsb-Nhp-Nsb(SEQ ID NO：1)，其中X是H或C1-8酰基并且Y是-OH或-NH2或C1-8烷基。在一些实施方案中，类肽聚合物具有序列Nsb-Nhp-Nhp-Nhp-Nsb-Nhp-Nhp-Nhp-Nsb-Nhp(SEQ ID NO：7)，其中X是H或C1-8酰基并且Y是-OH或-NH2或C1-8烷基。在一些实施方案中，类肽聚合物具有序列Nsb-Nsb-Nhp-Nhp-Nsb-Nsb-Nhp-Nhp-Nsb-Nsb(SEQ ID NO：8)，其中X是H或C1-8酰基并且Y是-OH或-NH2或C1-8烷基。在一些实施方案中，类肽聚合物具有序列Nsb-Nhp-Nhp-Nhp-Nhp-Nhp-Nsb-Nhp-Nhp-Nhp(SEQ ID NO：9)，其中X是H或C1-8酰基并且Y是-OH或-NH2或C1-8烷基。在一些实施方案中，Y是仲胺或叔胺。
在一些实施方案中，类肽聚合物的序列长度n为10，并且类肽聚合物包含：10个Nme单体，1个Nhp单体和9个Nme单体，2个Nhp单体和8个Nme单体，3个Nhp单体和7个Nme单体，4个Nhp单体和6个Nme单体，5个Nhp单体和5个Nme单体，6个Nhp单体和4个Nme单体，7个Nhp单体和3个Nme单体，以及8个Nhp单体和2个Nme单体或者9个Nhp单体和1个Nme单体。
在一些实施方案中，类肽聚合物的序列长度n为10，并且类肽聚合物包含：1个Nhe单体和9个Nsb单体，2个Nhe单体和8个Nsb单体，3个Nhe单体和7个Nsb单体，4个Nhe单体和6个Nsb单体，5个Nhe单体和5个Nsb单体，6个Nhe单体和4个Nsb单体，7个Nhe单体和3个Nsb单体，8个Nhe单体和2个Nsb单体，9个Nhe单体和1个Nsb单体或10个Nhe单体。
在一些实施方案中，类肽聚合物的序列长度n为10，并且类肽聚合物包含：10个Nbu单体，1个Nhp单体和9个Nbu单体，2个Nhp单体和8个Nbu单体，3个Nhp单体和7个Nbu单体，4个Nhp单体和6个Nbu单体，5个Nhp单体和5个Nbu单体，6个Nhp单体和4个Nbu单体，7个Nhp单体和3个Nbu单体，8个Nhp单体和2个Nbu单体，或9个Nhp单体和1个Nbu单体。
在一些实施方案中，类肽聚合物的序列长度n为10，并且类肽聚合物包含：10种Nib单体，1种Nhp单体和9种Nib单体，2种Nhp单体和8种Nib单体，3种Nhp单体和7种Nib单体，4个Nhp单体和6个Nib单体，5个Nhp单体和5个Nib单体，6个Nhp单体和4个Nib单体，7个Nhp单体和3个Nib单体，8个Nhp单体和2个Nib单体或9个Nhp单体和1个Nib单体。
在一些实施方案中，类肽聚合物的序列长度n为10，并且类肽聚合物包含：10个Npr单体，1个Nhp单体和9个Npr单体，2个Nhp单体和8个Npr单体，3个Nhp单体和7个Npr单体，4个Nhp单体和6个Npr单体，5个Nhp单体和5个Npr单体，6个Nhp单体和4个Npr单体，7个Nhp单体和3个Npr单体，8个Nhp单体和2个Npr单体，或9个Nhp单体和1个Npr单体。
在一些实施方案中，类肽聚合物的序列长度n为10，并且类肽聚合物包含：10个Nip单体，1个Nhp单体和9个Nip单体，2个Nhp单体和8个Nip单体，3个Nhp单体和7个Nip单体，4个Nhp单体和6个Nip单体，5个Nhp单体和5个Nip单体，6个Nhp单体和4个Nip单体，7个Nhp单体和3个Nip单体，8个Nhp单体和2个Nip单体，或9个Nhp单体和1个Nip单体。
在一些实施方案中，类肽聚合物的序列长度n为14，并且类肽聚合物包含：6个Nhp单体和8个Nsb单体，7个Nhp单体和7个Nsb单体，8个Nhp单体和6个Nsb单体，10个Nhp单体和4个Nsb单体或14个Nhp单体。
在一些实施方案中，类肽聚合物的序列长度n为14，并且类肽聚合物包含：6个Nhp单体和8个Nib单体，7个Nhp单体和7个Nib单体，8个Nhp单体和6个Nib单体，10个Nhp单体和4个Nib单体，或14个Nhp单体。
在一些实施方案中，类肽聚合物的序列长度n为16，并且类肽聚合物包含：5个Nhp单体和11个Nsb单体，7个Nhp单体和9个Nsb单体，8个Nhp单体和8个Nsb单体，10个Nhp单体和6个Nsb单体，12个Nhp单体和4个Nsb单体或16个Nhp单体。
在一些实施方案中，类肽聚合物的序列长度n为22，并且类肽聚合物包含：7个Nhp单体和15个Nsb单体，10个Nhp单体和12个Nsb单体，11个Nhp单体和11个Nsb单体，14个Nhp单体和8个Nsb单体，17个Nhp单体和5个Nsb单体或22个Nhp单体。
在一些实施方案中，本发明所述的类肽聚合物形成螺旋结构。在一些实施方案中，螺旋结构采用类似于聚脯氨酸螺旋的结构。在某些情况下，类肽聚合物形成聚脯氨酸I螺旋。在某些其他情况下，类肽聚合物形成聚脯氨酸II螺旋。在一些实施方案中，当类肽聚合物包含至少一个N-芳基侧链时采用螺旋结构。在一些实施方案中，N-芳基侧链是Nep单体。
在一些实施方案中，类肽聚合物在约0℃至约-20℃的温度下降低或抑制冰晶形成。在其他实施方案中，类肽聚合物在约-20℃至约-40℃的温度下降低或抑制冰晶形成。在某些实施方案中，类肽聚合物在约-20℃下降低或抑制冰晶形成。在某些其他实施方案中，类肽聚合物在约-40℃至约-200℃(例如约-196℃)内的温度下降低或抑制冰晶形成。
在一些实施方案中，类肽聚合物在约0℃至约-200℃的温度，约-10℃至约-190℃的温度，约-20℃至-180℃，约-30℃至-170℃，约-40℃至-160℃，约-50℃至-150℃，约-60℃至-140℃，约-70℃至约-130℃，约-80℃至约-120℃，约-90℃至约-120℃，或约-100℃至约-110℃的温度范围内降低或抑制冰晶形成。
在其他实施方案中，类肽聚合物在或约-10℃，在或约-15℃，在或约-25℃，在或约-30℃，在或约-35℃下降低或抑制冰晶形成在或约-40℃，在或约-45℃，在或约-50℃，在或约-55℃，在或约-60℃，在或约-65℃，在或约-70℃，在或约-75℃，在或约-80℃，在或约-85℃，在或约-90℃，在或约-95℃，在或约-100℃，在或约-105℃，在或约-110℃，在或约-115℃，在或约-120℃，在或约-125℃，在或约约-135℃，在或约-140℃，在或约-145℃，在或约-150℃，在或-155℃，在或约-160℃，在或约-165℃，在或约-170℃，在或约-175℃，在或约-180℃，在或约-185℃，在或约-190℃，在或约-195℃，在或约-196℃，在或约-200℃降低或抑制冰晶形成。
在一些实施方案中，类肽聚合物(例如存在于组合物，制剂或产品如冷冻保护液，防冻液，冷冻食品或化妆品护理产品中)的浓度在约100nM至约100mM之间。在某些实施方案中，类肽聚合物(例如，存在于组合物，制剂或产品例如冷冻保护液，防冻溶液，冷冻食品或化妆品护理产品中)的浓度在约100nM至250nM之间，在约250nM与500nM之间，在约500nM与750nM之间，在约750nM与1μM之间，在约1μM与5μM之间，在约5μM与25μM之间，在约25μM与50μM之间，约50μM和100μM之间，约100μM和250μM之间，约250μM和500μM之间，约500μM和750μM之间，约750μM和1mM之间，约1mM至10mM，约10mM至50mM，或约50mM至100mM之间。在其他实施方案中，类肽聚合物(例如存在于组合物，制剂或产品例如冷冻保护液，防冻液，冷冻食品或化妆品护理产品中)的浓度为约100nM，约1μM，约10μM，约100μM，约1mM，约10mM或约100mM。在具体的实施方案中，类肽聚合物的浓度为约1,2,3,4,5,6,7,8,9或10mM。
B.类肽和肽杂合物
另一方面，本发明包括了类肽-肽杂合物。在一些实施方案中，类肽-肽杂交体包含本发明所述的类肽聚合物和一种或多种氨基酸。氨基酸可以是天然存在的氨基酸或其变体。在一些实施方案中，类肽-肽杂交体包含约1至10个氨基酸(例如，约1,2,3,4,5,6,7,8,9或10个氨基酸)。在其他实施方案中，类肽-肽杂交体包含约10至100个氨基酸(例如，约10,15,20,25,30,35,40,45,50,55,60,65,70,75,80,85,90,95或100个氨基酸)。在一些实施方案中，类肽-肽杂合物包含超过约100个氨基酸。在其他实施方案中，类肽-肽杂交体包含2至50个类肽单体(例如2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17,18,19,20,21,22,23,24,25,26,27,28,29,30,31,32,33,34,35,36,37,38,39,40,41,43,44,45,46,47,48,49或50个类肽单体)和至少约1至100个氨基酸(例如，至少约1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,15,20,25,30,35,40,45,50,5,60,65,70,75,80,85,90个，95,或100个氨基酸)。
氨基酸可以位于聚合物内的任何位置，包括在N-和C-末端和/或任何类肽单体之间。在类肽-肽杂合物包含两个或更多个氨基酸的情况下，氨基酸位置可以全部是连续的，或者它们的仅一部分可以是连续的。或者，所有的氨基酸可以被一个或多个类肽单体分开。
在一些实施方案中，氨基酸是D-氨基酸。在其他实施方案中，氨基酸是L-氨基酸。在一些其他实施方案中，类肽-肽杂合物包含D-氨基酸和L-氨基酸的组合。在一些实施方案中，所述一种或多种氨基酸选自丙氨酸，半胱氨酸，天冬氨酸，谷氨酸，苯丙氨酸，甘氨酸，组氨酸，异亮氨酸，精氨酸，赖氨酸，亮氨酸，甲硫氨酸，天冬酰胺，脯氨酸，谷氨酰胺，丝氨酸，苏氨酸，缬氨酸，色氨酸，酪氨酸及其组合。在一些情况下，一种或多种氨基酸选自异亮氨酸，苏氨酸，丙氨酸及其组合。
在一些实施方案中，类肽聚合物中的一个或多个Nsb类肽单体被一个或多个异亮氨酸氨基酸残基置换以产生类肽-肽杂合物。一个或多个异亮氨酸氨基酸可以是D-氨基酸，L-氨基酸或其组合。在其他实施方案中，类肽聚合物中的一个或多个Nhp类肽单体被一个或多个苏氨酸氨基酸残基置换以产生类肽-肽杂合物。一种或多种苏氨酸氨基酸可以是D-氨基酸，L-氨基酸或其组合。在一些其他实施方案中，类肽聚合物中的一种或多种Nme类肽单体被一个或多个丙氨酸氨基酸残基置换以产生类肽-肽杂合物。一种或多种丙氨酸氨基酸可以是D-氨基酸，L-氨基酸或其组合。
在一些实施方案中，类肽-肽杂合物包含以下序列：
Nep-Nep-Xaa-Xaa-Xaa-Xaa-Nep-Nep-Nep-Nep-Nme-Nme(SEQ ID NO:3)；其中Xaa氨基酸残基是独立选择的氨基酸，例如D-氨基酸，L-氨基酸或其组合。作为非限制性实例，Xaa的所有例子都是Arg，Ala，Val和/或Ser氨基酸残基。
在一些实施方案中，类肽-肽杂合物包含以下序列：
Nme-Nme-Xaa-Nme-Nme-Nme-Nme-Nhp-Nhp-Nsb-Xaa-Nme-Nme-Xaa-Nme-Nme-Nme(SEQ ID NO:4)；
其中Xaa氨基酸残基是独立选择的氨基酸，例如D-氨基酸，L-氨基酸或其组合。作为非限制性实例，Xaa的所有例子都是Arg，Ala，Val和/或Ile氨基酸残基。
在其他实施方案中，类肽-肽杂合物包含以下序列：
Nme-Nme-Xaa-Nme-Nme-Nme-Nme-Nme-Nme-Nme-Xaa-Xaa(SEQ ID NO:5)；其中Xaa氨基酸残基是独立选择的氨基酸，例如D-氨基酸，L-氨基酸或其组合。作为非限制性实例，Xaa的所有例子都是Arg，Ala，Val和/或Leu氨基酸残基。
在其他实施方案中，类肽-肽杂合物包含以下序列：
Arg-Nsb-Nsb-Nhp-Nhp-Nsb-Nsb-Nhp-Nhp-Nsb-Nsb(SEQ ID NO:6)；
其中Arg氨基酸残基是D-氨基酸或L-氨基酸。在一些实施方案中，类肽-肽杂合物包含表10中所列的结构。
C.合成方法
另一方面，本发明提供了合成类肽聚合物或类肽-肽杂合物的方法。本发明的类肽聚合物和类肽-肽杂合物可以使用所述的一般方法和程序从易得的起始材料制备。化合物最好采用典型或优选的工艺条件(即反应温度，时间，反应物的摩尔比，溶剂，压力等)合成，除非另有说明，否则也可以使用其它工艺条件。最佳反应条件可以随所用的特定反应物或溶剂而变化，但是这些条件可以由本领域技术人员通过常规优化程序来确定。
本发明的类肽聚合物和类肽-肽杂合物可以由有机合成领域的技术人员从已知的或可商购的原料和试剂制备。溶剂和试剂可以直接购买并且未经进一步纯化。
在一些实施方案中，采用亚单体方法(图1)用于类肽的合成，其中每个N-取代的甘氨酸单体由两种容易获得的“亚单体”组装而成。低聚类肽的合成基于标准固相合成方法，类似于肽的固相合成。每个单体添加反应循环由两个步骤组成，酰化步骤和亲核置换步骤。在一些实施方案中，固相组装不需要使用N-保护的单体，因为不存在需要保护的反应性侧链官能团。本领域技术人员将认识到存在许多固相合成方法，包括自动化机器合成仪。在一些实施方案中，所使用的合成仪是由Protein Technologies,Inc.公司制造的XMultiplex多肽合成仪。在一些实施方案中，所使用的合成仪是由Protein Technologies,In公司制造的Overture多肽合成仪。在其他实施方案中，类肽使用本领域已知的传统有机化学方法手动合成。通过在合成过程中的适当时间提供合适的氨基酸代替类肽单体，可以将类似于上述相同的技术应用于类肽-肽寡聚体的合成。
作为非限制性实例，可以在100mg Rink酰胺树脂(NovaBiochem；0.49mmol/g)上合成类肽聚合物。Rink酰胺树脂(100mg)用1.5mL的DCM洗涤两次，随后在1.5mL的DMF中溶胀。溶胀步骤可以进行两次。通过加入20％哌啶/DMF可将Fmoc保护基团从树脂中除去。搅拌混合物10分钟，排干，重复哌啶处理，接着用DMF(1.5mL，5次)充分洗涤。第一个单体合成可以手动进行，通过树脂和7毫克溴乙酸(0.27毫摩尔；Sigma-Aldrich)，189微升DIEA(1.08毫摩尔；Chem Impex International)在2毫升DCM中反应，摇床上室温下反应30分钟随后用DCM(5mL，2mL)和DMF(5mL，2mL)充分洗涤。反应后得到的溴代酰化树脂可以与2毫升1M胺亚单体在DMF中放在摇床上在室温下反应30分钟，然后用DMF(5毫升，2毫升)充分洗涤。随着溴乙酸手动反应完成后，第一次单体单体置换步骤和所有随后的溴乙酰化和胺置换步骤可通过自动化合成仪进行，直至获得所需的低聚物长度。自动溴乙酰化步骤可以通过添加1660μL的1.2M溴乙酸的DMF溶液和400μL的DIC(Chem Impex International)来进行。搅拌混合物20分钟，排干，并用DMF洗涤(用2mL三次)。接下来，可以加入2mL的亚单体(2mmol)的DMF溶液以通过溴化物的亲核取代引入侧链。搅拌混合物20分钟，排干，用DMF洗涤(用2mL三次)并用DCM洗涤(用2mL三次)。类肽-树脂可以在室温下在2mL的20％HFIP(Alfa Aesar)的DCM(v/v)溶液中裂解。裂解反应恒定搅拌下在玻璃管中反应30分钟。HFIP/DCM可以在氮气流下蒸发。可以将最终产物溶于5mL 50％ACN的HPLC级H2O中，并用0.5μm不锈钢烧结注射器尖端过滤器(Upchurch Scientific)过滤。使用Beckman Coulter System Gold仪器对化合物进行纯化，室温纯化时使用C18反相分析HPLC柱(Peeke Scientific，5μm，2.0×50mm)。控制20分钟内5-95％乙腈/水(0.1％TFA，Acros Organics)的线性梯度，流速为0.7mL/min。为了去除样品溶液中的任何痕量HFIP，可将溶于50％ACN/H2O中的聚合物前体冷冻干燥过夜。
可以通过电喷雾电离(ESI)质谱分析类肽聚合物和类肽-肽杂合物。通常，1-5μM待分析类肽聚合物或类肽-肽杂合物溶解在0.5-2mL含有1％有机酸如三氟乙酸的50％去离子水/50％HPLC级ACN中。通过用电子轰击使制备的样品离子化，从而使分子分裂成带电碎片。然后通过加速碎片并将它们暴露在电场或磁场中，根据它们的质荷比的不同来分离离子。离子被能够检测带电粒子的设备如电子倍增器检测到。通过关联质量与所鉴定的质量或特征性碎裂模式相关联来鉴定类肽和类肽-肽杂合物。
D.使用方法
在一些方面，本发明提供了一种冷冻保护液的配方。在一些实施方案中，所述冷冻保护液包含发明所述的类肽聚合物，类肽-肽杂合物或其组合。在其他实施方案中，所述冷冻保护液还包含选自离子物质，渗透性冷冻保护剂，非渗透性冷冻保护剂，抗氧化剂，细胞膜稳定化合物，水通道蛋白或其他通道形成化合物，醇，糖衍生物，非离子表面活性剂，蛋白质，二甲基亚砜(DMSO)，聚乙二醇(PEG)，聚乙烯吡咯烷酮，Ficoll无菌细胞分离液，聚乙烯醇，透明质酸，甲酰胺，天然或合成水凝胶的成分及其组合。在特定的实施方案中，渗透性冷冻保护剂渗透细胞膜并降低细胞内水的含量，由此减少在任何相应温度下形成的细胞内冰的数量。在其他特定的实施方案中，非渗透性冷冻保护剂通过离子间相互作用的形式诱导溶液胶体渗透压的变化并改变细胞膜与细胞外水的结合。
在一些情况下，所述冷冻保护液还包含选自丙二醇，乙二醇，甘油，甲醇，丁二醇，阿杜醇，乙醇，1,3-丙二醇，二甘醇，聚环氧乙烷，赤藓糖醇，山梨醇，木糖醇，聚丙二醇，2-甲基-2,4-戊二醇(MPD)，甘露醇，肌醇，二硫醇，1,2-丙二醇的成分及其组合。
在其他情况下，所述冷冻保护液还包含选自单糖，二糖，多糖及其组合的糖。在特定情况下，糖选自葡萄糖，3-O-甲基-D-吡喃葡萄糖，半乳糖，阿拉伯糖，果糖，木糖，甘露糖，蔗糖，海藻糖，乳糖，麦芽糖，棉子糖，葡聚糖的成分和其组合。
在其他情况下，该冷冻保护液还包含PEG或多种不同的PEG化合物。在一些其他情况下，至少一种PEG化合物的平均分子量小于约1,000g/mol(例如，小于约1,000,950,900,850,800,750,700,650,600,550,500,450,400,350,300,250,200,150或100g/mol)。在特定的情况下，至少一种PEG化合物的平均分子量在约200和400g/mol之间(例如约200,210,220,230,240,250,260,270,280,290,300,310,320,330,340,350,360,370,380,390或400克/摩尔)。在一些情况下，冷冻保护液包含的PEG或选自PEG 200，PEG 300，PEG 400及其组合的多种PEG化合物。
在其他情况下，所述冷冻保护液还包含选自卵清蛋白，牛血清白蛋白，人血清白蛋白，明胶及其组合的蛋白质。还在其他情况下，所述防冻剂溶液还包含天然或合成水凝胶，其中所述天然或合成水凝胶包含壳聚糖，透明质酸或其组合。
在非限制性实例中可以使用包括但不限于干细胞，肝组织或肝细胞，肾，肠，心脏，胰腺，骨髓，类器官和其他生物组织的细胞或组织模型来评估冷冻保护液的各种性质的，例如有效浓度，粘度，水溶性和/或膜渗透性。
在一些实施方案中，所述冷冻保护液在约0℃至约-20℃的温度下降低或抑制冰晶形成。在其他实施方案中，所述冷冻保护液在约-20℃至约-40℃的温度下降低或抑制冰晶形成。在某些实施方案中，所述冷冻保护液在约-20℃下减少或抑制冰晶形成。在某些其他实施方案中，所述冷冻保护液在约-40℃至约-200℃(例如约-196℃)的温度下降低或抑制冰晶形成。
在一些实施方案中，所述冷冻保护液在约0℃至约-200℃的温度，约-10℃至约-190℃的温度，约-20℃至约-20℃180℃，约-30℃至约-170℃，约-40℃至约-160℃，约-50℃至约-150℃，约-60℃至约-150℃约-140℃，约-70℃至约-140℃，约-80℃至约-130℃，约-90℃至约-120℃，或约-100℃至约-110℃的温度范围内降低或抑制冰晶形成。
在其他实施方案中，所述冷冻保护液在或约-10℃，在或约-15℃，在或约-25℃，在或约-30℃，在或约-35℃，在或约-40℃，在或约-45℃，在或约-50℃，在或约-55℃，在或约-60℃，在或约-65℃，在约-70℃，在或约-75℃，在或约-80℃，在或约-85℃，在或约-90℃，在或约-95℃，在或约-100℃，在约-105℃，在或约-110℃，在或约-115℃，在或约-120℃，在或约-125℃，在或约约-135℃，在或约-140℃，在或约-145℃，在或约-150℃，在或-155℃，在或约-160℃，在或约-165℃，在或约-170℃，在或约-175℃，在或约-180℃，在或约-185℃，在或约-190℃，在或约-195℃，在或约-196℃，在或约-200℃下降低或抑制冰晶形成。
在一些实施方案中，冷冻保护液中类肽聚合物和/或类肽-肽杂合物的浓度在约100nM和约100mM之间。在一些实施方案中，冷冻保护液中类肽聚合物和/或类肽-肽杂合物的浓度在约100nM至约250nM之间，约250nM至约500nM之间，约500nM至约750nM之间，约750nM和约1μM之间，约1μM和约5μM之间，约5μM和约25μM之间，约25μM和约50μM之间，约50μM和约100μM之间，约100μM和约250μM之间约250μM至约500μM之间，约500μM至约750μM之间，约750μM至约1mM之间，约1mM至约10mM之间，约10mM至约50mM之间或约50mM和约100mM。在一些实施方案中，冷冻保护液中类肽聚合物和/或类肽-肽杂合物的浓度为约100nM，约1μM，约10μM，约100μM，约1mM，约10mM或约100mM。在具体的实施方案中，冷冻保护液中类肽聚合物和/或类肽-肽杂合物的浓度为约1,2,3,4,5,6,7,8,9或10mM。
在其他方面，本发明提供了用于保存生物样品的方法。在特定的实施方案中，生物样品具有细胞组成。在一些实施方案中，生物样品是组织。在其他实施方案中，生物样品是器官。还在其他实施方案中，生物样品是细胞。在特定的实施方案中，生物样品包含一种或多种组织，器官或细胞，或它们的组合。在一些实施方案中，所述方法包括使生物样品与本发明所述的类肽聚合物，类肽-肽杂合物，冷冻保护液或其组合接触。在一些情况下，当使用组合物或溶液的组合时，使生物样品与组合物或溶液接触可以在多个步骤中完成。作为非限制性实例，可以首先将生物样品与本发明所述的类肽聚合物接触，然后在稍后的时间点将生物样品与本发明所述的冷冻保护溶液接触。
在特定情况下，组织是生物工程组织。在一些情况下，生物样品选自心脏，肝，肺，肾，胰腺，肠，胸腺，角膜，神经细胞，血小板，精子细胞，卵细胞，胚胎细胞，干细胞，骨细胞及其组合。
冷冻保护可用于多种生物样品的保存。非限制性实例包括类器官保存，干细胞保存(例如造血干细胞，胚胎干(ES)细胞，多能干细胞(PSC)和诱导多能干细胞(iPSC))，成体细胞和细胞系的保存(例如淋巴细胞，粒细胞，免疫系统细胞，骨细胞)，胚胎，精子和卵细胞保存，组织保存和器官保存。例如，在器官移植领域，保存组织，器官和其他生物样品和结构十分有效。同样作为本领域技术人员所周知，本发明也包括对生物样品冷冻保护的其他广泛应用。
在其他方面，本发明提供了用于保存一种或多种生物大分子的方法。所述生物大分子包括天然存在或非自然存在的生物大分子。适合于通过本发明的组合物和方法进行低温保护的生物大分子的非限制性实例包括核酸(例如DNA，RNA)，氨基酸，蛋白质，肽，脂质和复合结构(例如脂质体)。在一些实施方案中，所述方法包括使生物大分子与本发明所述的类肽聚合物，类肽-肽杂合物，冷冻保护液或其组合接触。在一些情况下，生物大分子是纯化分离的蛋白质。在特定情况下，纯化分离的蛋白质是蛋白酶。在一些情况下，当使用组合物或溶液的组合时，使一种或多种生物大分子与组合物或溶液接触可以在多个步骤内完成。作为非限制性实例，可首先将一种或多种生物大分子与本发明所述类肽聚合物接触，然后在稍后的时间点将生物样品与所述的冷冻保护溶液接触。
使用本发明的组合物和方法对生物大分子进行低温保护可用于多种用途。适合的非限制性实例包括保存DNA(例如基因组DNA)和RNA样品，保存干细胞生长因子和保存抗体。本领域技术人员将很容易推演出在其他应用领域施用本发明的组合物和方法。
在具体的实施方案中，分离的蛋白质是已经结晶的蛋白质。晶体冷冻保护已成为用于研究生物大分子(例如蛋白质和肽)的晶体学方法的重要工具。在很多情况下，对被实验样品进行低温保护和随后的在超低温状态下进行数据采集对于获得完整的数据集并克服x射线对样品的辐射损伤问题来说是至关重要的。此外，，低温处理已经成为一个理想的方法允许晶体学家操作小的晶体，因为其可以进行晶体的长期储存而不会损失衍射质量。冷冻保护液提供了一种手段来保护大分子晶体免受冷冻过程中冰形成的破坏性影响。冷冻保护通常涉及将晶体浸入形成无定形玻璃的溶液中(即玻璃化)，同时在液氮中迅速冷却。理想的结晶学冷冻保护液应该是超高效的(即，冷冻保护液在低浓度下达到有效的保护结果)。目前可用的冷冻保护液并不具有超高效的特点。因此，如果冷冻保护液浓度太低，在实验过程中会形成结晶冰，从而导致背景干扰。若冷冻保护液浓度太高，由于溶剂效应，X射线高能照射瞬间，被测晶体结构可能立即被溶解，则会得到低质量数据从而影响后续的结构分析。例如，在X射线晶体学应用中使用的现有技术水平的冷冻保护液需要使用20％乙二醇以防止在晶体蛋白质储存温度下形成冰晶。在收集X射线数据期间，乙二醇被加热，并溶解晶体，从而阻碍进一步的数据收集。有关其他信息，请参阅Garman et al,J.Appl.CRYST.30：211(1997)。
在一些实施方案中，本发明所述的类肽聚合物，类肽-肽杂合物或冷冻保护液或其组合可以减少X射线数据收集期间晶体的溶解。在一些实施方案中，本发明描述的类肽聚合物，类肽-肽杂合物，冷冻保护液或其组合能够降低背景散射。
使用本发明的组合物和方法进行低温保护的生物样品和大分子可以来自任何生物界物种(例如动物界(包括但不限于人和家畜动物)，植物界，真菌(包括但不限于蘑菇)，原生生物，古细菌/古细菌和细菌/真细菌)。
另一方面，本发明提供了一种美容护理产品。在一些实施方案中，美容护理产品包含发明描述的类肽聚合物，类肽-肽杂合物，冷冻保护溶液或其组合。在一些实施方案中，美容护理产品是护肤产品。在一些实施方案中，护肤产品是局部应用的。典型的局部用制剂配方包括乳膏，血清，软膏，喷雾剂，洗剂和贴剂。
另一方面，本发明提供了一种防冻产品，例如除冰或防冰产品。在一些实施例中，防冻产品包含发明所述的类肽聚合物，类肽-肽杂合物，低温保护溶液或其组合。在一些实施例中，防冻产品用于防止，抑制或延迟物体上的冰的形成，包括但不限于一般的机械和电气设备。在一些实施例中，防冻产品防止，抑制或延迟飞机或其部件，无人驾驶飞机，汽车或其部件，包括汽车发动机，齿轮系统，制动系统，窗户，喷淋系统，输气管道或电气电缆，包括电力线。在其他情况下，防冻产品可用作动力学水合物抑制剂。在一些实施方案中，防冻产品进一步包含乙二醇，甲醇，丙二醇，甘油或其组合。
另一方面，本发明提供了一种冷冻食品相关的产品。在一些实施方案中，冷冻食品相关产品包含此发明所述的类肽聚合物，类肽-肽杂合物，低温保护溶液或其组合。在一些实施方案中，冷冻食品可选自冰淇淋，酸奶，海鲜，水果和肉制品。在一些实施方案中，冷冻食品的相关产品还包含丙二醇。
E.超低温保存方案
本发明所述的组合物和方法适用于任何数量的冷冻保存方案。作为非限制性实例，本发明的组合物和方法可用于在超冷保存至零度以下的高域温度(例如0℃至-20℃)期间进行冷冻保存。在器官移植领域，器官通常用冰进行冷却(例如，冷却至0-4℃)，移植窗限制在约10小时。通过使用含有常用小分子CPA的冷冻保护液进行体外机器灌注，可以在-6℃的温度下将器官保存长达96小时。尽管进一步降低冷冻保存温度到-6℃以下，可以延长可能的冷冻保存时间，但是用现有CPA达不到这样的效果，因为进一步降低温度所需的高浓度CPA具有高毒性将导致不可逆的器官损伤。有关更多信息，请参阅，Uygun K,et.al.Nat.Protoc.10(3):484-94(2015)。使用离体灌注方法或以其他方式使生物样品(例如器官和组织)或大分子与类肽聚合物，类肽-肽杂合物和/或本文描述的冷冻保护液接触，可实现过冷到高亚零度的温度，从而允许在低于目前可行温度的低温下进行更长时间的低温保存。本领域技术人员即可发现本发明对其他零度下高域温度超冷保存的应用方向。
作为另一个非限制性实例，本发明的组合物和方法可用于低温保存步骤(例如-20℃至-196℃)。通常至少在部分温度降低期间以程序控温(有时称为慢速冷冻)的方法执行冷冻方案。例如，生物样品或大分子可以与本发明所述的类肽聚合物，类肽-肽杂合物和/或冷冻保护液接触，并以程序降温(例如以1℃/每分钟的降温速率)的方式直到达到所需的温度。或者，可以以受控速率降低温度直至达到所需温度(例如，在-80℃和-180℃之间)，然后可以将样品或大分子快速冷冻(例如，把样品浸入到液氮或将样品或大分子置于液氮之上)。只要在破坏保存的样品或大分子的冰晶形成之前，类肽聚合物，类肽-肽杂合物或冷冻保护液可以与在该方案期间的任何时刻与被冷冻保存的样品或大分子接触。
作为又一个非限制性实例，本发明的组合物和方法可用于低温冷冻方案(例如-90℃至-196℃)。例如，生物样品或大分子可与本发明所述的类肽聚合物，类肽-肽杂合物或冷冻保护液接触，然后插入液氮或液氮蒸气流中以快速冷冻样品而不形成冰晶。由于无冰晶存在，因此样品或大分子中的水处于无定形或玻璃状态，因此起破坏作用的冰不会形成。
本领域技术人员将容易理解，根据特定的生物学样品和/或被冷冻保存的大分子以及特定的冷冻保存方案，本发明描述的类肽聚合物，类肽-肽杂合物和冷冻保护液的浓度和组成可以随之改变。
F.筛选方法
在一个相关方面，本发明提供了筛选类肽聚合物，类肽-肽杂合物和/或冷冻保护液的效率的方法。
在一个实施方案中，使用偏光显微镜检测冰晶形成来筛选类肽聚合物，类肽-肽杂合物和/或冷冻保护液是否可以降低水的冰点。偏振光显微镜是一种使用偏振光作为光源的光学显微镜技术。图像对比起因于平面偏振光与双折射(或双折射)物质的相互作用，以产生两个单独的波分量，每个波分量在相互垂直的平面中被各自偏振。通常普通和非常波前的这些分量的速度是不同的，并且随着穿过样本的传播方向而变化。离开样品后，轻组分变得不同相，但当它们通过分析仪时，它们会产生相长和相消干涉。这种干扰在样品中产生可检测的对比度。使用这种技术很容易检测到冰晶形成，因为冰晶是双折射物质。在标准实验中，比较将包含类肽聚合物，类肽-肽杂合物和/或冷冻保护液的样品冷却至所需温度达所需的时间以及将一个或多个样品在设定的温度下放置在偏振光显微镜下，检查有无冰晶的形成。
在一个实施方案中，使用差示扫描量热法定量热滞后活性来筛选类肽聚合物，类肽-肽杂合物和/或冷冻保护液是否可以降低水溶液的凝固点。差示扫描量热法是一种热分析技术，其中测量升高样品和参比物所需热量的差异为温度的函数。当发生相变等物理变化时，需要比基准更多或更少的热量流入样品，以保持相同的温度。参比样品和样品之间的温度差异报告了样品在低于0℃的温度下降低或抑制冰晶形成的能力。在标准实验中，将包含类肽聚合物，类肽-肽杂合物和/或冷冻保护液的样品与缺少类肽聚合物，类肽-肽杂合物和/或冷冻保护液的参考样品进行比较。
G.冷冻复苏后细胞存活率测定以测试化合物效率
在一个相关方面，本发明提供细胞存活力测定细胞经类肽聚合物，类肽-肽杂合物和/或冷冻保护液冷冻复后的复苏存活率。
在一些实施方案中，使用细胞活力测定方法来测定细胞存活率。简言之，商品名称为resazurin(7-羟基-3H-吩恶嗪-3-酮10-氧化物)，是一种无毒的可以透过细胞的化合物，呈蓝色，几乎不发荧光。进入细胞后，resazurin被还原成resorufin，这是一种红色和高荧光的化合物。随着活细胞不断将resazurin转化为resorufin，周围细胞的整体荧光和颜色也会随之增加。死细胞细胞不能将resazurin转化为resorufin，因此细胞的培养基的总体荧光和颜色和样品中活细胞相对量成正比。在标准实验中，将细胞和类肽聚合物，类肽-肽杂合物和/或冷冻保护液在任何合适的容器中混合。然后将混合物冷却至目标温度(低于0℃)并保持一定的时间。然后将细胞恢复至环境温度，并添加试剂，温育并按照Thermo Fisher方案进行测量。通常，通过测量样品在波长处的相对荧光值来确定细胞得存活率。
在一些实施方案中，使用Thermo Fisher Scientific Inc.提供的用于哺乳动物细胞的存活率/细胞毒性试剂盒测试细胞活性。该试剂盒使用两种指示剂分子：钙黄绿素AM和乙胺高同型二聚体-1(EthD-1)。活细胞的特征在于其普遍存在的细胞内酯酶活性，该酶可以把实际上没有荧光的细胞渗透性钙黄绿素AM酶促转化为强荧光钙黄绿素来测定细胞活力。聚阴离子染料钙黄绿素能够很好地保留在活细胞内，在活细胞中产生强烈均匀的绿色荧光相反，EthD-1进入膜损伤的细胞后与核酸结合后荧光可以增强40倍，从而在死细胞中产生鲜红色荧光 值得注意的是，EthD-1不能够进入具有完整细胞膜的活细胞，因此活细胞和死细胞很容易通过此测定区分。通过传统的荧光素长通滤光片同时观查到钙黄绿素和EthD-1的荧光。或者，也可以分别观察来自这些染料的荧光，比如可以用标准荧光素带通滤光片观察钙黄绿素的荧光，用碘化丙啶或德克萨斯染料的滤光片观察EthD-1的荧光。在标准实验中，将细胞和类肽聚合物，类肽-肽杂合物和/或冷冻保护液在任何合适的容器中混合。然后将混合物冷却至所需的低于0℃的温度，在该温度下保持所需的时间，然后返回至环境温度。随后的步骤包括添加钙黄绿素AM和EthD-1试剂并按照Thermo Fisher方案中所述测量荧光信号。典型地，通过测量两种试剂在上述指定波长下的相对荧光来确定细胞的活力。
在一些实施方案中，使用MTT法测定细胞活力。MTT法是通过比色法检测细胞存活和生长的方法。其依赖于黄色四唑MTT(3-(4,5-二甲基噻唑基-2)-2,5-二苯基四唑鎓溴化物)还原为水不溶性的蓝紫色结晶甲瓒(Formazan)并沉积在细胞中，而死细胞无此功能其。四唑染料还原依赖于NAD(P)H-依赖性氧化还原酶，其主要位于代谢活跃的活性细胞的胞质室中。MTT测定试剂盒可从例如ATCC(www.atcc.org)或Sigma-Aldrich(www.sigmaaldrich.com)获得。在标准实验中，将细胞和类肽聚合物，类肽-肽杂合物和/或冷冻保护液在任何合适的容器中混合。然后将混合物冷却至所目标温度(低于0℃)并保持所需的时间，之后将细胞恢复至环境温度，并加入MTT试剂，温育并按照ATCC或Sigma-Aldrich方案所述进行测定。通常，转换的染料的吸光度在570nm的波长下测量，同时扣除630-690nm的背景。
IV.例子
提供以下实施例来举例说明，其实例不限制本发明的权利要求。
实例1.类肽抑制冰晶形成
该实施例说明了在低于0℃的温度下N-取代的类肽聚合物和类肽-肽杂合物的冰晶抑制性质。
毛细管法
在该实验中，在含有MilliQ超纯水的毛细管中制备四种水溶液。一个样品仅含有水，另一个样品含有160mM乙二醇(EG)。另两个样品各含有9mM的类肽聚合物。类肽聚合物样品之一含有的类肽聚合物含称为“化合物1”，而另一种样品含有的类肽聚合物称为“化合物10”。类肽聚合物的序列如下：
化合物1:Nsb-Nsb-Nhp-Nsb-Nsb-Nhp-Nsb-Nsb-Nhp-Nsb(SEQ ID NO:1)；
化合物10:Nhp-Nhp-Nhp-Nhp-Nhp-Nhp-Nhp-Nhp-Nhp-Nhp(SEQ ID NO:2).
化合物的结构见表2.
样品制备后，将所有样品在珀耳帖半导体冷台上缓慢冷却并在-20℃下保持恒温。一小时后，并立即使用180x立体变焦显微镜的数码相机拍照(图2A)。水和EG样品显示出明显的冰晶形成，其中EG样品显示比仅含水样品更少的冰形成。相反，含有类肽聚合物化合物的样品均无结冰。图2B显示均值归一化的数据。值得注意的是，EG样品的浓度为类肽样品浓度的18倍，仍然明显结冰，而类肽样品则无结冰。
晶体x射线衍射法
为了增加类肽筛选的通量，使用晶体学X射线衍射(XRD)技术来评估冰晶形成。对于这些实验，测试了名为“化合物2”，“化合物8”，“化合物10”，“化合物11”，“化合物12”，“化合物13”和“化合物58”的样品。化合物2,8,10,11,12和13是类肽聚合物，其结构在表2中给出。化合物58是类肽-肽杂合物，其结构在表10中给出。化合物58化合物12结构类似，不同之处在于在N-末端最后的残基以精氨酸氨基酸替代。
对于这些实验，使用15％至30％(v/v)的EG浓度。通常，在35-40％(v/v)浓度的XRD样品分析期间使用EG，DMSO和其他冷冻保护液来玻璃化溶液并避免来自冰晶的衍射干扰。使用1和5mg/mL类肽和类肽-肽化合物的浓度。图3A，3B和3C分别示出了在完全玻璃化，部分玻璃化存在立方冰和冷冻(立方冰晶)的条件下的XRD数据。化合物8,10,11,12,13和58的XRD数据提供于图4A-4G和图5A-5G中。图3D给出了各种EG浓度和两种化合物2,8和12浓度形成的冰结晶环数目累加结果。
测试溶液样品组的几种混合物显示出极强抗冰效果。图3D显示了与EG相比的一些类肽聚合物溶液的实验结果。“IceRing1”和“IceRing2”是指冰结晶环的形成得分，其范围介于0(不形成冰环)和15(大量冰环的形成)之间。化合物2,12和8等的添加可抑制冰晶结晶环的形成，并显着降低了必需的EG浓度。
在经液氮快速降温后，样品中含有浓度为5mg/mL(0.5％(w/v))的化合物12和浓度为17.5％(v/v)的EG完全玻璃化，没有冰晶形成。该特定混合物在液氮蒸气流中进行快速降温的多次试验中的可完全抑制冰的形成(图3A)，并且大大优于30％EG的标准溶液(图3B)。在这些图中，黑点和环代表冰晶。与相同摩尔浓度的EG相比，抗冰效果强500倍。在不划归任何特定理论的情况向，此结果提示此类肽化合物的抑制结冰的机制与天然抗冻蛋白质相似，为非依数性。
容积扩大化测试
为了测试本发明组合物在更大容积量的应用中的有效性，在此我们使用与用于标准卵子和干细胞保存的体积类似的溶液体积进行实验。在这个实验中，将两种样品，一种含有22.5％EG和缓冲液，另一种含有22.5％EG，5mg/ml(0.5％w/v)化合物12和缓冲液的样品在液氮中快速冷冻。如图6A所示，化合物12溶液显示完全玻璃化，在从液氮中取出后不立即形成冰，而对照溶液明显被冷冻，产生大量白色冰晶。在37℃水浴中复温，导致了意想不到的效果。在复温过程中，化合物12溶液经理反玻璃化(图6B，右)的过程小于2秒并迅速融化，而在20秒后可以观察到明显白色大尺寸冰块漂浮在对照样品中(图6B，左)。样品管外部有冷凝水现象，因为管体温度实际上仍然远低于室温。该结果表明化合物12在解冻过程中有抑冰剂的功能。
此外，将100μL样品在-20℃冰箱中放置过夜后，发现化合物12溶液未被冷冻(图6C，右)。该结果表明，本发明的组合物提供了在低于0℃的温度下长时间保存样品而不结冰的能力。此外，这些实验表明，通过低温低温保存或通过过冷方法，在-20℃以及接近玻璃化温度-80℃通过掺入本发明的化合物可以达到无冰条件，从而显著降低降低所需渗透性CPAs的有效浓度同时降低了冷冻保存的毒性。
如此处所示，发现化合物12的制剂在亚毫升体积的玻璃化过程中防止了冰的形成。事实上，这些溶液在-20℃时能够保持完全无结晶，并且在-196℃下速冷时也能够玻璃化。目前，用于体外受精的标准人类卵细胞保存技术溶液体积低于5uL(通常为0.5至2.5μL)，同时使用50％或更高的冷冻保护液浓度。因此，化合物12在相应的体积条件下能够防止冰形成，并且仅需要非常低浓度的小分子冷冻保护液，这使得其非常有利于在体外受精手术中，安全保存人源卵细胞。
实例2.细胞毒性和冷冻保存筛选
该实施例表明，本发明的组合物几乎不具有细胞毒性，并且与现有化合物相比可以优化低温保存的结果，同时减少CPA需要量并因此降低CPA相关的毒性。
细胞毒性方法
为了证明本发明的冷冻保护液组合物的安全性，使用HEK293细胞系开发了基于细胞的高通量细胞毒性测定的方法。HEK293细胞系是在组织培养中从人类胚胎肾细胞中分离的容易培养和增殖的干细胞系。
使用Tecan Genesis全自动液体处理系统在96孔板和384孔板上制备溶液。溶液含有细胞培养液，缓冲液，冷冻保护液组合物(化合物12)或DMSO。将溶液调节至所需的pH值。进行连续稀释以获得含有各种浓度的化合物12和DMSO的溶液。仅使用细胞培养液进行对照实验。
对于这些实验，将细胞以低密度接种(即10％覆盖率)，暴露于含有化合物12或DMSO的溶液中，并置于37℃培养箱中。通常约3至5天后当仅用空载体的对照细胞细胞生长接近70％长满的时候，通过MTT分析评估化合物的细胞毒性。
如图7所示，当通过MTT测定分析时，化合物12的毒性曲线与仅仅使用细胞培养液的对照组没有明显差别。另一方面，在高于0.5％(v/v)的任何浓度下，DMSO对细胞已经有显著毒性。值得注意的是，化合物12在其可以防止非生物样品中形成冰的有效浓度(0.5％w/v)下不显示毒性，并且在比该浓度高4倍的浓度下仍然没有显示出明显的毒性。
这些结果表明，即使在DMSO对细胞具有毒性显著降低细胞存活的浓度下，本发明的组合物也可以有效地预防冰晶的形成，并对细胞没有显著毒性。
基于细胞的冷冻保存测试
最初基于细胞的冷冻保存测试，使用简单的溶液在加入和不加入化合物12进行实验，以最最大化减小混杂的外部因素得影响。对于第一组实验，制备两种样品溶液。第一个样品溶液含有浓度为22.5％(v/v)的乙二醇(EG)和缓冲液，第二个样品溶液含有EG(22.5％(v/v))，5mg/mL(0.5％(w/v))的化合物12和缓冲液。
当HEK293细胞生长直至70％覆盖率的时候，用胰蛋白酶处理除去粘附蛋白使细胞与培养基分离并悬浮。使用血细胞计数器对细胞进行计数，并将样品细胞浓度调节至每微升10,000个细胞的最终浓度。通过离心将细胞压缩成紧密的细胞团粒，随后将每个样品与20μL的样品溶液混合。然后将样品浸入液氮中快速冷冻，最后在37℃水浴中复温。在复温后，将细胞用400倍体积的培养液进行稀释。正对照样品在37℃下不经过冷冻复温，持续浸润在培养液中。负对照样品仅在冻融过程中仅适用细胞培养液，并对其进行冷冻复温处理。细胞解冻后，用钙黄绿素AM染色30分钟，并使用荧光板读数器测量细胞活性。
如图8所示，化合物12的加入极大地改善了细胞存活率，这说明化合物具有很强的冷冻保存细胞的能力。同时观察到含有化合物12的样品在冷冻过程期间实现完全玻璃化而不形成冰。另外，与缺少化合物12的样品相比，化合物12可以更快的通过反玻璃化过程，减少冰晶造成的损伤。
进行第二组实验以评估含有5mg/mL化合物12加上二醇，二糖和一般缓冲液的混合制剂的冷冻保存能力。样品在经液氮玻璃化后解冻后细胞的存活率的评价如上所述。如图9所示，冷冻处理后，含有化合物12的样品中到细胞存活率接近100％(即98％)，这与未用液氮冷冻处理的对照组结果类似的。细胞形态和荧光信号与非冷冻处理的对照组十分近似，这表明经此冷冻保护液处理的细胞在经历降温复温后几乎没有发生任何损伤。
作为第二组实验的一部分，将制剂的冷藏保存能力与两种已知的冷冻保存试剂进行了比较。VS2E是一种含有非化学定义的聚合物但是不含DMSO和血清的溶液。DMSO的无血清溶液(参见Nishigaki et al.Int.J.Dev.Biol.55:3015-311(2011)。并且M22是一种从21st Century Medicine购买的用于进行器官玻璃化的溶液。图9显示包含化合物12相对于VS2E和M22制剂可实现更优化的低温保存，VS2E和M22的细胞存活率分别为72％和51％。应该注意的是，对于M22样品，背景荧光可能导致实验结果高于实际，因为图像中的显示的活细胞成像表明经M22处理的样品在复苏后具有远低于51％的细胞存活率。
本发明的组合物在含有明显减少的乙二醇量的溶液中防止形成冰的能力非常有效。具体而言，低浓度的组合物(例如0.5％(w/v))足以在玻璃化过程中阻止冰的生长，并使溶液保持在20uL规模的无冰液体状态，这种体积规模规模对于保存各种类型的细胞都是有用的。
总之，这些结果显示本发明的组合物可以实现优异的低温保存并减少CPA的使用量，从而减少与CPA相关的细胞毒性。本发明中组合物的优越性质对于细胞治疗用细胞，特别敏感的细胞系和/或需要被长期培养的细胞特别有用。
示例性实施方案
根据当前公开的主题提供的示例性实施方案包括但不限于权利要求和以下实方案：
1.类肽聚合物的结构如结构式(I)所示：
包含其互变异构体或其立体异构体，
其中：
每个R1独立地选自H，任选取代的C1-18烷基，任选取代的C2-18烯基，任选取代的C2-18炔基，任选取代的C1-18羟烷基，任选取代的烷氧基，任选取代的C1-18烷基氨基任，选取代的C1-18烷基硫基，任选取代的羧基烷基，C3-10环烷基，杂环烷基，芳基，杂芳基，(C3-10环烷基)烷基，(杂环烷基)烷基，芳基烷基和杂芳基烷基，
其中R1的至少一个是C1-18羟烷基，和
其中所述环烷基，杂环烷基，芳基和杂芳基基团中的任一个任选且独立地被一个或多个R 3基团取代；
每个R2独立地选自H，任选取代的C1-18烷基，任选取代的C2-18烯基，任选取代的C2-18炔基，任选取代的C1-18羟烷基，任选取代的C1-18烷基氨基，任选取代的C1-18烷硫基和任选取代的羧烷基；
每个R3独立地选自卤素，氧代，硫代，OH，SH，氨基，C1-8烷基，C1-8羟烷基，C1-8烷氨基和C1-8烷硫基；
X和Y独立地选自H，任选取代的C1-8烷基，任选取代的C1-8酰基，任选取代的C1-8烷氨基，羟基，巯基，氨基，羧基，任选取代的C1-8羟烷基，任选取代的C1-8烷氨基，任选取代的C2-8烷硫基，任选取代的C1-8羧烷基和卤素X；或者
或者X和Y一起形成共价键；和
代表聚合物中单体数目的下标n在2和50之间；
条件是当n在3和7之间时，R1的所有情况都不是羟乙基。
2.实施方案1所述的类肽聚合物，其中每个R 1独立地选自由以下组成
其中：
m在1和8之间；和
R3选自H，C1-8烷基，卤素，羟基，巯基，硝基，胺，氧代基和硫代基
3.实施方案2所述的类肽聚合物，其中一个或多个R1具有根据R1a的结构：
4.实施方案3所述的类肽聚合物，其中每个R1a基团独立地选自：
5.实施方案3所述的类肽聚合物，其中每个R 1a基团是：
6.实施方案3所述的类肽聚合物，其中每个R1a基团是：
7.实施方案2所述的类肽聚合物，其中一个或多个R1具有根据R1b的结构：
8.实施方案7所述的类肽聚合物，其中每个R1b基团独立地选自：
9.实施方案7所述的类肽聚合物，其中每个R1b基团是：
10.实施方案7所述的类肽聚合物，其中每个R1b基团是：
11.实施方案1所述的类肽聚合物，其中每个R1独立地选自由以下组成的组；
12.实施方案1所述的类肽聚合物，其中每个R1是独立选择的C1-18羟烷基。
13.实施方案12所述的类肽聚合物，其中每个R1是独立选择的C1-6羟烷基。
14.实施方案13所述的类肽聚合物，其中每个R1是相同的C1-6羟烷基。
15.实施方案14所述的类肽聚合物，其中R1的每个实例是
16.实施方案1至15中所述的任一项的类肽聚合物，其中R2的每个实例为H。
17.实施方案1至16中所述的任一项的类肽聚合物，其中n在3和25之间。
18.实施方案1至16中所述的任一项的类肽聚合物，其中n在8至50之间。
19.实施方案1至16中所述的任一项的类肽聚合物，其中n在8和20之间。
20.实施方案1至19中所述的任一项的类肽聚合物，其中X选自H，C1-8烷基和C1-8酰基；Y选自羟基和氨基。
21.实施方案1至19中所述的任一项的类肽聚合物，其中X和Y一起形成共价键。
22.实施方案1所述的类肽聚合物，其中n是10，并且类肽聚合物包含：
3个Nhp(2-((2-羟丙基)氨基)乙酸)单体和7个Nsb(2-(仲丁基氨基)乙酸)单体；或者
4个Nhp单体和6个Nsb单体；或者
5个Nhp单体和5个Nsb单体；或者
6个Nhp单体和4个Nsb单体；或者
7个Nhp单体和3个Nsb单体；或者
8个Nhp单体和2个Nsb单体；或者
10个Nhp单体。
23.实施方案22所述的类肽聚合物，其中类肽聚合物具有序列Nhp-Nhp-Nhp-Nhp-Nhp-Nhp-Nhp-Nhp-Nhp-Nhp；X是H或C1-8酰基；并且Y是羟基或氨基或C 1-8烷基。
24.实施方案22所述的类肽聚合物，其中所述类肽聚合物具有序列Nsb-Nsb-Nhp-Nsb-Nsb-Nhp-Nsb-Nsb-Nhp-Nsb；X是H或C1-8酰基；并且Y是羟基或氨基或C 1-8烷基。
25.实施方案22所述的类肽聚合物，其中类肽聚合物具有序列Nsb-Nhp-Nhp-Nhp-Nsb-Nhp-Nhp-Nhp-Nsb-Nhp；X是H或C1-8酰基；并且Y是羟基或氨基或C 1-8烷基。
26.实施方案22所述的类肽聚合物，其中所述类肽聚合物具有序列Nsb-Nsb-Nhp-Nhp-Nsb-Nsb-Nhp-Nhp-Nsb-Nsb；X是H或C1-8酰基；并且Y是羟基或氨基或C 1-8烷基。
27.实施方案22所述的类肽聚合物，其中类肽聚合物具有序列Nsb-Nhp-Nhp-Nhp-Nhp-Nhp-Nsb-Nhp-Nhp-Nhp；X是H或C1-8酰基；并且Y是是羟基或氨基或C 1-8烷基。
28.实施方案22所述的类肽聚合物，其中类肽聚合物的序列见表2序列。
29.实施方案1所述的类肽聚合物，其中n是10，并且类肽聚合物包含：
3个Nhp(2-((2-羟丙基)氨基)乙酸)单体和7个Nme(2-(甲基氨基)乙酸)单体；或者
4个Nhp单体和6个Nme单体；或者
5个Nhp单体和5个Nme单体；或者
6个Nhp单体和4个Nme单体；或者
7个Nhp单体和3个Nme单体；或者
8个Nhp单体和2个Nme单体。
30.实施方案29所述的类肽聚合物，其中类肽聚合物序列见表3。
31.实施方案1所述的类肽聚合物，其中n是10，并且类肽聚合物包含：
5个Nhe(2-((2-羟乙基)氨基)乙酸)单体和5个Nsb(2-(仲丁基氨基)乙酸)单体；或者
5个Nhp(2-((2-羟丙基)氨基)乙酸)单体和5个Nbu(2-丁氨基)乙酸)单体。
32.实施方案31所述的类肽聚合物，其中所述类肽聚合物的序列见表4。
33.实施方案1所述的类肽聚合物，其中n是10，并且类肽聚合物包含：
4个Nhp(2-((2-羟丙基)氨基)乙酸)单体和6个Nib(2-(异丁基氨基)乙酸)单体；或者
4个Nhp单体和6个Nbu(2-丁基氨基)乙酸)单体；或者
4个Nhp单体和6个Npr(2-丙基氨基)乙酸)单体；或者
4个Nhp单体和6个Nip(2-(异丙基氨基)乙酸)单体。
34.实施方案33所述的类肽聚合物，其中所述类肽聚合物的序列见表5。
35.实施方案1所述的类肽聚合物，其中n为14，并且类肽聚合物包含：
6个Nhp(2-((2-羟丙基)氨基)乙酸)单体和8个Nsb(2-(仲丁基氨基)乙酸)单体；或者
7个Nhp单体和7个Nsb单体；或者
8个Nhp单体和6个Nsb单体；或者
10个Nhp单体和4个Nsb单体；或者
14个Nhp单体。
36.实施方案35所述的类肽聚合物，其中类肽聚合物具有表6列出的序列。
37.实施方案1所述的类肽聚合物，其中n为14，并且类肽聚合物包含：
6个Nhp(2-((2-羟丙基)氨基)乙酸)单体和8个Nib(2-(异丁基氨基)乙酸)单体；或者
7个Nhp单体和7个Nib单体；或者
8个Nhp单体和6个Nib单体；或者
10Nhp单体和4个Nib单体；或者
14个Nhp单体。
38.实施方案37所述的类肽聚合物，其中类肽聚合物具有表7列出的序列。
39.实施方案1所述的类肽聚合物，其中n为16，并且类肽聚合物包含：
5个Nhp(2-((2-羟丙基)氨基)乙酸)单体和11个Nsb(2-(仲丁基氨基)乙酸)单体；或者
7个Nhp单体和9个Nsb单体；或者
8个Nhp单体和8个Nsb单体；或者
10个Nhp单体和6个Nsb单体；或者
12个Nhp单体和4个Nsb单体；或者
16个Nhp单体。
40.实施方案39所述的类肽聚合物，其中类肽聚合物具有表8列出的序列。
41.实施方案1所述的类肽聚合物，其中n为22，并且类肽聚合物包含：
7个Nhp(2-((2-羟丙基)氨基)乙酸)单体和15个Nsb(2-(仲丁基氨基)乙酸)单体；或者
10个Nhp单体和12个Nsb单体；或者
11个Nhp单体和11个Nsb单体；或者
14个Nhp单体和8个Nsb单体；或者
17个Nhp单体和5个Nsb单体；或者
22个Nhp单体。
42.实施方案41所述的类肽聚合物，其中所述类肽聚合物具有表9所列的序列。
43.实施方案1至42中所述任一项的类肽聚合物，其中所述类肽聚合物形成螺旋结构。
44.实施方案1至43中所述任一项的类肽聚合物，其中类肽聚合物在约0℃至约-20℃的温度下降低或抑制冰晶形成。
45.实施方案1至43中所述任一项的类肽聚合物，其中所述类肽聚合物在约-20℃至约-40℃的温度下降低或抑制冰晶形成。
46.实施方案1至43中所述的任一项的类肽聚合物，其中所述类肽聚合物在约-20℃下减少或抑制冰晶形成。
47.实施方案1至43中所述的任一项的类肽聚合物，其中所述类肽聚合物在约-40℃至约-200℃的温度下降低或抑制冰晶形成。
48.包含实施方案1至47中所述的任一项的类肽聚合物和一个或多个氨基酸的类肽-肽杂合物，其中所述一个或多个氨基酸位于类肽聚合物的一端或两端和/或一个或多个类肽单体中间。
49.实施方案48所述的类肽-肽杂合物，其中所述一种或多种氨基酸选自丙氨酸，半胱氨酸，天冬氨酸，谷氨酸，苯丙氨酸，甘氨酸，组氨酸，异亮氨酸，精氨酸，赖氨酸，亮氨酸，甲硫氨酸，天冬酰胺，脯氨酸，谷氨酰胺，丝氨酸，苏氨酸，缬氨酸，色氨酸，酪氨酸及其组合。
50.实施方案48所述的类肽-肽杂合物，其中所述一种或多种氨基酸选自由异亮氨酸，亮氨酸，丝氨酸，苏氨酸，丙氨酸，缬氨酸，精氨酸及其组合。
51.冷冻保护液包含实施方案1至47中任一项的类肽聚合物，实施方案48至50中任一项的类肽-肽杂合物或其组合。
52.实施方案51所述的冷冻保护液，其进一步包含选自离子，渗透性冷冻保护液，非渗透性冷冻保护液，抗氧化剂，细胞膜稳定化合物，水通道蛋白或其他通道形成化合物，醇，糖衍生物，非离子表面活性剂，蛋白质，二甲基亚砜(DMSO)，聚乙二醇(PEG)，细胞分离液聚乙烯吡咯烷酮，聚乙烯醇，透明质酸，甲酰胺，天然或合成水凝胶及其组合。
53.实施方案52所述的冷冻保护液，其中所述醇选自丙二醇，乙二醇，甘油，甲醇，丁二醇，阿东糖醇，乙醇，1,3-丙二醇，二甘醇，聚环氧乙烷，赤藓糖醇，山梨醇，木糖醇，聚丙烯醇，2-甲基-2,4-戊二醇(MPD)，甘露醇，肌醇，二硫醇，1,2-丙二醇及其组合。
54.实施方案52所述的冷冻保护液，其中所述糖是单糖。
55.实施方案54所述的冷冻保护液，其中所述单糖选自由葡萄糖，3-O-甲基-D-吡喃葡萄糖，半乳糖，阿拉伯糖，果糖，木糖，甘露糖及其组合。
56.实施方案52所述的冷冻保护液，其中所述糖是二糖。
57.实施方案56所述的冷冻保护液，其中所述二糖选自蔗糖，海藻糖，乳糖，麦芽糖及其组合。
58.实施方案52所述的冷冻保护液，其中所述糖是多糖。
59.实施方案58所述的冷冻保护液，其中所述多糖选自由棉子糖，葡聚糖及其组合。
60.实施方案52所述的冷冻保护液，其中PEG具有小于约1,000g/mol的平均分子量。
61.实施方案52所述的冷冻保护液，其中PEG具有约200-400g/mol的平均分子量。
62.实施方案52所述的冷冻保护液，其中所述蛋白质选自卵清蛋白，牛血清白蛋白，人血清白蛋白，明胶及其组合。
63.实施方案52所述的冷冻保护液，其中所述天然或合成水凝胶包含壳聚糖，透明质酸或其组合。
64.实施方案52所述的防冻剂溶液，其中非离子表面活性剂选自聚氧乙烯月桂基醚，聚山梨酸酯80及其组合。
65.用于保存组织，器官或细胞的方法，所述方法包括使组织，器官或细胞与实施方案1至47中所述的任一项的类肽聚合物，实施方案48至50中任一项的类肽–肽杂合物，实施方案51至64所述的中任一项的冷冻保护液或其组合接触。
66.实施方案65所述的方法，其中所述类肽聚合物，类肽-肽杂合物，冷冻保护液或其组合以足以在约0℃至约-20℃的温度下减少或抑制冰晶形成的量存在。
67.实施方案65所述的方法，其中所述类肽聚合物，类肽-肽杂合物，冷冻保护液或其组合以足以在约-20℃至约-40℃的温度下减少或抑制冰晶形成的量存在。
68.实施方案65所述的方法，其中所述类肽聚合物，类肽-肽杂合物，冷冻保护液或其组合以足以在约-20℃的温度下减少或抑制冰晶形成的量存在。
69.实施方案65的方法，其中所述类肽聚合物，类肽-肽杂合物，冷冻保护液或其组合以足以在约-40℃至约-200℃的温度下减少或抑制冰晶形成的量存在
70.实施方案65至69中所述的任一项所述的方法，其中所述的组织是生物工程化的组织。
71.实施方案65至70所述的中任一项所述的方法，其中所述类肽聚合物，所述类肽-肽杂合物或其组合以约100nM至约100mM的浓度存在。
72.实施方案65至71所述的中任一项的方法，其中所述组织，器官或细胞选自心脏，肝脏，肺，肾，胰腺，肠，胸腺，角膜，神经细胞，血小板，精细胞，卵细胞，胚胎细胞，干细胞，人多能干细胞，造血干细胞，淋巴细胞，粒细胞，免疫系统细胞，骨细胞，类器官及其组合。
73.一种用于保存生物大分子的方法，所述方法包括使生物大分子与实施方案1至47中任一项的类肽聚合物，实施方案48至50中任一项的类肽-肽杂合物，实施方案51至64中任一项的冷冻保护液，或其组合接触。
74.实施方案73所述的方法，其中生物大分子选自由核酸，氨基酸，蛋白质，分离的蛋白质，肽，脂质，复合结构及其组合。
75.化妆品护理产品包含实施方案1至47所述的中任一项的类肽聚合物，实施方案48至50中任一项的类肽-肽杂合物，实施方案51至64中任一项的冷冻保护液或其组合。
76.抗冻产品包含实施方案1至47所述的中任一项的类肽聚合物，实施方案48至50中任一项的类肽-肽杂合物，实施方案51至64中任一项的冷冻保护液或其组合。
77.实施方案76所述的防冻产品，其中防冻产品是除冰或防冰的产品，作用是防止，抑制或延迟物体上冰的形成的。
78.根据实施方案77所述的防冻产品，其中所述物体选自航空器或其部件，气体管道，窗户，电气设备，无人机，电缆，电力线，机械设备，汽车发动机，齿轮系统和制动系统。
79.冷冻食品包含实施方案1至47中任一项的类肽聚合物，实施方案48至50中任一项的类肽-肽杂合物，实施方案51至64中任一项的冷冻保护液或其组合。
80.实施方案79所述的冷冻食品相关产品，其中所述冷冻食品选自冰淇淋，酸奶，海鲜，水果和肉制品。
在本说明书中图示和讨论的实施示例仅旨在教导本领域技术人员对发明人来说已知的最好的制造和使用本发明的方式。本说明书中的任何内容都不应被认为是限制本发明的保护范围。所给出的所有例子都是代表性的而非限制性的。如本领域技术人员根据上述教导所理解的那样，本发明的上述实施例可以被修改或改变，而不偏离本发明。因此应该理解，在权利要求及其等价要求的范围内，本发明可以以与本说明书具体描述不同的方式来实施。本说明书中引用的所有出版物，专利和专利申请均通过引用并入本文作为参考，就如同每个单独的出版物，专利或专利申请被具体地和单独地指出并通过引用并入参考。
非正式的序列列表

Claims (80)

1.一种根据式(I)的类肽聚合物：
其互变异构体或其立体异构体
其中：每个R1独立地选自由以下组成的组：H，任选取代的C1-18烷基，任选取代的C2-18烯基，任选取代的C2-18炔基，任选取代的C1-18羟烷基，任选取代的烷氧基，任选取代的C1-18烷氨基，任选取代的C1-18烷硫基，任选取代的羧烷基，C3-10环烷基，杂环烷基，芳基，杂芳基，(C3-10环烷基)烷基，(杂环烷基)烷基，芳烷基和杂芳烷基，
其中R1的至少一个实例是C1-18羟烷基，和
其中所述环烷基，杂环烷基，芳基和杂芳基基团中的任一个任选且独立地被一个或多个R3基团取代；
每个R2独立地选自由以下组成的组：H，任选取代的C1-18烷基，任选取代的C2-18烯基，任选取代的C2-18炔基，任选取代的C1-18羟烷基，任选取代的C1-18烷基氨基，任选取代的C1-18烷硫基和任选取代的羧烷基；
每个R3独立地选自由以下组成的组：卤素，氧代基，硫代基，羟基，巯基，氨基，C1-8烷基，C1-8羟烷基，C1-8烷氨基和C1-8烷硫基；
X和Y独立地选自由以下组成的组：H，任选取代的C1-8烷基，任选取代的C1-8酰基，任选取代的C1-8烷氨基，羟基，巯基，氨基，羧基，任选取代的C1-8羟烷基，任选取代的C1-8烷氨基，任选取代的C2-8烷硫基，任选取代的C1-8羧烷基和卤素；或者
可选地X和Y一起形成共价键；和
代表所述聚合物中单体数目的下标n在2和50之间；
条件是当n在3和7之间时，R1的所有实例都不是羟乙基。
2.根据权利要求1所述的类肽聚合物，其中每个R1独立地选自由以下组成的组
其中：
m在1和8之间；和
R3选自由以下组成的组：H，C1-8烷基，卤素，羟基，巯基，硝基，氨基，氧代基和硫代基。
3.根据权利要求2所述的类肽聚合物，其中一个或多个R1具有根据R1a的结构：
4.根据权利要求3所述的类肽聚合物，其中每个R1a基团独立地选自：
5.根据权利要求3所述的类肽聚合物，其中每个R1a基团是：
6.根据权利要求3所述的类肽聚合物，其中每个R1a基团是：
7.根据权利要求2所述的类肽聚合物，其中一个或多个R1具有根据R1b的结构：
8.根据权利要求7所述的类肽聚合物，其中每个R1b基团独立地选自：
9.根据权利要求7所述的类肽聚合物，其中每个R1b基团是:
10.根据权利要求7所述的类肽聚合物，其中每个R1b基团是：
11.根据权利要求1所述的类肽聚合物，其中每个R1独立地选自由以下组成的组
12.根据权利要求1所述的类肽聚合物，其中R1的每个实例是独立选择的C1-18羟烷基。
13.根据权利要求12所述的类肽聚合物，其中R1的每个实例是独立选择的C1-6羟烷基。
14.根据权利要求13所述的类肽聚合物，其中R1的每个实例是相同的C1-6羟烷基。
15.根据权利要求14所述的类肽聚合物，其中R1的每个实例是
16.根据权利要求1所述的类肽聚合物，其中R2的每个实例是H。
17.根据权利要求1所述的类肽聚合物，其中n在3和25之间。
18.根据权利要求1所述的类肽聚合物，其中n在8和50之间。
19.根据权利要求1所述的类肽聚合物，其中n在8和20之间。
20.根据权利要求1所述的类肽聚合物，其中X选自由H，C1-8烷基和C1-8酰基组成的组；Y选自由羟基和氨基组成的组。
21.根据权利要求1所述的类肽聚合物，其中X和Y一起形成共价键。
22.根据权利要求1所述的类肽聚合物，其中n是10，所述类肽聚合物包含：3个Nhp(2-((2-羟丙基)氨基)乙酸)单体和7个Nsb(2-(仲丁基氨基)乙酸)单体；或者
4个Nhp单体和6个Nsb单体；或者
5个Nhp单体和5个Nsb单体；或者
6个Nhp单体和4个Nsb单体；或者
7个Nhp单体和3个Nsb单体；或者
8个Nhp单体和2个Nsb单体；或者
10Nhp单体。
23.根据权利要求22所述的类肽聚合物，其中所述类肽聚合物具有序列Nhp-Nhp-Nhp-Nhp-Nhp-Nhp-Nhp-Nhp-Nhp-Nhp；X是H或C1-8酰基；Y是羟基或氨基或C1-8烷基。
24.根据权利要求22所述的类肽聚合物，其中所述类肽聚合物具有序列Nsb-Nsb-Nhp-Nsb-Nsb-Nhp-Nsb-Nsb-Nhp-Nsb；X是H或C1-8酰基；Y是羟基或氨基或C1-8烷基。
25.根据权利要求22所述的类肽聚合物，其中所述类肽聚合物具有序列Nsb-Nhp-Nhp-Nhp-Nsb-Nhp-Nhp-Nhp-Nsb-Nhp；X是H或C1-8酰基；Y是羟基或氨基或C1-8烷基。
26.根据权利要求22所述的类肽聚合物，其中所述类肽聚合物具有序列Nsb-Nsb-Nhp-Nhp-Nsb-Nsb-Nhp-Nhp-Nsb-Nsb；X是H或C1-8酰基；并且Y是羟基或氨基或C1-8烷基。
27.根据权利要求22所述的类肽聚合物，其中所述类肽聚合物具有序列Nsb-Nhp-Nhp-Nhp-Nhp-Nhp-Nsb-Nhp-Nhp-Nhp；X是H或C1-8酰基；并且Y是羟基或氨基或C1-8烷基。
28.根据权利要求22所述的类肽聚合物，其中所述类肽聚合物具有表2中列出的序列。
29.根据权利要求1所述的类肽聚合物，其中n是10，所述类肽聚合物包含：
3个Nhp(2-((2-羟丙基)氨基)乙酸)单体和7个Nme(2-(甲基氨基)乙酸)单体；或者
4个Nhp单体和6个Nme单体；或者
5个Nhp单体和5个Nme单体；或者
6个Nhp单体和4个Nme单体；或者
7个Nhp单体和3个Nme单体；或者
8个Nhp单体和2个Nme单体。
30.根据权利要求29所述的类肽聚合物，其中所述类肽聚合物具有表3中列出的序列。
31.根据权利要求1所述的类肽聚合物，其中n是10，所述类肽聚合物包含：
5个Nhe(2-((2-羟乙基)氨基)乙酸)单体和5个Nsb(2-(仲丁基氨基)乙酸)单体；或者
5个Nhp(2-((2-羟丙基)氨基)乙酸)单体和5个Nbu(2-丁基氨基)乙酸)单体。
32.根据权利要求31所述的类肽聚合物，其中所述类肽聚合物具有表4中列出的序列。
33.根据权利要求1所述的类肽聚合物，其中n是10，所述类肽聚合物包含：
4个Nhp(2-((2-羟丙基)氨基)乙酸)单体和6个Nib(2-(异丁基氨基)乙酸)单体；或者
4个Nhp单体和6个Nbu(2-丁基氨基)乙酸)单体；或者
4个Nhp单体和6个Npr(2-丙基氨基)乙酸)单体；或者
4个Nhp单体和6个Nip(2-(异丙基氨基)乙酸)单体。
34.根据权利要求33所述的类肽聚合物，其中所述类肽聚合物具有表5中列出的序列。
35.根据权利要求1所述的类肽聚合物，其中n为14，所述类肽聚合物包含：
6个Nhp(2-((2-羟丙基)氨基)乙酸)单体和8个Nsb(2-(仲丁基氨基)乙酸)单体；或者
7个Nhp单体和7个Nsb单体；或者
8个Nhp单体和6个Nsb单体；或者
10个Nhp单体和4个Nsb单体；或者
14个Nhp单体。
36.根据权利要求35所述的类肽聚合物，其中所述类肽聚合物具有表6中列出的序列。
37.根据权利要求1所述的类肽聚合物，其中n为14，所述类肽聚合物包含：
6个Nhp(2-((2-羟丙基)氨基)乙酸)单体和8个Nib(2-(异丁基氨基)乙酸)单体；或者
7个Nhp单体和7个Nib单体；或者
8个Nhp单体和6个Nib单体；或者
10Nhp单体和4个Nib单体；或者
14个Nhp单体。
38.根据权利要求37所述的类肽聚合物，其中所述类肽聚合物具有表7中列出的序列。
39.根据权利要求1所述的类肽聚合物，其中n为16，所述类肽聚合物包含：
5个Nhp(2-((2-羟丙基)氨基)乙酸)单体和11个Nsb(2-(仲丁基氨基)乙酸)单体；或者
7个Nhp单体和9个Nsb单体；或者
8个Nhp单体和8个Nsb单体；或者
10个Nhp单体和6个Nsb单体；或者
12个Nhp单体和4个Nsb单体；或者
16个Nhp单体。
40.根据权利要求39所述的类肽聚合物，其中所述类肽聚合物具有表8中列出的序列。
41.根据权利要求1所述的类肽聚合物，其中n为22，所述类肽聚合物包含：
7个Nhp(2-((2-羟丙基)氨基)乙酸)单体和15个Nsb(2-(仲丁基氨基)乙酸)单体；或者
10个Nhp单体和12个Nsb单体；或者
11个Nhp单体和11个Nsb单体；或者
14个Nhp单体和8个Nsb单体；或者
17个Nhp单体和5个Nsb单体；或者
22个Nhp单体。
42.根据权利要求41所述的类肽聚合物，其中所述类肽聚合物具有表9中列出的序列。
43.根据权利要求1所述的类肽聚合物，其中所述类肽聚合物形成螺旋结构。
44.根据权利要求1所述的类肽聚合物，其中所述类肽聚合物在约0℃至约-20℃的温度下减少或抑制冰晶形成。
45.根据权利要求1所述的类肽聚合物，其中所述类肽聚合物在约-20℃至约-40℃的温度下减少或抑制冰晶形成。
46.根据权利要求1所述的类肽聚合物，其中所述类肽聚合物在约-20℃下减少或抑制冰晶形成。
47.根据权利要求1所述的类肽聚合物，其中所述类肽聚合物在约-40℃至约-200℃的温度下减少或抑制冰晶形成。
48.一种包含根据权利要求1所述的类肽聚合物和一种或多种氨基酸的类肽-肽杂合物，其中所述一种或多种氨基酸位于所述类肽聚合物的一端或两端和/或一个或多个类肽单体中间。
49.根据权利要求48所述的类肽-肽杂合物，其中所述一种或多种氨基酸选自由以下组成的组：丙氨酸，半胱氨酸，天冬氨酸，谷氨酸，苯丙氨酸，甘氨酸，组氨酸，异亮氨酸，精氨酸，赖氨酸，亮氨酸，甲硫氨酸，天冬酰胺，脯氨酸，谷氨酰胺，丝氨酸，苏氨酸，缬氨酸，色氨酸，酪氨酸及其组合。
50.根据权利要求48所述的类肽-肽杂合物，其中所述一种或多种氨基酸选自由以下组成的组：异亮氨酸，亮氨酸，丝氨酸，苏氨酸，丙氨酸，缬氨酸，精氨酸及其组合。
51.一种冷冻保护液，其包含权利要求1的类肽聚合物，权利要求48的类肽-肽杂合物，或其组合。
52.根据权利要求51所述的冷冻保护液，其进一步包含选自由以下组成的组的化合物：离子，渗透性冷冻保护剂，非渗透性冷冻分子，抗氧化剂，细胞膜稳定化合物，水通道蛋白或其他通道形成化合物，醇，糖，糖衍生物，非离子表面活性剂，蛋白质，二甲基亚砜(DMSO)，聚乙二醇(PEG)，聚乙烯基吡咯烷酮，聚乙烯醇，透明质酸，甲酰胺，天然或合成水凝胶及其组合。
53.根据权利要求52所述的冷冻保护液，其中所述醇选自由以下组成的组：丙二醇，乙二醇，甘油，甲醇，丁二醇，阿东糖醇，乙醇，1,3-丙二醇，二甘醇，聚环氧乙烷，赤藓糖醇，山梨醇，木糖醇，聚丙二醇，2-甲基-2,4-戊二醇(MPD)，甘露醇，肌醇，二硫醇，1,2-丙二醇及其组合。
54.根据权利要求52所述的冷冻保护液，其中所述糖是单糖。
55.根据权利要求54所述的冷冻保护液，其中所述单糖选自由以下组成的组：葡萄糖，3-O-甲基-D-吡喃葡萄糖，半乳糖，阿拉伯糖，果糖，木糖，甘露糖及其组合。
56.根据权利要求52所述的冷冻保护液，其中所述糖是二糖。
57.根据权利要求56所述的冷冻保护液，其中所述二糖选自由以下组成的组：蔗糖，海藻糖，乳糖，麦芽糖及其组合。
58.根据权利要求52所述的冷冻保护液，其中所述糖是多糖。
59.根据权利要求58所述的冷冻保护液，其中所述多糖选自由棉子糖，葡聚糖及其组合组成的组。
60.根据权利要求52所述的冷冻保护液，其中所述PEG具有小于约1,000g/mol的平均分子量。
61.根据权利要求52所述的冷冻保护液，其中所述PEG具有约200-400g/mol的平均分子量。
62.根据权利要求52所述的冷冻保护液，其中所述蛋白质选自由卵清蛋白，牛血清白蛋白，人血清白蛋白，明胶及其组合组成的组。
63.根据权利要求52所述的冷冻保护液，其中所述天然或合成水凝胶包含壳聚糖，透明质酸或其组合。
64.根据权利要求52所述的冷冻保护液，其中所述非离子表面活性剂选自由聚氧乙烯月桂基醚，聚山梨酸酯80及其组合组成的组。
65.一种用于保存组织、器官或细胞的方法，所述方法包括使组织、器官或细胞与权利要求1的类肽聚合物，权利要求48的类肽–肽杂合物，权利要求51的冷冻保护液，或其组合接触。
66.根据权利要求65所述的方法，其中所述类肽聚合物、类肽-肽杂合物、冷冻保护液或其组合以足以在约0℃至约-20℃的温度下减少或抑制冰晶形成的量存在。
67.根据权利要求65所述的方法，其中所述类肽聚合物、类肽-肽杂合物、冷冻保护液或其组合以足以在约-20℃至约-40℃的温度下减少或抑制冰晶形成的量存在。
68.根据权利要求65所述的方法，其中所述类肽聚合物、类肽-肽杂合物、冷冻保护液或其组合以足以在约-20℃的温度下减少或抑制冰晶形成的量存在。
69.根据权利要求65所述的方法，其中所述类肽聚合物、类肽-肽杂合物、冷冻保护液或其组合以足以在约-40℃至约-200℃的温度下减少或抑制冰晶形成的量存在。
70.根据权利要求65所述的方法，其中所述的组织是生物工程化的组织。
71.根据权利要求65所述的方法，其中所述类肽聚合物，所述类肽-肽杂合物或其组合以约100nM和约100mM之间的量存在。
72.根据权利要求65所述的方法，其中所述组织、器官或细胞选自由以下组成的组：心脏，肝脏，肺，肾，胰腺，肠，胸腺，角膜，神经细胞，血小板，精细胞，卵细胞，胚胎细胞，干细胞，人多能干细胞，造血干细胞，淋巴细胞，粒细胞，免疫系统细胞，骨细胞，类器官及其组合。
73.一种用于保存生物大分子的方法，所述方法包括使生物大分子与权利要求1的类肽聚合物，权利要求48的类肽-肽杂合物，权利要求51的冷冻保护液，或其组合接触。
74.根据权利要求73所述的方法，其中所述生物大分子选自由以下组成的组：核酸，氨基酸，蛋白质，分离的蛋白质，肽，脂质，复合结构及其组合。
75.一种化妆品护理产品，其包含权利要求1的类肽聚合物，权利要求48的类肽-肽杂合物，权利要求51的冷冻保护液，或其组合。
76.一种防冻产品，其包含权利要求1的类肽聚合物，权利要求48的类肽-肽杂合物，权利要求51的冷冻保护液，或其组合。
77.根据权利要求76所述的防冻产品，其中所述防冻产品是用于防止、抑制或延迟物体上冰的形成的除冰或防冰的产品。
78.根据权利要求77所述的防冻产品，其中所述物体选自由以下组成的组：航空器或其部件，气体管道，窗户，电气设备，无人机，电缆，电力线，机械设备，汽车发动机，齿轮系统和制动系统。
79.一种冷冻食品，其包含权利要求1的类肽聚合物，权利要求48的类肽-肽杂合物，权利要求51的冷冻保护液，或其组合。
80.根据权利要求79所述的冷冻食品，其中所述冷冻食品选自由冰淇淋，酸奶，海鲜，水果和肉制品组成的组。
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