JP5219898B2

JP5219898B2 - 光照射装置及び光測定装置

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Publication number: JP5219898B2
Application number: JP2009076595A
Authority: JP
Inventors: 卓治片岡; 平良伊藤
Original assignee: Hamamatsu Photonics KK
Current assignee: Hamamatsu Photonics KK
Priority date: 2009-03-26
Filing date: 2009-03-26
Publication date: 2013-06-26
Anticipated expiration: 2029-03-26
Also published as: JP2010230396A

Description

本発明は、マイクロプレートに対して照射光を照射するための光照射装置、及びこの光照射装置とマイクロプレートを備え測定対象物の測定を行う光測定装置に関する。

従来、マイクロプレートのウェルに照射光（励起光）を照射する技術としては、特許文献１〜３に記載の技術が知られている。特許文献１の場合、照射光は、マイクロプレートの裏面から、マイクロプレートのウェルの深さ方向に対して平行に、当該ウェルに照射される。マイクロプレートのウェルには、培養液、蛍光指示薬及び評価化合物等の溶液と細胞等の測定対象物とが注入される。

特開２００７−１０８１４６号公報特開平１０−１９７４４９号公報特開平１０−２８１９９４号公報

特許文献１に記載の照射光の照射方法において、照射光は、ウェルの深さ方向に対して平行に当該ウェルに照射されるので、測定対象物だけでなく溶液にも多量に照射される場合がある。この場合、溶液からの背景光ノイズが比較的大きくなる。そこで、本発明は、マイクロプレートからの背景光ノイズを低減可能な光照射装置を提供することを目的とする。

本発明の光照射装置は、測定対象物を収容するための複数のウェルが設けられたマイクロプレートに対して照射光を照射するための光照射装置であって、複数の凹部が形成された主面と、該主面と略直交する側面と、を有する導光部材と、導光部材の側面から導光部材に照射光を入射する光源と、を備え、凹部は、主面に開口を有し、導光部材は、ウェルの底面と凹部の開口とが対向するように配置可能であり、側面から導光部材に入射される照射光は、凹部の側面において屈折及び反射され、複数の凹部の開口からそれぞれ出射される、ことを特徴とする。

また、本発明の光測定装置は、測定対象物を収容するための複数のウェルが設けられたマイクロプレートと、マイクロプレートに対して照射光を照射するための光照射装置と、を含む光測定装置であって、光照射装置は、複数の凹部が形成された主面及び該主面と略直交する側面を有する導光部材と、導光部材の側面から導光部材に照射光を入射する光源と、を備え、凹部は、主面に開口を有し、導光部材は、ウェルの底面と凹部の開口とが対向するように配置され、導光部材の側面から導光部材に入射される照射光は、凹部の側面において屈折及び反射され、複数の凹部の開口からそれぞれ射出されて、マイクロプレートのウェルの前記底面に入射される、ことを特徴とする。

本発明の光照射装置及び光測定装置によれば、照射光は、凹部の側面において屈折及び反射されて凹部の開口から出射されるので、ウェルの深さ方向に対して傾きをもってウェルに照射される。このため、培養液、蛍光指示薬及び評価化合物等の溶液に照射される照射光が比較的少ない。よって、溶液に照射光が照射されることにより生じるマイクロプレートからの背景光ノイズを低減可能である。

本発明の光照射装置においては、凹部は円柱形状の窪みである、ことが好ましい。この場合、凹部の側面に角がないので、凹部の内部にランダムな光の散乱を誘発し易い。したがって、マイクロプレートの各ウェルに対する照射光の照射ムラを低減することができる。

本発明の光照射装置においては、凹部の底面は平坦である、ことが好ましい。この場合、凹部の底面が平坦であるので、導光部材に入射して凹部の底面に到達する照射光の一部は、凹部の底面において全反射される。このため、ウェルの深さ方向に対して平行な照射光の入射が低減される。

本発明の光照射装置においては、凹部の底面は鏡面加工されている、ことが好ましい。この場合、凹部の底面が鏡面加工されているので、導光部材に入射して凹部の底面に到達する照射光の大部分は、凹部の底面において全反射される。このため、ウェルの深さ方向に対して平行な照射光の入射を一層低減可能である。

本発明によれば、マイクロプレートからの背景光ノイズを低減可能な光照射装置及び光測定装置を提供することができる。

本実施形態に係る光測定装置の断面構成を表す図である。図１に示されたマイクロプレートを説明するための図である。図１に示された光照射装置を説明するための図である。図１に示された光照射装置を説明するための図である。図１に示されたマイクロプレートのウェルと導光部材の凹部との関係を表す図である。図１に示された光照射装置を説明するための図である。図１に示された光照射装置を説明するための図である。図１に示された光照射装置を説明するための図である。図１に示されたマイクロプレート及び導光部材における照射光の光路を表す図である。図１に示されたマイクロプレートに保持された測定対象物及び溶液からの測定光（蛍光）を測定した結果を表す図である。

以下、図面を参照して、本発明に係る好適な実施形態について詳細に説明する。なお、図面の説明において、可能な場合には、同一要素には同一符号を付し、重複する説明を省略する。図１は、本実施形態に係る光測定装置の断面構成を模式的に表す図である。図１に示されるように、光測定装置１０は、マイクロプレート２０と、マイクロプレートストッカー３０，４０と、運搬ベルト５０と、光照射装置６０と、励起光カットフィルタ７０と、検出器８０と、を備える。また、光照射装置６０は、導光部材６１と光源装置６２とを含む。光測定装置１０は、マイクロプレート２０に保持された測定対象物に対して照射光（励起光）を照射することにより、測定対象物から発せられる測定光（蛍光）を検出する装置である。

図２（ａ）は、マイクロプレート２０の平面図であり、図２（ｂ）は、図２（ａ）のＩ−Ｉ線に沿ってとられたマイクロプレート２０の断面構成を表す図である。図２（ａ）及び図２（ｂ）に示されるように、マイクロプレート２０は、円柱形状の窪みのウェル２１を複数個（例えば９６個）有する。マイクロプレート２０の主面２２には、これら複数のウェル２１の開口が、例えば、８列１２行に配列されている。また、複数のウェル２１のそれぞれには、細胞等の測定対象物Ａと培養液、蛍光指示薬及び評価化合物等の溶液Ｂとがそれぞれ注入されて保持される。測定対象物Ａは、ウェル２１の底部に沈殿する。なお、マイクロプレート２０のウェルは円柱形状の窪みのウェル２１に限らない。例えば、マイクロプレート２０のウェルは、図２（ｃ）に示されるように角柱形状の窪みのウェル２１ａであってもよい。

再び図１を参照して説明する。マイクロプレートストッカー３０は、測定前のマイクロプレート２０を格納する。また、マイクロプレートストッカー４０は、測定後のマイクロプレート２０を格納する。運搬ベルト５０は、マイクロプレートストッカー３０から所定の測定位置（光照射装置６０と向き合う位置）まで測定前のマイクロプレート２０を運搬する。さらに、運搬ベルト５０は、この所定の測定位置からマイクロプレートストッカー４０まで測定後のマイクロプレート２０を運搬する。

光照射装置６０は、導光部材６１と、光源装置６２と、を含む。導光部材６１は、例えば、石英ガラスで構成されている。光源装置６２は、導光部材６１の側面６１ｂから照射光を入射する。光照射装置６０は、マイクロプレート２０の裏面２３側からウェル２１に対して照射光を照射する。ここで、光測定装置１０は、光照射装置６０を裏面２３に垂直な方向（マイクロプレート２０のウェル２１の深さ方向）に移動するための機構を有している（不図示）。なお、光照射装置６０は、導光部材６１の主面６１ａとマイクロプレート２０の裏面２３とが所定の間隔（例えば５ｍｍ程度）を有するように配置されて固定されていてもよい。この場合、マクロプレート２０は光照射装置６０に衝突することなく所定の測定位置に運搬される。

励起光カットフィルタ７０は、照射光の透過を阻止し、測定対象物Ａ等からの測定光を透過する。検出器８０は、マイクロプレート２０の裏面２３側に配置され、励起光カットフィルタ７０を透過した測定光を結像するための光学系（不図示）と、結像された像を撮像するための２次元ＣＣＤカメラ等の光検出装置を有しており、測定対象物Ａ等からの測定光を検出する。なお、検出器８０は、マイクロプレート２０の主面２２側に配置することも可能である。この場合、検出器８０は、例えば、マイクロプレート２０の各ウェル２１に対してそれぞれ配置された複数の光電子増倍管、もしくはマイクロプレート２０の複数のウェル２１を撮像可能な２次元撮像装置とすることができる。また、検出器８０に光電子増倍管を用いた場合、マイクロプレート２０の主面２２側の上方において光電子増倍管を移動させ、各ウェル２１からの測定光を検出することができる。

続いて、光照射装置６０について詳細に説明する。図３（ａ）は図３（ｂ）のII―II線に沿ってとられた光照射装置６０の断面構成を表す図である。図３（ｂ）は光照射装置６０の平面図である。図３（ａ）及び図３（ｂ）に示されるように、光照射装置６０の導光部材６１は、主面６１ａと、この主面６１ａに略直交し互いに対向する二つの側面６１ｂと、主面６１ａに略直交し互いに対向する二つの側面６１ｃと、を有する。また、導光部材６１は、主面６１ａに２次元的に配列されて設けられた複数の凹部６１ｅを有する。凹部６１ｅは、導光部材６１の主面６１ａに開口を有する円柱形状の窪みであり、光出射面６１ａと略平行で平坦な底面６１ｆを含む。この底面６１ｆは鏡面加工されている。

導光部材６１の側面６１ｂには、光源装置６２が配置されている。光源装置６２は、フレーム６２ａと、光源としてのＬＥＤ６２ｂと、フィルタ６２ｃと、を含む。ＬＥＤ６２ｂは、導光部材６１の側面６１ｂに沿って複数配列されてフレーム６２ａにより保持されている。これら複数のＬＥＤ６２ｂは、導光部材６１の側面６１ｂからフィルタ６２ｃを介して導光部材６１に指向性を有する照射光を入射する。フィルタ６２ｃは、特定の波長帯域の光のみを透過するショートパスフィルタやバンドパスフィルタ等であり、ＬＥＤ６２ｂから出射される光から、測定に適した波長の照射光のみを透過する。このように、ＬＥＤ６２ｂとフィルタ６２ｃとを組み合わせることにより、より測定に適した波長の光を導光部材６１へ入射させることができるので、測定精度を高めることができる。

なお、導光部材６１の各凹部は円柱形状の窪みの凹部６１ｅに限らず、図３（ｃ）に示されるように角柱形状の窪みの凹部６１ｇであってもよい。さらに、導光部材６１の各凹部（凹部６１ｅや凹部６１ｇ）は、図４（ａ）及び図４（ｂ）に示されるように断面（図３（ｂ）のII―II線に沿ってとられた断面）が台形状の窪みであってもよい。この場合、導光部材６１の各凹部（凹部６１ｅや凹部６１ｇ）の側面と主面６１ａとの成す角φは、鋭角であることが望ましいが、９０度〜１２０度程度の鈍角であってもよい。また、図４（ｃ）に示されるように、凹部６１ｅが複数設けられた角柱状の光ファイバ６１ｉを複数配列することにより導光部材６１を形成することもできる。以上説明した導光部材６１は、図１に示されるように、ウェル２１の底面と、凹部６１ｅの開口とが対向するように配置可能である。なお、導光部材６１の各凹部（凹部６１ｅや凹部６１ｇ）の深さは、２ｍｍ程度であることが好ましい。

図５は、複数のウェル２１に対する複数の凹部６１ｅの配置パターンのバリエーションを模式的に表す図である。図５（ａ）に示されるように、各凹部６１ｅは各ウェル２１と一対一に対応するように設けられることが好ましいが、図５（ｂ）に示されるように、複数の凹部６１ｅが一つのウェル２１に対応するように設けられてもよい。また、各凹部６１ｅは、図５（ｃ）に示されるように、各ウェル２１と一対一に対応し、且つ、ウェル２１よりも幅広に設けられてもよい。さらに、各凹部６１ｅは、図５（ｄ）に示されるように、一つのウェル２１に複数の凹部６１ｅが対応し、且つ、主面６１ａの上方から見て、各凹部６１ｅの一部がウェル２１に重ならないように（そして、各凹部６１ｅの残りの部分がウェル２１に重なるように）設けられてもよい。

光源装置６２の光源としては、互いに異なる波長の光を出射する２種のＬＥＤを用いることができる。この場合、図６（ａ）に示されるように、導光部材６１の側面６１ｂに沿ってＬＥＤ６２ｂを複数配列し、導光部材６１の他の側面６１ｃに沿って、ＬＥＤ６２ｂとは異なる波長の光を出射するＬＥＤ６２ｄを複数配列する。これにより、光源装置６２は、互いに異なる２種の波長の照射光を導光部材６１に入射することができる。ＬＥＤ６２ｂと導光部材６１との間にはフィルタ６２ｃが配置され、ＬＥＤ６２ｄと導光部材６１との間には、フィルタ６２ｃとは異なる波長の光を透過するショートパスフィルタやバンドパスフィルタ等のフィルタ６２ｅが配置される。よって、フィルタ６２ｅは、ＬＥＤ６２ｄから出射される光から、測定に適した波長の照射光のみを透過することができる。また、図６（ｂ）に示されるように、導光部材６１の側面６１ｂ及び側面６１ｃに沿って、ＬＥＤ６２ｂとＬＥＤ６２ｄとを交互に配列することも可能である。このとき、ＬＥＤ６２ｂ及びＬＥＤ６２ｄと導光部材６１との間には、フィルタ６２ｃ及びフィルタ６２ｅが交互に配置される。

なお、光源装置６２の光源は、ＬＥＤに限らない。光源装置６２の光源としては、例えば、図７（ａ）に示されるように、キセノンランプ６２ｆ等の白色光源を用いることができる。この場合、キセノンランプ６２ｆは、波長切替装置６２ｇ及び光ファイバ６２ｈを介して、指向性を有する所定の波長の照射光を導光部材６１の側面６１ｂから導光部材６１に入射する。これにより、ＬＥＤでは実現できない波長の光を照射光として用いることができる。このとき、光源としてのキセノンランプ６２ｆ自体は、図７（ａ）に示されるように、導光部材６１の側面６１ｂに配置されなくてもよい。また、図７（ｂ）に示されるように、光源装置６２の光源として指向性を有さない光を出射する所定の光源６２ｋを用い、この光源６２ｋとフィルタ６２ｍとの間に、コリメータレンズ６２ｎを配置してもよい。このコリメータレンズ６２ｎは、図７（ｃ）に示されるように、導光部材６１の側面６１ｂに導光部材６１と一体的に設けることも可能である。フィルタ６２ｍは、光源６２ｋにより出射される光から、測定に適した波長の照射光のみを透過する。

図８は、導光部材６１に入射する照射光の範囲を表す図である。図８（ａ）に示されるように、側面６１ｂのうち、凹部６１ｅの裏面６１ｆと導光部材６１の底面６１ｈとの間の領域に対応する部分から照射光を入射することが好ましいが、図８（ｂ）に示されるように、側面６１ｂの全面から照射光を入射してもよい。

以上説明したように、光照射装置６０においては、主面６１ａに複数の凹部６１ｅが形成された導光部材６１に対して、導光部材６１の側面６１ｂから指向性を有する照射光が入射される。導光部材６１に入射した照射光の一部は、図９（ａ）中の破線Ｌ１によって示される光路を進行し、凹部６１ｅの底面６１ｆ、導光部材６１の裏面６１ｈ及び主面６１ａにおいて全反射される。このため、ウェル２１の深さ方向に進行する照射光が凹部６１ｅ内に入射することを抑制できる。また、導光部材６１に入射する照射光の一部は、図９（ａ）中の一点鎖線Ｌ２によって示される光路を進行し、凹部６１ｅの側面から凹部６１ｅ内に入射する。この照射光は、導光部材６１と凹部６１ｅ内の空気との屈折率差から、光出射面６１ａと平行な方向に向けて屈折し、各ウェル２１に照射される。これにより、ウェル２１に入射する照射光は、ウェル２１の深さ方向に対して傾きをもつ。したがって、図９（ｂ）に示されるように、溶液Ｂに照射される照射光が比較的少なくなる。よって、溶液Ｂに照射光が照射されることにより生じる背景光ノイズを低減できる。これに対し、図９（ｃ）は、従来の方法によって、ウェル２１の深さ方向にウェル２１に照射光を照射した場合の照射光の光路を表す図である。図９（ｃ）に示されるように、従来の方法によれば、測定対象物Ａに加えて溶液Ｂにも多くの照射光が照射されるので、背景光ノイズが比較的大きくなる。

図１０は、測定対象物Ａ等からの測定光としての蛍光を測定した結果を表す図である。横軸は各ウェル２１に注入された細胞（測定対象物Ａ）の数を表しており、縦軸は蛍光検出比率を表している。各ウェル２１に注入される細胞は、蛍光染色色素によって染色されたものである。破線Ｌ３によって表された測定結果は、マイクロプレート２０の各ウェル２１に細胞と蛍光溶液（溶液Ｂ：ＦＩＴＣ）とを注入した後に、ウェル２１の深さ方向に対して平行な照射光をウェル２１に照射することによって細胞から発せられる蛍光を測定する従来の方法により得られた結果である。一点鎖線Ｌ４によって表された測定結果は、マイクロプレート２０の各ウェル２１に細胞と蛍光溶液とを注入した後に、光照射装置６０を用いて各ウェル２１に照射光を照射することによって細胞から発せられた蛍光を測定した結果である。この測定において、導光部材６０の各凹部６１ｅの深さは、４ｍｍである。二点鎖線Ｌ５によって表された測定結果は、マイクロプレート２０の各ウェル２１に細胞と蛍光溶液とを注入した後に、光照射装置６０を用いて各ウェル２１に照射光を照射することによって細胞から発せられた蛍光を測定した結果である。この測定において、光照射装置６０の導光部材６１の各凹部６１ｅの深さは、１ｍｍである。実線Ｌ６によって表された測定結果は、マイクロプレート２０の各ウェル２１に細胞のみを注入した後に、各ウェル２１に照射光を照射することによって細胞から発せられた蛍光を測定した結果である。したがって、図１０においては、実線Ｌ６によって表された結果に近いほど、蛍光溶液からの背景光ノイズが低減された結果となっている。図１０に示された測定結果によれば、一点鎖線Ｌ４及び二点鎖線Ｌ５によって表された、光照射装置６を用いて照射光を照射した場合の測定結果は、破線Ｌ３によって表された従来の照射光の照射方法による測定結果に比べて、実線Ｌ６によって表された測定結果に近いことがわかる。したがって、光照射装置６０によれば、背景光ノイズが低減されていることがわかる。

１０…光測定装置、２０…マイクロプレート、２１，２１ａ…ウェル、２２，６１ａ…主面、２３，６１ｈ…裏面、３０，４０…マイクロプレートストッカー、５０…運搬ベルト、６０…光照射装置、６１…導光部材、６１ｂ，６１ｃ…側面、６１ｅ，６１ｇ…凹部、６１ｆ…底面、６２…光源装置、６２ａ…フレーム、６２ｂ，６２ｄ…ＬＥＤ、６２ｃ，６２ｅ，６２ｍ…フィルタ、６２ｆ…キセノンランプ、６２ｇ…波長切替装置、６１ｉ，６２ｈ…光ファイバ、６２ｋ…光源、６２ｎ…コリメータレンズ、７０…励起光カットフィルタ、８０…検出器。

Claims

測定対象物を収容するための複数のウェルが設けられたマイクロプレートに対して照射光を照射するための光照射装置であって、
複数の凹部が形成された主面と、該主面と略直交する側面と、を有する導光部材と、
前記導光部材の前記側面から前記導光部材に前記照射光を入射する光源と、
を備え、
前記凹部は、前記主面に開口を有し、
前記導光部材は、前記ウェルの底面と前記凹部の前記開口とが対向するように配置可能であり、前記側面から前記導光部材に入射される前記照射光は、前記凹部の側面において屈折及び反射され、複数の前記凹部の前記開口からそれぞれ出射される、
ことを特徴とする光照射装置。
前記凹部は円柱形状の窪みである、
ことを特徴とする請求項１に記載の光照射装置。
前記凹部の底面は平坦である、
ことを特徴とする請求項１又は請求項２に記載の光照射装置。
前記凹部の底面は鏡面加工されている、
ことを特徴とする請求項３に記載の光照射装置。
測定対象物を収容するための複数のウェルが設けられたマイクロプレートと、前記マイクロプレートに対して照射光を照射するための光照射装置と、を含む光測定装置であって、
前記光照射装置は、複数の凹部が形成された主面及び該主面と略直交する側面を有する導光部材と、前記導光部材の前記側面から前記導光部材に前記照射光を入射する光源と、を備え、
前記凹部は、前記主面に開口を有し、
前記導光部材は、前記ウェルの底面と前記凹部の前記開口とが対向するように配置され、前記導光部材の前記側面から前記導光部材に入射される前記照射光は、前記凹部の側面において屈折及び反射され、複数の前記凹部の前記開口からそれぞれ射出されて、前記マイクロプレートの前記ウェルの前記底面に入射される、
ことを特徴とする光測定装置。