KR101869518B1

KR101869518B1 - 췌장암 줄기세포의 emt-met 가소성을 이용한 암 치료용 수지상 세포 백신의 제조 방법

Info

Publication number: KR101869518B1
Application number: KR1020180036186A
Authority: KR
Inventors: 황인후
Original assignee: 황인후
Priority date: 2018-03-28
Filing date: 2018-03-28
Publication date: 2018-06-20

Abstract

본 발명은 EMT-MET 가소성을 이용하여 E-cadherin의 발현을 유도한 후, 파랍토시스-세포사(paraptosis-like cell death)를 유도한 췌장암 세포 배양물 또는 이로부터 추출된 엑소좀을 미성숙 수지상 세포에 처리하여 성숙 수지상 세포로 분화를 유도하는, 성숙 수지상 세포의 제조 방법을 제공한다. 또한, 본 발명은 상기 방법에 따라 제조한 성숙한 수지상 세포를 제공한다. 또한 본 발명은 상기 성숙 수지상 세포를 포함하는, 암 치료용 수지상 세포 백신의 제조방법 및 이를 통해 제조된 암 치료용 수지상 세포 백신을 제공한다. 본 발명의 세포사멸을 유도한 췌장암 세포 배양물을 이용한 제조방법을 통해 제조한 성숙 수지상 세포는 췌장암에 대하여 종양의 성장을 억제하는, 2차 면역반응을 보인다.

Description

췌장암 줄기세포의 EMT-MET 가소성을 이용한 암 치료용 수지상 세포 백신의 제조 방법{Method of Preparing Dendritic Cell Based Cancer Vaccine Using EMT-MET Plasticity in Pancreatic Cancer Stem Cells}

본 발명은 췌장암 줄기세포의 EMT-MET 가소성을 이용한 암 치료용 수지상 세포 백신의 제조 방법에 대한 것으로, 보다 상세하게는 EMT-MET 가소성을 유도한 후, 파랍토시스-세포죽음(paraptosis-like cell death)를 유도한 췌장암 줄기세포 배양물 또는 이로부터 추출된 엑소좀을 이용한 성숙화된 수지상 세포 제조 방법과 상기 방법을 통해 제조된 성숙 수지상 세포, 암 치료용 수지상 세포 백신의 제조 방법 및 췌장암 치료용 수지상 세포 백신에 관한 것이다.

수지상 세포(Dendritic Cell, DC)는 포유류 면역계의 항원 제시 세포이며 막성 혹은 가시와 같은 나뭇가지 모양의 돌기를 가지고 있다. 수지상 세포의 주요 기능은 항원 물질을 처리하여 면역계의 T 세포에 세포 표면에 제시하는 것이다. 따라서 수지상세포는 비감작 T 림프구를 활성화시키는 주요한 항원표지세포로, 타고난 면역 체계와 적응 면역 체계 사이의 메신저 역할을 한다. 현재까지 면역시스템을 이용한 암 치료가 많은 동물실험을 통해 증명되었으며 인간의 T 림프구에 의해 인식되는 종양 특이적 항원의 동정이 면역요법의 발달을 촉진하고 있다.

예방 백신은 질병을 예방하는 가장 효과적인 방법 중 하나로, 예방 백신은 감염의 확산을 막기 위해 고안되었으며, 이들의 활동은 특정 항체 및 기억 B 세포(memory B cell)의 유도와 관련이 있다. 반면에 치료 백신은 주어진 질병의 원인을 제거하기 위해 고안되었다. 치료 백신의 활동은 주로 암 또는 감염된 세포를 거부하는 세포 독성 T 림프구(Cytotoxic T Lymphocyte, CTL)를 생성하도록 감작된 항원 특이 CD8⁺ T 세포에 대해 의존적이다.

암 치료용 백신은 암 특이 기억 T 세포(tumor-specific memory T cells) 및 암 특이 작동 T 세포(tumor-specific effector T cells)를 유도하여 종양 재발을 조절하고 종양의 양을 감소시킬 수 있다. CD8⁺ T 세포(림프구)의 면역 조절을 위해, 수지상 세포가 면역촉진제로서 사용되고 이를 이용하여 효과적인 항암면역 (antitumour immunity)을 유도할 수 있다.

엑소좀은 많은 종류의 세포에서 분비되어 세포 외 공간으로 분비되는 소포이다. 연구에 따르면 종양에서 단순 추출된 엑소좀(Tumor derived exosomes, TEX)은 종양의 성장과 전이를 촉진할 뿐만 아니라 유전자 정보를 수혜자 세포로 옮김으로써 면역 반응을 억제할 수 있다고 한다. 항원 제시 세포의 일종인 수지상 세포(DC)는 발암 과정에서 종양 특이적 T 세포 면역 반응을 유도할 수 있다. TEXs에 의해 유도된 성숙한 DC가 암 면역 요법에 적용될 수 있는 항종양 효과를 증가시킨다는 증거가 증가하고 있다.

암 줄기 세포(Cancer stem cell, CSC)를 표적화하도록 설계된 수지상 세포 (DC) 기반 백신은 숙주 항-CSC 면역을 부여함으로써 중요한 항-종양 반응을 유도 할 수 있다. 최근 연구에 따르면 CSC-DC 백신은 원발 종양의 전이를 억제하고 암 줄기 세포에 대한 체액 면역 반응을 유도할 수 있다. 이 접근법은 암 면역 요법에서 암 줄기 세포 백신의 가능성을 보여준다(Oncoimmunology. 2015 Jan 9;4(3):e990767. eCollection 2015 Mar) 또한, CD133은 췌장암 줄기세포의 임상적 표지자로서 의미가 있으며, E-cadherin의 세포 표면 활성 상태는 암의 전이 진행을 억제하며, 뿐만 아니라 E-카데린(E-cadherin)은 암세포의 성장, 침입 및 약물 내성을 억제한다(Mol Biol Cell. 2016 Nov 1; 27(21): 3233-3244.). 이러한 성질을 이용하기 위하여 본 연구의 연구진들은 세계 최초로 E-cadherin이 발현되지 않는 것으로 알려진 췌장암줄기세포인 MiaPaCa-2에서 EMT-MET 가소성을 이용하여 E-cadherin을 발현시켜 본 발명에 사용하였다.

한편, 임상연구에 있어서 현재 연구개발된 수지상 세포 백신은 기대에 크게 미치지 못한 성과를 보이고 있다(Crit Rev Oncol Hematol 66:118(2008)).

이에 본 발명자들은 수지상 세포를 이용한 췌장암 백신 조성물 개발을 위하여 연구한 결과, EMT-MET 가소성을 통해 암의 성장과 전이를 억제하는 단백질인 E-cadherin의 발현과 파랍토시스(paraptosis)를 유도한 췌장암 세포 배양물 또는 이로부터 추출한 엑소좀을 미성숙 수지상 세포에 처리하면 수지상 세포의 성숙 분화가 유도되는 효과가 있음을 확인하였고, 이의 췌장암에 대한 백신 효과를 확인하여 본 발명을 완성하였다.

따라서 본 발명의 목적은 성숙 수지상 세포의 제조방법을 제공하는 것이다.

또한 본 발명의 다른 목적은 본 발명에 따른 제조방법을 통해 제조한 성숙 수지상 세포를 제공하는 것이다.

또한 본 발명의 또 다른 목적은 수지상 세포 백신의 제조방법을 제공하는 것이다.

또한 본 발명의 다른 목적은 본 발명에 따른 제조방법을 통해 제조한 수지상 세포 백신을 제공하는 것이다.

또한 본 발명의 다른 목적은 본 발명에 따른 제조방법을 통해 제조한 성숙 수지상 세포를 포함하는 췌장암 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공하는 것이다.

상기와 같은 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 다음의 단계를 포함하는 성숙 수지상 세포의 제조방법을 제공한다.

(a) 췌장암 줄기세포를 원심분리하여 3차원 회전 타원체 배양을 형성하는 단계;

(b) 상기 3차원 회전 타원체 배양한 췌장암 줄기세포에 파랍토시스(paraptosis)를 유도하는 단계;

(c) 상기 파랍토시스가 유도된 췌장암 줄기세포 및 배지로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상을 포함하는 세포 배양물을 수득하는 단계; 및

(d) GM-CSF를 포함하는 배지에 상기 세포 배양물을 첨가하고 미성숙 수지상 세포를 배양하여 성숙 수지상 세포로 분화 유도하는 단계.

본 발명의 또 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 상기 제조방법을 통해 제조한 성숙 수지상 세포를 제공한다.

본 발명의 또 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 다음의 단계를 포함하는 수지상 세포 백신의 제조방법을 제공한다.

(c) 상기 파랍토시스가 유도된 췌장암 줄기세포, 배지 또는 세포 및 배지로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나를 포함하는 세포 배양물을 수득하는 단계;

(d) GM-CSF를 포함하는 배지에 상기 세포 배양물을 첨가하고 미성숙 수지상 세포를 배양하여 성숙 수지상 세포로 분화 유도하는 단계; 및

(e) 분화되지 않은 미성숙 수지상 세포를 제거하여 성숙 수지상 세포로 이루어진 조성물을 수득하는 단계.

본 발명의 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 상기 제조방법을 통해 제조한 수지상 세포 백신을 제공한다.

본 발명의 또 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 상기 제조방법을 통해 제조한 성숙 수지상 세포를 유효성분으로 포함하는 췌장암 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.

이하 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명은 다음의 단계를 포함하는 성숙 수지상 세포의 제조방법을 제공한다.

다음의 단계를 포함하는 성숙 수지상 세포의 제조 방법:

상기 세포사멸이 유도된 췌장암 줄기세포 및 배지로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상을 포함하는 세포 배양물은 필요에 따라, 초음파 처리(sonication)한 후 원심 분리하여 수득한 상층액일 수 있다.

본 발명에 따른 성숙 수지상 세포 제조방법은 암세포를 3차원 회전 타원체 배양하여 EMT-MET 가소성(plasticity)을 유도하여 E-cadherin이 발현된 것을 확인하고, 이에 파랍토시스(paraptosis) 세포사를 유도한 췌장암 세포 배양물(추출액) 또는 이로부터 유래한 엑소좀을 처리하여, 미성숙 수지상 세포의 성숙을 유도하는 것에 특징이 있다.

본 발명에서 "EMT-MET 가소성(plasticity)이 유도된 세포"란 상피간엽이행(Epithelial to Mesenchymal Transition, EMT)와 간엽상피전환(Mesenchymal-epithelial transition, MET)간의 가소성(plasticity)이 유도된 세포를 의미한다. 줄기세포는 인체에서와 마찬가지로 스페로이드 배양(3차원 회전체 배양)을 하면 EMT를 통해 이동과, MET를 통해 운동성과 모양 가변성이 반복되는 미세한 과정을 거치는 데, 이를 EMT-MET plasticity이라 한다. 또한, 상기 상피간엽이행은 상피줄기세포 혹은 분화된 상피세포들이 체세포돌연변이(somatic mutation)를 축적하면서 간엽세포의 특성을 지닌 줄기세포로 변형된다는 이론이다.

구체적으로, 본 발명의 일실시예에 따르면 3차원 회전 타원체 배양하였을 때 세포에 상기 EMT, MET 또는 EMT 및/또는 MET 과정의 가소성이 유도된 것을 확인하였다. 상기 EMT 및/또는 MET 과정의 가소성이 유도될 시 세포의 모양 및 특성이 변하는데, 본 발명은 EMT 또는 MET 과정 및 그 중간 단계에서 표현형 및 기능적 특성에 관여하는 각기 다른 유전정보, 단백질, 성장인자를 함유하고 있는 세포 배양물을 이용하여 세포의 특성을 유도하고, 그 특성을 이용하는 데 특징이 있다.

본 발명에서 사용된 용어, "엑소좀(exosome)"이란 여러 종류의 세포들로부터 분비되는 막 구조의 소낭체로, 다른 세포 및 조직에 결합하여 막 구성요소, 단백질, RNA를 전달하는 등 다양한 역할을 하는 것으로 알려져 있다.

본 발명의 미성숙 수지상 세포는 DC 전구 세포를 함유하는 적합한 조직 공급원으로부터 DC 전구 세포를 분리하거나 또는 미성숙 DC를 제조하는 방법에 의해 취득할 수 있다. 미성숙 DC를 제조하는 방법이란, 전구세포를 시험관내에서 분화시켜 미성숙 DC를 생산하는 방법을 말하며, 상기 전구세포는 적합한 조직공급원으로부터 유래한 혈액 단일핵 세포(mononuclear cell) 또는 조혈모세포일 수 있으며, 상기 적합한 조직 공급원이란 골수, 말초 혈액 및 제대혈 등일 수 있으며, 보다 바람직하게는 골수 세포로부터 유래된 것이다.

본 발명에 있어서, 상기 과립구-대식세포 콜로니 자극 인자(GM-CSF)는 대식세포의 수를 급격히 증가시켜 수지상 세포의 분화를 유도하는데 도움을 줄 수 있다.

상기 파랍토시스(paraptosis)는 췌장암 세포에 메리디아닌 C(Meridianin C)를 처리하여 췌장암 줄기세포에 저항하는 전신 면역을 촉진하는 것임을 특징으로 한다.

상기 메리디아닌 C(Meridianin C)는 아플리디움 메리디아눔(Aplidium meridianum)으로부터 분리된 새로운 단백질 키나아제 억제제로, 하기 화학식 1로 표시되며 해양으로부터 유래된 인돌 알칼로이드이다.

[화학식 1]

최근 Meridianin C가 C/EBPα(C/Emopamil binding proteinα), PPARγ(Peroxisome proliferator-activated receptor γ), 렙틴(leptin), 그리고 아디포넥틴(adiponectin)과 같은 전사인자들을 조절함으로써 지방생성(adipogenesis)을 억제하여 항비만 활성을 가진다는 결과가 보고되었다(Park et al ., 2014).

상기 파랍토시스(paraptosis)는 프로그램화된 세포사멸(programmed cell death)의 일종으로, 미토콘드리아의 팽창과 함께 세포질에서 공포라 불리는 일종의 빈 공간을 형성하는 특징을 보이는 세포사의 하나의 형태이다. 파랍토시스는 세포사멸(apoptosis) 및 세포괴사(necrosis)와 형태학적으로 뚜렷한 차이를 보인다. 파랍토시스의 가장 큰 특징은 세포질의 공포변성(cytoplasmic vacuolation), 카스파제(caspase)의 활성화의 독립 및 억제와 세포사멸 형태(apoptotic morphology)의 결핍이다. 파랍토시스에는 세포막 손실(membrane blebbing), 염색질 응축(chromatin condensation), 및 핵 분열(nuclear fragmentation)과 같은 세포 사멸의 특징적인 특성이 결여되어 있다. 또한 파랍토시스는 세포 괴사와 달리, 특징적인 세포질 액포(cytoplasmic vacuole) 형성 및 늦은 미트콘드리아 팽윤(swelling) 및 응집(clumping)과 같은 다소 원시적인 세포 사멸 경로를 나타낸다.

본 발명의 바람직한 일 구현예에 따르면, 상기 Meridianin C는 10μM 내지 50 μM의 농도로 췌장암 세포에 처리될 수 있다. 바람직하게는 15μM 내지 45 μM, 20μM 내지 40 μM 또는 25μM 내지 35μM의 농도로 처리될 수 있다.

상기 Meridianin C가 상기 범위 미만의 농도로 처리되면 췌장암 세포에 대한 세포사멸 효과가 저하될 수 있고, 상기 범위를 초과하는 농도로 처리되면 암세포가 면역학적으로 죽은 상태를 넘어 생물학적으로 암세포가 죽어 백신의 항원으로 효과가 없는 문제가 발생할 수 있다.

또한, 췌장암 줄기세포 MiaPaCa-2는 E-cadherin이 발현되지 않는 세포이나, 본 발명에 따른 상기 3차원 회전 타원체 배양한 췌장암 줄기세포 MiaPaCa-2는 EMT-MET 가소성을 이용하여 E-cadherin을 발현시킨 것을 특징으로 한다. 특히, 본 발명에 따른 췌장암 줄기세포의 E-cadherin의 발현은 다운 스트림(Down-stream) 및/또는 업 스트림(up-stream) 발현 모두를 포함할 수 있다.

본 발명의 일구현예에 따르면, 3차원 회전 타원체 배양한 췌장암 줄기세포는 배양 3일 내지 5일에 E-cadherin이 발현되었으며, 3일째에 가장 높은 발현을 보였다(도 2(b) 참고).

상기 (b)단계 내지 (d)단계의 췌장암 줄기세포 추출물 및 배양물은 종양 면역원성 엑소좀을 포함하는 것을 특징으로 한다.

또한 상기 (d)단계에서 미성숙 수지상 세포의 배양은 30분 내지 48시간 동안 수행되는 것이 바람직하며, 24시간 이상 수행되는 것이 보다 바람직하다.

상기 시간보다 짧게 배양하는 경우, 수지상 세포의 성숙 분화 유도 효과가 저하되어, 췌장암에 대한 백신 효과가 저하되는 문제가 야기될 수 있다. 상기 시간보다 길 경우 장기간 배양으로 인한 분화효율이 저하될 수 있고, 세포 생육성의 손상 및 과잉의 세포증식에 따른 새로운 항원성 획득 또는 발현이나 증식 과정에서 예기치 못한 형질 획득이나 돌연변이에 의해 악성 세포가 출원할 가능성이 있으므로 상기 배양시간이 적절할 수 있다.

본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 상기 방법으로 제조한 성숙 수지상 세포를 제공한다.

본 발명의 바람직한 일 구현예에 따르면, 미성숙 수지상 세포에 상기 파랍토시스-세포사멸이 유도된 췌장암 줄기세포 추출물, 배양물 또는 엑소좀을 처리한 경우, 성숙 수지상 세포 마커의 높은 발현을 보였으며, 전체적으로 95% 이상의 세포가 성숙 수지상세포로 유됨을 확인할 수 있었다. 따라서 세포사멸이 유도된 췌장암 줄기 세포 추출물, 배양물 또는 엑소좀은 미성숙 수지상 세포의 성숙 및 면역 시스템을 유도하는 효과가 있음을 확인하였다.

또한 상기 방법에 따라 제조된 본 발명의 성숙 수지상 세포는 2차 접종시, 종양 성장 억제 효과가 있으므로 췌장암 치료용 백신으로 사용할 수 있다.

따라서 본 발명은 다음의 단계를 포함하는 수지상 세포 백신의 제조방법을 제공한다:

상기 세포사멸은 3차원 회전 타원체 배양함으로써 EMT 및/또는 MET 가소성을 통해 암 줄기세포에서 E-cadherin을 발현시켜 억제물질을 유도한 췌장암 줄기 세포에 메리디아닌 C(Meridianin C)를 처리하여 유도한 파랍토시스(paraptosis)인 것을 특징으로 하며, 상기 (b)단계의 췌장암 세포 배양물은 종양 면역원성 엑소좀을 포함하는 것을 특징으로 한다.

더불어 본 발명은 상기 방법으로 제조한 수지상 세포 백신을 제공하며, 본 발명에 따른 수지상 세포 백신은 췌장암 치료용 백신인 것을 특징으로 한다.

본 발명에서 용어, “백신”은 생체에 면역을 주는 항원을 함유한 생물학적인 제제로서, 감염증의 예방을 위하여 사람이나 동물에 주사하거나 경구 투여함으로써 생체에 면역이 생기게 하는 면역원 또는 항원성 물질을 말한다. 생체 내 면역은 병원균의 감염 후에 생체 내 면역력이 자동으로 얻어지는 자동면역과 외부에서 주입한 백신에 의하여 얻어지는 수동 면역으로 크게 나누어진다. 자동면역이 면역에 관계하는 항체의 생성 기간이 길고 지속적인 면역력의 특징이 있는 반면, 백신에 의한 수동 면역은 감염증 치료에 즉시 작용하나 지속력이 떨어지는 단점이 있다.

본 발명의 백신 조성물에는 약제학적으로 허용되는 담체를 포함할 수 있다. 항원 물질을 생체 내 부위에 전달하는데 적합한 임의의 성분을 의미하며, 예를 들어, 물, 식염수, 인산염 완충 식염수, 링거 용액, 덱스트로스 용액, 혈청 함유 용액, 한스 용액, 기타 수용성의 생리학적 평형 용액, 오일, 에스테르 및 글리콜 등이 포함되나, 이에 한정되지 않는다.

본 발명의 담체는 화학적 안정성 및 등장성을 증진시키기 위해 적합한 보조 성분과 보존제를 포함할 수 있으며, 트레할로스, 글라이신, 솔비톨, 락토오스 또는 모노소듐 글루타메이트(MSG)와 같은 안정화제를 포함시켜 온도 변화 또는 동결건조에 대해 백신 조성물을 보호할 수 있다. 본 발명의 백신 조성물은 멸균수 또는 식염수(바람직하게는 완충된 식염수)와 같은 현탁 액체를 포함할 수 있다.

본 발명의 백신 조성물은 면역원에 대한 면역반응을 향상시키기에 충분한 양의 임의의 애쥬번트(adjuvant)를 함유할 수 있다. 적합한 애쥬번트는 문헌 Takahashi et al. (1990) Nature 344:873-875에 기술되어 있으며, 예컨대, 알루미늄염(알루미늄 포스페이트(Aluminium phosphate) 또는 알루미늄 히드록시드(Aluminium hydroxide), 스쿠알렌(Squalene) 혼합물(SAF-1), 무라밀(muramyl) 펩티드, 사포닌(Saponin) 유도체, 마이코박테리아(mycobacterium) 세포벽 제조물, 모노포스포릴(monophosphoryl) 지질 A, 미콜산(mycolic acid) 유도체, 비이온성 블록 공중합체 계면활성제, Quil A, 콜레라 독소 B 서브유닛(cholera toxin B subunit), 폴리포스파젠(polyphosphazene) 및 유도체, 및 면역자극 복합체(immun-stimulating complexes, ISCOMs)를 포함하나, 이에 한정되지는 않는다.

다른 모든 백신 조성물과 마찬가지로, 면역원의 면역학적 유효량은 경험적으로 결정되어야 하며, 이 경우 고려될 수 있는 인자는 면역원성, 투여 경로 및 투여되는 면역 투여 회수를 들 수 있다. 또한 환자의 암의 진행과 전이 상태, 제형의 종류, 환자의 연령, 성별, 체중, 건강 상태, 식이, 투여 시간 및 투여 방법에 따라 조절될 수 있다.

본 발명의 백신 조성물 중의 항원물질인 세포사멸이 유도된 췌장암 세포 배양물은 본 발명의 조성물 내에서 다양한 농도로 존재할 수 있으나, 통상적으로, 상기 항원물질이 생체 내에서 적절한 수준의 항체 형성을 유도하기에 필요한 농도로 포함한다.

본 발명에서 용어, “투여”는 어떠한 적절한 방법으로 환자에 소정의 물질을 도입하는 것을 의미하며, 본 발명의 수지상 세포 백신의 투여경로는 이들이 목적 조직에 도달할 수 있는 한 어떠한 일반적인 경로를 통하여 투여될 수 있다.

본 발명의 백신 조성물은 전신 또는 점막 경로를 통해 투여함으로써, 췌장암을 치료하기 위해 사용될 수 있다. 백신 조성물의 투여는 근내, 복막내, 피내 또는 피하 경로를 통한 주사, 경구/식사, 호흡기, 비뇨생식관으로의 점막 투여를 포함할 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.

또한, 수지상세포에 근거한 백신의 효능을 높이기 위하여 수지상세포를 주입시에 IL-12와 같은 T 세포의 활성화를 도와주는 사이토카인을 병용 투여하거나, 이러한 사이토카인 유전자를 트랜스펙션 시킨 수지상세포를 사용할 수 있을 것이다.

본 발명에 의해 제조되는 백신의 유효성분인 수지상세포를 포함하는 세포는, 인간 체내에 치료용 백신으로서 접종하기 때문에, 안전성을 높이기 위해 세포 증식성을 없애 두는 것도 가능하다. 예를 들면, 선택적으로 세포 백신으로서 보다 안전하게 이용하기 위해, 가열처리, 방사선처리, 또는 마이토마이신 C(mitomycin C, MMC) 처리 등으로 처리하고, 백신으로서의 기능을 남긴 채, 증식성을 없앨 수 있다. 예를 들면, X선 조사를 이용하는 경우, 총방사선량 1000 내지 3300 Rad로 조사할 수 있다. 마이토마이신 C 처리법은, 예를 들면, 수지상세포에 25~50 ㎍/㎖의 마이토마이신 C를 첨가하여, 37℃, 30분 내지 60분간 보온처리할 수 있다. 열에 의한 세포처리방법은, 예를 들면, 50℃ 내지 65℃에서 20분간 가열처리를 행할 수 있다.

또한, 본 발명의 방법에 따라 제조된 성숙 수지상 세포는 췌장암 치료 효과를 보이기 때문에, 췌장암 예방 또는 치료용 약학적 조성물로 제공될 수 있다.

면역치료용으로는 미성숙한 수지상 세포에 비하여 본 발명의 성숙한 수지상 세포가 바람직할 수 있다. 성숙한 수지상 세포의 자손만이 M-CSF-R가 없으며, M-CSF의 제거/부존재에 대하여 안정하게 남을 수 있고, 성숙한 수지상 세포는 (종양-유래된) IL-10 또는 VEGF와 같은 저해성 인자(inhibitory factor)에 대해 저항성이 있을 수 있다. 또한, 성숙한 수지상세포는 또한 미성숙한 수지상세포에 비해 우수한, 생체외에서 및 생체내에서의 T 세포 활성화 반응을 야기할 수 있다는 것이 보고되었다.

본 발명의 약학적 조성물에서 사용될 수 있는 성숙 수지상 세포는 특별히 한정되는 것은 아니고, 자가 유래 (autologous) 또는 동종유래 (allogenic)의 수지상 세포를 모두 포함할 수 있는데, 이는 당업자에 의해 적절히 선택되어 져야 할 것이다.

본 발명의 췌장암 예방 또는 치료용 약학적 조성물은 약학적으로 허용 가능한 담체를 더 포함할 수 있다.

약학적으로 허용되는 담체로는 예컨대, 경구 투여용 담체 또는 비경구 투여용 담체를 추가로 포함할 수 있다. 경구 투여용 담체는 락토스, 전분, 셀룰로스 유도체, 마그네슘 스테아레이트, 스테아르산 등을 포함할 수 있다. 또한 비경구 투여용 담체는 물, 적합한 오일, 식염수, 수성 글루코스 및 글리콜 등을 포함할 수 있다. 또한, 안정화제 및 보존제를 추가로 포함할 수 있다. 적합한 안정화제로는 아황산수소나트륨, 아황산나트륨 또는 아스코르브산과 같은 항산화제가 있다. 적합한 보존제로는 벤즈알코늄 클로라이드, 메틸- 또는 프로필-파라벤 및 클로로부탄올이 있다. 그 밖의 약학적으로 허용되는 담체로는 다음의 문헌에 기재되어 있는 것을 참고로 할 수 있다(Remington's Pharmaceutical Sciences, 19th ed., Mack Publishing Company, Easton, PA, 1995).

본 발명의 약학적 조성물은 인간을 비롯한 포유동물에 어떠한 방법으로도 투여할 수 있다. 예를 들어, 경구 또는 비경구로 투여할 수 있으며, 비경구적인 투여방법으로는 이에 제한되는 것은 아니나, 정맥내, 근육내, 동맥내, 골수내, 경막내, 심장내, 경피, 피하, 복강내, 비강내, 장관, 국소, 설하 또는 직장내 투여일 수 있다.

본 발명의 약학적 조성물은 상술한 바와 같은 투여 경로에 따라 경구 투여용 또는 비경구 투여용 제제로 제형화 할 수 있다. 제형화할 경우에는 하나 이상의 완충제(예를 들어, 식염수 또는 PBS), 항산화제, 정균제, 킬레이트화제(예를 들어, EDTA 또는 글루타치온), 충진제, 증량제, 결합제, 아쥬반트(예를 들어, 알루미늄 하이드록사이드), 현탁제, 농후제 습윤제, 붕해제 또는 계면활성제, 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제될 수 있다.

경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 액제, 겔제, 시럽제, 슬러리제, 현탁액 또는 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 본 발명의 약학적 조성물에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분(옥수수 전분, 밀 전분, 쌀 전분, 감자 전분 등 포함), 칼슘카보네이트(calcium carbonate), 수크로스(sucrose), 락토오스(lactose), 덱스트로오스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨 말티톨, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 나트륨 카르복시메틸셀룰로오즈 및 하이드록시프로필메틸-셀룰로즈 또는 젤라틴 등을 섞어 조제될 수 있다. 예컨대, 활성성분을 고체 부형제와 배합한 다음 이를 분쇄하고 적합한 보조제를 첨가한 후 과립 혼합물로 가공함으로써 정제 또는 당의정제를 수득할 수 있다.

단순한 부형제 이외에 마그네슘 스티레이트 탈크 같은 윤활제들도 사용된다. 경구를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제 또는 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순 희석제인 물 또는 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제 또는 보존제 등이 포함될 수 있다.

또한, 경우에 따라 가교결합 폴리비닐피롤리돈, 한천, 알긴산 또는 나트륨 알기네이트 등을 붕해제로 첨가할 수 있으며, 항응집제, 윤활제, 습윤제, 향료, 유화제 및 방부제 등을 추가로 포함할 수 있다.

비경구적으로 투여하는 경우 본 발명의 약학적 조성물은 적합한 비경구용 담체와 함께 주사제, 경피 투여제 및 비강 흡입제의 형태로 당 업계에 공지된 방법에 따라 제형화될 수 있다. 상기 주사제의 경우에는 반드시 멸균되어야 하며 박테리아 및 진균과 같은 미생물의 오염으로부터 보호되어야 한다. 주사제의 경우 적합한 담체의 예로는 이에 한정되지는 않으나, 물, 에탄올, 폴리올(예를 들어, 글리세롤, 프로필렌 글리콜 및 액체 폴리에틸렌 글리콜 등), 이들의 혼합물 및/또는 식물유를 포함하는 용매 또는 분산매질일 수 있다. 보다 바람직하게는, 적합한 담체로는 행크스 용액, 링거 용액, 트리에탄올 아민이 함유된 PBS (phosphate buffered saline) 또는 주사용 멸균수, 10% 에탄올, 40% 프로필렌 글리콜 및 5% 덱스트로즈와 같은 등장 용액 등을 사용할 수 있다. 상기 주사제를 미생물 오염으로부터 보호하기 위해서는 파라벤, 클로로부탄올, 페놀, 소르빈산, 티메로살 등과 같은 다양한 항균제 및 항진균제를 추가로 포함할 수 있다. 또한, 상기 주사제는 대부분의 경우 당 또는 나트륨 클로라이드와 같은 등장화제를 추가로 포함할 수 있다.

경피 투여제의 경우 연고제, 크림제, 로션제, 겔제, 외용액제, 파스타제, 리니멘트제, 에어롤제 등의 형태가 포함된다. 상기에서 ‘경피 투여’는 약학적 조성물을 국소적으로 피부에 도포하여 약학적 조성물에 함유된 유효한 양의 활성성분이 피부 내로 전달되는 것을 의미한다.

흡입 투여제의 경우, 본 발명의 성숙 수지상 세포 배양물과 적합한 추진제, 예를 들면, 디클로로플루오로메탄, 트리클로로플루오로메탄, 디클로로테트라플루오로에탄, 이산화탄소 또는 다른 적합한 기체를 사용하여, 가압 팩 또는 연무기로부터 에어로졸 스프레이 형태로 편리하게 전달할 수 있다. 가압 에어로졸의 경우, 투약 단위는 계량된 양을 전달하는 밸브를 제공하여 결정할 수 있다. 예를 들면, 흡입기 또는 취입기에 사용되는 젤라틴 캡슐 및 카트리지는 화합물, 및 락토즈 또는 전분과 같은 적합한 분말 기제의 분말 혼합물을 함유하도록 제형화할 수 있다. 비경구 투여용 제형은 모든 제약 화학에 일반적으로 공지된 처방서인 문헌(Remington's Pharmaceutical Science, 15th Edition, 1975. Mack Publishing Company, Easton, Pennsylvania 18042, Chapter 87: Blaug, Seymour)에 기재되어 있다.

본 발명에 따른 췌장암 예방 또는 치료용 약학적 조성물의 바람직한 투여량은 환자의 상태, 체중, 질병의 정도, 약물형태, 투여경로 및 기간에 따라 다르지만, 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있다. 그러나, 바람직한 효과를 위해서는 1일 0.0001 내지 2,000 mg/kg으로, 바람직하게는 0.001 내지 2,000 mg/kg으로 투여할 수 있다. 투여는 하루에 한 번 투여할 수도 있고, 수회 나누어서 투여할 수도 있다. 다만, 상기 투여량에 의해서 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다. 본 발명에 따른 약학적 조성물은 본 발명의 효과를 보이는 한 그 제형, 투여 경로 및 투여 방법에 특별히 제한되지 아니한다.

본 발명에 따른 췌장암 예방 또는 치료용 약학적 조성물은 쥐, 생쥐, 가축, 인간 등의 포유 동물에 다양한 경로로 투여할 수 있다. 투여의 모든 방식은 예를 들면, 경구, 직장 또는 정맥, 근육, 피하, 자궁 내 경막 또는 뇌혈관내(intracerebroventricular) 주사에 의해서 투여할 수 있다.

본 발명의 약학적 조성물은 단독으로, 또는 수술, 방사선 치료, 호르몬 치료, 화학 치료 또는 생물학적 반응조절제를 사용하는 방법들과 병용하여 사용할 수 있다.

본 명세서에서 '치료'란 치료되는 개체 또는 세포의 자연적 과정을 변경시키려는 임상적 시술을 의미하며, 임상적 병리의 예방을 위해서도 수행될 수 있다. 치료의 바람직한 효과는 질병의 발생 또는 재발 억제, 증상의 완화, 질병의 임의의 직접 또는 간접적인 병리학적 결과의 감소, 질병 진행 속도의 감소, 질병 상태의 개선, 호전, 완화 또는 개선된 예후 등을 포함한다. 또한 용어 '예방'은 질병의 발병을 억제시키거나 진행을 지연시키는 모든 행위를 의미한다.

본 명세서에서 용어 ‘~을 포함하는(comprising)’이란 ‘함유하는(including)’또는 ‘특징으로 하는(characterized by)’과 동일한 의미로 사용되며, 본 발명에 따른 조성물 또는 방법에 있어서, 구체적으로 언급되지 않은 추가적인 구성 성분 또는 방법의 단계 등을 배제하지 않는다. 또한 용어 ‘로 구성되는(consisting of)’이란 별도로 기재되지 않은 추가적인 요소, 단계 또는 성분 등을 제외하는 것을 의미한다. 용어 ‘필수적으로 구성되는(essentially consisting of)’이란, 조성물 또는 방법의 범위에 있어서, 기재된 물질 또는 단계와 더불어 이의 기본적인 특성에 실질적으로 영향을 미치지 않는 물질 또는 단계 등을 포함할 수 있는 것을 의미한다.

따라서, 본 발명은 EMT-MET 가소성을 이용하여 E-cadherin의 발현을 유도한 후, 파랍토시스-세포죽음(paraptosis-like cell death)을 유도한 췌장암 세포 배양물 또는 이로부터 추출한 엑소좀이 미성숙 수지상 세포의 성숙을 유도하며, 성숙한 수지상 세포가 췌장암에 대하여 백신 활성을 가짐을 확인한 것으로, 본 발명에 따른 세포사멸을 유도한 췌장암 세포 배양물을 처리하여 제조한 성숙 수지상 세포는 접종시 췌장암의 성장을 억제시키는 2차 면역 효과가 있으므로, 췌장암 치료용 백신으로 사용할 수 있다.

도 1은 췌장암 세포주에 Meridianin C를 농도별로 처리한 결과로, 도 1 중 (A)는 농도에 따른 암세포의 파랍토시스 유도 정도를 확인한 결과이고, 도 1 중 (B)는 농도에 따른 암세포의 활성도를 확인한 결과이다.
도 2는 스페로이드 배양을 통해 EMT-MET 가소성이 유도된 것을 확인한 결과로, 도 2 중 (A)는 췌장암 줄기세포의 평면 배양과 스페로이드 배양에서 줄기세포 마커의 발현 레벨을 비교한 결과이고, 도 2 중 (B)는 EMT-MET 가소성이 유도된 췌장암 줄기세포에서 E-cadherin이 발현되는 시점(웨스턴 블랏 결과의 농도밀도를 측정하여 바 그래프로 정량적으로 표현함)을 확인한 결과이며, 도 2 중 (C)는 파랍토시스가 유도된 췌장암 줄기세포로부터 수득한 엑소좀 분획에 엑소좀 포함 여부를 확인한 결과이다.
도 3은 Meridianin C에 의해 파랍토시스-세포사멸이 유도된 췌장암 줄기세포 추출액(M-TDE)를 처리하였을 때 미성숙한 수지상 세포의 성숙이 유도됨을 확인한 결과로, 도 3 중 (A)는 주조직적합성복합체Ⅱ(major histocompatibility complex Ⅱ, MHC Class Ⅱ)의 발현을 확인한 결과이고, 도 3 중 (B)는 CD86의 발현을 확인한 결과이다.
도 4는 파랍토시스-세포사멸(paraptosis-like cell death)이 유도된 췌장암 줄기 세포 추출액(M-TDE)를 처리하여 제조한 성숙 수지상 세포의 암백신 효과를 확인한 결과로, 도 4 중 (A)는 암을 발생시킨 동물 모델에 Meridianin C를 처리하여 파랍토시스- 세포죽음이 유도된 췌장암 줄기세포를 주입한 후, 암의 성장을 확인한 결과이고, 도 4 중 (B)는 파랍토시스-세포죽음이 유도된 췌장암 줄기세포를 이용하여 제조한 성숙 수지상 세포의 암백신 효과를 2 종류의 췌장암 줄기세포에서 확인한 결과이며, 도 4 중 (C)는 파랍토시스-세포사멸이 유도된 췌장암 줄기세포 배양물로부터 수득한 엑소좀을 처리한 성숙 수지상 세포의 암백신 효과를 2 종류의 췌장암 줄기세포에서 확인한 결과이다.

이하 본 발명을 상세히 설명한다.

단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.

<실험 방법>

세포 배양

췌장암 세포인 Panc-1, MiaPaCa-2 세포주 (한국세포주은행 구매)를 10 % 소태아 혈청(Thermo, Rockville, MD, USA)이 보충된 RPMI 1640에서 배양하였다. 분리된 세포를 15 L 튜브에 수확하고 13,000 rpm으로 3 분간 원심 분리하였다. 그 후 상등액을 제거하고, 새로운 배양 배지에 재 현탁시켰다. 재차 현탁된 세포를 2차원 (2D) 단층 배양을 위해 6-웰 플레이트로, 또는 초 저부착 표면 96-웰 둥근 바닥 플레이트에 도말하였다. 이어서, 1,800 rpm에서 3 분간 원심 분리하여 3 차원(3D) 회전 타원체(spheroid) 배양을 형성시켰다. 이를 3일간 37℃ 인큐베이터에서 배양하였다.

췌장암 줄기세포 배양물 제조

상기와 같이 3D 회전 타원체 배양시킨 MiaPaCa-2 또는 Panc-1에 있어서, EMT-MET 가소성에 의해 줄기세포 마커 CD133과 암전이 억제단백인 E-카데린(E-cadherin)이 발현된 것을 확인한 후, 40μM의 Meridianin C를 24시간 처리하여 파랍토시스를 유도하여 암을 면역학적으로 사멸상태로 만들었다. 그런 후, 4 일째에 MiaPaCa-2 줄기 세포와 배지 전부를 수득하여 초음파 처리(sonication)한 후 1500rpm에서 10분간 원심 분리하여 얻어진 상층액을 수지상 세포 성숙 유도를 위한 췌장암 줄기세포 배양물로 사용하였다. 더불어 비교군으로 복합 스페로이드 배양 MiaPaCa-2 줄기세포주를 액체 질소(liquid nitrogen, -180℃)와 배양기(incubator, 37℃)에서 5회의 동결-해동(freezing-thawing) 과정을 거친 후 1500rpm에서 10분간 원심 분리하여 얻어진 상층액을 수지상 세포 성숙 유도를 위한 췌장암 줄기세포 배양물을 제조하였다.

엑소좀 추출

상기와 같이 제조한 3D 회전 타원체 배양시킨 MiaPaCa-2 세포 배양물로부터 엑소좀을 추출하였다. 먼저 세포 및 배양액을 튜브에 모은 후, 300xg의 속도로 10분간 원심분리하였다. 이를 통해 수득한 상등액을 50ml 원심분리 튜브에 옮기고 2000xg의 속도로 4℃에서 20 분간 원심분리하였다.

분리된 상등액을 수득하여 초원심분리 로터에 적합한 폴리 알로머 튜브 또는 폴리 카보네이트 병으로 옮긴 후, 10,000 xg의 속도로 4 ℃에서 30 분간 원심분리하고, 펠렛을 수득하였다. (이때, 스윙-버킷 로터의 경우, 펠렛은 튜브의 바닥에 있다. 고정 각도 로터의 경우 펠렛은 튜브의 바닥 근처에서 위를 향한 튜브 측면에 있다.).

그런 후, 100,000 xg의 속도로, 4 ℃에서 최소 70 분간 원심 분리한 후, 상등액을 완전히 제거하였다.

그런 후 1 mL 인산염완충식염수(phosphate buffer saline, PBS)의 각 튜브에 펠렛을 재부유시켰다. 모든 튜브로부터 재부유된 펠렛을 모은 후 이에 PBS를 넣어 튜브를 완전히 채우고 100,000 xg, 4 ℃에서 70분간 원심 분리하였다. 그 후 모든 상등액을 제거하였다. 상등액을 제거하여 수득한 펠렛(엑소좀)을 재부유하거나, 농축하여 사용하였다.

재부유하는 경우, 50 내지 100μl의 PBS 또는 TBS를 첨가하여 재부유시켰다.

엑소좀을 농축하는 경우, TLA-100.3 로터와 상응하는 두꺼운 벽의 폴리 카보네이트 튜브를 사용하여 탁상형 초원심 분리기에서 상기에서 수득한 상등액을 100,000 xg의 속도로, 4℃에서 1 시간 동안 원심 분리하였다. 눈에 보이는 펠렛 위 PBS 대부분을 제거하고 20 내지 50 μl의 신선한 PBS에 엑소좀을 재부유시켰다.

수지상 세포의 Ex vivo 배양

암컷 순계인 C57BL/6 mice(5-6 주령)(센타코에서 구입)의 대퇴골을 제거하고 내독소가 없는 PBS(phosphate buffer saline)로 세척하였다. 세척 후, 적혈구(Red blood cell, RBC) 용해 버퍼로 혈액 또는 불순물 등을 제거하여, 골수 수지상 세포를 수득하였다. 골수 세포에서 분리된 미성숙 수지상 세포(immature dendritic cells(DC))만 분리하고 1×10⁶/ml의 세포에 GM-CSF와 IL-4(각 100ng/ml)를 넣고 6일간 배양하였다. 배양 3일째에 덱사메타손(Dexamethasone) 1uM, 비타민 D3(Vit D3) 10nM를 처리하였다. 또한 6일째에 상기에서 제조한 각각의 췌장암 줄기세포 배양물 또는 엑소좀 50ug/ml을 넣고 24시간 더 배양하였고, 배양 7일째에 모두 수확하였다. 또한, 양성 대조군으로, 골수 수지상 세포에 500ng/ml의 LPS(lipopolysaccharide)를 투여하였다. 그런 후, 각각의 골수 수지상 세포를 4℃에서 30분 내지 60분 동안 PBS로 배양하여 분리하였고, 세포 스크레이퍼를 사용하여 미분화된 수지상 세포를 제거하였다. 이를 주사용 생리식염수에 부유시킨 후(1×10⁶/200ul/mouse) 2시간 이내에 생쥐 피하로 투여하였다.

웨스턴블랏

상기에서 제조한 파랍토시스를 유도한 MiaPaCa-2 세포 배양물을 용해한 후 이를 로딩 완충액과 혼합하고 SDS-PAGE로 분리하였다. 이어서 단백질을 니트로 셀룰로오스막(nitrocellulose membrane)으로 옮겼다. 막 상에 비특이적 결합 부위는 실온에서 90분 동안 5 % 비지방 분유(skim milk)를 사용하여 차단하였다. 막을 섭씨 4℃에서 1차 항체인 E-cadherin, Wnt10a, CD63 또는 CD133(Cell Signaling Technology 구매)와 함께 항온 배양한 후, 실온에서 1 시간 동안 2차 항체(Cell Signaling Technology 구매)를 처리하였다. 막밴드에 있는 단백질 밴드는 Santa Cruz Biotechnology Inc. 의 ECL Plus Blotting Detection System을 사용하여 시각화하였다.

<실시예 1> Meridianin C의 파랍토시스-세포사멸 유도 효과 확인

1μM, 2μM, 5μM, 10μM 또는 20μM의 Meridianin C을 MiaPaCa-2 세포주에 투여하여, 농도에 따른 세포의 변화를 확인하였다.

그 결과 도 1과 같이, Meridianin C는 농도의존적으로 MiaPaCa-2 세포주의 파랍토시스를 유도하였고, 세포의 활성도는 5μM Meridianin C를 처리하였을 때부터 저하되기 시작해 10μM 또는 20μM의 Meridianin C를 처리하였을 때 확연히 저하된 것을 확인하였다.

<실시예 2> 3D 회전 타원체 배양시킨 MiaPaCa-2 세포주의 EMT-MET 가소성 유도 여부 확인

3D 회전 타원체 배양시킨 MiaPaCa-2에 Meridianin C를 처리한 세포 배양물과 대조군인 2차 평면배양된 MiaPaCa-2에 Meridianin C를 처리한 세포 배양물의 줄기세포 마커 CD133과 엑소좀에 대한 마커 CD 63의 발현 레벨을 비교하였고, 3D 회전 타원체 배양을 시킨 MiaPaCa-2 세포 배양물에서 E-cadherin이 발현되는 시점을 확인하였다.

먼저 도 2 중 A와 같이, 3D 회전 타원체 배양시킨 MiaPaCa-2에서 줄기세포 마커인 CD133의 발현이 뚜렷이 증가한 것을 확인하였다.

그 결과 도 2 중 B와 같이, 3D 회전 타원체 배양시킨 MiaPaCa-2 세포 배양물(CSC)에서 E-cadherin 발현이 3일에 최대치를 보인 후 5일에 감소하면서 사라지는 것을 관찰하였다. E-cadherin이 발현되지 않는다고 보고된 MiaPaCa-2 세포에서 E-cadherin를 발현시킨 결과는 세계 최초로 확인된 것이다. 더불어, 상기 <실험방법>에서 추출한 3D 회전 타원체 배양시킨 MiaPaCa-2 분획과 2차 평면배양된 MiaPaCa-2 분획의 엑소좀 포함 정도를 비교하기 위해, 엑소좀 선별 마커로 알려진 CD63의 발현을 확인한 결과 도 2 중 C와 같이, CSC에서 CD63의 현저한 발현을 확인하였다.

<실시예 3> 세포사멸이 유도된 췌장암 세포 배양물의 수지상 세포 성숙 유도 효과 확인

3일 동안 배양한 마우스의 미성숙 수지상 세포를 3D 회전 타원체 배양시킨 MiaPaCa-2에 Meridianin C(40μM)를 처리한 세포 추출물(0.9 cells×ml)(M-TDE)에 18시간동안 노출시켰다. 그런 후, 얼음 상에서 수지상 세포에 성숙 수지상 세포 마커인 CD86 및 MHC 클래스 Ⅱ(Biosciences(San Diego, CA))를 1시간 동안 처리하여 염색하였다. 그런 후, 유동세포계측기(Facscalibur (Becton-Dickinson))로 성숙 수지상세포의 발현도를 확인하였다. 그 결과 도 3과 같이, 세포사멸이 유도된 췌장암 세포에 노출된 수지상 세포의 경우 CD86 및 MHC 클래스 Ⅱ가 대조군보다 더 발현된 것을 확인할 수 있었으며, 전체적으로 95% 이상의 세포가 성숙 수지상세포로 유도됨을 확인할 수 있었다. 따라서 파랍토시스에 의해 세포사멸이 유도된 췌장암 세포는 미성숙 수지상 세포의 성숙을 유도하는 효과가 있음을 확인하였다.

<실시예 4> 세포사멸이 유도된 췌장암 세포가 수지상 세포의 특이적 면역을 유도함을 확인

누드 마우스에 MiaPaCa-2 세포주 또는 Panc-1 세포주를 피하주입한 후 24시간 후부터 3D 회전 타원체 배양시킨 후, 파라톱시스를 유도한 MiaPaCa-2 암 줄기세포 배양물과 비교군으로 누드 마우스에 MiaPaCa-2 세포주를 피하주입한 후 24시간 후부터 복합 3D 회전 타원체 배양시킨 MiaPaCa-2 암 줄기세포 배양물이 처리된 수지상 세포(CSC-DC)를 일주일 간격으로 2 회 피하주사하여 백신 접종을 하였다. 그 후 종양 성장을 모니터한 결과 도 4 중 (A)와 같이, 대조군(Naive)의 경우 종양성장(N=8)을 보인 반면, 3D 회전 타원체 배양시킨 후, 파라톱시스가 유도된 MiaPaCa-2 세포(Meridianin C)를 투여한 경우에는 종양성장없음(N=8)을 보였다. 또한 MiaPaCa-2 및 Panc-1 암 세포주를 피하주사하여 형성시킨 종양에서의 본 발명에 따른 수지상 세포 백신의 효과를 확인한 결과 도 4 중 (B)와 같이, 대조군(Naive)의 경우 종양성장(N=3)을 보였고, 선행기술과의 비교를 위해 대조군으로 복합 3D 회전 타원체 배양시킨 MiaPaCa-2 암줄기세포 배양물이 처리된 수지상 세포를 투여한 MiaPaCa-2 세포 (MM-CSC-DC)는 성장이 억제되는 것을 보였다. 반면, 파라톱시스가 유도된 3D 회전 타원체 배양시킨 MiaPaCa-2 세포 배양물이 처리된 수지상 세포를 투여한 경우에는(MiaPaCa-2 암 세포주를 피하주사한 후에 주사한 경우(MM-CSC^E-cad-DC), Panc-1 암 세포주를 피하주사한 후에 주사한 경우(PM-CSC^E-cad-DC)), 두 실험군 모두 종양성장없음(N=8)을 보였다. 또한 도 4 중 (C)와 같이, MiaPaCa-2 및 Panc-1 암 세포주를 피하주입한 후 상기 <실험방법>에서 제조한 대조군(Naive)의 경우 종양성장(N=3)을 보였고, 복합 3D 회전 타원체 배양시킨 MiaPaCa-2 암줄기세포 배양물 유래 엑소좀이 처리된 수지상 세포를 투여한 MiaPaCa-2 세포(MM-CSC-DCE)는 성장이 억제되는 것을 보여주었다. 반면에, 3D 회전 타원체 배양시킨 후, 파라톱시스를 유도한 MiaPaCa-2 암줄기세포 배양물 유래 엑소좀이 처리된 수지상 세포를 투여한 경우와 MiaPaCa-2 암 세포주를 피하주사 후에 주사한 경우(MM-CSC^E-cad-DCE) 및 Panc-1 암 세포주를 피하주사후에 주사한 경우(PM-CSC^E-cad-DCE) 모두 종양성장없음(N=8)을 보였다.

전술한 본 발명의 설명은 예시를 위한 것이며, 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 지식을 가진 자는 본 발명의 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 쉽게 변형이 가능하다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적이 아닌 것으로 이해해야만 한다.

이상 살펴본 바와 같이, 본 발명은 EMT-MET 가소성을 이용하여 E-cadherin의 발현을 유도한 후, 파랍토시스-세포사(paraptosis-like cell death)를 유도한 췌장암 세포 배양물 또는 이로부터 추출된 엑소좀이 미성숙 수지상 세포의 성숙을 유도하는 것을 확인하고, 이의 백신 효과를 확인한 것으로, 본 발명에 따른 세포사멸을 유도한 췌장암 세포 배양물 또는 이로부터 추출한 엑소좀을 처리하여 제조한 성숙 수지상 세포는 접종시 종양의 성장을 억제하는, 2차 면역반응을 보였다. 따라서 상기 성숙 수지상 세포는 암, 특히 췌장암 치료용 백신 조성물로 유용하게 이용될 수 있다.

Claims

다음의 단계를 포함하는 성숙 수지상 세포의 제조 방법:
(a) 췌장암 줄기세포를 원심분리하여 3차원 회전 타원체 배양을 형성하는 단계;
(b) 상기 3차원 회전 타원체 배양한 췌장암 줄기세포에 파랍토시스(paraptosis)를 유도하는 단계;
(c) 상기 파랍토시스가 유도된 췌장암 줄기세포 및 배지로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상을 포함하는 세포 배양물을 수득하는 단계; 및
(d) GM-CSF를 포함하는 배지에 상기 세포 배양물을 첨가하고 미성숙 수지상 세포를 배양하여 성숙 수지상 세포로 분화 유도하는 단계.
제1항에 있어서,
상기 췌장암 줄기세포는 MiaPaCa-2인 것을 특징으로 하는 성숙 수지상 세포의 제조 방법.
제1항에 있어서,
상기 파랍토시스(paraptosis)는 췌장암 줄기세포에 메리디아닌 C(Meridianin C)를 처리하여 유도한 것을 특징으로 하는, 성숙 수지상 세포의 제조 방법.
제1항에 있어서,
상기 3차원 회전 타원체 배양한 췌장암 줄기세포는 상피간엽이행(Epithelial to Mesenchymal Transition, EMT) 및/또는 간엽상피전환(Mesenchymal-epithelial transition, MET) 가소성이 유도된 것을 특징으로 하는, 성숙 수지상 세포의 제조 방법.
제1항에 있어서,
상기 3차원 회전 타원체 배양한 췌장암 줄기세포는 EMT가 유도된 것을 특징으로 하는, 성숙 수지상 세포의 제조 방법.
제1항에 있어서,
상기 3차원 회전 타원체 배양한 췌장암 줄기세포는 MET가 유도된 것을 특징으로 하는, 성숙 수지상 세포의 제조 방법.
제1항에 있어서,
상기 3차원 회전 타원체 배양한 췌장암 줄기세포는 E-카데린(E-cadherin)이 발현되는 것을 특징으로 하는, 성숙 수지상 세포의 제조 방법.
제1항에 있어서,
상기 (b)단계 내지 (d)단계의 췌장암 줄기세포 배양물은 종양 면역원성 엑소좀을 포함하는 것을 특징으로 하는, 성숙 수지상 세포의 제조 방법.
제1항에 있어서,
상기 미성숙 수지상 세포는 단핵구 또는 조혈모세포로부터 유래한 것을 특징으로 하는, 성숙 수지상 세포의 제조 방법.
제9항에 있어서,
상기 단핵구 또는 조혈모세포는 골수, 말초혈액 또는 제대혈로부터 유래한 것을 특징으로 하는, 성숙 수지상 세포의 제조 방법.
제1항 내지 제10항 중 어느 한 항의 방법으로 제조한 성숙 수지상 세포.
다음의 단계를 포함하는 수지상 세포 백신의 제조 방법:
(a) 췌장암 줄기세포를 원심분리하여 3차원 회전 타원체 배양을 형성하는 단계;
(b) 상기 3차원 회전 타원체 배양한 췌장암 줄기세포에 파랍토시스(paraptosis)를 유도하는 단계;
(c) 상기 파랍토시스가 유도된 췌장암 줄기세포, 배지 또는 세포 및 배지로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나를 포함하는 세포 배양물을 수득하는 단계;
(d) GM-CSF를 포함하는 배지에 상기 세포 배양물을 첨가하고 미성숙 수지상 세포를 배양하여 성숙 수지상 세포로 분화 유도하는 단계; 및
(e) 분화되지 않은 미성숙 수지상 세포를 제거하여 성숙 수지상 세포로 이루어진 조성물을 수득하는 단계.
제12항에 있어서,
상기 파랍토시스(paraptosis)는 췌장암 줄기세포에 메리디아닌 C(Meridianin C)를 처리하여 유도한 것을 특징으로 하는, 수지상 세포 백신의 제조 방법.
제12항에 있어서,
상기 3차원 회전 타원체 배양한 췌장암 줄기세포는 상피간엽이행(Epithelial to Mesenchymal Transition, EMT) 및/또는 간엽상피전환(Mesenchymal-epithelial transition, MET) 가소성이 유도된 것을 특징으로 하는, 수지상 세포 백신의 제조 방법.
제12항에 있어서,
상기 3차원 회전 타원체 배양한 췌장암 줄기세포는 EMT가 유도된 것을 특징으로 하는, 성숙 수지상 세포의 제조 방법.
제12항에 있어서,
상기 3차원 회전 타원체 배양한 췌장암 줄기세포는 MET가 유도된 것을 특징으로 하는, 성숙 수지상 세포의 제조 방법.
제12항에 있어서,
상기 (b)단계 내지 (d)단계의 췌장암 줄기세포 배양물은 종양 면역원성 엑소좀을 포함하는 것을 특징으로 하는, 수지상 세포 백신의 제조 방법.
제12항 내지 제17항 중 어느 한 항의 방법에 따라 제조된 수지상 세포 백신.
제18항에 있어서,
상기 수지상 세포 백신은 췌장암 치료용 백신인 것을 특징으로 하는 수지상 세포 백신.
제1항 내지 제10항 중 어느 한 항의 방법으로 제조한 성숙 수지상 세포를 유효성분으로 포함하는 췌장암 예방 또는 치료용 약학적 조성물.