MXPA01006046A - Instrumento de analisis y clasificacion de patron axial para organismos multicelulares empleando un activador de dispersion de luz mejorado. - Google Patents

Abstract

Se describe un instrumento mejorado que consiste de un analizador optico y un selector de fluido que usa medios de dispersion de luz y de fluorescencia para identificar de forma optica y activar la seleccion fluida de organismos multicelulares de poblaciones vivientes de organismos tales como las varias etapas del ciclo de vida de Caenorhabditis elegans, las etapas larvarias de Drosofila melanogaster, y las etapas embrionarias de Danio rero. En el caso en donde la fluorescencia de estos organismos es muy debil, acompana a las senales electronicas ruido electronico de niveles comparativamente muy grandes que se generan por el detector de fluorescencia y sus circuitos asociados. Debido a que estas senales no pueden usarse para marcar la presencia de un organismo, debe usarse otra senal menos ruidosa para proporcionar una compuerta para la deteccion de fluorescencia. Una compuerta derivada de la senal de dispersion de luz de bajo nivel de ruido del organismo se recolecta sobre un angulo de aceptacion de al menos 20 grados. Dicha senal de dispersion de luz proporciona una compuerta no ambigua uniforme para senales de fluorescencia debil. Estas senales pueden correlacionarse con la posicion a lo largo del eje mayor de los organismos multicelulares alargados y usarse como analisis mejorado y parametros de seleccion.

Description

INSTRUMENTO DE ANÁLISIS Y CLASIFICACIÓN DE PATRÓN AXIAL PARA ORGANISMOS MULTICELULARES EMPLEANDO UN ACTIVADOR DE DISPERSIÓN DE LUZ MEJORADO ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN Campo de 1.a invención La presente solicitud de relaciona con instrumentos para analizar y separar objetos suspendidos en un fluido, tales instrumentos específicamente optimizados para analizar y separar organismos multicelulares alargados.

Descripción de la técnica relacionada La presente invención se refiere a mecanismos de alta velocidad para • identificar automáticamente y seleccionar físicamente organismos multicelulares con ciertas características fenotípicas espacialmente distintivas, que pueden detectarse de forma óptica, de poblaciones mezcladas. Ejemplos de organismos multicelulares son todas las etapas de la Caenorhabdi tis elegans, la larva Drosophila melanogaster (de la mosca de la fruta), o los embriones Danio rero (del pez cebra) . Éstos son útiles como organismos modelo para enfermedades humanas y estudios genómicos funcionales. Ejemplos de características ópticas, espacialmente distintivs son; las expresiones localizadas de moléculas de proteína fluorescente de ADN Ref: 130809 codificada, variaciones localizadas del índice de refracción o granularidad, o variaciones localizadas en sitios de enlaces específicos (receptores) para anticuerpos marcados de forma óptica, lectinas, u otros ligandos específicos. Los organismos multicelulares intactos, tales como C. Elegans, larva D. melanogaster, o embriones D. rero se usan frecuentemente como sistemas modelo para ayudar a entender la función de los genes humanos que han sido implicados en una enfermedad. Se han identificado homólogos del gene humano en estos organismos modelo y se han inducido mutaciones específicamente en aquellos genes homólogos. Tales mutaciones resultan frecuentemente en un cambio fenotípico fácilmente observable en el organismo modelo y se ha mostrado que ciertas mutaciones responden a compuestos farmacológicos y estas respuestas producen colateralmente cambios que se detectan de forma óptica en el organismo. Los mutantes de organismos intactos se usan ahora como una nueva clase de tamices de droga in vivo para bibliotecas de un compuesto farmacológicamente potencial producido mediante el uso de métodos de química combinatoria. Con estos organismos, se pueden identificar objetivos para la intervención de drogas sin la necesidad de entender completamente las trayectorias bioquímicas complejas que relacionan al genoma con el fenotipo. Esto permite tamices económicos y rápidos de las bibliotecas del compuesto para drogas humanas nuevas y útiles mientras que limitan las pruebas de controversia política en mamíferos. La exposición de mutantes de organismos modelo a diversas bibliotecas de compuestos de droga, aun cuando las mutaciones específicas involucradas no se han enlazado todavía a homólogos del gene humano ayuda también a definir la función del gene. La adición de tales técnicas genómicas funcionales al repertorio de la biología molecular y los métodos bioquímicos pueden acelerar enormemente el proceso para el descubrimiento de drogas. Los investigadores pueden anotar bibliotecas de droga para la toxicidad, la actividad no específica, o la permeabilidad de la membrana celular observando su comportamiento en organismos intactos. De esta manera, se pueden descartar bibliotecas y/o miembros de bibliotecas tóxicos o no efectivos en una etapa temprana sin gastar recursos valiosos. Mientras que los organismos modelos tales como el nematodo C. Elegans, la mosca de fruta D. melanogaster, y el pez cebra D. rero, han probado ser útiles en el estudio de la enfermedad humana, todavía no se han usados con éxito en el campo del descubrimiento de drogas de alta velocidad y alta capacidad. Hasta ahora las preparaciones y técnicas de análisis de alta velocidad han estado ausentes para estos organismos grandes. Esto presenta un obstáculo a investigadores que necesitan buscar a través de miles de organismos multicelulares una nueva mutación o la respuesta a una muestra de droga determinada. Por ejemplo, con las técnicas de biología molecular actual, un gran laboratorio puede producir mutaciones de supresión en un organismo multicelular de prueba a razón de 20 a 30 por mes. Por tanto con el objeto de evaluar el efecto de una biblioteca de un compuesto químico (que frecuentemente contiene 100,000 compuestos discretos) en una clase de organismos mutados, en primer lugar se puede manipular y depositar un número preciso de organismos de la especie mutante y de la misma etapa de desarrollo en varios recipientes tales como pozos de un arreglo de placas de microtitulación. Deben eliminarse los tipos silvestres o desviaciones de la especie mutante deseada, u organismos en diferentes etapas de desarrollo. Usando métodos manuales lentos, la clasificación y depósito de organismos de tipo apropiado es un cuello de botella en tiempo para el proceso completo de descubrimiento de drogas. Además, los métodos manuales dependen de pipetas que surten volúmenes precisos de fluido pero no un número preciso de organismos. En muchos estudios en donde la velocidad de reproducción se altera por la mutación, es necesario comenzar el estudio del efecto de un compuesto a partir de la biblioteca combinatoria con un número exacto y conocido de organismos multicelulares en cada pozo. Esto es, en el mejor de los casos, un requerimiento desalentador. Además de la necesidad de métodos de preparación rápidos existe una necesidad por métodos de análisis rápidos. Por ejemplo, si una especie mutante o sistema de expresión puede caracterizarse por fluorescencia o coloración del patrón espacial, entonces el efecto de los compuestos terapéuticos o ambientes tóxicos en estas especies podría determinarse por cambios en estos patrones. Por ejemplo, la proteína fluorescente verde (GFP) se usa como un gene de reporte para indicar que se ha expresado un gene insertado. La expresión de la proteína fluorescente normalmente ocurre en un patrón espacial específico dentro de un organismo multicelular. La discriminación de un patrón de otro normalmente se lleva a cabo en forma manual con el microscopio fluorescente. Esta es una tarea extremadamente tediosa que requiere un número significativo de trabajadores que estén entrenados en niveles académicos muy altos. La solicitud de Patente Norteamericana colateral pendiente No. de Serie 09/378,634, presentada el 20 de agosto de 1999 describe un sistema de instrumentación para el análisis y clasificación rápidos de organismos multicelulares usando características ópticas tales como dispersión y fluorescencia de luz para clasificar cada organismo en una corriente de flujo. Un valor sencillo de intensidad de fluorescencia a una longitud de onda dada se detecta y se asigna a cada organismo. La presente invención es una mejora que permite que un analizador y selector de flujo localice y reporte no solamente la intensidad sino también la posición de fluorescencia a lo largo del eje mayor (largo) del organismo y use esta nueva información espacial para clasificar los organismos. Si una especie mutante o un organismo transgénico se caracteriza por un patrón espacial o fluorescencia estable, una coloración u otras características que se detectan de forma óptica, entonces los efectos de compuestos terapéuticos o ambientes tóxicos pueden determinarse potencialmente monitoreando cambios en estos patrones espaciales. La discriminación de un patrón de otro normalmente se lleva a cabo manualmente con el microscopio fluorescente. Esta es una tarea extremadamente tediosa que requiere un número significativo de trabajadores que estén entrenados en niveles académicos muy altos. La automatización de la detección de patrones espaciales de fluorescencia mejorará la objetividad y la velocidad de medición.

Anteriormente se han usado instrumentos de flujo para contar el número de nematodos en un volumen fluido. Tal dispositivo lo describió Byerly y colaboradores (L. Byerly, R. C. Cassada, y R. L. Russel, "Machine for Rapidly Counting and Measuring the Size of Small Nematodes (Máquina para Rápidamente Contar y Medir el tamaño de Nematodos Pequeños)"', Rev. Sci . Instrum. Vol. 46, No. 5, Mayo 1975) en donde el citómetro de flujo empleó flujo cubierto para orientar los nematodos a lo largo de la dirección de flujo de tal manera que pudo medirse su tamaño y pudo contarse organismo por organismo mediante un método de impedancia eléctrica. El dispositivo era similar a un contador Coulter comercial. La presente invención difiere del dispositivo de Byerly porque puede proveer un dispositivo que selecciona y deposita (clasifica) organismos específicos. También la presente invención no se limita al uso de un detector de impedancia, el cual únicamente puede estimar el tamaño total, sino en su lugar usa la detección óptica para resolver de forma óptica características localizadas a lo largo del eje mayor del organismo y usar esto para analizar y clasificar. Se ha descrito un instrumento óptico de flujo para el análisis de organismos alargados tal como plancton con anchuras de 500 µm y longitudes de más de 1000 µm con flujo cubierto para lograr la orientación del plancton (J. C.

Peeters, G. B. Dubelaar, J. Ringelberg, y J. W. Visser, "Optical Plankton Anlyser: a Flow Cytometer for Plankton Analysis, I: Design Considerations (Analizador Óptico de Plancton: un Citómetro de Flujo para Análisis de Plancton, I: Consideraciones de Diseño)" Cytometry 1989 Sept. 10 (5) : 522-528; y G. B. Dubelaar, A. C. Groenwegen, W. Stokdijk, G. J. Van den Engh, y J. M. Visser, "Optical Plankton Analyser: a Flow Cytometer for Plankton Analysis, II: Specifications (Analizador Óptico de Plancton: un Citómetro de Flujo para Análisis de Plancton, II: Especificaciones)" Cytometry 1989 Sept. 10 (5): 529-539. El intervalo de tamaño del plancton usado en estos citómetros ópticos de flujo es similar al que se encuentra en nematodos C. elegans, larva de mosca de fruta, y embriones de pez cebra; sin embargo no hay condición que evite la ambigüedad de señales de dispersión de luz que se eliminan por medio de la presente invención.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN La presente invención utiliza una corriente de flujo de fluido para orientar organismos multicelulares alargados y un rayo óptico estacionario enfocado de forma estrecha para hacer un barrido sobre ellos a lo largo de su eje mayor cuando éstos fluyen. Las características tales como densidad de célula, refractabilidad, granularidad, y fluorescencia se pueden detectar y registrar como función de la posición a lo largo de la longitud del organismo orientado (es decir, un barrido de patrón axial) . La invención es una mejora en velocidad y precisión estadística sobre las actuales técnicas manuales para el análisis uno por uno de organismos multicelulares bajo el microscopio. La información del barrido puede usarse para caracterizar la expresión del gene y permitir la selección y deposición física de fenotipos con características deseadas, o puede usarse para determinar alteraciones en la expresión del gene ocasionada por prueba de compuestos tóxicos o terapéuticos como se le encuentra en bibliotecas de química combinatoria. En el caso en donde la fluorescencia para estos organismos sea muy débil, comparativamente acompañan a las señales electrónicas niveles muy altos de ruido electrónico que se generan por el detector de fluorescencia y sus circuitos asociados. Estas señales débiles no pueden usarse para marcar la presencia de un organismo, y debe usarse otra señal menos ruidosa para la detección de fluorescencia de compuerta. La pérdida axial de luz podría usarse como dicha compuerta. Otra compuerta preferida se puede derivar de la señal de dispersión de luz de bajo nivel de ruido del organismo. Sin embargo, la compuerta de la dispersión de luz, tal como se practica en la citometría de flujo de celdas sencillas, crea señales ambiguas cuando se usan en organismos multicelulares y por lo tanto dan lugar a una compuerta falsa para la fluorescencia. Se describe aquí un medio de detección de dispersión de luz que proporciona una compuerta de manera no ambigua para estas señales de fluorescencia. Estas señales pueden correlacionarse con la posición a lo largo del eje mayor de los organismos multicelulares alargados y usarse como parámetros de análisis y selección mejorados. Los citómetros ópticos de flujo tradicionales analizan y seleccionan partículas pequeñas y células sencillas en suspensión líquida mediante la detección de dispersión de luz en (sobre) ángulos de cono estrecho o sólidos a varios ángulos con respecto al rayo óptico incidente y la emisión de fluorescencia a varias longitudes de onda. La información acerca del tamaño y estructura de células puede derivarse de la dispersión de luz recolectada en diferentes ángulos. Por ejemplo, la información acerca del tamaño puede derivarse de la dispersión de luz derivada en ángulos menores en relación con el rayo óptico incidente mientras que la información acerca de la granularidad celular interna puede derivarse de la dispersión de luz detectada en un ángulo amplio (cercano a un ángulo recto) en relación con el rayo óptico. Adicionalmente, el arte anterior muestra que el tamaño de las estructuras granulares a ser detectadas determina el ángulo y el cono de aceptación para la detección óptima de ángulo amplio. Las señales de dispersión de luz recolectadas a ángulos específicos y sobre ángulos de cono estrecho se usan también para la compuerta de detectores de fluorescencia débil de células sencillas. Las señales de fluorescencia débil no pueden usarse efectivamente para marcar la presencia de una célula en el rayo óptico debido a que a estas señales las acompañan altos niveles de ruido electrónico. Los impulsos de ruido de gran amplitud exceden el nivel del umbral para la detección de fluorescencia y producen lecturas falsas que se confunden como células de fluorescencia débil. Para evitar esto, los citómetros de flujo generalmente usan señales de uno o más detectores situados para detectar dispersión de luz en uno o más ángulos en relación con el rayo para producir señales de luz relativamente libres de ruido que pueden discriminarse efectivamente contra la fluorescencia falsa del ruido electrónico, y proporciona una compuerta a la fluorescencia verdadera de las células (se llama la atención del lector hacia la Patente Norteamericana 4,284,412) . Es clave para el uso de estos detectores de dispersión de luz como compuertas de fluorescencia que su • ángulo sólido de detección sea estrecho. Por ejemplo, los llamados detectores de "dispersión de avance de ángulo pequeño" (LAFS) frecuentemente se colocan tan cerca como 0.5 grados con respecto al eje óptico y recuperan luz únicamente en un cono de un grado. Los detectores de dispersión de luz de ángulo amplio frecuentemente se colocan en posiciones en el intervalo de aproximadamente 10 grados a 90 grados fuera del eje y también recolectan luz dentro de conos de ángulos pequeños de menos de cinco grados. Si el ángulo del cono de recolección no se mantiene tan pequeño como sea posible, entonces la información acerca de la granularidad y el tamaño puede empalmarse. Bajo estas condiciones por ejemplo, puede hacerse que las células no se distingan de las células pequeñas y que las células granulares no se distingan de las células no granulares del mismo tamaño. Cuando se usan detectores de dispersión de luz de cono de aceptación estrecha (NACLS) para monitorear el paso de organismos multicelulares tales como C. Elegans, surgen tres problemas que no ocurren con células sencillas tales como las células de sangre. En primer lugar, se encontró que la señal de dispersión de luz no necesariamente se eleva por arriba de la línea base (cero) al inicio del paso de los organismos a través del rayo óptico, sino que en su lugar se eleva a un tiempo posterior impredecible. En segundo lugar, se encontró que la señal de dispersión de luz no necesariamente regresa a la línea base (cero) al final del paso del organismo a través del rayo óptico, sino que en su lugar regresa en un tiempo temprano impredecible. En tercer lugar, también se encontró que la señal de dispersión de luz frecuentemente regresa a la línea base (cero) en uno o más tiempos impredecibles mientras el organismo está en el rayo. Por lo tanto, el esfuerzo más básico para clasificar por tamaño los organismos celulares con base en su "tiempo de vuelo" a través del rayo de luz de análisis es frustrado por este comportamiento impredecible de las señales de dispersión de luz que se recolectan en ángulos cónicos estrechos. Además, las señales de dispersión de luz de ángulo cónico estrecho que se inician tarde no son útiles para proporcionar una compuerta a señales de fluorescencia débil. Finalmente, las señales de dispersión de luz de ángulo cónico estrecho que regresan a la línea base tempranamente no pueden usarse para denotar la posición de la fluorescencia débil a lo largo del eje del organismo. Las señales que regresan a la línea de base tempranamente pueden confundirse también con el paso de dos o más organismos separados cuando en realidad solamente uno pasó a través del rayo de análisis.

La presente invención no emplea los métodos usuales de detección de dispersión de luz de célula sencilla, y en su lugar usa la recolección de dispersión de luz sobre ángulos cónicos muy amplios cuando analiza y selecciona organismos multicelulares. Un aspecto de la invención es recolectar luz dispersa en un ángulo sólido amplio tal como uno de al menos 0.01 p radianes (ángulo de aceptación de 20°). Esto proporciona una señal de dispersión de luz que se hace positiva con precisión en el momento en que el organismo entra al rayo, permanece en forma no ambigua por arriba de la línea base mientras el organismo está en el rayo, y regresa a la línea base con precisión en el momento en que el organismo sale del rayo. Este aspecto de la invención permite otro aspecto de la invención, el cual es usar señales de dispersión de luz precisa, no ambigua en tales ángulos cónicos amplios para marcar la posición lineal de señales de fluorescencia débiles y ruidosas a lo largo del eje del organismo. La anchura del ángulo cónico que se necesita depende del tipo de organismo. La presente invención usa la señal de dispersión de luz no ambigua de un ángulo de aceptación amplio, un detector de dispersión de luz (WACLS) como compuerta y un método de medición del tiempo para el análisis de fluorescencia a lo largo del eje del organismo. La localización de la fluorescencia a lo largo del eje del organismo es un parámetro importante para el análisis y selección. Por ejemplo, con el C. Elegans, es importante en muchas aplicaciones de clonación separar los machos de los hermafroditas. Esto puede lograrse con una lectina marcada en forma fluorescente (aglutinina de germen de trigo) que se une a la vulva del hermafrodita y con la bolsa copulatoria del macho. Estas dos estructuras no son fácilmente distinguibles en brillantez, pero la vulva se localiza cerca del punto medio del organismo y la bolsa copulatoria se localiza en la cola. Por lo tanto, la localización axial de la fluorescencia viene a ser el parámetro para analizar y clasificar diferencialmente machos y hermafroditas. Esto se ilustra esquemáticamente en la Figura 3 en donde se muestran dos trazos de osciloscopio para organismos sencillos. Un trazo (Figura 3A) tiene un pico fluorescente cerca del punto medio, y el otro (Figura 3B) tiene un pico fluorescente en la cola. Dado que no existe señal fluorescente para marcar el principio - del organismo en los trazos de osciloscopio de la Figura 3, debe establecerse un medio para marcar el principio y el fin del paso del organismo a través del rayo de luz. Esto se efectúa mediante el uso de la señal de dispersión de luz de cono de aceptación amplio (WACLS) . El inicio de esta señal activa un reloj en el . procesador electrónico que, a su vez ocasiona que los datos sean muestreados a intervalos regulares de tiempo mientras que la señal de dispersión de luz de cono de aceptación amplio permanece por arriba de un nivel de umbral prefijado. El muestreo se detiene cuando la señal WACLS cae por abajo del umbral, denotando la parte final del organismo. La siguiente es una representación paramétrica de un organismo multicelular que puede emplearse por medio del uso de una señal WACLS para proporcionar una compuerta al muestreo de fluorescencia a lo largo del eje del organismo. Considérese un detector WACLS que produce una señal SI y un mecanismo de medición de tiempo que muestrea señales de todos los otros detectores cada T microsegundos. Supóngase que existen otros detectores de dispersión de luz o de absorción situados en varias posiciones angulares con respecto al rayo de análisis. Denótense a las señales de estos detectores por S2, S3, ..., Sn. Supóngase adicionalmente que existen detectores de fluorescencia sensibles a varias longitudes de onda de emisión que producen señales Fl, F2, F3, ..., Fn. La siguiente matriz tiene columnas de datos para cada detector e hileras de datos para cada intervalo de muestreo.

SI S2 S3 Sn Fl F2 F3 Fn Tl 0 0 0 0 0 0 0 0 T2 al 0 cl 0 e2 0 0 0 T3 a2 b2 c2 d3 0 f3 g3 0 T4 a3 0 c3 d4 0 f4 0 0 T5 a4 b4 0 0 0 f5 0 0 Tn-1 an-1 0 0 0 0 0 gn-1 0 Tn 0 0 0 0 0 0 0 0 La matriz del ejemplo anterior muestra una señal WACLS SI con entradas que no son cero de intervalos de tiempo T2 a Tn-1. Esta es la señal de toma de tiempo independiente de todos los demás canales detectores. Los otros detectores de dispersión de luz S2 a Sn no son necesariamente detectores WACLS, y por lo tanto tienen valores cero durante el tiempo T2 a Tn-1. La característica de fluorescencia con longitud de onda de emisión Fl es pequeña y se localiza entre el intervalo T2. Esto representa una característica que puede usarse para marcar la "cola" del organismo (véase la Figura 1) . La característica de fluorescencia con longitudes de onda de emisión F2 no es tan pequeña (a lo largo de la dirección axial) y tiene lugar a localizaciones diferentes que la característica Fl. La localización relativa de la característica se establece con referencia en la toma de tiempo iniciada por la señal SI del detector WACLS. Si la velocidad del organismo es conocida y se usa el marcador de "cola", entonces también puede determinarse la localización absoluta de esta característica. La característica de fluorescencia con longitud de onda de emisión F3 se muestra en dos localizaciones pequeñas indicadas en las secuencia de toma de tiempo de WACLS como T3 y Tn-1. Cada organismo barrido se puede representar por una matriz paramétrica (representación de datos) de este tipo. Aunque que no contiene tanta información como una imagen de microscopio del organismo, los tiempos de adquisición de datos para tales matrices son del orden de cinco microsegundos a 250 microsegundos, dependiendo de la longitud del organismo. Esta alta velocidad se logra porque fotomultiplicadores simples y rápidos recolectan la dispersión de luz y no se forma ninguna imagen. En imágenes de citómetros usualmente se almacenan en cámaras CCD, las cuales inherentemente son menos sensibles que los fotomultiplicadores, y por lo tanto requieren más tiempo para recolectar suficientes fotones para formar una imagen. Los tiempos de formación de imagen para el análisis de fluorescencia de organismos tales como C. el egans son del orden de 50 milisegundos, los cuales son de 200 a 10,000 veces más lento que el tiempo requerido para recolectar y almacenar los datos paramétricos descritos anteriormente. El tiempo de muestreo y la velocidad del organismo determina la resolución espacial del método paramétrico. Por ejemplo, cuando el organismo típicamente viaja a unos 500 cm/segundo a través del rayo de análisis, entonces para un tiempo de muestreo de cinco microsegundos la resolución espacial es aproximadamente de 25 µm. La presente invención usa una señal WACLS para desviar o proporcionar una compuerta de salida de detectores de fluorescencia u otros detectores ópticos de tal forma que puede construirse una representación de datos de características a lo largo de la longitud de un organismo analizado. Un procesador o controlador analiza esta representación para seleccionar organismos que satisfagan características predeterminadas. El controlador opera un selector de fluido que controla una corriente separada para desviar la primera corriente de fluido que contiene los organismos que se desecharán. Cuando el controlador determina la presencia de un organismo que cumple con las características de selección, el selector de fluido se opera para cortar la corriente de fluido separada de tal forma que se deja pasar al organismo dentro del recipiente de muestra.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS La Figura 1 muestra una representación en forma de diagrama de la óptica, célula de flujo, electrónica de control, y selector de fluido. La Figura 2 muestra una representación en forma de diargrama de los rayos ópticos del instrumentos de la Figura 1. Las Figuras 3A y 3B muestran diagramas que se relacionan con señales de fluorescencia (con compuerta de uno de los métodos de la invención) relacionados con C. elegans hermafroditas (Figura 3A) y machos (Figura 3B) medidos por el instrumento de la presente invención. La Figura 4A muestra trazos reales del osciloscopio de un detector de dispersión de luz delantero de NACLS (trazo inferior) colocado a un ángulo de 45 grados en relación con el eje óptico y un detector de fluorescencia (trazo superior) colocado a ángulos rectos (noventa grados) en relación con el eje óptico. La Figura 4B muestra trazos reales del osciloscopio de un detector de dispersión de luz delantero de NACLS (trazo inferior) colocado a un ángulo de 45 grados en relación con el eje óptico y un detector de fluorescencia (trazo superior) colocado a ángulos rectos (noventa grados) en relación con el eje óptico.

La Figura 5 muestra trazos reales del osciloscopio de un detector de extinción (trazo inferior) colocado en el eje óptico y un detector de fluorescencia en ángulos rectos con respecto al eje óptico (trazo superior) . La Figura 6A muestra trazos reales del osciloscopio de un detector de dispersión de luz delantero de WACLS (trazo inferior) y un detector de fluorescencia en ángulos rectos con respecto al eje óptico (trazo superior); las muestras de C. elega ns barridas mostraron varios puntos discretos de fluorescencia. La Figura 6B muestra trazos reales del osciloscopio de un detector de dispersión de luz delantero de WACLS (trazo inferior) y un detector de fluorescencia en ángulos rectos con respecto al eje óptico (trazo superior) ; los especímenes C. elegans barridos mostraron una pequeña fluorescencia adicional en un extremo.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN La siguiente descripción se proporciona para permitir que cualquier persona experta en el arte realice y use la invención y establezca las mejores modalidades contempladas por el inventor para llevar a cabo su invención. Sin embargo, los expertos en el arte podrán apreciar con facilidad varias modificaciones, dado que los principios generales de la presente invención se han definido aquí específicamente para proporcionar dispositivos de • compuerta óptica y métodos para usarse con un analizador/clasificador óptico diseñado para organismos multicelulares alargados.

Sistema eacperimental de barrido del flujo Se construyó un instrumento tal como el que se muestra esquemáticamente en la Figura 1 con un par de fuentes láser (ion de argón y helio-neón) intercambiables como la fuente de luz. La detección se llevó a cabo de forma variable con fotodetectores y fotomultiplicadores de silicio. La celda de flujo fue rectangular con una capilaridad de sección transversal cuadrada midiendo 250 µm en un lado para usarse con C. elegans. El capilar de la celda de flujo fue de 1000 µm en un lado para acomodar en primer lugar a través de un tercer estado larvario, larva D. melanogaster. Se usa flujo cubierto para orientar estos organismos alargados cuando emergen de la boquilla de muestra y entran al capilar de la celda de flujo. Esta celda de flujo capilar se localiza en la línea del foco del rayo láser. La Figura 2 muestra en forma de diagrama la relación geométrica del flujo de varios rayos ópticos. La luz fluorescente se recolecta mediante un lente asférico simple u objetivos de microscopio y pasa a través de filtros de emisión a los fotomultiplicadores. En virtud del rayo láser enfocado y del lente de recolección, el organismo que fluye es barrido ópticamente al pasar a través del foco.

NACLS Simultáneo y fluorescencia del C. elegans Se colocó un detector de dispersión de luz en varias posiciones angulares con respecto al eje óptico en la dirección de dispersión delantera. El ángulo del cono de recolección fue de aproximadamente seis grados (NACLS) . Se usaron un fotomultiplicador con un lente de recolección de 20X y un filtro barrera optimizado para fluorescencia de la GFP en el detector de fluorescencia. El C. elegans que se usó para esta ilustración expresó GFP en dos localizaciones en la "cabeza" y en ninguna otra parte. Los trazos del osciloscopio para la dispersión de luz y la fluorescencia se muestran en las Figuras 4A y 4B. Los trazos muestran el paso del organismo a través de la línea de foco del rayo láser. El trazo inferior 1 es la señal de dispersión de luz y el trazo superior 2 es la señal de fluorescencia. El eje x es el tiempo. La Figura 4A es típica de una clase de trazo de dispersión de luz observada con un de detector NACLS. El detector se colocó a 45 grados delante del ángulo de dispersión de luz directamente debajo del eje de rayo láser (debajo del plano horizontal en la Figura 2) tal como emerge de la celda de flujo. Ninguna luz ' dispersa proveniente de las estructuras de celda de flujo fue por sí misma incidente en el detector. Las señales de NACLS parecen emerger en un tiempo apropiado. El comienzo del trazo de NACLS y el trazo de la débil autofluorescencia de las estructuras anteriores del nematodo coinciden. La señal de NACLS parece regresar a la línea base después de que pasa la cabeza fluorescente. Desafortunadamente, el trazo regresa también a la línea base durante la mitad del paso del nematodo. Esto podría dar la falsa impresión de que dos organismos han pasado en lugar de uno. Esta señal de NACLS demuestra la necesidad por un nuevo impulsor no ambiguo y señal de toma de tiempo. La Figura 4B ilustra otro problema asociado con la colocación inapropiada de un detector de dispersión de luz para la generación de pulsos. En este ejemplo, el mismo detector se colocó en el plano horizontal de la Figura 2, pero a un ángulo de 45 grados en la dirección hacia adelante. En este caso, luz dispersa, desviada del capilar incidió en el detector. Se usó un circuito de restauración de la línea base para nivelar en cero este nivel de luz. El trazo de NACLS muestra un falso retorno a la línea base que es ocasionado por el ángulo del cono de aceptación que es muy pequeño, y además un lugar en donde la señal se hace negativa. La región que se hace negativa es ocasionada cuando luz desviada de la celda de flujo es bloqueada por el nematodo en un grado en el que existe más bloqueo de luz que dispersión de luz. Esta señal no podría usarse como generador de pulso o señal de toma de tiempo por dos razones. La primera es que el cono de aceptación del detector fue muy pequeño y la segunda fue que la luz desviada sobre el detector se bloqueó por el paso del nematodo.

Problemas asociados con las señales de extinción óptica como señales de pulso y activación de tiempo La Figura 5 ilustra otro problema asociado con la colocación inapropiada de un detector de dispersión de luz para la activación. En este caso se colocó un detector directamente sobre el eje y en el rayo láser. El objetivo fue medir el bloqueo de luz (extinción) por los organismos. La extinción de luz es una alternativa posible a la WACLS de activación de la presente invención. El C. elegans de prueba tuvo una región débil sencilla de fluorescencia en una localización neuronal en la cabeza localizada ligeramente posterior a la punta de la "nariz". Se usó un objetivo de 40X para recolectar más luz dado que el organismo era de fluorescencia muy débil. El detector de extinción recolectó luz en un cono de dos grados. En este caso el trazo de extinción regresa a la línea base durante el paso del nematodo, y se hace aún ligeramente negativo. Por lo tanto, esta señal no podría usarse como activadora o señal de toma de tiempo..

WACLS y fluorescencia simultáneas del C. elegans Se colocó un fotodetector en el eje óptico con un ángulo de cono de recolección de aproximadamente 30 grados (unos 0.004p estereorradianes) (WACLS). Se colocó una máscara sobre la parte frontal central del detector para bloquear cualquier luz transmitida directamente o luz dispersa desviada de capilar de la celda de flujo. De esta manera, el detector recolectó dispersión de luz de los organismos sobre un ángulo de cono varias veces más amplio que en los ejemplos anteriores. Se usó el fotomultiplicador con un lente de recolección de 40X y un filtro barrera para proteína de fluorescencia verde para detectar fluorescencia dado que la señal de fluorescencia fue muy débil . La Figura 6A muestra una señal de WACLS en el trazo inferior y la señal de fluorescencia asociada en el trazo superior. Nótese que la señal de WACLS comienza y termina en el tiempo apropiado y no regresa a la línea base durante el paso del nematodo. Esta fue una observación consistente y sistemática en tanto que el ángulo de aceptación fue suficientemente amplio y la luz del rayo de iluminación o del detector de dispersión no recolectó luz desviada. El C. elegans particular usado para este ejemplo expresó fluorescencia a lo largo de toda su longitud con 5 a 6 puntos a lo largo del eje en donde la expresión fue localmente mayor. Puede observarse cierta evidencia para estos picos locales en el trazo de fluorescencia. La señal de WACLS comienza y termina en el tiempo apropiado y no regresa a la línea base durante el paso del nematodo a través del rayo láser. No hubieron excepciones a esta observación cuando se analizaron más de 500 nematodos. En los ejemplos de señales de activación inútiles descritos anteriormente cerca de la mitad de las señales regresaron de manera inapropiada a la línea base. La Figura 6B muestra también los trazos para un C. elegans con una expresión de proteína fluorescente muy débil. Existe un nivel bajo de autofluorescencia a través de la longitud del organismo y dos regiones locales de expresión débil cerca de la cola. La señal WACLS comienza y termina en el tiempo apropiado y non regresa a la línea base durante el paso del nematodo a través del rayo láser. La señal de fluorescencia es demasiado ruidosa para servir como señal de activación y de toma de tiempo, sin embargo el principio y el fin de la señal WACLS es fuerte y no ambigua, y podría usarse para sincronizar y guiar un análisis del trazo de fluorescencia a la localización de los dos picos débiles.

Además de los equivalentes de los elementos reclamados, las substituciones obvias conocidas por los expertos en el arte se definen como parte del alcance de los elementos definidos. Por lo tanto se entenderá que las reivindicaciones incluyen lo que específicamente se ilustra y describe arriba, lo que es conceptualmente equivalente, lo que obviamente puede substituirse y también lo que incorpora esencialmente la idea de la invención. Se han establecido las modalidades ilustradas solamente para el propósito de ejemplo y no deberán tomarse como limitaciones de la invención. Por lo tanto, deberá entenderse que, dentro del alcance de las reivindicaciones anexas, la invención puede practicarse de forma diferente a la que específicamente se describe aquí. Se hace constar que con relación a esta fecha, el mejor método conocido por la solicitante para llevar a la práctica la citada invención, es el que resulta claro de la presente descripción de la invención.

Claims (1)

1. REIVINDICACIONES Habiéndose descrito la invención como antecede, se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes reivindicaciones: 1. Un instrumento para analizar y surtir selectivamente objetos del tipo en donde los objetos son organismos multicelulares alargados de una fuente que contiene organismos multicelulares en una suspensión fluida, en donde dichos organismos multicelulares se hacen fluir a través de un rayo óptico después de haber sido orientados en relación a la dirección de flujo, el instrumento caracterizado porque el paso de dichos organismos a través de rayo óptico se detecta por un primer detector el cual detecta la luz dispersada por los organismos multicelulares en un ángulo sólido de al menos 0.01 p estereorradianes, se disponen a lo largo de una longitud del organismo multicelular detectores ópticos adicionales para la detección secuencial de características ópticas, medios para la creación de una representación de datos de las características ópticas secuenciales, medios para el análisis de la representación de datos y un selector de fluido corriente abajo de un punto en donde dichos organismos pasan a través de dicho rayo óptico, dicho selector adaptado para responder a los medios de análisis para permitir que un organismo detectado pase a un recipiente de muestra. 2. El instrumento de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque dichos detectores adicionales están configurados para ser cambiados por una salida del primer detector óptico de tal forma para producir salidas solamente cuando el primer detector óptico detecta el paso de uno de los organismos multicelulares a través del rayo óptico. 3. El instrumento de conformidad con la reivindicación 2, caracterizado porque el medio para la creación está adaptado para operar en las salidas cambiadas de los detectores adicionales. 4. El instrumento de conformidad con la reivindicación l, caracterizado porque adicionalmente comprende un controlador conectado al selector de fluido de forma operativa para causar que dicho selector seleccione organismos multicelulares que tienen representaciones de datos que cumplen con criterios predeterminados. 5. Un método para surtir selectivamente organismos multicelulares alargados del tipo que incluye los pasos de centrar y orientar dichos organismos en una corriente de flujo de fluido que pasa a través de una zona de detección óptica caracterizado por la detección de la presencia de un organismo multicelular en la zona de detección por medio de un detector de dispersión de luz que tiene un ángulo de aceptación sólido de al menos 0.001 p estereorradianes, mediante el cambio de señales de salida de detectores ópticos adicionales con una salida del detector de dispersión de luz, creando una representación de datos de características ópticas secuenciales del organismo multicelular que pasa a través de la zona de detección, analizando la representación de datos para seleccionar un organismo detectado, y controlando un cambio de fluido de tal forma que se permite que el organismo seleccionado pase dentro de un recipiente de muestra. 6. El método de conformidad con la reivindicación 5, caracterizado porque se permite que el organismo detectado pase dentro de un químico de prueba o ambiente de prueba. 7. El método de conformidad con la reivindicación 5, caracterizado porque adicionalmente comprende los pasos de exponer los organismos multicelulares a un químico de prueba o a un ambiente de prueba antes de pasar a través de la zona de detección óptica para determinar si la representación de datos se altera por el químico de prueba o el ambiente de prueba. 8. Una estructura de datos representativa de un organismo multicelular alargado que contiene indicios de características ópticas secuenciales dispuestas a lo largo de una longitud de dicho organismo, dicha estructura de datos caracterizada porque comprende salidas secuenciales almacenadas que se derivan de detectores ópticos dispuestos para recibir energía óptica que emana de un organismo multicelular alargado cuando dicho organismo pasa a través de un rayo óptico en donde una señal de un detector de dispersión de luz que detecta luz en un ángulo sólido de al menos 0.01 p estereorradianes es usado par crear la estructura de datos.