ES2327761T3 - Procedimiento para generar animales transgenicos no humanos. - Google Patents

Abstract

Un objeto de la presente invención lo constituye un procedimiento para generar animales transgénicos, vertebrados e invertebrados, preferamente vertebrados, y más preferentemente mamíferos no humanos, para secuencias de ADN exógeno o transgenes de dimensiones variables caracterizado porque se generan a partir de embriones transgénicos por co-microinyección de espermatozoides o cabezas de espermatozoides (en el case de ratón) unidos a dicha secuencia de ADN exógeno de interés en ovocitos no fertilizados. Igualmente, forman parte de la invención los animales transgénicos no humanos así obtenidos.

Description

Procedimiento para generar animales transgénicos no humanos.

Sector de la técnica

La presente invención proporciona un procedimiento para la producción de animales mamíferos transgénicos no humanos por introducción de moléculas de ADN de gran tamaño (centenares de kilobases) para uso en aplicaciones biológicas, biomédicas y biotecnológicas. La importancia de esta invención radica en el valor de los animales transgénicos que genera, tanto en el sentido de los nuevos productos generados por estos animales como en cuanto a su uso como animales experimentales para el estudio o el diagnóstico de enfermedades animales y humanas, o incluso en cuanto a su uso en genómica funcional para contribuir, de manera efectiva, a la descripción de la función génica.

Estado de la técnica

La producción de animales transgénicos por introducción de ADN exógeno en el genoma de sus células somáticas o germinales nos proporciona modelos experimentales para uso por parte de la comunidad científica, pero también organismos para aplicaciones agrícolas, biotecnológicas, farmacológicas y médicas. Algunos ejemplos son la introducción de genes humanos en el genoma del ratón con el fin de estudiar y diagnosticar determinadas enfermedades; o la modificación genética de vacas para producir en su leche grandes cantidades de proteínas de interés para la industria farmacológica; o el estudio funcional de nuevos genes aportados por la secuencia completa de genomas animales.

Las técnicas transgénicas son utilizadas mayormente en animales usados para experimentos de laboratorio (principalmente ratones, pero también ratas y otros roedores en menores cantidades) y en animales. Las metodologías empleadas para producir animales transgénicos han evolucionado gracias al desarrollo de nuevas técnicas de manipulación reproductiva y molecular. Entre las técnicas más usadas están la microinyección pronuclear de oocitos fertilizados, el uso de virus recombinantes como mediadores para introducir el gen transgénico en el genoma embrionario, el uso de células madre pluripotentes embrionarias genéticamente alteradas por diversos métodos, o la transferencia de ADN mediada por esperma muerto o vivo (Nagy A., Gertstenstein M, Vintersten K, Behringer R. Manipulating the mouse embryo. A laboratory manual (3ª edición) Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor. New York. 2003).

Estos métodos han demostrado ser muy efectivos cuando se producen productos transgénicos con pequeñas moléculas de ADN, pero no existen métodos eficientes y reproducibles que permitan la introducción de grandes moléculas de ADN (mayores de 170 Kb), tales como, por ejemplo, cromosomas artificiales de levaduras (CAL) o cromosomas artificiales de mamíferos (CAM) en el genoma animal. A medida que aprendemos la complejidad del genoma animal, nos damos cuenta de que tenemos que utilizar longitudes mayores de ADN en los intentos transgénicos para poder garantizar la introducción conjunta de todas las secuencias genéticas codificantes y secuencias potencialmente reguladoras y de este modo asegurar una correcta expresión génica en tiempo, lugar y nivel, y para estudiar grandes regiones genómicas complejas o estructuras que agrupen varios genes que funcional de un modo coordinado (es decir, los loci génicos de cadenas ligeras o pesadas de inmunoglobulinas) [Giraldo P., Montoliu L. (2201) Size matters: use of YACs, BACs y PACs in transgenic animals, Transgenic Research 10(2): 83-103].

Existen dos métodos usados para producir organismos transgénicos con cromosomas artificiales: la microinyección pronuclear de oocitos fertilizados y la manipulación de células madre (transfectadas con ADN por lipofección, o fusionando las propias células madre con células de levadura portadoras de CAL) [Peterson K.R. (2003), Transgenic mice carrying yeast artificial chromosomes. Expert Reviews in Molecular Biology 5: 1-25]. En lo que se refiere a la microinyección pronuclear, el diámetro interno de la aguja de microinyección (inferior o igual a 1 micrómetro) puede evitar que se introduzcan grandes moléculas de ADN sin romperse, como sucede la mayoría de las veces. Cuando aumenta el tamaño del transgén, también aumenta la posibilidad de dañar el ADN durante la purificación, la dilución, el almacenamiento y principalmente durante la manipulación. Una alternativa a la microinyección es transformar las células madre pluripotentes embrionarias con cromosomas artificiales para usar posteriormente estas células transformadas en la producción de quimeras uniéndolas a embriones en estado de preimplantación, que pueden transferir excepcionalmente el transgén a su descendencia. Este protocolo es muy largo y costoso, y es por ello por lo que proponemos un protocolo adicional más rápido y más simple que permitirá la introducción eficiente y reproducible de secuencias de gran tamaño en el genoma de mamíferos. Hemos demostrado ya la eficacia de nuestro protocolo para producir ratones transgénicos con CAL constituidos por moléculas de ADN de 250 kb, donde se ha introducido el transgén de un modo estable sin roturas [Schedl A., Montoliu L., Kelsey G., Schütz G. (1993), A 250 kb YAC covering the tyrosinase gene confers position independent y copy number dependent expression in transgenic mice, Nature 362: 258-261; Giraldo P. y Montoliu L. (2002), Artificial chromosome transgenesis in pigmentary research, Pigment Cell Research 15(4): 258-264], y demostramos por vez primera que esta secuencia se transmite de un modo Mendeliano a la descendencia, para producir el fenotipo esperado.

Se han encontrado seis patentes relacionadas con el uso de esperma para mediar en la producción de organismos transgénicos. Estas patentes son:

\bullet"Methods for producing transgenic animals", CA2394699, Schatten Gerald y Chan Anthony.

\bullet"Methods of performing transgenesis", CA234042, Perry Anthony y Wakayama Teruhiko.

\bullet"Mammalian transgenesis by intracytoplasmatic sperm injection", CA2340199, Rapp Jeffrey y Sutrave Pramod.

\bullet"A method of transgenic embryo production comprising the coinsertion of a nucleic acid and a membrane-disrupted sperm head into the cytoplasm of unfertilized methaphase II oocyte". Tyuzo Yanagimachi.

\bullet"The introduction and expression of large genomic sequences in transgenic animals", WO9423049, Gearhart John D; Lamb Bruce T.

Algunas de estas patentes mencionan la posible utilización de tecnología para crear animales transgénicos con construcciones de ADN de gran tamaño; sin embargo, en ninguna de las patentes enumeradas se han producido estos animales transgénicos, ni se pueden crear dichos animales transgénicos usando la tecnología descrita en estas patentes.

Descripción de la invención Breve descripción

La invención proporciona un método para obtener animales mamíferos no humanos transgénicos con moléculas de ADN de gran tamaño (>170 kb), preferiblemente utilizando cromosomas artificiales de levaduras y cromosomas de mamíferos. Resumiendo, esta invención consiste en generar embriones transgénicos por comicroinyección de oocitos no fertilizados con esperma que se ha unido previamente a la molécula de ADN transgénico. En este método, describimos, por vez primera, la fragmentación específica tanto de la membrana como del ADN del espermatozoide por un procedimiento de congelación-descongelación, con objeto de aumentar la eficiencia de la integración del transgén. Una vez se han sometido los espermatozoides a tratamiento de rotura térmica, se coincuban a 4ºC con el cromosoma artificial y se diluyen entonces en un tampón específico [Schedl A., Larin Z., Montoliu L., Thies E., Kelsey G., Lehrach H., Schütz G. (1993), A method for the generation of YAC transgenic mice by pronuclear microinjection. Nucleic Acids Research 21: 4783-4787; Montoliu L., Bock C.T., Schütz G. y Zentgraf H. (1995) Visualization of large DNA molecules by electron microscopy with polyamines: Application to the analysis of yeast endogenous and artificial chromosomes, Journal of Molecular Biology 246: 486-493] que mantiene la integridad del ADN del cromosoma artificial. El proceso de mezcla emplea puntas de plástico con los extremos cortados y se ejecuta a una baja velocidad de succión y expulsión para evitar la fragmentación de la construcción. Después del período de coincubación (2 minutos), se inyectan los espermatozoides en el oocito.

Se puede realizar la microinyección por medio de micromanipuladores mecánicos convencionales, o más eficazmente con un manipulador piezoeléctrico. La abertura de la pipeta usada para inyectar intracitoplásmicamente los espermatozoides debe ser mayor que el diámetro de la cabeza del espermatozoide y dejar un hueco entre la célula espermática y las paredes del vaso capilar que permita la circulación de grandes moléculas de ADN, evitando así que se rompan. En nuestra invención, usamos pipetas de microinyección que tienen un diámetro interno de 7 \mum, un tamaño 10 veces mayor que el de la pipeta de microinyección pronuclear habitual, que permite la microinyección de construcciones de ADN de un tamaño muy grande sin fragmentación irreversible.

La metodología de la invención es aplicable a mamíferos no humanos, pero conceptualmente a todas las especies animales en las que están implicados en el proceso de fertilización espermatozoides y oocitos, no sólo de vertebrados, sino también de invertebrados. Con la metodología aquí descrita, hemos aumentado eficientemente la integración de elementos transgénicos producida por la inyección de espermatozoides y hemos producido, por vez primera, animales transgénicos que pueden transmitir un transgén (CAL) de 250 kb a su descendencia, produciendo un fenotipo que muestra una integración completa.

Descripción detallada

La invención tiene el problema de proporcionar nuevos procedimientos para producir animales mamíferos transgénicos no humanos para secuencias de ADN exógeno o transgenes de interés, preferiblemente de gran tamaño.

La solución aportada por esta invención se basa en que los inventores han mostrado que este nuevo procedimiento es capaz de producir animales transgénicos portadores de un cromosoma artificial de levadura (CAL) con un tamaño de 250 kb, integrado de forma estable en el ADN genómico, que se transmite de un modo mendeliano a su descendencia y que produce un fenotipo (recuperación de la pigmentación) que indica su completa presencia (véase el Ejemplo 1), y, en caso de utilizar ADN exógeno más pequeño, se ha obtenido una mayor frecuencia de animales transgénicos que cuando se utilizan otras metodologías conocidas (véase el Ejemplo 2). Más específicamente, con este procedimiento hemos obtenido un alto porcentaje de animales transgénicos (-45%) usando pequeñas secuencias de ADN (plásmidos de 5 kb), una frecuencia que supera con mucho la obtenida con otros métodos; además, usando CAL de 250 kb hemos obtenido una alta frecuencia de animales transgénicos (portadores de ADN CAL) del 35%, y entre ellos, hemos detectado animales portadores de la molécula de ADN CAL completamente integrada en el genoma del ratón hospedador con una frecuencia de \sim8%.

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Las principales diferencias y ventajas de nuestra invención son:

1. Utilización de un nuevo método de congelación que produce probablemente microrroturas en el ADN espermático. Las muestras son mantenidas por vez primera a -80ºC y por vez primera en medio M2 sin EDTA o EGTA, o elementos descondensantes, o enzimas de restricción, como es el caso con otros procedimientos (Perry AC, Wakayama T, Kishikawa H., Kasai T, Okabe M, Toyoda Y, Yanagimachi R. 1999. Mammalian transgenesis by intracytoplasmic sperm injection. Science 284/5417): 1180-1183; Chan AW, Luetjens CM, Dominko T, Ramaho-Santos J, Simerly CR, Hewitson L, Schatten G. 2000. TransgenICSI reviewed: foreign DNA transmission by intracytoplasmic sperm injection in Rhesus monkey. Mol Reprod Dev 56 (2 Supl.): 325-328; Perry AC, Rothman A, de las Heras JI, Feinstein P, Mombaerts P, Cooke HJ, Wakayama T. 2001. Efficient metaphase II transgenesis with different transgene archetypes. Nat Biotechnol 19(11): 1071-1073; Szczygiel MA, Moisyadi S, Ward WS. 2003. Expression of foreign DNA is associated with paternal chromosome degradation in intracytoplasmic sperm injection-mediated transgenesis in the mouse. Biol Reprod 6885): 1903-1910; Niemann H, Rath D, Wrenzycki C. 2003. Advances in biotechnology; new tools in future pig production for agriculture and biomedicine. Reprod Domest Anim 38(2): 82-89). Por vez primera, se demuestra que la rotura no sólo de la membrana, sino la probable rotura del ADN espermático, aumenta la eficacia de la integración del transgén.

2. Diferencias en el tiempo de coincubación entre ADN y espermatozoides. En nuestra invención, utilizamos 2 min. en lugar de los 30 ó 1 min. indicados en otros procedimientos.

3. Uso de cromosomas artificiales de levadura de gran tamaño (no de pequeñas secuencias, plásmidos, CAB) para producir animales transgénicos en combinación con los puntos 1 y 2. Ninguno de los procedimientos conocidos ha incluido ninguna experiencia con cromosomas artificiales de levadura. La publicación científica que más se parece a esta invención (aunque no emplea CAL y las metodologías son diferentes) es: Perry AC, Rothman A, de las Heras JI, Feinstein P. Mombaerts P, Cooke JH, Wakayama T. Efficient metaphase II transgenesis with different transgene archetypes, Nat Biotechnol. Nov. 2001; 19(11): 1071-3.

4. Un nuevo tipo de pipetas de microinyección que tienen un diámetro específico que permite introducir moléculas de ADN de gran tamaño sin romperlas.

5. Nuestra invención es el único sistema que selecciona los espermatozoides que han sufrido una mayor fragmentación (cabezas sin cola posdescongelación) para aumentar la eficiencia de la transgénesis.

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Resumiendo, el procedimiento aquí descrito en esta invención es el único que ha producido animales transgénicos con cromosomas artificiales de levadura de >250 kb por inyección de espermatozoides, y ha demostrado por vez primera que su integración es completa, estable y transmisible y produce el fenotipo deseado. Por lo tanto, un objeto de la presente invención es el procedimiento para generar animales transgénicos, vertebrados e invertebrados, preferiblemente vertebrados y más preferiblemente mamíferos no humanos, para secuencias de ADN exógeno o transgenes de dimensiones variables, de ahora en adelante el procedimiento de transgénesis de la invención, caracterizado por ser generados a partir de embriones transgénicos por comicroinyección de espermatozoides o de cabezas espermáticas (en el caso de ratones), unidos a dicha secuencia de ADN exógeno de interés en oocitos no fertilizados y por estar constituido por las siguientes etapas:

1) fragmentación espermática por congelación-descongelación del ADN y de las membranas del espermatozoide o de la cabeza del espermatozoide y su mantenimiento a -80ºC y en un medio tamponado isotónico sin EDTA o EGTA;

2) producción de la construcción de ADN usando como vectores para el transgén o para la secuencia de ADN exógeno de interés preferiblemente secuencias de gran tamaño presentes en bacteriófagos, cósmidos, cromosomas artificiales bacterianos (CAB) o cromosomas artificiales basados en el origen de replicación del bacteriófago P1 (CAP), y más preferiblemente cromosomas artificiales de levaduras (CAL) o cromosomas artificiales de mamíferos (CAM);

3) mezcla e incubación de construcciones de ADN con los espermatozoides o las cabezas espermáticas fragmentadas por descongelación durante 2-5 minutos, preferiblemente durante 2 minutos;

4) microinyección de construcciones y espermatozoides o cabezas espermáticas fragmentadas por descongelación en oocitos no fertilizados en fase II preparados usando pipetas de microinyección que tienen un diámetro específico que permite introducir moléculas de ADN de gran tamaño sin romperlas, y finalmente

5) transferencia de los embriones micromanipulados al oviducto/útero de una hembra receptora pseudogestante para poder continuar el desarrollo de la progenie transgénica.

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El término "ADN exógeno o transgén de interés", tal como se utiliza en la presente invención, se refiere a ADN que normalmente no es residente ni está presente en más de una copia en la célula que pretendemos transformar. El ADN exógeno puede incluir, aunque sin limitación, ADN de mamíferos, plantas, bacterias, virus, bacteriófagos, plásmidos o construcciones sintéticas. El ADN puede ser una molécula lineal o circular, con dos cadenas, y puede estar insertado o parte del ADN endógeno, al que se hace referencia mediante el término "ADN exógeno o transgén de interés", se refiere a dicha secuencia de ADN que es capaz de expresar en el animal transgénico una o más proteínas de interés y que permite, por ejemplo, obtener productos de interés comercial generados por estos animales (hormonas, factores terapéuticos, etc.), usar dichos animales como modelos de estudio o diagnosticar enfermedades animales o humanas, o usarlos en genómica funcional para contribuir a la descripción eficiente de la función genómica [Bedell MA, Jenkins NA, Copeland NG. Mouse models of human disease. Part I: techniques in resources for genetic analysis in mice. Genes Dev. Enero 1997 1; 1181): 1-10. Bedell Ma, Largaespada DA, Jenkins NA, Copeland NG. Mouse models of human disease. Part II: recent progress and future directions. Genes Dev. 1997 1:11(1)-43. Shashikant CS, Ruddle FH. 2003. Impact of transgenic technologies on functional genomics. Curr Issues Mol Biol 5(3): 75-98. Pintado B, Gutiérrez-Adán A. 1999. Transgenesis in large domestic species: future development for milk modification. Reprod Nutr Dev 39(5-6):535-544).

El término "ADN exógeno, transgén de tamaño variable de interés", tal como se usa en la presente invención, se refiere a ADN de cualquier tamaño, al menos por encima de 5 kb, preferiblemente de 170 kb, y más preferiblemente igual o superior a 250 kb.

El término "mamíferos no humanos", tal como se utiliza en la presente invención, se refiere, entre otros, a mamíferos usados como animales de laboratorio, tales como ratones, ratas y otros roedores, y animales de abasto, tales como vacas, ovejas, cabras, cerdos, conejos y caballos.

1.- Fragmentación espermática por congelación-descongelación

Un objeto particular de la presente invención es el procedimiento de transgénesis de la invención, caracterizado por realizar la fragmentación espermática por un proceso físico de congelación-descongelación en medio tamponado isotónico (preferiblemente M2) en ausencia de EDTA o EGTA, el cual, a pesar de ser muy agresivo, mejora la integración del transgén (véase el Ejemplo 2) y que se realiza como sigue:

a. se resuspende uniformemente el espermatozoide o la cabeza del espermatozoide que se va a congelar en un medio isotónico tamponado sin EDTA o EGTA (preferiblemente M2) hasta alcanzar una concentración de 1 a 3x10^{6} células por mililitro;

b. se preparan alícuotas de 50-100 \mul de la suspensión en criotubos (NUNC, Copenhagen), que se cierran firmemente y se ponen directamente en nitrógeno líquido (-196ºC) durante 10-15 minutos;

c. se mantienen las alícuotas a -80ºC (evitando la descongelación durante la transición de -196ºC a -80ºC) y se pueden usar durante 3-4 semanas sin que el desarrollo de los embriones se vea significativamente afectado, y

d. finalmente, se descongelan los espermatozoides o las cabezas espermáticas a temperatura ambiente durante 10 minutos y se han de usar entonces para microinyección intracitoplásmica en oocitos no fertilizados en las dos horas siguientes, como se describirá más adelante [Moreira P.N., Jiménez A., Fernández R., Bury-Madrid N., De La Fuente J., Pintado B. y Gutiérrez-Adán A. (2003). Mouse ICSI with frozen-thawed sperm: The impact of sperm freezing procedure and sperm donor strain. Mol Reprod Dev 66(1): 98-103].

Hay que hacer notar que, durante la colocación de las células espermáticas en nitrógeno líquido (b), es muy importante evitar la contaminación de la muestra con nitrógeno líquido, ya que esto podría comprometer el desarrollo embrionario, y por lo tanto se debe evitar la inmersión total de los criotubos.

Se puede aplicar la metodología descrita a cualquier muestra de espermatozoides o de cabezas espermáticas (fresca, congelada, deshidratada, epididimal o testicular) que mantengan su capacidad de fertilización y su potencial para generar un desarrollo embrionario normal por microinyección en oocitos no fertilizados en metafase II. Los métodos para recoger esperma fresco a partir de congelación o deshidratación, tanto de vertebrados como de invertebrados, son conocidos por los expertos y la metodología de congelación-descongelación aquí descrita puede ser fácilmente adaptada/modificada dependiendo de la especie animal o del tipo de esperma.

2.- Producción de construcciones de ADN usando cromosomas artificiales de levaduras como vectores para el transgén

Los procedimientos para preparar construcciones de ADN como vectores para la expresión de secuencias de interés son ampliamente conocidos por los expertos en este campo y pueden ser aplicables a la presente invención. Con fines ilustrativos, se obtiene ADN de cromosomas artificiales de levaduras (CAL) usando métodos previamente descritos y optimizados para su microinyección en oocitos de ratón con objeto de generar ratones transgénicos (Schedl A., Grimes B. y Montoliu L. (1996) YAC-transfer by microinjection. En: Methods in Molecular Biology, volumen 54, Yeast artificial chromosome protocols, ED: Markie D., capítulo 25: 293-306. Humana Press, Totowa (New Jersey); Lluís Montoliu. Large-scale preparation of agarose plugs of yeast AND (pp. 326-328). Purification of YAC AND with filtration units (pp. 329-331). Purification of YAC AND with filtration units (p. 333). En: Manipulating the Mouse Embryo. A Laboratory Manual (tercera Edición) (2003). Andras Nagy, Marian Gersenstein, Kristina Vintersten, Richard Behringer (Eds.), Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor, New York), ya aplicados a la generación de ratones transgénicos por medio de inyección pronuclear (Montoliu L., Umland T. y Schütz G. (1996) A locus control region at -12 kb of the tyrosinase gene. The EMBO Journal 15: 6026-6034).

Otro objeto particular de la presente invención es el procedimiento de transgénesis de la invención en el cual el ADN exógeno o el transgén de interés se encuentran en un cromosoma artificial de levadura (CAL) que actúa como vector. Otro objeto particular de la presente invención es el procedimiento de transgénesis de la invención en el que el transgén de interés se encuentra en un cromosoma artificial de mamífero (CAM) que actúa como vector, tal como, por ejemplo, el cromosoma artificial humano (Larin Z., Mejia JE. Advances in human artificial chromosome technology. Trends Genet. Jun. 2002; 18(6): 313-9. Cooke H. Mammalian artificial chromosomes as vectors: progress and prospects. Cloning Stem Cells. 2001; 3(4): 243-9. Hadlaczky G. Satellite DNA-Based artificial chromosomes for use in gene therapy. Curr Opin Mol Ther. Abr. 2001; 3(2): 125-32. Vos JM. Therapeutic mammalian artificial episomal chromosomes. Curr Opin Mol Ther. Abr. 1999; 1(2): 204-15).

Otro objeto particular de la presente invención es el procedimiento de transgénesis de la invención en el cual el ADN exógeno de gran tamaño o el transgén de interés se encuentran en un plásmido, un bacteriófago, un cósmido, un CAB, un CAP, un CAL, un CAM o cualquier otro elemento que actúe como vector.

3.- Mezcla e incubación de portadores de cromosomas artificiales de levaduras del transgén deseado con esperma descongelado

Se mezcla la solución espermática, fragmentada por descongelación y concentrada como se ha descrito previamente, con ADN exógeno contenido en cromosomas artificiales de levaduras, también descritos previamente. En este proceso, es importante reducir la posibilidad de fragmentación de las construcciones, así como mantener una concentración final específica del ADN (y macromoléculas asociadas) presente en la mezcla, para evitar situaciones de toxicidad para el embrión. La concentración final de ADN puede oscilar entre 2 y 20 nanogramos por microlitro, preferiblemente 10 nanogramos por microlitro de solución de ADN-esperma. La concentración de solución madre de ADN que contiene el transgén es preparada de tal modo que pueda ser diluida hasta alcanzar la concentración deseada de ADN, con un volumen de solución espermática que contenga un número de espermatozoides (o de cabezas) suficientemente elevado como para no dificultar el proceso de microinyección. Para una dilución 1:1 v:v (ADN:espermatozoides), la concentración mínima de ADN debe encontrarse, de manera ideal, en alrededor de 10-20 \mul en la solución madre.

Otro objeto particular de la presente invención es el procedimiento de transgénesis caracterizado por realizar la mezcla y la incubación de esperma y ADN como sigue:

1. se preparan muestras iniciales de tal forma que la concentración final de ADN sea igual a 10 nanogramos por microlitro de solución de ADN-esperma;

2. se pipetean las muestras, en condiciones estériles, usando puntas de plástico con las cabezas cortadas y una velocidad lenta de succión y expulsión y a baja temperatura (4ºC) para reducir la posibilidad de fragmentación de las construcciones, y

3. se incuba la solución de ADN-esperma en hielo durante 2 minutos, antes de diluirla con PVP al 10% en M2 (solución final de ADN-esperma) para ser microinyectada a temperatura ambiente durante las 2 horas siguientes.

4.- Preparación de los oocitos receptores

En la metodología de la invención, se realizan las microinyecciones en oocitos maduros que se encuentran en metafase II, independientemente del tipo de maduración (in vivo o in vitro) que hayan sufrido. Los oocitos inmaduros (es decir, en fase vesicular germinal) pueden ser madurados in vitro hasta que alcancen el estado de metafase II en medio promotor de la maduración. Se puede encontrar la metodología para la maduración in vitro de oocitos en Methods of Enzymology 225, 77-84, Academic Press (1993), y es accesible a cualquier experto en la materia. Se pueden obtener oocitos que hayan madurado in vivo por superovulación con inyecciones de gonadotropina u otras hormonas, o por medios quirúrgicos poco después de la ovulación. Los oocitos que se han retirado quirúrgicamente de oviductos de ratones están envueltos en una masa de células del cúmulo, que se dispersa por incubación en un medio tamponado que contiene hialuronidasa testicular (es decir, en ratones, 300 UI/ml de M2 durante 3-5 minutos). Se lavan entonces los oocitos libres de las células del cúmulo en un medio sin hialuronidasa y se ponen, hasta el momento de la inyección, en un medio de cultivo previamente equilibrado (es decir, KSOM + aminoácidos para oocitos de ratones a un 5% de CO_{2} y 37ºC).

5.- Comicroinyección intracitoplásmica de núcleo de espermatozoide y ADN exógeno en el oocito

Durante la fertilización de oocitos en metafase II por medio de microinyección intracitoplásmica de espermatozoides (IICE), se puede inyectar el espermatozoide completo. Sin embargo, se debe evitar la inyección de la cola del gameto masculino si su centrosoma no participa en el proceso de fertilización (es decir, en ratones). Esto facilita el proceso de microinyección y reduce el volumen de fluido inyectado en el citoplasma del oocito. La microinyección puede ser realizada por un experto en la materia y de forma convencional [es decir, la metodología para hámsteres está descrita en Yanagida, K., Yanagimachi, R., Perrault, S. D. y R. G. Keinfield, Biology of Reproduction 44, 440-447 (1991); Perry AC, Wakayama T, Kishikawa H, Kasai T, Okabe M, Toyoda Y, Yanagimachi R. Mammalian transgenesis by intracytoplasmic sperm injection. Science. 14 de Mayo de 1999; 284 (5417): 1180-3.], o con la ayuda de una unidad piezoeléctrica de microinyección (Piezo Impact Drive Unit de Prime Tech Ltd.; Tsukuda, Ibaraki-Ken, Japón). Esta unidad utiliza el efecto piezoeléctrico para mover la pipeta de inyección de una forma controlada de un lado a otro en cortas distancias (0,5 micrómetros aproximadamente). La unidad permite la regulación de la intensidad y la duración de cada impulso.

Para inyección en el oocito, se arrastra primeramente la cola (de haberla) de un núcleo de espermatozoide mezclado con ADN exógeno al capilar de inyección. Este capilar debe tener una punta (sección recta siempre que se utilice una unidad piezoeléctrica) con un diámetro interno de aproximadamente 6-10 \mum (dependiendo de la especie animal) que permita introducir moléculas de ADN de gran tamaño sin romperlas. En algunas especies, tales como el ratón, es suficiente inyectar la cabeza del espermatozoide para un normal desarrollo embrionario y esto simplifica el proceso de micromanipulación, ya que sólo se pueden inyectar las cabezas que se separan durante el proceso de congelación-descongelación -que son las cabezas que probablemente han sufrido más durante el proceso de congelación-descongelación-. Otro objeto particular de la presente invención es el procedimiento de transgénesis caracterizado por realizar el proceso de comicroinyección de las construcciones y de los espermatozoides o de las cabezas congeladas-descongeladas en oocitos preparados, en el caso de los ratones, seleccionando previamente las cabezas espermáticas que han perdido la cola durante el proceso de congelación-descongelación y por tener el capilar de microinyección un diámetro interno de entre 6 y 10 \mum aproximadamente, dependiendo de la especie animal, y preferiblemente de 7 \mum.

Durante la coinyección intracitoplásmica del complejo ADN exógeno-espermatozoide, se sitúa el oocito, por presión negativa y con ayuda de una pipeta de soporte, de tal forma que su placa metafásica esté situada lo más alejada del punto de penetración. Se perfora el área pelúcida por aplicación de impulsos piezoeléctricos de suficiente intensidad y velocidad. Después de expulsar el fragmento de área que se adhiere a la punta de la pipeta de inyección, sobre la gota de micromanipulación o en el espacio perivitelino del oocito, la cabeza del espermatozoide se aproxima a la abertura de la pipeta de inyección. Se avanza la pipeta de inyección hasta dos tercios del diámetro del oocito y, en ese punto, se aplica un impulso de intensidad sólo mínima para abrir la membrana. La penetración viene indicada por el combamiento de la membrana del oocito. Se libera el complejo ADN exógeno-espermatozoide con una cantidad mínima de fluido (no más de 6 picolitros) en el citoplasma del oocito, transportando así el transgén de interés. Se extrae entonces suavemente la pipeta de inyección del citoplasma del oocito para evitar el riesgo de lisis celular. Se realiza la microinyección lo más rápidamente posible en grupos de 10-15 oocitos, que se ponen después de 10-15 minutos de recuperación en la gota de microinyección en condiciones de cultivo (es decir, medio KSOM + aminoácidos para oocitos de ratón, equilibrado a un 5% de CO_{2} y 37ºC).

6.- Activación de oocitos fertilizados

Se sabe que, para que se produzca la activación de los oocitos tras la microinyección sin la ayuda de substancias químicas inductoras, es necesario dañar de algún modo la membrana plasmática del espermatozoide para permitir la liberación de los componentes internos localizados perinuclearmente (sin caracterización completa hasta el día de la fecha) al citoplasma del oocito. La acción de estos factores, ya detectable en el estadío de espermátide redonda, no es específica de especie (es decir, los factores espermáticos porcinos tienen la capacidad de activar los oocitos de ratones) y la inyección de un solo espermatozoide/cabeza es suficiente para activar el oocito receptor. En esta invención, se consigue la fragmentación de la membrana del espermatozoide por congelación-descongelación, un método que permite la activación directa de los oocitos microinyectados. En otras especies, se puede emplear la micromanipulación para producir fragmentación de la membrana del espermatozoide, por ejemplo inmovilizando su cola contra el fondo de la placa de microinyección. Lo mismo es posible tratando el esperma con detergentes tales como SDS y Tritón X-100, por sonicación o por congelación-deshidratación. En algunas especies (es decir, especies bovinas), la metodología IICE empleada no son los oocitos receptores. En esos casos, los métodos normales utilizados son: métodos de activación partenogenética tales como la electroactivación, inyección de substancias activadoras (es decir, adenofosfatina) o incubación de oocitos en un medio que contenga substancias activadoras tales como estimulantes de la liberación de Ca^{2+} interno (cafeína, ionóforo A 23187, ionomicina y etanol), moduladores de la señal de las fosfoproteínas (2-aminopurina, estaurosporina, esfingosina), inhibidores de la síntesis de proteínas (ciclohexamida, 6-dimetilaminopurina) o sus combinaciones (ionomicina con 6-dimetilaminopurina).

7.- Desarrollo de embriones manipulados para producir descendencia

Se transfieren embriones que se han desarrollado in vitro hasta alcanzar el estadío 2-8 células, de mórula o de blastocito al oviducto o al útero de una hembra pseudogestante. En ratones, se transfieren entre 15 y 20 embriones por cada hembra receptora.

Finalmente, el objetivo de la presente invención es un animal transgénico, vertebrado o invertebrado, y más preferiblemente un mamífero no humano, obtenido mediante el procedimiento de transgénesis descrito en la presente invención. Un mamífero no humano, al que se hace aquí referencia, es preferiblemente un animal encuadrado en uno de los grupos siguientes: animales de laboratorio tales como ratones, ratas y otros roedores, y animales de abasto, tales como vacas, ovejas, cabras, cerdos, conejos y caballos.

Ejemplos de realización

Los siguientes ejemplos tratan de ilustrar la metodología de la invención sin limitar su alcance.

Ejemplo 1 Producción de ratones transgénicos que son portadores de un cromosoma artificial de levadura de 250 kb por inyección de esperma Recogida de esperma y congelación-descongelación

Se recogió el esperma epididimal y se suspendió uniformemente en medio M2 (sin EDTA o EGTA). Se lavaron las células espermáticas así recogidas por centrifugación en un tubo de polipropileno de 1,5 ml con 1 ml de medio fresco y se resuspendieron para obtener una concentración final de 1-3 millones de espermatozoides por ml. Se prepararon después alícuotas de 100 microlitros de solución de esperma en tubos criogénicos (NUNC, Copenhagen), que fueron correctamente cerrados y puestos directamente en nitrógeno líquido (-196ºC) durante 10-15 minutos, sin sumergirlos completamente en él para evitar la contaminación de las muestras por nitrógeno líquido. Se mantuvieron luego las muestras durante períodos de hasta 4 semanas a -80ºC (evitando descongelar durante la transición de -196ºC a -80ºC). Se mantuvieron condiciones estériles a lo largo de todo el procedimiento.

Se descongelaron las muestras de esperma a temperatura ambiente durante 10 minutos antes de usarlas.

Preparación de ADN CAL

Se obtiene ADN de cromosoma artificial de levadura (CAL) por métodos que ya han sido descritos y optimizados para su microinyección en oocitos de ratones con objeto de generar ratones transgénicos (Schedl A., Grimes B y Montoliu L. (1996). YAC-transfer by microinjection. En: Methods in Molecular Biology, volumen 54, Yeast artificial chromosome protocols, Ed: Markie D., capítulo 25: 294-306. Humana Press, Totowa (New Jersey); Lluís Montoliu. Large-scale preparation of agarose plugs of yeast DNA (pp. 326-328). Purification of YAC DNA with filtration units (pp. 329-331). Purification of YAC DNA with filtration units (pag. 333). En: Manipulating the Mouse Embryo. A Laboratory Manual (Tercera Edición) (2003). Andras Nagy, Marian Gersenstein, Kristina Vintersten, Richard Behringer (Eds.), Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Edition) (2003). Andras Nagy, Marian Gersenstein, Kristina Vintersten, Richard Behringer (Eds.), Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor, New York), ya aplicados a la generación de ratones transgénicos por medio de inyección pronuclear (Montoliu L., Umland T. y Schütz G. (1996). A locus control region at -12 kb of the tyrosinase gene. The EMBO Journal 15: 6026-6034). Primeramente, se obtiene un cultivo en saturación de las células de levadura portadoras del CAL de interés. Tras varias concentraciones y lavados, se encapsulan las células de levadura en una matriz de agarosa con un bajo punto de fusión que tiene la forma de pequeños dados. Se exponen estos dados de agarosa a diferentes soluciones enzimáticas y tratamientos químicos con detergentes que conducen a la lisis celular y al aislamiento de moléculas de ADN intactas (incluyendo las correspondientes a los CAL). Se realiza la separación de la molécula de ADN correspondiente al CAL con respecto a los restantes 16 cromosomas de la célula de levadura por electroforesis preparatoria en un campo pulsante. Finalmente, se obtiene la molécula de ADN correspondiente al CAL en solución después de haber fundido, en condiciones controladas y en presencia de poliaminas y de una fuerza iónica dada del medio, la agarosa incubándola a 50ºC y digiriendo luego la agarosa licuada. Se usan tubos de centrífuga acoplados a membranas de diálisis con un tamaño de poro que permite el paso de todas las moléculas menores de 30.000 daltons para concentrar las moléculas de ADN CAL. Para purificar la solución concentrada de ADN del CAL, se somete la solución a un proceso de diálisis de 2-3 horas a temperatura ambiente sobre filtros flotantes con un tamaño de poro de 0,05 micrómetros frente a tampón de microinyección (Tris-HCl 10 mM, pH = 7,5, EDTA 0,1 mM, NaCl 100 mM, Espermina 30 micromolar, Espermidina 70 micromolar). Se estima la cantidad de ADN CAL por cuantificación específica mediante fluorimetría y se verifica comparando las intensidades de fluorescencia en un gel de agarosa de electroforesis horizontal frente a cantidades conocidas de ADN CAL. Hay que emplear el máximo cuidado y puntas de micropipeta con los extremos cortados para evitar la rotura de las moléculas de ADN CAL.

El CAL usado fue producido de este modo, se le llamó YRT2\DeltaLCR y tiene un tamaño de 250 kb e incluye el locus de la tirosinasa de ratón, un gen que codifica una enzima fundamental en la síntesis de melanina. Este CAL lleva una deleción interna de un área reguladora génica, cuya ausencia reduce dramáticamente su expresión en la piel, conservando su expresión en la retina/el ojo, de un modo similar al observado en otros CAL previamente descritos (Montoliu L., Umland T. y Schütz G. (1996). A locus control region at -12 kb of the tyrosinase gene. The EMBO Journal 15: 6026-6034; Giménez E., Giraldo P., Jeffery G. y Montoliu L. (2001). Variegated expression and delayed retinal pigmentation during development in transgenic mice with a deletion in the locus control region of the tyrosinase gene. Genesis 30(1): 21-25; Giraldo P. y Montoliu L. (2002). Artificial chromosome transgenesis in pigmentary research. Pigment Cell Research 15 (4): 258-264).

Preparación de la mezcla ADN-espermatozoide para el microinyector

Se mezcla la solución de esperma, fragmentada por descongelación y concentrada como se ha descrito previamente, con el ADN de cromosomas artificiales de levadura YRT\DeltaLCR. Se realiza el proceso de mezcla de la solución de esperma fragmentada por descongelación y concentrada con ADN de cromosomas artificiales de levadura por pipeteado, en condiciones estériles, usando puntas de plástico con los extremos cortados, a una velocidad lenta de succión y expulsión y a bajas temperaturas (4ºC), para reducir la posibilidad de que se fragmenten las construcciones. La concentración final de ADN (y macromoléculas asociadas) en la mezcla es también importante para evitar situaciones que sean tóxicas para el embrión. La concentración final de ADN no debe exceder de 10 nanogramos por microlitro de solución de ADN-espermatozoides. La concentración de solución madre de ADN que contiene el transgén es preparada de tal forma que se pueda diluir hasta alcanzar la concentración final de ADN deseada, con un volumen de solución de espermatozoides que contenga un número suficientemente alto de espermatozoides (o de cabezas) que no obstaculice el proceso de microinyección. Para una dilución 1:1 v:v (ADN:espermatozoides), la concentración mínima de ADN de ser, de manera ideal, de alrededor de 10-20 ng/\mul en la solución madre. La concentración de la solución madre de ADN que contenía el transgén era de 7,5 nanogramos por microlitro. La concentración final de ADN en este experimento era de 3,75 nanogramos por microlitro (dilución 1:1 de ADN:espermatozoides). Se cultivó la solución de ADN:espermatozoides sobre hielo durante 2 minutos, antes de diluirla con PVP al 10% en M2 para disminuir la adhesión a la pipeta de inyección. Esta solución final de ADN:espermatozoides debe ser microinyectada a temperatura ambiente durante las 2 horas siguientes.

Comicroinyección intracitoplásmica de núcleos de espermatozoides y de ADN exógeno en el oocito

Durante la fertilización de oocitos en metafase II por inyección intracitoplásmica de espermatozoides (IICE), se puede inyectar el espermatozoide completo. Sin embargo, se debe evitar inyectar la cola del gameto masculino si su centrosoma no participa en el proceso de fertilización (es decir, en ratones). Esto facilita el proceso de microinyección y reduce el volumen de fluido inyectado en el citoplasma del oocito. La microinyección puede ser realizada convencionalmente [es decir, la metodología para hámsteres está descrita en Yanagida, K., Yanagimachi, R., Perrault, S. D. y R. G. Keinfield, Biology of Reproduction 44, 440-447 (1991); Perry AC, Wakayama T, Kishikawa H, Kasai T, Okabe M, Toyoda Y, Yanagimachi R. Mammalian transgenesis by intracytoplasmic sperm injection. Science. 14 de Mayo de 1999; 284 (5417): 1180-3], o con la ayuda de una unidad de microinyección piezoeléctrica (Piezo Impact Drive Unit de Prime Tech Ltd.; Tsukuda, Ibaraki-Ken, Japón). Esta unidad utiliza el efecto piezoeléctrico para mover la pipeta de inyección de un modo controlado de un lado a otro en distancias cortas (0,5 micrómetros aproximadamente). La unidad permite regular la intensidad y la duración de cada impulso.

Para inyectar un núcleo de espermatozoide mezclado con ADN exógeno en el oocito, la cola del espermatozoide (de haberla) es arrastrada primeramente al capilar de inyección. Este capilar debe tener una punta (sección recta siempre que se utilice una unidad piezoeléctrica) con un diámetro interno de aproximadamente 6-10 \mum (dependiendo de la especie animal). En algunas especies, tales como el ratón, la inyección de la cabeza del espermatozoide es suficiente para un desarrollo embrionario normal, y esto simplifica el proceso de micromanipulación, y entonces sólo se pueden inyectar las cabezas que se separan durante el proceso de congelación-descongelación -que son las cabezas que probablemente han sufrido más durante el proceso de congelación-descongelación-.

Durante la coinyección intracitoplásmica de complejo ADN exógeno-espermatozoide, se sitúa el oocito, por presión negativa y con ayuda de una pipeta de soporte, de tal modo que su placa metafásica se encuentre lo más alejada del punto de penetración. Se perfora el área pelúcida por aplicación de impulsos piezoeléctricos de suficiente intensidad y velocidad. Después de expulsar el fragmento de área que se adhiere a la punta de la pipeta de inyección, sobre la gota de micromanipulación o en el espacio perivitelino del oocito, la cabeza del espermatozoide se aproxima a la abertura de la pipeta de inyección. Se avanza la pipeta de inyección a dos tercios del diámetro del oocito y en ese punto se aplica un impulso de intensidad sólo mínima para abrir la membrana. La penetración viene indicada por el combamiento de la membrana del oocito. Se libera el complejo ADN exógeno-espermatozoide con una cantidad mínima de fluido (no más de 6 picolitros) en el citoplasma del oocito, transportando así el transgén de interés. Se extrae entonces suavemente la pipeta de inyección del citoplasma del oocito para evitar el riesgo de lisis celular. Se realiza la microinyección lo más rápidamente posible en grupos de 10-15 oocitos, que se ponen después de 10-15 minutos de recuperación en la gota de microinyección en condiciones de cultivo (es decir, medio KSOM + aminoácidos para oocitos de ratón, equilibrado a un 5% de CO_{2} y 37ºC).

Desarrollo de embriones manipulados para producir descendencia

Se transfieren embriones que se han desarrollado in vitro hasta alcanzar el estadío de 2-8 células, de mórula o de blastocito al oviducto o al útero de una hembra pseudogestante. En ratones, se transfieren entre 15 y 20 embriones por cada animal receptor.

Análisis genético de la integración del CAL en los ratones nacidos TABLA 1 División embrionaria y transgenicidad obtenida con una construcción (CAL) de 250 kb

1

Nota adicional: de los 12 animales transgénicos vivos, al menos 1 de ellos (8%) presenta la totalidad de la secuencia YRT\DeltaLCR del CAL y manifiesta el fenotipo esperado (con pigmentación en los ojos y prácticamente ausente en la piel).

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Ejemplo 2 Uso de un nuevo protocolo de congelación-descongelación para aumentar la eficiencia de la integración de elementos transgénicos producidos por inyección intracitoplásmica de espermatozoides

Se analizó el efecto de la congelación del esperma en presencia o ausencia de agentes quelantes, que estabilizan los cromosomas de los espermatozoides (EDTA), en la integración de los transgenes. En este ejemplo, se usó un plásmido portador del gen GFP (un plásmido de aproximadamente 5 kb) bajo la regulación del promotor de CMV, que produce una proteína fluorescente fácilmente detectada en un microscopio de fluorescencia. Empleando un protocolo de microinyección intracitoplásmica similar al descrito en el Ejemplo 1, se analizó el número de blastocitos que expresaban el transgén según el sistema de congelación utilizado. Los resultados indicaron que, cuando se congeló el esperma con agentes quelantes, el porcentaje de blastocitos que expresaban el transgén (GFP) era significativamente menor (20-30% de blastocitos verdes de 40 blastocitos analizados) que cuando el medio de congelación no contenía dichos agentes quelantes (100% de blastocitos verdes de 40 blastocitos analizados). Posteriormente, se usó este protocolo de fragmentación por congelación para producir ratones transgénicos y se obtuvo un 45% de animales transgénicos, una frecuencia que excede con mucho de la obtenida con otros métodos (Tabla 2) y donde el transgén se incorporó íntegramente en todos los casos.

TABLA 2 División embrionaria y transgenicidad obtenida con una construcción (EGFP) de 5,3 kb

2

Materiales y métodos Animales de laboratorio

Se usaron ratones CD-1 (hembras de 6-8 semanas de edad y machos de 3-8 meses de edad) como donantes de oocitos y de espermatozoides. Los ratones hembra receptores de los embriones eran hembras CD-1 previamente cruzadas con machos vasectomizados de la misma cepa para inducir una pseudogestación. Los animales fueron alimentados ad libitum con una dieta convencional y mantenidos en una sala con temperatura y luz controladas (23ºC, 14 horas de luz:10 horas de obscuridad). Todos los experimentos con animales fueron realizados según las directrices especificadas en la Guide for the Care and Use of the European Federation of Laboratory Animal Science Associations.

Recogida y preparación de los oocitos

Se recogieron oocitos en metafase II (MII) 14 horas después de administrar gonadotropina coriónica humana (HCG), obtenida de hembras superovuladas con 5 UI de PMSG y una dosis equivalente, administrada 48 horas después, de HCG. Se dispersaron las células del cúmulo por medio de 3-5 minutos de incubación en medio M2 que contenía 350 UI/ml de hialuronidasa.

Se lavaron entonces los oocitos libres de las células del cúmulo en un medio libre de hialuronidasa y se pusieron en un medio de cultivo previamente equilibrado hasta el momento de la microinyección (es decir, KSOM + aminoácidos para oocitos de ratón a un 5% de CO_{2} y 37ºC).

Micromanipulación, cultivo y transferencia de embriones

La inyección pronuclear en ratones fue realizada convencionalmente (Nagy A., Gertstenstein M, Vintersten K, Behringer R. Manipulating the mouse embryo. A laboratory manual (3ª edición), Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York, 2003). La integración de CAL asistida por IICE llevada a cabo con esperma congelado-descongelado fue realizada en medio M2, a temperatura ambiente, inmediatamente después de mezclar los espermatozoides y el ADN, durante un período no superior a 120 minutos. Se mezcló un volumen de solución de espermatozoides-CAL con 5 de medio M2 que contenía un 10% de polivinilpirrolidona (PVP) para reducir la adhesión. La placa de IICE contenía una gota de manipulación (medio M2), una gota de espermatozoides-CAL (solución de espermatozoides-CAL en M2/10% de PVP) y una gota de M2/10% de PVP para limpiar la aguja de inyección. Se realizaron las inyecciones con una unidad piezoeléctrica usando una pipeta que contenía mercurio, con una punta recta y un diámetro interno de 5-6 micrómetros. Se coinyectaron las cabezas individualizadas obtenidas tras congelación-descongelación con ADN en los oocitos. Se inyectaron los oocitos en grupos de 10. Después de 15 minutos de recuperación a temperatura ambiente en medio M2, se pusieron los oocitos supervivientes en KSOM cubierto de aceite mineral y se cultivaron a 37ºC en una atmósfera con un 5% de CO_{2}. Para obtener descendencia, se transfirieron los embriones inyectados pronuclearmente o fertilizados por IICE a los oviductos de hembras receptoras pseudogestantes CD-1.

Claims (15)

1. Procedimiento para la generación de animales transgénicos no humanos para secuencias de ADN exógeno o transgenes, generados a partir de embriones transgénicos por comicroinyección de espermatozoides o de cabezas de espermatozoides, caracterizado por consistir en las etapas siguientes:

- fragmentación tanto de la membrana como del ADN espermático por un procedimiento de congelación-descongelación en un medio isotónico tamponado que no contiene EDTA o EGTA;

- producción de una construcción de ADN usando un vector para el transgén o la secuencia de ADN exógeno de interés, de un tamaño mayor de 170 kb;

- mezcla e incubación de dicha construcción de ADN con dicho espermatozoide fragmentado por descongelación durante un tiempo de 2 a 5 min.;

- comicroinyección de dicha construcción de ADN y del espermatozoide fragmentado por descongelación en oocitos preparados en metafase II no fertilizados, y

- transferencia de los embriones micromanipulados resultantes al oviducto/útero de una hembra receptora pseudogestante para permitir el posterior desarrollo de descendencia transgénica.

2. Procedimiento según la reivindicación 1, caracterizado por el hecho de que dichos animales son animales vertebrados.

3. Procedimiento según la reivindicación 2, caracterizado por el hecho de que dichos animales vertebrados son mamíferos.

4. Procedimiento según la reivindicación 3, caracterizado por el hecho de que dichos mamíferos son roedores.

5. Procedimiento según la reivindicación 3, caracterizado por el hecho de que dichos mamíferos son animales de abasto.

6. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, caracterizado por ser dicho medio isotónico tamponado M2.

7. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, caracterizado por tener dicha construcción de ADN un tamaño de 250 kb o mayor.

8. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, caracterizado por ser dicho vector un bacteriófago.

9. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, caracterizado por ser dicho vector un cósmido.

10. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, caracterizado por ser dicho vector un cromosoma artificial bacteriano, CAB.

11. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, caracterizado por ser dicho vector un cromosoma artificial basado en el origen de replicación del bacteriófago P1, CAP.

12. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, caracterizado por ser dicho vector un cromosoma artificial de levadura, CAL.

13. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, caracterizado por ser dicho vector un cromosoma artificial de mamífero, CAM.

14. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13, caracterizado por el hecho de que dicha incubación dura un tiempo de 2 min.

15. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones precedentes, caracterizado por consistir en las etapas siguientes:

- fragmentación tanto de la membrana como del ADN espermático por un procedimiento de congelación-descongelación en un medio isotónico tamponado que no contiene EDTA o EGTA;

- producción de una construcción de ADN de 250 kb o mayor usando como vector para el transgén o la secuencia de ADN exógeno de interés un bacteriófago, un cósmido, un CAB, un CAP, un CAL o un CAM;

- mezcla e incubación de dicha construcción de ADN con dicho espermatozoide fragmentado por descongelación durante un tiempo de 2 min.;

- comicroinyección de dicha construcción y del espermatozoide fragmentado por descongelación en oocitos preparados en metafase II no fertilizados, y

- transferencia de los embriones micromanipulados resultantes al oviducto/útero de una hembra receptora pseudogestante para permitir el posterior desarrollo de descendencia transgénica.