KR100886401B1 - 세포질내 정자 주입에 의한 포유류의 유전자 도입 - Google Patents
세포질내 정자 주입에 의한 포유류의 유전자 도입 Download PDFInfo
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Abstract
미수정 마우스 난모세포내로 도입유전자를 인코딩하는 정자머리 및 외래성 핵산과의 공동주입에 의한 도입유전자-표현 엠브리오와 공동주입전 핵산-정자머리 연관성에 관한 것이다. 공동 주입에 의한 엠브리오의 대리모로의 비선택적 전이는 삽입된 도입유전자를 발현하는 자손을 생산하였다.
Description
본 출원은 1998년 8월 11일에 출원된 제 60/096,078 호와 1999년 5월 13일에 제출된 제 60/133,970 호인 미국 가특허 출원의 이익을 요구한다.
미국정부는 아동 건강과 인류 진화(Child Health and Human Development)의 국립 협회에 의해 수여된 계약 제 HD-34362 호로 규정된바와 같이 본 발명에 있어서 완불된 라이센스와 특허권자가 합당하게 라이센스를 요구할 수 있는 제한된 범위내의 권리를 가지고 있다.
유전자 도입 동물은 과학, 의약 및 농업적 목적에 있어서 중요하다. 유전공학에 의해 생산된 가금을 이용한 우유에서의 외래 단백질의 생산은 치료학상의 재조합 단백질을 만드는데 있어서 알맞은 시스템으로 믿어진다. 또한, 돼지와 같은 동물 지놈(genome)에 인간 유전자의 삽입은 그러한 동물이 인간 장기용 생체 장기 또는 세포 "공장", 또는 인간 면역 시스템에 의해 거부반응없는 세포로 작용가능하게 할 수 있다.
외래성 DNA를 체성 및 배아 세포에 도입시킴으로써 유전자 도입 포유류를 얻는 여러가지 방법들이 발표되어 있다. 이들 중 한 가지의 방법인 전핵 미세주입(pronuclear microinjection)이 넓게 사용되게 되었고 1980년대 초에 마우스(mouse) 모델에서 최초로 발전되었다. 전핵 미세주입은 하나의 세포(one-cell) 엠브리오(embryo)의 전핵에 도입유전자(tg) DNA의 주입을 필요로 한다[J.W. Gordon, et al., proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 77, 7380(1980); J.W. Gordon and F.H. Ruddle, Science 214, 1244 (1981); R.D. Palmiter and R.L. Brinster, Annu. Rev. Genet. 20, 465(1986); and J.W. Gordon, Int. Rev, Cytol. 115(1989)]. 전핵 접합자(zygote)들의 발생은 마우스에서 간단히 일어나는 반면에, 이것은 큰 상업적 동물종으로 예시된 종에 필연적으로 맞는 것은 아니다. 예를 들어, 소와 돼지들의 경우에, 접합자들은 그 풍부한 지방이 접합자들을 불투명하게 하는 경우에 전핵 주입을 위해서는 어려운 기질이다. 반면에 마우스의 접합자는 반투명이다.
DNA 구조체로 트랜스펙션(transfection)에 의해 얻어진 유전자도입 엠브리오닉 스템(embryonic stem, ES) 셀은 소, 양 등에서 상상의 동물을 얻기 위해 사용되어 왔다. 이 방법은 엠브리오 발생의 상실배 단계(약 20-50개 세포) 또는 포배기 단계(약 100개 세포)에 있는 수정된 엠브리오에 바람직한 돌연변이를 숨기고 있는 유전공학에 의해 생산된 ES 셀의 주입 방법을 포함한다. 이식시, 그런 엠브리오는 종종 상상의 동물을 발생시키는데, 그 야생형 동물과의 계속되는 번식은 불규칙한 빈도(종종 0 과 같다)로 ES 셀이 도출된 지놈의 점 라인(germ line) 유전의 결과로 나타난다. 유전자 이전의 효율이 낮기 때문에, 그리고 엠브리오 이전에 많은 수용 동물들이 필요로 하기 때문에, 이 방법에 의한 유전자 도입한 큰 동물들의 생산은 어렵다고 여겨져 왔다.
상술한 바와 같이, 전핵 미세주입 방법이나 ES 셀 트랜스펙션 방법 어느 것도 아직 tg 삽입의 결과가 조절되거나 예견할 수 없는데, 이는 이종 DNA의 세포로의 도입이 종종 도입유전자(transgene) 또는 그 다수의 복제물들이 호스트 지놈으로 삽입되는 준-랜덤 방식에 의해 야기된 유해한 "위치" 또는 복제 수 효과(copy number effect)에 이른다(J.W. Gordon, supra). 따라서, 유전자도입한 큰 동물들을 생산시 이들 방법의 효율성은 하기된다.
유전자도입 삽입의 결과물에 대한 더 큰 조절은 동형의 재조합을 가능케 하는 DNA 구조체로 트랜스펙션된 마우스 ES 셀 라인을 사용함으로써 이루어질 수 있다[M.J. Evans and M.H. Kaufman, Nature 292, 154(1981); M. Kuehn, et al., ibid. 326, 295(1987)]. 이들 "유전자 타켓(gene targeted)" ES 셀은 다른 자리, 지놈-범위에는 영향을 미치지 않는 매우 정교한 방식으로 녹아웃(knock out) 또는 변형된 하나 이상의 특정 유전자들이다. "불멸화된" 유전자도입 ES 셀 라인은 구조체 삽입 위치를 확인하기 위해 생체 밖에서 확립되어 잘 특정지어져 왔다. 그러나, 유전자 타켓은 현재 하나의 종에 제한되는데 이는 확립된, 점라인(germ line) - ES 셀 라인(cell line)의 존재에 기여하는- 마우스이다.
포유류 점 라인을 변형시키기 위한 이용가능한 방법에 있어서의 한계는 난모세포 또는 주입전 엠브리오를 감염시키는 재조합 레트로바이러스(retroviruse)의 이용 방법[D. Jahner, et al., Proc. Natl. Acad. U.S.A. 82, 6927(1985); A.W.S. Chan, et al., ibid., 95,14028(1998)]과 전달 시스템을 중개하는 복제-결여 아데노바이러스(adenovirus)의 이용 방법[Y. Kanegae, et al., Nucleic Acids Res. 23, 3816(1995)]을 포함한 다른 대안적 방법에 대한 연구를 촉진시켰다. 그러나, 바이러스 실험 계획안은 클로닝시 여분의 단계를 포함하며, 능숙히 처리되어야만 하는 재조합 아데노바리이러스와 레트로바이러스를 용이하게하는 특이화된 강화 설비의 필요로 포함한다. 이들 방법에 의한 바이러스의 전달은 여전히 미세주입 장치 또는 난모세포의 투명대의 제거를 필요로 한다.
정자는 또한 생체외에서의 수정을 하는 동안 DNA를 전달하는 운반체로 사용될 수 있다고 보고되어 있다(IVF)[M.Lavitrano, et al., Cell 57, 717(1989)]. 이 접근에 있어서는, 생체외에서 살아있는 정자는 재조합 DNA를 난모세포내로 도입하는 벡터로 사용될 수 있다. 정자가 매개된 자손으로 DNA 이전은 유전자도입 동물의 발생을 현저하게 단순화시킬 가능성을 가짐에도 불구하고, 유전자도입 동물을 시종일관하게 생산하는데 있어서의 신뢰성이 없는 점 때문에 유전자 도입을 증진시킴에 있어서 살아있는 정자 방법의 효율성에 대하여 상당한 논쟁이 되어오고 있다[M.Lavitrano, et al., 1989, supra; R.N. Brinster, et al.,Cell 59,239(1989); B.Maione,et al., Mol. Reprod. Dev.50,406(1998)]. 하나의 보고서에 의하면, 외래성 DNA가 온전한 정자를 꾸미기 위해 전도된 형식으로 실험되었다[M.Lavitrano, et al., Mol. Reprod. Dev.31,161(1992)]. 이는 막 구조가 정자의 머리와 외래성 재조합생성의 DNA의 안정된 결합에 대한 장벽으로 작용할 수 있다는 것을 제시하였다. 다른 보고서에 의하면, 플라스미드 DNA와 2시간 동안 생체외에서 배양된 살아있는 마우스 정자는 원형질 막 뿐만 아니라 핵속으로 외래성 DNA의 약간의 흡수가 있음을 보여주었다. 정관으로부터 채취된 정자에 6시간 전 에 플라스미드 DNA가 주입된 경우에도 약간의 핵 흡수가 있음을 보여주었다. 그러나 이들 정자의 어느것도 수정된 난모세포에는 사용되지 않았다[E. Huguet and P.Esponda, Mol. Reprod. Dev.51,42(1998)].
따라서, 유전자도입 동물을 믿을 수 있게 생산할 수 있는 효율적인 유전자 도입 방법의 필요성이 여전히 있다. 더욱이 유전자 도입에 의해 생산된 가축을 얻기 위해서나 제약학상의 "생산공장"의 용도로 사용될 큰 동물과 인체 기관이나 이종이식을 위한 세포의 원천을 얻기 위한 효과적인 방법으로서의 필요성이 있다.
본 발명은 외래성 핵산과 막이 파괴된 정자머리 또는 막이 없는 정자머리를 수정되지 않는 난모세포에 공동주입함으로써 유전자도입된 수정된 난모세포를 형성하게 한 뒤 유전자도입한 수정 난모세포가 유전자도입 엠브리오로 그리고 바람직하다면 살아있는 자손으로 발생하게 하는 단계로 구성되는 유전자도입 엠브리오를 얻기 위한 방법을 제공하는 것이다. 상기 공동주입(coinserting) 방법은 막이 파괴된 또는 막이 없는 정자머리와 외래성 핵산을 약 30초에서 5분간, 전형적으로 약 45초에서 3분간, 더 전형적으로는 약 1분에서 2분의 시간동안 함께 전배양(preincubating)하는 하위단계로 바람직하게 구성된다. 난모세포내로의 정자머리와 외래성 핵산의 동시삽입은 미세주입, 바람직하게는 피에조 전기(piezo electrically) 작동 미세주입에 의한다. 막이 파괴된 또는 막이 없는 정자머리와 혼합된 외래성 핵산은 하나 이상의 도입유전자를 포함하여 하나 이상의 도입유전자를 가진 유전자도입 엠브리오를 생산하게 된다.
본 발명에 사용되는 막이 파괴된 정자는 동결-해동 정자나 재수화된동결-건조 정자로부터 얻을 수 있다. 동결-건조에 의한 정자 보존방법과 엠브리오와 살아있는 자손을 얻기위해 생체외에서 난모세포를 수정시킬 재구성 동결-건조 정자를 사용하는 방법은 본 발명과 함께 계류중인 1998년 10월 23일에 출원된 미국 특허 출원 제 09/177,391 호의 주제이다. 이것의 상세한 설명은 본문에 참고자료로 포함된다. 핵산과 전핵 물질로 구성되는 본 발명에 사용하기에 적합한 막이 파괴된 정자머리는 하기된 바와 같이 신선한 정자를 세정제에 의해 처리함으로써 얻어진다.
본 발명의 방법은 유전자도입 엠브리오나 영장류, 양, 소, 돼지, 곰, 고양이, 개, 말과 설치류와 같은 포유류의 살아있는 자손을 생산하기위해 사용될 수 있다. 이 방법은 또한 성게, 바닷가재, 전복이나 조개 등에 제한되지 않고 유전자도입한 무척추동물을 생산하는데 사용될 수 있다. 이 방법은 또한 유전자도입한 물고기, 양서류, 파충류와 조류를 생산하는데 사용될 수 있다. 본 발명의 과정에 의해 생성된 살아있는 유전자도입 자손(파운더(founder) 동물)은 파운더 지놈에 tg의 안정된 삽입과 파운더의 수정율을 보여줌으로써 알 수 있는 바와 같이 그 각자 유전자도입 자손을 생산할 수 있음이 발견되어 왔다.
본문에 설명된 포유류 유전자도입 방법은 외래성 DNA의 수정된 난모세포에 전핵 주입하는 방법 또는 살아있는 온전한 정자를 외래성 DNA와 혼합하거나 또 유전자도입 엠브리오를 형성하는 난모세포를 수정하기위해 이들 정자를 사용하는 방법을 포함하는 기존의 생체외에서의 방법과 대조된다. 본 발명의 방법에 있어서 미수정 중기 Ⅱ 난모세포의 사용은 접합자를 필요로하는 방법보다 나은 상당히 간단 하고 용이한 방법을 나타낸다. 더욱이 세포질내 정자 주입(ICSI)에 의한 유전자도입은 전핵 미세주입의 일정한 결점을 회피할 수 있다. 예로 약 100배 큰 팁(tip) 구경(예로, 직경 10㎛의 ICSI 팁으로 약 78㎛2 와 비교되는 1㎛의 전핵 미세주입 팁으로 약 0.78㎛2)을 가진 미세주입 피펫의 사용은 이스트 또는 포유류의 인위적인 염색체와 같은 큰 구조체를 다루는데 용이할 것이다. 더욱이 본 발명의 방법에 의하면, 막이 파괴되었거나 막이 없는 정자머리로 tg DNA의 도입은 더 높은 안정성과 메가베이스(megabase)와 서브메가베이스(sub-megabase) 구조체의 보호를 제시한다.
도 1은 온전한(신선한)것(A), 트리톤(Triton) X-100에 의해 막이 파괴된 것(B), 동결-해동(C), 또는 동결-건조(D)한 마우스의 정자머리를 가로지른 시상 단면을 도시하는 현미경 사진. (ac는 아크로좀 캡; eq는 이퀘토리얼 세크멘트; pa는 포스트아크로좀 영역)
도 2는 싱글-샷(shot) 이중 유전자도입에 의해 생산된 유전자도입 엠브리오를 도시하는 현미경 사진. 난모세포내로 pCX-LacZ 와 pCX-EGFP tg DNA의 혼합물과 함께 전배양된 정자가 미세주입되었다. 3.5일 후에 호프만 모듈레이션 대조 현미경 관찰에 의해 나타낸(x400) 동일한 엠브리오는 염색되지않는 것(도2A), 장 파장(480nm)의 자외선아래의 GFP 발현(도2B) 그리고 X-갤(gal)로 염색한 β-갈락토시데이즈(galactosidase) 발현(도2C)으로 나타난다.
도 3은 트랜스제닉 파운더와 유전자도입하지 않은 대조로부터의 꼬리 팁 생 검의 분석에 대한 현미경 사진에 대한 도해이다(도3A). 유전자도입하지 않은 것(a)(마우스16)과 유전자도입한 녹색-형광(b)(마우스3)으로부터 꼬리 팁의 형광입체현미경 선을 나타낸다. 녹색 형광 스킨(skin)은 넌(non)-녹색 헤어를 통해 시각화될 수 있다(도3B). 프로브(probe)로 pCX-EGFP 단편을 사용한 대조 B6D2F1(와일드 타입, wt)(0)으로부터, 또 마우스 넘버 3(5에서 9),19(>50), 28(5에서 9), 41(2)로부터 총 DNA 서던블락(suthern blot)분석을 나타내고 있다. 각 지놈당 tg 복제 수의 측정값을 덧붙여 나타내고 있다(도3C). 마우스 넘버 16, 17, 30, 36, 47, 49, 대조군 B6D2F1(wt), 마우스 넘버 3, 19, 28, 41로부터의 총 DNA의 PCR분석을 나타내고 있다.
본 발명은 외래성 핵산과 막이 파괴된 정자머리 또는 막이 없는 정자머리를 수정되지 않은 난모세포에 공동주입함으로써 유전자도입 엠브리오를 얻는 방법을 제공한다. 본 발명의 방법은 다음의 단계로 구성된다. (i) 막이 파괴된 정자나 막이 제거된 정자머리를 구한다. (ii) 막이 파괴된 정자나 막이 제거된 정자머리를 원하는 유전자를 함유하고 있는 외래성 핵산과 함께 혼합한다. 그리고 (iii) 외래성 핵산과 막이 파괴된 정자 또는 막이 제거된 정자머리를 분리된 수정되지 아니한 난모세포에 함께 삽입하여 원하는 도입유전자를 발현하는 유전자도입 엠브리오를 형성하게 한다. 이 방법은 대리모의 자궁에 유전자도입 엠브리오를 이식하고 이 엠브리오가 살아있는 유전자도입 자손으로 발생하도록하는 이 후의 단계를 포함한다.
본 발명의 방법의 각각의 단계와 그 하위 단계의 실시예를 지금 더 구체적으 로 설명하겠다.
신선한 정자의 준비.
무척추동물과 척추동물로부터 신선한 정자는 이 분야에서 알려진 기술에 의해 모아진다. 예로, 마우스, 골드 햄스터, 기니픽, 래빗 등과 같은 설치류의 성숙한 정자는 미측 부고환(caudae epididymis)에서 수집할 수 있는 반면에 인간, 돼지, 말, 황소, 염소, 닭 등과 같은 다른 종에서는 성숙한 정자를 생식능력이 있는 수컷의 신선한 사정한 정액에서 분리할 수 있다. 물고기(예로, 검상꼬리송사리, Xiphophorus helleri)와 성게(Tripneustes gratilla)와 같은 무척추동물들은 성숙한 수컷의 고환으로부터 수집할 수 있다.
미측 부고환으로부터 정자를 얻는 방법의 예는 다음과 같다. 미측 부고환은 성숙한 수컷 마우스(약 생후 8주령된)로부터 분리된다. 혈액과 지방을 미측 부고환으로부터 제거한다. 그리고 나서 밀집한 정자 덩어리를 방출시키기위해 압착한다. 정자 덩어리의 한 방울(약 2마이크로리터,㎕)을 1.5 밀리미터(㎖) 폴리프로필렌 원심분리기 튜브에 넣고 CZB 메디움(medium)(이것의 구성은 아래에서 설명한다), 인산염으로 완충된 셀라인 또는 등장성의 셀라인과 같은 0.5ml의 따뜻한 생리적 메디움으로 입힌다. 37℃에서 약 10에서 20분 후에 수면에 뜨는 것에서 운동성있는 정자를 수집할 수 있다.
정액으로부터 정자를 얻는 방법의 예는 다음과 같다. 인간으로부터 사정된 신선한 정액을 약 30분간 실온(약25℃)에서 액화시킨다. 그리고나서 그 정액을 약 10ml의 셀라인으로 희석하고 부스러기를 제거하기 위해 약 두겹의 티슈 페이퍼를 통하여 여과한다. 그리고나서 여과액을 약 10분간 400 x g 으로 원심분리하고 침전된 정자를 바람직한 농도의 생리적 용액에 재현탁화 한다.
고환으로부터 정자를 얻는 방법은 다음과 같다. 도려내진 고환이 적혈구-용해 완충액(예로, 155밀리몰(mM)의 NH4Cl, 10mM KHCO3, 2mM EDTA, pH 7.2-7.4)에 놓고 정교한 가위로 잘게 썬다. 그리고 부스러기를 제거하기 위해 약 두겹의 티슈 페이퍼를 통하여 여과시킨다. 여과액을 원심분리하고(예로, 700x g, 5분간) 펠릿(pellet)을 바람직한 농도의 생리적 용액에 재현탁화 한다.
이렇게 발견한 온전한 원형질과 아크로좀 막을 가진 마우스 정자를 도 1에서 나타내고 있는데, 이것은 마우스 정자의 머리를 관통한 전형적인 시상 단면의 현미경 사진이다. 이곳의 "ac"는 아크로좀 캡(acrosomal cap)을 나타내고, "eq"는 이퀘토리얼 세그멘트(equatorial segment)을 나타내고, "pa"는 포스트아크로좀 영역(postacrosomal region)을 나타낸다. 정자는 하기되는 동결-해동 또는 동결-건조 과정을 준비하면서 생리적 메디움에 현탁화된다. 선택적으로 정자는 막이 제거된 정자머리를 얻기 위해 더 많은 과정을 수행할 수 있다.
막이 파괴된 정자의 준비.
막이 파괴된 신선한 정자.
상기에서 설명한 바에 따라 얻어진 신선한 정자의 막은 아래에서 더 자세히 설명하겠지만, 피에조 전기 작동 미세주입장치로부터 단일 펄스의 적용에 의한 미세주입 피펫내에서 정자의 꼬리부터 머리의 전위(轉位)에 의한 기계적인 방법에 의 해 파괴될 수 있다. 여기서 사용된 바와 같이, "신선한(fresh)" 정자라는 용어는 수정되지 않은 난모세포로 주입되는 막이 파괴된 정자를 말한다. 그리고 이것은 IVF에 대한 이전의 보고에 있어서의 DNA의 전달을 위한 운반체로 사용된 "살아있는(live)"정자와는 구별되고, 또 차이를 나타낸다.
동결-해동된 정자.
정자의 동결과 그 후의 해동은 원형질 막의 파괴를 가져온다. 이후에 더 자세하게 기술되겠지만, 원형질 막이 온전한(live)것과 원형질 막이 손상을 입은(dead)것을 구별할 수 있는 생존 능력 염색(staining)기술에 의해 평가할 수 있다. 이런 동결-해동된 막 파괴 정자는 일반적으로 "dead"로 판단된다. 동결-해동된 정자는 T.Wakayama, et al., J.Reprod. Fert. 112, 11(1996) 과 S.Kuretake, et al., Biology of Reproduction 55, 789(1996)에서 설명한 방법에 따라 준비될 수 있다. 특히 CZB 메디움에 마우스 부고환 정자를 현탁화시킨 후에 18% 라피노오스(raffinose)와 같은 동결방지제와 함께 또는 동결방지제 없이 -20℃또는 -50℃또는 -196℃에서 냉각시키고 1일에서 28일 동안 동결보관한 후에 해동시키면 수정되지 않은 난모세포에 이들의 머리가 미세주입될 때 정상의 수정 능력있는 살아있는 자손의 발생을 지지하게 된다.
마우스 부고환 정자를 동결시키는 모범적인 방법에 있어서, CZB 메디움의 정자 농도는 ml당 약 3에서 10x106 이다. 100㎕의 정자 현탁액 일정량을 1.5ml의 폴리프로필렌 미세원심분리 튜브로 옮기고 36%(w/v)D(+)-라피노오스(raffinose)(18% 라 피노오스의 최종 농도를 줌)와 함께 또는 이것 없이 같은 양의 CZB메디움과 완전히 혼합한다. 이 현탁액의 일정양 50㎕을 라벨된 1ml의 극저온 저장용기(A/S NUNC, Copenhagen)로 분배한다. 이 용기는 단단히 막개를 막고 곧바로 -20℃나 -50℃ 결빙기나 액체 질소(-196℃)에 넣는다. 샘플은 1일에서 4주까지의 범위에 따라 저장할 수 있다.
해동에 있어서, 용기를 결빙기나 액체 질소로부터 옮겨서 24℃에서 26℃의 물이나 공기에서 약 10분 정도 놓아둔다. 해동된 정자 현탁액이 하기될 원형질내 정자 주입(ICSI)의 사용을 위해 지금 준비되어 있다.
마우스 부고환 정자의 동결-해동된 정자를 얻기 위한 방법을 본문에 기술하였음에도 불구하고 이 분야에서의 통상적인 기술은 이 방법을 과도한 실험없이도 다른 척추동물이나 무척추동물로부터 얻은 정자에 적용시킬 수 있다.
재수화된 해동-건조된 정자.
해동-건조 정자는 원형질 막의 파괴의 결과를 가져온다. 이는 아래에서 더 자세하게 설명하겠지만, 원형질 막이 온전한(live)것과 원형질 막이 손상을 입은(dead)것으로 구별할 수 있는 생존 능력 염색(staining)기술에 의해 평가할 수 있다. 이런 해동-건조 막 파괴 정자는 일반적으로 "dead"로 판단된다. 해동-건조 정자는 T.Wakayama and Yanagimachi, Nature Biotechnology 16, 639,(1998)과 우리의 계류 중인 1998년 10월 23일에 출원한 U.S.특허 출원, Serial No.09/177,391에서 설명한 방법에 따라 준비될 수 있다. 특히 특허 출원은 척추동물과 무척추동물로부터 얻은 동결-건조 정자에 있어서 사용될 수 있는 일반적인 방법을 설명하고 있다. 모범적인 예에 있어서, 마우스 부고환 정자는 (1) 4mg/ml BSA를 함유하는 에틸렌디아민 테트라아세틱 애시드(EDTA)가 없는 CZB 메디움이나 (2) 10%(v/v)의 태아 소(bovine) 혈청(Hyclone,Logan,UT)으로 보충된 둘베코의 변형 에갈의 메디움(Dulbecco's modified Eagle's medium; DMEM)내에 현탁화한 후에 액체 질소에서 동결시키고 물이 거의 0퍼센트가 되게 건조시킨다. 그리고 6달 동안 동결-건조하게 저장하고 재수화시키면 이들이 재수화되어 수정되지 않은 난모세포에 이들의 머리가 미세주입될 때 정상의 수정 능력있는 살아있는 자손의 발생을 지지하게 된다.
마우스 부고환 정자를 동결시키는 바람직한 방법에 있어서, CZB나 DMEM메디움에서의 정자 농도는 ml당 약 3에서 10x106이다. 정자 현탁액의 일정양(100㎕)을 곧바로 액체 질소에 담겨질 2ml 앰플(Wheaton Scientific, Millville, Nj, Catalogue No. 651506)에 넣는다. 10분 후에, 이 앰플을 동결-건조 시스템(Model 10-020, Virtis Co.,Gardner,NY)에 부착된 예냉기(pre-cooled)(-50℃)동결 플라스크에 놓는다. 삽입물의 압력은 약 1밀리토르(milliTorr)이다. 약 12시간 후에, 그 플라스크를 개스-건조 병(Fisher Scientific, Pittsburg, PA Catalogue No.09-204)의 방법에 의해 공급되는 할로겐으로 채운 후에 그 시스템으로부터 옮긴다. 각각의 앰플은 진공 펌프와 99%이상의 가스가 그것으로부터 펌프질되어 나온 후에 밀폐되는 프레임에 연결된다. 앰플을 각각 알루미늄 호일로 싸서 실온이나 4℃의 어두운 곳에서 사용되기 1년 전까지 저장한다.
전술한 동결-건조된 정자의 재수화에 있어서, 위에서 준비한 동결-건조 정자를 함유하는 앰플은 깨어져서 100㎕의 증류수가 앰플에 첨가되어 재구성된 정자 현탁액을 형성하게 한다.
마우스 부고환 정자에 있어 재수화 동결-건조 정자를 얻는 방법은 여기에서 설명하고 있음에도 불구하고, 이 분야의 통상적인 기술의 하나는 미국 특허 출원, 제 09/177,391 호에서 나타내고 있는 바와 같이 다른 척추동물이나 무척추동물로부터 얻은 정자에 이 방법을 과도한 실험없이도 적용할 수 있다.
정자머리의 주입 후의 난모세포의 활성과 정상 수정의 빈도는 동결-건조된 정자의 재수화 후 시간의 증가와 함께 감소하는 특징이 있다. 재수화와 주입 간의 허용될 수 있는 시간 간격은 동물의 종에 따라 변할 수 있다. 그러나 마우스 정자에 있어서의 이 시간 간격은 적당하게는 1시간이나 그 이하이다.
막이 제거된 정자머리의 준비.
막이 제거된 정자머리는 원형질 막과 내측 및 외측 아크로좀 막을 포함한 모든 막이 부족한, 하지만 핵과 전핵 물질을 보유하고 있는 세정제에 의해 추출된 머리를 말한다. 예로, 정자 머리는 SDS(소디움 도데실 설페이트)와 함께 또는 이것 없이 트리톤(Triton) X-100으로 처리함으로써 막을 제거할 수 있다. 트리톤 X-100은 단백질의 변성이 없는 조건 하에서 막 구성요소의 제거를 위해 널리 사용되는 잘 알려진 이온성 없는 표면활성제이다. SDS는 막 단백질을 포함한 다양한 단백질을 용해시키는데 사용되는 음이온성의 세정제(detergent)이다. 마우스에 있어서, Triton X-100을 사용함으로써 정자머리 막의 제거는 난모세포를 활성화시키고 정상 적으로 엠브리오의 발생을 이끌어갈 수 있는 것을 보여주고 있다.
정자머리의 막을 제거하는 바람직한 예는 다음과 같다. 상기에서처럼 준비된 정자 현탁액의 일부가 초음파 처리된다. 예로 상기에서처럼 후미측 부고환, 고환 또는 정액에서 수집된 정자는 5ml의 BM 완충액(75밀리몰(mM)의 NaCl, 24mM EDTA, 50mM Tri-HCl,pH 7.2)내에서 현탁화되고 바이오소닉 소니케니터(biosonik sonicator)의 70%-80%의 출력에서 약 30초간 초음파처리된다. 정자의 95%이상이 이 처리에 의해 머리가 떨어져나가게 된다. 정자머리의 막을 제거하기 위해서 초음파 처리된 정자 현탁액을 700x g에서 약 5분간 원심분리하고 그 펠렛을 BM 완충액으로 세척한 후에 상온에서 약 5분간 NIM메디움(123.0밀리몰(mM)의 KCl, 2.6mM NaCl, 7.8 mM NaH2PO4, 1.4mM KH2PO4, 3mM Na2EDTA로 구성되고 pH가 7.2인 NIM메디움)에서 1%의 트리톤 X-100으로 처리하였다. 그리고나서 머리는 NIM메디움으로 완전히 씻어내고 정자 현탁액 메디움에서 다시 현탁화시켰다.
정자 생존능력의 평가.
정자머리의 전방 영역을 관통하여 장축을 따른 단면을 나타내는 도1의(B),(C)와 (D)의 현미경은 사진은 이퀘토리얼 영역(eq)을 제외한 원형질과 아크로좀 막은 트리톤 X-100(세정제)(B), 동결-해동(C) 또는 동결-건조(D)의 처리에 의한 정자내에서 없어지거나 파괴된다는 것을 보여준다. 정자의 생존능력은 일반적으로 정자가 살아있거나 또는 죽어있는 것을 구별할 수 있는 어떤 염색 방법을 이용함으로써 평가할 수 있다. 본 발명에 있어서의 사용을 위한 적당한 상업적으로 이용가능한 생존능력 테스트 킷트는 생존/죽음(live/dead) FertiLight(Molecular Probe, Eugene, Oregon으로부터 입수가능함)인데, 이는 프로피디움 아이오다이드(propidium iodide)/SYBR14로 염색한 후에 자외선(UV)현미경 아래서 형광 패턴에 따라 원형질 막이 온전한 것과(live) 손상을 입은 것(dead)을 구별할 수 있게 한다. 온전한 원형질 막을 가진 "온전한(live)" 정자의 핵은 녹색 형광을 가진 반면 "dead" 정자의 그것은 밝은 오렌지-레드의 형광을 가진다. 위에서 설명한 것과 같은 물리적 막 파괴 또는 동결-해동, 동결-건조와 막 제거 과정에 의해 준비된 모든 정자들은 일반적으로 "dead"로 나타날 것으로 기대된다.
도입유전자를 함유한 외래성 핵산의 선택과 준비.
본 발명에 따은 유전적 변형은 외래성 DNA를 접합자의 지놈으로 안전하게 도입하는 것을 말하는 것으로 또 이것은 외래 DNA를 숙주세포의 핵 DNA내로 그리고/또는 미토콘드리내의 핵밖의 DNA내로 도입하는 것을 포함한다. 외래 DNA는 변이 전에 접합자에 고유한 것(정상적으로 내재하는 것이 아닌)이 아니다. 또는 한 번의 복제 이상에서는 정상적으로 존재하지 않는다. 그러나, "외래(foreign)" DNA는 고유한 진의 그 이상의 복제를 포함하거나 상호억제(cosuppression)의 목적으로 도입되는 유전자 서열을 포함한다.
외래 유전 물질은 제한되지 않고 식물, 박테리아, 박테리오파지, 플라스미드, 플라스티드, 포유류와 합성 DNA구조물을 포함하는 다양한 기원으로부터의 DNA를 포함할 수 있다. DNA는 원형이거나 직선형이 될 수 있고 싱글 스트랜드(strand) 또는 더블 스트랜드가 될 수 있다. DNA는 센스나 안티-센스의 배열로 그리고 싱글 스트랜드나 더블 스트랜드의 형태로 호스트(host) 셀 DNA내로 도입될 수 있다. 호스트 셀 내로 도입되는 DNA의 모두 또는 일부는 호스트의 지놈으로 도입될 수 있다.
플라스미드나 특정의 유전자을 포함하는 클로닝 벡터의 선택이나 또는/그리고 합성 구조는 이 분야에서 널리 알려져 있다. 상상의 플라스미드의 합성 구조물은 유전자 또는 관심을 가지는 유전자을 함유하고 종종 호스트 지놈으로의 도입을 용이하게 할 프로모터 그리고/또는 반대 소스로 얻어지는 리더 서열(leader sequences)을 포함한다. 원핵생물의 클로닝 벡터 서열은 미세주입 유전자의 도입 빈도에 명확한 효과를 가지지 않음에도 불구하고 마우스와 같은 포유류의 점 라인(germ line)으로 도입된 진핵 유전자의 발현을 심하게 방해할 수 있음이 주지되어 왔다[B. Hogan, et al., in Manipulating the Mouse Embryo, Section E, Second Ed., Cold Spring Harbor Laboratory, p.22(1994)을 보라)]. 그런 까닭에 진의 적합한 발현을 원한다면, 마우스와 같은 포유류의 점 라인으로 그것을 도입하기 전에 클론된 유전자로부터 실질적으로 모든 벡터 서열을 제거하는 것을 권장할 수 있다. 벡터 서열은 이 분야에서 알려진 방법에 의해 원하는 유전자, 프로모터, 인헨서(enhancer)등과 같은 것을 포함하는 단편을 생산하기 위해 벡터에 존재하는 제한 부위에 따라 제한 효소를 사용함으로써 제거될 수 있다.
도입된 유전자의 발현의 정도는 대체로 프로모터의 힘과 유전자가 도입된 세포내로 도입된 DNA의 복제 수에 의해 결정된다. 그런 까닭에 발현 벡터는 SV40 어얼리(early) 또는 레이트(late)프로모터, 사이토메갈로바이러스 이미디에이트 어얼 리(CMV-IE)프로모터, 사이트플라즈믹 β-액틴 프로모터와 아데노바이러스 메이저(major) 레이트 프로모트와 같은 강한 프로모터를 사용한다.
세포내로의 성공적인 DNA의 전달은 "리포터(reporter)" 유전자의 발현에 의해 일차적으로 평가될 수 있다. 리포터 유전자은 변이를 위해 사용된 DNA의 구성요소이고 또 다른 원하는 특징을 주는 도입유전자와는 동일하거나 혹은 다를 수 있다. 리포터 유전자에 의해 형질변환된 세포나 조직에 수여된 특징은 보통 조직화학이나 형광분석에 의해 쉽게 발견할 수 있다. Sratagene, Inc.,Lajolla, CA와 Clontech Laboratories, Inc., Palo Alto, CA와 같은 이 분야에서 알려진 기술인, 트랜스펙션 효율의 양을 표시하기 위해 생체외에서 상업적으로 사용된 많은 리포터 진과 수 많은 플라스미드와 상업적 원천으로부터 이용가능한 리포터 도입유전자를 포함하는 클로닝벡터가 있다. 본 발명의 사용에 있어 바람직한 리포터 유전자은 제한되지 않고 시크리티드 알카린 포스파테이즈[SEAP; β-갈락토시데이즈(β-gal); 개똥벌레 루시페라아제와 클로람페니콜 아세틸트랜스페라제(CAT)를 포함한다]. 상피내(in situ) β-gal 염색(staining), 상피내 β-글루쿠로니에디즈[GUS] 및 상피내 루시케라제 에세이(assay)와 같은 생체내 리포터 에세이(assay)는 고정된 세포나 조직 단편에서 유전자 전이를 발견하는데 또한 이용할 수 있다. 이들 과정들은 효소 기질이나 항체로 염색하는 것을 수반하는 트랜스펙션된 세포의 시각화를 가능하게 한다. 이들 과정 중에, Escherichia coli LacZ 유전자의 발현을 수반하는 in situ β-gal 염색은 이것의 간단함과 민감성 때문에 넓게 사용되는 방법이다. 이 과정에서, X-gal 기질과 β-gal의 반응은 광 현미경아래서 쉽게 시각화될 수 있는 진한 푸른색을 나타낸다. 그리고 이것은 트랜스펙션 효율의 직접적 평가를 가능하게 한다.
해파리 Aequoea victoria 로부터 녹색 형광 단백질(GFP)은 유전자 발현을 모니터링하고 다양한 세포와 기관에서 단백질의 위치에 대한 중요한 리포터가 되었다.[R.Y Tsien, Annu. Rev. Biochem. 67, 509(1998); G. Zhang, et al., Biochemical and Biophysical Research Communications 227, 707-771(1996); T. Takada, et al., Nature Biotechnology 15, 485-460(1997)]. GFP는 발견(detection)을 위한 어떤 기질을 필요로하지 않기 때문에 유전자도입 엠브리오의 선택을 위한 적당한 마커(marker)가 될 수 있다. 진핵 유전자의 세포에서의 GFP발현은 세포들이 UV나 푸른 빛에 의해 자극되는 경우 녹색 형광을 생산한다. GFP의 발색단은 단백질의 1차구조에 내재하고, GFP로부터의 형광은 추가적인 보조인자, 기질 또는 추가적인 유전자 생성물을 필요로 하지 않는다. GFP형광은 안정되어 있고, 종에 독립되어 있고 또 형광 현미경 기술, 플로(flow) 세포(혈구)계산 기술과 거시적 영상 기술을 이용하여 비침습적으로(noninvasively) 모니터될 수 있다. 청색광에 의한 자극시에 GFP의 형광 강도를 높이기위해 포유류의 세포에서 EGFP의 발현을 이끌어가는 휴먼 CMV의 이미디에이트 어얼리 프로모터(immediate early promotor)와 SV40 폴리아데닐레이션 시그날(polyadenylation signal)을 함유하는 향상된 GFP(EGFP)변이가 구성되었다.(Clontech Laboratories로부터 입수가능한 pEGFP-C1)
원하는 도입유전자를 함유하는 벡터 단편과 함께 정자의 혼합.
상기에서와 같이 준비된 정자는 더 이상의 준비없이 또는 상기에서 설명한 바와 같이 3개의 막-파괴 실험계획중 하나를 받은 후에 벡터 단편과 함께 혼합될 수 있다. 전형적인 혼합 과정에 있어서, 벡터 단편(약 2.5ng/㎕)을 함유하는 1㎕의 DNA 용액이 CZB 나 NIM과 같은 생리학적 메디움내의 약 2에서 5x105의 정자를 포함하는 9ul의 현탁액과 함께 혼합되고 또 7ng/ul의 최종 DNA단편 농도를 주는 피펫팅에 의해 혼합된다. 그 혼합액은 실온(약 25℃)에서 또는 얼음위에서 약 30초에서 약 5분간, 전형적으로는 약 45초에서 약 3분간, 더 전형적으로는 약 1분에서 약 3분간, 바람직하게는 약 1분간 배양된다. 배양 시간과 온도 뿐만 아니라 정자와 DNA단편의 농도는 이 분야의 기술에서 알려진 바와 같이, 단편의 크기에 따라 또는 정자의 크기 등에 따라 변할 수 있다.
정자와 DNA단편의 혼합물의 미세주입은 보통 실온에서 정자-DNA혼합의 1시간이내에 또는 정자의 막제거의 1시간 이내에 행해진다.
수용 난모세포.
본 발명의 방법에 사용될 수 있는 수용 난모세포는 생체 내에서 계속하여 성장할 미성숙 난모세포(예로, GV단계)와 동물로부터 수확된 성숙 난모세포(Met II 단계)모두를 포함한다. 예로 성숙 난모세포는 동물에 생식선자극호르몬이나 다른 호르몬(예로, 말과 인간의 융모막성 생식선 자극호르몬의 순차적 투여)의 주입에 의한 과배란에 의한 방법으로, 그리고 배란 후(예로, 집 고양이는 발정시작 후 80에서 84시간 후에, 소는 발정시작 후 72에서 96시간 후에, 마우스는 발정시작 후 13에서 15시간 후에) 짧은 시간내에 수술적으로 수확하는 방법에 의해 얻을 수 있다. 단지 미성숙 난모세포를 얻는 것이 가능한 경우에는 그들이 진행되어 Met II 단계에 이르기까지 성장-촉진 메디움에서 배양한다. 이것은 생체 외 성숙("IVM")이라고 알려져 있다. 미성숙 소 난모세포의 IVM방법은 WO 98/07841에 설명되어있고, 미성숙 마우스 난모세포의 IVM은 Eppig&Telfer (Method in Enzymology 225,77-84, Academic Press, 1993)에서 설명하고 있다.
수정에서의 난모세포의 생체 내 성숙단계는 이미 앞에서 엠브리오를 생산하는 생체 외 핵 이식 방법의 성공에 있어 중요하다고 보고되어 있다. 난모세포의 세포질의 화학은 성숙과정을 통하여 변한다고 알려져 있다. 예로, 성숙, 분열중기단계-촉진 인자("MPF")와 관련되는 세포질 활성은 미성숙 난모세포에서 제일 감수 분열의 중기에서 높아지고 제일 극체의 형성 및 배출과 함께 감소하고 Met Ⅱ에서 다시 최고 수준에 이른다. MPF의 활성은 Met Ⅱ에서 난모세포에 높게 나타나고 난모세포의 활성에 따라 급격히 감소한다. 일반적으로, 포유류의 핵 전환에 대한 보고는 수용자로서 MetⅡ난모세포의 사용에 관한 설명이다. MetⅡ난모세포는 수정능력있는 정자에 활성화되는 형태의 것이다. 세포의 핵이 수정되지 않은 MetⅡ난모세포(말하자면, 높은 MPF활성을 가진 것)의 세포질내로 도입되는 때에는 세포의 핵 피막(피막이 있는 경우)이 부서지고 염색질이 농축되어 중기 염색체의 형성의 결과를 낳는다.
수용 난모세포는 난관으로부터 난세포더미 복합체의 형태로 수술적으로 수확되어 Hepes-CZB메디움(아래에서 설명함)과 완충 메디움에 넣는다. 소구(cumulus) 세포는 0.1% 보바인 테스티큘라 하이알유로니데이즈(bovine testicular hyaluronidase)(예로, 300 USP units/mg, ICN Pharmaceutic, Costa Mesa, CA)와 같은 분산 효소로 분산된다. 소구가 없는 난모세포는 공기내의 5%(v/v) CO2로 평형이 유지된 CZB메디움내와 같은 메디움내에서 35.7℃에서, 미네랄 오일(E.R. Squibb 와 Sons, Princeton, NJ로부터 입수할 수 있는 것과 같은)아래에서 더 이상의 처리전에 1시간 보다 적은 시간동안 놓여진다.
생체외의 성공적인 수정을 위해 필요한 정자 구성요소.
마우스에서는 정상적인 수정은 분리된 정자머리를 난모세포 내로 주입함으로써 달성될 수 있고, 원형질과 아크로좀 막과 모든 꼬리 구성요소들은 정상적인 엠브리오 발생에 있어서 필수적인 것은 아니라는 것이 알려져 있다. 마우스와 어쩌면 가장 일반적인 실험실 설치류들은 정자 중심체의 정상적인 수정을 위해 필요하지 않고 또 정상적인 수정의 동안에 정자의 목 부근의 정자 중심체는 수정 후 난모세포 내에서 퇴화되는 것으로 예정되어 있다는 점에서 "예외적(exceptional)"이라고 할 수 있다.
반대로, 소와 인간을 포함한 대부분의 진수(eutherian) 포유류에 있어서는 정자의 중심체는 엠브리오의 발생 동안 계속되는 난할에 있어서 뿐만 아니라 수컷과 암컷 전핵의 결합에 필수적인 미세소관의 형성에 있어서 중심적인 역할을 한다. 그런 까닭에 이들 종에 있어서는 정자의 핵(머리)과 중심체 모두가 난모세포에 주입되어야하는 것은 정상적인 자손을 생산하는데 필수적인 것으로 보인다. 이 시점 에서는 모든 종의 정자 중심체가 동결-해동, 동결-건조나 세정제에 의한 막 제거 시에 살아남는지에 대하여는 알려져 있지 않다. 만일 살아남지 못하다면, 정상적인 엠브리오의 발생을 확실하게 하기 위해 동결되지 않은 정자로부터 얻은 중심체를 난모세포 내로 동결-해동, 동결-건조 나 막 제거된 정자머리와 함께 주입하여야 한다. 그러나 비정상적인 전핵 발생이나 비정상적인 엠브리오 발생의 결과를 낳을 수도 있다.
중심체는 정상적으로 머리와 꼬리가 분리될 때 정자머리의 후부 끝에 부착되거나 정자 꼬리의 전방 끝에 부착된다. 그런 까닭에 정자의 중심체는 정자 머리와 동시에 난모세포 내로 삽입될 수 있거나 또는 동시적인 또는 연속적인 정자 꼬리의 삽입 수단에 의해 주입될 수 있다.
정자 핵의 수용 난모세포로의 주입.
온전한 정자는 외래성 핵산과 함께 수용 난모세포의 세포질 내로 주입될 수 있다. 정자의 크기가 큰 종에 있어서는 바람직하게는 분리된 정자머리(핵)가 미세주입기술에 의해 수용 난모세포로 직접 주입된다. 동결-해동된, 재수화된 동결-건조 정자머리 또는 막이 제거된 정자머리와 함께 외래성 핵산의 수용 난모세포의 주입의 바람직한 방법에는 피에조 전기 작동 미세피펫이 사용된다.
바람직한 피에조 전기 작동 장치는 Piezo Micromanipulator/Piezo Impact Drive Unit by Prime tech Ltd(Tsukuba,Ibarakiken, Japan)의 이름으로 판매된다. 이 장치는 고도로 조절된 범위 내에서 빠른 방법, 아주 짧은 거리(약 0.5 um)의 (주입)피펫 홀드를 향상시키기 위해 피에조 전기 효과를 이용한다. 각 펄스의 강도 와 지속의 정도는 변화될 수 있고 콘트롤 유닛에 의해 조절된다.
난모세포로의 주입을 위해, 정자/정자머리와 외래성 핵산과의 혼합물내의 단일 정자는 벤더(vondor)의 지시에 따라 피에조 전기 작동 장치내에 장착되어 있는 짧고 편평한 끝을 가진 약 5um 내경의 주입 피펫속으로 꼬리가(꼬리가 있다면) 제일 먼저 빨려 들어간다. 정자 머리와 꼬리는 목 부근에 단일의 또는 수개의 피에조 펄스를 작용시킴으로써 분리된다. 그리고 나서 머리는 피펫속으로 깊이 끌어당겨진다. 선택적으로 정자/정자머리와 외래성 핵산과의 혼합물 내의 단일 정자머리는 난모세포 내로의 주입을 위해 주입 피펫 속으로 빨려들어갈 수 있다.
정자머리(핵)와 외래성 핵산의 동시 주입동안 난모세포는 통상적인 홀딩 피펫에 의해 부착된다. 선택된 정자머리를 함유하고 있는 주입 피펫의 팁은 난모세포의 투명대와 접촉하게 되고 다수의 압전기 펄스( 강도 1-5, 스피드 4-6의 크기로 셋팅된 컨트롤러을 사용하여)로 내부에 약간의 음압을 유지하면서 피펫을 전진시키기 위해 적용된다. 피펫의 팁이 투명대를 통과하여 지나가면 결과적으로 조나 프러그(zona plug)가 난황주위 공간으로 밀려가고 정자머리는 피펫의 팁 근처에 이를 때 까지 앞으로 밀려간다. 그리고 나서 피펫 팁은 원형질 막과 나란히 놓여지고 전진(난모세포의 반대편으로)되고 홀딩 피펫은 난모세포의 피질의 반대편에 거의 다다르게 된다. 난모세포 원형질 막은 주입 바늘 팁 주위에 깊이 함입된다. 투명대의 급한 이완에 의해 나타나는 것과 같이 1에서 2의 압전기 펄스(강도1-2, 속도 1)의 적용에 의해 투명대는 피펫 팁에서 구멍이 뚫리게 되는데 이것은 명확하게 볼 수 있다. 그리고 나서 정자머리는 외래성 핵산을 함유하는 동반하는 메디움의 최소 양(약 6 pl)과 함께 난세포질(ooplsma)로 밀려가게 된다. 그 후 피펫을 난모세포의 세포질 내에 새롭게 도입된 머리를 남겨둔 채 조심스럽게 회수한다. 이 방법은 활발하고 전형적으로 다른 모든 시간에는 배양 상태에서 유지되는 10-15 난모세포 군에서 행해진다.
통상적인 주입 피펫이 사용되는 대안적인 미세주입 변형들이 공동주입 과정을 위해 사용될 수 있다. 햄스터 난모세포로 정자머리를 주입하기 위해 통상적인 피펫을 사용하는 적합한 미세주입방법의 예는 Yanagida, K.,Yanagimachi, R., Perreault, S.D.와 R.G.Kleinfeld, Biology of Reproduction 44,440-447(1991)에서 설명하고 있다. 이런 방법에 속하는 이것의 상세한 설명은 여기서 참고문헌으로 도입될 수 있다.
외래성 핵산과 정자/정자머리/막이제거된 정자머리의 미세 공동주입은 여러 가지 잇점을 제공한다. 첫째로, 미세주입에 의해 도입되는 정자/정자머리는 정자 타입의 폭 넓은 범위에 적용할 수 있고, 크기와 모양 등에 관계없이 적용할 수 있다. 둘째로, 미세주입은 상기에서 설명한 외래성 핵산에 덧붙여 다른 물질(agent)의 난모세포로의 조심스럽게 조절된 공동-주입(기증 정자/정자머리)이 가능하다. 이들은 아래에서 예를 들어 보여주고 있다. 셋째, 본 발명의 실시예의 정자/정자머리의 주입은 피에조 전기 작동에 의한 미세주입과 빠르게 행해지고 샘플들의 효과적인 처리가 제공되어 정자와 조작이 행해진 난모세포의 외상을 줄인다. 어떤 종(예로 마우스)의 난모세포는 통상적인 바늘을 사용한 미세주입은 잘 받아들여지지 않는 반면에 피에조 전기적 작동되는 미세주입은 놓은 성공률을 제공한다.
수정된 난모세포의 활성.
마우스 난모세포는 단일의 온전한 마우스 정자, 이것의 분리된 머리의 주입에 의해 활성화될 수 있다는 것은 알려져 있다. 분리된 정자꼬리는 난모세포를 활성화시킬 수 없다. 활성의 정자-유래 난모세포-활성 인자들은 전형적으로 둥근 정자세포의 정자로의 변형동안에 나타난다. 이들 인자들의 작용은 고도로 종-특이성이 있는 것은 아니다, 왜냐하면 마우스 난모세포는 햄스터, 래빗, 돼지, 인간과 물고기 등과 같은 다른 종의 정자의 주입에 의해서도 활성화되기 때문이다. 이런 활성인자의 하나는 크로모좀의 이퀘토리얼 세그멘트 영역(equatorial segment region)에 존재하는 33킬로달톤(kilodalton)단백질이다. 오실린(oscillin)이라 불리는 이 단백질은 단순히 동결과 해동에 의해 성숙한(햄스터)정자로부터 쉽게 추출된다. 오실린 뿐만 아니라 성숙한 정자는 쉽게 추출되지 않지만 Triton X-100과 SDS로 정자를 순차적으로 처리함으로써 얻을 수 있는 다른 활성 인자를 가지고 있는 것 같다. 쉽게 추출되는 오실린과 동결/해동 추출-저항 인자가 생물학적으로 또 화학적으로 동일한지는 알려져 있지 않다.
트리톤 X-100의 존재하에 초음파처리된 정자머리는 모든 구성요소들을 잃어버리지만 핵과 핵주위 물질은 그렇지 않다는 것은 알려져 있다. 하지만 난모세포내로 미세외과수술적으로 주입되는 경우에 트리톤 X-100으로 처리된 정자머리(원형질 막을 가지지 않고 핵과 핵주위 물질을 가진)는 온전한 정자만큼이나 효과적으로 난모세포를 활성화시킨다.
우리의 계류 중인 U.S.특허 출원, Serial No. 09/177,391 과 T.Wakayama, et al., 1997, supra에서 설명한 바와 같이 적어도 마우스에 있어서는 동결-해동 또는 동결-건조 정자머리의 주입후에 살아남은 대부분의 난모세포들은 활성화되고 정상적으로 수정되었기 때문에 정자-유래의 난모세포-활성 분자는 동결-해동과 동결-건조에 저항성을 가져야 한다.
만일 다른 종에서 정자머리의 주입이 난모세포를 활성화시키지 못한다면 전기활성화, 하나 또는 그 이상의 난모세포-활성 물질의 주입, 또는 하나 또는 그 이상의 난모세포-활성 물질을 함유하고 있는 메디움으로 난모세포의 이동등에 의한 처녀수태 수단에 의해 활성화가 일어날 수 있다. 활성 자극을(또는 활성 자극의 혼합)제공할 수 있는 시약은 제한되지 않고 정자 세포질 활성 인자와 어떤 약리학적 화합물(예로, Ca2+와 다른 신호 전달 모듈레이터)을 포함하는데 이들은 정자 머리와 외래성 핵산의 공동주입 후나 또는 동시 미세주입에 의해 도입될 수 있다. 어떤 활성 자극은 Ca2+분비 자극제(예로, 카페인, A 23187과 이오노마이신(ionomycine)과 같은 Ca2+ 이오노포어(ionophore), 에탄올), 인단백질 신호의 모듈러(예로, 2-아미노퓨린, 스타우로스푸린(staurospurine)과 스피고신(sphingosie)), 단백질 합성 억제제(예로, A 23187, 사이클로헥시마이드(cycloheximide)), 6-디메틸아미노퓨린 또는 전술한 것의 혼합(예로, 6-디메틸아미노퓨린와 이온노마이신)을 포함하는 활성 화합물의 부분의 하나 또는 수개를 포함하는 메디움에 수정된 난모세포를 이동시킴으로써 얻어질 수 있다. 바람직한 방법에 있어서는, 마우스 난모세포의 활성은 2 에서 10 mM Sr2+을 함유하는 Ca2+가 없는 CZB메디움에서 1-6시간동안 배양함으로써 달성될 수 있다.
생육 가능한 태아와 자손을 생산하기 위한 엠브리오의 발생.
다음의 전핵 형성에 있어, 엠브리오는 2-8 세포 단계 또는 상실배/배아세포 단계에 이르기까지 생체 외에서 배양될 수 있고, 이 시점에서 엠브리오는 대리모의 수란관이나 자궁으로 옮겨진다.
생물학적으로 흥미로운 물질의 정자머리와 함께 동시 주입.
본 발명의 실시예에서, 정자머리와 외래성 핵산의 난모세포로의 미세-공동주입은 ,이 기간의 전에 또는 난모세포로의 정자머리의 주입 후에, 엠브리오의 발생 결과를 변화시킬 수 있는 하나 또는 그 이상의 물질의 도입을 가능하게 한다. 예로, 추가적인 리보뉴클레익 애시드(RNA) 또는 DNA는 정자머리와 외래성 핵산의 공동주입(coinjection) 전이나 후에 미세주입에 의해 난모세포 내로 도입될 수 있다. 예로, cis-활성 시그널(signal)을 숨기는 재조합 DNA 의 주입은 내재하거나 또는 공동-주입된 전사 (transcription)인자에 의해서 재조합DNA의 존재하에 시퀀스의 전사가 일어난다. 또 발생 억제 인자에 길항적 영향 또는 엠브리오의 발생에 긍정적인 영향을 미치는 인코딩된(encoded) 단백질의 연속적인 발현이 일어난다. 더욱이 전사는 발생 억제 단백질을 엔코딩하는 mRNA에 대항하는 안티센스(antisense)활성을 가질 수 있다. 선택적으로, 안티센스의 조절은 난모세포내에서 사전의 전사없이 그들의 핵산 타켓과 직접적으로 상호작용함으로써 억제효과를 발휘할 수 있는 핵산(또는 그들의 유도체)을 주입함으로써 달성될 수 있다.
본 발명의 방법에 의해 도입된 재조합 DNA(직선형이나 또는 그렇지 않는 경우)는 좁은 범위에서 넓은 범위의 발생의 발현 윤곽을 나타내는 프로모터의 조절아래서 하나 또는 그 이상의 발현된, 작용 유전자를 포함하는 작용 레플리콘(replicon)을 포함한다. 예로, 프로모터는 즉시 조정하지만 단지 초기 접합자(zygote)에서만 프로모터가 활성인 간단한 발현을 조정한다. 도입된 DNA는 엠브리오의 발생동안 몇가지 점에서 상실될 수 있거나 또는 하나 또는 그 이상의 지놈의 위치에서 삽입될 수 있어 유전자 도입된 각자의 생을 통하여 안정되게 복제될 수 있다. 한 실시예에 있어서, 텔로머레이즈(telomerase) 또는 수퍼옥사이드 디스뮤테이즈(superoxide dismutase)와 같은 "안티-에어징(anti-aging)"단백질로 추정되는 단백질을 엔코딩하는 DNA 구조체가 미세주입에 의해 난모세포내로 도입될 수 있다. 선택적으로 이런 단백질은 직접 주입될 수 있다.
실시예
본 발명의 방법을 실례를 들어 구체적으로 설명하기 위해 수정되지 않은 난모세포로 도입되는 막이 제거된 그리고/또는 막이 파괴된 정자, 발현된 리포터 유전자를 함유한 플라스미드의 복제-부족 단편(fragment)과 유전자도입 마우스 엠브리오의 발생과 살아있는 유전자도입 자손의 능력이 평가되었다. 리포터 유전자(gene)의 사용은 엠브리오와 도입유전자를 발현하는 살아있는 자손을 즉각적으로 확인할 수 있게 하였다.
여기에서 설명한 실시예는 한계가 있음을 의도한 것이 아니라, 이 분야의 기 술을 가진 사람은 마우스 이상의 다른 소스(sources)로부터의 도입유전자, 정자와 난모세포 그리고 다른 생리학적 메디움이나 시약들이 본 발명의 방법에 사용될 수 있다는 것을 알 것이다.
메디아(Media)와 시약(reagent)
다른 방법이 정해져 있지 않다면 모든 유기와 무기 화합물은 Sigma Chemical Co.(St. Louis, MO)로부터 구입되었다.
수확된 난모세포는 외래성 DNA와 막파괴 정자나 막이 제거된 정자 머리의 공동주입전에 CZB메디움(Chatot, et al.,1989. J. Reprod. Fert. 86, 679-688)에서 유지되었다. CZB메디움은 81.6 mM KCl, 1.7mM CaCl2, 1.2 mM MgSO4, 1.8 mM KH2
PO4, 25.1 mM NaHCO3, 0.1 mM Na2EDTA, 31 mM Na.락테이트, 0.3 mM Na.피루베이트, 7 U/ml 페니실린 G, 5 U/ml 스트렙토마이신 설페이트와 4 mg/ml 보바인 시럼 알부민(BSA)을 포함한다. 난관과 계속되는 처리와 미세조작으로부터 수집된 난모세포를 위한 메디움은 20 mM 히피스(Hepes), 감소된 양의 NaHCO3(5mM)과 BSA(3mg/ml)을 함유하는 변형된 CZB이었다. 이 메디움은 여기서 Hepes-CZB라 칭해진다. 미세주입 목적을 위해서, Hepes-CZB내의 BSA를 0.1mg/ml 폴리비닐 알코올(PVA, 차가운 물에 용해되고, 평균 분자량은 10x103)로 대체할 것이 권장되었다. 왜냐하면 PVA는 BSA보다 장시간에 걸쳐 주입 피펫의 벽을 덜 끈적거리게 하였고 수 많은 정자머리/난모세포의 도입을 위해 단일 피펫의 반복적인 사용동안에 유익하였기 때문이었다. 양 메디움 모두의 pH는 약 7.4이었다. 조작된 모든 난모세포는 미네랄 오일아래서 실온(23℃에서 25℃)의 공기에서 Hepes-완충 CZB(Hepes-CZB)으로 옮겨졌다.
신선한 정자의 분리를 위해 사용된 메디움은 CZB메디움이었다. 동결-해동된 그리고 재수화된 동결-건조 정자는 CZB메디움이나 123.0 mM KCl, 2.6 mM NaCl, 7.8 mM NaH2PO4, 1.4 mM KH2PO4, 3 mM Na2EDTA을 포함하는 핵 분리 메디움(NIM)에서 현탁화되었다. 이것의 pH 값은 1 M HCl의 적은 양의 첨가에 의해 7.2로 맞추었다. 막이 제거된 신선한 정자가 NIM내에서 수확되었고 또한 NIM내에서 Triton X-100 추출에 의해 처리되었다. 세척 후에, 막이 제거된 정자머리는 NIM 또는 CZB메디움내에서 현탁화되었다. 외래성 DNA와 정자의 배양(CZB나 NIM내에서)후에 그 혼합물은 PVP(평균 분자량은 360,000, ICN Biochemistry, costa Mesa, CA)로 보충되었다.
동물
이들 실험에 사용된 동물들은 하와이 대학의 시험 동물 서비스의 가이드라인에 따라 유지되었고 이들은 Institute of Laboratory Resources National Reseach Council의 Committee on Care and Use of Laboratory Animals에 의해 준비되었다(DHEW 출판 no. [NIH] 80-23, 1985년에 개정). 동물의 핸드링과 처리에 관한 프로토콜은 재고되었고 하와이 대학에서 Animal Care and Use Committee에 의해 승인되었다.
실시예1
난모세포의 준비
성숙한 B6D2F1(C57BL/6 X DBA/2)암컷 마우스들이 7.5 인터내셔널 유니트(UI) 의 임신 말 혈청 생식선자극호르몬과 7.5 UI의 휴먼 융모막성 생식선자극호르몬(hCG)을 48시간 간격으로 연속적으로 주사함으로써 과배란을 유도하였다. hCG의 주사후 14시간경과 후에 소구(cumulus)-난모세포 복합체가 난관으로부터 수집되었고 Hepes-CZB메디움 내에서 3분간 소구(cumulus)세포를 분산시키기 위해 보바인 테스티큐랄 하이루로니데이즈(bovine testicular hyaluronidase)(300 USP U/ml; ICN Biochemistry, Costa Mesa, CA)와 함께 처리하였다. 혈청 핵과 함께 주사하기 전에 난모세포는 헹구어져서 공기 중에서 5%(v/v) CO2로 평행이 유지된 미네랄 오일아래서, 37℃에서 4시간 동안 CZB메디움에서 저장되었다.
실시예2
신선한 정자의 준비
신선한 정자들 B6D2F1 수컷 마우들의 후측 부고환으로부터 수집되었다. 각각의 부고환에 손가락 압력을 가하면서 부고환의 원위측에 날카로운 포셉(forceps)으로 구멍을 내었다. 부고환 밖으로 스며나오는 밀집한 정액 덩어리를 페트리 디쉬로 옮겼다. 정자의 방울(약 2ul)을 1.5ml의 폴리프로필렌 미세원심분리 튜브(Fisher Scientific, Pittsburgh, PA)의 바닥에 놓고 0.2에서 0.5 ml의 CZB메디움으로 입혀졌다. 약 20분간의 배양 후에 메디움위 상위 0.4 ml이 수집되어 검사되었다. 현탁액(ml당 약 3에서 10x106)내의 정자의 99%이상이 활동적으로 움직임이 있었다.
실시예 3
동결-해동된 정자의 준비
동결-해동된 정자는 T.Wakayama, D.G. Whittingham and R. Yanagimachi, J. Reprod. Fert., 112, 11-17, 1998.에서 설명한 방법에 따라 준비되었다. 간단하게, 후측 부고환으로부터 얻은 정자의 한 방울을 1.5ml의 폴리프로필렌 원심분리 튜브의 바닥에 놓고 0.5 ml의 따뜻한 CZB메디움으로 입혀졌다. 37℃에서 약 20분간 둔 후에, 메디움의 상위 0.2ml을 수집했다. 현탁액은 ml당 약 3에서 10x106개의 정자를 포함했다. 정자 현탁액의 일정양(100 ul)을 1.5ml의 폴리프로필렌 미세원심분리 튜브에 옮기고 같은 양의 CZB메디움과 36%(w/v)D(+)-라피노오스(raffinose)와 같이 또는 이것이 없이 완전히 혼합하였다. 각각 라피노오스의 최종 농도는 18% 또는 0%(w/v)이었다. 각 현탁액의 일정양(aliquot)(50ul)을 라벨된 1ml의 극저온 용기(A/S NUNC, Copenhagen)에 분배하였다. 각 용기는 철저히 봉해져서 곧바로 -20℃ 또는 -50℃의 결빙기나 액체 질소(-196℃)로 옮겼다. 모든 샘플들은 1일에서 4주까지의 순서의 기간동안 저장되었다.
해동을 위해서, 용기는 결빙기나 액체 질소에서부터 옮겨져서 24-26℃의 물이나 공기에서 약 10분간 두었다. 해동된 정자 현탁액의 샘플은 상기에서 설명한 바와 같이 상업적으로 이용가능한 정자 생존 능력 테스트 킷트(Live/dead FertiLight, Molecular Probes, Inc., Eugene, OR)에 의해 운동성과 "생존능력"을 검사하였다. 라피노오스가 없는 상태에서 동결된 모든 정자는 운동성이 없고 "dead" (막이 파괴됨)이었다. 어떤 온도에서는 라피노오스의 존재하에 동결된 정자 는 적어도 97%가 운동성이 없고 "dead"이었다.
해동된 정자 현탁액은 한 번 세척되고 외래성 DNA와 혼합하기 전에 400 ul의 CZB메디움에서 다시 재현탁화되었다.
막의 파괴는 도1(C)에서 도시하고 있는 바와 같이 전자현미경에 의해 확인되었다. 파괴는 아크로조말 캡(acrosomal cap)의 막에서 가장 명확하다.
실시예 4
재수화된 동결-건조 정자의 준비
재수화된 동결-건조 정자는 T.Wakayama와 R. Yanagimachi, Nature Biochechology 16, 638-640, 1998.와 우리의 계류 중인 U.S. 특허 출원, Serial No. 09/177,391에서 설명한 방법에 따라 준비되었다. 간단하게, 상기에서 설명한 바와 같이 준비된 마우스 정자 현탁액의 일정양(100ul)을 1.5 ml의 폴리프로필렌 미세원심분리 튜브에 옮기고 1ml의 4mg/ml BSA을 함유한 EDTA가 없는 CZB메디움 또는 10%(v/v) 태아 보바인 혈청(Hyclone, logan, UT)으로 보충된 Dulbecco's 변형 Eagle's 메디움(DMEM)과 함께 완전히 혼합하였다. 37.5℃에서 약 30분간 배양된 후에 메디움의 상층 0.3에서 0.5ml을 튜브로부터 옮겼다. 현탁액은 ml당 약 3에서 10x106개의 정자를 함유하였다.
정자 현탁액의 일정양(aliquot)(100ul)을 2ml의 앰플(ampule)(Wheaton Scientific, Millville, NJ)에 넣고 이 앰플을 바로 액체 질소에 담궜다. 10분 후에, 앰플은 동결-건조 시스템(Model 10-020, VirTis, Gardner, NY)에 부착된 전냉 된(-50℃)동결-플라스크에 옮겼다. 입구(inlet)압력은 약 1 밀리토르(millitorr)였다. 약 12시간 후에, 플라스크는 개스-건조 용기(gas-drying jar)(fisher Scientific, Pittsburgh, PA, Catalogue No. 09-204)의 방법으로 공급되는 아르곤(argon)으로 채워진 후에 시스템으로부터 제거되었다. 각 앰플은 개스의 99%이상이 펌프질 되어 밖으로 배출한 후에 진공 펌프와 밀봉된 프레임에 연결되었다. 앰플은 각각 알루미늄 호일로 감싼 후에 실온(약 25℃)또는 4℃의 어둠에서 보관하였다.
재수화를 위해서, 상기에서와 같이 준비된 동결-건조된 정자를 함유한 앰플은 깨어진 후 100 ul의 증류수를 앰플에 첨가하여 재구성된 정자 현탁액을 형성케 하였다.
막 파괴는 도 1(D)에서 도시하고 있는 바와 같이 전자 현미경에 의해 확인하였다. 파괴는 아크로조말 캡(acrosomal cap)의 막에서 가장 명확하다.
실시예 5
막이 제거된 정자머리의 준비
트리톤 X-100 추출을 위한 정자는 0℃-1℃에서 NIM메디움 내에서 2개의 후측 부고환을 정교하게 잘게 다짐으로써 분리하였고 최종 900 ul의 양을 생산하기 위해 이렇게 해서 모은 정자 현탁액을 여과하였다. Triton X-100 추출을 위하여, 900 ul의 NIM내의 정자 현탁액에 0.5%의 Triton X-100 100 ul을 첨가하고 얼음에서 약 30초간 분쇄함으로써 혼합하였다. 세포들은 2℃에서 1분간 20,000 x g으로 원심분리함으로써 펠릿(pellet)화되었고 2℃에서 2분간 20,000 x g으로 펠릿화되기 전에 2ml의 얼음같이 차가운(i-c) NIM에서 완전히 재현탁화되었다. 최종 펠릿은 400ul의 CZB나 NIM에서 재현탁화되었다.
정자머리의 막제거는 도 1(B)에서 도시하고 있는 바와 같이 전자 현미경에 의해 확인하였다. 파괴는 아크로조말 캡(acrosomal cap)의 막에서 가장 명확하다.
실시예 6
도입유전자(transgene)의 준비
향상된 녹색 형광 단백질(EGFP)도입유전자는 큰(3.5kb) 플라스미드 pCX-EGFP의 Sal GI-Bam HI 단편이었다. 이 단편은 강한 cytomegalovirus-IE-chicken β-actin 인헨스 조합으로부터 발현된 EGFP 유전자을 숨기고 있지만 복제의 진핵 오리진(origin)이 부족하다. [H. Niwa, K. Tamamura, J.Miyazaki, Gene 108, 193(1991); G. Zhang, G.Vanessa, S.R. Kain, Biochem. Biophys. Res. Commun. 227, 707(1996); T. takada et al., Nature Biotechnol. 15, 458(1997)]. EGFP를 함유하는 3.5kb의 단편은 제한효소 Sal GI과 Bam HI과 함께 플라스미드 pCX-EGFP를 다이제스쳔(digestion)시킴으로써 얻었고 이 분야 기술에 잘 알려진 방법에 의해 정제하였다.
px-CANLacZ의 직선화된 단편을 가진 정제된 lacZ은 Sal GI 또는 Xho I 와 Sal GI로 다이제스천(digestion)시킴으로써 얻었다. px-CANLacZ Xho I-Sal GI단편은 복제 오리진이 부족하다. px-CANLacZ에 의해 엔코드된 β-갈락토시데이즈(galactosidase)는 핵 국한 신호(nuclear localization signal)을 함유한다.
아래에서 설명된 어떤 실험에서는, 플라스미드 pCX-LacZ의 단편은 pCX-LacZ Sal GI-Pst I 단편을 생산하기 위해 Sal GI와 Pst로 다이제스쳔시킴으로써 얻었다. pCX-LacZ은 pCX-EGFP에서 유도된 것인데, 여기의 EGFP 유전자(gene)은 β-갈락토시데이즈(galactosidase)을 엔코드하는 것에 의해 대치된다.
실시예 7
DNA단편과 정자의 혼합물의 준비
상기에서 설명한 바에 따라 준비된 정자 즉, 신선한 정자 또는 동결-해동, 동결-건조, 트리톤 X-100 추출의 세 가지 막 파괴 프로토콜(protocol)중 하나로 처리된 후의 정자는 아래에서 설명하는 바와 같이 DNA단편과 혼합되었다.
GFP 유전자를 함유하는 상기에서 설명한 단편의 1 ㎕의 양을 7 ng/㎕의 최종 DNA GFP단편 농도를 주기 위해 피펫팅하여 9㎕의 이미 준비된 정자 현탁액(2에서 5x105개의 정자를 포함함)과 함께 혼합하였다. 유사하게, 1㎕의 Sal GI 또는 Xho I/Sal GI단편을 각각 9㎕의 정자 현탁액과 혼합하였고 Sal GI px-CANLacZ 단편의 최종 농도가 각각 4.5 ng/㎕와 9ng/㎕가 되게 하였다.
단일의 미세-공동주입(coinjection)후에 2개의 tg's를 공동발현하는 엠브리오를 발생하기 위해 사용되었던 싱글-샷 더블 유전자도입(single-shot double transgenesis)의 어떤 실험에서는, 정자머리는 주입전에 2개의 도입유전자, 말하자면 pCX-EGFP Sal Gi-Bam HI 단편(최종 농도는 2.5 ng/㎕이다)을 포함하는 단일 DNA용액과 pCX-LacZ Sal GI-Pst I 단편(최종 농도는 2.5ng/㎕이다)과 함께 혼합되었 다.
상기에서 설명된 DNA-정자 혼합체는 상온(약 25℃)또는 얼음(ice)상에서 1분간 배양되었고 그 후 최종 농도가 약 10%(w/v)PVP가 되도록 폴리비닐피로리돈(polyvinylpyrrolidone)(PVP, 평균 분자량 360,00)과 함께 혼합하였다.
어떤 실험에 있어서는, 플라스미드 단편과 함께 배양된 후 정자의 세척 효과를 측정하기 위해 DNA-정자 혼합물을 혼합하고 그리고 pCX-EGFP DNA와 함께 1분간의 배양 후 곧바로 2개의 5㎕의 양으로 나누었다. 하나의 일정양(aliquot)(세척된 정자)을 희석하고 50㎕의 얼음처럼 차가운, 신선한 CZB 또는 NIM과 함께 잘 혼합함으로써 세척하였다. 세척된 정자의 일정양의 상층액을 조심스럽게 제거하고 5㎕의 신선한 CZB 또는 NIM으로 대체하였다. 두 번째의 일정량(aliquot)으로부터의 상층액은 이것의 펠릿을 재현탁화하기위해 사용되었다.(그런 까닭에 이 샘플을 세척되지 않았다.)
몇몇의 실험에서는, 정자의 공동주입 없는 DNA단편만의 주입의 효과를 측정하기 위해 신선하게 희석한 플라스미드 pCX-EGFP(NIM내의 7 ng/㎕ )의 Sal GI-Bam HI단편을 주입 전에 같은 양의 PVP 20%(v/v)와 혼합하였다.
모든 실험을 있어서, 아래에서 설명하는 바와 같이 위에서 얻어진 혼합물들은 미세주입을 위해 현미경 스테이지(stage)상에 놓여졌다. 모든 주입은 실온에서 정자-DNA혼합 또는 정자-Triton X-100 혼합의 1시간 내에 Hepea-CZB메디움내에서 이루어졌다.
실시예 8
정자 핵의 난모세포로의 주입
정자머리와 외래성 DNA의 준비된 난모세포로의 공동주입을 위해, 미세주입 챔버(chamber)는 플라스틱 디쉬(100 mm x 15 mm; Falcon Plastics, Oxnard, CA, Catalogue No. 1001)의 커버(cover)(10 mm의 깊이)를 이용하는 것으로 하였다. 2개의 작은 방울과 1개의 긴 방울로 구성되는 열(row)이 디쉬의 가운데 선을 따라 놓여졌다. 첫 번째 작은 방울(2 ㎕; 2 mm의 직경)은 피펫 세척을 위한 것이었다.(12%[w/v]PVP을 함유하는 Hepes-CZB, 평균 분자량 360,000 달톤). 두 번째 작은 방울(2 ㎕; 2 mm의 직경)은 위에서 준비된 정자와 DNA단편의 혼합물이었다. 세 번째의 긴 방울(6 ㎕; 2mm 넓이와 6 mm의 길이)은 난모세포를 위한 Hepes-CZB메디움이었다. 이들 작은 방울들 각각은 미네랄 오일로 씌워졌다.(E.R. Squibb and Sons, Princeton, NJ). 디쉬는 대조광 간섭 인버티드 마이크로스코프(inverted microscope interference contrast optics)의 스테지 상에 놓여졌다.
정자 핵과 외래성 DNA의 난모세포로의 미세-공동주입은 앞선 설명한 피에조-전기 미세주입기(piezo-electric micriinjector)방법에 의해, Prime Tech Ltd에 의한 Piezo Micromanipulator Model MB-U을 사용함으로써 달성되었다. 이 장치는 아주 높은 속도에서 피펫 홀드를 아주 짧은 거리(예로 0.5 ㎛)를 동시에 전진시키기 위해 피에조 전기 효과를 사용한다. 펄스의 강도와 속도는 콘트롤러에 의해 조절되었다.
상기에서 준비된 난모세포로의 주입을 위해, 외래성 DNA와 혼합되어 있는 단일 정자머리는 피에조 전기 피펫 작동장치에 부착되어 있는 주입 피펫( 팁에서 약 5 uM I.D) 내로 빨려들어갔다. 전체 정자가 사용되었을 때, 단일 정자는 주입 피펫내로 꼬리가 먼저 흡입되었다. 정자머리와 꼬리는 단일의 또는 수 차례의 피에조 펄스를 목 부근에 작용함으로써 분리되었다. 펄스의 강도와 속도(빈도)는 컨트롤러 PMAS-CT01(컨트롤러 셋팅 크기; 강도 2, 속도 1)에 의해 조절되었다. 그리고 나서 머리는 피펫의 깊숙이 끌어당겨졌고 소량의(약 0.5 ㎕)의 수은이 주입 피펫의 근위 끝에 놓여졌다. 꼬리로부터 머리의 전위(dislocation)에 의해 막을 파괴시키고 그런 까닭에 이 실험들에 사용된 신선한 정자와 IVF에 의한 유전자도입를 촉진시키는 살아있는 정자에 관한 이전의 보고된 내용과의 차이점을 나타낸다.
동시에, 성숙한 수정되지 않은 난모세포를 Hepes-CZB메디움의 현미경 스테이지상에 놓았다. 난모세포를 홀딩 피펫에 의해 잡고 주입 피펫의 팁을 투명대의 3시 방향에 접촉시켰다. 가벼운 음압을 가하면서 피펫을 전진시키기 위해 수 차례의 피에조-펄스(강도 1-2, 속도 1-2)를 가하였다. 피펫의 팁이 투명대를 관통하여 지나갔을 때 피펫 내의 투명대의 원주상의 조각들을 난황주의 공간으로 밀어냈다. 정자머리를 주입 피펫의 거의 끝 부분에 이를 때까지 밀어 전진시켰다. 피펫은 그 끝이 난모세포의 피질의 반대 쪽에 다다를 때까지 기계적으로 전진시켰다. 투명대는 1 또는 2의 피에조 펄스(강도 1-2, 속도 1)를 적용함으로써 구멍이 뚫리게 되었고 정자의 머리는 투명대 내로 주입되었다. 각 주입당 외래성 DNA를 함유하는 혼합물의 약 1 피토리터(pl)가 피펫으로부터 방출된 것으로 예측된다. 그리고 나서 난모세포의 원형질 내에 정자머리를 남겨둔 채 피펫을 조심스럽게 회수하였다.
모든 주입은 실온에서 Hepes-CZB에서 행해졌다. 각각의 난모세포에 하나의 정자머리를 주입하였다. 이런 방법으로 10-15분 안에 약 5-20개의 난모세포에 미세주입을 하였다. 주입 후 곧 용해된 난모세포는 버렸다.
실험에 있어서, 정자의 공동주입없이 DNA단편만의 주입의 효과를 측정하기 위해 위에서 설명한 바와 같이 PVP내의 플라스미드 pCX-EGFP의 Sal GI-Bam HI단편 약 1 pl을 각 난모세포에 주입하였다. 상온에서 5-10분간의 시간회복 후에 주입된 난모세포를 10 mM SrCl2와 세포질분열-억제제 사이토칼라신 B 5ug/ml을 함유하는 Ca2+-없는 CZB로 옮기고 약 6시간 동안 37℃에서 배양하였다. 정자나 정자머리에 의해 활성화되지 않는 난모세포는 엠브리오의 발생이 일어날 수 있도록 다른 방법들에 의해 활성화되어야 한다. 스트론티움 이온(strontium ion)에 활성화는 이 관련 분야에서 잘 알려진 많은 처녀생식 활성화 방법 중의 하나이다. 이는 우리의 계류 중인 1998년 10월 10일에 출원된 U.S. 특허 출원, Serial No.09/132,104에서 설명되었고 이 난모세포의 활성화에 적합한 상세한 설명은 참고문헌으로 여기에 도입된다. 세포질분열-방지제의 사용은 염색체의 방출을 방지하기 위해 이 분야에서 관련 기술에 잘 알려져 있다. 난모세포에서의 세포질분열을 방지하는 것에 관한 U.S. 특허 출원, Serial No.09/132,104의 상세한 설명은 참고문헌으로 여기서 또한 도입된다.
처녀생식의 방법으로 활성화된 난모세포를 CZB메디움으로 옮겨 아래에서 설명하는 바와 같이 표준 엠브리오 배양 조건에서 배양을 계속했다. 엠브리오에 의한 GFP발현은 배양 후 3.5일 후에 측정하였다. 그 방법은 아래에서 설명한다.
실시예 9
난모세포의 검사, 엠브리오의 배양과 대리모로의 이식
정자머리와 외래성 DNA가 주입된 난모세포는 공기중에 5%(v/v)CO2로 형평이 유지된 미네랄 오일 하에서 37℃에서 배양되었고 5-6시간 후에 인버티드(inverted)현미경으로 검사하였다. 2개의 명확한 전핵과 두 번째 극체를 가진 것은 정상적으로 수정되었다고 여겨져 CZB에서 4일간 배양하였다. 상실배기 또는 포배기에 이른 엠브리오를 엠브리오의 발생단계를 자궁내막의 발생단계와 일치시키기 위해 3일전에 정관절제한(CD-1) 수컷과 교미시킨 수용 암컷(전형적으로는 CD-1 알비노(albino) 암컷)의 자궁 뿔에 이식하였다. 평균 10 포배기/상실배에 각각의 뿔로 이식되었다. 암컷이 자신의 대리 자손을 출산하고 기르도록 하였다. 몇몇의 성숙한 수컷과 암컷 자손들을 임의로 선택하여 이들의 수정능력을 검사하기 위해 교미시켰다.
실시예 10
도입유전자의 발현을 위한 엠브리오의 검사
미세-공동주입 후 3-3.5일 후에 UV 광원(4100nm), 플루오레세인 아이소타이오사이안염(fluorescein isothiocyanate) 필터를 가진 상형광(epifluorescence) 현미경으로 GFP의 발현여부를 통해 엠브리오를 검사하였다. 이것은 형광이 없는 경우(GFP발현이 없는 경우), 약한 형광이 있는 경우, 강한 형광의 엠브리오와 모 자이크의 명확 구별을 가능하게 하였는데 이것을 거기에 따라 기록하였다.
px-CANLacZ β-갈락토시데이즈의 발현은 T. Tsukul, et al., Nature Biotechnology 14, 9102(1996)에서 설명하고 있는 바와 같이 1%(v/v)포름알데히드(formaldehyde), 0.2%(v/v)글루탈알데히드(glutaraldehyde)와 BSA(5mg/ml)을 함유하고 있는 포스페이트-완충 셀라인(phosphate-buffered saline, PSB, pH 7.6)에서 상온에서 5분간 고정된 후 하루에 3개의 엠브리오를 분석하였다. 고정된 엠브리오를 BSA(5mg/ml)을 함유하는 PBS내에서 완전히 세척하였고 BSA(5mg/ml), 4mM 포타슘 페리사이아나이드(potassium ferricyanide), 2 mM MgCl2와 5-브로모-4-클로로-3-인도릴 β-D-갈락토피라노사이드(X-gal)(1mg/ml)을 함유하는 PSB에서 37℃에서 약 5시간 동안의 배양에 의해서 염색되었다. 엠브리오는 검사되었고 광 현미경에 의해서 기록되었다.
2개의 도입유전자가 정자머리와 함께 주입된 실험에 있어서는, 3-3.5일이 지난 후에 상기에서 설명한 방법에 따라 GFP의 발현을 먼저 기록한 후에 β-갈락토시데이즈(galactosidase)의 발현을 기록하였다. 사진을 위해서, LacZ 발현을 보기 위한 고정(fixation)과 염색 전에 엠브리오를 현미경 슬라이드와 커브 슬라이드 사이에 올려놓고 발생과정과 GFP발현을 보기 위해 상을 모았다.
실시예 11
도입유전자 발현을 위한 살아있는 자손에 대한 검사
상기에서 설명한 바와 같이, 대리모에 인식된 엠브리오로부터 얻은 살아있는 자손에서 정규 자리를 벗어난 GFP의 발현을 관찰하기 위해 생후 1-4일간 검사하였 다. GFP발현은 UV광원으로부터 입사조명 아래서 녹색 스킨(skin) 색으로 명확히 관찰되었다.
실시예 12
도입유전자의 지놈 삽입(integration)의 분석
꼬리-팁 지놈의 DNA의 물리적 분석은 서든 블랏(Southern blotting)이나 폴리머레이즈 체인 리액션(PCR)에 의해 행해졌다. 꼬리-팁 생검(biopsies)은 3-6주령된 것으로 무작위로 선택된 어린 녹색 마우스와 그들의 녹색이 아닌 같은 배의 새끼에서 행하였다. 꼬리-팁 조직은 이 분야의 관련 기술로 잘 알려진 방법에 의해 총(total), 지놈의 DNA의 추출을 위해 사용되었다. 꼬리의 사진은 4100/440 nm 필터를 가진 형광 입체현미경아래서 얻은 것이었다.
서턴 블랏(Southern blot)분석을 위해서, 각 샘플당 10ug의 지놈의 DNA을 Eco RI로 다이제스천(digestion)시켰고 pCX-EGFP의 733-염기-페어(pair) Eco RI 단편으로 탐색하였다. GFP유전자(gene)를 찾기 위해 각 반응 당 1 ug의 지놈의 DNA로 전위에 (TTGAATTCGCCACCATGGTGAGC)와 후위에 (TTGAATTCTTACTTGTACAGCTCG-TCC)올리고뉴클레오타이드(oligonucleotide) 프라이머(primer)을 사용하여 PCR을 실시하였다. 반응 변수는 95℃에서 9분간(1 싸이클), 94℃에서 45초간, 60℃에서 30초간, 72℃에서 40초간(40 싸이클)이었다. PCR 산물은 전기영동에 의해 분리되었고 에티디움 브롬마이드(ethidium bromide)로 염색한 후에 시각화되었다.
외래성 리포터로 엔코딩하는 DNA 또는 정자머리 또는 이들 모두의 분열 중기 Ⅱ의 난모세포로의 미세주입 후 생산된 엠브리오에서의 도입유전자의 발현
정자와 DNA가 1분간 전배양되고 그 후 공동주입되고 생체외에서 3.5일간 배양된 엠브리오에서 GFP와 β-갈락토시데이즈(galactosidase)의 발현이 기록되었다. GFP는 상형광(epifluorescence) 현미경에 의해 발견되었고 β-갈락토시데이즈는 상기에서 설명한 바와 같이 염색에 의해 발견되었다. 그 결과는 표1에서 나타내고 있다. 형광 할구(blastomer)를 함유하는 엠브리오의 비율은 pCX-EGFP DNA가 신선한 정자와 함께 주입되었을 때 가장 낮았다. 하지만 DNA가 Triton X-100(64%), 동결-해동(82%) 또는 동결-건조(87%)에 의해 막이 파괴된 정자와 함께 주입되었을 때는 더 높은 값으로 상승했다. 직선형의 px-CANLacZ DNA단편과 동결-해동 또는 동결-건조된 정자로 수정되지 않은 난모세포로의 공동주입은 또한 lacZ tg product β-갈락토시데이즈를 발현하는 엠브리의 비율이 높은 것(92%-94%)으로 나타났다. 더욱이 2개의 다른 tg DNAs(각각 GFP와 LacZ를 엔코디하는)의 혼합물과 정자의 공동주입은 단일 미세주입으로부터 양측 tg들을 발현하는 엠브리오를 생산했다. 도2는 이런 단일-샷 더블 유전자도입(single-shot double transgenesis)에 생산된 유전자도입 엠브리오를 나타내고 있다. 난모세포에 pCX-LacZ와 pCX-EGFP tg DBAs의 혼합물과 함께 전배양된 정자로 미세주입하였다. 같은 엠브리오가 3.5일 후에 호프만 모듈레이션 대조 현미경에 의해 염색되지 않는 채로 보이고(도2A), GFP의 발현을 보기 위해 장파장의(480nm)의 UV아래서 보이고(도2B), β-갈락토시데이즈의 발현을 보기위해 X-gal로 염색되어 보인다(도2C).
전체적으로, 전술한 데이터는 막이 파괴된 정자머리와 외래성 핵산의 수정되지 않는 난모세포의 공동주입은 효율적으로 유전자도입 엠브리오를 생산할 수 있 다는 것을 제시하고 있다.
pCS-EGFP DNA와 함께 혼합된 후에 신선한 메디움으로 세척된 정자는 세척되지 않는 것과 비교할 때 약간의 감소된 효율성(63% 대 80%)을 가짐에도 불구하고 형광 포배(blastocyst)을 생산하는 능력을 유지하였다(표1). 이것은 외래성 DNA와 정자 사이에 혼합되는 동안(주입되기 전)에 빠른 결합(association)이 있음을 제시한다.
유사한 상호작용이 난모세포 내(주입 후에)에서 발생할 수 있는지를 탐색하기 위해 우리는 주입 전에 혼합하지 않고 정자머리와 pCX-EGFP DNA를 연속적으로 주입하였다. 우리는 비록 75%의 양성 콘트롤 엠브리오(표1에서와 같이 동결-해동 정자머리-pCX-EGFP의 공동주입)가 형광이었음에도 불구하고 계속하여 외래성(GFP)DNA의 발현을 관찰하는데 실패하였다. 500 pg/ul(하지만 50 pg/ul이 아님)에서 pCX-EGFP와 함께 공동주입된 동결-해동된 정자머리는 현저한 GFP의 발현을 나타내는 포배(blastocyst)를 생산했다. GFP 발견(마이크로리터당 50에서 500 pg의 pCX-EGFP DNA에 대응하는)의 역치(threshold)는 피코리터(picoliter) 주입당 평균 15에서 150 분자를 나타낸다.
정자머리와 함께 주입하는 것과 비교하여, 비슷한 양의 GFP tg DNA만의 주입은 좋은 처녀생식 발생을 막지 않았다(주입 후 생존한 난모세포의 98%가 상실배-포배기까지 발생하였다)(표1). 더욱이 이 결과의 엠브리오의 어는 것도 현저한 tg 발현을 나타내지 않았다. 따라서 정자머리가 없었다면 tg 발현이 거의 없었거나 전사 활성 tg DNA의 에피크로모조말(epichromosomal) 저항이 있었을 것이다.
표1의 데이터는 외래성 DNA와 생각건대 현저하게 핵주위 기질의 기초 단백질을 포함하는 정자머리 하부막 구조사이의 주입전 결합이 있다는 생각을 지지한다[F. J. Longo et al., J.Cell Biol. 105, 1105(1987)]. 우리의 실험실의 다른 실험에 있어서는, 우리는 정자핵은 적어도 하나의 엔도뉴클레이저(endonuclease)를 가지고 25℃에서 막이 제거된 정자는 빠르게 완전한 엠브리오 발생을 유지시키는 능력을 상실한다는 것을 발견했다[B. Maione et al., DNA Cell Biol. 16,1087(1997)]. 그런 까닭에, 여기서 사용된 정자 지놈 DNA가 손상이 없었고, 난모세포가 개입된 tg 삽입을 용이하게 하는 단일-가닥(strand) 브레이크(break)의 존재했던 것 같지 않다.
이상하게도, 우리는 정자머리-pCX-EGFP 공동주입 후 GFP-양성 과 GFP-음성인 할구(+/- 상실배-포배)를 모두 포함하는 모자이크 엠브리오를 발견했다. 그러나 pCX-EGFP DNA만의 주입 후에는 그렇지 않았다(표1). 이런 +/- 모자이크의 빈도는 tg DNA 삽입은 종종 ICSI후 세포 주기의 제일 S-기 후까지 지연되었다는 것을 의미한다. 이런 삽입의 지연은 tg DNA가 정자머리와 함께 주입되지 않았다면 명확하게 일어나지 않았다. 이것의 한 가지 해석은 정자-유래 물질은 초기 엠브리오에서 외래성 DNA를 안정화시키고 그것에 의해서 지연된 삽입(integration)을 용이하게 한다는 것이다; 이런 물질이 없다면(예로, 처녀에 있어서), 외래성 DNA는 그것이 삽입되기 전에 퇴화될 것이다.
정자머리-pCX-EGFP의 공동주입 후에, 엠브리오의 발생 잠재력은 포함된 형광 할구의 비율이 증가함에 따라 감소되었다(표1). 반대로, 정자머리-pxCANLacZ 공동 주입 후 tg 발현은 엠브리의 발생을 나타내지 않았다(표1). 이론에 의해 제한됨이 없이, 이것은 GFP 발현에 유독한 효과를 가져오는 것이 가능하다. 말하자면, 초기 엠브리오 발생은 GFP 발색단(chromophore)의 성숙을 수반하는 H2O2의 방출에 아주 민감할 수 있다(R.Y. Tsien, supra).
외래성 리포터(reporter)로 엔코딩하는 DNA 또는 정자머리 또는 이들 모두의 분열 중기 Ⅱ의 난모세포로의 미세주입 후 생산된 자손(offspring)에서 도입유전자의 발현
tg DNA 구조체의 지놈믹 삽입(integration)이 살아있는 자손(파운더 마우스(founder mice))에서 설명될 수 있는 지를 결정하기 위해 3가지의 막 파괴 과정중의 하나를 시행한 정자머리를 pCX-EGFP DNA와 함께 주입하였다. 그 결과의 엠브리오를 상기에서 설명한 바와 같이 생체외에서 3.5-4일간(상실-포배기까지)배양하였고 그 후 대리모에 선택적이지 않게 이식하였다. 즉 형광을 토대로 하지 않았다는 것을 말한다. tg 삽입(integration)의 표현형 분석은 장파장의 UV 빛 아래서 도 3A(a)와 도 3A(b)에서 도시하고 있는 바와 같이, 유전자도입 마우스와 그렇지 않는 콘트롤 마우스로부터 꼬리-팁 생검을 통한 검사를 함으로써 행하였다. 유전자도입 마우스의 녹색-형광 스킨(skin)은 녹색이 아닌 털(hair)을 통하여 시각화될 수 있었다. 자손의 높은 비율(17%-21%)은 스킨에서 현저한 GFP발현에 관하여 유전자도입이었다(도2). 발현의 이 효율은 정자를 준비하기 위해 사용된 막 파괴 방법에 달려 있지 않았다. 접합자의 출산까지(to term)의 발생 비율은 막이 파괴된 정자머리의 3 그룹의 각각은 비슷하였으나(12%-14%) 외래성 DNA가 없는 상태에서 비슷하게 처리된 머리의 미세주입 후에 얻은 비율과 비교하여 비교적 낮았다.
이들 데이터는 표1에서 예시하고 있는 결과와 일치한다. 이 데이터는 GFP-음성(negative)인 세포를 함유하는 엠브리오가 모두 양성인 세포를 함유하는 경우보다 출산까지 더 잘 발생한다는 것을 나타낸다. 뿐만 아니라, 3.5일의 배양에서 음성으로 기록된 어떤 살아있는 자손은 GFP-양성과 음성 모두를 가진 모자이크 엠브리오로부터 아마도 생겼을 것이다. 이론에 의해 제한됨이 없이, pCX-EGFP DNA 공동주입은 전이식(preimplantation)과 후이식(postimplantation) 엠브리오의 발생 모두에 해로운 영향을 미치는 것으로 믿어진다. 그러나 후이식 발생에 대한 방해가 tg 발현의 결과인지 또는 외래성 DNA의 존재의 결과인지는 알려져 있지 않다.
서던 블랏(Southern blotting)(도3B) 또는 PCR(도3C)에 의한 꼬리-팁 전체 지놈믹 DNA의 물리적 분석은 녹색 형광에 보이는 모든 파운더 마우스 계열(line)은 처음에 표현형 음성으로 기록된 것을 포함하는 tg을 가졌다는 것을 보여주었다. 그러나 꼬리 팁의 생검은 GFP발현을 나타내었다. 세 가지 경우에 있어서, 발견할 수 있는 녹색 형광이 부족한 파운더에 있어서는 tg는 PCR에 의해 입증되었다. 이론에 의한 제한 없이, tg가 발현되지 않는 것은 tg 삽입 위치에 국소적으로 cis-활성 요소때문인 것으로 여겨진다. 프로브(probe)로 pCX-EGFP 단편을 사용하는 콘트롤 B6D2F,(wt)(0)와 파운더 마우스 넘버 3(5에서 9), 19(.50), 28(5에서9)와 41(2)로부터 전체 DNA의 서던 블랏(Southern blot)분석은 도3B에서 예시하고 있다. 여기서 지놈당 평가된 tg 복제 수는 괄호에 나타낸다. 서던 블랏(Southern blot)분석은 파 운더(founder)에서 tg 복제 수가 ≤1에서 >50의 범위였다는 것을 나타내었다. 이 결과는 전핵 미세주입 후 tg 삽입의 패턴과 닮았다. 지놈믹 pCX-EGFP DNA와 GFP발현의 효율성 모두 tg DNA는 삽입에 있어 총제적인 재배열을 하지 않는다는 것을 제시한다.
마우스 16, 17, 30, 36, 47, 49, 콘트롤 B6D2F1(wt), 3, 19, 28과 41로부터의 전체 DNA의 PCR분석은 도3C에서 예시하고 있고 마우스 17, 3, 19와 28에서 GFP도입유전자의 존재를 확인한다.
무작위 선택한 12 GFP발현 파운더(표2와 유산한 계열로부터, 8 암컷, 4 수컷)를 유전자도입하지 않은 동물과 교잡되어 한 케이스(암컷)을 빼고는 전부 한배의 새끼(litters)를 생산했다. 수정된 11 파운더의 8은 27%에서 50%의 빈도로(평균 40%) 그들의 피부에 정규 자리에서 벗어나 GFP를 발현하는 새끼를 생산했다. 대부분의 경우에서 tg 유전성의 패턴은 단일 위치 GFP 유전자의 멘델 법칙의 점 라인(germ line)유전과 일치하였다.
바람직한 실시예에 관련하여 본 발명을 설명하는데 있어서, 본 발명을 밝혀진 구체적인 형태에 제한하려고 의도하는 것이 아닌 것으로 이해되어야 한다. 반대로, 본 발명의 참뜻과 범위 내에서 맞아떨어지는 모든 변형과 대안적인 형태를 커버하려고 의도하였다.
* 외래성 DNA 단편들은 pCX-EGFP-Bam HI-Sal GI 또는 px-CANLacZ-Sal GI, Sal G1-Xho I 또는 Xho I이었다.
†"a"와 "b"의 첨자를 가진 같은 칼럼내의 값이 비교되었을 때, 그들은 중대 하게 다르다(p<0.05). "c"의 첨자를 가진 같은 칼럼내의 값은 중대하게 다르지 않다.
§Tg 발현; -, 음성; +,양성; +/-, 양성과 음성모두를 포함하는 m-b.
* 각 열은 막이 제거된 정자머리와 플라스미드 pCX-EGFP의 단편으로 공동주입된 난모세포로부터 생산된 엠브리오와 퍼프(pups)들의 발생을 기록한다.
†m-b는 상실배-포배를 의미한다. 괄호속의 값은 엠브리오 전이에서 수용자로 사용된 대리모를 나타낸다.
§Tg 발현; +는 그들의 피부에 정상위치에서 벗어나게 GFP를 발현하는 양성 퍼프들.
** 값들이 유의하게 다르지 않다.
Claims (21)
- 외래성 핵산을 비인간(non-human) 포유동물 유래의 막이 파괴된 정자머리 또는 막이 제거된 정자머리와 일정기간 배양하는 단계;상기 외래성 핵산과 상기 정자머리를 비인간 포유동물 유래의 미수정 난모세포로 공동삽입하여, 유전자도입 수정 난모세포를 형성하는 단계;상기 유전자도입 수정 난모세포를 유전자도입 엠브리오로 발생시키는 단계;를 포함하는 비인간 포유동물 유전자도입 엠브리오를 얻는 방법.
- 제1항에 있어서, 상기 공동삽입 단계가 피에조 전기 작동 미세주입에 의해 수행되는 것을 특징으로 하는 비인간 포유동물 유전자도입 엠브리오를 얻는 방법.
- 제2항에 있어서, 상기 외래성 핵산과 상기 정자머리가 상기 미수정 난모세포의 세포질 내로 공동주입되는 것을 특징으로 하는 비인간 포유동물 유전자도입 엠브리오를 얻는 방법.
- 제1항에 있어서, 상기 정자머리가 동결 및 해동된 정자로부터 얻어지는 것을 특징으로 하는 비인간 포유동물 유전자도입 엠브리오를 얻는 방법.
- 제1항에 있어서, 상기 정자머리가 재수화된 동결건조 정자로부터 얻어지는 것을 특징으로 하는 비인간 포유동물 유전자도입 엠브리오를 얻는 방법.
- 제1항에 있어서, 상기 정자머리가 핵 및 핵주위 물질을 포함하는 막이 제거된 머리인 것을 특징으로 하는 비인간 포유동물 유전자도입 엠브리오를 얻는 방법.
- 제6항에 있어서, 상기 정자머리가 세정제로 처리된 정자로부터 얻어지는 것을 특징으로 하는 비인간 포유동물 유전자도입 엠브리오를 얻는 방법.
- 제1항에 있어서, 상기 미수정 난모세포가 분열중기 Ⅱ의 난모세포인 것을 특징으로 하는 비인간 포유동물 유전자도입 엠브리오를 얻는 방법.
- 삭제
- 제1항에 있어서, 상기 기간이 30초 내지 5분인 것을 특징으로 하는 비인간 포유동물 유전자도입 엠브리오를 얻는 방법.
- 제10항에 있어서, 상기 기간이 45초 내지 3분인 것을 특징으로 하는 비인간 포유동물 유전자도입 엠브리오를 얻는 방법.
- 제11항에 있어서, 상기 기간이 1분 내지 2분인 것을 특징으로 하는 비인간 포유동물 유전자도입 엠브리오를 얻는 방법.
- 제1항에 있어서, 상기 외래성 핵산이 하나의 도입유전자 이상을 포함하는 것을 특징으로 하는 비인간 포유동물 유전자도입 엠브리오를 얻는 방법.
- 제1항에 있어서, 상기 유전자도입 엠브리오를 살아있는 자손으로 발생시키는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 비인간 포유동물 유전자도입 엠브리오를 얻는 방법.
- 제14항에 있어서, 상기 발생시키는 단계는 상기 유전자도입 엠브리오를 대리모로 이식하는 하위 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 비인간 포유동물 유전자도입 엠브리오를 얻는 방법.
- 삭제
- 제1항에 있어서, 상기 비인간 포유동물이 비인간 영장류, 양, 소, 돼지, 곰, 고양이, 개, 말 및 설치류로 이루어진 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 비인간 포유동물 유전자도입 엠브리오를 얻는 방법.
- 삭제
- 삭제
- 삭제
- 비인간 포유동물 유래의 막이 파괴된 정자머리 또는 막이 제거된 정자머리를 얻는 단계;상기 정자머리를 원하는 유전자를 포함하는 외래성 핵산과 혼합하는 단계;상기 정자머리와 외래성 핵산의 혼합물을 비인간 포유동물 유래의 분리된 미수정 분열중기 Ⅱ 난모세포로 공동주입하여, 유전자도입 수정 난모세포를 형성하는 단계; 및상기 유전자도입 수정 난모세포를 유전자도입 엠브리오로 발생시키는 단계;를 포함하는 비인간 포유동물 유전자도입 엠브리오를 얻는 방법.
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