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Hintergrund
der Erfindung
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1. Gebiet
der Erfindung
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Die
vorliegende Erfindung betrifft Instrumente zur Analyse und zur Trennung
von Objekten, die in einem Fluid suspendiert sind – insbesondere
solche Instrumente, die optimiert sind, um längliche mehrzellige Organismen
zu analysieren und zu trennen.
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2. Stand der
Technik
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Die
vorliegende Erfindung betrifft Hochgeschwindigkeitsmechanismen zum
automatischen identifizieren und physikalischen Auswählen von
mehrzelligen Organismen mit gewissen räumlich unterscheidbaren, optisch
erfassbaren phänotypischen
Eigenschaften aus gemischten Populationen. Beispiele anwendbarer mehrzelliger
Organismen sind alle Stadien der Caenorhabditis elegans, Drosophila
melanogaster (Fruchtfliegen)-Larven oder Danio rero (Zebrafisch)-Embryos.
Diese sind als Modellorganismen für menschliche Krankheiten und
funktionale Genomstudien nützlich.
Beispiele räumlich
unterscheidbarer optischer Eigenschaften sind die lokalisierte Äußerung von
DNA kodierten fluoreszierenden Proteinmolekülen, lokalisierte Änderungen des
Brechungsindex oder Granularität
oder lokalisierte Änderungen
an spezifischen Anbindungsstellen (Rezeptoren) für optisch gekennzeichnete Antikörper, Lektine
oder andere spezifische Liganden.
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Intakte
mehrzellige Organismen wie z. B. C. elegans, D. melanogaster-Larven
oder D. rero-Embryos werden häufig
als Modellsysteme eingesetzt, um die Funktionsweise menschlicher
Gene zu verstehen, die bei Krankheiten eine Rolle spielen. Menschliche
Genhomologe wurden in diesen Modellorganismen identifiziert und
Mutationen wurden spezifisch in jenen Genhomologen induziert. Solche
Mutationen führen
häufig
zu einer leicht beobachtbaren phänotypischen Änderung
im Modellorganismus und es ist gezeigt worden, dass gewisse Mutanten
auf pharmakologische Verbindungen reagieren und diese Reaktionen
als Beiprodukt optisch messbare Änderungen
im Organismus erzeugen.
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Mutationen
intakter Organismen werden nun als neue Klasse von in vivo Medikamententests
für die Einrichtung
von Bibliotheken (Sammlungen) potenzieller pharmakologischer Verbindungen
verwendet, die durch Verwendung kombinatorischer chemischer Verfahren
erzeugt werden. Mit diesen Organismen kann man Ziele für die Medikamentenanwendung
identifizieren, ohne vollständig
die komplexen biologischen Abfolgen zu verstehen, die das Genom
mit dem Phänotyp
verbinden. Dies erlaubt eine schnelle und ökonomische Testreihe der Verbindungsbibliotheken
für neue
und nützliche
Humanmedikamente, während
politisch kontroverse Versuche an Säugetieren begrenzt werden.
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Das
Aussetzen der Mutationen des Modellorganismus an verschiedene Sammlungen
von Medikamentenverbindungen hilft ebenso dabei, die Genfunktion
zu definieren, selbst wenn die spezifischen hierbei eingeschlossenen
Mutationen noch nicht mit menschlichen Genhomologen verbunden wurden.
Das Hinzufügen
solcher funktionaler Gentechniken zum Repertoire der molekularbiologischen
und biochemischen Verfahren kann den Medikamentenentdeckungsprozess
stark beschleunigen. Forscher können
Medikamentensammlungen mit Bemerkungen über Toxizität, nicht spezifische Aktivität oder Zellmembranpermeabilität versehen,
indem sie ihr Verhalten in intakten Organismen beobachten. Auf diese
Weise können
toxische oder unwirksame Sammlungen und/oder Sammlungsmitglieder
in einem frühen
Stadium verworfen werden, ohne wertvolle Ressourcen zu verschwenden.
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Während die
Modellorganismen wie z. B. die Nematode C. elegans, die Fruchtfliege
D. melanogaster und der Zebrafisch D. rero sich beim Studium menschlicher
Krankheiten als nützlich
erwiesen haben, wurden sie nicht mit Erfolg auf dem Gebiet der Hochgeschwindigkeits-
und Hochdurchsatzmedikamentenforschung eingesetzt. Bislang fehlten
Hochgeschwindigkeitspräparations-
und Analysetechniken für
diese großen
Organismen. Dies stellt ein Hindernis für Forscher dar, die durch tausende
mehrzelliger Organismen nach einer neuen Mutation oder einer Reaktion
auf ein gegebenes Probenmedikament suchen müssen. Z. B. kann eine große Sammlung
mit Hilfe heutiger molekularbiologischer Techniken die Löschung von
Mutationen in einem mehrzelligen Testorganismus mit einer Rate von
20-30 pro Monat erzeugen. Um dann die Wirkung einer Sammlung chemischer
Verbindungen (die häufig
100.000 diskrete Verbindungen enthält) an einer Klasse mutierter
Organismen auszuwerten, muss man zuerst eine präzise Anzahl von Organismen
des mutierten Stamms desselben Entwicklungsstadiums manipulieren
und in verschiedene Behälter,
wie z. B. Vertiefungen eines Mikrotitrierplattenarrays deponieren.
Wilde Arten oder Abweichungen von dem erwünschten mutierten Stamm oder
Organismen in einem unterschiedlichen Entwicklungsstadium müssen eliminiert
werden. Die Verwendung langsamer manueller Methoden, die Auswahl
und das Ablegen von Organismen der geeigneten Art stellt einen zeitlichen
Engpass für
den gesamten Vorgang der Medikamentenentdeckung dar. Zusätzlich beruhen
manuelle Verfahren auf Pipetten, die genaue Volumina an Flüssigkeit
abgeben, jedoch nicht genaue Anzahlen von Organismen. In vielen
Studien, in denen die Reproduktionsrate durch die Mutation geändert wird, ist
es notwendig, das Studium der Wirkung einer Verbindung aus der kombinatorischen
Sammlung mit einer exakten und bekannten Anzahl mehrzelliger Organismen
in jeder Vertiefung zu beginnen. Dies ist bestenfalls ein entmutigendes
Erfordernis.
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Zusätzlich zum
Bedarf an schnellen Präparationsverfahren
besteht ein Bedarf an schnellen Analyseverfahren. Wenn z. B. ein
mutierter Stamm oder ein Ausdrucksystem durch ein räumliches
Fluoreszenzmuster oder Verfärbungsmuster
gekennzeichnet werden kann, dann könnte die Wirkung der therapeutischen
Verbindungen oder der toxischen Umgebungen auf diese Stammkulturen
durch Änderungen
in diesen Mustern bestimmt werden. Z. B. wird grün fluoreszierendes Protein
(GFP) als Reportergen verwendet, um anzuzeigen, dass ein eingesetztes
Gen sich ausgedrückt
hat. Der Ausdruck des fluoreszenten Proteins tritt gewöhnlich in einem
spezifischen räumlichen
Muster im mehrzelligen Organismus auf. Die Unterscheidung eines
Musters von einem anderen wird zurzeit von Hand mit dem Fluoreszenzmikroskop
durchgeführt.
Dies ist eine extrem anstrengende Aufgabe, die eine wesentliche
Anzahl an Arbeitskräften
erfordert, die eine hochrangige akademische Ausbildung besitzen
müssen.
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Die
US 6,400,453 beschreibt
ein Instrumentensystem für
die schnelle Analyse und Sortierung von mehrzelligen Organismen
unter Verwendung optischer Eigenschaften, wie z. B.
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Streulicht
und Fluoreszenz, um jeden Organismus in einer fließenden Strömung zu
klassifizieren. Ein einzelner Wert der Fluoreszenzintensität an einer
gegebenen Emissionswellenlänge
wird gemessen und jedem Organismus zugewiesen. Die vorliegende Erfindung
ist eine Verbesserung, die einen Flussanalysator und -sortierer
in die Lage versetzt, nicht nur die Intensität, sondern auch die Position
der Fluoreszenz entlang der (langen) Hauptachse des Organismus zu
lokalisieren und zu berichten, und diese neue räumliche Information einzusetzen,
um die Organismen zu sortieren.
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Wenn
eine mutierte Stammkultur oder ein transgener Organismus durch ein
stabiles räumliches
Fluoreszenzmuster, Verfärbungsmuster
oder andere optisch messbare Eigenschaften gekennzeichnet wird,
dann können
die Wirkungen der therapeutischen Verbindungen oder toxische Umgebungen
auf diese Stammkulturen potenziell bestimmt werden, indem Änderungen
in diesen räumlichen
Mustern beobachtet werden. Die Unterscheidung eines Musters von
einem anderen wird zurzeit von Hand mit Hilfe des Fluoreszenzmikroskops durchgeführt. Dies
ist eine extrem ermüdende
Aufgabe, die eine wesentliche Anzahl an Arbeitskräften erfordert,
die eine hochgradige akademische Ausbildung besitzen müssen. Die
Automatisierung der Messung der räumlichen Fluoreszenzmuster
wird die Objektivität
und die Geschwindigkeit der Messung verbessern.
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Flussinstrumente
wurden bereits bevor verwendet, um die Anzahl von Nematoden in einem
Flüssigkeitsvolumen
zu zählen.
Solch eine Vorrichtung wurde von Byerly et al (L. Byerly, R.C. Cassada
und R.L. Russell, „Machine
for Rapidly Counting and Measuring the Size of Small Nematodes", Rev. Sci. Instrum.,
Band 46, Nr. 5, Mai 1975) beschrieben, wo das Durchflusszytometer
eine Randströmung
einsetzte, um die Nematoden entlang der Flussrichtung zu orientieren,
so dass ihre Größe gemessen
und eine Zählung
von einem Organismus nach dem anderen mit einer elektrischen Impedanzmethode
vorgenommen werden konnte. Die Vorrichtung war einem handelsüblichen
Coulter-Zähler ähnlich.
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Die
vorliegende Erfindung unterscheidet sich von Byerly-Vorrichtung darin,
dass sie eine Vorrichtung bereitstellen kann, die spezifische Organismen
auswählt
und ablegt (sortiert). Die vorliegende Erfindung ist auch nicht
auf die Verwendung eines Impendanzsensors beschränkt, der lediglich die Gesamtgröße bestimmen
kann, sondern verwendet stattdessen eine optische Messung, um lokalisierte
Merkmale entlang der Hauptachse des Organismus räumlich aufzulösen und
diese zum Analysieren und Sortieren zu verwenden.
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Ein
optisches Flussinstrument zur Analyse von länglichen Organismen wie z.
B. Plankton mit Breiten von 500 μm
und Längen über 1000 μm wurde beschrieben,
um mit einer Randströmung
die Orientierung des Planktons zu erreichen (J.C. Peeters, G.B.
Dubelaar, J. Ringelberg und J.W. Visser, „Optical Plankton Analyser:
a Flow Cytometer for Plankton Analysis, I: Design Considerations" Cytometry 10. September
1989 (5): 522-528; und G.B. Dubelaar, A.C. Groenwegen, W. Stokdijk,
G.J. van den Engh und J.W. Visser, "Optical Plankton Analyser: a Flow Cytometer
for Plankton Analysis, II: Specifications", Cytometry 10. September 1989 (5):
529-539). Der Größenbereich
des in diesen optischen Durchflusszytometern verwendeten Planktons
ist ähnlich
jenem, der bei C. elegans Nematoden, Fruchtfliegenlarven und Zebrafischembryos
angetroffen wird; jedoch ist keine Einrichtung vorgesehen, die die
zweideutigen Streulichtsignale vermeidet, die von der vorliegenden
Erfindung eliminiert werden.
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Darstellung
der Erfindung
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Die
vorliegende Erfindung stellt ein Instrument zur Analyse und selektiven
Abgabe von länglichen mehrzelligen
Organismen bereit, umfassend eine Quelle, die mehrzellige Organismen
in einer Fluidsuspension enthält;
Mittel zum Verursachen der Bewegung der Fluidsuspension in einer
Flussrichtung; Mittel zum Ausrichten der länglichen mehrzelligen Organismen
relativ zur Flussrichtung; eine Lichtquelle zur Erzeugung eines optischen
Strahls, durch welchen die länglichen
mehrzelligen Organismen nach deren Ausrichtung durchtreten; einen
ersten optischen Detektor zum Erfassen von Licht, welches von den
länglichen
mehrzelligen Organismen gestreut wurde, über einen Raumwinkel von mindestens
0,03 π Steradiant
(20°), um
einen Durchtritt der Organismen durch den optischen Strahl zu erfassen;
mindestens einen zusätzlichen
optischen Detektor zum Erfassen sequentieller optischer Eigenschaften,
die entlang einer Länge
der mehrzelligen Organismen angeordnet sind, Mittel zur Erzeugung
einer Datendarstellung der sequentiellen optischen Eigenschaften,
Mittel zur Analyse der Datendarstellung, und einen Fluidschalter
stromabwärts
von einem Punkt, wo die Organismen durch den optischen Strahl durchtreten,
wobei der Schalter geeignet ist, um auf die Mittel zur Analyse zu reagieren
und es so den erfassten Objekten zu erlauben, zu einem Probenbehälter zu
gelangen.
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In
einer Ausführungsform
wird die Ausgabe eines optischen Detektors verwendet, um die Ausgabe
der anderen optischen Detektoren anzusteuern.
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In
einer weiteren Ausführungsform
ist das Mittel zur Erzeugung einer Datendarstellung der sequentiellen
optischen Eigenschaften geeignet, um in Funktion der angesteuerten
Ausgaben der zusätzlichen
Detektoren zu arbeiten.
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In
einer weiteren Ausführungsform
umfasst das Instrument eine Steuerung, die mit dem Fluidschalter verbunden
ist und arbeitet, um den Schalter zu veranlassen mehrzellige Organismen
auszuwählen,
deren Datendarstellungen vorbestimmte Kriterien erfüllen.
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Ein
Verfahren zum selektiven Ausgeben von länglichen mehrzelligen Organismen,
umfassend die folgenden Schritte:
Zentrieren und Orientieren
der Probenobjekte in einem fließendem
Fluidstrom; Durchführen
des Fluidstroms durch eine Messzone, optisches Erfassen des Vorhandenseins
eines mehrzelligen Organismus, der durch Messzone durchtritt, mit
Hilfe eines Lichtstreuungssensors, der einen Akzeptanz-Raumwinkel von mindestens 0,03 π Steradiant
(20°) aufweist,
Ansteuern der Ausgabesignale von zusätzlichen optischen Sensoren
mit einer Ausgabe des Lichtstreuungssensors, Erzeugen einer Datendarstellung
von sequentiellen optischen Eigenschaften der mehrzelligen Organismen,
welche Ausgabesignale von den zusätzlichen optischen Sensoren
umfasst; Analysieren der Datendarstellung, um einen erfassten Organismus
auszuwählen
und Steuerung eines Fluidschalters, um es den erfassten Objekten
zu erlauben, zu einem Probebehälter
zu gelangen.
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In
einer Ausführungsform
wird der erfasste Organismus einer Testchemikalie oder einer Testumgebung
zugeführt.
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In
einer weiteren Ausführungsform
werden die mehrzelligen Organismen vor dem Durchführen durch die
optische Messzone einer Testchemikalie oder einer Testumgebung ausgesetzt,
um zu bestimmen, ob die Datendarstellung von der Testchemikalie
oder Testumgebung verändert
wird. Die vorliegende Erfindung verwendet eine fließende Flüssigkeitströmung, um
die länglichen
mehrzelligen Organismen zu orientieren, und einen eng fokussierten
stationären
optischen Strahl, um sie entlang ihrer Hauptachse während des
Vorbeiströmens
abzutasten. Merkmale wie Zellendichte, Brechungsvermögen, Granularität und Fluoreszenz
können
gemessen und als Funktion der Position entlang der Länge des
orientierten Organismus aufgezeigt werden (d. h. eine axiale Musterabtastung).
Die Erfindung ist eine Verbesserung der Geschwindigkeit und der
statistischen Genauigkeit gegenüber
gegenwärtigen
manuellen Techniken zur Analyse mehrzelliger Organismen nacheinander
unter dem Mikroskop. Die Information aus der Abtastung kann verwendet
werden, um den Genausdruck zu kennzeichnen und die physikalische
Auswahl und das Ablegen der Phänotypen
mit erwünschten Eigenschaften
zu ermöglichen,
oder sie kann verwendet werden, um Änderungen im Genausdruck zu
bestimmen, die durch toxische oder therapeutische Verbindungen verursacht
werden.
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Im
Fall, in dem die Fluoreszenz von diesen Organismen sehr schwach
ist, begleiten vergleichsweise hohe elektronische Rauschniveaus
die elektronischen Signale, die vom Fluoreszenzdetektor und seiner
zugehörigen
Elektronik erzeugt werden. Diese schwachen Signale können nicht
verwendet werden, um das Vorhandensein eines Organismus zu markieren
und andere weniger Rausch-behaftete Signale müssen verwendet werden, um die
Fluoreszenzmessung anzusteuern. Der axiale Lichtverlust kann als
solch eine Ansteuerung verwendet werden. Eine weitere bevorzugte
Ansteuerung kann vom rauscharmen Lichtstreusignal des Organismus
abgeleitet werden. Herkömmliches
Ansteuern mit Lichtstreuung, wie es bei der Durchflusszytometrie
einzelner Zellen praktiziert wird, erzeugt mehrdeutige Signale,
wenn es auf mehrzellige Organismen angewendet wird und führt somit
zur einer falschen Ansteuerung der Fluoreszenz. Eine Lichtstreuungsmessvorrichtung
wird hier beschrieben, die unzweideutig diese Fluoreszenzsignale
ansteuert. Diese Signale können dann
mit der Position entlang der Hauptachse des länglichen mehrzelligen Organismus
korreliert werden und als verbesserte Analyse- und Sortierparameter
eingesetzt werden.
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Herkömmliche
optische Durchflusszytometer analysieren und sortieren kleine Partikel
und einzelne Zellen in flüssiger
Suspension, indem sie die Lichtstreuung innerhalb eines engen Kegels
oder Raumwinkels unter verschiedenen Winkeln zum einfallenden optischen
Strahl und die Fluoreszenzemission an verschiedenen Wellenlängen messen.
Informationen über
die Zellengröße und -struktur
kann aus der an unterschiedlichen Winkeln gesammelten Lichtstreuung
abgeleitet werden. Z. B. können
Informationen über
die Größe aus der
Lichtstreuung abgeleitet werden, die an kleinen Winkeln relativ
zum einfallenden optischen Strahl gemessen wird, während Informationen über die
interne Zellgranularität
von der Lichtstreuung abgeleitet werden können, die unter einem weiten
Winkel (in der Nähe
eines rechten Winkels) relativ zum optischen Strahl gemessen wird.
Weiter zeigt der Stand der Technik, dass die Größe der zu messenden granularen
Strukturen den Winkel und den Akzeptanzkegel für eine optimale Weitwinkelmessung
bestimmt.
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Die
Lichtstreuungssignale, die unter spezifischen Winkeln und über enge
Kegelöffnungswinkel
gemessen werden, werden auch verwendet, um die Detektoren der schwachen
Fluoreszenzsignale von den einzelnen Zellen anzusteuern. Die schwachen
Fluoreszenzsignale können
nicht effektiv eingesetzt werden, um das Vorhandensein einer Zelle
im optischen Strahl anzuzeigen, da hohe Niveaus an elektronischem
Rauschen diese Signale begleiten. Rauschspitzen überschreiten häufig den
Grenzwert für
die Fluoreszenzmessung und erzeugen falsche Auslesungen, die mit
schwach fluoreszierenden Zellen verwechselt werden. Um dies zu vermeiden,
verwenden Durchflusszytometer allgemein Signale von einem oder mehreren
Detektoren, die so platziert sind, dass sie die Lichtstreuung unter
einem oder mehreren Winkeln relativ zum Strahl messen, um relativ rauschfreie
Signale zu erzeugen, die effektiv von falscher Fluoreszenz aufgrund
elektronischen Rauschens unterschieden werden können und die wahre Fluoreszenz
von den Zellen ansteuern können
(die Aufmerksamkeit des Lesers sei auf das US Patent 4,284,412 gerichtet).
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Es
ist für
den Einsatz dieser Lichtstreuungsdetektoren als Fluoreszenzansteuerer
(fluorescence gates) grundlegend, dass ihr Erfassungsraumwinkel
eng ist. Z. B. werden sog. „Kleinwinkel-Vorwärtsstreuungs-Detektoren" (LAFS detectors,
low angle forward scattering detectors) häufig bis auf 0,5° zur optischen
Achse platziert und sammeln Licht nur innerhalb eines Kegels von
einem Grad. Weitwinkel-Lichtstreuungsdetekoren
werden häufig
an Positionen gestellt, die von ungefähr 10°-90° von der Achse reichen, und
auch Licht innerhalb kleiner Öffnungskegel
von weniger als 5° sammeln.
Wenn der Winkel des Sammelkegels nicht so gering wie möglich gehalten
wird, dann können
die Informationen über
die Granularität
und die Größe sich
vermischen. Unter diesen Bedingungen werden z. B. große Zellen
von kleinen Zellen ununterscheidbar und granulare Zellen werden
von nicht granularen Zellen derselben Größe ununterscheidbar.
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Wenn
Lichtstreuungsdetektoren mit engem Akzeptanzkegel (NACLS) (narrow
acceptance cone light scatter) verwendet werden, um den Durchtritt
mehrzelliger Organismen wie z. B. C. elegans zu beobachten, treten
drei Probleme auf, die nicht mit einzelnen Zellen, wie z. B. Blutzellen
auftreten. Zuerst wurde herausgefunden, dass das Lichtstreuungssignal
nicht notwendigerweise zu Beginn des Durchtritts des Organismus durch
den optischen Strahl über
die Grundlinie (Null) ansteigt, sondern stattdessen zu einer unvorhersagbar späteren Zeit.
Zweitens wurde herausgefunden, dass das Lichtstreuungssignal nicht
notwendigerweise am Ende des Durchtritts des Organismus durch den
optischen Strahl auf die Grundlinie (Null) zurückkehrt, sondern stattdessen
zu einer unvorhersehbaren früheren
Zeit. Drittens wurde auch herausgefunden, dass das Lichtstreuungssignal
häufig
zu einem oder mehreren unvorhersehbaren Zeiten auf die Grundlinie
(Null) zurückkehrt,
während
der Organismus sich im Strahl befindet.
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Daher
wird die grundlegende Anstrengung, die Größe der mehrzelligen Organismen
basierend auf ihrer „Flugzeit" durch den Analyselichtstrahl
zu messen, von diesem unvorhersehbaren Verhalten der Lichtstreusignale
zunichte gemacht, die über
enge Öffnungswinkel
gesammelt werden.
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Des
Weitern sind mit engem Öffnungswinkel
gemessene Lichtstreuungssignale, die spät starten, nicht zum Ansteuern
schwacher Fluoreszenzsignale geeignet. Schließlich können mit engem Öffnungswinkel
gemessene Lichtstreuungssignale, die zu früh zur Grundlinie zurückkehren,
nicht verwendet werden, um die Position einer schwachen Fluoreszenz
entlang der Achse des Wurms anzuzeigen. Die Signale, die zu früh auf die
Grundlinie zurückkehren,
können
mit dem Durchtritt von zwei oder mehr separaten Organismen verwechselt
werden, wenn tatsächlich
nur einer durch den Analysestrahl hindurch getreten ist.
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Die
vorliegende Erfindung verwendet nicht die gewöhnlichen Einzelzellen-Lichtstreuungsmessverfahren,
sondern verwendet stattdessen eine Lichtstreuungsmessung über einen
weiten Öffnungswinkel
bei der Analyse und dem Sortieren von mehrzelligen Organismen. Ein
Aspekt der Erfindung ist es, gestreutes Licht über einen weiten Raumwinkel
wie z. B. 0,03 π Steradiant
(20°) oder
mehr zu sammeln. Dies stellt ein Lichtstreuungssignal bereit, das
zuverlässig
zu dem Zeitpunkt positiv wird, an dem Organismus in den Strahl eintritt, eindeutig über der
Grundlinie verbleibt, während
sich der Organismus im Strahl befindet, und zuverlässig auf die
Grundlinie zurückkehrt,
wenn der Organismus aus dem Strahl austritt. Dieser Aspekt der Erfindung
ermöglicht
einen anderen Aspekt der Erfindung, nämlich genaue eindeutige Lichtstreuungssignale,
die über
weiten Öffnungswinkel
gesammelt wurden, zu verwenden, um die lineare Position der schwachen
und rauschbehafteten Fluoreszenzsignale entlang der Achse des Organismus
zu markieren. Die Breite des benötigten Öffnungswinkels
hängt von
der Art des Organismus ab.
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Die
vorliegende Erfindung verwendet ein eindeutiges Lichtstreuungssignal
von einem Lichtstreuungsdetektor mit weiten Akzeptanzwinkel (WACLS,
wide acceptance angle light scatter) als Ansteuerung und ein Zeitgeberverfahren
zur Analyse der Fluoreszenz entlang der Achse des Organismus. Die
Lokalisierung der Fluoreszenz entlang der Achse des Organismus ist
ein wichtiger Parameter für
die Analyse und das Sortieren. Z. B. ist es beim C. elegans in vielen
Klonieranwendungen wichtig, die männlichen Organismen von Hermaphroditen
zu trennen. Dies kann mit einem Fluoreszenzmarkierten Lektin (Weizenkeim-Agglutinin)
erzielt werden, dass sich an die Vulva des Hermaphroditen und den
Kopulationssack des Männchens
anbindet. Diese beiden Strukturen sind in ihrer Helligkeit nicht
leicht unterscheidbar, jedoch befindet sich die Vulva in der Nähe des Mittelpunkts
des Organismus und der Kopulationssack befindet sich im Schwanz.
Somit wird die axiale Lokalisierung der Fluoreszenz der Parameter
zur differentiellen Analyse und Sortierung von Männchen und Hermaphroditen.
Dies ist schematisch in 3 veranschaulicht,
wo zwei Oszilloskopspuren für
Einzelorganismen gezeigt sind. Eine Spur (3A) besitzt
einen Fluoreszenzpeak in der Nähe
des Mittelpunkts und die andere (3B) besitzt
einen Fluoreszenzpeak im Schwanz.
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Da
kein Fluoreszenzsignal vorhanden ist, um den Anfang des Organismus
in den Oszilloskopspuren der 3 zu
markieren, muss ein Mittel aufgestellt werden, um den Anfang und
das Ende des Durchtritts des Organismus durch den Lichtstrahl zu
markieren. Dies wird dadurch gemacht, dass ein mit weitem Akzeptanzöffnungswinkel
gemessenes Streulichtsignal (WACLS-Signal) verwendet wird. Der Start dieses
Signals löst eine
Uhr im elektronischen Prozessor aus, die wiederum veranlasst, dass
die Fluoreszenzdaten in regelmäßigen Zeitintervallen
abgefragt werden, während
das mit weitem Akzeptanzwinkel gemessene Lichtstreuungssignal über einem
im Voraus festgelegten Grenzwert bleibt. Die Abfragestopps, bei
dem das WACLS-Signal unter den Grenzwert fällt, bezeichnen das Ende des
Organismus.
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Das
Folgende ist eine parametrische Darstellung eines mehrzelligen Organismus,
die durch Verwendung eines WACLS-Signals
zum Ansteuern der Fluoreszenzmessung entlang der Achse des Organismus
eingesetzt werden kann. Man nehme einen WACLS-Detektor, der ein
Signal S1 erzeugt, und einen Zeitgebermechanismus, der die Signale
von allen anderen Detektoren alle T Mikrosekunden abfragt. Es sei
angenommen, dass sich andere Lichtstreuungs- oder Lichtabsorbtionsdetektoren
an verschiedenen Winkelpositionen in Bezug auf den Analysestrahl
befinden. Die Signale dieser Detektoren seien mit S2, S3...Sn bezeichnet.
Weiter sei angenommen, dass Fluoreszenzdetektoren vorhanden sind,
die auf die verschiedenen Emissionswellenlängen empfindlich sind und Signale
F1, F2, F3...Fn erzeugen. Die folgende Matrix besitzt Datenspalten
für jeden
Detektor und Datenreihen für
jedes Messintervall.
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Das
obige Matrixbeispiel zeigt das WACLS-Signal S1 mit nicht verschwindenden
Einträgen
für die
Zeitintervalle T2 bis Tn-1. Dies ist das unabhängige Zeitgebersignal für alle anderen
Detektorkanäle.
Die anderen Streulichtdetektoren S2 bis Sn sind nicht notwendigerweise
WACLS-Detektoren und haben daher während der Zeit T2 bis Tn-1
Nullwerte. Das Fluoreszenzmerkmal der Emissionswellenlänge F1 ist
klein und im Intervall T2 lokalisiert. Dies stellt ein Merkmal dar,
das verwendet werden kann, um den „Schwanz" des Organismus zu markieren (siehe 1).
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Das
Fluoreszenzmerkmal mit der Emissionswellenlänge S2 ist nicht so klein (entlang
der axialen Richtung) und tritt an einer anderen Stelle als das
F1-Merkmal auf. Die relative Position des Merkmals wird mit Bezug
auf die von dem WACLS-Detektorsignal
S1 ausgelöste
Zeitgebung bestimmt. Wenn die Geschwindigkeit des Organismus bekannt
ist und die „Schwanz"-Markierung verwendet wird, kann die
absolute Position dieses Merkmals auch bestimmt werden. Das Fluoreszenzmerkmal
mit der Emissionswellenlänge
F3 zeigt sich an zwei kleinen Stellen, die in der WACLS-Timing-Sequenz
als T3 und Tn-1 angezeigt sind.
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Jeder
abgetastete Organismus kann mit einer parametrischen Matrix dieser
Art dargestellt werden. Während
sie nicht so viel Information wie ein Mikroskopbild des Organismus
enthalten, haben die Datenerfassungszeiten für solche Matrizen die Größenordnung
von 5 Mikrosekunden bis 250 Mikrosekunden, abhängig von der Länge des
Organismus. Diese hohe Geschwindigkeit wird erreicht, da einfache,
schnelle Fotomultiplikatoren das gestreute Licht sammeln und kein
Bild geformt wird. Bei Zytometern werden die Bilder gewöhnlich von
CCD-Kameras gespeichert, die inhärent
weniger empfindlich als Fotomultiplikatoren sind und daher mehr Zeit
zum Sammeln von genügend
Photonen brauchen, um ein Bild zu formen. Die Abbildungszeiten für Fluoreszenzanalyse
von Organismen wie z. B. C. elegans sind von der Größenordnung
von 50 ms, was 200 bis 10.000 mal langsamer ist als die Zeit, die
nötig ist,
um die oben beschriebenen parametrischen Daten zu sammeln und zu
speichern. Die Abfragezeiten und die Geschwindigkeit des Organismus
bestimmen die räumliche Auflösung des
parametrischen Verfahrens. Wenn sich z. B. der Organismus typischerweise
mit einer Geschwindigkeit von ungefähr 500 cm/s durch den Analysestrahl
bewegt, dann beträgt
für eine
5 Mikrosekunden dauernde Abfragezeit die räumliche Auflösung ungefähr 25 μm.
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Kurze Beschreibung
der Zeichnungen
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1 zeigt
diagrammatische Darstellung der Optik, der Flusszelle, der Steuerungselektronik
und des Fluidschalters.
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2 zeigt
eine diagrammatische Darstellung der optischen Strahlen des Instruments
der 1.
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Die 3A und 3B zeigen
sich auf Fluoreszenzsignale beziehende Diagramme (angesteuert durch
eines der Verfahren der Erfindung), die sich auf einen hermaphroditischen (3A)
und einen männlichen
(3B) C. elegans beziehen, wie durch das Instrument
der vorliegenden Erfindung gemessen.
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4A zeigt
eine tatsächliche
Oszilloskopspur von einem NACLS-Vorwärtslichtstreuungsdetektor (untere
Spur), der unter einem Vorwärtslichtstreuwinkel
von 45° und
einen Bruchteil eines Grades unterhalb der optischen Achse angeordnet
ist, und von einem Fluoreszenzdetektor (obere Spur) unter rechtem
Winkel zu optischen Achse.
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4B zeigt
tatsächliche
Oszilloskopspuren von einem NACLS-Vorwärtslichtstreuungsdetektor
(untere Spur), der unter 45° relativ
zur optischen Achse platziert ist, und von einem Fluoreszenzdetektor
(obere Spur), der unter einem rechten Winkel relativ zur optischen
Achse positioniert ist.
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5 zeigt
tatsächliche
Oszilloskopspuren von einem Absorptionsdetektor (extinction detector,
untere Spur), der auf der optischen Achse positioniert ist, und
von einem Fluoreszenzdetektor, der unter rechtem Winkel zur optischen
Achse liegt (obere Spur).
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6A zeigt
tatsächliche
Oszilloskopspuren von einem WACLS-Vorwärtslichtstreuungsdetektor
(untere Spur) und von einem Fluoreszenzdetektor unter rechtem Winkel
zur optischen Achse (obere Spur); die abgetasteten C. elegans Proben
zeigen mehrere diskrete Fluoreszenzpunkte.
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6B zeigt
tatsächliche
Oszilloskopspuren von einem WACLS-Vorwärtslichtstreuungsdetektor
(untere Spur) und von einem Fluoreszenzdetektor unter rechtem Winkel
zur optischen Achse (obere Spur); die abgetasteten C. elegans Proben
zeigen eine kleine zusätzliche
Fluoreszenz an einem Ende.
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Detaillierte Beschreibung
bevorzugter Ausführungsformen
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Die
folgende Beschreibung wird bereitgestellt, um den Fachmann in die
Lage zu versetzen, die Erfindung herzustellen und zu verwenden,
und stellt die besten Ausführungen
dar, die vom Erfinder zur Durchführung
dieser Erfindung in Betracht gezogen wurden. Verschieden Abwandlungen
werden jedoch dem Fachmann leicht offensichtlich sein, da die allgemeinen
Prinzipien der vorliegenden Erfindung hier spezifisch definiert
wurden, um optische Ansteuerungsvorrichtungen (optical gating devices)
und Verfahren zur Verwendung mit einem optischen Analysator/Sortierer
bereitzustellen, der für
längliche
mehrzellige Organismen konzipiert wurde.
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Das experimentelle
Flussabtastsystem
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Ein
Instrument wie jenes, das schematisch in 1 gezeigt
ist, wurde mit einem austauschbaren Paar von Lasern (Argon-Ionen- und Helium-Neon-Laser)
als Lichtquelle gebaut. Die Messung wurden verschiedentlich mit
Siliziumfotodetektoren und Fotomultiplikatoren durchgeführt. Die
Flusszelle war rechteckig und wies eine Kapillare quadratischen
Querschnitts auf, die an einer Seite 250 μm misst, zur Verwendung mit
dem C. elegans. Die Flusszellenkapillare war an einer Seite 1000 μm lang, um
die erste bis dritte Erscheinungsform der D. melanogaster-Larven
aufzunehmen. Die Randströmung
wurde verwendet, um diese länglichen
Organismen auszurichten, wenn sie aus der Probendüse austreten
und in die Flusszellenkapillare eintreten.
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Diese
Kapillarenflusszelle liegt an der Fokuslinie des Laserstrahls. Die 2 zeigt
diagrammatisch das geometrische Verhältnis der Strömung unter
verschieden optischen Strahlen. Das Fluoreszenzlicht wird durch
einfache asphärische
Linsen oder Mikroskopobjektive gesammelt und durch Emissionsfilter
an Fotomultiplikatoren weitergeleitet. Aufgrund des fokussierten
Laserstrahls und der Sammellinsen wird der fließende Organismus optisch abgetastet,
wenn er durch den Brennpunkt tritt.
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Gleichzeitige
NACLS und Fluoreszenz von C. elegans Ein Streulichtsensor wurde
an verschiedenen Winkelpositionen in Bezug auf die optische Achse
in der Vorwärtsstreurichtung
platziert. Der Sammelöffnungswinkel
betrug ungefähr
6° (NACLS).
Ein Fotomultiplikator mit einer 20 X-Sammellinse und einem Barrierefilter, der
für die
Fluoreszenz vom GFP optimiert ist, wurde auf dem Fluoreszenzprotektor
eingesetzt. Die C. elegans, die für diese Darstellung verwendet
wurden, drückten
das GFP an zwei Stellen im „Kopf" aus und sonst nirgendwo.
Die Oszilloskopspuren für
das Streulicht und die Fluoreszenz sind in den 4A und 4B gezeigt.
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Die
Spuren zeigen den Durchtritt des Organismus durch die Fokuslinie
des Laserstrahls. Die untere Spur 1 ist das Lichtstreuungssignal
und die obere Spur 2 ist das Fluoreszenzsignal. Die X-Achse ist
die Zeit. Die 4A ist typisch für eine Klasse
von Lichtstreuungsspuren, die mit einem NACLS-Detektor beobachtet werden.
Der Detektor wurde unter einem 45° Vorwärtslichtstreuungswinkel
direkt unterhalb der Laserstrahlachse (unterhalb der horizontalen
Ebene in 2) platziert, wo er aus der
Flusszelle austritt. Kein gestreutes Licht von den Flusszellenstrukturen
selbst fiel auf den Detektor ein. Das NACLS-Signal scheint zur richtigen Zeit
anzusteigen. Das Ansetzen der NACLS-Spur und der schwachen Autofluoreszenzspur
von den vorderen Strukturen der Nematode fallen zusammen. Das NACLS-Signal
scheint auf die Grundlinie zurückzukehren, nachdem
der Fluoreszenzkopf passiert ist. Unglücklicherweise kehrt die Spur
auch ungefähr
während
der Mitte des Durchtritts der Nematode auf die Grundlinie zurück. Dies
würde den
falschen Anschein erwecken, dass zwei Organismen statt einem durchgetreten
sind. Dieses NACLS-Signal zeigt, dass Bedarf nach einem neuen, eindeutigen
Auslöse-
und Zeitgebersignal besteht.
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Die 4B zeigt
ein anders Problem, das mit der unrichtigen Platzierung eines Streulichtdetektors zum
Auslösen
verbunden ist. In diesem Beispiel wurde derselbe Detektor in der
horizontalen Ebene der 2 platziert, jedoch unter einem
Winkel von 45° zur
Vorwärtsrichtung.
In diesem Fall fiel gestreutes Streulicht (stray scattered light)
von der Kapillare auf den Detektor ein. Ein Grundlinienwiederherstellungsschaltkreis
(baseline restoration circuit) wurde verwendet, um dieses Lichtniveau
wieder auf Null zu bringen. Die NACLS-Spur zeigt eine falsche Rückkehr zur
Grundlinie, die dadurch verursacht wird, dass der Akzeptanzöffnungswinkel
zu gering ist, und zusätzlich
an einer Stelle, wo das Signal negativ wird. Der ins Negative gehende
Bereich wird verursacht, wenn Streulicht von der Flusszelle von
der Nematode zu einem Ausmaß blockiert
wird, das mehr Licht blockiert als gestreut wird. Dieses Signal
könnte
nicht als Auslöser-
oder Zeitgebersignal verwendet werden, und zwar aus zwei Gründen. Der
erste ist, dass der Detektorakzeptanzöffnungswinkel zu klein war,
und der zweite ist, dass das Streulicht auf dem Detektor durch den
Durchtritt der Nematode blockiert wurde.
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Mit den optischen
Extinktionssignalen als Auslöser-
und Zeitgebersignalen verbundene Probleme
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5 zeigt
ein anderes Problem, dass mit der unrichtigen Platzierung eines
Streulichtdetektors zum Auslösen
verbunden ist. In diesem Fall wurde ein Sensor direkt auf die Achse
und in den Laserstrahl positioniert. Die Aufgabe war, die Lichtblockierung
(Extinktion) aufgrund der Organismen zu messen. Die Lichtextinktion
ist eine mögliche
Alternative zum bevorzugten WACLS-Auslöser der vorliegenden Erfindung.
Der Testorganismus C. elegans besaß einen einzelnen schwachen Bereich
mit Fluoreszenz an einer neuronalen Stelle im Kopf, die geringfügig hinter
der Spitze der „Nase" liegt. Ein 40X-Objektiv
wurde verwendet, um mehr Licht zu sammeln, da dieser Organismus
sehr schwach fluoreszent war. Der Extinktionssensor sammelte Licht über einen Öffnungswinkel
von 2°.
In diesem Fall kehrt die Extinktionsspur während des Durchtritts der Nematode auf
die Grundlinie zurück
und wird sogar geringfügig
negativ. Daher könnte
dieses Signal nicht als Auslöser- oder
Zeitgebersignal verwendet werden.
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Gleichzeitige
WACLS und Fluoreszenz von C. elegans
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Ein
Fotodetektor wurde auf die optische Achse platziert und besaß einen
Sammelraumwinkel von ungefähr
0,07 π Steradiant
(30°) (WACLS).
Eine Maske wurde über
die mittige Vorderseite des Detektors gelegt, um jedes direkt übertragene
Licht oder Streulicht (stray light) von der Flusszellenkapillare
zu blockieren. Auf diese Weise sammelte der Detektor Streulicht
vom Organismus über
einen um mehrere Male breiteren Öffnungswinkel
als in den vorhergehenden Beispielen. Der Fotomultiplikator mit
einer 40X-Sammellinse und einem Barrierefilter für das grüne Fluoreszenzprotein wurde
verwendet, um die Fluoreszenz zu messen, da das Fluoreszenzsignal
sehr schwach war.
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6A zeigt
ein WACLS-Signal auf der unteren Spur und das zugehörige Fluoreszenzsignal
auf der oberen Spur. Man bemerke, dass das WACLS-Signal zur richtige
Zeit beginnt und endet und nicht während des Durchtritts der Nematode
auf die Grundlinie zurückkehrt.
Dies war eine konsistente und systematische Beobachtung, solang
der Akzeptanzwinkel ausreichend breit war und Licht von dem beleuchtendem
Strahl oder dem Streulicht nicht vom Streulichtdetektor gesammelt
wurde. Der besondere Organismus C. elegans, der für dieses
Beispiel verwendet wurde, drückte
seine Fluoreszenz entlang der gesamten Länge mit 5-6 Punkten entlang
der Achse aus, wo der Ausdruck lokal stärker war. Einige Nachweise
für die
lokalen Peaks können
in der Fluoreszenzspur gesehen werden. Das WACLS-Signal beginnt
und endet zur richtigen Zeit und kehrt nicht während des Durchtritts der Nematode
durch den Laserstrahl auf die Grundlinie zurück. Es gab keine Ausnahmen
zu dieser Beobachtung bei der Analyse von über 500 Nematoden. In den oben
beschriebenen Beispielen der nutzlosen Auslösersignale kehrten fast die
Hälfte
der Signale unrichtig auf die Grundlinie zurück.
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Die 6B zeigt
auch die Spuren für
einen C. elegans mit einem sehr schwachen Fluoreszenzproteinausdruck.
Es ist ein geringes Niveau an Autofluoreszenz über die Länge des Organismus und zwei
lokale Bereiche schwachen Ausdrucks in der Nähe des Schwanzes vorhanden.
Das WACLS-Signal beginnt und endet zur richtigen Zeit und kehrt
nicht während
des Durchtritts der Nematode durch den Laserstrahl auf die Grundlinie
zurück.
Das Fluoreszenzsignal ist viel zu rauschbehaftet, um als Selbstauslöser- und
Zeitgebersignal zu dienen, jedoch ist das Einsetzen und das Ende
des WACLS-Signals
stark und eindeutig und könnte
verwendet werden, um eine Analyse der Fluoreszenzspur zur Stelle
der zwei schwachen Peaks zeitlich zu bestimmen und zu führen.
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Zusätzlich zu
den Äquivalenten
der beanspruchten Elemente sind offensichtliche Ersetzungen, die jetzt
und später
dem Fachmann bekannt sind oder werden, als innerhalb des Schutzbereichs
der definierten Elemente liegend definiert. Die Ansprüche sind
demnach so zu verstehen, dass sie das umfassen was spezifisch oben
dargestellt und beschrieben wurde, was vom Konzept her äquivalent
ist, was offensichtlich hierfür ersetzt
werden kann und auch was im Wesentlichen die Grundidee der Erfindung
verkörpert.
Die dargestellte Ausführungsform
wurde nur im Zuge eines Beispiels bereitgestellt und sollte nicht
als die Erfindung beschränkend
angesehen werden. Daher ist zu verstehen, dass die Erfindung anders
als spezifisch hier beschreiben innerhalb des Schutzbereichs der
beigefügten
Ansprüche
ausgeführt
werden kann.
