DE19719001A1 - Verfahren zum immunologisch-funktionalen Nachweis biologisch aktiver Insulin-Like Growth Factor Binding Proteine oder löslicher Insulin-Like Growth Factor - Rezeptoren im Immunoassay - Google Patents

Verfahren zum immunologisch-funktionalen Nachweis biologisch aktiver Insulin-Like Growth Factor Binding Proteine oder löslicher Insulin-Like Growth Factor - Rezeptoren im Immunoassay

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Description

Verfahren zum immunologisch-funktionalen Nachweis biologisch aktiver Insulin-like Growth Factor Binding Proteine (IGFBP's) oder löslicher Insulin-Like Growth Factor- Rezeptoren im Immunoassay.
Insulin-like Growth Factors (früher auch als "Somatomedine" bezeichnet) sind Peptide, die bei Wachstum, Differenzierung und anderen biologischen Vorgängen menschlicher und tierischer Zellen ein wichtige Rolle spielen (1, 2). Bei Menschen und allen bisher untersuchten Säugetieren, aber beispielsweise auch bei Fischen und Reptilien sind bisher jeweils zwei unterschiedliche Insulin-like Growth Factors, IGF-I und IGF-II bekannt (3). Die bekannten Insulin-like Growth Factors anderer Spezies weisen eine sehr hohe Sequenzhomologie zu den beiden menschlichen Insulin-like Growth Factors auf.
Die biologische Wirkung der Insulin-like Growth Factors auf die Zielzelle wird über zwei verschiedene Rezeptoren, den IGF-I Rezeptor (4, 5) und den IGF-II/Mannose- 6-Phosphatrezeptor (6) vermittelt. Vom IGF-II Rezeptor wurde auch eine lösliche Form nachgewiesen, die aus der extrazellulären Domäne des Rezeptors besteht (7, 8, 9).
Eine Besonderheit der Insulin-like Growth Factors ist, daß sie im Blut und in anderen Körperflüssigkeiten mit hoher Affinität an spezifische Bindungsproteine, die sogenannten Insulin-like Growth Factor Binding Proteine (10, 11) transportiert werden. Von diesen Proteinen sind beim Menschen und verschiedenen Tieren bisher sieben verschiedene Proteine (IGFBP-1 bis -6, und ein kürzlich entdecktes IGF-bindendes Protein mac-25) mit hoher Sequenzhomologie bekannt. Die Bindung der Insulin-like Growth Factors an die Bindungsproteine oder Rezeptoren hängt stark vom pH ab, der Komplex dissoziiert im sauren pH Bereich, die Dissoziation kann durch Neutralisierung rückgängig gemacht werden.
Das Insulin-like Growth Factor Bindungsprotein mit der höchsten Konzentration in humanem Serum ist IGFBP-3. Dieses Bindungsprotein bildet als einziges mit seinem Liganden (IGF-I oder IGF-II) und einem zweiten Protein, der sogenannten Säure-labilen Untereinheit (Acid-labile subunit, ALS) einen ternären Komplex.
Eine Besonderheit der Insulin-like Growth Factor Binding Proteine ist, daß sie im Serum und anderen Körperflüssigkeiten durch Proteasen in Bruchstücke gespalten werden können (11-16). Einige dieser Bruchstücke sind biologisch aktiv, d. h. sie können noch IGF-I und IGF-II binden, andere wiederum nicht. Ein in der Literatur beschriebenes Beispiel ist das Auftreten eine Protease für IGFBP-3, u. a. im Serum Schwangeren (17-21). Es gibt Hinweise, daß diese Proteasen die Affinität der IGF's an die Bindungsproteine und damit ihre biologische Aktivität, beeinflussen (22-26). Einige andere posttranslationale Modifikationen, wie z. B. Phosphorylierungen, Glykosilierungen etc. spielen vermutlich eine ähnliche Rolle (27-29).
Der qualitative und quantitative Nachweis der Insulin-like Growth Factor Bindungsproteine erfolgt im Radioimmunoassay, im sogenannten Enzymimmunoassay oder anderen nichtradioaktiven Immunoassays(Übersicht über die Methoden in 30). Die Bedeutung der löslichen Rezeptoren wird noch untersucht. Beim Radioimmunoassay werden radioaktiv markierte Insulin-like Growth Factor Bindungsproteine oder Antikörper eingesetzt, bei den anderen Nachweisverfahren verwendet man beispielsweise mit Enzymen markierte Antikörper oder Antikörper, die mit fluoreszierenden Verbindungen markiert sind.
Beim Radioimmunoassay gibt es sogenannte kompetitive Testverfahren, bei denen ein Antikörper verwendet wird, der an eine feste Phase (Teströhrchen, Mikrotiterplatte etc.) gebunden ist oder durch eine Fällungsreaktion präzipitiert werden kann. Um die Bindung an diesen Antikörper konkurrieren das Insulin-like Growth Factor Bindungsprotein aus der Probe und ein zugegebenes markiertes Bindungsprotein, der sogenannte Tracer. Im zweiten Schritt werden entweder der Antikörper mit dem gebundenen Bindungsprotein ausgefällt, und dadurch aus dem Reaktionsgemisch abgetrennt. Im Falle des an eine Festphase gebundenen Antikörpers werden nichtgebundene Proteine durch Waschen der Festphase entfernt.
Im Enzymimmunoassay, aber auch in einigen Radioimmunoassays kann im sogenannten nichtkompetitiven Test oder "Sandwichimmunoassay" ein Antikörperpaar verwendet werden. Der erste Antikörper dient dazu, das Bindungsprotein an eine feste Phase zu immobilisieren. Der zweite, markierte Antikörper dient dazu, das an den ersten Antikörper gebundene Protein durch Messung der Radioaktivität, der enzymatischen Aktivität etc. quantitativ nachzuweisen. Diese Nachweisverfahren haben jedoch den Nachteil, daß sie keine Aussage über die biologische Aktivität des gebundenen Proteins machen. Die im Immunoassay verwendeten Antikörper weisen sowohl das biologisch aktive Bindungsprotein, aber auch inaktive Fragmente nach, die die Bindungsstelle des Antikörpers enthalten. Es werden also auch biologisch nicht aktive Bruchstücke der Bindungsproteine oder posttranslational veränderte Proteine nachgewiesen, die ihre biologische Aktivität, d. h. die Fähigkeit Insulin-like Growth Factors zu binden, verloren haben. Bekannt ist beispielweise ein Fragment des IGFBP-3 mit einem Molekulargewicht von ca. 18 kDa, das mit verschiedenen Antikörpern nachweisbar ist, das aber nicht mehr in der Lage ist, Insulin-Like Growth Factors zu binden, also die biologische Aktivität verloren hat.
Der Vorteil der vorliegenden Erfindung beruht darin, daß es durch die Kombination eines Antikörpers und eines markierten Liganden möglich ist, nur den biologisch aktiven Teil des jeweiligen Bindungsproteins oder Rezeptors nachzuweisen.
Zur Markierung der biologisch aktiven Bindungsproteine wird die Probe auf pH 2,8 oder kleiner angesäuert. Gebundene, "natürliche" IGF's disoziieren ab. Anschließend wird mit einer Lösung neutralisiert, die einen Überschuß eines markierten Liganden (Markiertes IGF-I oder IGF-II) enthält. Bei Neubildung der Komplexe aus Insulin-like Growth Factors und Insulin-like Growth Factor Binding Proteinen bzw. Rezeptoren werden die natürlich vorhandenen IGF's durch den Überschuß des markierten Liganden verdrängt.
Der Ansäuerungsschritt kann entfallen, wenn nur der "freie" Anteil der Bindungsproteine nachgewiesen werden soll, d. h. der Anteil an den kein IGF gebunden ist. In diesem Fall genügt die Zugabe des markierten Liganden.
Nach erfolgter Markierung sind prinzipiell zwei Nachweiswege möglich:
  • 1. Das nachzuweisende Bindungsprotein (bzw. Rezeptor) wird durch einen spezifischen Antikörper aus dem Reaktionsgemisch abgetrennt.
    Dazu kann der Antikörper an eine feste Phase gebunden sein, zum Beispiel an ein Teströhrchen, die Vertiefung einer Mikrotiterplatte etc. Der an die Festphase gebundene Antikörper wird mit der vorbereiteten Probe in kubiert und bindet das nachzuweisende Bindungsprotein, und zwar sowohl biologisch aktive als auch inaktive Fragmente. Nach der Inkubation werden nicht gebundene Proteine durch Waschen entfernt. Eine andere Möglichkeit zur Abtrennung aus dem Reaktionsgemisch, ist die Präzipitation des spezifischen Antikörpers.
    Danach wird die Menge des gebundenen, markierten Liganden direkt oder indirekt quantitativ bestimmt.
    Ein direkter Nachweis kann beispielsweise durch Messung der Aktivität des radioaktiven markierten Liganden oder durch Messung der Fluoreszenz eines mit Fluoreszenzfarbstoffen markierten Liganden erfolgen.
    Ein indirekter Nachweis ist beispielweise durch Antikörper gegen die Markierungsgruppe (z. B. Markierung des Liganden mit Di-Nitrophenol, Nachweis des gebundenen Liganden mit Antikörpern gegen Di-Nitrophenol) oder andere Proteine mit hoher Affinität zur Markierungsgruppe (z. B. Markierung des Liganden mit Biotin, Nachweis des biotinylierten Liganden mit Avidin oder Stretavidin).
  • 2. Die Affinität von Antikörpern oder anderen Proteinen zur Markierungsgruppe kann auch dazu dienen, den markierten Liganden und damit auch die daran gebundenen Bindungsproteine aus dem Reaktionsgemisch zu entfernen. Der spezifische Nachweis des gebundenen Proteins erfolgt dann durch den spezifischen Antikörper gegen das nachzuweisende Bindungsprotein.
Beispiel
Enzymimmunoassay zum Nachweis von IGFBP-3 mit biotinyliertem IGF-I oder IGF-II mit indirektem Nachweis des markierten, gebundenen Liganden durch Streptavin- Peroxidase.
Biotin ist eine Verbindung mit niedrigem Molekulargewicht und wird in vielen Testsystemen zur nichtradioaktiven Markierung von Molekülen verwendet. Aktivierte Biotinderivate, die die Markierung von Molekülen aller Art ermöglichen, sind kommerziell erhältlich. Eine Biotinmarkierung synthetischer Peptide ist im Rahmen der Peptidsynthese durchführbar. Der Nachweis biotinylierter Verbindungen wird durch die hohe Affinität zu zwei nahe verwandten Proteinen, Avidin und Streptavidin, ermöglicht. Diese Proteine können leicht mit Enzymen oder anderen Verbindungen markiert werden. Häufig verwendete Enzyme sind z. B. Peroxidase oder alkalische Phosphatase. Für Peroxidase und alkalische Phosphatase gibt es sowohl kolorimetrische Substrate als auch chemilumineszierende Substrate. Darüberhinaus ist es auch möglich Streptavidin oder Avidin mit fluoreszierenden oder lumineszierenden Verbindungen direkt zu markieren.
Probenvorbereitung vergl. Reaktionsschema, Zeichnungen Blatt 1 und Blatt 2:
Die Probe (Serum, Zellkulturüberstand, Zellextrakt) wird mit einem sauren Puffer auf einen pH von kleiner oder gleich 2,8 gebracht (Reaktionsschema Schritt 1). Dabei dissoziieren gebundene IGF's ab. Danach wird mit einem Puffer neutralisiert, der biotinyliertes IGF-I oder IGF-II oder eine Mischung von IGF-II im Überschuß enthält (Reaktionsschema Schritt 2). Diese binden im neutralen pH -Bereich an alle Bindungsproteine in der Probe und verdrängen das nicht markierte IGF aus der Probe. Inaktive IGFBP-Fragmente werden nicht markiert.
Die vorbereitete Probe wird in die Vertiefung der Mikrotiterplatte gegeben, (Schritt 3), die mit einem spezifischen Antikörper gegen IGFBP-3 beschichtet ist und inkubiert (Schritt 4).
IGFBP-3 (auch biologisch inaktive Fragmente) bindet an den Antikörper an der festen Phase. Nach Ablauf der Inkubationszeit werden nicht gebundene Proteine (also auch andere IGFBP's, im Beispiel IGFBP-1 und -2) durch Waschen entfernt (Schritt 5). Anschließend wird ein Avidin oder Streptavidin-Peroxidasekonjugat in die Vertiefung der Mikrotiterplatte pipettiert (Schritt 6). Das Streptavidinkonjugat bindet an das biotinylierte IGF-I oder IGF-II, das nur an biologisch aktives IGFBP-3 gebunden ist. Nach einer Stunde Inkubationszeit wird nichtgebundenes Enzymkonjugat durch Waschen entfernt (Schritt 7). Anschließend wird ein Substrat zupipettiert. Die Farbreaktion des Enzyms, das an Streptavidin gekoppelt ist, wird mit einem Photometer gemessen (Schritt 8). Sie ist proportional zur Menge des biologisch aktiven IGFBP-3.
Anlagen Reaktionsschema (Zeichnung, 2 Seiten) Literaturstellen
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Claims (1)

  1. Verfahren zum immunologisch-funktionalen Nachweis biologisch aktiver Insulin-like Growth Factor Binding Proteine oder löslicher Insulin-Like Growth Factor- Rezeptoren im Immunoassay, mit folgenden Merkmalen:
    • - zum immunologischen Nachweis oder zur Abtrennung eines Bindungsproteines aus der Probe wird ein spezifischer Antikörper verwendet.
    • - der funktionale Nachweis oder die Abtrennung des biologisch aktiven Teils des Insulin-like Growth Factor Binding Proteins oder Rezeptors aus der Probe erfolgt durch einen markierten Liganden.
    Liganden nach diesem Anspruch sind Insulin-like Growth Factors bzw. von diesen abgeleitete Derivate bzw. Teilsequenzen die mindestens 3 Aminosäuren der natürlichen Sequenzen enthalten oder Peptide oder andere synthetischen Liganden, die die Struktur oder Bindungsfähigkeit der Insulin-like Growth Factors oder Teilsequenzen der Insulin-like Growth Factors imitieren.
    Markierungen nach diesem Anspruch sind alle Markierungen, über die ein direkter oder indirekter Nachweis des an die Insulin-like Growth Factor Bindungsproteine oder den löslichen Rezeptoren gebundenen Liganden erfolgen kann, beispielsweise also direkter oder indirekter Nachweis über Messungen der Radioaktivität, der enzymatischen Aktivität, der Chemi- und Biolumineszenz, der Fluoreszenz etc.
DE1997119001 1997-05-06 1997-05-06 Verfahren zum immunologisch-funktionalen Nachweis biologisch aktiver Insulin-Like Growth Factor Binding Proteine oder löslicher Insulin-Like Growth Factor - Rezeptoren im Immunoassay Expired - Lifetime DE19719001C2 (de)

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