CN113925960B - 一种预防或治疗i型糖尿病的疫苗系统及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种预防或治疗I型糖尿病的疫苗系统，利用递送粒子递送含有与I型糖尿病相关抗原的细胞或组织中的全细胞的水溶性组分和/或非水溶性组分。本发明利用全细胞组分中自身抗原产生的免疫耐受即可用于I型糖尿病的预防和治疗，是用于制备I型糖尿病相关的疫苗或药物的有力备选。

Description

一种预防或治疗I型糖尿病的疫苗系统及其制备方法
技术领域
本发明涉及免疫治疗技术领域，尤其涉及一种预防或治疗I型糖尿病的疫苗系统及其制备方法。
背景技术
免疫是人体的一种生理功能，人体依靠这种功能识别“自己”和“非己”成分，从而破坏和排斥进入人体的抗原物质(如病毒和细菌等)，或人体本身所产生的损伤细胞和肿瘤细胞等，以维持人体的健康。近些年来免疫技术的发展极其迅速，尤其是癌症的免疫治疗领域。但是对自身免疫性疾病尤其是I型糖尿病的治疗手段还相对匮乏。
I型糖尿病是最常见的自身免疫性疾病之一，患者一般发病年龄比较年轻，一旦发病就需要终生使用胰岛素。I型糖尿病的发病是由胰岛β细胞相关抗原特异性T细胞异常识别和攻击胰腺部位的β细胞导致的。因为β细胞是人体内生产胰岛素的细胞，而胰岛素是调节机体血糖的最重要的成分，所以一旦β细胞被机体免疫细胞攻击杀死后，机体便无法生产足够多的胰岛素控制自身血糖。所以β细胞相关抗原特异性T细胞是I型糖尿病发生发展的关键性因素。如果能诱导产生针对β细胞相关抗原的免疫耐受，那么机体就不会异常识别和攻击胰腺β细胞了，从而实现I型糖尿病的预防和治疗。
在I型糖尿病中，Insulin(胰岛素)、谷氨酸脱羧酶65KD异构体(GAD65)、胰岛素瘤结合蛋白-2(IA-2)和锌转运子8(ZnT8)等很多种抗原在I型糖尿病的发病中扮演重要角色。正是这些自身抗原引起的抗原特异性T细胞攻击杀灭胰岛β细胞才导致的I型糖尿病。但是这些抗原种类繁多，而之前的I型糖尿病的预防疫苗都是采用某一种或某几种特定抗原，因而较难覆盖全面的抗原谱，所以就很难诱导机体对所有的抗原产生免疫耐受。而这些抗原都存在于胰岛β细胞中，因而胰岛β细胞是诱导产生免疫耐受的最佳抗原来源。但是由于这些抗原蛋白质中有的属于跨膜蛋白因而正常情况下不能溶于水，所以限制了以上述蛋白质为抗原制备可诱导免疫耐受的技术和产品。因此，仍需要一种覆盖抗原谱更全面的免疫产品。
发明内容
为解决上述技术问题，本发明提供了一种预防或治疗I型糖尿病的疫苗系统，利用细胞组分中这些自身抗原而产生的免疫耐受即可用于I型糖尿病的预防和治疗。
本发明的一种预防或治疗I型糖尿病的疫苗系统，包括递送粒子及其负载的细胞组分，细胞组分为含有与I型糖尿病相关抗原的细胞或组织中的全细胞的水溶性组分和/或非水溶性组分。
进一步地，含有与I型糖尿病相关抗原的细胞为β细胞。
进一步地，β细胞为胰腺β细胞、β细胞细胞系、由多能干细胞转化而来的β细胞或任何其他途径制备得到的β细胞。
进一步地，将含有与I型糖尿病相关抗原的细胞或组织在-20℃～-273℃下冷冻，加水或不含增溶剂的水溶液后反复冻融裂解细胞，上清液为水溶性组分，沉淀中经增溶后可溶的部分为非水溶性组分。
本发明中，水溶性组分为可溶于纯水或不含增溶剂的水溶液中的原水溶性部分；非水溶性组分为原非水溶性部分采用适当增溶方法由在纯水或不含增溶剂的水溶液中不溶变为在含增溶剂的水溶液或有机溶剂中可溶的部分。
本发明的疫苗系统可将细胞组分递送给相关免疫细胞，通过所装载的成分而激活和增强自身免疫系统对抗原的免疫耐受。本发明将含有与I型糖尿病相关抗原的细胞或含有此种细胞的组织裂解后，首先获取在纯水或不含增溶剂的水溶液中可溶的水溶性组分，而后采用含有增溶剂的增溶水溶液将非水溶性组分溶解于增溶液中，这样就可将所有的细胞组分都转变为可在水溶液中溶解的组分，并进而将其负载于纳米粒子或微米粒子内/外以制备纳米疫苗或微米疫苗。在实际应用中也可将细胞或组织裂解后直接采用含有增溶剂的增溶水溶液溶解全细胞组分而不分别收集水溶性组分和非水溶性组分，并采用增溶水溶液溶解后的全细胞组分制备纳米疫苗或微米疫苗。
进一步地，非水溶性组分经增溶后负载于递送粒子。细胞组分包括水溶性部分和非水溶性部分，即囊括了整个细胞的成分和组分，保证了绝大部分抗原物质被负载于所制备的疫苗系统中，从而提高疫苗系统的全面性和免疫原性。
进一步地，增溶所用的增溶剂选自尿素、盐酸胍、脱氧胆酸钠、十二烷基硫酸钠(SDS)、甘油、蛋白质降解酶、白蛋白、卵磷脂、0.1-2000mg/mL的无机盐、Triton、吐温、醋酸、胆固醇、氨基酸、糖苷、胆碱、BrijTM-35、八乙二醇单月桂醚(Octaethylene glycolmonododecyl ether)、3-[3-(胆酰胺丙基)二甲氨基]丙磺酸内盐(CHAPS)、洋地黄皂苷(Digitonin)、月桂基二甲胺氧化物(lauryldimethylamine oxide)、
Figure BDA0003239275410000031
CA-630、二甲基亚砜(DMSO)、乙腈、乙醇、甲醇、N,N-二甲基甲酰胺(DMF)、异丙醇、二氯甲烷、丙醇和乙酸乙酯中的一种或多种。
进一步地，递送粒子的内部和/或表面负载有抑制免疫的物质，如免疫抑制剂或可辅助引起免疫耐受的其他物质，可进一步增强疫苗系统的免疫原性和效果。具体地，免疫抑制佐剂可为微生物来源的免疫抑制剂、人或动物免疫系统的产物、mRNA、DNA、固有免疫抑制剂、适应性免疫激动剂、化学合成药物、真菌多糖类；糖皮质激素类药、钙调磷酸酶抑制药、抗代谢药、抗体、细胞因子、烷化剂、中药成分、植物药成分、矿物药成分等。优选为环孢素、雷帕霉素、他克莫司(Tacrolimus，FK506)、芬戈莫德、甲基强的松龙、雷公藤、霉酚酸酯、环磷酰胺、硫唑嘌呤、依维莫司、山地明、赛斯平、环孢多肽A、环孢灵(Cy-A、Cs-A)、新出地明(Neoral)、抗IL-2受体单克隆抗体、TGF-β、白介素、人参、黄芪的有效成分中的至少一种。
进一步地，疫苗系统的表面连接有主动靶向功能的靶头。
进一步地，靶头靶向树突状细胞、巨噬细胞、B细胞、T细胞、NK细胞、NKT细胞、中性粒细胞、嗜酸性粒细胞或嗜碱性粒细胞，这些细胞大多存在于淋巴结、胸腺、脾脏或骨髓中。
进一步地，水溶性组分和/或非水溶性组分负载于递送粒子的内部，和/或水溶性组分和/或非水溶性组分负载于递送粒子的表面。包括但不仅限于水溶性组分同时装载于递送粒子中和负载于递送粒子表面，非水溶性组分同时装载于递送粒子中和负载于递送粒子表面，水溶性组分装载于递送粒子中而非水溶性组分负载于递送粒子表面，非水溶性组分装载于递送粒子中而水溶性组分负载于递送粒子表面，水溶性组分和非水溶性组分装载于递送粒子中而只有非水溶性组分负载于递送粒子表面，水溶性组分和非水溶性组分装载于递送粒子中而只有水溶性组分负载于递送粒子表面，水溶性组分装载于递送粒子中而水溶性组分和非水溶性组分同时负载于递送粒子表面，非水溶性组分装载于递送粒子中而水溶性组分和非水溶性组分同时负载于递送粒子表面，水溶性组分和非水溶性组分同时装载于递送粒子中而且水溶性组分和非水溶性组分同时负载于递送粒子表面。本发明的疫苗系统的结构示意图如图2-28所示，在实际使用中可为其中一种或两种及以上的不同结构的纳米粒子或微米粒子。
进一步地，递送粒子为纳米级粒子和/或微米级粒子，由有机合成高分子材料、天然高分子材料或无机材料制备得到。有机合成高分子材料为聚乳酸-羟基乙酸共聚物PLGA、聚乳酸PLA、聚乙醇酸PGA、聚乙二醇PEG、聚己内酯PCL、泊洛沙姆Poloxamer、聚乙烯醇PVA、聚乙烯吡咯烷酮PVP、聚醚酰亚胺PEI、聚三亚甲基碳酸酯PTMC、聚酸酐、聚对二氧六环酮PDON、聚对二氧环己酮PPDO、聚甲基丙烯酸甲酯PMMA、聚氨基酸或多肽；天然高分子材料为卵磷脂、胆固醇、海藻酸钠、白蛋白、胶原蛋白、明胶、细胞膜(包括全细胞膜组分或部分细胞膜组分)、外泌体、淀粉或糖类；无机材料为三氧化二铁、四氧化三铁、碳酸钙或磷酸钙。
进一步地，纳米级粒子的粒径为1nm-1000nm，微米级粒子的粒径为1μm-1000μm。此粒径范围保证疫苗能被抗原提呈细胞吞噬，而为了提高吞噬效率，粒径大小要在适宜的范围内，优选地，纳米级粒子粒径大小为30nm-1000nm，最优选为100nm-600nm；优选地，微米级粒子粒径大小为1μm-10μm，最优选为1μm-5μm。
进一步地，递送粒子可不带电、带负电或带正电。
进一步地，递送粒子可按照已开发的制备方法制备，包括但不仅限于溶剂挥发法、透析法、挤出法和热熔法。在本发明的一些实施例中，递送粒子采用溶剂挥发法中的复乳法制备得到，具体步骤如下：
(1)将第一预定体积的含有第一预定浓度的水相溶液加入第二预定体积的含有第二预定浓度的有机相溶液中；
(2)将步骤(1)得到的混合液进行纳米化或微米化；
(3)将步骤(2)得到的混合物加入第三预定体积的含有第三预定浓度乳化剂水溶液中并进行纳米化或微米化；
(4)将步骤(3)得到的液体加入第四预定体积的第四预定浓度的乳化剂水溶液中，并进行搅拌直至满足预定搅拌条件；
(5)将步骤(4)得到的混合液离心或超滤后，取沉淀物或超滤产物并与水溶性组分或者溶于增溶剂中的原非水溶性组分混合后即得纳米疫苗或微米疫苗。
或在步骤(1)-(4)之后进行以下步骤S1-S3：
S1、在步骤(5)离心后，将沉淀物重悬于第五预定浓度的含有冻干保护剂的水溶液中或者PBS(或生理盐水)中；
S2、将S1得到的混悬液进行冷冻干燥处理后，将冻干物质备用；
S3、将S1中得到的混悬液或S2得到的冻干物质，与水溶性组分或者溶于增溶剂的原非水溶性组分混合后即得纳米疫苗或微米疫苗。
其中，
在步骤(1)中，水相溶液或有机相溶液中含有与I型糖尿病相关抗原的细胞裂解物中的各组分以及免疫佐剂，裂解物中的各组分为水溶性组分或溶于增溶剂中的原非水溶性组分。水相溶液所含有的来自细胞或组织的水溶性组分的浓度或者是来自细胞或组织的溶于增溶剂的原非水溶性组分的浓度，即第一预定浓度要求蛋白质多肽浓度大于1ng/mL，优选1mg/mL-100mg/mL。之所以选择这样的浓度，是发明人经大量试验发现，一般所用细胞裂解物水溶液浓度越大，制备的递送粒子负载的各类抗原越多，当蛋白质多肽浓度大于1ng/mL时，才能负载足够抗原以激活相关免疫反应。免疫佐剂在初始水相中的浓度为大于0.01pg/mL，优选0.01mg/mL-20mg/mL。
在步骤(1)中，将有机合成高分子材料、天然高分子材料或无机材料溶解于有机溶剂中，得到有机相溶液，其中，有机溶剂可选用DMSO、乙腈、乙醇、氯仿、甲醇、DMF、异丙醇、二氯甲烷、丙醇、乙酸乙酯等，优选二氯甲烷。第二预定浓度为0.5mg/mL-5000mg/mL，优选为100mg/mL。有机合成高分子材料优选为PLGA，其具有一定的免疫调节功能，适合作为疫苗制备时的辅料。
实际中，有机相溶液的第二预定体积根据其和水相溶液的第一预定体积的比例设定，进而调整制备的递送粒子大小。在本发明中，第一预定体积和第二预定体积之比为1:1.1-5000，优选为1:10。
在步骤(2)或(3)中，超声或者搅拌或者均质处理或者微流控进行纳米化或微米化，时间、速度、压力能控制制备的递送粒子大小。超声处理时，超声功率为50W～500W，时间大于0.1秒，比如2～200秒；搅拌为机械搅拌或者磁力搅拌时，搅拌速度大于50rpm，搅拌时间大于1分钟，比如搅拌速度为50rpm～1500rpm，搅拌时间为0.5小时～5小时；均质处理时使用高压/超高压均质机或高剪切均质机，压力大于20psi，使用高剪切均质机时转速大于1000rpm；微流控流速大于0.001mL/min。
在步骤(3)或(4)中，乳化剂水溶液为聚乙烯醇(PVA)水溶液，第三预定浓度大于1mg/mL，如1-100mg/mL。第三预定体积根据其与第二预定体积的比例进行调整。在本发明中，第二预定体积与第三预定体积之比为1:1.1-1000，优选为2:5。在具体实施过程中为了控制纳米粒子的尺寸，可以对两者之比进行调整。
在步骤(4)中，第四预定浓度大于0.01mg/mL，如0.01-100mg/mL。第三预定体积与第四预定体积之比为1:1.5-2000，优选为1:10。预定搅拌条件为直至有机溶剂挥发完成。
在步骤S1中，冻干保护剂优选为海藻糖。第五预定浓度为质量百分比1-15％，之所以如此设定，是为了在后续进行冷冻干燥中不影响冻干效果。
进一步地，疫苗系统的形状为球形、椭球形、桶形、多角形、棒状、片状、线形、蠕虫形、方形、三角形、蝶形或圆盘形。
本发明还要求保护上述疫苗系统在制备预防或治疗I型糖尿病的疫苗或药物中的应用。
本发明的疫苗系统诱导引发针对含有与I型糖尿病相关抗原的细胞所有组分的免疫耐受以后，机体不能再识别和主动攻击该细胞，从而达到预防和治疗I型糖尿病的效果。
借由上述方案，本发明至少具有以下优点：
本发明提供了一种利用纳米级或微米级的粒子递送细胞水溶性组分或非水溶性组分的疫苗系统，以及用于制备预防和治疗I型糖尿病的疫苗中的应用。通过将抗原组分递送到相关免疫细胞，就可以诱导产生免疫耐受，从而预防或缓解或治疗I型糖尿病。
上述说明仅是本发明技术方案的概述，为了能够更清楚了解本发明的技术手段，并可依照说明书的内容予以实施，以下以本发明的较佳实施例并配合详细附图说明如后。
附图说明
为了使本发明的内容更容易被清楚的理解，下面根据本发明的具体实施例并结合附图，对本发明作进一步详细的说明。
图1为本发明疫苗系统的制备过程示意图；a为水溶性组分和非水溶性组分分别收集和制备纳米疫苗或微米疫苗的示意图，b为采用含有增溶剂的增溶液溶解全细胞组分和制备纳米疫苗或微米疫苗的示意图；
图2-17为载有水溶性组分或非水溶性组分的纳米粒子或微米粒子的结构示意图；图2-5中纳米粒子或微米粒子表面和内部均含有免疫佐剂；图6-9中免疫佐剂只分布于纳米粒子或微米粒子的内部；图10-13中纳米粒子或微米粒子只在外表面含有免疫佐剂；图14-17纳米粒子或微米粒子内部和外表面均无免疫佐剂；图2，图6，图10和图14中纳米粒子或微米粒子所负载的细胞或组织组分中的水溶性组分或非水溶性组分分布于纳米粒子或微米粒子内部时未形成明显的内核；图3，图7，图11和图15中纳米粒子或微米粒子所负载的细胞或组织组分中的水溶性组分或非水溶性组分分布于纳米粒子或微米粒子内部时形成了一个内核部分，内核可为制备过程中生成或通过使用聚合物或无机盐等方式形成；图4，图8，图12和图16中纳米粒子或微米粒子所负载的细胞或组织组分中的水溶性组分或非水溶性组分分布于纳米粒子或微米粒子内部时形成了多个内核部分，内核可为制备过程中生成或通过使用聚合物或无机盐等方式形成；图5，图9，图13和图17中纳米粒子或微米粒子所包载的细胞或组织组分中的水溶性组分或非水溶性组分分布于纳米粒子或微米粒子内部时位于所形成内核的外层；a：纳米粒子或微米粒子内部包载和表面负载的均为细胞或组织组分中的水溶性组分；b：纳米粒子或微米粒子内部包载和表面负载的均为细胞或组织组分中的非水溶性组分；c：纳米粒子或微米粒子内部包载的为细胞或组织组分中的非水溶性组分而表面负载的均为细胞或组织组分中的水溶性组分；d：纳米粒子或微米粒子内部包载的为细胞或组织组分中的水溶性组分而表面负载的均为细胞或组织组分中的非水溶性组分；e：纳米粒子或微米粒子内部同时包载的细胞或组织组分中的水溶性组分和非水溶性组分，而纳米粒子或微米粒子表面也同时负载细胞或组织组分中的水溶性组分和非水溶性组分；f：纳米粒子或微米粒子内部同时包载的细胞或组织组分中的水溶性组分和非水溶性组分，而纳米粒子或微米粒子表面只负载细胞或组织组分中的水溶性组分；g：纳米粒子或微米粒子内部同时包载的细胞或组织组分中的水溶性组分和非水溶性组分，而纳米粒子或微米粒子表面只负载细胞或组织组分中的非水溶性组分；h：纳米粒子或微米粒子内部只包载的细胞或组织组分中的非水溶性组分，而纳米粒子或微米粒子表面同时负载细胞或组织组分中的水溶性组分和非水溶性组分；i：纳米粒子或微米粒子内部只包载的细胞或组织组分中的水溶性组分，而纳米粒子或微米粒子表面同时负载细胞或组织组分中的水溶性组分和非水溶性组分；
图18-28为主动靶向靶头修饰的载有水溶性或非水溶性细胞组分的纳米粒子或微米粒子的结构示意图；图18-图19中纳米粒子或微米粒子表面和内部均含有免疫佐剂；图20-图21中免疫佐剂只分布于纳米粒子或微米粒子的内部；图22-图23中纳米粒子或微米粒子只在外表面含有免疫佐剂；图24-图25纳米粒子或微米粒子内部和外表面均无免疫佐剂；图26细胞组分和/或免疫佐剂只分布于纳米粒子或微米粒子内部；图27细胞组分和/或免疫佐剂只分布于纳米粒子或微米粒子外部；图28细胞组分和免疫佐剂分别分布于纳米粒子或微米粒子内部或外部。在图18-25中，图18中2.a-2.i，图20中6.a-6.i，图22中10.a-10.i和图24中14.a-14.i纳米粒子或微米粒子所负载的细胞或组织组分中的水溶性组分或非水溶性组分分布于纳米粒子或微米粒子内部时未形成明显的内核；图19中3.a-3.i，图20中7.a-7.i，图22中11.a-11.i和图24中15.a-15.i中纳米粒子或微米粒子所负载的细胞或组织组分中的水溶性组分或非水溶性组分分布于纳米粒子或微米粒子内部的一个内核部分；图19中4.a-4.i，图21中8.a-8.i，图23中12.a-12.i和图25中16.a-16.i纳米粒子或微米粒子所负载的细胞或组织组分中的水溶性组分或非水溶性组分分布于纳米粒子或微米粒子内部的多个内核部分；图19中5.a-5.i，图21中9.a-9.i，图23中13.a-13.i和图25中17.a-17.i纳米粒子或微米粒子所包载的细胞或组织组分中的水溶性组分或非水溶性组分分布于纳米粒子或微米粒子内部所形成内核的外层；a：纳米粒子或微米粒子内部包载和表面负载的均为细胞或组织组分中的水溶性组分；b：纳米粒子或微米粒子内部包载和表面负载的均为细胞或组织组分中的非水溶性组分；c：纳米粒子或微米粒子内部包载的为细胞或组织组分中的非水溶性组分而表面负载的均为细胞或组织组分中的水溶性组分；d：纳米粒子或微米粒子内部包载的为细胞或组织组分中的水溶性组分而表面负载的均为细胞或组织组分中的非水溶性组分；e：纳米粒子或微米粒子内部同时包载的细胞或组织组分中的水溶性组分和非水溶性组分，而纳米粒子或微米粒子表面也同时负载细胞或组织组分中的水溶性组分和非水溶性组分；f:纳米粒子或微米粒子内部同时包载的细胞或组织组分中的水溶性组分和非水溶性组分，而纳米粒子或微米粒子表面只负载细胞或组织组分中的水溶性组分；g:纳米粒子或微米粒子内部同时包载的细胞或组织组分中的水溶性组分和非水溶性组分，而纳米粒子或微米粒子表面只负载细胞或组织组分中的非水溶性组分；h：纳米粒子或微米粒子内部只包载的细胞或组织组分中的非水溶性组分，而纳米粒子或微米粒子表面同时负载细胞或组织组分中的水溶性组分和非水溶性组分；i:纳米粒子或微米粒子内部只包载的细胞或组织组分中的水溶性组分，而纳米粒子或微米粒子表面同时负载细胞或组织组分中的水溶性组分和非水溶性组分；在图26-28中，a,b和c中纳米粒子或微米粒子所负载的细胞或组织组分中的水溶性组分或非水溶性组分分布于纳米粒子或微米粒子内部时未形成明显的内核；d,e和f中纳米粒子或微米粒子所负载的细胞或组织组分中的水溶性组分或非水溶性组分分布于纳米粒子或微米粒子内部的一个内核部分；g，h和i中纳米粒子或微米粒子所负载的细胞或组织组分中的水溶性组分或非水溶性组分分布于纳米粒子或微米粒子内部的多个内核部分；j，k和l中纳米粒子或微米粒子所包载的细胞或组织组分中的水溶性组分或非水溶性组分分布于纳米粒子或微米粒子内部所形成内核的外层；a,d,g和j中纳米粒子或微米粒子负载的均为细胞或组织组分中的水溶性组分；b，e，h和k中纳米粒子或微米粒子负载的均为细胞或组织组分中的非水溶性组分；c，f，i和l中纳米粒子或微米粒子同时负载细胞或组织组分中的水溶性组分和非水溶性组分；
图29-37为实施例1-9中采用纳米疫苗或微米疫苗预防I型糖尿病的实验结果。
说明书附图标记说明：1、水溶性组分；2、非水溶性组分；3、免疫佐剂；4、递送粒子；5、递送粒子中的内核部分；6、靶头。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步说明，以使本领域的技术人员可以更好地理解本发明并能予以实施，但所举实施例不作为对本发明的限定。
实施例1β细胞全细胞组分负载于纳米疫苗内部和表面用于I型糖尿病的预防
本实施例以小鼠β细胞—NIT-1细胞来说明如何制备负载有β细胞全细胞组分的纳米疫苗，并应用该疫苗预防I型糖尿病。
NIT-1细胞为小鼠β细胞模型，可以用来作为胰岛β细胞、由干细胞等转化。首先裂解NIT-1细胞制备NIT-1细胞的水溶性组分和非水溶性组分。然后，以有机高分子材料PLGA为纳米粒骨架材料，以雷帕霉素为免疫佐剂采用溶剂挥发法制备负载有β细胞的水溶性组分和非水溶性组分的纳米疫苗。然后采用该纳米疫苗来预防I型糖尿病。
(1)在高糖培养基中培养NIT-1β细胞后，收集所培养的NIT-1β细胞，离心后去除培养基，用超纯水重悬NIT-1β细胞，然后采用-20℃到-273℃冷冻，加一定量超纯水后反复冻融3次以上，并可伴有超声以破坏裂解细胞。待细胞裂解后，将裂解物以大于100g的转速离心1分钟以上并取上清液即为NIT-1β细胞可溶于纯水的水溶性组分；在所得沉淀部分中加入8M尿素溶解沉淀部分即可将NIT-1β细胞中不溶于纯水的非水溶性组分转化为在8M尿素水溶液中可溶。上述所得来源于细胞裂解物的水溶性组分和溶解于8M尿素中的原非水溶性组分即为制备用于预防I型糖尿病的疫苗的抗原来源。
(2)本实施例中制备纳米疫苗及作为对照的空白纳米粒采用溶剂挥发法中的复乳法，所采用的纳米粒子制备材料PLGA分子量为24KDa-38KDa，所采用的免疫佐剂为雷帕霉素且雷帕霉素分布于纳米粒子内部，在制备时雷帕霉素与PLGA一同溶解于有机相中。制备方法如前所述。在纳米粒子表面吸附细胞组分后所得纳米疫苗平均粒径为300nm左右，纳米疫苗表面电位为-5mV左右。每1mg PLGA纳米粒子约负载180μg蛋白质或多肽组分，每1mgPLGA纳米疫苗内所使用的雷帕霉素免疫佐剂共约为0.05mg。空白纳米粒粒径为260nm左右，空白纳米粒制备时分别采用含有等量雷帕霉素的纯水或8M尿素代替相对应的水溶性组分和非水溶性组分。负载几种I型糖尿病抗原多肽的纳米粒制备方法与纳米疫苗相同，所负载的多肽为Insulin B 9-23,Insulin A 14-20,IGRP 206-214,和GAD 225-244，每1mg PLGA纳米粒子约负载200μg多肽组分和等量的雷帕霉素。
(3)本研究对照组分别是PBS组和空白纳米粒+细胞裂解物组。选取3周龄雌性NOD小鼠进行本实验。
在实验中，每组10只NOD小鼠。在疫苗组中，从第三周开始每隔7天皮下注射200μL内部和表面都负载β细胞裂解物中水溶性组分的2mg PLGA纳米疫苗和200μL内部和表面都负载溶于8M尿素中原非水溶性组分的2mg PLGA纳米疫苗，连续给6周。PBS对照组从第三周开始每隔7天皮下注射400μL PBS，连续给6周。空白纳米粒+细胞裂解物对照组从第三周开始每隔7天分别皮下注射β细胞裂解物中水溶性组分和溶于8M尿素中的原非水溶性组分、以及含有等量佐剂的4mg PLGA空白纳米粒，注意以上三者需分开给药并注射在不同皮下部位，以免游离的细胞裂解物吸附于空白纳米粒表面，连续注射6周。多肽纳米粒组第三周开始每隔7天分别皮下注射负载多种多肽的纳米粒，连续给药6周。各组小鼠从第8周开始每天记录小鼠血糖情况。以血糖高于11.0mmol·L-1为糖尿病开始发病。记录不同时间段NOD小鼠糖尿病发病情况。
(4)实验结果
NOD小鼠为I型糖尿病模型小鼠。有大约60％-85％的雌性NOD小鼠在未经预防处理的情况下会在22周后罹患I型糖尿病。从附图29可以看出，雌性NOD小鼠在注射PBS或空白纳米粒+细胞裂解物处理的情况在25周后有70％-80％患有糖尿病；负载多肽纳米粒处理组的小鼠在25周后有50％患有糖尿病。但是在采用疫苗进行预防的组内，在25周后只有约20％小鼠会患有I型糖尿病。综上所述，本发明所述的负载β细胞全细胞组分纳米疫苗对I型糖尿病具有良好预防效果，且预防效果优于只是负载几种多肽的纳米粒。
实施例2β细胞全细胞组分负载于微米疫苗内部和表面用于I型糖尿病的预防
(1)同实施例1。
(2)本实施例中制备微米疫苗及作为对照的空白微米粒采用溶剂挥发法中的复乳法，所采用的微米粒子制备材料PLGA分子量为24KDa-38KDa，所采用的免疫佐剂为雷帕霉素且雷帕霉素分布于微米粒子内部，在制备时雷帕霉素与PLGA一同溶解于有机相中。制备方法如前所述。在纳米粒子表面吸附细胞组分后所得微米疫苗平均粒径为1.5μm左右，微米疫苗表面电位为-6mV左右。每1mg PLGA微米疫苗约负载200μg蛋白质或多肽组分，每1mgPLGA微米疫苗内外所使用的雷帕霉素免疫佐剂共约为0.05mg。空白微米粒子粒径为1.3μm左右，空白微米粒制备时分别采用含有等量雷帕霉素的纯水或8M尿素代替相对应的水溶性组分和非水溶性组分。负载几种I型糖尿病抗原多肽的微米粒制备方法与纳米疫苗相同，所负载的多肽为Insulin B 9-23,Insulin A 14-20,IGRP 206-214,和GAD 225-244，每1mg PLGA微米粒子约负载200μg多肽组分和等量的雷帕霉素。
(3)将实施例1的纳米疫苗替换为本实施例的微米疫苗，其余同实施例1。
(4)实验结果
NOD小鼠为I型糖尿病模型小鼠。有大约60％-85％的雌性NOD小鼠在未经预防处理的情况下会在22周后罹患I型糖尿病。从附图30可以看出，雌性NOD小鼠在注射PBS或空白微米粒+细胞裂解物处理的情况在25周后有70％-80％患有糖尿病；负载多肽纳米粒处理组的小鼠在25周后有50％患有糖尿病。但是在采用疫苗进行预防的组内，在25周后只有约20％小鼠会患有I型糖尿病。综上所述，本发明所述的负载β细胞全细胞组分微米疫苗对I型糖尿病具有预防效果。
实施例3β细胞水溶性组分负载于纳米疫苗内部和表面用于I型糖尿病的预防
(1)在高糖培养基中培养NIT-1β细胞后，收集所培养的NIT-1β细胞，离心后去除培养基，用超纯水重悬NIT-1β细胞，然后采用-20℃到-273℃冷冻，加一定量超纯水后反复冻融3次以上，并可伴有超声以破坏裂解细胞。待细胞裂解后，将裂解物以大于100g的转速离心1分钟以上并取上清液即为NIT-1β细胞可溶于纯水的水溶性组分。上述所得来源于细胞裂解物的水溶性组分即为制备用于预防I型糖尿病的疫苗的抗原来源。
(2)本实施例中制备纳米疫苗及作为对照的空白纳米粒采用溶剂挥发法中的复乳法，所采用的纳米粒子制备材料PLGA分子量为24KDa-38KDa，所采用的免疫佐剂为雷帕霉素且雷帕霉素分布于纳米粒子内部，在制备时雷帕霉素与PLGA一同溶解于有机相中。制备方法如前所述。在纳米粒子表面吸附细胞组分后所得纳米疫苗平均粒径为300nm左右，纳米疫苗表面电位Zeta potential为-5mV左右。每1mg PLGA纳米粒子约负载180μg蛋白质或多肽组分，每1mgPLGA纳米疫苗内所使用的雷帕霉素免疫佐剂共约为0.05mg。空白纳米粒粒径为260nm左右，空白纳米粒制备时分别采用含有等量雷帕霉素的纯水代替相对应的水溶性组分。
(3)本研究对照组分别是PBS组和空白纳米粒+细胞裂解物组。选取3周龄雌性NOD小鼠进行本实验。
在实验中，每组10只NOD小鼠。在疫苗组中，从第三周开始每隔7天皮下注射200μL内部和表面都负载β细胞裂解物中水溶性组分的4mg PLGA纳米疫苗连续给6周。PBS对照组从第三周开始每隔7天皮下注射400μL PBS，连续给6周。空白纳米粒+细胞裂解物对照组从第三周开始每隔7天分别皮下注射β细胞裂解物中水溶性组分以及含有等量佐剂的4mgPLGA空白纳米粒，注意以上两者需分开给药并注射在不同皮下部位，以免游离的细胞裂解物吸附于空白纳米粒表面，连续注射6周。各组小鼠从第8周开始每天记录小鼠血糖情况。以血糖高于11.0mmol·L-1为糖尿病开始发病。记录不同时间段NOD小鼠糖尿病发病情况。
(4)实验结果
NOD小鼠为I型糖尿病模型小鼠。有大约60％-85％的雌性NOD小鼠在未经预防处理的情况下会在22周后罹患I型糖尿病。从附图31可以看出，雌性NOD小鼠在注射PBS或空白纳米粒+细胞裂解物处理的情况在25周后有70％-80％患有糖尿病。但是在采用疫苗进行预防的组内，在25周后只有约40％小鼠会患有I型糖尿病。综上所述，本发明所述的负载β细胞水溶性组分纳米疫苗对I型糖尿病具有预防效果。
实施例4β细胞全细胞组分负载于纳米疫苗内部和表面用于I型糖尿病的治疗
(1)同实施例1。
(2)同实施例1。
(3)本研究对照组分别是PBS组和空白纳米粒+细胞裂解物组。选取25周龄已经糖尿病发病的雌性NOD小鼠进行本实验。
在实验中，每组10只NOD小鼠。在疫苗组中，从第0天开始每隔3天皮下注射200μL内部和表面都负载β细胞裂解物中水溶性组分的2mg PLGA纳米疫苗和200μL内部和表面都负载溶于8M尿素中原非水溶性组分的2mg PLGA纳米疫苗，连续给6次。PBS对照组从第0天开始每隔3天皮下注射400μL PBS，连续给6次。空白纳米粒+细胞裂解物对照组从第0天开始每隔3天分别皮下注射β细胞裂解物中水溶性组分和溶于8M尿素中的原非水溶性组分、以及含有等量佐剂的4mg PLGA空白纳米粒，注意以上三者需分开给药并注射在不同皮下部位，以免游离的细胞裂解物吸附于空白纳米粒表面，连续注射6次。各组小鼠从每天记录小鼠血糖情况。以血糖高于11.0mmol·L-1为糖尿病发病，以血糖连续三天低于11.0mmol·L-1为糖尿病缓解治愈。记录不同时间段NOD小鼠糖尿病发病情况。
(4)实验结果
从附图32可以看出，雌性NOD小鼠发病小鼠在注射PBS或空白纳米粒+细胞裂解物处理后均继续患有糖尿病。但是在采用疫苗进行治疗处理后有约40％的小鼠I型糖尿病患者治愈。这是因为I型糖尿病小鼠发病后体内胰腺组织内仍保有一小部分可以继续分泌胰岛素的β细胞，一旦抗原特异性T细胞对β细胞的攻击停止，上述存留的β细胞可以继续扩增。而本发明所述的疫苗可以激活体内的免疫耐受，进而抑制抗原特异性T细胞对β细胞的攻击。这也就为I型糖尿病治愈提供了基础。综上所述，本发明所述的负载β细胞全细胞组分纳米疫苗对I型糖尿病具有治疗效果。
实施例5含有β细胞的组织全细胞组分负载于微米疫苗内部和表面用于I型糖尿病的预防
本实施例以小鼠胰腺组织来说明如何制备负载有β细胞的胰腺组织全细胞组分的微米疫苗，并应用该疫苗预防I型糖尿病。
胰腺部位含有小鼠β细胞，可以用来作为胰岛β细胞来源制备疫苗。首先摘取小鼠的胰腺组织后分别制备所得组织的全细胞的水溶性组分和非水溶性组分。然后，以有机高分子材料PLGA为纳米粒骨架材料，以编码TGF-β的mRNA为免疫佐剂采用溶剂挥发法制备负载有β细胞的水溶性组分和非水溶性组分的微米疫苗。然后采用该微米疫苗来预防I型糖尿病。
(1)将多只BALB/c小鼠牺牲后摘取小鼠的胰腺组织。将胰腺组织切块后研磨，通过细胞过滤网加入适量纯水并反复冻融和超声处理至少3次。待组织细胞裂解后，将组织的细胞裂解物以大于3000RPM的转速离心5min取上清液即为组织细胞中可溶于纯水的水溶性组分；在所得沉淀部分中加入8M尿素水溶液溶解沉淀部分即可将不溶于纯水的原非水溶性组分转化为在8M尿素水溶液中可溶。上述所得来源于组织的细胞裂解物的水溶性组分和溶解于8M尿素中的原非水溶性组分即为制备用于预防I型糖尿病的疫苗的抗原来源。
(2)本实施例中制备微米疫苗及作为对照的空白微米粒采用溶剂挥发法中的复乳法，所采用的微米粒子制备材料PLGA分子量为24KDa-38KDa，所采用的免疫佐剂为编码TGF-β的mRNA且编码TGF-β的mRNA分布于微米疫苗内部，在制备时mRNA溶解于水相中。制备方法如前所述。在微米疫苗表面吸附细胞组分后所得微米疫苗平均粒径为1.5μm左右，微米疫苗表面电位Zeta potential为-8mV左右。每1mg PLGA微米疫苗约负载200μg蛋白质或多肽组分，每1mgPLGA微米疫苗内外所使用的免疫佐剂共约为0.01mg。空白微米粒子粒径为1.3μm左右，空白微米粒制备时分别采用含有等量佐剂的纯水或8M尿素代替相对应的水溶性组分和非水溶性组分。
(3)本研究对照组分别是PBS组和空白微米粒+组织细胞裂解物组。选取3周龄雌性NOD小鼠进行本实验。
在实验中，每组10只NOD小鼠。在疫苗组中，从第三周开始每隔7天皮下注射200μL内部和表面都负载组织细胞裂解物中水溶性组分的2mg PLGA微米疫苗和200μL内部和表面都负载溶于8M尿素中原非水溶性组分的2mg PLGA微米疫苗，连续给6周。PBS对照组从第三周开始每隔7天皮下注射400μL PBS，连续给6周。空白微米粒+自主细胞裂解物对照组从第三周开始每隔7天分别皮下注射细胞裂解物中水溶性组分和溶于8M尿素中的原非水溶性组分、以及含有等量佐剂的4mg PLGA空白微米粒，注意以上三者需分开给药并注射在不同皮下部位，以免游离的细胞裂解物吸附于空白微米粒表面，连续注射6周。各组小鼠从第8周开始每天记录小鼠血糖情况。以血糖高于11.0mmol·L-1为糖尿病开始发病。记录不同时间段NOD小鼠糖尿病发病情况。
(4)实验结果
NOD小鼠为I型糖尿病模型小鼠。有大约60％-85％的雌性NOD小鼠在未经预防处理的情况下会在22周后罹患I型糖尿病。从附图33可以看出，雌性NOD小鼠在注射PBS或空白微米粒+细胞裂解物处理的情况在25周后有70％-80％患有糖尿病。但是在采用疫苗进行预防的组内，在25周后只有约30％小鼠会患有I型糖尿病。综上所述，本发明所述的负载β细胞全细胞组分微米疫苗对I型糖尿病具有预防效果。
实施例6经过刺激的β细胞全细胞组分负载于纳米疫苗内部和表面用于I型糖尿病的预防
本实施例以刺激后的小鼠β细胞—NIT-1细胞来说明如何制备负载有β细胞全细胞组分的纳米疫苗，并应用该疫苗预防I型糖尿病。β细胞在经过一定条件或某些物质刺激后会增加胰岛素颗粒等含有抗原物质的生产和分泌。所以本实施例在收集处理小鼠β细胞前对β细胞进行一定的刺激使其胞内含有的胰岛素颗粒等抗原含量增加，这样就增加了全细胞组分中抗原的含量和比例。
NIT-1细胞为小鼠β细胞模型，可以用来作为胰岛β细胞、由干细胞等转化。首先裂解NIT-1细胞制备NIT-1细胞的水溶性组分和非水溶性组分。然后，以有机高分子材料PLGA为纳米粒骨架材料，以雷帕霉素为免疫佐剂采用溶剂挥发法制备负载有β细胞的水溶性组分和非水溶性组分的纳米疫苗。然后采用该纳米疫苗来预防I型糖尿病。
(1)在高糖培养基中将葡萄糖含量增加一倍，并同时加入0.05μM/L毒胡萝卜素(Thapsigargin)至培养基中孵育培养NIT-1β细胞12小时。尔后，收集所培养的NIT-1β细胞，离心后去除培养基，用超纯水重悬NIT-1β细胞，然后采用-20℃到-273℃冷冻，加一定量超纯水后反复冻融3次以上，并可伴有超声以破坏裂解细胞。待细胞裂解后，将裂解物以大于100g的转速离心1分钟以上并取上清液即为NIT-1β细胞可溶于纯水的水溶性组分；在所得沉淀部分中加入8M尿素溶解沉淀部分即可将NIT-1β细胞中不溶于纯水的非水溶性组分转化为在8M尿素水溶液中可溶。上述所得来源于细胞裂解物的水溶性组分和溶解于8M尿素中的原非水溶性组分即为制备用于预防I型糖尿病的疫苗的抗原来源。
(2)本实施例中制备纳米疫苗及作为对照的空白纳米粒采用溶剂挥发法中的复乳法，所采用的纳米粒子制备材料PLGA分子量为24KDa-38KDa，所采用的免疫佐剂为雷帕霉素且雷帕霉素分布于纳米粒子内部，在制备时雷帕霉素与PLGA一同溶解于有机相中。制备方法如前所述。在纳米粒子表面吸附细胞组分后所得纳米疫苗平均粒径为300nm左右，纳米疫苗表面电位Zeta potential为-5mV左右。每1mg PLGA纳米粒子约负载180μg蛋白质或多肽组分，每1mgPLGA纳米疫苗内所使用的雷帕霉素免疫佐剂共约为0.05mg。空白纳米粒粒径为260nm左右，空白纳米粒制备时分别采用含有等量雷帕霉素的纯水或8M尿素代替相对应的水溶性组分和非水溶性组分。
(3)本研究对照组分别是PBS组和空白纳米粒+细胞裂解物组。选取3周龄雌性NOD小鼠进行本实验。
在实验中，每组10只NOD小鼠。在疫苗组中，从第三周开始每隔7天皮下注射200μL内部和表面都负载经过刺激的β细胞裂解物中水溶性组分的2mg PLGA纳米疫苗和200μL内部和表面都负载溶于8M尿素中原非水溶性组分的2mg PLGA纳米疫苗，连续给6周。PBS对照组从第三周开始每隔7天皮下注射400μL PBS，连续给6周。空白纳米粒+细胞裂解物对照组从第三周开始每隔7天分别皮下注射β细胞裂解物中水溶性组分和溶于8M尿素中的原非水溶性组分、以及含有等量佐剂的4mg PLGA空白纳米粒，注意以上三者需分开给药并注射在不同皮下部位，以免游离的细胞裂解物吸附于空白纳米粒表面，连续注射6周。各组小鼠从第8周开始每天记录小鼠血糖情况。以血糖高于11.0mmol·L-1为糖尿病开始发病。记录不同时间段NOD小鼠糖尿病发病情况。
(4)实验结果
NOD小鼠为I型糖尿病模型小鼠。有大约60％-85％的雌性NOD小鼠在未经预防处理的情况下会在22周后罹患I型糖尿病。从附图34可以看出，雌性NOD小鼠在注射PBS或空白纳米粒+细胞裂解物处理的情况在25周后有70％-80％患有糖尿病。但是在采用疫苗进行预防的组内，在25周后只有约10％小鼠患有I型糖尿病。综上所述，本发明所述的负载β细胞全细胞组分纳米疫苗对I型糖尿病具有预防效果。
实施例7 6M盐酸胍溶解β细胞和胰腺组织组分并负载于微米粒子内部和表面用于I型糖尿病的预防
本实施例以小鼠NIT-1β细胞和小鼠胰腺组织裂解后的混合物为抗原并采用6M盐酸胍溶解全细胞组分后，负载有全细胞组分的微米疫苗以预防I型糖尿病。首先对NIT-1β细胞和胰腺组织细胞进行灭活和变性处理并以6M盐酸胍裂解细胞和组织并溶解其全细胞组分。然后，以PLGA为微米粒子骨架材料，以雷帕霉素为免疫佐剂采用溶剂挥发法制备负载有β细胞和胰腺组织组分的微米疫苗。然后采用该微米疫苗来预防I型糖尿病。
(1)细胞和胰腺组织的收集方法同上。将所得β细胞和胰腺组织细胞分别采用紫外线和高温加热进行灭活和变性处理，然后采用适量6M盐酸胍裂解β细胞和胰腺组织细胞并溶解组织和细胞裂解物，将组织裂解物与细胞裂解物1:1混合后即为制备疫苗的原料来源。
(2)本实施例中微米疫苗及空白微米粒子采用分子量为38KD-54KD的PLGA(50:50)，制备方法如前所述。采用他克莫司(FK506)为免疫佐剂，在制备时他克莫司与PLGA一起溶解于有机相中。所制备微米疫苗平均粒径为2.5μm左右，微米粒子表面Zeta电位为-4mV。每1mg PLGA微米粒子内外负载蛋白质和多肽组分为200μg，每1mgPLGA纳米粒内外所使用的免疫佐剂共0.05mg。
(3)本研究对照组分别是PBS组和空白微米粒+细胞裂解物组。选取3周龄雌性NOD小鼠进行本实验。
在实验中，每组10只NOD小鼠。在疫苗组中，从第三周开始每隔7天皮下注射200μL内部和表面都负载细胞裂解物中水溶性组分的2mg PLGA微米疫苗和200μL内部和表面都负载溶于8M尿素中原非水溶性组分的2mg PLGA微米疫苗，连续给6周。PBS对照组从第三周开始每隔7天皮下注射400μL PBS，连续给6周。空白微米粒+细胞裂解物对照组从第三周开始每隔7天分别皮下注射β细胞裂解物中水溶性组分和溶于8M尿素中的原非水溶性组分、以及含有等量佐剂的4mg PLGA空白微米粒，注意以上三者需分开给药并注射在不同皮下部位，以免游离的细胞裂解物吸附于空白微米粒表面，连续注射6周。各组小鼠从第8周开始每天记录小鼠血糖情况。以血糖高于11.0mmol·L-1为糖尿病开始发病。记录不同时间段NOD小鼠糖尿病发病情况。
(4)实验结果
NOD小鼠为I型糖尿病模型小鼠。有大约60％-85％的雌性NOD小鼠在未经预防处理的情况下会在22周后罹患I型糖尿病。从附图35可以看出，雌性NOD小鼠在注射PBS或空白微米粒+裂解物处理的情况在25周后有70％-80％患有糖尿病。但是在采用疫苗进行预防的组内，在25周后只有约30％小鼠会患有I型糖尿病。综上所述，本发明所述的负载β细胞和胰腺组织全细胞组分微米疫苗对I型糖尿病具有预防效果。
实施例8经过刺激的β细胞全细胞组分负载于纳米疫苗内部用于I型糖尿病的预防
(1)同实施例6。
(2)本实施例中制备纳米疫苗及作为对照的空白纳米粒采用溶剂挥发法中的复乳法，所采用的纳米粒子制备材料PLGA分子量为24KDa-38KDa，所采用的免疫佐剂为雷帕霉素且雷帕霉素分布于纳米粒子内部，在制备时雷帕霉素与PLGA一同溶解于有机相中。制备方法如前所述，但是纳米疫苗表面不负载抗原。纳米疫苗平均粒径为280nm左右，纳米疫苗表面电位Zeta potential为-25mV左右。每1mg PLGA纳米粒子约负载60μg蛋白质或多肽组分，每1mgPLGA纳米疫苗内所使用的雷帕霉素免疫佐剂共约为0.05mg。空白纳米粒粒径为260nm左右，空白纳米粒制备时分别采用含有等量雷帕霉素的纯水或8M尿素代替相对应的水溶性组分和非水溶性组分。
(3)将实施例6的疫苗替换为本实施例制备的疫苗，其余同实施例6。
(4)实验结果
NOD小鼠为I型糖尿病模型小鼠。有大约60％-85％的雌性NOD小鼠在未经预防处理的情况下会在22周后罹患I型糖尿病。从附图36可以看出，雌性NOD小鼠在注射PBS或空白纳米粒+细胞裂解物处理的情况在25周后有70％-80％患有糖尿病。但是在采用疫苗进行预防的组内，在25周后只有约30％小鼠患有I型糖尿病。综上所述，本发明所述的负载β细胞全细胞组分纳米疫苗对I型糖尿病具有预防效果。
实施例9β细胞非水溶性组分负载于纳米疫苗内部和表面用于I型糖尿病的预防
(1)在高糖培养基中培养NIT-1β细胞后，收集所培养的NIT-1β细胞，离心后去除培养基，用超纯水重悬NIT-1β细胞，然后采用-20℃到-273℃冷冻，加一定量超纯水后反复冻融3次以上，并可伴有超声以破坏裂解细胞。待细胞裂解后，将裂解物以大于100g的转速离心1分钟以上并取沉淀，在所得沉淀部分中加入8M尿素溶解即可将NIT-1β细胞中不溶于纯水的非水溶性组分转化为在8M尿素水溶液中可溶。上述所得来源于细胞裂解物的溶解于8M尿素中的原非水溶性组分即为制备用于预防I型糖尿病的疫苗的抗原来源。
(2)将纯水替换为8M尿素，其余同实施例3。
(3)将水溶性组分替换为原非水溶性组分，其余同实施例3。
(4)实验结果
NOD小鼠为I型糖尿病模型小鼠。有大约60％-85％的雌性NOD小鼠在未经预防处理的情况下会在22周后罹患I型糖尿病。从附图31可以看出，雌性NOD小鼠在注射PBS或空白纳米粒+细胞裂解物处理的情况在25周后有70％-80％患有糖尿病。但是在采用疫苗进行预防的组内，在25周后只有约40％小鼠会患有I型糖尿病。综上所述，本发明所述的负载β细胞水溶性组分纳米疫苗对I型糖尿病具有预防效果。
显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的举例，并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所引申出的显而易见的变化或变动仍处于本发明创造的保护范围之中。

Claims (5)

1.一种疫苗系统在制备预防或治疗I型糖尿病的药物中的应用，其特征在于：所述疫苗系统包括递送粒子及其负载的细胞组分，所述细胞组分为含有与I型糖尿病相关抗原的细胞或组织中的全细胞的水溶性组分和/或非水溶性组分；
将含有与I型糖尿病相关抗原的细胞或组织在-20℃ ~ -273℃下冷冻，加水或不含增溶剂的水溶液后反复冻融裂解细胞，上清液为所述水溶性组分，沉淀中经增溶后可溶的部分为所述非水溶性组分；或将含有与I型糖尿病相关抗原的细胞或组织裂解后采用含有增溶剂的水溶液溶解，得到同时含有水溶性组分和非水溶性组分的细胞组分；
增溶所用的增溶剂选自尿素或盐酸胍；
所述递送粒子的内部和/或表面负载有抑制免疫的物质；所述抑制免疫的物质选自雷帕霉素、他克莫司和编码TGF-β的mRNA中的一种或多种；
所述含有与I型糖尿病相关抗原的细胞为β细胞；
所述递送粒子为纳米级粒子和/或微米级粒子，且由聚乳酸-羟基乙酸共聚物或聚乳酸制备得到，所述纳米级粒子的粒径为1nm-1000nm，所述微米级粒子的粒径为1μm-1000μm。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述β细胞为胰腺β细胞、β细胞细胞系或由多能干细胞转化而来的β细胞。
3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述疫苗系统的表面连接有主动靶向功能的靶头。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于：所述靶头靶向树突状细胞、巨噬细胞、B细胞、T细胞、NK细胞、NKT细胞、中性粒细胞、嗜酸性粒细胞或嗜碱性粒细胞。
5.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述水溶性组分和/或非水溶性组分负载于所述递送粒子的内部，和/或所述水溶性组分和/或非水溶性组分负载于所述递送粒子的表面。
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