KR100429140B1

KR100429140B1 - 인간 조혈 모세포로부터 분화되는 림프구성 수상돌기 세포및 그의 생산 방법

Info

Publication number: KR100429140B1
Application number: KR10-2001-0016569A
Authority: KR
Inventors: 김현수; 김효철; 이경복
Original assignee: (주)라이프코드; 김현수
Priority date: 2001-03-29
Filing date: 2001-03-29
Publication date: 2004-04-29
Also published as: JP2004525634A; US7390658B2; WO2002078599A3; KR20020076593A; DE60209470D1; CN1543502A; EP1389234A4; EP1389234B1; DE60209470T2; AU2002243070A1; WO2002078599A2; JP4212360B2; CA2442300C; EP1389234A2; CN1277917C; CA2442300A1; US20040132185A1; HK1070389A1

Abstract

본 발명은 인간 조혈 모세포 (human hematopoietic stem cell)로부터 분화되는 CD8α⁺림프구성 수상돌기 세포 (lymphoid dendritic cell)에 관한 것으로, 보다 상세하게는 GM-CSF (granulocyte macrophage-colony stimulating factor) 및 IFN-γ (IFN-γ)를 순차적으로 처리하여 조혈 모세포를 배양함으로써 조혈 모세포로부터 림프구성 수상돌기 세포를 생산하는 방법, 상기 방법에 따라 인간 조혈 모세포로부터 분화된 림프구성 수상돌기 세포, 상기 수상돌기 세포를 유효성분으로 하는 면역 치료용 조성물에 관한 것이다.

Description

인간 조혈 모세포로부터 분화되는 림프구성 수상돌기 세포 및 그의 생산 방법{CD8α+ LYMPHOID DENDRITIC CELL DIFFERENTIATED FROM HUMAN HEMATOPOIETIC STEM CELL AND A METHOD FOR MASS-PRODUCING SAME}

본 발명은 인간 조혈 모세포로부터 분화되는 CD8α⁺림프구성 수상돌기 세포, 조혈 모세포로부터 림프구성 수상돌기 세포를 생산하는 방법 및 상기 수상돌기세포를 유효성분으로 하는 면역 치료용 조성물에 관한 것이다.

대식세포 (macrophage) 등의 면역 관련 세포는 생체 내에 침입한 항원을 탐식 (phagocytosis)하여 분해시키기도 하지만 부분적으로 분해되지 않은 항원을 다시 세포 표면의 조직 적합성 항원 (major histocompatibility complex)과 함께 나타내어 보조 T 세포 (T helper cell; Th 세포) 또는 세포 독성 T 림프구 (cytotoxic T lymphocyte; CTL)를 자극함으로써 보다 강력한 세포성 면역 반응 (cellular immune response)을 매개하기도 한다. 이러한 세포들을 항원 제시 세포(antigen presenting cell; APC)라 하는데, 대식세포, 활성화된 B-세포 및 수상돌기 세포 (dendritic cell)가 대표적이며, 이들 중 수상돌기 세포가 가장 강력한 항원 제시 세포로 알려져 있다 (Steinman R. M.,Annu. Rev. Immunol.9:271, 1991).

수상돌기 세포는 특수화된 항원 제시 세포로 항원 특이적인 면역 반응을 유도하거나 자가 면역 반응에 관계된 T-세포를 제거하여 자가 항원 (self antigen)에 대한 면역 관용 (immune tolerance)을 일으키는 기능을 갖는다. 이러한 상반된 수상돌기 세포의 기능은 각각 다르게 분화된 수상돌기 세포 하부 집단 (subset)의 존재에 기인하는 것으로 여겨지고 있다. 최근의 연구에 따르면, 쥐에는 해부학적 위치, 이식 실험 및 세포 표면 항원의 종류에 따라 골수성 (myeloid) 수상돌기 세포와 림프구성 (lymphoid) 수상돌기 세포의 최소한 2가지 종류의 수상돌기 세포가 존재한다.

CD11c⁺, MHC Ⅱ⁺, CD4⁺, CD8α^-의 표면 항원 특징을 갖는 수상돌기 세포는 골수성 전구세포 (myeloid precursor cell)로부터 효과적으로 분화 유도되는 골수성 수상돌기 세포이고, 반대로 CD11c⁺, MHC Ⅱ⁺, CD4^-, CD8α⁺의 표면 항원의 특징을 갖는 수상돌기 세포는 림프구성 수상돌기 세포로 불리는데, 흉선 (thymus) 또는 지라 (spleen)에 소량으로 존재한다. 현재까지는 골수성 수상돌기 세포는 직접적인 면역 반응에 관계하며 림프구성 수상돌기 세포는 자가 반응 (self-reactive) 림프구를 제거하는 기능을 갖고 있을 것이라고 생각하여 왔다.

그러나, 이러한 추측과는 달리 항원을 감작 (pulse) 시킨 CD8α⁺수상돌기 세포를 실험 동물 발바닥에 주사하면 림프절로의 이동이 없이도 직접 면역 반응을 유발하는 것이 확인되었다 (Adrianet al., Brief Definitive Report189(3):593-598, 1999.).

일반적으로 IL-12에 반응하여 IFN-γ를 만드는 세포로는 자연 살상 세포 (NK-cell)와 T-세포가 알려져 있으며, 골수성 수상돌기 세포에서 IFN-γ를 생성한다는 보고는 없었다. 그러나 최근의 일부 연구는 쥐의 CD8α⁺림프구성 수상돌기 세포로부터 IL-12에 의존하여 IFN-γ가 생성된다는 보고가 있었으며 (Toshiakiet al., Brief Definitive Report. 189(12):1981-1986, 1999), 쥐를 대상으로 한 동물 실험에서 랑게르한스 세포 (Langerhans cell)와 같은 골수성 수상돌기 세포를 CD8α^-마우스에 주사하였을 때 림프절 (lymph node)로 이동하여 CD8α⁺수상돌기 세포로 분화되고, 분화된 세포가 IFN-γ를 생산한다는 사실이 보고된 바 있다 (Miriamet al., Blood96(5):1865-1872, 2000). 이런 형태의 수상돌기 세포는 림프구성 수상돌기 세포로서, 과거 면역 관용 (tolerance)에 관계할 것이라는 생각과는 달리 세균을 포함한 항원에 대한 직접적인 면역 반응에 관여할 가능성이 높다는 것이 밝혀졌다.

또한, 쥐의 비장에서 IL-12에 의존하여 IFN-γ를 직접 생산하는 CD8α⁺수상돌기 세포가 발견되었으며 (Toshiakiet al., Brief Definitive Report189(12):1981-1986, 1999), 쥐의 비장에 존재하는 수상돌기 세포가 IL-12에 의존적으로 IFN-γ를 생산하고, IL-4 및 IL-18의 상승효과를 보이는 CD8α⁺라는 것이 확인된 바 있다 (Taroet al., The Journal of Immunology164:64-71, 2000).

한편, 가장 최근 동물 실험은 골수성 전구 세포 (myeloid progenitor cell)의 이식 실험을 통하여 골수 전구 세포로부터 CD8α⁺수상돌기 세포가 만들어짐을 보여주고 있는데 (Davidet al., Science290:2152-4, 2000), 이러한 사실은 CD8α이 림프구계열 (lymphoid lineage)의 표지자가 아니거나 혹은 골수구계에서 림프구계 세포가 분화될 수 있음을 보여주는 것이다.

이와 같이 자연계에서 CD8α⁺수상돌기 세포가 단순히 면역관용(immune tolerance) 현상의 주된 항원 제시 세포인 것은 아니며, 오히려 항원에 대한 직접적인 면역반응을 유발할 수 있을 뿐만 아니라 IFN-γ의 직접 생산을 통해 더욱 강력한 면역 반응을 일으킬 수 있음이 확인되었다.

수상돌기 세포는 자극에 의해 활성화되어 IL-12를 만들며 이는 T-세포를 자극하여 IFN-γ를 생산함으로써 보조 T 세포 타입 I (T helper cell type I) 반응을 유도하게 된다. 그러나, 자연상태에서 수상돌기 세포는 매우 적어 이를 면역 치료에 이용하기 위해서는 혈액내 단핵구 (monocyte)나 조혈 모세포로부터 분화시켜 대량 증식시키는 과정이 필요하다. 이때 사용되는 사이토카인들로는 GM-CSF, IL-4등이 주된 것이며, 이외에도 종양 괴사 인자 (tumor necrosis factor; TNF-α) 또는 간(幹)세포 인자 (stem cell factor; SCF)가 추가적으로 사용되기도 한다. 일반적으로 GM-CSF를 이용하여 만들어진 수상돌기 세포의 면역 표현형은 CD1a, CD4, CD11c, CD40, CD54, CD80, CD83, CD86, HLA class I, HLA class Ⅱ가 양성이며 CD3, CD8, CD14에 대해서는 음성을 나타내는 골수성 수상돌기 세포이다 (Williamset al., Int. Rev. Cytol.153:412, 1994; Santiago-Schwarzet al., Nature360:258, 1993; Rosenzwajget al., Blood87:535, 1996).

그러나, 공지의 NK 세포 또는 T 세포보다 IFN-γ와 같은 사이토카인을 월등히 많이 만들며 강력한 세포성 면역 반응을 촉진하는 CD8α⁺림프구성 수상돌기 세포는 쥐의 흉선 또는 지라에서 분리되거나 또는 골수성 수상돌기 세포로부터 분화시킨 이외에는, 인간에 있어 아직 그 존재조차 확인되지 않은 것은 물론 조혈모세포로부터의 분화에 대해서도 연구된 바가 없다.

이에 본 발명자들은 인간 조혈모세포로부터 CD8α⁺의 림프구성 수상돌기 세포를 분화시키기 위해 예의 연구한 결과, GM-CSF와 IFN-γ를 순차적으로 배지에 첨가하여 배양하면 CD1a^-, CD3^-, CD4^-, CD8α⁺, CD11c⁺, CD14^-, CD40⁺, CD54⁺, CD80⁺, CD83⁺, CD86⁺, HLA class I⁺, HLA class Ⅱ⁺의 면역 표현형을 갖는 림프구성 수상돌기 세포로 분화되는 것을 확인하였으며, 분화된 림프구성 수상돌기 세포가 항원에 대한 효과적인 탐식 활성을 갖고, 동종 T 세포의 증식을 자극하는 능력을 가지며 최종 성숙시켰을 때 IL-12와 IFN-γ를 동시에 대량 생산함을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.

따라서 본 발명의 목적은 인간 조혈모세포로부터 분화된 CD8α⁺의 림프구성 수상돌기 세포를 제공하는 것이다.

또한, 본 발명의 목적은 조혈모세포로부터 CD8α⁺의 림프구성 수상돌기 세포를 분화시키는 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 방법에 의해 조혈모세포로부터 분화된 CD8α⁺의 림프구성 수상돌기 세포를 이용하여 사이토카인을 대량생산하는 방법을 제공하는 것이다.

아울러 본 발명은 상기 조혈모세포로부터 분화된 CD8α⁺의 림프구성 수상돌기 세포 또는 이들이 생산하는 사이토카인을 유효성분으로 하는 면역 치료용 조성물을 제공하는 것을 목적으로 한다.

도 1은 인간 조혈 모세포를 2주간 배양하되, 처음 1주간은 GM-CSF (50ng/ml)만을, 나머지 1주간은 IFN-γ (200U/ml)를 3일에 한번씩 처리하고 13일째 1 μg/ml의 이오노마이신 (ionomycin)을 처리하여 분화시킨 림프구성 수상돌기 세포를 주사 전사현미경 (A) 및 투과 전자현미경 (B)으로 관찰한 사진이고,

도 2는 인간 조혈 모세포를 처음 1주간은 GM-CSF (50ng/ml)만을, 나머지 1주간은 IFN-γ (200U/ml)를 3일에 한번씩 처리하고 13일째 1 μg/ml의 이오노마이신 (ionomycin)을 처리하여 총 2주간 배양하면서 헤모사이토미터 (hemocytometer)를 이용하여 광학현미경으로 배양시간에 따른 세포수 변화를 나타낸 그래프이고,

도 3은 인간 조혈 모세포를 처음 1주간은 GM-CSF (50ng/ml)만을, 나머지 1주간은 IFN-γ (200U/ml)를 3일에 한번씩 처리하고 13일째 1 μg/ml의 이오노마이신 (ionomycin)을 처리하여 2주간 배양한 다음, CD1a, CD3, CD4, CD8α, CD11c, CD14, CD40, CD54, CD80, CD83, CD86, HLA (human leukocyte antigen) classⅠ (ABC), HLA class Ⅱ (DR)의 세포 표면 항원에 대한 항체들을 이용하여, 분화된 수상돌기세포의 면역 표현형을 조사한 히스토그램 (histogram)이고,

A : GM-CSF로 1주간 배양한 후의 결과

B : GM-CSF로 1주간, 이후 IFN-γ로 1주간 배양한 후의 결과

x 축 : 세포 개체의 빈도

y 축 : 형광의 강도 (이하 동일)

초록색 실선 (open histogram) : 음성 대조군

파란색 도형 (filled histogram) : 세포 표면 항원에 대한 양성 세포군

도 4는 인간 조혈 모세포를 처음 일주일간은 GM-CSF (50ng/ml)만을, 나머지 일주일은 IFN-γ (200U/ml)를 3일에 한번씩 처리하고 13일째 1 μg/ml의 이오노마이신 (ionomycin)을 처리하여 2주간 배양한 다음, 각각 CD3과 CD4만을 염색하거나 (A) 또는 CD3과 CD8a만을 염색하여 (B) 분화된 수상돌기 세포의 면역 표현형을 조사한 히스토그램 (histogram)이고,

도 5는 인간 조혈 모세포로부터 분화된 수상돌기 세포의 항원 탐식 능력을 조사하기 위하여 FITC로 표지된 덱스트란 (dextran-FITC)를 혼합 배양하여 세포내로 탐식 (phagocytosis)된 덱스트란의 양을 유세포 분석기로 측정한 결과를 보여주는 히스토그램이고,

파란색 도형 : 음성 대조군

초록색 실선 : 덱스트란-FITC를 탐식한 세포군

도 6은 인간 조혈 모세포로부터 분화된 수상돌기 세포가 동종 T-세포 증식을 자극할 수 있는지 확인하기 위해, 상기 수상돌기 세포를 감마선으로 조사하여 효과세포 (effector cell)로 사용하고, 정상인의 혈액에서 분리된 T-세포를 반응 세포 (responder cell)로 사용하여 혼합 림프구 반응 (mixed lymphocyte reaction)을 수행한 결과를 보여주는 그래프이고,

◆ : GM-CSF로 1주간 처리한 세포군

■ : GM-CSF로 1주간, 이후 IFN-γ로 1주간 처리한 세포군

도 7은 인간 조혈 모세포로부터 분화된 수상돌기 세포가 사이토카인을 분비하는지 확인하기 위하여, 인터루킨-12 (interleukin-12; IL-12) 및 IFN-γ에 대한 항체를 이용한 ELISA (enzyme-linked immunosorbent assay) 결과를 보여주는 그래프이다.

A : 1주간 GM-CSF로 배양한 후 생산된 단백질의 양

B : 1주간 GM-CSF로, 이후 1주간 IFN-γ로 배양한 후 생산된 단백질의 양

C : 1주간 GM-CSF로, 이후 1주간 IFN-γ로 배양하고, 마지막으로 하루 동안 이오노마이신으로 성숙시킨 후 생산된 단백질의 양

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 조혈 모세포 (hematopoietic stem cell)로부터 분화되며 CD8α⁺의 면역 표현형을 갖는 림프구성 수상돌기 세포를 제공한다.

또한, 본 발명은 GM-CSF 및 IFN-γ를 순차적으로 첨가하여 배양함으로써 조혈 모세포로부터 림프구성 수상돌기 세포를 생산하는 방법을 제공한다.

또한, 본 발명은 조혈모세포로부터 분화된 상기 CD8α⁺림프구성 수상돌기 세포를 유효성분으로 하는 면역 치료용 조성물을 제공한다.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명의 CD8α⁺림프구성 수상돌기 세포는 바람직하게는 완전히 성숙되었을 때 CD1a^-, CD3^-, CD4^-, CD8α⁺, CD11c⁺, CD14^-, CD40⁺, CD54⁺, CD80⁺, CD83⁺, CD86⁺, HLA-I⁺, HLA-Ⅱ⁺의 면역 표현형을 갖는 것을 특징으로 한다.

상기에서 본 발명의 CD8α⁺림프구성 수상돌기 세포는 조혈 모세포, 보다 바람직하게는 인간 조혈 모세포로부터 증식 분화될 수 있는데, 특히 GM-CSF (granulocyte macrophage-colony stimulating factor)와 인터페론-γ(IFN-γ)를 순차적으로 첨가하여 배양함으로써 효과적으로 증식 분화시킬 수 있다.

보다 상세하게는, GM-CSF를 첨가한 배지에서 약 6 내지 8일간 조혈 모세포를 배양한 후, 다시 IFN-γ를 첨가한 배지에서 약 6 내지 8일간 추가 배양함으로써 성숙된 CD8α⁺림프구성 수상돌기 세포를 대량으로 생산할 수 있다.

상기에서, GM-CSF 및 IFN-γ는 2∼4일, 바람직하게는 3일에 한 번씩 배지에 첨가하되, GM-CSF는 20∼200 ng/ml, 바람직하게는 약 50 ng/ml을 첨가하고, IFN-γ는 50~500 U/ml, 바람직하게는 약 200 U/ml의 양으로 첨가하는 것이 바람직하다.

특히, 상기와 같이 GM-CSF와 IFN-γ를 순차적으로 첨가하여 배양한 후 최종적으로 이오노마이신 (ionomycin)을 추가로 첨가하여 약 1일간 배양함으로써 분화된 수상돌기 세포를 완전하게 성숙시킬 수 있으며, IFN-γ의 생산도 증가시킬 수 있다. 이 때, 이오노마이신은 약 0.1∼10 μg/ml, 바람직하게는 약 1 μg/ml의 농도로 첨가하는 것이 좋다.

본 발명의 CD8α⁺림프구성 수상돌기 세포는 뛰어난 인터루킨-12 및 IFN-γ의 생산 능력을 나타내고 동종 T 세포의 증식을 자극하는 활성을 보이므로, 보조 T 세포의 활성화 및 CTL 활성화를 통한 강력한 세포성 면역 반응을 유도할 수 있다.본 발명의 CD8α⁺림프구성 수상돌기 세포가 갖는 이러한 활성으로 인해 본 발명의 CD8α⁺림프구성 수상돌기 세포 또는 상기 세포가 생산하는 IL-12 및 IFN-γ와 같은 사이토카인을 직접 생체내로 주사함으로써 면역 증강 효과를 나타낼 수 있으며, 이러한 면역 치료용 조성물 또한 본 발명의 범위에 속한다.

상기 CD8α⁺림프구성 수상돌기 세포 또는 이들 세포가 생산하는 사이토카인을 유효성분으로 하는 면역 치료용 조성물은 수상돌기 세포를 이용한 면역 치료법 등 공지의 방법에 따라 환자의 생체 내로 주입될 수 있는데, 바람직하게는 피하 또는 정맥 주사 등의 방법으로 적용될 수 있다. 또한, 종양 주위 또는 종양내로 직접 주사하는 방법도 시도될 수 있다.

이러한 세포 치료법은 환자의 자가 세포를 추출하고 대량 배양하여 강력한 면역 증강 효과가 있는 수상돌기 세포로 만든 후 이 세포가 항원을 탐식 할 수 있는 기회를 준다. 상기 과정에서 수상돌기 세포의 면역 증강력을 높이기 위해 방사선 조사 또는 자외선 조사로 약화시킨 암세포를 직접 수상돌기 세포와 함께 배양시키거나, 항암제와 같은 세포 독성 물질이나 반복적인 냉동-해동 과정을 통해 암세포를 사멸시킨 후 이 분해물 (lysate)을 수상돌기 세포에 처리하여 감작 (pulse)시킬 수도 있다. 그 외의 방법으로 암세포의 DNA, RNA, 단백질 또는 펩타이드를 수상돌기 세포의 감작을 위한 항원으로 사용 할 수 있다. 이와 같이 항원으로 감작된 수상돌기 세포는 이를 환자에게 직접 주사하거나, 또는 상기 수상돌기 세포를 환자의 혈액에서 추출한 T 세포와 반응시켜 직접 암 살해 세포를 만든 다음 활성화된 T 세포를 환자에게 주사할 수도 있다. 이 때, 항원으로 감작된 수상돌기 세포나 T 세포를 주사한 후 그 활성화 효과가 지속적으로 강력하게 나타나도록 IL-2를 저용량으로 함께 주사하는 것이 바람직하다.

특히, 환자 자신의 조혈 모세포를 분리하여 이로부터 강력한 면역 반응 유발능을 갖는 CD8α+ 림프구성 수상돌기 세포를 대량 증식 분화시킨 후, 이를 다시 환자의 체내로 주입하여 면역 반응을 일으키는 경우, 면역 거부 반응 등의 문제점을 해결할 수 있다. 또한, 반복적인 주사를 요하는 사이토카인에 의한 치료와는 달리 세포 자체를 주입하여 계속적으로 사이토카인을 생산할 수 있다는 장점을 갖는다. 나아가 상기 조혈 모세포로부터 분화시킨 림프구성 수상돌기 세포를 공지의 유전 공학적 방법을 통해 면역 거부 반응을 최소화하거나 성장 인자 유전자를 도입하여 과발현시키는 등의 조작을 수행할 수도 있다.

상기 면역 치료용 조성물은 T 세포 증식 유도 활성으로 인해 일반적인 면역 증강 효과는 물론 특정 항원으로 인한 질병에 대하여 강력한 세포성 면역 반응을 유도할 수 있으며, IFN-γ를 대량생산하므로 항암 및 항 바이러스 치료에도 효과적으로 적용될 수 있다. 본 발명의 CD8α⁺림프구성 수상돌기 세포를 면역 치료에 이용하는 경우, 상기 수상돌기 세포의 1회 투여량은 1×10⁷∼ 1×10⁹세포수인 것이 바람직하며, 치료하고자 하는 질환, 질환의 중증도, 투여 경로, 환자의 체중, 연령 및 성별 등의 여러 관련 인자를 고려하여 증감이 가능하다.

본 발명의 CD8α⁺림프구성 수상돌기 세포는 인간에서는 그 존재 및 분화 가능성이 본 발명자들에 의해 최초로 확인된 것으로서, 특히 조혈 모세포로부터 분화시키는 방법에 대해서는 동물 실험을 통해서도 확인된 바 없는 것이다.

따라서, 본 발명의 CD8α⁺림프구성 수상돌기 세포는 본 발명의 방법에 따라 조혈 모세포로부터 분화시켜 얻을 수도 있지만, 골수성 전구세포 (myeloid progenitor cell)로부터도 동일한 방법에 의해 증식 분화시킬 수 있을 것으로 기대된다.

본 발명의 바람직한 일 실시예에서는, 암환자들에게 매일 일정량의 G-CSF 를 피하 주사한 다음, 4일째에 환자의 말초 조혈 모세포 (peripheral blood stem cell, PBSC)를 단핵구 분반술 (leukapheresis)을 통해 단핵세포들만을 모으고, 고 구배 면역 자장 분리법으로 조혈 모세포에 특이적인 표면 항원인 CD34 양성 세포만을 분리하여 조혈 모세포를 얻었다. 분리된 조혈 모세포를 완전 배지에서 배양하면서 처음 1주간은 GM-CSF만을 처리하였고, 나머지 1주간은 IFN-γ를 처리하되, 각 사이토카인 처리는 3일에 한번씩 수행하였다. 마지막으로 13일째에는 칼슘 이온 투과 담체 (Ca²⁺ionophore)인 이오노마이신 (ionomycin, Sigma)을 처리하여 하루 더 배양함으로써 분화 증식된 세포를 완전히 성숙시켜 수상돌기 세포로 분화시켰다.

상기와 같이 분화된 세포는 현미경적 관찰 결과, 핵이 한쪽으로 치우쳐 있고풍부한 세포질과 세포질 내에 많은 과립을 갖고 있으며 세포 표면에 많은 돌기들이 존재하는 것으로 확인되어, 상기 분화된 세포가 수상돌기 세포의 전형적인 세포 형태를 나타냄을 알 수 있었다. 또한, 세포수는 GM-CSF 처리 1주간 서서히 증가하다가 2주째 IFN-γ를 투여한 후에는 급격하게 증가하는 양상을 나타냈으며, 배양 시작 후 14일 후에는 배양 초기에 비해 평균 30배 이상의 세포수 증가를 보였다.

본 발명의 또다른 실시예에서는 세포 표면 항원인 CD1a, CD3, CD4, CD8α, CD11c, CD14, CD40, CD54, CD80, CD83, CD86, HLA classⅠ 및 HLA claass Ⅱ에 대한 항체를 FITC 또는 PE로 표지하여 면역염색분석을 수행하였는데, 증식된 세포는 성숙된 수상돌기 세포의 특징적인 표지자인 CD11c 및 CD83에 대해 양성을 나타내어 형태학적 특징 외에도 면역 표현형에 있어서도 수상돌기 세포임을 확인할 수 있었다.

또한, 범 T-세포 표지자인 CD3에 대해서는 음성이고 골수성 수상돌기 세포에서 흔히 나타나는 CD4는 음성이지만 CD8α은 양성 반응을 보여, 본 발명의 분화된 수상돌기 세포가 CD8α⁺의 림프구성 수상돌기 세포임을 알 수 있었다.

면역염색분석법에 의한 면역 표현형의 조사 결과, 본 발명에 의해 인간 조혈모세포로부터 증식 분화된 수상돌기 세포의 면역 표현형은 CD1a^-, CD3^-, CD4^-, CD8α⁺, CD11c⁺, CD14^-, CD40⁺, CD54⁺, CD80⁺, CD83⁺, CD86⁺, HLA-I⁺, HLA-Ⅱ⁺의 특징을 갖는 것으로 나타났다.

한편, 본 발명의 또다른 실시예에서는 분화된 림프구성 수상돌기 세포의 항원 탐식 능력을 조사하였는데, 덱스트란-FITC를 첨가하여 37°C에서 1시간 동안 배양한 후 유세포 분석기로 조사한 결과, 본 발명의 CD8α⁺림프구성 수상돌기 세포는 활발한 탐식작용을 나타내었고, 이러한 현상은 4℃에서 억제되었다. 또한, IFN-γ를 처리한 2주째의 세포들이 더 증가된 탐식능을 나타내었다

한편, 본 발명의 또다른 실시예에서는 본 발명의 림프구성 수상돌기 세포가 림프구의 증식을 자극할 수 있는지 알아보기 위해 혼합 림프구 반응 (Mixed Leukocyte Reaction; MLR)을 수행하였는데, 감마선으로 조사한 수상돌기 세포를 효과세포로, 정상인에서 분리한 T 세포를 반응세포로 사용하여 다양한 비율로 혼합한 뒤 T 세포의 증식 정도를 BrdU를 이용한 ELISA로 분석하였다. BrdU는 T 세포의 증식과정에서 DNA 복제시에 dTTP (deoxy thymidine triphosphate) 대신 염색체 내로 도입되므로 그 도입 정도는 T 세포의 증식 정도를 반영하게 된다.

상기와 같은 MLR 실험 결과, 효과세포: 반응세포의 비율이 1:10⁴에서부터 급격한 T 세포의 증식을 보이기 시작하였으며, INF-γ를 처리한 후에도 동종 T 세포에 대한 증식 유도 효과는 비슷한 것으로 나타났는데, 이러한 결과는 본 발명의 림프구성 수상돌기 세포가 동종 T 림프구의 증식을 자극하는 기능을 갖고 있으며, 이를 통해 생체 내에서 강력한 면역 반응을 유도할 수 있음을 보여주는 것이다.

또다른 본 발명의 실시예에서는, 본 발명의 수상돌기 세포 배양액을 수거하여 사이토카인 생산 능력을 측정하였는데, 1주째 IFN-γ를 투여하기 직전까지는 IL-12 및 IFN-γ 두 가지 모두 낮은 생산을 보였고, 2주째에도 이오노마이신으로최종 성숙시키기 전까지는 낮은 수준을 유지하였지만, 이오노마이신을 첨가한 후에는 IL-12 및 IFN-γ생산량 모두 급격한 증가를 나타내었다. 따라서 상기 결과로부터 본 발명의 CD8α⁺림프구성 수상돌기 세포를 IL-2 또는 IFN-γ와 같은 사이토카인의 대량 생산에 사용하고자 하는 경우에는 분화 단계에서 최종적으로 이오노마이신과 같은 면역 증강제를 처리하여 수상돌기 세포를 완전히 성숙시키는 것이 바람직함을 알 수 있다. 상기와 같이 수상돌기 세포를 완전히 성숙시키기 위해 이오노마이신 외에도 리포폴리사카라이드 (lipopolysaccharide; LPS) 또는 KLH (keyhole limpet hemocyanin) 등이 사용될 수 있다.

이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다.

단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.

<실시예 1> 조혈 모세포 추출 및 수상돌기 세포 생성

유방암, 백혈병 및 림프종 환자 10명의 말초 조혈 모세포 (peripheral blood stem cell, PBSC)를 단핵구 분반술 (leukapheresis)로 모았다. 먼저, 환자들에게 매일 300μg의 G-CSF (granulocyte-colony stimulating factor)를 피하 주사한 다음, 4일째에 Cobe Spectra (Cobe BCT, Inc., CO)를 이용한 대용량 혈구 분반을 통해 말초 조혈 모세포를 추출하였다. 피콜-하이파크(Ficoll-Hypaque; Histopaque,Sigma, USA)를 이용한 밀도 구배 원심분리법 (density gradient centrifugation)에 의하여 상기에서 얻은 조혈 모세포로부터 단핵세포 (mononuclear cell)를 분리한 다음, 5% 우 혈청 알부민 (bovine serum albumin; BSA)을 포함하는 인산 완충 식염수 (phosphate-buffered saline; PBS)로 한 번 세척하고 30μm 메쉬 (mesh)의 거름망으로 걸렀다. 단핵세포들을 모아 4°C에서 30분간 CD34 단일 클론 항체 (QBend-10 mouse IgG1, Miltenyi reagent A2)와 반응시키고 PBS로 한 번 세척한 다음, 고 구배 면역 자장 분리법 (high gradient immunomagnetic separation, HGIS; MidiMACS, Miltenyi biotech, USA)을 이용하여 CD34⁺단핵세포들을 분리하였다. 분리된 CD34⁺조혈 모세포를 배지로 세척한 후 초기 농도 1 x10⁵/ml로 2주간 배양했다. 배지로는 X-VIVO 20 (Biowhittaker, USA)에 5% 인간 혈청 알부민(human serum albumin), 페니실린 (100 U/ml), 스트렙토마이신 (100 μg/ml), 100 U/ml의 L-글루타민 (이상 Sigma에서 구입)을 첨가하여 만든 완전배지를 사용하였다. 배양기간 동안, 처음 1주간은 50ng/ml의 GM-CSF (Leucogen, LG 화학, 한국)를 처리하였고, 나머지 1주간은 200U/ml의 IFN-γ(Intermax-γ, LG 화학, 한국)를 처리하되, 각 사이토카인 처리는 3일에 한번씩 수행하였다. 마지막으로 13일째에는 1 μg/ml의 면역 증강제로서 칼슘 이온 투과 담체 (Ca²⁺ionophore)인 이오노마이신 (ionomycin, Sigma)을 처리하여 하루 더 배양함으로써 분화 증식된 세포를 성숙시켰다.

상기와 같이 배양된 수상돌기 세포를 광학 현미경하에서 관찰한 결과 비교적 풍부한 세포질을 가지며 세포 표면에 많은 돌기를 갖는 수상돌기 세포를 관찰할 수있었다. 세포들은 초기 배양기간 동안 군집을 이루어 증식하며 플라스크의 표면에 붙어 자라다가 2주째 IFN-γ를 투여하면 각각의 세포로 떨어져 증식하기 시작한다. 부유 형태로 자라는 이 시기의 세포들을 도립 광학현미경 (inverted microscope)으로 관찰하면 세포 표면에 뚜렷하게 나타난 돌기들을 관찰할 수 있다. 주사 전자현미경(scanning electron microscope) 및 투과 전자현미경 (transmission electron microscope)으로 관찰한 결과, 핵이 한쪽으로 치우쳐 있고 풍부한 세포질과 세포질 내에 많은 과립을 갖고 있으며 세포 표면에 많은 돌기들이 존재하는 것을 확인하여 분화된 세포가 수상돌기 세포의 전형적인 세포 모양을 나타냄을 알 수 있었다 (도 1참조).

<실시예 2> 배양시간에 따른 세포수의 증가

배양시간에 따른 세포수의 증가를 조사하기 위해, IFN-γ를 처리한 다음 세포가 플라스크 표면에서 떨어져 증식하기 시작하였을 때 및 추가적으로 1주간 더 배양하여 총 배양기간 2주 후에 각각 배양액 1ml를 취하여 헤모사이토미터 (hemocytometer)로 세포수를 측정하였다. 그 결과, 도 2에 나타난 바와 같이 초기 세포수 1 x10⁵/ml에서 GM-CSF 처리 1주일간 세포들의 숫자가 서서히 증가하다가 2주째 IFN-γ를 투여한 후에는 급격하게 세포수 증가를 나타내었으며, 배양 시작 후 14일 후에는 약 30 x 10⁵/ml 의 세포수로 배양 초기에 비해 평균 30배 이상의 증가를 보였다.

<실시예 3> 분화된 세포의 면역 표현형 조사

실시예 1에서 증식 분화된 수상돌기 세포의 면역 표현형을 조사하기 위해, 세포 표면 항원인 CD1a, CD3, CD4, CD8α, CD11c, CD14, CD40, CD54, CD80, CD83, CD86, HLA classⅠ (ABC), HLA class Ⅱ (DR)에 대한 특이성을 가지며 FITC (fluorescein isothiocyanate) 또는 PE (phycoerythrin)로 표지된 항체 (Coulter, USA)를 이용하였다. 구체적으로, 상기 단일 클론 항체들을 포함하는 완충용액 (PBS; 5% 우태아 혈청 포함)에 1 x 10⁵세포를 혼합하여 15분간 암실에서 실온으로 반응시킨 다음, 이를 PBS로 세척하고 유세포 분석기 (flow cytometry; FACScan, Becton Dickinson)로 분석하였다.

상기 분석 결과를 도 3에 나타내었는데, GM-CSF로 배양을 시작한 후 7일째의 면역 표현형은 CD1a⁺세포가 많이 발견되며 CD11c⁺세포가 많이 발견되었다. 물론 CD40, CD54, CD80, CD83, CD86, HLA class I 및 Ⅱ에 대해서도 양성 반응을 보이나 성숙된 수상돌기 세포의 표지자인 CD83은 약한 양성반응을 보였다. 이후 IFN-γ를 투입하여 1주일간 주가 배양하고 최종적 성숙을 위하여 이오노마이신으로 하루간 처리한 결과, CD1a 및 CD14는 완전히 음성으로 전환되었고, CD83⁺세포수가 급격히 증가하여 성숙된 수상돌기 세포가 분화 증식되었음을 확인할 수 있었다. CD11c은 수상돌기 세포의 특징적인 표지자로서 이에 대해 양성이라는 것은 조혈 모세포로부터 분화된 세포가 현미경적으로 관찰되는 형태학적 특징뿐만 아니라 면역 표현형에있어서도 수상돌기 세포의 특징을 나타냄을 보여주는 것이다. 또한, 초기 1주간의 세포에서는 성숙된 수상돌기 세포에 특징적인 표지자인 CD83에 대해 약한 양성반응을 나타내다가 1주일간 IFN-γ의 존재 하에 추가배양 하였을 때 양성 세포가 늘어났다. 이러한 결과는 분화된 수상돌기 세포가 IFN-γ및/또는 이오노마이신의 첨가로 인해 완전 성숙됨을 보여주는 것이다.

한편, CD1a는 일반적으로 수상돌기 세포에서 양성 반응을 보이나 이번 실험에서는 다른 결과를 보이고 있는데, IFN-γ가 투입되어 단핵 백혈구 (monocyte)의 증식이 의심되었으나 CD14가 음성으로 나온 것으로 보아 단핵 백혈구는 아닌 것으로 생각된다. 나머지 표지자들은 지속적으로 강한 양성 반응을 보였다 (도 3)

또한 이 시기의 세포들은 범 T-cell 표지자인 CD3에 대해서는 음성이고 골수성 수상돌기 세포에서 흔히 나타나는 CD4는 음성이지만 CD8α은 양성 반응을 보이기 시작하여 (도 4), CD8α⁺의 림프구성 수상돌기 세포임을 알 수 있었다.

이상의 결과를 종합할 때, 본 발명에 의해 인간 조혈모세포로부터 증식 분화된 수상돌기 세포의 면역 표현형은 CD1a^-, CD3^-, CD4^-, CD8α⁺, CD11c⁺, CD14^-, CD40⁺, CD54⁺, CD80⁺, CD83⁺, CD86⁺, HLA-I⁺, HLA-Ⅱ⁺의 림프구성 수상돌기 세포임을 알 수 있다 (도 3및도 4참조).

<실시예 4> CD8α ⁺ 수상돌기 세포의 항원 탐식 능력 확인

실시예 1에서 증식 분화시킨 림프구성 수상돌기 세포가 항원 탐식 (phagocytosis) 능력을 갖는지 확인하기 위하여, 거대 분자량을 갖는 FITC가 표지된 덱스트란 (dextran-FITC, Sigma)을 수상돌기 세포와 37°C에서 1시간 동안 혼합 배양한 후, 유세포 분석기로 분석하여 세포 내로 탐식된 덱스트란의 양을 측정하였다. 이때 우태아 혈청 (FBS)은 사용하지 않았으며 세포수는 2 x 10⁵를 사용하였다.

상기와 같이 덱스트란-FITC를 이용한 항원 탐식능 검사에서 실시예 1의 CD8α⁺림프구성 수상돌기 세포는 활발한 탐식작용을 나타내었고, 이러한 현상은 4℃에서 억제되었다. 또한, IFN-γ를 처리한 2주째의 세포들이 더욱 증가된 탐식능을 나타내었다 (도 5).

한편, 상기 반응은 에너지 의존적인 탐식 작용이므로 저온에서 대사를 정지시키면 반응이 일어나지 않지만, 간혹 단순히 표면에만 붙은 것이라면 저온에서도 반응이 일어날 수 있다. 따라서 배양된 수상돌기 세포를 4°C에서 4시간 동안 배양한 후 동일한 실험을 수행한 결과, 수상돌기 세포에 의한 덱스트란-FITC 탐식 작용이 4℃에서는 억제되는 것으로 나타나 비특이적 결합에 의한 현상이 아니라는 것을 확인하였다.

<실시예 5> CD8α ⁺ 수상돌기 세포의 림프구 증식 유도 능력 조사

본 발명의 림프구성 수상돌기 세포가 림프구의 증식을 자극할 수 있는지 알아보기 위해 혼합 림프구 반응 (Mixed Leukocyte Reaction; MLR)을 수행하였다.

먼저, 정상인의 혈액에서 T 림프구를 분리한 다음, 감마선 (30 Gy)으로 조사한 수상돌기 세포를 효과세포 (effector cell)로, 상기에서 분리된 정상인의 동종 T 림프구를 반응세포(responder cell)로 하여 혼합 배양하였다. 피콜-하이파크 (Ficoll-Hypaque; Histopaque; Sigma Chemical, USA)를 이용한 밀도 구배 원심분리법 (density gradient centrifugation)에 의하여 정상인의 혈액으로부터 단핵세포 (mononuclear cell)를 분리하고, 분리된 단핵세포들을 PBS로 한번 세척한 다음, 3 x 10⁸의 세포를 칼럼 (human T cell enrichment column, R D, USA)에 넣고 실온에서 10분간 기다린 후 PBS로 분리된 T-세포를 세척하여 추출하였다. 효과세포와 반응세포의 비율 (수상돌기 세포:T-세포)을 각각 1:1, 1:10, 1:10², 1:10³, 1:10⁴로 하여 마이크로 플레이트 (Corning)에 3배수로 넣고 37℃에서 3일간 배양하였다. 이후 세포 분화 ELISA 키트 (cell proliferation ELISA kit, BrdU (colorimetry); Boehringermanheim, 독일)를 이용하여 BrdU의 세포내 유입 정도, 즉 T 세포의 증식 정도를 측정하였다. 이를 간단히 살펴보면, 상기 효과세포와 반응세포를 일정 비율로 혼합하여 배양한 다음, 20 μl의 BrdU (5-bromo-2'-deoxyuridine)를 첨가하여 24시간 더 배양하였다. 포름알데히드를 첨가하여 30분간 상온에서 고정시킨 후 플레이트에 100 μl의 항 BrdU 용액을 넣고 실온에서 90분간 반응시켰다. 이후 상기 플레이트를 PBS로 세척한 후 발색 기질을 넣어 30분간 반응시켰다. 1 N의 H₂SO₄로 반응을 정지시킨 다음, ELISA 플레이트 측정기 (Molecular device, USA)를 이용하여 450 nm 파장에서의 흡광도를 측정하였다.

상기 MLR 실험 결과, 효과세포: 반응세포의 비율이 1:10⁴에서부터 급격한 T 세포의 증식을 보이기 시작하였으며, INF-γ를 처리한 후에도 동종 T 세포에 대한 증식 유도 효과는 비슷한 것으로 나타났다. 상기 결과로부터 본 발명의 림프구성 수상돌기 세포가 동종 T 림프구의 증식을 자극하는 기능을 갖고 있음을 알 수 있다 (도 6).

<실시예 6> 림프구성 수상돌기 세포의 사이토카인 분비 능력

실시예 1과 동일한 방법으로 인간 조혈 모세포로부터 림프구성 수상돌기 세포를 증식 분화시키되, 배양 7일째에 IFN-γ를 투입하기 전, IFN-γ투입 후 최종 성숙을 위한 이오노마이신 투입 직전 및 이오노마이신 투입 1일 후에 각각 배양 상등액을 모아 -72°C에 보관해 두었다. 상기 보관된 배양액에 대해 ELISA (enzyme-linked immunosorbant assay)를 수행하여 IL-12와 IFN-γ의 분비능을 측정하였다.

먼저, 0.1 mol/L의 NaHCO₃용액에 최종 농도 2 μg/ml가 되도록 희석한 항 인간 IL-12 및 항 인간 IFN-γ항체 (Pharmingen) 50 μl를 ELISA 플레이트 (Corning)에 분주하여 4°C에서 하루동안 코팅하였다. 5% FBS을 포함하는 PBS로 각 플레이트를 3시간 동안 차단한 다음, 50 μl의 검체와 표준 시료를 첨가하여 상온에서 4시간 동안 반응 시켰다. 상기 플레이트를 PBS로 수 차례 세척한 후 바이오틴 (biotin)으로 표지된 검출 항체 (Pharmingen)를 2 μg/ml의 농도로 첨가하여 반응시키고 3시간 후 세척하였다. 이 후 스트렙타비딘과 결합된 양고추냉이 퍼옥시다제 (streptavidin-horseradich peroxidase)를 1:2000으로 희석한 용액과 반응시켰다. 한 시간 후 플레이트를 세척하고 발색기질로 TMB (Zymed, CA)를 첨가한 다음 ELISA 플레이트 측정기 (Molecular device, USA)를 이용하여 450 nm에서 흡광도를 측정하였다.

상기와 같이 수상돌기 세포 배양액을 모아 측정한 결과, 1주째 IFN-γ를 투여하기 직전까지는 IL-12 및 IFN-γ 두 가지 모두 낮은 생산을 보였으며, 2주째에도 이오노마이신으로 최종 성숙시키기 전까지는 낮은 수준을 유지하였다. 그러나, 이오노마이신을 첨가한 후에는 IL-12 및 IFN-γ생산량 모두 급격한 증가를 나타내었다 (도 7).

본 발명의 CD8α⁺림프구성 수상돌기 세포는 인간에 있어서는 그 존재가 처음으로 확인된 것으로, T 세포 증식 자극 능력, 탐식 작용 및 IL-12와 IFN-γ와 같은 사이토카인의 대량 분비 활성을 통해 강력한 Th-1 타입 면역 반응을 유도하며, GM-CSF 및 IFN-γ를 순차적으로 첨가하여 배양함으로써 조혈 모세포 등으로부터 대량 생산이 가능하므로, 상기 림프구성 수상돌기 세포는 IL-12 및 IFN-γ의 생산,항암 또는 항바이러스 치료를 위한 세포 치료 요법, 임상 연구 및 면역 세포의 분자 생물학적 연구에 폭넓게 이용할 수 있다.

Claims

조혈 모세포 (hematopoietic stem cell)로부터 분화되며 CD8α⁺의 면역 표현형을 갖는 림프구성 수상돌기 세포.
제1항에 있어서, CD1a^-, CD3^-, CD4^-, CD8α⁺, CD11c⁺, CD14^-, CD40⁺, CD54⁺, CD80⁺, CD83⁺, CD86⁺, HLA-I⁺, HLA-Ⅱ⁺의 면역 표현형을 갖는 것을 특징으로 하는 림프구성 수상돌기 세포.
제1항에 있어서, 조혈 모세포는 인간 조혈 모세포인 것을 특징으로 하는 림프구성 수상돌기 세포.
제1항에 있어서, GM-CSF (granulocyte macrophage-colony stimulating factor)와 인터페론-γ(IFN-γ)를 순차적으로 첨가하여 배양함으로써 조혈 모세포로부터 분화시킨 것을 특징으로 하는, 림프구성 수상돌기 세포.
제1항에 있어서, 인터루킨-12 및 IFN-γ의 생산 활성을 갖는 것을 특징으로 하는, 림프구성 수상돌기 세포.
혈액으로부터 분리한 단핵세포 (mononuclear cell)를 GM-CSF를 첨가한 배지에서 약 6 내지 8일간 배양한 후, 다시 IFN-γ를 첨가한 배지에서 약 6 내지 8일간 추가 배양하는 단계를 포함하는, CD8α⁺의 면역 표현형을 갖는 림프구성 수상돌기 세포의 생산 방법.
제6항에 있어서, 단핵세포는 조혈 모세포, 단핵구, 골수성 전구세포 (myeloid progenitor cell) 또는 골수성 수상돌기 세포인 것을 특징으로 하는 방법.
제7항에 있어서, 조혈 모세포는 인간 조혈 모세포인 것을 특징으로 하는 방법.
제6항에 있어서, GM-CSF 및 IFN-γ는 2∼4일에 한 번씩 배지에 첨가하되, GM-CSF는 20-200 ng/ml, IFN-γ는 50-500 U/ml의 양으로 첨가하는 것을 특징으로 하는 방법.
제6항에 있어서, GM-CSF와 IFN-γ를 순차적으로 첨가하여 배양한 후 0.1∼10 μg/ml의 이오노마이신 (ionomycin)을 첨가하여 약 1일간 배양하여 세포를 성숙시키는 단계를 추가적으로 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
제6항에 있어서, 수상돌기 세포는 CD1a^-, CD3^-, CD4^-, CD8α⁺, CD11c⁺, CD14^-, CD40⁺, CD54⁺, CD80⁺, CD83⁺, CD86⁺, HLA-I⁺, HLA-Ⅱ⁺의 면역 표현형을 갖는 것을 특징으로 하는 방법.
제6항에 있어서, 수상돌기 세포는 인터루킨-12 및 IFN-γ의 생산 활성을 갖는 것을 특징으로 하는 방법.
제1항 내지 제5항 중 어느 한 항의 수상돌기 세포를 유효성분으로 하는 항암 또는 항 바이러스 면역 치료용 조성물.
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