JP5778354B2 - 細胞観察装置、電気刺激装置、及び細胞観察方法 - Google Patents

Description

本発明は、細胞を含む試料を対象に電気刺激に伴う反応を観察するための細胞観察装置、電気刺激装置、及び細胞観察方法に関する。

創薬分野では、細胞などの試料に投与した薬品の影響を、細胞から放出された光を測定して評価する場合がある。特許文献１には、細胞が配置される複数のウェルが配列されたマルチウェルプレートを対象にウェル内の観察領域に電界を発生させるための電極アレイを備えた測定装置が開示されている。この電極アレイは、２枚の平行平板電極である陰極及び陽極からなる。また、特許文献２には、細胞の電場刺激に応じた生物学的応答を蛍光検出によってモニターする測定装置が開示され、この測定装置には正極及び負極からなる同軸ケーブルの形状の電極対を、細胞が配置されたウェルに配置可能な構成が採用されている。

特表２００７−５３４９２７号公報 特表２００５−５１４９０９号公報

ここで、上記特許文献１に記載の測定装置では、測定時には電極アレイをウェルの底との間に隙間を設けるように配置されている。また、上記特許文献２に記載の測定装置においては、測定時に電極対を細胞から離して配置して使用することが好ましいとされている。

しかしながら、電極をウェル内の細胞から離して配置させる場合には、安定した観察結果を得るためには電極とウェル内の細胞との距離を安定化させる必要があるが、そのための制御機構が複雑化する傾向にある。これは、電極と細胞との距離が変わってしまうと細胞に印加される電界が大きく変化してしまうためである。

そこで、本発明は、かかる課題に鑑みて為されたものであり、簡易な構成で複数配列された保持部内の細胞に印加される電界の安定化を図ることが可能な細胞観察装置、電気刺激装置、及び細胞観察方法を提供することを目的とする。

本願の発明者らは、細胞を含む試料を保持する保持部が複数配列された試料ケースによって保持された細胞に、陽極と陰極とを含む電極対によって電界を印加してそれに対する細胞の反応を観察する際には、陽極と細胞との間の距離が微小に変わるだけで観察される反応が大きく変化してしまうことを見出し、本願発明の後述する構成を発案するに至った。

すなわち、上記課題を解決するため、本発明の一側面に係る細胞観察装置は、細胞を含む試料を保持する保持部が複数配列された試料ケースによって保持された細胞を観察する細胞観察装置であって、試料ケースを載置するための載置部と、陽極と陰極とを含む電極対が複数配列された電気刺激部と、試料ケースの保持部内に電極対が配置されるように、電気刺激部の位置を制御する位置制御部とを備え、陰極の保持部側の先端は、陽極の保持部側の先端よりも伸びている。

或いは、本発明の他の側面に係る電気刺激装置は、細胞を含む試料を保持する保持部が複数配列された試料ケースに挿入されて、細胞に電圧を印加する電気刺激装置であって、陽極と陰極とを含む電極対が複数配列されており、陰極の先端は、陽極の先端よりも伸びている。

或いは、本発明の他の側面に係る細胞観察方法は、細胞を含む試料を保持する保持部が複数配列された試料ケースによって保持された細胞を観察する細胞観察方法であって、試料ケースを載置部に載置する載置ステップと、陽極と陰極とを含む電極対が複数配列された電気刺激部に対して、試料ケースの保持部内に電極対が配置されるように、位置を制御する位置制御ステップとを備え、陰極の保持部側の先端は、陽極の保持部側の先端よりも伸びている。

このような細胞観察装置、電気刺激装置、及び細胞観察方法によれば、試料ケースに複数配列された保持部内に陽極と陰極とを含む電極対が配置されることにより、この電極対により細胞を含む試料に電界が印加可能にされる。ここで、電極対を構成する陽極及び陰極は、陰極の先端が陽極の先端よりも伸びているので、陰極の先端が保持部の底部の試料に接触するように電極対を保持部内に挿入することにより、陽極の先端と試料との距離を所定距離に安定化させることができる。これにより、簡易な位置制御機構を備えるだけで電極対から試料に印加される電界を安定化することができ、試料に関する均一な観察結果を得ることができる。

本発明によれば、簡易な構成で複数配列された保持部内の細胞に印加される電界の安定化を図ることが可能になる。

本発明の好適な一実施形態に係る細胞観察装置１の概略構成を示す図である。 図１のマイクロプレート２０の構成を示す斜視図である。 図１のマイクロプレート２０の断面構造を示す側面断面図である。 図１の電気刺激部１６の一部破断断面図である。 図１の細胞観察装置１の試料Ｓの光測定時の動作を示すフローチャートである。 図５の光測定処理の前に実行される位置設定用データテーブルの設定処理の手順を示すフローチャートである。 図１の細胞観察装置１の試料Ｓの光測定時の別の動作を示すフローチャートである。 図７のステップＳ２１で実行される位置設定用データテーブルの設定処理の手順を示すフローチャートである。 図１のデータ解析装置５０による電気刺激部１６の位置制御の様子を示す一部破断断面図である。 図１のデータ解析装置５０による電気刺激部１６の位置制御の様子を示す一部破断断面図である。 本実施形態の変形例にかかる電極対１７の構造を示す断面図である。 本実施形態の変形例にかかる電極対１７の構造を示す断面図である。 本発明の変形例にかかる細胞観察装置における電気刺激部１６の位置制御用の構造を示す正面図である。 細胞観察装置１において電気刺激を行っていない場合に取得された９６個の各ウェル２１毎の二次元光像の解析領域における平均蛍光強度の時間変化の測定結果を示す図である。 細胞観察装置１において電気刺激を行った場合に取得された９６個の各ウェル２１毎の二次元光像の解析領域における平均蛍光強度の時間変化の測定結果を示す図である。 図１４及び図１５の測定結果から１つのウェルに対応する測定結果を抽出して示す図である。

以下、添付図面を参照しながら本発明による細胞観察装置、電気刺激装置、及び細胞観察方法の実施の形態を詳細に説明する。なお、図面の説明において同一の要素には同一の符号を付し、重複する説明を省略する。また、各図面は説明用のために作成されたものであり、説明の対象部位を特に強調するように描かれている。そのため、図面における各部材の寸法比率は、必ずしも実際のものとは一致しない。

図１は、本発明による細胞観察装置１の一実施形態を模式的に示す構成図である。また、図２は、マイクロプレート２０の構成の一例を示す斜視図である。また、図３は、図２に示したマイクロプレート２０の断面構造を示す側面断面図である。本実施形態による細胞観察装置１は、試料ケースとしてマイクロプレート２０を用い、マイクロプレート２０によって保持された状態で測定位置Ｐに配置された試料Ｓからの蛍光を測定するための装置である。

また、試料Ｓは所定の細胞を含む。所定の細胞には、例えば神経細胞がある。また、本実施形態における細胞観察装置、電気刺激装置、及び細胞観察方法は、蛍光測定以外にも、例えば燐光や発光など、試料から放出された光を測定する光測定に一般に適用可能である。以下、細胞観察装置１の構成について説明する。

図１に示す細胞観察装置１は、データ取得装置１０、位置制御コントローラ（位置制御部）３０、撮像制御コントローラ３２、及びデータ解析装置５０を備えて構成されている。データ取得装置１０は、蛍光観察の対象となる細胞を保持したマイクロプレート２０が内部に収容される暗箱１５と、暗箱１５の内部に設置されて測定位置Ｐに配置された試料Ｓからの蛍光の測定に用いられる動画像取得部４０とを有している。

本実施形態において試料ケースとして用いられているマイクロプレート２０は、図２及び図３に示すように、複数のウェル（保持部）２１が二次元アレイ状に配列された板状部材であり、その複数のウェル２１のそれぞれにおいて、試料Ｓを保持可能な構成となっている。図２に示した構成例では、複数のウェル２１として、８×１２＝９６個の円形状のウェル２１が二次元アレイ状に配置されている。ウェル２１の断面形状としては、円形状、楕円形状、矩形状等が挙げられる。また、このマイクロプレート２０の底面２２は、試料Ｓに照射される蛍光測定用の励起光、及び試料Ｓから放出される蛍光を透過可能な材質によって形成されている。なお、一般に細胞観察装置１においては、マイクロプレート２０の底面２２は、測定対象となる試料Ｓから放出された光を透過可能な材質によって形成されていれば良い。

暗箱１５内においては、マイクロプレート２０は、蛍光観察用の開口を有するマイクロプレートホルダ（載置部）１１に載置されている。また、これらのマイクロプレート２０及びマイクロプレートホルダ１１を、暗箱１５内で所定の方向（図１中においては、右側から左側へと向かう方向）に搬送するマイクロプレート搬送機構１２が、暗箱１５内に設置されている。

搬送機構１２でのマイクロプレート２０の搬送方向に対して搬入側となる暗箱１５の一方側には、試料Ｓが保持された測定前のマイクロプレート２０を所定枚数（例えば、２５枚）ストックしておくための搬入側マイクロプレートストッカー１３が設置されている。また、マイクロプレート２０の搬送方向に対して搬出側となる暗箱１５の他方側には、測定後のマイクロプレート２０をストックしておくための搬出側マイクロプレートストッカー１４が設置されている。

このような構成において、搬入側マイクロプレートストッカー１３から暗箱１５内へと搬入されたマイクロプレート２０は、マイクロプレートホルダ１１によって保持されるとともに搬送機構１２によって搬送される。そして、マイクロプレート２０は測定位置Ｐで一旦停止させられ、この状態で、マイクロプレート２０によって保持された試料Ｓに対して必要な光測定が行われる。測定完了後、マイクロプレート２０は再び搬送機構１２によって搬送され、搬出側マイクロプレートストッカー１４へと搬出される。なお、図１においては、搬送機構１２、及びストッカー１３、１４については、マイクロプレート２０を搬入、搬送、搬出するための具体的な構成の図示を省略している。

蛍光測定の実行時にマイクロプレート２０及び試料Ｓが配置される測定位置Ｐの上方には、マイクロプレート２０のウェル２１内に挿入されて試料Ｓに電界を発生させるための電気刺激部（電気刺激装置）１６が設置されている。また、測定位置Ｐの下方には、ウェル２１内に収容された試料Ｓからマイクロプレート２０の底面２２を介して放出される蛍光の検出に用いられる動画像取得部（光検出部）４０が設置されている。

動画像取得部４０は、マイクロプレート２０のウェル２１内に保持された試料Ｓから放出された光を含むマイクロプレート２０の二次元の光強度分布を表す二次元光像を検出して、二次元光像の動画像データを取得する動画像取得手段である。検出される二次元光像としては、少なくとも１つのウェル２１内に保持された試料Ｓから放出された光を含む光強度分布であればよい。この動画像取得部４０は、撮像装置４５と、導光光学系４１と、光学フィルタ部４２と、励起光源４３とによって構成されている。撮像装置４５は、複数の画素が二次元に配列された二次元画素構造を有し、試料Ｓから放出される蛍光による二次元の光検出画像である蛍光画像を検出する。この撮像装置４５としては、例えば高感度のＣＣＤカメラやＣＭＯＳイメージカメラを用いることができる。また、必要があれば、カメラの前段にイメージ増倍管、リレーレンズ等を配置して動画像取得部４０を構成しても良い。なお、動画像取得部４０は、静止画を取得してもよく、動画及び／又は静止画を取得する画像取得部としての機能を有する。

また、マイクロプレート２０が配置される測定位置Ｐと、撮像装置４５との間には、導光光学系４１が設置されている。導光光学系４１は、複数のウェル２１のそれぞれに試料Ｓが保持されたマイクロプレート２０を底面２２側からみた二次元光像を撮像装置４５へと導く光学系である。導光光学系４１の具体的な構成については、マイクロプレート２０及び撮像装置４５の構成等に応じ、必要な機能（例えば集光機能、光像縮小機能等）を実現可能な光学素子によって適宜構成すれば良い。そのような光学素子としては、例えばテーパファイバがある（特開２００１−１８８０４４号公報参照）。また、導光光学系４１としては、凹凸を有する導光部材を有する光照射装置を用いる構成でもよい（特開２０１０−２３０３９７号公報および特開２０１０−２３０３９６号公報参照）。

また、図１においては、さらに、導光光学系４１と撮像装置４５との間に、必要に応じて蛍光の導光光路上への光学フィルタの配置、切換等を行うことが可能な光学フィルタ部４２が設置されている。ただし、このような光学フィルタ部４２については、不要であれば設けなくても良い。

励起光源４３は、試料Ｓに対して蛍光測定用の励起光を供給するための励起光供給手段である。励起光源４３の具体的な構成としては、蛍光測定の対象となる試料Ｓの種類、試料Ｓに照射する励起光の波長等に応じて適宜構成すれば良いが、例えば、光を供給する照明光源と、励起光の波長の選択、切換を行うための光学フィルタ部とによって構成することができる。また、試料Ｓに対して行われる光測定の種類により、励起光の供給が不要な場合には、励起光源４３を設けない構成としても良い。

本実施形態においては、導光光学系４１は、マイクロプレート２０及び試料Ｓからの二次元光像を撮像装置４５へと導くとともに、励起光源４３からの励起光を試料Ｓへと導くことが可能な光学系として構成される。このような光学系は、例えば、マイクロプレート２０からの蛍光を通過させるとともに、励起光源４３からの励起光を反射させるダイクロイックミラー等を用いて構成することができる。なお、図１においては、導光光学系４１における蛍光及び励起光の光路を、それぞれ実線及び破線によって模式的に示している。

次に、電気刺激部１６の構成について詳細に説明する。図４は、電気刺激部１６がマイクロプレート２０に挿入された状態での電気刺激部１６の一部破断断面図である。電気刺激部１６は、マイクロプレート２０に向けて垂直に伸びる複数の電極対１７が２次元的に配列されるようにベース部１８に固定された構造を有している。詳細には、電極対１７は、マイクロプレート２０のウェル２１に対向して伸びるように、マイクロプレート２０の複数のウェル２１の二次元アレイ状の配列に対応して二次元状に配列されている。それぞれの電極対１７は、先端が開口されて陽極１７ｂを囲むような円筒状の形状を有する陰極１７ａと、陰極１７ａの中心軸上に配置されるように陰極１７ａ内部に挿入された棒状（例えば、円柱状の形状）の陽極１７ｂとによって構成され、陰極１７ａの外径がウェル２１の内径よりも小さくされている。なお、陰極１７ａの円筒状の形状としては、断面が円形状であってもよいし、楕円形状であってもよい。また、電極対１７は、陰極１７ａのウェル２１側の開口の先端が陽極１７ｂのウェル２１側の先端よりも所定の長さ（例えば、１μｍ以上１．０ｍｍ以下の長さ）だけ伸びたような構造、すなわち、陽極１７ｂの先端のベース部１８からの距離が、陰極１７ａの先端のベース部１８からの距離よりも所定の長さ（例えば、１μｍ以上１．０ｍｍ以下の長さ）だけ小さくされた形状を有する。これにより、円筒状の形状の陰極１７ａ内に棒状の陽極１７ｂが収まる。また、陰極１７ａの先端から陽極１７ｂが突出せず、陰極１７ａの先端と陽極１７ｂの先端が同じ高さとならない構成となっている。ここで、電極対１７は、陰極１７ａと陽極１７ｂとがそれぞれ一部材によって構成されるものには限定されず、どちらか或いは両方が複数部材によって構成されていてもよい。

また、電気刺激部１６には、電極対１７をベース部１８を介して支持する移動機構１９が設けられている。移動機構１９は、電極対１７をマイクロプレート２０に対して接近或いは後退させるように（図１のＺ方向）移動させると共に、電極対１７をマイクロプレート２０の底面２２に沿った方向（図１のＸ軸Ｙ軸を含む平面に沿った方向）に移動させる駆動機構であり、試料Ｓの観察時にそれぞれの電極対１７を対向するウェル２１内に配置させるように駆動すると共に、試料Ｓの観察終了時に電極対１７をウェル２１内から離脱させるように駆動する。

このような構成のデータ取得装置１０に対し位置制御コントローラ（位置制御部）３０、撮像制御コントローラ３２が接続されている。位置制御コントローラ３０は、移動機構１９に電気的に接続され、試料Ｓの光測定開始時に、電極対１７をマイクロプレート２０のウェル２１内に配置させるように移動機構１９を制御する。また、位置制御コントローラ３０は、電極対１７にも電気的に接続され、電極対１７の陰極１７ａと陽極１７ｂとの間に電位差が生じるように、陰極１７ａと陽極１７ｂにそれぞれ電圧を印加する。撮像制御コントローラ３２は、励起光源４３による励起光の照射、及び撮像装置４５によるマイクロプレート２０における二次元の蛍光画像の撮像を制御する。

さらに、位置制御コントローラ３０及び撮像制御コントローラ３２に対し、データ解析装置５０が接続されている。このデータ解析装置５０は、動画像取得部４０によって取得された光検出画像を含む動画像データを撮像制御コントローラ３２を経由して取得し、動画像データを対象にして解析処理を行う解析処理手段である。また、データ解析装置５０は、位置制御コントローラ３０及び撮像制御コントローラ３２を介して、データ取得装置１０の各部の動作を制御することによって、細胞観察装置１における試料Ｓに対する蛍光測定を制御する（詳細は後述する）。また、図１においては、データ解析装置５０には、測定結果等を表示する表示装置６１と、データの入力や蛍光測定に必要な指示の入力等に用いられる入力装置６２とが接続されている。

以下、図５及び図６を参照しながら、細胞観察装置１による試料Ｓの光測定時の動作を説明すると共に、本実施形態にかかる細胞観察方法について詳述する。図５は、細胞観察装置１の試料Ｓの光測定時の動作を示すフローチャート、図６は、光測定の前に実行される位置設定用データテーブルの設定手順を示すフローチャートである。

まず、細胞の光測定の開始入力が入力装置６２を介して入力されると、データ解析装置５０において、処理対象の動画像データに含まれる二次元光像もしくは静止画像における解析領域が決定される（ステップＳ０１：解析領域決定ステップ）。この解析領域としては、各ウェル２１の反射像における陽極１７ｂの直下の領域を含むような領域が事前に記憶されたデータを基に設定される。次に、マイクロプレートストッカー１３内の試料Ｓが保持された測定対象のマイクロプレート２０が、マイクロプレートホルダ１１に載置された状態で、マイクロプレート搬送機構１２によって暗箱１５内の測定位置Ｐまで搬送される（ステップＳ０２：載置ステップ）。そして、データ解析装置５０によって移動機構１９を利用して電気刺激部１６の位置が制御されることにより、複数の電極対１７の先端がマイクロプレート２０の対応するウェル２１にそれぞれ挿入される（ステップＳ０３：位置制御ステップ）。このとき、データ解析装置５０は、予め記憶された位置設定用データテーブルのなかから現在使用されているマイクロプレート２０の種類に対応した位置データを参照し、電極対１７の陰極１７ａの先端がマイクロプレート２０の底面２２に接触するように電極対１７の位置を制御する。これにより、陽極１７ｂは、その先端がウェル２１の底面から陰極１７ａとの長さの差の分の所定距離（例えば、１μｍ以上１．０ｍｍ以下の距離）ほど離れた状態で配置される。

その後、データ解析装置５０によって位置制御コントローラ３０が制御されることによって、電極対１７に電圧が供給されてマイクロプレート２０のウェル２１内に電界が発生される（電気刺激の付与）。電界が発生した状態で、動画像取得部４０によってウェル２１内に保持された試料Ｓから放出された蛍光を含むマイクロプレート２０の二次元光像が検出され、その二次元光像を表す動画像データがデータ解析装置５０によって取得される。なお、動画像取得部４０のフレームレートは電圧印加の周波数よりも高く設定されている。さらに、取得された動画像データに含まれる二次元光像を対象に、データ解析装置５０により、マイクロプレートホルダ１１上のマイクロプレート２０の電極対１７に対面する領域の一部に設定された解析領域における光強度が解析されることによって、試料Ｓに関する解析情報が取得されて表示装置６１に出力される（ステップＳ０４：光検出ステップ、情報解析ステップ）。試料Ｓ中の細胞には膜電位感受性蛍光色素が付与されているので、電気刺激を印加したときには、細胞のイオンチャネルに開閉に伴う膜電位の変化が蛍光の強度変化として観察される。このような解析領域における光強度の解析手法としては、解析領域における画素値の変化の振幅、変化率、ピーク周期、ピーク回数、ピーク時間、立ち上がり時間、立ち下がり時間、及びピーク変動幅等を評価値として算出する手法が考えられる。

図６に移って、図５の光測定の前に実行される位置設定用データテーブルの設定手順を説明する。最初に、マイクロプレートストッカー１３内にウェル２１が空の状態の複数種類のマイクロプレート２０が用意される（ステップＳ１１）。次に、複数種類のマイクロプレート２０のうちの一種類のマイクロプレート２０が、マイクロプレートホルダ１１に載置された状態で、マイクロプレート搬送機構１２によって暗箱１５内の測定位置Ｐまで搬送される（ステップＳ１２）。その後、データ解析装置５０の入力装置６２を利用して、位置制御コントローラ３０に対して電気刺激部１６の位置を調整するための位置データが入力されることにより、複数の電極対１７の先端がマイクロプレート２０の対応するウェル２１にそれぞれ挿入される（ステップＳ１３）。このとき、それぞれの電極対１７の陰極１７ａの先端が対向するウェル２１の底面２２に接触する位置になるように電気刺激部１６の位置が調整される。その時に入力装置６２によって入力された位置データが、マイクロプレート２０の種類に関するデータに関連付けてデータ解析装置５０内の位置設定用データテーブルに記憶される（ステップＳ１４）。以上のステップＳ１２〜ステップＳ１４の処理は、全ての種類のマイクロプレート２０について繰り返され（ステップＳ１５）、位置設定用データテーブルの設定が完了する。

なお、細胞観察装置１による位置設定用データテーブルの設定は、試料Ｓを対象にした光測定動作の途中で実行されてもよい。図７は、このような場合の細胞観察装置１による試料Ｓの光測定時の動作手順を示している。

この場合、細胞の光測定の開始入力が入力装置６２を介して入力されると、電気刺激部１６の位置を調整するための位置設定用データテーブルの設定が実行される（ステップＳ２１）。次に、データ解析装置５０において、処理対象の動画像データに含まれる二次元光像における解析領域が決定される（ステップＳ２２：解析領域決定ステップ）。この解析領域としては、各ウェル２１の反射像における陽極１７ｂの直下の領域を含むような領域が事前に記憶されたデータを基に設定される。次に、マイクロプレートストッカー１３内の試料Ｓが保持された測定対象のマイクロプレート２０が、マイクロプレートホルダ１１に載置された状態で、マイクロプレート搬送機構１２によって暗箱１５内の測定位置Ｐまで搬送される（ステップＳ２３：載置ステップ）。そして、データ解析装置５０によって、移動機構１９を利用して電気刺激部１６の位置が制御されることにより、複数の電極対１７の先端がマイクロプレート２０の対応するウェル２１にそれぞれ挿入される（ステップＳ２４：位置制御ステップ）。このとき、データ解析装置５０は、ステップＳ２１で記憶された位置設定用データテーブルの位置データを参照し、電極対１７の陰極１７ａの先端がマイクロプレート２０の底面２２に接触するように電極対１７の位置を制御する。ただし、実際にはマイクロプレート２０のウェル２１には試料Ｓが保持されているため、電極対１７の陰極１７ａの先端がマイクロプレート２０の底面２２に接触しないこともある。これにより、陽極１７ｂは、その先端がウェル２１の底面から陰極１７ａとの長さの差の分の所定距離（例えば、１μｍ〜１．０ｍｍ）ほど離れた状態で配置される。

その後、データ解析装置５０によって位置制御コントローラ３０が制御されることによって、電極対１７に電圧が供給されてマイクロプレート２０のウェル２１内に電界が発生する（電気刺激の付与）。電界が発生した状態で、動画像取得部４０によってウェル２１内に保持された試料Ｓから放出された蛍光を含むマイクロプレート２０の二次元光像が検出され、その二次元光像を表す動画像データがデータ解析装置５０によって取得される。さらに、取得された動画像データに含まれる二次元光像を対象に、データ解析装置５０により、マイクロプレートホルダ１１上のマイクロプレート２０の電極対１７に対面する領域の一部に設定された解析領域における光強度が解析されることによって、試料Ｓに関する解析情報が取得されて表示装置６１に出力される（ステップＳ２５：光検出ステップ、情報解析ステップ）。

図８に移って、図７のステップＳ２１で実行される位置設定用データテーブルの設定手順の詳細を説明する。最初に、マイクロプレートストッカー１３内にウェル２１が空の状態の測定用のマイクロプレート２０と同じ種類のマイクロプレート２０が用意される（ステップＳ３１）。次に、マイクロプレート２０が、マイクロプレートホルダ１１に載置された状態で、マイクロプレート搬送機構１２によって暗箱１５内の測定位置Ｐまで搬送される（ステップＳ３２）。その後、データ解析装置５０の入力装置６２を利用して、位置制御コントローラ３０に対して電気刺激部１６の位置を調整するための位置データが入力されることにより、複数の電極対１７の先端がマイクロプレート２０の対応するウェル２１にそれぞれ挿入される（ステップＳ３３）。このとき、それぞれの電極対１７の陰極１７ａの先端が対向するウェル２１の底面２２に接触する位置になるように電気刺激部１６の位置が調整される。その時に入力装置６２によって入力された位置データが、ステップＳ２４で参照されるためにデータ解析装置５０内の位置設定用データテーブルに一時記憶される（ステップＳ３４）。以上で位置設定用データテーブルの設定が完了する。

上述した細胞観察装置１による試料Ｓの光測定時のステップＳ０３（図５）及びステップＳ２４（図７）におけるデータ解析装置５０による電気刺激部１６の位置制御の詳細について説明する。図９（ａ）に示すように、ステップＳ０３，Ｓ２４では、まず、データ解析装置５０によって位置設定用データテーブルが参照されることにより、複数の電極対１７の先端のマイクロプレート２０の底面２２に沿った方向（Ｘ−Ｙ平面に沿った方向）の位置がそれぞれのウェル２１に対向する位置となるように、電気刺激部１６が移動される。さらに、図９（ｂ）に示すように、データ解析装置５０により位置設定用データテーブルが参照されて、電極対１７の陰極１７ａの先端がウェル２１の底面に溜まった試料Ｓに接触するまで、電気刺激部１６がＺ軸方向に挿入される。ここで、位置設定用データテーブルに記憶されるＺ軸方向の位置データは、陰極１７ａの先端とウェル２１の底面との間に試料Ｓを挟む分の微小長さ分（例えば０．１以上０．２ｍｍ以下の距離）を考慮して設定される。その後、図１０に示すように、データ解析装置５０により、電極対１７の陰極１７ａの先端がウェル２１の底面に溜まった試料Ｓを押圧して底面に接触するまで、電気刺激部１６がＺ軸方向に挿入される。このように電極対１７の位置を予め取得した位置から０．１ｍｍ以上０．２ｍｍ以下の距離程度さらに底面を押圧するように制御することにより、複数のウェル２１の底面の位置が不均一な場合であっても、全てのウェル２１について陰極１７ａの先端をその底面と接触させることができる。

以上説明した細胞観察装置１及び細胞観察装置１による細胞観察方法によれば、マイクロプレート２０に複数配列されたウェル２１に陽極１７ｂと陰極１７ａとを含む電極対１７が配置されることにより、この電極対１７により細胞を含む試料Ｓに電界が印加可能にされる。ここで、電極対１７を構成する陽極１７ｂ及び陰極１７ａは、陰極１７ａの先端が陽極１７ｂの先端よりも伸びているので、陰極１７ａの先端がウェル２１の底部の試料Ｓに接触するように電極対１７をウェル２１内に挿入することにより、陽極１７ｂの先端と試料Ｓとの距離を所定距離（例えば、１μｍ以上１ｍｍ以下の距離）に安定化させることができる。これにより、簡易な位置制御機構を備えるだけで電極対１７から試料Ｓに印加される電界を安定化することができ、試料Ｓに関する均一な観察結果を得ることができる。また、このような構成によれば、陰極１７ａが試料Ｓに接触するため、試料Ｓに適切な電位差を与えることができる。

上記の細胞観察装置１においては、データ解析装置５０は、陰極１７ａのウェル２１側の先端がウェル２１の底面に接触するように位置を制御するので、陽極１７ｂの先端と試料Ｓとの距離を所定距離に安定化させることができ、簡易な位置制御機構を備えるだけで電極対１７から試料Ｓに印加される電界を安定化することができる。

また、陽極１７ｂは、棒状電極であるので、ウェル２１の底面２２上の電界の強い領域を陽極１７ｂ近傍の領域に限定することができる。その結果、試料Ｓに関する高感度の観察結果を得ることができる。

なお、本発明は、前述した実施形態に限定されるものではない。

例えば、電気刺激部１６の電極対１７の構造は同軸形状には限定されず、様々な形状を採用できる。さらに、データ解析装置５０は、この電極対１７の構造に対応して解析領域を設定することができる。

図１１及び図１２には、本実施形態の変形例にかかる電極対１７の構造を示している。図１１（ａ）〜（ｄ）及び図１２（ａ）〜（ｂ）には、それぞれ、右側には電極対１７のマイクロプレート２０の底面に垂直な方向に沿った断面、左側には電極対１７のマイクロプレート２０のマイクロプレート２０の底面沿った断面図をウェル２１と共に示している。これらの図に示すように、電極対１７は、図１１（ａ）に示す同軸形状の他、図１１（ｂ）に示すような棒状の陽極１７ｂとそれに対面する平板状の陰極１７ａの組み合わせの構造、図１１（ｃ）に示すような２本の棒状の陽極１７ｂで平板状の陰極１７ａを並列して挟むような構造、図１１（ｄ）に示すような２本の棒状の陽極１７ｂで棒状の陰極１７ａを並列して挟むような構造、図１２（ａ）に示すような棒状の陽極１７ｂとそれに並列した棒状の陰極１７ａの組み合わせの構造、及び図１２（ｂ）に示すような棒状の陽極１７ｂとそれに対向する２本の棒状の陰極１７ａの組み合わせの構造を採用することができる。また、平板状の陽極と陰極を平行に配置した平行電極対の構造を採用してもよい。いずれの電極対１７の構造であっても、陰極１７ａのウェル２１側の先端が陽極１７ｂのウェル２１側の先端よりも所定の長さだけ伸びたような構造に設定される。

また、上記細胞観察装置１では、データ解析装置５０が電気刺激部１６の位置を内部に記憶されたデータを参照して電子的に制御していたが、位置制御用部材を用いて機械的に制御してもよい。図１３には、本発明の変形例にかかる細胞観察装置における電気刺激部１６の位置制御用の構造を示している。同図に示す電気刺激部１６のベース部１８には位置検出用のボタンセンサ（位置検出センサ）２４がＺ軸方向側の面に設けられており、そのボタンセンサ２４のＺ軸方向側には暗箱１５（図１）に対して固定された長尺状の位置基準部材２５が設けられている。この位置基準部材２５には所定のＺ軸方向位置にボタンセンサ２４と対向するように緩衝部材２５ａが設けられている。このような細胞観察装置においては、データ解析装置５０により、電気刺激部１６の電極対１７がマイクロプレート２０のウェル２１に挿入されるようにＺ軸方向に移動されると、ボタンセンサ２４の位置基準部材２５の緩衝部材２５ａに対する当接が検出され、その検出に応じて電気刺激部１６の移動が停止される。ここで、位置基準部材２５の緩衝部材２５ａの端面の位置を、電極対１７の陰極１７ａがウェル２１の底面に接触する位置に対応したボタンセンサ２４の先端の位置に設定することにより、電気刺激部１６の位置が電極対１７の陰極１７ａの先端がウェル２１の底面に接触するように制御される。また、位置基準部材２５に緩衝部材２５ａを設けることでボタンセンサ２４が位置基準部材２５に当接した当初の圧力を和らげることができ、陰極１７ａの先端がウェル２１の底面に接触してもすぐにはボタンセンサ２４が作動せず、所定距離（例えば、０．１ｍｍ〜０．２ｍｍ程度）下がった状態で電気刺激部１６の移動が停止される。そのため、複数のウェル２１の底面の位置が不均一な場合であっても、全てのウェル２１について陰極１７ａの先端をその底面と接触させることができる。

また、上述の実施例では、マイクロプレートストッカー１３内の試料Ｓが保持された測定対象のマイクロプレート２０が、マイクロプレートホルダ１１に載置された状態で、マイクロプレート搬送機構１２によって暗箱１５内の測定位置Ｐに搬送される構成としたが、マイクロプレート２０を手動で暗箱１５内の測定位置Ｐに配置する構成としてもよい。

上述した実施形態の細胞観察装置１及びそれを用いた細胞観察方法においては、試料Ｓとして筋肉を構成する心筋細胞（心筋を構成する細胞）や骨格筋細胞を測定対象としてもよい。心筋細胞や骨格筋細胞は、活動電位が引き金となって伸縮を行う。この際、カルシウムイオンが、細胞膜を介して細胞外から細胞内へ、又は細胞内から細胞外へ移動するため、カルシウムイオンに反応する色素で染色してその蛍光を観察することで、心筋細胞や骨格筋細胞の伸縮の様子が確認できる。通常、生体内の筋細胞は活動電位を制御するペースメーカー細胞により伸縮を行うが、ｉＰＳ細胞やＥＳ細胞などの幹細胞から生まれた心筋細胞や骨格筋細胞は、ペースメーカーとなる細胞が存在しなかったり、制御がうまくできなかったりする場合がある。ただ、このような筋細胞でも、細胞観察装置１を用いて外部から電気刺激を与えることで、活動電位を制御し、細胞を伸縮させることができる。近年、心筋細胞や骨格筋細胞を用いて創薬評価を行う需要が高まっている。特に、外部からの電気刺激を行う本実施形態は、通常のペーシング（pacing）に加え、薬効が拍動数に依存する化合物の評価を可能にし、また意図的に不整脈を起こさせることもできるので、様々な化合物の評価手法として有効なものである。

ここで、筋細胞を対象にした実施例について説明する。

マイクロプレート２０の９６個のウェル２１内に保持される試料Ｓとして、生後１〜４日のＳＤラットの心臓（心室）の心筋細胞を１ウェルあたり２×１０^４個（cells）となるまで培養したものを用いた。このマイクロプレート２０としては、ウェル２１をコラーゲンＩコーティングしたものを用いた。また、心筋細胞はカルシウム色素（Cal520-AM）で染色した。

位置制御ステップ（図５：Ｓ０３）では、データ解析装置５０により、心筋細胞が保持されたウェル２１内に電極対１７が配置されるように制御される。その後の光検出ステップ（図５：Ｓ０４）では、データ解析装置５０の制御により、電極対１７に電圧が供給されてウェル２１内の心筋細胞に電気刺激が付与される。詳細には、電極対１７には、波高値が５Ｖで時間幅が５ｍｓの矩形波のパルス電圧を繰り返し周波数が１Ｈｚで５秒間印加される。この繰り返し周波数は０．５Ｈｚ〜２Ｈｚの範囲に設定されることが好ましい。同時に、データ解析装置５０により、電極対１７に電圧が印加された状態で１フレームあたり３１ｍｓ、つまり、フレームレートが３０フレーム／秒でマイクロプレート２０の二次元光像を表す動画像データが取得される。そして、データ解析装置５０により、取得された動画像データを用いて解析領域における蛍光強度が解析される。

図１４及び図１５には、本実施例において取得された９６個の各ウェル２１毎の二次元光像の解析領域における平均蛍光強度の時間変化の測定結果を示しており、図１４はパルス電圧による電気刺激を行っていない場合の測定結果、図１５はパルス電圧による電気刺激を行った場合の測定結果を示している。これらの測定結果においては、各ウェル２１毎の測定結果を、１列〜１２列及びＡ行〜Ｈ列の２次元で配列して示している。これらの測定結果により、パルス電圧によるペーシングを行っていない場合には、９６個のウェルの中の一部のウェルにはペースメーカーとなる細胞が働いて蛍光強度の変化がみられるが、全くペースメーカーが働いていないウェルも存在することがわかる。一方、パルス電圧によるペーシングを行っている場合には、９６個の全てのウェルで蛍光強度の変化が観測された。

さらに、図１６には、図１４及び図１５の測定結果のうちのＢ行３列のウェルのものを抽出して示しており、（ａ）が電気刺激を行っていない場合、（ｂ）が電気刺激を行った場合の結果を示している。このように、ペーシングなしの場合にはまだらなピークが観測されていたが、ペーシングを行った場合には電気刺激のタイミングＴ１に応じて周期的な蛍光ピークが観測され、心筋細胞のペーシング用途に上記の細胞観察装置および細胞観察方法が有効であることが確認できた。

なお、矩形波のパルス電圧を心筋細胞にランダムに印加することにより、不整脈の状態での観察にも上記の細胞観察装置および細胞観察方法は有効である。

ここで、上記の細胞観察装置においては、位置制御部は、陰極の保持部側の先端が保持部の底面に接触するように位置を制御する、ことが好適である。かかる構成を採れば、陽極の先端と試料との距離を所定距離に安定化させることができる。これにより、簡易な位置制御機構を備えるだけで電極対から試料に印加される電界を安定化することができる。

また、陽極は、棒状電極であることも好適である。かかる棒状電極を備えれば、ウェルの底面上の電界の強い領域を陽極近傍の領域に限定することができる。その結果、試料に関する高感度の観察結果を得ることができる。

さらに、陰極は、陽極を囲むような円筒状電極であってもよいし、陽極に対面する板状電極であってもよいし、陽極に並列に配置された棒状電極であってもよい。

また、陰極の先端は、陽極の先端よりも１μｍ以上１．０ｍｍ以下の長さだけ伸びていることが好適である。この場合、電極対から試料に印加される電界をさらに安定化することができる。

さらに、位置制御ステップでは、陰極の保持部側の先端が保持部の底面に接触するように位置を制御する、ことが好適である。こうすれば、簡易な位置制御で電極対と試料との位置関係を安定化させることができる。

本発明は、細胞を含む試料を対象に電気刺激に伴う反応を観察するための細胞観察装置、電気刺激装置、及び細胞観察方法を使用用途とし、簡易な構成で複数配列された保持部内の細胞に印加される電界の安定化を図ることができるものである。

１…細胞観察装置、１１…マイクロプレートホルダ（載置部）、１６…電気刺激部、１７…電極対、１７ａ…陰極、１７ｂ…陽極、２０…マイクロプレート（試料ケース）、２１…ウェル（保持部）、２２…底面、３０…位置制御コントローラ（位置制御部）、５０…データ解析装置（位置制御部）、Ｐ…測定位置、Ｓ…試料。

Claims (12)

1. 細胞を含む試料を保持する保持部が複数配列された試料ケースによって保持された前記細胞を観察する細胞観察装置であって、
   前記試料ケースを載置するための載置部と、
   第１の電極と第２の電極とを含む電極対が複数配列された電気刺激部と、
   前記試料ケースの前記保持部内に前記電極対が配置されるように、前記電極対と前記保持部の底面との間の距離を制御する位置制御部とを備え、
   前記第２の電極の前記保持部側の先端は、前記第１の電極の前記保持部側の先端よりも伸びており、
   前記位置制御部は、前記第２の電極の前記保持部側の先端が前記保持部の前記底面に接触するように前記距離を制御する、
   ことを特徴とする細胞観察装置。
2. 前記第１の電極は、棒状電極である、
   ことを特徴とする請求項１記載の細胞観察装置。
3. 前記第２の電極は、前記第１の電極を囲むような円筒状電極である、
   ことを特徴とする請求項２記載の細胞観察装置。
4. 前記第２の電極は、前記第１の電極に対面する板状電極である、
   ことを特徴とする請求項２記載の細胞観察装置。
5. 前記第２の電極は、前記第１の電極に並列に配置された棒状電極である、
   ことを特徴とする請求項２記載の細胞観察装置。
6. 前記位置制御部は、筋細胞を含む前記試料を保持する前記保持部内に前記電極対が配置されるように制御し、
   前記電極対に繰り返しパルス電圧を印加した状態での前記保持部における解析領域の光強度を解析する、
   ことを特徴とする請求項１〜５のいずれか１項に記載の細胞観察装置。
7. 細胞を含む試料を保持する保持部を有する試料ケースによって保持された前記細胞を観察する細胞観察装置であって、
   前記試料ケースを載置するための載置部と、
   第１の電極と第２の電極とを含む電極対を有する電気刺激部と、
   前記試料ケースの前記保持部内に前記電極対が配置されるように、前記電極対と前記保持部の底面との間の距離を、前記電極対を前記保持部の底面に直交した方向に移動させることにより制御する位置制御部とを備え、
   前記第２の電極の前記保持部側の先端は、前記第１の電極の前記保持部側の先端よりも伸びており、
   前記位置制御部は、前記第２の電極の前記保持部側の先端が前記保持部の前記底面に接触するように前記距離を制御する、
   ことを特徴とする細胞観察装置。
8. 前記位置制御部は、筋細胞を含む前記試料を保持する前記保持部内に前記電極対が配置されるように制御し、
   前記電極対に繰り返しパルス電圧を印加した状態での前記保持部における解析領域の光強度を解析する、
   ことを特徴とする請求項７記載の細胞観察装置。
9. 細胞を含む試料を保持する保持部が複数配列された試料ケースによって保持された前記細胞を観察する細胞観察方法であって、
   前記試料ケースを載置部に載置する載置ステップと、
   第１の電極と第２の電極とを含む電極対が複数配列された電気刺激部を用いて、前記試料ケースの前記保持部内に前記電極対が配置されるように、前記電極対と前記保持部の底面との間の距離を制御する位置制御ステップとを備え、
   前記第２の電極の前記保持部側の先端は、前記第１の電極の前記保持部側の先端よりも伸びており、
   前記位置制御ステップでは、前記第２の電極の前記保持部側の先端が前記保持部の底面に接触するように前記距離を制御する、
   ことを特徴とする細胞観察方法。
10. 前記位置制御ステップでは、筋細胞を含む前記試料を保持する前記保持部内に前記電極対が配置されるように制御し、
    前記電極対に繰り返しパルス電圧を印加した状態での前記保持部における解析領域の光強度を解析する、
    ことを特徴とする請求項９記載の細胞観察方法。
11. 細胞を含む試料を保持する保持部を有する試料ケースによって保持された前記細胞を観察する細胞観察方法であって、
    第１の電極と第２の電極とを含み、前記第２の電極の前記保持部側の先端が、前記第１の電極の前記保持部側の先端よりも伸びている電極対を、前記保持部の底面に直交した方向に移動させることにより、前記第２の電極の前記保持部側の先端が前記保持部の底面に接触するように前記保持部内に挿入し、
    前記電極対を用いて前記細胞に電気刺激を与え、
    前記細胞から発せられる光を検出する、
    ことを特徴とする細胞観察方法。
12. 前記細胞は、筋細胞である、
    ことを特徴とする請求項１１記載の細胞観察方法。