JP2004530100A - タリウム(i)感受性アッセイを用いるイオンチャネル調節剤の検出方法 - Google Patents
タリウム(i)感受性アッセイを用いるイオンチャネル調節剤の検出方法 Download PDFInfo
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Abstract
Description
技術分野
本発明は、タリウム(I)(Tl+)感受性蛍光アッセイを用いて、イオンチャネル、イオンチャネル連結型受容体、またはイオントランスポーターの活性を調節する化合物をスクリーニングする方法に関する。
【0002】
背景技術
イオンチャネルは、細胞膜を越えるイオン輸送を介在する膜貫通型タンパク質である。これらのチャネルは殆どの細胞型にあり、細胞の興奮性と恒常性の調節に重要である。イオンチャネルは、多くの細胞過程、例えば活動電位、シナプス伝達、ホルモン分泌、筋収縮等に関与している。生体細胞における多くの重要な生物学的過程はカルシウム(Ca2+)、カリウム(K+)およびナトリウム(Na+)イオンなどのカチオンの、イオンチャネルを介する転座を包含する。カチオンチャネルは、重要な薬剤標的として認められるイオンチャネルの大きく多様なファミリーを意味する。
【0003】
多様な命名法がイオンチャネルに用いられている。イオンチャネルは、リガンド依存性または電位依存性、選択的または非選択的イオンチャネルとして定義される(ノース、R. A., 1995, Ligand and Voltage−Gated Ion Channels、CRCプレス・インク;ボーカラートン、フロリダ州、1−58)。例えば、古典的な電位依存性カリウムチャネル、ナトリウムチャネル、およびカルシウムイオンチャネルは、生理学的条件下においてそれらの個々のイオンに対して強い選択性または優先性を発揮するために、一般的には選択的イオンチャネルであると考えられている。しかしながら、選択性は絶対ではなく、例えばナトリウムチャネルはリチウム等の他のイオンを通すことができる。反対に、非選択的カチオンチャネルは、僅かなあるいは全く優先性を示さずに多くのカチオンを輸送する。例えば、アルファ−アミノ−3−ヒドロキシ−5−メチル−4−イソキサゾールプロプリオネート(AMPA)型グルタミン酸受容体イオンチャネルは、リガンド依存性非選択的イオンチャネルであり、リチウム、ナトリウム、カリウム、ルビジウム、セシウム、およびカルシウムイオン等のイオンを容易に貫通させる。リガンド依存性イオンチャネルは、イオンチャネルにリガンドを結合させることにより調節される。リガンド依存性イオンチャネルの例としては、グルタミン酸、ニコチン酸アセチルコリン受容体、AMPA、N−メチル−D−アスパラギン酸(NMDA)およびバニロイド受容体が挙げられる。
【0004】
電位依存性イオンチャネルは、チャネルを開閉して細胞膜電位変化に応答し、よってイオン輸送を介在する。これらのチャネルは興奮性(例えば、神経細胞、筋肉)および非興奮性(例えば、外分泌腺/内分泌線分泌、および血液)細胞中に存在し、細胞性信号伝達および相互作用に重要な役割を果たし(コンリー、 E. C.; ブラマ−、W. J.、The Ion Channel FactsBook IV:Voltage−Gated Channels, 1999, アカデミック・プレス、ロンドン、英国)、それ故創薬の重要な標的である。これらのイオンチャネルは好適な薬剤標的の多くの特徴的特質を持ち、例えば、(1)これらは既知の生物学的機能を持ち;(2)それらはインビボで小分子量化合物により修飾され、また接近し易く;および(3)それらはインビトロでの特性決定とハイスループットスクリーニングのためのアッセイシステムを持っている(クラン、M;Current Opin. Biotech., 1998, 9, 565−572)。
【0005】
カリウム(K+)チャネルはカチオンチャネルの大きな、多様な遺伝子ファミリーによりコードされ、その開閉特性を基にして電位依存性およびリガンド依存性サブタイプに分けられる。これらのチャネルは、殆どすべての細胞型、組織および器官で調節機能を兼ね備えた高分子(macromelecule)に結合した膜である(ノース, R. A.、1995, Ligand and Voltage−Gated Ion Channels, CRCプレス・インク, ボーカラトーン、フロリダ州、1−58)。K+チャネルは電気的興奮性細胞(例えば、神経や筋肉)および非興奮性細胞(例えば、リンパ球)の膜電位、情報伝達、インスリン分泌、ホルモン放出、および血管トーン(vascular tone)、細胞内容量および免疫応答を調節する(ヒル, B., Ionic channels of Excitable Membranes, 1992, Ed. 2,サンダーランド、マサチューセッツ州; Sinauer)。近年、K+チャネルは重要な生理学的過程において同定され、心血管病、血圧/血管抵抗、癲癇、鎌形赤血球貧血、骨格筋疾患、島細胞代謝、免疫抑制、炎症、および癌を含むヒト疾病に伴うことが発見された(バルマン、D. E., Hum. Mol. Genet.1997, 6, 1679−1685;アッカーマン M. J.; オラファム、D. E., N. Engl.J. Med. 1997, 336, 1575−1586;クラン、M., 同上)。
【0006】
電位依存性K+チャネルは膜電位の変化を検出し、K+イオンを輸送することにより応答する。リガンド依存性K+チャネルは小分子量作働体(effector)、例えばカルシウム、ナトリウム、ATP、または脂肪酸などにより調節される(ラズダンスキ、Cardiovascular Drugs and Therapy, 1992, 6, 313−319)。電位依存性およびリガンド依存性K+チャネルの両者がカリウムイオンを輸送するけれども、それらは生理学的、生化学的および薬理学的性質において異なる。カリウムイオンチャネルを分類するにあたり、ドウプニクらはK+チャネルタンパク質の内向き整流(inward rectifying)ファミリーの体系的命名法を提唱している(ドウプニクら、Curr. Opin. Neuro. 1995, 8, 268−277)。このファミリーは、その三次構造と、一価のカチオン電位依存性チャネルとホモロガス(homologous)なポア(pore)領域が特徴的である。
【0007】
Kir−3チャネルは、Gタンパク質で調節されるK+電位依存性チャネルファミリーのサブファミリーである(ドウプニクら、同上)。Gタンパク質介在情報伝達経路はイオンチャネル、つまりイオンチャネル連結型受容体に直接結合していると示唆されている。Gタンパク質調節K+チャネル、例えばGタンパク質賦活内向き整流K+チャネル(GIRK)は心臓および神経機能の調節に重要であると示されている(クラチら、Prog. Neurobiol., 39, 229−246; グロウンおよびバーンバウマー, Ann. Rev. Physiol. 1990, 52, 297−213; マーク, M. D. およびヘルリッズ, S., Eur. J. Biochem., 2000, 267, 5830−5836; リーニー, J. L.およびティンカー, A.; Proc. Natl. Acad. Sci., 2000, 97, 5651−5656)。
【0008】
ニューロン受容体の心房性K+チャネルへの結合はカルチンらにより示された(カルチンら、 Proc. Nat. Acad. Sci., 1991, 88, 5694−5698)。これらのイオンチャネルの活性、特に、タンパク質のGタンパク質結合受容体(GPCR)ファミリーに連結したイオンチャネルの活性をモニターすることにより、GPCRの活性に及ぼす潜在的な調節化合物の効果を観察する、間接的方法が提供される。よって、GPCRは創薬の優れた標的である。現在のところ、GPCR活性を調節する化合物を検出する、簡単で有効なハイスループットスクリーニングアッセイが求められている。
【0009】
生理学的に関連する基質のイオンチャネルを介しての移動は、多様な物理的、光学的または化学的手法で辿ることが出来る(ステイン、W.D., Transport and Diffusion Across Cell Membranes, 1986, アカデミック・プレス、オーランド、フロリダ州)。イオンチャネルの調節剤のアッセイとしては、電気生理学的アッセイ、微小電極を用いるセルバイセル アッセイ(ウ, C.−F., スズキ, N., およびプー, M.M., J. Neurosci, 1983, 3 1888)、つまり、細胞内およびパッチクランプ法(ネエール, E.; サッカマン, B., 1992, Sci., Amer., 266, 44−51)、および放射活性トレイサーイオン法が挙げられる。パッチクランプ法および細胞全膜電位クランプ、電流クランプ、および二電極電位クランプ法は、電極を置く際に高程度の空間的精密さを要求する。機能的アッセイは、パッチクランプ法を用いて細胞全膜電流を測定することにより行うことができるが、しかしながら、処理能力は1日に行うアッセイ数で非常に限定されている。
【0010】
ラジオトレーサーイオンは、細胞試料内におけるチャネル制御イオン転座の生化学的および薬理学的研究に用いられている(ホスフォード、D,A.ら、Brain Res., 1990, 516, 192−200)。この方法において、放射活性トレーサーイオンと活性リガンドに一定の期間細胞を曝露し、ついで細胞を洗浄し、放射能含量を測定する。放射活性アイソトープはよく知られており(エバンス、E.A.;ムラマツ、M, Radiotracer techniques and applications, M. デッカー;ニューヨーク、1977)、およびそれらの使用は高感度での標的基質の検出を可能としている。しかしながら、放射活性アイソトープは多くの安全対策を必要とする。別法のさらに安全な非放射活性標識試薬の使用が近年増加している。
【0011】
蛍光検出を用いる光学方法は、パッチクランプおよび放射活性トレーサー法に対する好適な別法である。光学方法は、細胞群の場合と同様に単一細胞におけるイオン流動の全工程の測定を可能とする。蛍光法による輸送をモニターすることの利点は、これらの方法の高感度、一時的分解能、生体物質の控えめな要求、放射活性の欠如、およびイオン輸送を継続的にモニターして動的情報を得る能力が挙げられる(アイデルマン, O. カバンチック, Z.I., Biochim. Biophys. Acta, 1989, 988, 319−334)。蛍光により輸送をモニターする一般的原理は、化合物の転座に伴う蛍光特性においてコンパートメント依存性変異を持つことに基づいている。
【0012】
光学法は当初Ca2+イオン流動の測定のために開発され(スカルパ, A. Methods of Enzymology, 1979, 56,301, アカデミック・プレス、オーランド、フロリダ州;チェン, R.Y., Biochemistry, 1980, 19, 2396;グリンキービッツ, G., ポエニック, M., チェン, R.Y., J. Biol Chem., 260, 3440)、ハイスループットアッセイ用に一部変更された(米国特許第6,057,114号)。Ca2+イオンの流動はカルシウム感受性蛍光色素、例えばFluo−3、Fluo−4、カルシウム・グリーン他等を用いて一般的に行なわれる(Molecular Probes Inc., Handbook of Fluorescent probes and research chemicals, 7th edition, chapter 1, ユージーン、オレゴン州)。神経細胞における電気的活性の光学検出は電位感受性膜色素と光検知器設備を用いて行われる(グリンバルド, A, 1985, Annu. Rev. Neurosci. 8, 263;ロー, L.M.およびシンプソン, L.L., 1981, Biophys. J. 34, 353;グリンバルド, A.ら、1983, Biophys. J. 39, 301; グリンバルド, A.ら, Biophys. J. 42, 195)。
【0013】
カーペンらは生体細胞における1価のカチオン流動を検出する光学方法を開発した。この方法は細胞全膜内のセシウムイオン(Cs+)による、包埋色素、アントラセン−1,5−ジカルボン酸(ADC)の蛍光消光に基づくイオン流動を測定した(カーペン, J.W., サッチス, A.B.、パスキール, E. B., ヘス、G. P., Anal. Biochem. 1986, 157, 353−359)。本方法は特殊な神経伝達物質に対して応答する細胞をスクリーニングするために用いられた。カーペンらの方法は、Cs+がNa+やK+に置き換わることができるすべてのシステムで応用でき、トレーサーイオン法に匹敵することが証明されている。しかしながら、最も古典的K+およびナトリウムチャネルはCs+に対して最も選択的であり、それ故にこの方法は非選択的カチオンチャネルにのみ有用である。
【0014】
タリウムイオンは多くのK+チャネルを通過して輸送されることが、以前に報告されている(ヒル, B., J Gen. Physiol., 1972, 59, 637−58)。1価のカチオン流動を測定するためのタリウム蛍光消光法は再構築された膜小胞体で最初に開発された(モーア, H−P. H., ラフテリー, M. A., Proc. Natl, Acad. Sci, 1980, 77, 4509−4513)。タリウムはポリアニオン蛍光色素、8−アミノナフタレン−1,3,6−トリスルホネート(ANTS)の蛍光に影響を及ぼすと報告された(モ−ア, H−P. H., ラフテリー、同上)。この方法は、精製されたアセチルコリン受容体を含有する膜小胞体を通過するイオン輸送反応速度論を解明するために用いられた(ウ, W. C.−S.;モーア, H−P. H.;ラフテリー, M. A., Proc. Natl, Acad. Sci,, 1984, 78, 775−779)。タリウムイオンの小胞体への流入は、包埋蛍光試薬、ANTSの蛍光に及ぼすタリウムイオンの効果により測定された(ウ, W, C−S. モーア, H−P. H, ラフテリー, M. A.、同上)。しかしながら、この方法は小胞体を使用することに限定され、生理学的条件下での塩化タリウムの不溶性のため、細胞全膜には適用できないことが報告された。
【0015】
ここで述べる光学またはラジオトレーサー法の適用は、ハイスループットスクリーニング法へのそれらの順応性に限定される。例えば、Ca2+透過カチオンチャネルのハイスループットスクリーニング法は、一般的には、カルシウム感受性蛍光色素、例えばFluo−3、Fluo−4、カルシウム・グリーン等を用いて行う(米国特許第6,057,114および5,985,214)。これらのスクリーニング法は、カルシウムまたは他の関連する2価イオンを通過させるチャネルに主に適用でき、よってK+チャネルにはおおむね無用である。殆どの他のカチオンチャネルのハイスループットスクリーンは電位感受性色素、例えばDiBACを用いて行う(米国特許第5,882,873)。これらの色素はイオン流動の結果としておこる膜貫通型電位の変化を示す。しかしながら、このような方法は、膜電位を変える電荷を持つチャネルの型を直接的には分別せず、よって他の課題のなかで、細胞に存在するイオンチャネルの多様性のため、再現性に影響する人工物に対してはもっと困難である。
【0016】
カチオンチャネル活性を調節する化合物をスクリーニングする現行方法の限界により、カチオンチャネルの新規な調節剤の検索を妨げていた。さらに、チャネル活性の現行のアッセイは、潜在的調節剤の大きなライブラリーまたはグループをスクリーニングするために必要なハイスループットスクリーニング法には適当ではない。よって、カチオンチャネル活性を調節する多数の化合物候補をスクリーニングし同定する新規なアッセイ方法が依然としてこの分野で望まれている。本発明はこれらのまたは他の要望を満足させるものである。
【0017】
発明の概要
よって、本発明は、イオンチャネル、イオンチャネル連結型受容体またはイオントランスポーターの調節剤を検出する新規なタリウム感受性光学アッセイ方法を提供するものである。本方法は、生体細胞内のイオンチャネル、イオンチャネル連結型受容体またはイオントランスポーターの機能活性を測定するタリウム感受性アッセイを用いる。
【0018】
本発明方法はさらに、イオンチャネル、イオンチャネル連結型受容体またはイオントランスポーターの調節剤を同定する、ハイスループットスクリーニングアッセイを提供する。これは、イオンチャネル、イオンチャネル連結型受容体またはイオントランスポーターの活性を阻害または活性化する能力で、調節剤候補をスクリーニングするアッセイを提供するものである。本発明のハイスループットスクリーニングアッセイを用いることにより、イオンチャネル、イオンチャネル連結型受容体またはイオントランスポーターの活性を調節する新規化合物が、新規治療薬または診断薬の開発に用いるために同定される。
【0019】
本発明方法はまた、対象となるイオンチャネル、イオンチャネル連結型受容体またはイオントランスポーターを発現する細胞を培養するための新規な低Cl−細胞培養培地と、本発明のタリウム感受性アッセイを行うための新規なCl―−フリーアッセイ緩衝液を提供する。これらの溶液において、200mMより大きいタリウムイオン濃度が得られる。一つの態様において、細胞培養培地は2mM以下のCl−を含有し、塩素アニオンは有機グルコン酸アニオンで置換される。これらすべてのアッセイを既知の生理学的Cl−含有緩衝液中で行うことは可能だが、新規Cl―−フリー緩衝条件と低Cl−細胞培養培地は、さらに堅調で一貫性のある結果を出す。
【0020】
発明の詳細な説明
本発明は、イオンチャネル、イオンチャネル連結型受容体またはイオントランスポーターの活性を調節する対象化合物を検出および同定するための、細胞全膜を用いる新規なタリウム感受性アッセイ法を提供する。対象化合物はイオンチャネル、イオンチャネル連結型受容体またはイオントランスポーターの活性を活性化あるいは阻害する。そのような調節剤は、イオンチャネル、イオンチャネル連結型受容体またはイオントランスポーターの原核細胞および真核細胞系における生化学、生理学および薬理学を解明するために用いることができる、貴重なリサーチ・ツールである。
【0021】
さらに、そのような調節剤は、カチオンチャネル関連疾患、イオンチャネル連結型受容体を伴う疾患、抗生物質、抗カビ剤、炎症緩和剤、免疫学的疾患等の多くの疾病に有用な薬剤の開発を含む、多様な病態を治療するための診断薬または治療薬開発の為のリード化合物を提供する。
【0022】
よって、本発明アッセイは、カチオンチャネル関連疾患および/またはイオンチャネル連結型受容体を伴う疾患の治療に用いることができる薬剤の製薬学的開発のリード化合物を同定する方法を提供する。イオンチャネル、イオンチャネル連結型受容体またはイオントランスポーター活性の潜在的調節剤のスクリーニングのためのハイスループット法もまた提供される。
【0023】
さらに、本発明方法を実施するための新規な低Cl−細胞培養培地およびCl―−フリーアッセイ緩衝液も、本発明方法は包含するものである。
【0024】
定義
本出願に用いられる以下の用語および表現は特定の意味を持つ。
【0025】
「イオンチャネル」とは、開口またはポアを細胞膜内に形成するタンパク質で、ポアまたは開口はそれを通してイオンを流動させることができる。
【0026】
「イオンチャネル連結型受容体」とは、イオンチャネルに連結しているタンパク質であり、該タンパク質活性はイオンチャネルの活性に影響を与える。
【0027】
「イオントランスポーター」とは、細胞膜を通過してイオンを輸送するタンパク質である。
【0028】
「調節剤」とは、イオンチャネルの活性を変化することの出来る、つまり、イオンチャネルを介してイオンの移動または輸送を変えることができる、化合物または薬剤である。調節剤は有機分子または化学物質(天然のものまたは非天然のもの)であり、例えば生物学的高分子(例えば、核酸、タンパク質、非ペプチド、または有機分子)、または生体物質(例えば細菌、植物、菌類、または動物(特に哺乳動物)細胞または組織、タンパク質またはタンパク質フラグメント)から作られた抽出物である。調節剤は生物学的過程の阻害剤または活性化剤として作用する、例えば、アゴニスト、アンタゴニスト、部分的アゴニスト、部分的アンタゴニスト、抗腫瘍剤、細胞毒剤、腫瘍形成または細胞増殖阻害剤、および細胞増殖促進剤として作用するその能力で評価する。調節材の活性は既知、未知または部分的に既知である。
【0029】
チャネル遮断薬は、イオンチャネルを介するイオンの移動を直接的または間接的に阻害する化合物である。化合物は直接ポアを閉塞したり、ポアの開口を結合して阻害したり、またはイオンチャネルの開口時間およびその頻度に影響して、その効果を発揮する。
【0030】
チャネル開口剤はイオンチャネルを介するイオンの移動を活性化する化合物である。化合物は、イオンチャネルの開口期間および/またはその頻度に影響を及ぼして、または電位依存性イオンチャネルの電位依存度を変えてイオンチャネルが開口して、イオンチャネルを調節する。
【0031】
アゴニストはイオンチャネル、イオンチャネル連結型受容体またはイオントランスポーターを活性化することができる分子である。
【0032】
アンタゴニストは、アゴニスト作用に影響を与える分子、またはイオンチャネル、イオンチャネル連結型受容体またはイオントランスポーターの活性を阻害する分子である。
【0033】
本発明方法
本発明は、生体細胞のカチオンチャネルの機能活性を測定するためのタリウム感受性アッセイを用いる、カチオンチャネル調節剤を検出する新規方法を提供する。本発明は、カチオン流動(流入または流出)、特にタリウムイオンの流動を検出する、簡単で便利な光学方法を提供する。タリウムイオンの流動を検出することにより、直接的または間接的にイオンチャネルの活性を測定および観察することができる。
【0034】
本発明の一態様において、イオンチャネルに連結しているイオンチャネル連結型受容体の調節剤を間接的に検出するために本方法は用いることが出来る。ここに記載のタリウム感受性アッセイを用いて、受容体に連結している(調節剤の存在下または非存在下)イオンチャネルの機能活性を測定または観察することにより、イオンチャネル連結型受容体の調節剤の効果を観察することができる。
【0035】
本発明の他の態様において、イオントランスポーターの調節剤を検出するために、本方法は用いることが出来る。ここに述べるように、タリウム感受性アッセイを用いてイオントランスポーターの機能活性を測定および観察することにより、イオントランスポーターの調節剤の効果を観察することができる。
【0036】
一般的流入方法:
本発明方法は、本発明のタリウム感受性アッセイを用いて、標的イオンチャネル、イオンチャネル連結型受容体またはイオントランスポーターの潜在的調節剤である化合物を検出および同定する方法も包含するものである。これらのアッセイは、標的イオンチャネル(例えばカリウムイオンチャネル)、受容体に連結するイオンチャネル(例えばGIRK)、イオンチャネル連結型受容体(例えばGPCR)、またはイオントランスポーター(例えばグルタミン酸トランスポーター)を発現する細胞、検出可能(信号発生)タリウム感受性試薬(例えばBTC)、タリウムイオンおよびイオンチャネル、イオンチャネル連結型受容体またはイオントランスポーター活性の調節剤候補を含有する試験混合物をインキュベーションすることを包含する。タリウム感受性試薬の光学信号は調節剤を加える前に測定する。アッセイは、発生するイオンチャネル、イオンチャネル連結型受容体またはイオントランスポーター活性に好適な条件下で行う。タリウム感受性試薬の光学信号の変化を測定する。信号の増加または減少はイオンチャネルまたはイオントランスポーターを通過するタリウムイオンの移動を示す。
【0037】
本発明方法は、イオンチャネルを発現する細胞全膜を用いて実施し、次の工程からなる。1)イオンチャネルを発現する細胞を好適な条件下で培養し;2)信号発生タリウム感受性試薬(例えば、細胞透過性タリウム感受性試薬)と該細胞を接触または負荷し;3)好適な条件下で細胞を処理(例えば、洗浄または細胞外消光剤の添加)して過剰のタリウム感受性試薬の寄与を細胞外に除き;4)ベースライン測定のために検知可能な信号を測定し;5)細胞を、タリウムイオンとイオンチャンネルのための好適な刺激剤溶液(イオンチャネル、イオンチャネル連結型受容体またはイオントランスポーターを活性化する溶液)を含有する溶液と接触させ、イオンチャネル調節化合物候補と細胞を接触せしめ;6)信号を検出する。
【0038】
本発明の他の態様において、本発明方法はイオンチャネルおよびイオンチャネル連結受容体を発現する細胞全膜を用いて行い、次の工程を包含する:1)対象のイオンチャネルおよびイオンチャネル連結型受容体を発現する細胞を好適な条件下で培養し;2)信号発生タリウム感受性試薬(例えば、細胞透過性タリウム感受性試薬)と細胞を接触または負荷し;3)好適な条件下で細胞を処理(例えば、洗浄または細胞外消光剤の添加)して過剰のタリウム感受性試薬を除き;4)ベースライン測定のために検出可能な信号を測定し;5)細胞をイオンチャネル連結型受容体の調節化合物候補と接触させ;6)検出可能な信号を測定し;7)細胞を、タリウムイオンとイオンチャネル連結型受容体のための好適な刺激剤溶液を含む溶液と接触させ;および8)検出可能な信号を測定する。
【0039】
本発明のさらなる態様において、本発明方法はイオントランスポーターを発現する細胞全膜を用いて行い、次の工程を包含する:1)対象のイオントランスポーターを発現する細胞を好適な条件下で培養し;2)信号発生タリウム感受性試薬(例えば、細胞透過性タリウム感受性試薬)と細胞を接触または負荷し;3)好適な条件下で細胞を処理(例えば、洗浄または細胞外消光剤の添加)して過剰のタリウム感受性試薬を除き;4)ベースライン測定のために検出可能な信号を測定し;5)細胞をイオントランスポーター調節剤候補と接触させ;6)検出可能な信号を測定し;7)細胞を、タリウムイオンとイオントランスポーターのための好適な刺激剤溶液を含む溶液と接触させ;および8)検出可能な信号を測定する。
【0040】
タリウム感受性試薬により発生した信号の変化は、調節剤の添加前に、つまりタリウム塩または調節剤の添加前または後に、試験混合物中のベースライン信号を測定することにより、決定できる。
【0041】
調節剤候補の効果の分析を容易にするために対照実験を行うことは、本分野の通常の技術者は理解するであろう。対照実験は、(1)本発明方法と同一条件下で、天然のトランスフェクトされていない細胞;(2)刺激剤溶液非存在下の試験混合物にタリウムイオンを添加;(3)イオンチャネル、イオンチャネル連結型受容体またはイオントランスポーターの調節剤候補を試験混合物に添加せず、本発明方法と同条件下の細胞;および/または(4)イオンチャネル、イオンチャネル連結型受容体またはイオントランスポーターの既知の調節剤を用いて、本発明方法と同条件下の細胞、を用いて行う。
【0042】
一般的流出方法:
本発明はさらにイオン流出を測定する方法を提供する。タリウム流入を測定する方法は前述したとおりであり、また後記実施例の項で説明する。流出アッセイは流入アッセイで用いた同じ細胞を用い、BTCなどの上記信号発生タリウム感受性蛍光試薬で負荷する。細胞をタリウムと接触させて細胞を負荷する。一態様として、約15分間タリウムイオンと細胞を接触させる。細胞を洗浄して過剰のタリウムイオンを除き、流入アッセイで用いたように信号の変化を検出する同じ機器を用いて分析する(例えば、フルオロメトリック・イメージ・プレート・リーダー(FLIPR)(モレキュラー・デバイシス・コープ、サニーベール、カルフォルニア))。アッセイチャネルは、多くのリガンドのなかから一つを添加することにより、またはカリウム濃度を変えたりして細胞の膜電位を変えることによって刺激され開口し、イオンチャネルを介してイオンを流出させる。BTCでは、流出は蛍光減少を起こす。他の化合物、例えば対照化合物は流入アッセイと同じでよい。細胞を前述のとおりタリウムイオンで先に負荷しておき、洗浄して過剰のタリウムイオンを除く以外は、本発明方法の流入アッセイと同条件が適用できる。
【0043】
刺激剤溶液:
刺激剤溶液とは、イオンチャネル、イオンチャネル連結型受容体またはイオントランスポーター(例えばアゴニスト)を活性化する溶液である。ある種のイオンチャネル/トランスポーターは常時活性であり、その場合はタリウムイオントレーサーの他に「刺激剤」を添加する必要はない。刺激剤を要するチャネルにとって、刺激剤はリガンド、チャネルまたはイオンチャネル連結型受容体に結合してそれを作動させる分子、アゴニストである。刺激剤は電位依存性チャネルにとっては膜電位の変化でもある。典型的な電位依存性チャネルは電極による直接的電気的刺激により、または脱分極を起こすイオン組成物を含有する刺激剤溶液(例えば、高い対外カリウム)を用いることにより活性化される。さらに、タリウムイオンは電位依存性チャネルの刺激剤としても作用することができる。そのようなケースでは、タリウムイオンは「トレーサー」としてもまた「脱分極刺激剤」としても作用できる。流入アッセイでは、タリウムイオンは刺激剤の添加の直前、添加中、またはその後で加えることができる。
【0044】
本発明方法は、本方法で用いるイオンチャネル、イオンチャネル連結型受容体またはイオントランスポーターのタイプに基づいて選択される刺激剤溶液を包含する。好適な刺激剤溶液と、イオンチャネル、イオンチャネル連結型受容体、またはイオントランスポーターを選択することは、本分野の技術範囲である。一態様では、刺激剤溶液はイオンチャネルを活性化する試薬を含まない緩衝液が挙げられ、よってイオンチャネル、イオンチャネル連結型受容体、またはイオントランスポーターは実質的に静止したままである。この態様において、刺激剤溶液は、対象のイオンチャネル、イオンチャネル連結型受容体、またはイオントランスポーターを活性化しないが、調節試薬を細胞に添加しアッセイを開始させたときに、イオンチャネル、イオンチャネル連結型受容体、またはイオントランスポーターの活性化を促進する試薬が挙げられる。
【0045】
電位依存性チャネル(例えば、N型カルシウムチャネルまたはKCNQ2チャネル)との使用に選択された刺激剤溶液は、細胞膜の静止電位に対するイオンチャネルの感受性に依存する。これらの電位依存性イオンチャネルを用いる方法では、刺激剤溶液は膜を脱分極する働きをする活性化試薬が挙げられる(例えば、イオノフォア、バリノマイシン等)。
【0046】
細胞膜の脱分極による活性化のための、いくつかの電位依存性イオンチャネルとの使用に選択された刺激剤溶液は、細胞含有ウェルのカリウムイオンの最終濃度が約10〜150mM(例えば50mM KCl)の範囲になるような濃度のカリウム塩が挙げられる。さらに、電位依存性イオンチャネルはまた電気的刺激によっても刺激される。
【0047】
イオンチャネル連結型受容体およびリガンド依存性イオンチャネルとの使用に選択された刺激剤溶液は、そのような受容体を活性化することが知られているリガンドに依存する。例えば、ニコチン酸アセチルコリン受容体はニコチンまたはアセチルコリンにより活性化されることが知られており、同様に、ムスカリン性アセチルコリン受容体はムスカリンまたはカルバミルコリンの添加により活性化される。これらの系と使用される刺激剤溶液はニコチン、アセチルコリン、ムスカリンまたはカルバミルコリンが挙げられる。
【0048】
細胞:
本発明方法は、1)タリウムに透過性のイオンチャネル:2)タリウムイオンに透過性のイオンチャネルまたはイオンチャネル連結型受容体;または3)タリウムイオンに透過性のイオントランスポーター、を持つ細胞を用いる。本発明方法に用いる細胞は、1)イオンチャネル;2)イオンチャネルおよびイオンチャネル連結型受容体;または3)イオントランスポーターをコードするDNAで宿主細胞をトランスフェクトすることにより作成することができる。
【0049】
基本的には内因性イオンチャネル、イオンチャネルおよびイオンチャネル連結型受容体、またはイオントランスポーターを発現するいかなる細胞も用いることができるが、単一型のイオンチャネル、イオンチャネルおよびイオンチャネル連結型受容体、またはイオントランスポーターを優先的に発現するように、そのようなイオンチャネル、イオンチャネルおよびイオンチャネル連結型受容体、またはイオントランスポーターをコードする異種核酸で形質転換された、またはトランスフェクトされた細胞を用いることが好ましい。
【0050】
異種細胞表面タンパク質発現のための好ましい細胞は、容易におよび効率良くトランスフェクトされて、イオンチャネル、イオンチャネルおよびイオンチャネル連結型受容体、またはイオントランスポーターを発現するものである。イオンチャネルを発現する天然の細胞、およびイオンチャネル、イオンチャネルおよびイオンチャネル連結型受容体、またはイオントランスポーターを発現するようにトランスフェクトされた細胞は本分野の技術者には良く知られているか、あるいは本分野の技術者に同定され得る。異種細胞表面タンパク質を発現するように遺伝学的に設計された多くの細胞が知られている。イオンチャネル、イオンチャネルおよびイオンチャネル連結型受容体、またはイオントランスポーターを発現するために使用できる細胞型は、これらに限定されないが、細菌細胞、酵母細胞、および哺乳動物細胞が挙げられる。そのような細胞の例としては、これらに限定されないが、ヒト胎児腎臓(HEK)細胞、HEK293細胞(米国特許第5,024,939号:スチルマンら、1985, Mol. Cell Biol., 5, 2051−2060)、チャイニーズハムスター卵巣(CHO)細胞(ATCC Nos. CRL9618, CCL61, CRL9096)、ゼノパス絨毛卵母、(XLO)細胞、ベビーハムスター腎臓(BHK)細胞(ATCC No. CCL10)、マウスL細胞(ATCC No. CCLI.3)、ジャルカット(ATCC No. TIB 152)および153 DG44細胞(Chasin (1986) Cell. Molec. Genet. 12: 555)、ヒト胎児腎臓(HEK)細胞(ATCC No. CRL1573)、PC12細胞(ATCC No. CRL17.21)およびCOS−7細胞(ATCC No, CRL1651)が挙げられる。
【0051】
細胞は溶液中でまたは固体支持体上で培養できる。細胞は付着性または非付着性である。固体支持体は、これらに限定されないが、ガラスまたはプラスチック培養皿、またはマルチウェルプレートである。
【0052】
アッセイにおいて検出可能な蛍光信号を誘い出すことのできる細胞はいずれもマルチウェル・プレートに用いることができるが、各ウェルに植種される細胞数は、アッセイ時に細胞がコンフルエンスあるいは殆どコンフルエルスにあるが過剰増殖はしないように選択されるべきであり、それにより信号のシグナル対バックグランド(S/B)比が増加する。
【0053】
別法として、本発明方法は全細胞よりむしろ、イオンチャネル、イオンチャネルおよびイオンチャネル連結型受容体、またはイオントランスポーターを持つ膜(例えば膜小胞体)を用いて行うことができる。膜小胞体の使用は本分野の技術者に知られている。
【0054】
本発明方法は、イオンチャネル、イオンチャネル連結型受容体、例えば、GPCRなどの受容体、イオンチャネルと連結し、またはイオンチャネルの活性を調節できる信号伝達経路、およびイオンチャネル、細菌ポリンまたはイオントランスポーターに連結したタンパク質に適用できる。
【0055】
イオンチャネル:
本発明方法に用いることが出来るイオンチャネルのタイプとしては、これらに限定されないが、リガンドまたは電位依存性、伸展活性化カチオンチャネル、選択的または非選択的カチオンチャネルが挙げられる。
【0056】
リガンド依存性非選択的カチオンチャネルのタイプとしては、これらに限定されないが、アセチルコリン受容体、AMPA、カイニン酸およびNMDA受容体などのグルタミン酸受容体、5−ヒドロキシトリプタミン依存性受容体チャネル、APT依存性(P2X)受容体チャネル、ニコチン酸アセチルコリン依存性受容体チャネル、バニロイド受容体、リアノジン受容体チャネル、IP3受容体チャネル、細胞内cAMPで原位置(in situ)活性化されたカチオンチャネル、および細胞内cGMPで原位置(in situ)活性化されたカチオンチャネルが挙げられる。
【0057】
電位依存性イオンチャネルのタイプとしては、Ca2+、K+およびNa+が挙げられる。チャネルは外生的または内生的に発現される。チャネルは安定的にまたは一時的に、天然のまたは組換えセルラインの両者で発現される。
【0058】
K+チャネルのタイプとしては、これらに限定されないが、KCNQI(KvLOT1)、KCNQ2、KCNQ3、KCNQ4、KCNQ5、HERG、KCNE1(IeK、MinK)、Kv1.5、Kir 3.1、Kir 3.2、Kir 3.3、Kir 3.4、Kir 6.2、SUR2A、ROMK1、Kv2.1、Kvl.4、Kv9.9、Kir6、SUR2B、KCNQ2、KCNQ3、GIRK1、GIRK2、GIRK3、GIRK4、hlK1、KCNA1、SUR1、Kvl.3、HERG(コンレイ,E.C.およびブラマー,W.J.;1999, The Ion Channel, Factsbook IV: Voltage−Gated Channels, アカデミック・プレス、ロンドン、英国)、細胞内カルシウム賦活K+チャネル、ラット脳(BK2)(マッキンノン,D., (1989) J. Biol Chem. 264, pp. 9230−8236);マウス脳(BK1)(テンペルら、(1988) Nature 332, pp. 837−839)等が挙げられる。
【0059】
Na+チャネルのタイプとしては、これらに限定されないが、ラット脳IおよびII(ノダら、 1986, Nature 320, pp. 188−192);ラット脳III(カヤノら、1988, FEBS Lett. 228, pp. 187−194);ヒトII(ATCC No. 59742, 59743およびGenomics 1989, 5: 204−208)等が挙げられる。
【0060】
Ca2+チャネルのタイプとしては、これらに限定されないが、ヒトカルシウムチャネルα1、α2、βおよび/またはγサブユニット(米国出願第07/745,206および07/868,354)、リアノジン受容体(RyR)およびイノシトール 1,4,5−トリホスフェート受容体(IP3R)(T. ジャヤラマンら、J. Biol. Chem., 267, pp. 9474−77 (1992); A. M. カメロンら、 Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 92, pp. 1784−44 (1995));ラビット骨格筋α1サブユニット(タナベら、(1987) Nature 328, pp. 313−E318);ラビット骨格筋α2サブユニット (エリスら、(1988) Science 241, pp. 1661−1664);ラビット骨格筋pサブユニット(ルースら、(1989) Science 245, pp. 1115−1118);ラビット骨格筋ガンマ・サブユニット(ジェイら、(1990) Science 248, pp. 490−492)等が挙げられる。
【0061】
イオンチャネル連結型受容体:
本発明方法はイオンチャネル連結型受容体活性および情報伝達システムを間接的に測定するために用いることもできる。本発明方法の一態様において、受容体の活性化によりイオンチャネルの活性の調節へと導かれる、後続の細胞内事象を起こす場合に、イオンチャネル連結型受容体の活性は測定される。この調節は受容体サブユニットとイオンチャネルとの相互作用(例えば、GPCRβγサブユニットとGPCR連結型K+チャネル(例えばGIRK))の結果であり、あるいはイオンチャネル活性を調節するカルシウム、脂質代謝物、サイクリックヌクレオチドなどのメッセンジャー分子濃度の変化によるものである。
【0062】
Gタンパク質結合受容体のなかで、ムスカリン様アセチルコリン受容体(mAChR)、アドレナリン受容体、セロトニン受容体、ドパミン受容体、アンギオテンシン受容体、アデノシン受容体、ブラジキニン受容体、代謝調節型興奮性アミノ酸受容体等を用いることが出来る。
【0063】
本発明の間接的測定法のもう一つのタイプは、活性化されると細胞内サイクリックヌクレオチド(cAMP、cGMP)のレベルに変化を起こす受容体の活性を測定することを包含する。例えば、ある種のドパミン、セロトニン、代謝活性型グルタミン酸受容体およびムスカリン様アセチルコリン受容体の活性化により、細胞質のcAMP、cGMPレベルの増加または減少を起こす。さらに、サイクリックヌクレオチド依存性イオンチャネル、例えば、桿体視細胞(rod photoreceptor cell)チャネルや嗅覚ニューロンチャネルが存在し(アルテンホッフェン、W. ら、(1991) Proc. Natl. Acad, Sci U. S. A. 88: 9868−9872 およびダーランら、 (1990) Nature 347: 184−187)、それらはcAMPまたはcGMPの結合により活性化されカチオンに透過性である。よって、本発明方法によれば、視細胞または嗅覚受容体チャネルのサイクリックヌクレオチド活性化量の変化により生じた細胞質イオンレベルの変化は、活性化された場合にcAMPまたはcGMPレベルの変化を起こす受容体の機能測定に用いられる。受容体の活性化がサイクリックヌクレオチドレベルの減少を起こす場合には、このアッセイにおいて細胞に受容体活性化化合物を加える前に、該細胞を細胞内サイクリックヌクレオチドレベルを増加させる試薬、例えばホルスコリンに曝露しておくことが好ましい。
【0064】
このタイプのアッセイに用いられる細胞はイオンチャネル(GIRKなど)をコードするDNAと、活性化された場合に細胞質内のサイクリックヌクレオチドレベルに変化を起こすイオンチャネル連結型受容体(ある種の代謝型グルタミン酸受容体、ムスカリンアセチルコリン受容体、ドパミン受容体、セロトニン受容体等)をコードするDNAとで、宿主細胞を共トランスフェクトすることにより得ることができる。
【0065】
受容体を活性化した際に、細胞内に発現したイオンチャネルの活性に変化を起こすことができる受容体タンパク質を発現する細胞であれば本発明方法に用いることが出来る。例えば、カルシウムチャネルを開口することによって、あるいはCa2+をセカンドメッセンジャーとして利用する反応の開始を起こすことによって細胞内カルシウム濃度を間接的に影響することによって、活性化の際にカルシウムの細胞内濃度を直接的に増加することができる受容体タンパク質(Gタンパク質結合受容体)を発現する細胞が本発明方法に用いることが出来る。そのようなイオンチャネル連結型受容体またはイオンチャネルを内生的に発現する細胞、およびそのような細胞表面タンパク質の1つまたはそれ以上をコードする好適なベクターでトランスフェクトすることができる細胞は本分野の技術者には知られており、または本分野の技術者により同定されることができる。
【0066】
本発明に使用する受容体は、これらに限定されないが、以下のものが挙げられる。ムスカリン性受容体、例えばヒトM2(ジェンバンク・アセッション番号 M16404);ラットM3(ジェンバンク・アセッション番号 M16407);ヒトM4(ジェンバンク・アセッション番号 M16405);ヒトM5(ボーナーら、(1988) Neuron 1, pp. 403−410)等;ニューロンニコチン酸アセチルコリン受容体、例えばヒトα2、ヒトα3、およびヒトβ2、米国特許第504,455(1990年4月3日出願;その全体がここに参照として組み入れられている)に開示のサブタイプ;ヒトα5、サブタイプ(チニら、(1992) Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 89: 1572−1576)、ラットα2サブユニット(ワダら、(1988) Science 240, pp. 330−334);ラットα3サブユニット(ボールターら、(1986) Nature 319, pp. 368−374);ラットα4サブユニット(ゴールドマンら、(1987) Cell 48, pp. 965−973);ラットα5サブユニット(ボールターら、(1990) J. Biol. Chem. 265, pp. 4472− 4482);ニワトリα7サブユニット(クーツリアーら、(1990) Neuron 5: 847−856);ラットβ2サブユニット(デネリスら、(1988) Neuron 1, pp. 45−54);ラットβ3サブユニット(デネリスら、(1989) J. Biol. Chem. 264, pp. 6268−6272);ラットβ4サブユニット(デュボイシンら、(1989) Neuron 3, pp. 487−496);ラットαサブユニットのコンビネーション、ラットNMDAR1受容体(モリヨシら、(1991) Nature 354: 31−37 および スギハラら(1992) Biochem. Biophys. Res. Comm. 185: 826−832); マウスNMDA el 受容体 (メグロら、(1992) Nature 357: 70−74); ラットNMDAR2A、NMDAR2BおよびNMDAR2C受容体(モンヤーら、(1992) Science 256: 1217−1221);ラット代謝調節型 mGluR1受容体(ホウムドら、(1991) Science 252: 1318−1321);ラット代謝調節型mGluR2、mGluR3およびmGluR4受容体(タナベら、(1992) Neuron 8: 169−179);ラット代謝調節型 mGluR5 受容体(アベら. (1992) J. Biol. Chem. 267: 13361−13368)等;アドレナリン受容体、例えばヒトベータ1(フリーレら、(1987) Proc. Natl. Acad. Sci. 84, pp. 7920−7924);ヒト アルファ2(コビルカら、(1987) Science 238, pp. 650−656);ハムスター ベータ2(ディクソンら、(1986) Nature 321, pp. 75−79)等;ドパミン受容体、例えばヒトD2(ストーマンら、(1990) Molec. Pharm. 37, pp. 1−6);哺乳類ドパミンD2受容体(米国特許第5,128,254); ラット(ブンゾウら、(1988) Nature 336, pp. 783−787)等;セロトニン受容体、例えばヒト5HT1a(コビルカら、(1987) Nature 329, pp. 7579);セロトニン5HT1C受容体(米国特許第4,985,352);ヒト5HT.sub.1D(米国特許第5,155,218);ラット5HT2(ジュリウスら、(1990) PNAS 87, pp. 928−932);ラット5HT1c(ジュリウスら、(1988) Science 241, pp. 558−564) 等。
【0067】
イオントランスポーター:
本発明方法はまたイオントランスポーターの活性測定にも適用できる。
本発明方法に用いるイオントランスポーターは、これらに限定されないが、神経伝達物質イオントランスポーター(ドパミンイオントランスポーター、グルタミン酸イオントランスポーターまたはセロトニンイオントランスポーター)(ガデア、A. および ロペス−コロム, A. M., J. Neurosci. Res., 2001, 63, 453−460)、ナトリウム−カリウム ATPase、プロトン−カリウムATPase(シルバー、R. B. およびソレイマニ, M., Am.J. Physiol, 1999, 276, F799−F811)、ナトリウム/カルシウムイオン交換体、および塩化カリウムイオン共トランスポーター(ギレン, C. M,ら、J. Biol. Chem., 1996, 271, 16237−16244)。
【0068】
緩衝液:
本発明方法に用いる緩衝液のタイプとしては、約pH5.5〜pH9.0に緩衝能力のものであればよく、例えばHEPESやPBSが挙げられる。緩衝液は本分野でよく知られており、Molecular Cloning; A Laboratory Manual (2nd edition, サムブロック、フリッチおよびマニアティス、1989, コールド・スプリング・ハーバー・プレス)、またはShort Protocols in Molecular Biology(オースベル, F. M., ら、1989, ジョン・ウェリー・アンド・サンズ)により容易に得ることができる。
【0069】
既知の生理学的Cl−含有緩衝液ですべてのアッセイを実行することはできるが、新規なCl―−フリー緩衝条件および低Cl−細胞培養培地ではさらに堅調で一貫性のある結果が得られる。
【0070】
新規細胞培養培地:
本発明の一態様において、さらに一貫性のあるアッセイ結果を得るために溶液中のタリウムイオンのさらに高い濃度を用いる為に、新規な細胞培養培地およびアッセイ緩衝溶液が提供される。これらの両溶液において、200mMまでのタリウムイオン濃度を用いることができる。
【0071】
新規な細胞培養培地は、殆ど完全にCl−を含まない位の非常に低レベルのCl−を含有する。細胞培養培地はこの分野で知られた細胞培養に適したすべての成分(カチオン、アニオン、ビタミンおよびアミノ酸)を含むが、但し、Cl−濃度は約2mMより多くないように限定されている。残留するCl−は有機アニオングルコン酸塩で置き換えることができる。約pH5.5〜9.0の間を緩衝する処理能力の緩衝液であればどれども、例えばHEPESが使用できる。
【0072】
細胞培養培地は以下の一つまたは複数を含有する:グルコン酸ナトリウム;グルコン酸カリウム;MgSO4・7H2O;NaHCO3;グルコン酸カルシウム;NaH2PO4;グルコース;ビタミン;アミノ酸;グルタミンおよび緩衝液(例えばHEPES)。
【0073】
新規細胞培養培地組成物の好ましい態様は、グルコン酸ナトリウム(109mM);グルコン酸カリウム(5.4mM);MgSO4・7H2O(0.8mM);NaHCO3(26.2mM);グルコン酸カルシウム(3.6mM);NaH2PO4(1.2mM);HEPES, pH7.3 w/NaOH(25mM);グルコース(5.6mM);100Xビタミン(10ml/L);50X アミノ酸(20ml/L);およびグルタミン(2mM)を含有する。
【0074】
新規Cl ― −フリーアッセイ緩衝液:
本発明は新規Cl―−フリーアッセイ緩衝液組成物および使用方法を提供する。Cl―−フリーアッセイ緩衝液は、Cl−イオン濃度が約2mM以下に限定されたどの緩衝液でもよい。残留Cl−イオンは有機アニオングルコン酸塩で置き換えることができる。新規Cl―−フリーアッセイ緩衝組成物は250から360 mOsMの浸透圧範囲であり、緩衝能力はpH5.5からpH9.0の間である。Cl―−フリーアッセイ緩衝液の浸透圧は本発明方法に用いる細胞型に依る。例えば、ゼノパス卵母細胞などの細胞は200 mOsM以下の条件下で生存できるが、一方他の細胞型では、1000mOsMまでの高い浸透圧の細胞培養培地とアッセイ緩衝液の、高い浸透圧条件下で生存する。
【0075】
新規Cl―−フリーアッセイ緩衝液はグルコン酸ナトリウム、グルコン酸カリウム、グルコン酸カルシウム、グルコン酸マグネシウム、グルコースおよび緩衝液(例えば HEPES)を含有する。好ましい新規Cl―−フリーアッセイ緩衝組成液はグルコン酸ナトリウム(140mM)、グルコン酸カリウム(2.5mM)、グルコン酸カルシウム(6mM)、グルコン酸マグネシウム(1mM)、グルコース(5.6mM)およびHEPES(10mM)を含有する。
【0076】
タリウム塩:
本発明方法において、細胞膜を通過するタリウムイオン(つまり、トレーサー)流動はタリウム感受性試薬を用いて測定する。タリウム塩溶液はタリウムイオンを提供する。
【0077】
本発明方法に用いるタリウム溶液に用いるタリウム塩は水溶性であり、例えばTl2SO4、Tl2CO3、TlCl、TlOH、TlOAc、TlNO3塩等が挙げられる。
【0078】
タリウム感受性試薬:
本発明方法は信号発生タリウム感受性試薬を提供する。タリウム感受性試薬は細胞膜を通過するタリウム流動の指示薬として用いられ、十分に感受性であり細胞質のタリウムイオン濃度の変化に応答して蛍光または光学強度の検出可能な変化を起こすものである。検出可能な信号を起こすタリウム感受性試薬としては、これらに限定されないが、蛍光化合物および非蛍光化合物が挙げられる。
【0079】
タリウム感受性蛍光試薬:
タリウム感受性試薬の本発明の一態様としては、蛍光化合物が挙げられる。本質的に、細胞内に負荷できるいかなるタリウム感受性蛍光化合物も用いることが出来る。好ましくは、化合物はタリウムイオンの低濃度を検出できるように選択される。これらの蛍光化合物はタリウムイオンの存在下で蛍光減少又は増加を示すことが出来る。
【0080】
好ましいタリウム感受性蛍光試薬としては、これらに限定されないが、ANTS、Fluo−4、Fluo−3、PBFI、フェン・グリーン(Phen Green)、マグネシウム・グリーン、BTC、APTRA−BTC、Mag−Furaレッド、Fluo−4FF、FluoZin−1およびFluoZin−2が好ましい色素である(Molecular Probes Inc.、ージーン、オレゴン州)。ANTS、Fluo−4、Fluo−3、PBFI、フェン・グリーン、APTRA−BTCおよびMag−Furaレッドはタリウムイオンの存在下で蛍光減少を示す。マグネシウム・グリーン、BTC、Fluo−4FF、FluoZin−lおよびFluoZin−2はタリウムイオンで増加する蛍光を示す。タリウム感受性蛍光試薬は親水性でも疎水性であってもよい。
【0081】
タリウム感受性蛍光試薬は、細胞を色素の膜透過性誘導体を含む溶液に接触させて細胞質内に負荷できるが、しかしながら、もっと疎水性の指示薬を用いることにより、負荷過程は促進される。よって、蛍光指示薬は、非修飾された色素に比べさらに容易に細胞膜に透過できるさらに疎水性のアセトキシメチルエステル(Am)が良く知られており、入手可能である。色素のアセトキシメチルエステル形が細胞に入った後、エステル基は、細胞質エステラーゼにより除かれ、それにより細胞質に色素は捕獲される。
【0082】
タリウム感受性試薬の蛍光は蛍光信号を検知できる装置で測定する。装置の一つとしてFLIPR(Molecular Devices Corp.、サニーベール、カルフォルニア)があり、蛍光はタリウムイオンとイオンチャネル、イオンチャネル連結型受容体またはイオントランスポーター調節剤の添加前、添加中、および添加後に、1Hzまでの速度で記録される。非接着細胞に用いる装置としてはFLIPRおよびフロー・サイトメーター(flow cytometer)(Becton−Dickenson)が例示できる。
【0083】
イオンチャネル活性の調節剤を検出する本発明の一態様において、BTCはタリウム感受性蛍光試薬である。タリウムイオンの存在下、BTCは488nmで励起した場合、蛍光の強い増加を示す。
【0084】
タリウム感受性試薬およびタリウムイオンの細胞内への輸送は信号の増加または減少を起す。タリウムイオンはその濃度勾配に従って開口したチャネルを通過して移動し、細胞内の色素蛍光強度を変え、よって、記録できる信号を起こす。カチオンチャネルの活性化はタリウムイオンの流入速度を促進し(タリウム感受性蛍光化合物の蛍光変化を起こし)およびその阻害によりタリウムイオンの流入速度を減少させる(タリウム感受性蛍光試薬の蛍光に全くまたは殆ど変化をもたらさない)。一般的に、タリウムイオンがそれに結合していなければ、蛍光はそのまま変化しない。よって、イオンチャネルがチャネル調節剤候補により遮断され、タリウム流入が阻害されていれば、蛍光変化は殆どまたは全く検出されない。
【0085】
細胞外消光剤:
蛍光タリウム感受性試薬を用いる一態様において、過剰の蛍光化合物は細胞外消光剤の充分量を用いて除かれる。細胞外消光剤の使用により細胞から非負荷されたタリウム感受性蛍光試薬を洗浄する必要を未然に防ぐ。細胞外消光剤は細胞透過性ではなく、タリウム感受性蛍光試薬の蛍光から容易に分離できる蛍光を持つ、光吸収型蛍光化合物である。細胞外消光剤の吸光スペクトルはタリウム感受性蛍光試薬の発光を有意に吸収する。細胞外消光剤は、細胞内へのその経路を阻害する化学組成物でなくてはならず、一般的に消光剤は電荷されるかまたは非常に大きな化合物であるべきである。細胞外消光剤の濃度範囲はマイクロモルからミリモルの範囲であり、その光吸収能に依る。使用できる細胞外消光剤としては、それらに限定されないが、タートラジンおよびアマランス、あるいはそのような消光剤の混合物が挙げられる。消光剤は「色素、染料および指示薬のシグマ・アルドリッチ・ハンドブック」(フロイド、G. グリーン, 1990, セントルイス、ミズーリ州)に記載されている。
【0086】
タリウム感受性非蛍光試薬:
本発明方法はさらにタリウム感受性非蛍光試薬を提供する。
本発明の一態様において、タイウムイオンと反応して、沈殿物や着色生成物を形成し、よって試験混合物の光学濃度の検出可能な変化を起こす非蛍光化合物であるタリウム感受性試薬の使用を提供する。これらの化合物としては、これらに限定されないが、ヨウ化物、臭化物、およびクロム酸塩が挙げられる。
【0087】
本発明の一態様において、タリウム感受性試薬が非蛍光化合物である場合、タリウムイオンおよびチャネル調節剤の添加の前、添加中および添加後に吸光度を分光光度計で記録できる。イオンチャネルおよび/または受容体を発現する細胞はヨウ化物、臭化物またはクロム酸塩で負荷される。細胞を、例えば、緩衝生理食塩水で洗浄する。タリウムイオンの細胞内への輸送は光学濃度信号の増加または減少を起こす。タリウムイオンは、その濃度勾配に従って開口したチャネルを通過し、細胞内の光学濃度を変え、記録できる信号を起こす。カチオンチャネルの活性化はタリウムイオンの流入速度を促進し(沈殿物または着色生成物の形成を増加する)およびその阻害によりタリウムイオンの流入速度を減少させる(沈殿物または着色生成物の生成に全くまたは殆ど変化をもたらさない)。一般的に、タリウムイオンが非蛍光化合物と反応しなければ、光学濃度はそのままで変化しない。よって、イオンチャネルが遮断され、タリウムイオン流入が阻害されると、光学濃度変化は殆どまたは全く検出されない。
【0088】
調節剤候補:
本発明はイオンチャネル、イオンチャネル連結型受容体またはイオントランスポーター活性を調節する化合物を同定する方法を提供する。基本的には、本発明のアッセイには潜在的な調節剤としていかなる化学物質も使用することができるが、水溶液または有機(特にDMSOを基礎とした)溶液に溶解できる化合物が好ましい。シグマ・ケミカル・カンパニー(Sigma Chemical Co.、セントルイス、ミズーリ州)、アルドリッチ・ケミカル・カンパニー(Aldrich Chemical Co.、セントルイス、ミズーリ州)、シグマ・アルドリッチ(Sigma−Aldrich、セントルイス、ミズーリ州)、フルカ・ケミカ・バイオケミカ・アナラチカ(Fluka Chemika−Biochemica Analytika、バッチス、スイス)などの多くの化学物質の商業的供給者が存在することは、この分野の技術者に認識されるであろう。
【0089】
イオンチャネル、イオンチャネル連結型受容体およびイオントランスポーターの例は上記で例示した。
【0090】
ハイスループットスクリーニング (High−Throushput Screening) 法:
本発明方法はハイスループットスクリーニング用に適合できる。ハイスループットスクリーニング法は既知であり、マイクロタイタープレートまたはピコ、ナノまたはマイクロリッターアレイの使用を採用する。
【0091】
本発明のハイスループット法は、対象のイオンチャネル、イオンチャネルおよびイオンチャネル連結型受容体またはイオントランスポーターを発現する細胞全膜を用いて行い、以下の工程を含む。1)好適な条件下で細胞を培養し;2)要すれば、細胞を固体支持体上に接着させ;3)細胞を検出可能な信号を生成する細胞透過性タリウム感受性試薬で負荷し;4)好適な条件下で細胞を処理(洗浄または細胞外消光剤の添加)して過剰のタリウム感受性試薬を除き;5)検出可能な信号を測定し;6)タリウムイオンと適した刺激剤溶液を含む溶液を加え;7)調節化合物候補を加え;8)検出可能な信号を測定し:および9)検出可能な信号の変化を記録する(つまり、タリウムイオン、刺激剤溶液および調節化合物の添加の前後)。検出可能な信号の変化はチャネル調節剤の効果を示す。
【0092】
本発明のアッセイは、大きなケミカル・ライブラリーのハイスループットスクリーニングを可能とするよう、例えばアッセイ工程を自動化し、いかなる通常の供給源からの調節化合物候補をアッセイに提供するように設計されている。固体支持体上で並行して行われるアッセイ(例えば、ロボット利用アッセイにおいてマイクロタイタープレート上のマイクロタイターフォーマット)は良く知られている。自動化システムおよび光学検出(または信号)の変化を検出および測定する方法は良く知られている(米国特許第6,171,780;5,985,214;6,057,114)。
【0093】
本発明のハイスループットスクリーニング法は多数の潜在的な治療用調節化合物を包含するコンビナトリアル・ライブラリーを提供することを含む(ボーマン、S, C. & E News, 1999, 70 (10), 33−48)。コンビナトリアル・ケミカル・ライブラリーの調製およびスクリーニングは本分野の技術者によく知られている。
【0094】
コンビナトリアル・ケミカル・ライブラリーは、化学合成や生物学的合成を用いて得られる、多様な化学基礎的要素、例えば試薬等を集めた、多種多様の化学物質のコレクションである。例えば、ポリペプチドライブラリーなどの一次コンビナトリアル・ケミカル・ライブラリーは、与えられた化合物長(ポリペプチド化合物におけるアミノ酸の数)にする為のすべての可能な方法で、一連の化学基礎的要素(アミノ酸)の結合して形成される。数百万の化学物質が、このような化学基礎的要素をコンビナトリアル的に混合することにより合成される。
【0095】
そのようなコンビナトリアル・ケミカル・ライブラリーとしては、これらに限定されないが、ペプチドライブラリーがある(米国特許第5,010,175、Furka, Int. J. Pept. Prot. Res., 1991, 37: 487−493およびホートンら、Nature, 1991, 354, 84−88)。化学的多様なライブラリーを作り出す為の他のケミストリーも用いることも出来る。そのようなケミストリーとしては、これらに限定されないが、ペプトイド(PCT公開公報WO 91/19735); コードされたペプチド(PCT公開公報WO 93/20242);ランダム・バイオオリゴマー(PCT公開公報WO 92/00091);ベンゾジアゼピン(米国特許第5,288,514);ヒダントイン、ベンゾジアゼピンおよびジペプチドなどのダイバーソマー(diversomers)(ホブスら、Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 1993, 90, 6909−6913);ビニル性ポリペプチド(ハギハラら、J. Amer. Chem. Soc. 1992, 114, 6568);ベータ−D−グルコース・スカフォルディングとの非ペプチド性ペプチド模倣(peptidomimetics)(ハーシュマンら、J. Amer. Chem. Soc., 1992, 114, 9217−9218);小化合物ライブラリーの類似体有機合成(チェンら、J, Amer. Chem. Soc., 1994, 116, 2661;アームストロングら、Acc. Chem. Res., 1996, 29, 123−131);あるいは小有機分子ライブラリー(例えば、ベンゾジアゼピン、バーム C & E News, 1993, Jan. 18, page 33);オリゴカルバメート(チョら、Science, 1993, 261, 1303);および/またはホスホン酸塩ペプチジル(キャンベルら、J. Org. Chem. 1994, 59, 658);核酸ライブラリー(セリガー, Hら、Nucleotides & Nucleotides, 1997, 16, 703−710);ペプチド核酸ライブラリー(米国特許第5,539,083参照);抗体ライブラリー(バーンら、Nature Biotechnology, 1996, 14(3), 309−314およびPCT/US96/10287参照);炭水化物ライブラリー(リャンら、Science, 1996, 274, 1520−1522および米国特許第5,593,853、ニルソン, UJら、Combinatorial Chemistry & High Throughput Screening, 1999 2, 335−352;シュワイザー, F; ヒンドガール, O., Current Opinion In Chemical Biology, 1999 3, 291−298);イソプレノイド(米国特許第5,569,588);チアゾリジノンおよびメタチアザノン(米国特許第5,549,974);ピロリジン(米国特許第5,525,735および5,519,134);モルホリノ化合物(米国特許第5,506,337);ベンゾジアゼピン(米国特許第5,288,514)および他の同様の技術。
【0096】
コンビナトリアル・ライブラリーの調製の為の装置は市販されている(例えば、357 MPS、390 MPS、Advanced Chem. Tech.,ルイビル、ケンタッキー州、Symphony, Rainin, ウォバーン、マサチューセッツ州、433A Applied Biosystems, ホスターシティー、カルフォルニア州、9050 Plus, Millipore,ベッドフォード、マサチューセッツ州)。さらに、多くのコンビナトリアル・ライブラリーそのものが市販されている(例えば、ComGenex、プリンストン、ニュージャージー州、Asinex, モスクワ、ロシア、Tripos, Inc., セントルイス、ミズーリ州、ChemStar, Ltd., モスクワ、ロシア、3D Pharmaceuticals、エクストン、ペンシルベニア州、Martek Bio sciences、コロンビア、メリーランド州等参照)。
【0097】
コンビナトリアル・ケミカル・ライブラリーはここで開示の1つまたは複数のアッセイでスクリーニングされて、標的イオンチャネル活性(ボーマン, S., 上記;ダガミ, R., C. & E. News, 1999, 70 (10), 51−60)、イオンチャネル連結型受容体またはイオントランスポーターの活性の調節能を発揮するライブラリー構成化合物(特に、化学スペシーズまたはサブクラス)を同定する。このように同定された調節化合物は、通常のリード化合物としての役目をし、または潜在的または実際的な治療剤としてそのものを使用することができる。
【0098】
ハイスループットアッセイにおいて、アッセイの成分が適宜に機能していることを確認するためポジティブ対照を用いることが望ましい。ポジティブ対照の例において、既知のカチオンチャネル開口剤化合物をアッセイの試験混合物と接触させ、得られたカチオンチャネル活性の増加をここに開示の方法に従って測定する。ポジティブ対照の他の例において、カチオンチャネルを発現する細胞には、既知のカチオンチャネル遮断薬化合物を加えることができ、得られたカチオンチャネル活性の減少を同様にして検出する。イオンチャネル、イオンチャネル連結型受容体またはイオントランスポーターに既知の効果を持つ化合物と調節剤候補が結合できることは、当然認識されるであろう。例えば、既知のカチオンチャネル開口剤または遮断薬は、そうでなければ既知のイオンチャネル調節剤の存在により引き起こされであろう、カチオンチャネル活性化または抑制に影響を与える調節剤を発見するために用いることが出来る。
【0099】
本発明のハイスループットアッセイにおいては、数千個までの異なる調節剤候補を1日でスクリーニングすることが可能である。特に、マイクロタッタープレートの各ウェルを、選択した潜在的調節剤に対する分離したアッセイを行うことに用いることができ、または濃度またはインキュベーション時間効果が観察されるなら、各5〜10個ずつのウェルで単一調節剤を試験することができる。よって、1枚の標準マイクロタッタープレートで約100(96)個の調節剤を試験することができる。1536穴プレートを用いるならば、1枚のプレートで約100〜約1500個の異なる化合物を容易に試験することが出来る。1日あたり多くの異なるプレートを試験することも可能である。約6,000〜20,000の、さらには約100,000〜1,000,000個の異なる調節剤化合物候補をアッセイスクリーニングすることが本発明方法を用いることにより可能である。
【0100】
本発明の有利性:
本発明は、多様な方法でイオンチャネル、イオンチャネル連結型受容体またはイオントランスポーターの調節剤を検出し特性決定できる現行の技術の改良を示す。例えば、(a)放射活性試薬の必要がない;(b)方法はタリウムイオンの透過性を利用している;(c)イオンチャネル、イオンチャネル連結型受容体またはイオントランスポーターの活性をタリウムイオン流動のみでモニターし、生理学的関連イオンの存在により混乱されない;(d)イオンチャネル、イオンチャネル連結型受容体またはイオントランスポーターの化学的または生化学的修飾の必要がない;(e)アッセイは細胞全膜で実施でき、特に新規な低Cl−細胞培養培地と新規なCl―−フリーアッセイ緩衝液を用いて行うことができる;(f)アッセイにより発生した信号または発光は、従来既知の光学手法を用いて一般的に得られるものより、有意に大きく、さらの強固である;(g)信号変化は調節剤候補の存在によりで発生し、よって特異な調節試薬の同定が容易にできる;(h)現在入手可能な多様なタリウム感受性試薬がある;(i)アッセイ過程において、アッセイフォーマットはイオンチャネルおよび/または受容体を固体支持体上に固定することを要しない;および(j)記載の各フォーマットは容易に自動化およびハイスループットスクリーニング用に変更可能である。
【0101】
下記の実施例は本発明方法および化合物を例示するために、また通常の技術者がこれを合成したり使用したりするのを助けるために提示する。実施例はここに特許される特許証により許される保護の開示範囲を制限するためのものではない。
【0102】
実施例I
本実施例は哺乳動物細胞での対象のイオンチャネルの発現を説明する。
【表1】
【0103】
表1は実施例中のタリウム感受性アッセイで用いるDNA構築物を示す。各クローン物の制限サイトは、対象のイオンチャネルcDNAが如何にして哺乳動物細胞発現に必要なDNAベクターにサブクローンされるかを例示する(pCDNA3(インビトロゲン、カールスバッド、カルフォルニア)およびplRESneo(クローンテック、パロ・アルト、カルフォルニア))。安定なセルラインの選択および調製に用いる細胞型(HEK;ヒト胎児腎臓細胞)および抗生物質の濃度を示す。標準的分子生物学的手法が表1に列記したイオンチャネル遺伝子のクローニングで用いた。詳細なクローニング技術もまた文献に記載されている(HSlo/BK(ドウオレツキ, SI.ら、Mol. Brain Res.. 27: 189−193);KCNQ2(特許WO 99/07832);SKチャネル(ケーラー,Mら、Science 1996, 273: 1709−1714);およびVR1(M J カテリナら、Nature 1997, 389: 816−824))。
【0104】
VR1−pIRESneoをリポフェクタミン プラス(Lipofectamine PLUS、Life Technologies)トランスフェクション・キット・プロトコールを用いて、CHO細胞にトランスフェクトした。hSK−pCDNA3、hslo(BK)−pCDNA3およびmKCNQ2−pCDNA3を、リポフェクタミン プラス(Life Technologies)トランスフェクション・キット・プロトコールを用いて別々にHEK−293細胞にトランスフェクトした。細胞はCHO細胞には500μg/mlの濃度で、HEK293細胞には800μg/mlの濃度で、G418(Life Technologies)を用いて選択した。薬剤選択の12日後、各セルラインのタリウム流入アッセイを用いて、ここに記載(実施例II)のとおりにチャネル発現を分析した。FLIPRマニュアルに記載の、CHO細胞でのカルシウム応答の測定指示に従い、カルシウム感受性色素Fluo−3を用いて、hVR1発現CHO細胞をチャネルの細胞内カルシウム増加能で評価した(Molecular Devices,サニーベール、カリフォルニア州)。
【0105】
実施例II
本実施例は、ペプチド阻害剤アパミン(Sigma Chemical Co., セントルイス、ミズーリ州;ハチ毒より)の、スモールコンダクタンスカルシウム賦活K+チャネル(SK2)(ケーラー, M.ら、Science 1996, 273:1709−14)に対する効果を測定する、タリウム流入の尺度としてBTC蛍光変化を用いる本発明のタリウム流入アッセイの能力を例示する。
【0106】
スモールコンダクタンスカルシウム賦活K+チャネル(SK2)を安定的に発現するHEK−293セルライン(ATCC、マナッサス、バージニア州から入手)を、ポリ−D−リジンプレートで被膜し、低Cl−細胞培養培地を20μl/ウェルで含有した384穴マイクロタイタープレートに約80%コンフルエンスで植種した。細胞は37℃で5%CO2インキュベーター内で終夜静置培養した。
【0107】
細胞含有プレートをインキュベーターから取り除き、アマランスとタルトラジン(本アッセイでの最終濃度はアマランスは2mMで、タルトラジンは1mM)含有Cl―−フリーアッセイ緩衝液20μL/ウェルに溶解した、2μM BTC−AM(Molecular Probes、ユージーン、オレゴン州)で約15分間負荷した。BTCのAMエステル(BTC−AM)は膜透過性である。これは膜を越えて拡散するので、細胞性エステラーゼにより切断されて、荷電された膜非透過性色素BTCを生成する。これらのタイプの色素および負荷メカニズムは本技術に精通した技術者には良く知られている。
【0108】
一旦負荷されると、アパミン(表IIのCl−−フリーアッセイ緩衝液に溶解した500nM保存液を5μl/ウェル、あるいはCl−−フリーアッセイ緩衝液の同容量)を加えた。ついでマイクロタイタープレートをプレートリーダー、FLIPRに移す。アパミンまたはCl−−フリーアッセイ緩衝液単独に曝露した後あるいは同時に、2mMアマランスと1mMタルトラジン含有Cl−−フリーアッセイ緩衝液に溶解した、5μMのイノマイシン(Calbiochem)と7.5mMのTl2SO4を含有する刺激剤緩衝液5μl/ウェルに、細胞を曝露した。
【0109】
示されるすべてのデータはFLIPR(Molecular Devices、サニーベール、カリフォルニア州)を用いて集めた。好適な標準プロトコールでは、刺激剤緩衝液の添加前ベースラインとして1Hzにて1分10秒間データを取得する。
【0110】
SK2、スモールコンダクタンスカルシウム賦活K+チャネルの活性化および遮断を測定するタリウム流入技術の能力は図1に示された。
【0111】
安定なベースライン蛍光が、カルシウムイオノフォア、イノマイシンおよびタリウムイオンの添加前に、SK2チャネル遮断薬アパミンの存在下または非存在下で培養した細胞で観察された。タリウムイオンとイノマイシン(細胞内カルシウムの増加とそれに続くSK2の活性化を起こす)の添加により、BTC蛍光の実質的増加が観察された。蛍光のこの増加はSK2遮断薬アパミンの添加により完全に消失した。BTC蛍光のアパミン感受性増加は、同様の条件下の天然のトランスフェクトされていないHEK細胞では観察されず、またはイノマイシンの非存在下でタリウムの添加では観察されないことから、これらの結果はSK2チャネルの活性化を測定するタリウム流入アッセイ能を明確に例示する。これらのデータはまたカルシウム賦活SK2チャネルの遮断薬を同定するこのアッセイの能力を例示する。
【0112】
細胞培養培地とアッセイ緩衝液に用いるすべての試薬はシグマ・アルドリッチ(セントルイス、ミズーリ州)から入手したが、100X ビタミンと50X アミノ酸溶液はライフ・テクノロジー(ロックビル、メリーランド州)から入手した。試薬に用いた記号表示は供給者から提供されたものあった。
【0113】
【表2】
【0114】
【表3】
【0115】
実施例III
本実施例は、タリウム流入の尺度としてBTC蛍光の変化を利用するCa2+感受性電位依存性Maxi−Kチャネルを遮断または開口する化合物を検出するための、本発明のタリウム流入アッセイの使用を例示する。
【0116】
この実施例のすべての実験条件は以下の点を除いて実施例IIと同じであった。
1.HEK−293細胞をMaxi−Kチャネルで安定的にトランスフェクトした。ラージコンダクタンスカルシウム賦活K+チャネル、Maxi−Kチャネルを発現する細胞を用いた(ドオレツキ SI, トロジナッキ JT, グリブロフ VK、Brain Res Mol Brain Res. 1994, 1: 189−93) (aka BK, slo);および
2.用いたチャネル開口剤はNS−1619(シグマ・アルドリッチ、セントルイス、ミズーリ州)を15μMの最終濃度で用いた。用いたチャネル遮断薬はイベリオトキシン(Iberiotoxin、シグマ・アルドリッチ、セントルイス、ミズーリ州)を100nMの最終濃度で用いた。
【0117】
チャネル遮断薬を検出するために、アッセイは11μlの刺激剤緩衝液(2mMのアマランスと1mMのタートラジン含有Cl−−フリーアッセイ緩衝液(表II)に溶解した、15μMイノマイシン、12.5 Tl2SO4および50mM K2SO4含有)を添加して開始した。
【0118】
チャネル開口剤を検出するために、刺激剤緩衝液は、15μM イノマイシンの替わりに5μMイノマイシンを用いる以外は、チャネル遮断薬のアッセイ条件と同一であった。これらの条件下、チャネルは亜最大的に開口し、チャネル開口剤を観察できた。
【0119】
Maxi−K、ラージコンダクタンスカルシウムおよび電位依存性K+チャネルの活性化および阻害の測定を可能にするタリウム流入技術の能力は図2に例示する。
【0120】
安定なベースライン蛍光は、イノマイシンおよび超生理学的カリウムの添加前に、HEK細胞脱分極およびタリウム流入を起こす、Maxi−Kチャネル遮断薬イベリオトキシンまたはMaxi−Kチャネル開口剤 NS−1619の存在下または非存在下で培養した細胞で観察される。タリウム、イノマイシンおよびカリウムイオンの添加により、BTC蛍光の相当な増加が観察される。蛍光のこの増加はイベリオトキシンの添加により完全に消失した(図2A)。Maxi−Kチャネルの小幅な開口を起こすわずかに異なる条件下では、NS−1619の添加により、NS−1619非存在下で観察されるものと比べ、BTC蛍光のタリウム誘発増加を著しく増加した。イベロトキシンやNS−1619は両者とも、天然のトランスフェクトされていないHEK細胞に負荷されたBTCの蛍光に影響を与えなかった。これらの結果から、カルシウムおよび電位依存性Maxi−Kチャネルの遮断薬および開口剤の両方を同定する、またはこれらの調節剤の活性を測定する、タリウム流入技術の能力を明確に示す。
【0121】
実施例IV
本実施例は、タリウム流入の尺度としてBTC蛍光変化を用いて、電位依存性K+チャネル KCNQ2(欧州特許第WO 99/07832)を遮断する、または開口する化合物を検出する、タリウム流入アッセイの能力を例示する。
【0122】
この実施例のすべての実験条件は以下の例外を除いて、実施例IIと同じであった。
1.電位依存性K+チャネルKCNQ2で安定にトランスフェクトされたHEK−293セルラインを用いた;
2.用いたチャネル開口剤は最終濃度15μMのレチガビン(retigabine)であった(メイン, M. J.ら、Mol. Pharmacol., 2000, 58, 253−62);および
3.用いたチャネル遮断薬DMP−543(ザックゼック、Rら、J. Pharmacol. Exp. Ther. 1998, 285, 724−30)は最終濃度15μMであった。
【0123】
チャネル遮断薬を検出するために、KCNQ2チャネルをタリウムイオン(5mM)とK+(20mM)の組み合わせで開口した。開口剤を検出するために、アッセイはタリウムイオン(3mM)で開始した。
【0124】
チャネル遮断薬を検出するために、刺激剤緩衝液(2mMアマランスおよび1mMタートラジン含有Cl−−フリーアッセイ緩衝液(表II)に溶解した12.5mM Tl2SO4、50mM K2SO4含有)11μlを加えて、アッセイを開始した。
【0125】
開口剤を検出するために、刺激剤緩衝液(2mMアマランスおよび1mMタートラジン含有Cl−−フリーアッセイ緩衝液に溶解した7.5mM Tl2SO4含有)11μlを加えて、アッセイを開始した。
【0126】
KCNQ2電位依存性K+チャネルの活性化および遮断を測定可能にするタリウム流入技術の能力は図3に示す。安定なベースライン蛍光はタリウムおよび超生理学的カリウムの添加(HEK細胞の脱分極化を起こす)前に、KCNQ2チャネル遮断薬DMP−543またはKCNQ2チャネル開口剤レチガビンの存在下または非存在下で培養した細胞で観察される。タリウムおよびカリウムの添加により、BTC蛍光の大きな増加が観察された。蛍光のこの増加はDMP−543の添加により完全に消失した(図3A)。KCNQ2チャネルの小幅な開口に有利なわずかに異なる条件下では、KCNQ2開口剤レチガビンの添加により、レチガビン非存在下で観察されるものと比べ、BTC蛍光のタリウム誘発増加を著しく増加した(図3B)。DMP−543やレチガビンは両者とも、天然のトランスフェクトされていないHEK細胞に負荷されたBTCの蛍光に影響を与えなかった。これらの結果から、電位依存性KCNQ2チャネルの遮断薬および開口剤の両方を同定し、またこれらの調節剤の活性を測定する、タリウム流入技術の能力が明確に示される。
【0127】
実施例V
本発明は、タリウム流入の尺度としてBTC蛍光の変動を用いる、リガンド依存性、非選択的カチオンチャネル、VR1(カプサイシン受容体)(カテリナMJら、Nature 1997, 389, 816−824)の調節剤を検出するタリウム流入技術の能力を例示する。
この実施例のすべての実験条件は以下の例外を除いて、実施例IIと同じであった。
17.非選択的カチオンチャネル バニロイド受容体(VR1)を安定に発現するセルラインCHOを用いた;
18.チャネルアンタゴニスト、カプサゼピン(capsazepine、シグマ・アルドリッチ、RBI、セントルイス、ミズーリ州)を10μMの最終濃度で用いた;および
19.刺激剤緩衝液(2mMアマランスおよび1mMタートラジン含有Cl−−フリーアッセイ緩衝液に溶解した、1mMカプサイシンおよび7.5mM Tl2SO4含有)5μlを加えて、アッセイを開始した。
【0128】
VR1リガンド依存性、非選択的カチオンチャネルの活性化および阻害を測定可能にするタリウム流入アッセイの能力を図4の通り例示した。
【0129】
安定なベースライン蛍光は、タリウムおよびVR1アゴニスト、カプサイシンの添加前に、VR1アンタゴニスト、カプサゼピンの存在下または非存在下で培養した細胞で観察された。タリウムおよびカプサイシンの添加により、BTC蛍光の実質的な増加が観察された。蛍光のこの増加はカプサゼピンの添加により完全に消失した。BTCのカルシウム感受性により、VR1発現CHO細胞のBTC蛍光は、カプサイシン単独では減少は僅かでが、増加は示さなかった。カプサゼピン単独ではVR1発現CHO細胞に負荷したBTC蛍光に影響を与えない。これらのデータより、リガンド依存性、非選択的カチオンチャネルVR1のアゴニストおよびアンタゴニスト両者を同定し、これらの調節剤の活性を測定する、タリウム流入技術の能力が明確に例示される。
【0130】
実施例VI
本発明は、スモールコンダクタンスカルシウム賦活K+チャネル(SK2)の阻害剤検出のための、タリウム流出技術の能力を例示する。
この実施例のすべての実験条件は以下の例外を除いて、実施例IIと同じであった。
細胞を2μM BTC−AMで負荷する代わりに、2μMのFluoZin−1(Molecular Probes、ユージーン、オレゴン州)で負荷した。
FluoZin−1で細胞を負荷後、細胞を7.5mMのTl2SO4含有Cl−−フリーアッセイ緩衝液 10μl/ウェルに、10分間室温下で曝露した。この工程ではタリウムイオン感受性蛍光色素FluoZin−1と相互反応し、その蛍光を増加させるタリウムで細胞を負荷した。
【0131】
タリウムイオンで細胞を負荷後、細胞を洗浄する溶液を吸引除去し、Cl−−フリーアッセイ緩衝液 80μl/ウェルで置換した。80μl/ウェルのCl−−フリーアッセイ緩衝液を直ちに吸引除去し、2mMアマランスおよび1mMタートラジン含有Cl−−フリーアッセイ緩衝液40μl/ウェルで置換した。
【0132】
要すれば、タリウムイオンとFluoZin−1負荷細胞を測定の為にFLIPRに移す前に、アパミン(Cl−−フリーアッセイ緩衝液に溶解した5μM保存溶液を10μl/ウェル)または等量のアパミン非含有のCl−−フリーアッセイ緩衝液を加えた。
【0133】
SK2およびSK2遮断薬アパミンの活性を検出するために、刺激剤緩衝液(Cl−−フリーアッセイ緩衝液に溶解した5μMのイノマイシン含有)13μl/ウェルを加えて、アッセイを開始した。対照として、いくつかのウェルはCl−−フリーアッセイ緩衝液単独で処理し、イノマイシンは加えなかった。
【0134】
SK2の活性およびアパミンによるその阻害を、タリウム流出技術を利用して測定する能力を図5に示す。SK2遮断薬アパミンの存在下または非存在下で、同様のベースライン蛍光が細胞内で観察された。イノマイシンの添加により、FluoZin−1から離れ、活性化SKチャネルの介して細胞を出て行くタリウムイオンにより、蛍光の減少が観察された。蛍光のこの減少はイノマイシンの添加なしでは存在せず、SK2遮断薬アパミンの存在により殆ど消失した。これらのデータより、SK2の活性およびアパミンによるその阻害を検出するためのタリウム流出技術の能力が明快に例示される。
【0135】
実施例VII
本発明は、スモールコンダクタンスカルシウム賦活K+チャネル、SK2の活性化を通じて、Gタンパク質連結型受容体、ムスカリン様アセチルコリン受容体のアゴニストおよびアンタゴニストを検出するタリウム流入技術の能力を例示する。
この実施例のすべての実験条件は以下の例外を除いて、実施例IIと同じであった。
同じSK2発現HEK−293細胞を用いた。HEK−293細胞は本来的にムスカリン様アセチルコリン受容体を発現する。
選択された細胞をSK2遮断薬アパミンでプレインキュベーションする代わりに、いくつかのウェルをアセチルコリン受容体アンタゴニスト、アントロピン10μMでプレインキュベーションした。
ムスカリン性受容体のアゴニストの活性を検出するために、Cl−−フリーアッセイ緩衝液に溶解した、ムスカリン性受容体アゴニスト、オキソトレモリン−M(オキソ−M)を10μM含有のタリウム含有刺激剤緩衝液13μl/ウェルを添加して、アッセイを開始した。対照として、オキソ−Mを添加せず、Cl−−フリーアッセイ緩衝液単独でいくつかのウェルを処理した。
【0136】
タリウム流入技術を利用して、SK2K+チャネルの活性化を介して、ムスカリン様アセチルコリン受容体のアゴニストおよびアンタゴニストを検出する能力は図6に示す。安定なベースライン蛍光は、アセチルコリン受容体アンタゴニスト、アトロピンの存在下または非存在下の細胞で観察された。オキソ−Mの添加により、BTC蛍光の増加が見られた。蛍光のこの増加はオキソ−Mの添加が無ければ存在しなかった。さらに、BTC蛍光のオキソ−M刺激による増加はアトロピンの存在により完全に妨害された。これらのデータにより、SK2K+チャネルの活性化を介して、Gタンパク質連結型ムスカリン様アセチルコリン受容体のアゴニストおよびアンタゴニストを検出する、タリウム流出技術の能力が明快に例示された。
【0137】
実施例VIII
本実施例はハイスループットスクリーニングへのタリウム流入アッセイの適用性を例示する。
イオンチャネルヘの選択性を示す調節剤を素早くスクリーニングし、試験するために、384穴FLIPRを用いた。この装置は同時に光学的に、384穴マイクロテスト・プレートの各ウェルにある細胞の蛍光変化を測定する(図5)。
【0138】
電位依存性K+ チャネルを、実施例IVのKCNQ2で前述したものと同様の条件を用いて、開口剤化合物および遮断薬化合物の両方でスクリーニングした。スクリーニングは、約48,000試料/8時間の速度でスタッカーを備えたモレチュラー・デバイシスFLIPR384を用いて、一人で行った。
【0139】
タリウム流動アッセイで同定される遮断薬および開口剤化合物は、ゼノパス卵母細胞に発現される同じ電位依存性チャネルを用い、2極電位クランプにより検証した(バーナード, E. A.ら、Proc. R, Soc. Lond., 1982, B215, 241−246;クラフテ, D., レスター, H. A., 1989, J. Neurosci. Meth., 26, 211−215)。検証率は開口剤で80%以上、遮断薬で80%以上であった。スクリーニングされた電位依存性K+ チャネルの正真正銘の開口剤および遮断薬の同定における、タリウム流動アッセイの、1人あたりの試験検体の高い比率と忠実さは、カチオンチャネルの活性を調節できる分子を効率的に発見するためのこのアッセイの有用性を明確にする。
【0140】
総合して、本発明方法はリガンドおよび電位依存性チャネル両者、および非選択的カチオンチャネルの調節剤を、ハイスループットスクリーニングに有用なマイクロタイター・プレート・フォーマットで検出できることを、これらの実施例は明瞭に示す。
【図面の簡単な説明】
【図1】実施例IIに記載の、Ca2+賦活スモールコンダクタンスK+チャネル、SK2のためのタリウム流入アッセイを示す。矢印はイオノマイシン(ionomycin)とタリウムイオンを添加した時点を示す。
【図2】図2Aおよび図2Bは、実施例IIIに記載の、C2+賦活ラージコンダクタンスK+チャネル、Maxi−Kのためのタリウム流入アッセイを示す。A):100nM IBTX、またはB):15μM NS―1619。矢印はイオノマイシン、タリウムイオンおよびK+を添加した時点を示す。
【図3】図3Aおよび図3Bは、実施例IVに記載の、電位依存性K+チャネル、KCNQ2のためのタリウム流入アッセイを示す。A):15μM DMP−546またはB):15μM レチガビン(retigabine)。矢印はタリウムイオンまたは(タリウムイオンとK+)を添加した時点を示す。
【図4】実施例Vに記載の、リガンド依存性非選択的カチオンチャネル、VR1(カプサイシン受容体)のためのタリウム流入アッセイを示す。矢印はカプサイシンとタリウムイオンを添加した時点を示す。
【図5】実施例VIに記載の、Ca2+賦活スモールコンダクタンスK+チャネル、SK2のためのタリウム流出アッセイを示す。矢印はイオノマイシンを添加した時点を示す。
【図6】実施例VIIに記載の、Ca2+賦活スモールコンダクタンスK+チャネル、SK2を介するタリウムイオン流入の検出を通じて連結したムスカリン性アセチルコリン受容体アッセイを示す。矢印はムスカリン性アセチルコリン受容体アゴニスト、オキソテレモリン−M(oxoteremorine−M (oxo−M))を添加した時点を示す。
【図7】実施例VIIIIに記載の、標準的タリウム流入アッセイのための典型的実験プロトコールを示す。
Claims (33)
- 以下の工程からなる、細胞内に発現されたイオンチャネル、イオンチャネル連結型受容体またはイオントランスポーターの活性を検出及び測定する方法:
(a)イオンチャネル、イオンチャネルおよびイオンチャネル連結型受容体またはイオントランスポーターを発現する細胞を、信号発生タリウム感受性試薬と接触させ;
(b)該細胞をイオンチャネル、イオンチャネル連結型受容体またはイオントランスポーターの調節剤候補と接触させ;
(c)タリウム塩溶液を含有するアッセイ緩衝液と該細胞を接触させ;および
(d)信号発生タリウム感受性試薬により生じた信号を検出および測定し、イオンチャネル、イオンチャネル連結型受容体またはイオントランスポーターの調節剤候補の、該イオンチャネル、イオンチャネル連結型受容体またはイオントランスポーターの活性に対する効果を決定する。 - 該イオンチャネルがタリウムイオンに透過性であるカチオンチャネルからなる、請求項1記載の方法。
- 該カチオンチャネルが、カリウムイオンチャネル、ナトリウムイオンチャネルおよびカルシウムイオンチャネルからなる群から選択される、請求項2記載の方法。
- 該カチオンチャネルがカリウムイオンチャネルである、請求項2記載の方法。
- 該カリウムイオンチャネルがカルシウム賦活電位依存性チャネルである、請求項4記載の方法。
- 該カリウムイオンチャネルがSKチャネル、Maxi−K、HERGおよびKCNQチャネルからなる群から選択される、請求項4記載の方法。
- 該カチオンチャネルがリガンド依存性VR1チャネルである、請求項2記載の方法。
- 該カチオンチャネルが非選択的イオンチャネルである、請求項2記載の方法。
- 該非選択的イオンチャネルが、アセチルコリン受容体、AMPA、カイニン酸およびNMDA受容体などのグルタミン酸受容体、5−ヒドロキシトリプタミン依存性受容体チャネル、ATP依存性(P2X)受容体チャネル、ニコチン酸アセチルコリン依存性受容体チャネル、バニロイド受容体、リアノジン受容体チャネル、IP3受容体チャネル、細胞内cAMPにより原位置(in situ)活性化されたカチオンチャネル、および細胞内cGMPで原位置(in situ)活性化されたカチオンチャネルからなる群から選択される、請求項8記載の方法。
- 該タリウム塩溶液が水溶性タリウム塩からなる、請求項1記載の方法。
- 該タリウム塩が、Tl2SO4、Tl2CO3、TlCl、TlOH、TlNO3およびTlOAcからなる群から選択される、請求項10記載の方法。
- 該タリウム塩がTl2SO4である、請求項11記載の方法。
- 該アッセイ緩衝液がCl―−フリーである、請求項1記載の方法。
- 該アッセイ緩衝液がグルコン酸ナトリウム、グルコン酸カリウム、グルコン酸カルシウム、グルコン酸マグネシウム、HEPESおよびグルコースをさらに含有する、請求項13記載の方法。
- 該細胞を、Cl−を2mM以下の濃度で含有する低Cl−細胞培養培地で培養することを特徴とする、請求項1記載の方法。
- 低Cl−細胞培養培地がグルコン酸ナトリウム、グルコン酸カリウム、MgSO4・7H2O、NaHC03、グルコン酸カルシウム、NaH2PO4、HEPES、グルコース、100Xビタミン、50Xアミノ酸およびグルタミンを含有する、請求項15記載の方法。
- 該タリウム感受性試薬がタリウム感受性蛍光試薬またはタリウム感受性非蛍光試薬である、請求項1記載の方法。
- 該タリウム感受性蛍光試薬が、ANTS、Fluo−4、Fluo−3、PBFI、フェン・グリーン、マグネシウム・グリーン、APTRA−BTC、Fluo−4FF、FluoZin−1、FluoZin−2、Mag−FuraレッドおよびBTCからなる群から選択される、請求項17記載の方法。
- 該タリウム感受性試薬がタリウム感受性非蛍光試薬である、請求項1記載の方法。
- 該タリウム感受性非蛍光試薬が塩素、臭素およびヨウ素からなる群から選択される、請求項19記載の方法。
- 該イオンチャネル連結型受容体がGPCR、代謝調節型グルタミン酸受容体、ムスカリン様アセチルコリン受容体、ドパミン受容体およびセロトニン受容体からなる群から選択される、請求項1記載の方法。
- 該イオントランスポーターがドパミンイオントランスポーター、グルタミン酸イオントランスポーター、セロトニンイオントランスポーター、ナトリウム−カリウム ATPase、プロトン−カリウム ATPase、ナトリウム/カルシウムイオン交換体、およびカリウム−塩素イオン共トランスポーターからなる群から選択される、請求項1記載の方法。
- 細胞を信号発生タリウム感受性蛍光試薬と接触させる工程後、該細胞をさらに細胞外蛍光消光化合物と接触させることを特徴とする、請求項1記載の方法。
- 該調節化合物候補が、該イオンチャネル、イオンチャネル連結型受容体またはイオントランスポーターを活性化または阻害する、請求項1記載の方法。
- タリウム塩溶液に刺激剤溶液をさらに加えることを特徴とする、請求項1記載の方法。
- 刺激剤溶液がイオノフォア、KCl、ニコチン、アセチルコリン、ムスカリンおよびカルバミルコリンからなる群から選択される、請求項25記載の方法。
- 以下の工程からなる、イオンチャネル、イオンチャネル連結型受容体またはイオントランスポーターの調節剤を同定する方法:
(a)イオンチャネル、イオンチャネルおよびイオンチャネル連結型受容体またはイオントランスポーターを発現する細胞を信号発生タリウム感受性試薬と接触させ;
(b)該細胞を調節剤候補と接触させ;
(c)タリウム塩溶液を含有するアッセイ緩衝液と細胞を接触させ;および
(d)該イオンチャネル、イオンチャネル連結型受容体またはイオントランスポーターの活性に対する調節剤の効果を示す、信号発生タリウム感受性試薬により発生した信号を検出、測定する。 - 工程(b)の後、信号発生タリウム感受性試薬により発生した信号を測定する工程をさらに包含することを特徴とする、請求項27記載の方法。
- 該調節剤が、該イオンチャネル、イオンチャネル連結型受容体またはイオントランスポーターを活性化または阻害する、請求項27記載の方法。
- タリウム感受性アッセイに用いる新規なCl―−フリーアッセイ緩衝液。
- 該アッセイ緩衝液がグルコン酸ナトリウム、グルコン酸カリウム、グルコン酸カルシウム、グルコン酸マグネシウム、HEPESおよび グルコースをさらに含有することを特徴とする、請求項29の組成物。
- Cl−イオン濃度が2mM以下である、低Cl−細胞培養培地。
- 低Cl−細胞培養培地がグルコン酸ナトリウム、グルコン酸カリウム、MgSO4・7H2O、NaHCO3、グルコン酸カルシウム、NaH2PO4、HEPES、グルコース、100Xビタミン、50Xアミノ酸およびグルタミンを含有する、請求項31記載の組成物。
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