JP2011529564A - ナトリウム/カルシウム交換体(ncx)「リバースモード」調節化合物を検出するための蛍光ベースのアッセイ - Google Patents
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Abstract
Description
a)ナトリウム/カルシウム交換体を発現する細胞を備え;
b)細胞内カルシウムを測定するための着色物質を備え;
c)細胞をナトリウム/カルシウム交換体活性化剤と接触させ;そして
d)該着色物質からの発光シグナルのカルシウム媒介変化を、対照実験において生じた発光シグナルと比較する。
a)ナトリウム/カルシウム交換体を発現する細胞を備え;
b)細胞内カルシウムを測定するための着色物質を備え;
c)細胞を化合物と接触させ、ここで、該細胞は、該化合物で処理する前に、ナトリウム/カルシウム交換体活性化剤で処理される;そして
d)該着色物質からの発光シグナルのカルシウム媒介変化を、対照実験において生じた発光シグナルと比較する。
a)ナトリウム/カルシウム交換体をエクスプライムする(expriming)凍結乾燥細胞;
b)着色物質;
c)化合物緩衝液;及び
d)着色物質緩衝液、
を含むパーツのキットに関する。
用語「アッセイ」は、系又は物の特性を測定する手順を指す。アッセイは、生物学的アッセイについて一般的に使用される省略用語であり、インビトロ実験の一種である。アッセイは、典型的に、生きている生物に対する物質の効果を測定するために行われる。アッセイは定性的又は定量的であり得、それらは新薬の開発に必須である。
特に好ましいのは、アミノ酸配列が、それぞれ、配列番号1、配列番号2及び配列番号3に対応する、SLC8ファミリーメンバーNCX1、NCX2及び/又はNCX3である。
Technique 46:390-397;Brini et al., 1995, J. Biol. Chem. 270:9896-9903;Knight & Knight, 1995, Meth. Cell. Biol. 49:201-216を参照のこと。アポエクオリンを発現する哺乳類細胞へセレンテラジン補因子を添加することによって哺乳類細胞における細胞内カルシウムを測定する方法を記載する米国特許第5,714,666号もまた興味深い場合がある。
1.材料及び方法
1.1.化学物質及び装置
ヒトNCX1、NCX2及びNCX3をそれぞれ安定発現する組換えCHO-K1細胞株は、Steinbeis-Transferzentrum fur Angewandte Biologische Chemie, Mannheimによって配送された。細胞を、標準条件(37℃、5%CO2が補われた空気)下で連続培養に維持した。CHO-K1 NCX1、CHO-K1 NCX2及びCHO-K1 NCX3細胞を、10%ウシ胎仔血清(FCS)及び450μg/ml G418を補充した、グルタミンを加えたHAM'S-F12培地中に維持した。細胞を、トリプシン溶液を使用しての分離後3〜4日毎に継代し、150.000細胞/mlの濃度で再び播種した。
電気生理学的なキャラクタリゼーションを、Iongate Biosciences GmbH, Frankfurtにて行った。
氷冷したPBS(リン酸緩衝化生理食塩水)又はトリプシンを電気生理学実験の少なくとも18時間前に適用することによって、培養細胞を分離し、カバースリップ上に再び平板培養した。以下の組成を有する、2つの浴溶液及びピペット溶液を、パッチクランプ実験のために調製した:
浴(外部)溶液「低カルシウム」:
135mM NMG、5mM MgCl2、2mM CaCl2、4mM EGTA、30mM HEPES, pH 7.4
(HCl→pH 7.0、次いでCsOH→pH 7.4)
浴(外部)溶液「高カルシウム」:
139mM NMG、5mM MgCl2、2mM CaCl2、30mM HEPES, pH 7.4
(HCl→pH 7.0、次いでCsOH→pH 7.4)
ピペット(内部)溶液:
100mM NaCl、5mM KCl、2mM CaCl2、2mM MgCl2、2.1mM EGTA、35mM TEA-Cl、4mM Mg-ATP、0.5mM Na-GTP、5.63mMホスホクレアチン、30mM HEPES、3.5 U/ml クレアチンホスホキナーゼ(70ml ピペット溶液+3500 U 濾過クレアチンホスホキナーゼ, ad 100mlピペット溶液), pH 7.4 (NaOH)
1.5.1.細胞プレートの調製
実験の1日前に、細胞をトリプシンで分離し、96ウェルマイクロプレート中35,000細胞/100μl培地/ウェルの密度で平板培養し、37℃、5%CO2及び90%湿度で約22時間インキュベートした。
最終濃度の1.5×の濃度で、化合物をアッセイ緩衝液中調製した。化合物溶液をプレインキュベートし、16℃で保存した。IC50測定のために、45μMの出発濃度(最終:30μM)での希釈系列を、Biomek2000で調製した。
1mMグラミシジンストック溶液を、溶媒として冷エタノール(4℃)を使用して毎日調製した。ストック溶液から出発し、アッセイ緩衝液を使用して、60μMグラミシジンアッセイ溶液を調製した。96ウェルポリプロピレンプレートに、150μl/ウェルのグラミシジンアッセイ溶液を充填し、4℃で保存した。添加プレートは、再充填が必要とされる前に2回使用できただけであり、何故ならば、グラミシジン溶液はRTで活性を非常に速く失うためである。
1.培地を細胞プレートから除去した
2.100μl/ウェルの色素ローディング緩衝液を添加した
3.細胞をRTで90分間インキュベートした
4.100μlアッセイ緩衝液/ウェルで3回洗浄し、緩衝液を後で完全に捨てた
5.Biomek FXを使用して、80μlのテスト化合物を種々の濃度(1.5×濃縮)で添加した
6.CO2インキュベーター中16℃及び5%CO2で45分間、細胞をインキュベートした
7.細胞プレートをFLIPRに移し、測定の間、40μlのグラミシジンアッセイ溶液(最終濃度:20μMグラミシジン)を添加することによって記録した。
10μMのNCX阻害剤A000135933を高コントロールとして、緩衝液を低コントロールとして使用した。
以下の計算は、FLIPRソフトウエアの統計エクスポート関数を使用して得られたデータに基づいた:統計1=マックス-ミニ(サンプル1−240)。必要に応じて、計算はエッジ効果について修正した。初期結果としてのNCXの阻害は、グラミシジン添加後の蛍光増加の阻害を指し、統計値1から誘導した。高コントロールは、10μM A000135933でのNCX活性の阻害を指し、低コントロールは、緩衝液のみの添加後にNCX阻害が無いことを指す。
従って、%阻害を、コントロールを参照して計算した(0%阻害=低コントロール、100%阻害=高コントロール)。結果は、以下の式を用いて、補正済みの生データ及びプレート内コントロールから計算した:
2.1.電気生理学的な細胞株キャラクタリゼーション
2.1.1.親細胞株
電気生理学データをIongate GmbHから得た。CHO-K1細胞を使用し、安定なCHO-NCX1、CHO-NCX2及びCHO-NCX3細胞株を樹立した。高細胞内Na+濃度下で細胞外Ca2+を適用した場合、親細胞は有意な電流応答(0.12±0.07 pA/pF、図2)を示さなかった。記載した条件下で、ニッケルの使用によって、人工産物(artifact)は生じなかった。典型的な電流を図3に示す。
CHO-NCX1細胞は、4秒後、非活性化がほとんど伴うことなく、Ca2+適用後に外向きの定常電流を示した。相対的なピーク電流は1.40±0.18 pA/pFであった(n=3、図4a)。電流は、5mMニッケルの適用によって、完全にかつ可逆的に遮断できた(91.3±3.3%)。
2.2.1.NCX1アッセイ
「リバース」モードを分析するHTSベースのNCX1アッセイは、文献において公知ではなかった。グラミシジンの適用は、組み合わせたパッチクランプ及び蛍光測定から公知である。全てのパラメータを最適化しなければならなかった。同時に実行しての、「フォワード」及び「リバース」モードアッセイの間の柔軟性のために、緩衝液条件(例えば、Ca2+濃度、pH)及び1ウェル当たりの細胞数が、「フォワード」モードアッセイから適合され、非常に良好な結果を示した。
20μMのグラミシジン濃度が、S/B及びz’因子に関してのCa2+取り入れ活性について最良の結果を示した。より低い濃度は、遅い動態に起因して十分でなく、より高い濃度は、細胞の副作用を引き起こした(図6a、b)。ツール化合物A000135933のIC50(さらにまた図11a、b)は、種々のグラミシジン濃度によって影響されなかった(図7a)。グラミシジンをエチルアルコールに溶解し、溶媒の影響をキャラクタライズしなければならなかった。2%までのエチルアルコールは、アッセイのバックグラウンド蛍光に対して影響を示さず、一方、濃度を増加させることによって、蛍光が僅かに増加した(図7b)。
「フォワード」又は「リバース」モードを分析するNCX2アッセイは、文献において公知ではなかった。「フォワードモード」アッセイの確立は、アッセイのロバスト性及び感度の制限に起因して成功しなかった。明確性のために、この報告ではデータは示していない。「リバースモード」アッセイは、グラミシジンの適用に基づいた。グラミシジンは、アルカリ透過性孔を形成する。グラミシジン誘導Ca2+流入は、間接的であり、NCX依存性である。グラミシジン添加後のNCX1の活性化は、一次ニューロンに対する放射性イオン流束又は蛍光測定から公知である(Kiedrowski et al., Journal of Neurochemistryl, 2004)。同時に実行しての、種々のサブタイプのNCXアッセイ間の比較性のために、緩衝液条件(例えば、Ca2+濃度、pH)、細胞数、インキュベーション時間、及びグラミシジン濃度を、「リバース」モードNCX1アッセイからNCX2アッセイについて適合させた。
NCX3アッセイは、文献において公知ではなかった。「フォワードモード」アッセイの確立は、アッセイのロバスト性及び感度の制限に起因して成功しなかった。明確性のために、この報告ではデータを示していない。「リバースモード」アッセイは、グラミシジンの適用に基づいた。グラミシジンは、アルカリ透過性孔を形成する。グラミシジン誘導Ca2+流入は、間接的であり、NCX依存性である。グラミシジン添加後のNCX1の活性化は、一次ニューロンに対する放射性イオン流束又は蛍光測定から公知である(Kiedrowski et al., Journal of Neurochemistry, 2004)。同時に実行しての、種々のサブタイプのNCXアッセイ間の比較性のために、緩衝液条件(例えば、Ca2+濃度、pH)、細胞数、インキュベーション時間、及びグラミシジン濃度を、「リバース」モードNCX1アッセイからNCX3アッセイについて適合させた。
NCX3活性に対する、20μMグラミシジンでの活性化後のA000135933の効果を調べ(図21a)、計算された用量反応関係を図19bに示す。
Claims (28)
- ナトリウム/カルシウム交換体のカルシウム取り入れ活性を測定するためのアッセイであって、以下:
a)ナトリウム/カルシウム交換体を発現する細胞を備える工程;
b)細胞内カルシウムを測定するための着色物質を備える工程;
c)細胞をナトリウム/カルシウム交換体活性化剤と接触させる工程;及び
d)上記着色物質からの発光シグナルのカルシウム媒介変化を、対照実験において生じた発光シグナルと比較する工程、
を含む、上記アッセイ。 - ナトリウム/カルシウム交換体が、以下のリスト:NCX1、NCX2、NCX3のNCXタンパク質;又は以下のリスト:NCKX1、NCKX2、NCKX3、NCKX4、NCKX5のNCKXタンパク質である、請求項1に記載のアッセイ。
- ナトリウム/カルシウム交換体が、以下のリスト:NCX1、NCX2、NCX3のNCXタンパク質である、請求項1に記載のアッセイ。
- ナトリウム/カルシウム交換体が、哺乳類起源のものであり、好ましくは、ラット、マウス、イヌ、ウシ、ブタ、サル又はヒトに由来する、請求項1〜3のいずれか1項に記載のアッセイ。
- 細胞が、CHO、HEK、COS7及びJURKAT細胞からなる群より選択される、請求項1〜4のいずれか1項に記載のアッセイ。
- 着色物質が、細胞に入ることができそして色素に加水分解され得る色素前駆体として、細胞に添加され、それによって、色素が、該細胞中においてカルシウムと複合体化し、発光シグナルを与える、請求項1〜5のいずれか1項に記載のアッセイ。
- 発光シグナルが蛍光であり、工程c)をモニターすることがFLIPR装置を使用する、請求項1〜6のいずれか1項に記載のアッセイ。
- 色素前駆体が、アセトキシメチルエステル誘導体である、請求項6に記載のアッセイ。
- 色素が、カルシウム感受性蛍光色素fluo-4である、請求項6に記載のアッセイ。
- ナトリウム/カルシウム交換体のカルシウム取り入れ活性のアゴニスト又はアンタゴニストとしての活性について化合物をテストするための請求項1〜9のいずれか1項に記載のアッセイの使用。
- ナトリウム/カルシウム交換体の変化した発現に関連する疾患の診断のための請求項1〜9のいずれか1項に記載のアッセイの使用。
- 化合物の添加に応答してのナトリウム/カルシウム交換体のカルシウム取り入れ活性を測定するためのアッセイであって、以下:
a)ナトリウム/カルシウム交換体を発現する細胞を備える工程;
b)細胞内カルシウムを測定するための着色物質を備える工程;
c)細胞を化合物と接触させる工程、ここで、該細胞は、該化合物で処理する前に、ナトリウム/カルシウム交換体活性化剤で処理される;及び
d)上記着色物質からの発光シグナルのカルシウム媒介変化を、対照実験において生じた発光シグナルと比較する工程、
を含む、上記アッセイ。 - ナトリウム/カルシウム交換体が、以下のリスト:NCX1、NCX2、NCX3のNCXタンパク質;又は以下のリスト:NCKX1、NCKX2、NCKX3、NCKX4、NCKX5のNCKXタンパク質である、請求項12に記載のアッセイ。
- ナトリウム/カルシウム交換体が、以下のリスト:NCX1、NCX2、NCX3のNCXタンパク質である、請求項12に記載のアッセイ。
- ナトリウム/カルシウム交換体が、哺乳類起源のものであり、好ましくは、ラット、マウス、イヌ、ウシ、ブタ、サル又はヒトに由来する、請求項12〜14のいずれか1項に記載のアッセイ。
- 細胞が、CHO、HEK、COS7及びJURKAT細胞からなる群より選択される、請求項12〜15のいずれか1項に記載のアッセイ。
- 着色物質が、細胞に入り、色素に加水分解され得る色素前駆体として、細胞に添加され、それによって、色素が、該細胞中においてカルシウムと複合体化し、発光シグナルを与える、請求項12〜16のいずれか1項に記載のアッセイ。
- 発光シグナルが蛍光であり、工程c)をモニターすることがFLIPR装置を使用する、請求項12〜17のいずれか1項に記載のアッセイ。
- 色素前駆体が、アセトキシメチルエステル誘導体である、請求項17に記載のアッセイ。
- 色素が、カルシウム感受性蛍光色素fluo-4である、請求項17に記載のアッセイ。
- 化合物が、ナトリウム/カルシウム交換体アンタゴニストである、請求項12〜20のいずれか1項に記載のアッセイ。
- a)ナトリウム/カルシウム交換体をエクスプライムする凍結乾燥細胞;
b)着色物質;
c)化合物緩衝液;及び
d)着色物質緩衝液、
を含むパーツのキット。 - 着色物質が、カルシウム感受性蛍光色素fluo-4である、請求項22に記載のパーツのキット。
- ナトリウム/カルシウム交換体が、以下のリスト:NCX1、NCX2、NCX3のNCXタンパク質;又は以下のリスト:NCKX1、NCKX2、NCKX3、NCKX4、NCKX5のNCKXタンパク質である、請求項22又は23に記載のパーツのキット。
- ナトリウム/カルシウム交換体が、以下のリスト:NCX1、NCX2、NCX3のNCXタンパク質である、請求項22又は23に記載のパーツのキット。
- ナトリウム/カルシウム交換体が、哺乳類起源のものであり、好ましくは、ラット、マウス、イヌ、ウシ、ブタ、サル又はヒトに由来する、請求項22〜25のいずれか1項に記載のパーツのキット。
- ナトリウム/カルシウム交換体のカルシウム取り入れ活性のアゴニスト又はアンタゴニストとしての活性について化合物をテストするための請求項22〜26のいずれか1項に記載のパーツのキットの使用。
- ナトリウム/カルシウム交換体変化発現に関連する疾患の診断のための請求項22〜26のいずれか1項に記載のパーツのキットの使用。
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