JP2011501155A - タリウムの流入および流出測定のための組成物および方法 - Google Patents
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Abstract
Description
この出願は、2007年10月15日出願の米国出願番号60/979,958に対して優先権を主張し、その開示はその全体を参照することにより本明細書に組み込まれる。
本発明は、細胞内のイオンチャネル活性検出のための方法に関する。本方法は、細胞に添加緩衝液を提供し、刺激緩衝液を細胞に提供することを含み、ここで当該添加緩衝液は少なくとも一つの環境感受性タリウム指示薬(発光色素など)および塩素イオンを含み、当該刺激緩衝液はタリウムを含む。刺激緩衝液の提供により、イオンチャネルを通してのタリウムの細胞への流入が起こる。刺激緩衝液の提供後、細胞内でタリウム指示薬の発光(蛍光など)が検出され、ここで色素の発光はタリウムの有無で変化し得る。
イオンチャネルのハイスループット・スクリーニング(HTS)(HCSなど)は、自動化パッチクランプ機器の効率により、現在制限されている。カルシウム指示薬BTC AMエステルを負荷したクローン細胞株のカリウムチャネル活性の代理指示薬として、タリウム流入を使用することは、現在確立されている(Weaver et al., Journal of Biomolecular Screening 2004; 9(8): 671-677(非特許文献1))。今日まで、イオンチャネルのモニタリングのための分析にはタリウム(I)を使用しており、これは選択的に開放カリウムチャネル(Hille, J. Gen. Physiol. 1973; 61:. 669-686(非特許文献2))に入ってBTCに結合し、カリウムチャンネル活性の光学読み出しが得られる。この方法は、化合物ライブラリーのHTSモードで試験された薬剤で、イオンチャネルの活性化および/または阻害を研究するために使用できる。
本発明は、細胞内のイオンチャネル活性検出のための方法に関する。本方法は、イオンチャネルを通してのタリウムの流入または流出を測定するために使用できる。本方法は一般に、細胞に添加緩衝液を提供し、刺激緩衝液を細胞に提供することを含み、ここで当該添加緩衝液は少なくとも一つの環境感受性タリウム指示薬(蛍光色素などの発光色素など)および塩素(塩素イオンなど)を含み、当該刺激緩衝液はタリウムを含む。添加緩衝液は、生理的条件の塩素イオンを含み得る。刺激緩衝剤の提供により、イオンチャネルを通してのタリウムの細胞への流入が起こり得る。刺激緩衝剤の提供後、細胞内で色素の発光(蛍光など)が検出され、ここで色素の発光はタリウムの有無で変化し得る。
本発明を詳細に説明する前に、当然のことながら、この発明は具体的な組成物またはプロセス段階に限定されない。この明細書および添付の特許請求の範囲では、文脈から明らかにそうでないと分かる場合を除いて、単数形「a」「an」および「the」は複数の言及を含むことに注目すべきである。「約」という用語は、数値を表す時に使われた時は、文脈から明らかにそうでないと分かる場合を除いて、その数値の± 15%の範囲を含むことにも注目すべきである。
6-アミノ-9-(2-カルボキシル-3,4,5,6-テトラフルオロフェニル)-3H-キサンテン-3-オン、
6-アミノ-9-(2,4-ジカルボキシフェニル)-2-フルオロ-3H-キサンテン-3-オン、
6-アミノ-9-(2,4-ジカルボキシフェニル)-7-フルオロ-3H-キサンテン-3-オン、
4',5'-ビス((ジ(カルボキシメチル)アミノ)メチル)-2',7'-ジフルオロフルオレセイン(2',7'-ジフルオロカルセイン)、
4',5'-ビス((ジ(カルボキシメチル)アミノ)メチル)-2',7'-ジフルオロフルオレセイン、アセトキシメチルエステル(2',7'-ジフルオロカルセインAM)、
4-(カルボキシメチル)チオ-5,6,7-トリフルオロフルオレセイン、
6-(カルボキシメチル)チオ-4,5,7-トリフルオロフルオレセイン、
4-(カルボキシメチル)チオ-2',5,6,7,7'-ペンタフルオロフルオレセイン、
6-(カルボキシメチル)チオ-2',4,5,7,7'-ペンタフルオロフルオレセイン、
9-(4-カルボキシ-2-スルホフェニル)-2',7'-ジフルオロフルオレセイン、
4',5'-ジクロロ-2',7'-ジメトキシ-4,5,6,7-テトラフルオロフルオレセイン-5-カルボン酸、
2',7'-ジクロロ-4,5,6,7-テトラフルオロフルオレセイン、
1',8'-ジフルオロフルオレセイン、
2',7'-ジフルオロフルオレセイン、
2',7'-ジフルオロフルオレセイン二酢酸、
4',5'-ジフルオロフルオレセイン、
2',7'-ジフルオロ-6-ヒドロキシ-3H-キサンテン-3-オン、
2',7'-ジフルオロフルオレセイン-5-カルボン酸、
2',7'-ジフルオロフルオレセイン-5-カルボン酸二酢酸、
2',7'-ジフルオロフルオレセイン-5-カルボン酸二酢酸、アセトキシメチルエステル、
2',7'-ジフルオロフルオレセイン-6-カルボン酸、
2',7'-ジフルオロフルオレセイン-5-スルホン酸、
2',7'-ジフルオロフルオレセイン-6-スルホン酸、
2',7'-ジメトキシ-4,5,6,7-テトラフルオロフルオレセイン、
2',7'-ジメトキシ-4,5,6,7-テトラフルオロフルオレセイン-5-カルボン酸、
5-ドデカノイルアミノ-2',7'-ジフルオロフルオレセイン、
2'-フルオロフルオレセイン、
4'-フルオロフルオレセイン、
2',4,5,6,7,7'-ヘキサフルオロフルオレセイン、
2',4,5,6,7,7'-ヘキサフルオロフルオレセイン二酢酸、
1,2,4,5,7,8-ヘキサフルオロ-6-ヒドロキシ-9-(ペンタフルオロフェニル)-3H-キサンテン-3-オン、
6-ヒドロキシ-9-(2-スルホ-3,4,5,6-テトラフルオロフェニル)-3H-キサンテン-3-オン、
2',4',5',7'-テトラブロモ-4,5,6,7-テトラフルオロフルオレセイン、
2',4',5',7'-テトラフルオロフルオレセイン、
2',4',5',7'-テトラフルオロフルオレセイン-5-カルボン酸、
2',4',5',7'-テトラフルオロフルオレセイン二酢酸、
4,5,6,7-テトラフルオロフルオレセイン、
4,5,6,7-テトラフルオロフルオレセイン二酢酸、
4,5,6,7-テトラフルオロフルオレセイン-2',7'-ジプロピオン酸、
4,5,6,7-テトラフルオロフルオレセイン-2',7'-ジプロピオン酸、アセトキシメチルエステル、または
2',4',5',7'-テトラヨード-4,5,6,7-テトラフルオロフルオレセイン。
タリウム流入分析
以下は、本発明のいくつかの方法で使用できる成分の例である。
成分A:
バイアル当たり:FluoZin-1 AMエステル(Invitrogen)1〜20μg
凍結乾燥し、単回使用の15 mLバイアル中に保管
成分B:5X分析緩衝液:1x25 mL
バイアル当たり:50容量% 10XHBSS 12.5 mL
10容量% 1 M HEPES 2.5 mL
40容量% H2O 10 mL
成分C:5X塩素を含まない刺激緩衝液:1x25 mL
バイアル当たり:700 mM グルコン酸ナトリウム 3.82 g
12.5 mM グルコン酸カリウム 73 mg
9 mM グルコン酸カルシウム 96.7 mg
5 mM グルコン酸マグネシウム 51.7 mg
100 mM HEPES 2.5 mL 1M
水 22.5 mL
成分D:濃縮(125 mM)K2SO4溶液:1x20 mL
バイアル当たり:125 mM 硫酸カリウム 435 mg
H2O 20 mL
成分E:濃縮(50 mM)Tl2S04 溶液:1x20 mL
バイアル当たり:50 mM 硫酸タリウム 505 mg
H2O 20 mL
成分F:100X:lx1 mL
バイアル当たり:PLURONIC F127 20〜100 mg
PLURONIC P85 5〜20 mg
H2O 1 mL
hERGイオンチャネルでトランスフェクトされた細胞の分析
hERGイオンチャネルでトランスフェクトされた細胞を、本発明の方法を使用して分析した。0.5 uM FluoZin-1 AMエステルを含む分析緩衝液中に細胞を添加し、1X希釈の刺激緩衝液(成分C、25 mM K2SO4および10 mM T12SO4を含む)で刺激した。「対照」はtet-刺激hERG 293 T Rex細胞で、「tetなし」トレースはhERG発現のために刺激されなかった細胞であった。刺激は25 uLの容量で細胞に与えられ、5倍希釈のため100 uLまで添加された。この特定の実施例では、細胞のタリウム最終濃度は約4 mMであった。図1は、hERGイオンチャネルでトランスフェクトされ、本発明の方法を使用して分析された細胞の吸収曲線(時間の関数をdF/Fとしてプロット)を示す。図2は、hERGイオンチャネル(テトラサイクリン誘導または非テトラサイクリン誘導)でトランスフェクトされたhERG活性細胞を、96ウェルプレート中、FLUXORタリウムNW検出キット(Invitrogen Corporation、カリフォルニア州カールズバッド)で測定したものを示す(カリウムイオン刺激の時間を矢印で示す)。
タリウム感受性分析
タリウム(I)に対する化合物の感受性を評価するために分析が提供される。タリウム(I)に十分な感受性を持つ化合物は、イオンチャネルを通してのタリウムの流入および流出を測定するためのタリウム指示薬として使用し得る。蛍光化合物の10マイクロモル溶液を、pH 7.4の10 mM HEPES緩衝液で調製する。最大蛍光発光強度は、化合物の励起最大波長での励起で測定される。測定は、蛍光分光光度計のキュベットまたは蛍光マイクロプレート・リーダーのマイクロプレート・ウェル中で行われる。硫酸タリウムの原水溶液の量を増加させながら蛍光化合物溶液に添加し、タリウム(I)の最終濃度が0、5、10、50、100、500、1000、2000マイクロモルになるようにする。硫酸タリウム溶液を添加するたびに、蛍光強度を測定し、タリウム(I)がゼロの場合に得られた強度と比較する。タリウム(I)濃度の範囲を通して全体的蛍光強度変化が25%の場合、イオンチャネルを通してのタリウムの流入および流出を測定するための分析について、化合物がさらに評価されるための十分なタリウム(I)感受性を持つことを示す。
Claims (79)
- 以下の段階を含む、細胞内のイオンチャネルの活性を検出する方法:
a)イオンチャネルを持つ細胞を提供する段階、
b)細胞に、タリウム指示薬および生理的濃度の塩素イオンを含む添加緩衝液を提供する段階、
c)細胞にタリウムを含む刺激緩衝液を提供する段階であって、それによりイオンチャネルを通してのタリウムの細胞への流入が起こる、段階、
d)タリウム指示薬を検出する段階。 - タリウム指示薬が細胞内でタリウムと結びつく、請求項1記載の方法。
- タリウム指示薬がタリウムの有無で変化する光学特性を持つ、請求項1記載の方法。
- タリウム指示薬がタリウムイオンと結びついた時に蛍光の増加を示す化合物である、請求項1記載の方法。
- タリウム指示薬がタリウムイオンと結びついた時に細胞内で光学密度の変化を示す化合物である、請求項1記載の方法。
- タリウム指示薬が疎水性である、請求項1記載の方法。
- タリウム指示薬が親水性である、請求項1記載の方法。
- タリウム指示薬がアセトキシメチルエステル部分を含む、請求項1記載の方法。
- タリウム指示薬が環境に感受性のある蛍光色素である、請求項1記載の方法。
- タリウム指示薬が非蛍光化合物である、請求項1記載の方法。
- タリウム指示薬がタリウムと結びついて沈殿物または着色生成物を形成する、請求項10記載の方法。
- タリウム指示薬がヨウ化物、臭化物およびクロム酸塩から選択されたイオンである請求項10記載の方法。
- タリウム指示薬がタリウムイオンの存在下で蛍光強度の減少を示す、請求項1記載の方法。
- タリウム指示薬がANTS、Fluo-4、Fluo-3、PBFI、フェングリーン、APTRA-BTCまたはMag-Fura Red、またはその誘導体もしくは塩である、請求項13記載の方法。
- タリウム指示薬がタリウムイオンの存在下で蛍光の増加を示す、請求項1記載の方法。
- タリウム指示薬がマグネシウムグリーン、Fluo-4FF、FluoZin-1またはFluoZin-2、RhodZin-3、またはその誘導体もしくは塩である、請求項15記載の方法。
- タリウム指示薬がタリウム感受性分析で25%以上の蛍光強度変化を示す蛍光化合物である、請求項1記載の方法。
- タリウム指示薬が一価または二価のカチオンに感受性のある蛍光化合物である、請求項17記載の方法。
- タリウム指示薬がZn2+またはCa2+指示薬である、請求項18記載の方法。
- タリウム指示薬がキサンテン部分を含む、請求項1記載の方法。
- タリウム指示薬がFluoZin 1、FluoZin 2、FluoZin 3、FluoZin 4、Red Fluo-4FF、マグネシウムグリーン、フェングリーン、RhodZin-3、またはその誘導体もしくは塩である、請求項20記載の方法。
- タリウム指示薬がクマリン部分を含む、請求項1記載の方法。
- タリウム指示薬がBTCまたはAPTRA-BTC、またはその誘導体もしくは塩である、請求項22記載の方法。
- タリウム指示薬がベンゾフラン部分を含む、請求項1記載の方法。
- タリウム指示薬がMag-Fura Redまたはその誘導体もしくは塩である、請求項24記載の方法。
- タリウム指示薬がナフタレン部分を含む、請求項1記載の方法。
- タリウム指示薬がクラウンエーテル部分を含む、請求項26記載の方法。
- タリウム指示薬がアセトキシメチルエステル部分を含む、請求項1〜27のいずれか一項記載の方法。
- 添加緩衝液の塩素イオン濃度が約2 mMより大きい、請求項1記載の方法。
- 添加緩衝液の塩素イオン濃度が約5 mM〜約20 mMである、請求項1記載の方法。
- 添加緩衝液の塩素イオン濃度が約20 mM〜約100 mMより大きい、請求項1記載の方法。
- 添加緩衝液の塩素イオン濃度が約50 mM〜約150 mMである、請求項1記載の方法。
- 塩素イオン源がNaClまたはKClである、請求項1記載の方法。
- タリウムが塩の形態である、請求項1記載の方法。
- タリウム塩が添加緩衝液に可溶性である、請求項34記載の方法。
- タリウム塩がTl2SO4、Tl2CO3、TlCl、TlOH、TlOAc、およびTlNO3から選択される、請求項34記載の方法。
- 刺激緩衝液が約4.0 mM未満の濃度のタリウムを含む、請求項1記載の方法。
- 刺激緩衝液が約3.0 mM未満の濃度のタリウムを含む、請求項1記載の方法。
- 刺激緩衝液が約0.1〜約2.0 mMの濃度のタリウムを含む、請求項1記載の方法。
- 刺激緩衝液が約0.1 mM〜約20 mMの濃度のタリウムを含み、かつ添加緩衝液が、約50 mM〜約150 mMの濃度の塩素イオンを含む、請求項1〜39のいずれか一項記載の方法。
- 刺激緩衝液が約2.0 mM〜約5.0 mMの濃度のタリウムを含み、かつ添加緩衝液が、約50 mM〜約150 mMの濃度の塩素イオンを含む、請求項1〜39のいずれか一項記載の方法。
- タリウムレベルを定量化する段階をさらに含む、請求項1記載の方法。
- タリウムレベルを定量化する段階が、タリウム流入に反応したタリウム指示薬の少なくとも一つの光学特性を測定する段階を含む、請求項42記載の方法。
- タリウム指示薬の少なくとも一つの光学特性が強度、極性、周波数、または光学密度である、請求項43記載の方法。
- タリウム指示薬が光学顕微鏡法、共焦点顕微鏡法、蛍光顕微鏡法または分光光度法で検出される、請求項1記載の方法。
- 添加緩衝液が細胞に提供された後に細胞を洗浄する段階をさらに含む、請求項1記載の方法。
- 添加緩衝液が細胞に提供された後に細胞を洗浄する段階を含まない、請求項1記載の方法。
- 添加緩衝液に消光剤を添加する段階をさらに含む、請求項47記載の方法。
- 消光剤が実質的に細胞透過性でない、請求項48記載の方法。
- 消光剤がタートラジン、アマランス、アシッドレッド37、コンゴレッド、トリパンブルー、ブリリアントブラック、またはこれらの組み合わせである、請求項48記載の方法。
- イオンチャネルを刺激で刺激する段階をさらに含む、請求項1記載の方法。
- 刺激がイオンチャネルに結合するリガンド、チャネル連結型受容体、または電気刺激である、請求項51記載の方法。
- 刺激が、GIRKカリウムイオンチャネルを活性化してタリウムを流入させることができるGタンパク質共役受容体アゴニストである、請求項51記載の方法。
- 刺激がニコチン、アセチルコリン、ムスカリン、カルバミリン、またはGIRKカリウムイオンチャネル活性化剤である、請求項51記載の方法。
- 刺激がイオンチャネルの脱分極を生じる組成物を含む、請求項51記載の方法。
- 組成物がイオノフォア、バリノマイシン、またはカリウム塩を含む、請求項55記載の方法。
- 組成物がチャネル・ロドプシン、ハロロドプシン、または量子ドットナノ結晶を含む、請求項55記載の方法。
- 以下の段階を含む、細胞内のイオンチャネルの活性を検出する方法:
a)イオンチャネルを含む細胞にタリウムを負荷する段階、
b)細胞に、タリウム指示薬および生理的濃度の塩素イオンを含む溶液を提供する段階、
c)イオンチャネルを通してタリウムの流出を生じるように細胞のイオンチャネルを刺激する段階、ならびに
d)タリウム指示薬を検出する段階。 - 過剰のタリウムを除去するために細胞を洗浄する段階をさらに含む、請求項58記載の方法。
- イオンチャネルがタリウム指示薬に対して不透過性である、請求項58記載の方法。
- 以下の段階を含む、細胞内のイオンチャネルの活性を検出する方法:
a)細胞を添加緩衝液と接触させる段階であって、ここで該細胞はイオンチャネルを含み、かつ該添加緩衝液はタリウム指示薬および生理的濃度の塩素イオンを含む、段階、
b)該細胞にタリウムを含む刺激緩衝液を提供する段階であって、それによりイオンチャネルを通してのタリウムの細胞への流入が起こる、段階、ならびに
c)タリウム指示薬を検出する段階。 - イオンチャネルがカリウムイオンチャネル、受容体に連結したイオンチャネル、チャネル連結型受容体、およびイオントランスポーターから選択される、請求項1〜61のいずれか一項記載の方法。
- イオンチャネルがリガンドまたは電位依存性のイオンチャネル、伸展活性化カチオンチャネル、または選択的または非選択的カチオンチャネルである、請求項1〜61のいずれか一項記載の方法。
- 細胞が細菌、酵母、植物および動物細胞から成る群より選択される、請求項1〜61のいずれか一項記載の方法。
- 細胞が哺乳動物細胞である、請求項1〜61のいずれか一項記載の方法。
- 細胞がカリウムチャネルを含む、請求項1〜61のいずれか一項記載の方法。
- 細胞がニューロン、心臓細胞、がん細胞、または平滑筋細胞である、請求項1〜61のいずれか一項記載の方法。
- 細胞が不死化細胞である、請求項1〜61のいずれか一項記載の方法。
- イオンチャネルがタリウムイオンに対して透過性である、請求項1〜61のいずれか一項記載の方法。
- タリウム指示薬がANTS、Fluo-4、Fluo-3、PBFI、フェングリーン、マグネシウムグリーン、Mag-Fura Red、Fluo-4FF、FluoZin-1およびFluoZin-2、RhodZin-3、またはその誘導体もしくは塩から成る群より選択される、請求項1〜61のいずれか一項記載の方法。
- タリウム指示薬がANTS、Fluo-4、Fluo-3、PBFI、フェングリーン、マグネシウムグリーン、Mag-Fura Red、Fluo-4FF、FluoZin-1、RhodZin-3およびFluoZin-2、またはその塩から成る群より選択される化合物のアセトキシメチル(AM)エステル誘導体である、請求項1〜61のいずれか一項記載の方法。
- 以下を含む、細胞内のイオンチャネルの活性を検出するためのキット:
a)タリウム指示薬および生理的濃度の塩素イオンを含む添加緩衝液、ならびに
b)タリウムを含み、かつイオンチャネルを通してのタリウムの細胞への流入を引き起こす刺激緩衝液。 - 以下を含む、細胞内のイオンチャネルの活性を検出するためのキット:
a)タリウムを含むタリウム負荷溶液、ならびに
b)タリウム指示薬および生理的濃度の塩素イオンを含む添加緩衝液。 - 以下を含む、細胞内のイオンチャネルの活性を検出するための溶液:
a)タリウム指示薬、
b)生理的濃度の塩素イオン、および
c)タリウム。 - 溶液中のタリウム濃度が< 4.5 mMである、請求項74記載の溶液。
- 溶液中のタリウム濃度が約0.1 mM〜約4 mMである、請求項74記載の溶液。
- 溶液中のタリウム濃度が約0.1 mM〜約2 mMである、請求項74記載の溶液。
- 溶液中の塩素イオン濃度が約10 mM〜約150 mMである、請求項74〜77のいずれか一項記載の溶液。
- 溶液中の塩素イオン濃度が約50 mM〜約150 mMである、請求項74〜77のいずれか一項記載の溶液。
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