JP2003533973A

JP2003533973A - トランスジェニック動物の作製方法

Info

Publication number: JP2003533973A
Application number: JP2001544490A
Authority: JP
Inventors: ジェラルドスチャッテン; アンソニーダブリュー．エス．チャン
Original assignee: オレゴンヘルスアンドサイエンスユニバーシティ
Priority date: 1999-12-17
Filing date: 2000-12-15
Publication date: 2003-11-18
Also published as: US20010044937A1; WO2001043540A3; WO2001043540A2; CA2394600A1; AU2103601A; US20030221206A1; EP1241935A2

Abstract

(57)【要約】本発明はトランスジェニック動物の作製方法に関する。具体的には、本発明の方法は、トランスジェニック細胞内精子注入、レトロウイルス遺伝子移入、細胞内核注入および前核注入によるトランスジェニック動物の作製を含む。加えて、本発明は、トランスジェニック動物をヒトの疾患および診断のモデルとして使用する方法にも関する。特にこれらのトランスジェニック動物は、胚および胎児の発生のモデルとして、薬剤治療および遺伝子治療の安全性および有効性を評価するモデルとして、ならびに疾患診断のモデルとして使用することができる。本発明の方法は、ヒト疾患を治療するためにトランスジェニック胚細胞を使用する方法にも関する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】発明の分野本発明は、トランスジェニック動物の作製方法およびヒトの疾患ならびに診断
用のモデルとしてトランスジェニック動物を使用する方法に関する。

【０００２】発明の背景トランスジェニック技術の開発において、多数のトランスジェニック動物が作
製されてきた（Palmiterら、300 NATURE 611〜15、1982；Ebertら、2 MOL.ENDOC
RIN 277〜83、1988；Sutraveら、4 GENE DEV.1462〜72、1990；Purselら、45 TH
ERIOGENOLOGY 348、1996）。たとえば、トランスジェニック動物は、医薬品製造
用のバイオリアクターの役割を果たすために開発されている（Clarkら、7 BIOTE
CH 487〜92、1989；Wilmutら、41 J.REPROD.FERT.135〜46、1990；Krimpenfort
ら、9 BIOTECH.844〜47、1991；Schniekeら、278 SCIENCE 2130〜33、1997）。
この技術は主に、トランスジェニックマウスの作製に焦点を当ててきた（たとえ
ば米国特許第6,137,029号；6,156,727号；6,127,598号；6,111,166号；6,107,54
1号および6,077,990号を参照）。

【０００３】トランスジェニック動物は、代謝工程の新たな分子地図中に発生するヒトの疾
患のためのモデルとなっている（NishimoriおよびMatzuk、1 REV.REPROD 203〜1
2、1996）。これらの調査の多くがトランスジェニックマウスを使用して行われ
ているのに対して、生物医学的、薬学的（すなわち「ファーミング」）および農
学的含意を示す、他のトランスジェニック動物に対する研究が今、行われつつあ
る（たとえば米国特許第6,147,202号を参照）。各種の疾患用のげっ歯類モデル
を作製するための、強力な技術が現在利用可能であるにもかかわらず、これらの
モデルは、ヒトの障害の研究には必ずしも適していない。トランスジェネシスの
アプローチを非ヒト霊長類にまで広げることは、このモデルの有用性をさらに向
上させることになる。ヒト疾患用の臨床関連モデルとしてのトランスジェニック
非ヒト霊長類の作製は、生医学的研究にはきわめて重要である。加えて、安全で
有効な遺伝子治療プロトコールの保証は、ノックアウトマウスと重症患者との間
のギャップを埋める適切な調査システムが発見されるまで、十分に実現すること
はできない。その上、非ヒト霊長類とヒトとの類似性によって、新しい遺伝子治
療のアプローチの安全性および有効性の試験を行うモデルを考案する場合の、ト
ランスジェニック方法の有用性が向上する。結果として、遺伝子修飾された非ヒ
ト霊長類を作製する信頼性のある有効な方法の必要性がある。

【０００４】トランスジェニック非ヒト霊長類の作製は、困難な作業であることが証明され
ている。このことは一部は、卵母細胞ドナーとして利用可能なサルの数が限定さ
れていること；適切に計画された代理が少ないこと；考えられる移入用のトラン
スジェニック胚を選択するための、胚盤胞段階まで成長している胚の数が限定さ
れていること；4〜8細胞期（すなわち、母系から胚遷移の直前または遷移時）を
超えた胚の手術によらない移入を成功させる適切な手順がないこと；および各実
験の費用が高いことによる。さらに、トランスジェニック非ヒト霊長類を作製す
る場合の主な障害は、従来の遺伝子移入プロトコールの有効性が低いことであっ
た。

【０００５】本発明はトランスジェニック動物作製の改良された方法を提供する。本発明は
特に、トランスジェニック非ヒト霊長類の作製方法に関する。これらの方法は、
たとえば老化、AIDS、癌、アルツハイマー病、自己免疫疾患、代謝障害および肥
満などの生物医学研究の全領域にわたる研究にとって貴重な、遺伝子修飾された
非ヒト霊長類を作製する方法を提供できる。トランスジェネシスの別の用途には
、遺伝性疾患の分子ベースの調査用モデルの作製、臨床試験前の遺伝子、幹細胞
および体細胞治療の安全性および有効性の証明、絶滅危惧種の保存、そして場合
によっては、配偶子仲介遺伝子治療への新たなアプローチさえ含まれる。

【０００６】発明の概要本発明は、細胞内精子注入（ICSI）により、精子からの外因性DNAを卵母細胞
に移入することによってトランスジェニック動物を作製する方法に関する。好ま
しい態様において、卵母細胞は胚段階まで培養され、次に胚は代理雌に移植され
、次いで分娩によってトランスジェニック動物が作製される。本発明の別の態様
において、卵母細胞は3〜16細胞胚段階まで培養される。本発明のさらなる態様
において、外因性DNAは、外因性DNAと精子を混合し、DNA精子混合物を37℃にて3
0分間インキュベートし；DNA結合精子をTALP-HEPES緩衝液中で洗浄することによ
って、精子に結合される。

【０００７】本発明の方法の別の態様において、トランスジェニック動物は哺乳類、鳥類、
爬虫類、両生類または魚類でもよい。本方法の別の態様において、トランスジェ
ニック動物は非ヒト霊長類である。本発明のさらに好ましい態様において、トラ
ンスジェニック非ヒト霊長類はアカゲザル（rhesus macaque）、ヒヒ（baboon）
、ノドシロオマキザル（capuchin）、チンパンジー（chimpanzee）、ピグテール
マカク（pigtail macaque）、スーティーマンガベー（sooty mangabey）、リス
ザル（squirrel monkey）、オランウータン（oranutan）または他の非ヒト霊長
類である。

【０００８】本発明の別の態様において、外因性DNAは、調節核酸配列および1つ以上の構造
遺伝子配列を含む発現ベクターである。本発明の発現ベクターはさらに、プラス
ミドベクター、ウイルスベクターおよびレトロウイルスベクターを含むことがで
きる。加えて、外因性DNAは1つ以上の発現ベクターを含むことができる。

【０００９】本発明のさらなる態様において、発現ベクターの調節核酸配列はプロモーター
である。本発明の1つの態様において、プロモーターはウイルスプロモーター、
構成性プロモーターまたは誘導性プロモーターである。さらに詳細には、本発明
のプロモーターはサイトメガロウイルスプロモーターである。本発明のさらなる
態様において、プロモーターはプロタミン1プロモーターである。

【００１０】本発明は、受容体、酵素、サイトカイン、ホルモン、成長因子、免疫グロブリ
ン、細胞周期タンパク質、細胞伝達タンパク質、膜タンパク質および細胞骨格タ
ンパク質からなる群より選択されるポリペプチドをコードする構造遺伝子にも関
する。

【００１１】本発明の別の態様において、構造遺伝子配列はレポーター遺伝子である。詳細
には、レポーター遺伝子は緑色蛍光タンパク質であるか、レポーター遺伝子はβ
-ガラクトシダーゼ遺伝子、分泌胎盤アルカリホスファターゼ遺伝子およびルシ
フェラーゼ遺伝子からなる群より選択される。

【００１２】代替の態様において、構造遺伝子配列は疾患遺伝子である。さらに詳細には疾
患遺伝子は、心臓疾患、神経疾患、生殖障害、癌、眼疾患、内分泌系障害、肺疾
患、代謝障害、遺伝性疾患、自己免疫障害および老化からなる群より選択される
疾患と関連している。

【００１３】本発明の好ましい態様において、外因性DNAは蛍光団によって標識される。別
の態様において、蛍光団はローダミンである。

【００１４】ヒト疾患のモデルとしてトランスジェニック動物を作製するための方法も、本
発明の範囲内である。詳細には、ヒト疾患のモデルは心臓疾患、神経疾患、生殖
障害、癌、眼疾患、内分泌系障害、肺疾患、代謝障害、自己免疫障害および老化
からなる群より選択される。別の態様において本発明の方法は、遺伝性疾患の、
胚および胎児発生の、疾患診断のモデルであるトランスジェニック動物を作製す
るために使用される。本発明のまた別の態様において、トランスジェニック動物
は、薬剤治療、遺伝子治療、幹細胞治療および体細胞治療からなる群より選択さ
れる治療の安全性および有効性を証明するモデルである。

【００１５】別の態様において、本発明の方法は絶滅危惧種の保存に使用される。別の態様
において、方法は精子を介した遺伝子治療に使用される。

【００１６】本発明は、本明細書に述べる方法によって作製されたトランスジェニック胚に
も関する。好ましい態様において、トランスジェニック胚は胚および胎児発生の
モデルである。本発明の別の態様において、トランスジェニック胚はトランスジ
ェニックキメラ胚である。

【００１７】本明細書に記載される方法によって作製されたトランスジェニック動物も、本
発明の範囲内である。好ましい態様において、トランスジェニック動物は、ヒト
疾患、遺伝性疾患および疾患診断のモデルである。別の態様において、トランス
ジェニック動物は、薬剤治療、遺伝子治療、幹細胞治療および体細胞治療からな
る群より選択される治療の安全性および有効性を証明するモデルである。

【００１８】本発明は、化学的除染および物理的除去による精子の浄化方法にも関する。詳
細には、プロテイナーゼ、DNA分解酵素、およびRNA分解酵素を用いて精子を化学
的に除染し、ポリスチレンおよび磁気ビーズを用いてあらゆる除染剤を物理的に
除去できる。

【００１９】本発明は、レトロウイルスベクターの注入によって外因性DNAを卵母細胞に移
入して、トランスジェニック動物を作製する方法にも関する。好ましい態様にお
いて、卵母細胞は次に細胞内精子注入によって受精し、胚段階まで培養され、代
理雌に移植され、分娩によりトランスジェニック動物が作製される。レトロウイ
ルスベクターは好ましくは、卵母細胞の卵黄周囲腔に注入される。本発明の別の
態様において、卵母細胞は未成熟卵母細胞または受精前卵母細胞である。さらな
る態様において、卵母細胞は4〜8細胞胚期まで培養される。

【００２０】別の態様において、トランスジェニック動物は好ましくは、非ヒト霊長類であ
る。本発明のさらなる態様において、非ヒト霊長類は、アカゲザル、ヒヒ、ノド
シロオマキザル、チンパンジー、ピグテールマカク、スーティーマンガベー、リ
スザル、オランウータンまたは他の非ヒト霊長類である。

【００２１】本発明の別の態様において、レトロウイルスベクターは調節遺伝子配列および
構造遺伝子配列を含む。調節遺伝子配列はプロモーター、好ましくはウイルスプ
ロモーターである。本発明の1つの態様において、プロモーターはサイトメガロ
ウイルスプロモーターまたはヒト伸長因子1αプロモーターである。さらなる態
様において、レトロウイルスベクターはモロニーネズミ白血病ウイルス、ハービ
ーネズミ肉腫ウイルス、ネズミ乳腺癌ウイルスまたはラウス肉腫ウイルスである
。

【００２２】本発明はレトロウイルスベクターの検出方法にも関する。特に、CV-1/S＋L-ア
ッセイ法、PCR、サザン分析およびクローンCV-1-LNC-EGFP細胞などのアッセイ法
を用いて、組織試料中のレトロウイルスベクターの存在を検出できる。

【００２３】膜結合タンパク質を含むレトロウイルスベクターも本発明の範囲内である。好
ましい態様において、膜結合タンパク質はラブドウイルス科（Rhabdoviridae）
から選択される糖タンパク質である。別の態様において、膜結合タンパク質は、
水疱性口炎ウイルス、ピル（Piry）ウイルス、チャンディプラ（Chandipura）ウ
イルス、コイのスプリングウイルス血症（Spring viremia）ウイルス、狂犬病ウ
イルス、またはモコラウイルスによる糖タンパク質である。

【００２４】本発明は、受容体、酵素、サイトカイン、ホルモン、成長因子、免疫グロブリ
ン、細胞周期タンパク質、細胞伝達タンパク質、膜タンパク質および細胞骨格タ
ンパク質からなる群より選択されるポリペプチドをコードする構造遺伝子を含む
、レトロウイルスベクターにも関する。

【００２５】別の態様において、レトロウイルスベクターの構造性遺伝子はリポーター遺伝
子である。詳細にはレポーター遺伝子は、緑色蛍光タンパク質遺伝子、β-ガラ
クトシダーゼ遺伝子、分泌胎盤アルカリホスファターゼ遺伝子およびルシフェラ
ーゼ遺伝子からなる群より選択される。

【００２６】本発明は、細胞内核注入によるトランスジェニック霊長類の作製方法にも関す
る。好ましい態様において、割球は胚から分離し、核は割球から単離される。割
球核は細胞内核注入によって除核卵母細胞に注入され、卵母細胞は次に活性化さ
れる。活性化の後、卵母細胞を胚段階まで培養し、次いで胚を代理雌の卵管に移
植し、トランスジェニック動物が分娩によって作製される。さらなる態様におい
て、内部細胞塊細胞は核移入のために、前記割球から単離される。

【００２７】細胞内核注入法の別の態様において、トランスジェニック動物は好ましくは非
ヒト霊長類である。本発明のさらなる態様において、非ヒト霊長類はアカゲザル
、ヒヒ、ノドシロオマキザル、チンパンジー、ピグテールマカク、スーティーマ
ンガベー、リスザル、オランウータンまたは他の非ヒト霊長類である。

【００２８】細胞内核注入法のさらなる態様において、卵母細胞の活性化は、化学的活性化
、精子サイトゾル（オシリン）活性化または電気活性化によって行われる。

【００２９】体細胞、好ましくは皮膚細胞から分離した核を用いた細胞内核注入法によって
トランスジェニック霊長類を作製する方法も、本発明の範囲内である。

【００３０】本発明の方法は、前核注入によってトランスジェニック霊長類を作製する方法
にも関する。好ましくは、卵母細胞は細胞内精子注入によって受精させる。さら
なる態様において、外因性DNAは前核注入によって受精接合子の前核に移入され
る。好ましい態様において、接合子は胚段階まで培養され、次に胚は代理雌の卵
管に移植され、分娩によりトランスジェニック動物が作製される。

【００３１】本発明のさらなる態様は、ヒト疾患の治療のためにトランスジェニック胚細胞
を用いる方法である。詳細には、本発明で述べるトランスジェニック動物および
トランスジェニック霊長類を作製する方法は、トランスジェニック胚性幹細胞の
作製にも使用できる。次にこれらのトランスジェニック胚細胞を用いて、心臓疾
患、神経疾患、生殖障害、癌、眼疾患、内分泌系障害、肺疾患、代謝障害、自己
免疫障害および老化などの疾患を治療できる。

【００３２】発明の詳細な説明本発明でトランスジェニック動物の作製方法を説明する前に、本発明は、その
ように説明される特定の方法論、プロトコール、細胞系統、動物種または属、構
築物、そして試薬に限定されず、もちろん変わってもよいことを理解されたい。
本明細書で使用される用語は、特定の態様を説明するためだけのものであり、添
付の特許請求の範囲によってのみ限定される本発明の範囲を限定するものではな
いことを理解されたい。

【００３３】本明細書および添付の請求の範囲で使用されるように、単数形「1つの（a）」
、「1つの（an）」および「その（the）」は、文脈が明確に別途指示しない限り
複数参照も含むことに注意する必要がある。したがって、たとえば、「a vector
（1個のベクター）」への参照は、1つ以上のベクターへの参照であり、当業者に
既知のその等価物を含み、以下同様とする。

【００３４】別途定義しない限り、本明細書で使用するすべての技術的および科学的用語は
、本発明の属する当業者に一般に理解されるのと同じ意味を持つ。本明細書で述
べるものと同様または同等の方法、装置および物質はすべて本発明の実施または
試験で使用できるが、好ましい方法、装置および物質をここで説明する。

【００３５】本明細書で言及するすべての刊行物および特許は、たとえば、現在述べる発明
とともに使用される刊行物で述べられた構築物および方法論を説明および開示す
る目的で、参照として本明細書に組み入れられている。上記および本文中に記載
される刊行物は、本出願の出願日前に、その開示のためだけに提供される。本明
細書ではいずれも、本発明者らが前の発明によってそのような開示を先行させる
権利がないことを認めるものと解釈されるべきではない。

【００３６】定義便宜上、明細書、実施例および添付の請求の範囲で用いられる、ある一定の用
語および語句の意味を以下に示す。

【００３７】「卵」という用語は、本明細書で使用されるように、哺乳類の卵に関して使用
される場合、透明帯および卵丘細胞（卵胞細胞）により、関連するプロテオグリ
カンとともに包囲された卵母細胞を意味する。

【００３８】「卵母細胞」という用語は、雌配偶子細胞を意味し、1次卵母細胞、2次卵母細
胞および成熟未受精卵を含む。卵母細胞は、卵細胞質に包囲された大型の核（す
なわち卵核胞）を持つ大型細胞である。卵細胞質は、mRNA、リボソーム、ミトコ
ンドリア、卵黄タンパク質などを含む非核細胞質含量を含む。

【００３９】「受精前卵母細胞」という用語は、本明細書で使用されるように、インビトロ
成熟培地に暴露した後であるが、精子に暴露する前である（すなわち成熟してい
るが受精していない）成熟前卵母細胞などの雌配偶子細胞を意味する。受精前卵
母細胞は第1減数分裂を完了し、第1極体を放出し、核膜を欠いている（核膜は受
精が起こるまで再生されない；受精後、第2極体の突出および雄ならびに雌前核
の形成とともに、第2減数分裂が起きる）。受精前卵母細胞は、第2減数分裂の中
期IIでは成熟卵母細胞とも呼ばれる。

【００４０】「未受精卵」または「未受精卵母細胞」という用語は、本明細書で使用される
ように、受精していない雌配偶子細胞を意味し、これらの用語は成熟前および受
精前卵母細胞を含む。

【００４１】「卵黄周囲腔」という用語は、哺乳類卵または卵母細胞の透明帯と原形質膜と
の間に配置された空間を意味する。

【００４２】「精子」という用語は、雄配偶子細胞を意味し、精原細胞、1次精母細胞、2次
精母細胞、精子細胞、分化精子細胞、円形精子細胞および精子を含む。

【００４３】「体細胞」という用語は、生殖細胞または生殖細胞前駆体以外のあらゆる動物
細胞を意味する。

【００４４】「胚性幹細胞」または「幹細胞」という用語は、未分化細胞である細胞を指し
、生殖細胞（精子および卵）を含む、胚または成体内の多くの分化細胞種を誘導
する末端分化を受ける。これらの細胞種は、本明細書で「ES細胞」とも呼ばれる
。

【００４５】「動物」という用語は、哺乳類（たとえばげっ歯類、霊長類（たとえばサル、
類人猿、およびヒト）、ヒツジ、イヌ、メウシ、ブタ）、両生類、爬虫類、魚類
および鳥類などのすべての脊椎動物を含む。胚および胎児段階を含め、発生の全
段階の個々の動物も含む。

【００４６】「トランスジェニック動物」とは、ヒトの介入によって導入された非相同核酸
を含む1つ以上の細胞を含む、あらゆる動物、好ましくは哺乳類（たとえばマウ
ス、ラット、リス、ハムスター、モルモット、ブタ、ヒヒ、リスザルおよびチン
パンジーなど）、鳥類または両生類を意味する。導入遺伝子（transgene）は、
細胞前駆体への導入によって、精密な遺伝子操作によって、または組換えウイル
スによる感染によって、直接または間接的に細胞内に導入される。本明細書に述
べるトランスジェニック動物において、導入遺伝子により細胞は目的の構造遺伝
子を発現する。しかし、導入遺伝子が沈黙型であるトランスジェニック動物も含
まれる。

【００４７】「トランスジェニック細胞」とは、導入遺伝子を含む細胞を意味する。

【００４８】「生殖細胞系トランスジェニック動物」とは、遺伝子改変または遺伝子情報が
生殖系細胞に導入され、それにより子孫に遺伝子情報を伝達する能力を付与する
、トランスジェニック動物を意味する。そのような子孫が実際にその遺伝子情報
の改変の一部または全部を有する場合、それらも同様にトランスジェニック動物
である。

【００４９】「遺伝子」という用語は、ポリペプチドまたは前駆体の作製に必要な制御およ
びコード配列を含むDNA配列を意味する。ポリペプチドは全長コード配列によっ
て、または所望の酵素活性が維持されている限り、コード配列のどの部分によっ
てもコードできる。

【００５０】「導入遺伝子」という用語は広範には、これに限定されるわけではないが、お
そらく通常はゲノム内に存在しない配列を含む遺伝子またはDNA、所与のゲノム
内に存在するが、通常は所与のゲノム内で転写および翻訳（「発現」）されない
遺伝子、またはゲノム内に導入することが望まれる他の遺伝子またはDNAを含め
、動物のゲノムに導入されるすべての核酸を意味する。これは、非トランスジェ
ニック導入遺伝子ゲノムに通常存在するが、発現での変更が望まれる、または変
更または変化形での導入が望まれる遺伝子を含む。導入遺伝子は詳細には、定義
された遺伝子座を標的とするが、染色体内にランダムに組込まれるか、染色体外
の複製DNAの場合がある。導入遺伝子は1つ以上の転写調節配列と、選択した核酸
の最適な発現に必要なイントロンなどの、他の核酸を含む。本発明の好ましい導
入遺伝子は、ウイルス導入遺伝子である。導入遺伝子は数ヌクレオチド長という
短さになりうるが、好ましくは少なくとも約50、100、150、200、250、300、350
、400または500ヌクレオチド長またはさらに長く、たとえば全ウイルスゲノム長
になりうる。導入遺伝子はコード配列または非コード配列、またはその組合せで
ある。導入遺伝子は通常、適切な条件下で1つ以上の導入遺伝子の発現を誘導可
能な調節要素を含む。

【００５１】「目的の構造遺伝子」という語句はたとえば、目的の生物学的に活性のタンパ
ク質またはアンチセンスRNAを発現する構造遺伝子を意味する。「構造遺伝子」
という用語は、転写を誘導する非コード調節配列を除外する。構造遺伝子の全体
または一部は、植物、菌類、動物、細菌ゲノムまたはエピソーム、真核、核また
はプラスミドDNA、cDNA、ウイルスDNAまたは化学的に合成されたDNAを含む、当
技術分野で既知の供給源に由来する。構造遺伝子は、発現生成物の生物活性また
は化学構造、発現率、または発現制御の方法に影響を与える、コード化または非
翻訳領域のどちらかに1つ以上の修飾を含むことがある。そのような修飾はこれ
に限定されるわけではないが、1つ以上のヌクレオチドの突然変異、挿入、欠失
および置換が含まれる。構造遺伝子は連続コード配列を構成するか、適切なスプ
ライス接合部によって結合された1つ以上のイントロンを含むことがある。構造
遺伝子は融合タンパク質もコードする。

【００５２】「異種DNA」という用語は、「外因性DNA」と互換的に使用され、細胞内に天然
に存在しないDNAを意味する。

【００５３】「ゲノム」という用語は、核DNAコンポーネント、染色体または染色体外DNA、
ならびに細胞質ドメイン（たとえばミトコンドリアDNA）を含む、生物の完全なD
NA全量を含むものとする。

【００５４】「導入遺伝子構築物」という用語は、特定のヌクレオチド配列を発現する目的
で生成された、または他の組換えヌクレオチド配列の構築で使用される、目的の
構造遺伝子を含む核酸分子（たとえばベクター）を意味する。

【００５５】「ベクター」という用語は、本明細書で使用されるように、結合されている別
の核酸分子を輸送する能力のある核酸分子を意味する。好ましいベクターは、結
合している核酸分子の自律的複製および／発現が可能であるベクターである。操
作可能に結合された遺伝子の発現を指示可能なベクターは、本明細書で、「発現
ベクター」と示される。一般に、組換えDNA技術で有用な発現ベクターは、ベク
ター形では染色体に結合しない円形の二本鎖DNAを意味する、「プラスミド」の
形であることが多い。本明細書では、プラスミドがベクターの一般に使用される
形であるため、「プラスミド」と「ベクター」が互換的に使用される。しかし、
本発明は、同等の機能を果たし、本明細書において次に、当技術分野で既知とな
る発現ベクターの他の形を含むものとする。

【００５６】「遺伝子発現」とは、検出可能なレベルの送達ヌクレオチド配列が発現される
ように、ヌクレオチド配列に対して正しい転写および翻訳が行われる工程を意味
する。

【００５７】「プロモーター」という用語は、転写を指示するのに十分な最小ヌクレオチド
配列を意味する。本発明には、細胞型特異的、組織特異的に関して制御可能であ
るか、外部シグナルまたは薬剤により誘発性である、プロモーター依存性遺伝子
発現を引き起こすのに十分なプロモーター要素も含まれ、そのような要素は未変
性遺伝子の5'または3'領域、またはイントロン内に位置しうる。「誘発性プロモ
ーター」という用語は、転写のRNAポリメラーゼ結合および開始の速度が外部の
刺激によって調整できるプロモーターを意味する。「構成性プロモーター」とい
う用語は、転写のRNAポリメラーゼ結合および開始の速度が一定であり、外部の
刺激から比較的独立しているプロモーターを意味する。「一時的な調節プロモー
ター」は、転写のRNAポリメラーゼ結合および開始の速度が発生中の特定の時間
に調整されるプロモーターである。

【００５８】「調節配列」という用語は、本明細書に使用されるように、操作可能に結合し
た遺伝子の転写を制御できる核酸配列を意味する。本発明の調節配列は、プロモ
ーター、エンハンサーおよび／またはサイレンサーを含むことがある。したがっ
て、プロモーターまたは調節要素の調節制御下に遺伝子を置くことは、遺伝子の
発現が調節配列によって制御されるように遺伝子を配置することを意味する。一
般に、プロモーターは、制御する遺伝子の5'（上流）に配置されているのがみら
れる。このように、プロモーター遺伝子組合せの構築において、プロモーターは
好ましくは遺伝子の上流で、プロモーターと天然の設定でそれが制御する遺伝子
との間の距離に似た、転写開始部位からの距離に配置する。当技術分野において
既知のように、この距離のある変形は、プロモーター機能を失わずに許容できる
。同様に、制御下に置かれる異種遺伝子に対する、エンハンサーなどの調節要素
の好ましい配置は、天然で調節する構造遺伝子に対する天然の位置を反映してい
る。エンハンサーは、プロモーター要素に対して、比較的独立した位置および方
向であると考えられる。加えて、ポリAシグナルなどの3'非翻訳領域も調節配列
として利用できる。

【００５９】「アンチセンス核酸」という用語は、RNA分子（たとえばmRNA分子）などの、
特異的核酸分子の少なくとも一部に相補性である、またはハイブリダイズする核
酸分子（たとえばDNAヌクレオチド、RNAヌクレオチドまたは修飾（たとえば、2'
-O-アルキル（たとえばメチル）置換ヌクレオチドなど、分子の安定性を向上さ
せる修飾）またはその組合せ）を意味する。アンチセンス核酸は、mRNAなどの該
当する核酸にハイブリダイズし、二本鎖分子を生成する。細胞は二本鎖mRNAを翻
訳しないため、これはmRNAの翻訳を妨害する。本発明で使用されるアンチセンス
核酸は、通常少なくとも10〜12ヌクレオチド長、たとえば少なくとも15、20、25
、50、75または100ヌクレオチド長である。アンチセンス核酸も、阻害二本鎖を
形成するために標的核酸と同じくらい長くすることも可能である。アンチセンス
核酸はアンチセンスオリゴヌクレオチドと同様に細胞内に導入可能であり、また
はアンチセンス核酸をコードする核酸が導入された細胞内で作製可能である。

【００６０】「レトロウイルスベクター」という用語は、宿主細胞のゲノムに細胞を侵入さ
せたり、レトロウイルスゲノム（二本鎖プロウイルスとして）を組込むことがで
きるレトロウイルスまたはレトロウイルス粒子を意味する。

【００６１】ヒト疾患のトランスジェニック動物モデルは顕著な躍進に至り、多数の病気の
分子ベースを明らかにした。これらの発見はすでに、疾患の診断、治療および治
癒にさえ影響を与えている（Palmiterら、300 NATURE 611〜15、1982；Koopman
ら、351 NATURE 117〜121、1991；Wrightら、9 BIOTECH. 330〜34、1991、Tang
ら、49 BIOL.REPROD.346〜53、1993）。生物医学の研究者は、配偶子、胚および
代理の調製における豊富な知識、費用および利用可能性；短い世代期間；特に有
用なマーカーおよび／または特徴を示す多数の近交株；および大規模な遺伝子デ
ータベースを含む複数の理由により、トランスジェニックマウスモデルを選択し
た。（HOGANら、「マウス胚の操作（MANIPULATION OF THE MOUSE EMBRYO）」、C
old Spring Harbor Press、Long Island、NY,1986）。トランスジェニックマウ
スモデルが有用なツールとなっても、ヒトとの相違によって、マウスでは十分に
答えられない問題がある。結果として、トランスジェニック非ヒト霊長類を作製
するための革新的な手法を開発および最適化する需要がある。

【００６２】本発明は、細胞の全部ではなく一部に導入遺伝子を持つ動物、すなわちモザイ
ク動物と同様に、すべての細胞に導入遺伝子を持つトランスジェニック動物を提
供する。導入遺伝子は単一導入遺伝子として、またはたとえば頭-頭タンデム、
または頭-尾タンデム、または尾-尾タンデムで、または複数のコピーとして組込
むことができる。二重、三重または多重トランスジェニック動物は好ましくは、
少なくとも2つ以上の導入遺伝子を含む。好ましい態様において、動物はGFP導入
遺伝子と、目的の構造遺伝子をコードする導入遺伝子を含む。

【００６３】タンパク質をコードする1つ以上の遺伝子を導入遺伝子として使用する場合、
適切な調節要素に遺伝子を操作可能に結合することが望ましく、これにより導入
遺伝子の発現が可能となる。調節要素、たとえばプロモーター、エンハンサー（
たとえば誘発性または構成性）、またはポリアデニル化シグナルは当技術分野で
周知である。調節配列は内因性調節配列、すなわち導入遺伝子として導入される
のと同じ動物種による調節配列でもよい。調節配列は導入遺伝子として使用され
る遺伝子の天然調節配列でもよい。

【００６４】本明細書に述べる導入遺伝子構築物は、DNA配列の下流の3'非翻訳領域を含む
ことがある。そのような領域は、発現系のRNA転写を安定させることが可能であ
るため、発現系から望ましいタンパク質の収量を増加させることができる。3'非
翻訳領域のうち、本発明の構築物で有用なのはポリAシグナルを提供する配列で
ある。そのような配列はたとえば、SV40小型t抗原に由来するか、当技術分野で
周知の他の3'非翻訳配列である。3'非翻訳領域の長さは重要ではないが、そのポ
リA転写産物の安定効果は、発現配列のRNAを安定させるのに重要である。

【００６５】導入遺伝子構築物は、プロモーターと、シグナル配列をコードするDNA配列と
の間に5'非翻訳領域も含む。そのような非翻訳領域は、プロモーターが採取され
るのと同じ制御領域によるものか、異なる遺伝子によるものでもよく、たとえば
他の合成、半合成または天然源に由来することがある。

【００６６】アンチセンス核酸も、本発明の導入遺伝子構築物に使用される。たとえば、ア
ンチセンスポリヌクレオチド配列（DNAコード鎖に対して相補性）は細胞内に導
入されて、「正常な」遺伝子の発現を低減させる。この手法は、たとえば、アン
チセンス核酸、リボザイムまたはトリプレックス剤を使用して、特定のmRNAの転
写または翻訳を阻害するために、そのmRNAをアンチセンス核酸またはトリプレッ
クス剤によってマスキングするか、リボザイムによって開裂させる。あるいは、
この方法は、遺伝子生成物の作用または効果を模倣する、または遺伝子の作用を
阻害する試薬の投与を含む。遺伝子のインビトロ翻訳を変化させるアンチセンス
法の使用は、当技術分野で周知である（たとえばMarcus-Sekura、172 ANAL.BIOC
HEM.289〜95、1988を参照）。

【００６７】本明細書に述べる導入遺伝子構築物は、増幅のために適切なあらゆるプラスミ
ド、バクテリオファージまたはウイルスベクターに挿入されるか、それによって
、Maniatisらが述べる方法などの当技術分野で既知の方法を用いて増殖される（
「分子クローニング、実験マニュアル（MOLECULAR CLONING A LABORATORY MANUA
L）」、Cold Spring Harbor、NY、1989）。構築物は、それより大きなプラスミ
ドの一部として調製され、それによって当技術分野で既知の有効な方法で、作製
のクローニングおよび選択が可能となる。構築物は、望ましい哺乳類に挿入する
ために残りのプラスミド配列から容易に単離できるように、都合のよい制限酵素
切断部位間に配置できる。

【００６８】本発明の別の態様は、前核注入による外因性DNAの導入によって、トランスジ
ェニック動物、好ましくは非ヒト霊長類を作製する方法を提供する（BREMおよび
MULLER、「新規遺伝子を有する動物（ANIMALS WITH NOVEL GENES）」、Cambridg
e University Press（N.Maclean編）179〜244、1994；Wall、45 THERIOGENOLOGY
57〜68、1996）。前核は、精子が卵母細胞の細胞質に含有された後に、配偶子
核の脱縮合によって形成される。DNAを前核に直接注入すると、局在化したDNAの
濃度が上昇するため、分子内および分子間結合が促進されて、染色体破損点での
DNA挿入とその後のDNA修復が起きる（Bishop、36 REPROD.NUTR.DEV.607〜18、19
96）。前核注入は通常、1つの挿入部位に複数の導入遺伝子複製を生じさせる。
外因性DNAの染色体内への挿入は、DNA複製中に発生する可能性が最も高い（Coff
in、31 J.MED.VIROL.43〜49、1990）。本技術で使用するDNA断片のサイズはかな
り大きい（Bremら、44 MOL.REPROD.DEV.56〜62、1996）。したがって、導入遺伝
子の発現を制御するために、遺伝子座制御領域または動原体性領域などの調節要
素が、外因性DNAに含まれることがある。トランスジェニック霊長類の場合、両
方の前核がすぐに見えるため、前核注入はトランスジェニック胚を作製するのに
有効な方法である。

【００６９】導入遺伝子は通常、微量注入によって導入され、受精卵母細胞は次に、好まし
くは約16〜150の細胞を含む着床前胚が得られるまでインビトロで培養される（
米国特許第4,873,191号を参照）。受精卵母細胞を着床前段階まで培養する方法
は、Gurdonら（101 METH ENZYMOL.370〜86、1984）、HOGANら（「マウス胚の操
作；実験マニュアル（MANIPULATION OF THE MOUSE EMBRYO；A LABORATORY MANUA
L）」、C.S.H.L.N.Y.、1986）、Hammerら（315 NATURE 680〜83、1985）、Gando
lfiら（81 J.REPROD.FERT.23〜28、1987）、Rexroadら（66 J.ANIM. SCI.947〜9
53、1988）、Eyestoneら（85 J.REPROD.FERT.715〜720、1989）；およびCamous
ら（72 J.REPROD.FERT.779〜785、1984）が述べている。着床前胚は着床まで凍
結させてもよい。着床前胚は偽妊娠雌の卵管に移植され、導入遺伝子が組込まれ
た発生段階によって、トランスジェニックまたはキメラ動物が出生する。キメラ
哺乳類は、真の生殖系列トランスジェニック動物を作製するために飼育できる。

【００７０】本発明の別の態様は、トランスジェニック細胞内核注入（ICNI）法である。IC
NIは、胚または体細胞核のいずれかと、その関連する細胞成分を除核した卵母細
胞に移入するという点で、電気融合を用いた核導入に似ている。核が卵母細胞細
胞質に直接注入されるため、電気融合とは複数の点で異なる。ICNIは、特に限ら
れた数の卵母細胞で作業する場合に、電気融合に勝るいくつかの利点を有する。
核注入経路がさらに制御され、核を特定の細胞質部位（すなわち皮質対中央細胞
質）に移入する可能性が存在する。さらに、核導入の時間を卵母細胞活性化の時
間と区別できる。体細胞核を用いるICNIは、特定の突然変異を含む動物モデルを
増殖させる見込みとともに、ワクチンおよび生理学的研究のために同一研究試料
を増殖させる見込みもある（Biggers、26 THERIOGENOLOGY 1〜25、1986）。

【００７１】 2倍体核を移入する前に、レシピエントの細胞質（成熟卵母細胞）からゲノムD
NA相補物を除去する必要がある。核移入前の除核手順の有効性は、後の胚発生に
有害な影響を持つ倍数性異常を避け、レシピエント細胞質の遺伝的な寄与をすべ
て消滅させ、新たに導入された核が関与しない単為活性化および胚発生の可能性
を除外するために、きわめて重要である。除核は卵母細胞DNAをヘキスト33342で
標識することによって、一連の種で正しく行われている（CristerおよびFirst、
61 STAIN TECHNOL.1〜5、1986；Smith 99 J.REPROD.FERT.39〜44、1993）。蛍光
団で標識されたDNAは、紫外線光で励起されると強力な蛍光を発する。したがっ
てDNAは、除核手順中に描出され、完全な除去が確認できる（中期IIプレートお
よび第1極体）。ウシに関する報告は、卵母細胞をUV照射に10秒間暴露すると、
胚の生存率と生きている仔ウシの産生に影響がないことを示している（Westhusi
nら、95 J.REPROD.FERT.475〜480、1992）。同様に、ウサギおよびアフリカツメ
ガエルの卵母細胞を15秒未満照射すると、卵母細胞の発生能力に影響は見られな
かった（Yangら、27 MOL.REPROD.DEV.118〜29、1990；Gurdon 101 J.MICROSCOPI
C SOC.299〜311、1960）。しかし、卵母細胞をUV光に30秒以上暴露させると、膜
の完全性に損失が生じ、メチオニン含有量が低下し、ウシ卵母細胞においてタン
パク質合成のパターンが著しく変化し（Smith、1993）、ウサギ卵母細胞では生
存率が低下し（Yangら、1990）、照射アフリカツメガエル卵母細胞では30％の異
常発生が生じる（Gurdon、1960）。しかし、卵母細胞細胞質に対する紫外線光の
破損効果の可能性は、非常に短時間の場合でも考慮する必要がある。

【００７２】除核未受精卵母細胞を産生するために、サイトカラシン（BおよびD）、コルセ
ルニドおよびデミコルシンなどのマイクロフィラメント阻害物質が多くの種の除
核に、幅広く使用されている（McGrathおよびSolter、226 SCIENCE 1317〜19、1
984；Pratherら、37 BIOL.REPROD.859〜66、1987；Cheongら、48 BIOL.REPROD.9
58〜63、1993；Chastantら、44 MOL.REPROD.DEV.423〜32、1996）。他のマイク
ロフィラメント阻害物質には、G-アクチンに結合してマイクロフィラメント組織
を崩壊させるラツルンクリンA（latrunculin A）、ジャスプラキノリド（jaspla
kinolide）、海綿から単離された大環状のペプチドであるジャスピス-ジョンス
トニー（Jaspis Johnstoni）が含まれる（Schattenら、83 PROC.NATL.ACAD.SCI.
USA 105〜09、1986）。除核によって減数紡錘がレシピエント卵母細胞から首尾
よく除去されたことを確認するために、バイタル緑色および赤色蛍光核酸染料を
使用する（Thomasら、56 BIOL.REPROD 991〜98、1997）。卵母細胞の除核は、マ
イクロフィラメント阻害物質の不在時に透明帯膜への貫入後に、細胞質の直接吸
引を含む細胞内除核によっても行うことができる。レシピエント卵母細胞の除核
が首尾よく行われたことは、除去物質の蛍光分析によって確認される。除核ピペ
ット内部の2つの別個のDNA相補物の描出（中期プレートおよび第1極体）は、レ
シピエント核ゲノムが除去されたことを示し、卵母細胞の励起を不要にする。

【００７３】本発明の方法は、レトロウイルスベクターを用いた外因性DNAの卵母細胞への
導入による、トランスジェニック動物の産生にも関する。レトロウイルスベクタ
ーを用いると、ウイルス感染工程を利用して、宿主細胞内に遺伝子を効果的に導
入することができる（Kimら、4 ANIM.BIOTECHNOL.53〜69、1993；Kimら、35 MOL
.REPROD.DEV.105〜13、1993；HaskellおよびBowen、40、MOL.REPROD.DEV.386〜9
0、1995；Chanら、95 PROC.NATL.ACAD SCI.USA 14028〜33、1998；Krimpenfort
ら、1991；Bowenら、50 BIOL.REPROD.664〜68、1994；Tadaら、1 TRANSGENICS 5
35〜40、1995）。レトロウイルスゲノム内にクローニングされた外因性遺伝子ま
たは異種遺伝子（すなわち、分子生物学的技術を用いて挿入された）は、レトロ
ウイルスによって感染されやすい宿主細胞に効率的に送達できる。周知の遺伝子
操作により、レトロウイルスゲノムの複製能力を破壊できる。生じた複製欠陥ベ
クターを用いて、新たな遺伝子物質を細胞に導入できるが、それらは複製できな
い。ヘルパーウイルスまたはパッケージング細胞系を用いると、ベクター粒子が
集合し、細胞から出てくる。レトロウイルスベクターの宿主範囲（すなわちこれ
らのベクターが感染可能な範囲）は、別の密接に関連したウイルスからの外被タ
ンパク質を含めることによって変更できる。トランスジェニック動物の産生にレ
トロウイルスを使用する方法は、Chanら、1998および米国特許第6,080,912号に
記載されている。

【００７４】複製欠陥レトロウイルスベクターは、哺乳類細胞に遺伝子を移入するための有
効で安全な経路として確立されている（ShimotohnoおよびTemun、26 CELL 67〜7
7、1981；Rubensteinら、83 PROC.NATL.ACAD.SCI.USA 366〜68、1986）。レトロ
ウイルス感染の手段によって移入された遺伝子は、めったに再配列せず、前核注
入では通常発生する複数の挿入を持つことが少ない。（BishopおよびSmith、6 M
OL.BIOL.MED.283〜98、1989；Wall、1996）。いくつかの研究は、トランスジェ
ニックウシの産生でDNAを初期ウシ胚に移入するために、複製欠陥レトロウイル
スベクターを媒体として使用することが可能であることを示している（Kimら、1
993；HaskellおよびBowen、1995；Chanら、1998）。モロニーネズミ白血病ウイ
ルス（MoMLV）に由来する複製欠陥レトロウイルスベクターは、外因性遺伝子を
哺乳類細胞に効果的に移入できる（Gilboaら、4 BIOTECH 504〜12、1986；Kimら
、1993）。

【００７５】レトロウイルスの宿主細胞への組込は、レトロウイルスインテグラーゼおよび
レトロウイルスゲノムの端に位置する特異的ヌクレオチド配列を介する（Goff、
26 ANNU.REV.GENET.527〜44、1992）。加えて、有糸分裂M期の間の核エンベロー
プの崩壊も、レトロウイルス組込には重要である（Roeら、12 EMBO.J.2099〜210
8、1993）。核エンベロープの崩壊によって、組込前のレトロウイルス組込前複
合体の核内への転座を可能にする。第2減数分裂の中期II（MII）の間、卵母細胞
は、静止期中の前核の形成まで核エンベロープを持たない。したがって、MII卵
母細胞のレトロウイルス感染は、ゲノム内での遺伝子組込効率を向上させた（Ch
anら、1998）。

【００７６】従来のレトロウイルスベクターのいくつかの欠点は、インビボの標的組織およ
び臓器でのその使用を制限している（Adamら、89 PROC NATL.ACAD.SCI.USA 8981
〜85、1992；Burnsら、90 PROC. NATL.ACAD.SCI.USA 8033〜37、1993；Yeeら、4
3 METHODS CELL BIOL.99〜112、1994）。ウイルス外被タンパク質の安定性およ
び宿主細胞認識の機構に関連する、低いウイルス力価および制限された宿主範囲
（Albrittonら、57 CELL 655〜59、1989；Yeeら、1994）は主な制限である。ト
ランスジェニックマウス、ニワトリ、およびウシは、卵母細胞または初期胚をレ
トロウイルスベクターで感染させて作製されている（Jaenischら、1975；Stewar
tら、97 J.EMBRYOL.EXP.MORPHOL.SUPPL.263〜75、1986；Stewartら、6 EMBO 383
〜88、1987；Chanら、1998）。しかし、複製欠陥レトロウイルスベクターを使用
する際の主な障害は、制限されたウイルス力価（10⁵〜10⁶cfu/ml）および限定さ
れた宿主の特異性である（WallおよびSeidel、38 THERIOGENOLOGY 337〜57、199
2；Kimら、1993）。

【００７７】低いウイルス力価および制限された宿主範囲を克服するために、レトロウイル
スベクターは水疱性口炎ウイルスの外被糖タンパク質（VSV-G）を用いて偽型化
できる。この糖タンパク質は、宿主細胞の原形質膜のリン脂質成分と相互作用す
る。偽型化されたベクターは、感染性の範囲の拡張を示し、感染性を著しく損な
わずに濃縮できた（10⁹〜10¹⁰cfu/ml）（Chanら、1998）。本発明はVSV-Gタンパ
ク質の使用に限定されていない；そのため、他のベシクロウイルスまたはLyssa
ウイルスの糖タンパク質を使用できる。

【００７８】トランスジェネシスに利用される各種のウイルスベクターは、これに限定され
るわけではないが、アデノウイルス、ヘルペスウイルス、ワクシニア、または好
ましくは、レトロウイルスなどのRNAウイルスを含む。1つの外因性遺伝子を挿入
できるレトロウイルスベクターの例は、これに限定されるわけではないが、モロ
ニーネズミ白血病ウイルス（MoMuLV）、ハービーネズミ肉腫ウイルス（HaMuSV）
、ネズミ乳腺癌ウイルス（MuMTV）、およびラウス肉腫ウイルス（RSV）が含まれ
る。その他多くのレトロウイルスベクターが複数の遺伝子を包含できる。これら
のベクターはすべて、トランスジェニック細胞が識別できるように、選択可能マ
ーカー用の遺伝子を移入または組込可能である。目的の（プロモーター領域を含
む）遺伝子配列を、たとえば特異性標的細胞上の受容体リガンドをコードする別
の遺伝子を持つウイルスベクター内に挿入することによって、ベクターはここで
標的特異性である。当業者には、ポリヌクレオチドの標的特異性送達を引き起こ
すレトロウイルスゲノム内に挿入可能な、特異性ポリヌクレオチド配列がただち
に明らかとなる。

【００７９】受精中の精子の役割には、1倍体ゲノムを結果として生じる接合子に移入する
ことが含まれる。この能力は、トランスジェニック動物の産生で外因性DNAを送
達する革新的な戦略として利用されている（Lauria ＆ Gandolfi、36 MOL.REPRO
D.DEV.255〜57、1993；Kimら、46 MOL.REPROD.DEV.1〜12、1997；Chanら、MOL.H
UMAN REPROD 26〜33、2000；Perryら、284 SCIENCE 1180〜83、1999）。

【００８０】本明細書に述べる本発明の方法は、精子表面に結合した外因性DNAが細胞内精
子注入（ICSI）の間、保持され、卵内に移入されることを示している。実施例1
で述べるように、外因性DNAを精子と混合し、インキュベートおよび洗浄する。
次にDNA結合精子はICSI法によって卵母細胞に注入される。本技術（「トランス
ジェンICSI」）は、臨床的に関連した研究用のトランスジェニック非ヒト霊長類
試料を日常的に作製するための、そしてヒト疾患の診断、予防および治癒用にト
ランスジェニック霊長類を作製するための、革新的で強力な手法である。

【００８１】トランスジェンICSI技術は、外因性DNAを動物に導入する高度に有効な手段を
提供する。インビトロで受精中に、外因性DNAをマウス卵母細胞内に移入するた
めに精子を担体として使用することによりトランスジェネシス技術に新たな見識
がもたらされた（Lavitranoら、57 CELL 717〜23、1989）。トランスジェンICSI
の間に外因性遺伝物質を霊長類卵母細胞に送達することによって、生出生と同様
に両方の胚導入遺伝子発現が生じ、この新たな手順の実現可能性を証明する（Ch
anら、6 MOL.HUM.REPROD.26〜33、2000）。DNAと結合した霊長類精子は、測定可
能な各規準によって正常な満期の子孫に対して、完全な生殖可能性を維持してい
る。霊長類はより大規模で長期間の調査および専念が必要であるが、トランスジ
ェニックマウスとヒト患者のギャップを埋めるための、トランスジェニック霊長
類作製のための生医学的理論的根拠は明確である。しかし、この作業は、生出生
を得るためにわずか1週間しかかからず、人道的な安楽死の後に結果分析に関し
てより許容的な系である、トランスジェニックげっ歯類の産生とは大幅に異なる
。トランスジェニックマウスは、2〜2.8％のDNA組込率のICSIによって産生され
ている（Perryら、284 NATURE 1180〜83、1999）。精子の原形質膜を破ると、お
そらくDNAの結合、インターナリゼーションおよび／または組込が増加するため
に、遺伝子導入効率が向上した。

【００８２】 ICSIによるトランスジェネシスは、外因性DNA伝達の有望な手法となり、卵母
細胞、代理母および移入された胚の数が霊長類のように貴重で、限定されている
系では特に有用である。トランスジェンICSIは、家畜種（すなわちブタおよびウ
シ）による卵母細胞のほぼ不透明な細胞質内での、または両方の前核が区別でき
ない場合（たとえば霊長類）、次の微量注入のために雄前核を配置する問題を消
滅させる。トランスジェンICSI技術は、インビトロでの受精中に外因的に結合し
たDNAの消失の可能性に関する落とし穴も回避する。

【００８３】ローダミン標識プラスミドDNAは、共焦点顕微鏡によって画像化されるように
、精子頭の表面へのDNAが結合することを証明する、動的蛍光マーカーとして作
用した（図1：マウス（A）；ウシ（B）、アカゲザル（C））。トリプシン反応活
性度により、精子細胞表面への付着はタンパク質仲介であることが示唆されたが
、ローダミンシグナルは完全に洗浄した後も維持された。（Lavitranoら、31 MO
L.REPROD.DEV.161〜69、1992；Zaniら、21 EXP.CELL RES.57〜64、1995）。ICSI
によるアカゲザル受精のレーザー走査共焦点およびデジタルエピ蛍光画像化によ
って、ICSI手順全体にわたって、そして前核発生の初期の間、微量注入された精
子に関連するローダミンプラスミド蛍光の保存が証明された（図1Dおよび1E；図
2A〜2C）。細胞質を通過したより深い焦点によって消光されたシグナルの明るさ
は、大部分の外因的に結合したDNAがICSI後も維持されていることを示した。さ
らに、プラスミドは精子核と結合したままで、分散しない。動的で生の高解像度
画像化によって、精子選択の間（図2A）、精子注入の間（図2B）および成功した
ICSIの後（図2C）の、ローダミン標識プラスミドDNAの精子への持続性結合が証
明された。ローダミン標識プラスミドのシグナルは、拡張し、おそらく卵の細胞
質に消光されると、ぼやけた画像が検出不能となるため、卵母細胞が第1細胞期
に入ると消失する。微量注入された遊離プラスミドは、卵母細胞の細胞質中を迅
速に分散する。

【００８４】緑色蛍光タンパク質（GFP）をコードするローダミン標識プラスミドを使用す
ると、GFPを発現するトランスジェニックアカゲザル胚がこの新たな手法によっ
て高い頻度で産生された。CMVプロモーター（Rh-CMV-GFP）の制御下にあるGFP遺
伝子をコードするローダミン標識プラスミドと結合したアカゲザル精子は、成熟
アカゲザル（図1D）、またはウシ（図1E）卵母細胞に微量注入した後にプラスミ
ドを保持していた。モザイクGFP発現は、4細胞期という早い時期に検出される（
図1G）。割球の数と発現胚の割合(％)は、少なくとも胚盤胞期まで増加し、そこ
で内部細胞塊および栄養外胚葉の両方がGFP蛍光を示す（図1H）。直接GFP蛍光検
出は、GFP発現の最も感受性の高い指標ではない。直接GFP画像化によって検出不
能であるが、胚は抗GFP抗体によって固定および標識された。蛍光顕微鏡で検出
可能なシグナルを持つ1個の割球が観測され、抗GFP免疫細胞化学を用いて、導入
遺伝子のGFP発現が検出できることが示されている。検出不能の直接GFP蛍光は、
タンパク質のミスフォールディングによる、または認識エピトープを含むペプチ
ドの部分翻訳による、閾値未満のレベルのGFP発現によって生じることがある。

【００８５】多くの胚において、サルでは4〜8細胞期に生じると考えられる、微量注入され
たDNA結合精子を用いた発現の開始は母胚遷移の後に生じ、モザイク状であり、
桑実胚においてわずか1個の割球に空間的に制限することができる。さらに、微
量注入精子上のローダミン標識DNAの動的微光レベル画像化は、卵母細胞細胞質
内では、DNAが注入精子と結合したままであることを示した（図2A〜2C）。

【００８６】 ICSIによって受精した卵母細胞内の精子細胞表面上に、大量のプラスミドDNA
が観察された（図1Dおよび1E）。成熟卵母細胞へのDNA標識精子の注入により緑
色蛍光タンパク質を発現するアカゲザル胚は、39.4％の効率で生成された（図1G
および1H）。アカゲザルの妊娠は、4〜8細胞胚を移入した場合のみ、日常的に成
功するため（Hewitsonら、5 NAT.MED.431〜3、1999）、GFP発現胚盤胞の成長は
、実験的に重要な業績である。

【００８７】 4〜8細胞期のGFP発現胚を移入した3匹のアカゲザルの妊娠は、7つの胚移入に
よるものであった。健康な雄が期限終了時に出生し、解剖学的に正常な双生児（
雄および雌）が35日目に早産で死産された。

【００８８】 ICSIによる受精は、精子に付着した外因性遺伝子を排除することが示されてい
る、正常な原形質膜の相互作用を回避する。しかし、ICSI中の卵母細胞内への遺
伝子物質の送達によって、病原体の代替通路と、その後の胚の感染がもたらされ
る可能性がある。このことは、絶滅危惧種および生医学研究動物のコロニー管理
に関して、潜在的な小区分を提示する。

【００８９】 ICSIは受精の天然経路および卵母細胞の天然防御機構を回避するため、ICSI用
に選択した精子外部に付着した潜在的な病原体を削減または消滅させる戦略がい
くつか提示されている。理想的には、これらの衛生処置は、細菌のない精子のみ
を導入するために、物理的除去および化学的除染の両方を採用する必要がある。
これらの化学処置は好ましくは、正常な生殖に影響を与えず、それゆえ好ましく
はICSIの前または最中に除去または中和されることが好ましい。細菌性およびウ
イルス性病原体の消滅は、たとえば酵素がICSIの前に除去されるように物理的に
結合されていたり、細胞質内で中和されるようなpHまたはイオン感受性を持って
いる場合は、酵素衛生処置によって行うことができる。たとえば、プロテイナー
ゼおよび／またはヌクレアーゼ（DNA分解酵素、RNA分解酵素）を使用できる。実
質的な洗浄でさえ完全な除染の可能性は低いため、外因性基質への物理的結合が
提案されている。酵素架橋のために、鮮やかな蛍光染料を含むポリスチレンまた
は磁気ビーズが市販されている。

【００９０】無数の潜在的に生存可能な精子の中で選択するための非観血式アッセイ法（す
なわちBerkovitzら、1 ANDROLOGIA 1〜8、1999）は、トランスジェニック方法に
とって重要である。除染酵素を透明帯に結合することは、透明帯を通過した貫通
後の卵黄周囲腔内部での精子の選択への単純で容易な手法である。その理由は、
ICSIの精子を選択する非観血性の、天然の方法に依存するからである。加えてこ
の手法はまた、外因性物質が受精時の最初の障壁であるため物理的に消滅させ、
精子はその非損傷原形質膜を維持するため、生殖のための精子生存率は干渉され
ずに、結合した酵素はおそらく、異質な感染粒子を破壊すると思われる。

【００９１】成熟精子が不在の場合に、ICSIの代わりの手法は、卵母細胞への精子細胞の注
入を含む。1つの研究において、卵母細胞と円形精子細胞との電気融合では、1組
の1倍体染色体を持つ最も若い雄生殖細胞により、正常な受精マウスが出生した
（Oguraら、91 PROC.NATL.ACAD.SCI.USA 7460〜62、1994）。ヒトでの報告は、
生存可能な胚を作製するための、円形精子細胞注入（ROSI）の可能性を示してい
る（Tesarikら、333 N.ENGL.J.MED.525、1995）。円形精子細胞注入は発生能力
のあるアカゲザル胚の作製に至らなかったが、伸長精子細胞注入（ELSI）は成功
している。

【００９２】本発明のさらなる態様において、トランスジェニックリポーターを利用して、
遺伝子送達系を評価し、トランスジェニック胚を選択できる。トランスジェニッ
クリポーターの使用は、外因性DNAの標的細胞への正しい送達を決定するための
強力なツールである。多くのトランスジェニックリポーターが利用可能であるが
、最も一般的で、幅広く使用されているのは、発生および基本生物研究を含む多
くの応用で使用されてきた、緑色蛍光タンパク質（GFP）である（Naylor、58 BI
OCHEM. PHARMACOL.749〜57、1999；Ikawaら、430 FEBS LETT. 83〜87、1998；Ri
zzutoら、6 CURR.BIOL.183〜88、1996）。

【００９３】他のトランスジェニックリポーターは、これに限定されるわけではないが、β
-ガラクトシダーゼ、ルシフェラーゼ、および分泌胎盤アルカリホスファターゼ
を含む。酵素であるβ-ガラクトシダーゼは、β-gal結合を含む分子の加水分解
を触媒し、反応生成物は比色アッセイ法によって検出できる（Kubischら、104 J
.REPROD.FERTIL.133〜39、1995；Chanら、52、MOL.REPROD.DEV.406〜13、1999）
。ルシフェラーゼは、黄緑光を生成するルシフェリンの酸化的脱カルボキシル化
を触媒し、その活性は、光子画像化によって検出できる（Thompsonら、92 PROC.
NATL.ACAD.SCI.USA 1317〜21、1995；Menckら、7 TRANSGENIC RES.331〜41、199
8）。分泌胎盤アルカリホスファターゼ（SEAP）は、胎盤アルカリホスファター
ゼの切断形で、構成的に分泌され、化学発光によって検出される（Chanら、52、
BIOL.REPROD.137、1995）。

【００９４】トランスジェニックリポーターの発現を用いて、特定の細胞または組織型の発
生をモニタリングできる。たとえば、組織または細胞特異性プロモーターを利用
して、リポーターの発現を調節できる。磁気共鳴画像法（MRI）、陽電子放射ト
ポグラフィー（PET）などの非観血式画像化、またはバイオフォトニック画像化
を用いると、特定の細胞の起源、移動および運命が分析できる。したがってこの
技術は、たとえば、胚発生中のインシュリン産生細胞または神経細胞（たとえば
パーキンソン病、アルツハイマー病および自閉症に関係する細胞）のモニタリン
グに使用できる。

【００９５】感受性の高い方法、すなわちポリメーラーゼ連鎖反応（PCR）による生検胚試
料中の導入遺伝子の検出は、移入に関して陽性の胚を選択するのに広く使用され
てきた（KingおよびWall、1 MOL.REPROD.DEV.57〜62、1988；Ninomiyaら、1 MOL
.REPROD.DEV.242〜48、1989；Cousensら、39 MOL.REPROD.DEV.384〜91、1994；K
risherら、78 J.Dairy Sci.1282〜88、1994；Bowenら、50 BIOL.REPROD.664〜66
8、1994）。胎児および子孫の偽陽性率が比較的高いことは、スクリーニング手
順が不正確であることを示している（BurdonおよびWall、33 MOL.REPROD.DEV.43
6〜42、1992；Cousenら、1994）。トランスジェニックリポータータンパク質は
、胚への遺伝子移入後の外因性DNAの存在を示すもうひとつの方法である。初期
胚段階における導入遺伝子発現は必ずしも、外因性DNAの胚ゲノムへの組込を示
さないが、GFP胚の選択の成功およびGFPトランスジェニックマウスの作製は、胚
選択におけるトランスジェニックリポーターの重要性を示している（Takadaら、
49 NAT.BIOTECH.346〜53、1997）。

【００９６】本発明は、プロモーターなどの調節要素の制御下にある導入遺伝子も提供する
。制御可能なプロモーター系または遺伝子発現系が最も望ましい。段階特異性お
よび／または組織特異性プロモーターの選択は、目的の遺伝子または標的臓器に
依存する。遺伝子送達系では、強力なウイルスプロモーターであるサイトメガロ
ウイルス（CMV）は、プロタミン1プロモーターと同様に、適切なプロモーターで
ある（O'Gormanら、94 PROC.NATL.ACAD.SCI.USA 14602〜07、1997）。このプロ
モーターは、トランスジェニック研究で広く用いられている。これは特異性を欠
いているが、構成性発現パターンは、遺伝子送達効率を評価する間において利点
を有する。

【００９７】遺伝子発現調節で有用な他のプロモーターは、これに限定されるわけではない
が、ウイルス（たとえばモロニー白血病ウイルス）由来の遺伝子のプロモーター
、各種哺乳類（たとえばヒト、ウサギ、イヌ、ネコ、モルモット、ハムスター、
ラットおよびマウス）に由来する遺伝子のプロモーターを含む。好ましいプロモ
ーターは、目的の構造遺伝子（たとえばインシュリン、エリスロポエチン、また
は血小板由来成長因子の遺伝子）によるプロモーターである。別の好ましい態様
において、誘発性プロモーター（たとえばテトラサイクリン調節系およびメタロ
チオネインプロモーター）を用いて、導入遺伝子の発現を調節することができる
（Iidaら、70 J.VIROL.6054〜59、1996；Palmiter、91 PROC.NATL.ACAD.SCI.USA
1219〜23、1994）。

【００９８】 DNAへのローダミン結合によって、DNA動態の生の画像化が可能となる。共焦点
および従来型のデジタル画像化により、精子が卵の細胞質に入った後の外因性DN
Aの運命と同様に、精子へのDNAの結合が確認される。ローダミンは、長波長（し
たがって破壊的な低いエネルギーが少ない）赤色光による励起、ローダミンDNA
蛍光とGFPトランスジェニック発現による緑色蛍光との混同の回避を含む、複数
の理由により、優れた蛍光DNAマーカーである。

【００９９】 GFPの発現の動態画像化は、FITCフィルターを用いて蛍光顕微鏡によって検査
される。本発明の方法では、GFP発現は2細胞から胚盤胞期までに起こる。発現は
胚の転写活性に依存する。2種類の異なる発現が予想できる。導入遺伝子発現は
、組込導入遺伝子に由来するか、非組込外因性DNA（過渡的発現）に由来する。
組込が成功した場合、転写における母性胚性遷移の後に発現が予想される。過渡
的発現は、活性転写機構が存在する場合、インビトロでの培養の間に常時予想さ
れる。したがって、外因性DNAの発現は、成功した遺伝子送達の良好な参照であ
るが、成功した組込は、トランスジェニック子孫の産生によって、または胚ゲノ
ムへの外因性DNAの正しい組込のインサイチューPCRによる分析によって確認する
必要がある。

【０１００】従来型または共焦点顕微鏡法のどちらかによって画像化された、卵母細胞およ
び胚の生存率パラメータの決定は、胚移入のためのGFP発現胚または割球を選択
する後の段階で重要である。したがって、対照接合子および胚における正常な発
生を防止する光強度および暴露時間は、生存率による暴露を定量することによっ
て決定される。このデータを用いると、微光レベル画像化が最適化されて、後の
発生を危うくする量のわずかな割合の光強度を用いて、蛍光画像を収集すること
ができる。

【０１０１】 GFPの発現、PCR分析、サザンブロット分析、蛍光インサイチューハイブリダイ
ゼーション（FISH）、およびインサイチューPCRを利用して、組織試料中の導入
遺伝子の存在を検査し、外因性DNAの標的細胞ゲノムへの組込を確認することが
できる。サザンブロット分析は、プロウイルスのサイズ、組込パターン、および
導入遺伝子の可能な再配置を示す。インサイチューPCRは、導入遺伝子の染色体
位置を確認する。分析の解釈は試料間で変化し、組織試料を収集する時間に依存
する。

【０１０２】 3つの発生進行期を、割球、胎児および子孫で、導入遺伝子の存在について分
析できる。割球では、従来のPCR分析は、非組込遊離型外因性DNAと組込導入遺伝
子を区別できない。割球での正しい組込を判定するためには、FISHまたはインサ
イチューPCRが必要である。どちらの方法も、標的細胞ゲノム内の導入遺伝子の
位置を正確に定義できる。インサイチューPCRの利点は、シグナルの増幅であり
、これは次にFISHによって検出できる。成功した組込の場合、FISHシグナルの局
在化は核DNAの位置に相当する。

【０１０３】胎児段階において、非組込遊離型外因性DNAは分解されているため、PCR分析の
信頼性はさらに高くなる。子孫では、非組込遊離型外因性DNAは存在しないため
、PCRは信頼性の高い、トランスジェネシス導入遺伝子のスクリーニング方法で
あり、組込はさらにサザンブロット分析によって確認できる。トランスジェネシ
スが完全に成功したことは、インサイチューPCRとサザンブロッティングによっ
て示される。

【０１０４】トランスジェネシスの成功は、着床前期の生胚に対する直接微光レベルGFP蛍
光によって確認できる。GFP発現が検出限界未満のレベルで発生するかどうか、
または不正なフォールディングまたは誤発現が発生したかどうかを判定するため
に、GFPへのモノクローナル抗体を使用して、直接GFP蛍光を防止しない蛍光団を
用いた間接免疫細胞化学によって、個々の割球を検査する。単一細胞（すなわち
割球）PCRを用いて、GFP導入遺伝子の存在を判定し、シグナルが消失している場
合には、破壊の頻度と時間フレームを決定する。最後に、発生の常態は、細胞内
構造（すなわち細胞骨格および膜内プローブ）のマーカーと同様に、利用可能な
細胞周期チェックポイントマーカー（すなわちDNA複製、減数分裂および細胞質
分裂）を用いて評価できる。

【０１０５】本発明の別の態様は、キメラ構築によるトランスジェニック動物の産生に関す
る。キメラは異なる遺伝子起源の細胞で構成されるモザイク生物である。一般に
、複数の胚の割球が完全に分解し、次に異なる胚からの割球が再集合し、さらに
胚盤胞期まで発生する。集合キメラは、1つの種内だけでなく（Gardner、6 ADV.
BIOSCI.279〜301、1971；Stevens、276 NATURE 266〜67、1978；SternおよびWil
son、28 J.EMBRYOL.EXP.MORPHOL.247〜54、1972）、種の間でも（Fehillyら、19
84）首尾よく産生され、生きた子孫を生じた。キメラを構築する場合、考えられ
る発生の異常を回避するために、同じ性の割球を使用する必要がある。生存可能
であるが、性が混合したキメラによって子孫の男性化が発生することは避けられ
ない（Patekら、1991）。1個のXY含有割球によって、XX胚では異なるが、男性化
と精巣決定が生じ（Koopmanら、1990）、予想表現型が変化する。主にXY胚にXX
割球が存在すると、精巣形成とその後の繁殖性を損なう。キメラを作製する場合
、同胞胚からの割球の混合により、遺伝子のモザイク現象が発生することは避け
られない。異なる割球は異なる挿入部位の導入遺伝子を含むことができる。たと
えば、肝臓が1個の割球に由来する場合、すべての肝臓細胞は（FISHまたはイン
サイチューPCRによって）同一の導入遺伝子局在化を示すはずである。他方、肝
臓が同胞胚による2つ以上の割球から発生した場合、導入遺伝子は異なる肝臓細
胞の異なる染色体または染色体部位に局在化する。プラスミドの組込と遺伝子発
現は精子を介した移入を用いてランダムであるため、胚における「トランスジェ
ネシス」のレベルは、キメラの作製によって上昇する。

【０１０６】トランスジェニック子孫は、当業者に周知の複数の方法のいずれかによって検
出できる。限定しない例には、少なくとも導入遺伝子の一部に相補性であるプロ
ーブを使用する、サザンブロットまたはノザンブロット分析が含まれる。導入遺
伝子によってコードされるタンパク質に対する抗体を使用するウェスタンブロッ
ト分析は、導入遺伝子生成物の存在をスクリーニングする代わりまたは追加の方
法として採用してもよい。DNA試料は組織または細胞から調製し、導入遺伝子の
発現をPCRで分析する。

【０１０７】導入遺伝子の存在を評価する代替または追加の方法は、制限なく、酵素および
／または免疫学アッセイ法などの生化学アッセイ法、特定のマーカーまたは酵素
活性に関する組織的染色、フローサイトメトリー分析、mRNA分析のインサイチュ
ーハイブリダイゼーション、タンパク質発現のFACS分析が含まれる。血液の分析
も、各種の血液細胞および他の血液構成要素のレベルに対する導入遺伝子の効果
を評価するのと同様に、血液中の導入遺伝子産生物の存在を検出するのに有用で
ある。

【０１０８】動物細胞も、たとえば組織切片を調製することによって直接分析される。ある
態様において、（たとえばパラホルムアルデヒドまたはホルマリンによって）組
織を固定することが好ましい。組織切片は凍結させて調製するか、パラフィンに
埋め込んでもよい。動物組織のスライドは、免疫組織化学、インビトロハイブリ
ダイゼーションまたは組織学（たとえばヘマトキシリンおよびエオシン染色）に
使用できる。

【０１０９】霊長類に由来するトランスジェニック細胞、遺伝子的に同一の細胞および幹細
胞は、多くの疾患（たとえば老化、AIDS、癌、アルツハイマー病、自己免疫疾患
、代謝障害、肥満、器官形成、精神病および生殖）の研究にとって非常に貴重で
ある。さらに、分子薬に対するこれらの細胞の重要性および遺伝子治療プロトコ
ールの革新的な戦略の発展は、軽視されるべきではない。たとえば臨床戦略には
、クローニング、補助生殖技術、トランスジェネシス、ならびに分化全能および
不死化胚芽（EG）および幹細胞（ES）の使用が含まれる。加えて、同一性、トラ
ンスジェニック、および／もしくは不死化分化全能性のEGまたはES由来細胞は、
不妊症、配偶子形成、避妊、補助生殖、不妊の遺伝子的基礎、雄対雌の減数分裂
細胞周期の調節、再生老化および特発性不妊の非エンドクリンベースに関連する
、分子的事象を識別する理想的な臨床前モデルである。

【０１１０】これらのトランスジェニック技術は、ヒト発生、特に着床前および着床後発生
、体軸特異化、体細胞形成、器官形成、インプリンティング、胚外膜配置および
多能性の研究にも利用できる。トランスジェニックリポーターの動的非観血式画
像化を使用すると、霊長類胎児内の細胞配置が妊娠期間と寿命を通じて識別され
る。疾患機構を発見し、分子医学治療を作製および最適化するために、クローニ
ングおよびトランスジェネシスも使用できる。たとえば、特定の遺伝子の遺伝子
ノックアウトを用いて作製されたサルにより、癌、動脈硬化を引き起こす心疾患
および脳卒中、先天的代謝障害および他の胎児ならびに新生児疾患、パーキンソ
ン病、腎多嚢胞病、盲目、聴覚障害、感覚障害、記憶疾患（Lesch-NyanおよびZe
llwegers）および嚢胞性線維症に対する治療法の発見が促進される。これらのト
ランスジェニック動物は、糖尿病、肝臓損傷、腎臓疾患、人工臓器開発、創傷治
癒、心臓発作による損傷、脳卒中後の脳損傷、脊髄損傷、記憶損失、アルツハイ
マー病および他の痴呆、筋肉および神経損傷を含む細胞療法の評価および改良に
も使用することができる。

【０１１１】したがって、本発明は、ヒトの疾患を治療するためにトランスジェニック胚細
胞を使用する方法にも関する。詳細には、本明細書で述べるトランスジェニック
動物およびトランスジェニック霊長類の産生方法は、トランスジェニック胚性幹
細胞の作製にも使用できる。

【０１１２】簡単には、受精後、卵は数日間にわたって分割し、胚盤胞を形成する。胚盤胞
は通常、どちらも栄養膜細胞の層でカプセル化された、内部細胞塊と液体で満た
された空洞を有する細胞の中空球である。胚（すなわち胚盤胞）の内部細胞塊か
らの細胞を用いて、胚性幹細胞（ES）細胞と呼ばれる細胞系を誘導し、これらの
細胞は組織細胞にて維持できる（たとえばSchuldinerら、97 PROC.NATL.ACAD.SC
I.USA 11307〜12、2000；Amitら、15 DEV.BIOL.271〜78、2000；米国特許第5,84
3,789号；米国特許第5,874,301号を参照）。一般に、幹細胞は比較的未分化であ
るが、分化した機能細胞を生じさせる。たとえば、造血幹細胞は赤血球および白
血球などの末端分化血液細胞を生じさせる。

【０１１３】本発明で記載される方法（たとえばトランスジェンICSI、レトロウイルス遺伝
子移入）を用いると、特定の疾患に関連する遺伝子を発現する、トランスジェニ
ック霊長類胚性幹細胞が産生される。たとえば、トランスジェニック霊長類胚性
幹細胞は、ドーパミンの生合成経路に関与する酵素であるチロシンヒドロキシラ
ーゼを発現するように作製される。パーキンソン病では、この神経伝達物質が脳
の脳幹神経節領域で枯渇している。したがって、チロシンヒドロキシラーゼを発
現するトランスジェニック霊長類胚性幹細胞を、パーキンソン病に罹患している
患者の脳幹神経節領域に移植すると、神経レベルのドーパミンが潜在的に復元さ
れる（たとえばBankiewiczら、144 EXP.NEUROL.147〜56、1997を参照）。したが
って、本発明で記載されている方法は、多くのヒト疾患を治療するのに用いられ
る（Rathjenら、10 REPROD.FERTIL.DEV.31〜47、1998；Guanら、16 ALTEX 135〜
41、1999；Roviraら、96 BLOOD 4111〜117、2000；Mullerら、14 FASEB J.2540
〜48、2000）。

【０１１４】特定のヒト疾患のモデルを開発するために、以下の段階によってトランスジェ
ニックサルを作製することができる：1）遺伝子系伝達を示すトランスジェニッ
クサルの産生、2）サル子孫クローンの産生、3）多能性細胞系の確立およびキメ
ラ霊長類の作製、4）妊娠、トランスジェネシス効率および胎児ならびに子孫の
結果をモニタリングする、非観血式手順の開発、5）特定の遺伝子のノックアウ
トを作製するための、相同組換えの開発、6）ヒト疾患を打倒するための同一の
霊長類の作製（たとえば乳癌および卵巣癌をモデル化するHer-2またはBRCA-1/2
ノックアウト）、7）すべての生殖可能性を保持するとともに、安価な記録保管
を可能にする、配偶子、生殖腺および胚保管手順の開発、8）未感染霊長類をオ
ンサイトとオフサイトの両方で増殖させる手順の開発。

【０１１５】実施例本発明は、いかなる方法でも制限的であると解釈すべきではない以下の実施例
によってさらに例示される。本出願全体で引用された、（文献参照、発行済みの
特許、公開された特許出願および同時係属中の出願を含む）すべての引用参考文
献の内容は、参照として本明細書に明示的に組み入れられる。

【０１１６】実施例1. トランスジェンICSI手順精子表面に結合したDNAを送達する利点のひとつは、外因性DNAが任意の大きさ
でよいことである。線形DNA構築物は、前核注入後により高い遺伝子組込効率を
示す（Brinsterら、82 PROC.NATL.ACAD.SCI.USA 4438〜42、1985）。外因性DNA
を直線化する独自の制限酵素によって、脱縮合された精子核クロマチンを処理す
ると、適合性切断部位が作製される。外因性DNAの組込は、ランダム事象と考え
られ、DNA開裂に依存する。適合性切断部位の作製により、線形外因性DNAに適合
性の、部分的非ランダム組込部位が与えられて、組込事象が増加する。DNA組込
後の精子の評価は、PCRおよびインサイチューPCRによって行う。PCR手法は、遊
離DNAと組込DNAを区別しないため、十分な方法ではないかもしれない。したがっ
てインサイチューPCRは、クロマチン内での導入遺伝子の位置を示すことができ
る代替の方法である。残留プラスミドDNAは卵母細胞表面から洗い落とされ、PCR
分析用に核DNAを抽出する前に、ローダミンシグナルは共焦点顕微鏡法でモニタ
リングされる。各割球で外因性DNAの存在を確認するために、各割球を単離して
、PCRで分析した。

【０１１７】精子の収集と調製アカゲザルの精液はプラスミドDNA標識に使用した。生殖力が証明されたアカ
ゲザルの雄を、ペニス電気射精により許容できる精液試料を日常的に生成するよ
う訓練した（Bavisterら、28、BIOL.REPROD.983〜99、1983）。凝固した射精物
を液化した後、液体精子を5mlのTALP-HEPES中で400xgにて5分間遠心分離にかけ
て洗浄した。1mlのTALP-HEPES中でペレットを再懸濁した後、少量の試料を構造
分析用に取り除き、残りは計数し、15ml円錐管内で、平衡にしたTALP（1ml）中
で20x10⁶精子/mlの濃度まで希釈した。

【０１１８】プラスミドの作製緑色蛍光タンパク質（GFP）cDNAおよびローダミン結合部位を含む、プラスミ
ドDNAは、サイトメガロウイルス（CMV）プロモーターの制御下で構築した（ジー
ンセラピーシステムズ、サンディエゴ、カリフォルニア州）。プラスミドDNAの
ローダミン標識は、製造者が説明するとおりに行った。

【０１１９】 CMVプロモーターの制御下にあるGFPcDNAを用いた。CMVプロモーターは、トラ
ンスジェニックの研究で広く使用されている強力なウイルスプロモーターである
ため使用した。特異性は欠いているが、その構成性発現パターンは遺伝子送達効
率を評価する際に利点を有する。GFPトランスジェニックリポーターの使用は、
外因性DNAを卵母細胞および胚に正しく送達されたことを判定するための、強力
なツールである。蛍光顕微鏡が必要であるが、GFP選択後のトランスジェニック
マウスの作製成功によって、胚および胎児の発生への効果は限定されているか、
ほとんどないことが示唆される。

【０１２０】蛍光DNAマーカー、DNAへのローダミン結合の使用によって、ICSIと同様に、IV
F中のDNAの動態を生で画像化できる。共焦点および従来型のデジタル画像化によ
って、精子が卵の細胞質に入った後の外因性DNAの運命と同様に、DNAの精子への
結合が確認される。ローダミンは、長波長（したがって破壊的な低いエネルギー
が少ない）赤色光による励起、ローダミンDNA蛍光とGFP導入遺伝子発現から予想
される緑色蛍光との混同の回避を含む、複数の理由によって選択された。

【０１２１】精子核の調製およびDNA結合外因性DNAの精子核内へのインターナリゼーションおよび精子ゲノム内への組
込を向上させるために、アカゲザル精子核にインビトロ脱縮合を行い、制限酵素
で処理して、外因性DNAおよび精子ゲノムの両方に切れ目を作製した。適合性切
断部位を作製するために、制限酵素を用いてDNA構築物を線形にし、脱縮合精子
核クロマチンを切断した。

【０１２２】アカゲザル精子の運動性画分は、45：90％パーコール（Percoll）濃度勾配で7
00xgにて10分間回転させて単離した。ペレットは20℃にて、KMT培地（100mM KCl
、2mM MgCl₂、10mM Tris-HCl（pH7.0）および5mM EGTA）中で、5μg/mlのリゾレ
シチンで再懸濁し、次にKMT中の3％BSAで10分間すすいだ。精子は次に、KMT中の
5mM DTT（pH8.2）を用いて37℃にて1時間処理し、次にKMTで3回洗浄した。洗浄
後、DTT処理精子は、DNAプラスミドと共にインキュベートした。標識精子は、DN
A制限酵素Pvu Iを含む解凍抽出物（約1000精子/μl）で1：10に希釈した。抽出
物：精子混合物を37℃にて1時間インキュベートした。

【０１２３】脱縮合精子核（直径約9〜10μm）は、抽出物1：10をPipes緩衝液（80mM Pipes
（pH6.8）、5mM EGTA、1mM MgCl₂）で希釈し、卵母細胞に隣接する油の下約10μ
lを配置することによって単離した。次にICSIを実施したが、大きくなった精子
核のサイズに適合させるために、直径がわずかに大きいICSI針を用いた。注入精
子が卵母細胞の活性化を開始させ、父系ゲノムではなくおそらく精子中心体に寄
与さえする場合、単為発生は、胚の性比率、すなわち雄胚の出現率と同様にモニ
タリングされた。

【０１２４】外因性DNAの精子への結合精子は、ローダミンと結合したGFPcDNAをコードするプラスミドDNAによって標
識した（ジーンセラピーシステム、サンディエゴ、カリフォルニア州）。精子（
1x10⁶/14μl）は、500ng（1μl）のプラスミドDNA（Rh-CMV-GPF）と混合し、37
℃にて30分間インキュベートした。標識精子をTALP-HEPES緩衝液中で洗浄および
3回遠心分離した後、蛍光顕微鏡画像化を行ってから、次に細胞内精子注入で使
用した。DNA結合精子のトリプシン処理は、リン酸緩衝生理的食塩水中の2mg/ml
のトリプシン（シグマ、セントルイス）によって、洗浄前に30分間インキュベー
トして行った。ローダミン標識プラスミドDNAは精子に貪欲に結合し、動的蛍光
マーカーとして作用した（図1A〜1C）。

【０１２５】アフリカツメガエル卵抽出物を用いた無細胞精子核脱縮合プラスミド結合効率を向上させるために、精子核をアフリカツメガエル無細胞
抽出物に暴露した。アフリカツメガエル無細胞抽出物はMurrayに従って調製した
（36 METH. CELL BIOL. 581〜605、1991）。アフリカツメガエル卵母細胞は、第
1日目にX.リービス（X.laevis）の背側リンパに100I.U.PMSGを注入して、成熟ま
で誘発した。第4日目に500I.U.hCGの第2回注入は、雌の産卵を誘発した。MMR培
地中に産卵された卵は、hCG注入の10〜12時間後に収集した。MMR中ですすいで細
片を除去し、卵はシステイン脱ゼリー化溶液（100mM KCl、0.1mM CaCl₂、1mM Mg
Cl₂および2％w/v L-システイン、pH7.8）に6分間暴露して、脱ゼリー化した。0.
2xMMRで2回すすいだ後、卵をXB（抽出緩衝液：100mM KCl、0.1mM CaCl₂、1mM Mg
Cl₂、10mM HEPES（pH7.8）、50mMショ糖および5mM EGTA）で4回すすぎ、プロテ
アーゼ阻害剤のロイペプチン、キモスタチンおよびペプスタチンA（それぞれ10
μg/ml）を含むXBでさらに2回すすいだ。卵は、（ゲル化を防止するために）プ
ロテアーゼ阻害剤および100μg/mlのサイトカラシンBを含む最小体積のXBによっ
て遠心管に移した。卵はベックマンSW28ロータ内で2000rpmでの2分間の遠心分離
中にパックされ、過剰な緩衝液およびVersalubeを除去した。次に卵に対して、S
W28ロータ内で20,000rpmにて、20分間の層状化遠心分離工程を行った。UltraCle
ar（商標）遠心管の側面に穴をあけて、細胞質層を除去した。細胞質抽出物は次
に、サイトカラシンBおよびプロテアーゼ阻害剤を含む「エナジーミックス」（1
50mM リン酸クレアチン、20mM ATP（pH7.4）、2mM EGTA（pH7.7）および20mM Mg
Cl₂：5μl/100μl抽出物）によって強化した。凍結する場合、ショ糖を最終濃度
200mMとなるように抽出物に加え、分割量を液体窒素中で瞬間凍結し、-70℃で保
存した。

【０１２６】アカゲザル卵胞の刺激規則的な月経周期を示す雌のアカゲザルの過剰刺激は、外因性ゴナドトロピン
によって誘発した（Zelinski-Wootenら、51 HUM.REPROD.433〜40、1995；Mengら
、57 BIOL.REPROD.454〜459、1997；Hewitsonら、13 HUM.REPROD.3449〜55、199
8）。月経時に開始し、雌はGnRH抗体（アンタイド；エリアズセロノ、オーボン
ヌ、スイス、0.5mg/kg体重、s.c.）を用いて6日間ダウンレギュレートし、その
間、組換えヒトFSH（r-hFSH；オルガノン社、ウェストオレンジ、ニュージャー
ジー；30IU、i.m.）を1日2回投与し、次にr-hFSH＋r-hLH（r-hLH、エリアズセロ
ノ、それぞれ30IU、i.m.、1日2回）を1、2または3日続けた。十分な卵胞反応を
確認するために、第7日目に超音波検査を実施した。r-hCG（セロノ、ランドルフ
、マサチューセッツ；1000IU）は、卵胞が3〜4mmの場合に、排卵させるために投
与する。

【０１２７】腹腔鏡検査法によるアカゲザル卵胞吸引卵胞吸引はｈＣＧ投与の２７時間後に実施した。テフロン（登録商標）管で裏
打ちした針吸引器具を用いて、卵母細胞を卵胞から吸引した（Ｒｅｎｏｕら、３
５ＦＥＲＴＩＬ．ＳＴＥＲＩＬ．４０９〜１２、１９８１、およびＢａｖｉｓ
ｔｅｒら、１９８３によって変更された）。約４０〜６０ｍｍＨｇの圧力で連続
真空によって、複数の個別の卵胞を、ヘパリン処理した血液収集管内に吸引した
。収集管は、卵母細胞の収集および成熟期の評価のため、ただちに専用の霊長類
卵母細胞／接合子研究所に運んだ。

【０１２８】アカゲザル卵母細胞の収集および評価各収集管の内容物は、2mg/ml ヒアルロニダーゼを補充したTALP-HEPESで希釈
した。卵母細胞はすすいだ後、成熟状態の評価前に、3mg/ml BSA（CMRL-BSA）を
含み、10μg/ml ブタFSHおよび10IU/ml hCGを補充した予備平衡CMRL培地に移し
た。拡張した卵丘細胞、明確な卵黄周囲腔および第1極体を示す中期II停止卵母
細胞を、CMRL-BSA中で受精の最大8時間前まで維持した。未成熟卵母細胞は、CMR
L-BSAおよびホルモン中で最大24時間まで成熟させた（Bavisterら、1983；BOATM
AN、「非ヒト霊長類の前および周辺移植胚のインビトロにおける成長（IN VITRO
GROWTH OF NON-HUMAN PRIMATE PRE-AND-PERI IMPLANTATION EMBRYOS）」273〜3
08（B.D.Bavister編、Plenum Press 1987））。

【０１２９】細胞内精子注入保持ピペット（外径100μm、内径20μm）および50°の斜角と短く鋭い先端部
を有する微量注入針（外径6〜7μmおよび内径4〜5μm）（ヒューマジェン社.、
シャーロッツビル、バージニア州）を、ホフマン変調対比（HMC）オプティクス
を装備したニコンダイアフォト顕微鏡に取付けた。保持ピペットは、ハミルトン
注射器に取付けたナリシギ（MN-151）マニピュレータ内に保持した。注入ピペッ
トは、ナリシギ（IM-6）注入システムに連結された電動エッペンドルフ（5170）
マイクロマニピュレータに取付けた。注入は、100mmの組織培養皿に入れ、軽鉱
油で覆った100μlのTALP-HEPES中で32℃にて行った。（Hewitsonら、55 BIOL.RE
PROD.271〜80、1996；Hewitsonら、1998）。受精能を獲得し、過剰活性化された
精子は、10％ポリビニルピロリドン（PVP）で1：10に希釈した。精子PVP液滴か
ら1個の精子を微量注入針内に尾から最初に吸引し、卵母細胞含有液滴に移した
。卵母細胞は極体によって12時に固定化し、微量注入針を透明帯経由で細胞質内
に挿入した。透明帯は、精子が卵母細胞内に再度放出された時に、細胞質を静か
に吸引することによって破られた。微量注入された卵母細胞は、1個の精子が細
胞質内に存在することを確認するために、40倍のHMC対物鏡を用いて検査した。

【０１３０】ICSI時の間のDNA結合精子の動的画像化画像は、プリンストンCCDカメラおよびメタモルフソフトウェア（ユニバーサ
ルイメージング、ウェストチェスター、ペンシルバニア州）を装備した、反転TE
-300ニコン顕微鏡で捕捉した。最終画像は、アドビフォトショップ（アドビシス
テムズ社、マウンテンビュー、カリフォルニア州）を用いて作製した。ローダミ
ン標識DNAは、微量注入した精子表面にICSI後に留まっていた（図1Dおよび1E）
。

【０１３１】トランスジェンICSI卵母細胞および胚の培養卵母細胞は平衡TALP中で洗浄し、培養するため、油の下の100μl TALP中に戻
した。受精は3〜6時間以内に、HMCオプティクスを用いて第2極体を検出すること
によって評価した。前核の数は、注入の12〜16時間後に評価した。第1卵割分裂
（注入の24〜28時間後）の完了後、2細胞胚を、油被覆した100μl中に播種した
バッファローラット肝臓細胞単層（BRL 1442、ATCC、ロックビル、メリーランド
州）上でCMRL＋10％FCS（ハイクローンラボラトリーズ社、ローガン、ユタ州）
中にて同時培養した。胚は計画されたレシピエントに移入するために、3〜16細
胞期に選択した。

【０１３２】胚の移植卵ドナーと同調した正常な月経周期を持つアカゲザルの雌は、潜在的な胚レシ
ピエントとしてスクリーニングした。スクリーニングは、月経周期の第8日目（
月経の最初の日を第1日とする）から毎日血液試料を収集し、血清プロゲステロ
ンおよびエストロゲンを分析した。排卵の時期は、血清エストロゲンの著しい減
少と、血清プロゲステロンの1ng/mlを超える増加によって検出した。外科的な胚
移植は第2日目または第3日目に、腹側中部開腹術によって、レシピエントの卵管
内へ行った。卵管はカニューレ処置し、2個の4〜8細胞期の胚を細いカテーテル
経由で移植した。

【０１３３】着床を確認するために、血液試料を毎日収集し、血清エストロゲンおよびプロ
ゲステロンを分析し（Lanzendorfら、42 BIOL.REPROD.703〜11、1990）、妊娠は
移植後第35日目に超音波検査によって確認した。超音波検査の間、胎児全長、大
腿骨長、頭囲、胎児の心活動、卵嚢のサイズの測定を行った。超音波は第2トリ
メスターの間、発生常態を判定するためにもう1回行った。十分なエストロゲン
およびプロゲステロンレベルを維持していたが、超音波検査によって妊娠してい
ないと見なされたレシピエントでは、LHバイオアッセイ法で測定された血清サル
絨毛性ゴナドトロピン（mCG）について血液試料を分析した（EllinwoodおよびRe
sko、22 BIOL.REPROD.955〜63、1980）。

【０１３４】出生および乳児アカゲザルは時々、子癇前症を経験し、出生時の合併症によって新生児が失わ
れることがあるため、乳児は妊娠の約155日目に帝王切開によって分娩させた。
乳児は身体測定し、頭囲を記録した後、母ザルが手術から開腹するまで保育器に
入れた。乳児は母親に再移植する前に、胎盤血を塗ったため、拒絶反応の可能性
は最小限となった。胎盤組織の一部を収集し、トランスジェネシスについて検査
した。乳児は6ヶ月の離乳時まで母親と一緒にしておいた。子孫の組織は生検に
よって収集し、トランスジェネシスについて検査した。

【０１３５】生の、デジタル微光レベルエピ蛍光画像化による胚GFP導入遺伝子発現の検出生きた胚は、FITCフィルタおよびプリンストンCCDカメラを装備したニコンTE-
300反転マイクロスコープによって画像化した。画像はメタモルフソフトウェア
（ユニバーサルイメージング、ウェストチェスター、ペンシルバニア州）によっ
て捕捉および分析した。

【０１３６】免疫細胞化学による胚GFP導入遺伝子発現の検出 GFP発現を検出するために、選択した胚はポリクローナルウサギ抗GFP抗体（ク
ロンテック、カリフォルニア）によって固定および免疫染色した。0.5％プロナ
ーゼによって透明帯を除去した後、胚をポリリジン被覆カバースリップに付着さ
せ、TALP-HEPES中の2％ホルムアルデヒド中で1時間固定した。固定した胚は、2
％トリトンX-100洗浄剤を含む0.1M PBS中で40分間、透過化処理し、続いて150mM
グリシンおよび3mg/BSAを含むPBS阻害溶液中で30分間インキュベートした。1次G
FP抗体をPBS中で1：100に希釈し、37℃にて、1時間適用した。0.1％トリトン洗
浄剤を含むPBS中で30分間洗浄した後、ローダミン結合抗ラビットIgG2次抗体を
用いて、GPF1次抗体を検出した。DNAは、最後から2番目のすすぎ液および胚に添
加した5μg/ml ヘキスト33342によって標識した。次に試料をベクタシールドア
ンチフェード（ベクターラボズ、カリフォルニア州）に置き、適切なフィルタと
高数値の口径の対物レンズを備えたツァイスアキシフォトエピ蛍光顕微鏡によっ
て検査した。

【０１３７】PCRによるアカゲザル組織中の導入遺伝子の検出 2つの死産からの組織を収集し、DNA抽出まで-20℃にて保管した。血液から収
集した黄褐色の被覆は、PMN分離溶媒（ロビンズサイエンティフィック社）を用
いて、遠心分離によって分離した。DNAはプロテイナーゼK、続いてフェノールク
ロロホルム抽出によって抽出した。エタノール沈殿の後、DNAペレットをTris-ED
TA緩衝液（pH8.0）中で再懸濁した。ゲノムDNA（1mg）は、GFP特異性プライマー
セットを用いたPCR分析に使用した。 DNA混合物は、200mMのdNTP（ファルマシア）、1.0mMの各プライマー、1.5mMのMg
Cl₂、0.1体積の10x反応緩衝液、および1単位のTaq DNAポリメラーゼ（プロメガ
、マディソン、ウィスコンシン州）を含んでいた。増幅サイクルは、94℃で5分
間、続いて94℃で2分間、60℃で2分間、72℃で2分間を30サイクルであった。PCR
生成物は2％アガロースゲル上で分離した。

【０１３８】DNA複製の検出 DNA合成は、ブロモデオキシウリジン（BrdU、ベーリンガーマンハイム社、イ
ンディアナ州）を用いて、固定後、あるいは生きた卵母細胞または胚にオレゴン
グリーンdUTP（モルキュラープローブス、オレゴン州）の微量注入後に決定した
。トランスジェンICSI後の最初の1時間以内に、卵母細胞を50μMのBrdUを含むTA
LPに移すか、1μMのオレゴングリーンdUTPを用いて微量注入した。37℃にて適切
な段階までインビトロ培養した後、胚は、エピ蛍光または共焦点顕微鏡で検査す
るために、透過化処理して-20℃にて20分間固定する（50mMグリシン緩衝液中の7
0％エタノール pH2.0）か、生きた胚としてスライド上に配置した。固定された
胚では、BrdUは、BrdU（ベーリンガー）に対するマウスIgGモノクローナル抗体
（6μg/ml）によって標識し、フルオレセイン結合ヤギ抗マウスIgG2次抗体の1：
50希釈によって検出した。DNAは最後から2番目のPBSすすぎ液中で5μg/ml ヘキ
スト33342によって標識し、BrdUの含有についてスライドを観察した。1μM オレ
ゴングリーンdUTPを用いた微量注入後の、生きた胚でのDNA合成は、Carrollら（
206 DEV.BIOL.232〜47、1999）で述べられているように、従来型のエピ蛍光また
は共焦点顕微鏡法によって検出した。簡潔には、トランスジェンICSI胚のDNAに
含有されない遊離オレゴングリーンdUTPヌクレオチドは、高強度蛍光（〜488nm
）を用いた、核付近の細胞質部位の光退色によって減少した。光退色の後、含有
されなかったオレゴングリーンdUTPは、DNA合成を示している、DNA結合オレゴン
グリーンdUTPを含む鮮やかな蛍光の核よりも、はっきりしていない。核蛍光の画
像は、冷却したCCDカメラか、共焦点顕微鏡の光検出器によって捕捉した。

【０１３９】有糸分裂の検出 TALP-HEPES中で調製した0.5％プロナーゼで2〜7分インキュベートして、接合
子および胚から透明帯を除去した。37℃にて30分間回復させた後、透明帯を含ま
ない卵母細胞をポリリジン被覆カバースリップに付着させ、3％トリトンX-100洗
剤および8％メタノールを含む緩衝液M（SimerlyおよびSchatten、225 METH.ENZY
MOL.516〜52、1993）中で10分間透過化処理した。透過化処理した接合子はさら
に冷（-10℃）無水メタノール中で20分間固定してから、0.1％トリトンを含む0.
1M PBSによって再水和した。微小管局在化は、多くの種によるβ-チューブリン
に対する広範な交差反応性を持つ、E-7（1：5）、β-チューブリンに対するマウ
スモノクローナル抗体を用いて実施した（ChuおよびKlymkowsky、8 FIRST INTER
.SYMP.CYTOSKEL.DEV.140〜42、1987）。E-7抗体は、ローダミンまたはCy5標識ヤ
ギ抗マウスIgG2次抗体（ザイメッドラボラトリーズ社、サンフランシスコ、カリ
フォルニア州）を用いて検出した。GFPの発現を検出するために、市販のウサギ
ポリクローナル抗GFP抗体を製造者の指示に従って使用した（1：100；Clontech
、カリフォルニア州）。1次抗体は0.1％トリトンを含むPBSによってすすぐ前に3
7℃にて40分間適用した。ローダミンまたはCy5に結合したヤギ抗ウサギIgG2次抗
体を用いて、抗GFP1次抗体を検出した。DNAは、最後から2番目のすすぎ液に加え
た5μg/ml ヘキスト33342によって、蛍光的に検出した。カバースリップをベク
タシールドに取付け、従来型の免疫蛍光およびレーザー走査共焦点顕微鏡法を用
いて検査した。

【０１４０】トランスジェンICSIによって産生された胚は、培養時のさまざまな時間に蛍光
顕微鏡法で検査した。GFP cDNAは、強力なウイルス性プロモーターであり、核発
生時に構成的に発現されると思われるCMVプロモーターによって制御される。胚
がPCR陽性であるが、GFP発現が検出されない場合、RT-PCRを用いて、胚中の転写
機構が活性であるかどうか判断した。

【０１４１】RT-PCRによるGFP発現の検出トランスジェンICSIの後、個々の胚をPBSで洗浄し、5μlのDEPC処理水が入っ
た0.2ml薄壁微量遠心分離管に移した。次の増幅工程用のcDNA鋳型を作製するた
めに、オリゴ-d（T）プライマーを逆転写反応（RT）で使用した。次にRT-PCR生
成物がPCRによって増幅される。簡潔に言えば、156bpの断片が得られる、GFP用
の特異性プライマーセット、 GFP＃1：およびGFP＃2：を使用した。PCR反応は最終体積50μlで実施した。5μlのTris-EDTA緩衝液（pH8
.0）中の約1μgのゲノムDNAおよび1ngのプラスミドDNAを鋳型として使用した。4
5マイクロリットル（45μl）のPCR反応混合物（200μM dNTP、1.0μMの各プライ
マー、1.5mM MgCl₂、0.1体積の10x反応緩衝液および1U Taqポリメラーゼ）を各
試料に加えた。サイクルは、94℃で2分間、50℃で2分間および72℃で2分間であ
った。30サイクルの後、PCR生成物は2％アガロースゲル上の電気泳動によって分
離した。

【０１４２】従来型および共焦点免疫蛍光胚は、従来型の免疫蛍光およびレーザー走査共焦点顕微鏡法の両方を用いて検
査した。従来型の蛍光顕微鏡法は、光退色が無視できるため、高数値口径の対物
レンズを用いたツァイスアクシフォト顕微鏡を用いて行った。データは白黒Tri-
Xおよびカラーエクタクロムフィルムを用いて収集し、次に冷却したCCDカメラ（
プリンストンインスツルメンツ社、トレトン、ニュージャージー州）を用いてデ
ジタル記録した。レーザー走査共焦点顕微鏡法は次に、フルオレセイン、ローダ
ミン、Cy-5およびUVの同時励起用のクリプトン-アルゴン/ヘリウム-ネオンレー
ザーを備えた、ライカTCS-NTを用いて行った。共焦点顕微鏡は、胚盤胞の内部細
胞塊（ICM）および栄養外胚葉（TE）細胞の正確な画像を提供する。デジタル画
像はジャズディスクに記録および保管した。デジタルデータは、アドビフォトシ
ョップ（アドビシステムズ社、マウンテンビュー、カリフォルニア州）を用いて
、色素昇華型プリンタ（ソニー）にダウンロードした。測定および分析はメタモ
ルフソフトウェア（ユニバーサルイメージング、ウェストチェスター、ペンシル
バニア州）および画像分析プログラムであるNIHイメージを用いて行った。

【０１４３】アカゲザル胚性幹細胞の確立透明帯は、インビトロ生成されたGFP感染2細胞アカゲザル胚からプロナーゼに
よって除去した。透明帯のない胚を2回洗浄した。各胚は、マイトマイシン処理
マウス胎性繊維芽細胞（MFF）、および15％の熱処理ウシ胎児血清を補充した5μ
lのCRlaaを含む72マイクロウェルプレートに移した。コロニーの大きさが、マイ
トマイシン処理MFFを含む35mm皿に移せるほど濃くなるまで、培地を毎日交換し
た。培地は15％FBSおよび0.1mM β-メルカプトエタノールを補充したDMEMに変更
した。培地は次に1日または2日おきに交換し、コロニーの選択領域を鋭いピペッ
トで切断し、新しい不活性化MFF層に塗った。

【０１４４】胎児による1次細胞培養物の確立 1次培養物は、確立された細胞培養プロトコールにしたがって、3つすべての胚
葉から発生した胎性組織から確立した。組織は滅菌条件下ではさみを用いて刻み
、0.25％トリプシン-EDTAに移し、37℃にて1時間インキュベートした。分解した
細胞を組織培養フラスコに移し、DMEM中で培養し、10％FCSを補充した。

【０１４５】実施例2. 遺伝子導入ICSIでのDNA組込アカゲザル胎児および子孫から採取した組織のPCR解析有核の血液細胞、出産時の胎盤、および３の胚葉由来の組織からDNAを抽出し
た。血液をヘパリン処理した管で回収し、2500 x g、4℃で15分間遠心した。白
血球を含む軟膜を15ml円錐管に移した。皮膚組織をハサミで切り刻んで15ml円錐
管に移した。２倍量の低張溶解緩衝液（150mM NH₄Cl、10 mM KHCO₃、10mM Na₂-E
DTA）を加えて赤血球を溶解した。30秒2500 x gで遠心後、上清を捨て、その過
程を赤血球が取り除かれるまで繰り返えした。そして、白血球または切り刻まれ
た組織を3ml塩消化緩衝液 (10mM Tris-HCl、400 mM NaCl、 2%SDS、50mM EDTA、
pH 8.0）に再懸濁した。プロテイナーゼＫ（50μl; 10mg/ml）およびトリプシン
（70μl; 5mg/ml）を加えて、サンプルをボルテックスし、組織が溶解するまで
（2〜4時間）50℃で振盪（150rpm）し、インキュベーションした。消化後、RNA
分解酵素(100U)を加えて、試料を50℃で１時間振盪（150rpm）してインキュベー
トした。３分の１量の5M NaClを加えて、管を反転して試料を混合し、3,000 x g
で30分間遠心した。上清を取り除いて2倍量の95%エタノールを含む管へ移した。
DNA沈殿を無菌チップにより取り出して、マイクロ遠心管に移して、70%エタノー
ルで2回洗浄した。そのDNA試料をPCRで解析した。

【０１４６】サザンブロット解析ゲノムDNA (10μg）を制限酵素で消化してDNA断片を0.8%アガロースゲル上で
電気泳動により分離した。室温でゲルを酸につけて脱プリン（ゲルを0.25N HCl
で15分間洗浄）し、変性（ゲルを1.5M NaCl、0.5M NaOHで20分間２回洗浄）した
。この手順の後、DNA断片をハイボンドN+ナイロン膜（Amersham）に移した。膜
を1M Tris-Cl (pH 8.0) 1.5M NaCl 溶液で15分間洗浄して中和した。DNA断片を
膜に架橋するために1時間80℃で膜を加熱した。加熱した膜をハイブリダイゼー
ションチューブに移して予め加熱したラピッドハイブリダイゼーション緩衝液（
Amersham）6mlを加えた。膜を65℃のハイブリダイゼーションオーブンの中で１
時間揺らしてインキュベートした。³²P標識したプローブ（1 x 10⁶ cpm/ml）を
ハイブリダイゼーション溶液に加えて、膜を65℃でさらに40〜60分間ハイブリダ
イズした。ハイブリダイゼーションの次に、膜を65℃で高ストリンジェンシー緩
衝液により４回洗って、-80℃で2〜3週間X線フィルムに曝した。成功した組込を
判定するのために消化パターンを解析した。

【０１４７】FISH解析による導入遺伝子の検出実施例2で記述したように、潜在的なトランスジェニック細胞をFISH解析用に
調製した。GFP配列用に、予め標識したハイブリダイゼーションプローブ（3μl
）を6時間37℃で適用し、カバーガラスとゴム糊で封着した。73℃で0.4x SSC/0.
3% NP-40でハイブリダイゼーションを止めて、 2x SSC/0.1% NP-40により再び洗
浄して、全ての残りのハイブリッドしなかったプローブを取り除いた。核を5μg
/mlヘキスト（Hoechst）33342でカウンター染色して、ベクタシールド（Vectash
ield）にマウントして、通常のエピ蛍光顕微鏡および共焦点顕微鏡で観察した。
組み込んだ導入遺伝子の局在を決定するため、数種の知られたアカゲザル染色体
配列で同時にFISHを行った。X染色体を認識するプライマー（Vysis、Downers Gr
ove、IL）、および染色体13および21の配列を認識するプライマー（Vysis、Down
ers Grove、IL）を使用した。

【０１４８】インサイチューPCRによる核型（Karyotype）解析および導入遺伝子の検出標的細胞ゲノムにおける単コピーの遺伝子の配列を増幅するため、インサイチ
ューPCRを行った。抽出したDNAを使用するかわりに、スライドに固定した細胞に
対してこの技術を行った。GFP遺伝子を認識するDNAプライマーを使用した。胚細
胞を実施例１に記述したように調製した。PCR増幅サイクルは、94℃で3分間の後
、94℃で1分、60℃で1分、そして72℃で1分を30サイクルであった。蛍光ヌクレ
オチドを増幅過程に使用して、細胞をヘキスト3342でカウンター染色した。エピ
蛍光下でそのシグナルを観察するか、または増殖産物を認識する特異的プローブ
でさらなるハイブリダイゼーションを行ってシグナルを高めた。その増殖産物は
、間期の細胞だけでなく、中期の広がった染色体においても検出することができ
る。トランスジェニック胚のモザイク性を測定するために、単一の胚由来の割球
を分離して、インサイチューPCRに使用した。インサイチューPCRは、単に導入遺
伝子の存在を判定するだけでなく、導入遺伝子のゲノム上の位置をも判定するこ
とができる。

【０１４９】実施例3. レトロウイルスの遺伝子移入 GFPを発現するトランスジェニックサルを、偽型複製欠損レトロウイルスベク
ターを成熟したアカゲザルの卵母細胞の卵黄周囲腔（PVS）に注入することによ
り作製し、その後、卵細胞内精子注入法（ICSI）により受精させた。3匹の健康
なオスが20個の移植胚から生まれ、その少なくとも1匹はトランスジェニックだ
った。

【０１５０】ベクターの作製 GFP遺伝子の全翻訳領域を含む0.75kb の断片をGFP発現ベクターpEGFP-N1(Clon
tech Laboratories, Inc.、Palo Alto、CA)のHpaIおよびHindIII消化によって埋
め合わせた。GFP遺伝子断片をレトロウイルス発現ベクターpLNCX（Clontech Lab
oratories）のマルチクローニング部位のHpaIおよびHindIII部位に挿入し、GFP
遺伝子はCMVプロモーター（プラスミド: pLNC-EGFP）によって制御した。

【０１５１】 hEF-1αプロモーターおよびGFPむプラスミドphEFnGFPは、EcoRVおよびNotIで
消化して、充填し平滑末端部位を作製した。3.44kb消化断片をpLNCXの平滑末端
部位に挿入した。この第２のレトロウイルスベクターをpLNEF-EGFPと命名した。
プラスミドを293GPパッケージング細胞株に安定的にトランスフェクトして、GFP
発現細胞をフローサイトメトリーおよびネオマイシン（G418）選択により選別し
た。パッケージング細胞を水疱性口内炎ウイルス外被糖タンパク質Ｇ（vesicula
r stomatitis virus envelope glycoprotein G(VSV-G)）でトランスフェクトし
た。トランスフェクション後48時間で上清を回収して、超遠心により濃縮した。
ウイルス力価を測定して、定量分割した溶液を-80℃で保存した。

【０１５２】自律複製可能なレトロウイルス（Replication competent retrovirus）ベクターDNAおよび宿主ゲノムDNAが組換えを起こしてウイルス粒子を放出する
わずかな危険性がある。従って、このレトロウイルス技術の安全性を試験するた
め、播種を自律複製可能なレトロウイルス（RCR）に関して解析した。RCR存在解
析のために利用されるアッセイ法は、3T3増幅アッセイ法；サルコーマポジティ
ブ、リューケミアネガティブ（Sarcoma positive, Leukemia negative（S+L-）
）アッセイ法；および特異的レトロウイルス配列のPCR解析を含んでいた。

【０１５３】最初のベクター回収でのパッケージング細胞からの上清および長期培養（１週
間）からの上清を回収して、3T3増幅アッセイ法を行い、いかなるRCRが存在する
場合にも、それを検出するためにS+L-アッセイ法を行った。パッケージング細胞
にRCRを見出した場合には、全ての関連する産物を捨てた。播種がRCR不在または
複製不能である場合には、偽型ベクターを標準的な回収手順により回収し、卵母
細胞注入に使用した。

【０１５４】血液試料を胚移植の前の代理メスから採取した。胎児移植前、30日目、90日目
、および出産の日を含め、全部で4つの血液試料を不妊中および妊娠中のメスか
ら回収した。さらに、代理メスは出産後（又は胚移植後）6ヶ月間試験し、RCR状
態を測定した。CV-1/S+L-アッセイ法、PCR、サザン解析、およびクローンCV-1-L
NC-EGFP細胞を使用したレトロウイルス解析により、これらの試料からの血清ま
たは全血を解析した。

【０１５５】また、卵母細胞吸引前の卵ドナーから血液試料を、および精子ドナーから試料
（血液および精子）を定期的に採取し、対照として使用した。胎盤、臍帯、臍帯
血、および乳児の頬側塗末を出生時に採取し、月齢1,3,6,および12ヶ月に、皮膚
および筋肉生検に加えて血液試料を採取した。CV-1/S+L-アッセイ法、PCR、サザ
ン解析（十分なDNAが利用可能な場合）、およびクローンのCV-1-LNC-EGFP細胞を
使用したレトロウイルス解析により、全ての試料を解析した。

【０１５６】 3T3増幅アッセイ法に関しては、5%の組織培養液、上清、血清、または全血を
、急速に分裂中のNIH/3T3細胞（60%コンフルエンス）上に、ポリカチオン8mg/ml
の存在下、12時間37℃でおいた。潜在的なRCRキャリアー由来の切り刻んだ組織
および細胞、例えばリンパ球を、急速に分裂中のNIH/3T3細胞（60%コンフルエン
ス）上にポリカチオン8mg/ml の存在下、48時間37℃で共培養した。培養後４８
時間で、試料を取り除いて洗浄し、そして新しい培養液に取り換えた。培養液を
４日目に変えて、連続的な培養を７日目まで維持した。７日目に、上清を回収し
て0.45mm注射器で濾過し、細胞片を取り除いた。S+L-アッセイ法を使用して上清
を解析した。3T3増幅アッセイ法では少数のRCR増殖を可能にする。CV-1増幅アッ
セイ法に関しては、NIH-3T3細胞株の代わりに、アカゲザルCV-1細胞株を使用し
た。

【０１５７】 S+L-アッセイ法は、ネコPG-4細胞を利用し、増殖巣形成単位（focus formatio
n units（ffu））の形成によりRCRの存在を検出する。3T3増殖アッセイ法から取
った上清を急速に分裂中のPG-4細胞（60%コンフルエンス）上に、8mg/mlのポリ
カチオン存在下、12時間37℃でおいた。培養後12時間で、試料を取り除き、洗浄
して、新しい培養液を加えた。新しい培養液を4日毎に取り換えて、7日目および
14日目に増殖巣の形成を調べた。各増殖巣を取り、PCRで解析し、RCRの存在を確
かめた。

【０１５８】特異的レトロウイルス配列を増殖させるために設計したプライマー組を使用し
て、PCR解析を行った。DNAを血液から抽出し、血液試料が不十分な場合は同様に
皮膚および筋肉組織診から抽出した。標的配列は、水疱性口内炎ウイルス由来の
VSV-G被膜遺伝子、およびMoMLV由来のパッケージング細胞gag遺伝子およびpol遺
伝子を含んでいた。

【０１５９】 VSV-G、gag、およびpolをプローブとして使用し、対照のアカゲザルDNAについ
て最初のサザンブロットを最適化した。gag、pol 、GFP、およびVSV-Gの配列を
基にして、制限エンドヌクレアーゼを使用した。全ての代理メスからの血液試料
だけでなく、子孫からの血液および組織生検に対してサザン解析を行った。さら
に、導入遺伝子（例えば、GFP）が子孫のゲノムに組み込まれたか否かを判定す
るためにサザンを行った。

【０１６０】 GFPレポーター遺伝子をコードするレトロウイルスベクターを有するCV-1細胞
株を確立した。十分なGFPシグナルをもたせるため、高GFP発現のためのLNC-EGFP
を使用した。CV-1細胞を偽型レトロウイルスベクターで感染させ、または従来の
方法によりトランスフェクトした。導入した細胞をネオマイシンにより選択し、
そしてGFP陽性細胞をフローサイトメトリーにより選別した。それぞれの細胞を
約96プレートへ選別し、そしてクローンのCV-1-LNC-EGFP細胞株を確立した。CV-
1-LNC-EGFP細胞がNIH3T3増幅過程に取って代わる。曝された動物のからの血清ま
たは試料を使用して、CV-1-LNC-EGFP細胞株を播種した。１週間増殖の後、上清
を集めて濾過し、「従来の」CV-1細胞を播種するために使用した。GFP発現また
はネオマイシン抵抗性細胞の検出は、RCRの存在を示す。

【０１６１】卵母細胞注入成熟したアカゲザル卵母細胞の卵黄周囲腔（PVS）に、VSV外被糖タンパク質G
で偽型化した（VSV-G偽型) 高力価（10⁸〜10⁹cfu/ml）サルレトロウイルスベク
ターを注入した(Chenら, 1998)。サイトメガロウイルス初期プロモーター（cyto
megalovirus early promoter（CMV）） [LNCEGFP-(VSV-G)]またはヒト伸長因子1
αプロモーター(human elongation factor-1 alpha promoter（hEF-1α）) [LNE
FEGFP-(VSV-G)] の制御下にあるGFP遺伝子をVSV-G偽型が運んだ。

【０１６２】約10〜100pl を卵母細胞のPVSに導入した；これによって1〜10ベクター分子が
LNCEGFP-(VSV-G)[10⁹cfu/ml]を使用することで注入され、0.1〜1分子がLNEFEGFP
-(VSV-G)[10⁸cfu/ml]で注入された（図 3A〜3D）。卵母細胞を６時間培養してIC
SIにより受精した。全部で224個の卵母細胞に注入して126個の卵母細胞（57%）
が４細胞を超えて発生し、40個の胚（4〜8細胞期）を20匹の代理メスに、各２個
ずつ移植した。代理メスは血清エストラジオールおよびプロゲストロンのレベル
を基に選択した（Hewitsonら、1998）。

【０１６３】電子顕微鏡によって画像化されたように、PVS注入後4.5時間以内にレトロウイ
ルスを卵母細胞内へ組み入れた（図3E）。卵母細胞をイトウ・カルノフスキー固
定液（Ito-Karnovsky’s fixative）で、室温で１時間固定して、0.1Mカコジレ
イト緩衝液（NaCacodylate buffer）で洗浄し、0.5%K₃Fe(Cn)₆で1%OSO₄の、0.1M
カコジレイト緩衝液で１時間、後固定した。洗浄後、卵母細胞を処理するため
アガロースブロックに包埋した。卵母細胞を4%酢酸ウラニルで１時間前染色して
、水で洗浄し、アセトンの濃度勾配系列で脱水し、Epon812で浸透し、そして包
埋した。超薄切片をMT5000ウルトラトームで切り、300目の格子上に回収して、
酢酸ウラニルで染色して、クエン酸塩を導いた。切片はフィリップス（Philips
）300電子顕微鏡で観察して、コダック4489陰性フィルムに記録した。

【０１６４】 5匹の妊娠では、3匹の健康なオスを出生させたが、1組の双子兄弟が73日目で
流産し（150〜155日が正常な懐胎）、そして、１匹の妊娠が阻害された。流産し
た1組の双子胎児は、解剖学的に通常のオスであり、また他方は子宮内で大部分
が再吸収された。3匹の出生と枯死した妊娠とは、LNEFEGFP-(VSV-G)を使用した9
例の胎児移植の結果によるものであり、一方で双子妊娠はLNCEGFP-(VSV-G)を使
用した11例の胎児移植で確立された。

【０１６５】

【表１】アカゲザルにおける偽型VSV-G注入によるトランスジェネシス

【０１６６】導入遺伝子組込の検出導入遺伝子の結合、転写、および発現を調べるため、組織試料（毛、血液、臍
帯、胎盤、培養したリンパ球、頬の上皮細胞、および尿中に出された泌尿生殖器
細胞）を新生児から得た。死産したオスの組織、再吸収された胎児、そして枯死
した妊娠についても解析した。血液、頬の上皮細胞、および尿の試料を除き、実
施例１に記述したようにDNA抽出によって試料を抽出した。ヒールスティックか
らの乾燥した血のスポットを3Mペーパー上にスポットして、アルカリ抽出法によ
り抽出した。簡単には、それぞれの個体の乾燥した血液のスポットから5mmの円
盤をあけて取り、0.2M NaOH（20μl）を加え、そして試料を75℃で３０分インキ
ュベートした。180μl の0.02M Tris-HCl（pH 7.5）で抽出物を中和した。抽出
物の一定分量（5μl）をPCR反応（RudbeckおよびDissing、25 BIOTECHNIQUES 58
8、1998）に使用した。MasterAmp Buccal swab DNA extraction kit（商標）(Ep
icentre Corp、 Madison、WI）を使用して、頬の細胞を単離した。尿の試料（0.
1〜0.3ml）を5ml TNE（10mM Tris-HCl(pH 8.0)、1mM EDTA、および100mM NaCl）
へ混合して、3,000 rpmで１０分間遠心し、ペレットをDNA抽出に使用した（Haya
kawaおよびTakenaka、48 AM. J. PRIMATOL. 299〜304、1999）。

【０１６７】 GFP遺伝子およびベクターに隣接するプライマー組を使用したPCRよりゲノムDN
Aを解析した。GFP遺伝子には、5’プライマーをGFP遺伝子に設定し、3’リバースプライマーをベクターの隣接領域に設定した。PCR解析により、pLNC-EGFPから552bpの増殖
産物を得て、pLNEF-EGFPより435bpの増殖産物を得た。β-グロビンの内対照とし
て、β-グロビン5’プライマーおよび3’リバースプライマーを使用した。このプライマー組によりβ-グロビン遺伝子を増幅した後に318bpの
増殖産物を得た。プロウイルス配列として、3’LTRフォワードプライマー U3領域に設定して、5’LTRリバースプライマーをpLNCXのU5領域に設定した。このプライマー組、5’LTRおよび3’LTRにより、
プロウイルス配列の増殖後500bpの断片増幅産物を得た。

【０１６８】各プライマー組に関するPCR反応は、94℃で１分、55℃で１分、そして72℃で
１分の合計35サイクル行った。 PCR反応産物の一定分量を2%アガロースゲル上で
解析した。

【０１６９】 GFP導入遺伝子の存在は、新生児から解析した全ての組織で示され、胎盤およ
び精巣を含む両方の死産児から解析した全ての組織で導入遺伝子が存在していた
（図4Aおよび4C）。

【０１７０】RT-PCRによるGFP発現の検出 GFP転写レベルを測定するために、導入遺伝子に特異的なプライマー組を使用
してRT-PCRを行った。全RNA（2.5μg）を調製して、DNA分解酵素Iで処理した。R
ETRscript第一鎖合成RT-PCR kit（商標）(Ambion、Austin、TX）を使用して、RN
Aを逆転写した。GFPフォワードプライマーおよびGFPリバースプライマーでの逆転写反応により作製したGFP転写産物にPCRを行った。このプライマー組に
よってGFP cDNAを増幅した後、494bpの増殖産物を得た。β-グロビンの内の転写
対照には、前に記述したβ-グロビンプライマー組を使用した。そのプライマー
組により、β-グロビン転写産物の増殖後、242bpの増幅産物を得た。

【０１７１】導入遺伝子の転写は、導入遺伝子を持つ胎児および乳児由来のすべての組織に
おいて示され（図4Bおよび4C）、それらのトランスジェニック状況の形態を提供
した。

【０１７２】免疫細胞化学によるGFPの発現の検出 GFPの発現を抗GFP画像処理によっても検出した。フルオレセインイソチオシア
ネート（fluorescent isothiocyanate）(FITC）フィルターおよびプリンセトンC
CDカメラ（ORCA）を装備したニコン（Nikon）SMZ解剖顕微鏡を使用して、死産児
の直接の蛍光検査を行った。メタモルフソフトウェア（Metamorph software）(U
niversal Imaging、West Chester、PA）により画像を捉えて解析した。生検した
組織試料をティシューテック（Tissue-Tek）O.C.T.（Sakura Finetek U.S.A., I
nc.、Torrance、CA）で速効凍結し、凍結切片（10μm）をクリオスタットを使用
して切った。2%パラフォルムアルデヒドの0.05M PBS中、室温で10分間切片を固
定し、PBSで洗浄して、10%羊血清のPBS中、室温振盪台上で20分間ブロックした
。一次モノクローナル抗GFP抗体（1:100; Clontech Laboratories）をPBS中1.5
％羊血清で希釈して、組織切片を加え、そして振盪台上、室温で60分間インキュ
ベートした。十分なPBS洗浄後、ローダミン接合抗マウス(IgG)2次抗体（1:50）
を使用し、1.5%羊血清のPBSで希釈して、暗室中の振盪台上に室温で45分間おい
て、GFP一次抗体を検出した。PBSで繰り返し洗浄後、ヘキスト33342（5μg/ml）
で２分間、DNAをカウンター染色して、ベクタシールドアンチフェイド（Vecto
r Labs、 Burlingame、CA、USA）にマウントした。スライドを適切なフィルター
付きニコンエクリプス（Eclips）エピ蛍光顕微鏡、高開口対物レンズ、および
メタモルフソフトウェアを使用したデジタルCCDカメラで検査し

【０１７３】死産した胎児の毛、つま先の爪、および胎盤におけるGFPの直接蛍光が、遺伝
子導入の証拠を提供した（図5A、5B、および5C）。凍結組織切片の抗体染色試験
はGFPタンパク質の存在を示した（図5C）。抗GFP検出およびエピ蛍光画像を重ね
合わせることで、直接のGFP蛍光と抗GFP画像処理が共局在していることが示され
た（図5E）。対照の胎児では、直接および間接蛍光の何れも観察されていない。

【０１７４】サザンブロット解析ゲノムDNAを制限酵素HindIII（pLNC-EGFPに１つの消化部位）で消化した。DNA
断片を0.8%アガロースゲル上で電気泳動して分離し、ハイボンドN+ナイロン膜に
移した。迅速ハイブリダイゼーション緩衝液（Amersham）中、³²P標識GFP断片で
ブロットをハイブリダイズした。65℃で高ストリンジェンシー緩衝液で５回洗浄
した後、ブロットをフォスフォスクリーン（Phospho Screen）（BIO RAD）に36
〜48時間曝して、モレキュラーイメージャー（Molecular Imager）FX（BIO RAD
）でシグナルを検出した。その後、ブロットをX線フィルムに-80℃で7〜10日間
曝した。

【０１７５】死産し、および再吸収された胎児由来の組織のサザンブロット解析は、それら
のゲノムDNAへの多重組込部位を示した（図6Bおよび6C）。宿主ゲノムへのプロ
ウイルス組込の成功を指示するレトロウイルスLTR固有領域に特異的なプライマ
ー組を使用して、胎盤、臍帯、血液、毛、および口腔内細胞のPCRにより、ベク
ターの組込が判定された。プロウイルス配列が1匹の乳児（「ANDi」）および２
匹の死産児（乳児BおよびC）で見られた（図6D）。

【０１７６】実施例4. 細胞内核注入法（Intracytoplasmic Nuclear Injection (ICNI)）卵割期の割球の単離インビトロで作製した胚で4〜16細胞のものをCa²⁺、Mg²⁺不含TALP-HEPESで短
時間インキュベートして割球間の結合を緩めた。7.5μg/mlサイトカラシンＢを
補充して、割球の細胞膜下のミクロフィラメント網を弛緩して、膜の弾力性を高
めた。胚を保持ピペットにより支え、除核ピペット（20〜25μm内径）を、透明
帯を貫通して挿入してそれぞれの割球を吸引により取りはずす（Pratherら、255
J. EXP. ZOOL. 355〜58, 1990; Krisherら、78J. DAIRY SCI. 1282〜88, 1995
）。必要ならば、ピペットからの吸引および排出を繰り返して割球を脱凝集する
。または、ドナー胚の帯を短時間プロネース処理（0.5%プロネースで1.5分間）
により取りはずして、割球を洗浄し、そしてCa²⁺およびMg²⁺不含培養液に30分お
く。0.25%トリプシン存在中ガラスピペットを使用して割球を分離し、核移植に
使用する（CollasおよびRobl、43 BIOL. REPROD. 877〜84、1992; SticeおよびR
obl、39 BIOL. REPROD. 657〜664、1998; Kankaら、43 MOL. REPROD. DEV. 135
〜44, 1996）。

【０１７７】内部細胞塊の割球の単離免疫手術により広げたアカゲザル胚盤胞から、内部細胞塊（inner cell mass
cells（ICM））を単離する（SolerおよびKnowles、72 PROC. NATL. ACAD. SCI.
USA 5099〜102、1975; Keeferら、50 BIOL. REPROD. 935〜39、1994）。簡単に
は、ウサギ抗アカゲザル脾臓細胞抗血清で栄養外胚葉細胞を標識する。TALP-HEP
ESで3回洗浄後、モルモットの補体で胚盤胞をインキュベートし、20μg/ml プロ
ピジウムインドール（propidium iodide（PI））を含むCMRL培養液で1:10に希釈
し、10〜15分間37℃でインキュベートする（Handyside & Hunter、231 J. EXP.
ZOOL. 429〜34、1984; 1988; Hardyら、107 DEVELOPMENT 594〜604、1989）。こ
れは、栄養外胚葉細胞にPIの浸潤性を与える補体カスケードを活性化する。分解
した栄養外胚葉細胞内のICMsを30分間インキュベーターに戻して、穏やかなピペ
ッティングによりICMの単離を行う。Ca²⁺、Mg²⁺不含TALPで２分間ICM細胞を脱凝
集する。各割球はピペッティングを繰り返して単離し、TALP培養液でそれぞれ単
独に培養して核移植を行う。

【０１７８】割球の核の単離単離したアカゲザルの割球は、血清飢餓によってG0/G1の細胞周期を抜けさせ
る。低張の溶液（0.8％ NaCitrate、0.1 %BSA）中、37℃で10分間最初に割球を
膨張させ、21,000g、37℃で20分間、ショ糖勾配遠心を行う。遠心力は細胞を引
き裂いて分解し、細胞膜に包まれた核および少量の原形質（核体（Karyoplast）
）を残す。核体は密度の約1.3g/mlショ糖に止まる。ショ糖を取り除くため、核
体懸濁液を胚培養液で洗浄する。大部分が、核除外のTRITC-IgGを除いて細胞質
封入になるまで、割球を氷中に保つ。核はトランスポート緩衝液で2回洗浄され
、ICNIに新しく使用されるものと思われる。

【０１７９】２段階プロトコルによるICNIによる割球核注入分裂中期II停止卵母細胞は、最初に標準的な方法を使用して核をはずす（Domi
nkoら、60 Biol. Reprod. 1496〜502、1999）。フラミングブラウン水平マイク
ロピペットプーラー（Flaming Brown horizontal micropipette puller）を使用
し、ホウケイ酸ガラス毛細管（Sutter Instrument Co.、San Rafael、CA）より
、保持ピペットを調製する。注入手順をホフマン変調対比（HMC）視野を装備し
たニコンダイアフォト（Diaphot）顕微鏡で行う。保持ピペットをハミルトン注
射器に付属したナリシギ（MN-151）マニピュレーターで持保持する。注入ピペッ
トをナリシギ（IM-6）注入システムに付属して動力化されたエッペンドルフ（51
70）マイクロマニピュレーターにマウントする。32℃で100μl液滴のTALP-HEPES
中、100mmの組織培養皿の蓋上で、ライトミネラルオイルで覆って、注入を行う
（Hewitsonら、1996）。一つの割球の核を注入ピペットに吸引して、卵母細胞の
細胞質に、穏やかな細胞質吸引ののち挿入する（極体が12時）。割球の核を卵母
細胞の中心において注入ピペットを引く。

【０１８０】１段階プロトコルによるICNIによる割球核注入この１段階プロトコルでは、単一の割球核を注入ピペットに吸引して、卵母細
胞の細胞質に、穏やかな細胞質吸引ののち挿入する（極体が４時）。割球の核を
卵母細胞の中心において注入ピペットを注意深く有糸分裂紡錘体（エピ蛍光照明
で可視化されている）に動かす。紡錘体を穏やかに吸引して取り除き、注入ピペ
ットを引く。注入した卵母細胞の除核が成功したことを、取り除いた核体の蛍光
解析により確認する。

【０１８１】割球ICNIに続く卵母細胞の化学的活性化割球注入直後、または割球核注入後4〜6時間してから、５分パルスのイオノマ
イシン（5mM; CalBiochem）、カルシウムイオノフォアにより、化学的活性化を
誘導する。これが活性化の開始および維持に十分でない場合、イオノマイシンお
よび1.9mM 6-DMAP中で４時間の組合せをススコ・パリッシュ（Susko-Parrish）
らによる記述のように活性化のために使用する（166 DEV. BIOL. 729〜39、1994
）。

【０１８２】割球のICNIに続く卵母細胞の精子の細胞質ゾル（オシリン（oscillin））活性化精子細胞質ゾルの因子（オシリン; MW=33kDa）による卵母細胞の活性化は、多
くの哺乳類において反復性のカルシウム放出を刺激し、皮質顆粒エキソサイトー
シス、前核形成、および分裂現象を開始させる（Daleら、41 EXPERIENTA 1086
〜70、1985; Swann, 110 DEVELOPMENT 1295〜1302、1996; SticeおよびRobl、39
MOL. REPROD. 657〜64、1990; Parringtonら、379 NATURE 364〜68、1996）。
同様の卵母細胞の活性化を行うため、アカゲザル精子から調製した抽出物でのア
カゲザル未受精卵の活性化を、ICNI卵母細胞にマイクロ注入することにより行う
。アカゲザル精子をペニス電子射精（penile electroejaculation）により回収
し、TALP-HEPES培養液で１回洗浄する。120mM KCl、20mM HEPES、100μM EGTA、
および10mMソディウムグリセロホスフェート、pH7.5（Swann、1990）で作った修
飾された細胞内緩衝液（intracellular buffer（ICB））で３回、精子のペレッ
トを洗浄する。最後の精子ペレットをICB中で5〜10 x 10⁸sperm/mlに調整して、
４の解凍周期により溶解する。溶解した試料を100,000 x g 1時間4℃で遠心して
、澄んだ上清を精子細胞質ゾルの画分として集める。セントリコン（Centricon
）30 微量濾過膜（Amicon、Beverly、MA）を使用して、この画分を3〜5倍濃縮し
、そして使用するまで10μl画分で-80℃で保存する。活性化を開始するため、8
〜10plの濃縮した精子細胞質ゾルの画分（〜5%の卵容量）を1〜2μmチップでマ
イクロピペットを使用してICNI卵母細胞へ微量注入する。注入した卵母細胞を37
℃に戻して培養したのち、レシピエントのメスへ移植し、または免疫細胞化学解
析のために固定する。

【０１８３】割球ICNIに続く卵母細胞の電気的活性化卵母細胞を融合培養液（0.25ソルビトール、100mM 酢酸カルシウム、0.1M酢酸
マグネシウム(pH 7.2)、265mOsm）に移して10分間で平衡にする。平衡にしたの
ち、２本の平行し離れている500μm針金からなる融合チャンバーに卵母細胞を移
す。チャンバーを融合培養液で覆って、BTX2000電気細胞マニピュレーターを使
用して２回の20μ秒パルス（2.4 kV電場強度）により活性化する。

【０１８４】２段階手順を使用した融合による核移植２段階手順（Pratherら、1987、1990; Sticeら、38 MOL. REPROD. DEV. 61〜6
8、 1994; Dominkoら、1999）においては、卵母細胞を除核し、除核ののちすぐ
に同じ開いている帯を通してドナー割球に挿入する（除核?移植）。除核した卵
母細胞を手順中ずっと保持ピペット上に保持し、除核の間にできた帯の穴を簡単
に見つけることができ、割球の操作に再利用できるため、２段階手順は、より核
移植対のより速い成果が見込まれる。卵母細胞の細胞膜が連続的に保持すること
を保証するためこの手順はミクロフィラメント阻害剤存在中で行う必要があり、
そのため長時間これを阻害剤に曝したことによる後の胚発生に与える悪影響の可
能性が考慮されるべきである。核移植が完成した後、核移植対を融合前に回復さ
せるため、阻害剤不含培養液へ移す。平均的な10の卵母細胞を核移植のためにい
ろいろな時間をあたえて使用するならば、除核・移植の持続時間は30〜45分より
長くは期待されない。

【０１８５】３段階手順を使用した融合による核移植３段階手順(Wilmut ら、385 NATURE 810〜13、1997；Bondioliら、33 THERIOG
ENOLOGY 164〜74、1990; barnesら、36 MOL. REPROD. DEV. 33〜41、1993) では
、卵母細胞を除核し、手続からインビトロ培養に返し、そしてドナー割球に20〜
30分後、再び同じ帯の穴を通して挿入する（除核・回復・移植）。同数の卵母細
胞に行う３段階手順は、完成のためにさらに30分必要となる：除核した卵母細胞
が阻害剤不存在培養液中で回復するために20分、そして帯の穴を見出して割球の
移植にほどよく一直線にするために卵母細胞を再配置するために10分である。し
かしながら、このアプローチを使用すると、ミクロフィラメント阻害剤存在中で
卵母細胞が費やす時間を短くすることができ、ドナー細胞は全く曝されることが
ない。核移植ユニットを融合培養液に入れて溶解する。融合の前に核移植ユニッ
トをならべて卵母細胞と割球の膜が電流に対して直角になるようにする。融合の
後、卵母細胞を洗浄して胚培養液の中に入れ、レシピエントメスへ移植し、また
は免疫細胞学的解析のために固定する。

【０１８６】開腹術による胎児移植ウォルフ（Wolf）ら（41 BIOL. REPROD. 335〜46、1989）によって記載された
ように中腹を開く手術によって、外科的な胚移植を行う。トムキャットカテーテ
ルを使用して、4〜8細胞期の胚を含めて、3mg/ml BSAを含んだHEPES緩衝液とし
たTALP中で、卵管を排管する。約0.05ml培養液中で、胚をカテーテルから排出し
てカテーテルを引く。胚の移植の成功を保証するために、そのメスからの除去の
のちにカテーテルに培養液を流す。外因性のプロゲストロンを、胚移植に加え、
移植中に妊娠の開始および維持を助けてもよい。

【０１８７】ICNIによる体細胞の核注入皮膚の試料を生検によりアカゲザル成体より採取する。組織試料を切り刻んで
0.25%トリプシンEDTAのPBS中30分間時々撹拌しながらインキュベートする。その
30分後、10分間室温で細胞の懸濁を沈殿させることができ、分離した細胞を含む
上清を取り除いて、新しい管へ移す。試料を遠心して少なくとも3回DMEM培養液
で洗浄し、10%FCSを補充する。最終の細胞ペレットを5mlの同じ培養液で再懸濁
し、37℃、5%CO₂最高湿度の空気中でインキュベートする。繊維芽細胞の初代培
養を、細胞が密集したら（通常１週間あたり１回）継代する。毎継代ごとに、繊
維芽細胞の試料をDNA解析用に凍結する。核移植の4〜6日まえにG0/G1期に同調さ
せるためにDMEMのみ（血清なしで）で繊維芽細胞を培養する。ICNI手続を上記の
ように行う。

【０１８８】実施例5. 前核注入前核注入用の接合子の作製精子を導入遺伝子で修飾してないことを除き、実施例１に記述したようにICSI
によって接合子を作製する。ICSI後約10〜15時間で、前核となった接合子を前核
注入に使用する。

【０１８９】前核注入接合子を100mmペトリ皿中の100μl洗浄液に移して、ミネラルオイルで覆う。
内径20〜30μmの保持ピペットを、ナリシギマイクロマニピュレーターにあてて
シリコンオイルで満たした微量注射器に結合し、一方で保持ピペットをフルオリ
ネート（fluorinert）（Sigma、St. Louis、MO）で満たす。毛細管機能を高める
ために毛細管の側面に沿って切痕がある注入針を準備する。エッペンドルフトラ
ンスジェクター（Eppendorf Transjector）5426を使用して、1の前核にDNA（4μ
g/μl）を微量注入する。トランスジェクターのパラメーターを300〜500 hpaの
注入圧力および 15〜25hpaの補正圧力にセットする。注入の長さは前核の膨張を
観察することによって調整する。

【０１９０】直接の前核注入であるこの技術によって作製した胚は、実施例２に記述された
ような方法を使用して解析される。

【０１９１】実施例6. キメラの作製割球の分離と単離キメラのアカゲザル胚を同姓の割球から作製する。4〜16細胞期の胚をドナー
トランスジェニック割球の出所として使用する。Ca²⁺、Mg²⁺不含TALP-HEPESで短
時間インキュベーションした後、サイトカラシンＢ（7.5μg/ml）を導入する。
胚を保持ピペットにより保持し、除核ピペット（20〜25μm I.D.）を、透明帯を
貫通して挿入し、各割球を吸引（Pratherら、1990; Krisherら、1995）によって
取りはずす。または、ドナー胚の帯を短時間プロネース処理によって取り除き、
割球を洗浄してCa²⁺、Mg²⁺不含培養液に30分間入れる。0.25%トリプシン存在中
でガラスピペットを使用して割球を分離して、トランスジェニック割球をエピ蛍
光下で選択する。

【０１９２】GFP発現トランスジェニックキメラの調製各胚より非トランスジェニック割球を１個、FISHアッセイ法に使用して、胚の
性を決定し、割球ドナーとして使用する。蛍光下で選択し、および同姓の胚を起
源とするトランスジェニック割球だけを空いた透明帯内へおいて、同じ時期の胚
を再創作する。凝集後、胚をインビトロで培養して、これらの発生能力を判定す
る。同姓で非トランスジェニック割球をプールし、対照の胚を同じ方法で創作す
る。またはトランスジェニック割球を非トランスジェニック胚の中へ移す。新し
く創作した胚の中でただ一個の割球が潜在的なトランスジェニックであるなら、
分化組織の正確な細胞系譜が判定できる。

【０１９３】胚の生検、および割球におけるFISH解析によるXおよびY染色体の検出生検によって単一の割球を単離し、FISHのために処理する。割球をピペットで
スライドに移し、PBSを0.01N HCl/0.1% Tween-20に換えて、帯を分解して細胞膜
を透過化処理する。スライドをPBSで洗浄し、濃度が上昇するエタノール系列で
脱水する。100μg/mlペプシン、0.01N HCl中37℃で20分間インキュベートして、
ハイブリダイゼーションのため核に接近できるようにし、細胞質の残遺物を取り
除く。ハイブリダイゼーションの前に、スライドをもう一つの濃度が上昇するエ
タノール系列 (Coonen ら、9 HUM. REPROD. 533〜37、1994）を通じて脱水して
、変性溶液（フォルムアミド/SSC）に37℃で5分間浸した。変性段階の次に、3μ
lのハイブリダイゼーションプローブ（Vysis: CEP X SpectrumGreen（商標）/CE
P Y SpectrumOrange（商標））を6時間37℃で充たす。ハイブリダイゼーション
を0.4x SSC/0.3% NP-40で止めて、スライドを2x SSC/0.1% NP-40で洗浄してハイ
ブリッドしなかったプローブを取り除く。核を5μg/ml ヘキスト33342でカウン
ター染色して、ベクタシールドにマウントする。XおよびY染色体を通常および共
焦点の顕微鏡を使用して検出する。

【０１９４】データ解析胚割球の単離後、60分以内にFISH解析を完成でき、この遅れは凝集キメラに対
して有害な影響を持たない。新しく創作されたキメラの生育力に与える脱凝集お
よび再凝集の影響は、操作していない対照の生育力と比較される。キメラを培地
に入れ、その発育を観察する。胚の発育は全細胞数で評価される。

【０１９５】記述された発明の方法および体系の様々な修正および変化は、発明の範囲およ
び精神から逸脱することなく当業者にとって明白だと思われる。特定の好ましい
態様と結びつけて発明が記述されてきたが、請求する発明はそのような特定の態
様に過度に限定されるべきではないことが理解されるはずである。実際に、発明
の実施のために記述された様式の様々な修正は、分子生物学または関連分野の業
者に明白であり、添付の特許請求の範囲に存在することが意図される。

【図面の簡単な説明】

【図１Ａから１Ｈ】 ICSIによるプラスミド移入（図1A〜1H）。ローダミン
標識プラスミドDNAはマウス（1A）、ウシ（1B）およびアカゲザル精子（1C）に
強く結合する。ローダミン標識DNAはICSIの後に微量注入された精子の表面に留
まっている。アカゲザル卵母細胞（1D）またはウシ卵母細胞（1E）に微量注入さ
れたアカゲザル精子。抗GFPモノクローナル抗体およびヘキストDNA染色を用いた
、16細胞期アカゲザル胚におけるGFP発現の検出（1F）。注入精子に結合したGFP
遺伝子をコードするローダミン標識プラスミドDNAを用いたICSIによるトランス
ジェネシス後にGFPを発現する、生4細胞（1G）および胚盤胞期（1H）アカゲザル
胚。図1A〜1Eはレーザー走査共焦点顕微鏡によって収集した。図1A、1Bおよび1C
は、14標識精子のオーバーレイ画像によって作製し、精子のそれぞれの画像は異
なる焦点面で撮影した16画像のオーバーレイである。図1Fは、デジタル微光レベ
ル蛍光画像化（プリンストンCCD、微分干渉コントラスト、ツァイスアクシオフ
ォト）によって収集した。

【図２Ａから２Ｃ】ローダミン標識プラスミドDNAと結合した精子を用い
たアカゲザルICSIの生、デジタル微光レベルエピ蛍光画像化（図2A〜2C）。10％
PVP中に懸濁され、ローダミン標識を示す1個の精子は、注入ピペット内に尾が先
に吸引される（2A）。ピペットは卵母細胞の透明帯および透明帯膜を通じて挿入
され、第2の吸引ピペットによって固定され、精子は卵母細胞細胞質内に深く配
置される（2B）。細胞質を短時間吸引することによって、精子が放出前に卵母細
胞内に正しく配置される（2C）。すべての手順は、連続ローダミン描出を行うた
めに、デジタル微光レベル蛍光画像化を用いて100倍に拡大して行う。

【図３Ａから３Ｅ】ベクター粒子中にGFPタンパク質を有するVSV-G偽型レ
トロウイルスベクターの、成熟アカゲザル卵母細胞の卵黄周囲腔（PVS）への注
入（図3A〜3E）。PVSへのベクター溶液の注入、FITCフィルタセットを用いた（3
A）透過光および（3B）蛍光。ベクターのPVS注入後のアカゲザル卵母細胞、（3C
）透過光および（3D）蛍光。4.5時間後、ベクター粒子が卵母細胞細胞質内に見
られる（矢印3E）。

【図４Ａから４Ｉ】死産胎児から回収した組織のPCRおよびRT-PCR分析（
図4A〜4I）。非損傷胎児からの、合計13組織に対してPCR分析（4A）を、11組織
に対してRT-PCR分析（4B）を行った。非損傷胎児の全体の分析を（4C）に示した
。精密な解剖学的規格が限定されていたので、広範な説明を行うため、8つの異
なる領域から再吸収胎児からの組織を収集した。再吸収胎児のPCR、RT-PCRおよ
び全体分析を（4D、4Eおよび4F）に示した。Pl-胎盤；Lu-肺；Li-肝臓；He-心臓
；In-腸；Ki-腎臓；Bl-膀胱；Te-精巣；Mu-筋肉；Sk-皮膚；Ta-尾；Pa-膵臓；Sp
-脾臓；T1-再吸収胎児による胎盤；T2〜T9-再吸収胎児の8つの領域から回収した
組織；C1-非トランスジェニックアカゲザル組織；C2-C1＋pLNC-EGFP、C3-ddH₂O
；C4-293GP-LNCEGFPパッケージング細胞；C5-非トランスジェニック肝臓；C6-DN
A分解酵素を含まないトランスジェニック肺；C7-逆転写を含まないトランスジェ
ニック肺。乳児（「ANDi」およびサルB）より、各子孫からの合計7つの試料がPC
R分析用（4G）に、2つの試料がRT-PCR分析用（4H）に得られた。新生児の分析（
4I）により、「ANDi」はすべての分析組織内にmRNAが存在するトランスジェニッ
ク雄であることが示されている。Pl-胎盤；Cd-帯、Bl-全血；Ly-リンパ球；Bu-
頬側塗抹標本；Ur-尿；およびHa-体毛。

【図５Ａから５Ｅ】 GFPリポーターの発現（図5A〜5E）。死産胎児中でのG
FP発現は直接蛍光検査によって、毛幹（5A）および足指の爪（5B）の両方で見ら
れた。胎盤凍結切片の免疫染色およびエピ蛍光検査により、GFPタンパク質の存
在が証明される。ローダミンと結合する抗GFPモノクローナル抗体および2次抗体
を用いた免疫染色（5C）。同じ切片のエピ蛍光は、GFPタンパク質の発現を証明
している（5D）。免疫染色およびエピ蛍光画像のオーバーレイによる、GFPタン
パク質の共局在化（矢印）（5E）。核はヘキストDNA染色を用いて染色した。

【図６Ａから６Ｄ】 HindIII（単一消化部位）消化ゲノムDNAのサザンブロ
ット分析（6A）。³²Pによって標識した全長GFPは、導入遺伝子を検出するプロー
ブとして使用し、導入遺伝子は正常雄死産（6B）および再吸収胎児（6C）のゲノ
ムDNA中で検出された。非トランスジェニックアカゲザル組織は負の対照として
、pLNC-EGFP DNAは正の対照として使用した。それぞれから得た組織内で、種々
のサイズの断片が示された。この結果は、導入遺伝子内の単一消化部位とともに
、制限酵素の使用による、複数の組込部位を示す。独特なプロウイルス配列の検
出（6D）。各乳児からの5つの組織、雄死産および再吸収胎児からの2つの組織す
べてに対し、PCRを行った。「ANDi」と2つの死産でプロウイルス配列が検出され
、それらがトランスジェニックであることが示される。略語は図4A〜4Iと同じで
ある。Mu-非損傷胎児からの筋肉およびT3-再吸収胎児からの組織。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩテーマコート゛(参考）Ａ６１Ｐ 11/00 Ａ６１Ｐ 11/00 15/00 15/00 25/00 25/00 27/02 27/02 35/00 35/00 37/02 37/02 Ｃ１２Ｎ 5/10 Ｃ１２Ｎ 15/00 Ａ 15/09 5/00 Ｂ (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ，ＴＲ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＭＺ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＧ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＢＺ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＲ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＤＭ，ＤＺ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＡ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＭＺ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＴＺ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＡ，ＺＷ (72)発明者チャンアンソニーダブリュー．エス．アメリカ合衆国オレゴン州アロハナンバー329 エス．ダブリュー．マスターズループ 4589 Ｆターム(参考） 4B024 AA01 AA10 AA20 BA80 CA02 CA04 CA20 DA02 EA04 FA02 GA11 GA12 HA17 HA20 4B065 AA90X AB01 AC14 AC20 BA02 BA04 BA30 CA24 CA44 4C084 AA13 NA10 ZA012 ZA332 ZA362 ZA592 ZB072 ZB262 ZC032 ZC212

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】精子由来の外因性DNAを細胞内精子注入によって卵母細胞に
移入し、胚期まで培養したトランスジェニック非ヒト霊長類胚を非ヒト霊長類代
理メスの卵管に移植する工程と、トランスジェニック非ヒト細胞を分娩によって作製する工程を含む、トランスジ
ェニック動物の作製方法。
【請求項２】非ヒト霊長類が、アカゲザル（rhesus macaque）、ヒヒ（ba
boon）、ノドシロオマキザル（capuchin）、チンパンジー（chimpanzee）、ピグ
テールマカク（pigtail macaque）、スーティーマンガベー（sooty mangabey）
、リスザル（squirrel monkey）、オランウータン（oranutan）からなる群より
選択される、請求項1記載の方法。
【請求項３】外因性DNAが、発現ベクターである、請求項1記載の方法。
【請求項４】発現ベクターが、調節核酸配列および構造遺伝子配列を含む
、請求項3記載の方法。
【請求項５】発現ベクターが、プラスミドベクター、ウイルスベクターお
よびレトロウイルスベクターからなる群より選択される、請求項3記載の方法。
【請求項６】調節核酸配列が、プロモーターである、請求項4記載の方法
。
【請求項７】プロモーターが、ウイルスプロモーターである、請求項6記
載の方法。
【請求項８】ウイルスプロモーターが、サイトメガロウイルスプロモータ
ーである、請求項7記載の方法。
【請求項９】プロモーターが、プロタミン1プロモーターである、請求項6
記載の方法。
【請求項１０】プロモーターが、誘導性プロモーターおよび構成性プロモ
ーターである、請求項6記載の方法。
【請求項１１】構造遺伝子配列が、受容体、酵素、サイトカイン、ホルモ
ン、成長因子、免疫グロブリン、細胞周期タンパク質、細胞伝達タンパク質、膜
タンパク質および細胞骨格タンパク質からなる群より選択されるポリペプチドを
コードする、請求項4記載の方法。
【請求項１２】構造遺伝子配列が、レポーター遺伝子である、請求項4記
載の方法。
【請求項１３】レポーター遺伝子が、緑色蛍光タンパク質遺伝子である、
請求項12記載の方法。
【請求項１４】レポーター遺伝子が、β-ガラクトシダーゼ遺伝子、分泌
胎盤アルカリホスファターゼ遺伝子およびルシフェラーゼ遺伝子からなる群より
選択される、請求項12記載の方法。
【請求項１５】レポーター遺伝子が、トランスジェニック胚の細胞または
組織の発生をモニタリングするために使用される、請求項記12載の方法。
【請求項１６】構造遺伝子配列が疾患遺伝子である、請求項4記載の方法
。
【請求項１７】疾患遺伝子が、心臓疾患、神経疾患、生殖障害、癌、眼疾
患、内分泌系障害、肺疾患、代謝障害、遺伝性疾患、自己免疫障害および老化か
らなる群より選択される疾患に関連している、請求項14記載の方法。
【請求項１８】外因性DNAが蛍光団によって標識される、請求項1記載の方
法。
【請求項１９】蛍光団がローダミンである、請求項18記載の方法。
【請求項２０】外因性DNAが1以上の発現ベクターからなる、請求項1記載
の方法。
【請求項２１】発現ベクターが、調節核酸配列および2つ以上の構造遺伝
子配列を含む、請求項3記載の方法。
【請求項２２】卵母細胞が、3〜16細胞胚期まで培養される、請求項1記載
の方法。
【請求項２３】トランスジェニック非ヒト霊長類が、ヒト疾患のモデルで
ある、請求項1記載の方法。
【請求項２４】ヒト疾患が、心臓疾患、神経疾患、生殖障害、癌、眼疾患
、内分泌系障害、肺疾患、代謝障害、自己免疫障害および老化からなる群より選
択される、請求項23記載の方法。
【請求項２５】トランスジェニック非ヒト霊長類が、遺伝性疾患のモデル
である、請求項1記載の方法。
【請求項２６】トランスジェニック動物が、胚および胎児の発生のモデル
である、請求項1記載の方法。
【請求項２７】トランスジェニック非ヒト霊長類が、薬剤治療、遺伝子治
療、幹細胞治療および体細胞治療の安全性および有効性を証明するモデルである
、請求項1記載の方法。
【請求項２８】トランスジェニック動物が、疾患診断のモデルである、請
求項1記載の方法。
【請求項２９】絶滅危惧種の保存に関する、請求項1記載の方法。
【請求項３０】精子を介した遺伝子治療に使用される、請求項1記載の方
法。
【請求項３１】精子が、化学的除染および物理的除去からなる群より選択
される衛生処置を受ける、請求項1記載の方法。
【請求項３２】化学的除染が、プロテイナーゼ、DNA分解酵素およびRNA分
解酵素からなる群より選択される、請求項31記載の方法。
【請求項３３】物理的除去による衛生処置が、ポリスチレンおよび磁気ビ
ーズからなる群より選択される、請求項31記載の方法。
【請求項３４】請求項1記載の方法によって作製されたトランスジェニッ
ク非ヒト霊長類胚。
【請求項３５】胚および胎児の発生のモデルである、請求項34記載のトラ
ンスジェニック胚。
【請求項３６】請求項1記載の方法によって作製されたトランスジェニッ
ク非ヒト霊長類。
【請求項３７】ヒト疾患のモデルである、請求項36記載のトランスジェニ
ック非ヒト霊長類。
【請求項３８】遺伝性疾患のモデルである、請求項36記載のトランスジェ
ニック非ヒト霊長類。
【請求項３９】薬剤治療、遺伝子治療、幹細胞治療および体細胞治療から
なる群より選択される処置の安全性および有効性を証明するモデルである、請求
項36記載のトランスジェニック非ヒト霊長類。
【請求項４０】疾患診断のモデルである、請求項38記載のトランスジェニ
ック非ヒト霊長類。
【請求項４１】トランスジェニックキメラ胚である、請求項34記載のトラ
ンスジェニック胚。
【請求項４２】外因性DNAをウイルスベクター注入によって卵母細胞に移
入し、細胞内精子注入によって卵母細胞を受精させ、該卵母細胞を胚期まで培養
することによって作製したトランスジェニック胚を代理メスの卵管に移植する工
程と、トランスジェニック非ヒト霊長類を分娩によって作製する工程とを含む、トラン
スジェニック非ヒト霊長類を作製する方法。
【請求項４３】動物が非ヒト霊長類である、請求項42記載の方法。
【請求項４４】非ヒト霊長類が、アカゲザル、ヒヒ、ノドシロオマキザル
、チンパンジー、ピグテールマカク、スーティーマンガベー、リスザル、オラン
ウータンである、請求項43記載の方法。
【請求項４５】卵母細胞が未成熟卵母細胞を含む、請求項42記載の方法。
【請求項４６】卵母細胞が未受精卵母細胞を含む、請求項42記載の方法。
【請求項４７】卵母細胞の卵黄周囲腔にレトロウイルスベクターで注入す
る、請求項44記載の方法。
【請求項４８】卵母細胞を4〜8細胞胚期まで培養する、請求項42記載の方
法。
【請求項４９】レトロウイルスベクターが、調節遺伝子配列および構造遺
伝子配列を含む、請求項42記載の方法。
【請求項５０】調節配列が、プロモーターである、請求項49記載の方法。
【請求項５１】プロモーターが、ウイルスプロモーターである、請求項50
記載の方法。
【請求項５２】ウイルスプロモーターが、サイトメガロウイルスプロモー
ターである、請求項51記載の方法。
【請求項５３】プロモーターが、ヒト伸長因子1αプロモーターである、
請求項50記載の方法。
【請求項５４】ウイルスベクターが、モロニーネズミ白血病ウイルス、ハ
ービーネズミ肉腫ウイルス、ネズミ乳腺癌ウイルスおよびラウス肉腫ウイルスか
らなる群より選択されるレトロウイルスベクターである、請求項42記載の方法。
【請求項５５】ウイルスベクターがレトロウイルスベクターである、請求
項42記載の方法。
【請求項５６】レトロウイルスベクターが、膜結合タンパク質を含む、請
求項42記載の方法。
【請求項５７】膜結合タンパク質が、ラブドウイルス科（Rhabdoviridae
）から選択される糖タンパク質である、請求項56記載の方法。
【請求項５８】糖タンパク質が、水疱性口炎ウイルス、ピル（Piry）ウイ
ルス、チャンディプラ（Chandipura）ウイルス、コイのスプリングウイルス血症
（Spring viremia）ウイルス、狂犬病ウイルスおよびモコラウイルスからなる群
より得られる、請求項57記載の方法。
【請求項５９】構造遺伝子配列がレポーター遺伝子である、請求項49記載
の方法。
【請求項６０】レポーター遺伝子が緑色蛍光タンパク質遺伝子である、請
求項59記載の方法。
【請求項６１】レポーター遺伝子が、p-ガラクトシダーゼ遺伝子、分泌胎
盤アルカリホスファターゼ遺伝子およびルシフェラーゼ遺伝子からなる群より選
択される、請求項59記載の方法。
【請求項６２】構造遺伝子配列が、受容体、酵素、サイトカイン、ホルモ
ン、成長因子、免疫グロブリン、細胞周期タンパク質、細胞伝達タンパク質、膜
タンパク質、または細胞骨格タンパク質であるポリペプチドをコードする、請求
項49記載の方法。
【請求項６３】胚から割球を分離して、割球から核を除去し、除核した卵
母細胞に細胞内核注入によって割球核を注入するか、または除核した卵母細胞と
割球核を融合することによってトランスジェニック卵母細胞を作製する工程と、トランスジェニック卵母細胞を活性化し、かつ胚期まで培養する工程と、トランスジェニック非ヒト霊長類を分娩により作製する工程とを含む、トランス
ジェニック霊長類を作製する方法。
【請求項６４】非ヒト霊長類が、アカゲザル、ヒヒ、ノドシロオマキザル
、チンパンジー、ピグテールマカク、スーティーマンガベー、リスザル、オラン
ウータンである、請求項63記載の方法。
【請求項６５】内部細胞塊または割球由来の細胞がトランスジェニック胚
から単離される、請求項63記載の方法。
【請求項６６】卵母細胞活性化が、化学活性化、精子サイトソル（オシリ
ン）活性化または電気活性化である、請求項63記載の方法。
【請求項６７】非ヒト霊長類体細胞から核を分離し、除核した卵母細胞に
細胞内核注入によって核を注入し、卵母細胞を活性化し、かつ胚期まで培養する
ことによって作製したトランスジェニック胚を代理メスの卵管に移植する工程と
、トランスジェニック非ヒト霊長類を分娩により作製する工程とを含む、トランス
ジェニック非ヒト霊長類を作製する方法。
【請求項６８】非ヒト霊長類が、アカゲザル、ヒヒ、ノドシロオマキザル
、チンパンジー、ピグテールマカク、スーティーマンガベー、リスザル、オラン
ウータンからなる群より選択される、請求項67記載の方法。
【請求項６９】体細胞が皮膚細胞である、請求項67記載の方法。
【請求項７０】卵母細胞活性化が、化学活性化、精子サイトソル（オシリ
ン）活性化および電気活性化からなる群より選択される、請求項67記載の方法。
【請求項７１】細胞内精子注入によって非ヒト卵母細胞を受精させて受
精卵母細胞を作製し、前核注入によって外因性DNAを受精卵母細胞の前核に移入
し、受精卵母細胞を胚期まで培養することによって作製したトランスジェニック
胚を代理メスの卵管に移植する工程と、トランスジェニック霊長類を分娩により作製する工程とを含む、トランスジェニ
ック非ヒト霊長類を作製する方法。
【請求項７２】トランスジェニック霊長類細胞を作製する工程、およびトランスジェニック霊長類細胞を被験者に導入し、トランスジェニック細胞が疾
患を治療する工程を含む、疾患を有するヒト被験者を治療する方法。
【請求項７３】トランスジェニック霊長類細胞が、細胞内精子注入、レト
ロウイルス遺伝子移入、細胞内核注入および前核注入からなる群より選択される
方法によって作製される、請求項72記載の方法。
【請求項７４】ヒトの疾患が、心臓疾患、神経疾患、生殖障害、癌、眼疾
患、内分泌系障害、肺疾患、代謝障害、自己免疫障害および老化からなる群より
選択される、請求項72記載の方法。
【請求項７５】外因性DNAを精子と混合する工程と、 DNAと精子が結合したDNA精子混合物をインキュベートする工程と、 DNA結合精子を洗浄する工程とを含む方法によって外因性DNAを精子に結合する、
請求項1記載の方法。
【請求項７６】請求項1、42、63、68、または73記載の方法によって産生
されたトランスジェニック非ヒト霊長類から単離される、トランスジェニック非
ヒト霊長類細胞。
【請求項７７】細胞質内精子注入によって、精子からの外因性DNAを卵母
細胞へ移入する工程と、卵母細胞を胚期まで培養する工程と、それによって、トランスジェニック霊長類細胞をインビトロで作製する工程とを
含む、トランスジェニック霊長類細胞を作製する方法。
【請求項７８】レトロウイルスベクターの注入によって、卵母細胞に外因
性DNAを移入する工程、細胞質内精子注入によって、卵母細胞を受精させる工程と、該卵母細胞を胚期まで培養する工程とを含み、それによって、トランスジェニック霊長類細胞をインビトロで作製する、トラン
スジェニック霊長類細胞を作製する方法。
【請求項７９】胚から割球を分離する工程と、割球から核を除去する工程と、除核した卵母細胞に細胞内核注入によって割球核を注入するか、または除核した
卵母細胞と割球核を融合することによってトランスジェニック卵母細胞を作製す
る工程と、トランスジェニック卵母細胞を活性化して、かつ胚期まで培養する工程とを含み
、それによってトランスジェニック霊長類細胞をインビボで作製する、トランスジ
ェニック霊長類細胞を作製する方法。
【請求項８０】霊長類体細胞由来の核を単離する工程と、除核した卵母細胞に細胞内核注入によって割球核を導入する工程と、卵母細胞を活性化して培養し、トランスジェニック胚を作製する工程とを含み、
それによってトランスジェニック霊長類細胞をインビボで作製する、トランスジ
ェニック霊長類細胞を作製する方法。
【請求項８１】霊長類卵母細胞を細胞内精子注入によって受精させ、受精
霊長類細胞を作製する工程と、外因性DNAを前核注入によって受精卵母細胞の前核に移入する工程と、受精卵母細胞を胚期まで培養してトランスジェニック胚を作製する工程とを含み
、それによってトランスジェニックヒト霊長類細胞をインビトロで作製する、トラ
ンスジェニック霊長類細胞を作製する方法。
【請求項８２】請求項77、78、79、80、または81記載の方法によって作製
される、トランスジェニック霊長類細胞。
【請求項８３】胚幹細胞である、請求項82記載のトランスジェニック霊長
類細胞。
【請求項８４】ヒト細胞である、請求項83記載のトランスジェニック霊長
類細胞。