JP6655125B2 - 細胞観察装置及び細胞観察方法 - Google Patents

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Description

本発明は、細胞を含む試料から電圧印加に伴い発せられた光を測定する細胞観察装置及び細胞観察方法に関する。
創薬分野では、細胞などの試料に投与した薬品の影響を、細胞から放出された光を測定して評価する場合がある。特許文献１には、細胞が配置される複数のウェルが配列されたマルチウェルプレートを対象にウェル内の観察領域に電界を発生させるための電極アレイを備えた測定装置が開示されている。この電極アレイは、２枚の平行平板電極である陰極及び陽極からなる。また、特許文献２には、細胞の電場刺激に応じた生物学的応答を蛍光検出によってモニターする測定装置が開示され、この測定装置には正極及び負極からなる同軸ケーブルの形状の電極対を、細胞が配置されたウェルに配置可能な構成が採用されている。
特表２００７−５３４９２７号公報 特表２００５−５１４９０９号公報
しかしながら、上記特許文献１に記載の測定装置では、細胞が配置されるウェル内の観察領域としては、陰極と陽極との中間の円形状領域とされている。そのために、プレートに配列された複数のウェルに対して観察領域を適切に設定することが困難な傾向にある。また、上記特許文献２に記載の測定装置では、ウェル内の観察領域は特に設定されていない。
そこで、本発明は、かかる課題に鑑みて為されたものであり、複数配列されたウェル内の試料からの光を高感度に解析することが可能な細胞観察装置及び細胞観察方法を提供することを目的とする。
上記課題を解決するため、本発明の一形態に係る細胞観察装置は、細胞を含む試料を保持するウェルが複数配列されたマイクロプレートによって保持された細胞から放出された光を測定する細胞観察装置であって、マイクロプレートを載置するための載置部と、陽極と陰極とを含む電極対が複数配列された電気刺激部と、マイクロプレートのウェル内に電極対が配置されるように、電気刺激部の位置を制御する位置制御部と、マイクロプレートのウェル内の試料からの光を検出する光検出部と、光検出部による検出結果に応じて得られた光強度分布を対象に、ウェルの境界の位置を特定し、ウェルの境界の位置を基に解析領域を設定し、解析領域の光強度を解析することによって、試料に関する解析情報を取得する情報解析部と、を備える。
或いは、本発明の他の形態に係る細胞観察方法は、細胞を含む試料を保持するウェルが複数配列されたマイクロプレートによって保持された細胞から放出された光を測定する細胞観察方法であって、マイクロプレートを載置部に載置する載置ステップと、陽極と陰極とを含む電極対が複数配列された電気刺激部に対して、マイクロプレートのウェル内に電極対が配置されるように、位置を制御する位置制御ステップと、マイクロプレートのウェル内の試料からの光を検出する光検出ステップと、光検出ステップにおける検出結果に応じて得られた光強度分布を対象に、ウェルの境界の位置を特定し、ウェルの境界の位置を基に解析領域に設定し、解析領域の光強度を解析することによって、試料に関する解析情報を取得する情報解析ステップと、を備える。
本発明によれば、複数配列されたウェル内の試料からの光を高感度に解析することが可能になる。
本発明の好適な一実施形態に係る細胞観察装置１の概略構成を示す図である。 図１のマイクロプレート２０の構成を示す斜視図である。 図１のマイクロプレート２０の断面構造を示す側面断面図である。 図１の電気刺激部１６の一部破断断面図である。 図１の細胞観察装置１の試料Ｓの光測定時の動作を示すフローチャートである。 図５における解析領域の決定動作の詳細を示すフローチャートである。 解析領域の決定動作時の電気刺激部１６とマイクロプレート２０との位置関係を示す一部破断断面図である。 解析領域の決定動作時にデータ解析装置５０によって取得された電極対１７の反射像を含む２次元光像Ｇ１を示す図である。 図１の細胞観察装置１の試料Ｓの光測定時の別の動作を示すフローチャートである。 解析領域の決定動作時にデータ解析装置５０によって取得された電極対１７の反射像を含む２次元光像Ｇ１を示す図である。 図１の細胞観察装置１の試料Ｓの光測定時の別の動作を示すフローチャートである。 図１１における解析領域の決定動作の詳細を示すフローチャートである。 解析領域の決定動作時の電気刺激部１６とマイクロプレート２０との位置関係を示す一部破断断面図である。 動画像取得部４０によって撮像されたウェル２１の画像において設定される解析領域の範囲を示す図である。 動画像取得部４０によって撮像されたウェル２１の画像において設定される解析領域の範囲を示す図である。 本実施形態の変形例にかかる電極対１７の構造と、それに対応してデータ解析装置５０によって設定される解析領域のイメージを示す図である。 本実施形態の変形例にかかる電極対１７の構造と、それに対応してデータ解析装置５０によって設定される解析領域のイメージを示す図である。 細胞観察装置１において電気刺激を行っていない場合に取得された９６個の各ウェル２１毎の二次元光像の解析領域における平均蛍光強度の時間変化の測定結果を示す図である。 細胞観察装置１において電気刺激を行った場合に取得された９６個の各ウェル２１毎の二次元光像の解析領域における平均蛍光強度の時間変化の測定結果を示す図である。 図１８及び図１９の測定結果から１つのウェルに対応する測定結果を抽出して示す図である。
以下、添付図面を参照しながら本発明による細胞観察装置、及び細胞観察方法の実施の形態を詳細に説明する。なお、図面の説明において同一の要素には同一の符号を付し、重複する説明を省略する。また、各図面は説明用のために作成されたものであり、説明の対象部位を特に強調するように描かれている。そのため、図面における各部材の寸法比率は、必ずしも実際のものとは一致しない。
図１は、本発明による細胞観察装置１の一実施形態を模式的に示す構成図である。また、図２は、マイクロプレート２０の構成の一例を示す斜視図である。また、図３は、図２に示したマイクロプレート２０の断面構造を示す側面断面図である。本実施形態による細胞観察装置１は、試料ケースとしてマイクロプレート２０を用い、マイクロプレート２０によって保持された状態で測定位置Ｐに配置された試料Ｓからの蛍光を測定するための装置である。
また、試料Ｓは所定の細胞を含む。所定の細胞には、例えば神経細胞がある。また、本実施形態における細胞観察装置及び細胞観察方法は、蛍光測定以外にも、例えば燐光や発光など、試料から放出された光を測定する光測定全般に適用可能である。以下、細胞観察装置１の構成について説明する。
図１に示す細胞観察装置１は、データ取得装置１０、位置制御コントローラ（位置制御部）３０、撮像制御コントローラ３２、及びデータ解析装置（情報解析部）５０を備えて構成されている。データ取得装置１０は、蛍光測定の対象となる細胞を保持したマイクロプレート２０が内部に収容される暗箱１５と、暗箱１５の内部に設置されて測定位置Ｐに配置された試料Ｓからの蛍光の測定に用いられる動画像取得部４０とを有している。
本実施形態において試料ケースとして用いられているマイクロプレート２０は、図２及び図３に示すように、複数のウェル（保持部）２１が二次元アレイ状に配列された板状部材であり、その複数のウェル２１のそれぞれにおいて、試料Ｓを保持可能な構成となっている。ウェル２１の断面形状としては、円形状、楕円形状、又は矩形状等が挙げられる。図２に示した構成例では、複数のウェル２１として、８×１２＝９６個の円形状のウェル２１が二次元アレイ状に配置されている。また、このマイクロプレート２０の底面２２は、試料Ｓに照射される蛍光測定用の励起光、及び試料Ｓから放出される蛍光を透過可能な材質によって形成されている。なお、一般に細胞観察装置１においては、マイクロプレート２０の底面２２は、測定対象となる試料Ｓから放出された光を透過可能な材質によって形成されていれば良い。
暗箱１５内においては、マイクロプレート２０は、蛍光観察用の開口を有するマイクロプレートホルダ（載置部）１１に載置されている。また、これらのマイクロプレート２０及びマイクロプレートホルダ１１を、暗箱１５内で所定の方向（図１中においては、右側から左側へと向かう方向）に搬送するマイクロプレート搬送機構１２が、暗箱１５内に設置されている。
搬送機構１２でのマイクロプレート２０の搬送方向に対して搬入側となる暗箱１５の一方側には、試料Ｓが保持された測定前のマイクロプレート２０を所定枚数（例えば、２５枚）ストックしておくための搬入側マイクロプレートストッカー１３が設置されている。また、マイクロプレート２０の搬送方向に対して搬出側となる暗箱１５の他方側には、測定後のマイクロプレート２０をストックしておくための搬出側マイクロプレートストッカー１４が設置されている。
このような構成において、搬入側マイクロプレートストッカー１３から暗箱１５内へと搬入されたマイクロプレート２０は、マイクロプレートホルダ１１によって保持されるとともに搬送機構１２によって搬送される。そして、マイクロプレート２０は測定位置Ｐで一旦停止させられ、この状態で、マイクロプレート２０によって保持された試料Ｓに対して必要な光測定が行われる。測定完了後、マイクロプレート２０は再び搬送機構１２によって搬送され、搬出側マイクロプレートストッカー１４へと搬出される。なお、図１においては、搬送機構１２、及びストッカー１３、１４については、マイクロプレート２０を搬入、搬送、搬出するための具体的な構成の図示を省略している。
蛍光測定の実行時にマイクロプレート２０及び試料Ｓが配置される測定位置Ｐの上方には、マイクロプレート２０のウェル２１内に挿入されて試料Ｓに電界を発生させるための電気刺激部１６が設置されている。また、測定位置Ｐの下方には、ウェル２１内に収容された試料Ｓからマイクロプレート２０の底面２２を介して放出される蛍光の検出に用いられる動画像取得部（光検出部）４０が設置されている。
動画像取得部４０は、マイクロプレート２０のウェル２１内に保持された試料Ｓから放出された光を含むマイクロプレート２０の二次元の光強度分布を表す二次元光像を検出して、二次元光像の動画像データを取得する動画像取得手段である。検出される二次元光像としては、少なくとも１つのウェル２１内に保持された試料Ｓから放出された光を含む光強度分布であればよい。この動画像取得部４０は、撮像装置４５と、導光光学系４１と、光学フィルタ部４２と、励起光源４３とによって構成されている。撮像装置４５は、複数の画素が二次元に配列された二次元画素構造を有し、試料Ｓから放出される蛍光による二次元の光検出画像である蛍光画像を検出する。この撮像装置４５としては、例えば高感度のＣＣＤカメラやＣＭＯＳイメージカメラを用いることができる。また、必要があれば、カメラの前段にイメージ増倍管、リレーレンズ等を配置して動画像取得部４０を構成しても良い。なお、動画像取得部４０は、静止画を取得してもよく、動画及び／又は静止画を取得する画像取得部としての機能を有する。
また、マイクロプレート２０が配置される測定位置Ｐと、撮像装置４５との間には、導光光学系４１が設置されている。導光光学系４１は、複数のウェル２１のそれぞれに試料Ｓが保持されたマイクロプレート２０を底面２２側からみた二次元光像を撮像装置４５へと導く光学系である。導光光学系４１の具体的な構成については、マイクロプレート２０及び撮像装置４５の構成等に応じ、必要な機能（例えば集光機能、光像縮小機能等）を実現可能な光学素子によって適宜構成すれば良い。そのような光学素子としては、例えばテーパファイバがある（特開２００１−１８８０４４号公報参照）。また、導光光学系４１としては、凹凸を有する導光部材を有する光照射装置を用いる構成でもよい（特開２０１０−２３０３９７号公報および特開２０１０−２３０３９６号公報参照）。
また、図１においては、さらに、導光光学系４１と撮像装置４５との間に、必要に応じて蛍光の導光光路上への光学フィルタの配置、切換等を行うことが可能な光学フィルタ部４２が設置されている。ただし、このような光学フィルタ部４２については、不要であれば設けなくても良い。
励起光源４３は、試料Ｓに対して蛍光測定用の励起光を供給するための励起光供給手段である。励起光源４３の具体的な構成としては、蛍光測定の対象となる試料Ｓの種類、試料Ｓに照射する励起光の波長等に応じて適宜構成すれば良いが、例えば、光を供給する照明光源と、励起光の波長の選択、切換を行うための光学フィルタ部とによって構成することができる。また、試料Ｓに対して行われる光測定の種類により、励起光の供給が不要な場合には、励起光源４３を設けない構成としても良い。
本実施形態においては、導光光学系４１は、マイクロプレート２０及び試料Ｓからの二次元光像を撮像装置４５へと導くとともに、励起光源４３からの励起光を試料Ｓへと導くことが可能な光学系として構成される。このような光学系は、例えば、マイクロプレート２０からの蛍光を通過させるとともに、励起光源４３からの励起光を反射させるダイクロイックミラー等を用いて構成することができる。なお、図１においては、導光光学系４１における蛍光及び励起光の光路を、それぞれ実線及び破線によって模式的に示している。
次に、電気刺激部１６の構成について詳細に説明する。図４は、電気刺激部１６がマイクロプレート２０に挿入された状態での電気刺激部１６の一部破断断面図である。電気刺激部１６は、マイクロプレート２０に向けて垂直に伸びる複数の電極対１７が２次元的に配列されるようにベース部１８に固定された構造を有している。詳細には、電極対１７は、マイクロプレート２０のウェル２１に対向して伸びるように、マイクロプレート２０の複数のウェル２１の二次元アレイ状の配列に対応して二次元状に配列されている。それぞれの電極対１７は、先端が開口された円筒状の形状を有する陰極１７ａと、陰極１７ａの中心軸上に配置されるように陰極１７ａ内部に挿入された棒状（例えば、円柱状の形状）の陽極１７ｂとによって構成され、陰極１７ａの外径がウェル２１の内径よりも小さくされている。なお、陰極１７ａの円筒状の形状としては、断面が円形状であってもよいし、楕円形状であってもよい。また、電極対１７は、陽極１７ｂの先端が陰極１７ａの先端上の開口面から所定距離（例えば、１μｍ以上１．０ｍｍ以下の範囲）だけ引っ込むような構造、すなわち、陽極１７ｂの先端のベース部１８からの距離が、陰極１７ａの先端のベース部１８からの距離よりも所定距離だけ小さくされた形状を有する。これにより、円筒状の形状で陰極１７ａ内に棒状の陽極１７ｂが収まり、陰極１７ａの先端から陽極１７ｂが突出せず、陰極１７ａの先端と陽極１７ｂの先端が同じ高さとならない構成となっている。ここで、電極対１７は、陰極１７ａと陽極１７ｂとがそれぞれ一部材によって構成されるものには限定されず、どちらか或いは両方が複数部材によって構成されていてもよい。
また、電気刺激部１６には、電極対１７をベース部１８を介して支持する移動機構１９が設けられている。移動機構１９は、電極対１７をマイクロプレート２０に対して接近或いは後退させるように移動させる駆動機構であり、試料Ｓの観察時にそれぞれの電極対１７を対向するウェル２１内に配置させるように駆動すると共に、試料Ｓの観察終了時に電極対１７をウェル２１内から離脱させるように駆動する。
このような構成のデータ取得装置１０に対し位置制御コントローラ（位置制御部）３０、撮像制御コントローラ３２が接続されている。位置制御コントローラ３０は、移動機構１９に電気的に接続され、試料Ｓの光測定開始時に、電極対１７をマイクロプレート２０のウェル２１内に配置させるように移動機構１９を制御する。また、位置制御コントローラ３０は、電極対１７にも電気的に接続され、電極対１７の陰極１７ａと陽極１７ｂとの間に所定の電位差が生じるように、陰極１７ａと陽極１７ｂにそれぞれ所定の電圧を印加する。撮像制御コントローラ３２は、励起光源４３による励起光の照射、及び撮像装置４５によるマイクロプレート２０における二次元の蛍光画像の撮像を制御する。
さらに、位置制御コントローラ３０及び撮像制御コントローラ３２に対し、データ解析装置５０が接続されている。このデータ解析装置５０は、動画像取得部４０によって取得された光検出画像を含む動画像データを撮像制御コントローラ３２を経由して取得し、動画像データを対象にして解析処理を行う解析処理手段である。また、データ解析装置５０は、位置制御コントローラ３０及び撮像制御コントローラ３２を介して、データ取得装置１０の各部の動作を制御することによって、細胞観察装置１における試料Ｓに対する蛍光測定を制御する（詳細は後述する）。また、図１においては、データ解析装置５０には、測定結果等を表示する表示装置６１と、データの入力や蛍光測定に必要な指示の入力等に用いられる入力装置６２とが接続されている。
以下、図５及び図６を参照しながら、細胞観察装置１による試料Ｓの光測定時の動作を説明すると共に、本実施形態にかかる細胞観察方法について詳述する。図５は、細胞観察装置１の試料Ｓの光測定時の動作を示すフローチャート、図６は、図５における解析領域の決定動作の詳細を示すフローチャートである。
まず、細胞の光測定の開始入力が入力装置６２を介して入力されると、データ解析装置５０において、処理対象の動画像データに含まれる二次元光像もしくは静止画像における解析領域が決定される（ステップＳ０１：解析領域決定ステップ）。次に、マイクロプレートストッカー１３内の試料Ｓが保持された測定対象のマイクロプレート２０が、マイクロプレートホルダ１１に載置された状態で、マイクロプレート搬送機構１２によって暗箱１５内の測定位置Ｐまで搬送される（ステップＳ０２：載置ステップ）。そして、データ解析装置５０によって移動機構１９を利用して電気刺激部１６の位置が制御されることにより、複数の電極対１７の先端がマイクロプレート２０の対応するウェル２１にそれぞれ挿入される（ステップＳ０３：位置制御ステップ）。このとき、電極対１７は、陰極１７ａの先端がウェル２１の底面に所定距離接近するまでウェル２１内に挿入される。これにより、陽極１７ｂは、その先端がウェル２１の底面から所定距離（例えば、１μｍ〜１．０ｍｍ）ほど離れた状態で配置される。
その後、データ解析装置５０によって位置制御コントローラ３０が制御されることによって、電極対１７に電圧が供給されてマイクロプレート２０のウェル２１内に電界が生じる（電気刺激の付与）。電界が発生した状態で、動画像取得部４０によってウェル２１内に保持された試料Ｓから放出された蛍光を含むマイクロプレート２０の二次元光像が検出され、その二次元光像を表す動画像データがデータ解析装置５０によって取得される。なお、動画像取得部４０のフレームレートは電圧印加の周波数よりも高く設定されている。さらに、取得された動画像データに含まれる二次元光像を対象に、データ解析装置５０により、マイクロプレートホルダ１１上のマイクロプレート２０の電極対１７に対面する領域の一部に設定された解析領域における光強度が解析されることによって、試料Ｓに関する解析情報が取得されて表示装置６１に出力される（ステップＳ０４：光検出ステップ、情報解析ステップ）。試料Ｓ中の細胞には膜電位感受性蛍光色素が付与されているので、電気刺激を印加したときには、細胞のイオンチャネルに開閉に伴う膜電位の変化が蛍光の強度変化として観察される。このような解析領域における光強度の解析手法としては、解析領域における画素値の変化の振幅、変化率、ピーク周期、ピーク回数、ピーク時間、立ち上がり時間、立ち下がり時間、及びピーク変動幅等を評価値として算出する手法が考えられる。
図６に移って、図５のステップＳ０１の解析領域決定ステップの詳細手順を説明する。最初に、マイクロプレートストッカー１３内のウェル２１が空の状態の参照用のマイクロプレート２０が、マイクロプレートホルダ１１に載置された状態で、マイクロプレート搬送機構１２によって暗箱１５内の測定位置Ｐまで搬送される（ステップＳ１１）。次に、データ解析装置５０によって電気刺激部１６の位置が制御されることにより、複数の電極対１７の先端がマイクロプレート２０の対応するウェル２１にそれぞれ挿入される（ステップＳ１２）。図７には、この時の電気刺激部１６とマイクロプレート２０との位置関係を示しており、電極対１７は、陰極１７ａの先端がウェル２１の底面に所定距離接近するまでウェル２１内に挿入される。これにより、陽極１７ｂは、その先端がウェル２１の底面から所定距離（例えば、１μｍ〜１．０ｍｍ）ほど離れた状態で配置される。
その後、励起光源４３によってマイクロプレート２０の底面２２（図３）に照明光を照射させながら、動画像取得部４０によって、複数のウェル２１を含むマイクロプレート２０の二次元光像が検出され、その二次元光像を表す動画像データ又は静止画像データがデータ解析装置５０によって取得される（ステップＳ１３）。この２次元光像には当然に電極対１７の反射像も映し出される。さらに、取得された動画像データに含まれる二次元光像を対象に、データ解析装置５０により、電極対１７の陽極１７ｂ及び陰極１７ａの先端の位置が特定され、記憶される（ステップＳ１４）。図８（ａ）には、データ解析装置５０によって取得された電極対１７の反射像を含む２次元光像Ｇ１の一例を示している。同図に示すように、２次元光像Ｇ１には、リング状の陰極１７ａの端部の反射像Ｇ１１及び円形の陽極１７ｂの反射像Ｇ１２が映し出されている。データ解析装置５０は、輝度差を検出することにより、円形の陽極１７ｂの反射像Ｇ１２の範囲を、陽極１７ｂの先端をウェル２１の底面上に延長した領域として特定する。
そして、データ解析装置５０により、特定された反射像Ｇ１２の範囲を含む領域が二次元光像における解析領域として設定され、記憶される（ステップＳ１５）。図８（ｂ）には、データ解析装置５０によって設定される２次元光像Ｇ１上の解析領域の一例を示している。同図に示すように、２次元光像Ｇ１には、円形の陽極１７ｂの反射像Ｇ１２を含むような矩形の解析領域Ｒ１が設定される。この解析領域Ｒ１の形状としては矩形には限定されず、円形、多角形等の他の形状であってもよい。このように、それぞれのウェル２１に対する解析領域の位置、座標もしくは範囲を記憶することで、光測定時に同じ種類のマイクロプレートを用いる場合、マイクロプレート２０をマイクロプレートホルダ１１に載置するたびに解析領域を設定する必要がなく、光測定時間を短縮できる。
ただし、細胞観察装置１による解析領域の設定は、試料Ｓを対象にした光測定動作の途中で実行されてもよい。この場合、測定に用いるマイクロプレート毎に解析領域を設定するので、解析領域を精度よく設定できる。図９は、このような場合の細胞観察装置１による試料Ｓの光測定時の動作手順を示している。
この場合、まず、細胞の光測定の開始入力が入力装置６２を介して入力されると、マイクロプレートストッカー１３内の試料Ｓが保持された測定対象のマイクロプレート２０が、マイクロプレートホルダ１１に載置された状態で、マイクロプレート搬送機構１２によって暗箱１５内の測定位置Ｐまで搬送される（ステップＳ２１：載置ステップ）。次に、励起光源４３によってマイクロプレート２０の底面２２（図３）に照明光を照射させながら、動画像取得部４０によって、９６個のウェル２１を含むマイクロプレート２０の二次元光像が検出され、その二次元光像を表す動画像データがデータ解析装置５０によって取得される（ステップＳ２２）。この２次元光像には、ウェル２１の反射像、場合によっては試料Ｓから発せられる蛍光像も映し出される。さらに、取得された動画像データに含まれる二次元光像を対象に、データ解析装置５０により、ウェル２１の境界の位置が特定され、その境界位置を基に解析領域が決定される（ステップＳ２３）。図１０（ａ）には、データ解析装置５０によって取得されたウェル２１の反射像を含む２次元光像Ｇ２の一例を示している。同図に示すように、２次元光像Ｇ２には、円形のウェル２１の反射像Ｇ２２が映し出されている。データ解析装置５０は、輝度差を検出することにより円形のウェル２１の反射像Ｇ２２の境界を特定する。そして、図１０（ｂ）に示すように、データ解析装置５０により、２次元光像Ｇ２において反射像Ｇ２２の境界の中心に矩形の解析領域Ｒ２が設定される。この解析領域Ｒ２としては、反射像Ｇ２２の境界内の中心点を含む所定の画素幅を有する矩形領域が設定され、解析領域Ｒ２の画素幅としては、解析領域Ｒ２が陽極１７ｂの先端をウェル２１の底面上に延長した領域を含むような十分な値に予め設定される。この解析領域Ｒ２の形状としては矩形には限定されず、円形、多角形等の他の形状であってもよい。
その後、データ解析装置５０によって移動機構１９を利用して電気刺激部１６の位置が制御されることにより、複数の電極対１７の先端がマイクロプレート２０の対応するウェル２１にそれぞれ挿入される（ステップＳ２４：位置制御ステップ）。次に、データ解析装置５０によって位置制御コントローラ３０が制御されることによって、電極対１７に電圧が供給されてマイクロプレート２０のウェル２１内に電界が発生する（電気刺激の付与）。電界が発生した状態で、動画像取得部４０によってウェル２１内に保持された試料Ｓから放出された蛍光を含むマイクロプレート２０の二次元光像が検出され、その二次元光像を表す動画像データもしくは静止画像データがデータ解析装置５０によって取得される。さらに、取得された動画像データに含まれる二次元光像を対象に、データ解析装置５０により、マイクロプレートホルダ１１上のマイクロプレート２０の電極対１７に対面する領域の一部に設定された解析領域における光強度が解析されることによって、試料Ｓに関する解析情報が取得されて表示装置６１に出力される（ステップＳ２５：光検出ステップ、情報解析ステップ）。
また、上述した細胞観察装置１による解析領域の設定は、マイクロプレート２０の二次元光像に表れた電極対１７の反射像を参照して実行されてもよい。図１１及び図１２は、このような場合の細胞観察装置１による試料Ｓの光測定時の動作手順を示している。
この場合、まず、マイクロプレートストッカー１３内の試料Ｓが保持された測定対象のマイクロプレート２０が、マイクロプレートホルダ１１に載置された状態で、マイクロプレート搬送機構１２によって暗箱１５内の測定位置Ｐまで搬送される（ステップＳ３１：載置ステップ）。そして、データ解析装置５０によって移動機構１９を利用して電気刺激部１６の位置が制御されることにより、複数の電極対１７の先端がマイクロプレート２０の対応するウェル２１にそれぞれ挿入される（ステップＳ３２：位置制御ステップ）。次に、データ解析装置５０において、処理対象の動画像データに含まれる二次元光像における解析領域が決定される（ステップＳ３３：解析領域決定ステップ）。
その後、データ解析装置５０によって位置制御コントローラ３０が制御されることによって、電極対１７に電圧が供給されてマイクロプレート２０のウェル２１内に電界が発生する（電気刺激の付与）。電界が生じた状態で、動画像取得部４０によってウェル２１内に保持された試料Ｓから放出された蛍光を含むマイクロプレート２０の二次元光像が検出され、その二次元光像を表す動画像データがデータ解析装置５０によって取得される。さらに、取得された動画像データに含まれる二次元光像を対象に、データ解析装置５０により、マイクロプレートホルダ１１上のマイクロプレート２０の電極対１７に対面する領域の一部に設定された解析領域における光強度が解析されることによって、試料Ｓに関する解析情報が取得されて表示装置６１に出力される（ステップＳ３４：光検出ステップ、情報解析ステップ）。
図１２に移って、図１１のステップＳ３３の解析領域決定ステップの詳細手順を説明する。最初に、測定用のマイクロプレート２０が測定位置Ｐまで搬送されて電極対１７がウェル２１に挿入された状態（図１３）で、励起光源４３によってマイクロプレート２０の底面２２（図３）に照明光が照射される。そして、動画像取得部４０によって、少なくとも１つのウェル２１を含むマイクロプレート２０の二次元光像が検出され、その二次元光像を表す動画像データもしくは静止画像データがデータ解析装置５０によって取得される（ステップＳ４１）。なお、マイクロプレート２０の二次元光像としては、複数のウェル２１を含むことが好ましい。この場合、複数のウェルに対して一括して解析領域を設定することができる。この２次元光像には当然に電極対１７の反射像も映し出される。このとき、電極対１７の反射像は、陰極１７ａおよび陽極１７ｂの先端から反射された光に基づいている。さらに、取得された動画像データに含まれる二次元光像を対象に、データ解析装置５０により、図６のステップＳ１４，Ｓ１５と同様にして、二次元光像における解析領域が設定される（ステップＳ４２，Ｓ４３）。このとき、データ解析装置５０は、電極対１７の陰極１７ａもしくは陽極１７ｂの先端の反射像に基づいて、解析領域を設定する。具体的には、二次元光像から、陰極１７ａもしくは陽極１７ｂの先端の形状を認識し、その形状に基づいて、解析領域を設定する。
上述した細胞観察装置１による解析領域の設定方法では、陽極１７ｂの先端をウェル２１の底面上に延長した領域を含むような解析領域が設定されていたが、それ以外にも、試料Ｓに含まれる細胞が反応する電界強度の閾値、及び細胞がダメージを受ける電界強度の閾値に応じて、以下のように解析領域を設定してもよい。
図１４（ａ），（ｂ）及び図１５（ａ），（ｂ）には、動画像取得部４０によって撮像されたウェル２１の画像において設定される解析領域の範囲と、その画像に対応するウェル２１内の電界強度Ｅの分布を示している。
図１４（ａ）は、電極対１７に印加される電位が比較的小さい場合の解析領域の設定例であり、ウェル２１の反射像Ｇ４１の中心に検出された陽極１７ｂの反射像Ｇ４２を覆うように円形の解析領域Ｒ４１が設定される。この解析領域Ｒ４１は、その範囲の電界強度が、細胞が反応する電界強度の閾値Ｅ０と細胞がダメージを受ける電界強度の閾値Ｅ１との間の値となるように設定される。例えば、電極対１７の陽極１７ｂ先端からウェル２１の底面までの距離がｄであり、陽極１７ｂの反射像Ｇ４２の半径がａである場合には、解析領域Ｒ４１は、陽極１７ｂに対面するウェル２１上の一部の範囲として、反射像Ｇ４２の中心から半径Ｌ１の円形状に設定され、この半径Ｌ１はａ≦Ｌ１≦ａ＋ｄの範囲の値が設定される。ただし、試料Ｓの細胞の反応が活発な場合には、半径Ｌ１は０＜Ｌ１＜ａの範囲の値に設定されてもよい。
また、図１４（ｂ）は、電極対１７に印加される電位を比較的大きくした場合の解析領域の設定例であり、ウェル２１の反射像Ｇ４１の中心に検出された陽極１７ｂの反射像Ｇ４２を覆うように解析領域Ｒ４１より大きい解析領域Ｒ４２が設定される。この解析領域Ｒ４２は、陽極１７ｂの先端をウェル２１の底面上に延長した領域に加えその領域の外側のリング状の近傍領域も含み、その範囲の電界強度が、細胞が反応する電界強度の閾値Ｅ０と細胞がダメージを受ける電界強度の閾値Ｅ１との間の値となるように設定される。例えば、電極対１７の陽極１７ｂ先端からウェル２１の底面までの距離がｄであり、陽極１７ｂの反射像Ｇ４２の半径がａである場合には、解析領域Ｒ４２は、反射像Ｇ４２の中心から半径Ｌ２の円形状に設定され、この半径Ｌ２はａ＋ｄ＜Ｌ２≦ａ＋３×ｄの範囲の値が設定される。
また、図１５（ａ）は、電極対１７に印加される電位をさらに大きくした場合の解析領域の設定例であり、ウェル２１の反射像Ｇ４１の中心に検出された陽極１７ｂの反射像Ｇ４２の外側に、リング状の解析領域Ｒ４３が設定される。この解析領域Ｒ４３は、陽極１７ｂの先端をウェル２１の底面上に延長した領域を除いたその領域の外側のリング状の近傍領域であり、その範囲の電界強度が、細胞が反応する電界強度の閾値Ｅ０と細胞がダメージを受ける電界強度の閾値Ｅ１との間の値となるように設定される。すなわち、ウェル２１の中心の細胞がダメージを受けた領域を除くように解析領域が設定される。例えば、電極対１７の陽極１７ｂ先端からウェル２１の底面までの距離がｄであり、陽極１７ｂの反射像Ｇ４２の半径がａである場合には、解析領域Ｒ４３は、反射像Ｇ４２の中心に対応する位置を中心とした円形領域から半径Ｌ３の円形領域を除くように設定され、この半径Ｌ３は０＜Ｌ３≦ａの範囲の値が設定される。
また、図１５（ｂ）は、電極対１７によって印加される電位の分布が非対称な場合の解析領域の設定例であり、陽極１７ｂの反射像Ｇ４２の外側に、一部が切り欠かれたリング状の解析領域Ｒ４４が設定される。この解析領域Ｒ４４は、その範囲の電界強度が、細胞が反応する電界強度の閾値Ｅ０と細胞がダメージを受ける電界強度の閾値Ｅ１との間の値となるように設定される。すなわち、陽極１７ｂの反射像Ｇ４２の外側の電界強度が小さく細胞の反応が弱い部分を除いた解析領域が設定される。
以上説明した細胞観察装置１及び細胞観察装置１による細胞観察方法によれば、マイクロプレート２０に複数配列されたウェル２１内に陽極１７ｂと陰極１７ａとを含む電極対１７が配置され、この電極対１７により電界が発生した状態でウェル２１内の試料Ｓからの蛍光が動画像取得部４０によって検出され、データ解析装置５０によって、その検出結果に応じた二次元光像を対象にウェル２１上の陽極１７ｂに対面する領域の一部が解析領域に設定され、解析領域の光強度を基に解析情報が取得される。これにより、電気刺激によって反応が生じた細胞を含む範囲が効率的に解析され、ノイズに起因する光強度に対する細胞の反応に起因する光強度の比率を大きくすることができる。その結果、細胞を含む試料Ｓからの蛍光を高感度に解析することが可能となる。特に、マイクロプレート２０に播種された細胞を観察対象にする場合には、ウェル２１上に均一に細胞を配置させることは困難である。細胞観察装置１によれば検出領域を最適化して高感度な解析結果を得ることができる。
上記の細胞観察装置１においては、陽極１７ｂの先端をウェル２１底面上に延長した領域を含むように解析領域が設定されるので、ウェル２１上において印加される電界の強度が高い領域を解析領域に設定することができる結果、試料Ｓからの蛍光をさらに高感度に解析することができる。
また、陽極１７ｂの先端を延長した領域及び該領域の近傍領域を含むように解析領域を設定することにより、ウェル２１上において細胞の反応が比較的弱い場合であってもウェル２１上において印加される電界の強度が高い領域を広く解析領域に設定することができる結果、試料Ｓからの蛍光をさらに高感度に解析することができる。
また、陽極１７ｂの先端を延長した領域を除く該領域の近傍領域を含むように解析領域を設定することにより、ウェル２１上において印加電界が強すぎて細胞にダメージが生じた場合であっても、反応が生じた細胞の範囲を効率的に解析領域に設定することができる。すなわち、陽極１７ｂの先端の延長領域においては、細胞に電極が接触したり電界が強すぎたりして細胞が反応しないためにその延長領域を解析対象から除く一方、その延長領域の近傍においては細胞が反応しやすいためにその近傍が解析領域として設定される。その結果、反応が生じた細胞を対象にノイズの少ない解析結果を得ることができる。
なお、本発明は、前述した実施形態に限定されるものではない。例えば、データ解析装置５０による解析領域の設定は、電極対１７に供給する電位に応じて解析領域の大きさを変更するように、次のように実行されてもよい。すなわち、印加電位をＥ２に設定した場合に図１４（ａ）に示したような半径Ｌ１の解析領域Ｒ４１を設定した後に、印加電圧をＥ３＝ｎ×Ｅ２（ｎは２以上の整数）に増加させた場合を想定する。この場合、陽極１７ｂの反射像Ｇ４２の縁とウェル２１の反射像Ｇ４１の縁との距離をＧとすると、半径Ｌ２＝ａ＋Ｌ４となるような図１４（ｂ）に示したような解析領域Ｒ４２が設定され、このときの半径の加算値Ｌ４は、印加電圧の倍率の増加に応じて増加された値Ｌ４＝（１−１／ｎ）×Ｇに設定される。
また、電気刺激部１６の電極対１７の構造は同軸形状には限定されず、様々な形状を採用できる。さらに、データ解析装置５０は、この電極対１７の構造に対応して解析領域を設定することができる。
上述したように、データ解析装置５０は、マイクロプレートホルダ１１に載置されたマイクロプレート２０の二次元光像に基づいて、ウェル２１に対して解析領域を設定する。このとき、データ解析装置５０は、マイクロプレート２０の二次元光像に含まれる対象物の反射像に基づいて解析領域を設定する構成としてもよい。この場合、対象物としては、マイクロプレート２０のウェル２１の内壁であっても良いし、電気刺激部１６の陰極１７ａもしくは陽極１７ｂであってもよく、また、それらには限定されない。これらの場合、複数のウェルに対して、解析領域を適切に設定することができる。
図１６及び図１７には、本実施形態の変形例にかかる電極対１７の構造と、それに対応してデータ解析装置５０によって設定される解析領域のイメージを示している。図１６（ａ）〜（ｄ）及び図１７（ａ）〜（ｂ）には、それぞれ、右側には電極対１７のマイクロプレート２０の底面に垂直な方向に沿った断面、左側には電極対１７のマイクロプレート２０のマイクロプレート２０の底面沿った断面図をウェル２１の反射像Ｇ４１の内側に設定される解析領域の範囲Ｒ５１〜Ｒ５６と共に示している。また、反射像Ｇ４１内部の点線は電極対１７によって形成される電位の等電位線を示している。これらの図に示すように、電極対１７は、図１６（ａ）に示す同軸形状の他、図１６（ｂ）に示すような棒状の陽極１７ｂと平板状の陰極１７ａの組み合わせの構造、図１６（ｃ）に示すような２本の棒状の陽極１７ｂで平板状の陰極１７ａを挟むような構造、図１６（ｄ）に示すような２本の棒状の陽極１７ｂで棒状の陰極１７ａを挟むような構造、図１７（ａ）に示すような棒状の陽極１７ｂと棒状の陰極１７ａの組み合わせの構造、及び図１７（ｂ）に示すような棒状の陽極１７ｂとそれに対向する２本の棒状の陰極１７ａの組み合わせの構造を採用することができる。また、平板状の陽極と陰極を平行に配置した平行電極対の構造を採用してもよい。いずれの電極対１７の構造に対して設定される解析領域の範囲Ｒ５１〜Ｒ５６であっても、マイクロプレート２０の底面上の陽極１７ｂの先端に対面する領域の一部であって、陽極１７ｂの先端を延長した範囲を含み、陽極１７ｂの先端近傍の等電位線の形状に対応した範囲に設定される。
また、上述の実施例では、マイクロプレートストッカー１３内の試料Ｓが保持された測定対象のマイクロプレート２０が、マイクロプレートホルダ１１に載置された状態で、マイクロプレート搬送機構１２によって暗箱１５内の測定位置Ｐに搬送される構成としたが、マイクロプレート２０を手動で暗箱１５内の測定位置Ｐに配置する構成としてもよい。
上述した実施形態の細胞観察装置１及びそれを用いた細胞観察方法においては、試料Ｓとして筋肉を構成する心筋細胞（心筋を構成する細胞）や骨格筋細胞を測定対象としてもよい。心筋細胞や骨格筋細胞は、活動電位が引き金となって伸縮を行う。この際、カルシウムイオンが、細胞膜を介して細胞外から細胞内へ、又は細胞内から細胞外へ移動するため、カルシウムイオンに反応する色素で染色してその蛍光を観察することで、心筋細胞や骨格筋細胞の伸縮の様子が確認できる。通常、生体内の筋細胞は活動電位を制御するペースメーカー細胞により伸縮を行うが、ｉＰＳ細胞やＥＳ細胞などの幹細胞から生まれた心筋細胞や骨格筋細胞は、ペースメーカーとなる細胞が存在しなかったり、制御がうまくできなかったりする場合がある。ただ、このような筋細胞でも、細胞観察装置１を用いて外部から電気刺激を与えることで、活動電位を制御し、細胞を伸縮させることができる。近年、心筋細胞や骨格筋細胞を用いて創薬評価を行う需要が高まっている。特に、外部からの電気刺激を行う本実施形態は、通常のペーシング（pacing）に加え、薬効が拍動数に依存する化合物の評価を可能にし、また意図的に不整脈を起こさせることもできるので、様々な化合物の評価手法として有効なものである。
ここで、筋細胞を対象にした実施例について説明する。
マイクロプレート２０の９６個のウェル２１内に保持される試料Ｓとして、生後１〜４日のＳＤラットの心臓（心室）の心筋細胞を１ウェルあたり２×１０４個（cells）となるまで培養したものを用いた。このマイクロプレート２０としては、ウェル２１をコラーゲンＩコーティングしたものを用いた。また、心筋細胞はカルシウム色素（Cal520-AM）で染色した。
位置制御ステップ（図５：Ｓ０３）では、データ解析装置５０により、心筋細胞が保持されたウェル２１内に電極対１７が配置されるように制御される。その後の光検出ステップ（図５：Ｓ０４）では、データ解析装置５０の制御により、電極対１７に電圧が供給されてウェル２１内の心筋細胞に電気刺激が付与される。詳細には、電極対１７には、波高値が５Ｖで時間幅が５ｍｓの矩形波のパルス電圧を繰り返し周波数が１Ｈｚで５秒間印加される。この繰り返し周波数は０．５Ｈｚ〜２Ｈｚの範囲に設定されることが好ましい。同時に、データ解析装置５０により、電極対１７に電圧が印加された状態で１フレームあたり３１ｍｓ、つまり、フレームレートが３０フレーム／秒でマイクロプレート２０の二次元光像を表す動画像データが取得される。そして、データ解析装置５０により、取得された動画像データを用いて解析領域における蛍光強度が解析される。
図１８及び図１９には、本実施例において取得された９６個の各ウェル２１毎の二次元光像の解析領域における平均蛍光強度の時間変化の測定結果を示しており、図１８はパルス電圧による電気刺激を行っていない場合の測定結果、図１９はパルス電圧による電気刺激を行った場合の測定結果を示している。これらの測定結果においては、各ウェル２１毎の測定結果を、１列〜１２列及びＡ行〜Ｈ列の２次元で配列して示している。これらの測定結果により、パルス電圧によるペーシングを行っていない場合には、９６個のウェルの中の一部のウェルにはペースメーカーとなる細胞が働いて蛍光強度の変化がみられるが、全くペースメーカーが働いていないウェルも存在することがわかる。一方、パルス電圧によるペーシングを行っている場合には、９６個の全てのウェルで蛍光強度の変化が観測された。
さらに、図２０には、図１８及び図１９の測定結果のうちのＢ行３列のウェルのものを抽出して示しており、（ａ）が電気刺激を行っていない場合、（ｂ）が電気刺激を行った場合の結果を示している。このように、ペーシングなしの場合にはまだらなピークが観測されていたが、ペーシングを行った場合には電気刺激のタイミングＴ１に応じて周期的な蛍光ピークが観測され、心筋細胞のペーシング用途に上記の細胞観察装置および細胞観察方法が有効であることが確認できた。
なお、矩形波のパルス電圧を心筋細胞にランダムに印加することにより、不整脈の状態での観察にも上記の細胞観察装置および細胞観察方法は有効である。
本発明の一側面の細胞観察装置は、細胞を含む試料を保持する保持部が複数配列された試料ケースによって保持された細胞から放出された光を測定する細胞観察装置であって、試料ケースを載置するための載置部と、陽極と陰極とを含む電極対が複数配列された電気刺激部と、試料ケースの保持部内に電極対が配置されるように、電気刺激部の位置を制御する位置制御部と、試料ケースの保持部内の試料からの光を検出する光検出部と、光検出部による検出結果に応じて得られた光強度分布を対象に、保持部上の陽極に対面する領域の一部を解析領域に設定し、解析領域の光強度を解析することによって、試料に関する解析情報を取得する情報解析部と、を備える。
或いは、本発明の他の側面の細胞観察方法は、細胞を含む試料を保持する保持部が複数配列された試料ケースによって保持された細胞から放出された光を測定する細胞観察方法であって、試料ケースを載置部に載置する載置ステップと、陽極と陰極とを含む電極対が複数配列された電気刺激部に対して、試料ケースの保持部内に電極対が配置されるように、位置を制御する位置制御ステップと、試料ケースの保持部内の試料からの光を検出する光検出ステップと、光検出ステップにおける検出結果に応じて得られた光強度分布を対象に、保持部上の陽極に対面する領域の一部を解析領域に設定し、解析領域の光強度を解析することによって、試料に関する解析情報を取得する情報解析ステップと、を備える。
このような細胞観察装置、及び細胞観察方法によれば、試料ケースに複数配列された保持部内に陽極と陰極とを含む電極対が配置され、この電極対により電界が発生した状態で保持部内の試料からの光が光検出部によって検出され、情報解析部によって、その検出結果に応じた光強度分布を対象に保持部上の陽極に対面する領域の一部が解析領域に設定され、解析領域の光強度を基に解析情報が取得される。これにより、電気刺激によって反応が生じた細胞を含む範囲が効率的に解析され、ノイズに起因する光強度に対する細胞の反応に起因する光強度の比率を大きくすることができる。その結果、細胞を含む試料からの光を高感度に解析することが可能となる。
ここで、上記の細胞観察装置においては、情報解析部は、光強度分布における対象物の反射光像に基づいて、解析領域を設定する、ことが好適である。上記の細胞観察方法においては、情報解析ステップで、光強度分布における対象物の反射光像に基づいて、解析領域を設定する、ことが好適である。こうすれば、保持部上の陽極に対面する領域が容易に特定され、解析領域を効率的かつ正確に設定することができる。
また、上記対象物は、電気刺激部の陰極の先端、もしくは陽極の先端である、ことが好適である。この場合、解析領域をより正確に設定することができる。
さらに、上記対象物は、試料ケースの保持部の内壁である、ことも好適である。こうすれば、解析領域をより確実に設定することができる。
また、情報解析部は、陽極の先端を延長した領域を含むように解析領域を設定する、ことが好適である。かかる構成を採れば、保持部上において印加される電界の強度が高い領域を解析領域に設定することができる結果、試料からの光をさらに高感度に解析することができる。
また、情報解析部は、陽極の先端を延長した領域及び該領域の近傍領域を含むように解析領域を設定する、ことも好適である。かかる情報解析部を備えれば、保持部上において細胞の反応が比較的弱い場合であっても保持部上において印加される電界の強度が高い領域を広く解析領域に設定することができる結果、試料からの光をさらに高感度に解析することができる。
さらに、情報解析部は、陽極の先端を延長した領域を除く該領域の近傍領域を含むように解析領域を設定する、ことも好適である。かかる情報解析部を備えれば、保持部上において印加電界が強すぎて細胞にダメージが生じた場合であっても、反応が生じた細胞の範囲を効率的に解析領域に設定することができる。
１…細胞観察装置、１１…マイクロプレートホルダ（載置部）、１６…電気刺激部、１７…電極対、１７ａ…陰極、１７ｂ…陽極、２０…マイクロプレート（試料ケース）、２１…ウェル（保持部）、２２…底面、３０…位置制御コントローラ（位置制御部）、４０…動画像取得部（光検出部）、５０…データ解析装置（情報解析部）、Ｓ…試料。

Claims (8)

  1. 細胞を含む試料を保持するウェルが複数配列されたマイクロプレートによって保持された前記細胞から放出された光を測定する細胞観察装置であって、
    前記マイクロプレートを載置するための載置部と、
    陽極と陰極とを含む電極対が複数配列された電気刺激部と、
    前記マイクロプレートの前記ウェル内に前記電極対が配置されるように、前記電気刺激部の位置を制御する位置制御部と、
    前記マイクロプレートの前記ウェル内の前記試料からの光を検出する光検出部と、
    前記光検出部による検出結果に応じて得られた光強度分布を対象に、前記ウェルの境界の位置を特定し、前記ウェルの境界の位置を基に解析領域を設定し、前記解析領域の光強度を解析することによって、前記試料に関する解析情報を取得する情報解析部と、
    を備え、
    前記情報解析部は、前記光強度分布における前記陽極あるいは前記陰極の先端の像に基づいて前記解析領域をさらに設定する、
    細胞観察装置。
  2. 前記情報解析部は、前記光強度分布における輝度差に基づいて、前記ウェルの境界の位置を特定する、
    請求項１記載の細胞観察装置。
  3. 前記情報解析部は、前記電極対に印加される電位に応じて、前記解析領域の大きさを設定する、請求項１又は２に記載の細胞観察装置。
  4. 前記位置制御部は、筋細胞を含む前記試料を保持する前記ウェル内に前記電極対が配置されるように制御し、
    前記情報解析部は、前記電極対に繰り返しパルス電圧を印加した状態での前記解析領域の光強度を解析する、
    請求項１〜３のいずれか１項に記載の細胞観察装置。
  5. 細胞を含む試料を保持するウェルが複数配列されたマイクロプレートによって保持された前記細胞から放出された光を測定する細胞観察方法であって、
    前記マイクロプレートを載置部に載置する載置ステップと、
    陽極と陰極とを含む電極対が複数配列された電気刺激部に対して、前記マイクロプレートの前記ウェル内に前記電極対が配置されるように、位置を制御する位置制御ステップと、
    前記マイクロプレートの前記ウェル内の前記試料からの光を検出する光検出ステップと、
    前記光検出ステップにおける検出結果に応じて得られた光強度分布を対象に、前記ウェルの境界の位置を特定し、前記ウェルの境界の位置を基に解析領域に設定し、前記解析領域の光強度を解析することによって、前記試料に関する解析情報を取得する情報解析ステップと、
    を備え、
    前記情報解析ステップでは、前記光強度分布における前記陽極あるいは前記陰極の先端の像に基づいて前記解析領域をさらに設定する、
    細胞観察方法。
  6. 前記情報解析ステップでは、前記光強度分布における輝度差に基づいて、前記ウェルの境界の位置を特定する、
    請求項５に記載の細胞観察方法。
  7. 前記情報解析ステップでは、前記電極対に印加される電位に応じて、前記解析領域の大きさを設定する、
    請求項５又は６に記載の細胞観察方法。
  8. 前記位置制御ステップでは、筋細胞を含む前記試料を保持する前記ウェル内に前記電極対が配置されるように制御し、
    前記情報解析ステップでは、前記電極対に繰り返しパルス電圧を印加した状態での前記解析領域の光強度を解析する、
    請求項５〜７のいずれか１項に記載の細胞観察方法。
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