发明内容
本发明旨在提供一种新的体外检测分析物对生物体的效应的方法。
本发明的另一个目的是提供用于上述新的测定方法的系统。
在本发明的第一方面,提供了一种体外检测分析物对生物体的效应的方法,它包括步骤:
a.构建检测系统,该系统包括:
n个用于盛放细胞或组织的容器Sn,n大于等于2,各容器S具有进口和出口,各容器Sn的出口处设有阻止细胞或组织通过的滤材,各容器Sn的进口和出口可拆卸且密封地与管路Tn和Tn’相连;和
至少一个泵W,各容器Sn通过管路Tn和Tn’与泵W液体连通;
b.在容器Sn中加入不同的细胞或组织,其加量不小于获得测定结果所需的细胞或组织的最小需量,不同细胞或组织加量之比符合它们在生物体内的天然含量之比;
c.向系统中加入培养基,培养基的加量与各细胞或组织加量之比符合它们在生物体内的天然含量之比;
d.向系统中加入分析物;
e.启动泵W,设定其流速使得系统内培养基的循环周期符合生物体内的体液循环周期;
f.定时从容器Sn中取样,检测分析物对其中细胞或组织产生的效应。
在另一优选例中,所述系统还包括将管路Tn和/或Tn’汇总后与W连通的管段C和/或C’,所述管段C和/或C’与各管路Tn和/或Tn’以及与泵W可拆卸且密封连接。
在另一优选例中,从管段C和/或C’加入分析物。
在另一优选例中,所述生物体是哺乳动物,更佳地为人。
在另一优选例中,所述体液是血液。
在本发明的第二方面,提供了一种体外测定分析物对生物体的效应的系统,它包括:
n个用于盛放细胞或组织的容器Sn,n大于等于2,各容器S具有进口和出口,各容器S的出口处设有阻止细胞或组织通过的滤材,各容器S的进口和出口可拆卸且密封地与管路Tn和Tn’相连;和
至少一个泵W,各容器Sn通过管路Tn和Tn’与泵W液体连通。
在另一优选例中,它还包括将管路Tn和/或Tn’汇总后与W连通的管段C和/或C’,所述管段C和/或C’与各管路Tn和/或Tn’以及与泵W可拆卸且密封连接。
在另一优选例中,所述各容器Sn的容量不小于获得测定结果所需的细胞或组织的最小需量。
在另一优选例中,所述各容器Sn的容量之比满足其中不同细胞或组织的含量之比符合它们在生物体内天然含量比的要求。
在另一优选例中,所述系统的总容量与各容器Sn的容量与之比不小于生物体内循环体液与所述不同细胞或组织的天然含量比。
据此,本发明提供了一种新的体外检测分析物对生物体的效应的方法及相应的系统。
具体实施方式
发明人经过广泛而深入的研究,意外地发现,将各个装有细胞或组织的不同容器分别同装有分析物溶液的容器相连,并通过泵产生液体回路。由于与分析物接触的各细胞或组织是处于一个完整的动态系统中,彼此之间相互影响相互作用,与真实的生物体体内过程更加接近,因此可以实现安全可靠的体外生物测定。
体外检测分析物对生物体的效应的方法和系统
本发明提供的体外检测分析物对生物体的效应方法,需要构建检测系统,所述的系统包括:(i)n个用于盛放细胞或组织的容器Sn,n大于等于2,各容器S具有进口和出口,各容器Sn的出口处设有阻止细胞或组织通过的滤材,各容器Sn的进口和出口可拆卸且密封地与管路Tn和Tn’相连;和(ii)至少一个泵W,各容器Sn通过管路Tn和Tn’与泵W液体连通。
在本发明的一个优选例中,所述系统还包括将管路Tn和/或Tn’汇总后与W连通的管段C和/或C’,所述管段C和/或C’与各管路Tn和/或Tn’以及与泵W可拆卸且密封连接。
本发明提供的方法中,分析物可以本领域常用的方法加入,如注射加入管路中,或直接加入各容器中。一种优选的方式是加入管路汇总后与泵连通的管段C和/或C’中。
在本发明的另一个优选例中,所述的方法包括以下步骤:
(1)将适量分析物分别加入管段C’和C(如图1)的培养液中;
(2)用软管和泵将管段C’和C连接起来,其中泵的位置在管段C’和C之间;
(3)将n(n≥2)种适量细胞或组织及培养液分别加入一个实验容器Sn,然后将这些实验容器用输液管路分别并联到管段C’和C,并使每一个实验容器都与管段C’和C以及泵形成闭合回路;
(4)将所有管段和实验容器置于合适的温度环境,如34-40℃,更佳地为35-38℃;
(5)启动泵,让管段C’中的溶液流向管段C,管段C中的溶液流向每一个实验容器,每一个实验容器中的溶液则流回管段C’,如此反复,直到实验周期结束;
(6)检测实验容器中细胞或组织的指标变化。
在本发明提供的方法中,分析物指拟研究、实验的药物、前体药物、食品添加剂、饮料、化妆品、消毒剂、饲料添加剂、农药、除草剂、化肥等化学物质和成分。
所述的培养液指能保证各种细胞或组织在实验周期内生存的通用培养液,如人或动物的血清、包括RPMI 1640,DMEM,Eagle’s MEM,TC199,Ham’s F10,F12在内的各种合成培养基等;如果实验周期很短,也可以用Hanks液。这些培养液或培养用溶液已经是本领域的成熟产品,可以从国内外的许多公司(如Life Technology,Hylone,Sigma等公司)订购。也可以参照文献方法(吴冠云等编著,生物化学与分子生物学实验常用数据手册,科学出版社,1999年。裴国献等主编,组织工程学实验技术,人民军医出版社,2006年)自己配制。
所述的n种细胞或组织是人为选定的,拟通过实验研究加以考察确定分析物是否对其有影响的n种细胞或组织。例如,要考察分析物的代谢物对其他细胞或组织的影响时,n种细胞或组织之一为肝细胞或肝组织。
可以使用本领域常用的泵,只要可以使液体产生定向的流动,优选蠕动泵。泵的转速可调节,以获得最佳的泵流量,如流动速度3-10ml/分钟,优选5-8ml/分钟。
对于管路的材料没有限制,本领域熟知的各种生物相容性材料均可采用。例如,可以使用本领域常规的软管将蠕动泵W、管段C’和C连接,优选硅橡胶软管,也可以采用聚四氟乙烯或或石英毛细管。
容器S的出口处有滤材,以防止细胞流出容器。由于大部分细胞的直径大于10微米,所用截流值为10-20微米的滤材。滤材的材质没有限制,本领域熟知的各种生物相容性材料均可采用,例如尼龙滤膜。滤材的形式可以是在管路端口塞入适量聚酯纤维或玻璃纤维,也可以购买专门的细胞滤器接入管路。
实验温度以接近人和动物的体温为宜,例如34-38℃。
本发明方法可检测效应包括但不限于以下种类指标中的一项或多项:细胞的数量、形态的变化;细胞或组织的基因表达水平的变化;细胞或组织的蛋白水平的变化;细胞或组织的生化指标的变化;细胞或组织的生理指标的变化。
分析物的加量取决于预定的分析物待测浓度,通常,分析物的质量除以实验体系中液体总体积所得应等于所述预定浓度。
细胞或组织的加量应不少于获取检测结果所需的最小需量。同时,当检测分析物对多种细胞或组织的效应时,各细胞或组织的加量之比应尽可能接近它们在失误体内的天然比例。所述天然比例为本领域常识,在诸多现有文献例如解剖学、生理学经典教科书或动物实验手册等中多有记载。所述生物体可以是例如但不限于哺乳动物,例如家畜,畜牧动物,宠物,或者人。
容器S的体积可以根据细胞或组织的量,在方便操作的情况下选择尽可能小的容器,这有利于节省试剂用量等实验自愿。然而,容器S应能容纳满足取自细胞或组织维持所需的足量培养液。这样的“足量培养液”是细胞或组织培养领域的技术人员众所周知的常识。
出于简化系统总体积计算和简化细胞或组织加量与培养液加量匹配的考虑,系统中管路的体积宜尽可能小。
系统中培养液的总体积应当根据所选细胞或组织所对应的生物体的该细胞或组织与体液天然比例来确定。所述天然比例为本领域常识,在诸多现有文献例如解剖学、生理学经典教科书或动物实验手册等中多有记载。
系统中加入的培养液体积之和应当等于实验体系中液体的总体积。根据细胞对应的生物体种类,最佳泵流量宜设定为:完成密闭回路中所有液体一次循环所需的时间与该生物体的体液循环一次的时间相近。所述体液例如但不限于血液。
发明方法中需要设定或调定的因素包括:分析物的浓度,细胞的种类、用量,培养液总量,泵流速等。
用本领域常规的方法检测细胞或组织的细胞的数量、形态的变化;细胞或组织的基因表达水平的变化;细胞或组织的蛋白水平的变化;细胞或组织的生化指标的变化;细胞或组织的生理指标的变化等。
本发明实施过程中需要注意的事项及操作要领,与细胞培养和体外细胞实验相同,也是本领域技术人员所公知的。
采用本发明的实验方法,管段C’和C以及泵的作用相当于心脏,管路的作用相当于血管,容器S根据所盛的细胞或组织不同,就相当于不同的器官。分析物对容器S内细胞或组织的效应相当于其进入生物体内对相应细胞或组织的效应。假设,把人或动物的心、脑、肝、肾的细胞或组织分别放入本发明系统的各容器S内,按照本发明的方法运行该系统,就可以研究实验分析物及其经肝的代谢产物对上述各主要器官细胞的影响。采用本发明的方法,由于与分析物接触的各细胞或组织是处于一个完整的动态系统中,彼此之间相互影响相互作用,与真实的生物体体内过程更加接近,所得到的研究实验结果更加有实践指导价值。
用途
由于制药工业的飞速发展,药物筛选、药物安全性评价和药物的质量控制受到普遍关注。特别是中药,由于其成分特别复杂,药源大多为天然动植物,受产地、季节、加工方法的影响很大,目前尚无好的方法用于其筛选、安全评价和质量控制。
本发明提供的系统可用于药物的有效性与安全性的筛选和质量控制中,所述药物优选中药或植物提取物。
本发明提供的方法和系统可以在几小时内获得所实验的药物或成份在动物或人体内是否有效、无毒的信息,避免了昂贵费时的动物实验过程。
本发明的主要优点在于:
1、在体外更好的模拟分析物和各细胞或组织的相互作用和影响;
2、试验结果更接近在生物体内的情况;
3、试验安全性高,结果可靠;
4、可实现高通量研究,且耗时少。
以下通过特定的具体实施例来说明本发明的实施方式,本领域技术人员可通过实施例所揭示的内容轻易地了解本发明的其它优点与功效。本发明也可通过其它不同的具体实施例加以施行或应用,本说明书中的各项细节也可基于不同观点与应用,在不背离本发明的精神下进行各种修饰与变更。
实施例1
检测系统的构建
1.取1.5ml的微型离心管4支,分别标为:S1,S2,C’,C(见图1);另取4根10厘米长,内径800微米的聚四氟乙烯毛细管,分别标为:T1,T2,T1’,T2’;1根20厘米长,内径1毫米的硅橡胶软管,标为T;管路(T1,T2,T1’,T2’,T)总体积为178微升。
1台微型蠕动泵(BT00-50M/DG-1型,购自保定兰格恒流泵有限公司),标为:W;自制的橡皮塞4支,可以用00号橡皮塞用刀切割成适宜大小形状,适合于塞紧1.5ml微型离心管,塞子的大小应使加塞后的1.5ml离心管容积为1.2ml。此时系统的总容积约为5ml。
2.在所有的微型离心管管塞上打孔。
3.将硅胶软管T穿过蠕动泵泵头,使管的中部夹紧在泵头上。
4.将软管T的两端分别插入微型离心管C和C’的管塞孔,将T1管的两端分别插入微型离心管C和S1的管塞孔,将T2管的两端分别插入微型离心管C和S2的管塞孔,将T1’管的两端分别插入微型离心管S1和C’的管塞孔,将T2’管的两端分别插入微型离心管S2和C’的管塞孔。插管时应注意,所有微型离心管的进液管的管口应在离心管的底部,出液管的管口应在离心管的上部,并在管口内塞入适量玻璃纤维,以避免细胞流出。
5.将各离心管中充满水,开启蠕动泵,检查体系的密封性。若管路溶液流动正常,无泄漏,则构建了一体外生物测定装置。
6.将管路中的水弃去,并将实验体系进行常规无菌处理。
实施例2
分析物制备
萘是一种工业原料。作为一种环境毒物,可以作为本实施例的分析物。我们将待测浓度设计为:0.5nmol/ml。将试剂商店买来的萘球研碎成粉末,称取128mg溶解在1ml无水乙醇中,然后取3微升加入3ml DMEM培养基(购自捷瑞生物工程(上海)有限公司,Cat.#920086)中,混匀,终浓度为1nmol/ml(128ng/ml)。上述操作为无菌操作。
实施例3
获取细胞
1.获取肝细胞:从中国科学院细胞库(上海200031岳阳路320号 中国科学院上海细胞生物学研究所)购买培养的人肝细胞(L-02)107个。
2.获取肺细胞:从中国科学院细胞库购买培养的人胚肺细胞(HLF)107个。
实施例4
检测I
注:所有操作为无菌操作
已知:
1.人体肝脏重量约为1.2Kg,人肺脏的重量约为1Kg;成年人的总血量约为5000ml,其中80%参与血液循环(约为4000ml),20%储存在肝脏、脾脏。(左明雪主编,人体解剖生理学,高等教育出版社,2003年8月,第一版)
2.人肝脏约有2.5×109个肝细胞;
(http://www.39.net/disease/LiverDiseases/hbv/ygzlk/jkzx/sl/196 352.html)
3.人安静时,每次心脏搏动的心输出量约为70ml/博,按人体平均心率75次/分钟计算,则一分钟心脏的血流量为5250ml;(左明雪主编,人体解剖生理学,高等教育出版社,2003年8月,第一版)
4.检测细胞中基因表达水平所需的细胞数约为106个;检测细胞中蛋白水平所需的细胞数约为105个;检测细胞死亡指标所需的细胞数约为103个;(基因表达谱芯片和蛋白芯片产品说明书)
因此,为保证能够检测细胞基因表达水平的变化,细胞的数量必须大于106个。由于人体中肝脏和肺脏的重量比约为1∶1,所以,在本实施例中,确定肝细胞和肺细胞的用量均为3×106个。人肝脏含有2.5×109个肝细胞,此时,人体参加循环的血液体积为4000ml,因此使用3×106个肝细胞作为细胞时,培养液的总体积应当为:(3×106×4000)/2.5×109ml=4.8ml。由于一分钟心脏的血流量为5250ml,人体参加循环的血液体积为4000ml,因此在本实施例中,培养液的总体积为4.8ml时,要使得所有培养液一次循环所需的时间与人的血液循环一次的时间相近,则蠕动泵的流量应为:(5250/4000)×4.8=6.3ml。
测定方法:
1.将实施例1构建的装置放入一恒温箱中,37℃保温。
2.将实施例2制备的分析物溶液各取1.2ml分别放入实施例1所述的微型离心管C’和C中,塞紧管塞。
3.将实施例3获取的肝细胞和肺细胞各取三分之一,分别用1.2ml DMEM培养基悬浮,转入实施例1所述的微型离心管S1和S2中,塞紧管塞。
4.待体系温度恒定后,启动蠕动泵,调整转速,使其流量达到6.3ml/分钟。
5.2小时后,停止蠕动泵。将S2中的肺细胞混悬液用DMEM培养基稀释到200-2000个细胞/ml,取出100ul悬液,加入0.1ml的0.4%的台盼兰溶液,轻轻混匀,数分钟后,用血球计数板计数细胞。活细胞排斥台盼兰,因而染成蓝色的细胞是死细胞。结果表明,肺细胞死亡率达30%。
5.将S1中的肝细胞混悬液1000转/分钟离心,弃去上清液,将肝细胞按文献(P.鲍尔迪,G.W.哈特菲尔德著,DNA芯片和基因表达-从实验到数据分析与模建[影印版],科学出版社,2003年10月第一版)方法,抽提mRNA,反转录成cDNA并用荧光染料Cy3标记;另取未与分析物作用的等量肝细胞作为对照,也按上述方法抽提RNA,反转录成cDNA并用荧光染料Cy5标记;然后将两种不同标记的cDNA混合,与人表达谱芯片(Agilent Technologies,Human 1Aoligo microarray kit(V2))按说明书要求进行杂交、检测,肝细胞的基因表达图(局部)如图2A所示。
实施例5
检测II
按照实施例4的方法,只是S1中不加肝细胞,2小时后考察肺细胞的死亡情况。
结果表明,不加肝细胞时,肺细胞与分析物作用2小时未见明显死亡。将剩余的肺细胞按文献方法(M.谢纳著,蛋白质芯片[影印版],科学出版社,2005年4月第一版),与蛋白芯片(康成生物工程有限公司,Cat#:HM5000)按说明书要求进行反应,肺细胞中蛋白芯片检测图(局部)如图3A所示。
实施例6
检测III
按照实施例4的方法,只是C和C’中用空白培养基代替含分析物的培养基,2小时后考察肺细胞的死亡情况。
结果表明,不加分析物时,肝细胞、肺细胞2小时未见死亡。将肝细胞按实施例4方法用同样的表达谱芯片检测肝细胞基因表达情况,图谱(局部)如图2B所示。肺细胞按实施例5方法用同样的蛋白芯片检测肺细胞蛋白,肺细胞中蛋白芯片检测图(局部)如图3B所示。
图2A和B两张肝细胞基因表达水平的差异表明萘对肝细胞基因表达是有影响的。图3A和B两张肺细胞蛋白芯片检测图基本一致,说明萘对肺细胞蛋白的影响不大。结合细胞死亡结果显示,萘本身对人细胞的毒性极小,但其代谢产物对肺细胞有较大毒性。这与现有技术对萘的研究结果完全吻合:从黎明,胡家庆等在“萘毒性的研究进展”(中国预防医学杂志,2002,3(3):252-254)中揭示:萘本身对人细胞的毒性极小,但其代谢产物对肺细胞有较大毒性,萘代谢产物在体内达到0.25nmol/ml时,对肺细胞有明显毒性。
由此可见,本发明的方法和系统,不需体内实验就可提供可靠的检测信息。而且,本发明系统和方法能够很好的模拟生物体的循环环境,通过一次试验给出分析物对多细胞或多脏器总和效应的结果,这是传统的细胞实验无法实现的。
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考,就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解,在阅读了本发明的上述讲授内容之后,本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改,这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。