CN117122678A - 一种制备抗原递送粒子的方法 - Google Patents

一种制备抗原递送粒子的方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种制备抗原递送粒子的方法，所述方法包括先使用含有溶解剂的溶解液裂解细胞和/或组织后，然后使用溶解液溶解裂解物组分，然后使用纯水或者水溶液稀释溶解了裂解物的溶解液，蛋白质多肽组分会因为溶解剂含量的下降而析出，离心后使用溶解液二次溶解沉淀组分，即得到分离纯化得到的抗原组分。然后将分离纯化后的抗原组分负载到纳米粒子或微米粒子的内部和/或表面，所述纳米粒子或微米粒子即为抗原递送粒子。抗原递送粒子可以直接作为疫苗使用，或者用于激活其他免疫细胞制备细胞疫苗，或者用于激活其他免疫细胞辅助检测和分选扩增特定细胞。本发明的制备方法简单、快捷、消耗少、离心时溶液粘度低不需要高速离心获得沉淀。

Description

一种制备抗原递送粒子的方法
技术领域
本公开涉及免疫治疗领域，尤其涉及一种制备抗原递送粒子的方法。
背景技术
癌症疫苗是癌症等疾病免疫治疗的重要方法之一。影响癌症疫苗的主要因素包括抗原、佐剂和递送剂型。以癌症疫苗为例，对癌症疫苗影响最大的主要因素包括肿瘤抗原、佐剂和递送剂型。其中，抗原可以诱导激活特异性免疫反应，佐剂可以放大特异性的免疫反应，剂型可以影响抗原提呈细胞(antigen-presenting cells,APCs)对疫苗的吞噬和后续激活抗原特异性T细胞的效率。在这三者中，抗原是能够引发特异性免疫反应的主要成分，因而是最关键的因素。癌细胞和/或肿瘤组织含有全部的癌细胞特异性抗原和癌细胞相关抗原，是最好的肿瘤抗原递送粒子或癌症疫苗的制备原料。但是未经纯化的全细胞组分中含有DNA和糖类物质等其他物质，因而降低了蛋白质和多肽等肿瘤抗原组分的含量，因而本发明使用含有溶解剂的溶解液增溶溶解肿瘤组织/癌细胞的全细胞裂解物组分后，再通过稀释的方法降低蛋白质和多肽组分的溶解度从而沉淀析出，再配合其他方法分离纯化出细胞中的抗原组分，可以有效增强负载抗原组分的纳米粒子或微米粒子的体外和体内作用的功效。
发明内容
发明要解决的问题
为了将细胞裂解物(比如癌细胞裂解物)中的蛋白质多肽组分分离纯化出来，且为了使分离纯化的方法尽可能简单方便，本发明使用了一种先使用含有溶解剂的溶解液裂解细胞和/或组织后，溶解细胞和/或组织的裂解物组分，然后加入超过溶解液体积的纯水或者水溶液稀释含有溶解剂的溶解液，从而使溶解液增溶溶解的蛋白质多肽等沉淀析出的抗原组分分离纯化的方法。该分离纯化方法简便易行，不需要使用含盐物质进行盐析，也没有盐析时因为含盐物质粘度高导致需要使用很高离心速度才能将盐析出的物质全部离心沉淀的潜在困扰。
用于解决问题的方案
一种制备抗原递送粒子的方法，所述方法包括如下步骤：
(1)使用含有溶解剂的溶解液裂解细胞和/或组织；
(2)使用含有溶解剂的溶解液溶解步骤(1)裂解后的裂解物组分；
(3)加入体积是含有溶解剂的溶解液8倍以上的纯水或者水溶液，稀释含有溶解剂的溶解液，从而使溶解于溶解液中的裂解物组分中的蛋白质多肽等抗原组分因为溶解度下降而形成沉淀；
(4)离心后收集沉淀部分即为分离纯化的抗原组分；
(5)直接将收集的沉淀部分使用含有溶解剂的溶解液二次溶解后作为分离纯化的抗原组分使用，或者将收集的沉淀部分使用含有溶解剂的溶解液二次溶解后与步骤(4)离心后上清液中的组分经过其他方法分离纯化得到的其他组分合并后一起作为分离纯化的抗原组分使用；
其中，所述溶解剂独立地选自含有结构式1结构的化合物、脱氧胆酸盐、十二烷基硫酸盐、甘油、蛋白质降解酶、多肽、氨基酸、糖苷和胆碱等中的一种或多种；其中，结构式1如下：
R1为C、S、P、N或O，R2～R5独立地选自氢、烷基、巯基、氨基、羧基、取代或未取代的胍基；
优选地，所述溶解剂选自盐酸二甲双胍、硫酸二甲双胍、磺酸二甲双胍、二甲双胍盐、二甲双胍、尿素、过氧化尿素、盐酸胍、硫酸胍、磺酸胍、胍盐、脲盐、脲、脱氧胆酸盐、十二烷基硫酸盐、甘油、蛋白质降解酶、多肽、氨基酸、糖苷和胆碱等中的一种或多种。
优选地，所述方法还包括如下步骤：
(6)将分离纯化后的抗原组分进一步负载到纳米粒子或微米粒子的内部和/或表面。
优选地，所述负载分离纯化后的抗原组分的纳米粒子或微米粒子具有如下所示的组分：
(i)粒子材料形成的纳米粒子和/或微米粒子骨架结构；
(ii)使用含有溶解剂的溶解液裂解细胞和/或组织的裂解物，和溶解后从其中分离纯化的抗原组分；
优选地，所述抗原组分负载于所述骨架结构的内部和/或表面；
更优选地，在细胞裂解前或者裂解后还可以使用适当方法增强抗原组分的免疫原性；
进一步优选地，所述增强抗原组分免疫原性的方法包括但不限于辐照、氧化、还原、使用半抗原物质修饰、固定、酶处理、变性、加热、矿化等。
优选地，在步骤(ii)进行前，还可以使用特定的化学物质对所述细胞和/或组织做固定处理或者沉淀处理；
优选地，所述特定的化学物质包括但不限于甲醛、多聚甲醛、戊二醛、其他含有醛基的物质、乙醇、甲醇、丙酮、乙酸、丙酸、丁酸、甲酸、福尔马林、重铬酸盐、高锰酸钾、铬酸、苦味酸、Zamboni固定液、PLP固定液、FPA固定液、TAF固定液、Rossman固定液、Regaud固定液、PLPD固定液、PAPG固定液、Orth固定液、Muller固定液、McDoWell固定液、中性甲醛钙固定液、FAB固定液、Carnoy固定液、Clarke固定液、B-5固定液、Bouin固定液、FineFIX固定液、A.G.M(70％乙醇80ml+冰醋酸10ml+甲醇10ml)固定液、Helly固定液、Zenker固定液、Kolmer固定液、AAF固定液、Hollande固定液、Gendre固定液、醛类固定液、汞类固定液、醇类固定液、氧化剂类固定液、苦味酸盐类固定液、其他细胞或组织的固定剂或固定液、氧化二乙烯等中的一种或者多种。
优选地，所述氧化是使用氧化剂氧化抗原组分；
优选地，所述氧化剂包括但不限于次氯酸、过氧化氢(双氧水，H2O2)、过硫酸盐、重铬酸盐、过氧乙酸、铬酸、过硫酸铵、次氯酸钠、过碳酸钠、过硼酸钠、过硼酸钾、高氯酸盐、高锰酸盐、过氧化钠、KIO3、KBrO3、ClO3 -、ClO4 -、Na2O2、K2O2、MgO2、CaO2、BaO2、NO3 -、MnO4 -、F2、Cl2、O2、Br2、I2、S、Si、HNO3、MnO2、FeCl3等中的一种或多种。
优选地，所述辐照包括任何常用的辐照方法；
优选地，所述辐照包括但不限于放射性物质辐照、电子束辐照、微波辐照、紫外线辐照、X射线辐照、α射线辐照、β射线辐照、γ射线辐照等中的一种或者多种。
优选地，所述半抗原物质包括但不限于2,4-二硝基氟苯、2,4-二硝基氯苯、三硝基苯酚、二硝基苯酚、白蛋白、Ovalbumin、N-碘乙酰基-N’-(5-磺酸基1-萘基)亚乙基二酰胺、取代或未取代的苯磺酰胺、甲醛、多聚甲醛、其他含有醛基的半抗原物质、鼠李糖、半乳糖、氨基半乳糖等中的一种或者多种。
优选地，所述负载分离纯化后的抗原组分的纳米粒子或微米粒子具有如下所示的组分：
(i)粒子材料形成的纳米粒子和/或微米粒子骨架结构；
(ii)来自细胞和/或组织的全细胞裂解物组分和/或含抗原组分的部分细胞裂解物组分；
优选地，还可以通过适当方法增强来自细胞和/或组织的全细胞裂解物组分和/或含抗原组分的部分细胞裂解物组分的免疫原性；
优选地，所述增强免疫原性的来自细胞和/或组织的全细胞裂解物组分和/或含抗原组分的部分细胞裂解物组分负载于所述骨架结构的内部和/或表面；
优选地，所述部分细胞裂解物组分中含有的抗原组分包含细胞和/或组织裂解物中的蛋白质和多肽组分和/或细胞裂解物中的RNA组分或mRNA组分；
优选地，所述部分细胞裂解物组分中含有的抗原组分包含细胞和/或组织裂解物中的蛋白质和多肽组分和/或细胞裂解物中的脂质组分；
优选地，所述部分细胞裂解物组分中含有的抗原组分包含细胞和/或组织裂解物中的脂质组分和/或细胞裂解物中的RNA组分或mRNA组分；
优选地，所述抗原组分为使用适当方法从使用含有溶解剂的溶解液裂解后溶解的裂解物组分中分离提纯得到；
优选地，所述裂解物组分中的分离纯化得到的抗原组分也可以在细胞或肿瘤组织裂解前或者裂解后进行辐照，也可以在分离纯化的抗原组分负载到纳米粒子或者微米粒子以后进行辐照。
优选地，所述负载分离纯化后的抗原组分的纳米粒子或微米粒子进一步负载至少一种如下所示的组分：
(iii)裂解物组分中的RNA组分或mRNA组分；
(iv)免疫佐剂；
(v)带正电荷的物质；
优选地，所述免疫佐剂包括但不限于如下至少一种：模式识别受体类激动剂、Toll样受体激动剂、卡介苗(BCG)、卡介苗细胞壁骨架、卡介苗甲醇提取残余物、卡介苗胞壁酰二肽、草分枝杆菌、多抗甲素、卡介苗细胞壁骨架、卡介苗甲醇提取残余物、卡介苗胞壁酰二肽、草分枝杆菌、多抗甲素、矿物油、病毒样颗粒、免疫增强的再造流感病毒小体、霍乱肠毒素、皂苷及其衍生物、Resiquimod、胸腺素、新生牛肝活性肽、咪喹莫特、多糖、姜黄素、免疫佐剂CpG、免疫佐剂poly(I:C)、免疫佐剂poly ICLC、短小棒状杆菌苗、溶血性链球菌制剂、辅酶QIO、左旋咪唑、聚胞苷酸、白细胞介素、干扰素、聚肌苷酸、聚腺苷酸、明矾、磷酸铝、羊毛脂、植物油、细胞因子、mRNA、MF59、双链RNA、双链DNA、单链DNA、铝佐剂、锰佐剂、钙佐剂、STING激动剂、内毒素佐剂、脂质体佐剂、CAF01、人参有效成分、黄芪有效成分等；
优选地，所述免疫佐剂包括Toll样受体3激动剂和Toll样受体9激动剂中的至少一种；
更优选地，所述免疫佐剂包括Poly(I:C)、Poly ICLC、A类CpG-OND、B类CpG-OND和C类CpG-OND中的至少一种；
优选地，所述带正电荷的物质包括但不限于带正电荷的氨基酸、带正电荷的多肽、带正电荷的脂质、带正电荷的蛋白质、带正电荷的聚合物，和/或带正电荷的无机物等中的一种或多种；
优选地，所述带正电荷的物质包括但不限于蜂毒肽、RALA多肽、KALA多肽、R8多肽、精氨酸、组氨酸、赖氨酸、聚精氨酸、聚赖氨酸、聚组氨酸和NH4HCO3等中的一种或多种。
优选地，所述纳米粒子的粒径为1nm-1000nm，优选为50-500nm，更优选为100-400nm；优选地，所述微米粒子的粒径为1μm-1000μm，优选为1-10μm，更优选为1-5μm。
本发明还提供了一种根据所述方法制备得到的抗原递送粒子。
本发明还提供了一种药物组合物，所述药物组合物包括所述抗原递送粒子；优选地，所述药物组合物还包括一种或多种药学上可接受的载体。
本发明还提供了一种所述抗原递送粒子或所述药物组合物在如下(1)-(4)至少一项中的用途：
(1)制备用于预防或治疗疾病的药物；
(2)制备用于激活抗原提呈细胞，制备抗原提呈细胞疫苗；
(3)辅助激活抗原特异性T细胞，检测抗原特异性T细胞含量；
(4)辅助激活抗原特异性T细胞后，分离扩增被激活的抗原特异性T细胞，将其用于预防或治疗疾病。
优选地，所述负载分离纯化后的抗原组分的纳米粒子或微米粒子可以直接作为疫苗使用；
优选地，所述负载分离纯化后的抗原组分的纳米粒子或微米粒子也可以作为抗原递送粒子激活树突状细胞和/或B细胞后，将被激活的树突状细胞和/或B细胞作为细胞疫苗使用；
优选地，所述负载分离纯化后的抗原组分的纳米粒子或微米粒子也可以作为抗原递送粒子体外辅助激活癌细胞特异性T细胞后用于检测癌抗原特异性T细胞的含量，或者用于辅助激活抗原特异性T细胞后分离和/或扩增被激活的抗原特异性T细胞用于疾病的预防和治疗。
优选地，所述疾病为癌症或者肿瘤；
优选地，所述癌症或肿瘤为实体肿瘤或者血液瘤。
发明的效果
本公开使用稀释法分离提纯了使用含有溶解剂的溶解液所溶解的细胞(如癌细胞)和/或组织(如肿瘤组织)中的抗原组分，能够富集蛋白质和多肽抗原组分，并规避了可能由糖类和DNA等物质引起的潜在毒副作用。由于含有溶解剂的溶解液在溶解剂含量达到一定浓度以后才会具有增溶作用，而且在溶解蛋白质等物质的过程中会使蛋白质和多肽物质变性(因为癌症疫苗等想要激活的是T细胞途径的细胞免疫，其所识别的为多肽的1级序列片段，而不是体液免疫所识别的3级空间构象结构，因而蛋白质变性对蛋白质抗原组分的针对细胞免疫的免疫原性没有负面影响，甚至会在某种程度增强蛋白的免疫原性)，因而当稀释时溶解液中的溶解剂浓度下降导致已经变性的蛋白质和多肽等物质会不溶析出，而糖类和DNA等物质可以继续溶解于稀释后的水溶液中，从而达到分离蛋白质多肽等抗原物质的目的。该方法简便，快捷，无需添加高浓度盐类等物质进行盐析。
当使用高浓度盐类物质盐析使用含有溶解剂溶解的裂解物时，体系中同时含有高浓度盐类和溶解剂，会导致溶液的粘度很高，离心时需要使用比较高的转速才能将盐析析出的沉淀物离心出来，对离心转速和离心仪器要求更高。而采用本发明所述的加入大量纯水或者水溶液(比如PBS)进行稀释的方法分离纯化时，步骤简便，不需要额外的试剂，离心时也不需要很高的转速，因而使得纯化的操作和过程更简单快捷便利。
附图说明
图1为本公开中分离纯化细胞或组织裂解物中的抗原组分的部分可行的制备过程及应用示意图。
图2为结构式1的结构，其中R1为C、S、P、N或O，R2～R5独立地选自氢、烷基、巯基、氨基、羧基、取代或未取代的胍基等任意其他基团。
图3-图7为实施例1-5中使用负载分离纯化后的抗原组分的纳米疫苗和/或微米疫苗或者DC疫苗或者辅助分选扩增的T细胞预防或治疗癌症时肿瘤生长速度和生存期实验结果；其中，a为预防或治疗癌症时的肿瘤生长速度实验结果(n≥8)；b为预防或治疗癌症时的小鼠生存期实验结果(n≥8)，每个数据点为平均值±标准误差(mean±SEM)；其中，a图中肿瘤生长抑制实验的显著性差异采用ANOVA法分析，b图中显著性差异采用Kaplan-Meier和log-rank test分析。
图8为实施例6中使用抗原递送纳米粒子检测癌细胞特异性T细胞的实验结果。
在上述图中，***表示与PBS对照组相比p＜0.005，有显著性差异；##代表两组相比p＜0.01，有显著性差异；#代表两组相比p＜0.05，有显著性差异。
具体实施方式
为使本发明的技术方案和有益效果能够更加明显易懂，下面通过列举具体实施例的方式进行详细说明。除非另有定义，本文所使用的技术和科学术语与本申请所属的技术领域中的技术和科学术语的含义相同。
本实施例中所用到的实验技术与实验方法，如无特殊说明均为常规技术方法，例如下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件或按照制造厂商所建议的条件。实施例中所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可通过正规商业渠道获得。
在本发明的权利要求和/或说明书中，术语“一(a)”或“一(an)”或“一(the)”可以指“一个”，但也可以指“一个或多个”、“至少一个”以及“一个或多于一个”。
如在权利要求和说明书中所使用的，词语“包含”、“具有”、“包括”或“含有”是指包括在内的或开放式的，并不排除额外的、未引述的元件或方法步骤。
术语“罹患疾病”是指：身体出现了疾病症状。
术语“治疗”是指：在罹患疾病之后，使受试者接触(例如给药)递送粒子、递送系统、疫苗、负载抗原的药物、药物组合物，从而与不接触时相比使该疾病的症状减轻，并不意味着必需完全抑制疾病的症状。
术语“预防”是指：在罹患疾病之前，通过使受试者接触(例如给药)本公开的递送粒子、递送系统、疫苗、负载抗原的药物、药物组合物，从而与不接触时相比减轻罹患疾病后的症状，并不意味着必需完全抑制患病。
本公开中的疫苗可以使用本领域技术人员已知的任何方法来制备。例如，常规混合、溶解、造粒、乳化、磨细、包封、包埋和/或冻干工艺。
在本公开中，施用途经能够以任何适用的方式进行变化或调整，以满足药物的性质、患者和医务人员的便利以及其它相关因素的需求。
本公开上下文中使用的术语“个体”、“患者”或“受试者”包括哺乳动物。哺乳动物包括但不限于，家养动物(例如，牛，羊，猫，狗和马)，灵长类动物(例如，人和非人灵长类动物如猴)，兔，以及啮齿类动物(例如，小鼠和大鼠)。
术语“肿瘤”和“癌症”在本文中互换地使用，涵盖实体瘤和液体肿瘤。术语“肿瘤”指所有赘生性(neoplastic)细胞生长和增殖，无论是恶性的还是良性的，及所有癌前(pre-cancerous)和癌性细胞和组织。术语“癌症”、“癌性”和“肿瘤”在本文中提到时并不互相排斥。
本公开所述抗原组分制备时，部分实施例使用了肿瘤组织或者癌细胞系，在实际应用可以使用肿瘤组织、癌细胞系、从肿瘤组织分离出来的癌细胞经过培养扩增后的癌细胞、外周血中分离出来的循环肿瘤细胞经过培养扩增后所得的癌细胞等几种方法得到的癌细胞/肿瘤组织来制备抗原组分，在实际应用中也可以使用任何其他可行的方案途径得到癌细胞；在实际应用中也可以使用其他细胞或者组织制备其他疾病中的抗原组分，比如使用β细胞制备1型糖尿病的抗原组分，使用胰腺组织或者胰岛组织制备1型糖尿病的抗原组分。
限于篇幅，本公开实施例中所述癌种为实体瘤，在实际应用中也可以使用本公开所述的纳米疫苗或微米疫苗对血液瘤和淋巴瘤等进行治疗。因为血液瘤和淋巴瘤免疫微环境没有实体瘤复杂，所以本公开所述的纳米疫苗或微米疫苗在血液瘤和淋巴瘤中的效果更佳。
本发明提供了一种制备抗原递送粒子的方法，首先使用含有溶解剂的溶解液裂解细胞或组织，然后将裂解后的裂解物使用含有溶解剂的溶解液增溶溶解，然后加入8倍体积以上的纯水或者水溶液稀释溶解液，使溶解液中增溶溶解的蛋白质多肽组分沉淀析出(稀释导致具有增溶作用的溶解剂的含量降低，从而导致蛋白质和多肽不溶析出)。
然后将分离纯化的抗原组分负载于纳米粒子或微米粒子作为疫苗或者抗原递送粒子使用：作为疫苗使用可以用来预防或者治疗疾病；作为抗原递送粒子使用可以用于体外激活抗原提呈细胞制备抗原提呈细胞疫苗，或者辅助激活抗原特异性T细胞后检测抗原特异性T细胞的含量，或者辅助激活抗原特异性T细胞后将抗原特异性T细胞分选扩增后用于预防或者治疗疾病。
本发明提供了一种制备抗原递送粒子的方法，所述方法包括如下步骤：
(1)使用含有溶解剂的溶解液裂解癌细胞和/或肿瘤组织；
(2)使用含有溶解剂的溶解液溶解步骤(1)裂解后的裂解物组分；
(3)加入体积是含有溶解剂的溶解液8倍以上的纯水或者水溶液，稀释含有溶解剂的溶解液，从而使溶解于溶解液中的裂解物组分中的蛋白质多肽组分因为溶解度下降而形成沉淀；
(4)离心后收集沉淀的蛋白质多肽抗原部分；
(5)直接将收集的沉淀部分使用含有溶解剂的溶解液溶解后作为分离纯化的抗原组分使用，或者将收集的沉淀部分使用含有溶解剂的溶解液二次溶解后与步骤(4)离心后上清液中的组分经过其他方法分离得到的其他组分合并后一起作为分离纯化的抗原组分使用。
在某些实施方案中，所述其他处理方法包括但不限于盐析、氧化、还原、加热、放射照射(辐照)等。
在某些实施方案中，所述细胞和/或组织中的裂解物的制备步骤为：先使用含有溶解剂的溶解液裂解细胞和/或组织得到其裂解物，然后使用含有溶解剂的溶解液溶解裂解物组分。
在某些实施方案中，分离纯化癌细胞和/或肿瘤组织中抗原组分的步骤包括：
(1)使用含有溶解剂的溶解液裂解癌细胞和/或肿瘤组织；
(2)使用含有溶解剂的溶解液溶解步骤(1)裂解后的裂解物组分；
(3)加入体积是含有溶解剂的溶解液8倍以上的纯水或者水溶液，稀释含有溶解剂的溶解液，从而使溶解于溶解液中的裂解物组分中的蛋白质多肽等抗原组分因为溶解度下降而形成沉淀；
(4)离心后收集沉淀部分即为分离纯化的抗原组分；
(5)直接将收集的沉淀部分使用含有溶解剂的溶解液二次溶解后作为分离纯化的抗原组分使用，或者将收集的沉淀部分使用含有溶解剂的溶解液二次溶解后与步骤(4)离心后上清液中的组分经过其他方法分离纯化得到的其他组分合并后一起作为分离纯化的抗原组分使用；步骤(4)离心后上清液中的组分经过的其他处理方法包括但不限于盐析、加热、氧化、还原、放射照射(辐照)等。
在某些实施方案中，所述癌细胞和/或肿瘤组织中的裂解物的制备步骤为：先使用含有溶解剂的溶解液裂解癌细胞和/或肿瘤组织得到其裂解物，然后使用含有溶解剂的溶解液溶解裂解物组分。
在某些实施方案中，本发明所述的分离纯化抗原组分的方法可以只使用稀释溶解液的方法(简称稀释法)，也可以使用稀释溶解液的方法与其他方法配合共同分离纯化抗原组分。
在某些实施方案中，可以用于与稀释溶解液的方法配合使用的分离纯化抗原组分的方法包括但不限于盐析、加热、酶处理、氧化、还原、层析、电泳、色谱法、重结晶、沉淀、透析、萃取、辐射、固定、矿化、辐照等。
在某些实施方案中，所述溶解剂独立地选自含有结构式1结构的化合物、脱氧胆酸盐、十二烷基硫酸盐、甘油、蛋白质降解酶、多肽、氨基酸、糖苷和胆碱中的一种或多种；其中，结构式1如下：
R1为C、S、P、N或O，R2～R5独立地选自氢、烷基、巯基、氨基、羧基、取代或未取代的胍基。
在某些实施方案中，含有结构式1结构的化合物包括但不限于盐酸二甲双胍、硫酸二甲双胍、磺酸二甲双胍、二甲双胍盐、二甲双胍、尿素、过氧化尿素、盐酸胍、硫酸胍、磺酸胍、胍盐、脲盐、脲、其他含有胍基的化合物、碳酸胍、精氨酸、胍基乙酸、胍基磷酸、氨基磺酸胍、胍基琥珀酸、盐酸氨基脲、氨基甲酰脲、乙酰脲、磺酰脲类化合物(格列本脲、格列齐特、格列喹酮、格列美脲等)、硫脲类化合物(硫氧嘧啶类、咪唑类等)、亚硝基脲类等。
在某些实施方案中，所述尿素和盐酸胍等含有结构式1中的结构。发明人发现具有结构式1结构的物质可以作为溶解液中的溶解剂溶解细胞或者肿瘤组织中的非水溶性组分，因而除了尿素和盐酸胍、二甲双胍等常见的含有胍基结构的化合物外，其他含有该结构的化合物也具有作为溶解剂溶解非水溶性组分的能力。
在某些实施方案中，所述溶解剂选自盐酸二甲双胍、硫酸二甲双胍、磺酸二甲双胍、二甲双胍盐、二甲双胍、尿素、过氧化尿素、盐酸胍、硫酸胍、磺酸胍、胍盐、脲盐、脲、脱氧胆酸盐、十二烷基硫酸盐、甘油、蛋白质降解酶、多肽、氨基酸、糖苷和胆碱等中的一种或多种。
在某些实施方案中，所述方法还包括如下步骤：
(6)将分离纯化后的抗原组分进一步负载到纳米粒子或微米粒子的内部和/或表面。
在某些实施方案中，所述方法还包括如下步骤：
(7)将负载分离纯化后的抗原组分的纳米粒子或微米粒子制备为疫苗。
在某些实施方案中，所述负载分离纯化后的抗原组分的纳米粒子或微米粒子可以直接作为疫苗使用。
在某些实施方案中，所述负载分离纯化后的抗原组分的纳米粒子或微米粒子也可以作为抗原递送粒子激活树突状细胞和/或B细胞后，将被激活的树突状细胞和/或B细胞作为细胞疫苗使用。
在某些实施方案中，所述负载分离纯化后的抗原组分的纳米粒子或微米粒子也可以作为抗原递送粒子体外辅助激活癌细胞特异性T细胞(肿瘤特异性T细胞)后用于检测癌细胞特异性T细胞的含量，或者用于辅助激活抗原特异性T细胞后分离和/或扩增被激活的抗原特异性T细胞用于疾病的预防和治疗。
在某些实施方案中，所述负载分离纯化的抗原组分的纳米粒子或微米粒子具有如下所示的组分：
(i)粒子材料形成的纳米粒子和/或微米粒子骨架结构；
(ii)来自细胞(如癌细胞)和/或组织(如肿瘤组织)的全细胞裂解物组分和/或含抗原组分的部分细胞裂解物组分；
在某些实施方案中，所述全细胞裂解物组分和/或含抗原组分的部分细胞裂解物组分负载于所述骨架结构的内部和/或表面。
在某些实施方案中，在细胞裂解前或者裂解后还可以使用适当方法增强抗原组分的免疫原性。
在某些实施方案中，所述增强抗原组分免疫原性的方法包括但不限于辐照、氧化、还原、使用半抗原物质修饰、固定、酶处理、变性、加热、矿化等。
在某些实施方案中，使用稀释法稀释含有溶解剂的溶解液后，上清液中的物质还可以进行后续的分离纯化处理和/或增强免疫原性处理，处理的方法包括但不限于盐析、加热、酶处理、使用RNA分离试剂盒、使用mRNA分离试剂盒、氧化、还原、固定、半抗原物质共作用、矿化等方法中的一种或多种。
在某些实施方案中，所述来自癌细胞和/或肿瘤组织使用含有溶解剂的溶解液裂解，裂解所得的裂解物使用含溶解剂的溶解液增溶溶解；所述部分细胞组分中含有的抗原组分包含癌细胞和/或肿瘤组织裂解物中的蛋白质和多肽组分和/或细胞/组织裂解物中的RNA组分或mRNA组分。
在某些实施方案中，所述抗原组分使用纯水或者水溶液稀释溶解液的方法分离纯化出抗原组分。
在某些实施方案中，使用稀释法分离纯化抗原组分可以与其他分离纯化抗原组分的方法相配合，比如加热、盐析、提取RNA、提取mRNA等。
在某些实施方案中，所述抗原组分可以进行适当处理以增强其免疫原性，增强抗原组分的免疫原性的处理方法可以在细胞或肿瘤组织裂解前，也可以在细胞或肿瘤组织裂解后，也可以在将抗原组分负载到纳米粒子或微米粒子后。
在某些实施方案中，抗原组分增强免疫原性的处理方法包括但不限于使用射线进行辐照、将细胞或组织与特定物质共孵育、使用半抗原物质修饰、氧化、还原、固定、矿化、酶处理等。
在某些实施方案中，所述辐照为使用紫外线、X射线、微波、电子束、γ射线、α射线、β射线、放射源等不同辐照方法中的一种或多种处理一段时间。
在某些实施方案中，所述癌细胞或肿瘤组织在裂解前可以与特定化学物质共孵育刺激癌细胞或肿瘤组织，所述刺激癌细胞的特定物质包括但不限于小分子化合物(如阿霉素、紫杉醇、长春新碱、维甲酸、三氧化二砷等)、生长因子、细胞因子、植物提取物(如人参等重要的提取物、植物根茎提取物等)、趋化因子、干扰素、细菌分泌物、细菌细胞外囊泡等。使用特定物质与癌细胞或肿瘤组织共孵育刺激癌细胞或肿瘤组织的目的是为了使癌细胞产生更多抗原组分。
在某些实施方案中，所述半抗原物质为与蛋白质或多肽共作用后可以增加蛋白质或多肽免疫原性的物质。
在某些实施方案中，所述半抗原物质包括但不限于2,4-二硝基氟苯(DNFB)、2,4-二硝基氯苯(DNCB)、三硝基苯酚(TNP)、二硝基苯酚(DNP)、白蛋白、Ovalbumin(OVA)、N-碘乙酰基-N’-(5-磺酸基1-萘基)亚乙基二酰胺(AED)、取代或未取代的苯磺酰胺、甲醛、半乳糖、鼠李糖、氨基半乳糖、多聚甲醛、其他含有醛基的半抗原物质等。
在某些实施方案中，所述氧化是使用氧化剂氧化抗原组分。
在某些实施方案中，所述氧化剂包括但不限于过次氯酸、过氧化氢(双氧水，H2O2)、过硫酸盐、双氧水(过氧化氢)、KIO3、KBrO3、氯气、重铬酸盐、过氧乙酸、铬酸、过硫酸铵、次氯酸钠、过碳酸钠、过硼酸钠、过硼酸钾、高氯酸盐、高锰酸盐、过氧化钠、KIO3、KBrO3、ClO3 -、ClO4 -、Na2O2、K2O2、MgO2、CaO2、BaO2、NO3 -、MnO4 -、F2、Cl2、O2、Br2、I2、S、Si、HNO3、MnO2、FeCl3等中的一种或多种。
在某些实施方案中，所述氧化可以增强部分抗原组分的免疫原性。
在某些实施方案中，所述还原剂包括但不限于二硫苏糖醇(DTT)、三(2-羧乙基)膦(TCEP)等还原剂中的一种或多种。
在某些实施方案中，所述酶处理方法包括但不限于使用核酸酶、DNA酶、胃蛋白酶、糜蛋白酶、胰蛋白酶、其他蛋白消化酶、蛋白酶抑制剂等中的一种或多种。本公开中酶解包括但不限于使用核酸酶、胃蛋白酶、胰蛋白酶、蛋白酶抑制剂、糜蛋白酶、DNA酶等任何可行的酶解方法。
在某些实施方案中，所述辐照包括任何常用的辐照方法；
在某些实施方案中，所述辐照包括但不限于放射性物质辐照、紫外线辐照、电子束辐照、X射线辐照、α射线辐照、微波辐照、β射线辐照、γ射线辐照中的一种或者多种。
在某些实施方案中，所述矿化包括但不限于使用硅化、钙化、镁化等任何矿化或者生物矿化的方法。
在某些实施方案中，所述分离纯化抗原组分的方法可以只使用稀释法，也可以使用稀释法与其他方法配合共同分离纯化抗原组分。
在某些实施方案中，可以用于与稀释法配合使用的分离纯化抗原组分的方法包括但不限于盐析、加热、酶处理、氧化、还原、层析、电泳、色谱法、重结晶、沉淀、透析、萃取、辐射、固定、矿化、辐照等。
在某些实施方案中，所述层析包括但不限于柱层析、气相层析、高压液相层析、吸附层析、分配层析、薄层层析、高效液相层析、离子交换层析、薄膜层析、亲和层析、凝胶层析等。
在某些实施方案中，所述色谱法包括但不限于柱色谱法、薄层色谱法、液相色谱法、气相色谱法、超临界流体色谱法等。
在某些实施方案中，所述电泳法包括但不限于SDS电泳法、等电点聚焦电泳法、等速电泳法、免疫电泳法、血清蛋白电泳法、核酸电泳法、DNA定序电泳法、凝胶电泳法、制备电泳法等。
在某些实施方案中，使用半抗原物质与细胞(如癌细胞)或者组织(如肿瘤组织)中的细胞共作用一定时间，修饰细胞或者组织中的抗原组分，然后裂解细胞和/或组织得到其裂解物；或者先裂解细胞(如癌细胞)或者组织(如肿瘤组织)得到其裂解物，然后使用半抗原物质修饰细胞或者组织裂解物中的抗原组分。
在某些实施方案中，使用半抗原物质修饰过的细胞(如癌细胞)或组织(如肿瘤组织)的裂解物组分可以直作为抗原组分接被负载于纳米疫苗或者微米疫苗中，或者经过适当处理分离提纯或者进一步增强免疫原性后再作为抗原组分被负载于纳米疫苗或者微米疫苗中。
在某些实施方案中，在裂解细胞(如癌细胞)或者组织(如肿瘤组织)之前或者将半抗原物质与细胞(如癌细胞)或者组织(如肿瘤组织)共作用前，可以使用射线辐照细胞(如癌细胞)或者组织(如肿瘤组织)，以灭活细胞(如癌细胞)或者组织(如肿瘤组织)，所述射线包括但不限于γ射线、X射线、电子束、微波、β射线、α射线等。
在某些实施方案中，所述用于增强抗原组分免疫原性的辐照，其中辐照为任何常用的辐照方法，包括但不限于放射性物质辐照、电子束、微波、紫外线辐照、X射线辐照、α射线辐照、β射线辐照、γ射线辐照等辐照方法等中的一种或者多种。
在某些实施方案中，所述酶处理方法包括但不限于使用核酸酶、DNA酶、胃蛋白酶、糜蛋白酶、胰蛋白酶、其他蛋白消化酶、蛋白酶抑制剂等中的一种或多种。
在某些实施方案中，用于酶解的酶包括但不限于核酸酶、胃蛋白酶、胰蛋白酶、蛋白酶抑制剂、糜蛋白酶、DNA酶等中的一种或多种的酶解方法。
在某些实施方案中，本公开所述的细胞来源为任何可以获得细胞的方法。以癌细胞为例，本公开所述的癌细胞来源为任何可以获得癌细胞的方法，包括但不限于癌细胞系、从肿瘤组织中分离提取出来的癌细胞经过体外扩增得到的癌细胞、从血液中分离提取出来的循环肿瘤细胞经过扩增得到的癌细胞、或者从干细胞分化培养的癌细胞等。
在某些实施方案中，所述细胞或组织在裂解前可以与特定化学物质共孵育刺激细胞或组织。
在某些实施方案中，所述癌细胞或肿瘤组织在裂解前可以与特定化学物质共孵育刺激癌细胞或肿瘤组织。
在某些实施方案中，所述刺激癌细胞的特定物质包括但不限于小分子化合物(如阿霉素、紫杉醇、长春新碱、维甲酸、三氧化二砷等)、生长因子、细胞因子、趋化因子、植物提取物(如人参等重要的提取物、植物根茎提取物等)、干扰素、细菌分泌物、细菌细胞外囊泡等。使用特定物质与癌细胞或肿瘤组织共孵育刺激癌细胞或肿瘤组织的目的是为了使癌细胞产生更多抗原组分。
在某些实施方案中，所述抗原组分为使用稀释法纯化后得到，或者使用稀释法后再配合其他适当方法从使用含有溶解剂的溶解液溶解的裂解物组分中分离提纯得到，所述裂解物组分中的分离纯化得到的抗原组分也可以在细胞或肿瘤组织裂解前或者裂解后进行辐照，也可以在分离纯化的抗原组分负载到纳米粒子或者微米粒子以后进行辐照。
在某些实施方案中，所述癌细胞来自一个或者多个机体，或者来自一种或多种癌细胞系；所述肿瘤组织来自一个或者多个机体；所述癌细胞和/或肿瘤组织中的裂解物组分中的蛋白质和多肽组分中含有抗原组分。
在某些实施方案中，所述癌细胞和/或肿瘤组织在裂解前或(和)裂解后既可经过包括但不限于灭活或(和)变性、固定、层析、电泳、色谱法、重结晶、沉淀、透析、萃取、辐射、加热、盐析、酶处理、氧化、还原、矿化、辐照、辐射、离子化、化学修饰、核酸分离提纯、蛋白酶内切或降解、核酸酶处理等处理后，再使用含有溶解剂的溶解液裂解后溶解裂解物组分后再提取分离其中的蛋白质和多肽组分；也可以细胞裂解前或(和)裂解后不经过任何灭活或(和)变性、固定、加热、盐析、氧化、还原、矿化、酶处理、离子化、辐照、辐射、层析、电泳、色谱法、重结晶、沉淀、透析、萃取、辐射、化学修饰、蛋白酶内切或降解、核酸酶处理直接使用含有溶解剂的溶解液裂解后溶解裂解物组分后提取分离其中的蛋白质和多肽组分。本公开部分实施例中，肿瘤组织细胞在裂解前经过了辐照、高温灭活或(和)变性处理，在实际使用过程中也可以在细胞裂解后做辐照、加热处理，或者也可以细胞裂解前和裂解后均做辐照、加热灭活或(和)变性处理；在实际使用过程中也可以采用包括但不限于放射线辐照、高压、核酸分离提纯、固定、层析、电泳、色谱法、重结晶、沉淀、透析、萃取、辐照、辐射、加热、盐析、氧化、还原、酶处理、矿化、离子化、化学修饰、核酸酶处理、蛋白酶内切或降解、胶原酶处理、冷冻干燥等处理方法。本领域技术人员可以理解，在实际应用过程中技术人员可根据具体情况进行适当调整。
在某些实施方案中，所述负载分离纯化的抗原组分的纳米粒子或微米粒子具有如下所示的组分：
(i)粒子材料形成的纳米粒子和/或微米粒子骨架结构；
(ii)来自细胞和/或组织的全细胞裂解物组分和/或含抗原组分的部分细胞裂解物组分；
在某些实施方案中，还可以通过适当方法增强来自细胞和/或组织的全细胞裂解物组分和/或含抗原组分的部分细胞裂解物组分的免疫原性；
在某些实施方案中，所述增强免疫原性的来自细胞和/或组织的全细胞裂解物组分和/或含抗原组分的部分细胞裂解物组分负载于所述骨架结构的内部和/或表面；
在某些实施方案中，所述部分细胞裂解物组分中含有的抗原组分包含细胞和/或组织裂解物中的蛋白质和多肽组分和/或细胞裂解物中的RNA组分或mRNA组分；
在某些实施方案中，所述抗原组分为使用适当方法从使用含有溶解剂的溶解液裂解后溶解的裂解物组分中分离提纯得到；
在某些实施方案中，所述裂解物组分中的分离纯化得到的抗原组分也可以在细胞或肿瘤组织裂解前或者裂解后进行辐照，也可以在分离纯化的抗原组分负载到纳米粒子或者微米粒子以后进行辐照。
在某些实施方案中，所述负载分离纯化后的抗原组分的纳米粒子或微米粒子进一步负载至少一种如下所示的组分：
(iii)裂解物组分中的RNA组分或mRNA组分；
(iv)免疫佐剂；
(v)带正电荷的物质。
在某些实施方案中，所述免疫佐剂包括但不限于如下至少一种：模式识别受体类激动剂、Toll样受体激动剂、卡介苗(BCG)、卡介苗细胞壁骨架、卡介苗甲醇提取残余物、卡介苗胞壁酰二肽、草分枝杆菌、多抗甲素、卡介苗细胞壁骨架、卡介苗甲醇提取残余物、卡介苗胞壁酰二肽、草分枝杆菌、多抗甲素、矿物油、病毒样颗粒、免疫增强的再造流感病毒小体、霍乱肠毒素、皂苷及其衍生物、Resiquimod、胸腺素、新生牛肝活性肽、咪喹莫特、多糖、姜黄素、免疫佐剂CpG、免疫佐剂poly(I:C)、免疫佐剂poly ICLC、短小棒状杆菌苗、溶血性链球菌制剂、辅酶QIO、左旋咪唑、聚胞苷酸、白细胞介素、干扰素、聚肌苷酸、聚腺苷酸、明矾、磷酸铝、羊毛脂、植物油、细胞因子、mRNA、MF59、双链RNA、双链DNA、单链DNA、铝佐剂、锰佐剂、钙佐剂、STING激动剂、内毒素佐剂、脂质体佐剂、CAF01、人参有效成分、黄芪有效成分等。
在某些实施方案中，所述免疫佐剂包括Toll样受体3激动剂和Toll样受体9激动剂中的一种或多种。
在某些实施方案中，所述免疫佐剂包括Poly(I:C)、Poly ICLC、A类CpG-OND、B类CpG-OND和C类CpG-OND中的一种或多种。
在某些实施方案中，所述带正电荷的物质包括但不限于带正电荷的氨基酸、带正电荷的多肽、带正电荷的脂质、带正电荷的蛋白质、带正电荷的聚合物，和/或带正电荷的无机物等中的一种或多种。
在某些实施方案中，所述带正电荷的物质选自蜂毒肽、RALA多肽、KALA多肽、R8多肽、精氨酸、组氨酸、赖氨酸、聚精氨酸、聚赖氨酸、聚组氨酸和NH4HCO3等中的一种或多种。
在本公开中，使用了有机高分子物质作为纳米粒子或微米粒子的制备材料，在实际应用中，也可以使用任何其他可以负载抗原并制备得到纳米或者微米大小的粒子的制备材料，包括但不限于无机材料、病毒(如病毒蛋白质)、细菌(如细菌壁、细菌蛋白质或者全细菌)、其他生物来源(外泌体、细胞外囊泡、细菌膜组分)的材料等。
在本公开中，所述负载分离纯化的抗原组分的纳米粒子或微米粒子中，每1mg粒子材料负载0.001-2000μg蛋白质或多肽组分。在一些实施方案中，所述纳米粒子或微米粒子还负载免疫增强佐剂，其中，每1mg粒子材料负载1-800μg免疫增强佐剂。在实际应用中，每1mg粒子材料负载的蛋白质多肽等抗原组分含量还可以更高。
在本公开中，所述负载分离纯化的抗原组分的纳米粒子或者微米粒子的内部和/或表面还可以含有膜组分，纳米粒子或微米粒子内部和/或表面的膜组分为选自抗原提呈细胞的细胞膜、抗原提呈细胞的细胞外囊泡、癌细胞的细胞膜、癌细胞的细胞外囊泡、细菌的细胞膜和细菌的细胞外囊泡中的一种或者多种。
当膜组分位于纳米粒子或微米粒子表面时，将膜组分负载到纳米粒子或微米粒子表面的方法包括但不限于超声、共孵育、共挤出、超滤、离心、透析、化学键连接、搅拌、透析、均质化和匀浆中的一种或多种。
纳米粒子/微米粒子也可以是细菌和病毒；或者使用细菌的细胞壁制备纳米粒子或微米粒子，或者使用细菌蛋白质或者病毒的蛋白质制备纳米粒子和微米粒子。
本公开部分示例性的实施方式中使用了溶剂挥发法制备负载抗原组分的纳米粒子或微米粒子，在实际应用中也可以使用其他任何可以制备抗纳米粒子或微米粒子的方法，包括但不限于沉淀法、透析法、分散法、微流控法、高压均质化法、搅拌法、喷雾干燥法、相分离法、静电喷射法、乳液聚合法、机器搅拌剪切法、膜乳化法等。
在某些实施方案中，，所述癌细胞和/或肿瘤组织裂解物分离纯化后的抗原组分可以为选自如下的一种或两种：(1)蛋白质多肽组分；(2)蛋白质多肽组分和RNA组分(或mRNA组分)；(3)脂质组分。
在一些优选的实施方案中，所述蛋白质多肽与RNA组分(或mRNA组分)的质量比为(0.1-100)：(0.1-100)；优选为(0.1-2)：(0.1-2)。
在某些实施方案中，所述粒子骨架结构、蛋白质和多肽组分的质量比为1：0.001-1：10。
在某些实施方案中，所述粒子骨架结构、蛋白质和多肽组分的质量比为1：0.001-1：2。
在某些实施方案中，所述粒子骨架结构、蛋白质和多肽组分的质量比为1：0.05-1：1。
在某些实施方案中，除了负载蛋白质多肽组分外还同时负载RNA组分或mRNA组分时，所述粒子骨架结构和RNA组分或mRNA组分的质量比为1：0.001-1：10。
在某些实施方案中，除了负载蛋白质多肽组分外还同时负载RNA组分或mRNA组分时，所述粒子骨架结构和RNA组分或mRNA组分的质量比为1：0.01-1：2。
在某些实施方案中，除了负载蛋白质多肽组分外还同时负载RNA组分或mRNA组分时，所述粒子骨架结构和RNA组分或mRNA组分的质量比为1：0.05-1：1。
在某些实施方案中，所述蛋白质和多肽组分和RNA组分/mRNA组分的质量比为1：0.001-1：10。
在某些实施方案中，所述蛋白质和多肽组分和RNA组分/mRNA组分的质量比为1：0.01-1：2。
最优选地，所述蛋白质和多肽组分和RNA组分/mRNA组分与的质量比为1：0.05-1：1。
在某些实施方案中，具有免疫原性的蛋白和/或多肽可以来源于癌细胞/肿瘤组织中的一部分组分和细胞外囊泡裂解物。进一步地，所述细胞外囊泡裂解物选自癌细胞的细胞外囊泡裂解物和/或细菌的细胞外囊泡裂解物。所述癌细胞和/或肿瘤组织中的一部分组分与所述细胞外囊泡裂解物组分的质量比为(0.1-10)：(0.1-10)；优选为(0.5-2)：(0.5-2)。示例性地，质量比为1:1、0.5:1、0.8:1、1:1.2、1:1.5、1:2、2:1、3:1、4:1、5:1、1:3、1:4、1:5等等。
在某些实施方案中，具有免疫原性的蛋白和/或多肽可以来源于癌细胞/肿瘤组织中的一部分组分和细菌裂解物。进一步地，所述癌细胞/肿瘤组织中的一部分组分与所述细菌裂解物的质量比为(0.1-10)：(0.1-10)；优选为(0.5-2)：(0.5-2)。示例性地，质量比为1:1、0.5:1、0.8:1、1:1.2、1:1.5、1:2、2:1、3:1、4:1、5:1、1:3、1:4、1:5等等。
在某些实施方案中，所述粒子材料经过PEG修饰或未经PEG修饰，优选地，制备骨架结构时，未经PEG修饰的粒子材料与经过PEG修饰的粒子材料的质量比为9-200:1。在纳米粒子或微米粒子的制备材料可以在PLGA或者PLA等主要材料中加入适量PEG修饰的PLGA或者PLA，注射进入机体后可以更好的达到长循环和被动靶向的效果；其中PEG修饰的PLGA或者PLA等与未修饰的PLGA或者PLA质量比为0.05％到20％，优选为0.1％到10％。
在某些实施方案中，所述纳米粒子或微米粒子的粒子制备骨架材料、蛋白质和多肽组分的质量比1：0.001-10；优选的，粒子制备骨架材料、蛋白质和多肽组分的质量比1：0.01-2；最优选的，粒子制备骨架材料、蛋白质和多肽组分的质量比1：0.05-1。
在某些实施方案中，所述纳米粒子或微米粒子的制备材料选自天然高分子材料、生物材料、微生物材料、合成高分子材料和/或无机材料。
在某些实施方案中，所述抗原递送粒子(纳米粒子或微米粒子)的形状为任意形状，包括但不限于球形、椭球形、桶形、多角形、棒状、片状、线形、蠕虫形、方形、三角形、蝶形、圆盘形、囊泡形等。在某些实施方案中，所述纳米粒子的粒径为1nm-1000nm；优选为50-500nm；更优选为100-400nm。
在某些实施方案中，所述微米粒子的粒径为1μm-1000μm；优选为1-10μm；更优选为1-5μm。
在某些实施方案中，纳米粒子或微米粒子表面还可以负载有膜组分，膜组分可以来自于抗原提呈细胞、癌细胞、细菌或者细胞外囊泡中的一种或多种。
在某些实施方案中，用于制备纳米粒子或微米粒子表面所负载的生物膜组分的抗原提呈细胞可以来源于自体或者同种异体，也可以来自于细胞系或者干细胞。抗原提呈细胞可以是DC细胞、B细胞、巨噬细胞或者上述三者的任意混合物，也可以是其他具有抗原提呈功能的细胞。抗原提呈细胞可以经过负载抗原的纳米粒子或微米粒子激活。
在某些实施方案中，纳米粒子或微米粒子表面所负载的生物膜组分来源于细胞外囊泡时，可以是癌细胞的细胞外囊泡、细菌的细胞外囊泡或者抗原提呈细胞的细胞外囊泡中的一种或者多种。
在某些实施方案中，任何本领域人员知晓的纳米粒子、微米粒子制备方法均可以用于制备本公开所述的纳米粒子或微米粒子，包括但不限于溶剂挥发法、透析法、相分离法、喷雾干燥法、乳液聚合法、机器搅拌剪切法、膜乳化法、微流控法、超滤法、均质乳化法、分散法、沉淀法等等。
本发明还提供了一种根据所述方法制备得到的抗原递送粒子，抗原递送粒子可以直接作为疫苗使用，或者用于激活免疫细胞制备细胞疫苗，或者用于激活免疫细胞后辅助检测特定细胞，或者用于激活免疫细胞后辅助分选扩增特定细胞。
本发明还提供了一种药物组合物，所述药物组合物包括所述抗原递送粒子。
在某些实施方案中，所述药物组合物还包括一种或多种药学上可接受的载体。
本发明还提供了一种所述抗原递送粒子或所述药物组合物在如下(1)-(4)至少一项中的用途：
(1)制备用于预防或治疗疾病的药物；
(2)制备用于激活抗原提呈细胞，制备基于抗原提呈细胞疫苗；
(3)辅助激活抗原特异性T细胞，检测抗原特异性T细胞含量；
(4)辅助激活抗原特异性T细胞后，分离扩增被激活的抗原特异性T细胞，将其用于预防或治疗疾病。
在某些实施方案中，所述负载分离纯化后的抗原组分的纳米粒子或微米粒子可以直接作为疫苗使用。
在某些实施方案中，所述负载分离纯化后的抗原组分的纳米粒子或微米粒子也可以作为抗原递送粒子激活树突状细胞和/或B细胞后，将被激活的树突状细胞和/或B细胞作为细胞疫苗使用。
在某些实施方案中，所述负载分离纯化后的抗原组分的纳米粒子或微米粒子也可以作为抗原递送粒子体外辅助激活癌细胞特异性T细胞(肿瘤特异性T细胞)后用于检测癌细胞特异性T细胞的含量，或者用于辅助激活抗原特异性T细胞后分离和/或扩增被激活的抗原特异性T细胞用于疾病的预防和治疗。
在某些实施方案中，所述疾病为癌症或者肿瘤；
在某些实施方案中，所述癌症或肿瘤为实体肿瘤或者血液瘤。
在一些具体的实施方案中，本公开以使用稀释法分离纯化抗原组分后将抗原组分使用溶剂挥发法负载于纳米粒子或微米粒子为例，提供如下示例性的制备方法：
步骤1，使用含有溶解剂的溶解液裂解肿瘤组织或者癌细胞，然后使用含有溶解剂的溶解液溶解裂解物组分。
在某些实施方案中，在组织或细胞裂解前，可以进行适当处理以增强抗原组分的免疫原性，增强免疫原性的处理方法包括但不限于使用射线辐照、加热、与某些能增强细胞内抗原合成的物质共孵育、氧化、固定、还原、半抗原物质修饰、酶处理、矿化等。
在某些实施方案中，所述辐照为使用紫外线、X射线、γ射线、电子束、微波、α射线、β射线、放射源等不同辐照方法中的一种或多种处理一段时间。
在某些实施方案中，所述癌细胞或肿瘤组织在裂解前可以与特定化学物质共孵育刺激癌细胞或肿瘤组织，所述刺激癌细胞的特定物质包括但不限于小分子化合物(如阿霉素、紫杉醇、长春新碱、维甲酸、三氧化二砷等)、生长因子、细胞因子、植物提取物(如人参等重要的提取物、植物根茎提取物等)、趋化因子、干扰素、细菌分泌物、细菌细胞外囊泡等。使用特定物质与癌细胞或肿瘤组织共孵育刺激癌细胞或肿瘤组织的目的是为了使癌细胞产生更多抗原组分。
在某些实施方案中，所述半抗原物质为与蛋白质或多肽共作用后可以增加蛋白质或多肽免疫原性的物质。
在某些实施方案中，所述半抗原物质包括但不限于2，4-二硝基氟苯(DNFB)、2，4-二硝基氯苯(DNCB)、三硝基苯酚(TNP)、二硝基苯酚(DNP)、白蛋白、Ovalbumin(OVA)、N-碘乙酰基-N’-(5-磺酸基1-萘基)亚乙基二酰胺(AED)、取代或未取代的苯磺酰胺、鼠李糖、半乳糖、氨基半乳糖、甲醛、多聚甲醛、其他含有醛基的半抗原物质等。
在某些实施方案中，本公开中可以使用任何可以氧化抗原组分的氧化剂，包括但不限于过次氯酸、过氧化氢(双氧水，H2O2)、过硫酸盐、重铬酸盐、过氧乙酸、铬酸、过硫酸铵、次氯酸钠、过碳酸钠、过硼酸钠、过硼酸钾、高氯酸盐、高锰酸盐过氧化钠、KIO3、KBrO3、ClO3 -、ClO4 -、Na2O2、K2O2、MgO2、CaO2、BaO2、NO3 -、MnO4 -、F2、Cl2、O2、Br2、I2、S、Si、HNO3、MnO2、FeCl3中的一种或多种。
在某些实施方案中，本公开所述的还原剂包括但不限于二硫苏糖醇(DTT)、三(2-羧乙基)膦(TCEP)等。
在某些实施方案中，本公开中的酶处理方法包括但不限于使用核酸酶、DNA酶、胃蛋白酶、糜蛋白酶、胰蛋白酶、其他蛋白消化酶、蛋白酶抑制剂等中的一种或多种。本公开中酶解包括但不限于使用核酸酶、胃蛋白酶、胰蛋白酶、蛋白酶抑制剂、糜蛋白酶、DNA酶等任何可行的酶解方法。
在某些实施方案中，本公开所述的矿化的方法，包括但不限于使用硅化、钙化、镁化等任何矿化或者生物矿化的方法。
在某些实施方案中，癌细胞可以为一种或多种癌细胞或者癌细胞系，也可以为将肿瘤组织中的癌细胞培养后所得的癌细胞，也可以为来自循环肿瘤细胞经扩增后得到的癌细胞；肿瘤组织为来源于一个机体或者多个机体的肿瘤组织。裂解方法为癌细胞和/或肿瘤组织常用的裂解方法，包括但不限于反复冻融、溶胀、超声处理、高压处理、均质化、挤出、匀浆、高速搅拌、化学物质处理、高剪切力处理、超滤处理、皱缩等处理方式中的一种或多种。
在某些实施方案中，所述溶解剂选自含有结构式1结构的化合物、脱氧胆酸盐、十二烷基硫酸盐、甘油、蛋白质降解酶、多肽、氨基酸、糖苷和胆碱中的一种或多种；其中，结构式1如下：
R1为C、S、P、N或O，R2～R5独立地选自氢、烷基、巯基、氨基、羧基、取代或未取代的胍基。含有结构式1结构的化合物包括但不限于盐酸二甲双胍、硫酸二甲双胍、磺酸二甲双胍、二甲双胍盐、二甲双胍、尿素、过氧化尿素、盐酸胍、硫酸胍、磺酸胍、胍盐、脲盐、脲、其他含有胍基的化合物、碳酸胍、精氨酸、胍基乙酸、胍基磷酸、氨基磺酸胍、胍基琥珀酸、盐酸氨基脲、氨基甲酰脲、乙酰脲、磺酰脲类化合物(格列本脲、格列齐特、格列喹酮、格列美脲等)、硫脲类化合物(硫氧嘧啶类、咪唑类等)、亚硝基脲类等。
步骤2，往含有溶解剂的溶解液溶解的裂解物组分中加入8倍以上体积的纯水或者水溶液，稀释溶解剂的含量，从而使蛋白质和多肽组分沉淀析出，离心后收集沉淀部分即为抗原组分。
所述离心速度为1000RPM-12000RPM。
步骤3，使用含有溶解剂的溶解液二次溶解步骤2收集的沉淀组分(抗原组分)，直接使用；或者使用含有溶解剂的溶解液二次溶解步骤2收集的沉淀组分(抗原组分)后，将步骤2离心得到的上清液进行适当处理后得到其他组分，将溶解液溶解的抗原组分与上清液中分离纯化得到的组分混合后作为抗原组分使用。
在某些实施方案中，本公开中，步骤2得到的上清液组分还可以经过盐析、加热、酶处理、氧化、还原、固定、层析、电泳、色谱法、重结晶、沉淀、透析、提取RNA组分、提取mRNA组分、降解DNA组分、萃取、辐射、矿化、辐照、辐射等适当方法处理后分离纯化得到其他组分；上清液中分离纯化得到的其他组分可以和含有溶解剂的溶解液二次溶解的抗原组分合并后作为抗原组分使用。比如使用适当方法从上清液中分离得到mRNA组分或RNA组分，然后将mRNA组分或RNA组分与含有溶解剂的溶解液二次溶解的沉淀部分混合即得抗原组分。
在某些实施方案中，所述二次溶解沉淀组分使用的溶解液中的溶解剂选自含有结构式1结构的化合物、脱氧胆酸盐、十二烷基硫酸盐、甘油、蛋白质降解酶、多肽、氨基酸、糖苷和胆碱中的一种或多种；其中，结构式1如下：
R1为C、S、P、N或O，R2～R5独立地选自氢、烷基、巯基、氨基、羧基、取代或未取代的胍基。含有结构式1结构的化合物包括但不限于盐酸二甲双胍、硫酸二甲双胍、磺酸二甲双胍、二甲双胍盐、二甲双胍、尿素、过氧化尿素、盐酸胍、硫酸胍、磺酸胍、胍盐、脲盐、脲、其他含有胍基的化合物、碳酸胍、精氨酸、胍基乙酸、胍基磷酸、氨基磺酸胍、胍基琥珀酸、盐酸氨基脲、氨基甲酰脲、乙酰脲、磺酰脲类化合物(格列本脲、格列齐特、格列喹酮、格列美脲等)、硫脲类化合物(硫氧嘧啶类、咪唑类等)、亚硝基脲类等。
步骤4，将步骤3得到的使用含有溶解剂的溶解液增溶溶解的抗原组分作为初水相，加入到有机相中，制备得到初乳样品。
制备时，混合初始水相与有机相，具体为将第一预定体积的含有第一预定浓度的抗原组分的水相溶液加入第二预定体积的含有第二预定浓度的制备粒子原材料的有机相中。
在一些实施例中，水相溶液可含有如下i)～ii)中的至少一种：i)裂解物中抗原组分；ii)裂解物中的抗原组分以及免疫增强佐剂。裂解物中的抗原组分在制备时为溶于含有尿素或盐酸胍等溶解剂的溶解液中的分离纯化的抗原组分。第一预定浓度为水相溶液所含有的蛋白质和多肽的浓度，或者是水相溶液中所含有的抗原组分的浓度，第一预定浓度要求蛋白质和多肽浓度含量大于1ng/mL，以便能负载足够的抗原组分以激活相关细胞。免疫增强佐剂在初始水相中的浓度为大于0.01ng/mL。
在一些实施例中，有机溶剂选用二氯甲烷或乙酸乙酯。另外，在一些实施例中，制备粒子原材料的第二预定浓度的范围为0.5mg/mL-5000mg/mL，优选为100mg/mL。
实际中，有机相的第二预定体积根据其和水相的第一预定体积的比例进行设定，在本公开中，水相的第一预定体积和有机相的第二预定体积之比的范围为1:1.1-1:5000，优选地为1:10。在具体实施过程中，可根据需要对第一预定体积、第二预定体积和第一预定体积与第二预定体积之比进行调整，以调整制备的纳米粒或微米粒的尺寸大小。
在一些实施方案中，水相溶液为包含细胞和/或组织裂解物中的抗原组分的溶液时，其中蛋白质和多肽的浓度大于1ng/mL，优选1mg/mL～100mg/mL。在一些实施方案中，水相溶液为包含裂解物中抗原组分与免疫佐剂的溶液时，其中蛋白质和多肽的浓度大于1ng/mL，优选为1mg/mL～100mg/mL，免疫佐剂的浓度大于0.01ng/mL，优选为0.001mg/mL～20mg/mL。在一些实施方案中，有机相溶液中，溶剂为DMSO、乙腈、乙醇、氯仿、甲醇、DMF、异丙醇、二氯甲烷、丙醇、乙酸乙酯等，优选为二氯甲烷；有机相的浓度为0.5mg/mL～5000mg/mL，优选为100mg/mL。
在一些实施方案中，当水相溶液为包含裂解物中的抗原组分的溶液时，其中蛋白质和多肽组分的浓度大于0.01ng/mL，优选为1μg/mL～1mg/mL。在一些实施方案中，当水相溶液为包含抗原组分与免疫佐剂的溶液时，其中蛋白质和多肽组分的浓度大于1ng/mL，优选为1μg/mL～1mg/mL，免疫佐剂的浓度大于0.01ng/mL，优选为0.001mg/mL～20mg/mL。在一些实施方案中，有机相溶液中，溶剂为DMSO、乙腈、乙醇、氯仿、甲醇、DMF、异丙醇、二氯甲烷、丙醇、乙酸乙酯等，优选为二氯甲烷；有机相的浓度为0.5mg/mL～5000mg/mL，优选为100mg/mL。
步骤5，将步骤4得到的混合液进行如下任一种处理：i)大于2秒的超声处理；ii)大于1分钟的搅拌；iii)均质处理；iv)微流控处理。优选地，机械搅拌或者磁力搅拌时，搅拌速度大于50rpm，搅拌时间大于1分钟，比如搅拌速度为50rpm～1500rpm，搅拌时间为0.1小时～24小时；超声处理时，超声功率大于5W，时间大于0.1秒，比如2～200秒；均质处理时使用高压/超高压均质机或高剪切均质机，使用高压/超高压均质机时压力大于5psi，比如20psi～100psi，使用高剪切均质机时转速大于100rpm，比如1000rpm～5000rpm；使用微流控处理流速大于0.01mL/min,比如0.1mL/min-100mL/min。通过超声或者搅拌或者均质处理或者微流控处理进行纳米化和/或微米化，超声时间长短或搅拌速度或均质处理压力及时间等能控制制备的纳米粒子或微米粒子大小，过大或过小都会带来粒径大小的变化。
步骤6，将步骤5处理后得到的混合物加入第三预定体积的含有第三预定浓度乳化剂的水溶液中并进行如下任一种处理：i)大于2秒的超声处理；ii)大于1分钟的搅拌；iii)均质处理；iv)微流控处理。该步骤将步骤2得到的混合物加入到乳化剂水溶液中继续超声或搅拌或均质化或混合以进行纳米化或微米化。在本公开中，超声时间大于0.1秒，比如2～200秒；搅拌速度大于50rpm，比如50rpm～500rpm；搅拌时间大于1分钟，比如60～6000秒。优选地，搅拌为机械搅拌或者磁力搅拌时，搅拌速度大于50rpm，搅拌时间大于1分钟，比如搅拌速度为50rpm～1500rpm，搅拌时间为0.5小时～5小时；超声处理时，超声功率为50W～500W，时间大于0.1秒，比如2～200秒；均质处理时使用高压/超高压均质机或高剪切均质机，使用高压/超高压均质机时压力大于20psi，比如20psi～100psi，使用高剪切均质机时转速大于1000rpm，比如1000rpm～5000rpm；使用微流控处理流速大于0.01mL/min,比如0.1mL/min-100mL/min。超声或者搅拌或者均质处理或者微流控处理进行纳米化或微米化，超声时间长短或搅拌速度或均质处理压力及时间等能控制制备的纳米粒子或微米粒子大小，过大或过小都会带来粒径大小的变化。
在一些实施例中，乳化剂水溶液为聚乙烯醇(PVA)水溶液，第三预定体积为5mL，第三预定浓度为20mg/mL。第三预定体积根据其与第二预定体积的比例进行调整。在本公开中，第二预定体积与第三预定体积之比的范围为1:1.1-1:1000，优选地可以为2:5。在具体实施过程中为了控制纳米粒子或微米粒子的尺寸，可以对第二预定体积和第三预定体积之比进行调整。同样地，本步骤的超声时间或搅拌时间或均质化时间、乳化剂水溶液的体积以及浓度的取值根据，均为了得到尺寸大小合适的纳米粒或微米粒。
步骤7，将步骤6处理后得到的液体加入第四预定体积的第四预定浓度的乳化剂水溶液中，并进行搅拌直至满足预定搅拌条件。
本步骤中，乳化剂水溶液为PVA溶液或其他溶液。
第四预定浓度为5mg/mL，通过第四预定浓度的选择得到尺寸大小合适的纳米粒或微米粒。第四预定体积的选择依据第三预定体积与第四预定体积之比决定。在本公开中，第四预定体积与第三预定体积之比的范围为1:1.5-1:2000，优选地为1:10。在具体实施过程中为了控制纳米粒子或微米粒子的尺寸可以对第三预定体积和第四预定体积之比进行调整。
在本公开中，本步骤的预定搅拌条件为直至有机溶剂挥发完成，也即步骤1中的二氯甲烷挥发完成。
步骤8，将步骤7处理得到的满足预定搅拌条件的混合液在以大于100RPM的转速进行大于1分钟的离心后，去除上清液，并将剩下的沉淀物重新混悬于第五预定体积的第五预定浓度的含有冻干保护剂的水溶液中或者第六预定体积的PBS(或生理盐水)中；或者使用超滤离心或者使用能够去除特定分子量物质的透析法，去除游离的PVA等物质的同时将体系中的溶液更换为含有第五预定浓度的冻干保护剂的第五预定体积的水溶液或者第六预定体积的PBS(或生理盐水)。
步骤9，将步骤8得到的含有冻干保护剂的混悬液进行冷冻干燥处理后，将冻干物质备用。
可选的，使用防射线对制备得到的负载抗原组分的纳米粒子或微米粒子进行辐照一定时间。
步骤10，将第六预定体积的步骤8中得到的重悬于PBS(或生理盐水)中的含纳米粒子/微米粒子的混悬液，或者采用第六预定体积的PBS(或生理盐水)重悬步骤9得到的冷冻干燥后的含有纳米粒或微米粒和冻干保护剂的冻干物质，然后直接使用；或者将上述样品与第七预定体积的抗原组分混合后使用。
在本公开中，第六预定体积与第七预定体积的体积比为1:10000到10000:1；优选地，体积比为1:100到100:1；最优选地，体积比为1:30到30:1。
步骤11，将步骤10所制备的纳米粒子或者微米粒子用于预防或者治疗癌症等疾病；或者使用纳米粒子微米粒子作为抗原递送粒子体外激活抗原提呈细胞(比如树突状细胞或者混合抗原提呈细胞)，制备抗原提呈细胞疫苗；或者使用纳米粒子或微米粒子辅助激活抗原特异性T细胞以检测抗原特异性T细胞的含量；或者使用纳米粒子或微米粒子辅助激活抗原特异性T细胞后，将抗原特异性T细胞分选或扩增，并将分选或扩增后的抗原特异性T细胞用于预防或治疗疾病。
实施例1负载分选纯化的抗原组分的纳米疫苗用于治疗胰腺癌
本实施例中，抗原组分来自于Pan02小鼠胰腺癌细胞系，以有机高分子材料PLGA为纳米粒骨架材料，以Polyinosinic-polycytidylic acid(poly(I:C))、CpG7909(即CpG2006)和CpG2395为免疫佐剂，采用溶剂挥发法制备纳米疫苗。
(1)抗原组分的制备
收集培养的Pan 02小鼠胰腺癌细胞，然后将其使用γ射线辐照2小时，然后加入2mL的8M尿素的PBS水溶液裂解癌细胞，然后将细胞裂解物组分使用6mL含8M尿素的PBS水溶液溶解。然后在上述含有裂解物组分的溶解液中加入64mL超纯水稀释含有溶解剂的溶解液，静置1小时后，将样品在3000RPM离心5分钟，去除上清液后将沉淀部分使用8M尿素的PBS水溶液二次溶解，即为制备纳米疫苗1的抗原组分1。
收集培养的Pan 02小鼠胰腺癌细胞，然后将其使用γ射线辐照2小时，然后加入2mL的8M尿素的PBS水溶液裂解癌细胞，然后将细胞裂解物组分使用6mL含8M尿素的PBS水溶液溶解。然后在上述溶解了裂解物组分的溶解液中逐滴加入40％的硫酸铵水溶液，制备得到16mL的样品，静置1小时后得到盐析后的样品，将样品在16000RPM离心60分钟，去除上清液后将沉淀部分使用8M尿素的PBS水溶液二次溶解，即为制备纳米疫苗2的抗原组分2。
收集培养的Pan 02小鼠胰腺癌细胞，然后将其使用γ射线辐照2小时，然后加入2mL的8M尿素的PBS溶液裂解癌细胞，然后将细胞裂解物组分使用6mL含8M尿素的PBS水溶液溶解。即为制备纳米疫苗3的抗原组分3。
(2)纳米疫苗的制备
本实施例中纳米疫苗1(Nanovaccine 1)采用溶剂挥发法中的复乳法制备。所采用的疫苗制备材料PLGA分子量为10KDa-20KDa，所采用的免疫佐剂为poly(I:C)、CpG7909和CpG2395。制备方法如前所述，在制备过程中首先采用复乳法在纳米粒子内部共负载抗原组分1和佐剂，然后将100mg纳米粒子1在12000g离心30分钟，并使用10mL含4％海藻糖的超纯水重悬后冷冻干燥48h。该纳米粒子1平均粒径为250nm左右，每1mg PLGA纳米粒子1约负载1.0mg蛋白质和多肽组分，负载poly(I:C)、CpG7909和CpG2395各0.02mg。
本实施例中纳米疫苗2(Nanovaccine 2)制备方法和制备材料同纳米疫苗1。在制备过程中首先采用复乳法在纳米粒子内部共负载抗原组分2和佐剂，然后将100mg纳米粒子2在12000g离心30分钟，并使用10mL含4％海藻糖的超纯水重悬后冷冻干燥48h。该纳米粒子2平均粒径为250nm左右，每1mg PLGA纳米粒子2约负载1.0mg蛋白质和多肽组分，负载poly(I:C)、CpG7909和CpG2395各0.02mg。
本实施例中纳米疫苗3(Nanovaccine 3)的制备方法和制备材料同纳米疫苗1。在制备过程中首先采用复乳法在纳米粒子内部共负载抗原组分3和佐剂，然后将100mg纳米粒子3在12000g离心30分钟，并使用10mL含4％海藻糖的超纯水重悬后冷冻干燥48h。该纳米粒子3平均粒径为250nm左右，每1mg PLGA纳米粒子3约负载1.0mg蛋白质和多肽组分，负载poly(I:C)、CpG7909和CpG2395各0.02mg。
(3)纳米疫苗治疗癌症
选取6-8周的雌性C57BL/6为模型小鼠制备胰腺癌荷瘤小鼠，第0天给每只小鼠背部右下方皮下接种1.5×106个Pan 02细胞。在小鼠接种肿瘤后第3天、第6天、第9天、第14天、第19天和第26天分别在小鼠皮下注射2mg纳米疫苗(纳米疫苗1，或者纳米疫苗2，或者纳米疫苗3)或者100μLPBS。监测小鼠肿瘤生长速度和小鼠生存期。在实验中，从第3天开始每3天记录一次小鼠肿瘤体积的大小。肿瘤体积采用公式v＝0.52×a×b2计算，其中v为肿瘤体积，a为肿瘤长度，b为肿瘤宽度。出于动物实验伦理，在小鼠生存期试验中当小鼠肿瘤体积超过2000mm3即视为小鼠死亡并将小鼠安乐死。
(4)实验结果
如图3所示，PBS对照组(PBS control)小鼠肿瘤体积快速长大，小鼠很快死亡。使用纳米疫苗1(Nanovaccine 1)、纳米疫苗2(Nanovaccine 2)、纳米疫苗3(Nanovaccine 3)的小鼠，其肿瘤生长速度都明显变慢，生存期明显延长，大部分小鼠无瘤痊愈。而且，纳米疫苗1效果和纳米疫苗2相当，纳米疫苗1和纳米疫苗2的效果都好于纳米疫苗3，说明使用稀释含有溶解剂的溶解液的方法分离纯化得到的细胞裂解物中的抗原组分效果与使用盐析方法分离纯化得到的细胞裂解物中的抗原组分效果相当，好于未经分离纯化和二次溶解的细胞裂解物组分。
本实施例中，在使用含有溶解剂的溶解液裂解癌细胞和溶解癌细胞裂解物组分之前使用γ射线对癌细胞进行了辐射处理，在实际应用中也可以使用电子束、X射线、α射线、β射线、紫外线、微波、放射源等不同辐照方法中的一种或多种处理一段时间；或者也可以不进行辐照处理直接使用含有溶解剂的溶解液裂解癌细胞和溶解癌细胞裂解物组分。
本实施例中，使用了培养的癌细胞系制备抗原组分，在实际应用中也可以使用肿瘤组织、肿瘤组织中分离出来的癌细胞经过培养扩增后的癌细胞、从血液或外周分离出来的循环肿瘤细胞等方法得到的癌细胞或者肿瘤组织作为抗原组分来源。
实施例2负载分离纯化的抗原组分的微米疫苗用于预防脑癌
(1)抗原组分的制备
在每只C57BL/6小鼠背部皮下接种1.5×106个GL261细胞，在肿瘤长到体积分别为约1000mm3时处死小鼠并摘取肿瘤组织。制备肿瘤组织的单细胞悬液，然后将细胞在RPMI1640(含10％FBS)完全培养基中培养7天(37℃，5％CO2)。培养完成后，收集癌细胞并在400g离心5分钟去除培养基。将沉淀的癌细胞使用适量6M盐酸胍水溶液裂解，然后使用6M盐酸胍水溶液溶解裂解物组分，然后加入15倍体积的超纯水稀释上述溶解液样品，然后静置2小时析出沉淀，然后在2500RPM离心5分钟，弃去上清液后将所得沉淀使用6M盐酸胍水溶液二次溶解，即得到抗原组分1。
在每只C57BL/6小鼠背部皮下接种1.5×106个GL261细胞，在肿瘤长到体积分别为约1000mm3时处死小鼠并摘取肿瘤组织。制备肿瘤组织的单细胞悬液，然后将细胞在RPMI1640(含10％FBS)完全培养基中培养7天(37℃，5％CO2)。培养完成后，收集癌细胞并在400g离心5分钟去除培养基。将沉淀的癌细胞使用适量6M盐酸胍水溶液裂解，然后使用6M盐酸胍水溶液溶解裂解物组分，即得到抗原组分2。
(2)微米疫苗的制备
本实施例中微米疫苗1(Micronvaccine 1)采用溶剂挥发法中的复乳法制备。所采用的微米粒子制备材料PLA分子量为30KDa-50KDa，所采用的免疫佐剂为poly(I:C)、CpG1018和CpG2395。制备方法如前所述，在制备过程中先在微米粒子内部负载抗原组分1和佐剂，然后将100mg微米粒子1在8000g离心20分钟，并使用10mL含4％海藻糖的超纯水重悬后冷冻干燥48h。该微米粒子1平均粒径为2.0μm左右，每1mg PLA微米粒子1约负载20μg蛋白质或多肽组分，负载poly(I:C)0.012mg，负载CpG 1018和CpG2395各0.005mg。
本实施例中微米疫苗2(Micronvaccine 2)采用溶剂挥发法中的复乳法制备。所采用的微米粒子制备材料PLA分子量为30KDa-50KDa，所采用的免疫佐剂为poly(I:C)、CpG1018和CpG2395。制备方法如前所述，在制备过程中先在微米粒子内部负载抗原组分2和佐剂，然后将100mg微米粒子2在8000g离心20分钟，并使用10mL含4％海藻糖的超纯水重悬后冷冻干燥48h。该微米粒子2平均粒径为2.0μm左右，每1mg PLA微米粒子约负载20μg蛋白质或多肽组分，负载poly(I:C)0.012mg，负载CpG 1018和CpG2395各0.005mg。
(3)微米疫苗用于预防癌症
选取6-8周的雌性C57BL/6为模型小鼠制备脑胶质瘤荷瘤小鼠，在小鼠接种肿瘤前的第-35天、第-28天、第-21天、第-14天和第-7天分别在小鼠皮下注射6mg微米疫苗1或者6mg微米疫苗2或者100μL PBS。第0天给每只小鼠背部右下方皮下接种1.5×106个GL261。小鼠肿瘤生长速度和生存期监测方法同上。
(4)实验结果
如图4所示，PBS组小鼠肿瘤体积快速长大小鼠很快死亡。使用微米疫苗1(Micronvaccine 1)、微米疫苗2(Micronvaccine 2)的小鼠，其肿瘤生长速度都明显变慢，生存期明显延长，且大部分小鼠无瘤。其中，微米疫苗1效果好于微米疫苗2，说明使用稀释法分离纯化得到的抗原组分负载到微米疫苗的效果好于直接将癌细胞裂解物直接负载到微米疫苗。
实施例3纳米疫苗用于肝癌的治疗
(1)抗原组分的制备
给每只C57BL/6小鼠后背部皮下接种1.5×106个Hepa 1-6肝癌细胞，在肿瘤长到体积分别为约1000mm3时处死小鼠并摘取肿瘤组织，然后将肿瘤组织在90℃加热5分钟，然后使用适量8M尿素水溶液裂解肿瘤组织，并使用8M尿素水溶液溶解肿瘤组织裂解物组分，然后加入10倍体积的超纯水稀释上述含有裂解物组分的8M尿素水溶液，静置3小时等待沉淀析出。然后在3500RPM离心10分钟，将沉淀部分使用8M尿素水溶液二次溶解；将上清液部分在95℃加热5分钟后使其析出沉淀，将样品在3500RPM离心10分钟后弃去上清液，使用8M尿素水溶液二次溶解加热后所得沉淀。然后将稀释后的沉淀使用8M尿素水溶液二次溶解的样品与加热后沉淀使用8M尿素溶解所得到的样品按质量比3:1混合后作为制备纳米疫苗1的抗原组分1。
(2)纳米疫苗的制备
本实施例中纳米疫苗1(Nanovaccine 1)采用溶剂挥发法中的复乳法制备。所采用的纳米疫苗制备材料PLGA分子量为10KDa-20KDa，PEG5000-PLGA分子量为15KDa-25KDa，使用的PLGA和PEG5000-PLGA的质量比为99:1。所采用的免疫佐剂为poly(I:C)、CpG 2395和CpG SL03。制备方法如前所述，制备时先在纳米粒子内部负载细胞抗原组分1和佐剂，然后将100mg纳米粒子1在12000g离心30分钟，并使用10mL含4％海藻糖的超纯水重悬后冷冻干燥48h。该纳米粒子1平均粒径为300nm左右，每1mg PLGA纳米粒子1约负载600μg蛋白质或多肽组分，负载poly(I:C)、CpG 2395和CpG SL03各0.1mg。
然后将上述负载了抗原组分和佐剂的PLGA纳米疫苗1分出一半使用γ射线辐照16小时，得到辐照后的纳米疫苗2。
(3)纳米疫苗治疗癌症
选取6-8周的雌性C57BL/6为模型小鼠制备肝癌荷瘤小鼠，第0天给每只小鼠背部右下方皮下接种1.5×106个Hepa 1-6肝癌细胞。在小鼠接种肿瘤后第3天、第6天、第9天、第14天、第19天和第25天分别在小鼠皮下注射100μL的1mg纳米疫苗(纳米疫苗1或者纳米疫苗2)或者100μL的PBS。小鼠肿瘤生长速度和生存期监测方法同上。
(4)实验结果
如图5所示，PBS组小鼠肿瘤体积快速长大小鼠很快死亡。使用纳米疫苗1(Nanovaccine 1)和纳米疫苗2(Nanovaccine 2)的小鼠生存期明显延长，小鼠绝大部分无瘤痊愈。而且纳米疫苗2的效果好于纳米疫苗1，说明将从细胞裂解物中的抗原组分负载到纳米疫苗中后使用射线进行辐照可以增强疫苗的效果。
实施例4负载纯化抗原组分的纳米粒子激活后分选扩增的T细胞用于乳腺癌的治疗
(1)抗原组分的制备
给每只C57BL/6小鼠后背部皮下接种1.0×106个E0771小鼠乳腺癌细胞，在肿瘤长到体积约1000mm3时处死小鼠并摘取肿瘤组织，然后加入20mL的3％的双氧水(过氧化氢)氧化作用12小时，加入适量尿素制备成8M尿素水溶液裂解肿瘤组织，并使用8M尿素水溶液溶解肿瘤组织裂解物组分，然后加入30倍体积的超纯水稀释上述含有裂解物组分的8M尿素水溶液，静置6小时等待沉淀析出。然后在3500RPM离心5分钟，将沉淀部分使用8M尿素水溶液二次溶解，即为制备纳米粒子1的抗原组分1。
给每只C57BL/6小鼠后背部皮下接种1.0×106个E0771小鼠乳腺癌细胞，在肿瘤长到体积约1000mm3时处死小鼠并摘取肿瘤组织，然后加入20mL的3％的双氧水(过氧化氢)氧化作用12小时，加入适量尿素制备成8M尿素水溶液裂解肿瘤组织，并使用8M尿素水溶液溶解肿瘤组织裂解物组分，即为制备纳米粒子2的抗原组分2。
(2)抗原递送纳米粒子的制备
本实施例中纳米粒子1(Nanoparticle 1)采用溶剂挥发法中的复乳法制备。所采用的纳米粒子制备材料PLGA分子量为20KDa-40KDa。所采用的免疫佐剂为poly(I:C)、CpG1018和CpG 7909。制备方法如前所述，制备时先在纳米粒子内部负载细胞抗原组分1和佐剂，然后将100mg纳米粒子1在12000g离心30分钟，并使用10mL含6％海藻糖的超纯水重悬后冷冻干燥48h，然后使用γ射线辐照16小时。该纳米粒子1平均粒径为230nm左右，每1mgPLGA纳米粒子1约负载200μg蛋白质或多肽组分，负载poly(I:C)、CpG 1018和CpG 7909各0.02mg。
本实施例中纳米粒子2(Nanoparticle 2)制备方法同实施例1。制备时先在纳米粒子内部负载细胞抗原组分2和佐剂，然后将100mg纳米粒子2在12000g离心30分钟，并使用10mL含6％海藻糖的超纯水重悬后冷冻干燥48h，然后使用γ射线辐照16小时。该纳米粒子2平均粒径为230nm左右，每1mg PLGA纳米粒子2约负载200μg蛋白质或多肽组分，负载poly(I:C)、CpG 1018和CpG 7909各0.001mg。
(3)抗原特异性T细胞的分选扩增
选取6-8周的雌性C57BL/6小鼠，在第0天给每只小鼠皮下接种1.0×106个E0771细胞，在第6天、第8天、第10天、第12天、第14天、第16天、第18天、第20天分别给每只小鼠腹腔注射150μg的小鼠PD-1抗体。在第21天处死小鼠,收集小鼠的外周血，然后从外周血中分离外周血单个核细胞(PBMC),然后将500万个PBMC细胞、1mg纳米粒子(纳米粒子1，或者纳米粒子2)在2mLRPMI1640完全培养基中共孵育36小时，然后采用流式细胞术分选孵育后的CD3+CD134+T细胞，即为可识别癌细胞抗原的抗原特异性T细胞。将上述分选得到的5万个CD3+CD134+T细胞与IL-2(20ng/mL)、IL-7(10ng/mL)、IL-15(10ng/mL)以及αCD3抗体(10ng/mL)和αCD28抗体(10ng/mL)在10mL的DMEM完全培养基(37℃，5％CO2)中共孵育21天以扩增癌细胞特异性T细胞(细胞活率约85％)。其中，使用纳米粒子1(纳米疫苗1)辅助分选扩增的癌细胞特异性T细胞为T细胞1(T cells 1)；使用纳米粒子2(纳米疫苗2)辅助分选扩增的癌细胞特异性T细胞为T细胞2(T cells 2)。
(4)分选扩增的癌细胞抗原特异性T细胞用于治疗癌症
选取6-8周的雌性C57BL/6为模型小鼠制备黑色素瘤荷瘤小鼠，第0天给每只小鼠背部右下方皮下接种1.0×106个E0771小鼠乳腺癌细胞。在小鼠接种肿瘤后第7天、第10天、第15天、第20天和第25天分别在小鼠皮下注射100万个分选扩增得到的抗原特异性T细胞(T细胞1或者T细胞2)或者100μL的PBS。小鼠肿瘤生长速度和生存期监测方法同上。
(5)实验结果
如图7所示，PBS组小鼠肿瘤体积快速长大小鼠很快死亡。使用T细胞1(T cells 1)和T细胞2(T cells2)治疗的小鼠生存期都明显延长，小鼠绝大部分无瘤痊愈，而且T细胞1的效果好于T细胞2，说明使用本发明所述稀释法纯化抗原组分可以有效提高抗原递送粒子辅助分选扩增的T细胞的治疗效果。
本实施例中使用了双氧水(过氧化氢)氧化肿瘤组织，在实际应用中也可以使用次氯酸、高锰酸钾或者其他氧化剂氧化癌细胞、肿瘤组织、肿瘤组织单细胞悬液、或者上述细胞裂解物组分或组织的裂解物组分中的抗原组分。或者在实际应用中也可以使用二硫苏糖醇(DTT)、三(2-羧乙基)膦(TCEP)等还原剂还原癌细胞、肿瘤组织、肿瘤组织单细胞悬液、或者上述细胞裂解物组分或组织的裂解物组分中的抗原组分。
实施例5负载纯化抗原组分的纳米粒子激活的树突状细胞(DC)疫苗用于结肠癌的治疗
(1)抗原组分的制备
每只C57BL/6小鼠后背部皮下接种1.5×106个MC38结肠癌细胞，在肿瘤长到体积约1000mm3时处死小鼠并摘取肿瘤组织，将肿瘤组织切块并使用75％酒精水溶液固定2小时，然后在2000RPM离心5分钟，弃去上清液后将固定后的肿瘤组织沉淀使用适量8M尿素和0.1M精氨酸的水溶液裂解，并使用8M尿素和0.1M精氨酸的水溶液溶解肿瘤组织的裂解物组分，然后加入20倍体积的超纯水稀释上述含有裂解物组分的8M尿素和0.1M精氨酸水溶液，静置6小时等待沉淀析出。然后在3500RPM离心10分钟，将沉淀部分使用8M尿素和0.1M精氨酸水溶液二次溶解；在上清液部分中加入饱和硫酸铵水溶液进行盐析，沉淀析出后将样品在15000RPM离心60分钟后弃去上清液，使用8M尿素和0.1M精氨酸水溶液二次溶解盐析后所得沉淀。然后将稀释后的沉淀使用8M尿素和0.1M精氨酸水溶液二次溶解的样品与盐析后沉淀使用8M尿素和0.1M精氨酸水溶液溶解所得到的样品按质量比10:1混合后作为制备抗原递送粒子1的抗原组分1。
给每只C57BL/6小鼠后背部皮下接种1.5×106个MC38结肠癌细胞，在肿瘤长到体积约1000mm3时处死小鼠并摘取肿瘤组织，然后使用适量8M尿素和0.1M精氨酸的水溶液裂解肿瘤组织，并使用8M尿素和0.1M精氨酸的水溶液溶解肿瘤组织裂解物组分，即为制备抗原递送粒子2的抗原组分2。
(2)负载抗原组分抗原递送纳米粒子的制备
本实施例中纳米粒子1(Nanoparticle 1)采用溶剂挥发法中的复乳法制备。所采用的纳米粒子制备材料PLGA分子量为10KDa-20Kda。所采用的免疫佐剂为poly(I:C)、CpGSL01和CpG SL03。制备方法如前所述，制备时先在纳米粒子内部负载细胞抗原组分1和佐剂，然后将100mg纳米粒子1在12000g离心30分钟，并使用10mL含6％海藻糖的超纯水重悬后冷冻干燥48h，然后使用电子束辐照2小时。该纳米粒子1平均粒径为280nm左右，每1mg PLGA纳米粒子1约负载2.0mg蛋白质或多肽组分，负载poly(I:C)、CpG SL01和CpG SL03各0.02mg。
本实施例中纳米粒子2(Nanoparticle 2)制备方法和材料同纳米粒子1。制备时先在纳米粒子内部负载细胞抗原组分2和佐剂，然后将100mg纳米粒子2在12000g离心30分钟，并使用10mL含6％海藻糖的超纯水重悬后冷冻干燥48h，然后使用电子束辐照2小时。该纳米粒子2平均粒径为230nm左右，每1mg PLGA纳米粒子2约负载2.0mg蛋白质或多肽组分，负载poly(I:C)、CpG SL01和CpG SL03各0.02mg。
(3)使用抗原递送粒子体外激活抗原提呈细胞(树突状细胞+B细胞)
本实施例以从小鼠骨髓细胞制备树突状细胞为例来说明如何制备DC。首先，取6-8周龄的C57BL/6小鼠颈椎脱臼处死，手术取出后腿的胫骨和股骨放入PBS中，用剪刀和镊子将骨周围的肌肉组织剔除干净。用剪刀剪去骨头两端，再用注射器抽取PBS溶液，针头分别从骨头两端插入骨髓腔，反复冲洗骨髓到培养皿中。收集骨髓溶液，400g离心3min后加入1mL红细胞裂解物裂红。加入3mLRPMI 1640(10％FBS)培养基终止裂解，400g离心3min，弃上清。将细胞放置在10mm培养皿中培养，使用RPMI 1640(10％FBS)完全培养基，同时加入重组小鼠GM-CSF(20ng/mL)，在37℃，5％CO2培养7天。第3天轻轻摇晃培养瓶，补充同样体积含有GM-CSF(20ng/mL)RPMI 1640(10％FBS)培养基。第6天，对培养基进行半量换液处理。第7天，收集少量悬浮及半贴壁细胞，通过流式检测，当CD86+CD80+细胞在CD11c+细胞中的比例为15-20％之间，诱导培养的BMDC即可被用来做下一步实验。
B细胞使用来源于小鼠脾细胞的B细胞。在制备时先将小鼠处死，然后制备小鼠脾细胞单细胞悬液，然后使用磁珠分选法分选得到CD19+的B细胞。
将BMDC(1000万个)和B细胞(1000万个)按数量比1:1混合后，与2mg纳米粒子(纳米粒子1，或者纳米粒子2)在含20ng/mL的白介素15(IL-15)的10mL RPMI1640完全培养基中共孵育24小时(37℃，5％CO2)。孵育完以后将混合细胞在400g离心4分钟去除体系中的游离纳米粒子，然后将被抗原递送粒子激活的混合细胞作为癌症疫苗使用。其中，使用纳米粒子1激活的混合细胞为混合细胞癌症疫苗1(Cell vaccine 1)；使用纳米粒子2激活的混合细胞为混合细胞癌症疫苗2(Cell vaccine 2)。
(4)DC疫苗治疗癌症
选取6-8周的雌性C57BL/6为模型小鼠制备黑色素瘤荷瘤小鼠，第0天给每只小鼠背部右下方皮下接种1.5×106个MC38结肠癌细胞。在小鼠接种肿瘤后第3天，第6天，第9天，第14天、第19天和第25天分别在小鼠皮下注射50万个细胞疫苗(细胞疫苗1或者细胞疫苗2)或者100μL的PBS。小鼠肿瘤生长速度和生存期监测方法同上。
(4)实验结果
如图7所示，PBS组小鼠肿瘤体积快速长大小鼠很快死亡。使用细胞疫苗1(Cellvaccine 1)和细胞疫苗2(Cell vaccine 2)的小鼠生存期明显延长，小鼠大部分无瘤痊愈，而且细胞疫苗1的效果好于细胞疫苗2。
本实施例中，在使用含有溶解剂的溶解液裂解肿瘤组织和溶解肿瘤组织裂解物组分前，先使用75％的酒精水溶液固定肿瘤组织，在实际应用中也可以使用其他固定液固定肿瘤组织或者癌细胞。可以使用的固定液包括但不限于丙酮、乙酸、丙酸、丁酸、甲酸、醛类固定液、汞类固定液、醇类固定液、氧化剂类固定液、苦味酸盐类固定液、其他细胞或组织的固定剂或固定液、氧化二乙烯等中的一种或者多种。
实施例6纳米粒子用于检测免疫细胞中的癌细胞特异性T细胞(肿瘤抗原特异性T细胞)
(1)抗原组分的制备
分别培养人肺癌细胞系A549细胞、H1299细胞、PC9细胞、H1437细胞、H226细胞、HCC1588细胞、H2170细胞和H520细胞，其中A549细胞、H1299细胞、PC9细胞和H1437细胞属于肺癌亚型肺腺癌细胞系，H226细胞、HCC1588细胞、H2170细胞和H520细胞属于肺癌亚型肺鳞癌细胞系。将上述8种细胞分别收集后，将上述A549细胞、H1299细胞、PC9细胞、H1437细胞、H226细胞、HCC1588细胞、H2170细胞和H520细胞按照细胞数量比1:1:1:1:1:1:1:1混合后加入3mL的8M过氧化尿素水溶液重悬细胞和裂解癌细胞，并加入5mL的8M过氧化尿素水溶液溶解裂解物组分，然后加入150mL的PBS稀释8M过氧化尿素水溶液，静置4小时后，在5000RPM离心5分钟，分别收集上清液和沉淀。将沉淀部分使用8M过氧化尿素水溶液二次溶解；在上清液中逐滴加入10％氯化钠水溶液盐析上清液中的蛋白质多肽组分，将盐析沉淀的蛋白质多肽使用8M过氧化尿素水溶液二次溶解。将上述稀释法收集的使用过氧化尿素二次溶解的抗原组分和盐析后收集的使用过氧化尿素水溶液二次溶解的抗原组分合并，即为制备纳米粒子1(NP)的抗原组分1。
(2)负载抗原组分的纳米粒子的制备
本实施例中纳米粒子1(NP1)采用溶剂挥发法中的复乳法制备。所采用的纳米粒子制备材料PLGA分子量为10KDa-30KDa，制备方法如前所述，在制备过程中首先采用复乳法在纳米粒子内部负载抗原组分1，然后将100mg纳米粒子在15000g离心30分钟，并使用10mL含4％海藻糖的超纯水重悬后冷冻干燥48h。该纳米粒子1平均粒径为200nm左右，每1mg PLGA纳米粒子约负载500μg蛋白质和多肽组分。
(3)癌细胞特异性T细胞(肿瘤特异性T细胞)的检测
非小细胞肺癌患者A在经过PD-1抗体免疫治疗后肿瘤体积明显缩小。分别在非小细胞肺癌患者A进行免疫治疗前和免疫治疗后3周抽取非小细胞肺癌癌症患者A的外周血8mL。从8mL非小细胞肺癌患者外周血中使用梯度离心法分离得到外周血单个核细胞(PBMC)。
将纳米粒子1(1.5mg)与PBMC(300万个)在3mL的AIM V无血清培养基中共孵育24小时(37℃，5％CO2)；或者对照组只将PBMC(300万个)单独在3mL的AIM V无血清培养基中共孵育24小时(37℃，5％CO2)。尔后，将样品在400g离心5分钟后弃去上清液，收集细胞沉淀，然后将细胞在PBS中重悬。先分别采用活死细胞染料和Fc block与细胞共孵育，以标记活细胞和避免非特异性抗体吸附，然后采用CD3抗体和IFN-γ抗体进行染色。尔后采用流式细胞仪检测分析染色后的细胞，分析CD3+IFN-γ+的T细胞在所有CD3+T细胞中所占的比例即为癌细胞特异性T细胞。
(4)实验结果
如图8所示，单独孵育PBMC，在治疗前(pre-therapy)和治疗后(post-therapy)都几乎检测不到任何被激活并具有杀伤功能的癌细胞特异性T细胞。使用纳米粒子1(Nanoparticle 1)共孵育后的细胞，能在治疗前和治疗后都检测到一定含量的癌细胞特异性T细胞，而且治疗后的含量显著高于治疗前。

Claims (15)

1.一种制备抗原递送粒子的方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：
(1)使用含有溶解剂的溶解液裂解细胞和/或组织；
(2)使用含有溶解剂的溶解液溶解步骤(1)裂解后的裂解物组分；
(3)加入体积是含有溶解剂的溶解液8倍以上的纯水或者水溶液，稀释含有溶解剂的溶解液，从而使溶解于溶解液中的裂解物组分中的蛋白质多肽等抗原组分因为溶解度下降而形成沉淀；
(4)离心后收集沉淀的部分即为分离纯化的抗原组分；
(5)直接将收集的沉淀部分使用含有溶解剂的溶解液二次溶解后作为分离纯化的抗原组分使用，或者将收集的沉淀部分使用含有溶解剂的溶解液二次溶解后与步骤(4)离心后上清液中的组分经过其他方法分离纯化得到的其他组分合并后一起作为分离纯化的抗原组分使用；
其中，所述溶解剂独立地选自含有结构式1结构的化合物、脱氧胆酸盐、十二烷基硫酸盐、甘油、蛋白质降解酶、多肽、氨基酸、糖苷和胆碱中的一种或多种；其中，结构式1如下：
R1为C、S、P、N或O，R2～R5独立地选自氢、烷基、巯基、氨基、羧基、取代或未取代的胍基；
优选地，所述溶解剂选自盐酸二甲双胍、硫酸二甲双胍、磺酸二甲双胍、二甲双胍盐、二甲双胍、尿素、过氧化尿素、盐酸胍、硫酸胍、磺酸胍、胍盐、脲盐、脲、脱氧胆酸盐、十二烷基硫酸盐、甘油、蛋白质降解酶、多肽、氨基酸、糖苷和胆碱中的一种或多种。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法还包括如下步骤：
(6)将分离纯化后的抗原组分进一步负载到纳米粒子或微米粒子的内部和/或表面。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述负载分离纯化后的抗原组分的纳米粒子或微米粒子具有如下所示的组分：
(i)粒子材料形成的纳米粒子和/或微米粒子骨架结构；
(ii)使用含有溶解剂的溶解液裂解细胞和/或组织的裂解物，和溶解后从其中分离纯化的抗原组分；
优选地，所述抗原组分负载于所述骨架结构的内部和/或表面；
更优选地，在细胞裂解前或者裂解后还可以使用适当方法增强抗原组分的免疫原性；
进一步优选地，所述增强抗原组分免疫原性的方法包括但不限于辐照、氧化、还原、使用半抗原物质修饰、固定、酶处理、变性、加热、矿化。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，在步骤(ii)进行前，还可以使用特定的化学物质对所述细胞和/或组织做固定处理或者沉淀处理；
优选地，所述特定的化学物质包括但不限于甲醛、多聚甲醛、戊二醛、其他含有醛基的物质、乙醇、甲醇、丙酮、乙酸、丙酸、丁酸、甲酸、福尔马林、重铬酸盐、高锰酸钾、铬酸、苦味酸、Zamboni固定液、PLP固定液、FPA固定液、TAF固定液、Rossman固定液、Regaud固定液、PLPD固定液、PAPG固定液、Orth固定液、Muller固定液、McDoWell固定液、中性甲醛钙固定液、FAB固定液、Carnoy固定液、Clarke固定液、B-5固定液、Bouin固定液、FineFIX固定液、A.G.M(70％乙醇80ml+冰醋酸10ml+甲醇10ml)固定液、Helly固定液、Zenker固定液、Kolmer固定液、AAF固定液、Hollande固定液、Gendre固定液、醛类固定液、汞类固定液、醇类固定液、氧化剂类固定液、苦味酸盐类固定液、其他细胞或组织的固定剂或固定液、氧化二乙烯中的一种或者多种。
5.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述氧化是使用氧化剂氧化抗原组分；
优选地，所述氧化剂包括但不限于次氯酸、过氧化氢、过硫酸盐、重铬酸盐、过氧乙酸、铬酸、过硫酸铵、次氯酸钠、过碳酸钠、过硼酸钠、过硼酸钾、高氯酸盐、高锰酸盐、过氧化钠、KIO3、KBrO3、ClO3 -、ClO4 -、Na2O2、K2O2、MgO2、CaO2、BaO2、NO3 -、MnO4 -、F2、Cl2、O2、Br2、I2、S、Si、HNO3、MnO2、FeCl3中的一种或多种。
6.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述辐照包括任何常用的辐照方法；
优选地，所述辐照包括但不限于放射性物质辐照、电子束辐照、微波辐照、紫外线辐照、X射线辐照、α射线辐照、β射线辐照、γ射线辐照中的一种或者多种。
7.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述半抗原物质包括但不限于2,4-二硝基氟苯、2,4-二硝基氯苯、三硝基苯酚、二硝基苯酚、白蛋白、Ovalbumin、N-碘乙酰基-N’-(5-磺酸基1-萘基)亚乙基二酰胺、取代或未取代的苯磺酰胺、甲醛、多聚甲醛、其他含有醛基的半抗原物质、鼠李糖、半乳糖、氨基半乳糖中的一种或者多种。
8.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述负载分离纯化后的抗原组分的纳米粒子或微米粒子具有如下所示的组分：
(i)粒子材料形成的纳米粒子和/或微米粒子骨架结构；
(ii)来自细胞和/或组织的全细胞裂解物组分和/或含抗原组分的部分细胞裂解物组分；
优选地，还可以通过适当方法增强来自细胞和/或组织的全细胞裂解物组分和/或含抗原组分的部分细胞裂解物组分的免疫原性；
优选地，所述增强免疫原性的来自细胞和/或组织的全细胞裂解物组分和/或含抗原组分的部分细胞裂解物组分负载于所述骨架结构的内部和/或表面；
优选地，所述部分细胞裂解物组分中含有的抗原组分包含细胞和/或组织裂解物中的蛋白质和多肽组分和/或细胞裂解物中的RNA组分或mRNA组分；
优选地，所述部分细胞裂解物组分中含有的抗原组分包含细胞和/或组织裂解物中的蛋白质和多肽组分和/或细胞裂解物中的脂质组分；
优选地，所述部分细胞裂解物组分中含有的抗原组分包含细胞和/或组织裂解物中的脂质组分和/或细胞裂解物中的RNA组分或mRNA组分；
优选地，所述抗原组分为使用适当方法从使用含有溶解剂的溶解液裂解后溶解的裂解物组分中分离提纯得到；
优选地，所述裂解物组分中的分离纯化得到的抗原组分也可以在细胞或肿瘤组织裂解前或者裂解后进行辐照，也可以在分离纯化的抗原组分负载到纳米粒子或者微米粒子以后进行辐照。
9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述负载分离纯化后的抗原组分的纳米粒子或微米粒子进一步负载至少一种如下所示的组分：
(iii)裂解物组分中的RNA组分或mRNA组分；
(iv)免疫佐剂；
(v)带正电荷的物质；
优选地，所述免疫佐剂包括如下至少一种：模式识别受体类激动剂、Toll样受体激动剂、卡介苗(BCG)、卡介苗细胞壁骨架、卡介苗甲醇提取残余物、卡介苗胞壁酰二肽、草分枝杆菌、多抗甲素、矿物油、病毒样颗粒、免疫增强的再造流感病毒小体、霍乱肠毒素、皂苷及其衍生物、Resiquimod、胸腺素、新生牛肝活性肽、咪喹莫特、多糖、姜黄素、免疫佐剂CpG、免疫佐剂poly(I:C)、免疫佐剂poly ICLC、短小棒状杆菌苗、溶血性链球菌制剂、辅酶QIO、左旋咪唑、聚胞苷酸、白细胞介素、干扰素、聚肌苷酸、聚腺苷酸、明矾、磷酸铝、羊毛脂、植物油、细胞因子、mRNA、MF59、双链RNA、双链DNA、单链DNA、铝佐剂、锰佐剂、钙佐剂、STING激动剂、内毒素佐剂、脂质体佐剂、CAF01、人参有效成分、黄芪有效成分；
优选地，所述免疫佐剂包括Toll样受体3激动剂和Toll样受体9激动剂中的至少一种；
更优选地，所述免疫佐剂包括Poly(I:C)、Poly ICLC、A类CpG-OND、B类CpG-OND和C类CpG-OND中的至少一种；
优选地，所述带正电荷的物质选自带正电荷的氨基酸、带正电荷的多肽、带正电荷的脂质、带正电荷的蛋白质、带正电荷的聚合物，和/或带正电荷的无机物中的一种或多种；
优选地，所述带正电荷的物质选自蜂毒肽、RALA多肽、KALA多肽、R8多肽、精氨酸、组氨酸、赖氨酸、聚精氨酸、聚赖氨酸、聚组氨酸和NH4HCO3中的一种或多种。
10.根据权利要求1-9中任一项所述的方法，其特征在于，所述纳米粒子的粒径为1nm-1000nm，优选为50-500nm，更优选为100-400nm；优选地，所述微米粒子的粒径为1μm-1000μm，优选为1-10μm，更优选为1-5μm。
11.一种根据权利要求1-10中任一项所述方法制备得到的抗原递送粒子。
12.一种药物组合物，其特征在于，所述药物组合物包括如权利要求10所述的抗原递送粒子；优选地，所述药物组合物还包括一种或多种药学上可接受的载体。
13.一种根据权利要求11所述的抗原递送粒子或根据权利要求12所述的药物组合物在如下(1)-(4)至少一项中的用途：
(1)制备用于预防或治疗疾病的药物；
(2)制备用于激活抗原提呈细胞，制备基于抗原提呈细胞疫苗；
(3)辅助激活抗原特异性T细胞，检测抗原特异性T细胞含量；
(4)辅助激活抗原特异性T细胞后，分离扩增被激活的抗原特异性T细胞，将其用于预防或治疗疾病。
14.根据权利要求13所述的用途，其特征在于，所述负载分离纯化后的抗原组分的纳米粒子或微米粒子可以直接作为疫苗使用；
优选地，所述负载分离纯化后的抗原组分的纳米粒子或微米粒子也可以作为抗原递送粒子激活树突状细胞和/或B细胞后，将被激活的树突状细胞和/或B细胞作为细胞疫苗使用；
优选地，所述负载分离纯化后的抗原组分的纳米粒子或微米粒子也可以作为抗原递送粒子体外辅助激活癌细胞特异性T细胞后用于检测癌抗原特异性T细胞的含量，或者用于辅助激活抗原特异性T细胞后分离和/或扩增被激活的抗原特异性T细胞用于疾病的预防和治疗。
15.根据权利要求13-14中任一项所述的用途，其特征在于，所述疾病为癌症或者肿瘤；优选地，所述癌症或肿瘤为实体肿瘤或者血液瘤。
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