DE69836736T2

DE69836736T2 - Vorrichtung zur automatischen elektrodenpositionierung

Info

Publication number: DE69836736T2
Application number: DE69836736T
Authority: DE
Inventors: Soren-Peter Olesen; Palle Christophersen; Morten Bech
Original assignee: Sophion Bioscience AS
Current assignee: Sophion Bioscience AS
Priority date: 1997-05-01
Filing date: 1998-04-29
Publication date: 2007-10-04
Anticipated expiration: 2018-04-30
Also published as: DE69836736D1; JP2002507278A; ATE349694T1; CA2285279A1; EP0980523B1; AU729397B2; EP0980523A1; WO1998050791A1; IL131823A0; DK0980523T3; NZ337814A; US6470226B1; AU7205498A

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft eine Vorrichtung und ein Verfahren zum automatischen Verbinden einer Elektrode mit einer Zelle und insbesondere eine automatische Patch-Clamp-Vorrichtung zum Untersuchen elektrischer Ereignisse in Zellmembranen, sowie eine Vorrichtung zum Ausführen von Patch-Clamp-Verfahren, die verwendet werden, um Ionen-Übertragungskanäle in biologischen Membranen zu studieren, und betrifft insbesondere solche Patch-Clamp-Vorrichtungen, die einen hohen Durchsatz haben und nur kleine Testproben von Verbindungen und nur kleine Mengen der Trägerflüsigkeit verwenden, und in der Lage sind, viele Tests in einem kurzen Zeitraum mit einem einzelnen Membranpatch durchzuführen. Allgemeiner betrifft die Erfindung eine neue Handhabung elektrophysiologischer Arzneimittel und eine Vorrichtung zum Durchmustern von chemischen Substanzen oder Verbindungen, die einen hohen Durchsatz schafft und nur ein kleines Volumen von Lösungen und Proben benötigt, die getestet werden sollen. Die Erfindung umfasst auch mehrere Verfahren zur Verwendung der Vorrichtung gemäß der Erfindung wie z.B. bei Durchmusterungsprogrammen in großem Maßstab in der pharmazeutischen Industrie.
STAND DER TECHNIK
Die allgemeine Idee, elektrisch einen Patch (Fleck) einer Membran unter Verwendung einer Mikropipette zu isolieren und die Ionenkanäle in diesem Patch unter Spannungs-Klemm-Bedingungen zu untersuchen, wurde von Neher, Sakmann und Steinback in dem Artikel „The Extracellular Patch Clamp, A Method for Resolving Currents Through Individual Open Channels in Biological Membranes", Pflueger Arch. 375, 219-278, 1978 umrissen. Sie fanden, dass sie dadurch, dass sie eine Pipette, die Acetylcholin (ACh) enthielt, gegen die Oberfläche einer Muskelzellmembrane pressten, diskrete Sprünge im elektrischen Strom sehen konnten, die dem Öffnen und Schließen von durch ACh aktivierten Ionenkanälen zugeordnet werden konnten. Sie waren bei ihrer Arbeit jedoch durch die Tatsache eingeschränkt, dass der Widerstand der Dichtung zwischen dem Glas der Pipette und der Membran (10 MΩ bis 50 MΩ) sehr klein war im Vergleich zum Widerstand des Kanals (bis 10 GΩ). Das elektrische Rauschen, das sich aus einer solchen Dichtung ergibt, steht im umgekehrten Verhältnis zum Widerstandswert und war groß genug, um die Ströme durch die Ionenkanäle zu verschleiernq, deren Leitfähigkeit kleiner ist als die des ACh-Kanals. Es verhinderte auch aufgrund der großen Ströme durch die Dichtung, die sich ergaben, die Spannung in der Pipette auf Werte zu klemmen, die von dem des Bades verschieden waren,
Es wurde dann entdeckt, dass durch eine Feuerpolierung der Glaspipette und das Anlegen eines schwachen Unterdrucks an das Innere der Pipette dann, wenn sie mit der Oberfläche der Zelle in Berührung gebracht wurde, Dichtungen mit sehr hohen Wider standswerten (1 GΩ bis 100 GΩ) erreicht werden konnten, wodurch das Rauschen um eine Größenordnung auf Pegel vermindert wurde, bei denen die meisten Kanäle von biologischem Interesse studiert werden können, und wodurch der Spannungsbereich stark erweitert wurde, über den hinweg diese Studien durchgeführt werden konnten. Diese verbesserte Dichtung wurde als „Giga-Dichtung" bezeichnet und die Pipette hat die Bezeichnung „Patch-Pipette" erhalten. Eine detailliertere Beschreibung der Giga-Dichtung findet sich bei O.P. Hamill, A. Marty, E. Neher, B. Sakmann & F.J. Sigworth: Improved patch-clamp techniques for high resolution current recordings from cells and cell-free membrane patches", Pflügers Arch. 391, 85-100, 1981. Für ihre Arbeit bei der Entwicklung des Patch-Clamp-Verfahrens erhielten Neher und Sakmann 1991 den Nobelpreis in Physiologie und Medizin.
Ionenkanäle sind Transmembran-Proteine, die den Transport von anorganischen Ionen durch die Zellmembranen hindurch katalysieren. Die Ionenkanäle haben Anteil an sehr verschiedenen Vorgängen, wie z.B. der Erzeugung und Zeitsteuerung von Aktionspotentialen, synaptischer Übertragung, Abscheidung von Hormonen, Kontraktion von Muskeln usw. Viele Arzneimittel üben ihre spezifischen Effekte über eine Modulation von Ionenkanälen aus. Beispiele sind anti-epileptische Verbindungen wie Phenytoin und Lamotrigine, welche die spannungsabhängigen Na⁺-Kanäle im Gehirn blockieren, antihypertensive Arzneimittel, wie Nifedipine und Diltiazem, welche die spannungsabhängigen Ca²⁺-Kanäle in glatten Muskelzellen blockieren und Stimulatoren der Insulin-Freisetzung wie Glibenclamide und Tolbutamide, welche einen durch ATP regulierten Ca⁺-Kanal in der Bauchspeicheldrüse blockieren. Zusätzlich zur chemisch induzierten Modulation der Ionenkanal-Aktivität hat das Patch-Clamp-Verfahren Wissenschaftler in die Lage versetzt, Manipulationen mit spannungsabhängigen Kanälen durchzuführen. Diese Verfahren umfassen die Einstellung der Polarität der Elektrode in der Patch-Pipette und die Änderung der Salzlösungs-Zusammensetzung, um die freien Ionenpegel in der Badlösung zu moderieren.
Das Patch-Clamp-Verfahren stellt eine wichtige Entwicklung in der Biologie und der Medizin dar, da dieses Verfahren die Messung des Ionenflusses durch einzelne Ionenkanal-Proteine ermöglicht und auch die Untersuchung von einzelnen Ionenkanal-Reaktionen auf Arzneimittel erlaubt. Kurz gesagt wird bei den herkömmlichen Patch-Clamp-Verfahren eine dünne Glaspipette (ungefährer Durchmesser 0,5 μm bis 2 μm) verwendet. Die Spitze dieser Patch-Pipette wird gegen die Oberfläche der Zellmembran gepresst. Die Pipettenspitze bildet einen dichten Abschluss mit der Zelle und isoliert einige wenige Ionenkanal-Proteine in einem winzigen Patch der Membran. Die Aktivität dieser Kanäle kann elektrisch gemessen werden (Einzelkanal-Aufzeichnung) oder, alternativ, der Patch-Clamp kann aufgerissen werden, wodurch Messungen der Kanalaktivität der gesamten Zellmembran ermöglicht werden (Gesamtzellen-Aufzeichnung).
Sowohl bei der Einzelkanal-Aufzeichnung als auch der Gesamtzellen-Aufzeichnung kann die Aktivität einzelner Kanal-Unterarten dadurch gekennzeichnet werden, dass eine „Spannungs-Klemmung" an die Membran angelegt wird. Durch die Verwendung einer Rückkoppelungsschleife erzeugt die „Spannungs-Klemmung" einen Spannungsgradien ten über die Membran und hierdurch können spannungsempfindliche Kanäle aktiviert werden.
Die Zeitauflösung und Spannungssteuerung bei solchen Experimenten sind beeindruckend und spielen sich oft im ms- oder sogar μs-Bereich ab. Ein Haupthindernis für das Patch-Clamp-Verfahren als allgemeine Methode beim pharmakologischen Durchmustern war die begrenzte Anzahl von Verbindungen, die pro Tag getestet werden konnten (typischerweise nicht mehr als 1 oder 2). Auch die sehr geringe erreichbare Rate des um die Zellen und die Patches herum durchgeführten Lösungs-Austausches bildet ein beträchtliches Hindernis.
Eine Haupteinschränkung, die den Durchsatz des Patch-Clamp-Verfahrens begrenzt, ist die Art des Zuführsystems, das die gelöste Verbindung zu den überströmten Zellen und Patches führt. Bei üblichen Patch-Clamp-Einrichtungen werden die Zellen in großen Experimentierkammern (0,2 ml bis 2 ml) angeordnet, die kontinuierlich von einer physiologischen Salzlösung durchströmt werden. Es werden dann Verbindungen dadurch eingebracht, dass der Einlass auf ein Ventil umgeschaltet wird, das mit einer kleinen Anzahl von Zuführflaschen verbunden ist. Bei diesem Verfahren gemäß dem Stand der Technik gibt es jedoch eine Reihe von Problemen. Erstens ist die Anzahl verschiedener Verbindungen durch die Anzahl von Flaschen begrenzt, die mit dem Einbringungssystem gleichzeitig verbunden werden können. Diese Anzahl ist üblicherweise kleiner als 6. Zweitens sind die erforderlichen Volumina der Trägerflüssigkeit und der zu testenden Probe in kritischer Weise hoch. Drittens ist die Zeit, die benötigt wird, um die gelöste Verbindung um die Zellen und Patches herum auszutauschen, bei üblichen Patch-Clamp-Experimenten lang. Viertens beinhaltet die Einführung und Einbringung von Verbindungen, die getestet werden sollen, üblicherweise ein beträchtliches Ausmaß von von Hand durchzuführender Manipulation und Unterbrechung, wodurch die Integrität der Zellen/Pipetten-Verbindung gefährdet wird.
Die Entwicklung von ausgefeilten Systemen für eine örtliche Anwendung von Verbindungen zur Aktivierung von durch Neurotransmitter geregelten Kanälen, wie z.B. U-Tube- und andere Systeme vermindert die effektive Aufbringungszeit auf 10 bis 100 ms, was häufig akzeptabel ist. Die Zuführsysteme, die die U-Röhrchen füllen, sind aber weniger flexibel und haben eine geringere Kapazität als diejenigen, die für die standardmäßigen Patch-Clamp-Verfahren verwendet werden. Dies begrenzt zurzeit die Verwendung solcher Verfahren in der medizinischen Industrie.
In WO 96/13721 wird eine Vorrichtung zum Ermitteln des Effekts von Testproben von Verbindungen auf Ionen-Transferkanäle einer Membran beschrieben, die einen Autosampler umfasst, der eine Vielzahl von Behältern aufweist, die geeignet sind, Testproben in Lösung zu enthalten, wobei Mittel zum automatischen Abziehen dieser Testproben aus jedem der Behälter und zu ihrer Abgabe in eine Aufnahme vorgesehen sind, wobei ein Behälter geeignet ist, eine Trägerflüssigkeit zu enthalten und eine Perfusionskammer ausgebildet ist, um eine in Lösung befindliche Testprobe, eine Trägerflüssigkeit und die besagte Membran aufzunehmen und wobei die Perfusionskammer eine Referenzelektrode umfasst, die geeignet ist, elektrisch eine in der Kammer enthaltene Lösung zu kon taktieren; weiterhin sind Einrichtungen zum Transportieren dieser gelösten Testproben von der Aufnahme des Autosamplers und der Trägerflüssigkeit von ihrem Behälter zu besagter Perfusionskammer, und Einrichtungen zum Entfernen der Testproben und der Trägerflüssigkeit aus der Perfusionskammer, eine Patch-Pipette, die eine in ihr angeordnete Elektrode aufweist und in beweglicher Weise über der Perfusionskammer angeordnet und geeignet ist, eine Dichtung mit hohem elektrischen Widerstand mit der Oberfläche eines Patches der Membran auszubilden, die in der Kammer angeordnet ist, sowie Einrichtungen vorgesehen, die elektrisch mit der Patch-Pipetten-Elektrode und der Referenzelektrode verbunden sind, um den Strom zu messen, der durch die Elektrode vor, während und nach dem Einführen der Testprobe in die Perfusionskammer fließt.
Es ist ein Nachteil der bekannten Vorrichtung, dass verschiedene von Hand durchzuführende Vorgänge erforderlich sind, um die Apparatur zu verwenden. Beispielsweise muss eine neue Perfusionskammer mit Zellen von Hand in der Vorrichtung positioniert werden und es muss eine neue Pipette von Hand in der Vorrichtung montiert werden, eine Zelle, zu der eine Patch-Clamp-Verbindung hergestellt werden soll, muss von Hand ausgewählt werden, die Pipettenspitze muss von Hand auf der Membran der ausgewählten Zelle positioniert werden, das Patch-Clamping muss von Hand durchgeführt werden usw.
Das US-Patent Nr. US-A-4,907,158 beschreibt ein Verfahren zur Durchführung von Arbeiten an Zellen einer Zellkultur, das die Mikroinjektion in Zellen in der Zellkultur oder das Abziehen von Flüssigkeit aus einer einzelnen Zelle oder das Abziehen ganzer Zellen mit Hilfe eines Unterdrucks aus der Zellkultur beschreibt. Das System ist computergestützt und eine Markierung, die in dem Bild auf einem Monitor bewegt werden kann, wird einem Fernsehbild der Zellkultur überlagert. Die Markierung wird durch die Bedienungsperson mit Hilfe einer Relativbewegung der Markierung bezüglich des Bildes in dem Fernsehbild auf der Zelle positioniert, in welche eine Injektion erfolgen soll. Die Koordinaten der auf diese Weise markierten Zellen werden vom Computer gespeichert, der danach die Kapillarspitze automatisch zu den ausgewählten Zellen vorwärts bewegt und diese penetriert. Der Rechner kann die Eindringbewegung parallel zur Längsachse der Kapillare mit Hilfe der überlagerten Bewegung der Objektbühne und durch eine überlagerte Bewegung des Antriebs für die Elevations-Verschiebung der Kapillare am Mikromanipulator führen.
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
Es ist ein Ziel der vorliegenden Erfindung, eine Vorrichtung und ein Verfahren zum automatischen Verbinden einer Elektrode mit einer Zelle zu schaffen.
Gemäß der Erfindung wird eine Elektrode zu einer oder mehreren Zellen hin bewegt, während ein elektrischer Parameter, wie z.B. die Spannung, der Strom, der Widerstand, die Leitfähigkeit, die Induktivität, die Kapazität usw. in einem elektrischen Kreis gemessen wird, der die Elektrode und eine die Zellen enthaltende Kammer umfasst. Wenn die Elektrode in die Nährflüssigkeit in der Kammer, welche die Zellen enthält, eintritt, ändert sich der Parameter abrupt und ebenso dann, wenn die Elektrode in eine Zelle eindringt, ändert sich der Parameter, wodurch die Berührung zwischen der Elektrode und der Zelle detektiert wird. Bei einer solchen Detektion kann die Bewegung der Elektrode automatisch angehalten werden, so dass die Elektrode mit der Zellmembran in Berührung bleibt, oder es kann die Bewegung über einen gewissen Abstand fortgesetzt werden, um die Elektrode in den inneren Teil der Zelle einzuführen. Beispielsweise wird dann, wenn es sich bei der Zelle um eine makroskopische Zelle handelt, wie z.B. eine Oocyte usw., die Messung an der Zelle typischerweise mit zwei Elektroden durchgeführt, die in den inneren Teil der Zelle eingeführt sind.
Gemäß einem ersten Gesichtspunkt der vorliegenden Erfindung wird eine Vorrichtung zum automatischen Positionieren einer Elektrode geschaffen, die dazu dient, eine Elektrode mit einer Zelle zu verbinden, und die folgendes umfasst:
eine Kammer zum Aufnehmen der Zellen,
eine Pipette, welche die Elektrode umfasst und eine Pipettenspitze besitzt, die geeignet ist, eine Dichtung mit hohem elektrischen Widerstand mit der Oberfläche einer Zellmembran zu schaffen und die in beweglicher Weise in der Nähe der Kammer positioniert ist,
Positioniereinrichtungen zum Halten und Positionieren der Pipette an gewünschten Stellen relativ zur Kammer,
Messeinrichtungen zur Messung eines elektrischen Parameters, wobei diese Messeinrichtungen elektrisch mit der Elektrode und der Kammer verbunden sind und einen elektrischen Kreis bilden, welcher die Elektrode und die Kammer umfasst, und
eine Steuerungseinrichtung zum Steuern der Positioniereinrichtungen in Reaktion auf die Parameter-Ermittlungen, wobei die Steuereinrichtung geeignet ist, die Positioniereinrichtungen in Reaktion auf die erhaltene Position derart automatisch zu steuern, dass die Pipettenspitze an der ermittelten Position der ausgewählten Zelle positioniert wird und eine Dichtung mit hohem elektrischen Widerstand mit der Zellmembran der ausgewählten Zelle bildet, wodurch ein elektrischer Parameter der Zellmembran ohne Eingreifen einer menschlichen Bedienungsperson ermittelt bzw. gemessen werden kann.
Gemäß einem zweiten Gesichtspunkt der vorliegenden Erfindung wird ein Verfahren zum automatischen Verbinden einer Elektrode mit einer Zelle geschaffen, wobei die Elektrode in einer Pipette enthalten ist, welche eine Pipettenspitze aufweist, die geeignet ist, mit der Oberfläche einer Zellmembran eine Dichtung mit hohem elektrischen Widerstand zu bilden, und wobei das Verfahren die folgende Schritte umfasst:
Positionieren einer Kammer zur Aufnahme der Zellen in einer Arbeitsposition, in welcher eine Verbindung der Elektrode mit der Zelle hergestellt werden kann,
Positionieren der Elektrode in der Nähe der Kammer in der Arbeitsposition,
Ermitteln eines elektrischen Parameters in einem elektrischen Kreis, der die Elektrode und die Kammer umfasst, und
Automatisches Steuern der Position der Pipette derart, dass die Pipettenspitze an der ermittelten Position der ausgewählten Zelle positioniert wird und eine Dichtung mit hohem elektrischen Widerstand mit der Zellmembran der ausgewählten Zelle bildet, wodurch ein elektrischer Parameter der Zellmembran ohne das Eingreifen einer menschlichen Bedienungsperson ermittelt bzw. gemessen werden kann.
Die Vorrichtung und das Verfahren der vorliegenden Erfindung sind in der Lage, automatisch eine Elektrode mit einer Zellmembran oder einem inneren Teil einer Zelle zu verbinden, beispielsweise um elektrische Ereignisse in Zellmembranen von Zellen aufzuzeichnen, die in einer Kammer positioniert sind.
In einer Gruppe von Zellen können spezielle Zellen Eigenschaften besitzen, die es wünschenswert machen, nur solche Zellen mit der Elektrode zu verbinden. Somit kann die Vorrichtung Auswahleinrichtungen zum Auswählen einer speziellen Zelle umfassen, die mit der Elektrode verbunden werden soll.
Beispielsweise können diese Auswähleinrichtungen die Messeinrichtungen und die Steuervorrichtung umfassen, wobei die Steuervorrichtung weiterhin geeignet ist, die Positioniereinrichtungen so zu steuern, dass die Elektrode die Kammer mit Zellen solange abtastet, bis eine Zelle mit einem Parameter innerhalb eines vorbestimmten Parameterbereiches detektiert wird, wodurch diese Zelle ausgewählt wird.
Die Auswahleinrichtungen können Bildeinrichtungen zur Erzeugung eines Bildes von Zellen in der Kammer, Digitalisierungseinrichtungen zum Aufzeichnen und Digitalisieren des Bildes durch Unterteilen des Bildes in Pixel, wobei die Digitalisierungseinrichtungen in arbeitsmäßiger Verbindung mit den Bildeinrichtungen stehen, und einen Speicher zum Speichern des digitalisierten Bildes umfassen, der elektrisch mit der Digitalisierungseinrichtung verbunden ist. Beispielsweise kann ein Graustufenbild digital durch ein Digitalbild dargestellt werden, das Pixel umfasst, von denen jedes einen Pixelwert besitzt, der die Graustufe des entsprechenden Pixels wiedergibt. In ähnlicher Weise kann ein Farbbild durch ein digitales Bild dargestellt werden, das Pixel umfasst, von denen jedes drei Pixelwerte aufweist, einen für jede der Farben rot, grün und blau.
Das Bild kann auf einer Wiedergabeeinheit, wie z.B. einem CRT-Monitor usw. dargestellt werden, der Teil einer Verwender-Schnittstellen-Einrichtung der Auswahlmittel bildet, und eine Bedienungsperson kann dann eine Zelle, die mit der Elektrode verbunden werden soll, beispielsweise unter Verwendung einer Maus, spezieller Tastatur-Tasten usw. auswählen.
Die Auswahleinrichtungen können weiterhin einen Prozessor umfassen, der mit dem Speicher verbunden ist und der geeignet ist, die Position der ausgewählten Zelle aus ihrer Position im Bild zu ermitteln. Die Steuerungseinrichtung kann elektrisch mit der Auswahleinrichtung verbunden und geeignet sein, die Position der ausgewählten Zelle zu empfangen und automatisch die Positioniereinrichtungen in Reaktion auf die empfangene Position so zu steuern, dass die Elektrode an der ermittelten Position der ausgewählten Zelle positioniert wird.
Alternativ kann die Auswahl einer Zelle automatisch durchgeführt werden. Zu diesem Zweck kann der Prozessor weiterhin geeignet sein, das digitalisierte Bild für die Identifikation von Zellen in der Kammer zu verarbeiten, sowie eine mit der Elektrode zu verbindenden Zelle auszuwählen und die Position der ausgewählten Zelle in der Kammer zu ermitteln.
Somit wird gemäß einem wichtigen Gesichtspunkt der Erfindung eine automatische Patch-Clamp-Vorrichtung zur Ermittlung eines elektrischen Parameters einer Zellmembran geschaffen, die folgendes umfasst:
die Kammer zum Aufnehmen der Zellen, die in der Vorrichtung in einer Betriebsstellung positioniert ist,
die Pipette, die in der Nähe der Kammer in deren Arbeitsposition in bewegbarer Weise positioniert ist und deren Pipettenspitze geeignet ist, eine Dichtung mit hohem elektrischen Widerstand mit der Oberfläche einer Zellmembran zu bilden,
die Positioniereinrichtungen zum Halten und Positionieren der Pipette an gewünschten Positionen relativ zur Kammer,
die Auswahleinrichtungen zum Auswählen einer Zelle, deren Zellmembran mit einer Dichtung mit einem hohen elektrischen Widerstand mit der Pipettenspitze verbunden werden soll, wobei die Vorrichtung weiterhin folgendes umfasst:
einen Prozessor, der geeignet ist, um die Zellen in der Kammer zu identifizieren,
eine der Zellen auszuwählen, die nachfolgend mit der Pipettenspitze verbunden werden soll, und
Ermitteln der Position der ausgewählten Zelle in der Kammer;
die Steuerungseinrichtung, die elektrisch mit der Auswähleinrichtung verbunden und geeignet ist, die ermittelte Position der ausgewählten Zelle zu empfangen und die Positioniereinrichtungen in Reaktion auf die empfangene Position automatisch so zu steuern, dass die Pipettenspitze an der ermittelten Position der ausgewählten Zelle positioniert wird und eine Dichtung mit hohem elektrischen Widerstand mit der Zellmembran der ausgewählten Zelle herstellt, und
die Messeinrichtungen zum Ermitteln eines elektrischen Parameters, die elektrisch mit der Pipettenspitze und der Kammer verbunden sind und einen elektrischen Kreis bilden, der die Pipettenspitze und die Kammer umfasst, wodurch ein elektrischer Parameter der Zellmembran ohne das Eingreifen einer menschlichen Bedienungsperson ermittelt werden kann.
Die Kammer wird typischerweise von einer Mulde in einem Kammerelement gebildet. Man kann die Zellen auf einem Abdeckglas, beispielsweise einem 3 mm-Abdeckglas wachsen lassen, das in der Mulde positioniert wird. Vorzugsweise wird die Kammer ständig mit einer geeigneten Salzlösung durchspült, um zu verhindern, dass die Zellen austrocknen und absterben. Im Folgenden wird die Kammer zum Aufnehmen der Zellen auch als Perfusionskammer oder Mikroperfusionskammer bezeichnet.
Eine Referenzelektrode ist vorzugsweise in der Kammer positioniert und steht in Berührung mit der Flüssigkeit in der Kammer, um das Aufzeichnen von elektrischen Ereignissen in einer Zellmembran einer Zelle in der Kammer zu ermöglichen.
Die Pipette ist eine Patch-Pipette, die typischerweise eine dünne Glaspipette ist (ungefähr 0,5 μm bis 2 μm im Durchmesser). Während des Patch-Clampings einer Zellmembran wird die Spitze der Patch-Pipette gegen die Oberfläche der Zellmembran gedrückt. Das Innenvolumen der Pipette kann dann in geeigneter Weise einem Unterdruck unterworfen werden, damit die Pipettenspitze eine dichte Anlage an der Zellmembran bildet und dadurch eine Giga-Dichtung zwischen der Pipettenspitze und der Zellmembran erzeugt wird. Vorzugsweise hat die Pipette eine Elektrode, so dass die Aktivität von Ionenkanälen der angeschlossenen Zellmembran elektrisch gemessen werden kann. Der Unterdruck (Saugwirkung) für die Pipettenspitze kann durch einen modifizierten Eppendorf-Oocyten-Injektor erzeugt werden. Der Injektor kann modifiziert werden, um Ausgangsdrücke im Bereich von –300 hPa bis +300 hPa in Schritten von 1 hPa mit einer Reaktionszeit von ungefähr 10 ms zu erzeugen. Dies erfüllt die Anforderungen für das Patch-Clamping.
Die Positioniereinrichtungen sind geeignet, eine Elektrode in einem Gehäuse oder einer Pipette aufzunehmen, mit dieser arbeitsmäßig in Eingriff zu treten und die Elektrode oder Pipette vorzugsweise in drei Dimensionen zu den gewünschten Positionen zu bewegen. Die Positioniereinrichtungen können einen elektronischen Mikromanipulator umfassen, beispielsweise einen Mikromanipulator, wie er von Eppendorf hergestellt wird.
Die Auswahleinrichtungen können irgendeinen Sensor umfassen, der für die Detektion von Zellen geeignet ist. Beispielsweise kann in einer Kammer mit einer sehr großen Anzahl von Zellen die Elektrode verwendet werden, um eine Zelle durch Messung der Leitfähigkeit zwischen der Elektrode und der Referenzelektrode der Kammer zu identifizieren. Wenn die Elektrode in die Kammer abgesenkt wird, nimmt die Leitfähigkeit zu, wenn sie in die Flüssigkeit in der Kammer eintaucht und die Leitfähigkeit nimmt wieder ab, wenn die Elektrode mit einer Zellmembran in Berührung kommt. Ein Prozessor kann geeignet sein, um Zellen durch die Überwachung der Leitfähigkeit zu identifizieren. Bei einer ausreichend dichten Zellpopulation muss nur ein kleines Volumen der Kammer mit Hilfe der Elektrode durchsucht werden, um eine Zellmembran durch Überwachung der Leitfähigkeit zu identifizieren, und die erste identifizierte Zelle kann beispielsweise für ein Patch-Clamping ausgewählt werden. Bei diesem Beispiel ist die Position der ausgewählten Zelle als die momentane Position der Elektrode bekannt.
Der Prozessor kann irgendeinen Rechner wie z.B. einen standardmäßigen IBM-kompatiblen PC oder einen Rechner umfassen, der mit einem Apple Macintosh kompatibel ist (MAC).
In einer Kammer mit einer weniger dichten Zellpopulation ist es bevorzugt, für die Detektion von Zellen einen optischen Sensor zu verwenden, der bei einer bevorzugten Ausführungsform auch für die Auswahl einer Zelle, beispielsweise einer Zelle, die kontaktiert werden soll, dienen kann. Somit kann die Auswahleinrichtung Abbildungseinrichtungen, wie z.B. ein Mikroskop usw. umfassen, um ein Bild von Zellen in der Kammer zu erzeu gen, und, positioniert in der Nähe der Kammer, Digitalisierungseinrichtungen wie z.B. eine hPCCD-Kamera, die einen digitalen Ausgang besitzt, eine Videokamera, mit einem Framegrabber usw., um das Bild dadurch aufzuzeichnen und zu digitalisieren, das das aufgezeichnete Bild in Pixel unterteilt wird, von denen jedes einen aufgezeichneten Intensitätswert besitzt, wobei die Digitalisierungseinrichtungen in betriebsmäßiger Verbindung mit den Bilderzeugungseinrichtungen in Verbindung stehen, einen Speicher, wie z.B. den Speicher eines PC, der zum Speichern des digitalisierten Bildes dient und elektrisch mit den Digitalisierungseinrichtungen verbunden ist.
Das Bild kann für eine Bedienungsperson der Vorrichtung beispielsweise auf einem CRT-Monitor wiedergegeben werden, und die Bedienungsperson kann eine Zelle unter Verwendung einer Verwender-Schnittstellen-Einrichtung wie z.B. einer Maus dadurch auswählen, dass sie einen Cursor mit der Maus auf eine gewünschte Zelle bewegt, die dann durch die Aktivierung einer Maustaste ausgewählt werden kann. Die Verwender-Schnittstellen-Einrichtungen können Zoom-Einrichtungen umfassen, welche die Auswahl eines speziellen Pixels des Bildes der ausgewählten Zelle ermöglichen, wodurch der entsprechende Punkt der Zellenoberfläche als Berührungspunkt mit der Elektrode oder Pipette ausgewählt wird.
In ähnlicher Weise kann die Bedienungsperson die Position der Spitze der Elektrode oder Pipette dadurch definieren, dass er den Cursor auf die entsprechende Position in dem Bild bewegt. Das Pixel, das sich bei der Aktivierung einer Maustaste an der Position des Cursors befindet, kann in dem Bild als die Position der Spitze der Elektrode oder Pipette ausgewählt werden.
Wenn die Bedienungsperson einen Zellen-Berührungspunkt ausgewählt hat, der mit der Elektrode berührt und/oder mit dem eine Patch-Clamp-Verbindung mit der Pipette hergestellt werden soll, kann die Vorrichtung die Elektrode oder Pipette automatisch zu dem Berührungspunkt bewegen, beispielsweise um eine automatische Patch-Clamp-Verbindung herzustellen.
Bei einer anderen Ausführungsform der Erfindung ist der Prozessor mit dem Speicher verbunden und weiterhin geeignet, das digitalisierte Bild zu verarbeiten, um Zellen in der Kammer zu identifizieren, einer Zelle, die danach mit der Pipette oder Elektrodenspitze verbunden werden soll, auszuwählen und die Position der ausgewählten Zelle in der Kammer zu ermitteln.
Der Prozessor kann geeignet sein, das digitalisierte Bild für die Identifizierung der Pipette oder Elektrodenspitze und die Ermittlung der Position der Pipette oder Elektrodenspitze zu verarbeiten.
Jedes bekannte und geeignete Bildverarbeitungsverfahren kann verwendet werden, um die Zellen und/oder die Pipette oder Elektrodenspitze zu erkennen und zu identifizieren, beispielsweise Verfahren, welche eine Kantenerkennung umfassen, um die Kontur von Zellen und/oder der Pipetten- oder der Elektrodenspitze zu identifizieren.
Es ist allgemein bekannt, ein Bild digital dadurch darzustellen, dass das Bild in eine große Anzahl von Segmenten unterteilt wird, die als Pixel bezeichnet werden, und einem jedem Pixel digitale Intensitätswerte zuzuordnen, die als Pixelwerte bezeichnet werden. Typischerweise wird das Bild in eine Matrix von Zeilen und Spalten von Pixeln unterteilt, und die Größe eines digitalen Bildes wird dann durch die Anzahl von Pixeln in einer Zeile und die Anzahl von Pixeln in einer Spalte wiedergegeben. Die Pixelwerte werden typischerweise in einem Anordnung von Speicherplätzen in einem digitalen Speicher gespeichert, wobei jeder Speicherplatz einem Pixel des Bildes entspricht. Beispielsweise kann ein Graustufenbild digital durch ein digitales Bild dargestellt werden, das Pixel umfasst, von denen jedes einen Pixelwert besitzt, der die Graustufe des Pixels darstellt. In ähnlicher Weise kann ein Farbbild durch ein digitales Bild dargestellt werden, das Pixel umfasst, von denen jedes drei Pixelwerte besitzt, jeweils einen für die Farben rot, grün und blau.
Weiterhin ist es allgemein bekannt, ein digitales Bild dadurch zu verarbeiten, dass ein neues digitales Bild mit der gleichen Anzahl von Pixeln wie das ursprüngliche Bild erzeugt wird, wobei für jedes Pixel durch eine lineare oder richtlineare Transformation des entsprechenden ursprünglichen Pixelwertes neue Pixelwerte erzeugt werden. Beispielsweise kann der neue Pixelwert mit Hilfe eines Algorithmus, beispielsweise eines räumlichen Digitalfilters aus dem ursprünglichen Pixelwert und Pixelwerten der benachbarten Pixel berechnet werden, so dass z.B. der neue Pixelwert der Mittelwert des ursprünglichen Pixelwertes des in Rede stehenden Pixels und seiner acht Nachbarpixel ist.
Es wird zur Zeit bevorzugt, die Zellen unter Verwendung einer räumlichen Filterung zu identifizieren, welche die Identifizierung ursprünglicher Pixel und die Markierung beispielsweise eines entsprechenden Pixels eines neuen digitalen Bildes umfasst, das die gleiche Anzahl von Pixeln wie das ursprüngliche Bild aufweist, bei der eine erste Markierung an diesem entsprechenden Pixel dann angebracht wird, wenn das ursprüngliche Pixel ein Pixel ist, auf dem eine Zelle abgebildet worden ist, d.h. wenn die Pixelwerte einer spezifischen Anzahl von Pixeln, die dem in Rede sehenden ursprünglichen Pixel benachbart sind, einschließlich diesem Pixel niedriger sind, als ein ausgewählter Schwellenwert.
Die räumliche Filterung kann weiterhin die Identifizierung und Markierung mit einer zweiten Marke einer Gruppe von einander benachbarten Pixeln, die mit der ersten Markierung markiert sind, umfassen, auf der eine einzelne Zelle abgebildet wurde, indem die Anzahl von Pixeln ermittelt wird, die in der Gruppe der einander benachbarten Pixel enthalten sind, wobei Gruppen markiert werden, die eine Anzahl von Pixeln in einem vorbestimmten Bereich besitzen.
Darüber hinaus kann die räumliche Filterung die Identifizierung und Markierung mit einer dritten Marke einer Gruppe von einander benachbarten Pixeln umfassen, die mit der zweiten Markierung markiert sind, wenn der Abstand von Pixeln der Gruppe von einander benachbarten Pixeln zu Pixeln, die mit der ersten Markierung markiert sind, größer als ein vorbestimmter minimaler Abstand ist.
Die ausgewählte Zelle kann unter den Zellen ausgewählt werden, die auf entsprechenden Gruppen von benachbarten Pixeln abgebildet sind, die mit der dritten Markierung markiert sind.
Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird ein Satz von geometrischen Parametern für Zellen mit der dritten Markierung berechnet, wie z.B. ein maximaler Zellen-Durchmesser, ein Zellen-Formfaktor, ein Zellen-Quadratwert usw. Der Wert eines Auswahlparameters, der eine Funktion des geometrischen Parameters ist, wird für Zellen mit der dritten Markierung berechnet und die Auswahl einer Zelle wird basierend auf den berechneten Auswahlparameterwerten durchgeführt. Beispielsweise kann die erste Zelle, die einen berechneten Auswahlparameterwert innerhalb eines vorbestimmten Bereiches besitzt, ausgewählt werden, oder die Zelle von den Zellen mit der dritten Markierung mit einem Auswahlparameterwert, der am nächsten zu einem gewünschten Wert liegt, kann ausgewählt werden usw. Der Auswahlparameter kann irgendeine arithmetische Kombination des Satzes von geometrischen Parametern sein, wie z.B. das Produkt aus maximalem Zelldurchmesser, Formfaktor und Quadratwert.
Der Quadratwert einer Zelle wird dadurch berechnet, dass mathematisch ein Quadrat um die Zelle herum angepasst wird und das Verhältnis der Anzahl von Pixeln in der Zelle zur Gesamtzahl von Pixeln in dem Quadrat berechnet wird. Somit wird dann, wenn d_max den maximalen Durchmesser einer Zelle und A die Fläche der Zelle bezeichnen, wird der Quadratwert gegeben durch
Wenn der Umfang der Zelle mit C bezeichnet wird, ist der Formfaktor gegeben durch
Man sieht, dass der Formfaktor einen Wert besitzt, der im Bereich von 0 bis 1 liegt und dass der Formfaktor für einen Kreis gleich 1 ist.
Ein vorbestimmter Auswahl-Parameterbereich kann dadurch ermittelt werden, dass von Hand geeignete Zellen selektiert werden, beispielsweise mit Hilfe einer Maus und eines Cursors wie oben beschrieben, und dass der Auswahl-Parameterwert der ausgewählten Zellen berechnet wird. Nach der Auswahl einer geeigneten Anzahl von Zellen, beispielsweise von 25 bis 40 Zellen, können der Mittelwert und die Standardabweichung der Zellen berechnet werden und während der Auswahl kann die Zelle ausgewählt werden, die einen Parameter-Auswahlwert besitzt, der dem Mittelwert am nächsten kommt. Somit können die verschiedenen Arten von Zellen zu entsprechend unterschiedlichen Auswahl-Parameter-Bereichen führen.
Die Position des zentralen Pixels der ausgewählten Zelle kann die ermittelte Position der ausgewählten Zelle bilden.
Das Signal-Rausch-Verhältnis von Zell-Bildern kann beträchtlich erhöht werden, wenn die Zellen fluoreszierend oder phosphoreszierend, z.B. dadurch gemacht werden; dass die Zellen mit einem fluoreszierenden oder phosphoreszierenden Farbstoff gefärbt werden oder durch Implantation eines Gens für ein fluoreszierendes oder phosphoreszierendes Protein, beispielsweise das Enhanced-Green-Fluorescent-Protein (EGFP). Weiterhin können die Abbildungseinrichtungen optische Filter umfassen, welche die Strahlung, die von den Zellen emittiert wird durchlassen und andere Strahlung blockieren. Dies kann die oben beschriebenen Zellen-Auswahlverfahren vereinfachen. Beispielsweise kann dann, wenn EGFP verwendet wird, die Auswahl der Zelle auf die Schritte reduziert werden, die auf der gewünschten Intensität der grünen Farbe, welche die Zellen mit der ersten Markierung markiert, der Berechnung der Auswahl-Parameterwerte von Zellen mit der ersten Markierung und der Auswahl der Zelle mit dem besten Auswahl-Parameterwert beruhen.
Es wird zurzeit bevorzugt, dass der Prozessor geeignet ist, unter Verwendung der räumlichen Filterung des Bildes Pixel zu identifizieren, auf welche die Pipettenspitze oder Elektrode abgebildet wird.
Die räumliche Filterung kann weiterhin das Identifizieren und das Markieren mit einer vierten Marke eines Pixels als Pixel umfassen, auf das die Pipette oder Elektrodenspitze abgebildet wird, wenn die Pixelwerte einer speziellen Anzahl von Nachbar-Pixeln zu dem in Rede stehenden Pixel, einschließlich diesem Pixel, niedriger sind als ein zweiter Schwellenwert.
Weiterhin kann die räumliche Filterung die Identifizierung einer Linie von Pixeln umfassen, wobei jedes Pixel auf der Linie im Zentrum der Pixel, die mit der vierten Markierung markiert sind, und auf der Linie des in Rede stehenden Pixels positioniert ist, und die Position der Pipettenspitze kann als die Position eines Endpixels der Linie von Pixeln festgelegt werden.
Um in der Lage zu sein, den Einfluss verschiedener Verbindungen auf eine Zellmembran über Stunden hinweg zu untersuchen, ohne dass das Eingreifen einer Bedienungsperson erforderlich ist, ist es nötig, in der Lage zu sein, die Testkammer mit der gegenwärtig mit einer Strom-Klemm-Verbindung verbundenen Zelle gegen eine neue Testkammer und eine neue Patch-Pipette auszutauschen, so dass sichergestellt ist, dass man sich immer auf die Testergebnisse verlassen kann.
Somit umfasst die Vorrichtung vorzugsweise weiterhin ein Kammerelement, das eine Vielzahl von Kammern zur Aufnahme von Zellen und Kammerelement-Bewegungseinrichtungen umfasst, die dazu dienen, die Kammern nacheinander aus einer Kammer-Speicherposition in die Arbeitsstellung zu bewegen.
Es ist bevorzugt, dass eine Vielzahl von Testzellen-Kulturen in die jeweiligen Kammern der Vielzahl von Kammern eingebracht wird, bevor die Tests von Verbindungen durchgeführt werden. Vorzugsweise lässt man die Zellen auf einer Proteinschicht auf einem Abdeckglas wachsen, das in einer entsprechenden Kammer positioniert wird, bevor das Testen der Verbindungen durchgeführt wird.
Der Ausdruck „Arbeitsposition" bedeutet, dass die Positioniereinrichtungen zum Halten und Positionieren der Pipette und die Kammer relativ zueinander so angeordnet werden, dass eine ausgewählte Zelle in der Kammer durch eine Patch-Clamp-Verbindung mit der Pipettenspitze verbunden werden kann. Das Kammerelement mit den Kammern kann in Relation zu feststehenden Positioniereinrichtungen bewegt werden oder die Positioniereinrichtungen können relativ zu einem feststehenden Kammerelement bewegt werden.
Vorzugsweise umfasst die vorliegende Vorrichtung Kammerelement-Bewegungseinrichtungen, die dazu dienen, eine Kammer aus einer ersten Speicherposition, in der die Kammer mit einer die Zellen enthaltenden Flüssigkeit, beispielsweise einer Salzlösung, versorgt werden kann, zur Arbeitsposition zu bringen, und zu einer anderen Speicherposition, wenn eine Zelle in einer anderen Kammer eine Patch-Clamp-Verbindung erhalten soll.
Die Kammer-Bewegungseinrichtungen können die Positioniereinrichtungen umfassen, dazu ausgebildet werden können, das Kammerelement zu gewünschten Positionen zu schieben und/oder zu ziehen.
Das Kammerelement kann Kammerelement-Speichereinrichtungen zum Speichern von Daten umfassen, und die Vorrichtung kann Einrichtungen zum Lesen der in den Kammerelement-Speichereinrichtungen enthaltenen Daten umfassen.
Die Daten können ein Ablaufdatum für das Kammerelement, Identifikationsdaten, Eichdaten usw. umfassen.
Um die richtige Bewegung einer Kammer aus der Speicherposition, in der sie nicht benutzt wird, in die Arbeitsstellung zu erleichtern, können die Kammerelement-Bewegungseinrichtungen auf irgendeine bekannte Art gesteuert werden. Diese bekannte Art kann eine Bewegung sein, die hinsichtlich der Zeit, der Weite bzw. Länge der Bewegung, des Drehwinkels der Motorwelle gesteuert wird, oder es können optische, elektrische oder mechanische Einrichtungen vorgesehen werden, um zu ermitteln, wann sich eine gewünschte Kammer in ihrer Arbeitsposition befindet, um dann die Bewegung zu beenden.
Das Kammerelement kann Kammern umfassen, die in einer rechtwinkligen Anordnung mit Zeilen und Spalten von Kammern angeordnet sind, wobei das Kammerelement relativ zu den Positioniereinrichtungen längs der Achsen von Zeilen und Spalten bewegt wird, wenn eine neue Kammer in ihre Arbeitsposition bewegt wird, oder die Kammern können in kreisförmigen Anordnungen angeordnet sein, beispielsweise auf einem Drehtisch, wobei die kreisförmige Anordnung relativ zu den Positioniereinrichtungen gedreht wird, wenn eine neue Kammer in ihre Arbeitsposition gebracht werden soll.
Das Kammerelement kann auf einer Montageplatte montiert sein, die in einer x-y-Ebene mit Hilfe von zwei Elektromotoren bewegt werden kann, und das Kammerelement kann beispielsweise durch einen dritten Motor um eine zur x-y-Ebene senkrechte Achse drehbar sein, so dass die einzelnen Kammern in ihrer jeweiligen Arbeitsposition durch Drehen des Kammerelementes positioniert werden können. Das Abbildungssystem kann weiter hin ein invertiertes Mikroskop umfassen, das mit der Montageplatte eine Baueinheit bildet. Die Position der Fokusebene des Mikroskops kann einstellbar sein, wodurch eine Autofokussierung vor der Einleitung der Pipetten- und Zellen-Erkennung ermöglicht wird.
Halter zum Halten der Elektroden oder Pipetten können mit den Elektroden oder Pipetten in einem Array, beispielsweise in zwei Zeilen auf einem Element angeordnet sein, das auf der Montageplatte positioniert ist.
Alternativ kann das Kammerelement weiterhin Halter zum Halten der Pipetten umfassen.
Die Positioniereinrichtungen können weiterhin geeignet sein, um wahlweise eine Pipette aus ihrem Halter herauszuziehen und die Pipette in ihrem Halter einzusetzen, beispielsweise wenn sich die entsprechende Kammer in ihrer Arbeitsstellung befindet.
Die Vorrichtung kann weiterhin Einrichtungen zur Zufuhr von Flüssigkeit, wie z.B. einer Salzlösung zu den Kammern des Kammerelementes umfassen.
Vorzugsweise umfassen die Einrichtungen zum Zuführen von Flüssigkeit zu den Kammern des Kammerelementes Einrichtungen zum Zuführen einer ersten Flüssigkeit zu den Kammern in einer Speicherposition und einer zweiten Flüssigkeit zu den Kammern in der Arbeitsstellung.
Die Vorrichtung kann weiterhin Absaugeinrichtungen zum Entfernen von überschüssiger Flüssigkeit umfassen, die durch die Kammern fließt.
Somit wird das Patch-Clamp-Verfahren mit der Verwendung eines Autosamplers kombiniert, wobei diese Kombination zunächst für einen Fachmann insbesondere deswegen nicht offensichtlich war, weil das Verfahren gegen Störungen wie z.B. Vibrationen und elektrisches Rauschen empfindlich ist, die durch den Autosampler verursacht werden, so dass man diese Kombination für unmöglich oder nicht arbeitsfähig halten konnte.
Die Vorrichtung kann verwendet werden, um automatisch Arzneimittel zu handhaben und einzubringen und um die Vorrichtung in einem elektrophysiologischen System zum Durchmustern von chemischen Substanzen oder Verbindungen zu verwenden, um ihren Einfluss auf die Ionenkanal-Übertragung zu messen, wobei das neue System dafür sorgt, dass ein hoher Durchsatz erzielt werden kann und nur kleine Fluid-Volumina benötigt werden.
Es ist ein weiteres Ziel der vorliegenden Erfindung, die benötigte Menge einer chemischen Verbindung zum Testen zu vermindern und die Durchmusterungsrate zu erhöhen, wodurch das erste elektrophysiologische Testsystem geschaffen wird, das für eine kommerzielle pharmazeutische Durchmusterung im industriellen Maßstab geeignet ist.
Es ist weiterhin ein Ziel, eine neue Mikroperfusionskammer-Struktur zu schaffen, die Mikroperfusionskammern mit extrem geringem Volumen aufweist.
Ein weiteres Ziel der Erfindung ist es, neue Verfahren zur Durchführung des Patch-Clamp-Verfahrens unter Verwendung der Vorrichtung gemäß der vorliegenden Erfindung zu schaffen. Die vorausgehenden und weitere Ziele, Vorteile und charakterisierende Merkmale der Erfindung ergeben sich aus der folgenden Beschreibung bestimmter erläuternder Ausführungsformen der Erfindung, die unter Bezugnahme auf die beigefügte Zeichnung beschrieben werden, wobei in allen Figuren gleiche Bezugszeichen die gleichen Elemente bezeichnen.
Unter anderem wird folgendes für sich allein oder in Kombination offenbart:
Eine Vorrichtung zum Ermitteln des Effektes von Testproben von Verbindungen auf die Ionen-Übertragungskanäle einer Membran, die folgende Bestandteile umfasst:
einen Autosampler, der eine Vielzahl von Behältern aufweist, die geeignet sind, Testproben in Lösung zu enthalten, und der Einrichtungen zum automatischen Abziehen dieser Testproben aus jedem der Behälter und zu ihrer Abgabe in eine Aufnahme umfasst,
einen Behälter, der geeignet ist, eine Trägerflüssigkeit zu enthalten,
eine Perfusionskammer, die geeignet ist, eine gelöste Testprobe, eine Trägerflüssigkeit und die Membran aufzunehmen, wobei die Perfusionskammer eine Referenzelektrode umfasst, die geeignet ist, eine in der Kammer enthaltene Lösung elektrisch zu kontaktieren,
Einrichtungen zum Transportieren der Testproben in Lösung aus der Aufnahme des Autosamplers und der Trägerflüssigkeit aus ihrem Behälter in die Perfusionskammer, und Einrichtungen zum Entfernen der Testprobe und der Trägerflüssigkeit aus der Perfusionskammer,
eine Patch-Pipette, in der sich eine Elektrode befindet und die in beweglicher Weise über der Perfusionskammer positioniert und geeignet ist, eine Dichtung mit hohem elektrischen Widerstand mit der Oberfläche eines Patches der Membran zu bilden, die in der Kammer angeordnet ist, und
Einrichtungen, die elektrisch mit der Patch-Pipetten-Elektrode und der Referenzelektrode verbunden sind, um den Strom zu messen, der durch diese Elektroden vor und nach dem Einführen der Testprobe in die Perfusionskammer fließt;
eine solche Vorrichtung, bei der die Einrichtungen zum Transportieren der Testproben und der Trägerflüssigkeit zur Perfusionskammer ein U-Röhrchen umfassen, das über der Perfusionskammer montiert ist und eine Öffnung zum Abgeben einer Testprobe und ihrer Trägerflüssigkeit in die Perfusionskammer aufweist, und
eine Vorrichtung zum Ermitteln des Effektes von Testproben von Verbindungen auf die Ionen-Übertragungskanäle einer Membran, die folgendes umfasst:
einen Autosampler, der eine Vielzahl von Behältern aufweist, die geeignet sind, Testproben in Lösung zu enthalten, und der Mittel zum automatischen Abziehen der Testproben aus jedem der Behälter und zu ihrer Abgabe in eine Aufnahme umfasst,
einen Behälter, der geeignet ist, eine Trägerflüssigkeit zu enthalten,
eine Mikropertusionskammer, die geeignet ist, gelöste Testproben, eine Trägerflüssigkeit und die Membran aufzunehmen, wobei das Volumen der Mikroperfusionskammer ungefähr 5 μl bis ungefähr 50 μl beträgt, wobei die Mikroperfusionskammer eine Referenzelektrode umfasst, die geeignet ist, mit einer in der Kammer enthaltenen Lösung elektrisch in Kontakt zu treten,
Einrichtungen zum Transportieren einer gelösten Testprobe aus der Aufnahme des Autosamplers und der Trägerflüssigkeit aus ihrem Behälter in die Mikroperfusionskammer und Einrichtungen zum Entfernen der Testprobe und der Trägerflüssigkeit aus der Mikroperfusionskammer,
eine Patch-Pipette, in der sich eine Elektrode befindet und die in beweglicher Weise über der Mikroperfusionskammer angeordnet und geeignet ist, eine Dichtung mit hohem elektrischen Widerstand mit der Oberfläche eines Patches der Membran zu bilden, die in der Kammer angeordnet ist, und
Einrichtungen, die elektrisch mit der Patch-Pipetten-Elektrode und der Referenzelektrode verbunden sind, um vor und nach der Einführung einer Testprobe in die Mikroperfusionskammer den Strom zu messen, der durch die Elektroden fließt;
eine solche Vorrichtung, bei der das Volumen der Mikroperfusionskammer im Bereich von ungefähr 10 μl bis ungefähr 15 μl liegt;
eine solche Vorrichtung, bei der das Volumen der Mikroperfusionskammer im Bereich von ungefähr 10 μl bis ungefähr 12 μl liegt;
eine solche Vorrichtung, die Einrichtungen zum Ansaugen von abzuführender Flüssigkeit aus der Mikroperfusionskammer umfasst;
eine solche Vorrichtung, bei der die Einrichtungen des Autosamplers für ein automatisches Abziehen der Testproben aus den Behältern und zu ihrer Abgabe in eine Aufnahme eine Spritzenpumpe und eine damit verbundene Nadel umfassen; und
eine solche Vorrichtung, bei der eine Schlauchschleife in Reihe mit den Einrichtungen zum Transportieren der Testprobe angeordnet ist, um quantitativ das Volumen der Probe zu ermitteln, die in die Mikroperfusionskammer eingeführt wird.
Weiterhin eine Mikroperfusionskammer-Baueinheit, die folgendes umfasst: Eine Basis, eine Öffnung in der Basis und transparente Einrichtungen über den Boden der Basis, wobei die Öffnung und die transparenten Einrichtungen in der Weise zusammenwirken, dass sie Seitenwände und den Boden einer Mikroperfusionskammer bilden, eine Referenzelektrode, die angeordnet ist, um mit einer Flüssigkeit in der Kammer in Berührung zu stehen, Einrichtungen zum Einbringen einer Flüssigkeit in die Kammer, Einrichtungen zum Absaugen einer Flüssigkeit aus der Kammer und Einrichtungen zum elektrischen Verbinden der Referenzelektrode mit einer elektrischen Messeinrichtung,
eine solche Mikroperfusionskammer-Baueinheit, bei der die transparenten Einrichtungen, die den Boden der Kammer bilden, ein transparentes Abdeckglas sind;
eine solche Mikroperfusionskammer-Baueinheit, bei der die besagte Basis in der Weise Silber umfasst, dass sie einen Überzug aus einem Silberhalid aufweist, der zumindest auf der Oberfläche der Öffnung abgeschieden ist, welche die Seitenwände der Mikroperfusionskammer bilden, wodurch eine Referenzelektrode in der Basis geschaffen wird, die geeignet ist, mit einer in der Kammer enthaltenen Flüssigkeit in elektrischem Kontakt zu stehen,
eine derartige Mikroperfusionskammer-Baueinheit, bei der die Basis in der Weise Silber umfasst, dass sie einen Überzug aus Silberchlorid aufweist, der zumindest auf der Oberfläche der Öffnung abgeschieden ist, welche die Seitenwände der Mikroperfusionskammer bildet;
eine solche Mikroperfusionskammer-Baueinheit, bei der die Basis in der Weise Silber umfasst, dass sie einen Überzug aus Silberchlorid aufweist, der über ihre gesamte Oberfläche einschließlich der Seitenwände der Kammer abgeschieden ist,
eine solche Mikroperfusionskammer-Baueinheit, bei der die Mikroperfusionskammer zylindrisch, stumpfkegelig oder elliptisch ausgebildet ist,
eine solche Mikroperfusionskammer-Baueinheit, bei der das Volumen der Mikroperfusionskammer ungefähr 5 μl bis ungefähr 50 μl beträgt;
eine Mikroperfusionskammer-Baueinheit, bei der das Volumen der Mikroperfusionskammer ungefähr 10 μl bis ungefähr 15 μl beträgt;
eine solche Mikroperfusionskammer-Baueinheit, bei der das Volumen der Mikroperfusionskammer ungefähr 10 μl bis ungefähr 12 μl beträgt; und
eine solche Mikroperfusionskammer-Baueinheit, die eine Basis aufweist, die aus einem elektrisch nicht leitfähigen Material hergestellt ist, wobei in der Basis eine Öffnung vorgesehen ist und eine transparente Abdeckeinrichtung am Boden der Basis, wobei die Öffnung und die transparente Abdeckeinrichtung in der Weise zusammenwirken, dass sie die Seitenwände und den Boden einer Mikropertusionskammer bilden, eine Referenzelektrode, die in der Basis montiert ist und sich durch eine Seitenwand der Mikroperfusionskammer erstreckt und so ausgebildet ist, dass sie mit einer in der Kammer enthaltenen Flüssigkeit in elektrischen Kontakt kommt,
Einrichtungen zum Einführen einer Flüssigkeit in die Kammer,
Einrichtungen zum Absaugen von Flüssigkeit aus der Kammer und
Einrichtungen, die dazu dienen, die Referenzelektrode mit einer elektrischen Messvorrichtung elektrisch zu verbinden;
eine solche Mikroperfusionskammer-Baueinheit, bei der die Basis ein Kunststoffmaterial umfasst;
eine solche Mikroperfusionskammer-Baueinheit, bei der das Kunststoffmaterial Polymethylmethacrylat, Polystyren, Polyvinylchlorid oder Polycarbonat ist;
eine solche Mikroperfusionskammer-Baueinheit, bei der die Elektrode einen Silberdraht umfasst, der von einer Mischung aus teilchenförmigen Silber und einem Silberhalid umgeben ist;
eine solche Mikroperfusionskammer-Baueinheit, bei der die Elektrode einen Silberdraht umfasst, der von einer Mischung aus teilchenförmigen Silber und Silberchlorid umgeben ist;
eine solche Mikroperfusionskammer-Baueinheit, bei der das teilchenförmige Silber und das Silberchlorid an dem Silberdraht befestigt sind;
eine solche Mikroperfusionskammer-Baueinheit, bei der die Einrichtung zum Einführen einer Flüssigkeit in die Mikroperfusionskammer eine Rille ist, die in der Basis vorgesehen ist und mit den transparenten Abdeckeinrichtungen zusammenwirkt, um einen Kanal zu bilden, wobei das proximale Ende des Kanals mit der Mikroperfusionskammer in Verbindung steht und eine Öffnung an der Oberseite der Basis vorgesehen ist, die mit dem distalen Ende des Kanals in Verbindung steht und geeignet ist, mit einer Einströmleitung zum Einführen einer Flüssigkeit in die Mikroperfusionskammer verbunden zu werden;
eine solche Mikroperfusionskammer-Baueinheit, bei der das Volumen der Mikroperfusionskammer ungefähr 5 μl bis ungefähr 50 μl beträgt;
eine solche Mikroperfusionskammer-Baueinheit, bei der das Volumen der Mikropertusionskammer ungefähr 10 μl bis ungefähr 15 μl beträgt; und
eine solche Mikroperfusionskammer-Baueinheit, bei der das Volumen der Mikroperfusionskammer ungefähr 10 μl bis ungefähr 12 μl beträgt.
Weiterhin ein Verfahren zur Ermittlung des Effektes von Testproben von Verbindungen auf die Ionen-Übertragungskanäle einer Membran, die in einer Perfusionskammer enthalten ist, wobei eine Patch-Pipette eine in ihr angeordnete Elektrode aufweist und mit ihrer Spitze mit der Oberfläche der Membran unter Ausbildung einer Giga-Ohm-Dichtung in Berührung steht, und wobei in der Kammer eine Referenzelektrode vorgesehen ist, die geeignet ist, mit einer in der Kammer enthaltenen Lösung in Berührung zu treten, wobei das Verfahren folgende Schritte umfasst:
kontinuierliches oder periodisches Einführen einer Trägerflüssigkeit in besagte Kammer, wobei die Trägerflüssigkeit Ionen enthält, deren Übertragungsmerkmale als Grundlinien-Referenz ermittelt werden sollen,
periodisches Einbringen einer der besagten Testproben, die in der gleichen Trägerflüssigkeit gelöst sind, in die Kammer, unter Verwendung eines Autosamplers, der eine Vielzahl von Behältern aufweist, welche Testproben in Lösung enthalten, und
sowohl vor als auch nach dem Einbringen der Testprobe in die Perfusionskammer erfolgendes Messen des fließenden elektrischen Stroms in einer elektrischen Messanordnungs-Schaltung, die zwischen der Pipettenelektrode und der Referenzelektrode angeschlossen ist, und Wiederholen dieses Vorganges,
ein solches Verfahren, bei dem die Trägerflüssigkeit kontinuierlich in die Perfusionskammer eingeführt und der Überschuss abgesaugt wird und wobei der Autosampler so programmiert ist, dass er periodisch eine Testprobe in den fließenden Strom der Trägerflüssigkeit einbringt, so dass sie mit dieser in die Perfusionskammer strömt,
ein solches Verfahren, bei dem die Perfusionskammer eine Mikroperfusionskammer ist, die ein Volumen von 5 μl bis ungefähr 50 μl besitzt;
ein solches Verfahren, bei dem das Volumen der Mikroperfusionskammer ungefähr 10 μl bis ungefähr 15 μl beträgt;
ein solches Verfahren, bei dem das Volumen der Mikroperfusionskammer ungefähr 10 μl bis ungefähr 12 μl beträgt;
ein solches Verfahren, bei dem die Trägerflüssigkeit periodisch in die Perfusionskammer eingebracht und die überschüssige Flüssigkeit abgesaugt wird und wobei der Autosampler so programmiert ist, dass er periodisch eine Testprobe in die Perfusionskammer strömen lässt;
ein solches Verfahren, bei dem einige der Behälter in dem Autosampler die Trägerflüssigkeit enthalten und wobei der Autosampler programmiert ist, periodisch die Trägerflüssigkeit und die Testprobe nacheinander in die Perfusionskammer einzuführen;
ein solches Verfahren, bei dem nur kleine Volumina sowohl der Testproben als auch der Trägerflüssigkeit verwendet werden, wobei die Perfusionskammer eine Mikroperfusionskammer ist, die ein Volumen von ungefähr 5 μl bis 50 μl besitzt, wobei einige der Behälter in dem Autosampler die Trägerflüssigkeit enthalten und wobei dieser Autosampler zunächst ein Volumen der Trägerflüssigkeit aus einem der Behälter ansaugt und die Trägerflüssigkeit veranlasst, in die Mikroperfusionskammer einzutreten, und wobei der Autosampler danach eine Testprobe aus einem der Behälter ansaugt und die Testprobe veranlasst, in die Mikroperfusionskammer einzutreten und die Trägerflüssigkeit in der Kammer zu ersetzen, und wobei eine elektrische Messung sowohl dann durchgeführt wird, wenn sich die Trägerflüssigkeit in der Mikroperfusionskammer befindet, als auch dann, wenn sich die Testprobe in der Mikroperfusionskammer befindet,
ein solches Verfahren, bei dem das Volumen der Mikroperfusionskammer ungefähr 10 μl bis ungefähr 15 μl beträgt;
ein Verfahren, bei dem das Volumen der Mikroperfusionskammer ungefähr 10 μl bis ungefähr 12 μl beträgt,
ein solches Verfahren, bei dem an die Elektroden ein äußerer elektrischer Strom angelegt wird, um den Referenzstrom auf den gewünschten Wert zu bringen, und
ein solches Verfahren, bei dem ein externer elektrischer Strom an die Elektroden angelegt wird, um den elektrischen Strom auf den gewünschten Wert zu bringen.
BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNG
In der Zeichnung zeigen:
1 eine schematische Ansicht einer allgemeinen Baueinheit von Komponenten, die in Kombination mit der Durchführung der verschiedenen Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung verwendet werden;
2 eine schematische Darstellung eines Teils der Vorrichtung, wie sie bei der Durchführung des kontinuierlichen Strömungsverfahrens der vorliegenden Erfindung verwendet wird,
3 eine schematische Darstellung eines Teils der Vorrichtung, die abgewandelt ist und verwendet wird, um das U-Röhrchen-Verfahren der vorliegenden Erfindung durchzuführen,
4 eine schematische Ansicht eines Teils der Vorrichtung, die modifiziert ist und bei der Durchführung des Stop-Flow-Verfahrens der vorliegenden Erfindung verwendet wird,
5 eine Draufsicht auf eine Mikroperfusionskammer-Platte gemäß einer Form der Erfindung,
6 eine Querschnittsansicht durch die Mikroperfusionskammer-Platte aus 5 längs der Linie 6-6 aus 5,
7 eine Draufsicht auf eine Mikroperfusionskammer-Platten-Baueinheit gemäß einer anderen Ausführungsform der Erfindung,
8 eine Draufsicht auf die Mikroperfusionskammer-Platte der Baueinheit aus 7,
9 eine Ansicht von unten der Mikroperfusionskammer-Platte der Baueinheit aus 7,
10 eine Querschnittsansicht längs der Linie 10-10 aus 8,
11 ein Diagramm, das die Wirkung von Referenzverbindungen auf spannungsabhängige Kalzium-Kanäle wiedergibt,
12 ein Diagramm, das die Wirkung von Testverbindungen auf durch Kalzium aktivierte Natrium-Kanäle wiedergibt,
13 eine schematische Ansicht eines drehbaren äußeren Teils eines Drehtisches, der mehrere Perfusionskammern umfasst,
14 eine schematische Ansicht eines feststehenden inneren Teils eines Drehtisches, der mehrere Perfusionskammern umfasst,
15 eine schematische Ansicht des Oberteils eines Drehtisches, der mehrere Perfusionskammern umfasst,
16 eine schematische Ansicht eines Drehtisches, der mehrere Perfusionskammern umfasst, wobei dieser Drehtisch den drehbaren äußeren Teil aus 13, den feststehenden inneren Teil aus 14 und den Oberteil aus 15 umfasst,
17 eine schematische Ansicht des Drehtisches aus 16, der weiterhin eine Anzahl von Trägern umfasst, von denen jeder geeignet ist, einen Pipettenhalter zu tragen,
18 eine Querschnittsansicht des Drehtisches aus 17,
19 eine Draufsicht auf einen Pipettenhalter und einen Vorverstärker,
20 zeigt ein Beispiel eines eingefrorenen Bildes einer Pipettenspitze und einer Anzahl von Zellen,
21 zeigt Pixelblöcke von 100×100 Pixeln in einem eingefrorenen Bild,
22 zeigt einen Filter, wie er für die räumliche Filterung in Schritt 1 des Verfahrens zur Ermittlung der „besten Zelle" verwendet wird,
23 zeigt einen „Auffüll"-Filter, der für eine räumliche Filterung in Schritt 2 des Verfahrens zur Ermittlung der „besten Zelle" verwendet wird,
24 zeigt einen „Größe"-Filter, wie er für die räumliche Filterung in Schritt 3 des Verfahrens zur Ermittlung der „besten Zelle" verwendet wird,
25 zeigt einen „Isolieren"-Filter, wie er für die räumliche Filterung in Schritt 4 des Verfahrens zur Ermittlung der „besten Zelle" verwendet wird, und
26 zeigt ein Bild einer Pipettenspitze, deren Position gerade ermittelt wird.
BESCHREIBUNG DER BEVORZUGTEN AUSFÜHRUNGSFORMEN
Die vorliegende Erfindung schafft eine Vorrichtung zur Durchführung von Patch-Clamp-Verfahren unter Verwendung eines Autosamplers, wie z.B. ein Verfahren, das eine HPLC-Vorrichtung verwendet, um eine sehr schnelle Vorrichtung zum Durchführen einer großen Anzahl von Experimenten in einem kurzen Zeitraum zu schaffen. Die Erfindung ermöglicht auch die Durchführung von Patch-Clamp-Experimenten unter Verwendung von nur kleinen Mengen von Testproben und kleinen Mengen von Trägerflüssigkeit. Die vorliegende Erfindung schafft auch mehrere neue Strukturen für Mikroperfusionskammern, die in der Lage sind, Patch-Clamp-Untersuchungen zu unterstützen, wobei nur sehr kleine Mengen der Testproben und sehr kleine Mengen der Trägerflüssigkeit verwendet werden. Die vorliegende Erfindung schafft auch mehrere verschiedene Verfahren zur Durchführung von Patch-Clamp-Experimenten unter Verwendung der neuen Vorrichtung. Weiterhin schafft die vorliegende Erfindung ein Verfahren und eine Vorrichtung zur automatischen Erkennung von Zellen und einer Pipettenspitze, wodurch das automatische Patch-Clamp-Verfahren und das Testen der Zellen erleichtert werden.
In 1 ist eine allgemeine Anordnung von Komponenten zur Durchführung der vorliegenden Erfindung dargestellt. Die dargestellte Anordnung ist insbesondere für eine Verwendung bei der Durchführung der Ausführungsform der Erfindung konstruiert, die als „Verfahren mit kontinuierlicher Strömung" bezeichnet wird. Mit einigen Abwandlungen kann die Anordnung jedoch auch bei der Durchführung anderer Ausführungsformen der Erfindung verwendet werden, wie noch beschrieben wird. Die Anordnung 10 von Komponenten umfasst einen Lufttisch 12, der einen Faraday'schen Käfig 14 trägt. Innerhalb des Faraday'schen Käfigs 14 ist eine Brücke 16 angeordnet, die eine Tischoberseite 18 trägt. Ein Autosampler 20 (Gilson Model 231 SL), der allgemein mit einem HPLC-System (High Performance Liquid Chromatograph) verwendet wird und mit einem Mehrfachanschluss-Ventil 22 ausgestattet ist, ist auf der Tischoberseite 18 zusammen mit einer Spritzenpumpe 24 und einer peristaltischen Pumpe 26 (Gilson Modell Miniplus 3) montiert. Testverbindungen in Lösung sind in Probenbehältern 28 enthalten, die in einem Autosampler-Korb 21 angeordnet sind. Eine Nadel 30, die eine Komponente des Autosamplers 20 ist, ist so montiert, dass sie sowohl seitlich als auch vertikal zwischen den Behältern 28 bewegbar ist. Eine Spülstation 23 ist vorgesehen, um Lösungsmittel zu sammeln, das zum Spülen der Nadel 30 verwendet wurde. Ein Injektionsdurchgang 32 steht mit dem Mehrfachanschluss-Ventil 22 in Verbindung. Die Spritzenpumpe 24 ist mit der Nadel 30 über eine Leitung 40 verbunden und bewirkt im Betrieb, dass die Nadel 30 ein abgemessenes Volumen von Flüssigkeit aus einem vor-ausgewählten Probenbehälter 28 an einer spezifischen Stelle des Autosampler-Korbes 21 aufzieht. Wenn die Nadel 30 eine zu testende, in Lösung befindliche Probe aufgezogen hat, bewegt sie sich zum Injektionsdurchgang 32 und injiziert die Probe in ihn hinein.
Ein Trägerflüssigkeits-Behälter 34, der geeignet ist, ein Fluid, wie z.B. eine physiologische Salzlösung zu enthalten, ist innerhalb des Faraday'schen Käfigs 14 montiert. Ein Sammelbehälter 36 für abzuführende Flüssigkeit ist ebenfalls innerhalb des Faraday'schen Käfigs 14 montiert. Eine Vielzahl von Leitungen verbindet die verschiedenen Komponenten der Baueinheit miteinander zu dem Zweck, zwischen ihnen Fluide zu transportieren. Beispielsweise verbindet eine Leitung 38 den Behälter 34 für Trägerflüssigkeit mit der peristaltischen Pumpe 26; eine Leitung 39 verbindet den Behälter 34 für Trägerflüssigkeit mit der Spritzenpumpe 24; eine Leitung 40 verbindet die Nadel 30 mit der Spritzenpumpe 24; eine Leitung 42 verbindet das Ventil 22 mit dem Sammelbehälter 36 für abzuführende Flüssigkeit; eine Leitung 44 verbindet die peristaltische Pumpe 26 mit dem Mehrfachverbindungs-Ventil 22; eine Leitung 48 verbindet den Injektionsdurchgang 32 mit dem Mehrfachanschluss-Ventil 22; eine Leitung 50 verbindet die Spülstation 23 mit dem Sammelbehälter 36 für abzuführende Flüssigkeit und eine Leitung 52 verbindet die peristaltische Pumpe 26 mit dem Sammelbehälter 36 für abzuführende Flüssigkeit.
Auf einem gesonderten Tisch ist ein invertiertes Mikroskop 54 (Nomarski Optics, Olympus Modell 9-70) montiert, das eine Bühne 56 besitzt. Das Mikroskop selbst ist an den beweglichen Teil des Tisches befestigt. Zumindest ein elektronischer Mikromanipulator 58 (Eppendorf) ist ebenfalls an der Mikroskopbühne 56 montiert und trägt einen Patch-Pipetten-Elektrodenhalter 60, an dem ein Vorverstärker (headstage) 61 und eine konventionelle Patch-Pipette 62 montiert sind, und der optional andere Elektroden halten kann, um die Spannungs- und Strom-Clamp-Kreise zu vervollständigen. Eine Mikroperfusionskammer-Platte 64 ist auf der Mikroskopbühne 56 montiert und umfasst eine Mikroperfusionskammer 72. Eine Zuführleitung 66 verbindet einen Auslass vom Mehrfachverbindungs-Ventil 22 mit einem Einlass der Mikroperfusionskammer-Platte 64 und eine Leitung 68 für abzuführende Flüssigkeit verbindet den Durchgang für abzuführende Flüssigkeit der Mikroperfusionskammer-Platte 64 mit einer Unterdruckquelle zum Entfernen von Abwasser. Der Abstand vom Auslass des Ventils 22 zur Mikroperfusionskammer 72 beträgt 10 cm, um das Totvolumen zu minieren. Die Elektrode in der Patch-Pipette 63 und die Referenzelektrode sind beide mit dem Vorverstärker 61 verbunden. Ein elektrischer Draht 76 verbindet den Vorverstärker 61 mit dem Spannungsverstärker 78. Ein elektrischer Draht 77 verbindet eine Referenzelektrode in der Mikroperfusionskammer 72 mit dem Vorverstärker 61. Weitere Spannungs- oder Strom-Clamp-Elektrodendrähte sind mit dem Verstärker verbunden, der so konstruiert ist, dass er den gewünschten Strom- oder Spannungsgradienten durch den Vorverstärker 61 erzeugt. Der Spannungsverstärker 78 ist seinerseits elektrisch mit einem Computer 80 verbunden, der verwendet wird, um die elektrischen Impulse zu messen, welche den Durchgang von Ionen durch Ionenkanal-Proteine der Membran oder Zelle anzeigen, die getestet wird. Der elektronische Mikromanipulator 58, der den Patch-Pipetten-Halter 60 trägt, ist auf der rechten Seite der Mikroskopbühne 56 montiert.
Um genau definierte Zugaben zu den Zellen oder Membranen zu erhalten und nur kleine Volumina von Testproben und Trägerflüssigkeiten zu verwenden, sollte der Auslass des Ventils 22 so nahe wie möglich bei der Mikropertusionskammer sein, oder bei dem U-Röhrchen, wenn diese Komponente verwendet wird. Daher ist der Autosampler selbst innerhalb des Faraday'schen Käfigs angeordnet, wie in 1 gezeigt, in der Nähe des Vorverstärkers 61 des Patch-Clamp-Verstärkers 78 und der Patch-Pipette 62, die mit der unter Test befindlichen Membran in Berührung steht. Dies führt zu zwei möglicherweise ernsten Problemen:
1) Elektrisches Rauschen
Das Einbringen irgendeiner Vorrichtung, die mit einer Wechselspannung versorgt werden muss, in einen Faraday'schen Käfig führt zu einer Quelle von elektromagnetischer Strahlung mit 50 Hz oder 60 Hz. Dieses elektromagnetische Rauschen kann ohne weiteres durch die Elektrode in der Patch-Pipette 62 aufgenommen werden (die dann als Antenne wirkt), wodurch das Stromsignal gestört wird. Ein sorgfältiges Erden aller metalli schen Teile des gesamten Aufbaus mit einer gemeinsamen qualitativ hochwertigen Masse löst dieses Problem im Wesentlichen. Es muss spezielle Sorgfalt aufgewendet werden, um kritische Teile des Autosamplers 20 zu erden und abzuschirmen, um übermäßiges elektrisches Rauschen zu vermeiden. Wenn andere Autosampler verwendet werden, bei denen es möglicherweise schwieriger ist, sie in wirksamer Weise zu erden, als bei dem Gilson-Modell, das bei dem in 1 dargestellten Aufbau verwendet wird, kann es nötig werden, den Autosampler in einem gesonderten Faraday'schen Käfig abzuschirmen.
2) Vibrationen
Vibrationen werden vom Autosampler 20 erzeugt, wenn sich die Nadel 30 zwischen den Probenbehältern 28 bewegt. Dies hat zwei Folgen: 1) Vibrationen, die auf die Pipette 62 übertragen werden, zerstören in untermeidlicher Weise die Giga-Dichtung (Giga-Ohm-Dichtung) sowohl beim Aufzeichnungsmodus, bei dem die Zelle von außen berührt wird, als auch beim Gesamtzellen-Aufzeichnungs-Modus. 2) Selbst schwache mechanische Vibrationen können in niederfrequentes elektrisches Rauschen transformiert werden, das im Stromsignal auftritt. Mit der Brückenanordnung, wie sie in 1 dargestellt ist, werden jedoch beide Probleme vermieden.
Das Verfahren wird in der Weise durchgeführt, dass eine Membran, die Ionenkanäle aufweist, in die Mikroperfusionskammer 72 eingebracht wird. Das Patch-Clamp-Verfahren kann in bequemerer Weise dadurch durchgeführt werden, dass ein kleines Abdeckglas 74 (2,8 mm) eingeführt wird, auf dem die kultivierten Zellen in der Mikroperfusionskammer 72 angeordnet werden können. Die Patch-Elektroden-Pipette 62 wird dann in die Mikroperfusionskammer 72 abgesenkt, bis sie mit der auf dem kleinen Abdeckglas 74 getragenen Membran in Berührung kommt. Es wird ein Unterdruck an die Patch-Pipette 62 angelegt, bis eine Giga-Dichtung (Giga-Ω) zwischen dem Ende der Patch-Pipette 62 und der biologischen Membran erzeugt worden ist. Dann wird das Testverfahren durchgeführt. Ein elektrisches Signal wird durch eine Elektrode in der Patch-Pipette 62 detektiert, die an den Vorverstärker 61 angeschlossen ist, und wird dann mit Hilfe des elektrischen Drahtes 76 zum Spannungsverstärker 78 und dem in 1 dargestellten Computer 80 übertragen. Eine Referenzelektrode (nicht dargestellt), die mit den Lösungen in der Kammer in Berührung steht, ist mit dem Masseanschluss des Vorverstärkers 61 verbunden.
Verschiedene Trägerlösungen können an die Verwendung beim Patch-Clamp-Verfahren in Abhängigkeit von dem für die zu testenden Verbindungen geeigneten Protokoll angepasst werden. Eine Standardlösung, die für die Aufzeichnung von durch Kalzium aktivierten Natriumkanälen geeignet ist, umfasst (in mM) 140 KCl, 1 CaCl₂, 1 MgCl₂, 1,3-EGTA, 10 HEPES. Diese Zusammensetzung führt zu einer freien Kalziumkonzentration in Lösung von 0,3 μM. Eine durch Kalziumionen induzierte K-Kanal-Aktivierung kann dadurch erzielt werden, dass man die EGTA-Konzentration auf 1,07 mM ändert, was zu einer freien Kalziumkonzentration in der Lösung von 1,0 μM führt. Testverbindungen werden in der Trägerlösung in Abhängigkeit von dem Protokoll der gewählten Untersu chungsmethode aufgelöst. Alle Testverbindungs-Lösungen und physiologischen Salzlösungen werden gefiltert, bevor sie in der Vorrichtung verwendet werden.
Bei der mit kontinuierlicher Strömung arbeitenden Form des Verfahrens wird, wie in 1 gezeigt, eine kontinuierliche Strömung der Trägerflüssigkeit mit Hilfe der peristaltischen Pumpe 26 erzeugt. Periodisch saugt der Autosampler 20 ein festgelegtes Volumen der Testverbindung aus einem gewählten Probenfläschchen 28 und bringt es über den Injektionsdurchgang 32 in die Schlauchschleife 70 (gesamte Schleifenfüllung) ein. Das Probenvolumen, das Schleifenvolumen, die Strömungsrate usw. sind optional. Nach dem Einbringen schaltet der Auslass des Mehrfachanschluss-Ventils 22 um und der Schleifeninhalt wird durch die Leitung 66 vom Ventil zur Mikroperfusions-Platte in die Mikroperfusionskammer 72 geleitet, aus der überschüssiges Fluid durch Absaugung entfernt wird. Die zeitliche Dauer der Zugabe der Testverbindungen wird durch die Schleifengröße und die Strömungsrate festgelegt. Die Ausspülzeit der Verbindung wird optional durch die Periode zwischen Injektionen bestimmt. Der Autosampler ändert die Kammerlösungen automatisch entsprechend einem im voraus festgelegten Programm. Die Anzahl der zwischen den Auswasch-Perioden getesteten Verbindungen variiert gemäß dem gewählten Protokoll.
Die spezifischen Vorteile des vorliegenden mit kontinuierlicher Strömung arbeitenden Systems im Vergleich zu herkömmlicheren, mit kontinuierlicher Strömung arbeitenden Systemen sind:

1) Automatisches Austauschen der Testlösungen
2) Extensive und flexible Koordination zwischen dem Autosampler und dem Patch-Clamp-Verstärker
3) Flexibilität der Zugabe der Verbindungen, des Änderns des Programms während der Experimente usw.
4) Automatische Auflösung von Verbindungen unmittelbar vor dem Testen der Verbindung (wichtig für instabile Materialien).
5) Automatisches Spülen der Nadel und des Injektionsdurchgangs zur Vermeidung von Materialverschleppungen zwischen einzelnen Zugaben.

In 2 sind die Einzelheiten des mit kontinuierlicher Strömung arbeitenden Verfahrens unter Verwendung der in 1 wiedergegebenen Vorrichtung in einem schematischen Diagramm dargestellt. Im Betrieb wird eine physiologische Salzlösung oder eine andere Trägerflüssigkeit von der Peristaltik-Pumpe 26 mit einer stetigen Rate durch das Ventil 22 und weiter zur Mikroperfusionskammer 72 gepumpt. Es wird auch Fluid kontinuierlich durch Unterdruck aus der Mikroperfusionskammer 72 über die Leitung 68 abgesaugt. Das Verfahren setzt sich in der folgenden Weise fort:

a) Ein kleines Luftvolumen wird durch die Spritzenpumpe 24 in die Nadel 30 angesaugt.
b) Die Nadel 30 wird zu einem Probenfläschchen 28 bewegt und saugt ein festgelegtes Volumen der Probe an.
c) Die Nadel 30 wird zum Injektionsdurchgang 32 bewegt und belädt die Schlauchschleife 70 mit der Probe (üblicherweise dreimal das Schleifenvolumen; überschüssiges Volumen wird über den Auslass 5 des Mehrfachanschluss-Ventils 22 zurückgewiesen).
d) Das Mehrfachanschluss-Ventil 22 schaltet auf den Injektionsmodus um und der Inhalt der Schlauchschleife 70 wird in die Leitung 66 injiziert, die vom Ventil 22 zur Mikroperfusionskammer 72 führt.
e) Das Mehrfachanschluss-Ventil 22 schaltet auf den Modus mit kontinuierlicher Strömung um und die Salzlösung strömt weiter, nachdem die Proben-Teilmenge getestet worden ist.
f) Bevor die nächste Zugabe eingeleitet wird, wird die Nadel 30 gespült (Perfusion auf beiden Seiten mit Vorratslösung) in der Spülstation 23. Die Vorratslösung wird aus dem Trägerfluid-Behälter 34 durch die Leitung vom Trägerfluid-Behälter 39 abgezogen und durch die Nadel 30 an der Spülstation 23 abgegeben. Der Injektionsdurchgang 32 wird dadurch gespült, dass Vorratssalzlösung durch das Ventil 22 zugeführt wird, wobei die abzuführende Lösung durch den Auslass 5 abgegeben wird.

In 3 ist eine modifizierte Ausführungsform der Erfindung dargestellt, die verwendet wird, um das U-Röhrchen-Verfahren durchzuführen. Die bei der Durchführung des Verfahrens dieser Ausführungsform verwendeten Komponenten sind im Wesentlichen die gleichen wie die in 1 gezeigten mit der Ausnahme, dass die Testprobe in die Perfusionskammer 73 durch eine Öffnung 83 abgegeben wird, die in der Unterseite eines U-Röhrchens 82 vorgesehen ist.
Herkömmliche, für eine schnelle Probenzugabe geeignete Systeme, wie das U-Röhrchen-System können von der Vorrichtung gemäß der vorliegenden Erfindung einschließlich des Autosamplers leicht bedient werden. Die Zellen werden in einer Perfusionskammer angeordnet, die etwas größeren ist als die, welche bei dem oben beschriebenen Verfahren mit kontinuierlicher Strömung verwendet wird. Dies erleichtert die Positionierung des U-Röhrchens. Der Autosampler arbeitet bei dem U-Röhrchen-Verfahren im Wesentlichen in der gleichen Weise wie bei dem oben beschriebenen Verfahren mit kontinuierlicher Strömung. Die Membran wird kontinuierlich von normaler Salzlösung durchströmt, die mit einer stetigen Rate von der peristaltischen Pumpe 26 durch eine Leitung 67 gepumpt wird, die von der peristaltischen Pumpe 26 zur Perfusionskammer 73 führt (diese Leitung verläuft nicht durch das Mehrfachanschluss-Ventil 22). Das Fluid wird auch kontinuierlich von der Perfusionskammer 73 über eine Leitung 68 und die peristaltische Pumpe abgesaugt. Die peristaltische Pumpe pumpt auch kontinuierlich normale Salzlösung durch das U-Röhrchen 82. Das Fluid wird durch das Mehrfachanschluss-Ventil 22 und dann weiter zu dem U-Röhrchen durch die Leitung 69 gepumpt. Wegen des verminderten Druckes in dem U-Röhrchen, der sich aus der Fluidströmung ergibt, wird eine kleine Menge von Fluid aus der Perfusionskammer 73 durch die Öffnung 83 in das U-Röhrchen hinein angesaugt. Wie bei dem Verfahren mit kontinuierlicher Strömung wird eine Arzneimittelprobe in die Schlauchschleife 70 eingebracht. Das Mehrfachanschluss-Ventil 22 schaltet auf den Injektionsmodus um und der Inhalt der Schlauchschleife 70 wird in die Leitung 69 vom Auslassdurchgang des Mehrfachanschluss-Ventils 22 zum U-Röhrchen 82 injiziert. Das Magnetventil 84 am Auslass des U-Röhrchens 82 wird geschlossen, was zu einem Anstieg des Drucks im U-Röhrchen führt, wodurch ein Teil der Arzneimittelprobe durch die Öffnung 83 und in die Perfusionskammer 73 gedrückt wird. Nachdem der Test der Arzneimittelprobe abgeschlossen ist, wird das Ventil 84 wieder geöffnet, wodurch ein weiteres Fließen der Medikamentenprobe durch die Öffnung 83 gestoppt wird. Die kontinuierliche Absaugung aus der Perfusionskammer spült die Medikamentenprobe schnell aus der Perfusionskammer fort.
Die Zugabezeit ist optional und wird durch den Zeitraum bestimmt, für den das Ventil geschlossen ist. Die Verwendung des U-Röhrchens erfordert eine größere experimentelle Perfusionskammer, wie in 3 dargestellt. Das U-Röhrchen wird von einem getrennten Mikromanipulator eingebracht und unter optischer Führung mit Hilfe des Mikroskops positioniert.
Der Vorteil des U-Röhrchen-Systems besteht darin, dass es eine kurze Zugabezeit, die für das Studium von durch Transmitter regulierten Kanälen erforderlich ist, mit der hohen Kapazität und dem Bedarf für kleine Volumina des Autosamplers kombiniert.
3 zeigt das Strömungsmuster, wie es in dem U-Röhrchen-System stattfindet. Dieses Muster ist im Wesentlichen das gleiche wie bei dem Verfahren mit kontinuierlicher Strömung, das oben beschrieben wurde. Im Betrieb wird Salzlösung mit einer stetigen Rate durch die Peristaltik-Pumpe 26 durch eine Leitung 67 gepumpt, die von der Peristaltik-Pumpe 26 zur Perfusionskammer 73 führt (diese Leitung verläuft nicht durch das Mehrfachanschluss-Ventil 22). Fluid wird auch kontinuierlich aus der Perfusionskammer 73 über die Leitung 68 und die Peristaltik-Pumpe abgesaugt. Die Peristaltik-Pumpe pumpt auch kontinuierlich normale Salzlösung durch das U-Röhrchen 82. Das Fluid wird durch das Mehrfachanschluss-Ventil 22 und weiter zum U-Röhrchen über die Leitung 69 gepumpt. Das allgemeine Verfahren ist das folgende:

a) Ein kleines Luftvolumen wird durch die Spritzenpumpe 24, die in 1 dargestellt ist, in die Nadel 30 angesaugt.
b) Die Nadel 30 wird zu einem Probenfläschchen 28 bewegt und saugt ein festgelegtes Volumen der Probe an.
c) Die Nadel 30 wird zum Injektionsdurchgang 32 bewegt und belädt die Schlauchschleife 70 mit der Probe (üblicherweise dreimal das Schleifenvolumen; überschüssiges Volumen wird durch den Auslass 5 abgewiesen).
d) Das Mehrfachverbindungs-Ventil 22 schaltet auf den Injektionsmodus um und der Inhalt der Schlauchschleife 70 wird in die Leitung 69 injiziert, die vom Auslassdurchgang des Mehrfachanschluss-Ventils 22 zum U-Röhrchen 82 führt.
e) Die Zugabe erfolgt durch Schließen des U-Röhrchen-Auslasses durch das Magnetventil 84.
f) Wenn das Magnetventil 84 wieder geöffnet wird, verdrängt der Strom normaler Salzlösung die Probe in dem U-Röhrchen. Die Probenlösung wird aus der Perfusionskammer 73 durch die kontinuierliche Strömung von normaler Salzlö sung ausgespült, die von der Leitung 67 gepumpt wird und durch die Leitung 68 abgesaugt.
g) Bevor die nächste Zugabe eingeleitet wird, wird die Nadel 30 gespült (Perfusion auf beiden Seiten mit Behälterlösung) in der Spülstation. Der Injektionsdurchgang 32 wird dadurch gespült, dass Vorratssalzlösung durch das Ventil 22 eingebracht wird, wobei abzuführende Lösung durch den Auslass 5 abgeführt wird.

Um die Anforderungen hinsichtlich des Lösungsvolumens und des Volumens der Testverbindung auf ein absolutes Minimum zu reduzieren, wurde ein Stopp-Flow-Verfahren gemäß der vorliegenden Erfindung entwickelt.
In 4 ist eine etwas abgewandelte Anordnung einiger der Komponenten dargestellt, die dazu dient, das Stopp-Flow-Verfahren durchzuführen. Das Gesamtvolumen des Totraums einschließlich des Injektionsdurchganges 32, des Mehrfachanschluss-Ventils 22 und der Schlauch- bzw. Rohrleitungen ist jetzt besonders kritisch. Folglich wird die Schlauchschleife 70 durch ein kurzes gerades Rohrstück 86 ersetzt, um den Weg der Testlösung zu verkürzen und dadurch das Volumen der erforderlichen Lösung zu vermindern. Das Volumen wird auch 15 μl durch eine spezielle Verbindung von Ventil-Einlässen und -Auslässen (keine Schleife) vermindert. Bei dieser Anordnung ist die Arbeitsweise des Autosamplers etwas unterschiedlich von der, die bei HPLC-Autosamplern Verwendung findet. Das allgemeine Prinzip ist jedoch einfach, und besteht darin, dass der Autosampler ein festgelegtes Volumen aus einem Probegläschen ansaugt und es direkt in die Mikroperfusionskammer 100 einbringt. Dieser Vorgang läuft in folgender Weise ab:

a) Ein kleines Luftvolumen wird in die Nadel 30 mit Hilfe der Spritzenpumpe 24 angesaugt, die in 1 dargestellt ist.
b) Die peristaltische Pumpe 26, die in 1 dargestellt ist, wird unmittelbar vor der Injektion automatisch aktiviert und überschüssiges Fluid in der Mikroperfusionskammer 100 wird abgesaugt.
c) Die Nadel 30 wird zu einem Probenfläschchen 28 bewegt und saugt 200 μl der Testlösung (Kontrolllösung + Testverbindung) oder nur Salzlösung an.
d) Die Nadel 30 wird zum Injektionsdurchgang bewegt. Unter Verwendung der Option „teilweise Schleifenfüllung" des Samplers werden die ersten injizierten 20 μl (die möglicherweise Luftblasen enthalten) durch einen Ventilauslass 5 für abzuführende Flüssigkeit und die Leitung 42 abgeführt.
e) Das Ventil wird umgeschaltet und die verbleibende Lösung, 180 μl, wird direkt in die Mikroperfusionskammer 100 eingegeben (Einführzeit 15 s, doch prinzipiell optional), wobei kontinuierlich überschüssiges Volumen aus der Kammer 100 durch die Leitung 68 abgesaugt wird.
f) Nach der Injektion werden die Pumpe und der Flüssigkeitsstrom für den erforderlichen Zeitraum angehalten und es werden die erforderlichen elektrischen Messungen als Anzeige für die Größe des Ionentransfers durchgeführt und der entsprechende Wert wird vom Computer aufgezeichnet.
g) Bevor die nächste Zugabe eingeleitet wird, wird die Nadel 30 gespült (Perfusion auf beiden Seiten mit Vorratslösung) in der Spülstation. Der Injektionsdurchgang 32 wird dadurch gespült, dass Vorratssalzlösung durch den Auslass 5 des Ventils 22 zugeführt wird.

Der Vorteil des Stopp-Flow-Systems ist primär, das nur ein sehr kleines Probenvolumen (maximal 220 μl insgesamt) benötigt wird. Wenn eine kleinere Perfusion als ungefähr das 20-fache des Kammervolumens akzeptabel ist, kann das Gesamtvolumen entsprechend vermindert werden. Experimente, die gemäß der vorliegenden Erfindung durchgeführt wurden, zeigen, dass mehr als 90% Austausch dadurch erzielt wird, das lediglich 100 μl injiziert werden (Gesamtmenge 140 μl). Ein derartig kleines, benötigtes Volumen ermöglicht den elektrophysiologischen Test von gesamten chemischen Bibliotheken, die häufig auf kleinen Mengen von Verbindungen aus der Synthese und/oder Isolation aus natürlichen Produkten beruhen.
Es wurden mehrere Mikroperfusionskammer-Baueinheiten entwickelt, die extrem kleine Mikroperfusionskammern besitzen. Die Verwendung dieser Mikroperfusionskammern schafft ein System zur Analyse von extrem kleinen Volumina von Testproben und Trägerflüssigkeiten, wodurch in sehr großem Maße die Zeit vermindert wird, die für das Testverfahren benötigt wird.
In den 5 und 6 ist eine Perfusionskammer-Baueinheit 88 mit sehr kleinem Volumen dargestellt. Wegen der extrem kleinen Größe der Kammer ist kein ausreichender Platz vorhanden, um zwei Elektroden in der Mikroperfusionskammer 100 zu positionieren. Folglich muss die Referenzelektrode ein integraler Teil der Kammerstruktur sein. Bei dem in den 5 und 6 dargestellten Ausführungsbeispiel umfasst die Kammer-Baueinheit 88 eine Silberscheibe 90, die mit einer dünnen Schicht 92 aus Silberchlorid beschichtet ist. Die Silberscheibe 90 und die Silberchloridschicht 92 wirken in der Weise zusammen, dass sie als Referenzelektrode dienen. Die Silberscheibe 90 hat eine Dicke von 1 mm und einen Durchmesser von 6 mm. Eine Öffnung 94 mit 3 mm ist in das Zentrum der Scheibe gebohrt, um den Hohlraum der Mikroperfusionskammer 100 zu bilden. Ein Silberdraht 96 ist an die Silberscheibe 90 angelötet. Die Silberchloridschicht 92 wurde dadurch auf die Oberfläche der Silberscheibe 90 aufgebracht, dass die Silberscheibe 90 in eine wässrige Lösung von Natriumchlorid eingebracht und die Scheibe 2 Stunden lang einem Elektrolyse-Verfahren unterzogen wurde, während dessen die Scheibe als Anode angeschlossen war und ein gesonderter Silberdraht als Kathode Verwendung fand. Um ein Kurzschließen der Elektrode zu verhindern, sollte zumindest die gesamte Oberfläche der Öffnung 94 mit Silberchlorid beschichtet sein. Vorzugsweise ist die gesamte Silberscheibe 90 mit Silberchlorid beschichtet, einschließlich der Oberfläche der Öffnung 94. Ein Abdeckglas 98 mit einem Durchmesser von 40 mm und einer Dicke von 0,1 mm wird an den Boden der beschichteten Silberscheibe 90 über der Öffnung 94 angeklebt, um einen durchsichtigen Boden der Mikroperfusionskammer 100 zu bilden. Das Volumen der Mikroperfusionskammer 100 kann im Bereich von 5 μl bis 50 μl liegen. Noch bessere Ergebnisse können mit einer Mikroperfusionskammer 100 im Bereich von 10 μl bis 15 μl erzielt werden, obwohl der bevorzugte Bereich 10 μl bis 12 μl beträgt, um nur kleine Proben des zu untersuchenden Materials und kleine Volumina der Trägerflüssigkeit zu verwen den, wodurch die Zeit vermindert wird, die für jeden Test erforderlich ist. Alle Lösungen treten in die Kammer durch den Einlass 102 ein und werden aus der Kammer durch den Auslass 104 abgesaugt.
Kultivierte Zellen kann man in Monoschichten auf kleinen Abdeckgläsern 74 (Dicke 0,1 mm, Durchmesser 2,6 mm) in einem Standard-Inkubator wachsen lassen. Vor der Durchführung der Experimente wird ein einzelnes Abdeckglas 74 mit Hilfe einer dünnen Pinzette auf den Boden der Mikroperfusionskammer 100 übergeführt und mit Salzlösung überspült. Die Patch-Pipette 62, die in 1 dargestellt ist, wird als Standard-Patch-Clamp-Vorrichtung, die einen End-Widerstandswert von 2 MΩ bis 6 MΩ erzeugt, von oben her abgesenkt, wie in den 1, 2, 3 und 4 dargestellt. Die Patch-Pipette 62 hat eine in ihr montierte Silber-Silberchlorid-Elektrode 63 und wird vom Patch-Pipettenhalter 60 getragen, bei dem es sich um einen Standardtyp handelt, der von HEKA-Electronics entwickelt wurde. Der Durchmesser der Pipette ist ungefähr 1 μm. Folglich bleibt dann, wenn die Pipette durch Ansaugung und Rückfüllung gefüllt wird, die Lösung aufgrund der Kapillarwirkung an ihrem Platz. Es ist nur eine geringe Saugwirkung, die vom Mund ausgeübt wird, erforderlich, um eine Giga-Dichtung zwischen der Pipette und der beim Testen verwendeten Membran zu erzeugen. Die in der Patch-Pipette 62 enthaltene Elektrode 63 ist elektrisch mit dem Vorverstärker 61 verbunden, der seinerseits elektrisch mit dem Patch-Clamp-Verstärker 78 verbunden ist, der seinerseits mit dem Rechner 80 verbunden ist. Der Silberdraht 96 ist elektrisch mit der Referenzelektrode verbunden, die die Silberscheibe 90 und die Silberchloridschicht 92 umfasst. Die Referenzelektrode ist mit dem Silberdraht 96 verbunden, der seinerseits elektrisch mit dem Masseanschluss am Vorverstärker 61 verbunden ist.
Der Einfluss einer jeden im Test befindlichen Probe auf die Ionenkanalübertragung wird durch den elektrischen Strom durch die Elektrode, die in der Patch-Pipette 62 enthalten ist und die Referenzelektrode gemessen und vom Rechner 80 aufgezeichnet.
In den 7, 8, 9 und 10 ist eine alternative Mikroperfusionskammer-Baueinheit 106 dargestellt. Wie in 7 gezeigt, umfasst die Baueinheit 106 eine Metall-Tragscheibe 108, die so konstruiert ist, dass sie genau in die zentrale Öffnung der Mikroskopbühne 56 passt. In der in der Tragscheibe 108 vorgesehenen Öffnung ist eine Mikroperfusionskammer-Scheibe 110 montiert, wie im Einzelnen in den 8 und 9 gezeigt. Die Mikroperfusionskammer-Scheibe 110 kann aus irgendwelchen elektrisch nicht leitfähigen Materialien hergestellt sein, zu denen unter anderem Kunststoffe einschließlich Methylmethacrylat, Polystyren, Polyvinylchlorid, Phenolformaldehyd und viele andere Materialien gehören. Eine Öffnung 112 ist in die Mikroperfusionskammer-Scheibe 110 gebohrt und hat einen Durchmesser von ungefähr 3 mm. Eine Rille 114 ist im Boden der Mikroperfusionskammer-Scheibe 110 vorgesehen und ein Abdeckglas 116 ist am Boden der Scheibe 110 angeklebt. Das Abdeckglas 116 wirkt mit der Öffnung 112 in der Weise zusammen, dass eine Mikroperfusionskammer 118 gebildet wird. Das Abdeckglas 116 arbeitet mit der Rille 114 in der Weise zusammen, dass ein Kanal 117 zum Einführen der flüssigen, zu testenden Probe und der Trag-Salzlösung in die Mikroperfusionskammer 118 gebildet wird. Eine Öffnung 120 ist in der oberen Wand der Scheibe 110 vorgesehen, um als Einlass für das Einführen von Flüssigkeiten in den Kanal 117 zu dienen. Ein Rohr bzw. Schlauch 122 verbindet die Öffnung mit dem Mehrfachanschluss-Ventil 22 des Autosamplers aus 1. Eine kleine Silber-Silberchlorid-Pellet-Elektrode 124 ist in einer Rille 126 eingebettet, die in der oberen Oberfläche der Scheibe 110 vorgesehen ist, und dient als Referenzelektrode. Die Pellet-Elektrode 124 ist aus einer Mischung von Silber und Silberchlorid hergestellt, die um einen Silberdraht herum zusammengepresst ist, der von IN-VIVO-METRIC, Kalifornien, bezogen wurde. Ein Draht von der Elektrode 124 ist direkt mit dem Vorverstärker 78 verbunden, die in 1 gezeigt ist.
Die Absaugung von überschüssigem Fluid aus der Mikroperfusionskammer wie z.B. 72, 100 oder 118 bildet ein besonderes Problem bei kleinen Kammern, da ein großer Bruchteil des Kammer-Gesamtvolumens je Sekunde abgesaugt wird. Eine sehr sanfte Absaugung mit einem winzigen Plastikröhrchen 128 (Eppendorf DELoader Typ) kann verwendet werden und ist wichtig, um Fluktuationen im Bereich der Flüssigkeitsoberfläche zu vermeiden. Instabile Flüssigkeitsoberflächen erzeugen ein veränderliches Hindergrundrauschen und können auch eine erhöhte mechanische Belastung auf die Zelle oder das Patch ausüben, wodurch der Aufzeichnungszeitraum begrenzt wird.
Die folgenden Beispiele dienen nur zur Erläuterung und sind nicht einschränkend zu verstehen. Sie führen zu einem klaren Verständnis der Art und Weise, auf welche die Erfindung ausgeführt werden kann.
BEISPIEL 1
Verfahren mit kontinuierlicher Strömung: Der Kalziumstrom einer dorsalen Wurzel-Ganglien-Zelle eines Hühnchens wurde durch Gesamtzellen-Aufzeichnung unter Verwendung des Verfahrens mit kontinuierlicher Strömung und mit Hilfe einer Vorrichtung ermittelt, wie sie oben beschrieben wurde und in den 7 bis 10 dargestellt ist, wobei diese Vorrichtung einen Autosampler, eine Spritzenpumpe, eine peristaltische Pumpe und eine Mikroperfusionskammer umfasst, die ein Volumen von 12 μl besitzt.
Die Ca²⁺-Ströme wurden von anderen Strömen durch die Verwendung der folgenden Pipetten- und Badlösungen isoliert:
Pipette: CsCl (100 mM), CsF (20 UIM), EGTA (10 mM), MgCl₂ (4 mM), HEPES (10 mM).
Bad: NaCl (140 mM), KCl (4 mM), CaCl₂ (2 mM), MgCl₂ (1 mM), HEPES (10 mM), TTX (0,3 pM). Die hohe Kalziumkonzentration blockiert K⁺-Ströme, während TTX (Tetrodotoxin) die Na⁺-Ströme blockiert.
Die Wirkungen von fünf bekannten Standards, Phenytoin, Amiloride, w-Conotoxin MVIIA, Bay-k 8644 und Nifedipine auf spannungsabhängige Kalziumkanäle wurden der Reihe nach untersucht und sind in 11 wiedergegeben. Die grafische Darstellung zeigt nacheinander durchgeführte Aufzeichnungen des maximalen Stroms, der durch 5 ms betragende Depolarisierungs-Spannungs-Schritte ausgehend vom –70 mV Ruhepotential zu bis 0 mV induziert wurde. Die Verbindungen wurden in Teilmengen von 500 μl durch geleitet. Weder Phenytoin noch Amiloride, die zu den Zeitpunkten 0 bzw. 15 Minuten injiziert wurden, beeinflussten den Strom, was anzeigte, dass sie keinen Einfluss auf die Kalzium-Ionenkanäle haben. Zum 30-Minuten-Zeitpunkt wurde eine Teilmenge von 500 μl von w-Conotoxin MVIIA injiziert. Das (I)-Conotoxin MVIIA hat eine hohe Affinität für die Kalziumkanäle vom N-Typ, wie durch die in der grafischen Darstellung aufgezeichnete Strommodulation gezeigt wird. Die grafische Darstellung zeigt auch, das die (I)-Conotoxin MVIIA-Bindung irreversibel war, da sich aus der grafischen Darstellung kein Auswascheffekt erkennen lässt. Bay-k 8644 und Nifedipine wurden zu den Zeitpunkten 45 Minuten bzw. 1 Stunde injiziert. Bay-k 8644 stimuliert Kalziumkanäle vom L-Typ in reversibler Weise, wie sich aus dem über die Zeit hinweg aufgetretenen Auswascheffekt zeigt. Nifedipine blockiert den Kalziumkanal vom L-Typ.
Somit wird gezeigt, dass die Erfindung bei der Ermittlung der Reaktion von durch Patch-Clamping isolierten Membran-Ionenkanälen auf die Durchspülung mit Verbindungen nützlich ist, die bekannte physiologische Aktivitäten besitzen. Die Ergebnisse zeigen, dass fünf Verbindungen in wenig mehr als 1 Stunde unter Verwendung eines einzigen Membran-Präparates getestet wurden und einen brauchbaren Bereich von physiologischen Reaktionen zeigten. In der Praxis sind beim Durchmustern von unbekannten Verbindungen einschließlich der Zugabe-Perioden als auch der Auswasch-Zeiträume zwischen den Zugaben kürzer und daher können 10 bis 20 Verbindungen im Verlaufe einer Stunde durchmustert werden (siehe insbesondere Beispiel 2).
BEISPIEL 2
STOPP-FLOW-VERFAHREN: Der Kaliumstrom einer in Kultur gezüchteten menschlichen koronaren Glattmuskel-Zelle wurde in einem herausgeschnittenen Patch, dessen Innenseite nach außen gewendet war, durch das Stopp-Flow-Verfahren unter Verwendung einer Vorrichtung ermittelt, wie sie oben beschrieben und in den 7 bis 10 dargestellt ist, die einen Autosampler, eine Spritzenpumpe, und eine Mikropertusionskammer umfasst, welche ein Volumen von 12 μl besitzt.
Die Zusammensetzung der Pipette und der Badlösungen war:
Pipette: KCl (140 mM), CaCl₂ (1 mM), MgCl₂ (1 mM), EGTA (1,3 mM), HEPES (10 mM).
Bad: KCl (140 ZuM), CaCl₂ (1 mM), MgCl₂ (1 mM), EGTA von 1,07 mM bis 2,0 mM. Die freie Ca²⁺-Konzentration wird durch die Konzentration von EGTA festgelegt. Alle Testverbindungen wurden in Badlösungen mit 0,3 pM freien Ca²⁺-Ionen aufgelöst.
Es wurden die Effekte von 25 unbekannten Verbindungen auf die mit Kalzium aktivierten Kaliumkanäle untersucht, wobei die Ergebnisse in 12 dargestellt sind. In dem experimentellen Protokoll wurden nacheinander unbekannte Verbindungen (offene Ringe) perfundiert (300 μl) mit dazwischen liegenden Auswaschungen mit Salzlösung (gefüllte Kreise). Jede Zugabe dauerte 2 Minuten und wird durch sechs Datenpunkte dargestellt. In dem Patch waren mehrere Kanäle vorhanden und ihre Aktivität wurde auf einen niedri gen Pegel (20 % der vollen Aktivität) durch eine Badlösung eingestellt, die eine niedrige Konzentration (0,3 μM) von freien Kalziumionen besaß. Dieser Pegel wurde gewählt, um in der Lage zu sein, sowohl mögliche Aktivierungs- als auch Blockier-Effekte der unbekannten Testverbindungen zu erkennen. Zu verschiedenen Infervallen wurde eine volle Aktivierung durch eine Perfusion mit einer Salzlösung induziert, die eine Konzentration von 1 μM freier Kalziumionen enthielt (nicht gefüllte Quadrate). Eine Perfusion bzw. Durchspülung mit Salzlösung, die 0,5 μM freie Kalziumionen enthielt, wurde am Ende getestet (*). Bei diesem speziellen Test von 25 unbekannten Substanzen bei einer Konzentration von 1 μM induzierte keine Verbindung eine Änderung von dem durch Kalzium aktivierten Basis-Kalium-Strom, doch zeigten die Kalium-Kanäle des Membranpräparats einen charakteristisch hohen Kalium-Strom, wenn sie der eine hohe Konzentration (1,0 μM) von Kalzium aufweisenden Salzlösung ausgesetzt wurden.
Somit wurde gezeigt, dass die Erfindung einen Mechanismus schafft, durch den kleine Volumina von Testverbindungen in schneller Folge nacheinander analysiert werden können. Der Test ist bemerkenswert, weil mehr als 25 unbekannte Testverbindungen im Verlauf eines Zeitraums von 2 Stunden durchmustert wurden. Der Test wurde durch eine intermittierende volle Aktivierung der K-Kanäle bestätigt, die durch Perfusion mit Salzlösungen induziert worden war, die eine höhere Konzentration freier Kalziumionen besaß. Diese Kaliumströme, die durch hohe Kalziumkonzentration induziert worden waren, zeigen den Rahmen der Stromreaktion, die von dem Membranpräparat verfügbar war, wodurch die Empfindlichkeit bewiesen wird, die erforderlich ist, um eine aktive Verbindung zu erkennen.
Die vorliegende Beschreibung offenbart einen neuen Weg zur Verwendung eines HPLC-Autosamplers bei der Durchführung von Patch-Clamp-Verfahren. Diese ermöglicht es, eine größere Anzahl von Tests in einem relativ kurzen Zeitraum durchzuführen. Die Beschreibung offenbart auch die Verwendung von neuen Mikroperfusionskammern-Baueinheiten, welche sehr kleine Mikroperfusionskammern besitzen, wodurch es möglich wird, sehr kleine Mengen von Testproben-Lösungen und Träger-Lösungen zu verwenden und zusätzlich die Zeit zu verringern, die für jeden Test benötigt wird. Die Beschreibung offenbart auch mehrere neue Verfahren zur Durchführung des Patch-Clamp-Verfahrens und der Erzielung von weiteren Vorteilen. Die Beschreibung offenbart weiterhin neue Mikroperfusionskammer-Strukturen, bei denen sehr kleine Kammern verwendet werden und die integrale Elektroden aufweisen.
In den beigefügten Ansprüchen wird der Ausdruck „Membran" verwendet, um Ganzzellen-Membranen oder Teilzellen-Membranen zu bezeichnen.
Obwohl in den beigefügten Zeichnungen bevorzugte Ausführungsformen der Erfindung dargestellt und in der vorausgehenden Beschreibung erläutert wurden, versteht sich, dass die Erfindung nicht auf die beschriebenen genauen Ausführungsformen oder die genauen Details der Arbeitsweise oder exakte Verfahren oder Vorgänge beschränkt ist, wie sie dargestellt und beschrieben wurden, sondern dass die vorliegende Erfindung nur durch den vollständigen Rahmen beschränkt ist, der in legaler Weise den beigefügten Ansprüchen entnommen werden kann.
In den 13 bis 18 ist ein Drehtisch 400 dargestellt, der mehrere Perfusionskammern 202 umfasst. Der Drehtisch 400 umfasst drei Teile, nämlich einen drehbaren äußeren Teil 200, einen feststehenden inneren Teil 220 und einen oberen Teil 246. Der drehbare äußere Teil 200 hat einen äußeren Umfang 210, einen inneren Umfang 208, der innerhalb dieses Umfanges 208 ein inneres Volumen 206 umschließt, und eine Vielzahl von Perfusionskammern 202. Jede der Perfusionskammern 202 ist mit dem inneren Volumen 206 durch die gebohrten Löcher 204 im äußeren Teil 200 verbunden. Die Anzahl von Perfusionskammern 202 mit den gebohrten Verbindungslöchern 204 beträgt bei einer bevorzugten Ausführungsform acht, doch können auch weniger wie z.B. vier oder aber auch mehr, beispielsweise sechzehn Perfusionskammern 202 vorgesehen werden.
Der äußere Umfang 222 des inneren Teils 220 ist geringfügig kleiner als der innere Umfang 208 des äußeren Teils 200, d.h. der innere Teil 220 passt in das Volumen 206 des äußeren Teils 200. Der innere Teil 220 umfasst eine ausgefräste Rille 228, die mit dem äußeren Umfang 222 über eine Vielzahl von Bohrungen in Verbindung steht. Die Rille 228 hat zwei Stopp-Punkte 230 und 232 sowie eine Referenzelektrode 226, die mit dem Inneren der Rille 228 verbunden ist, die zu einer Test-Perfusionskammer 202' führt. Am anderen Ende ist die Referenzelektrode 226 geerdet.
Der obere Teil 246 ist eine Platte mit einem äußeren Umfang 240 und zwei Löchern 242 und 244. Bei einer Ausführungsform der Erfindung hat der Umfang 240 der oberen Platte 246 die gleiche Größe wie der äußere Umfang 222 des inneren Teils 220, doch könnte der Umfang 240 der oberen Platte 246 größer oder kleiner als der äußere Umfang 222 des inneren Teils 220 sein, solange die beiden Löcher 242 und 244 so positioniert sind, dass sie eine Verbindung von der oberen Seite des oberen Teils 246 durch den oberen Teil 246 zur Rille 228 im inneren Teil 220 schaffen, wenn der obere Teil 246 auf dem inneren Teil 220 montiert ist.
Weiterhin ist dann, wenn der innere Teil 220 und der obere Teil 246 in dem äußeren Teil 200 so montiert sind, dass die gebohrten Löcher 224 im inneren Teil 220 in einer Verbindungsrelation mit den gebohrten Löchern 204 im äußeren Teil 200 positioniert sind, das Loch 244 im oberen Teil 246 so positioniert, dass es eine Verbindung von der Oberseite des oberen Teils 246 durch den oberen Teil 246 in die Rille 228 zwischen den beiden Stopp-Punkten 230 und 232 und weiterhin hinaus zur Test-Perfusionskammer 202' im anderen Ende der gebohrten Verbindungslöcher 224 und 204 schafft. In dieser Position schafft das Loch 242 eine Verbindung von der Oberseite des oberen Teils 246 durch den oberen Teil 246 in die Rille 228 und von dort zum Rest der Perfusionskammern 202 über die gebohrten Löcher 204 und 224. Bei diesem Drehtisch 400 können eine Lösung der Test-Perfusionskammer 202' durch das Loch 224 und gleichzeitig eine andere Lösung den anderen Perfusionskammern 202 durch das Loch 242 zugeführt werden, ohne dass die beiden Lösungen miteinander vermischt werden.
In 16 wurden der äußere Teil 200, der innere Teil 220 und der obere Teil 246 zusammengebaut, um den Drehtisch 400 zu bilden. Die Pfeile zeigen die Strömungsrichtungen für die flüssigen Lösungen, die dem Drehtisch 400 durch die Löcher 242 und 244 zugeführt werden.
Dadurch, dass der äußere Teil 200 relativ zum inneren Teil 220 gedreht wird, kann die Test-Perfusionskammer 202' aus ihrer gegenwärtigen in eine neue Position bewegt werden und zur gleichen Zeit kann eine andere Perfusionskammer 202 in die vorausgehende Position der Test-Perfusionskammer 202' bewegt werden, wodurch sie die Funktion als neue Test-Perfusionskammer 202' übernimmt.
In 17 ist eine andere Ansicht des Drehtisches 400 dargestellt. Der äußere Teil 200 des Drehtisches 400 umfasst eine Vielzahl von Pipettenhalter-Trägern 250, einen Pipettenhalter-Träger 250 für jede Perfusionskammer 202 im äußeren Teil 200. Jeder der Pipettenhalter-Träger 250 wird verwendet, um einen Pipettenhalter 260 zu tragen, wie dies für die Hälfte der Pipettenhalter-Träger 250 dargestellt ist.
In 18 ist ein Querschnitt durch den Drehtisch 400 dargestellt. Dieser Querschnitt ist vom Punkt c auf den Umfang des Drehtisches 400 über den Mittelpunkt f zum Punkt d auf dem Umfang des Drehtisches 400 gesehen. Wenn eine flüssige Lösung dem Loch 242 im oberen Teil 246 des Drehtisches 400 zugeführt wird, führt der Pfad, der das Loch 242, die Rille 228, das gebohrte Loch 224 und das gebohrte Loch 204 umfasst, die flüssige Lösung vom Loch 242 zur Perfusionskammer 202. Überschüssige flüssige Lösung wird über eine Überlaufrille 203 zu einer Kammer für abzuführende Flüssigkeit (nicht dargestellt) geführt, von der sie für eine Abführung durch Löcher (nicht dargestellt) im inneren Teil 220 und dem oberen Teil 246 mit Hilfe eines Schlauches abgeführt wird, der mit einer Absaugpumpe verbunden ist.
In 19 ist eine detaillierte Ansicht eines Pipettenhalters 260 wiedergegeben. Der Pipettenhalter 260 umfasst drei Hauptteile, den oberen Teil 266, den mittleren Teil 264 und den unteren Teil 262. Der untere Teil 262 umfasst einen ersten O-Ring 268, ein Loch 292 für eine Glaspipette 274 und ein erstes Gewinde 278. Der mittlere Teil 264 umfasst eine erste Schulter 294, ein zweites Gewinde 276, das zum ersten Gewinde 278 passt, und ein drittes Gewinde 282. Der obere Teil 266 umfasst eine zweite Schulter 296, ein viertes Gewinde 280, das zum dritten Gewinde 282 passt, einen zweiten O-Ring 270 und erste Verbindungseinrichtungen 302.
Wenn der Pipettenhalter 260 zusammengebaut wird, wird der Einsatzteil 284 in den oberen Teil 266 von unten her eingeführt und der Einsatzteil 284 wird an seinem Ort im oberen Teil 266 durch Reibung gehalten. An dem Einsatzteil 284 ist eine Elektrode 298 angelötet, die aus Silber und einer Schicht von Silberchlorid besteht. Der obere Teil 266 wird dann dadurch mit dem mittleren Teil 264 verbunden, dass sie unter Verwendung der Gewinde 280 und 282 zusammengeschraubt werden.
Ein Glasröhrchen oder eine Pipette 274 wird in das Loch 292 des unteren Teils 262 eingesetzt und die Elektrode 298 wird in die Pipette 274 eingeführt. Der untere Teil 262 wird dann auf dem mittleren Teil 264 unter Verwendung der Gewinde 276 und 278 aufgeschraubt. Bevor die beiden Teile festgezogen werden, wird die Glaspipette 274 gegen den unteren Teil des Einsatzteils 284 nach oben gedrückt. Wenn die beiden Teile fest miteinander verschraubt sind, dichtet der O-Ring 268 die Öffnung 292 ab und befestigt die Glaspipette 274 in ihrer Position.
Wenn der Pipettenhalter 260 mit der Pipette 274 für ein Patch-Clamp-Verfahren verwendet werden soll, wird er auf einem Manipulator 300 montiert. Der Manipulator 300 umfasst zweite Verbindungseinrichtungen 288 und einen Anschluss 286, der mit einer Absaugpumpe verbunden ist. Die ersten Verbindungseinrichtungen 302 des oberen Teils 266 passen in die zweiten Verbindungseinrichtungen 288 des Manipulators 300, so dass dann, wenn die ersten Verbindungseinrichtungen 302 des oberen Teils 266 in die zweiten Verbindungseinrichtungen 288 des Manipulators 300 gedrückt werden, eine Befestigung in dieser Position durch Reibung zwischen den ersten Verbindungseinrichtungen 302 und den zweiten Verbindungseinrichtungen 288 erfolgt.
Der Manipulator 300 kann auch einen Vorverstärker (nicht dargestellt) umfassen, um die während des Patch-Clamp-Verfahrens erhaltenen Messsignale vorzuverstärken.
Der zweite O-Ring 270 liefert eine Dichtung zwischen dem Manipulator 300 und dem oberen Teil 266 des Pipettenhalters 260. Der Anschluss 286 kann mit einem Schlauch bzw. einem Rohr verbunden sein, der bzw. das mit einer Absaugpumpe verbunden ist. Wenn die Pumpe zu saugen beginnt, wird Luft oder flüssige Lösung nach oben durch das winzige Loch in der Spitze 290 der Pipette 274 gesaugt.
Der Vorteil des derart ausgebildeten Pipettenhalters 260 ist, dass das erforderliche Vakuum, das an die Spitze 290 der Pipette 274 angelegt werden muss, durch die zweiten Verbindungseinrichtungen 288 durch den Pipettenhalter 260 hindurch angelegt werden kann. Wenn die Pipette 274 gewechselt wird, werden die Pipette 274 und der Pipettenhalter 260 weggeworfen und der Pipettenhalter-Träger 250 wird mit einem anderen Pipettenhalter 260 mit einer neuen Pipette 274 verbunden. Dieses Verfahren kann unter Verwendung des vorgesehenen Pipettenhalters 260 durchgeführt werden, ohne das ansonsten erforderliche Entfernen eines Absaugrohres, das am Pipettenhalter 260 montiert ist, und ohne das danach folgende Montieren des Absaugrohres an einem neuen Pipettenhalter 260, da das Absaugrohr an der zweiten Verbindungseinrichtung 288 montiert ist, um erneut verwendet zu werden. Der so ausgebildete Pipettenhalter 260 ist ideal für eine Verwendung bei einer automatisch arbeitenden Patch-Clamp-Vorrichtung.
Wenn er nicht benutzt wird, ist der Pipettenhalter 260 am Pipettenhalter-Träger 250 montiert. Wenn der Manipulator 300 bewegt wird, um den Pipettenhalter 260 zu ergreifen, werden die zweiten Verbindungseinrichtungen 288 gegen die ersten Verbindungseinrichtungen 302 gedrückt, bis ein Reibeingriff erzielt worden ist. Der Pipettenhalter-Träger 250 umfasst zwei Eingriffsteile 310 und 312, die mit der Schulter 296 des oberen Teils und der Schulter 294 des mittleren Teils 264 in Eingriff treten, so dass, wenn der Manipulator 300 gegen den Pipettenhalter 260 drückt, der Pipettenhalter 260 an seinem Ort durch die Eingriffsteile 310 und 312 gehalten wird.
In ähnlicher Weise bewegt dann, wenn der Pipettenhalter 260 vom Manipulator 300 entfernt werden soll, der Manipulator 300 den Pipettenhalter 260 in Position im Pipettenhalter-Träger 250, und wenn die Eingriffsteile 310 und 312 mit den Schultern 296 und 294 in Eingriff treten, werden die ersten Verbindungseinrichtungen 302 und die zweiten Verbindungseinrichtungen 288 auseinander gezogen.
Der äußere Teil 200 kann mit Führungsstiften 320 versehen sein, die auf dem äußeren Umfang positioniert sind, wie in 17 dargestellt. Wenn der äußere Teil 200 gedreht werden soll, kann der Manipulator 300 gegen die Führungsstifte 320 drücken und dadurch den äußeren Teil 200 um sein Zentrum f drehen. Die Führungsstifte 320 können auch auf dem oberen Teil des äußeren Teils 200 zwischen den Pipettenhalter-Trägern 260 montiert werden oder die Pipettenhalter-Träger 260 können auch als Führungsstifte verwendet werden, und in diesen beiden Fällen kann der Manipulator 300 gegen die Führungsstifte oder die Pipettenhalter-Träger 260 drücken und dabei den äußeren Teil 200 um seinen Mittelpunkt f drehen.
Bevor der oben beschriebene Drehtisch 400 verwendet wird, müssen ein oder mehrere Pipettenhalter 260 mit Pipetten ausgerüstet und im Pipettenhalter-Träger 250 positioniert werden und der Manipulator 300 sollte in eine neutrale oder Ruhestellung bewegt werden. Wenn die Messungen begonnen werden sollen, bewegt sich der Manipulator 300 um mit einem Pipettenhalter 260' in Eingriff zu treten, um diesen aufzunehmen. Der Manipulator 300 bewegt dann den aus der Vielzahl von Pipettenhaltern 260 ausgewählten Pipettenhalter 260' zur Test-Perfusionskammer 202', die den Pipettenhalter 260' am nächsten ist, wo die Spitze der Pipette auf einer ausgesuchten, zu untersuchenden Zelle positioniert wird und eine Patch-Clamp-Verbindung hergestellt und die Messung durchgeführt wird. Das Positionieren der Spitze der Pipette auf einer Zelle wird im Folgenden im Einzelnen beschrieben. Wenn die Messung durchgeführt worden ist, bewegt der Manipulator 300 den Pipettenhalter 260' zurück zum Pipettenhalter-Träger 250 und der Manipulator 300 und der Pipettenhalter 260' werden außer Eingriff gebracht. Der Manipulator 300 drückt dann gegen den Führungsstift 320, um den äußeren Teil 200 in eine neue Position zu drehen, wonach der Manipulator 300 einen neuen Pipettenhalter 260 aufnehmen kann, um den Vorgang erneut zu starten.
Die Bewegungen des Manipulators 300 können von einem Computer gesteuert werden, d.h. einem IBM-kompatiblen Standard-PC oder einem Computer, der mit einem Apple Macintosh (MAC) kompatibel ist.
Wenn, wie oben beschrieben, der Manipulator 300 die Spitze der Pipette zur Test-Perfusionskammer 202' bewegt hat, sollte die Spitze auf einer geeigneten Zelle positioniert werden.
Die Suche nach einer Zelle, mit der eine Patch-Clamp-Verbindung hergestellt werden soll und der Erkennung der Spitze der Pipette basieren auf optischen (grafischen) Informationen in digitalen Bildern der Objekte (Zelle und Pipette). Die digitalen Bilder können von einer analogen Videokamera aufgezeichnet werden, die mit einem Framegrabber verbunden ist, von einer digitalen Videokamera, einer Digitalkamera usw.
Der gleiche Computer, der zur Steuerung des Manipulators 300 und als Basis für den Framegrabber und die NeuroPatch-Software verwendet wird, kann auch verwendet werden, um die Messdaten während des Patch-Clamp-Vorgangs zu ermitteln, doch kann auch ein gesonderter Computer verwendet werden.
Das Bild, mit dem die zur Zeit existierende Ausführungsform der NeuroPatch-Software arbeitet, kann von einer Standard-Videokamera erhalten werden, die ein PAL-S-VHS-Ausgangssignal liefert. Dieses analoge Signal wird in einem Framegrabber digitalisiert, der eingerichtet worden ist, um das Bild mit einer Auflösung von 768×512 Pixel wiederzugeben, wobei 24 Bit verwendet werden, um die Farbe eines jeden Pixels darzustellen (16,7 M Farbmöglichkeiten pro Pixel = True Color). Solange keine Erkennung durchgeführt wird, wird ein Life-Bild dargestellt. Vor dem Starten der Zellen- und -Pipetten-Erkennungs-Routinen, wird das Life-Bild eingefroren und eine 256-Graustufen aufweisende Kopie des eingefrorenen Bildes wird auf einen Bildpufferspeicher übertragen. Die Erkennungs-Routinen arbeiten dann an dem eingefrorenen Bild im Bildpufferspeicher, doch wird dieses eingefrorene Bild von den Erkennungs-Routinen nicht verändert. Stattdessen werden die Ergebnisse der Erkennungs-Routinen in einem oder mehreren Bildern oder Bild-Pufferspeichern gespeichert.
Ein weiteres Beispiel eines eingefrorenen Bildes ist in 20 dargestellt. Das eingefrorene Bild 500 umfasst eine Vielzahl von Zellen 505 und eine Pipette 510 mit einer Pipettenspitze 508.
Die Auswahl einer geeigneten Zelle für eine Patch-Clamp-Verbindung kann unter Verwendung des folgenden Verfahrens durchgeführt werden. Das Verfahren umfasst fünf Schritte:

1) Normalisierung und Rauschfilterung des Bildes
2) Solidifikation
3) Größenfilterung
4) Isolationsfilterung
5) Auswahl der „besten Zelle"

Bei jedem der Schritte werden ein oder mehrere Filter auf das Bild angewendet. Es sei darauf hingewiesen, dass die Anwendung eines Filters auf ein digitalisiertes Bild dadurch durchgeführt wird, dass das Filter nacheinander auf jedes einzelne Pixel in einem ersten Bild angewendet wird. Das Ergebnis der Filterung wird in einem zweiten Bild oder Bildpufferspeicher in einer Position gespeichert, die dem Pixel in dem ersten Bild entspricht, und, nachdem das Filter auf alle Pixel im ersten Bild angewendet worden ist, enthält das zweite Bild das gefilterte Bild. Dieses Bild kann dann für eine weitere Filterung verwendet werden. Ein Filter kann mehr als ein Pixel im ersten Bild überdecken, doch wird das Ergebnis der Filterung nur in einem Pixel im zweiten Bild gespeichert. Wenn ein Pixel im ersten Bild als Zentralpixel gekennzeichnet wird, können die acht Pixel, die das Zentralpixelumgeben, vom Filter abgedeckt werden und das Filter verwendet daher in diesem Fall neun Pixel im ersten Bild, um einen neuen Pixel-Wert für ein Pixel im zweiten Bild zu berechnen, das dem Zentralpixel im ersten Bild entspricht. Ein einfaches Beispiel eines Filters, das neun Pixel verwendet, ist ein Mittelwertbildungs- oder Glättungsfilter. Der Mittelwert von neun Pixeln in einem Cluster von 3×3 Pixeln im ersten Bild wird berechnet und im Pixel in der Position in dem zweiten Bild gespeichert, die der Position des Zentralpixels im ersten Bild entspricht.
Wenn ein Bild auf einem Monitor wiedergegeben wird, entspricht ein spezifischer Pixel-Wert einer spezifischen Farbe (oder einem spezifischen Grauton). Ein Wert eines Pixels kann daher durch eine Farbe dargestellt werden und umgekehrt.
In den 22 bis 26 sind die Filter dargestellt, die bei der zur Zeit bevorzugten Ausführungsform der Erfindung verwendet werden. In jedem Filter wird das Zentralpixel mit „x" markiert und die benachbarten oder angrenzenden Pixel, die in dem Filter verwendet werden, sind mit einem „*" markiert. Das Filter arbeitet nicht notwendigerweise auf allen angrenzenden oder benachbarten Pixeln, und die Pixel, die nicht verwendet werden, sind mit einem „–„ markiert.
Wenn ein Bild gefiltert worden ist, können das Originalbild oder das sich ergebende oder gefilterte Bild auf einem Monitor wiedergegeben werden.
Im Folgenden wird eine Vielzahl von benutzerdefinierten Parametern verwendet. Diese Parameter definieren Werte, die verwendet werden sollen, wenn die Filter auf das Bild angewendet werden, entweder, um die Parameter der Filter (Größe, Funktion) zu definieren oder um die Pixel in dem zu filternden Bild auszuwählen. In Tabelle 1 sind der Name, der Bereich und die Standard-Ersatzwerte für die Filter dargestellt.
Schritt 1:
Die Aufgabe des ersten Schrittes besteht darin, das Bild mit 256 Graustufen von Zellen in ein Binärbild zu konvertieren, das Pixel umfasst, welche einen Wert aus einem Satz von zwei Werten besitzen. Pixel mit einem Graupegel-Wert, der größer ist als ein berechneter Schwellen-Wert (beispielsweise hellere Pixel) werden durch einen Wert dargestellt (beispielsweise die Farbe weiß) und Pixel mit einem Graupegel-Wert, der kleiner ist als ein Grenz-Wert (beispielsweise dunklere Pixel) werden durch einen anderen Wert (beispielsweise die Farbe rot) dargestellt.
Während die auf einem Schwellen-Wert basierende Bildkonversion durchgeführt wird, werden zwei zusätzliche Operationen gleichzeitig durchgeführt: Zunächst wird das Bild derart „normalisiert", dass Unterschiede in der Beleuchtungsintensität in verschiedenen Bildteilen nur wenig Einfluss darauf haben, ob eine Zelle erkannt werden kann oder nicht, und zweitens wird „primitives" Rauschen aus dem Bild heraus gefiltert.

1) Als erstes werden die mittleren Graupegel-Werte in neun Pixelblocks mit 100×100 Pixeln berechnet, siehe 21.
2) Werden basierend auf den oben berechneten mittleren Werten die mittleren Änderungen zwischen den Blöcken pro Pixel sowohl in der x- als auch der y-Richtung berechnet.
3) Drittens, wird für jedes der Pixel in dem zentralen 600×512 Pixel umfassenden Bereich des Bildes eine kombinierte Konversion und Filterung durchgeführt: a) ein Graupegel-Schwellenwert wird basierend auf den Mittelwerten und den mittleren Änderungen zwischen den Blöcken pro Pixel in 1) und 2) berechnet. b) ein vom Verwender definierter Inkrement-Wert (increment) wird dem in 3) a) berechneten Schwellenwert hinzugefügt, um den maximalen Schwellenwert für die in Untersuchung befindlichen Pixel zu bilden. c) Wenn der Graupegel-Wert des Pixels dunkler (kleiner) als der in 3) b) berechnete maximale Schwellenwert ist, wird die Nachbarschaft des Pixels unter Verwendung des in 22 gezeigten Filters untersucht.

Wenn die Anzahl von benachbarten Pixeln mit einem Grauwert kleiner oder gleich dem maximalen Schwellenwert größer oder gleich klein m ist (boundsFactor), wird das Pixel akzeptiert (rot markiert) oder zurückgewiesen (weiß markiert). Je größer m (boundsFactor) ist, um so größer muss die Sammlung bzw. das Cluster von benachbarten Pixeln sein, damit das Pixel akzeptiert wird.
Schritt 2:
Nach Schritt 1 ist es möglich, die Umrisse der Zellen und Teile ihres Inneren zu sehen. Die Zellen sollten als „solide" Strukturen ohne Löcher in ihrem Inneren erscheinen. So wird in diesem Schritt versucht, die Löcher im Inneren von Zellen zu schließen. Der Weg, auf dem dies erfolgt, hat den Nebeneffekt, dass kleine Lücken zwischen Clustern von Zellen ebenfalls geschlossen werden. Dieser Nebeneffekt wird später ein Vorteil in dem Sinn, dass Cluster als große Strukturen erscheinen, die aufgrund ihrer Größe so ausgeschieden werden, als ob es sich bei ihnen um ein Artefakt handeln würde.

1) In dem zentralen 380×380 Pixel umfassenden Bereich des Bildes (der im Schritt 1 verarbeitet worden ist, wird eine einfache „Auffüll"-Funktion angewendet; siehe 23) a) Wenn ein Pixel im vorausgehenden Schritt zurückgewiesen worden ist (unmarkiert oder weiß) und wenn seine Nachbarn auf der linken und der oberen Seite akzeptiert worden sind (markiert oder rot) wird eine Suche durchgeführt. b) Bei einer jeweils um ein Pixel nach rechts erfolgenden Bewegung wird aufgezeichnet, für wie viele verbundene Positionen die Pixel unmarkiert sind (weiß), während ihre Nachbarn nach oben eine Markierung (rot) aufweisen. Die Aufzeichnung hält an, wenn mehr als eine vom Verwender definierte Anzahl (horizontalCount) von Pixeln gezählt wird, wenn der Nachbar nach oben unmarkiert ist (weiß) oder wenn ein markiertes Pixel (rot) angetroffen wird. c) Wenn die Stopp-Bedingung von b) von einem markierten (rot) Pixel verschieden ist, das angetroffen wird, wird das Pixel ignoriert. Alternativ wird eine vertikale Aufzeichnung gestartet, bei der die Anzahl von verbundenen unmarkierten (weiß) Positionen unterhalb des Pixels ermittelt wird. Die Aufzeichnung stoppt, wenn mehr als eine vom Verwender definierte Anzahl (verticalCount) von Pixeln gezählt wird oder wenn ein markiertes (rot) Pixel angetroffen wird. d) Wenn die Stopp-Bedingung in c) von einem angetroffenen markierten (rot) Pixel verschieden ist, wird das Pixel ignoriert. Alternativ wird eine horizontale „Auffüllung" vom Basis-Pixel bis zu den gefundenen markierten (rot) Pixel in der horizontalen Richtung durchgeführt.

Schritt 3:
Nach Schritt 2 ist es möglich, die gefüllten Profile verschiedener Größen zu sehen. Zellen, die nahe beieinander positioniert sind, können als großer Pixelblock erscheinen, während Zellen, die in vernünftiger Weise isoliert sind, mit ihren korrekten Größen erscheinen. Jetzt wird ein Größenfilter so angewendet, das Gruppen von Pixeln, die kleiner sind als eine Minimalgröße oder größer als eine Maximalgröße für die weitere Auswertung disqualifiziert werden.

1) Auf den zentralen 380×380 Pixel umfassenden Bereich des Bildes (das im Schritt 2 verarbeitet worden ist), wird ein Größenfilter auf jedes markierte (rot) Pixel angewendet; siehe 24 a) Wenn ein Pixel markiert (rot) ist, wird die Nachbarschaft in einem Abstand von m Pixeln um dieses Pixel herum untersucht. b) Für die Überprüfung der minimalen Größe ist m ein vom Verwender definierter Low-Maskenwert (LowMaskRed). Wenn die Anzahl von markierten (rot) Nachbarn in einem Abstand m von dem Pixel weniger ist als ein vom Benutzer definierter Tiefpass-Wert (LowPassRed), wird das untersuchte Pixel unverändert gelassen (wodurch es disqualifiziert wird). c) Alternativ wird die Überprüfung auf maximale Größe durchgeführt. Hier ist m ein vom Verwender definierter High-Maskenwert (HighMaskRed). Wenn die Anzahl von markierten (rot) Nachbarn in einem Abstand m von dem Pixel höher ist als ein vom Verwender definierter Hochpass-Wert (HighPassRed) wird das untersuchte Pixel unverändert gelassen (wodurch es disqualifiziert wird). Alternativ hat das Pixel die Größentests durchlaufen und wird markiert (blau).

Schritt 4:
Nach Schritt 3 sind die Pixel-Cluster, welche hinsichtlich ihrer Größe die Erfordernisse, Zellen zu sein, erfüllen, markiert (blau). Jetzt wird eine weitere Untersuchung durchgeführt, um die Cluster auszuwählen, die ein geeignetes Ausmaß von Isolation für eine weitere Auswertung aufweisen.

1) In den Zentralen 360×360 Pixel umfassenden Bereich des Bildes (das im Schritt 3 verarbeitet worden ist) wird ein „Isolations"-Filter auf jedes markierte (blauen) Pixel angewendet; siehe 25. a) Wenn ein Pixel markiert ist (blau) wird die Nachbarschaft innerhalb eines Abstandes von m Pixeln um dieses Pixel herum untersucht. Hier ist m ein vom Verwender definierter Low-Masken-Wert (LowMaskBlue). b) Wenn die Anzahl von markierten (blau) Pixeln innerhalb des Abstandes m von dem Pixel größer oder gleich einem vom Verwender definierten Tiefpass-Wert ist (LowPassBlue) wird untersucht, welcher Wert von m (genannt HighMaskBlue) der Nachbarschaft wie im Schritt 3 weiterhin markierte (blau) Pixel enthält. Diese Untersuchung wird fortgesetzt, bis ein Wert für m gefunden wird, bei dem der Nachbarschafts-Zählwert 0 ist oder m gleich oder größer als ein vom Verwender definierter Hochpass-Wert (HighPassBlue) ist. c) Wenn m größer oder gleich dem unteren Masken-Wert + 1 ist (LowMaskBlue + 1) und wenn m kleiner als der Hochpass-Wert (HighPassBlue) ist, wurde ein isolierter Cluster von markierten (blau) Pixel gefunden. Die Anzahl von Pixeln, die diesen isolierten Cluster bilden, wird gezählt, und es wird ein „Freirand"-Abstand basierend auf einem vom Benutzer definierten Wert (freeBorderBase) berechnet. d) Die Anzahl von markierten (blau) Pixeln in dem „Freirand"-Band wird berechnet und wenn diese Anzahl kleiner ist als der HighMaskBlue-Wert, der gemäß dem obigen Schritt b) gefunden wurde, wird der Cluster von markierten (blau) Pixeln markiert (grün).

Schritt 5:
Nach Schritt 4 werden diejenigen Pixel-Cluster, von denen angenommen wird, dass sie Zellen darstellen, die für ein Patch-Clamping geeignet sind, markiert (grün). Dann werden die Cluster weiter untersucht, welche die „besten Zellen" darstellen und es werden die Koordinaten des Flächenschwerpunkts der „besten Zelle" zurückgegeben.

1) In dem zentralen Bereich von 360×360 Pixeln des Bildes (das in Schritt 4 bearbeitet worden ist) stellt jeder Cluster, der markiert (grün) ist, jeweils eine mögliche „beste Zelle" dar. Nacheinander wird jeder der Pixel-Cluster selektiert und der Flächenschwerpunkt wird dadurch gefunden, dass die Anzahl der Pixel gezählt und die Hälfte der x- und y-Werte zum oberen linken Pixel des markierten Clusters addiert werden.
2) Daraufhin wird die Anzahl der grün markierten Pixel gezählt und der Cluster mit der größten Anzahl von Pixeln wird als die „beste Zelle" selektiert. Die Funktion gibt die Position des Pixels zurück, das den Flächenschwerpunkt darstellt.

Ein weiterer Teil der NeuroPatch-Software betrifft die Erkennung der Pipettenspitze 508 und die Berechnung der genauen Position der Pipettenspitze 508.
Wenn auf die Pipettenspitze 508 Bezug genommen wird, ist zu berücksichtigen, dass deswegen, weil die Pipette 510 als Röhrchen ausgebildet ist, die Pipettenspitze 508 das Zentrum der Öffnung des Röhrchens ist.
Dieser Teil der Software kann unter Verwendung eines Verfahrens mit fünf Schritten ausgeführt werden.

1) Mittlere Filterung
2) Normalisierung und Rauschfilterung des Bildes sowie Kontrasterhöhung durch Schwellenwert-Anwendung
3) Ermittlung einer ersten Abschätzung für die Zentrallinie der Spitze 508
4) Ermittlung der optimalen genäherten Position der Pipette 510 auf dem Schirm
5) Ermittlung der geometrischen Zentrallinie der Pipette 510
6) Ermittlung der Spitze 508 der Pipette 510

Schritt 1:
Der erste Schritt bei dem Verfahren besteht darin, den mittleren Graupegel in einem Teil des Bildes zu berechnen. Wenn der Graupegel höher ist als ein vorbestimmter Schwellenwert, wird das Bild als zu hell betrachtet und die Pixel in dem Bild werden dadurch dunkler gemacht, dass der Wert eines jeden Pixels mit einer Konstante zwischen 0 und 1 multipliziert wird. Dieser Schritt erhöht den Kontrast in dem Bild in den Bereichen mit dem Bild der Spitze der Pipette, wodurch eine schnelle und genaue Ermittlung der Position der Spitze der Pipette möglich gemacht wird.
Schritt 2:
Die Aufgabe des zweiten Schrittes besteht darin, das Bild mit 256 Graustufen in ein Zweifarben-Bild zu konvertieren, in dem Pixel mit einem Graustufen-Wert, der größer ist, als ein berechneter Schwellenwert (d.h. hellere Pixel) durch einen Wert (beispielsweise die Farbe weiß) und Pixel mit einem Graustufen-Wert, der kleiner ist als der Schwellenwert (d.h. dunklere Pixel) durch einen anderen Wert (beispielsweise die Farbe rot) wiedergegeben werden.
Während diese auf einem Schwellenwert basierende Bildkonversion durchgeführt wird, werden zwei zusätzliche Vorgänge gleichzeitig ausgeführt: erstens wird das Bild „normalisiert", so dass Unterschiede hinsichtlich der Lichtbedingungen in verschiedenen Teilen des Bildes nur einen kleinen Einfluss darauf haben, ob die Pipette 510 erkannt werden kann oder nicht, und zweitens wird „primitives" Rauschen aus dem Bild heraus gefiltert.

1) Zunächst werden die mittleren Graupegel-Werte in neun Pixelblöcken von 100×100 Pixeln berechnet; siehe 21.
2) Zweitens werden basierend auf den oben berechneten Mittelwerten die zwischen den Blöcken auftretenden mittleren Änderungen pro Pixel sowohl in der x- als auch der y-Richtung berechnet.
3) Drittens wird für jedes der Pixel in dem zentralen 600×512 Pixel umfassenden Bereich des Bildes die kombinierte Konversion und Filterung durchgeführt: a) Basierend auf den mittleren Werten und den zwischen den Blöcken aufgetretenen mittleren Änderungen pro Pixel, die gemäß Schritt 1) und 2) berechnet wurden, wird ein Graupegel-Schwellenwert berechnet. b) Nach der Ermittlung des Graupegel-Schwellenwertes wird jedes Pixel untersucht und dann, wenn der Graupegel des Pixels kleiner oder gleich 90% des ermittelten Graupegel-Schwellenwertes ist, wird das Pixel durch einen Wert (beispielsweise die Farbe rot) wiedergegeben und anderenfalls wird das Pixel durch einen anderen Wert (beispielsweise die Farbe weiß) wiedergegeben. Dies bedeutet, dass jedes Pixel in dem Bild durch einen von zwei Werten (rot und weiß) wiedergegeben wird. Dadurch, dass der Schwellenwert, der rote und weiße Pixel voneinander unterscheidet, auf 90% des ermittelten Graupegel-Schwellenwertes gesetzt wird, wird der „Kontrast" des Bildes erhöht und die Spitze 508 der Pipette 510 wird deutlicher erkannt und es ist einfacher die Position der Spitze 508 zu ermitteln.

In 26 ist ein Beispiel für ein Bild wiedergegeben, das gemäß dem oben beschriebenen Verfahren gefiltert wurde. Nur die obere Hälfte des Bildes wurde gefiltert und die Pipette 510 ist klar erkannt.
Schritt 3:
Nach der Durchführung der Schwellenwert-Filterung des Bildes in Schritt 2 kann zunächst eine erste Abschätzung für die Position der Spitze 508 der Pipette 510 durchgeführt werden. In dem von der Kamera aufgezeichneten Bild erscheint die Pipette 510 als Dreieck und sie ist normalerweise so positioniert, dass der breiteste Teil der Pipette 510 sich an der Oberseite des Bildes und die Spitze 508 der Pipette 510 ungefähr im Zentrum des Bildes befindet. Daher ist es möglich, die oberste Reihe von Pixeln als Startreihe bei der Suche nach der Position der Spitze 508 der Pipette 510 zu verwenden. Für jedes Pixel in der obersten Reihe bzw. Zeile (x-Richtung) mit dem Wert rot wird die Anzahl von Pixeln unterhalb des obersten Pixels in der gleichen Spalte (y-Richtung) mit dem Wert rot gezählt. Es ist erforderlich, dass die Pixel mit dem Wert rot eine kontinuierliche Spalte von roten Pixeln bilden, doch da immer noch Rauschen im Bild vorhanden sein kann, ist es nur erforderlich, dass das Pixel mit der Nummer y und das letzte der Pixel mit den Nummern y + 4, y + 7 und y + 10 rot sind. Wenn dies der Fall ist, wird der Zählwert (der Y-Wert) inkrementiert und die Pixel unterhalb des Pixels mit der Nummer y werden untersucht. Dieses Verfahren wird wiederholt, bis alle Pixel mit den Nummern y, y + 4, y + 7 und y + 10 weiß sind, und der vorausgehende y-Wert wird zusammen mit dem x-Wert für diese Spalte gespeichert. Dieses Verfahren wird für jeden x-Wert im Bild durchgeführt, und wenn es vollständig durchgeführt worden ist, ist es möglich, den x-Wert für den größten y-Wert zu ermitteln. Die sich ergebende Position (x, y) ist die erste Abschätzung für eine Position der Spitze 508 der Pipette 510. In 26 ist diese Position mit dem Bezugszeichen 514 bezeichnet.
Schritt 4:
Die optimale Position der Spitze 508 der Pipette 510 liegt in der oberen Hälfte des Bildes und in der Mitte des Bildes in x-Richtung gesehen. Unter Verwendung der ersten Abschätzung für die Position der Spitze 508 der Pipette 510 ist es möglich, zu ermitteln, ob die Pipette 510 bewegt werden sollte oder ob die Position akzeptabel ist. Wenn die y-Koordinate in der ersten Abschätzung für die Position kleiner als 50 (Pixel von oben her gesehen) ist, wird die Spitze 508 als zu nahe bei der Oberseite des Bildes liegend betrachtet und die Spitze 508 sollte um einen Abstand nach unten bewegt werden, der einer Hälfte der Höhe des Bildes entspricht. Wenn im Gegensatz hierzu die y-Koordinate in der ersten Abschätzung für die Position größer als 450 (Pixel von oben gerechnet) ist, wird die Spitze 508 als zu nahe bei der Unterseite des Bildes liegend betrachtet und die Spitze 508 sollte um einen Abstand nach oben bewegt werden, der einer Hälfte der Höhe des Bildes entspricht. Die Spitze 508 wird unter Verwendung des Manipulators 300 bewegt.
Entsprechend liegt dann, wenn die x-Koordinate in der ersten Abschätzung für die Position kleiner ist als 158 (Pixel) oder größer als 610 (Pixel), die Spitze 508 zu nahe an den Seiten des Bildes und die Pipette 510 sollte zur Mitte hin bewegt werden. Die Größe der Bewegung ist in diesem Fall ungefähr ein Drittel der Breite des Bildes.
Wenn die Spitze 510 im Schritt 4 bewegt worden ist, werden die Schritte 1-4 wiederholt.
Schritt 5:
Nach der Ermittlung der ersten Abschätzung der Position der Spitze 508 der Pipette 510 und der Positionierung der Pipette in dem gewünschten Teil des Bildes kann die geometrische Mittellinie der Pipette ermittelt werden.
Dies wird dadurch durchgeführt, dass die mittlere x-Koordinate für jede Zeile (oder y-Wert) von der Oberseite des Bildes bis zur y-Koordinate der ersten Abschätzung berechnet wird, wobei nur die Pixel mit dem Wert rot verwendet werden. Nach der Berechnung der mittleren Koordinaten kann die beste gerade Linie durch die ermittelten Punkte berechnet werden. Diese Linie entspricht der Symmetrielinie der Pipette 510 und in 26 ist diese Linie mit 512 bezeichnet.
Schritt 6:
Der letzte Schritt des Verfahrens besteht darin, die tatsächliche Position der Spitze 508 der Pipette 510 zu berechnen. In Richtung einer Linie über eine ideale Pipettenspitze 508 gesehen, sollten die Pixel-Werte weiß-rot-weiß-rot-weiß haben, entsprechend einem Bereich außerhalb und links von der Pipette 510 (weiß), dem linken Teil der Pipette 510 (rot), dem Bereich innerhalb der Pipette 510 (weiß), dem rechten Teil der Pipette 510 (weiß) und entsprechend dem Bereiche außerhalb und rechts von der Pipette 510 (rot). Die Symmetrielinie der Pipette 510 sollte in dem weißen Bereich positioniert werden, der den Zentralbereich der Pipette 510 wiedergibt.
Beginnend von der Oberseite des Bildes wird ermittelt, wie weit nach unten längs der Symmetrielinie die Werte variieren, wie im Querschnitt der idealen Pipette 510 (weiß-rot-weiß-rot-weiß). Die Untersuchung wird längs der Symmetrielinie fortgesetzt, bis die Breite des mittleren weißen Teils eine Breite zwischen einem und fünf Pixeln besitzt. Der Schnittpunkt der Symmetrielinie und der letzten Zeile wird ermittelt und wenn die Werte in der Weise (weiß-rot-weiß-rot-weiß) variieren, wie bei der idealen Pipette 510, bestimmt dieser Schnittpunkt die Spitze 508 der Pipette 510.
Wenn die Werte nicht weiß-rot-weiß-rot-weiß sind, wird der Schnittpunkt als erste Abschätzung der Spitzenposition ermittelt. Die Pipette 510 wird dann etwas näher (ungefähr 5 bis 10 μm) an die Zellen heranbewegt, um die Spitze 508 in den Fokus der Kamera zu bringen und die Schritte 1 bis 6 werden wiederholt. Wenn es wiederum nicht möglich ist, die Position der Spitze 508 direkt zu ermitteln, wird die Pipette 510 in der x-y-Ebene bewegt und eine zweite Abschätzung wird unter Verwendung der Schritte 1 bis 6 berechnet. Wenn die erste und die zweite Abschätzung gleich sind (in diesem Fall bedeutet „gleich", dass die Unterschiede zwischen der ersten und der zweiten Abschätzung nicht größer sind als zwei Pixel in der x- oder y-Richtung) wird diese Abschätzung als die Position der Spitze 508 verwendet; anderenfalls wird die Pipette wiederum in der x-y-Ebene bewegt und die Position der Spitze ermittelt. Dieses Verfahren wird fortgesetzt, bis zwei gleiche Abschätzungen gefunden werden.
Nach Vervollständigung des letzten Schrittes gibt die Funktion einen Satz von Koordinaten für die detektierte Spitze 508 der Pipette zurück. In 26 ist dieser Satz von Koordinaten mit 516 bezeichnet.
Das NeuroPatch-Rechnerprogramm hat nun eine Position für die „beste Zelle" und eine Position für die Spitze 508 der Pipette 510 ermittelt. Der Manipulator 300 wird dann so gesteuert, dass er die Spitze 508 der Pipette 510 zum Zentrum der „besten Zelle" bewegt. Wenn dies durchgeführt worden ist, wird ein Unterdruck an den Anschluss 286 angelegt und es kann eine Giga-Dichtung erhalten werden. Tabelle 1

Claims

Automatische Elektroden-Positioniervorrichtung (10) zum Verbinden einer Elektrode mit einer Zelle, die folgendes umfasst: eine Kammer zum Aufnehmen von Zellen (72), eine Pipette (62), welche die Elektrode umfasst und eine Pipettenspitze (290) aufweist, die geeignet ist, eine Dichtung mit hohem elektrischen Widerstand mit der Oberfläche einer Zellmembran zu schaffen und die in der Nähe der Kammer beweglich positioniert ist, Positioniereinrichtungen (60) zum Halten und Positionieren der Pipette an gewünschten Stellen bezüglich der Kammer, Messeinrichtungen (78) zum Ermitteln eines elektrischen Parameters, wobei diese Messeinrichtungen elektrisch mit der Elektrode und der Kammer verbunden sind und einen elektrischen Kreis bilden, der die Elektrode und die Kammer umfasst, und eine Steuerung (58) zum Steuern der Positioniereinrichtungen in Reaktion auf die Parameterermittlungen, wobei die Steuerung geeignet ist, die Positioniereinrichtungen in Reaktion auf die empfangene Position so zu steuern, dass die Pipettenspitze an der ermittelten Position der ausgewählten Zelle positioniert wird und eine Dichtung mit hohem elektrischen Widerstand mit der Zellmembran der ausgewählten Zelle bildet, wodurch ein elektrischer Parameter der Zellmembran ohne Eingreifen einer menschlichen Bedienungsperson ermittelt werden kann.
Vorrichtung nach Anspruch 1, die weiterhin Auswahleinrichtungen (54, 80) zum Auswählen einer speziellen Zelle umfasst, die mit der Elektrode verbunden werden soll.
Vorrichtung nach Anspruch 2, bei der die Auswahleinrichtungen folgendes umfassen: Abbildungseinrichtungen (54) zum Erzeugen eines Bildes von Zellen in der Kammer, Digitalisierungseinrichtungen (80) zum Aufzeichnen und Digitalisieren des Bildes durch Aufteilen des Bildes in Pixel, von denen jedes einen aufgezeichneten Intensitätswert besitzt, wobei die Digitalisierungseinrichtungen in betriebsmäßiger Verbindung mit den Abbildungseinrichtungen stehen, und einen Speicher zum Speichern des digitalisierten Bildes, der elektrisch mit den Digitalisierungseinrichtungen verbunden ist.
Vorrichtung nach Anspruch 3, bei der die Auswahleinrichtungen weiterhin folgendes umfassen: Verwender-Schnittstelleneinrichtungen zum Anzeigen des Bildes (500) für eine durch den Benutzer erfolgende Auswahl einer mit der Elektrode zu verbindenden Zelle, und einen Prozessor, der mit dem Speicher verbunden und in der Lage ist, die Position der ausgewählten Zelle zu ermitteln, wobei die Steuerung elektrisch mit den Auswahleinrichtungen verbunden und geeignet ist, die Position der ausgewählten Zelle zu empfangen und die Positioniereinrichtungen in Antwort auf die empfangene Position so automatisch zu steuern, dass die Elektrode an der ermittelten Position der ausgewählten Zelle positioniert wird.
Vorrichtung nach Anspruch 3, bei der die Auswahleinrichtungen weiterhin folgendes umfassen: einen Prozessor, der mit dem Speicher verbunden und geeignet ist, das digitalisierte Bild zu verarbeiten, um die Zellen in der Kammer zu identifizieren, eine Zelle auszuwählen, die mit der Elektrode verbunden werden soll, und die Position der ausgewählten Zelle in der Kammer zu ermitteln, und wobei die Steuerung elektrisch mit den Auswahleinrichtungen verbunden und geeignet ist, die Position der ausgewählten Zelle zu empfangen und die Positioniereinrichtungen in Reaktion auf die empfangene Position so automatisch zu steuern, dass die Elektrode an der ermittelten Stelle der ausgewählten Zelle positioniert wird.
Vorrichtung nach Anspruch 1, bei der der Prozessor weiterhin geeignet ist, das digitalisierte Bild für eine Identifizierung der Pipettenspitze und eine Ermittlung der Position der Pipettenspitze zu verarbeiten.
Vorrichtung nach einem der Ansprüche 3 bis 6, bei der die Abbildungseinrichtungen ein Mikroskop umfassen.
Vorrichtung nach einem der Ansprüche 3 bis 7, bei der die Digitalisierungseinrichtungen eine Videokamera umfassen.
Vorrichtung nach einem der Ansprüche 3 bis 8, bei der der Prozessor geeignet ist, unter Verwendung einer räumlichen Filterung des Bildes Pixel zu identifizieren, auf die eine Zelle abgebildet ist.
Vorrichtung nach Anspruch 9, bei der die räumliche Filterung die Identifizierung und Markierung eines Pixels mit einer ersten Marke als ein Pixel umfasst, auf das eine Zelle abgebildet worden ist, wenn die Pixelwerte einer spezifi schen Anzahl von Pixeln, die dem betreffenden Pixel benachbart sind, einschließlich des Pixels selbst, niedriger sind als ein erster Schwellenwert.
Vorrichtung nach Anspruch 10, bei der die räumliche Filterung weiterhin die Identifizierung und Markierung einer Gruppe von benachbarten Pixeln mit einer zweiten Marke umfasst, die mit der ersten Markierung markiert sind, auf welche eine einzelne Zelle abgebildet wird, durch Ermitteln der Anzahl von Pixeln, die in der Gruppe von benachbarten Pixeln enthalten sind, und Bildung von Gruppen, die eine Anzahl von Pixeln innerhalb einer vorbestimmten Bereiches umfassen.
Vorrichtung nach Anspruch 11, bei der die räumliche Filterung weiterhin die Identifizierung und Markierung einer Gruppe von benachbarten Pixeln mit einer dritten Marke umfasst, die mit der zweiten Marke markiert sind, wenn der Abstand von Pixeln der Gruppe von benachbarten Pixeln zu Pixeln, die mit der ersten Marke markiert sind, größer ist, als ein vorbestimmter Minimalabstand.
Vorrichtung nach Anspruch 12, bei der die ausgewählte Zelle unter Zellen ausgewählt ist, die auf entsprechende Gruppen von benachbarten Pixeln abgebildet sind, die mit der dritten Marke markiert sind.
Vorrichtung nach Anspruch 13, bei der die Position des zentralen Pixels der ausgewählten Zelle die ermittelte Position der ausgewählten Zelle bildet.
Vorrichtung nach einem der Ansprüche 4 bis 14, bei der der Prozessor geeignet ist, unter Verwendung einer räumlichen Filterung des Bildes Pixel zu identifizieren, auf welche die Pipettenspitze abgebildet ist.
Vorrichtung nach Anspruch 15, bei der das die räumliche Filterung weiterhin die Identifizierung und Markierung eines Pixels mit einer vierten Marke als ein Pixel umfasst, auf welches die Pipettenspitze abgebildet ist, wenn die Pixelwerte einer spezifischen Anzahl von Pixeln, die dem betreffenden Pixel benachbart sind, einschließlich dem Pixel selbst, niedriger sind als ein zweiter Schwellenwert.
Vorrichtung nach Anspruch 16, bei der die räumliche Filterung weiterhin die Identifizierung einer Linie von Pixeln umfasst, wobei jedes Pixel der Linie im Zentrum von Pixeln positioniert ist, die mit der vierten Marke markiert und in der Reihe des betreffenden Pixels angeordnet sind.
Vorrichtung nach Anspruch 17, bei der die Position der Pipettenspitze als die Position eines Endpixels der Linie festgelegt wird.
Vorrichtung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, die weiterhin folgendes umfasst: ein Kammerelement (400), das eine Vielzahl von Kammern zur Aufnahme von Zellen aufweist, und Kammerelement-Bewegungseinrichtungen (200) zum sequentiellen Bewegen der Kammern aus einer Kammerspeicherposition in die Arbeitsposition.
Vorrichtung nach Anspruch 19, bei der das Kammerelement weiterhin Adapter zum Halten von Pipetten umfasst, wobei die Positioniereinrichtungen weiterhin ausgebildet sind, um wahlweise eine Pipette aus ihrem Adapter zurückzuziehen und die Pipette in ihren Adapter einzusetzen, wenn sich die betreffende Kammer in ihrer Arbeitsstellung befindet.
Vorrichtung nach Anspruch 19 oder 20, die weiterhin Mittel (22) zum Zuführen von Flüssigkeit zu den Kammern des Kammerelements umfasst.
Vorrichtung nach Anspruch 21, bei der die Mittel zum Zuführen von Flüssigkeit zu den Kammern des Kammerelements Mittel (66, 69) zum Zuführen einer ersten Flüssigkeit zu den Kammern in einer Speicherposition und einer zweiten Flüssigkeit zu der Kammer in der Arbeitsposition umfassen.
Vorrichtung nach einem der Ansprüche 19 bis 22, die weiterhin Saugeinrichtungen (68) zum Entfernen von überschüssiger Flüssigkeit umfasst, welche durch die Kammern fließt.
Vorrichtung nach einem der Ansprüche 19 bis 23, bei der das Kammerelement ein Drehtisch ist, der in der Vorrichtung drehbar positioniert ist und Vertiefungen aufweist, welche die Kammern bilden.
Verfahren zum automatischen Verbinden einer Elektrode mit einer Zelle, wobei die Elektrode in einer Pipette enthalten ist, die eine Pipettenspitze aufweist, die geeignet ist, eine Dichtung mit hohem elektrischen Widerstand mit der Oberfläche einer Zellmembran zu bilden, wobei das Verfahren folgende Schritte umfasst: Positionieren einer Kammer zum Aufnehmen von Zellen in einer Arbeitsstellung, in der die Verbindung der Elektrode mit der Zelle durchgeführt werden kann, Positionieren der Elektrode in der Nähe der Kammer in ihrer Arbeitsstellung, Ermitteln eines elektrischen Parameters in einem elektrischen Kreis, der die Elektrode und die Kammer umfasst, und automatisches Steuern der Positionierung der Pipette derart, dass die Pipettenspitze an der ermittelten Position der ausgewählten Zelle positioniert wird und eine Dichtung mit einem hohen elektrischen Widerstand mit der Zellmembran der ausgewählten Zelle schafft, wodurch ein elektrischer Parameter der Zellmembran ohne Einwirkung einer menschlichen Bedienungsperson ermittelt werden kann.
Verfahren nach Anspruch 25, das weiterhin den Schritt des Auswählens einer speziellen mit der Elektrode zu verbindenden Zelle umfasst.
Verfahren nach Anspruch 26, das weiterhin folgende Schritte umfasst: Erzeugen eines Bildes von Zellen in der Kammer, Aufzeichnen und Digitalisieren des Bildes durch Aufteilen des Bildes in Pixel, von denen jedes einen aufgezeichneten Intensitätswert besitzt, und Speichern des digitalisierten Bildes in einem Speicher.
Verfahren nach Anspruch 27, das weiterhin folgende Schritte umfasst: Wiedergabe des Bildes, durch den Verwender erfolgende Auswahl einer mit der Elektrode zu verbindenden Zelle, automatisches Ermitteln der Position der ausgewählten Zelle, und automatisches Positionieren der Elektrode an der ermittelten Position der ausgewählten Zelle.
Verfahren nach Anspruch 27, das weiterhin folgende automatisch ablaufende Schritte umfasst: Identifizieren von Zellen in der Kammer, Auswählen einer mit der Elektrode zu verbindenden Zelle, Ermitteln der Position der ausgewählten Zelle in der Kammer, und automatisches Positionieren der Elektrode an der ermittelten Position der ausgewählten Zelle.