HU231387B1 - Fluoreszcens festékfelhalmozódási vizsgálat - Google Patents
Fluoreszcens festékfelhalmozódási vizsgálat Download PDFInfo
- Publication number
- HU231387B1 HU231387B1 HUP1700432A HUP1700432A HU231387B1 HU 231387 B1 HU231387 B1 HU 231387B1 HU P1700432 A HUP1700432 A HU P1700432A HU P1700432 A HUP1700432 A HU P1700432A HU 231387 B1 HU231387 B1 HU 231387B1
- Authority
- HU
- Hungary
- Prior art keywords
- cells
- compound
- fluorescein derivative
- level
- sample
- Prior art date
Links
- 238000009825 accumulation Methods 0.000 title claims description 89
- 238000003556 assay Methods 0.000 title description 16
- 239000007850 fluorescent dye Substances 0.000 title description 7
- 230000000694 effects Effects 0.000 claims description 107
- 108010078791 Carrier Proteins Proteins 0.000 claims description 92
- 102000005416 ATP-Binding Cassette Transporters Human genes 0.000 claims description 84
- 108010006533 ATP-Binding Cassette Transporters Proteins 0.000 claims description 84
- 108010090306 Member 2 Subfamily G ATP Binding Cassette Transporter Proteins 0.000 claims description 74
- -1 fluorescein derivative ester compound Chemical class 0.000 claims description 73
- 102100022595 Broad substrate specificity ATP-binding cassette transporter ABCG2 Human genes 0.000 claims description 66
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 55
- 238000012360 testing method Methods 0.000 claims description 55
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 claims description 54
- 239000000523 sample Substances 0.000 claims description 44
- 108010047230 Member 1 Subfamily B ATP Binding Cassette Transporter Proteins 0.000 claims description 38
- 102100033350 ATP-dependent translocase ABCB1 Human genes 0.000 claims description 36
- XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N Urea Chemical compound NC(N)=O XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 36
- 239000012472 biological sample Substances 0.000 claims description 35
- 239000013642 negative control Substances 0.000 claims description 27
- DGEZNRSVGBDHLK-UHFFFAOYSA-N [1,10]phenanthroline Chemical compound C1=CN=C2C3=NC=CC=C3C=CC2=C1 DGEZNRSVGBDHLK-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 24
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 claims description 24
- UMGDCJDMYOKAJW-UHFFFAOYSA-N thiourea Chemical compound NC(N)=S UMGDCJDMYOKAJW-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 24
- 230000036457 multidrug resistance Effects 0.000 claims description 22
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 claims description 20
- YNPNZTXNASCQKK-UHFFFAOYSA-N Phenanthrene Natural products C1=CC=C2C3=CC=CC=C3C=CC2=C1 YNPNZTXNASCQKK-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 19
- 238000005259 measurement Methods 0.000 claims description 18
- 229910052801 chlorine Inorganic materials 0.000 claims description 17
- 238000000684 flow cytometry Methods 0.000 claims description 17
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 claims description 14
- 125000003917 carbamoyl group Chemical group [H]N([H])C(*)=O 0.000 claims description 13
- GNBHRKFJIUUOQI-UHFFFAOYSA-N fluorescein Chemical group O1C(=O)C2=CC=CC=C2C21C1=CC=C(O)C=C1OC1=CC(O)=CC=C21 GNBHRKFJIUUOQI-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 13
- 229910052739 hydrogen Inorganic materials 0.000 claims description 13
- 239000004202 carbamide Substances 0.000 claims description 12
- 230000002209 hydrophobic effect Effects 0.000 claims description 12
- 229910052731 fluorine Inorganic materials 0.000 claims description 11
- 101000823298 Homo sapiens Broad substrate specificity ATP-binding cassette transporter ABCG2 Proteins 0.000 claims description 9
- 239000000872 buffer Substances 0.000 claims description 9
- 125000002496 methyl group Chemical group [H]C([H])([H])* 0.000 claims description 9
- 108090000371 Esterases Proteins 0.000 claims description 8
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 claims description 8
- 150000002148 esters Chemical class 0.000 claims description 8
- 229910052751 metal Inorganic materials 0.000 claims description 7
- 239000002184 metal Substances 0.000 claims description 7
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 claims description 6
- 239000002738 chelating agent Substances 0.000 claims description 6
- 125000001495 ethyl group Chemical group [H]C([H])([H])C([H])([H])* 0.000 claims description 6
- 150000002391 heterocyclic compounds Chemical class 0.000 claims description 6
- 239000012160 loading buffer Substances 0.000 claims description 6
- 230000008569 process Effects 0.000 claims description 6
- 238000010791 quenching Methods 0.000 claims description 6
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 5
- 229910052794 bromium Inorganic materials 0.000 claims description 5
- 230000000171 quenching effect Effects 0.000 claims description 5
- 102100021339 Multidrug resistance-associated protein 1 Human genes 0.000 claims description 4
- 125000003342 alkenyl group Chemical group 0.000 claims description 4
- 125000004429 atom Chemical group 0.000 claims description 4
- 238000000799 fluorescence microscopy Methods 0.000 claims description 4
- 108010066052 multidrug resistance-associated protein 1 Proteins 0.000 claims description 4
- QJGQUHMNIGDVPM-UHFFFAOYSA-N nitrogen group Chemical group [N] QJGQUHMNIGDVPM-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- 102000014914 Carrier Proteins Human genes 0.000 claims description 3
- 239000012190 activator Substances 0.000 claims description 3
- 150000002500 ions Chemical class 0.000 claims description 3
- 150000002987 phenanthrenes Chemical class 0.000 claims description 3
- 125000001792 phenanthrenyl group Chemical group C1(=CC=CC=2C3=CC=CC=C3C=CC12)* 0.000 claims description 3
- 125000001436 propyl group Chemical group [H]C([*])([H])C([H])([H])C([H])([H])[H] 0.000 claims description 3
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 claims description 3
- 102000040811 transporter activity Human genes 0.000 claims description 3
- 108091092194 transporter activity Proteins 0.000 claims description 3
- 238000005558 fluorometry Methods 0.000 claims description 2
- 229910052736 halogen Inorganic materials 0.000 claims description 2
- 150000002367 halogens Chemical class 0.000 claims description 2
- 239000001257 hydrogen Substances 0.000 claims description 2
- 125000004435 hydrogen atom Chemical class [H]* 0.000 claims description 2
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 claims description 2
- 125000002577 pseudohalo group Chemical group 0.000 claims description 2
- 150000002440 hydroxy compounds Chemical class 0.000 claims 4
- 241000517645 Abra Species 0.000 claims 1
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 246
- 230000035508 accumulation Effects 0.000 description 82
- 239000000975 dye Substances 0.000 description 26
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 24
- 230000032258 transport Effects 0.000 description 20
- 229960001156 mitoxantrone Drugs 0.000 description 19
- KKZJGLLVHKMTCM-UHFFFAOYSA-N mitoxantrone Chemical compound O=C1C2=C(O)C=CC(O)=C2C(=O)C2=C1C(NCCNCCO)=CC=C2NCCNCCO KKZJGLLVHKMTCM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 19
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 18
- 230000006870 function Effects 0.000 description 17
- 239000012591 Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline Substances 0.000 description 15
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 15
- 102000013013 Member 2 Subfamily G ATP Binding Cassette Transporter Human genes 0.000 description 14
- 229910021645 metal ion Inorganic materials 0.000 description 14
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 13
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 12
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 11
- 239000000463 material Substances 0.000 description 11
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 11
- 238000001125 extrusion Methods 0.000 description 9
- 125000005647 linker group Chemical group 0.000 description 9
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 9
- LGGHDPFKSSRQNS-UHFFFAOYSA-N Tariquidar Chemical compound C1=CC=CC2=CC(C(=O)NC3=CC(OC)=C(OC)C=C3C(=O)NC3=CC=C(C=C3)CCN3CCC=4C=C(C(=CC=4C3)OC)OC)=CN=C21 LGGHDPFKSSRQNS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 8
- 150000003857 carboxamides Chemical class 0.000 description 8
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 8
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 8
- WHQCHUCQKNIQEC-UHFFFAOYSA-N benzbromarone Chemical compound CCC=1OC2=CC=CC=C2C=1C(=O)C1=CC(Br)=C(O)C(Br)=C1 WHQCHUCQKNIQEC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- 229960002529 benzbromarone Drugs 0.000 description 7
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 7
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 7
- 102000005681 phospholamban Human genes 0.000 description 7
- 108010059929 phospholamban Proteins 0.000 description 7
- 229950005890 tariquidar Drugs 0.000 description 7
- 238000001262 western blot Methods 0.000 description 7
- OZFAFGSSMRRTDW-UHFFFAOYSA-N (2,4-dichlorophenyl) benzenesulfonate Chemical compound ClC1=CC(Cl)=CC=C1OS(=O)(=O)C1=CC=CC=C1 OZFAFGSSMRRTDW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 description 6
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 6
- 210000000170 cell membrane Anatomy 0.000 description 6
- 230000004663 cell proliferation Effects 0.000 description 6
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 6
- 238000003125 immunofluorescent labeling Methods 0.000 description 6
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 6
- 102000003939 Membrane transport proteins Human genes 0.000 description 5
- 108090000301 Membrane transport proteins Proteins 0.000 description 5
- 230000027455 binding Effects 0.000 description 5
- 238000004364 calculation method Methods 0.000 description 5
- 210000005260 human cell Anatomy 0.000 description 5
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 5
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 5
- ZKHQWZAMYRWXGA-KQYNXXCUSA-J ATP(4-) Chemical compound C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1[C@@H]1O[C@H](COP([O-])(=O)OP([O-])(=O)OP([O-])([O-])=O)[C@@H](O)[C@H]1O ZKHQWZAMYRWXGA-KQYNXXCUSA-J 0.000 description 4
- ZKHQWZAMYRWXGA-UHFFFAOYSA-N Adenosine triphosphate Natural products C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1C1OC(COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)C(O)C1O ZKHQWZAMYRWXGA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N Carbon Chemical compound [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 4
- 230000001093 anti-cancer Effects 0.000 description 4
- 230000003833 cell viability Effects 0.000 description 4
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 4
- 125000002887 hydroxy group Chemical group [H]O* 0.000 description 4
- 210000000130 stem cell Anatomy 0.000 description 4
- PRDFBSVERLRRMY-UHFFFAOYSA-N 2'-(4-ethoxyphenyl)-5-(4-methylpiperazin-1-yl)-2,5'-bibenzimidazole Chemical compound C1=CC(OCC)=CC=C1C1=NC2=CC=C(C=3NC4=CC(=CC=C4N=3)N3CCN(C)CC3)C=C2N1 PRDFBSVERLRRMY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000012114 Alexa Fluor 647 Substances 0.000 description 3
- 108010051152 Carboxylesterase Proteins 0.000 description 3
- 102000013392 Carboxylesterase Human genes 0.000 description 3
- 241000251539 Vertebrata <Metazoa> Species 0.000 description 3
- 108010046516 Wheat Germ Agglutinins Proteins 0.000 description 3
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 3
- 239000006143 cell culture medium Substances 0.000 description 3
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 3
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 3
- 238000004624 confocal microscopy Methods 0.000 description 3
- 231100000433 cytotoxic Toxicity 0.000 description 3
- 230000001472 cytotoxic effect Effects 0.000 description 3
- 230000002900 effect on cell Effects 0.000 description 3
- 238000012744 immunostaining Methods 0.000 description 3
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 3
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 description 3
- 238000011068 loading method Methods 0.000 description 3
- 231100000252 nontoxic Toxicity 0.000 description 3
- 230000003000 nontoxic effect Effects 0.000 description 3
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 description 3
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 3
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 3
- 231100000331 toxic Toxicity 0.000 description 3
- 230000002588 toxic effect Effects 0.000 description 3
- 231100000419 toxicity Toxicity 0.000 description 3
- 230000001988 toxicity Effects 0.000 description 3
- 108091006112 ATPases Proteins 0.000 description 2
- 241000251468 Actinopterygii Species 0.000 description 2
- 102000057290 Adenosine Triphosphatases Human genes 0.000 description 2
- 239000012103 Alexa Fluor 488 Substances 0.000 description 2
- 241000238421 Arthropoda Species 0.000 description 2
- 206010013710 Drug interaction Diseases 0.000 description 2
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 2
- 241000238631 Hexapoda Species 0.000 description 2
- XEEYBQQBJWHFJM-UHFFFAOYSA-N Iron Chemical compound [Fe] XEEYBQQBJWHFJM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000270322 Lepidosauria Species 0.000 description 2
- 229940124639 Selective inhibitor Drugs 0.000 description 2
- 108010091105 Subfamily B ATP Binding Cassette Transporter Proteins 0.000 description 2
- 102000018075 Subfamily B ATP Binding Cassette Transporter Human genes 0.000 description 2
- QHNORJFCVHUPNH-UHFFFAOYSA-L To-Pro-3 Chemical compound [I-].[I-].S1C2=CC=CC=C2[N+](C)=C1C=CC=C1C2=CC=CC=C2N(CCC[N+](C)(C)C)C=C1 QHNORJFCVHUPNH-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 2
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 2
- 210000001124 body fluid Anatomy 0.000 description 2
- 239000010839 body fluid Substances 0.000 description 2
- BQRGNLJZBFXNCZ-UHFFFAOYSA-N calcein am Chemical compound O1C(=O)C2=CC=CC=C2C21C1=CC(CN(CC(=O)OCOC(C)=O)CC(=O)OCOC(C)=O)=C(OC(C)=O)C=C1OC1=C2C=C(CN(CC(=O)OCOC(C)=O)CC(=O)OCOC(=O)C)C(OC(C)=O)=C1 BQRGNLJZBFXNCZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 150000001721 carbon Chemical group 0.000 description 2
- 210000001175 cerebrospinal fluid Anatomy 0.000 description 2
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 2
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 2
- 239000013068 control sample Substances 0.000 description 2
- 210000000805 cytoplasm Anatomy 0.000 description 2
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 2
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 2
- 238000002825 functional assay Methods 0.000 description 2
- 238000011990 functional testing Methods 0.000 description 2
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 2
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 2
- XMBWDFGMSWQBCA-UHFFFAOYSA-N hydrogen iodide Chemical compound I XMBWDFGMSWQBCA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000007062 hydrolysis Effects 0.000 description 2
- 238000006460 hydrolysis reaction Methods 0.000 description 2
- 238000010166 immunofluorescence Methods 0.000 description 2
- 239000004615 ingredient Substances 0.000 description 2
- 125000001977 isobenzofuranyl group Chemical group C=1(OC=C2C=CC=CC12)* 0.000 description 2
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 2
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 2
- 239000003068 molecular probe Substances 0.000 description 2
- 230000036961 partial effect Effects 0.000 description 2
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 2
- 230000001177 retroviral effect Effects 0.000 description 2
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 2
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 2
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 2
- 238000007619 statistical method Methods 0.000 description 2
- 230000026683 transduction Effects 0.000 description 2
- 238000010361 transduction Methods 0.000 description 2
- 230000035899 viability Effects 0.000 description 2
- 239000002676 xenobiotic agent Substances 0.000 description 2
- NDVRKEKNSBMTAX-BTVCFUMJSA-N (2r,3s,4r,5r)-2,3,4,5,6-pentahydroxyhexanal;phosphoric acid Chemical compound OP(O)(O)=O.OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)C=O NDVRKEKNSBMTAX-BTVCFUMJSA-N 0.000 description 1
- NSMJMUQZRGZMQC-UHFFFAOYSA-N 2-naphthalen-1-yl-1H-imidazo[4,5-f][1,10]phenanthroline Chemical compound C12=CC=CN=C2C2=NC=CC=C2C2=C1NC(C=1C3=CC=CC=C3C=CC=1)=N2 NSMJMUQZRGZMQC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000041104 ABCB family Human genes 0.000 description 1
- 108091060863 ABCB family Proteins 0.000 description 1
- 102000041103 ABCC family Human genes 0.000 description 1
- 108091060864 ABCC family Proteins 0.000 description 1
- 102000041106 ABCG family Human genes 0.000 description 1
- 108091060882 ABCG family Proteins 0.000 description 1
- RZVAJINKPMORJF-UHFFFAOYSA-N Acetaminophen Chemical compound CC(=O)NC1=CC=C(O)C=C1 RZVAJINKPMORJF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241001432959 Chernes Species 0.000 description 1
- 241000526051 Chrysogonum virginianum Species 0.000 description 1
- 230000004568 DNA-binding Effects 0.000 description 1
- 206010059866 Drug resistance Diseases 0.000 description 1
- 239000006144 Dulbecco’s modified Eagle's medium Substances 0.000 description 1
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 1
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 1
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101000938351 Homo sapiens Ephrin type-A receptor 3 Proteins 0.000 description 1
- 101000941289 Homo sapiens Hepatic triacylglycerol lipase Proteins 0.000 description 1
- 101001047912 Homo sapiens Hydroxymethylglutaryl-CoA lyase, mitochondrial Proteins 0.000 description 1
- 101000573199 Homo sapiens Protein PML Proteins 0.000 description 1
- 239000005411 L01XE02 - Gefitinib Substances 0.000 description 1
- 102000011279 Multidrug resistance protein 1 Human genes 0.000 description 1
- 102000014842 Multidrug resistance proteins Human genes 0.000 description 1
- 108050005144 Multidrug resistance proteins Proteins 0.000 description 1
- 241000771698 Nerada Species 0.000 description 1
- 108700020796 Oncogene Proteins 0.000 description 1
- 206010036790 Productive cough Diseases 0.000 description 1
- 239000012979 RPMI medium Substances 0.000 description 1
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 101000986624 Streptococcus pyogenes Fibrinogen- and Ig-binding protein Proteins 0.000 description 1
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 1
- 230000009471 action Effects 0.000 description 1
- 230000009056 active transport Effects 0.000 description 1
- 239000002246 antineoplastic agent Substances 0.000 description 1
- 230000008827 biological function Effects 0.000 description 1
- 230000031018 biological processes and functions Effects 0.000 description 1
- 238000001574 biopsy Methods 0.000 description 1
- 230000008499 blood brain barrier function Effects 0.000 description 1
- 210000001218 blood-brain barrier Anatomy 0.000 description 1
- 210000004556 brain Anatomy 0.000 description 1
- WLZRMCYVCSSEQC-UHFFFAOYSA-N cadmium(2+) Chemical compound [Cd+2] WLZRMCYVCSSEQC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- DEGAKNSWVGKMLS-UHFFFAOYSA-N calcein Chemical compound O1C(=O)C2=CC=CC=C2C21C1=CC(CN(CC(O)=O)CC(O)=O)=C(O)C=C1OC1=C2C=C(CN(CC(O)=O)CC(=O)O)C(O)=C1 DEGAKNSWVGKMLS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000003197 catalytic effect Effects 0.000 description 1
- 230000003915 cell function Effects 0.000 description 1
- 108091092356 cellular DNA Proteins 0.000 description 1
- 230000019522 cellular metabolic process Effects 0.000 description 1
- 230000007541 cellular toxicity Effects 0.000 description 1
- 230000000973 chemotherapeutic effect Effects 0.000 description 1
- 230000002860 competitive effect Effects 0.000 description 1
- 238000001218 confocal laser scanning microscopy Methods 0.000 description 1
- 238000000942 confocal micrograph Methods 0.000 description 1
- 230000006743 cytoplasmic accumulation Effects 0.000 description 1
- 230000001086 cytosolic effect Effects 0.000 description 1
- 229940127089 cytotoxic agent Drugs 0.000 description 1
- 239000002254 cytotoxic agent Substances 0.000 description 1
- 231100000599 cytotoxic agent Toxicity 0.000 description 1
- 230000003013 cytotoxicity Effects 0.000 description 1
- 231100000135 cytotoxicity Toxicity 0.000 description 1
- 230000007423 decrease Effects 0.000 description 1
- LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I dipotassium trisodium dihydrogen phosphate hydrogen phosphate dichloride Chemical compound P(=O)(O)(O)[O-].[K+].P(=O)(O)([O-])[O-].[Na+].[Na+].[Cl-].[K+].[Cl-].[Na+] LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I 0.000 description 1
- 238000009826 distribution Methods 0.000 description 1
- 238000009509 drug development Methods 0.000 description 1
- 230000036267 drug metabolism Effects 0.000 description 1
- 230000008406 drug-drug interaction Effects 0.000 description 1
- 230000008030 elimination Effects 0.000 description 1
- 238000003379 elimination reaction Methods 0.000 description 1
- 125000004185 ester group Chemical group 0.000 description 1
- 230000003203 everyday effect Effects 0.000 description 1
- 230000005284 excitation Effects 0.000 description 1
- 230000029142 excretion Effects 0.000 description 1
- 238000011049 filling Methods 0.000 description 1
- MHMNJMPURVTYEJ-UHFFFAOYSA-N fluorescein-5-isothiocyanate Chemical compound O1C(=O)C2=CC(N=C=S)=CC=C2C21C1=CC=C(O)C=C1OC1=CC(O)=CC=C21 MHMNJMPURVTYEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000001943 fluorescence-activated cell sorting Methods 0.000 description 1
- XGALLCVXEZPNRQ-UHFFFAOYSA-N gefitinib Chemical compound C=12C=C(OCCCN3CCOCC3)C(OC)=CC2=NC=NC=1NC1=CC=C(F)C(Cl)=C1 XGALLCVXEZPNRQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910001385 heavy metal Inorganic materials 0.000 description 1
- 102000057382 human EPHA3 Human genes 0.000 description 1
- 102000054896 human PML Human genes 0.000 description 1
- 210000004408 hybridoma Anatomy 0.000 description 1
- 230000003301 hydrolyzing effect Effects 0.000 description 1
- 230000008676 import Effects 0.000 description 1
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 1
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 1
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 1
- 238000011835 investigation Methods 0.000 description 1
- 150000004694 iodide salts Chemical class 0.000 description 1
- 229940084651 iressa Drugs 0.000 description 1
- 229910052742 iron Inorganic materials 0.000 description 1
- 210000003292 kidney cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000002372 labelling Methods 0.000 description 1
- 210000004185 liver Anatomy 0.000 description 1
- 230000007774 longterm Effects 0.000 description 1
- 238000012423 maintenance Methods 0.000 description 1
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 1
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 1
- 230000004060 metabolic process Effects 0.000 description 1
- 239000003475 metalloproteinase inhibitor Substances 0.000 description 1
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 1
- 238000000386 microscopy Methods 0.000 description 1
- 230000009456 molecular mechanism Effects 0.000 description 1
- 125000004433 nitrogen atom Chemical group N* 0.000 description 1
- 229960002378 oftasceine Drugs 0.000 description 1
- 238000006384 oligomerization reaction Methods 0.000 description 1
- 230000002018 overexpression Effects 0.000 description 1
- 238000010422 painting Methods 0.000 description 1
- 239000002953 phosphate buffered saline Substances 0.000 description 1
- 210000002381 plasma Anatomy 0.000 description 1
- 239000013641 positive control Substances 0.000 description 1
- 231100000683 possible toxicity Toxicity 0.000 description 1
- 230000003334 potential effect Effects 0.000 description 1
- 230000004853 protein function Effects 0.000 description 1
- 238000011158 quantitative evaluation Methods 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 1
- 210000003802 sputum Anatomy 0.000 description 1
- 208000024794 sputum Diseases 0.000 description 1
- 230000010473 stable expression Effects 0.000 description 1
- 125000001424 substituent group Chemical group 0.000 description 1
- 230000001629 suppression Effects 0.000 description 1
- 229940124597 therapeutic agent Drugs 0.000 description 1
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 1
- 230000036962 time dependent Effects 0.000 description 1
- 231100000820 toxicity test Toxicity 0.000 description 1
- 238000003569 transporter assay Methods 0.000 description 1
- 210000004881 tumor cell Anatomy 0.000 description 1
- 210000002700 urine Anatomy 0.000 description 1
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/58—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving labelled substances
- G01N33/582—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving labelled substances with fluorescent label
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P17/00—Preparation of heterocyclic carbon compounds with only O, N, S, Se or Te as ring hetero atoms
- C12P17/02—Oxygen as only ring hetero atoms
- C12P17/06—Oxygen as only ring hetero atoms containing a six-membered hetero ring, e.g. fluorescein
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N21/00—Investigating or analysing materials by the use of optical means, i.e. using sub-millimetre waves, infrared, visible or ultraviolet light
- G01N21/62—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light
- G01N21/63—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light optically excited
- G01N21/64—Fluorescence; Phosphorescence
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/5005—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells
- G01N33/5008—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics
- G01N33/502—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics for testing non-proliferative effects
- G01N33/5035—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics for testing non-proliferative effects on sub-cellular localization
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/58—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving labelled substances
- G01N33/60—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving labelled substances involving radioactive labelled substances
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N2800/00—Detection or diagnosis of diseases
- G01N2800/52—Predicting or monitoring the response to treatment, e.g. for selection of therapy based on assay results in personalised medicine; Prognosis
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N2800/00—Detection or diagnosis of diseases
- G01N2800/70—Mechanisms involved in disease identification
- G01N2800/7023—(Hyper)proliferation
- G01N2800/7028—Cancer
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Immunology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Hematology (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Pathology (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Luminescent Compositions (AREA)
- Non-Silver Salt Photosensitive Materials And Non-Silver Salt Photography (AREA)
- Photoreceptors In Electrophotography (AREA)
Description
FLUORESZCENS FESTÉKFELHALMOZÓDÁSI VIZSGÁLAT
A TALÁLMÁNY TÁRGYKÖRE
A találmány tárgya fluoreszcensfesték-felhalmozódási vizsgálat hidrofób heterociklusos vegyületek biológiai mintában történő transzportálására képes, ABC transzporterek B, C vagy G családjába tartozó ABCmultidrog-transzporterek, mint effluxpumpák vizsgálatára, Különösen, a találmány tárgya ABCG2, ABCB1 és ABCC1 multidrogtranszporterek működésének mérése fluoreszcens festék sejtben való felhalmozódásának kimutatása révén.
A TALÁLMÁNY HÁTTERE
A tumorok multidrog rezisztenciájában és a xenobiotikumok általános eliminációjában kulcsfontosságúak az ABC multidrog-transzporterek, így ezek funkcionális vizsgálatai fontos eszközöket biztosítanak a kutatási és diagnosztikai alkalmazások számára. A membrántranszporterek ATP-kötö kazetta (ABC) szupercsaládjának számos tagja sokféle xenobiotikum és drog esetében működik efflux pumpaként. Ennélfogva, ezek a transzporterek fontos szereplők a rákellenes gyógyászati vegyületek elleni multidrog rezisztenciában, és jelentősen módosítják számos terápiás ágens felszívódási, eloszlási, anyagcsere, kiválasztási és toxicitási (ADMETox) paramétereit. Az emberi tumorok különféle drogokkal szembeni rezisztenciájában és gyógyszeranyagcserében résztvevő három kulcsfontosságú ABC efflux transzporter az ABCB1 (P-glikoprotein, Pgp), az ABCC1 (multidrog rezisztencia fehérje 1, MRP1) és az ABCG2 (mellrák rezisztencia fehérje, BCRP) fehérje, így ezek értékelése kiemelkedően fontos a gyógyszerfejlesztésben és a klinikai diagnosztikában [Doyle LA et al. Oncogene. 2003; Sarkadi B et al. Physiol Rev. 2006; Dean M et al. Nat Rév. 2005; Szakács G et al. Drug Discov Today. 2008; Robey RW et al. Curr Pharm Biotechnoi. 2012; Horsey AJ et al. Biochem Soc Trans. 2016], Az a tény, hogy a transzporterek számos drogot kötnek és szállítanak, e transzporterek expressziója és működése okozta drogkölcsönhatások és lehetséges drog-drog kölcsönhatások molekuláris mechanizmusai nagyrészt felderítetlenek. Mivel az ABC-transzporterek újkeletű szerkezeti és modellezési adatai [Taylor NM1 et al. Nature. 2017; László L et al. PLoS One. 2016] továbbra sem elegendőek a szubsztrátok közötti kölcsönhatások molekuláris szintű előrejelzéséhez, és így kiemelkedően fontosak e kölcsönhatások értékelésére szolgáló kísérleti eljárások.
A drog-kölcsönhatások potenciális hatásainak értékelésére hatékony vizsgálatokkal kell kiegészíteni az ABC multidrog-transzportfehérje expressziójára és elhelyezkedésére vonatkozó adatokat. Az ABC-transzporterek funkciójának értékelésére különféle vizsgálatok léteznek, beleértve droggal serkentett ATPáz aktivitást, egész sejten vagy invertált membránvezikulumokon végzett közvetlen drogtranszport-mérést, és olyan, széleskörben alkalmazott vizsgálati rendszer is létezik, amely fluoreszcens transzporterszubsztrátok élő sejtből történő extrúzióját követi nyomon [Hegedűs C, et al. Adv Drug Deliv Rév. 2009; Strouse JJ et al. Anal Biochem. 2013], Celluláris DNS-el való kölcsönhatáskor fluoreszcensé váló transzporterszubsztrát festékeket (például, Hoechst 33342 vagy DCV) már hatékonyan alkalmazzák e transzporterek celluláris funkciójának vizsgálatára [Strouse JJ, Id. fenn, Telford WG et al. Stem Cells. 2007; Boesch M et al. Cytom Part 2012; Boesch M et al. Stem Cells Int. 2016 Nerada Z et al. Cytom Part A. 2016], azonban e vegyületek hosszú távon mérgezöek és még nem találtak olyan festéket, amely mind a három fő ABC drogtranszportemek közös szubsztrátja lenne. Nem publikált szerkezetű eFluxx-IDH Green és Gold festékekkel végzett transzport vizsgálat eredményei ugyan előrevetítik a három multidrog-transzporter párhuzamos vizsgálatát, ám e festék viszonylag erősen toxikus [Lebedeva 1 V et al.
MlllillllH
SZTNH-100354840
122444-15508/SG
W ft ft ft ft ft
PLoS One. 2011],
A celluláris transzporterek vizsgálatának érzékenysége akkor nőtt meg jelentősen, amikor az ABCtranszporter által extrudált szubsztrát nem volt fluoreszcens, és egy adott magasan fluoreszkáló származék celluláris metabolizmustól függő felhalmozódását a transzporter aktivitása erősen lecsökkentette. Már elérhető ilyen, például a nem toxikus Calcein-AM sejtéletképességi festék alkalmazásával végzett, ABCB1 és ABCC1 vizsgálat [Homolya L. et al., 1993; Homolya L. et al. Br J Cancer. 1996; Karászi É et al. Br J Haematol. 2001,112: 308-314. Sarkadi et al., EP0784699B1 Published in 1996; Sarkadi et al. US5872014 patent granted on Feb 19, 1999].
Egy vizsgálat során váratlanul felismertük, hogy emberi ABC kulcsfontosságú transzportfunkciója értékelhető 3’,6-dihidroxi-fluoreszcein fluorofórhoz a fenantrolin 5. vagy 6. szénatomján (vagy a megfelelő fenantrénváz 9-10. szénatomján) keresztül és a fluoreszcein fluorofór izobenzofuranil csoportjának 5. szénatomján keresztül; kovalensen kapcsoló L csoport révén kapcsolódó fenantrolincsoportot vagy annak analógját tartalmazó sejtpermeábilis fluoreszcens fémion-indikátorral, ahol a (előnyösen nem fluoreszcens) fluoreszcein hidrofób észter formája lehetővé teszi a festék behatolását a sejtbe, ahol a celluláris észterázok hasítása után, kioltó (quenching) fémionok távollétében a festék erősen fluoreszcenssé válik. Felismertük, hogy a funkcionális ABC multidrog-transzportereket, különösen ABCG2-, ABCB1-, vagy ABCC1-transzportereket expresszáló sejtekben, a celluláris festék fluoreszcenciája erősen lecsökken.
Eszerint, a fluoreszcens festékfelhalmozódási vizsgálat, előnyösen a találmány szerinti PG-felhalmozódási vizsgálat új, egyedülálló eszköz a találmány szerinti festékeket transzportáló ABC multidrog-transzporterek, különösen az ABCG2, ABCB1, és ABCC1 multidrog-transzporterek funkciójának párhuzamos meghatározására. Előnyösen, a festékek, különösen PG festékek sejtes toxicitása nagyon alacsony. A felhalmozódási vizsgálat e transzporterek bármelyikét expresszáló sejtpopulációk szelektálását, elválasztását és tenyésztését is lehetővé teszi.
A TALÁLMÁNY RÖVID ISMERTETÉSE
A találmány egy első szempontja szerint, a találmány tárgya hidrofób heterociklusos vegyületek biológiai mintában történő transzportálására képes ABC-multidrog-transzporter ABC-transzporteraktivitásának értékelésére szolgáló eljárás, amely eljárás az alábbi lépéseket tartalmazza:
(a) biológiai minta sejtpopulációjának, azaz sejtmintáknak, és adott esetben, kontroll ABC-transzporter aktivitási szintű negatív kontroll sejteknek (vagy negatív kontroll sejtek egy vagy több populációjának) (azaz olyan sejtek, amelyekben nincs ABC-transzporter aktivitás vagy ha a kontroll esetében az ABC-transzporter aktivitás elegendő mértékben alacsony, azaz az ABC-transzporter aktivitás nem ér el egy küszöbértéket vagy a viszonyítási ABC-transzporter aktivitást) expozíciója egy (la) általános képletü fluoreszceinszármazék észtervegyületnek abból a célból, hogy a sejteket egy töltőközegben feltöltsük az észterszármazék-vegyülettel, ahol a sejten belüli celluláris észterázok a megfelelő fluoreszceinszármazék hidroxivegyületté tudják hidrolizálni az észtervegyületet;
122444-15508/SG
PHEN (la) ahol
R1 és R2 egymástól függetlenül hidrogént, halogéneket és pszeudohalogéneket tartalmazó csoportból, előnyösen H, F, Cl és Br közül választott, előnyösebben H és Cl vagy Cl és F közül választott; a találmány előnyös megvalósítási módjában az R1 és R2 azonos,
R3 és R4 egymástól függetlenül metil, etil vagy propil, előnyösen metil vagy etil, igen előnyösen metil, ahol előnyösen R3 és R4 azonos.
Az L C és N közül választott 2-5 láncatomot tartalmazó linker, előnyösen a linker a fluoreszceincsoport és a PHEN csoport pi elektronjait tartalmazó konjugált pi elektronrendszert alkot, és/vagy az L az aminokarbonil (karboxamid), karbamid, tiokarbamid, alkenil, C2- vagy C4 alkenilamin és C3 alkenilamid közül választott, előnyösen aminokarbonil (karboxamid), karbamid, és tiokarbamid közül választott,
PHEN a fenantrénváz 1-8 pozíciójának bármelyikében 1, 2 vagy 3 gyürünitrogént, előnyösen 2 gyürünitrogént tartalmazó fenantrénszármazék, ahol az L kovalensen kötődik a PHEN-hez a fenantrénváz 9. vagy 10. pozíciójának megfelelő pozícióban, és (b) összehasonlítjuk a mintasejtekben felhalmozódó fluoreszceinszármazék vegyület (az észter- vagy a hidroxilforma, vagy mindkettő) szintjét, a fluoreszceinszármazék vegyület szintjének meghatározására a mintasejtekben és - adott esetben - a negatív kontroll sejtekben a fluoreszceinszármazék vegyület negatív kontroll szintjének meghatározására, valamilyen megfelelő értékelési eljárás alkalmazásával, előnyösen a fluoreszcencia szintjének a sejtekben való értékelésével, (c) összehasonlítjuk a mintasejtekben mért fluoreszceinszármazék vegyület szintjét jellemzően ABCtranszporteraktivitás nélküli, adott esetben negatív kontroll sejtekből nyert, negatív kontroll szinttel, (c) ahol a mintasejtekben mért fluoreszceinszármazék vegyületnek a negatív kontroll szinthez képest alacsonyabb szintje jelzi az ABC-transzporter-aktivitás jelenlétét és/vagy szintjét a biológiai mintában.
A találmány egyik megoldási módjában a negatív kontroll szint egy meghatározott szint, előnyösen, negatív kontroll sejtek alkalmazásával előre meghatározva.
A találmány egy előnyös megvalósítási módjában az ABC multidrog-transzporter az ABC transzporterek B, C vagy G családjába tartozó multidrog-transzporter, amely előnyösen képes a sejtből PhenGreen vegyületet extrudálni.
Előnyösebben, az ABC multidrog-transzporter az ABCBl-ből (MDR1, Pgp), ABCCl-böl (MRP1) és ABCG2-ből (BCRP) álló csoportból választott.
122444-15508/SG
2221226
A találmány előnyös megvalósítási módjában, a fluoreszceinszármazék észtervegyület (Ib) általános képletü vegyület
PHEN (Ib) ahol az L linker az aminokarbonil (karboxamid), karbamid, tiokarbamid, C2 alkenilamin és C3 alkenilamid, előnyösen az aminokarbonil (karboxamid), karbamid és tiokarbamid közül választott, és
R1 és R2 egymástól függetlenül H, F, Cl és Br közül választott, előnyösebben H és Cl vagy Cl és F közül választott; a találmány előnyös megvalósítási módjában az R1 és R2 azonos, és PHEN a fentiekben meghatározottak szerint.
A találmány igen előnyös megvalósítási módjában, a fluoreszceinszármazék észtervegyület (Ha) általános képletü vegyület
(Ha) seciEcc ahol R1, R2 és L a fentiekben meghatározott, ahol előnyösen az L linker az aminokarbonil (karboxamid), karbamid és tiokarbamid közül választott, és
R1 és R2 egymástól függetlenül H, F, Cl és Br közül választott, előnyösebben H és Cl vagy Cl és F közül
122444-15508/SG választott; a találmány előnyös megvalósítási módjában az R1 és R2 azonos,
R3 és R4 egymástól függetlenül metil, etil vagy propil, előnyösen metil vagy etil, igen előnyösen metil, ahol előnyösen R3 és R4 azonos.
Előnyösen, a fluoreszceinszármazék észtervegyület (Ilb) általános képletü vegyület
W η Μ Η ιΝ Μ Μ az L linker az aminokarbonil (karboxamid), karbamid, tiokarbamid, alkenil, C2- vagy C4 alkenilamin és C3 alkenilamid, előnyösen az aminokarbonil (karboxamid), karbamid és tiokarbamid közül választott
R1 és R2 egymástól függetlenül H, F, Cl és Br közül választott, előnyösebben H és Cl vagy Cl és F közül választott; a találmány előnyös megvalósítási módjában az R1 és R2 azonos, előnyösen az L linker az aminokarbonil (karboxamid), karbamid és tiokarbamid közül választott,
R1 és R2 egymástól függetlenül H és Cl vagy Cl és F közül választott; a találmány előnyös megvalósítási módjában az R* és R2 azonos,
A találmány szerinti megoldásban a fluoreszceinszármazék hidroxivegyület az la, Ib, Ha és/vagy Ilb képletben bemutatott észtercsoport hidrolízise után képződött megfelelő alkohol.
Igen előnyösen, a fluoreszceinszármazék észtervegyület PhenGreen FL diacetát és PhenGreen SK diacetát közül választott, különösen PhenGreen SK diacetát és a fluoreszceinszármazék hidroxivegyület PhenGreen FL és PhenGreen SK, PhenGreen SK - megfelelően - közül választott.
A találmány előnyös megvalósítási módjában a biológiai minta az alábbiak közül választott:
- többsejtű élő szervezetből, előnyösen alanyból, előnyösen emlős alanyból, különösen emberi alanyból nyert biológiai minta,
- többsejtű élő szervezetből származó sejttenyészet (meghatározás: sejttenyészet vagy szövettenyészet); ahol előnyösen a sejt emlőssejt, különösen emberi sejt.
A találmány egy alternatív megvalósítási módjában a többsejtű élő szervezet a Meghatározások című fejezetben meghatározottak szerinti szervezet.
A találmány egy további előnyös megvalósítási módjában a tesztvegyület tesztelése a találmány szerinti eljárással történik, ahol
122444-15508/SG az (a) lépésben vagy egy további (al) lépésben a biológiai mintából származó tesztpopulációt tesztvegyületnek is kitesszük (tesztpopuláció), ahol a biológiai minta sejtjeinek referenciapopulációja nincs kitéve a tesztvegyületnek (referenciapopuláció), ahol a tesztvegyületet előnyösen a töltőpufferhez adjuk, a (b) lépésben vagy egy további (bl) lépésben meghatározzuk a fluoreszceinszármazék vegyület szintjét a tesztpopulációban és a referenciapopulációban a fluoreszceinszármazék vegyület szintjének meghatározására a tesztpopuláció és a referenciapopuláció mintasejtjeiben, a (c) lépésben vagy egy további (cl) lépésben összehasonlítjuk a fluoreszceinszármazék vegyületnek a tesztpopuláció és a referenciapopuláció mintasejtjeiben mért szintjét, így (e) a vizsgálati vegyület ABC-transzporteraktivitásra kifejtett hatását is értékeljük, ahol előnyösen a tesztpopuláció mintasejtjeiben a fluoreszceinszármazék vegyületnek, a referenciapopuláció sejtjeiben a fluoreszceinszármazék vegyület mért szintjéhez képest alacsonyabb szintje jelzi, hogy a tesztvegyület az ABCtranszporteraktivitás aktivátora a biológiai mintában és/vagy a tesztpopuláció mintasejtjeiben a fluoreszceinszármazék vegyületnek, a referenciapopuláció sejtjeiben a fluoreszceinszármazék vegyület mért szintjéhez képest magasabb szintje jelzi, hogy a tesztvegyület az ABCtranszporteraktivitás inhibitora a biológiai mintában.
Előnyösen, a tesztvegyület intracelluláris hatású vegyületek, citotoxikus vegyületek és terápiás vegyületek, előnyösen kemoterápiás vegyületek vagy feltételezetten ilyen hatású vegyületek közül választott.
A részletes leírás szerinti eljárásban negatív kontroll sejtpopuláció alkalmazására kerül sor és a populáció sejtjei az alábbi sejttípusok közül választott:
- ABC-transzporterfehérjét nem expresszáló sejtek,
- ABC-transzporterfehérjét egy előre meghatározott küszöbérték alatti szinten expresszáló sejtek,
- sejtek, amelyekben az ABC-transzportfehérje expressziója csendesítve van (silenced);
- sejt, amely a találmány szerinti fluoreszcenszármazék (észter vagy hidroxi alak) transzportálására nem képes ABC-transzporterfehérjét expresszál és/vagy
- sejtek, amelyekben az ABC-transzporterfehérje aktivitása gátolva van;
előnyösen, ahol egy vagy több kontroll sejtpopuláció alkalmazására kerül sor.
A találmány egy előnyös változatában vagy megvalósítási módjában a mintasejtekben a fluoreszceinszármazék vegyület szintjének egy negatív kontroll szinttel történő összehasonlítása ABC-transzporteraktivitás kvantitatív értékelését tartalmazza.
Előnyös értékelési eljárásban kvantitatív mérés és számítás végzésére kerül sor.
Előnyösen az ABC-transzporteraktivitás kvantitatív értékelése tartalmazza:
- mintasejtekben a fluoreszceinszármazék vegyület szintjének kvantitatív értékben, felhalmozódási rátaként (F) és a fluoreszceinszármazék vegyület negatív kontroll szintjének kvantitatív értékben, felhalmozódási rátaként (F*) történő kifejezését, és
- az egyik kvantitatív érték kivonását a másikból.
Előnyösen, mintasejtekben a fluoreszceinszármazék vegyület szintjének egy negatív kontroll szinttel történő összehasonlítása tartalmazza mintasejtekben a fluoreszceinszármazék vegyület szintjének a fluoreszceinszármazék vegyület ft ft H ft ft ft felhalmozódási rátájaként (F) történő kifejezését; és ekkor
122444-15508/SG
222122® az adott negatív kontroll sejtekben a fluoreszceinszármazék vegyület szintjének a fluoreszceinszármazék vegyület felhalmozódást rátájaként (F*) történő kifejezését; és az adott mintasejtekben jelenlévő ABC-transzporterfehérje aktivitásának mértékét szemléltető (jelző) MDR aktivitási faktor (MAF) kiszámítását az alábbi összefüggés alkalmazásával: MAF = (F*-F)/F*.
Igen előnyösen, a fluoreszceinszármazék vegyület szintje a tesztpopuláció-mintában vizsgálati MAF értékként van kvantitatíven meghatározva, és a fluoreszceinszármazék vegyület szintje a referenciapopuláció-mintában referencia MAF értékként van szintén kvantitatíven meghatározva, és a tesztvegyület ABC-transzporteraktivitásra kifejtett hatásának értékelése a MAF értékek összehasonlításával történik.
Egy előnyös eljárásban a fluoreszceinszármazék vegyület mérése fluorometriát tartalmazó eljárással történik.
Egy előnyös eljárásban a fluoreszceinszármazék vegyület mérése áramlási citometriát tartalmazó eljárással történik.
Egy előnyös eljárásban a fluoreszceinszármazék vegyület mérése sejtekről történő képek készítését tartalmazó eljárással, például fluoreszcens mikroszkópiával történik.
A találmány szerinti eljárás egy előnyös megvalósítási módjában, az eljárás tartalmaz továbbá az alábbi lépések közül egyet vagy többet:
- a sejtek túlélésének mérése a mintában,
- a mintasejtek által készített multidrog-transzporterfehérje mennyiségének meghatározása,
- a mintasejtek felszínén lévő multidrog-transzporterfehérje mennyiségének meghatározása.
Egy előnyös változatban a sejtek túlélésének mérése a mintában,
- élő sejtek antitesttel végzett festésével,
- elpusztult sejtek megfelelő festékkel végzett festésével történik.
A találmány egy további szempontja szerint vannak olyan alkalmazások, amelyek rendelkezései értelemszerűen megfelelnek a fentiekben részletesen leírt eljárásoknak.
A találmány tárgya fluoreszceinszármazék vegyület alkalmazása a fentiekben meghatározottak szerint ABC-transzporteraktivitás biológiai mintában történő értékelésére. Ebben a vonatkozásban, adott esetben, a fentiekben meghatározott alkalmas eljárást alkalmazásként lehet átfogalmazni.
A találmány tárgya fluoreszceinszármazék vegyület fentiekben meghatározottak szerinti alkalmazása egy adott tesztvegyület ABC-transzporteraktivitásra kifejtett hatásának vizsgálatára egy adott biológiai mintában. A találmány tárgya fluoreszceinszármazék vegyület és egy adott tesztvegyület fentiekben meghatározottak szerinti alkalmazása annak ABC-transzporteraktivitásra kifejtett hatásának vizsgálatára egy adott biológiai mintában. Ebben a vonatkozásban, adott esetben, a találmány tárgy a fentiekben meghatározott alkalmas eljárás, ahol a tesztelendő tesztvegyületet alkalmazásként lehet átfogalmazni.
A találmány tárgya fluoreszceinszármazék vegyület fentiekben meghatározottak szerinti alkalmazása ABC-transzporteraktivitással rendelkező vagy nem rendelkező sejtek szelektálására a fentiekben meghatározott eljárások bármelyike szerint végzett méréssel egy adott biológiai mintában.
122444-15508/SG
A találmány egy további szempontja szerint a találmány tárgya ABC-transzporteraktivitás biológiai mintában történő értékelésére szolgáló készlet, amely készlet tartalmaz
- a fentiekben meghatározottak szerinti fluoreszceinszármazék vegyületet,
- felvivöpuffert, és igény szerint negatív kontroll sejteket és vagy ABC-transzporteraktivitást gátló ágenst módokat PhenGreen kimutatására, és utasításokat multidrog-rezisztencia kimutatására biológiai mintában. A találmány egy előnyös megvalósítási módjában, a találmány tárgya a készlet alkalmazása a fentiekben meghatározott bármely alkalmazásra vagy a fentiekben meghatározott bármely eljárásban.
Előnyösen, az eljárásban vagy a készlet alkalmazásában az előző igénypontok bármelyike szerint, ahol a felvivöpuffer
- kétértékű, fluoreszcenciát kioltó („quenching”) fémionoktól mentes közeg, és/vagy
- fémkelátort, különösen EDTA-t, tartalmaz, különösen ahol PHE fémkelátor, előnyösen 1,10-fenantrén.
Különösen, ilyen felvivöpuffer alkalmazására akkor kerül sor, ha a PHE fenantrolin vagy annak bármilyen fémkelátképző-származéka. ,
Előnyösen, a közeg vagy a készlet cukorforrást, különösen glükózt, tartalmaz.
Előnyösen,a készlet alkalmazása az előző igénypontok bármelyike szerint, ahol a PGD koncentrációja 0,13 μΜ, előnyösen 0,1-2 μΜ, még előnyösebben 0,2-0,8 μΜ, igen előnyösen 0,3-0,7 μΜ.
MEGHATÁROZÁSOK
A leírás szerinti értelemben a „membrántranszporter” kifejezés sejtmembránba integrált fehérjét jelent, amely képes entitások - a jelen kontextusban a molekulák - transzportálására például exportálására (extrudálás) vagy importálására, azon membránon keresztül, amelybe integrálva van.
A leírás szerinti értelemben az “ABC-transzporter” kifejezés a membrántranszporterek alcsaládját alkotó olyan, ATP-kötő kazettát tartalmazó transzportereket jelent, amelyek az adenozin-trifoszfát (ATP) hidrolízisének energiáját hasznosítják a biológiai folyamatok végrehajtásához, ami az ABC-transzporterek esetében magában foglalja bizonyos entitások, a találmány kontextusában, molekulák transzportját a membránokon keresztül. A leírásban az ABC-transzporterek elnevezése és alcsaládjai a HUGO Gene Nomenclature Committee (HGNC) nomenklatúrája szerint vannak megadva.
Például, az “ABCG család” membrántranszporterei az ABC-transzporterek fél-transzportereket tartalmazó G alcsaládjába tartoznak, amelyek oligimerizációval alakítják ki a funkcionális transzportért. ABCG2 (egyéb nevek többek között: BRCP, MXR1, CDw338) a család multidrog-transzporter tagja.
Az “ABCB család” transzporterei az ABC-transzporterek B alcsaládjába tartoznak, amely teljes transzportereket és fél-transzportereket egyaránt tartalmaz, ami egyedi jelenség az ABC-transzportercsaládok között. Bizonyos tumorsejtekben túlexpresszálódó ABCB1 (MDR1, Pgp) multidrog-rezisztenciát mutató fehérje.
ft
Normális esetben a vér-agy gátban és a májban expresszálódik.
H ft ft ft
122444-15 508/SG
Az “ABCC család” membrántranszporterei az ABC-transzporterek C alcsaládjába tartoznak. Ez egy nagy csald, amelybe a jelen tudásunk szerint tizenhárom tag tartozik, közülük kilenc multidrog-rezisztens fehérje (MRP), amely multidrog-transzporter. Az MRP-fehérjék a természetben mindenfelé megtalálhatók és számos fontos funkciót közvetítenek.
Előnyösen, a találmány szerinti ABC-transzportfehérjék multidrog-transzporterek.
A „Multidrog-transzporter” a leírásban ABC multidrog-transzporter néven is említett ABC transzporterfehérje, amely több vagy előnyösen különféle, egymással kémiailag nem rokon - azaz egyértelmű szerkezeti hasonlóságot vagy rokonságot (első látásra) nem mutató - kémiai vegyületet képesek extrudálni abból a sejtből, amelynek membránján az ABC transzporterfehérje jelen van. ।
A találmány egy előnyös megvalósítási módjában, az ABC multidrog-transzporter hidrofób vegyületek, előnyösen, hidrofób heterociklusos vegyületek transzportjára (extrudálására, azaz, a sejtből az extracelluláris térbe irányuló transzportra) képes multidrog-transzporter (azaz, egy ABC multidrog-transzporter képes hidrofób heterociklusos vegyületeket transzportálni).
Multidrog-transzporter jellemzően ABC-transzporter, amely egy adott sejtben, jellemzően ráksejtben multridog-rezisztenciát okoz.
A találmány egy kiemelt megvalósítási módjában, az ABC multidrog-transzporter képes a leírásban meghatározott - linker révén összekapcsolt fluoreszceinszármazékot és fenantrénszármazékot (előnyösen fenantrolint) tartalmazó - vegyületek, előnyösen PhenGreen, transzportálására. Az utóbbi aktivitást nevezzük PhenGreen transzportálási aktivitásnak. A találmány egy igen előnyös megvalósítási módjában, a PhenGreen a PhenGreen FL diacetát és PhenGreen SK diacetát alkotta csoportból választott, és a sejtekben elsősorban jelen lévő vegyületként, PhenGreen FL és PhenGreen SK, előnyösen PhenGreen SK diacetát és PhenGreen SK közül választott.
Az ABC-transzporterekre vonatkozó további információ található az alábbi publikációban: Alexander SPH, Kelly E, Marrion N, Peters JA, Benson HE, Faccenda E, Pawson AJ, Sharman JL, Southan C, Davies JA and CGTP Collaborators (2015) The Concise Guide to PHARMACOLOGY 2015/16: Transporters. Br J Pharmacol. 172: 61 10-6202.
A találmány szerinti ABC-transzporter lehet, például, többsejtes növényből vagy állatból származó ABCtranszporter. A találmány egy előnyös megvalósítási módjában az állat ízeltlábú, például rovar, vagy előnyösen gerinces állat, például hal, kétéltű, hüllő, madár vagy emlős. A találmány előnyösebb megvalósítási módjában az állat emlős, egy igen előnyös megvalósítási módban pedig ember. A növény jellemzően egyszikű vagy kétszikű. A találmány egy előnyös megvalósítási módjában, az ABC-transzporter az MDR1, MXR (BCRP) vagy MRP, vagy ABCB1, ABCC1 vagy ABCG2 homológja az adott szervezetben vagy a találmány szerinti fluoreszcens vegyület extrudálására képes megfelelő vagy legközelebbi gén transzportere. A találmány szerinti ABCtranszporterek közé tartoznak a legalább 70%, 80%, 90%, 95% szekvenciaazonosságot mutató funkcionális mutánsok, amennyiben azok aktív helye és transzporteraktivitása megmarad.
Egy adott ABC-transzporterfehérje “ABC-transzporteraktivitása”, azaz, az „aktivitása” jelent bármilyen aktivitást, amelyet a transzportfehérje kifejt, beleértve például, annak biológiai funkcióját, transzportaktivitását, φ azaz egy adott drog transzportját a fehérjét hordozó membránon keresztül, vagy ATP-áz aktivitást, ameddig az
W
122444-15508/SG egy adott transzporttevékenység, például szubsztráttal serkentett ATP-áz aktivitás indikátora. Tág értelemben, az “aktivitás” kifejezés, a transzportaktivitás kimutatásának nézőpontjából, jelentheti az enzim teljes reakció ciklusának bármilyen részleges reakcióját (például, szubsztráthoz kötődést) a transzport során, és az aktivitás kimutatható, értékelhető vagy mérhető a részleges aktivitásnál megadott körülmények között.
Az ABC-transzporterfehérje „szubsztrátja” az ABC- transzporter által közvetített aktív transzportmechanizmus révén a sejtből extrudálható vegyület.
A leírás szerinti értelemben, egy adott “aktivátor” vegyület növeli az ABC-multidrogtranszporter aktivitását, míg agy adott “gátlószer (inhibitor)” csökkenti az ABC-multidrogtranszporter aktivitását. Gátlószer (inhibitor) lehet, például, a transzportfolyamat gátlószere vagy ugyanannak jó szubsztrátja a jelenlevő, érdeklődésre számot tartó vegyület mennyiségét meghaladó mértékben alkalmazva (kompetitív inhibitor).
A leírás szerinti értelemben a „biológiai minta” kifejezés jelentése biológiai minta vagy olyan sejteket tartalmazó biológiai tenyészet, amelyben az ABC-transzporteraktivitás vizsgálatára vagy értékelésére kerül sor.
A “biológiai minta” kifejezés sejteket tartalmazó anyagösszetételt vagy anyagokat jelent, ahol az összetétel valamilyen környezetből, előnyösen valamilyen élő szervezetből vagy ökoszisztémából (élő szervezeteket tartalmazó környezet), előnyösen valamilyen szervezetből származik, a feldolgozott összetételeket is beleértve, például megfelelő ágensekkel lett kiegészítve és/vagy az eredetileg gyűjtött mintából lett kitenyésztve.
A „biológiai tenyészet” vagy „tenyészet” sejtet, adott esetben szövet formájában, tartalmazó anyagösszetételt vagy anyagokat jelent, ahol a sejtek valamilyen közegbe vagy olyan körülmények közé lettek helyezve, amely alkalmas azok részbeni vagy valamilyen alpopulációjának élő formában való fenntartására; adott esetben valamilyen közegben vagy körülmények között, ahol a sejt képes szaporodni.
Nem szokatlan, hogy egy adott „biológiai tenyészet” egyben biológiai minta, amennyiben a sejteket részben vagy a sejtek alpopulációját előzőleg a környezetből, például élő szervezetből vagy ökoszisztémából, nyerték és azután tenyészetbe transzformálták.
Az élő szervezet, amelyből a minta származik, előnyösen többsejtű növény vagy állat. A találmány egy előnyös megvalósítási módjában az állat ízeltlábú, például rovar, vagy előnyösen gerinces állat, például hal, kétéltű, hüllő, madár vagy emlős. A találmány előnyösebb megvalósítási módjában az állat emlős, egy igen előnyös megvalósítási módban pedig ember. A növény jellemzően egy gazdaságilag fontos növény, például olyan, ami a fel van sorolva az alábbi publikációban: [Bennett, B.C. 2007. 3. fejezet Twenty-five Important Plant Families. B.C. Bennett, editor. UNESCO Encyclopedia of Life Support Systems. http://eolss.net,l de nem korlátozódik azokra.
A “biológiai minta” kinyerhető szövetből, testfolyadékból, vagy az illető alanytól gyűjtött mikroorganizmusokból. Gerincesekből származó minták közé tartozik, de nem kizárólag, köpet (feldolgozott vagy feldolgozatlan), bronchoalveoláris átmosási (BAL) folyadék, bronchiális mosási (BW) folyadék, vér, teljes vér, testfolyadékok, agy-gerincvelői folyadék (CSF), vizelet, plazma, szérum, vagy szövet (például, biopsziás anyag).
A tesztminta vagy minta olyan, hogy az abban vannak olyan sejtek, amelyekben van értékelhető ABCtranszporteraktivitás. Kontroll minta lehet kontroll minta vagy kontroll tenyészet, amelyben jelen vannak kontroll sejtek. Kontroll sejt lehet ismert vagy előre meghatározott, előnyösen magas ABC-transzporteraktivitást mutató, ,¾ pozitív kontroll sejt. Egyértelmű, hogy a magas szint a várt mérési tartomány felső tartományába esik. Negatív
M W
122444-15508/SG
W
CM
CM
ÍN ÍN H M IN ÍN kontroll sejtek jellemzően olyan sejtek, amelyekből hiányzik az ABC-transzporteraktivitás, olyan sejtek, amelyekben az ABC-transzporteraktivitás nem ér el egy adott küszöbértéket, vagy amelyekben az ABCtranszporteraktivitás egy adott alapértéket mutat. Előnyösen, a küszöbérték és/vagy az alapérték korábbi vizsgálatok során lett meghatározva vagy a várt mérési tartomány alsó tartományába eső értékre lett beállítva.
A leírás szerinti értelemben, valamilyen érték, például egy adott vegyület szintjének „értékelése” kifejezés, előnyösen több mintából végzett, akár analitikailag pontos meghatározásokat jelent - a számításokat és adott esetben statisztikai elemzést is beleértve - továbbá kevésbé pontos meghatározásokat, például, statisztikai elemzés nélküli kvantitatív meghatározásokat vagy akár csak néhány eredményül kapott értéket (például, alacsony, mérsékelt, magas, vagy igen vagy nem / jelen van vagy nincs jelen) szolgáltató meghatározásokat is jelent. Előnyösen, az értékelés kifejezés kvantitatív meghatározást vagy számítást magában foglaló mérést jelent.
A leírás szerinti értelemben, két szint “összehasonlítása” összehasonlítást foglal magában annak megállapítására, hogy melyik a magasabb vagy alacsonyabb, vagy valamilyen különbség, vagy a szintek arányán, vagy a szintekből eredő értékek meghatározására, amit igény szerint más matematikai eljárások egészítenek ki, ha az eljáráshoz szükséges értékelés (számítás) megkívánja.
A leírás szerinti értelemben az „egy” határozatlan névelő és ha a szövegkörnyezet lehetővé teszi az „a” határozott névelő a többesszámot is magában foglalja, hacsak a szövegkörnyezetben másként nincs jelezve. Eszerint, amennyiben a szövegkörnyezet azt lehetővé teszi, az „egy” kifejezés jelentése „egy vagy több”.
Az „izolált” kifejezés jelentése a természetes állapothoz képest az „emberi kéz” által megváltoztatva. Amennyiben egy adott molekula vagy összetétel előfordul a természetben, akkor van „izolálva”, ha meg lett változtatva és/vagy el lett távolítva eredeti környezetéből.
A „tartalmaz vagy „magában foglal” kifejezés úgy értelmezendő, hogy ezek jelentése nem kizárólagos és lehetővé teszi további tulajdonságok vagy eljárási lépések vagy összetevők hozzáadását vagy részvételét bármiben vagy bármihez, amely tartalmazza a felsorolt tulajdonságokat vagy eljárási lépéseket vagy összetevőket.
A leírás szerinti értelemben a „lényegében áll” vagy „lényegében tartalmaz” kifejezés egy listán, például igénypontban, felsorolt kötelező sajátságokat vagy eljárási lépéseket vagy összetevőket foglal magában, és nem zárja ki, hogy az alkalmazás, eljárás, összetétel vagy bármilyen más anyag lényeges jellemzőire hatást nem gyakorló további más sajátságokat vagy eljárási lépéseket vagy összetevőket tartalmazzon. A leírás szerinti értelemben, a „tartalmaz vagy „magában foglal” kifejezés, ha szükséges, új anyag hozzáadása nélkül a „lényegében tartalmaz” vagy „lényegében magában foglal” kifejezésekkel helyettesíthető.
Egy felsorolásból történő kiválasztás, például a „választott” kifejezés helyettesíthető „a következők alkotta csoportból választott kifejezéssel, ha a gyakorlat úgy kívánja és, ha a szövegkörnyezet megengedi, a listából történő egy vagy több tétel kiválasztása is beleértendő.
AZ ÁBRÁK RÖVID ISMERTETÉSE
1. ábra. Fluorescens PG felhalmozódás emberi sejtekben, ABCG2 expresszió hatása - áramlási citometriás vizsgálatok. A panel. PDG-koncentrációtól függő PG-felhalmozódás kontroll PLB-sejtekben (x) és PLB-ABCG2 sejtekben (·). A fekete négyzetek (: ABCG2) és háromszögek (▲: CTRL) szemléltetik a PG
122444-15508/SG felhalmozódását 2,5 μΜ KO143, egy specifikus ABCG2 inhibitor jelenlétében. B panel. PDG-koncentrációtól függő PG-felhalmozódás kontroll A431 (x) és A431-ABCG2 (·) sejtekben EDTA-DPBS közegben 37°C hőmérsékleten 30 percig mérve. A fekete négyzetek (: ABCG2) és háromszögek (A: CTRL) szemléltetik a PG felhalmozódását 2,5 μΜ KO 143 jelenlétében 0,5 μΜ PGD-nél. ± SD értékek feltüntetve.
2. ábra PG és mitoxantron (MX) emberi PLB és A431 sejtekben való felhalmozódásán alapuló MDRaktivitási tényezők Az ABCG2 változat festékextrúziós kapacitásra gyakorolt hatásai - áramlási citometriás vizsgálatok. A és B panelek: ABCG2 változatokat expresszáló PLB sejtekben (A Panel) és A431 sejtekben (B Panel) végbement PG-felhalmozódással számított MDR aktivitási tényező (Id. Eljárások). C és D panelek: ABCG2 változatokat expresszáló PLB sejtekben (C Panel) és A431 sejtekben (D Panel) végbement MXfelhalmozódással számított MDR aktivitási tényező. ± SD értékek feltüntetve.
3. ábra Fluoreszcens PG felhalmozódása emberi PLB sejtekben konfokális mikroszkópiával vizsgálva. ABCG2 fehérje expressziójának hatásai és a fehérje működésének gátlása Kol43-al. Miután 0,5 μΜ PGD-t adtunk a közeghez, 30 perc elteltével a fluoreszcens anti-WGA-val (vörös) előre jelzett sejtekben PG fluoreszcenciát (zöld) mértünk az ABCG2 inhibitor KO143 (2,5 μΜ) jelenlétében vagy hiányában.
4. ábra PG felhalmozódásának áramlási citometriával történő kimutatása emberi PLB-sejtekben kontroll PLB-sejtek és az ABCG2-transzportert expresszáló PLB-sejtek felismerése és elkülönítése. Kontroll PLB-sejteket és vad-típusú ABCG2-t expresszáló PLB-sejteket kevertünk össze különböző arányban (0,2 - 99,8%). PG-felhalmozódást mérése a 0,25 μΜ PGD hozzáadása után történt. Ugyanazon sejtek felszínén lévő ABCG2-fehérje immunfluoreszcens kimutatása az ABCG2-re specifikus 5D3 monoklonális antitest kötődésével történt. A grafikonon feltüntetett számok az elválasztott sejtek, relatív fluoreszcenciaértékek alapján mért, %-ban megadott arányát jelzik.
5. ábra Fluoreszcens PG felhalmozódása emberi sejtekben, ABCB1- és ABCC1-expresszió hatásai áramlási citometriás vizsgálatok.
A Panel. Kontroll PLB sejtek és ABCBl-et expresszáló PLB sejtek, B Panel. Kontroll A431 sejtek és ABCB1 -expressing A431 sejtek,
C Panel. Kontroll HL-60 sejtek és ABCB 1 -et expresszáló HL-60 sejtek, D Panel. Kontroll HEK sejtek és ABCBl-et expresszáló HEK sejtek.
E Panel. Kontroll PLB sejtek és ABCBl-et expresszáló PLB sejtek, Kontroll A431 sejtek és ABCB1expressing A431 sejtek
F Panel. Kontroll HL-60 sejtek és ABCBl-et expresszáló HL-60 sejtek, Kontroll HEK sejtek és ABCBlet expresszáló HEK sejtek.
6. ábra Fluoreszcens PG felhalmozódása emberi PLB- és HL-60 sejtekben konfokális mikroszkópiával vizsgálva. ABCB1- és ABCCl-fehérje expressziójának hatásai és a transzporterfunkció specifikus gátlása tariquidar-ral (ABCB1) vagy benzbromaronnal (ABCC1). Plazmamembránok jelzése céljából fluoreszcens anti-WGA-val előre jelzett sejtekben a PG-fluoreszcencia mérése 30 perccel azután történt, hogy a 0,5 μΜ PGD-t hozzáadtuk a közeghez, a transzporter gátlójának (0,25 μΜ tariquidar az ABCBl-nél vagy 50 μΜ benzbromaron az ABCCl-nél) jelenlétében vagy hiányában.
7. ábra PhenGreen-diacetát toxicitásának vizsgálata. A Panel. PhenGreen felhalmozódás hatása a sejtszaporodásra PLB-sejteken és PLB-ABCG2-sejten. Sejtszaporodást mértünk 0,5 μΜ PGD-vel 37°C-on, 30 φ percig történt kezelés után végzett sejtosztályozással. B és C Panel. A PGD-kezelés citotoxikus hatása HEK- és
CM M Η 122444-15508/SG
CM CM CM
A431-sejteken A sejteket a felvivőpufferben a jelzett koncentrációjú PGD-vel 30 percig 37°C-on előkezeltük, majd mostuk és normális sejttenyésztö-közegben (Id. Eljárások) 72 órán át tenyésztettük.
8. ábra A PG-felhalmozódás csökkentésére képes ABCG2, ABCB1 és ABCC1 funkcionális jelenlétének bemutatása.
9A. ábra ABCG2 festése anti-ABCG2-vel (BXP-21) Western bloton, és áramlási citometriás anti-ABCG2 (5D3) immunfluoreszcens festése emberi PLB-sejtekben - kontroll PLB- és PLB-ABCG2-sejtek
9B. ábra ABCG2 festése anti-ABCG2-vel (BXP-21) Western bloton, és áramlási citometriás anti-ABCG2 (5D3) immunfluoreszcens festése emberi A431-sejtekben - kontroll A431- és A431-ABCG2-sejtek.
10A. ábra ABCB1 festése anti-ABCG2-vel (C219) Western bloton, és áramlási citometriás anti-ABCBl (MRK16) immunfluoreszcens festése emberi PLB-sejtekben - kontroll PLB- és PLB-ABCB1-sejtek
10B. ábra ABCB1 festése anti-ABCBl-el (C219) Western bloton, és áramlási citometriás anti-ABCBl (MRK.16) immunfluoreszcens festése emberi A431-sejtekben - kontroll A431- és A431-ABCB1-sejtek
A. ábra ABCC1 festése anti-ABCCl-el (MRPmó) Western bloton, és áramlási citometriás anti-ABCCl (QCRL3) immunfluoreszcens festése emberi HL60-sejtekben - kontroll HL60-sejtek és HL60-ABCC1-sejtek
11B. ábra ABCC1 festése anti-ABCCl-el (MRPmó) Western bloton, és áramlási citometriás anti-ABCCl (QCRL3) immunfluoreszcens festése emberi HEK-sejtekben - kontroll HEK-sejtek és HEK-ABCC1
12. ábra PhenGreen felhalmozódás függése az időtől emberi PLB-sejteken és ABCG2-őt expresszáló PLB-sejteken. Az ABCG2 inhibitor Kol43 hatása. A panel: PG felhalmozódása 0,5 μΜ PGD jelenlétében, B Panel: PG felhalmozódása 2,5 μΜ PGD jelenlétében a felvivő közegben.
13. ábra MDR-aktivitási tényező mitoxantron (MX) felhalmozódás alapján történő mérései ABCBl-et vagy ABCCl-et expresszáló különféle sejtvonalakban. A megadott sejtvonalakban az MX-felhalmozódás mérése 60 percig, 37°C-on történt 1 μΜ MX jelenlétében.
14. ábra
A PhenGreen diacatetát szerkezete és az észteráz aktivitás utáni termék. Az elsődleges kézirat 19. sz. hivatkozásából.
A TALÁLMÁNY RÉSZLETES ISMERTETÉSE
A leírásban ismertetjük, hogy a PhenGreen SK diacetát (PGD) lehetővé teszi mind e három fő ABCmultidrogtranszporter párhuzamos és érzékeny funkcionális kimutatását. A PGD nem fluoreszcens, hidrofób molekula, amely gyorsan belép a sejtekbe, ahol az a nem specifikus észterázok a PGD hasításával intenzíven fluoreszkáló, hidrofil festékké, PhenGreen-é (PG), alakul és csapdába esik a sejten belül. A PG zöld fluoreszcenciája kétértékű fémionok, speciálisan nehézfémionok, jelenlétében különféle mértékben csökken [Ma E et al. Metallomics. Royal Society of Chemistry; 2015], Ennélfogva, a PGD terhelési és PG fluoreszcenciás mérési technológiát már régóta alkalmazzák vas- vagy kadmiumionok meghatározására különféle sejtes rendszerekben.
Érdekes módon, ahogy itt bemutatjuk, az ABCG2-, ABCB1-, és az ABCC1-transzporterek működése erősen csökkenti a PG felhalmozódását. Dokumentáltuk, hogy megfelelő vizsgálati körülmények között, kétértékű, fluoreszcenciát kioltó („quenching”) ionok távollétében, a fluoreszcens PG-felhalmozódás hatékonyan alkalmazható mindezen drogtanszporter funkcionális vizsgálatára. Nagyteljesítményű és „high content” tÖ (információgazdag) vizsgálatokat lehetővé tevő áramlási citometria és fluoreszcens mikroszkópia egyaránt fi fi
122444-15508/SG fi fi fi
W
W H M M alkalmas e mérések elvégzésére, és a rövid időtartamú PG-felhalmozódás nem toxikus a sejtekre. Szelektív transzportergátlók párhuzamos alkalmazása teszi ezt a vizsgálatot egyszerű, verzatilis és érzékeny eszközzé a specifikus ABC multidrog-transzporter funkció értékelésére.
A vizsgálatokból feltételezhető, hogy multidrog-transzporterek esetében más hasonló festékek analóg módon és hasonló eredményekkel extrudálódnak, amennyiben azok sejtpermeábilis észter formái bejuthatnak a sejtbe és a sejten belüli hidrolizálás után azokat a leírásban meghatározottak szerinti ABC multidrog-transzporter, különösen a három fő multidrog-transzporter ABCG2, ABCB1 és ABCC1, képes extrudálni.
Feltételezhető, hogy a kulcsfontosságú emberi ABC multidrog-transzporterek transzportfunkciója értékelhető az alábbiakat tartalmazó sejtpermeábilis fluoreszcens fémion-indikátorokkal
3’,6-dihidroxi-fluoreszcein fluorofórhoz a fenantrolin 5. vagy 6. szénatomja és a fluoreszcein fluorofór izobenzofúranil csoportjának 5. szénatomja révén, kovalensen kapcsoló L csoporttal kapcsolódó fenantrolincsoportot vagy annak analógját, ahol a (előnyösen nem fluorescens vagy eltérő, illetve megkülönböztethető fluoreszcens jelet adó) fluorescein 3’ és 6’ hidroxilcsoportjának hidrofób észter formája lehetővé teszi a festék behatolását a sejtbe, ahol a celluláris észterázok hasítása után, kioltó (quenching) fémionok hiányában a festék erősen fluoreszcenssé válik. A találmány egy szélesebb körű szempontja szerint, a fenantrolincsoport egy fenantrolinszármazék, amelyben egy, két vagy három vázalkotó nitrogénatom a fenantrolinétól vagy a hidrofób fenantrénváz más származékaitól eltérő pozícióban van, ami sejtbe történő bejutást és onnan kifelé irányuló transzportot tesz lehetővé. Mindenesetre, az L linker a megfelelő fenantrénváz 9-10. pozíciójában lévő szénhez van kötve. A találmány egy különösen előnyös megvalósítási módjában az L linkercsoporthoz fenantrolin (1,10 izomer) fémkelátor van kapcsolva.
Felismertük, hogy a funkcionális ABC-multidrog-transzportereket, előnyösen ABCG2-, ABCB1-, vagy ABCC1-transzportereket expresszáló sejtekben, a celluláris festék fluoreszcenciája erősen lecsökken.
Az 1,10-fenantrolin metallopeptidáz-gátló és amennyiben a festék tartalmaz ilyen kelátorcsoportot, a felvivőpufferben célszerűen ne legyen fémion és/vagy az ilyen fémionokat EDTA-val vagy valamilyen hasonló kelátképzővel komplexálni kell.
A találmány szerint feltételezett mechanizmus részletesebben a 8. ábrán van kifejtve.
Ahogyan a 8. ábrán látszik, e három multidrog-transzporter bármelyikének funkcionális jelenléte képes csökkenteni a PG felhalmozódását, feltehetően PGD-extrúzióval, és potenciálisan PG-extrúzióvaL Jelenleg még nem tudunk különbséget tenni ezen extrúziós hatások között, de korábbi vizsgálatok alapján leginkább az tűnik valószínűnek, hogy e fehérjéknek a hidrofil PGD a fő transzportált szubsztrátja (see [Homolya L et al. J Bioi Chem. 1993, Homolya L et al. Br J Cancer. 1996; Homolya L et al. BBA - Biomembr 2011]). Ez az alapja a festékextrúziós hatás felerősödésének az celluláris fluoreszcenciát illetően eredményül kapott változásokban, és a vizsgálat nagyfokú érzékenységének.
Észteráz általi hasonló hasítási folyamat történik a találmány szerinti egyéb vegyületek esetében is, ami a Illa és Illb képleteken bemutatott megfelelő hidroxiformákat eredményez. A találmány megvalósítási módjainak leírásában megadott szubsztituensek részletesen le vannak írva a találmány rövid leírása című részben:
122444-15508/SG
A PhenGreen vegyületek előállításának analógiáján, az ilyen vegyületek előállítása a szakember számára ismert.
Ráadásul, ilyen vegyületek előállítását ismerteti a US5648270 sz. amerikai egyesült államokbeli szabadalmi irat [Kuhn et al, US5648270 granted to Molecular Probes Inc, July 15, 1997].
Fontos, hogy a kulcsfontosságú emberi ABC multidrog-transzporterek transzportfunkciója értékelhető a leírás szerintieket tartalmazó sejtpermeábilis fluoreszcens fémion-indikátorokkal.
A találmány egy megvalósítási módjában, megvizsgáltuk a három kulcsfontosságú multidrog-transzporter - ABCG2 (BCRP), ABCB1 (MDR1, Pgp), és ABCC1 (MRP1) - lehetséges kölcsönhatásait egy adott vegyülettel, amit eredetileg intracelluláris fémion-koncentrációk kimutatására alkalmaztunk. A PhenGreen diacetát (PGD) hidrofób, sejtpermeábilis molekula, amelyet a sejteken belül a celluláris észterázok fluoreszcens PhenGreen-né (PG) hasítanak, és ez a hidrofil termék felhalmozódik a sejteken belül. A PG és különféle fémionok között φ kölcsönhatás a PG fluoreszcenciájának elfojtását eredményezi, így ez lehetővé teszi a celluláris fémkoncentrációk
W W 'H 122444-15508/SG
HM N W kvantitatív értékelését [tiling AC et al. J Biol Chem. 2012],
Az ABCB1 és ABCC1 multidrog-transzporterek esetében, e fehérjék funkciójának becslésére számos, fluoreszcencián alapuló transzportervizsgálat érhető el. A Hoechst 33342, MX és DCV DNS-t kötő festékek az ABCB1 által transzportált szubsztrátok, viszont e festékek az ABCC1 fehérje viszonylag gyengén transzportált szubsztrátjai. Számos fluoreszenc festék acetoximetil-észterét egyaránt transzportálja az ABCB1 [Homolya L et I al. BrJ Cancer. 1996], és a nem toxikus, Calcein-AM sejtéletképességi festék, amit egyaránt aktívan extrudál az ABCB1 és ABCC1 [Holló Z et al. Anticancer Rés. 1998], és amit széleskörűen alkalmaznak e fehérjék funkcionális vizsgálatára. A citoplazmatikus eszterázok által generált szabad Calcein transzporterfüggő csökkent felhalmozódása érzékeny funkcionális vizsgálat az ABCBl-re és ABCCl-re. Ezzel szemben, a calcein AM-t nem transzportálja az ABCG2, így ez a vizsgálati rendszer e transzporter esetében nem alkalmazható.
A találmány szerinti vegyületek alkalmazásakor a specifikus ABC multidrog-transzportert különféle mértékben expresszáló sejtek elkülönítését illetően a PGD-kezelés és PG-felhalmozódás szempontjából lényeges kérdés a felhalmozódott PG potenciális toxicitása. Ennélfogva megvizsgáltuk, hogy van-e a PG felhalmozódásnak hatása a sejtek életképességére és a sejtszaporodásra.
PG-felvételt és PG-felhalmozódást nem lehet sejttenyésztö közegben mérni, mivel a szérum nem specifikus észterázai a PGD-t PG-vé hasítják, emellett a fémionok jelenléte szignifikáns mértékben megváltoztatja a PG-fluoreszcenciát. Ennélfogva, sejttenyészetekben nem lehet közvetlenül megbecsülni a PGD citotoxikusságát, míg a PGD és PD releváns, potenciális celluláris hatásait a PG-terhelés vizsgálati időszaka után megbecsültük.
A találmány igen előnyös vizsgálati körülményei között, azaz fémionoktól mentes közegben és alacsony PG-koncentrációk mellett, az ABC-transzporter funkcióit, például áramlási citometriával vagy flureszcens mikroszkópiával, különösen érzékenyen lehet nyomonkövetni.
A leírásban dokumentáltak értelmében, ez a vizsgálat alkalmazható az ABCG2, ABCB1 és az ABCC1 drogtranszporterekre, új, egyedi lehetőséget szolgáltat e kulcsfontosságú emberi multidrog-transzporterek funkcionális tulajdonságainak vizsgálatára ugyanezen reagensek és körülmények alkalmazásával. Továbbá, az alacsony számú ABC-transzporter pozitív sejtek megkülönböztethetők és kiválogathatok a kevert sejtpopulációból. Ráadásul, egy rövid időtartamú PG-felhalmozódás után a sejtek nem mutatták a szaporodás megváltozásának vagy toxicitásnak jelét. Míg a DNS-re reaktív fluoreszcens transzporterszubsztrátok jelentős genetikai elváltozásokat okozhatnak, úgy tűnik, hogy a PG felhalmozódása a citoplazmában nem járt ilyen hatással. Ennélfogva, ezen eljárás támogatja a sejtosztályozást és további szelektív sejttenyésztést.
Összefoglalva, a PGD-felvételi és PG-felhalmozódási vizsgálat, a transzporterekre szelektív gátlók alkalmazásával kiegészítve, egy új és érzékeny eszköz a kulcsfontosságú multidrog-transzporterek funkcionális tulajdonságainak vizsgálatára, és transzportért expresszáló sejtek hatékony és szelektív osztályozására.
PÉLDÁK
Anyagok és eljárások
Anyagok
PhenGreen SK diacetátot (PGD) a Thermo Fischer Scientific (Waltham, MA, USA) szereztünk be. KO 143 a Tocris Bioscience (Bristol,UK) cégtől származik. Benzbromaront és mitoxantront a Sigma-Aldrich-Merck (St. φ Louis, USA) cégtől vásároltunk. Tariquidar Dr. S. Bates kedves ajándéka volt (NCI, NIH; azonban a SigmaM CM H 122444-15508/SG
CM
M
CM
Aldrich-tól is beszerezhető; CAS sz.: 206873-63-4). Az 5D3 antitestet ABCG2-5D3 hibridóma-sejtvonalból tisztítottuk (Dr. Brian Sorrentino szíves ajándéka). Az 5D3 antitest a Santa Cruz Biotechnology cégtől is beszerezhető (pn. sc-18841 UniProt no. Q9UNQ0).
AlexaFluor 488-al jelzett QCRL3 antitestet a Sony Biotechnology (Surrey, UK) cégtől szereztünk be. MRK16 antitestet a Kamiya Biomedical Company (Seattle, US) cégtől szereztünk be. Bxp-21-et az Abeam (Cambridge, UK) cégtől vásároltunk. C219 antitest az Enzo Life Sciences (New York, USA) cégtől származik. A másodlagos antitesteket (AlexaFluor 488 and 647), búzacsíra-eredetű agglutinint (WGA)-AlexaFluor 647 és TOPRO™-3 Iodide vegyületeket a Thermo Fischer Scientific (Waltham, MA, US) cégtől vettük. A foszfáttal puffereit sóoldat összetevőit a VWR-től (Radnor, Pennsylvania, USA) szereztük be. Hacsak másként nincs jelezve, minden egyéb anyag a Sigma-Aldrich-Merck (St. Louis, USA) cégtől származik.
Sejtvonalak
ABCG2 vagy ABCB1 fehérjét stabilan expresszáló, mielomonocita PLB-985-sejt-, emberi embrióból származó vesesejt- HEK-293 és bőrből származó epdermoid A431 ráksejt-vonalakat állítottunk elő retrovirális transzdukciós rendszer alkalmazásával [Elkind NB et al. Iressa. 2005Özvegy-Laczka C et al. J Bioi Chem. 2005Morisaki K et al. Cancer Chemother Pharmacol. 2005], ABCCl-et stabilan expresszáló, HEK-293 és HL60 emberi promielocitás leukémia-sejtvonalakat is előállítottunk retrovirális transzdukcióval [Holló Z et al.
I
Anticancer Rés. 1998]. E sejtvonalakban az ABC multidrog-transzporterek stabil expresszióját az MRK-16 és C219 (ABCB1), QCRL3 és MRPm6 (ABCC1) és 5D3 és Bxp-21 (ABCG2) antitestekkel (megfelelően) végzett speciális immunfestéssel és áramlási citometriás elemzéssel rendszeresen vizsgáltuk (Id. 9-11. Ábrák).
Áramlási citometria
Az ABC-transzporterek immunfestésének és transzportaktivitásának mérése kék (488 nm) és vörös lézerekkel (633 nm) ellátott FacsCanto II áramlási citométerrel (BD Bioscience, San Jose, CA) történt. A PhenGreen (PG) jelet a FITC-csatomán mutattuk ki (emissziós szűrő: 530/30 nm), mitoxantron (MX) és TOPRO-3 jeleket az APC-csatomán mutattuk ki (emissziós szűrő: 660/20 nm).
PhenGreen felhalmozódás mérése áramlási citometriával
A PG felhalmozódásának időtől való függőségének nyomonkövetésére, 5 χ 105 sejtet kétszer mostunk 1 mL DPBS-sel (1 g/L D-glükóz foszfáttal puffereit sóoldatban), majd felvevő pufferben (1 m M EDTA DPBS-ben) 37°C-on előinkubáltunk. Ezután, a sejteket PhenGreen SK diacetátot különféle koncentrációban tartalmazó felvevő pufferben inkubáltunk transzportergátló jelenlétében vagy hiányában, 37°C-on 1-60 percig. A festékfelvételt 150 μΐ jéghideg EDTA-DPBS hozzáadásával állítottuk le, majd a mérésig jégen tartottuk a sejteket (Id. 12. Ábra). A PG felhalmozódásának PGD-koncentrációtól való függőségének értékelésére, ABCBl-et vagy ABCG2-t expresszáló 5*105 PLB-985 vagy A431 sejtet, vagy ABCCl-et expresszáló HL-60 és HEK-293 sejtet 1 mL DPBS-el kétszer mostunk, majd EDTA-DPBS közegben 10 percig szobahőmérsékleten előinkubáltunk. A sejteket 0,1-5 μΜ PGD-t tartalmazó EDTA-DPBS-ben 37°C-on 30 percig inkubáltuk. A festékfelvételt 150 μΙ jéghideg EDTA-DPBS hozzáadásával állítottuk le. A mérésig jégen tartottuk a sejteket.
Transzportergátlás értékeléséhez az ABCG2 transzporterfunkcióját 2,5 μΜ KO143-al (KO), ABCBl-ét 0,25μΜ tariquidarral (TQ), az ABCC1 -ét pedig 50 μΜ benzbromaronnal (BB) gátoltuk. A sejteket (5 x 105) 37°Con 0,5 μΜ PGD-vel vagy 1 μΜ Mx-el inkubáltuk inhibitorok jelenlétében vagy anélkül 30 (PGD) vagy 60 percig (Mx). A reakciót jéghideg EDTA-DPBS hozzáadásával állítottuk le és a fentiekben leírtak szerint fluoreszcenciát φ mértünk.
122444-15508/SG n
w
Áramlási citometriás adatok elemzése
Minden kísérletet legalább háromszor elvégeztünk. Az adatok elemzése FACSDiva v6.1.3 szoftver (BD Bioscience, San Jose, CA), alkalmazásával történt, áramlási citometriás grafikonok az Attune Acoustic Focusing Cytometer vl.25 szoftver (Applied Biosystems, Life Technologies, Carlsbad, CA, USA) alkalmazásával készültek. Eredményeket középértek ± Standard szórás formájában adtuk meg. Az MDR aktivitási tényező % (MAF% - Id.: [Homolya L et al. Br J Cancer. 1996; Holló Z et al. Anticancer Res. 1998,18: 2981-7., Sarkadi et al. US5872014 1999]) kiszámítása az alábbiak szerint történt: MAF%= (((MFlinh-MFIo)/MFIinh)xlOO), ahol MFLnh és MFIo az átlagos fluoreszcencia-intenzitás (MFI) inhibitor jelenlétében (inh) vagy inhibitor nélkül (0). Az ECso elemzést az Origin 8.6. szoftver alkalmazásával végeztük.
Sejtek életképességének vizsgálata
Kontroll és ABCG2-t expresszáló sejteket (1 χ 106) a felvevő pufferben 10 percig 37°C-on előinkubáltunk, majd 0,5 μΜ PGD-vel vagy anélkül 30 percig 37°C-on inkubáltunk. A PGD-vel kezelt sejteket PG-fluoreszcencia alapján osztályoztuk FACS Aria III sejtosztályozó (BD Bioscience, San Jose, CA, 488 nm-es kék lézer excitációval és 530/30 nm emisszióval) alkalmazásával. A szétválogatott sejteket 3 mL RMPI közegben, 6-lyukú lemezekben felszuszpendáltuk, és az élő sejtek számát minden nap meghatároztuk. Az elpusztult sejteket TOPRO™-3 jodid segítségével zártuk ki.
Az ECso értékek becsléséhez HEK- vagy A431-sejteket 0,5 μΜ PGD-vel 30 percig 37°C-on EDTA-DPBS pufferben kezeltünk, majd mostuk és 2 mL DMEM közegben, 12-lyukú lemezeken 72 órán át tenyésztettük. Élő sejtek számának meghatározása FACSCantoII áramlási citométerrel történt, míg az elpusztult sejteket TOPRO™-3 jodidos festéssel zártuk ki.
Konfokális képek
Konfokális mikroszkópiához a sejteket 5χ 105) 1 mL DPBS-sel kétszer mostuk, majd felvivőpufferben hígított, búzacsíra-eredetű agglutininnel konjugált Alexa Fluor-647-el (WGA-A647,1 pg/mL) inkubáltuk 5 percig szobahőmérsékleten. Ezután a sejteket 0,5 pM PGD-vel, transzportergátlókkal vagy anélkül inkubáltuk 37°C-on 30 percig. A PGD-felvételt úgy állítottuk le, hogy a sejteket 1 mL DPBSsel mostuk. A felvételeket 63*NA = 1.4 Plan Apo objektívve] felszerelt Zeiss LSCM 710 mikroszkóppal készítettük. A felvételeket rögzítettük és Zen2 (Blue edition) szoftverrel elemeztük.
1. Példa - Sejtvonalak és vizsgálati körülmények
Az Abc-transzporterek és PGD közötti kölcsönhatások vizsgálata céljából, különféle, ABCtranszportereket expresszáló sejtvonalakat alkalmaztunk. Ahogyan az Anyagok és eljárások című részben ismertetésre került és részletesen dokumentált a 9-11. Ábrán, a megfelelő transzporterek stabil és szelektív túlexpresszióját a transzporterszintek áramlási citometriás immunfestéssel és Western blottolással értékeltük. Az ebben a vizsgálatban alkalmazott sejtvonalak közé tartoztak a következők: ABCG2-t, ABCBl-et vagy ABCC1et szelektíven túlexpresszáló PLB/HL-60 limfoblasztoid sejtek, ABCG2-t vagy ABCBl-et túlexpresszáló A431sejtek, és az ABCCl-et túlexpresszáló HEK-sejtek. Minden esetben, e transzportereket mérhetetlenül alacsony mértékben expresszáló, megfelelő kontrolsejteket alkalmaztunk (9-11. Ábra).
Az ABC-transzporterek celluláris PG-felhalmozódásra gyakorolt hatásainak vizsgálatára megfelelő körülmények kiválasztásához, a közeghez adott különféle (0,5-2,5 pM közötti) PGD-koncentrációknál megvizsgáltuk a PGD-felvétel és PG-felhalmozódás arányát az alkalmazott sejtvonalakon. Ezekben a Φ vizsgálatokban fémektől mentes közeget alkalmaztunk (Id. Eljárások) a PG-fluoreszcencia elfojtásának kizárása
Π M
122444-15508/SG
W
2 212 26 céljából. Több vizsgálati körülmény alapján, optimálisként, a sejteken alapuló vizsgálatokhoz nem toxikus közegként az 1 mM EDTA-val kiegészített, glükóztartalmú DPBS-t alkalmaztuk.
A hogyan azt a 12. Ábrán bemutatott, időbeli lefolyásra irányuló kísérlet mutatja, amikor 0,5-2,5μΜ PGDt adtunk a közeghez, a PLB-sejtekben a celluláris PG-fluoreszcencia 37°C-on 30 percnél kevesebb idő alatt érte el a telítettségi állapotot. Továbbá, e körülmények között, az ABC-transzporterek hatásai (ABCG2-re Id. a 12. Kiegészítő Ábrát) jól értékelhetőek voltak. Hasonló, időtől függő PG-felhalmozódást találtunk a többi alkalmazott sejtvonalban (nincs bemutatva).
2. Példa - ABCG2 hatásai a nem fluoreszcens PG felhalmozódásra
Az első kísérletsorozatban részletes elemzésnek vetettük alá a celluláris ABCG2-multidrog-transzporter expressziójának a PG-felhalmozódásra gyakorolt hatásait. Ábra 1A mutatja be a PG felhalmozódásának PGDkoncentrációtól való függőségét kontroll PLB-sejtekben és PLB-ABCG2-sejtekben, megfelelően, áramlási citometriával mérve. [A panel. PDG-koncentrációtól függő PG-felhalmozódás kontroll PLB-sejtekben (x) és PLB-ABCG2 sejtekben (·). A fekete négyzetek (: ABCG2) és háromszögek (▲: CTRL) szemléltetik a PG felhalmozódását 2,5 μΜ KO143, egy specifikus ABCG2 inhibitor, jelenlétében] 1B Ábra szemlélteti hasonló kísérletben a PG-felhalmozódás függőségét a PDG-koncentrációtól kontroll A431- és A431-ABCG2-sejtekben. [B Panel. PDG-koncentrációtól függő PG-felhalmozódás kontroll A431-sejtekben (x) és PLB-ABCG2-sejtekben (·), EDTA-DPBS közegben 37°C hőmérsékleten 30 percig mérve. A fekete négyzetek (: ABCG2) és háromszögek (A: CTRL) szemléltetik a PG felhalmozódását 2,5 μΜ KO143 jelenlétében 0,5 pM PGD-nél. ± SD értékek feltüntetve.]. A dokumentáltak szerint, a PLB-sejtekben alacsony (1 pM alatti) PGD-koncentrációknál az ABCG2 fehérje jelenléte a sejtmembránban lényeges különbséget jelent a felhalmozódott PG-fluoreszcencia mennyiségét illetően, és magasabb PGD-koncentrációknál ez a különbség valahogy kisebbé válik. Az A431 -sejtek esetében, növekvő PGD-koncentrációk mellett az ABCG2 fehérje okozta celluláris fluoreszcenciában fennálló különbség továbbra is nő, míg az ABCG2 jelenlétében és hiányában a fluoreszcenciaértékek aránya, megfelelően, nem nő. Ennélfogva, a további kísérleteinkben 0,5 pM-os PGD-koncentrációt alkalmaztunk, amely elégségesnek bizonyult a funkcionális vizsgálat optimális körülményeinek biztosítására.
Az alábbi kísérletekben az ABCG2 változatainak és mutánsainak a celluláris PG-felhalmozódásra gyakorolt hatásait vizsgáltuk, és ezeket az eredményeket összehasonlítottuk a celluláris mitoxantron (M) felhalmozódására vonatkozóan. MX az ABCG2-fehérje jól ismert fluoreszcens tamszporter-szubsztrátja és ezt a vegyületet széleskörűen alkalmazzák az ABCG2 működésének értékelésére. Azonban, az MX erős citotoxikus ágens és szeparálásra vagy transzportért expresszáló sejtek további tenyésztésére nem alkalmazható.
A 2. Ábrán látható kísérletekben, a multidrugrezisztencia (MDR) aktivitási faktorokat, azaz MAF-ot mutatjuk be (Id. hiv.: [Homolya L et al. Br J Cancer. 1996, Holló Zs et al., Anticancer Rés. 1998, Hollo, Zs et al. EP 0784699 Bl, 1999], amelyet az ABCG2 specifikus inhibitorának, a Kol43a-nak, jelenléténél és hiányában talált, sejten belüli flooreszcens PG felhalmozódásának különbségeiből számítottunk ki. Ahogyan az A Panelen látszik, kontroll PLB-sejtekben az MDR aktivitása igen alacsony, míg a vad típusú (wt) ABCG2-fehériét expresszáló PLB-se jtek magas aktivitási szintet mutatnak. Az ABCG2-transzporteraktivitás e folyamatban játszott szerepének bemutatására, az ABVG2-K86M nem funkcionális katalitikus mutáns PG-felhalmozódásra gyakorolt hatását is megvizsgáltuk. Amellett, hogy membránexpressziója szintén valamivel alacsonyabb (9A és 9B. Ábra), e mutánsváltozatnak nincs hatása a PG-felhalmozódásra, így alacsony MDR aktivitási faktort eredményezett. A B panel hasonló PG-felhalmozódást dokumentál a kontroliban és az ABCG2-t expresszáló A431-sejtekben, ami
122444-15508/SG lényegében ugyanezzel a felismeréssel e sejtvonalat illetően.
Párhuzamos kísérletekben az MX extrúziójának alapján az MDR aktivitási faktort is kiszámítottuk a kontroll és az ABCG2-t expresszáló PLB- (C Panel) és A431-sejtekben (D Panel), megfelelően. Ahogyan a 2. Ábra C és D paneljei látható, az MX-extrúziós mérések lényegében a PG-felhalmozódás alkalmazásával kapottakkal azonos eredményeket hozták.
Funkcionális ABCG2-transzporterek tanulmányozásában a PG-alapú vizsgálatok szélesebb körű alkalmazhatóságának vizsgálata céljából, fluoreszcens (konfokális) mikroszkópia alkalmazásával kontroll PLBsejtekben és ABCG2-t expresszáló PLB-sejtekben PG-felhalmozódást vizsgáltunk. Miután 0,5 μΜ PGD-t adtunk a közeghez, PG fluoreszcenciát (zöld) mértünk az ABCG2 inhibitor KO143 (2,5 μΜ) jelenlétében vagy hiányában.
Ezekben a kísérletekben, a sejtek plazmamembrán-kompartmentumának jelzése céljából, az élő PLBsejtek fluoreszcens anti-WGA antitesttel való festését is belevettük.
Ahogyan a 3. Ábrán a reprezentatív konfokális mikroszkópi felvételeken látható, a kontroll PLB-sejtekben intenzív zöld (sok sejtben világosszürke, néhányban sötétebb tónusú) jelként látható a PG citoplazmatikus felhalmozódása miatt, míg az PLB-ABCG2-sejtek gyakorlatilag nem halmoztak fel PG-t (sötét sejtek, fluoreszcencia jellemzően csak a membránjukban). A specifikus ABCG2-inhibitor Kol43 hozzáadása esetén, az ABCG2-t expresszáló sejtek celluláris fluoreszcenciája nagymértékben megnőtt. A fluoreszcens anti-WGA-val előre jelölt sejteknél a fluoreszcencia a plazmamembránoknál jelentkezik (ami az ábrán jellemzően mérsékelten szürke, eredetileg vörös, körként látható).
A következő kísérletekben megvizsgáltuk a PG-felhalmozódási vizsgálat alkalmazásának lehetőségét az ABCG2-fehérjét expresszáló sejtek kiválogatására. Szövetből vagy daganatból származó őssejtek esetében, az ABCG2-fehérje expressziója - az eredetileg Hoechst 33342 festékextrúzió alapján megfigyelt - oldalpopuláció (Side Population (SP)) megjelenését okozza, ami az ABCG2-fehérje működésére vezethető vissza (hiv.: [Telford WG, et al. Stem Cells. 2007; Boesch M et al. Cytom Part A. 2012; Sheng Z, et al. Nat Med. 2001]). Kontroll PLBsejteket és vad-típusú ABCG2-t expresszáló PLB-sejteket kevertünk össze különböző arányban (0,2 - 99,8%). PG-felhalmozódást mérése a 0,25 μΜ PGD hozzáadása után történt. Ugyanazon sejtek felszínén lévő ABCG2fehérje immunfluoreszcens kimutatása az ABCG2-re specifikus 5D3 monoklonális antitest kötődésével történt. A grafikonon feltüntetett számok az elválasztott sejtek, relatív fluoreszcenciaértékek alapján mért, %-ban megadott arányát jelzik (Id. anyagok és eljárások). Az eredményeket a 4 Ábra mutatja be. Az alacsony PG-felhalmozódás és annak ABCG2-inhibitor KO143-al történő növekedése alapján, még a teljes sejtkeverék kevesebb, mint 1%-át kitevő sejtpopuláció is láthatóvá tehető és elkülöníthető áramlási citometriával. Ez a funkcionális vizsgálat hasonlóan nagy érzékenységű, mint az ABCG2 fehérje sejtfelszíni jelölése a specifikus 5D3 monoklonális antitesttel (Id. 4. Ábra).
3. Példa - ABCB1 és ABCC1 hatásai a nem fluoreszcens PG felhalmozódásra
Ahogyan a fentiekben bemutattuk, a PG-felhalmozódás érzékeny vizsgálatot biztosít az ABCG2-aktivitás kimutatására, ennélfogva az alábbi kísérletekben megvizsgáltuk, hogy lehet-e a PG felhalmozódását az ABCB1 és/vagy ABCC1 működésének vizsgálatára alkalmazni.
Ahogyan az 5. Ábrán látszik, ABCBl-et vagy ABCCl-et expresszáló különféle emberi sejtvonalakban a PG-felhalmozódás jelentősen csökkent. Egy viszonylag tág - 0,1-5 μΜ közötti - koncentrációtartományban, az <0 ABCBl-et vagy ABCCl-et expresszáló sejtek szignifikánsan alacsonyabb szintű PG-t halmoznak fel, mint a ft ft H 122444-15508/SG ft ft ft
I kontroll parentális sejtjeik (A és B panelek: ABCBl-et expresszáló PLB- és A431-sejtek, megfelelően, a megfelelő kontrolokkal együtt, D és C Panelek: ABCBl-et expresszáló HL-60- és HEK-sejtek, megfelelően, a megfelelő kontrolokkal együtt). EDTA-DPBS közegben a sejteket 30 percig 37°C-on különféle (0,1-5 μΜ) koncentrációjú PGD-vel inkubáltuk, és a sejtekben a fluoreszcens PG felhalmozódását áramlási citometriávai mértük.
Ahogyan az 5. Ábra E paneljén látható, az MDR aktivitási faktor egyaránt kiszámítható a parenterális és a transzportért expresszáló sejtek összehasonlításával, vagy ABCBl-re (tariquidar) vagy ABCCl-re specifikus inhibitorok (benzbromaron) alkalmazásával.
Az MDR aktivitási faktor meghatározása céljából a PG-felhalmozódás hatékonyságának összehasonlítására a mitoxantron (MX) alkalmazásával összehasonlítva, párhuzamos kísérleteket végeztünk e két rendszer alkalmazásával ABCBl-et (PLB-sejtek) és ABCCl-et expresszáló sejtek (HL-60 sejtek) alkalmazásával, megfelelően. Ahogyan az a 14. Ábrán látszik, a PGD-vizsgálat az MX-hez hasonlóan vagy annál jobban alkalmazható mindkét transzporterfehérje MDR aktivitási faktorainak kiszámítására.
A celluláris fluoreszenciát közvetlenül nyomonkövető konfokális mikroszkópos kísérletekben (6. Ábra), a PG-felhalmozódási vizsgálat ABCB1 és ABCC1 multidrog-transzporterek, megfelelően, aktivitásának nyomonkövetésére való alkalmazhatóságát is dokumentáltuk. A PG-fluoreszcencia (eredetileg zöld, jellemzően világos de néha sötétebb szürke körök a sejtekben) mérése 30 perccel azután történt, hogy a 0,5 μΜ PGD-t hozzáadtuk a közeghez, a transzportét gátlójának (0,25 pM tariquidar az ABCBl-nél vagy 50 pM benzbromaron az ABCCl-nél) jelenlétében vagy hiányában. Előzőleg a sejteket fluoreszcens anti-WGA-val jelöltük (eredetileg vörös színű, közepesen szürke körök a sejtekben) a plazmamembránok jelzésére.
4. Példa - PG-felhalmozódás hatása a sejtek életképességére
A következő kísérletekben az vizsgáltuk, hogy van-e a PG felhalmozódásának bármilyen hatása a sejtek életképességére és sejtszaporodásra. PG-feltöltő közeget akkor kell alkalmazni, amint a szérum nem specifikus észterázai a PDG-t gyorsan PG-vé hasítják, és a fémionok jelentős mértékben meg változtatják a PGfluoreszcenciát.
Az első kísérletsorozatban (7. Ábra, A panel) PGD-feltöltőközegben, 0,5 pM PGD-vel vagy anélkül 37°Con 30 percig inkubált kontroll és ABCG2-t expresszáló sejteket alkalmaztunk. A PGD-vel kezelt sejteket áramlási citometriávai osztályoztuk PG-fluoreszcenciájuk alapján, és a sejteket RPMI-közegben felszuszpendáltuk. A sejtszaporodást 9 napos sejtszámlálással becsültük meg, és az elpusztult sejteket TO-PRO-3 festéssel zártuk ki. A 7. Ábrán. (A Panel) a PhenGreen felhalmozódásának hatása a sejtszaporodásra PLB-sejteken és PLB-ABCG2sejteken.
Egy második kísérletsorozatban HEK- és A431-sejteket a felvivőpufferben a jelzett koncentrációjú PGDvel 30 percig 37 C-on kezeltünk, majd mostuk és normális sejttenyésztő-közegben 72 órán át tenyésztettük. Az élő sejtek számának meghatározása áramlási citometriávai történt, míg az elpusztult sejteket TO-PRO-3 festéssel zártuk ki (Id. Eljárások). Ezen kísérletek alapján, a fenti PG-felhalmozódás alkalmazása transzporteraktivitási vizsgálatokban és sejtosztályozásban nem volt mérhető hatással a sejtszaporodásra. A 7. Ábrán. (B és C panelek.) PGD-kezelés citotoxikus hatásai HEK- és A431-sejteken.
Következtetések
A fentiekben bemutatott illusztrációs példákban kimutattuk, hogy a sejtek PhenGreen SK diacetáttal (PGD) Φ történt inkubálása után, különböző emberi sejtekben az ABCG2, ABCB1 vagy ABCC1 multidrog-transzporterek ft ft
H 122444-15508/SG ft ft ft jelentős mértékben csökkentik a fluoreszcens PG felhalmozódását. Más multidrog-transzportereket és fluoreszcens festékeket megfelelőnek vagy feltehetően megfelelőnek tekintünk a találmányban való alkalmazás tekintetében.
IPARI ALKALMAZHATÓSÁG
A leírásban dokumentáltak értelmében, a találmány szerinti vizsgálat alkalmazható az ABCG2, ABCB1 és az ABCC1 drogtranszporterekre, új, egyedi lehetőséget szolgáltat e kulcsfontosságú emberi multidrogtranszporterek funkcionális tulajdonságainak vizsgálatára ugyanezen reagensek és körülmények alkalmazásával. Továbbá, bemutattuk, hogy az alacsony számú ABC-transzporter pozitív sejtek megkülönböztethetők és kiválogathatok a kevert sejtpopulációból. Ráadásul, egy rövid időtartamú PG-felhalmozódás után a sejtek nem mutattak a szaporodás megváltozásának vagy toxicitásnak jelét. Míg a DNS-re reaktív fluoreszcens transzporterszubsztrátok jelentős genetikai elváltozásokat okozhatnak, úgy tűnik, hogy a PG felhalmozódása a citoplazmában nem járt ilyen hatással. Ennélfogva, ezen eljárás támogatja a sejtosztályozást és további szelektív sejttenyésztést.
Összefoglalva, a PGD-felvételi és PG-felhalmozódási vizsgálat, a transzporterekre szelektív gátlók alkalmazásával kiegészítve, egy új és érzékeny eszköz a kulcsfontosságú multidrog-transzporterek funkcionális tulajdonságainak vizsgálatára, és transzportért expresszáló sejtek hatékony és szelektív osztályozására.
HIVATKOZÁSOK
Nem szabadalmi irodalom
Alexander SPH, Kelly E, Marrion N, Peters JA, Benson HE, Faccenda E, Pawson AJ, Sharman JL, Southan C, Davies JA and CGTP Collaborators (2015) The Concise Guide to PHARMACOLOGY 2015/16: Transporters. Br J Pharmacol. 172: 6110-6202.
Bennett, B.C. 2007. 3. fejezet Twenty-five Important Plant Families. B.C. Bennett, editor. UNESCO Encyclopedia of Life Support Systems, http://eolss.net.
Boesch M, Reimer D, Rumpold H, Zeimet AG, Sopper S, Wolf D. DyeCycle Violet Used for Side Population Detection is a Substrate of P-Glycoprotein. Cytom Part A. 2012; 517-522. doi:10.1002/cyto.a.22038
Boesch M, Wolf D, Sopper S. Optimized Stem Cell Detection Using the DyeCycle-Triggered Side Population Phenotype. Stem Cells Int. 2016;2016. doi: 10.1155/2016/1652389
Dean M, Fojo T, Bates S. Tumour stem cells and drug resistance. Nat Rev. 2005;5. doi:10.1038/nrcl590
Doyle LA, Ross DD. Multidrug resistance mediated by the breast cancer resistance protein BCRP (ABCG2).
Oncogene. 2003;22: 7340-7358. doi:10.1038/sj.onc,1206938
Elkind NB, Szentpétery Z, Apáti Á, Özvegy-Laczka C, Ujhelly O, Szabo K, et al. Multidrug Transporter ABCG2 Prevents Tumor Cell Death Induced by the Epidermal Growth Factor Receptor Inhibitor Iressa. 2005; 1770-1778.
W Hegedűs C, Szakács G, Homolya L, Orbán TI, Telbisz Á, Jani M, et al. Ins and outs of the ABCG2 multidrug
IN
N
H 122444-15508/SG
N
N
IN transporter: An update on in vitro functional assays. Adv Drug Deliv Rev. 2009;61: 47-56. doi:10.1016/j.addr.2008.09.007
Holló Z, Homolya L, Hegedűs T, Müller M, Szakács G, Jakab K, et al. Parallel functional and immunological detection of human multidrug resistance proteins, P-glycoprotein and MRP1. Anticancer Res. 1998; 18: 2981-7.
I
Hollo, Zs, Homolya, Laszló, Sarkadi, Balazs EP 0784699 Bl, filed in 1995, published in 1999
Homolya L, Holló M, Müller M, Mechetner EB, Sarkadi B. A new method for a quantitative assessment of Pglycoprotein-related multidrug resistance in tumour cells. Br J Cancer. 1996;73: 849-55.
Homolya L, Holló Z, Germanns, Ursula A, Pastan I, Gottesman MM, Sarkadi B. Fluorescent Cellular Indicators are extruded by the Multidrug resistance Protein. J Biol Chern. 1993;29: 21493-21496.
Homolya L, Orbán TI, Csanády L, Sarkadi B. Mitoxantrone is expelled by the ABCG2 multidrug transporter directly from the plasma membrane. BBA - Biomembr. Elsevier B.V.; 2011;1808: 154-163. doi: 10.1016/j.bbamem.2010.07.031
Horsey AJ, Cox MH, Sarwat S, Kerr ID. The multidrug transporter ABCG2: still more questions than answers. Biochem Soc Trans. 2016;44: 824-30. doi:10.1042/BST20160014
Illing AC, Shawki A, Cunningham CL, Mackenzie B. Substrate profile and metal-ion selectivity of human divalent metal-ion transporter-1. J Biol Chern. 2012;287: 30485-30496. doi:10.1074/jbc.Ml 12.364208;
Karászi É, Jakab K, Homolya L, Szakács G, Holló Z, Nahajevszky S, et al. Calcein assay for multidrug resistance reliably predicts therapy response and survival rate in acute myeloid leukaemia. Br J Haematol. 2001 ;112: 308-314.
László L, Sarkadi B, Hegedűs T. Jump into a New Fold — A Homology Based Model for the ABCG2 / BCRP Multidrug Transporter. PLoS One. 2016;l 1: 1-22. doi:10.1371/joumal.pone.0164426
Lebedeva I V., Pande P, Patton WF. Sensitive and specific fluorescent probes for functional analysis of the three major types of Mammalian ABC transporters. PLoS One. 2011;6. doi: 10.1371 /journal.pone.0022429
Ma Y, Abbate V, Hider RC. Iron-sensitive fluorescent probes: monitoring intracellular iron pools. Metallomics. Royal Society ofChemistry; 2015;7: 212-222. doi:10.1039/C4MT00214H
Morisaki K, Robey RW, Özvegy-Laczka C, Honjo Y, Polgar O, Steadman K, et al. Single nucleotide polymorphisms modify the transporter activity of ABCG2. Cancer Chemother Pharmacol. 2005;56: 161-172. doi: 10.1007/s00280-004-0931 -x
Nerada Z, Hegyi Z, Szepesi Á, Tóth S, Hegedűs C, Várady G, et al. Application of fluorescent dye substrates for functional characterization of ABC multidrug transporters at a single cell level. Cytom Part A. 2016; doi:10.1002/cyto.a.22931
W
H 122444-15508/SG
W iN N H M M
Özvegy-Laczka C, Várady G, Köblös G, Ujhelly O, Cervenak J, Schuetz JD, et al. Function-dependent Conformational Changes of the ABCG2 Multidrug Transporter Modify Its Interaction with a Monoclonal Antibody on the Cell Surface. J Biol Chern. 2005;280: 4219^4227. doi: 10.1074/jbc.M411338200
Robey RW, lerano C, Zhan Z, Bates SE. The Challenge of Exploiting ABCG2 in the Clinic. Curr Pharm Biotechnol. 2012; 12: 595-608.
Sarkadi B, Homolya L, Szakács G, Váradi A. Human Multidrug Resistance ABCB and ABCG Transporters: Participation in a Chemoimmunity Defense System. Physiol Rev. 2006;86: 1179-1236. doi: 10.1152/physrev.00037.2005.
Sheng Z, Schuetz JD, Bunting KD, Colapietro A-M, JANARDHAN S, Morris JJ, et al. The ABC transporter Bcrpl / ABCG2 is expressed in a wide variety of stem cells and is a molecular determinant of the sidepopulation phenotype. Nat Med. 2001 ;7: 1028-34. doi: 10.1038/nm0901-1028
Strouse JJ, Ivnitski-Steele I, Waller A, Young SM, Perez D, Evangelisti AM, et al. Fluorescent substrates for flow cytometric evaluation of efflux inhibition in ABCB1, ABCC1, and ABCG2 transporters. Anal Biochem. 2013;437: 77-87. doi: 10.1016/j.ab.2013.02.018
Szakács G, Váradi A, Özvegy-Laczka C, Sarkadi B. The role of ABC transporters in drug absorption , distribution , metabolism , excretion and toxicity ( ADME -Tox). Drug Discov Today. 2008; 13: 379393. doi: 10.1016/j.drudis.2007.12.010
Taylor NMI, Manolaridis I, Jackson SM, Kowal J, Stahlberg H, Kaspar P. Structure of the human multidrug transporter ABCG2. Nature. Nature Publishing Group; 2017;546: 504-509. doi:10.1038/nature22345
Telford WG, Bradford J, Godfrey W, Robey RW, Bates SE. Side Population Analysis Using a Violet-Excited Cell-Permeable DNA Binding Dye. Stem Cells. 2007;25: 1029-1036. doi:10.1634/stemcells.2006-0567
Szabadalmak és szabadalmi bejelentések
Kuhn et al, US5648270 granted to Molecular Probes Inc, July 15, 1997
Sarkadi et al., EP0784699B1 Published in 1996;
Sarkadi et al. US5872014 patent granted on Feb 19, 1999],
Claims (18)
1. Eljárás hidrofób heterociklusos vegyületek biológiai mintában történő transzportálására képes, ABC transzporterek B, C vagy G családjába tartozó ABC-multidrog-transzporter transzporteraktivitásának értékelésére, amely eljárás az alábbi lépéseket tartalmazza:
(a) biológiai minta sejtpopulációját, azaz mintasejteket, és negatív kontroll sejtek populációját la általános képletü fluorszceinszármazék észtervegyületnek teszünk ki, miáltal a sejteket egy feltöltő tápközegben feltöltjük az észterszármazék-vegyülettel, ahol a sejten belüli celluláris észterázok a megfelelő fluoreszceinszármazék hidroxivegyületté tudják hidrolizálni az észtervegyületet, ahol legalább a hidroxivegyület fluoreszcens;
PHEN (Ia) ahol
R1 és R2 jelentése egymástól függetlenül hidrogén, halogén és pszeudohalogén, H, F, Cl és Br közül választott, előnyösebben H és Cl vagy Cl és F közül választott; a találmány előnyös megvalósítási módjában az R1 és R2 jelentése azonos,
R3 és R4 jelentése egymástól függetlenül metil, etil vagy propil, előnyösen metil vagy etil, igen előnyösen metil,
L jelentése C és N közül választott 2-5 láncatomot tartalmazó linker, ahol a linker a fluoreszcein-csoport és a PHEN csoport pi elektronjaival együtt konjugált pi elektronrendszert alkot, vagy az L jelentése a következők közül választott. 2-5 láncatomot tartalmazó aminokarbonil (karboxamid), 2-5-láncatomot tartalmazó alkenil, karbamid, tiokarbamid, C2- vagy C4 alkenilamin és C3 alkenilamid, előnyösen aminokarbonil, karbamid, és tiokarbamid,
PHEN a fenantrénváz 1-8 pozíciójának bármelyikében 1,2 vagy 3 gyűrünitrogént, előnyösen 2 gyűrűnitrogént tartalmazó fenantrénszármazék, ahol az L kovalensen kötődik a PHEN-hez a fenantrénváz 9. vagy 10. pozíciójának megfelelő pozícióban, és (b) a mintasejtekben felhalmozódó fluoreszceinszármazék észtervegyület vagy a megfelelő hidroxivegyület, vagy mindkettő szintjét mérjük, miáltal a fluoreszceinszármazék vegyület szintjét meghatározzuk a mintasejtekben, és a negatív kontroll sejtek populációjában is mérjük felhalmozódó fluoreszceinszármazék észtervegyület vagy a megfelelő hidroxivegyület, vagy mindkettő szintjét, miáltal meghatározzuk a fluoreszceinszármazék vegyület negatív kontroll szintjét, a fluoreszcencia szintjének a sejtekben való mérésével,
CM
CM H Π
CM
CM
1····
SZTNH-100354841
122444-15508/SG (c) a mintasejtekben mért fluoreszceinszármazék vegyület szintjét összehasonlítjuk a negatív kontroll sejtekből nyert, hiányzó ABC-transzporter-aktivitásra jellemző negatív kontroll szinttel, (d) ahol a mintasejtekben mért fluoreszceinszármazék vegyületnek a negatív kontroll szinthez képest alacsonyabb szintje jelzi az ABC-transzporter-aktivitás jelenlétét és/vagy szintjét a biológiai mintában.
2. Az 1. igénypont szerinti eljárás, ahol ABC multidrog-transzporter az ABCBl-böl (MDR1, Pgp), ABCC 1-ből (MRP1) és ABCG2-böl (BCRP) álló csoportból választott.
3. Az 1. vagy a 2. igénypont szerinti eljárás, ahol a fluoreszceinszármazék észtervegyület (Ilb) általános képletü vegyület
ahol az L linker jelentése 2-5 lánchosszúságú aminokarbonil, alkenil, karbamid, tiokarbamid, C2- vagy C4 alkenilamin és C3 alkenilamid, előnyösen az aminokarbonil, karbamid és tiokarbamid közül választott.
4. A 3. igénypont szerinti eljárás, ahol a fluorszceinszármazék észtervegyület PhenGreen FL diacetát és PhenGreen SK diacetát közül választott, különösen PhenGreen SK diacetát és a fluoreszceinszármazék hidroxivegyület rendre PhenGreen FL és PhenGreen SK közül választott, különösen PhenGreen SK.
5. Az 1-4. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, ahol biológiai minta a következők közül választott: biológiai minta, amely valamilyen többsejtű alanyból, előnyösen emlős alanyból, előnyösen emberi alanyból származik; sejttenyészet.
6. Az 1-5. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, ahol az (a) lépésben vagy egy további (al) lépésben a biológiai mintából származó tesztpopulációt tesztvegyületnek is kitesszük, ahol a biológiai minta sejtjeinek referenciapopulációját nem tesszük ki a tesztvegyületnek (referenciapopuláció), ahol a tesztvegyületet előnyösen a feltöltő pufferhez adjuk, a (b) lépésben vagy egy további (bl) lépésben meghatározzuk a fluoreszceinszármazék vegyület szintjét a tesztpopulációban és a referenciapopulációban a fluoreszceinszármazék vegyület szintjének meghatározására a tesztpopuláció és a referenciapopuláció mintasejtjeiben, a (c) lépésben vagy egy további (cl) lépésben összehasonlítjuk a fluoreszceinszármazék vegyületnek a tesztpopuláció és a referenciapopuláció mintasejtjeiben mért szintjét, így
H 122444-15508/SG ft ft ft
W M W H CM
CM CM (e) a tesztvegyület ABC-transzporteraktivitásra kifejtett hatását is értékeljük, ahol a tesztpopuláció mintasejtjeiben a fluoreszceinszármazék vegyületnek, a referenciapopuláció sejtjeiben a fluoreszceinszármazék vegyület mért szintjéhez képest alacsonyabb szintje jelzi, hogy a tesztvegyület az ABCtranszporteraktivitás aktivátora a biológiai mintában és/vagy a tesztpopuláció mintasejtjeiben a fluoreszceinszármazék vegyületnek, a referenciapopuláció sejtjeiben a fluoreszceinszármazék vegyület mért szintjéhez képest magasabb szintje jelzi, hogy a tesztvegyület az ABCtranszporteraktivitás inhibitora a biológiai mintában.
7. Az előző igénypontok bármelyike szerinti eljárás, ahol a negatív kontroll populáció sejtjei az alábbi sejttípusok közül választottak:
- ABC-transzporterfehérjét nem expresszáló sejtek,
- ABC-transzporterfehérjét egy előre meghatározott küszöbérték alatti szinten expresszáló sejtek,
- sejtek, amelyekben az ABC-transzportfehérje expressziója csendesítve van;
- sejtek, amelyek a találmány szerinti fluoreszceinszármazék észter- vagy hidroxivegyület, előnyösen PG, transzportálására nem képes mutáns ABC-transzporterfehérjét expresszálnak, és/vagy
- sejtek, amelyekben az ABC-transzporterfehérje aktivitása gátolva van;
8. Az előző igénypontok bármelyike szerinti eljárás, ahol a mintasejtekben a fluoreszceinszármazék vegyület szintjének egy negatív kontroll szinttel történő összehasonlítása ABC-transzporteraktivitás kvantitatív értékelését tartalmazza.
9. A 8. igénypont szerinti eljárás, ahol az ABC-transzporter aktivitásának kvantitatív mérése tartalmazza a mintasejtekben a fluoreszceinszármazék vegyület szintjének kvantitatív értékben, felhalmozódási rátaként (F) és a fluoreszceinszármazék vegyület negatív kontroll szintjének kvantitatív értékben, felhalmozódási rátaként (F*) történő kifejezését, és
- az egyik kvantitatív érték kivonását a másikból.
10. A 9. igénypont szerinti eljárás, ahol a mintasejtekben a fluoreszceinszármazék vegyület szintjének egy negatív kontroll szinttel történő összehasonlítása tartalmazza mintasejtekben a fluoreszceinszármazék vegyület szintjének a fluoreszceinszármazék vegyület felhalmozódási rátájaként (F) történő kifejezését; és ekkor az adott negatív kontroll sejtekben a fluoreszceinszármazék vegyület szintjének a fluoreszceinszármazék vegyület felhalmozódási rátájaként (F*) történő kifejezését; és az adott mintasejtekben jelenlévő ABC-transzporterfehérje aktivitásának mértékét szemléltető MDR aktivitási faktor (MAF) kiszámítását az alábbi összefüggés alkalmazásával: MAF = (F*-F)/F*.
11. A 6. igénypont szerinti eljárás, ahol a fluoreszceinszármazék vegyület szintje a tesztpopuláció-mintában a mintasejtekben vizsgálati MDR aktivitási faktor (MAF) értékként van kvantitatíven meghatározva a 10. igénypont szerint, és a fluoreszceinszármazék vegyület szintje a referenciapopuláció-mintában a mintasejtekben referencia MAF értékként van szintén kvantitatíven meghatározva a 10. igénypont szerint, és
122444-15508/SG a tesztvegyület ABC-transzporteraktivitásra kifejtett hatásának értékelése a MAF értékek összehasonlításával történik.
12. Az 1-11. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, ahol a fluoreszceinszármazék vegyület érékeiésére szolgáló eljárás fluorometriát, áramlási citometriát és/vagy fluoreszcens mikroszkópiát tartalmaz.
13. Az 1-12. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, amely tartalmaz továbbá a következő lépések közül egyet vagy többet:
- a sejtek túlélésének mérése a mintában,
- a mintasejtek által termelt multidrog-transzporterfehérje mennyiségének meghatározása, - a mintasejtek felszínén lévő multidrog-transzporterfehérje mennyiségének meghatározása.
14. Az 1., 3. vagy 4. igénypontok bármelyike szerinti fluoreszceinszármazék-észtervegyület alkalmazása ABC-transzporteraktivitás értékelésére valamilyen biológiai mintában, előnyösen az 1-13. igénypontok bármelyike szerinti eljárásban.
15. Az 1., 3. vagy 4. igénypontok bármelyike szerinti fluoreszceinszármazék-észtervegyület és egy adott tesztvegyület alkalmazása a tesztvegyület ABC-transzporteraktivitásra gyakorolt hatásának vizsgálatára valamilyen biológiai mintában, előnyösen a 6. vagy 11. igénypontok bármelyike szerinti vagy a 6. vagy 11. igénypontok bármelyikével kombinált 12-13. igénypontok bármelyike szerinti eljárásban.
16. Az 1., 3. vagy 4. igénypontok bármelyike szerinti fluoreszceinszármazék vegyületet alkalmazása ABCtranszporteraktivitással rendelkező vagy nem rendelkező sejtek szelektálására az 1-13. igénypontok bármelyike szerinti eljárás alkalmazásával végzett méréssel egy adott biológiai mintában.
17. Készlet alkalmazása hidrofób heterociklusos vegyületek biológiai mintában történő transzportálásáia képes, ABC transzporterek B, C vagy G családjába tartozó ABC-multidrog-transzporter ABCtranszporteraktivitásának értékelésére, amely készlet tartalmazza
- az 1, 4 vagy 5. igénypontok bármelyike szerinti fluoreszceinszármazék vegyületet,
- feltöltőpuffert, és adott esetben
- negatív kontroll sejteket és/vagy
- az ABC transzporteraktivitás inhibitorát és/vagy
- PhenGreen kimutatására szolgáló eszközöket, és utasításokat multidrog-rezisztencia kimutatására biológiai mintában.
18. Az 1-16. igénypontok bármelyike szerinti eljárás vagy a készlet 17. igénypont szerinti alkalmazása, ahol felvivöpuffer
- kétértékű, fluoreszcenciát kioltó („quenching”) ionoktól mentes közeg, és/vagy
- fémkelátort, előnyösen EDTA-t, tartalmaz, előnyösen ahol PHEN fémkelátor, előnyösen 1,10-fenantrén.
122444-15508/SG
SZTNH-100371669
1/17
LABRA
A. PhenGreen felhalmozódás - PLB sejtek so
B. PhenGreen felhalmozódás - A431 sejtek
122444-15508/SG
SZTNH-100103863
2/17
2. ABRA
A. PG felhalmozódás- PLB sejtek
Priority Applications (5)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| HUP1700432A HU231387B1 (hu) | 2017-10-25 | 2017-10-25 | Fluoreszcens festékfelhalmozódási vizsgálat |
| AU2018357091A AU2018357091A1 (en) | 2017-10-25 | 2018-10-25 | Fluorescent dye accumulation assay |
| EP18870920.8A EP3701250A4 (en) | 2017-10-25 | 2018-10-25 | FLUORESCENT DYE ACCUMULATION TEST |
| US16/759,422 US11982675B2 (en) | 2017-10-25 | 2018-10-25 | Method of assessing ABC transporter activity using fluorescent dye accumulation assay |
| PCT/HU2018/050046 WO2019081957A1 (en) | 2017-10-25 | 2018-10-25 | FLUORESCENT COLORANT ACCUMULATION ASSAY |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| HUP1700432A HU231387B1 (hu) | 2017-10-25 | 2017-10-25 | Fluoreszcens festékfelhalmozódási vizsgálat |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| HUP1700432A2 HUP1700432A2 (en) | 2019-05-28 |
| HU231387B1 true HU231387B1 (hu) | 2023-06-28 |
Family
ID=89992555
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| HUP1700432A HU231387B1 (hu) | 2017-10-25 | 2017-10-25 | Fluoreszcens festékfelhalmozódási vizsgálat |
Country Status (5)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US11982675B2 (hu) |
| EP (1) | EP3701250A4 (hu) |
| AU (1) | AU2018357091A1 (hu) |
| HU (1) | HU231387B1 (hu) |
| WO (1) | WO2019081957A1 (hu) |
Families Citing this family (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| HU231387B1 (hu) * | 2017-10-25 | 2023-06-28 | Cellpharma Kft. | Fluoreszcens festékfelhalmozódási vizsgálat |
Family Cites Families (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| HU217108B (hu) | 1994-08-31 | 1999-11-29 | SOLVO Biotechnológiai Kft. | Eljárás daganatok multidrogrezisztenciáját okozó fehérje aktivitásának in vitro mennyiségi kimutatására biológiai mintákban |
| HUP0002557A3 (en) * | 2000-07-03 | 2004-08-30 | Solvo Biotechnologiai Kft | Simple quantitative fluorescent assay method for determining the activity of transport proteins of interest |
| JP2011501155A (ja) | 2007-10-15 | 2011-01-06 | ライフ テクノロジーズ コーポレーション | タリウムの流入および流出測定のための組成物および方法 |
| US8445271B2 (en) * | 2010-05-03 | 2013-05-21 | Enzo Life Sciences, Inc. | Processes and kits for determining multi-drug resistance of cells |
| HU231387B1 (hu) * | 2017-10-25 | 2023-06-28 | Cellpharma Kft. | Fluoreszcens festékfelhalmozódási vizsgálat |
-
2017
- 2017-10-25 HU HUP1700432A patent/HU231387B1/hu unknown
-
2018
- 2018-10-25 US US16/759,422 patent/US11982675B2/en active Active
- 2018-10-25 EP EP18870920.8A patent/EP3701250A4/en active Pending
- 2018-10-25 WO PCT/HU2018/050046 patent/WO2019081957A1/en active Search and Examination
- 2018-10-25 AU AU2018357091A patent/AU2018357091A1/en active Pending
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| US20200284797A1 (en) | 2020-09-10 |
| HUP1700432A2 (en) | 2019-05-28 |
| WO2019081957A1 (en) | 2019-05-02 |
| US11982675B2 (en) | 2024-05-14 |
| EP3701250A4 (en) | 2021-09-08 |
| EP3701250A1 (en) | 2020-09-02 |
| AU2018357091A1 (en) | 2020-07-16 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US20180087091A1 (en) | Methods and compositions for labeling nucleic acids | |
| Klonis et al. | Evaluation of pH during cytostomal endocytosis and vacuolar catabolism of haemoglobin in Plasmodium falciparum | |
| Rodrigue et al. | A global functional analysis of missense mutations reveals two major hotspots in the PALB2 tumor suppressor | |
| Hegedűs et al. | Ins and outs of the ABCG2 multidrug transporter: an update on in vitro functional assays | |
| Fardel et al. | Nature and uses of fluorescent dyes for drug transporter studies | |
| Mencarelli et al. | A humanized mouse model to study mast cells mediated cutaneous adverse drug reactions | |
| Mathew et al. | ABCG2-mediated DyeCycle Violet efflux defined side population in benign and malignant prostate | |
| Toledo et al. | Nintedanib targets KIT D816V neoplastic cells derived from induced pluripotent stem cells of systemic mastocytosis | |
| Szabó et al. | A new fluorescent dye accumulation assay for parallel measurements of the ABCG2, ABCB1 and ABCC1 multidrug transporter functions | |
| Smith et al. | Kinetic analysis of intracellular Hoechst 33342—DNA interactions by flow cytometry: Misinterpretation of side population status? | |
| JP2019500623A (ja) | ヒストンｈ３メチル化ステータスをモニターするためのフローサイトメトリー | |
| Laurent et al. | Measurement of nitric oxide in mast cells with the fluorescent indicator DAF-FM diacetate | |
| Radwan et al. | EdU sensing: The Raman way of following endothelial cell proliferation in vitro and ex vivo | |
| WO2010094694A1 (en) | Assays to predict cardiotoxicity | |
| Merugu et al. | Chemical probes and methods for single-cell detection and quantification of epichaperomes in hematologic malignancies | |
| HU231387B1 (hu) | Fluoreszcens festékfelhalmozódási vizsgálat | |
| Apáti et al. | The importance of drug transporters in human pluripotent stem cells and in early tissue differentiation | |
| US20120258474A1 (en) | Methods of detecting dna damage | |
| JP7019171B2 (ja) | 細胞表面に存在する分子の結合による細胞間相互作用を計測する方法 | |
| WO2010003908A1 (en) | Screening assay for compounds targeting the p97 aaa-atpase complex in the ubiquitin proteasome system. | |
| Rothe et al. | Phagocyte function | |
| Charnley et al. | E-cadherin in developing murine T cells controls spindle alignment and differentiation during β-selection | |
| CN113677992A (zh) | 一种分析细胞群能量代谢的方法 | |
| Fu et al. | Determination and Quantitation of Cytotoxic T Cell-Mediated Cell Death | |
| Hayman | Genomic influences on platelet function |