CN114958739A - 一种细胞系统及其应用、以及激活广谱癌细胞特异性t细胞的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种细胞系统及其应用、以及激活广谱癌细胞特异性T细胞的方法，细胞系统包括从肿瘤浸润淋巴细胞中提取的癌细胞特异性T细胞，提取包括将肿瘤浸润淋巴细胞或肿瘤浸润淋巴细胞中的T细胞、抗原提呈细胞与负载癌细胞全细胞抗原的纳米粒子和/或微米粒子共孵育以激活癌细胞特异性T细胞，再将被激活的癌细胞特异性T细胞从肿瘤浸润淋巴细胞中分离的步骤。本发明克服了临床上目前无法有效筛选肿瘤浸润淋巴细胞中广谱和多克隆的癌细胞特异性T细胞的难题，能够从肿瘤浸润淋巴细胞中分离广谱的具有特异性肿瘤杀伤功能的效应性癌细胞特异性T细胞，且具有易分离获取和特异性高的特点，可用于癌症的预防和治疗。
Description
技术领域
本发明涉及免疫治疗领域，尤其涉及一种细胞系统及其应用、以及激活广谱癌细胞特异性T细胞的方法。
背景技术
肿瘤浸润淋巴细胞(tumor infiltrating lymphocytes,TILs)是一类从肿瘤组织中分离出的浸润淋巴细胞，主要以T细胞、B细胞、巨噬细胞和NK细胞为代表，是肿瘤微环境的重要组成部分，在肿瘤的免疫应答中具有核心作用，严重影响肿瘤患者的治疗和预后。其中，T细胞尤其是癌细胞特异性T细胞发挥着抗癌主力军的作用。T细胞是机体特异性识别和杀灭癌细胞的主要细胞，每一种癌细胞特异性T细胞的克隆可以特异性识别一种抗原表位。癌症患者体内尤其是经过免疫治疗或者放疗的患者体内都含有一定数量的癌细胞特异性T细胞。
研究显示，能够浸润到肿瘤部位的淋巴细胞，尤其是癌细胞特异性T细胞越多，肿瘤组织就越能被较好的控制。但是，不同类型的TILs在各类肿瘤的亚型中作用均不相同。其中，既有正向调节、发挥免疫监视作用的细胞，如CD8+TIL、NK细胞、CD4+Th1细胞等，又有负向调节、发挥免疫耐受作用的细胞，如CD4+Th2细胞、调节性T细胞(regulatory T cell,Treg)。因此，浸润到肿瘤部位的很多淋巴细胞并不一定发挥抗癌功效，比如2型巨噬细胞反而会促进肿瘤的生长，调节性T细胞尤其是癌症特异性调节性T细胞也会促进癌症生长。
肿瘤患者的TILs由于包括以上因素在内的各种原因受到了抑制，不能有效杀伤肿瘤，因此人们希望通过一些体外培养方法将TIL细胞富集起来，再回输给患者，发挥抗肿瘤作用，即TIL细胞疗法。利用肿瘤浸润淋巴细胞(TILs)治疗癌症的疗法已经发展多年，但是仍面临着如何更好地筛选杀伤性癌细胞特异性T细胞的问题(尤其是分选出广谱的癌细胞特异性T细胞的问题)。目前的方法主要是从处理的肿瘤组织中分离出T细胞等进行体外扩增后回输给患者使用。但是肿瘤浸润的T细胞很多并不都是肿瘤特异性的T细胞，而且很多肿瘤特异性的T细胞为调节性T细胞(Treg)或者耗竭失能的T细胞，并不能有效识别和杀伤癌细胞，所以即使机体分离扩增后回输给患者后效果也相对有限。而且，如果将Treg体外扩增后回输给患者反而会引起肿瘤组织生长更快。所以如何能够从肿瘤浸润淋巴细胞中筛选得到肿瘤特异性T细胞中的具有癌细胞识别和杀伤功能的效应性癌细胞特异性T细胞就显得非常关键，但是目前没有特别高效的手段可以很好地从肿瘤浸润淋巴细胞中分离该部分具有特异性肿瘤杀伤功能的效应性癌细胞特异性T细胞。
发明内容
为解决上述技术问题，本发明提供了一种来源于肿瘤浸润淋巴细胞的细胞系统，使用负载癌细胞全细胞抗原的纳米粒子或微米粒子先体外激活效应性癌细胞特异性T细胞，然后再利用被激活的效应性癌细胞特异性T细胞特异性表达的标志物分离提取上述癌细胞特异性T细胞，回输给患者预防或者治疗癌症，有效地解决了如何从肿瘤浸润淋巴细胞中特异性分离提取具有识别和杀伤癌细胞能力的广谱和多克隆的癌细胞特异性T细胞的问题。
本发明的第一个目的是提供一种来源于肿瘤浸润淋巴细胞的细胞系统，该细胞系统包括从肿瘤浸润淋巴细胞中提取的癌细胞特异性T细胞，所述的提取包括将(1)肿瘤浸润淋巴细胞或肿瘤浸润淋巴细胞中的T细胞、(2)抗原提呈细胞与(3)负载癌细胞全细胞抗原的纳米粒子(NP)或微米粒子(MP)共孵育以激活癌细胞特异性T细胞，再将被癌细胞全细胞抗原激活的癌细胞特异性T细胞分离的步骤；其中，癌细胞全细胞抗原包括经癌细胞和/或肿瘤组织裂解得到的水溶性抗原和/或非水溶性抗原，该非水溶性抗原经溶解剂或含溶解剂的溶解液溶解后负载于所述纳米粒子或微米粒子上。
进一步地，分离癌细胞特异性T细胞后，还包括对癌细胞特异性T细胞进行扩增或扩增分选的步骤。
进一步地，所述的扩增为体外扩增，扩增分选的方法包括但不限于与细胞因子和/或抗体共孵育。
进一步地，细胞因子包括但不限于白介素2(IL-2)、白介素7(IL-7)、白介素14(IL-14)、白介素4(IL-4)、白介素15(IL-15)、白介素21(IL-21)、白介素17(IL-17)、白介素12(IL-12)、白介素6(IL-6)、白介素33(IL-33)、γ干扰素(IFN-γ)、TNF-α。
进一步地，抗体包括但不限于αCD-3抗体、αCD-4抗体、αCD-8抗体、αCD-28抗体、αCD-40抗体、αOX-40抗体、αOX-40L抗体。
进一步地，得到的癌细胞特异性T细胞包括CD4+ T细胞和/或CD8+ T细胞，优选为同时包括CD4+ T细胞和CD8+ T细胞。
进一步地，所述的分离包括利用被癌细胞全细胞抗原激活的癌细胞特异性T细胞的特异性表面标志物进行筛选的步骤。特异性表面标志物包括但不限于CD69、CD25、OX40(CD134)、CD137、CD28等。
进一步地，利用表面标志物分离癌细胞特异性T细胞的技术包括但不限于流式细胞术和磁珠分选法。
本发明中，使用负载癌细胞全细胞抗原的纳米粒子和/或微米粒子先特异性激活肿瘤浸润淋巴细胞中预存的已在淋巴结中被激活过的癌细胞特异性T细胞，再利用被激活的癌细胞特异性T细胞分泌特定细胞因子或者高表达某些表面分子的特性，利用流式细胞术等手段分离得到癌细胞特异性T细胞，经体外扩增后回输给患者使用，能够分离和扩增到最多样和广谱的具有识别和杀伤癌细胞功能的癌症特异性T细胞。
进一步地，所述共孵育包括但不限于：负载癌细胞全细胞抗原的纳米粒子和/或微米粒子、抗原提呈细胞、肿瘤浸润淋巴细胞或肿瘤浸润淋巴细胞中的T细胞三者同时共孵育；或者负载癌细胞全细胞抗原的纳米粒子和/或微米粒子先与抗原提呈细胞二者共孵育一段时间，再加入肿瘤浸润淋巴细胞或肿瘤浸润淋巴细胞中的T细胞三者同时共孵育；或者负载癌细胞全细胞抗原的纳米粒子和/或微米粒子先与抗原提呈细胞二者共孵育一段时间，分离出抗原提呈细胞，将抗原提呈细胞与肿瘤浸润淋巴细胞或肿瘤浸润淋巴细胞中的T细胞二者再同时共孵育。
进一步地，上述肿瘤浸润淋巴细胞中的T细胞是从肿瘤浸润淋巴细胞中分选出来的T细胞，分选出的T细胞中包含癌细胞特异性T细胞，从肿瘤浸润淋巴细胞中分选出T细胞的方法可以为流式细胞法、磁珠分选法等。具体地，使用流式细胞术或者磁珠分选法从肿瘤浸润淋巴细胞中分选出CD45+的细胞和/或CD3+的细胞、分选出CD45+CD3+的细胞、分选出CD3+CD8+的细胞、分选出CD45+CD3+CD8+的细胞、分选出CD3+CD4+的细胞或分选出CD45+CD3+CD4+的细胞。
进一步地，上述肿瘤浸润淋巴细胞或肿瘤浸润淋巴细胞中的T细胞可以不经任何处理，或者细胞来源机体经过放疗、免疫治疗、化疗、粒子治疗、疫苗治疗等处理。
进一步地，肿瘤浸润淋巴细胞或肿瘤浸润淋巴细胞中的T细胞来源于自体或同种异体。
进一步地，抗原提呈细胞包括B细胞、树突状细胞(DC)和巨噬细胞中的至少一种，优选为两种及以上，如B细胞和DC细胞。
进一步地，抗原提呈细胞可以与肿瘤浸润淋巴细胞或肿瘤浸润淋巴细胞中的T细胞来源于同体、同种异体，细胞系或由干细胞转化而来。本领域技术人员可知，抗原提呈细胞可以来源于任何可以制备分离得到外周免疫细胞的方法。
进一步地，负载癌细胞全细胞抗原的纳米粒子和/或微米粒子与抗原提呈细胞和肿瘤浸润淋巴细胞或肿瘤浸润淋巴细胞中的T细胞共孵育至少4小时，使抗原能够递送到抗原提呈细胞内，且可被抗原提呈细胞处理和提呈到抗原提呈细胞表面。下述实施例中，共孵育时间至少为4小时，优选为24-96小时。
进一步地，负载癌细胞全细胞抗原的纳米粒子和/或微米粒子与抗原提呈细胞和肿瘤浸润淋巴细胞或肿瘤浸润淋巴细胞中的T细胞共孵育时，体系中可加入细胞因子；所述细胞因子包括但不限于白介素、干扰素、集落刺激因子和肿瘤坏死因子；所述白介素包括但不限于白介素2(IL-2)、白介素7(IL-7)、白介素14(IL-14)、白介素4(IL-4)、白介素15(IL-15)、白介素21(IL-21)、白介素17(IL-17)、白介素12(IL-12)、白介素6(IL-6)、白介素33(IL-33)。
进一步地，将癌细胞或肿瘤组织在-20℃～-273℃下冷冻，加水或不含溶解剂的溶液后进行反复冻融裂解，得到的上清液为水溶性抗原，沉淀中经溶解剂溶解后转为可溶的部分为非水溶性抗原。
进一步地，水溶性抗原和/或非水溶性抗原负载于粒子内部，和/或负载于粒子表面。具体的，所述负载方式为细胞的水溶性抗原和非水溶性抗原分别或同时被包载于粒子内部，和/或分别或同时负载于粒子表面，包括但不限于水溶性抗原同时装载于粒子中和负载于粒子表面，非水溶性抗原同时装载于粒子中和负载于粒子表面，水溶性抗原装载于粒子中而非水溶性抗原负载于粒子表面，非水溶性抗原装载于粒子中而水溶性抗原负载于粒子表面，水溶性抗原和非水溶性抗原装载于粒子中而只有非水溶性抗原负载于粒子表面，水溶性抗原和非水溶性抗原装载于粒子中而只有水溶性抗原负载于粒子表面，水溶性抗原装载于粒子中而水溶性抗原和非水溶性抗原同时负载于粒子表面，非水溶性抗原装载于粒子中而水溶性抗原和非水溶性抗原同时负载于粒子表面，水溶性抗原和非水溶性抗原同时装载于粒子中而且水溶性抗原和非水溶性抗原同时负载于粒子表面。
进一步地，纳米粒子或微米粒子还负载有免疫增强佐剂。免疫增强佐剂包括但不限于微生物来源的免疫增强剂、人或动物免疫系统的产物、固有免疫激动剂、适应性免疫激动剂、化学合成药物、真菌多糖类、中药及其他类中的至少一类；免疫增强佐剂包括但不限于模式识别受体激动剂、卡介苗(BCG)、锰相关佐剂、卡介苗细胞壁骨架、卡介苗甲醇提取残余物、卡介苗胞壁酰二肽、草分枝杆菌、多抗甲素、矿物油、病毒样颗粒、免疫增强的再造流感病毒小体、霍乱肠毒素、皂苷及其衍生物、Resiquimod、胸腺素、新生牛肝活性肽、米喹莫特、多糖、姜黄素、免疫佐剂CpG、免疫佐剂poly(I:C)、免疫佐剂poly ICLC、短小棒状杆菌苗、溶血性链球菌制剂、辅酶Q10、左旋咪唑、聚胞苷酸、锰佐剂、铝佐剂、钙佐剂、各种细胞因子、白细胞介素、干扰素、聚肌苷酸、聚腺苷酸、明矾、磷酸铝、羊毛脂、角鲨烯、细胞因子、植物油、内毒素、脂质体佐剂、MF59、双链RNA、双链DNA、铝相关佐剂、CAF01、人参、黄芪的有效成分中的至少一种。本领域技术人员可以理解，此处为列举并非穷举，免疫增强佐剂也可采用其他可使免疫反应增强的物质。
优选地，免疫增强佐剂为Toll样受体激动剂；更优选为两种及以上Toll样受体激动剂联用，保证纳米粒子或微米粒子被抗原提呈细胞吞噬后可以更好地激活癌细胞特异性T细胞。
进一步地，两种及以上Toll样受体激动剂联用为poly(I:C)/Poly(ICLC)与CpG-ODN(CpG寡脱氧核苷酸)联用。优选地，CpG-ODN为两种及以上的CpG-ODN。
进一步地，所述佐剂可以负载于纳米粒子或微米粒子的内部和/或表面。
进一步地，负载癌细胞全细胞抗原的纳米粒子或微米粒子还同时共负载增加溶酶体逃逸的物质。
进一步地，所述增加溶酶体逃逸的物质包括但不限于增加溶酶体内渗透压的载体和材料、降低溶酶体膜稳定性的载体材料、具有质子海绵效应的物质，其可负载于纳米粒子或微米粒子的内部和/或表面。
进一步地，增加溶酶体逃逸的物质包括但不限于氨基酸、聚氨基酸、有机高分子聚合物、核酸、多肽、脂类、糖类、具有质子海绵效应的无机物，
进一步地，纳米粒子或微米粒子的表面连接有主动靶向抗原提呈细胞的靶头，靶头可为甘露糖、甘露聚糖、CD19抗体、CD20抗体、BCMA抗体、CD32抗体、CD11c抗体、CD103抗体、CD44抗体等。
进一步地，水溶性抗原或非水溶性抗原负载于纳米粒子或微米粒子表面的方式包括吸附、共价连接、电荷相互作用、疏水相互作用、一步或多步的固化、矿化和包裹中的至少一种。
进一步地，纳米粒子的粒径为1nm-1000nm；微米粒子的粒径为1μm-1000μm；纳米粒子或微米粒子表面为电中性，带负电或者带正电。
进一步地，纳米粒子或微米粒子由有机合成高分子材料、天然高分子材料或无机材料制备得到，可以采用已有的制备方法制备得到，包括但不仅限于常见的溶剂挥发法、透析法、微流控法、挤出法、热熔法。
进一步地，有机合成高分子材料包括PLGA、PLA、PGA、PEG、PCL、Poloxamer、PVA、PVP、PEI、PTMC、聚酸酐、PDON、PPDO、PMMA、聚氨基酸、合成多肽等；天然高分子材料包括卵磷脂、胆固醇、海藻酸盐、白蛋白、胶原蛋白、明胶、细胞膜成分、淀粉、糖类、多肽等；无机材料包括三氧化二铁、四氧化三铁、碳酸盐、磷酸盐等。
进一步地，纳米粒子或微米粒子在制备过程中可以不做修饰处理，也可以采用适当的修饰技术以提高纳米粒子或微米粒子的抗原负载量。修饰技术包括但不限于生物矿化(如硅化、钙化、镁化)、凝胶化、交联、化学修饰、添加带电物质等。
进一步地，抗原被负载于纳米粒子或微米粒子内部的形式为任何可以将其负载于纳米粒子或微米粒子内部的方式，如包载。
进一步地，抗原被负载于纳米粒子或微米粒子表面的方式包括但不限于吸附、共价连接、电荷相互作用(如添加带正电的物质、添加带负电的物质)、疏水相互作用、一步或多步的固化、矿化、包裹等。
进一步地，负载于纳米粒子或微米粒子表面的水溶性抗原和/或非水溶性抗原负载后为一层或多层，表面负载多层水溶性抗原和/或非水溶性抗原时，层与层之间为修饰物。
进一步地，用于激活或辅助分离的粒子的粒径大小为纳米级或微米级，这样能保证粒子被抗原提呈细胞吞噬，而为了提高吞噬效率，粒径大小要在适宜的范围内。纳米粒子的粒径大小为1nm-1000nm，更优选地，粒径大小为30nm-1000nm，最优选地，粒径大小为100nm-600nm；微米粒子的粒径大小为1μm-1000μm，更优选地，粒径大小为1μm-100μm，更优选地，粒径大小为1μm-10μm，最优选地，粒径大小为1μm-5μm。
进一步地，负载癌细胞全细胞抗原的纳米粒子或微米粒子的形状包括但不限于球形、椭球形、桶形、多角形、棒状、片状、线形、蠕虫形、方形、三角形、蝶形或圆盘形。
进一步地，在体外激活癌细胞特异性T细胞时，可以同时使用只负载水溶性抗原的纳米粒子和/或微米粒子和只负载非水溶性抗原的纳米粒子和/或微米粒子、使用只负载水溶性抗原的纳米粒子和/或微米粒子、使用只负载非水溶性抗原的纳米粒子和/或微米粒子或者使用同时负载水溶性抗原和非水溶性抗原的纳米粒子和/或微米粒子。
进一步地，溶解剂选自尿素、盐酸胍、脱氧胆酸盐、十二烷基硫酸盐(如SDS)、甘油、蛋白质降解酶、白蛋白、卵磷脂、无机盐(0.1-2000mg/mL)、Triton、吐温、氨基酸、糖苷、胆碱中的至少一种。
本发明的第二个目的是提供上述来源于肿瘤浸润淋巴细胞的细胞系统在制备癌症治疗或预防药物中的应用。
进一步地，在癌症发生前、癌症发生后或手术切除肿瘤组织后多次给药。
进一步地，纳米粒子或微米粒子中，用于制备抗原的癌细胞或肿瘤组织中至少有一种与上述药物治疗的目标疾病类型相同。
本发明的第三个目的是提供一种体外激活癌细胞特异性T细胞的方法，该方法包括以下步骤：将负载癌细胞全细胞抗原的纳米粒子和/或微米粒子、抗原提呈细胞与癌细胞特异性T细胞或含有癌细胞特异性T细胞的细胞混合物共孵育；其中，癌细胞全细胞抗原包括经癌细胞和/或肿瘤组织裂解得到的水溶性抗原和/或非水溶性抗原，该非水溶性抗原经溶解剂或含溶解剂的溶解液溶解后负载于所述纳米粒子或微米粒子上。
进一步地，含有癌细胞特异性T细胞的细胞混合物包含肿瘤浸润淋巴细胞或来源于肿瘤浸润淋巴细胞的T细胞。
进一步地，溶解剂选自尿素、盐酸胍、脱氧胆酸盐、十二烷基硫酸盐(如SDS)、甘油、蛋白质降解酶、白蛋白、卵磷脂、无机盐(0.1-2000mg/mL)、Triton、吐温、氨基酸、糖苷、胆碱中的至少一种。
进一步地，抗原提呈细胞包括B细胞、树突状细胞和巨噬细胞中的一种或多种。
进一步地，共孵育时加入细胞因子，细胞因子包括但不限于白介素、干扰素、集落刺激因子和肿瘤坏死因子；所述白介素包括但不限于白介素2(IL-2)、白介素7(IL-7)、白介素14(IL-14)、白介素4(IL-4)、白介素15(IL-15)、白介素21(IL-21)、白介素17(IL-17)、白介素12(IL-12)、白介素6(IL-6)、白介素33(IL-33)。
本发明的第四个目的是提供一种经上述方法体外激活的癌细胞特异性T细胞。
现有技术中，由于激活方式的限制，癌细胞特异性T细胞被激活的种类和克隆数很少，本发明中，用于激活癌细胞特异性T细胞的纳米粒子或微米粒子所负载的癌细胞全细胞抗原来源于癌细胞和/或肿瘤组织，将非水溶性抗原负载到纳米粒子或微米粒子上，使该纳米或微米系统中含有更多的抗原，更优选地，将水溶性抗原和非水溶性抗原同时负载到粒子上，使粒子上负载全部抗原，使用负载与癌症相关全部抗原的粒子激活细胞，能够获得更广谱和多样的癌细胞特异性T细胞，且高度特异，在免疫治疗中效果更佳，从而为细胞治疗提供更有力的备选药物。
借由上述方案，本发明至少具有以下优点：
本发明提供了一种使用纳米级或微米级粒子递送系统体外辅助激活后分离肿瘤浸润淋巴细胞中的癌细胞特异性T细胞的技术，所分离得到的癌细胞特异性T细胞广谱而且高度特异，包含肿瘤浸润淋巴细胞中所有的效应性癌细胞特异性T细胞，为可以特异性识别和杀伤癌细胞的T细胞。将癌细胞特异性T细胞扩增后，所得细胞可以用于预防和治疗癌症。
上述说明仅是本发明技术方案的概述，为了能够更清楚了解本发明的技术手段，并可依照说明书的内容予以实施，以下以本发明的较佳实施例并配合详细附图说明如后。
附图说明
为了使本发明的内容更容易被清楚的理解，下面根据本发明的具体实施例并结合附图，对本发明作进一步详细的说明。
图1为本发明细胞系统的制备过程及应用示意图；其中，a为水溶性抗原和非水溶性抗原分别收集和制备纳米粒子或微米粒子的示意图；b为采用含有溶解剂的溶解液溶解癌细胞全细胞抗原和制备纳米粒子或微米粒子的示意图；c为使用a或b中制备的上述粒子激活肿瘤浸润淋巴细胞中的癌细胞特异性T细胞后利用T细胞被激活后的特征分离提取癌细胞特异性T细胞，尔后扩增该类T细胞，并用该类细胞预防或治疗癌症的示意图；
图2-20分别为实施例1-19中用分离扩增的癌细胞特异性T细胞预防或治疗癌症时小鼠肿瘤生长速度和生存期实验结果；a,预防或治疗癌症时的肿瘤生长速度实验结果(n≥8)；b,预防或治疗癌症时的小鼠生存期实验结果(n≥8)，每个数据点为平均值±标准误差(mean±SEM)；c和d为使用流式细胞术分析被癌细胞全细胞抗原激活的癌细胞特异性T细胞占总的肿瘤浸润T细胞比例的结果；a图中肿瘤生长抑制实验的显著性差异采用ANOVA法分析，b图中显著性差异采用Kaplan-Meier和log-rank test分析；***表示与PBS空白对照组相比p＜0.005，有显著性差异；**表示与PBS空白对照组相比p＜0.01，有显著性差异；*表示与PBS空白对照组相比p＜0.05，有显著性差异；###表示只与抗原提呈细胞共孵育而无任何纳米粒的T细胞对照组相比p＜0.005，有显著性差异；##表示只与抗原提呈细胞共孵育而无任何纳米粒/微米粒的T细胞对照组相比p＜0.01，有显著性差异；#表示只与抗原提呈细胞共孵育而无任何纳米粒/微米粒的T细胞对照组相比p＜0.05，有显著性差异；&&&表示与空白纳米粒/微米粒+游离裂解液辅助分离的T细胞对照组相比p＜0.005，有显著性差异；&&表示与空白纳米粒/微米粒+游离裂解液辅助分离的T细胞对照组相比p＜0.01，有显著性差异；&标示与空白纳米粒/微米粒+游离裂解液辅助分离的T细胞对照组相比p＜0.05，有显著性差异；δδδ代表与多肽纳米粒/微米粒辅助分离的T细胞组相比p＜0.005，有显著性差异；δδ代表与多肽纳米粒/微米粒辅助分离的T细胞组相比p＜0.01，有显著性差异；Ω代表只与纳米粒/微米粒和一种抗原提呈细胞共孵育辅助分离的T细胞组相比p＜0.05，有显著性差异；π代表与不负载溶酶体逃逸物质的纳米粒/微米粒辅助分离的T细胞组相比p＜0.05，有显著性差异；ξ代表与只负载一种CpG+Poly(I:C)混合佐剂的纳米粒/微米粒辅助分离的T细胞组相比p＜0.05，有显著性差异；μ代表与共孵育过程中不加入细胞因子辅助分离的T细胞组相比p＜0.05，有显著性差异；ρ代表与只负载一种佐剂(两类CpG)的纳米粒/微米粒辅助分离的T细胞组相比p＜0.05，有显著性差异；ρρ代表与只负载一种佐剂(两类CpG)的纳米粒/微米粒辅助分离的T细胞组相比p＜0.01，有显著性差异；
代表与只使用纳米粒/微米粒辅助分离的癌细胞特异性CD8+T细胞组相比p＜0.05，有显著性差异；θ代表与不负载佐剂的纳米粒/微米粒辅助分离的T细胞组相比p＜0.05，有显著性差异；θθ代表与不负载佐剂的纳米粒/微米粒辅助分离的T细胞组相比p＜0.01，有显著性差异。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步说明，以使本领域的技术人员可以更好地理解本发明并能予以实施，但所举实施例不作为对本发明的限定。
本发明所述的用于预防或治疗癌症的T细胞系统，其包含来自于肿瘤浸润淋巴细胞中的经过特异性分离和扩增的癌细胞特异性T细胞，该类癌细胞特异性T细胞在分离时先被负载抗原的纳米粒子和/或微米粒子激活，然后利用被激活后高表达的特异性分子被分离。分离后扩增的癌细胞特异性T细胞可以来自同种同体或者同种异体。纳米粒子和/或微米粒子负载癌细胞全细胞抗原或其混合物。制备预防或治疗癌症的T细胞系统，其制备过程及应用领域如图1所示。
在制备辅助分离癌细胞特异性T细胞的纳米粒子或微米粒子时，可裂解细胞或组织后先分别收集水溶性抗原和水不溶性抗原并分别制备纳米或微米粒子系统；或者也可以直接采用含有溶解剂的溶解液直接裂解细胞或组织并溶解癌细胞全细胞抗原并制备纳米或微米粒子系统。本发明所述癌细胞全细胞抗原在裂解前或(和)裂解后既可经过包括但不限于灭活或(和)变性、固化、生物矿化、离子化、化学修饰、核酸酶处理等处理后再制备纳米粒子或微米粒子；也可细胞裂解前或(和)裂解后不经过任何灭活或(和)变性、固化、生物矿化、离子化、化学修饰、核酸酶处理直接制备纳米粒子或微米粒子。本发明部分实施例中，肿瘤组织细胞在裂解前经过了灭活或(和)变性处理，在实际使用过程中也可以在细胞裂解后做灭活或(和)变性处理，或者也可以细胞裂解前和裂解后均做灭活或(和)变性处理；本发明部分实施例中细胞裂解前或(和)裂解后的灭活或(和)变性处理方法为紫外照射和高温加热，在实际使用过程中也可以采用包括但不限于放射线辐照、高压、固化、生物矿化、离子化、化学修饰、核酸酶处理、胶原酶处理、冷冻干燥等处理方法。本领域技术人员可以理解，在实际应用过程中技术人员可根据具体情况进行适当调整。
在使用纳米粒子或微米粒子体外激活癌细胞特异性T细胞时，需要抗原提呈细胞的辅助，抗原提呈细胞可以来源于自体或者同种异体，也可以来自于细胞系或者干细胞。抗原提呈细胞可以是DC细胞、B细胞、巨噬细胞或者上述三者的任意混合物，也可以是其他具有抗原提呈功能的细胞。
在癌细胞特异性T细胞被激活后，分离提取被癌细胞全细胞抗原特异性激活的癌细胞特异性T细胞时可以采用流式细胞术或者磁珠分选，或者其他任何可以提取分离该类细胞的方法。
在一些实施方案中，采用负载癌细胞全细胞抗原的纳米粒子或微米粒子分离扩增来自肿瘤浸润淋巴细胞的癌细胞特异性T细胞的具体制备方法如下：
步骤1，将第一预定体积的含有第一预定浓度的水相溶液加入第二预定体积的含有第二预定浓度制备粒子原材料的有机相中。
在一些实施例中，水相溶液可含有癌细胞裂解物中的各组分以及免疫增强佐剂；癌细胞裂解物中的各组分在制备时分别为水溶性抗原或是溶于尿素或盐酸胍等溶解剂中的原非水溶性抗原。水相溶液所含有的水溶性抗原的浓度或原非水溶性抗原的浓度，也即第一预定浓度要求蛋白质多肽浓度含量大于1ng/mL，能负载足够癌细胞全细胞抗原以激活相关细胞。免疫增强佐剂在初始水相中的浓度为大于0.01ng/mL。
在一些实施例中，水相溶液含有肿瘤组织裂解物中的各组分以及免疫增强佐剂；肿瘤组织裂解物中的各组分在制备时分别为水溶性抗原或者是溶于尿素或盐酸胍等溶解剂中的原非水溶性抗原。水相溶液所含有的水溶性抗原的浓度或原非水溶性抗原的浓度，也即第一预定浓度要求蛋白质多肽浓度含量大于0.01ng/mL，能负载足够癌细胞全细胞抗原以激活相关细胞。免疫增强佐剂在初始水相中的浓度为大于0.01ng/mL。
在一些实施例中，制备粒子原材料为PLGA，有机溶剂选用二氯甲烷。另外，在一些实施例中，制备粒子原材料的第二预定浓度的范围为0.5mg/mL-5000mg/mL，优选为100mg/mL。
在本发明中，之所以选择PLGA或修饰的PLGA，是由于该材料为生物可降解材料且已被FDA批准用作药物敷料。研究表明PLGA具有一定的免疫调节功能，因而适合作为纳米粒子或微米粒子制备时的辅料。在实际应用中可根据实际情况选择合适的材料。
实际中，有机相的第二预定体积根据其和水相的第一预定体积的比例进行设定，在本发明中，水相的第一预定体积和有机相的第二预定体积之比的范围为1:1.1-1:5000，优选地为1:10。在具体实施过程中可根据需要对第一预定体积、第二预定体积和第一预定体积与第二预定体积之比进行调整以调整制备的纳米粒或微米粒的尺寸大小。
优选地，水相溶液为裂解物组分溶液时，其中蛋白质和多肽的浓度大于1ng/mL，优选1mg/mL～100mg/mL；水相溶液为裂解物组分/免疫佐剂溶液时，其中蛋白质和多肽的浓度大于1ng/mL，优选1mg/mL～100mg/mL，免疫佐剂的浓度大于0.01ng/mL，优选0.01mg/mL～20mg/mL。有机相溶液中，溶剂为DMSO、乙腈、乙醇、氯仿、甲醇、DMF、异丙醇、二氯甲烷、丙醇、乙酸乙酯等，优选二氯甲烷；有机相的浓度为0.5mg/mL～5000mg/mL，优选为100mg/mL。
步骤2，将步骤1得到的混合液进行大于2秒的超声处理或大于1分钟的搅拌或均质处理或微流控处理。优选地，搅拌为机械搅拌或者磁力搅拌时，搅拌速度大于50rpm，搅拌时间大于1分钟，比如搅拌速度为50rpm～1500rpm，搅拌时间为0.1小时～24小时；超声处理时，超声功率大于5W，时间大于0.1秒，比如2～200秒；均质处理时使用高压/超高压均质机或高剪切均质机，使用高压/超高压均质机时压力大于5psi，比如20psi～100psi，使用高剪切均质机时转速大于100rpm，比如1000rpm～5000rpm；使用微流控处理流速大于0.01mL/min,比如0.1mL/min-100mL/min。超声或者搅拌或者均质处理或者微流控处理进行纳米化和/或微米化，超声时间长短或搅拌速度或均质处理压力及时间能控制制备的微纳粒子大小，过大或过小都会带来粒径大小的变化。
步骤3，将步骤2处理后得到的混合物加入第三预定体积的含有第三预定浓度乳化剂的水溶液中并进行大于2秒的超声处理或大于1分钟的搅拌或进行均质处理或微流控处理。该步骤将步骤2得到的混合物加入到乳化剂水溶液中继续超声或搅拌纳米化或微米化。在本发明中，超声时间大于0.1秒，比如2～200秒，搅拌速度大于50rpm，比如50rpm～500rpm，搅拌时间大于1分钟，比如60～6000秒。优选地，搅拌为机械搅拌或者磁力搅拌时，搅拌速度大于50rpm，搅拌时间大于1分钟，比如搅拌速度为50rpm～1500rpm，搅拌时间为0.5小时～5小时；超声处理时，超声功率为50W～500W，时间大于0.1秒，比如2～200秒；均质处理时使用高压/超高压均质机或高剪切均质机，使用高压/超高压均质机时压力大于20psi，比如20psi～100psi，使用高剪切均质机时转速大于1000rpm，比如1000rpm～5000rpm；使用微流控处理流速大于0.01mL/min,比如0.1mL/min-100mL/min。超声或者搅拌或者均质处理或者微流控处理进行纳米化或微米化，超声时间长短或搅拌速度或均质处理压力及时间能控制制备的纳米或微米粒子大小，过大或过小都会带来粒径大小的变化。
在一些实施例中，乳化剂水溶液为聚乙烯醇(PVA)水溶液，第三预定体积为5mL，第三预定浓度为20mg/mL。第三预定体积根据其与第二预定体积的比例进行调整。在本发明中，第二预定体积与第三预定体积之的范围为1:1.1-1:1000进行设定，优选地可以为2:5。在具体实施过程中为了控制纳米粒子或微米粒子的尺寸，可以对第二预定体积和第三预定体积之比进行调整。同样地，本步骤的超声时间或搅拌时间、乳化剂水溶液的体积以及浓度的取值根据，均为了得到尺寸大小合适的纳米粒或微米粒。
步骤4，将步骤3处理后得到的液体加入第四预定体积的第四预定浓度的乳化剂水溶液中，并进行搅拌直至满足预定搅拌条件。
本步骤中，乳化剂水溶液为PVA溶液或其他溶液。
第四预定浓度为5mg/mL，第四预定浓度的选择，以得到尺寸大小合适的纳米粒或微米粒为依据。第四预定体积的选择依据第三预定体积与第四预定体积之比决定。在本发明中，第三预定体积与第三预定体积之比为范围为1:1.5-1:2000，优选地为1:10。在具体实施过程中为了控制纳米粒子或微米粒子的尺寸可以对第三预定体积和第四预定体积之比进行调整。
在本发明中，本步骤的预定搅拌条件为直至有机溶剂挥发完成，也即步骤1中的二氯甲烷挥发完成。
步骤5，将步骤4处理满足预定搅拌条件的混合液在以大于100RPM的转速进行大于1分钟的离心后，去除上清液，并将剩下的沉淀物重新混悬于第五预定体积的第五预定浓度的含有冻干保护剂的水溶液中或者第六预定体积的PBS(或生理盐水)中。
在本发明一些实施方案中，步骤5所得沉淀重新混悬于第六预定体积的PBS(或生理盐水)中时不需要冻干，可直接进行后续纳米粒子或微米粒子表面吸附癌细胞裂解物的相关实验。
在本发明一些实施方案中，步骤5所得沉淀重新混悬于含有冻干保护剂的水溶液中时需进行冷冻干燥，再冷冻干燥以后再进行后续纳米粒子或微米粒子表面吸附癌细胞裂解物的相关实验。
在本发明中，所述冻干保护剂选用海藻糖(Trehalose)。
在本发明中，该步骤的冻干保护剂的第五预定浓度为质量百分比4％，之所以如此设定，是为了在后续进行冷冻干燥中不影响冻干效果。
步骤6，将步骤5得到的含有冻干保护剂的混悬液进行冷冻干燥处理后，将冻干物质备用。
步骤7，将第六预定体积的步骤5中得到的重悬于PBS(或生理盐水)中的含纳米粒的混悬液或者采用第六预定体积的PBS(或生理盐水)重悬步骤6得到的冷冻干燥后的含有纳米粒或微米粒和冻干保护剂的冻干物质直接使用；或者上述样品与第七预定体积的水溶性抗原或者溶解的原非水溶性抗原混合后使用。
在本发明中，第六预定体积与第七预定体积的体积比为1:10000到10000:1，优先体积比为1:100到100:1，最优体积比为1:30到30:1。
在一些实施例中，所述重悬的纳米粒子混悬液体积为10mL时，含有癌细胞裂解物或含有肿瘤组织裂解物中的水溶性抗原或者溶解的的原非水溶性抗原的体积与为1mL。在实际使用时可将二者体积和比例根据需要进行调整。
步骤8，取得肿瘤组织，将肿瘤组织切块后从中分离收集活的T细胞。肿瘤组织可以来自于自体或者同种异体。
步骤9，将步骤7制备的纳米和/或微米粒子与步骤8得到的T细胞和抗原提呈细胞混合后共孵育一定时间。
步骤10，采用流式细胞术、磁珠分选法等分离被癌细胞全细胞抗原激活的T细胞。
步骤11，将分离得到的被癌细胞全细胞抗原激活的T细胞进行体外扩增。
步骤12，将扩增后的癌细胞特异性T细胞，回输到患者体内预防或治疗癌症。
在另一些实施方案中，制备负载抗原的纳米粒子或微米粒子的具体制备方法如下：
步骤1～4同上。
步骤5，将步骤4处理满足预定搅拌条件的混合液在以大于100RPM的转速进行大于1分钟的离心后，去除上清液，并将剩下的沉淀物重新混悬于第五预定体积的第五预定浓度的含有癌细胞全细胞抗原中水溶性和/或非水溶性抗原的溶液中，或者将剩下的沉淀物重新混悬于第五预定体积的第五预定浓度的含有癌细胞全细胞抗原中水溶性和/或非水溶性抗原与佐剂混合的溶液中。
步骤6，将步骤5处理满足预定搅拌条件的混合液在以大于100RPM的转速进行大于1分钟的离心后，去除上清液，并将剩下的沉淀物重新混悬于第六预定体积的固化处理试剂或矿化处理试剂,作用一定时间后离心洗涤，然后加入第七预定提交的含有带正电或者带负电的物质并作用一定时间。
在本发明一些实施方案中，步骤6所得沉淀重新混悬于第七预定体积的带电物质后可不需要冻干，可直接进行后续纳米粒子或微米粒子表面负载癌细胞/组织裂解物的相关实验。
在本发明一些实施方案中，步骤6所得沉淀重新混悬于含有干燥保护剂的水溶液中后进行室温真空干燥或者冷冻真空干燥，在干燥以后再进行后续纳米粒子或微米粒子表面吸附癌细胞裂解物的相关实验。
在本发明中，所述冻干保护剂选用海藻糖(Trehalose)，或者甘露醇与蔗糖的混合溶液。在本发明中，该步骤的干燥保护剂的浓度为质量百分比4％，之所以如此设定，是为了在后续进行干燥中不影响干燥效果。
步骤7，将步骤6得到的含有干燥保护剂的混悬液进行干燥处理后，将干燥后的物质备用。
步骤8，将第八预定体积的步骤6中得到的重悬于PBS(或生理盐水)中的含纳米粒的混悬液或者采用第八预定体积的PBS(或生理盐水)重悬步骤7得到的干燥后的含有纳米粒或微米粒和干燥保护剂的干燥后物质直接使用；或者与第九预定体积的水溶性抗原或者非水溶性抗原混合后使用。
在本发明中，步骤5-步骤8的修饰和抗原负载步骤可重复多次以提高抗原的负载量。而且在添加带正电或带负电的物质时可以多次添加带同种电荷的或者也可以交替添加带不同电荷的物质。
在一些实施例中，所述重悬的纳米粒子混悬液体积为10mL时，含有癌细胞裂解物或含有肿瘤组织裂解物中的水溶性抗原或者原非水溶性抗原的体积与为0.1-100mL。在实际使用时可将二者体积和比例根据需要进行调整。
步骤9，取得肿瘤组织，将肿瘤组织切块后从中分离收集活的T细胞。肿瘤组织可以来自于自体或者同种异体。
步骤10，将步骤8制备的纳米和/或微米粒子与步骤9得到的T细胞和抗原提呈细胞混合后共孵育一定时间。
步骤11，采用流式细胞术、磁珠分选法等分离被癌细胞全细胞抗原激活的T细胞。
步骤12，将分离得到的被癌细胞全细胞抗原激活的T细胞进行体外扩增。
步骤13，将扩增后的癌细胞特异性T细胞，回输到患者体内预防或治疗癌症。
实施例1癌细胞特异性T细胞分离扩增后用于黑色素瘤的预防
本实施例以小鼠黑色素瘤为癌症模型来说明如何使用纳米粒子辅助分离扩增肿瘤浸润淋巴细胞中的癌细胞特异性T细胞后用于预防黑色素瘤。本实施例中，裂解B16F10黑色素瘤肿瘤组织以制备肿瘤组织的水溶性抗原和非水溶性抗原，然后，以有机高分子材料PLGA为纳米粒骨架材料，以Polyinosinic-polycytidylic acid(poly(I:C))为免疫佐剂采用溶剂挥发法制备负载有肿瘤组织的水溶性抗原和非水溶性抗原的纳米粒子系统，然后使用纳米粒子辅助分离肿瘤浸润淋巴细胞中的癌细胞特异性T细胞，分离得到的癌细胞特异性T细胞经扩增后注射到体内预防黑色素瘤。
(1)肿瘤组织的裂解及各组分的收集
在每只C57BL/6小鼠背部皮下接种1.5×105个B16F10细胞，在肿瘤长到体积分别为约1000mm3时处死小鼠并摘取肿瘤组织。将肿瘤组织切块后研磨，通过细胞过滤网加入适量超纯水并反复冻融5次，并伴有超声以破坏裂解细胞。待细胞裂解后，将裂解物以5000g的转速离心5分钟并取上清液即为可溶于纯水的水溶性抗原；在所得沉淀部分中加入8M尿素溶解沉淀部分即可将不溶于纯水的非水溶性抗原转化为在8M尿素水溶液中可溶。将水溶性抗原和非水溶性抗原按质量比1:1混合，即为制备纳米粒子系统的抗原原料来源。
(2)纳米粒子系统的制备
本实施例中纳米疫苗及作为对照的空白纳米粒采用溶剂挥发法中的复乳法制备。所采用的纳米粒子制备材料PLGA分子量为24KDa-38KDa，所采用的免疫佐剂为poly(I:C)且poly(I:C)只分布于纳米粒子内部。制备方法如前所述，在制备过程中首先采用复乳法在纳米粒子内部负载细胞组分和佐剂，在内部负载细胞裂解组分后，将100mg纳米粒子在10000g离心20分钟，并使用10mL含4％海藻糖的超纯水重悬后冷冻干燥48h。该纳米粒子平均粒径为280nm左右，纳米粒子表面电位为-3mV左右；每1mg PLGA纳米粒子约负载100μg蛋白质或多肽组分，每1mgPLGA纳米粒所使用的poly(I:C)免疫佐剂为0.02mg。空白纳米粒粒径为260nm左右，空白纳米粒制备时分别采用含有等量poly(I:C)的纯水或8M尿素代替相对应的水溶性抗原和非水溶性抗原。
(3)癌细胞特异性T细胞的分离和扩增
在每只C57BL/6小鼠背部皮下接种0.5×105个B16F10细胞，在肿瘤长到体积分别为约1000mm3时处死小鼠并摘取小鼠肿瘤组织和脾细胞。将小鼠肿瘤组织切成小块后使用胶原酶消化15分钟，然后通过细胞筛网制备单细胞悬液，离心并用PBS洗涤后使用流式细胞术从肿瘤组织单细胞悬液中分离活细胞中(使用活死细胞染料标记死细胞以去除死细胞)的CD3+T细胞。与此同时，将小鼠脾脏通过细胞筛网和裂解红细胞后制备脾细胞单细胞悬液，使用流式细胞术从脾细胞单细胞悬液中分选活细胞中(使用活死细胞染料标记死细胞以去除死细胞)的CD19+B细胞。将负载来源于肿瘤组织的癌细胞全细胞抗原的纳米粒子(50μg)、B细胞(200万个)和来自肿瘤浸润淋巴细胞的T细胞(50万个)在3mL RPMI 1649完全培养基中共孵育96小时(37℃，5％CO2)；或者将空白纳米粒子(50μg)+等量游离裂解液、B细胞(200万个)和来自肿瘤浸润淋巴细胞的T细胞(50万个)在3mL RPMI 1649完全培养基中共孵育96小时(37℃，5％CO2)；或者将B细胞(200万个)和来自肿瘤浸润淋巴细胞的T细胞(50万个)在3mL RPMI 1649完全培养基中共孵育96小时(37℃，5％CO2)。然后采用流式细胞术分选孵育后的细胞中的CD3+CD8+CD69+ T细胞，即为癌细胞特异性CD8+T细胞。将上述分选得到的癌细胞特异性T细胞与IL-2(2000U/mL)、IL-12(200U/mL)、IL-15(200U/mL)和αCD-3抗体(10ng/mL)共孵育10天(每两天换液一次)以扩增分选得到癌细胞特异性T细胞。
(4)癌细胞特异性T细胞用于癌症的预防
选取6-8周的雌性C57BL/6为模型小鼠制备黑色素瘤荷瘤小鼠，在小鼠过继转移细胞前1天,给受体小鼠腹腔注射100mg/kg剂量的环磷酰胺以清除受体小鼠体内的免疫细胞。然后，将步骤(3)制备得到的400万个癌细胞特异性T细胞静脉注射给受体小鼠。隔天，给每只受体小鼠背部右下方皮下接种1.5×105个B16F10细胞。监测小鼠肿瘤生长速度和小鼠生存期。在实验中，从第3天开始每3天记录一次小鼠肿瘤体积的大小。肿瘤体积采用公式v＝0.52×a×b2计算，其中v为肿瘤体积，a为肿瘤长度，b为肿瘤宽度。出于动物实验伦理，在小鼠生存期试验中当小鼠肿瘤体积超过2000mm3即视为小鼠死亡并将小鼠安乐死。
(4)实验结果
如图2所示，PBS对照组和接收无纳米粒辅助分离扩增的癌细胞特异性T细胞处理的小鼠其肿瘤生长速度很快，生存期很短。接收空白纳米粒+游离裂解液辅助分离扩增的癌细胞T细胞处理的小鼠其肿瘤生长速度变慢。接受负载癌细胞全细胞抗原的纳米粒子辅助分离扩增的癌细胞特异性T细胞处理的小鼠其肿瘤生长速度最慢，生存期最长。综上所述，本发明所述的癌细胞特异性T细胞对黑色素瘤具有良好的预防效果。
实施例2癌细胞特异性T细胞分离扩增后用于黑色素瘤的预防
本实施例以小鼠黑色素瘤为癌症模型来说明如何使用纳米粒子辅助分离扩增癌细胞特异性T细胞后用于预防黑色素瘤。本实施例中，裂解B16F10黑色素瘤肿瘤组织以制备肿瘤组织的水溶性抗原和非水溶性抗原，然后，以有PLGA为纳米粒骨架材料，以poly(I:C)和CpG1018为免疫佐剂采用溶剂挥发法制备负载有肿瘤组织的水溶性抗原和非水溶性抗原的纳米粒子系统，然后使用纳米粒子辅助分离肿瘤浸润淋巴细胞中的癌细胞特异性T细胞，分离得到的癌细胞特异性T细胞经扩增后注射到体内预防黑色素瘤。
(1)肿瘤组织的裂解及各组分的收集
在每只C57BL/6小鼠背部皮下接种1.5×105个B16F10细胞，在肿瘤长到体积分别为约1000mm3时处死小鼠并摘取肿瘤组织。将肿瘤组织切块后研磨，通过细胞过滤网加入适量纯水并反复冻融5次，并可伴有超声以破坏裂解细胞。待细胞裂解后，将裂解物以5000g的转速离心5分钟并取上清液即为可溶于纯水的水溶性抗原；在所得沉淀部分中加入8M尿素溶解沉淀部分即可将不溶于纯水的非水溶性抗原转化为在8M尿素水溶液中可溶。以上即为制备纳米粒子系统的抗原原料来源。
(2)纳米粒子系统的制备
本实施例中纳米疫苗及作为对照的空白纳米粒采用溶剂挥发法制备。在制备时负载癌细胞全细胞抗原中水溶性抗原的纳米疫苗和负载癌细胞全细胞抗原中非水溶性抗原的纳米粒子分别制备，然后使用时一起使用。所采用的纳米粒子制备材料PLGA分子量为7Da-17KDa，所采用的免疫佐剂为poly(I:C)和CpG1018且佐剂包载于纳米粒子内部。制备方法如前所述，在制备过程中首先采用复乳法在纳米粒子内部负载抗原和佐剂，在内部负载抗原(裂解组分)后，将100mg纳米粒子在10000g离心20分钟，并使用10mL含4％海藻糖的超纯水重悬后冷冻干燥48h。该纳米粒子平均粒径为280nm左右；每1mg PLGA纳米粒子约负载100μg蛋白质和多肽组分，每1mgPLGA纳米粒所使用的poly(I:C)和CpG1018免疫佐剂各0.02mg。本实施例中，采用等质量负载四种多肽新生抗原B16-M20(Tubb3,FRRKAFLHWYTGEAMDEMEFTEAESNM)，B16-M24(Dag1,TAVITPPTTTTKKARVSTPKPATPSTD)，B16-M46(Actn4,NHSGLVTFQAFIDVMSRETTDTDTADQ)和TRP2:180-188(SVYDFFVWL)的纳米粒子作为对照纳米粒子使用，对照纳米粒粒径为260nm左右，负载100μg多肽组分，负载等量佐剂。空白纳米粒粒径为250nm左右，只负载等量的免疫佐剂却不负载任何抗原组分。
(3)癌细胞特异性T细胞的分离和扩增
第0天，在每只C57BL/6小鼠背部皮下接种5×105个B16F10细胞，在第7天，第14天，第28天和分分别给小鼠别皮下注射100μL含水溶性抗原的1mgPLGA纳米粒子和100μL含非水溶性抗原的1mgPLGA纳米粒子。在第32天处死小鼠，收集小鼠的脾脏和肿瘤组织。将小鼠肿瘤组织切成小块后通过细胞筛网制备单细胞悬液，离心并用PBS洗涤后使用流式细胞术从肿瘤组织单细胞悬液中分离活细胞中(使用活死细胞染料标记死细胞以去除死细胞)的CD3+T细胞。与此同时，将小鼠脾脏通过细胞筛网和裂解红细胞后制备脾细胞单细胞悬液，使用流式细胞术从脾细胞单细胞悬液中分选活细胞中(使用活死细胞染料标记死细胞以去除死细胞)的CD19+B细胞。将负载来源于肿瘤组织的癌细胞全细胞抗原的纳米粒子(100μg)或多肽纳米粒子(100μg)或空白纳米粒(100μg)+游离裂解液与B细胞(200万个)、DC2.4细胞(200万个)和来自肿瘤浸润淋巴细胞的T细胞(40万个)在5mL RPMI1640完全培养基中共孵育48小时(37℃，5％CO2)，然后采用流式细胞术分选孵育后的CD3+CD134+ T细胞，即为被癌细胞全细胞抗原激活的癌细胞特异性T细胞。与此同时，使用流式细胞术分析不同纳米粒子与T细胞和抗原提呈细胞共孵育后CD3+CD134+ T细胞占CD3+ T细胞的比例。纳米粒子所负载的癌细胞全细胞抗原在被抗原提呈细胞(B细胞或DC细胞)吞噬后可被降解成抗原表位被提呈到抗原提呈细胞表面，可以识别癌细胞全细胞抗原的特异性T细胞即可以识别癌细胞全细胞抗原表位后被激活并表达特异性表面标志物，通过流式细胞术分析高表达特异性表面标志物的T细胞的比例，即可以知道被激活和可以分选出来的可以识别和具有杀伤效能的癌细胞特异性T细胞的数量。
将上述分选得到的癌细胞特异性T细胞与IL-2(2000U/mL)和αCD-3抗体(20ng/mL)共孵育14天(每两天换液一次)以扩增分选得到的癌细胞特异性T细胞。
(4)癌细胞特异性T细胞用于癌症的预防
选取6-8周的雌性C57BL/6为模型小鼠制备黑色素瘤荷瘤小鼠，在小鼠过继转移细胞前1天,给受体小鼠腹腔注射100mg/kg剂量的环磷酰胺以清除受体小鼠体内的免疫细胞。然后，将步骤(3)制备得到的100万个癌细胞特异性T细胞静脉注射给受体小鼠。隔天，给每只受体小鼠背部右下方皮下接种1.5×105个B16F10细胞。监测小鼠肿瘤生长速度和小鼠生存期。在实验中，从第3天开始每3天记录一次小鼠肿瘤体积的大小。肿瘤体积采用公式v＝0.52×a×b2计算，其中v为肿瘤体积，a为肿瘤长度，b为肿瘤宽度。出于动物实验伦理，在小鼠生存期试验中当小鼠肿瘤体积超过2000mm3即视为小鼠死亡并将小鼠安乐死。
(5)实验结果
如图3所示，接收PBS对照组和空白纳米粒对照组小鼠肿瘤生长速度都很快，小鼠生存期很短。与上述两组对照组相比，接收纳米粒辅助分离和扩增的癌细胞特异性T细胞的受体小鼠体内的肿瘤生长速度明显变慢，而且部分小鼠肿瘤消失痊愈。而且，负载癌细胞全细胞抗原的纳米粒子辅助分离扩增的癌细胞特异性T细胞对癌症的预防效果优于负载四种抗原多肽的纳米粒子辅助分离和扩增的癌细胞特异性T细胞。这说明负载四种新生抗原多肽纳米粒子能辅助分离的癌细胞特异性T细胞种类有限，因而扩增后的T细胞系统所含有的T细胞克隆数很少，所能识别和杀灭的癌细胞也就较少。而负载癌细胞全细胞抗原的纳米粒子能辅助分离更广谱的癌细胞特异性T细胞，因而扩增后所能得到的T细胞克隆数也就更广谱，所能识别和杀灭的癌细胞也就越多，治疗或预防癌症的效果也越好。
实施例3分选扩增的癌细胞特异性T细胞后用于黑色素瘤的治疗
本实施例以小鼠黑色素瘤为癌症模型来说明如何使用纳米粒子辅助分离扩增肿瘤组织浸润淋巴细胞中的癌细胞特异性T细胞后用于治疗黑色素瘤。本实施例中，首先裂解B16F10黑色素瘤肿瘤组织和癌细胞以制备肿瘤组织和癌细胞的水溶性抗原混合物(质量比1:1)和非水溶性抗原混合物(质量比1:1)，并将水溶性抗原混合物和非水溶性抗原混合物按质量比1:1混合。然后，以PLGA为纳米粒骨架材料，以Poly(I:C)和CpG2006为佐剂制备负载裂解物组分的纳米粒子，然后将纳米粒子与T细胞和抗原提呈细胞体外共孵育一定时间，激活癌细胞特异性T细胞和利用T细胞激活后高表达的表面标志物分离癌细胞特异性T细胞，扩增后用于治疗黑色素瘤。
(1)肿瘤组织和癌细胞的裂解及各组分的收集
收集肿瘤组织时先在每只C57BL/6小鼠背部皮下接种1.5×105个B16F10细胞，在肿瘤长到体积分别为约1000mm3时处死小鼠并摘取肿瘤组织，将肿瘤组织切块后研磨，通过细胞过滤网加入适量纯水并反复冻融5次，并可伴有超声以破坏裂解所得样品；收集培养的B16F10癌细胞系时，先离心去除培养基后使用PBS洗涤两次并离心收集癌细胞，将癌细胞在超纯水中重悬，反复冻融3次，并伴有超声破坏裂解癌细胞。待肿瘤组织或癌细胞裂解后，将裂解物以5000g的转速离心5分钟并取上清液即为可溶于纯水的水溶性抗原；在所得沉淀部分中加入8M尿素溶解沉淀部分即可将不溶于纯水的非水溶性抗原转化为在8M尿素水溶液中可溶。将肿瘤组织的水溶性抗原和癌细胞的水溶性抗原按质量比1:1混合；肿瘤组织的非水溶性抗原和癌细胞的非水溶性抗原按质量比1:1混合。将水溶性抗原混合物和非水溶性抗原混合物按质量比1:1混合，即为制备纳米粒子的抗原原料来源。
(2)纳米粒子的制备
本实施例中纳米粒子采用复乳法制备。所采用的纳米粒子制备材料PLGA分子量为7KDa-17KDa，所采用的免疫佐剂为poly(I:C)和CpG2006且佐剂包载于纳米粒子内。制备方法如前所述，在制备过程中首先采用复乳法在纳米粒子内部负载裂解液组分和佐剂，在内部负载裂解组分后，将100mg纳米粒子在10000g离心20分钟，并使用10mL含4％海藻糖的超纯水重悬后冷冻干燥48h；在使用前将其用9mL PBS重悬然后加入1mL的裂解液组分(蛋白质浓度80mg/mL)并室温作用10min，得到内外都负载裂解物的纳米粒子系统。该纳米粒子平均粒径为280nm左右，纳米粒子表面电位为-5mV左右；每1mg PLGA纳米粒子约负载130μg蛋白质或多肽组分，每1mg PLGA纳米粒所负载的poly(I:C)和CpG2006免疫佐剂各0.02mg。空白纳米粒粒径为260nm左右，空白纳米粒制备时分别采用含有等量佐剂。
(3)癌细胞特异性T细胞的分离和扩增
在第0天给每只C57BL/6小鼠背部皮下接种5×105个B16F10细胞，在第10天，第17天和第24天分别给小鼠皮下注射0.5mg PLGA纳米粒子。第31天处死小鼠，摘取小鼠肿瘤组织和脾脏。制备小鼠肿瘤组织单细胞悬液，使用磁珠分选法分选肿瘤浸润淋巴细胞中活细胞中(使用活死细胞染料标记死细胞以去除死细胞)的CD45+CD3+T细胞。制备脾细胞单细胞悬液，使用磁珠分选法分离脾细胞中活细胞中(使用活死细胞染料标记死细胞以去除死细胞)的CD19+B细胞。将分离得到B细胞(300万个)、DC2.4细胞(200万个)、T细胞(40万个)与负载肿瘤组织全组分抗原的纳米粒子(80μg)或者空白纳米粒子(80μg)+游离裂解液在40mL高糖DMEM完全培养基中共孵育72小时(37℃，5％CO2)，然后采用流式细胞术分选孵育后的CD3+CD69+ T细胞，即为被癌细胞全细胞抗原特异性激活的癌细胞特异性T细胞。与此同时，使用流式细胞术分析未经纳米粒子辅助分选的肿瘤组织浸润T细胞、与纳米粒子和抗原提呈细胞共孵育后的肿瘤组织浸润T细胞中CD3+CD69+ T细胞的比例。与此同时，将未经纳米粒子辅助分选的肿瘤组织浸润T细胞或者与纳米粒子和抗原提呈细胞共孵育后的肿瘤组织浸润T细胞，分别与B细胞(300万个)、DC2.4细胞(200万个)以及负载癌细胞全细胞抗原的纳米粒子(100μg)在3mL DMEM高糖完全培养基中共孵育48小时，然后收集孵育后的细胞并用带有荧光探针的IFN-γ抗体标记孵育后的细胞，尔后使用流式细胞术分析T细胞中IFN-γ+T细胞所占比例。纳米粒子所负载的癌细胞全细胞抗原在被抗原提呈细胞吞噬后可被降解成抗原表位被提呈到抗原提呈细胞表面，可以识别癌细胞全细胞抗原的特异性T细胞即可以识别癌细胞全细胞抗原表位后被激活并分泌杀伤性细胞因子。IFN-γ是抗原特异性T细胞识别抗原后被激活所分泌的最主要的细胞因子，但是由于其为分泌性细胞因子，所以需要做细胞固定和破膜后使用抗体染色(分析后细胞为死细胞)。使用流式细胞术分析的CD3+IFN-γ+T细胞即为可以识别和杀伤癌细胞的癌细胞特异性T细胞。
将上述分选得到的癌细胞特异性T细胞与IL-2(2000U/mL)在DMEM高糖完全培养基中共孵育7天(37℃，5％CO2，每两天换液一次)以扩增分选得到的癌细胞特异性T细胞。
(4)癌细胞特异性T细胞用于癌症的治疗
选取6-8周的雌性C57BL/6为模型小鼠制备黑色素瘤荷瘤小鼠。在第0天给每只小鼠背部右下方皮下接种1.5×105个B16F10细胞。在接种黑色素瘤后第4天、第7天、第10天、第15天、第20天和第25天分别静脉注射200万个癌细胞特异性T细胞。在实验中，从第3天开始每3天记录一次小鼠肿瘤体积的大小。肿瘤体积采用公式v＝0.52×a×b2计算，其中v为肿瘤体积，a为肿瘤长度，b为肿瘤宽度。出于动物实验伦理，在小鼠生存期试验中当小鼠肿瘤体积超过2000mm3即视为小鼠死亡并将小鼠安乐死。
(5)实验结果
如图4a和4b所示，PBS对照组和空白纳米粒对照组小鼠的肿瘤生长速度很快，而纳米粒子辅助分离和扩增的癌细胞特异性T细胞处理的小鼠其肿瘤生长速度明显变慢，而且部分小鼠肿瘤消失痊愈。综上所述，本发明所述的细胞系统对癌症具有优异的治疗效果。
如图4c和d所示，纳米粒子与抗原提呈细胞和肿瘤浸润T细胞共孵育后，CD3+IFN-γ+T细胞或者CD3+CD69+T细胞占CD3+T细胞的比例明显高于空白纳米粒子+游离裂解液组。而且CD3+IFN-γ+T细胞和CD3+CD69+T细胞占CD3+T细胞的比例基本相当。由此可见，本发明所述的分离方法可以有效的富集肿瘤组织中具有识别癌细胞和杀伤癌细胞能力的癌细胞特异性T细胞。
实施例4分选扩增的癌细胞特异性T细胞用于黑色素瘤肺转移的预防
本实施例以小鼠黑色素瘤肺模型来说明如何使用纳米粒子辅助分离癌细胞特异性T细胞，并用扩增后的细胞预防癌症转移。本实施例中，首先裂解B16F10黑色素瘤肿瘤组织以制备肿瘤组织的水溶性抗原和非水溶性抗原；然后，制备负载有肿瘤组织的水溶性抗原和非水溶性抗原的纳米粒子系统。在本实施例中采用了硅化和添加带电物质的方法来增加抗原的负载量，且只进行了一轮矿化处理。本实施例中，先使用纳米粒子辅助分离肿瘤浸润淋巴细胞中的癌细胞特异性T细胞，然后再体外扩增癌细胞特异性T细胞后注射使用。
(1)肿瘤组织的裂解及各组分的收集
在每只C57BL/6小鼠背部皮下接种1.5×105个B16F10细胞，在肿瘤长到体积分别为约1000mm3时处死小鼠并摘取肿瘤组织。将肿瘤组织切块后研磨，加入胶原酶在RPMI1640培养基中孵育30min,然后通过细胞过滤网加入适量纯水并反复冻融5次，并可伴有超声以破坏裂解细胞。待细胞裂解后，将裂解物以5000g的转速离心5分钟并取上清液即为可溶于纯水的水溶性抗原；在所得沉淀部分中加入8M尿素溶解沉淀部分即可将不溶于纯水的非水溶性抗原转化为在8M尿素水溶液中可溶，将水溶性抗原和非水溶性抗原按质量比2:1混合，即为制备粒子的抗原原料来源。
(2)纳米粒子的制备
本实施例中纳米粒子及作为对照的空白纳米粒采用溶剂挥发法制备，并进行了适当的修饰改进，在纳米粒子制备过程中采用低温硅化技术和添加带电物质两种修饰方法提高抗原的负载量。在制备时负载癌细胞全细胞抗原中水溶性抗原的纳米粒子和负载癌细胞全细胞抗原中非水溶性抗原的纳米粒子分别制备，然后使用时一起使用。所采用的纳米粒子制备材料PLGA分子量为24KDa-38KDa，所采用的免疫佐剂为poly(I:C)。制备方法如前所述，在制备过程中首先采用复乳法在纳米粒子内部负载抗原和佐剂，在内部负载抗原(裂解组分)后，将100mg纳米粒子在10000g离心20分钟，然后使用7mL PBS重悬纳米粒子并与3mL含有细胞裂解物(60mg/mL)的PBS溶液混合，尔后在10000g离心20分钟，然后采用10mL硅酸盐溶液(含150mM NaCl、80mM原硅酸四甲酯和1.0mM HCl，pH 3.0)重悬,并在室温固定10min，尔后在-80℃固定24h，使用超纯水离心洗涤后使用3mL含鱼精蛋白(5mg/mL)和聚赖氨酸(10mg/mL)的PBS重悬并作用10min,然后10000g离心20min洗涤，采用10mL含有细胞裂解物(50mg/mL)的PBS溶液重悬并作用10min,然后在10000g离心20分钟并使用10mL含4％海藻糖的超纯水重悬后冷冻干燥48h；在粒子使用前将其用7mL PBS重悬然后加入3mL含佐剂的癌组织裂解液组分(蛋白质浓度50mg/mL)并室温作用10min，得到内外都负载裂解物的经冷冻硅化和添加阳离子物质的修饰的纳米粒子系统。该纳米粒子平均粒径为350nm左右，纳米粒子表面电位为-3mV左右；每1mg PLGA纳米粒子约负载300μg蛋白质或多肽组分，每1mgPLGA纳米粒内外所使用的poly(I:C)免疫佐剂共约为0.02mg且内外各半。
对照纳米粒子将负载的癌细胞全细胞抗原替换为四种质量等量的黑色素瘤抗原多肽，其他与负载癌细胞全细胞抗原的纳米粒子相同。对照纳米粒子每1mgPLGA纳米粒所使用的poly(I:C)0.02mg，平均粒径为350nm左右，纳米粒子表面电位为-3mV左右。所负载的四种多肽新生抗原为B16-M20(Tubb3,FRRKAFLHWYTGEAMDEMEFTEAESNM)，B16-M24(Dag1,TAVITPPTTTTKKARVSTPKPATPSTD)，B16-M46(Actn4,NHSGLVTFQAFIDVMSRETTDTDTADQ)和TRP2:180-188(SVYDFFVWL)。
空白纳米粒粒径为300nm左右，空白纳米粒制备时分别采用含有等量poly(I:C)的纯水或8M尿素代替相对应的水溶性抗原和非水溶性抗原。
(3)树突状细胞的制备
本实施例以从小鼠骨髓细胞制备树突状细胞为例来说明如何制备骨髓来源的树突状细胞(BMDC)。首先，取1只6-8周龄C57小鼠颈椎脱臼处死，手术取出后腿的胫骨和股骨放入PBS中，用剪刀和镊子将骨周围的肌肉组织剔除干净。用剪刀剪去骨头两端，再用注射器抽取PBS溶液，针头分别从骨头两端插入骨髓腔，反复冲洗骨髓到培养皿中。收集骨髓溶液，400g离心3min后加入1mL红细胞裂解液裂红。加入3mL RPMI 1640(10％FBS)培养基终止裂解，400g离心3min，弃上清。将细胞放置10mm培养皿中培养，使用RPMI 1640(10％FBS)培养基，同时加入重组小鼠GM-CSF(20ng/mL)，37度，5％CO2培养7天。第3天轻轻摇晃培养瓶，补充同样体积含有GM-CSF(20ng/mL)RPMI1640(10％FBS)培养基。第6天，对培养基进行半量换液处理。第7天，收集少量悬浮及半贴壁细胞，通过流式检测，当CD86+CD80+细胞在CD11c+细胞中的比例为15-20％之间，诱导培养的BMDC即可被用来做下一步实验。
(4)癌细胞特异性T细胞的分离和扩增
在第0天给每只C57BL/6小鼠背部皮下接种5×105个B16F10细胞，在第7天，第14天，第21天和第28天分别给小鼠皮下注射100μL的1mgPLGA纳米粒子。在第35天处死小鼠，收集小鼠的肿瘤组织，将肿瘤组织切成小块后加入胶原酶消化30分钟，然后通过细胞筛网制备单细胞悬液，离心洗涤后使用流式细胞术分选肿瘤组织单细胞悬液中活细胞中(使用活死细胞染料标记死细胞以去除死细胞)的CD45+CD3+T细胞。将步骤(3)所制备的BMDC(300万个)与负载肿瘤组织全组分抗原的纳米粒子(80μg)或对照纳米粒子(80μg)在5mL DMEM高糖完全培养基中共孵育24小时(37℃,5％CO2)，然后加入50万个分选所得T细胞并继续共孵育24小时，尔后采用流式细胞术分选孵育后的CD3+CD69+ T细胞和CD3+CD25+ T细胞，即为被癌细胞全细胞抗原激活的癌细胞特异性T细胞。将上述分选得到的癌细胞特异性T细胞与IL-2(1000U/mL)、IL-7(200U/mL)、IL-15(200U/mL)、αCD-3抗体(10ng/mL)和αCD-28抗体(10ng/mL)在DMEM高糖完全培养基中共孵育14天(每两天换液一次)以扩增分离得到的癌细胞特异性T细胞。
(5)癌细胞特异性T细胞用于癌症转移的预防
选取6-8周的雌性C57BL/6为模型小鼠制备黑色素瘤荷瘤小鼠。在小鼠过继转移细胞前1天,给受体小鼠腹腔注射100mg/kg剂量的环磷酰胺以清除受体小鼠体内的免疫细胞。在第0天给小鼠静脉注射100μL的400万个癌细胞特异性T细胞。同时在第1天给每只小鼠静脉注射接种0.5×105个B16F10细胞，第14天处死小鼠，观察记录小鼠肺部黑色素瘤癌灶数量。
(6)实验结果
如图5所示，对照组小鼠的癌灶较多都长大，而经T细胞预处理的小鼠几乎没有癌灶。而且，负载癌细胞全细胞抗原的纳米粒子辅助分离扩增的T细胞对黑色素瘤肺转移的预防效果优于负载四种抗原多肽的纳米粒子辅助分离扩增的T细胞。这说明负载癌细胞全细胞抗原的纳米粒子能辅助分离更广谱和多样的癌细胞特异性T细胞，因而扩增后所能得到的T细胞克隆数也就更广谱，所能识别和杀灭的癌细胞也就越多，预防癌症转移的效果也越好。
实施例5微米粒子辅助分离扩增的癌细胞特异性T细胞用于预防癌症
本实施例中，首先使用6M盐酸胍裂解B16F10黑色素瘤癌细胞全细胞抗原。然后，以PLGA为微米粒骨架材料，以CpG BW006为免疫佐剂制备负载有癌细胞全细胞抗原的微米粒子系统。在本实施例中采用了硅化、添加阳离子物质和阴离子物质的方法增加抗原的负载量，而且进行了两轮硅化处理。微米粒子激活癌细胞特异性T细胞后，将被激活的癌细胞特异性T细胞分离后进行扩增，然后注射给小鼠预防癌症。
(1)癌细胞的裂解
将培养的B16F10黑色素瘤癌细胞系收集后在350g离心5分钟，然后弃去上清并用PBS洗涤两遍，然后采用6M盐酸胍重悬和裂解癌细胞，癌细胞全细胞抗原裂解并溶于6M盐酸胍后即为制备微米粒子系统的抗原原料来源。
(2)微米粒子系统的制备
本实施例中微米粒子及作为对照的空白微米粒采用复乳法制备，对复乳法进行了适当的修饰改进，在微米粒子制备过程中采用低温硅化技术和添加带电物质两种修饰方法提高抗原的负载量。所采用的微米粒子制备材料PLGA分子量为38KDa-54KDa，所采用的免疫佐剂为CpG。制备方法如前所述，在制备过程中首先采用复乳法在微米粒子内部负载癌细胞全细胞抗原和佐剂，在内部负载裂解组分后，将100mg微米粒子在10000g离心15分钟，然后使用7mL PBS重悬微米粒子并与3mL含有细胞裂解物(50mg/mL)的PBS溶液混合，尔后在10000g离心20分钟，然后采用10mL硅酸盐溶液(含120mM NaCl、100mM原硅酸四甲酯和1.0mMHCl，pH 3.0)重悬,并在室温固定12h，使用超纯水离心洗涤后使用3mL含聚天冬氨酸(10mg/mL)的PBS重悬并作用10min,然后10000g离心15min洗涤，采用10mL含有细胞裂解物(50mg/mL)的PBS溶液重悬并作用10min,然后在10000g离心20分钟。然后采用10mL硅酸盐溶液(含150mM NaCl、80mM原硅酸四甲酯和1.0mM HCl，pH 3.0),并在室温固定12h，使用超纯水离心洗涤后使用3mL含组蛋白(5mg/mL)和聚精氨酸(10mg/mL)的PBS重悬并作用10min,然后10000g离心15min洗涤，采用10mL含有细胞裂解物(50mg/mL)的PBS溶液重悬并作用10min,然后在10000g离心15分钟，并使用10mL含4％海藻糖的超纯水重悬后冷冻干燥48h；在粒子使用前将其用7mL PBS重悬然后加入3mL含佐剂的癌细胞裂解液组分(蛋白质浓度50mg/mL)并室温作用10min，得到内外都负载裂解物的经两轮冷冻硅化、添加阳离子物质和阴离子物质的修饰的微米粒子。该微米粒子平均粒径为2.50μm左右，微米粒子表面电位为-2mV左右；每1mg PLGA微米粒子约负载340μg蛋白质或多肽组分，每1mgPLGA微米粒内外所使用的CpG免疫佐剂共约为0.02mg且内外各半。
对照微米粒子将负载的癌细胞全细胞抗原替换为四种质量等量的黑色素瘤抗原多肽，其他与负载癌细胞全细胞抗原的微米粒子相同。对照微米粒子每1mgPLGA微米粒所使用的佐剂为0.02mg，粒径为2.50μm左右，微米粒子表面电位为-2mV左右，每1mg PLGA微米粒子约负载340μg蛋白质或多肽组分。所负载的四种多肽新生抗原为B16-M20(Tubb3,FRRKAFLHWYTGEAMDEMEFTEAESNM)，B16-M24(Dag1,TAVITPPTTTTKKARVSTPKPATPSTD)，B16-M46(Actn4,NHSGLVTFQAFIDVMSRETTDTDTADQ)和TRP2:180-188(SVYDFFVWL)。
空白微米粒粒径为2.43μm左右，表面电位为-3mV左右，空白微米粒制备时采用含有等量CpG的6M盐酸胍代替相对应的细胞组分。
(3)树突状细胞的制备
本实施例以从小鼠骨髓细胞制备树突状细胞为例来说明如何制备骨髓来源的树突状细胞(BMDC)。首先，取1只6-8周龄C57小鼠颈椎脱臼处死，手术取出后腿的胫骨和股骨放入PBS中，用剪刀和镊子将骨周围的肌肉组织剔除干净。用剪刀剪去骨头两端，再用注射器抽取PBS溶液，针头分别从骨头两端插入骨髓腔，反复冲洗骨髓到培养皿中。收集骨髓溶液，400g离心3min后加入1mL红细胞裂解液裂红。加入3mL RPMI 1640(10％FBS)培养基终止裂解，400g离心3min，弃上清。将细胞放置10mm培养皿中培养，使用RPMI 1640(10％FBS)培养基，同时加入重组小鼠GM-CSF(20ng/mL)，37度，5％CO2培养7天。第3天轻轻摇晃培养瓶，补充同样体积含有GM-CSF(20ng/mL)RPMI1640(10％FBS)培养基。第6天，对培养基进行半量换液处理。第7天，收集少量悬浮及半贴壁细胞，通过流式检测，当CD86+CD80+细胞在CD11c+细胞中的比例为15-20％之间，诱导培养的BMDC即可被用来做下一步实验。
(4)癌细胞特异性T细胞的分离和扩增
第0天，在每只C57BL/6小鼠背部皮下接种1.5×105个B16F10细胞。在第10天，第15天，第20天使用射线照射肿瘤部位对小鼠进行放射线照射治疗。在第25天处死小鼠，收集各组小鼠的肿瘤组织，将小鼠肿瘤组织切成小块后过细胞筛网，制备单细胞悬液，然后使用磁珠分选法分选肿瘤组织单细胞悬液中的活细胞中(使用活死细胞染料标记死细胞以去除死细胞)的CD3+ T细胞。将分选所得T细胞(50万个)、步骤(3)所制备的BMDC(500万个)与微米粒子(100μg)在2mL RPMI1640完全培养基中共孵育24小时(37℃,5％CO2)，尔后采用磁珠分选法分选T细胞中的CD69+ T细胞，即为被癌细胞全细胞抗原激活的癌细胞特异性T细胞。将上述分选得到的癌细胞特异性T细胞与IL-2(2000U/mL)、αCD-3抗体(20ng/mL)及αCD-28抗体(20ng/mL)在RPMI1640完全培养基中共孵育7天(两天换液一次)以扩增分选得到的癌细胞特异性T细胞。
(5)癌细胞特异性T细胞扩增后用于癌症的预防
选取6-8周的雌性C57BL/6为模型小鼠制备黑色素瘤荷瘤小鼠。在小鼠过继转移细胞前1天,给受体小鼠腹腔注射100mg/kg剂量的环磷酰胺以清除受体小鼠体内的免疫细胞。在第0天给小鼠静脉注射100μL含300万个癌细胞特异性T细胞。同时在第0天给每只小鼠皮下注射接种1.5×105个B16F10细胞，从第3天开始每3天记录一次小鼠肿瘤体积的大小。肿瘤体积采用公式v＝0.52×a×b2计算，其中v为肿瘤体积，a为肿瘤长度，b为肿瘤宽度。出于动物实验伦理，在小鼠生存期试验中当小鼠肿瘤体积超过2000mm3即视为小鼠死亡并将小鼠安乐死。
(6)实验结果
如图6所示，对照组小鼠的肿瘤都长大，而使用癌细胞特异性T细胞处理小鼠肿瘤生长速度都明显变慢且生存期明显延长。而且，负载癌细胞全细胞抗原的微米粒子辅助分离扩增的T细胞对黑色素瘤的预防效果优于负载四种抗原多肽的微米粒子辅助分离扩增的T细胞。这说明负载四种新生抗原多肽微米粒子能辅助分离的癌细胞特异性T细胞种类有限，因而扩增后的T细胞系统所含有的T细胞克隆数很少，所能识别和杀灭的癌细胞也就较少。而负载癌细胞全细胞抗原的微米粒子能辅助分离更多样的癌细胞特异性T细胞，因而扩增后所能得到的T细胞克隆数也就更广谱，所能识别和杀灭的癌细胞也就越多，治疗或预防癌症的效果也越好。
实施例6癌细胞特异性T细胞用于癌症的预防
本实施例中，首先使用8M尿素裂解B16F10黑色素瘤肿瘤组织，并溶解肿瘤组织裂解物组分。然后，以PLGA为纳米粒骨架材料，以Poly(I:C)和CpG2006为免疫佐剂制备负载有癌细胞全细胞抗原的纳米粒子系统，使用纳米粒子和抗原提呈细胞体外激活和分离出肿瘤浸润淋巴细胞中的癌细胞特异性T细胞后，将上述细胞扩增后用于预防癌症。
(1)肿瘤组织的收集及裂解
在每只C57BL/6小鼠背部皮下接种1.5×105个B16F10细胞，在肿瘤长到体积分别为约1000mm3时处死小鼠并摘取肿瘤组织。将肿瘤组织切块后研磨，通过细胞过滤网加入适量8M尿素裂解细胞，并溶解细胞裂解物。以上即为制备纳米粒子系统的抗原原料来源。
(2)纳米粒子系统的制备
本实施例中纳米粒子及作为对照的空白纳米粒采用溶剂挥发法制备。所采用的纳米粒子制备材料PLGA分子量为7KDa-17KDa，所采用的免疫佐剂为poly(I:C)和CpG2006,且裂解物组分和佐剂包载于纳米粒子内部。制备方法如前所述，在制备过程中首先采用复乳法在纳米粒子内部负载裂解物组分和佐剂，在内部负载抗原裂解组分和佐剂后，将100mg纳米粒子在12000g离心20分钟，并使用10mL含4％海藻糖的超纯水重悬后冷冻干燥48h，得冻干粉后备用。该纳米粒子平均粒径为270nm左右，纳米粒子表面电位为-3mV左右；每1mgPLGA纳米粒子约负载110μg蛋白质或多肽组分，每1mg PLGA纳米粒所使用的poly(I:C)和CpG2006免疫佐剂各为0.02mg。空白纳米粒粒径为250nm左右，空白纳米粒制备时采用含等量poly(I:C)和CpG2006的8M尿素代替裂解物组分。对照纳米粒子负载四种等质量的的黑色素瘤新生抗原多肽来代替裂解物组分，其他与负载癌细胞全细胞抗原的纳米粒子相同。对照纳米粒子每1mgPLGA纳米粒所使用的poly(I:C)和CpG2006免疫佐剂各为0.02mg，粒径为270nm左右，纳米粒子表面电位为-3mV左右，每1mg PLGA纳米粒子约负载110μg多肽组分。所负载的四种多肽新生抗原为B16-M20(Tubb3,FRRKAFLHWYTGEAMDEMEFTEAESNM)，B16-M24(Dag1,TAVITPPTTTTKKARVSTPKPATPSTD)，B16-M46(Actn4,NHSGLVTFQAFIDVMSRETTDTDTADQ)和TRP2:180-188(SVYDFFVWL)。
(3)癌细胞特异性T细胞的分离和扩增
第0天，在每只C57BL/6小鼠背部皮下接种1.5×105个B16F10细胞，在第第8天，第10天，第12天，第14天，第16天，第18天，第20天和分分别给小鼠别皮下注射100μL的αPD-1抗体(10mg/kg)。在第24天处死小鼠，分别收集各组小鼠的肿瘤组织，制备肿瘤组织单细胞悬液，然后使用磁珠分选法分选得到肿瘤组织单细胞悬液中的活细胞中(使用活死细胞染料标记死细胞以去除死细胞)的CD3+T细胞。然后，将分选得到的T细胞(50万个)与来源于同种异体的B细胞(250万个)、负载肿瘤组织全组分抗原的纳米粒子(100μg)或对照纳米粒子(100μg)在10mL RPMI1640完全培养基中共孵育48小时(37℃,5％CO2)，然后采用流式细胞术分选孵育后的CD3+CD8+CD69+ T细胞和CD3+CD4+CD69+ T细胞，即为被癌细胞全细胞抗原激活的癌细胞特异性T细胞。将上述分选得到的癌细胞特异性T细胞与IL-2(2000U/mL)、αCD-3抗体(20ng/mL)以及αCD-28抗体(20ng/mL)在RPMI1640完全培养基中共孵育11天(每两天换液一次)以扩增分选得到的癌细胞特异性T细胞。
(4)癌细胞特异性T细胞用于癌症的预防
选取6-8周的雌性C57BL/6为模型小鼠制备黑色素瘤荷瘤小鼠。在小鼠癌细胞特异性T细胞移植前1天,给受体小鼠腹腔注射100mg/kg剂量的环磷酰胺以清除受体小鼠体内的免疫细胞。在第0天给小鼠皮下注射100μL的80万个扩增得到的癌细胞特异性CD8+T细胞和20万个扩增得到的癌细胞特异性CD4+T细胞。同时在第0天给每只小鼠皮下注射接种1.5×105个B16F10细胞，从第3天开始每3天记录一次小鼠肿瘤体积的大小。肿瘤体积采用公式v＝0.52×a×b2计算，其中v为肿瘤体积，a为肿瘤长度，b为肿瘤宽度。出于动物实验伦理，在小鼠生存期试验中当小鼠肿瘤体积超过2000mm3即视为小鼠死亡并将小鼠安乐死。
(5)实验结果
如图7所示，对照组小鼠的肿瘤都长大，而经负载癌细胞全细胞抗原的纳米粒子辅助分离扩增得到的癌细胞特异性T细胞进行移植的小鼠肿瘤生长速度都明显变慢，且大部分小鼠癌细胞接种后肿瘤消失。负载癌细胞全细胞抗原的纳米粒子辅助分离扩增的T细胞对黑色素瘤的预防效果优于负载四种抗原多肽的纳米粒子辅助分离扩增的T细胞，这说明负载四种新生抗原多肽纳米粒子能辅助分离的癌细胞特异性T细胞种类有限，因而扩增后的T细胞系统所含有的T细胞克隆数很少，所能识别和杀灭的癌细胞也就较少。而负载癌细胞全细胞抗原的纳米粒子能辅助分离更多样的癌细胞特异性T细胞，因而扩增后所能得到的T细胞克隆数也就更广谱，所能识别和杀灭的癌细胞也就越多，治疗或预防癌症的效果也越好。
实施例7癌细胞特异性T细胞用于治疗结肠癌
本实施例以MC38小鼠结肠癌为癌症模型来说明如何使用纳米粒子辅助分离广谱的癌细胞特异性T细胞用于治疗结肠癌。首先裂解结肠癌肿瘤组织和肺癌癌细胞以制备水溶性抗原混合物(质量比1:1)和非水溶性抗原(质量比1:1)混合物，并将水溶性抗原混合物和非水溶性抗原混合物按质量比1:1混合。然后，以PLA为纳米粒骨架材料，以CpGM362和卡介苗(BCG)为免疫佐剂制备纳米粒子，并用该纳米粒子体外激活癌细胞特异性T细胞，然后分离提取扩增癌细胞特异性T细胞用于治疗结肠癌。
(1)肿瘤组织和癌细胞的裂解及各组分的收集
在每只C57BL/6小鼠背部皮下接种2×106个MC38细胞在肿瘤长到体积分别为约1000mm3时处死小鼠并摘取肿瘤组织。将肿瘤组织切块后研磨，通过细胞过滤网加入适量纯水并反复冻融5次，并可伴有超声以破坏裂解细胞。待细胞裂解后，将裂解物以大于5000g的转速离心5分钟并取上清液即为可溶于纯水的水溶性抗原；在所得沉淀部分中加入8M尿素溶解沉淀部分即可将不溶于纯水的非水溶性抗原转化为在8M尿素水溶液中可溶。
将培养的LLC肺癌细胞系收集后在350g离心5分钟，然后弃去上清并用PBS洗涤两遍，然后采用超纯水重悬细胞并反复冻融5次，并可伴有超声以破坏裂解细胞。待细胞裂解后，将裂解物以3000g的转速离心6分钟并取上清液即为可溶于纯水的水溶性抗原；在所得沉淀部分中加入8M尿素溶解沉淀部分即可将不溶于纯水的非水溶性抗原转化为在8M尿素水溶液中可溶。
将来自结肠癌肿瘤组织的和肺癌癌细胞的的水溶性抗原按质量比1:1混合；溶解于8M尿素中的非水溶性抗原也按质量比1:1混合。然后将水溶性抗原混合物和非水溶性抗原混合物按照质量比1:1混合，该混合物为制备纳米粒子的原料来源。
(2)BCG的裂解和各组分的收集
BCG的裂解方法和各组分的收集方法同癌细胞的裂解方法和各组分的收集方法，水溶性抗原和溶解的非水溶性抗原按质量比1:1混合。
(3)纳米粒子的制备
本实施例中纳米粒采用溶剂挥发法制备。所采用的纳米粒子制备材料PLA分子量为20KDa，所采用的免疫佐剂为CpGM362和BCG，且佐剂同时分布于纳米粒子内部和表面。制备方法如前所述，在制备过程中首先采用复乳法在纳米粒子内部负载裂解物混合物和佐剂，在内部负载裂解物和佐剂后，将100mg纳米粒子在10000g离心20分钟，并使用10mL含4％海藻糖的超纯水重悬后冷冻干燥48h。使用前将20mg纳米粒重悬于0.9mL PBS中，并于0.1mL含有裂解物混合物(80mg/mL)和佐剂的样品室温混合孵育5分钟后即可使用。该纳米粒子平均粒径为280nm左右，纳米粒子表面电位为-3mV左右；每1mg PLGA纳米粒子约负载140μg蛋白质或多肽组分，每1mgPLGA纳米粒含有CpGM362和BCG免疫佐剂各0.04mg。空白纳米粒粒径为260nm左右，空白纳米粒制备时分别采用含有等量佐剂的溶液代替相应裂解物组分。
(4)癌细胞特异性T细胞的分离和扩增
第0天每只C57BL/6小鼠背部皮下接种1.5×105个MC38细胞，在第10天，第15天和第21天分别给小鼠皮下注射100μL的1mg PLGA纳米粒子。在第24天处死小鼠，收集小鼠的肿瘤组织，制备肿瘤组织单细胞悬液并使用磁珠法从中分选出活细胞中(使用活死细胞染料标记死细胞以去除死细胞)的T细胞。将T细胞(40万个)、B细胞(40万个)、巨噬细胞(40万个)以及负载肿瘤组织全组分的纳米粒子(40μg)在DMEM完全培养基中共孵育96小时，然后采用流式细胞术分选孵育后的CD3+CD8+CD69+ T细胞，即为被癌细胞全细胞抗原激活的癌细胞特异性T细胞。将上述分选得到的癌细胞特异性T细胞与IL-2(1000U/mL)、IL-7(200U/mL)、IL-15(200U/mL)和αCD-3抗体(10ng/mL)在DMEM完全培养基中共孵育8天(每两天换液一次)以扩增分选得到的癌细胞特异性CD8+ T细胞。
(5)癌细胞特异性CD8+ T细胞用于癌症的治疗
选取6-8周的雌性C57BL/6为模型小鼠制备结肠癌荷瘤小鼠。在第0天给每只小鼠皮下接种2×106个MC38细胞，在第4、第7天、第10天、第15天和第20天分别给小鼠注射100μL含200万个癌细胞特异性CD8+T细胞。从第3天开始每3天记录一次小鼠肿瘤体积的大小。肿瘤体积采用公式v＝0.52×a×b2计算，其中v为肿瘤体积，a为肿瘤长度，b为肿瘤宽度。出于动物实验伦理，在小鼠生存期试验中当小鼠肿瘤体积超过2000mm3即视为小鼠死亡并将小鼠安乐死。
(6)实验结果
如图8所示，PBS对照组和空白纳米粒对照组小鼠的肿瘤都生长很快小鼠生存期很短。与对照组相比，纳米粒子辅助分离和扩增的癌细胞特异性T细胞移植组小鼠肿瘤生长速度明显变慢，而且部分小鼠肿瘤消失痊愈。综上所述，本发明所述免疫细胞治疗方案对结肠癌具有良好的治疗效果。
实施例8纳米粒子辅助分离的肿瘤浸润T细胞用于治疗黑色素瘤
本实施例以黑色素瘤为癌症模型来说明如何使用负载来源于黑色素瘤和肺癌肿瘤组织的癌细胞全细胞抗原的纳米粒子辅助分离肿瘤浸润淋巴细胞中的癌细胞特异性T细胞，并用该细胞治疗黑色素瘤。本实施例中，首先裂解B16F10黑色素瘤肿瘤组织和LLC肺癌肿瘤组织以制备肿瘤组织的水溶性抗原混合物(质量比3:1)和非水溶性抗原混合物(3:1)。以PLGA为纳米粒骨架材料，以锰颗粒和CpG2395为免疫佐剂制备负载上述混合物的纳米粒子，然后用该纳米粒子激活肿瘤浸润淋巴细胞中的癌细胞特异性T细胞，并分离扩增上述细胞用于癌症治疗。
(1)肿瘤组织的裂解及各组分的收集
在每只C57BL/6小鼠背部皮下接种1.5×105个B16F10细胞或者2×106个LLC肺癌细胞，在肿瘤长到体积分别为约1000mm3时处死小鼠并摘取肿瘤组织。肿瘤的裂解和各组分收集方法同实施例1。将来自黑色素瘤肿瘤组织的和来自肺癌肿瘤组织的水溶性抗原和溶解于8M尿素中的原非水溶性抗原分别按照3:1的比例混合即为制备纳米粒子的抗原来源。
(2)纳米粒子的制备
本实施例中纳米粒子采用复乳法制备。在制备时负载癌细胞全细胞抗原中水溶性抗原的纳米粒子和负载癌细胞全细胞抗原中非水溶性抗原的纳米粒子分别制备，然后使用时一起使用。所采用的纳米粒子制备材料PLGA分子量为24KDa-38KDa，所采用的免疫佐剂为锰胶体颗粒和CpG2395。先制备锰佐剂，然后将锰佐剂与癌细胞全细胞抗原中的水溶性抗原或非水溶性抗原混合后作为第一水相采用复乳法制备内部负载抗原和佐剂的纳米粒。在制备锰佐剂时，先将1mL 0.3M的Na3PO4溶液加入到9mL生理盐水中，后加入2mL 0.3M的MnCl2溶液，放置过夜后，即得到Mn2OHPO4胶体锰佐剂，锰佐剂粒径约为13nm。然后将锰佐剂与癌细胞全细胞抗原中的水溶性抗原(60mg/mL)或非水溶性抗原(60mg/mL)按1:3体积比混合后采用复乳法将抗原和锰佐剂负载到纳米粒内部。在内部负载抗原(裂解组分)和佐剂后，将100mg纳米粒子在10000g离心20分钟，使用10mL含4％海藻糖的超纯水重悬后冷冻干燥48h后备用。该纳米粒子平均粒径为370nm左右，纳米粒子表面电位为-5mV左右；每1mg PLGA纳米粒子约负载120μg蛋白质或多肽组分，每1mg PLGA纳米粒使用CpG2395佐剂为0.04mg。
空白纳米粒粒径为310nm左右，空白纳米粒制备时分别采用含有等量锰佐剂和CpG2395佐剂的纯水或8M尿素代替相对应的水溶性抗原和非水溶性抗原。
(3)树突状细胞的制备
同实施例4。
(4)癌细胞特异性T细胞的分离和扩增
第0天每只C57BL/6小鼠背部皮下接种1.5×105个B16F10细胞，在第10天，第15天和第20天分别给小鼠皮下注射100μL的负载水溶性抗原的1mg PLGA纳米粒子和100μL的负载非水溶性抗原的1mg PLGA纳米粒子。在第24天处死小鼠，收集小鼠肿瘤组织，制备肿瘤组织单细胞悬液并使用磁珠法从中分选出活细胞中(使用活死细胞染料标记死细胞以去除死细胞)的CD3+T细胞。将T细胞(30万个)、BMDC(300万个)以及负载肿瘤组织水溶性抗原的纳米粒子(60μg)和负载非水溶性抗原的纳米粒子(60μg)在3mL RPMI1640完全培养基中共孵育96小时(37℃，5％CO2)，然后采用流式细胞术分选孵育后的CD3+CD69+ T细胞，即为被癌细胞全细胞抗原激活的癌细胞特异性T细胞。将上述分选得到的癌细胞特异性T细胞与IL-2(4000U/mL)和αCD-3抗体(20μg)在RPMI1640完全培养基中共孵育12天(每两天换液一次)以扩增分选得到的癌细胞特异性T细胞。
(5)癌细胞特异性T细胞用于癌症的治疗
选取6-8周的雌性C57BL/6为模型小鼠制备黑色素瘤荷瘤小鼠。在第0天给每只小鼠皮下接种1.5×105个B16F10细胞，在第4、第7天、第10天、第15天和第20天分别给小鼠注射100μL含200万个癌细胞特异性T细胞。从第3天开始每3天记录一次小鼠肿瘤体积的大小。肿瘤体积采用公式v＝0.52×a×b2计算，其中v为肿瘤体积，a为肿瘤长度，b为肿瘤宽度。在小鼠生存期试验中当小鼠肿瘤体积超过2000mm3即视为小鼠死亡并将小鼠安乐死。
(6)实验结果
如图9所示，PBS对照组和空白纳米粒对照组小鼠的肿瘤都很快长大，与对照组相比，纳米粒子辅助分离的肿瘤浸润T细胞移植组小鼠肿瘤生长速度明显变慢，而且部分小鼠肿瘤消失痊愈。综上所述，本发明所述细胞治疗方案对黑色素瘤具有治疗效果。
实施例9癌细胞特异性T细胞用于乳腺癌的预防
本实施例以4T1小鼠三阴性乳腺癌为癌症模型来说明如何采用8M尿素溶解癌细胞全细胞抗原并制备负载有癌细胞全细胞抗原的微米粒子系统，并用该微米粒子辅助分离来自肿瘤组织浸润的癌细胞特异性T细胞并用于预防乳腺癌。
(1)癌细胞的裂解
将培养的4T1细胞在400g离心5分钟，然后用PBS洗涤两遍后重悬于超纯水中。所得癌细胞分别采用紫外线和高温加热进行灭活和变性处理，然后采用适量8M尿素裂解乳腺癌细胞并溶解裂解物即为制备粒子系统的原料来源。
(2)微米粒子系统的制备
本实施例中制备微米粒子采用复乳法，微米粒子骨架材料PLGA分子量为38KDa-54KDa，所采用的免疫佐剂为CpG2395和Poly(I:C)。制备时先采用复乳法制备内部负载裂解物组分和佐剂的微米粒子,在内部负载裂解物和佐剂后，将100mg微米粒子在9000g离心20分钟，使用10mL含4％海藻糖的超纯水重悬后干燥48h后备用。该微米粒子系统平均粒径为2.1μm左右，表面电位为-6mV左右；每1mg PLGA微米粒子约负载110μg蛋白质或多肽组分，含CpG2395和Poly(I:C)各0.03mg。
(3)树突状细胞的制备
同实施例4。
(4)癌细胞特异性T细胞的分离和扩增
第0天每只BALB/c小鼠背部皮下接种1×106个4T1细胞，在第10天，第17天和第24天分别给小鼠皮下注射100μL的1mg PLGA微米粒子。在第30天处死小鼠，收集小鼠的肿瘤组织及脾脏，制备肿瘤组织单细胞悬液和脾细胞单细胞悬液。使用流式细胞术从肿瘤组织单细胞悬液中分离活细胞中(使用活死细胞染料标记死细胞以去除死细胞)的CD3+T细胞；从脾细胞中分离活细胞中(使用活死细胞染料标记死细胞以去除死细胞)的CD19+B细胞。将T细胞(10万个)、B细胞(300万个)、BMDC(200万个)以及微米粒子(20μg)在2mL DMEM完全培养基中共孵育72小时(37℃，5％CO2)，然后采用流式细胞术从中分选出CD3+CD69+ T细胞，即为被癌细胞全细胞抗原激活的癌细胞特异性T细胞；或者将T细胞(10万个)、B细胞(500万个)以及微米粒子(20μg)在2mL DMEM完全培养基中共孵育72小时(37℃，5％CO2)，然后采用流式细胞术从中分选出CD3+CD69+ T细胞，即为被癌细胞全细胞抗原激活的癌细胞特异性T细胞。将上述两种方案分选得到的癌细胞特异性T细胞分别与IL-2(4000U/mL)和αCD-3抗体(20ng/mL)在DMEM完全培养基中共孵育12天(每两天换液一次)扩增分选得到的癌细胞特异性T细胞。
(4)癌细胞特异性T细胞用于癌症的预防
选取6-8周的雌性BALB/c为模型小鼠制备乳腺癌荷瘤小鼠。在小鼠过继转移细胞前1天,给受体小鼠腹腔注射100mg/kg剂量的环磷酰胺以清除受体小鼠体内的免疫细胞。在第0天给小鼠皮下注射100μL的150万个扩增的癌细胞特异性T细胞。同时在第0天给每只小鼠皮下注射接种1×106个4T1细胞，从第3天开始每3天记录一次小鼠肿瘤体积的大小。小鼠肿瘤监测方法同上。
(5)实验结果
如图10所示，与对照组相比，微米粒辅助分离得到的癌细胞特异性T细胞处理的小鼠肿瘤生长速度明显变慢且生存期明显延长。而且，在分离癌细胞特异性T细胞过程中同时使用两种抗原提呈细胞好于只使用一种抗原提呈细胞。由此可见，本发明所述的T细胞对乳腺癌具有预防效果。
实施例10癌细胞特异性T细胞用于癌症转移的预防
本实施例以小鼠黑色素瘤小鼠肺转移癌症模型来说明使用纳米粒子辅助分离的来自肿瘤组织浸润淋巴细胞的癌细胞特异性T细胞用于预防癌症转移。在实际应用时具体剂型，佐剂，给药时间、给药次数、给药方案可根据情况调整。本实施例中，将小鼠黑色素瘤肿瘤组织和癌细胞以8M尿素裂解后溶解，然后肿瘤组织裂解组分和癌细胞裂解组分按质量比1:2负载于纳米粒子系统，并用该粒子辅助分离肿瘤组织浸润淋巴细胞中的癌细胞特异性T细胞，预防小鼠体内的癌症转移。在本实施例中，采用负载四种多肽新生抗原B16-M20(Tubb3,FRRKAFLHWYTGEAMDEMEFTEAESNM)，B16-M24(Dag1,TAVITPPTTTTKKARVSTPKPATPSTD)，B16-M46(Actn4,NHSGLVTFQAFIDVMSRETTDTDTADQ)和TRP2:180-188(SVYDFFVWL)的纳米粒子作为对照纳米粒子使用。
(1)肿瘤组织和癌细胞的裂解
收集小鼠B16F10黑色素瘤肿瘤组织和培养的癌细胞后采用8M尿素裂解和溶解来自肿瘤组织和癌细胞的癌细胞全细胞抗原，然后肿瘤组织组分和癌细胞组分按质量比1:2混溶。
(2)纳米粒子的制备
本实施例中纳米粒子采用溶剂挥发法制备，所采用的纳米粒子制备材料PLGA分子量为24KDa-38KDa，不使用任何免疫佐剂。制备方法如前所述，在制备过程中首先采用复乳法在纳米粒子内部负载细胞组分，在内部负载裂解组分后，将100mg纳米粒子在10000g离心20分钟，并使用10mL含4％海藻糖的超纯水重悬后冷冻干燥48h后备用。该纳米粒子平均粒径为270nm左右；每1mg PLGA纳米粒子约负载90μg蛋白质和多肽组分。负载四种抗原多肽的对照纳米粒子制备方法同上，对照纳米粒子粒径为260nm左右，每1mg PLGA纳米粒子约负载90μg抗原多肽。空白对照纳米粒不负载任何细胞组分。
(3)癌细胞特异性T细胞的分离和扩增
在第0天给每只C57BL/6小鼠背部皮下接种1.5×105个B16F10细胞，在第14天和第24天分别给小鼠皮下注射100μL的1mg PLGA纳米粒子。在第26天处死小鼠并摘取小鼠肿瘤组织。分别制备肿瘤组织单细胞悬液和脾细胞单细胞悬液。从肿瘤组织单细胞悬液中使用流式细胞术分离肿瘤浸润的活细胞中(使用活死细胞染料标记死细胞以去除死细胞)的CD45+淋巴细胞；使用流式细胞术从脾细胞中分离活细胞中(使用活死细胞染料标记死细胞以去除死细胞)的CD19+B细胞和CD11c+DC细胞。将CD45+细胞(100万个)、B细胞(200万个)、DC细胞(40万个)与负载癌细胞全细胞抗原的纳米粒子(80μg)或80μg对照纳米粒子(或80μg空白纳米粒子+游离裂解液)在高糖DMEM完全培养基中共孵育72小时(37℃，5％CO2)。然后采用流式细胞术从孵育后细胞中分离CD3+CD137+ T细胞，即为被癌细胞全细胞抗原激活的癌细胞特异性T细胞。将上述分离得到的癌细胞特异性T细胞与IL-2(2000U/mL)和αCD-3抗体(20ng/mL)在高糖DMEM完全培养基中共孵育18天(每2天换液)以扩增癌细胞特异性T细胞。
(4)癌细胞特异性T细胞用于癌症转移的预防
选取6-8周的雌性C57BL/6为模型小鼠制备黑色素瘤荷瘤小鼠。在小鼠过继转移细胞前1天,给受体小鼠腹腔注射100mg/kg剂量的环磷酰胺以清除受体小鼠体内的免疫细胞。在第0天给小鼠静脉注射100μL含200万个分离扩增后的癌细胞特异性T细胞。同时在第1天给每只小鼠静脉注射接种0.5×105个B16F10细胞，第14天处死小鼠，观察记录小鼠肺部黑色素瘤癌灶数量。
(5)实验结果
如图11所示，纳米粒辅助分离和扩增后的癌细胞特异性T细胞可以有效预防癌症转移。而且，与只负载多肽抗原的纳米粒辅助分离的癌细胞特异性T细胞相比，负载癌细胞全细胞抗原的纳米粒辅助分离的癌细胞特异性T细胞预防癌症转移的效果更好。
实施例11肿瘤组织浸润癌细胞特异性T细胞用于胰腺癌的治疗
本实施例中，将小鼠Pan02胰腺癌肿瘤组织和MC38结肠癌肿瘤组织裂解组分按3:1的比例负载于纳米粒子，并使用该纳米粒子激活后分离肿瘤浸润淋巴细胞中的癌细胞特异性T细胞，然后扩增该细胞治疗胰腺癌。实验中，先取得小鼠胰腺癌和结肠癌肿瘤组织并将其裂解以制备水溶性抗原和溶于6M盐酸胍中的原非水溶性抗原。在制备粒子时，以PLGA为纳米粒子骨架材料，以BCG为佐剂制备纳米粒子，然后使用该纳米粒子辅助分离来自肿瘤浸润淋巴细胞的癌细胞特异性T细胞。
(1)肿瘤组织的裂解及各组分的收集
在每只C57BL/6小鼠腋下皮下接种2×106个MC38结肠癌细胞或接种1×106个Pan02胰腺癌细胞，在各只小鼠所接种肿瘤长到体积分别为约1000mm3时处死小鼠并摘取肿瘤组织。裂解方法及各组分的收集方法同实施例1，只是使用6M盐酸胍而非8M尿素溶解非水溶性抗原。水溶性抗原为胰腺癌肿瘤组织水溶性抗原和结肠癌肿瘤组织水溶性抗原3:1的混合物；非水溶性抗原为胰腺癌肿瘤组织非水溶性抗原和结肠癌肿瘤组织非水溶性抗原3:1的混合物。水溶性抗原混合物和非水溶性抗原混合物按质量比1:1混合。BCG的裂解和溶解方法同肿瘤组织裂解方法，水溶性抗原和非水溶性抗原按质量比1:1混合。
(2)纳米粒子的制备
本实施例中纳米粒子采用复乳法制备。所采用的纳米粒子制备材料PLGA分子量为7KDa-17KDa，所采用的免疫佐剂为BCG,且BCG包载于纳米粒子内。制备方法如前所述，在制备过程中首先采用复乳法在纳米粒子内部负载裂解物组分和佐剂，在内部负载抗原裂解组分和佐剂后，将100mg纳米粒子在12000g离心20分钟，并使用10mL含4％海藻糖的超纯水重悬后冷冻干燥48h，得冻干粉后备用。在纳米粒子注射前将20mg纳米粒子溶于0.9mL PBS中，与0.1mL含裂解物(80mg/mL)的样品混合并在室温作用10min后使用。该纳米粒子平均粒径为260nm左右，纳米粒子表面电位为-4mV左右；每1mg PLGA纳米粒子约负载130μg蛋白质和多肽组分，每1mg PLGA纳米粒使用BCG免疫佐剂0.08mg。空白纳米粒粒径为250nm左右，含等量佐剂。
(3)癌细胞特异性T细胞的分离和扩增
在第0天给每只C57BL/6小鼠背部皮下接种2×106个Pan02细胞，在第12天，第15天，第20天和第27天分别给小鼠皮下注射100μL的2mg的PLGA纳米粒子。第30天处死小鼠，摘取小鼠肿瘤组织和脾脏，制备肿瘤组织和脾细胞单细胞悬液。肿瘤浸润淋巴细胞中CD45+CD3+T细胞的分离以及脾细胞中B细胞的分离方法同实施例3。将B细胞(200万)、DC2.4细胞(100万)、骨髓来源的巨噬细胞(BMDM，100万个)、T细胞(50万个)与负载肿瘤组织全组分抗原的纳米粒子(100μg)或空白纳米粒子(100μg)+游离裂解液在DMEM高糖培养基中共孵育48小时(37℃，5％CO2)。然后采用流式细胞术从孵育后细胞中分选出CD3+CD69+ T细胞，即为被癌细胞全细胞抗原激活的癌细胞特异性T细胞。将上述分选得到的癌细胞特异性T细胞与IL-2(2000U/mL)和αCD-3抗体(30ng/mL)在高糖DMEM培养基中共孵育15天(两天换液一次)扩增癌T细胞。
(4)癌细胞特异性T细胞用于癌症的治疗
选取6-8周的雌性C57BL/6为模型小鼠制备胰腺癌荷瘤小鼠。在第0天给每只小鼠皮下接种1×106个Pan02细胞，在第4、第7天、第10天、第15天、第20天和第25天分别给小鼠注射100μL的200万个癌细胞特异性T细胞。从第3天开始每3天记录一次小鼠肿瘤体积的大小。肿瘤体积计算方法和小鼠生存期监测方法同上。
(4)实验结果
如图12所示，纳米粒辅助分离的来自肿瘤浸润淋巴细胞的癌细胞特异性T细胞可有效治疗胰腺癌。
实施例12癌细胞特异性T细胞用于癌症的预防
本实施例以甘露糖为靶头说明如何使用主动靶向纳米粒辅助分离肿瘤组织浸润淋巴细胞中的癌细胞特异性T细胞并用于预防癌症。在实际应用时具体剂型，佐剂，给药时间、给药次数、给药方案可根据情况调整。纳米粒子系统可通过树突状细胞表面的甘露糖受体摄取进入树突状细胞，并进而激活癌细胞特异性T细胞，分离的T细胞扩增后即可用于癌症的预防。
(1)癌细胞的裂解
收集培养的B16F10癌细胞后采用8M尿素裂解和溶解来源于癌细胞的癌细胞全细胞抗原。
(2)纳米粒子系统的制备
本实施例中纳米粒子系统使用复乳法制备。所采用的纳米粒子制备材料为PLGA和甘露糖修饰的PLGA，二者分子量都为7KDa-17KDa。制备带有靶头的纳米粒子时二者一起使用时质量比为4:1。所采用的免疫佐剂为Poly(I:C)和CpG SL03。制备方法如前所述，采用复乳法将裂解物组分和佐剂共负载于纳米粒子内部，然后将100mg纳米粒子在10000g离心20分钟，并使用10mL含4％海藻糖的超纯水重悬后冷冻干燥48h后备用。带有靶头纳米粒子的平均粒径均为270nm左右，每1mg PLGA纳米粒子约负载80μg蛋白质和多肽组分，含Poly(I:C)和CpGSL03各0.04mg。不负载佐剂但带有甘露糖靶头的对照纳米粒粒径也为270nm左右，制备时采用等量细胞组分但是不含任何免疫佐剂，每1mg PLGA纳米粒子约负载80μg蛋白质和多肽组分。带有甘露糖靶头的空白纳米粒粒径为250nm左右，制备时采用等量佐剂，但不负载任何细胞裂解组分。
(3)癌细胞特异性T细胞的分离和扩增
在第0天给每只C57BL/6小鼠背部皮下接种2.5×105个B16F10细胞，第10天，第15天、第20天和第27天分别给小鼠皮下注射100μL的1mg PLGA纳米粒子。第24天处死小鼠并摘取小鼠肿瘤组织和淋巴结。将小鼠肿瘤组织和淋巴结分别制备成单细胞悬液。然后从肿瘤组织单细胞悬液中使用流式细胞术分离活细胞中(使用活死细胞染料标记死细胞以去除死细胞)的CD45+CD3+T细胞。使用流式细胞术从脾细胞中分离活细胞中(使用活死细胞染料标记死细胞以去除死细胞)的CD11c+DC细胞。将T细胞(50万个)、来自淋巴结的DC细胞(100万个)、DC2.4细胞(200万个)与负载肿瘤组织全组分抗原的纳米粒子(100μg)或对照纳米粒子(100μg)在DMEM高糖培养基中共孵育72小时(37℃，5％CO2)，然后采用流式细胞术从孵育后细胞中分选出CD3+CD69+ T细胞，即为癌细胞特异性T细胞。将上述分选得到的T细胞与IL-2(2000U/mL)和αCD-3抗体(50ng/mL)在DMEM高糖培养基中共孵育12天(每两天换液一次)扩增T细胞。
(4)癌细胞特异性T细胞用于癌症的预防
选取6-8周的雌性C57BL/6为模型小鼠制备黑色素瘤荷瘤小鼠，在小鼠过继转移细胞前1天,给受体小鼠腹腔注射100mg/kg剂量的环磷酰胺以清除受体小鼠体内的免疫细胞。然后，将步骤(3)制备得到的500万个癌细胞特异性T细胞静脉注射给受体小鼠。隔天，给每只受体小鼠背部右下方皮下接种1.5×105个B16F10细胞。监测小鼠肿瘤生长速度和小鼠生存期。肿瘤生长和生存期监测方法同上。
(5)实验结果
如图13所示，与对照组相比，粒子辅助分离的癌细胞特异性T细胞处理的小鼠其肿瘤生长速度明显变慢。不管是否带有佐剂，纳米粒子都可以有效辅助分离肿瘤浸润淋巴细胞中的癌细胞特异性T细胞，但是带有佐剂效果更佳。这说明本发明所述的癌细胞特异性T细胞可以有效预防癌症。
实施例13癌细胞特异性T细胞预防肝癌
本实施例中，首先裂解Hepa1-6肝癌细胞，以PLGA为纳米粒子骨架材料，以Poly(I:C)和BCG为免疫佐剂制备负载来源于肝癌细胞的癌细胞全细胞抗原的纳米粒子系统，然后以该粒子辅助分离来自肿瘤浸润淋巴细胞的癌细胞特异性T细胞，分离提取该类细胞后预防肝癌。
(1)癌细胞的裂解及各组分的收集
收集培养的Hepa 1-6肝癌细胞后使用PBS洗涤两遍，使用加热和紫外照射处理肝癌细胞，尔后采用8M尿素水溶液(含200MM氯化钠)裂解和溶解来源于癌细胞的癌细胞全细胞抗原。使用8M尿素水溶液(含200MM氯化钠)裂解BCG后溶解裂解组分作为佐剂使用。
(3)纳米粒子系统的制备
本实施例中纳米粒子系统采用溶剂挥发法制备，所采用的纳米粒子制备材料PLGA分子量为24KDa-38KDa，所采用的免疫佐剂为BCG和Poly(I:C)，佐剂包载于纳米粒子内。制备方法如前所述，在制备过程中首先采用复乳法在纳米粒子内部负载癌细胞全细胞抗原和佐剂，在内部负载抗原(裂解组分)后，将100mg纳米粒子在10000g离心20分钟，并使用10mL含4％海藻糖的超纯水重悬后冷冻干燥48h后备用。该纳米粒子平均粒径为270nm左右；每1mg PLGA纳米粒子约负载100μg蛋白质和多肽组分，BCG和Poly(I:C)各0.04mg。对照纳米粒子平均粒径为270nm左右，每1mg PLGA纳米粒子约负载100μg蛋白质和多肽组分，不负载任何佐剂。
(3)癌细胞特异性T细胞的分离和扩增
在第0天给每只C57BL/6小鼠背部皮下接种2×106个Hepa 1-6细胞，第10天，第14天、第21天和第28天分别给小鼠皮下注射1mg PLGA纳米粒子。第33天处死小鼠摘取小鼠肿瘤组织和淋巴结，并制备小鼠肿瘤组织和淋巴结单细胞悬液。使用流式细胞术从肿瘤组织单细胞悬液中分离出活细胞中(使用活死细胞染料标记死细胞以去除死细胞)的CD45+CD3+T细胞。从小鼠淋巴结单细胞悬液中分离出活细胞中(使用活死细胞染料标记死细胞以去除死细胞)的CD19+B细胞和CD11c+DC细胞。将分离得到的T细胞(40万个)、B细胞(200万个)、DC细胞(200万个)与负载肿瘤组织全组分抗原的纳米粒子(100μg)或对照纳米粒子(100μg)在DMEM高糖培养基中共孵育48小时(37℃，5％CO2)，然后采用流式细胞术从孵育后细胞中分离出CD3+CD69+ T细胞，即为癌细胞特异性T细胞。将上述分选得到的癌细胞特异性T细胞与IL-2(1000U/mL)和αCD-3抗体(60ng/mL)在DMEM高糖培养基中共孵育14天(每两天换液一次)扩增T细胞。
(4)癌细胞特异性癌症的预防
选取6-8周的雌性C57BL/6为模型小鼠制备肝癌荷瘤小鼠。在小鼠过继转移细胞前1天,给受体小鼠腹腔注射100mg/kg剂量的环磷酰胺以清除受体小鼠体内的免疫细胞。在第0天给小鼠注射400万个癌细胞特异性T细胞。同时在第0天给每只小鼠皮下注射接种1.0×106个Hepa1-6肝癌细胞，肿瘤生长和小鼠生存期记录方式同上。
(5)实验结果
如图14所示，与对照组相比，纳米粒辅助分离的癌细胞特异性T细胞处理的小鼠肿瘤生长速度明显变慢。而且，不管是否带有佐剂，纳米粒子都可以有效激活和辅助分离肿瘤浸润淋巴细胞中的癌细胞特异性T细胞，但是带有佐剂的效果更好。这说明本发明所述的T细胞可以有效预防癌症。
实施例14钙化纳米粒子辅助分离癌细胞特异性T细胞用于预防癌症
本实施例说明钙化的纳米粒子辅助分离肿瘤浸润淋巴细胞中的癌细胞特异性T细胞，在实际使用时也可以使用其他生物矿化技术、交联、凝胶化等修饰粒子。本实施例中，将小鼠黑色素瘤肿瘤组织和癌细胞以8M尿素裂解后溶解，然后肿瘤组织裂解组分和癌细胞裂解组分按质量比1:1负载于纳米粒子系统，并用该粒子辅助分离肿瘤组织浸润淋巴细胞中的癌细胞特异性T细胞并扩增后用于癌症的预防。在本实施例中，采用负载四种多肽新生抗原B16-M20(Tubb3,FRRKAFLHWYTGEAMDEMEFTEAESNM)，B16-M24(Dag1,TAVITPPTTTTKKARVSTPKPATPSTD)，B16-M46(Actn4,NHSGLVTFQAFIDVMSRETTDTDTADQ)和TRP2:180-188(SVYDFFVWL)的纳米粒子作为对照纳米粒子使用。
(1)肿瘤组织和癌细胞的裂解
收集小鼠B16F10黑色素瘤肿瘤组织和培养的癌细胞后采用8M尿素裂解和溶解来源于肿瘤组织和癌细胞的癌细胞全细胞抗原，然后肿瘤组织组分和癌细胞组分按质量比1:1混溶。
(2)纳米粒子的制备
本实施例在纳米粒子内部和表面负载癌细胞全细胞抗原后生物钙化纳米粒子。本实施例中纳米粒子采用溶剂挥发法制备，所采用的纳米粒子制备材料PLGA分子量为7KDa-17KDa，所采用免疫佐剂CpG2006和Poly(I:C)负载于纳米粒子内部。制备方法如下所述，在制备过程中首先采用复乳法在纳米粒子内部负载抗原，在内部负载裂解组分后，将100mgPLGA纳米粒子在13000g离心20min后使用18mL PBS重悬，然后加入2mL溶解于8M尿素的肿瘤组织和癌细胞裂解液(60mg/mL)，在室温作用10分钟后在12000g离心20分钟后收集沉淀。然后将该100mg PLGA纳米粒子重悬于20mL DMEM培养基中，然后加入200μL of CaCl2(1mM)并在37℃反应两小时。然后在10000g离心20分钟后收集沉淀，并采用超纯水重悬后离心洗涤两遍。该纳米粒子平均粒径为290nm左右；每1mg PLGA纳米粒子约负载140μg蛋白质或多肽组分，CpG2006和Poly(I:C)各0.03mg。负载多种抗原多肽的对照纳米粒子制备方法同上，对照纳米粒子粒径为290nm左右，每1mg PLGA纳米粒子约负载140μg抗原多肽和等量佐剂。
(3)癌细胞特异性T细胞的分离和扩增
同实施例13。
(4)癌细胞特异性T细胞用于癌症的预防
同实施例1。
(5)实验结果
如图15所示，与对照组相比，钙化纳米粒辅助分离扩增得到的癌细胞特异性T细胞可以延长小鼠生存期有效预防癌症。而且，负载癌细胞全细胞抗原纳米粒子所辅助分离扩增的癌细胞特异性T细胞效果好于负载四种抗原多肽的纳米粒子辅助分离扩增的癌细胞特异性T细胞。
实施例15癌细胞特异性T细胞后用于黑色素瘤的治疗
本实施例以小鼠黑色素瘤为癌症模型来说明如何使用纳米粒子激活和辅助分离肿瘤浸润淋巴细胞中的癌细胞特异性T细胞，将上述细胞扩增后回输小鼠治疗黑色素瘤。
(1)肿瘤组织和癌细胞的裂解及各组分的收集
收集肿瘤组织时先在每只C57BL/6小鼠背部皮下接种1.5×105个B16F10细胞，在肿瘤长到体积分别为约1000mm3时处死小鼠并摘取肿瘤组织，将肿瘤组织切块后研磨，通过细胞过滤网后制备单细胞悬液，加入超纯水后反复冻融并伴有超声裂解上述细胞，然后加入核酸酶作用5分钟，再在95℃作用10分钟灭活核酸酶。尔后在8000g离心3分钟，上清液部分即为水溶性抗原；沉淀部分使用10％脱氧胆酸钠水溶液溶解非水溶性抗原。将水溶性抗原和脱氧胆酸钠溶解后的非水溶性抗原按质量比1:1混溶即为制备纳米粒子系统的抗原原料来源。
(2)纳米粒子系统的制备
本实施例中纳米粒采用复乳法制备，具有靶向树突状细胞的能力。所采用的纳米粒子制备材料为PLGA和甘露聚糖修饰的PLGA，二者分子量都为24KDa-38KDa，使用时未修饰PLGA和甘露聚糖修饰PLGA的质量比为9:1。所采用的免疫佐剂为poly(I:C)、CpG1018和CpG2216，增加溶酶体免疫逃逸的物质为KALA多肽(WEAKLAKALAKALAKHLAKALAKALKACEA)，且佐剂、KALA多肽包载于纳米粒子内。制备方法如前所述，在制备过程中首先采用复乳法在纳米粒子内部负载裂解液组分、佐剂、KALA多肽，在内部负载上述组分后，将100mg纳米粒子在12000g离心25分钟，并使用10mL含4％海藻糖的超纯水重悬后冷冻干燥48h。该纳米粒子平均粒径为250nm左右，表面电位为-5mV左右；每1mg PLGA纳米粒子约负载100μg蛋白质或多肽组分，每1mg PLGA纳米粒所负载的poly(I:C)、CpG1018和CpG2216免疫佐剂各0.02mg,负载KALA多肽0.05mg。纳米粒2的制备材料和方法相同，其粒径为250nm左右，表面电位为-5mV左右，不负载KALA多肽，负载等量佐剂和细胞裂解组分。纳米粒子3的制备材料和制备方法相同，为250nm左右，表面电位为-5mV左右；每1mg PLGA纳米粒子约负载100μg蛋白质和多肽组分，每1mg PLGA纳米粒所负载的poly(I:C)0.02mg,负载CpG1018为0.04mg,负载KALA多肽0.05mg。
(3)癌细胞特异性T细胞的制备
选取6-8周的雌性C57BL/6小鼠，在第0天给小鼠背部皮下接种1.5×105个B16F10，然后在第15天、第20天和第25天分别给小鼠皮下注射0.5mg的PLGA纳米粒子(负载裂解物组分、Poly(I:C)和两种CpG佐剂及KALA多肽)。在第30天处死小鼠,收集小鼠的瘤块和淋巴结。将小鼠瘤块切成小块后通过细胞筛网制备单细胞悬液，然后使用磁珠分选法从这些细胞中分选出活细胞中(使用活死细胞染料标记死细胞以去除死细胞)的CD45+CD3+的肿瘤浸润淋巴细胞中的T细胞。从淋巴结单细胞悬液中分离活细胞中(使用活死细胞染料标记死细胞以去除死细胞)的CD11c+DC细胞和CD19+B细胞。将分选得到的CD3+T细胞(50万个)、纳米粒子(40μg)、来自淋巴结的DC细胞(100万个)、B细胞(100万个)以及IL-7(10ng/mL)在2mLRPMI1640完全培养基中共孵育96小时。然后采用流式细胞术分选孵育后的T细胞中的CD3+OX40+ T细胞，即为可识别癌细胞全细胞抗原的癌细胞特异性T细胞。将上述分选得到的CD3+OX40+ T细胞与IL-2(1000U/mL)、IL-15(1000U/mL)、IL-21(1000U/mL)以及αCD-3抗体(20ng/mL)在RPMI1640完全培养基中共孵育14天(每两天换液一次)以扩增癌细胞特异性T细胞。
(4)扩增后的癌细胞特异性T细胞用于治疗癌症
选取6-8周的雌性C57BL/6为模型小鼠制备黑色素瘤荷瘤小鼠。在第0天给每只小鼠背部右下方皮下接种1.5×105个B16F10细胞。在接种黑色素瘤后第4天、第7天、第10天、第15天和第20天分别静脉注射150万个扩增后的癌细胞特异性T细胞。在实验中，小鼠肿瘤体积和生存期监测方法同上。
(5)实验结果
如图16所示，PBS对照组的肿瘤都长大。与对照组相比，癌细胞特异性T细胞处理的小鼠肿瘤生长速度明显变慢生存期明显延长。而且，加入增加溶酶体逃逸物质的纳米粒子辅助分离和扩增的癌细胞特异性T细胞好于未加入溶酶体逃逸的纳米粒子辅助分离和扩增的癌细胞特异性T细胞；使用两种CpG和Poly(I:C)作为混合佐剂辅助分离和扩增的癌细胞特异性T细胞的治疗效果好于只使用一种CpG和Poly(I:C)混合佐剂。综上所述，本发明所述的癌细胞特异性T细胞对癌症具有良好的治疗效果。
实施例16癌细胞特异性T细胞用于乳腺癌的预防
本实施例以4T1小鼠三阴性乳腺癌为癌症模型来说明如何采用负载癌细胞全细胞抗原的微米粒子辅助分选癌细胞特异性T细胞，用于预防乳腺癌。本实施例中，首先对乳腺癌细胞进行灭活和变性处理，尔后裂解细胞，并以辛基葡萄糖苷溶解裂解癌细胞中的非水溶性抗原。然后，以PLGA为微米粒子骨架材料，以CpG2007、CpG1018、和Poly ICLC为免疫佐剂，以聚精氨酸和聚赖氨酸为增强溶酶体逃逸的物质，制备负载有癌细胞全细胞抗原的微米粒子系统。
(1)癌细胞的裂解
将培养的4T1细胞在400g离心5分钟，然后用PBS洗涤两遍后重悬于超纯水中。所得癌细胞分别采用紫外线和高温加热进行灭活和变性处理，然后加入超纯水并反复冻融5次辅以超声裂解癌细胞，将细胞裂解物在5000g离心10分钟，上清液即为水溶性抗原，将沉淀物使用10％辛基葡萄糖苷溶解后即为溶解后的原非水溶性抗原，将水溶性抗原和非水溶性抗原按质量比2:1混合，即为制备微米粒子所需的裂解物组分。
(2)微米粒子系统的制备
本实施例中制备微米粒子系统及作为对照微米粒子采用复乳法，微米粒子骨架材料PLGA分子量为38KDa-54KDa，所采用的免疫佐剂为CpG2007、CpG1018和Poly ICLC，所采用的溶酶体逃逸增加物质为聚精氨酸和聚赖氨酸。制备时先采用复乳法制备内部负载裂解物组分、佐剂和KALA多肽的微米粒子,在内部负载裂解物和佐剂后，将100mg微米粒子在9000g离心20分钟，使用10mL含4％海藻糖的超纯水重悬后干燥48h后备用。该微米粒子系统平均粒径为3.1μm左右，微米粒子系统表面电位为-7mV左右；每1mg PLGA微米粒子约负载110μg蛋白质或多肽组分，含CpG和Poly ICLC各0.01mg，含聚精氨酸和聚赖氨酸各0.02mg。
(3)树突状细胞的制备
本实施例以从小鼠骨髓细胞制备树突状细胞为例来说明如何制备骨髓来源的树突状细胞(BMDC)。首先，取1只6-8周龄C57小鼠颈椎脱臼处死，手术取出后腿的胫骨和股骨放入PBS中，用剪刀和镊子将骨周围的肌肉组织剔除干净。用剪刀剪去骨头两端，再用注射器抽取PBS溶液，针头分别从骨头两端插入骨髓腔，反复冲洗骨髓到培养皿中。收集骨髓溶液，400g离心3min后加入1mL红细胞裂解液裂红。加入3mL RPMI 1640(10％FBS)培养基终止裂解，400g离心3min，弃上清。将细胞放置10mm培养皿中培养，使用RPMI 1640(10％FBS)培养基，同时加入重组小鼠GM-CSF(20ng/mL)，37度，5％CO2培养7天。第3天轻轻摇晃培养瓶，补充同样体积含有GM-CSF(20ng/mL)的RPMI 1640(10％FBS)培养基。第6天，对培养基进行半量换液处理。第7天，收集少量悬浮及半贴壁细胞，通过流式检测，当CD86+CD80+细胞在CD11c+细胞中的比例为15-20％之间，诱导培养的BMDC即可被用来做下一步实验。
(4)癌细胞特异性T细胞的制备
选取6-8周的雌性BALB/c小鼠，在第0天小鼠后背皮下接种2×106个4T1乳腺癌细胞；在第7天、第14天、第21天和第28天分别皮下注射0.3mg PLGA的微米粒子(负载裂解物组分、佐剂及增加溶酶体逃逸的物质)。在第32天处死小鼠,收集小鼠肿瘤组织，将肿瘤组织切成小块后通过细胞筛网制备单细胞悬液。使用流式细胞术从肿瘤组织单细胞悬液中分选活细胞中(使用活死细胞染料标记死细胞以去除死细胞)的CD45+的肿瘤浸润淋巴细胞。将分选得到的CD45+细胞(100万个)、微米粒子(100μg，负载裂解物组分、佐剂和增加溶酶体逃逸的物质)、BMDC(200万个)以及IL-7(10ng/mL)在5mL RPMI1640完全培养基中共孵育48小时(37℃，5％CO2)；或者将分选得到的CD45+细胞(100万个)、微米粒子(100μg，负载裂解物组分、佐剂和增加溶酶体逃逸的物质)和BMDC(200万个)在5mL RPMI1640完全培养基中共孵育48小时(37℃，5％CO2)。然后采用流式细胞术分选孵育后的CD45+T细胞中的CD3+CD8+CD69+ T细胞以及CD3+CD4+CD69+ T细胞，即为可识别癌细胞全细胞抗原的癌细胞特异性T细胞。将上述分选得到的CD8+CD69+ T细胞或者CD4+CD69+T细胞分别与IL-2(1000U/mL)、IL-6(1000U/mL)、IL-12(1000U/mL)以及αCD-28抗体(10ng/mL)在RPMI1640完全培养基中共孵育14天以扩增癌细胞特异性T细胞。
(5)癌细胞特异性T细胞用于癌症的预防
选取6-8周的雌性BALB/c为模型小鼠制备乳腺癌荷瘤小鼠。在小鼠过继转移细胞前1天,给受体小鼠腹腔注射100mg/kg剂量的环磷酰胺以清除受体小鼠体内的免疫细胞。在第0天给小鼠皮下注射100μL含60万个扩增得到的CD8+ T细胞以及40万个扩增得到的CD4+ T细胞。同时在第0天给每只小鼠皮下注射接种1×106个4T1细胞，从第3天开始每3天记录一次小鼠肿瘤体积的大小。肿瘤体积采用公式v＝0.52×a×b2计算，其中v为肿瘤体积，a为肿瘤长度，b为肿瘤宽度。出于动物实验伦理，在小鼠生存期试验中当小鼠肿瘤体积超过2000mm3即视为小鼠死亡并将小鼠安乐死。
(6)实验结果
如图17所示，与对照组相比，微米粒辅助分选得到的癌细胞特异性T细胞处理组肿瘤生长速度明显变慢且小鼠生存期明显延长。而且，共孵育过程中加入IL-7辅助分选得到的癌细胞特异性T细胞效果好于共孵育过程中不加IL-7辅助分选分选得到的癌细胞特异性T细胞。由此可见，本发明所述的癌细胞特异性T细胞对乳腺癌具有预防效果。
实施例17癌细胞特异性T细胞用于乳腺癌的预防
本实施例以4T1小鼠三阴性乳腺癌为癌症模型来说明如何微米粒子系统辅助分选癌细胞特异性T细胞，并经扩增后用于预防乳腺癌。
(1)癌细胞的裂解
将培养的4T1细胞在400g离心5分钟，然后用PBS洗涤两遍后重悬于超纯水中。所得癌细胞分别采用紫外线和高温加热进行灭活和变性处理，然后使用8M尿素水溶液(含500mM氯化钠)裂解癌细胞并溶解裂解物组分，即为制备微米粒子系统的抗原组分。
(2)微米粒子系统的制备
本实施例中制备微米粒子系统及作为对照微米粒子采用复乳法，微米粒子骨架材料为未修饰的PLA和甘露糖修饰的PLA，分子量都为40KDa，未修饰的PLA和甘露糖修饰的PLA的比例为4:1。所采用的免疫佐剂为CpG2006、CpG2216和Poly ICLC，所采用的溶酶体逃逸增加物质为精氨酸和组氨酸。制备时先采用复乳法制备内部负载裂解物组分、佐剂、精氨酸和组氨酸的微米粒子,尔后，将100mg微米粒子在9000g离心20分钟，使用10mL含4％海藻糖的超纯水重悬后干燥48h后备用。该微米粒子系统平均粒径为2.1μm左右，微米粒子系统表面电位为-7mV左右；每1mg PLGA微米粒子约负载100μg蛋白质或多肽组分，含CpG2006，CpG2216和Poly ICLC各0.01mg，含精氨酸和组氨酸各0.05mg。对照微米粒2制备材料和制备方法与本实施例所述微米粒子相同，粒径为2.1μm左右，表面电位为-7mV左右，只负载精氨酸和组氨酸和等量的细胞裂解物组分，而不负载任何佐剂。
(3)癌细胞特异性T细胞的制备
选取6-8周的雌性BALB/c小鼠，在第0天在小鼠后背皮下接种2×106个4T1乳腺癌细胞。在第7天、第14天、第21天和第28天分别皮下注射100μL含0.2mg PLGA的微米粒子(负载裂解物组分、佐剂及增加溶酶体逃逸的物质)。在第32天处死小鼠,收集小鼠肿瘤组织，然后制备肿瘤组织单细胞悬液，使用流式细胞术从肿瘤组织单细胞悬液中分选活细胞中(使用活死细胞染料标记死细胞以去除死细胞)的CD3+T细胞。将分选得到的CD3+T细胞(20万个)、微米粒子(50μg)、DC2.4细胞(50万个)以及IL-7(10ng/mL)在2mL RPMI1640完全培养基中共孵育48小时(37℃，5％CO2)，然后采用流式细胞术分选孵育后的CD3+T细胞中的CD3+CD8+CD69+ T细胞以及CD4+T细胞中CD4+CD69+ T细胞，即为可识别癌细胞全细胞抗原的癌细胞特异性T细胞。将上述分选得到的CD8+CD69+ T细胞或者CD4+CD69+T细胞分别与IL-2(2000U/mL)、IL-7(1000U/mL)以及αCD-3抗体(10ng/mL)在RPMI1640完全培养基中共孵育14天以扩增癌细胞特异性T细胞。
(4)癌细胞特异性T细胞用于癌症的预防
选取6-8周的雌性BALB/c为模型小鼠制备乳腺癌荷瘤小鼠。在小鼠过继转移细胞前1天,给受体小鼠腹腔注射100mg/kg剂量的环磷酰胺以清除受体小鼠体内的免疫细胞。在第0天给小鼠皮下注射100万个扩增后的CD8+T细胞和40万个扩增后的CD4+ T细胞。同时在第0天给每只小鼠皮下注射接种1×106个4T1细胞，小鼠肿瘤体积以及生存期监测方法同上。
(5)实验结果
如图18所示，与对照组相比，使用微米粒激活和辅助分离的癌细胞特异性T细胞扩增后处理的小鼠，其肿瘤生长速度明显变慢且小鼠生存期明显延长。而且，含有增加溶酶体逃逸功能的物质和混合佐剂的微米粒子所辅助分离得到的癌细胞特异性T细胞效果好于只含有溶酶体逃逸功能的物质而不含有混合佐剂的微米粒子所辅助分离得到的癌细胞特异性T细胞。由此可见，本发明所述的癌细胞特异性T细胞对乳腺癌具有预防效果，而且混合佐剂的使用有助于癌细胞特异性T细胞的分离和扩增。
实施例18癌细胞特异性T细胞后用于黑色素瘤的治疗
本实施例以小鼠黑色素瘤为癌症模型来说明如何使用纳米粒子辅助分选癌细胞特异性T细胞，并扩增后回输治疗黑色素瘤。本实施例中，首先裂解肿瘤组织和癌细胞以制备水溶性抗原和非水溶性抗原，然后，以PLGA为骨架材料，以Poly(I:C)和CpG为免疫佐剂，以R8(RRRRRRRR)多肽为溶解溶酶体逃逸能力的物质，制备负载水溶性抗原或非水溶性抗原的纳米粒子系统，然后将纳米粒子与树突状细胞、T细胞体外共孵育后分选被激活的癌细胞特异性T细胞，经扩增后回输治疗癌症。
(1)肿瘤组织和癌细胞的裂解及各组分的收集
收集肿瘤组织时先在每只C57BL/6小鼠背部皮下接种1.5×105个B16F10细胞，在肿瘤长到体积分别为约1000mm3时处死小鼠并摘取肿瘤组织，将肿瘤组织切块后研磨，通过细胞过滤网加入适量纯水并反复冻融5次(可伴有超声)以破坏裂解所得样品，加入核酸酶作用10分钟后在95℃加热10分钟灭活核酸酶；收集培养的B16F10癌细胞系时，先离心去除培养基后使用PBS洗涤两次并离心收集癌细胞，将癌细胞在超纯水中重悬，反复冻融3次，并伴有超声破坏裂解癌细胞，尔后在样品中加入核酸酶作用10分钟后在95℃加热5分钟灭活核酸酶。待肿瘤组织或癌细胞酶作用处理后，将裂解物以5000g的转速离心5分钟并取上清液即为可溶于纯水的水溶性抗原；在所得沉淀部分中加入8M尿素水溶液溶解沉淀部分。将肿瘤组织的水溶性抗原和癌细胞的水溶性抗原按质量比1:1混合；肿瘤组织的非水溶性抗原和癌细胞的非水溶性抗原按质量比1:1混合。然后将水溶性抗原混合物和非水溶性抗原混合物按质量比2:1混合，即为制备纳米粒子系统的抗原原料来源。
(2)纳米粒子系统的制备
本实施例中纳米粒子采用复乳法制备。所采用的纳米粒子制备材料PLGA分子量为7KDa-17KDa，所采用的免疫佐剂为poly(I:C)和CpG1018，R8多肽为增加溶酶体逃逸的物质，且佐剂和R8多肽负载于纳米粒子内。制备方法如前所述，在制备过程中首先采用复乳法在纳米粒子内部负载裂解液组分、佐剂和R8多肽，在内部负载完成后，将100mg纳米粒子在12000g离心25分钟，并使用10mL含4％海藻糖的超纯水重悬后冷冻干燥48h；在使用前将其用9mL PBS重悬然后加入1mL的裂解液组分(蛋白质浓度80mg/mL)并室温作用10min，得到内外都负载裂解物的纳米粒子系统。该纳米粒子平均粒径为290nm左右，纳米粒子表面电位为-5mV左右；每1mg PLGA纳米粒子约负载140μg蛋白质或多肽组分，每1mg PLGA纳米粒所负载的poly(I:C)和CpG1018免疫佐剂各0.02mg，负载0.01mg R8多肽。
(3)癌细胞特异性T细胞的制备
选取6-8周的雌性C57BL/6小鼠，在第0天后背皮下接种8×105个B16F10细胞，在第7天、第14天、第21天和第28天分别皮下注射100μL的0.5mg PLGA纳米粒子。在第32天处死小鼠,收集小鼠肿瘤组织和脾细胞。制备小鼠肿瘤组织单细胞悬液和脾细胞单细胞悬液。然后从小鼠肿瘤组织单细胞悬液中使用流式细胞术分离活细胞中(使用活死细胞染料标记死细胞以去除死细胞)的CD45+CD3+T细胞，从脾细胞单细胞悬液中分离活细胞中(使用活死细胞染料标记死细胞以去除死细胞)的CD19+B细胞。将分选得到的CD3+T细胞(100万个)、纳米粒子(100μg)、DC2.4细胞系(300万个)、B细胞(200万个)以及IL-7(10ng/mL)在5mL RPMI1640完全培养基中共孵育72小时，然后采用流式细胞术分选孵育后的CD3+T细胞中的CD3+OX40+T细胞，即为可识别癌细胞全细胞抗原的癌细胞特异性T细胞。将上述分选得到的癌细胞特异性T细胞与IL-2(2000U/mL)和αCD-3抗体(10ng/mL)在RPMI1640完全培养基中共孵育14天(每两天换液一次)以扩增癌细胞特异性T细胞。
作为对照，将从小鼠肿瘤组织单细胞悬液中中分离得到的活细胞中(使用活死细胞染料标记死细胞以去除死细胞)的CD3+T细胞未经与纳米粒子和抗原提呈细胞共孵育，直接使用流式细胞术从中筛选出CD3+OX40+的T细胞，直接与IL-2(2000U/mL)和αCD-3抗体(10ng/mL)在RPMI1640完全培养基中共孵育14天(每两天换液一次)以扩增癌细胞特异性T细胞。
(4)同种异体的细胞混合物给与患癌小鼠治疗癌症
选取6-8周的雌性C57BL/6为模型小鼠制备黑色素瘤荷瘤小鼠。在第0天给每只小鼠背部右下方皮下接种1.5×105个B16F10细胞。在接种黑色素瘤后第4天、第7天、第10天、第15天和第20天分别静脉注射扩增后的150万个癌症特异性CD3+ T细胞。小鼠肿瘤生长和生存期监测方法同上。
(5)实验结果
如图19所示，与对照组相比，被扩增的癌细胞特异性T细胞处理的小鼠其肿瘤生长速度明显变慢且小鼠生存期明显延长。而且，使用纳米粒粒子辅助分离得到的癌细胞特异性CD3+T细胞好于未经纳米粒子辅助分离直接扩增的CD3+T细胞。由此可见，本发明所述的癌细胞特异性T细胞对癌症具有预防效果，而且纳米粒子辅助分离具有明显的增强效果。
实施例19癌细胞特异性T细胞用于结肠癌的治疗
本实施例以小鼠结肠癌为癌症模型来说明如何使用负载有来源于结肠癌肿瘤组织的癌细胞全细胞抗原的纳米粒子辅助分选癌细胞特异性T细胞并用于治疗结肠癌。本实施例中，首先使用8M尿素水溶液裂解结肠癌肿瘤组织并溶解裂解组分，然后，以PLGA为骨架材料，以Poly(I:C)、CpG2336和CpG2006为佐剂，以NH4HCO3为增加溶酶体逃逸物质，制备纳米粒子系统，然后使用纳米粒子辅助分选癌细胞特异性T细胞，经过两步分选得到的癌细胞特异性T细胞经过扩增后用于癌症治疗。
(1)肿瘤组织的裂解及各组分的收集
收集肿瘤组织时先在每只C57BL/6小鼠背部皮下接种2×106个MC38结肠癌细胞，在肿瘤长到体积分别为约1000mm3时处死小鼠并摘取肿瘤组织，将肿瘤组织切块后研磨，通过细胞过滤网加入8M尿素水溶液理解肿瘤组织并溶解裂解后组分。以上即为制备纳米粒子系统的抗原原料来源。
(2)纳米粒子系统的制备
本实施例中纳米粒子采用复乳法制备。纳米粒子1的制备材料PLGA分子量为7KDa-17KDa，以Poly(I:C)和CpG为佐剂，以NH4HCO3为增加溶酶体逃逸物质，且佐剂和NH4HCO3负载于纳米粒子内；制备方法如前所述，在制备过程中首先在纳米粒子内部负载裂解液组分和佐剂，然后将100mg纳米粒子在10000g离心20分钟，并使用10mL含4％海藻糖的超纯水重悬后冷冻干燥48h后备用；该纳米粒子平均粒径为260nm左右，表面电位为-7mV左右；每1mgPLGA纳米粒子约负载90μg蛋白质和多肽组分，每1mg PLGA纳米粒所负载的poly(I:C)、CpG2336和CpG2006免疫佐剂各0.02mg，负载NH4HCO3 0.01mg。纳米粒子2的制备材料和制备方法同纳米粒子1,粒径为260nm左右，表面电位为-7mV左右，每1mg PLGA纳米粒子约负载90μg蛋白质和多肽组分，每1mg PLGA纳米粒负载NH4HCO3 0.01mg,负载CpG2336和CpG2006各0.03mg。
(3)癌细胞特异性T细胞的制备
选取6-8周的雌性C57BL/6小鼠，第0天在后背部皮下接种2×106个MC38结肠癌细胞，在第14天和第28天分别皮下注射100μL含0.4mg PLGA的纳米粒子(负载裂解物组分、混合佐剂及增加溶酶体逃逸的物质)。在第32天处死小鼠,摘取小鼠肿瘤组织并制备肿瘤组织单细胞悬液，然后使用流式细胞术从肿瘤组织单细胞悬液中分选活细胞中(使用活死细胞染料标记死细胞以去除死细胞)的CD8+T细胞和CD4+T细胞。将分选得到的CD8+T细胞(20万个)、CD4+T细胞(10万个)、纳米粒子(50μg)、B细胞(100万个)以及IL-7(10ng/mL)在2mLRPMI1640完全培养基中共孵育48小时(37℃，5％CO2)，然后采用流式细胞术分选孵育后的CD8+T细胞中的CD8+CD69+ T细胞以及CD4+T细胞中CD4+CD69+ T细胞，即为可识别癌细胞全细胞抗原的癌细胞特异性T细胞。将上述分选得到的CD8+CD69+ T细胞或者CD4+CD69+T细胞分别与IL-2(1000U/mL)、IL-12(1000U/mL)、IL-15(1000U/mL)以及αCD-3抗体(10ng/mL)在RPMI1640完全培养基中共孵育14天(每两天换液一次)以扩增癌细胞特异性T细胞。
(4)癌细胞特异性T细胞用于治疗癌症
选取6-8周的雌性C57BL/6为模型小鼠制备结肠癌小鼠。在第0天给每只小鼠背部右下方皮下接种2×106个MC38细胞。在接种结肠癌细胞后第6天、第9天、第12天、第15天、第20天和第25天分别静脉注射80万个CD8+癌细胞特异性T细胞和40万个CD4+癌细胞特异性T细胞；或者在上述天数注射120万个CD8+癌细胞特异性T细胞。小鼠肿瘤生长和生存期监测方法同上。
(5)实验结果
如图20所示，与对照组相比，纳米粒子辅助分离扩增得到的癌细胞特异性T细胞处理小鼠后其肿瘤生长速度明显变慢且小鼠生存期明显延长。而且，同时使用纳米粒子辅助分离和扩增得到的CD8+T细胞和CD4+T细胞好于只使用纳米粒子辅助分离和扩增得到的CD8+T细胞。而且，负载混合佐剂、裂解物组分和溶酶体逃逸物质的纳米粒子辅助分离的癌细胞特异性T细胞效果好于负载裂解物组分、单一CpG佐剂和溶酶体逃逸物质的纳米粒子。由此可见，本发明所述的癌细胞特异性T细胞对癌症具有优异治疗效果。
显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的举例，并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所引申出的显而易见的变化或变动仍处于本发明创造的保护范围之中。
Claims (21)
1.一种来源于肿瘤浸润淋巴细胞的细胞系统，其特征在于：所述细胞系统包括从肿瘤浸润淋巴细胞中提取的癌细胞特异性T细胞；
所述的提取包括将肿瘤浸润淋巴细胞或肿瘤浸润淋巴细胞中的T细胞、抗原提呈细胞与负载癌细胞全细胞抗原的纳米粒子和/或负载癌细胞全细胞抗原的微米粒子共孵育以激活癌细胞特异性T细胞，再将被癌细胞全细胞抗原激活的癌细胞特异性T细胞分离的步骤；
其中，癌细胞全细胞抗原包括经癌细胞和/或肿瘤组织裂解得到的水溶性抗原和/或非水溶性抗原，所述非水溶性抗原经溶解剂或含溶解剂的溶解液溶解后负载于所述纳米粒子或微米粒子上。
2.根据权利要求1所述的细胞系统，其特征在于：分离被癌细胞全细胞抗原激活的癌细胞特异性T细胞后，还包括对所述癌细胞特异性T细胞进行扩增或扩增分选的步骤。
3.根据权利要求2所述的细胞系统，其特征在于：所述的扩增分选为将所述癌细胞特异性T细胞与细胞因子和/或抗体共孵育。
4.根据权利要求1所述的细胞系统，其特征在于：所述的分离包括利用被癌细胞全细胞抗原激活的癌细胞特异性T细胞的表面标志物进行筛选的步骤。
5.根据权利要求4所述的细胞系统，其特征在于：所述表面标志物包括CD69、CD25、OX40、CD137和CD28中的一种或多种。
6.根据权利要求1所述的细胞系统，其特征在于：所述肿瘤浸润淋巴细胞中的T细胞为从肿瘤浸润淋巴细胞中分选出来的T细胞，所述的分选包括从肿瘤浸润淋巴细胞中分选出CD45+的细胞和/或CD3+的细胞、分选出CD45+CD3+的细胞、分选出CD3+CD8+的细胞、分选出CD45+CD3+CD8+的细胞、分选出CD3+CD4+的细胞或分选出CD45+CD3+CD4+的细胞。
7.根据权利要求1所述的细胞系统，其特征在于：所述抗原提呈细胞包括B细胞、树突状细胞和巨噬细胞中的一种或多种。
8.根据权利要求1所述的细胞系统，其特征在于：共孵育时加入细胞因子。
9.根据权利要求8所述的细胞系统，其特征在于：所述细胞因子包括白介素、干扰素、肿瘤坏死因子和集落刺激因子中的一种或多种。
10.根据权利要求1所述的细胞系统，其特征在于：所述纳米粒子或微米粒子还负载有免疫增强佐剂，所述免疫增强佐剂包括两种或两种以上Toll样受体激动剂。
11.根据权利要求1所述的细胞系统，其特征在于：所述纳米粒子或微米粒子还负载有增加溶酶体逃逸的物质。
12.根据权利要求1所述的细胞系统，其特征在于：所述溶解剂选自尿素、盐酸胍、脱氧胆酸盐、十二烷基硫酸盐、甘油、蛋白质降解酶、白蛋白、卵磷脂、无机盐、Triton、吐温、氨基酸、糖苷和胆碱中的一种或多种。
13.权利要求1-12任一项所述的细胞系统在制备用于治疗或预防癌症药物中的应用。
14.根据权利要求13所述的应用，其特征在于：所述肿瘤浸润淋巴细胞或肿瘤浸润淋巴细胞中的T细胞来源于自体或同种异体。
15.一种体外激活癌细胞特异性T细胞的方法，其特征在于，包括以下步骤：
将负载癌细胞全细胞抗原的纳米粒子和/或负载癌细胞全细胞抗原的微米粒子、抗原提呈细胞与癌细胞特异性T细胞或含有癌细胞特异性T细胞的细胞混合物共孵育；
其中，所述癌细胞全细胞抗原包括经癌细胞和/或肿瘤组织裂解得到的水溶性抗原和/或非水溶性抗原，所述非水溶性抗原经溶解剂溶解后负载于所述纳米粒子或微米粒子上。
16.根据权利要求15所述的方法，其特征在于：共孵育时加入细胞因子。
17.根据权利要求16所述的方法，其特征在于：所述细胞因子包括白介素、干扰素、肿瘤坏死因子和集落刺激因子中的一种或多种。
18.根据权利要求15所述的方法，其特征在于：所述溶解剂选自尿素、盐酸胍、脱氧胆酸盐、十二烷基硫酸盐、甘油、蛋白质降解酶、白蛋白、卵磷脂、无机盐、Triton、吐温、氨基酸、糖苷和胆碱中的一种或多种。
19.根据权利要求15所述的方法，其特征在于：所述纳米粒子或微米粒子还负载有免疫增强佐剂和/或增加溶酶体逃逸的物质；所述免疫增强佐剂包括两种或两种以上Toll样受体激动剂。
20.根据权利要求15所述的方法，其特征在于：所述抗原提呈细胞包括B细胞、树突状细胞和巨噬细胞中的一种或多种。
21.经权利要求15-20任一项所述的方法体外激活的癌细胞特异性T细胞。
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