CN115927526B - 一种hERG通道的高通量检测方法及其应用 - Google Patents
一种hERG通道的高通量检测方法及其应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明涉及细胞生物学技术领域，尤其是涉及一种hERG通道的高通量检测方法及其应用，该方法包括以下步骤：S1、将稳定表达hERG通道的细胞铺在孔板中培养；S2、向孔板中加入染料，避光孵育；S3、用刺激剂配置待检测的化合物，所述的刺激剂包含：钾离子、钠离子和钙离子；S4、向孔板中加入配置好的化合物，孵育；S5、化合物孵育完成后，利用FLIPR检测化合物的抑制效果。本发明的方法能够高通量的检测化合物对hERG通道的抑制效果。
Description
技术领域
本发明涉及细胞生物学技术领域，尤其是涉及一种hERG通道的高通量检测方法及其应用。
背景技术
目前hERG通道的检测主要有以下三种方法：
一、传统的电生理学方法：这一方法是检测包括hERG在内的离子通道的金标准。但是，由于电生理学本身技术难度较大，实践中对操作人员的技术能力要求较高，通常需要培训一年以上，才可以熟练进行，导致了此类检测手段无法实现高通量。
二、基于荧光的hERG检测技术：该方法是基于直接的高盐去极化刺激，无法做到对于通道状态依赖的检测，所以得到的待检测的化合物对于hERG作用敏感度、准确度很差，计算出的IC50数据往往会比电生理学的方法偏大10-20倍。
三、荧光偏振以及同位素结合的方法：该方法只是关注待检测的化合物和通道结合，而无法考察对通道功能的影响。
发明内容
本发明的目的在于提供一种hERG通道的高通量检测方法及其应用，该方法能够高通量的检测化合物对hERG通道的抑制效果。
本发明的第一方面，提供一种hERG通道的高通量检测方法，包括以下步骤：
S1、将稳定表达hERG通道的细胞铺在孔板中培养；
S2、向孔板中加入染料，避光孵育；
S3、用刺激剂配置待检测的化合物，所述的刺激剂包含：钾离子、钠离子和钙离子；
S4、向孔板中加入配置好的化合物，孵育；
S5、化合物孵育完成后，利用FLIPR检测化合物的抑制效果。
优选的，步骤S1包括：将稳定表达hERG通道的HEK293细胞铺在孔板中，在37°C细胞培养箱中培养24小时。
优选的，步骤S2包括：向孔板中加入Ti离子敏感的染料，37°C避光孵育1小时。
优选的，步骤S3中所述的刺激剂包含：20-40mM钾离子、70-90mM钠离子和1-2mM钙离子。
优选的，步骤S3中所述的刺激剂包含：40mM钾离子、80mM钠离子和1.8mM钙离子。
优选的，步骤S4包括：向孔板中加入配置好的化合物，35°C孵育30分钟以内。
优选的，步骤S5中FLIPR检测使用K2SO4和Ti离子开放通道。
优选的，步骤S5中FLIPR检测开放通道使用20mM K2SO4。
优选的，步骤S5中FLIPR检测开放通道使用2mM Ti离子。
本发明的第二方面，提供了上述的hERG通道的高通量检测方法在hERG通道检测试剂盒中的应用。
有益效果：
1、本发明的方法相比于传统的电生理学检测：技术难度显著降低，大大提高了实验效率；
2、本发明的方法相比于基于荧光的hERG检测技术：实验结果更加准确，更加敏感，可以获得更加符合生理条件下的结果；
3、本发明的方法相比于荧光偏振以及同位素结合的方法：可以直接考察通道功能而不是通过结合来间接的判断，且不需要同位素。
附图说明
为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为本发明中不同浓度的钾离子和K2SO4作用下实验信号窗口以及实验敏感性结果图，其中，IC50为西沙比利的半抑制浓度；
图2为本发明中不同浓度钾离子和K2SO4作用下实验信号窗口结果图；
图3为本发明中不同浓度钾离子和K2SO4作用下西沙比利的半抑制浓度结果图；
图4为本发明中多非利特对hERG通道抑制作用的效应剂量曲线图；
图5为本发明中E4031对hERG通道抑制作用的效应剂量曲线图；
图6为本发明中匹莫齐特对hERG通道抑制作用的效应剂量曲线图；
图7为本发明中维拉帕米对hERG通道抑制作用的效应剂量曲线图；
图8为本发明中四种化合物的IC50值与文献报道的IC50值结果对比图，其中Z’factor = 0.71（介于0.5 - 1.0之间）代表较好的实验。
具体实施方式
应该指出，以下详细说明都是例示性的，旨在对本申请提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本申请所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。需要注意的是，这里所使用的术语仅是为了描述具体实施方式，而非意图限制根据本申请的示例性实施方式。如在这里所使用的，除非上下文另外明确指出，否则单数形式也包括复数形式，此外，还应当理解的是，当在本说明书中使用术语“包含”和/或“包括”时，其指明存在特征、步骤、操作、器件、组件和/或它们的组合。
下面将结合实施例对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例一
本实施例提供一种细胞准备的方法，包括以下步骤：
（1）hERG钾通道稳定表达的HEK293细胞系在含有10 % 胎牛血清及0.8 mg/mLG418的DMEM培养基中培养，培养温度为37°C，二氧化碳浓度为5 %。
（2）细胞传代：除去旧培养基并用PBS洗一次，然后加入1 mL0.25 % TrypLE™Express溶液，37 °C孵育0.5 min。当细胞从皿底脱离，加入5 mL 37 °C预热的完全培养基。将细胞悬液用吸管轻轻吹打使聚集的细胞分离。将细胞悬液转移至无菌的离心管中，1000rpm离心5 min收集细胞。扩增或维持培养，将细胞接种于6 cm细胞培养皿，每个细胞培养皿接种细胞量为2.5*105 cells（最终体积：5 mL）。
（3）为维持细胞的生理活性，细胞密度在80%~90%之间。
（4）试验之前细胞用TrypLE™ Express分离，将5*10^3 细胞铺在384黑色底透孔板中培养（最终体积：25 µL/孔），隔夜培养后，进行试验检测。
实施例二
本实施例提供一种hERG通道的高通量检测方法，包括以下步骤：
（1）在实施例一准备的细胞中加入Ti离子敏感的染料，将细胞孔板放入37°C细胞培养箱中避光孵育1h。
（2）在染料孵育过程中配制10×待检测的化合物中间液，其中化合物利用刺激剂（含有一定浓度的钾离子、钠离子和钙离子）配置待检测的化合物，在35°C下，孵育30分钟以内，温度和孵育时间需要严格控制。
刺激剂中的钾离子浓度选择：通过实验验证了不同的钾离子浓度：5.33mM，20mM，40mM以及60mM，实验结果显示（见图1-3）：综合考虑信号窗口以及实验敏感性，优选钾离子浓度为20-40mM，更优选钾离子浓度为40mM。
刺激剂中的钠离子浓度选择：通过实验验证，钠离子浓度优选为70-90mM，更优选为80mM，在此浓度下，和钾离子浓度相互配合，能够更好的维持细胞的正常状态。
刺激剂中的钙离子浓度选择：根据多次实验结果表明，优选钙离子浓度为1-2mM，更优选钙离子浓度为1.37mM，最优选钙离子浓度为1.8mM，在此浓度下更好的稳定了细胞的状态。
综合上述实验结果，刺激剂优选含有40mM钾离子，80mM钠离子以及1.8mM钙离子。
（3）化合物孵育完成后，将细胞板转移至FLIPR检测，使用10-30mM （优选20mM）K2SO4 和2mM Ti离子开放通道，检测多非利特、E4031、匹莫齐特、维拉帕米四种化合物的抑制效果，实验结果表明（见图4-8）：使用本方法测定的多非利特、E4031、匹莫齐特、维拉帕米四种化合物的半抑制浓度与文献报道的半抑制浓度基本一致，表明本方法能够高通量的检测hERG通道。
综上，本实施例的hERG通道的高通量检测方法技术难度显著降低，大大提高了实验效率；实验结果更加准确，更加敏感，可以获得更加符合生理条件下的结果；可以直接考察通道功能而不是通过结合来间接的判断，且不需要同位素。
实施例三
本实施例提供了上述实施例二的hERG通道的高通量检测方法在hERG通道检测试剂盒中的应用。
最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。
Claims (2)
1.一种hERG通道的高通量检测方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1、将稳定表达hERG通道的细胞铺在孔板中培养；
S2、向孔板中加入Ti离子敏感的染料，37°C避光孵育1小时；
S3、用刺激剂配置待检测的化合物，所述的刺激剂包含：40mM钾离子、80mM钠离子和1.8mM钙离子；
S4、向孔板中加入配置好的化合物，35°C孵育30分钟以内；
S5、化合物孵育完成后，利用FLIPR检测多非利特、E4031、匹莫齐特、维拉帕米四种化合物的抑制效果，FLIPR检测使用K2SO4和Ti离子开放通道，FLIPR检测开放通道使用20mMK2SO4，FLIPR检测开放通道使用2mM Ti离子。
2.根据权利要求1所述的hERG通道的高通量检测方法，其特征在于，步骤S1包括：将稳定表达hERG通道的HEK293细胞铺在孔板中，在37°C细胞培养箱中培养24小时。
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