ES2245591B1 - Nuevo procedimiento para generar animales transgenicos no humanos, y los animales transgenicos asi obtenidos. - Google Patents
Nuevo procedimiento para generar animales transgenicos no humanos, y los animales transgenicos asi obtenidos. Download PDFInfo
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Abstract
Nuevo procedimiento para generar animales transgénicos no humanos, y los animales transgénicos así obtenidos. Un objeto de la presente invención lo constituye un procedimiento para generar animales transgénicos, vertebrados e invertebrados, preferentemente vertebrados, y más preferentemente mamíferos no humanos, para secuencias de ADN exógeno o transgenes de dimensiones variables caracterizado porque se generan a partir de embriones transgénicos por co-microinyección de espermatozoides o cabezas de espermatozoides (en el caso de ratón) unidos a dicha secuencia de ADN exógeno de interés en ovocitos no fertilizados. Igualmente, forman parte de la invención los animales transgénicos no humanos así obtenidos.
Description
Nuevo procedimiento para generar animales
transgénicos no humanos, y los animales transgénicos así
obtenidos.
La presente invención proporciona un
procedimiento para la producción de animales mamíferos no humanos
transgénicos mediante la integración de moléculas de ADN de gran
tamaño (cientos de kilobases) para aplicaciones en Biología,
Biomedicina y Biotecnología. La importancia de esta invención,
resulta del valor de los animales transgénicos que consigue generar,
tanto por los nuevos productos generados por estos animales, por su
uso como modelo de estudio o diagnóstico de enfermedades animales y
humanas, o por su uso en genómica funcional, para contribuir a la
descripción eficaz de la función génica.
La producción de animales transgénicos a través
de la introducción de ADN exógeno en el genoma de sus células
somáticas o germinales, proporciona modelos para la comunidad
científica, pero también organismos para aplicaciones agrícolas,
biotecnológicas, farmacológicas y médicas. Ejemplos, son la
introducción de genes humanos en el genoma del ratón con la
finalidad de estudiar y diagnosticar determinadas enfermedades; o la
modificación genética de ganado para la producción en leche, de
grandes cantidades de proteínas de interés farmacológico; o el
estudio funcional de nuevos genes proporcionados por la
secuenciación completa de genomas animales.
Las técnicas de transgénesis se utilizan
principalmente en animales de laboratorio (mayoritariamente
ratones, pero también ratas y otros roedores, en menor medida) y en
animales de producción ganadera. Las metodologías para producir
animales transgénicos han ido evolucionando gracias al desarrollo de
nuevas tecnologías reproductivas y moleculares. Entre las técnicas
mas utilizadas se encuentran la microinyección pronuclear de
ovocitos fecundados, la utilización de virus recombinantes como
mediadores para la introducción del transgén en el genoma
embrionario, la utilización de células troncales pluripotentes
embrionarias transformadas genéticamente por diversos métodos, o la
transferencia de ADN mediada por espermatozoides vivos o muertos
(Nagy A., Gertsenstein M, Vintersten K, Behringer R. Manipulating
the mouse embryo. A laboratory manual (3rd edition), Cold Spring
Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York, 2003).
Estos métodos se muestran muy eficaces a la hora
de producir transgénicos con moléculas de ADN de tamaño pequeño, sin
embargo, no existen métodos eficaces y reproducibles que permitan
introducir moléculas de ADN de gran tamaño (mayores de 170 Kb) como
por ejemplo los cromosomas artificiales de levadura (YAC) o de
mamífero (MAC), en el genoma animal. A medida que conocemos mejor la
complejidad del genoma animal, sabemos que es necesario utilizar
mayores longitudes de ADN en las construcciones transgénicas, para
poder garantizar la introducción conjunta de todas las secuencias
genéticas codificantes y potencialmente reguladoras, y de esta
forma, asegurar una correcta expresión del gen, en tiempo, lugar y
nivel; y para estudiar grandes regiones o estructuras genómicas
complejas que agrupan diversos genes funcionando coordinadamente
(por ej. el locus de los genes de las cadenas pesadas o ligeras de
las Inmunoglobublinas) [Giraldo P., Montoliu L. (2001) Size matters:
use of YACs, BACs and PACs in transgenic animals. Transgenic
Research 10(2): 83-103].
Existen dos métodos utilizados para producir
transgénicos con cromosomas artificiales: la microinyección
pronuclear de ovocitos fecundados y el uso de células troncales
(transfectadas con el ADN mediante lipofección o fusionando las
mismas células troncales con células de levadura portadoras del YAC)
[Peterson K.R. (2003) Transgenic mice carrying yeast artificial
chromosomes. Expert Reviews in Molecular Biology 5:
1-25]. En relación a la microinyección pronuclear,
el diámetro interno de la aguja de microinyección (menor o igual a 1
micrómetro) puede impedir que las grandes moléculas de ADN sean
introducidas, sin que sufran en la mayoría de las veces, roturas.
Cuando se incrementa el tamaño del transgén, se incrementa también
la posibilidad de dañar este ADN durante la purificación, dilución,
almacenamiento y principalmente, durante la manipulación. Una
alternativa a la microinyección es la transformación de células
troncales pluripotentes embrionarias con los cromosomas artificiales
para posteriormente utilizar estas células transformadas en la
producción de quimeras, mediante su unión con embriones en estadio
preimplantacional, que excepcionalmente puedan transferir el
transgén a la descendencia. Este protocolo es muy largo y costoso,
por lo que nosotros proponemos un protocolo adicional más rápido y
sencillo que permite introducir eficientemente y de forma
reproducible, secuencias de gran tamaño en el genoma de mamífero.
Nosotros hemos demostrado la eficacia de nuestro protocolo
produciendo ratones transgénicos con YACs constituidos por moléculas
de ADN de 250 Kb, en donde el transgén se ha introducido de forma
estable y sin sufrir roturas [Schedl A., Montoliu L., Kelsey G.,
Schütz G. (1993) A 250 kb YAC covering the tyrosinase gene confers
position independent and copy number dependent expression in
transgenic mice. Nature 362: 258-261; Giraldo P.
& Montoliu L. (2002) Artificial chromosome transgenesis in
pigmentary research. Pigment Cell Research 15 (4):
258-264], y demostramos por primera vez que esta
secuencia se transmite de forma mendeliana a la descendencia y
produce el fenotipo esperado.
Se han encontrado seis patentes relacionadas con
la utilización de espermatozoides para mediar la producción de
transgénicos, estas patentes son:
- "Methods for producing transgenic
animals" CA2394600 Schatten Gerald and Chan Anthony.
- "Method of performing trangenesis"
CA2340242 Perry Anthony and Wakayama Teruhiko.
- "Mammalian transgénesis by intracytoplasmic
sperm injection" CA2340199 Perry Anthony and Yanagimachi
Ryuzo.
- "Production of transgenic avians using
sperm-mediated transfection" WO03024199 Rapp
Jeffrey and Sutrave Pramod.
- ``A method of transgenic embryo production
comprising the coinsertion of a nucleic acid and a
membrane-disrupted sperm head into the cytoplasm of
unfertilized methaphase II oocyte.Ryuzo Yanagimachi.
- "The introduction and expression of large
genomic sequences in transgenic animals" WO9423049. Gearhart John
D; Lamb Bruce T.
Algunas de estas patentes nombran la posible
utilización de la tecnología para hacer animales transgénicos con
construcciones de ADN de gran tamaño, sin embargo, en ninguna de las
patentes descritas se ha hecho este tipo de transgénicos ni con la
metodología descrita en estas patentes se puede hacer dicho tipo de
transgénicos.
La invención contribuye con un método para la
obtención de animales mamíferos no humanos transgénicos, para
construcciones con moléculas de ADN de gran tamaño (>170 kb),
preferentemente cromosomas artificiales de levadura y de mamífero.
Abreviadamente, esta invención consiste en generar embriones
transgénicos por co-microinyección en ovocitos no
fertilizados, de espermatozoides que han sido previamente unidos a
la molécula de ADN transgénica. En este método describimos por
primera vez la específica fragmentación tanto de la membrana como
del ADN del espermatozoide, mediante un proceso de
congelación-descongelación, para aumentar la
eficacia de integración del transgén. Una vez que los
espermatozoides han sido sometidos al tratamiento de rotura térmica,
se co-incuban a 4ºC con el cromosoma artificial, que
se diluye en un tampón específico [Schedl A., Larin Z., Montoliu L.,
Thies E., Kelsey G., Lehrach H., Schütz G. (1993) A method for the
generation of YAC transgenic mice by pronuclear microinjection.
Nucleic Acids Research 21: 4783-4787;
Montoliu L., Bock C.T., Schütz G. & Zentgraf H. (1995)
Visualization of large ADN molecules by electron microscopy with
polyamines: Application to the analysis of yeast endogenous and
artificial chromosomes. Journal of Molecular Biology 246:
486-492] que mantiene la integridad del ADN del
cromosoma artificial. El proceso de mezcla utiliza puntas de
plástico con el extremo cortado y es ejecutado a una velocidad de
succión y expulsión lentas para evitar la fragmentación de la
construcción. Después del periodo de co-incubación
(2 minutos) los espermatozoides son microinyectados en el
ovocito.
La microinyección se puede realizar mediante la
utilización de un micromanipulador mecánico convencional, o más
eficientemente, mediante la utilización del microinyector
piezo-eléctrico. La abertura de la pipeta utilizada
para la inyección intracitoplasmática de los espermatozoides debe
ser superior al diámetro de la cabeza del espermatozoide y dejar un
espacio entre la célula espermática y las paredes del capilar que
permita la circulación de las grandes moléculas de ADN, evitando
así, su rotura. En nuestra invención utilizamos pipetas de
microinyección con un diámetro interno de 7 \mum, un tamaño que es
unas 10 veces superior al de una pipeta de microinyección pronuclear
habitual, lo cual posibilita la microinyección de construcciones de
ADN de gran tamaño, sin su irreversible fragmentación.
La metodología de la invención es aplicable en
mamíferos no humanos, pero conceptualmente, a todas las especies
animales en las que la fertilización englobe espermatozoides y
ovocitos, no solo de vertebrados sino también de invertebrados.
Con la metodología aquí descrita, hemos
conseguido aumentar eficientemente la integración de transgénicos
producidos por inyección de espermatozoides, y hemos producido por
primera vez animales transgénicos, capaces de transmitir a la
descendencia un transgén (YAC) de 250 kb, produciendo un fenotipo
que demuestra su completa integración.
La invención se enfrenta con el problema de
proporcionar nuevos procedimientos de producción de animales
transgénicos mamíferos no humanos para secuencias de ADN exógeno o
transgenes de interés, preferentemente, de grandes dimensiones.
La solución proporcionada por esta invención se
basa en que los inventores han demostrado que este nuevo
procedimiento es capaz de producir animales transgénicos portadores
de un cromosoma artificial de levadura (YAC) con un tamaño de 250Kb,
integrado establemente en el ADN genómico, transmitido de forma
mendeliana a la descendencia y que produce un fenotipo (recuperación
de la pigmentación) indicativo de su presencia íntegra (ver Ejemplo
1), y en el caso de utilizar ADN exógeno de menor tamaño se ha
obtenido una mayor frecuencia de animales transgénicos que con
respecto a otras metodologías conocidas (ver Ejemplo 2). En
concreto, con este procedimiento se ha conseguido un elevado
porcentaje de animales transgénicos (\sim45%) utilizando
secuencias pequeñas de ADN (plásmidos de 5 kb) frecuencia que es muy
superior a la obtenida con otras metodologías; además, usando YACs
de 250 Kb hemos obtenido también una elevada frecuencia de animales
transgénicos (portadores de ADN del YAC) del \sim35%, y entre
ellos, detectado animales portadores de la molécula de ADN del YAC
integrada en su totalidad en el genoma del ratón hospedador con una
frecuencia de \sim8%.
Las principales diferencias y ventajas de
nuestra invención son:
1.- Utilización de un método nuevo de
congelación que probablemente produce microroturas en el ADN del
espermatozoide. Las muestras se guardan por primera vez a -80ºC y
por primera vez en medio M2, que no lleva crioprotectores, ni EDTA,
ni EGTA, ni elementos descondensantes, ni enzimas de restricción,
como es el caso de otros procedimientos (Perry AC, Wakayama T,
Kishikawa H, Kasai T, Okabe M, Toyoda Y, Yanagimachi R. 1999.
Mammalian transgenesis by intracytoplasmic sperm injection. Science
284(5417):1180-1183; Chan AW, Luetjens CM,
Dominko T, Ramalho-Santos J, Simerly CR, Hewitson
L, Schatten G. 2000. TransgenICSI reviewed: foreign DNA transmission
by intracytoplasmic sperm injection in rhesus monkey. Mol Reprod Dev
56(2 Suppl):325-328; Perry AC, Rothman A, de
las Heras JI, Feinstein P, Mombaerts P, Cooke HJ, Wakayama T. 2001.
Efficient metaphase II transgenesis with different transgene
archetypes. Nat Biotechnol 19(11):1071-1073;
Szczygiel MA, Moisyadi S, Ward WS. 2003. Expression of foreign DNA
is associated with paternal chromosome degradation in
intracytoplasmic sperm injection-mediated
transgenesis in the mouse. Biol Reprod
68(5):1903-1910; Niemann H, Rath D, Wrenzycki
C. 2003. Advances in biotechnology: new tools in future pig
production for agriculture and biomedicine. Reprod Domest Anim
38(2):82-89). Por primera vez, se demuestra
que la rotura no sólo de la membrana sino también la probable rotura
del ADN del espermatozoide incrementa la eficiencia de integración
del
transgén.
transgén.
2. Diferencias en tiempo de
co-incubación entre ADN y espermatozoides. En
nuestra invención se utilizan 2 min. en lugar de 30 min ó 1 min
indicadas en otros procedimientos.
3. Utilización de cromosomas artificiales de
levadura de gran tamaño (no de secuencias pequeñas, plásmidos, BAC)
para producir transgénicos en combinación con el punto 1 y 2. En
ninguna de los procedimientos conocidos se ha realizado ninguna
experiencia con cromosomas artificiales de levadura, La publicación
científica más parecida a esta invención (aunque no usan YACs y las
metodologías son distintas) es: Perry AC, Rothman A, de las Heras
JI, Feinstein P, Mombaerts P, Cooke HJ, Wakayama T. Efficient
metaphase II transgenesis with different transgene archetypes. Nat
Biotechnol. 2001 Nov;19(11): 1071-3.
4.- Nuevo tipo de pipetas de microinyección con
un diámetro específico que permite la introducción de moléculas de
ADN de gran tamaño sin que se rompan.
5.- Nuestra invención es el único sistema que
selecciona espermatozoides que han sufrido una mayor fragmentación
(cabezas sin cola post descongelación) para aumentar la eficiencia
de la transgénesis.
En resumen, el procedimiento descrito en esta
invención es el único que ha producido transgénicos con cromosomas
artificiales de levadura de >250 kb mediante inyección de
espermatozoides, y ha demostrado por primera vez que su integración
es completa, estable, transmisible, y produce el fenotipo
deseado.
Por consiguiente, un objeto de la presente
invención lo constituye un procedimiento para generar animales
transgénicos, vertebrados e invertebrados, preferentemente
vertebrados, y más preferentemente mamíferos no humanos, para
secuencias de ADN exógeno o transgenes de dimensiones variables, en
adelante procedimiento de transgénesis de la invención,
caracterizado porque se generan a partir de embriones transgénicos
por co-microinyección de espermatozoides o cabezas
de espermatozoides (en el caso de ratón) unidos a dicha secuencia de
ADN exógeno de interés en ovocitos no fertilizados y porque está
constituida por los siguientes pasos:
- (1)
- la fragmentación espermática por congelación-descongelación del ADN y de la membrana de los espermatozoides o cabezas y su mantenimiento a -80ºC y en medio isotónico tamponado sin crioprotectores ni estabilizadores,
- (2)
- la producción de construcciones de ADN utilizando como vectores para el transgén o secuencia de ADN exógeno de interés, preferentemente secuencias de gran tamaño presentes en bacteriófagos, cósmidos, cromosomas artificiales bacterianos (BAC) o cromosomas artificiales basados en el origen de replicación del bacteriofago P1 (PACs), y más preferentemente, cromosomas artificiales de levadura (YACs) o de mamíferos (MACs),
- (3)
- la mezcla y la incubación de las construcciones de ADN con los espermatozoides o cabezas descongeladas-fragmentadas durante 2-5 minutos, preferentemente 2 minutos,
- (4)
- la co-microinyección de las construcciones y los espermatozoides o cabezas descongeladas-fragmentadas en ovocitos preparados en metafase II no fertilizados, utilizando pipetas de microinyección con un diámetro específico que permite la introducción de moléculas de ADN de gran tamaño sin que se rompan, y, finalmente,
- (5)
- la transferencia de los embriones micromanipulados al oviducto/útero de una hembra receptora pseudopreñada, para poder continuar el desarrollo de la progenie transgénica.
Tal como se utiliza en la presente invención el
término "ADN exógeno o transgén de interés" se refiere a un
ADN normalmente no residente, ni presente en más de una copia en la
célula que se pretende transformar. El ADN exógeno podrá incluir,
pero no únicamente, ADN de mamíferos, plantas, bacterias, virus,
bacteriófagos, plásmidos, o construcciones sintéticas. El ADN puede
ser una molécula lineal o circular, con dos cadenas, y se podrá
insertar en el genoma de la célula hospedadora bien en sentido o en
contra sentido. Todo o parte del ADN exógeno o transgén se podrá
insertar en el genoma de la célula hospedadora. Además, tal como se
refiere el termino "ADN exógeno o transgén de interés" se
refiere a que dicha secuencia de ADN es capaz de expresar en el
animal transgénico una o más proteínas de interés que permite, por
ejemplo, la obtención de productos generados por estos animales de
interés comercial (hormonas, factores terapéuticos, etc), su uso
como modelo de estudio o diagnóstico de enfermedades animales y
humanas, o su uso en genómica funcional para contribuir a la
descripción eficaz de la función génica. (Bedell MA, Jenkins NA,
Copeland NG. Mouse models of human disease. Part I: techniques and
resources for genetic analysis in mice. Genes Dev. 1997 Jan
1;11(1):1-10. Bedell MA, Largaespada DA,
Jenkins NA, Copeland NG. Mouse models of human disease. Part II:
recent progress and future directions. Genes Dev. 1997 Jan
1;11(1):11-43. Shashikant CS, Ruddle FH.
2003. Impact of transgenic technologies on functional genomics. Curr
Issues Mol Biol 5(3):75-98. Pintado B,
Gutierrez-Adan A. 1999. Transgenesis in large
domestic species: future development for milk modification. Reprod
Nutr Dev
39(5-6):535-544.)
Tal como se utiliza en la presente invención el
término "ADN exógeno o transgén de interés de dimensiones
variables", se refiere a un ADN de cualquier tamaño, al menos,
superior a 5 kb, preferentemente a 170 kb, y más preferentemente
igual o superior a 250 kb.
El término "mamíferos no humanos" tal como
se utiliza en la presente invención se refiere, entre otros, a
mamíferos como los animales de laboratorio como ratones, ratas y
otros roedores, y a animales de producción ganadera como vacas,
ovejas, cabras, cerdos, conejos y caballos.
Un objeto particular de la presente invención lo
constituye el procedimiento de transgénesis de la invención
caracterizado porque la fragmentación espermática se realiza
mediante un proceso físico de
congelación-descongelación en medio isotónico
tamponado (preferentemente M2) en ausencia de crioprotectores y
criopreservantes (como EDTA o EGTA), que a pesar de ser muy
agresivo, mejora la integración del transgén (ver Ejemplo 2), y que
se realiza de la siguiente forma:
- a)
- el espermatozoide o cabeza que se pretende congelar se resuspende uniformemente en medio isotónico tamponado sin crio-protectores (preferentemente M2), hasta una concentración de 1 a 3x10^{6} células por mililitro,
- b)
- se hacen alícuotas de 50-100 pl de la suspensión en criótubos (NUNC, Cophenhagen) que son firmemente cerrados y colocados directamente en nitrógeno líquido (-196ºC), durante 10-15 minutos,
- c)
- las alícuotas se guardan a -80ºC (evitando su descongelación durante la transición de -196ºC a -80ºC), y se pueden utilizar durante 3-4 semanas sin que el desarrollo embrionario resulte significativamente afectado, y
- d)
- finalmente las muestras de espermatozoides o cabezas son descongeladas a temperatura ambiente durante 10 minutos, y deberán entonces, ser utilizados para microinyección intracitoplasmática en ovocitos no fertilizados durante las próximas dos horas, como adelante se describe [Moreira P.N., Jiménez A., Fernández R., Bury-Madrid N., De La Fuente J., Pintado B. y Gutiérrez-Adán A. (2003). Mouse ICSI with frozen-thawed sperm: The impact of sperm freezing procedure and sperm donor strain. Mol Reprod Dev 66 (1): 98-103].
Hay que resaltar que durante la colocación de
las células espermáticas en nitrógeno líquido (b) es muy importante
evitar la contaminación de la muestra con nitrógeno líquido, lo cual
podría comprometer el desarrollo embrionario, por lo que se debe
evitar la completa inmersión de los criótubos.
La metodología descrita puede ser aplicada a
cualquier muestra de espermatozoides o cabezas (frescos, congelados
o deshidratados, epidídimales o testiculares), que mantengan su
capacidad fertilizante y potencialidad para generar desarrollo
embrionario normal por microinyección en ovocitos no fertilizados en
metafase II. Los métodos de recogida de espermatozoides frescos
procedentes de congelación ó deshidratación, tanto en vertebrados
como en invertebrados, son conocidos por los expertos, y la
metodología de congelación-descongelación que aquíse
describe podría ser fácilmente adaptada/modificada dependiendo de la
especie o del tipo de esperma.
Los procedimientos de elaboración de
construcciones de ADN como vectores para la expresión de secuencias
de interés son ampliamente conocidos por los expertos del sector, y
pueden ser aplicables para la presente invención. A título
ilustrativo, el ADN del cromosoma artificial de levadura (YAC) se
obtiene usando métodos descritos anteriormente optimizados para su
microinyección en ovocitos de ratón para generar ratones
transgénicos (Schedl A., Grimes B. & Montoliu L. (1996)
YAC-transfer by microinjection. In: Methods in
Molecular Biology, volume 54, Yeast artificial chromosome protocols,
Ed: Markie D., chapter 25: 293-306. Humana Press,
Totowa (New Jersey); Lluís Montoliu. Large-scale
preparation of agarose plugs of yeast ADN (pag.
326-328). Purification of YAC ADN with filtration
units (pag. 329-331). Purification of YAC ADN with
filtration units (pag. 333). En: Manipulating the Mouse Embryo. A
Laboratory Manual (Third Edition) (2003). Andras Nagy, Marian
Gertsenstein, Kristina Vintersten, Richard Behringer (Eds.), Cold
Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York) ya
aplicados para la generación de ratones transgénicos mediante
microinyección pronuclear (Montoliu L., Umland T. & Schütz G.
(1996) A locus control region at -12 kb of the tyrosinase gene. The
EMBO Journal 15: 6026-6034).
Otro objeto particular de la presente invención
lo constituye el procedimiento de transgénesis de la invención en
el que el ADN exógeno o transgén de interés se encuentra
comprendido en un cromosoma artificial de levadura (YAC) que actúa
como vector.
Otro objeto particular de la presente invención
lo constituye el procedimiento de transgénesis de la invención en
el que el transgén de interés se encuentra comprendido en un
cromosoma artificial de mamífero (MAC) que actúa como vector, como
por ejemplo cromosomas artificiales humanos (Larin Z, Mejia JE.
Advances in human artificial chromosome technology. Trends Genet.
2002 Jun;18(6): 313-9. Cooke H. Mammalian
artificial chromosomes as vectors: progress and prospecta. Cloning
Stem Cells. 2001; 3(4):243-9. Hadlaczky G.
Satellite ADN-based artificial chromosomes for use
in gene therapy. Curr Opin Mol Ther. 2001 Apr;3(2):
125-32. Vos JM. Therapeutic mammalian artificial
episomal chromosomes. Curr Opin Mol Ther. 1999
Apr;1(2):204-15). Otro objeto particular de
la presente invención lo constituye el procedimiento de transgénesis
de la invención en el que el ADN exógeno o transgén de interés de
gran tamaño se encuentra comprendido en un plásmido, un
bacteriófago, un cósmido, un BAC, un PAC, un YAC, un MAC, u otro
elemento que actúa como vector.
La solución espermática,
descongelada-fragmentada y concentrada como se
describe anteriormente, se mezcla con el ADN exógeno comprendido en
los cromosomas artificiales de levadura, descrita también
anteriormente. En este proceso es importante reducir la posibilidad
de fragmentación de las construcciones así como mantener una
determinada concentración final de ADN (y macromoléculas asociadas)
presentes en la mezcla, para evitar situaciones de toxicidad para el
embrión. La concentración final de ADN puede oscilar entre 2 y 20
nanogramos por microlitro, preferentemente 10 nanogramos por
microlitro de solución ADN-espermatozoide. La
concentración de la solución madre de ADN que contiene el transgén,
se prepara de forma que se pueda diluir hasta la concentración de
ADN final deseada, con un volumen de solución espermática que
contenga un número de espermatozoides (o cabezas) suficientemente
elevado para no dificultar el proceso de microinyección. Para una
dilución 1:1 v:v (ADN:espermatozoides) la concentración mínima de
ADN debe encontrarse, idealmente, en tomo de los
10-20 ng/\mul en la solución madre.
Otro objeto particular de la presente invención
lo constituye el procedimiento de transgénesis de la invención
caracterizado porque la mezcla e incubación de espermatozoiodes y
ADN se ejecuta de la siguiente forma:
1.- se preparan las muestras de partida de tal
forma que la concentración final de ADN sea de 10 nanogramos por
microlitro de solución ADN-espermatozoide,
2.- se pipetean las muestra, en condiciones de
esterilidad, utilizando puntas de plástico con el extremo cortado y
una velocidad de succión y expulsión lenta y a baja temperatura
(4ºC), para reducir la posibilidad de fragmentación de las
construcciones, y
3.- la solución
ADN-espermatozoide se incuba en hielo durante 2
minutos, antes de diluir con 10% PVP en M2 (solución
ADN-esperma final) para su microinyección a
temperatura ambiente durante las próximas dos horas.
En la metodología de la invención, las
microinyecciones se ejecutan en ovocitos maduros en metafase II,
independientemente del tipo de maduración (in vivo o in
vitro) que hayan sufrido. Ovocitos inmaduros (i.e. estadio de
vesícula germinal), se pueden madurar in vitro hasta el
estadio de metafase II en medios promotores de maduración. La
metodología para maduración in vitro de ovocitos de las más
diversas especies esta descrita (i.e. para ovocitos de ratón se
puede encontrar en, Methods of Enzymology 225,77-84,
Academic Press, 1993) y está al alcance de cualquier experto en la
materia. Ovocitos madurados in vivo pueden ser obtenidos de
hembras superovuladas con inyecciones de gonadotropinas u otras
hormonas, o por procedimientos quirúrgicos poco después de la
ovulación. Los ovocitos recuperados quirúrgicamente de los
oviductos, se encuentran envueltos por una masa de células de
cúmulos, que se dispersa por incubación en un medio tamponado
conteniendo hialuronidasa testicular (i.e. en ratón, 300 IU/ml M2,
durante 3-5 minutos). Los ovocitos libres de células
de cúmulos, son posteriormente lavados en medio sin hialuronidasa y
colocados, hasta el momento de la microinyección en medio de cultivo
previamente equilibrado (i.e. KSOM + aminoácidos para ovocitos de
ratón a 5% CO_{2} y 37ºC).
Durante la fertilización de ovocitos en metafase
II por inyección intracitoplasmática de espermatozoides (ICSI), el
espermatozoide completo puede ser inyectado. Sin embargo, la
inyección de la cola del gameto masculino debe ser evitada si su
centrosoma no participa en el proceso de fertilización (i.e. en
ratón). Esto facilita el proceso de microinyección y disminuye el
volumen de fluido que se inyecta en el citoplasma del ovocito. La
microinyección podrá ser realizada por un experto en la materia de
forma convencional [i.e. metodología para hámster esta descrita en
Yanagida, K., Yanagimachi, R., Perrault, S. D. y R. G. Kleinfield,
Biology of Reproduction 44, 440-447 (1991); Perry
AC, Wakayama T, Kishikawa H, Kasai T, Okabe M, Toyoda Y, Yanagimachi
R.Mammalian transgenesis by intracytoplasmic sperm injection.
Science. 1999 May 14;284(5417):1180-3.], o
con ayuda de una unidad de microinyección
piezo-eléctrica (Piezo Impact Drive Unit de Prime
Tech Ltd.; Tsukuda, Ibaraki-Ken, Japón). Esta unidad
utiliza el efecto piezo-eléctrico para mover en
vaivén, de forma controlada, la pipeta de inyección, pequeñas
distancias (aproximadamente 0.5 micrómetros). La unidad permite la
regulación de la intensidad y la duración de cada pulso.
Para la inyección en el ovocito, de un núcleo de
espermatozoide mezclado con ADN exógeno, la cola del espermatozoide
(si tiene una) es aspirada primero en el capilar de inyección. Este
capilar deberá tener una punta (de sección recta siempre que se
utilice una unidad piezo-eléctrica) con un diámetro
interno entorno de los 6-10 \mum (dependiendo de
la especie) que permite la introducción de moléculas de ADN de gran
tamaño sin que se rompan. En algunas especies, como por ejemplo en
el ratón, la inyección de la cabeza del espermatozoide es suficiente
para un desarrollo embrionario normal y esto simplifica el proceso
de micromanipulación, por lo que se puede inyectar únicamente las
cabezas que se separan durante el proceso de
congelación-descongelación que son también las que
probablemente más han sufrido en el proceso de
congelación-fragmentación.
Otro objeto particular de la presente invención
lo constituye el procedimiento de transgénesis de la invención
caracterizado porque el proceso de co-microinyección
de las construcciones y espermatozoides o cabezas
descongeladas-fragmentadas en ovocitos preparados
se realiza, en el caso del ratón, seleccionando cabezas de
espermatozoides que han sufrido previamente la perdida de la cola en
el proceso de congelación-descongelación y porque el
capilar de microinyección presenta un diámetro interno comprendido
entre los 6 y 10 \mum, en función de la especie, y más
preferentemente de 7 \mum.
Durante la co-inyección
intracitoplasmática del complejo espermatozoide-ADN
exógeno, el ovocito es colocado, mediante presión negativa y con
ayuda de una pipeta de sujeción, con su placa metafásica distante
del punto de penetración. La zona pelúcida es perforada por la
aplicación de pulsos piezo eléctricos con una intensidad y velocidad
suficientes. Después de expulsar el pedazo de zona que se queda en
la punta de la pipeta de inyección, en la gota de micromanipulación
o en el espacio perivitelino del ovocito, la cabeza del
espermatozoide se aproxima a la abertura de la pipeta de inyección.
Se avanza la pipeta de inyección, hasta dos tercios del diámetro del
ovocito, y ahí, se aplica un único pulso de intensidad mínima para
que su membrana se abra. La relajación de la membrana del ovocito
indica su penetración. El complejo
espermatozoide-ADN exógeno es liberado con una
cantidad mínima de fluido (no más de unos 6 picolitros) en el
citoplasma del ovocito, transportando así el transgén de interés a
su interior. La pipeta de inyección es posteriormente extraída del
citoplasma del ovocito suavemente para evitar el riesgo de lisis
celular. La microinyección se ejecuta lo más rápido posible, en
grupos de 10-15 ovocitos, que después de
10-15 minutos de recuperación en la gota de
microinyección se colocan en condiciones de cultivo (i.e. medio KSOM
+ aminoácidos para ovocitos de ratón, equilibrado a 5% CO_{2} y
37ºC).
Es conocido que para que la activación del
ovocito ocurra después de la microinyección sin la ayuda de la
utilización de otras substancias químicas inductoras, es necesario
dañar de algún modo la membrana plasmática del espermatozoide de
forma que se permita liberar los componentes internos localizados
perinuclearmente (hasta hoy no totalmente caracterizados) al
citoplasma del ovocito. La acción de estos factores, ya detectables
en estadio de espermátida redonda, no es especifica de una especie
(i.e. factores de espermatozoide de porcino tienen la capacidad para
activar ovocitos de ratón), y la inyección de un solo
espermatozoide/cabeza es suficiente para la activación del ovocito
recipiente. En esta invención la fragmentación de la membrana de los
espermatozoides se consigue por
congelación-descongelación lo cual permite la
activación directa de los ovocitos microinyectados. En otras
especies se puede utilizar la micromanipulación para producir la
fragmentación de la membrana del espermatozoide, por ejemplo durante
su inmovilización por aplastamiento de su cola de encuentro al fondo
de la placa de microinyección. Lo mismo es posible, tratando el
espermatozoide con detergentes como el SDS, el Triton
X-100, sonicación, o
congelación-deshidratación. En algunas especies
(i.e. bovino), la metodología de ICSI que se emplea no es suficiente
para activar los ovocitos receptores. En estos casos, se recurre
normalmente a métodos de activación partenogenética, como la
electroactivación, inyección de substancias activantes (i.e.
adenofostina), o incubación de los ovocitos en medio conteniendo
substancias activantes como estimuladores de la liberación del
Ca^{2+} interno (cafeína, ionoforo A 23187, ionomicina y etanol),
moduladores de señalización fosfoproteica
(2-aminopurina, estaurospurina, esfingosina),
inhibidores de síntesis proteica (ciclohexamida,
6-dimetilaminopurina), o combinaciones de los
anteriores (ionomicina con
6-dimetilaminopurina).
Los embriones que se desarrollan in vitro
hasta el estadio de 2-8 células, mol o blastocisto,
son transferidos al oviducto o útero de una hembra pseudopreñada. En
ratón, entre 15-20 embriones son transferidos por
animal receptor.
Finalmente, otro objeto de la presente invención
lo constituye un animal transgénico, vertebrado e invertebrado,
preferentemente un animal vertebrado, y más preferentemente un
mamífero no humano, obtenido por el procedimiento transgénesis
de la presente invención. Tal como se refiere un mamífero no humano
es, preferentemente, un animal del siguiente grupo: animales de
laboratorio como ratones, ratas y otros roedores, y a animales de
producción ganadera como vacas, ovejas, cabras cerdos, conejos y
caballos.
Los ejemplos siguientes procuran ilustrar la
metodología de la invención limitar el alcance de la invención.
El esperma del epidídimo fue recogido y
resuspendido uniformemente en medio M2 (sin
crio-protectores o crio-preservantes
como el EDTA o EGTA). Las células espermáticas recogidas se lavaron
por centrifugación en un tubo de centrifuga propileno de 1.5 ml con
1 ml de medio fresco y resuspendieron para obtener concentración
final de 1-3 millones espermatozoides/ml.
Posteriormente, se hicieron (alícuotas de 100 microlitros de
suspensión espermática en tubos criogénicos (NUNC, Cophenhagen) que
fueron correctamente cerrados y directamente colocados nitrógeno
liquido (-196ºC), durante 10-15 minutos, sin
completa inmersión para evitar contaminaron de las muestras con
nitrógeno liquido. Las muestras fue posteriormente guardadas por
periodos de hasta 4 semanas a -80ºC (evitando descongelación durante
la transición de -196ºC a -80ºC). La esterilidad fue mantenida
durante todo el procedimiento.
Las muestras de espermatozoide son descongeladas
a temperatura ambiente durante 10 minutos previamente a su uso.
El ADN del cromosoma artificial de levadura
(YAC) se obtiene usando métodos descritos anteriormente optimizados
para su microinyección en ovocitos de ratón para generar ratones
transgénicos (Schedl A., Grimes B. & Montoliu L. (1996)
YAC-transfer by microinjection. In: Methods in
Molecular Biology, volume 54, Yeast artificial chromosome protocols,
Ed: Markie D., chapter 25: 293-306. Humana Press,
Totowa (New Jersey); Lluís Montoliu. Large-scale
preparation of agarose plugs of yeast ADN (pag.
326-328). Purification of YAC ADN with filtration
units (pag. 329-331). Purification of YAC ADN with
filtration units (pag. 333). En: Manipulating the Mouse Embryo. A
Laboratory Manual (Third Edition) (2003). Andras Nagy, Marian
Gertsenstein, Kristina Vintersten, Richard Behringer (Eds.), Cold
Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York) ya
aplicados para la generación de ratones transgénicos mediante
microinyección pronuclear (Montoliu L., Umland T. & Schütz G.
(1996) A locus control region at -12 kb of the tyrosinase gene. The
EMBO Journal 15: 6026-6034). En primer lugar, se
obtiene un cultivo saturante de células de levadura portadoras del
YAC de interés. Tras varias concentraciones y lavados se encapsulan
las células de levadura en una matriz de agarosa de bajo punto de
fusión en forma de pequeños dados. Estos dados de agarosa se exponen
a diferentes soluciones enzimáticas y tratamientos químicos por
detergentes que conducen a la lisis celular y el aislamiento de las
moléculas de ADN intactas (incluyendo las correspondientes a los
YACs). La separación de la molécula de ADN correspondiente al YAC
del resto de los 16 cromosomas de la célula de levadura se realiza
mediante electroforesis preparativa en campo pulsante. Finalmente se
obtiene la molécula del ADN correspondiente al YAC en solución tras
fundir, en condiciones controladas y en presencia de poliaminas y de
una determinada fuerza iónica del medio, la agarosa mediante
incubación a 50ºC y posterior digestión de la agarosa licuada
mediante agarosa. Para la concentración de las moléculas de ADN del
YAC se utilizan tubos de centrifuga acoplados a membranas de
diálisis con un tamaño de poro que permite el paso de todas aquellas
moléculas inferiores a 30.000 Daltons. Para la purificación de la
solución concentrada de ADN del YAC se realiza una diálisis final
durante 2-3 horas, a temperatura ambiente, sobre
filtros flotantes, con un tamaño de poro de 0.05 micrómetros, contra
el tampón de microinyección (10 mM Tris-HC1 pH=7.5,
0.1 mM EDTA, 100 mM NaCl, 30 micromolar Espermina, 70 micromolar
Espermidina). Se estima la cantidad de ADN del YAC obtenida mediante
cuantificación específica por fluorimetría y se verifica por
comparación de intensidades de fluorescencia en un gel de agarosa de
electroforesis horizontal frente a cantidades de ADN de YACs
conocidas. El método produce habitualmente soluciones de ADN de YAC
con una concentración de 5 a 20 nanogramos por microlitro que se
almacenan a 4ºC, sin congelarse nunca, y manipulándose siempre con
sumo cuidado y puntas de micropipeta con el extremo cortado, con
objeto de evitar la rotura de las moléculas de ADN del YAC.
De esta forma se elaboró el YAC utilizado,
denominado YRT2\DeltaLCR, que tiene un tamaño de 250 kb e incluye
el locus de la tirosinasa de ratón, gen que codifica para un enzima
fundamental en la síntesis de melanina. Este YAC es portador de una
deleción interna de una región reguladora del gen cuya ausencia
reduce drásticamente su expresión en la piel manteniéndose su
expresión en retina/ojo, de forma similar a lo observado en otros
YACs previamente descritos (Montoliu L., Umland T. & Schütz G.
(1996) A locus control region at -12 kb of the tyrosinase gene. The
EMBO Journal 15: 6026-6034; Gimenez E., Giraldo P.,
Jeffery G. & Montoliu L. (2001) Variegated expression and
delayed retinal pigmentation during development in transgenic mice
with a deletion in the locus control region of the tyrosinase gene.
Genesis 30(1): 21-25; Giraldo P. &
Montoliu L. (2002) Artificial chromosome transgenesis in pigmentary
research. Pigment Cell Research 15 (4):
258-264).
La solución espermática,
descongelada-fragmentada y concentrada como se
describe anteriormente, se mezcla con el ADN del cromosoma
artificial de levadura YRT2\DeltaLCR. El proceso de mezcla de la
solución espermática descongelada- fragmentada con el ADN de los
cromosomas artificiales de levadura se ejecuta pipeteando, en
condiciones de esterilidad, utilizando puntas de plástico con el
extremo cortado, a una velocidad de succión y expulsión lentas y a
baja temperatura (4ºC), para reducir la posibilidad de fragmentación
de las construcciones. También es importante la concentración final
de ADN (y macromoléculas asociadas) presentes en la mezcla, para
evitar situaciones de toxicidad para el embrión. La concentración
final de ADN no debe ser superior a 10 nanogramos por microlitro de
solución ADN-espermatozoide. La concentración de la
solución madre de ADN que contiene el transgén, se prepara de forma
que se pueda diluir hasta la concentración de ADN final deseada, con
un volumen de solución espermática que contenga un número de
espermatozoides (o cabezas) suficientemente elevado para no
dificultar el proceso de microinyección. Para una dilución 1:1 v:v
(ADN:espermatozoides) la concentración mínima de ADN debe
encontrarse, idealmente, en tomo de los 10-20
ng/\mui en la solución madre. La concentración de la solución
madre de ADN que contenía el transgén era de 7.5 nanogramos por
microlitro. La concentración final de ADN en este experimento fue de
3.75 nanogramos por microlitro (dilución 1:1 de
ADN:espermatozoides). La solución ADN-espermatozoide
se incuba en hielo durante 2 minutos, antes de diluirse con 10% PVP
en M2 para disminuir adhesividad en la pipeta de inyección. Esta
solución final de ADN-esperma deberá ser
microinyectada a temperatura ambiente durante las próximas dos
horas.
Durante la fertilización de ovocitos en metafase
II por inyección intracitoplasmática de espermatozoides (ICSI), el
espermatozoide completo puede ser inyectado. Sin embargo, la
inyección de la cola del gameto masculino debe ser evitada si su
centrosoma no participa en el proceso de fertilización (i.e. en
ratón). Esto facilita el proceso de microinyección y disminuye el
volumen de fluido que se inyecta en el citoplasma del ovocito. La
microinyección podrá ser realizada de forma convencional [i.e.
metodología para hámster esta descrita en Yanagida, K., Yanagimachi,
R., Perrault, S. D. y R. G. Kleinfield, Biology of Reproduction 44,
440-447 (1991); Perry AC, Wakayama T, Kishikawa H,
Kasai T, Okabe M, Toyoda Y, Yanagimachi R.Mammalian transgenesis by
intracytoplasmic sperm injection. Science. 1999 May
14;284(5417):1180-3.], o con ayuda de una
unidad de microinyección piezo-eléctrica (Piezo
Impact Drive Unit de Prime Tech Ltd.; Tsukuda,
Ibaraki-Ken, Japón). Esta unidad utiliza el efecto
piezo-eléctrico para mover en vaivén, de forma
controlada, la pipeta de inyección, pequeñas distancias
(aproximadamente 0.5 micrómetros). La unidad permite la regulación
de la intensidad y la duración de cada pulso.
Para la inyección en el ovocito, de un núcleo de
espermatozoide mezclado con ADN exógeno, la cola del espermatozoide
(si tiene una) es aspirada primero en el capilar de inyección. Este
capilar deberá tener una punta (de sección recta siempre que se
utilice una unidad piezo-eléctrica) con un diámetro
interno en tomo de los 6-10 \mum (dependiendo de
la especie). En algunas especies, como por ejemplo en el ratón, la
inyección de la cabeza del espermatozoide es suficiente para un
desarrollo embrionario normal y esto simplifica el proceso de
micromanipulación, por lo que se puede inyectar únicamente las
cabezas que se separan durante el proceso de
congelación-descongelación que son también las que
probablemente más han sufrido en proceso de
congelación-fragmentación.
Durante la co-inyección
intracitoplasmática del complejo espermatozoide-ADN
exógeno, el ovocito es colocado, mediante presión negativa y con
ayuda de una pipeta de sujeción, con su placa metafásica distante
del punto de penetración. La zona pelúcida es perforada por la
aplicación de pulsos piezo eléctricos con una intensidad y velocidad
suficientes. Después de expulsar el pedazo de zona que se queda en
la punta de la pipeta de inyección, en la gota de micromanipulación
o en el espacio perivitelino del ovocito, la cabeza del
espermatozoide se aproxima de la abertura de la pipeta de inyección.
Se avanza la pipeta de inyección, hasta dos tercios del diámetro del
ovocito, y ahí, se aplica un único pulso de intensidad mínima para
que su membrana se abra. La relajación de la membrana del ovocito
indica su penetración. El complejo
espermatozoide-ADN exógeno es liberado con una
cantidad mínima de fluido (no más de unos 6 picolitros) en el
citoplasma del ovocito, transportando así el transgén de interés a
su interior. La pipeta de inyección es posteriormente extraída del
citoplasma del ovocito suavemente para evitar el riesgo de lisis
celular. La microinyección se ejecuta lo más rápido posible, en
grupos de 10-15 ovocitos, que después de
10-15 minutos de recuperación en la gota de
microinyección se colocan en condiciones de cultivo (i.e. medio KSOM
+ aminoácidos para ovocitos de ratón, equilibrado a 5% CO_{2} y
37ºC).
Los embriones que se desarrollan in vitro
hasta el estadio de 2-8 células, morula o
blastocisto, son transferidos al oviducto o útero de una hembra
pseudopreñada. En ratón, entre 15-20 embriones son
transferidos por animal receptor.
Nota adicional: De los 12 animales transgénicos
vivos al menos 1 de ellos (8%) presenta la totalidad de secuencias
del YAC YRT2\DeltaLCR y manifiesta el fenotipo esperado (con
pigmentación en ojos y prácticamente ausente en la piel).
Se analizó el efecto de congelar el esperma en
presencia o ausencia de agentes quelantes, que estabilizan los
cromosomas del espermatozoide (EDTA), en la integración del
transgén. En este ejemplo se utilizó un plásmido portador del gen
GFP (plásmido de 5 kb aproximadamente) bajo la regulación del
promotor CMV que produce una proteína fluorescente fácilmente
detectable en un microscopio de fluorescencia. Utilizando un
protocolo de inyección intracitoplamática similar al indicado en le
Ejemplo 1, se analizó el número de blastocistos que expresaban el
transgén dependiendo del sistema de congelación utilizado. Se obtuvo
que cuando el espermatozoide se congelaba con agentes quelantes, el
porcentaje de blastocistos expresando el transgén (GFP) era
significativamente menor (20-30% de blastocistos
verdes de 40 blastocistos analizados) que cuando en el medio de
congelación no se utilizaban estos agentes (100% de blastocistos
verdes de 40 blastocistos analizados). Posteriormente, se utilizó
este protocolo de congelación-fragmentación para
producir ratones transgénicos y se obtuvieron un 45% de animales
transgénicos, frecuencia que es muy superior a la obtenida con otras
metodologías (Tabla 2) y en los cuales el transgén fue incorporado
íntegramente en todos los casos.
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(Tabla pasa a página
siguiente)
Como donantes de ovocitos y esperma se
utilizaron ratones CD-1 (hembras de
6-8 semanas de edad y machos de 3-8
meses). Las receptoras para los embriones inyectados fueran hembras
CD-1 previamente cruzadas con machos vasectomizados
de la misma estirpe para inducir pseudopreñez. Los animales fueron
alimentados ad libitum con dieta convencional y mantenidos en una
habitación con temperatura y luz controladas (23ºC, 14 horas de luz:
10 horas de oscuridad). Todos los experimentos con animales fueran
ejecutados de acuerdo con las direcciones establecidas en el Guía
para Cuidado y Uso de la Federation of European Laboratory Animal
Science Associations.
Ovocitos en metafase II (MII) fueran recorridos
14 horas después de la administración de gonadotropina coriónica
humana (GCH), a partir de hembras superovuladas con 5 UI de PMSG y
de una dosis equivalente, 48 horas después, de HCG. Las células del
cumulus fueran disgregadas por una incubación de 3-5
minutos en medio M2 conteniendo 350 UUml de Hialuronidasa.
Los ovocitos libres de células de cúmulos, son
posteriormente lavados en medio sin hialuronidasa y colocados,
hasta el momento de la microinyección en medio de cultivo
previamente equilibrado (i.e. KSOM + aminoácidos para ovocitos de
ratón a 5% CO_{2} y 37ºC).
La inyección pronuclear en ratón ha sido
realizada de forma convencional (Nagy A., Gertsenstein M,
Vintersten K, Behringer R. Manipulating the mouse embryo. A
laboratory manual (3rd edition), Cold Spring Harbor Laboratory
Press, Cold Spring Harbor, New York, 2003). La
"ICSI-Assisted YAC Integration" con
espermatozoides congelados-descongelados ha sido
realizada en medio M2, a temperatura ambiente, inmediatamente
después de la mezcla entre espermatozoide y ADN, durante un periodo
no superior a 120 minutos. Un volumen de solución
espermatozoide-YAC ha sido mezclada con 5 de medio
M2 conteniendo 10% polivinil-pirrolidona (PVP) para
disminuir la adhesividad. La placa de ICSI contenía un gota de
manipulación (medio M2), un gota espermatozoide-YAC
(solución espermatozoide-YAC en M2/10% PVP), y una
gota de M2/10% PVP para limpieza de la aguja de inyección. Las
inyecciones han sido realizadas con una unidad
piezo-eléctrica utilizando una pipeta, conteniendo
mercurio, de extremidad recta con un diámetro interno de
5-6 micrómetros. Cabezas individualizadas obtenidas
después de la congelación-descongelación eran
co-inyectadas con el ADN en los ovocitos. Los
ovocitos eran inyectados en grupos de 10. Después de 15 minutos de
recuperación a temperatura ambiente en medio M2, los ovocitos
supervivientes eran colocados en KSOM cubierto con aceite mineral y
cultivados a 37ºC en una atmósfera 5% CO_{2}. Para obtener
descendencia, los embriones inyectados pronuclearmente o
fertilizados por ICSI eran transferidos a oviductos de hembras
CD-1 pseudopreñadas recipientes.
Claims (13)
1. Procedimiento para generar animales
transgénicos, vertebrados e invertebrados, preferentemente
vertebrados, y más preferentemente mamíferos no humanos, para
secuencias de ADN exógeno o transgenes de dimensiones variables
caracterizado porque se generan a partir de embriones
transgénicos por co-microinyección de
espermatozoides o cabezas de espermatozoides unidos a dicha
secuencia de ADN exógeno de interés en ovocitos no fertilizados y
porque está constituida por los siguientes pasos:
- 1)
- la fragmentación espermática por congelación-descongelación del ADN y de la membrana de los espermatozoides o cabezas y su mantenimiento a -80ºC y en medio isotónico tamponado sin crioprotectores ni estabilizadores,
- 2)
- la producción de construcciones de ADN utilizando como vectores para el transgén o secuencia de ADN exógeno de interés, preferentemente, secuencias de gran tamaño presentes en bacteriofágos, cósmidos, cromosomas artificiales bacterianos (BAC) o cromosomas artificiales basados en el origen de replicación del bacteriofago P1 (PACs), y más preferentemente, cromosomas artificiales de levadura (YACs) o de mamíferos (MACs),
- 3)
- la mezcla y la incubación de las construcciones de ADN con los espermatozoides o cabezas descongeladas-fragmentadas durante 2-5 minutos, preferentemente 2 minutos,
- 4)
- la co-microinyección de las construcciones y los espermatozoides o cabezas descongeladas-fragmentadas en ovocitos preparados en metafase II no fertilizados, utilizando pipetas de microinyección con un diámetro específico que permite la introducción de moléculas de ADN de gran tamaño sin que se rompan, y, finalmente,
- 5)
- la transferencia de los embriones micromanipulados al oviducto/útero de una hembra receptora pseudopreñada, para poder continuar el desarrollo de la progenie transgénica.
2. Procedimiento según la reivindicación 1
caracterizado porque el ADN exógeno puede ser un ADN de
cualquier tamaño, al menos, superior a 5 kb, preferentemente
superior a 170 kb, y más preferentemente igual o superior a
\hbox{250 kb.}
3. Procedimiento según las reivindicaciones 1 y
2 caracterizada porque los mamíferos no humanos pertenecen,
entre otros, al siguiente grupo: animales de laboratorio como
ratones, ratas y otros roedores, y a animales de producción ganadera
como vacas, ovejas, cabras, cerdos, conejos y caballos.
4. Procedimiento de transgénesis según la
reivindicación 1 a la 3 caracterizado porque el transgén de
interés se encuentra comprendido en un cromosoma artificial de
levadura (YAC) que actúa como vector.
5. Procedimiento de transgénesis según la
reivindicación 1 a la 3 caracterizado porque el transgén de
interés se encuentra comprendido en un cromosoma artificial de
mamífero (MAC) que actúa como vector, preferentemente, cromosomas
artificiales humanos.
6. Procedimiento de transgénesis según la
reivindicación 1 a la 3 caracterizado porque el transgén de
interés de gran tamaño se encuentra comprendido en un plásmido, un
bacteriófago, un cósmido, un BAC, un PAC, un YAC, un MAC, u otro
elemento que actúa como vector.
7. Procedimiento según las reivindicaciones 1 a
la 6 caracterizado porque la fragmentación espermática (1)
se realiza mediante un proceso fisico de
congelación-descongelación en medio isotónico
tamponado en ausencia de crioprotectores y criopreservantes, por
ejemplo, EDTA o EGTA, y que se realiza de la siguiente forma:
- a)
- el espermatozoide o cabeza que se pretende congelar se resuspende uniformemente en medio isotónico tamponado sin crio-protectores, preferentemente M2, hasta una concentración, preferentemente, de 1 a 3x106 células por mililitro,
- b)
- se elaboran alícuotas de 50-100 \mul de la suspensión en criótubos que son firmemente cerrados y colocados directamente en nitrógeno líquido (-196ºC), durante 10-15 minutos,
- c)
- las alícuotas se guardan a -80ºC (evitando su descongelación durante la transición de -196ºC a -80ºC), y finalmente,
- d)
- las muestras de espermatozoides o cabezas son descongeladas a temperatura ambiente durante 10 minutos, y deberán entonces, ser utilizados para microinyección intracitoplasmática en ovocitos no fertilizados durante las próximas dos horas.
8. Procedimiento de transgénesis de la invención
según la reivindicación 1 a la 6 caracterizado porque la
mezcla e incubación de espermatozoiodes y ADN (3) se ejecuta de la
siguiente forma:
1.- se preparan las muestras de partida de tal
forma que la concentración final de ADN sea entre 2 y 20 nanogramos
por microlitro, preferentemente 10 nanogramos por microlitro de
solución ADN-espermatozoide,
2.- se pipetean las muestra, en condiciones de
esterilidad, utilizando puntas de plástico con el extremo cortado y
una velocidad de succión y expulsión lentas y a baja temperatura
(4ºC), para reducir la posibilidad de fragmentación de las
construcciones, y
3.- la solución
ADN-espermatozoide se incuba en hielo durante 2
minutos, antes de diluir con 10% PVP en M2 (solución
ADN-esperma final) para su microinyección a
temperatura ambiente durante las próximas dos horas.
9. Procedimiento de transgénesis según las
reivindicaciones 1 a la 8 caracterizado porque el proceso de
co-microinyección de las construcciones y
espermatozoides o cabezas descongeladas-fragmentadas
en ovocitos preparados (4) se realiza, en el caso del ratón,
seleccionando cabezas de espermatozoides que han sufrido previamente
la perdida de la cola en el proceso de
congelación-descongelación y porque el capilar de
microinyección presenta un diámetro interno comprendido entre los 6
y 10 \mum, en función de la especie, y más preferentemente de 7
\mum.
10. Un animal transgénico, vertebrado e
invertebrado, preferentemente un animal vertebrado, y más
preferentemente un mamífero no humano, obtenido por el
procedimiento de transgénesis según las reivindicaciones 1 a la
9.
11. Un animal transgénico según la
reivindicación 10 caracterizado porque es un mamífero no
humano, preferentemente, un animal del siguiente grupo: animales de
laboratorio como ratones, ratas y otros roedores, y a animales de
producción ganadera como vacas, ovejas, cabras, cerdos, conejos y
caballos.
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Effective date: 20100312 |