DE102018108996B4

DE102018108996B4 - Verfahren zur Herstellung autologer T-Zellen

Info

Publication number: DE102018108996B4
Application number: DE102018108996.1A
Authority: DE
Inventors: Steffen Walter; Mamta KALRA; Ali Mohamed
Original assignee: Immatics US Inc
Current assignee: Immatics US Inc
Priority date: 2018-02-09
Filing date: 2018-04-16
Publication date: 2021-10-21
Anticipated expiration: 2038-04-17
Also published as: DE102018108996A1

Abstract

Verfahren zum Transduzieren von T-Zellen umfassend:Auftauen von gefrorenen mononuklearen Zellen des peripheren Bluts (PBMC),Ruhen der aufgetauten PBMC während etwa 4 bis etwa 6 Stunden,Aktivieren der T-Zellen in den ruhenden PBMC mit einem Anti-CD3 Antikörper und einem Anti-CD28 Antikörper;Transduzieren der aktivierten T-Zellen mit einem viralen Vektor,Expansion der transduzierten T-Zellen, undErhalten der expandierten T-Zellen.

Description

QUERVERWEIS AUF ZUGEHÖRIGE ANMELDUNGEN
Bei dieser Anmeldung handelt es sich um eine US-Provisionalanmeldung, die sich auf die US-Provisionalanmeldung Nr. 62/633.113 bezieht, die am 21. Februar 2018 eingereicht wurde, und die US-Provisionalanmeldung Nr. 62/628.521 , die am 9. Februar 2018 eingereicht wurde und deren Inhalt hiermit durch Verweis in ihrer Gesamtheit übernommen wird.
GEBIET DER ERFINDUNG
Die vorliegende Offenbarung bezieht sich im Allgemeinen auf Verfahren zur Herstellung autologer T-Zellen für die adoptive Immuntherapie. Die Offenbarung sieht ferner Verfahren zur genetischen Transduzierung von T-Zellen, Verfahren zur Verwendung von T-Zellen und T-Zellpopulationen davon vor.
HINTERGRUND DER ERFINDUNG
Die Verlagerung der Spezifität von T-Zellen gegen tumorassoziierte Antigene durch genetisch erzwungene Expression von T-Zell-Rezeptoren (TCRs) oder chimären Antigen-Rezeptoren (CARs) hat das Feld des adoptiven T-Zell-Transfers in jüngster Zeit gestärkt. Die Verwendung von CARs der zweiten und dritten Generation hat dazu beigetragen, dass seit Langem bestehende Problem der unzureichenden in vivo T-Zellpersistenz nach der Übertragung zu lösen, das die Wirksamkeit stark beeinträchtigt hat. Dennoch bleiben wichtige Hindernisse für eine breitere Anwendung bestehen, wie die Notwendigkeit, T-Zell-Produkte auf individueller Basis herzustellen, was diesen viel versprechenden Behandlungsansatz kaum wirtschaftlich machbar macht. Obwohl die Verwendung von autologen T-Zellen viel versprechend ist, kann es schwierig sein, bei stark vorbehandelten Patienten eine geeignete Anzahl von autologen Zellen zu erhalten.
Die US-Patentanmeldungen 2003/0170238 und 2003/0175272 offenbaren Verfahren zur adoptiven Immuntherapie, bei denen T-Zellen ruhen dürfen, indem sie für mindestens 48-72 Stunden, typischerweise für mindestens 72-120 Stunden, aus Aktivierungsstimuli entfernt und dann vor der Infusion durch Markierung der Zellen, beispielsweise mit mitogenen monoklonalen Antikörpern (mAbs), wie löslichen Anti-CD3- und Anti-CD28 mAbs reaktiviert werden, und danach die markierten Zellen mit autologen mononuklearen Zellen gemischt werden, die gegebenenfalls in Monozyten und Granulozyten verstärkt sind.
Die US-Patentanmeldung 2017/0051252 offenbart Verfahren zur Herstellung von T-Zell-Therapeutika, einschließlich der Schritte zum Erhalten einer Population von Zellen, die T-Zellen und antigenpräsentierende Zellen (APCs) enthalten; Kultivieren der Zellpopulation in einem Zellkulturmedium, umfassend (i) ein oder mehrere Zytokine, (ii) einen Anti-CD3-Antikörper oder ein CD3-bindendes Fragment davon und (iii) einen Anti-CD28-Antikörper oder ein CD28-bindendes Fragment davon, B7-1 oder ein CD28-bindendes Fragment davon, oder B7-2 oder ein CD28-bindendes Fragment davon, in dem die Kultur die T-Zellen aktiviert und stimuliert; Transduzieren der Population von aktivierten Zellen mit einem viralen Vektor; und Kultivieren der Population von Zellen in einem Zellwachstumsmedium, um die transduzierten T-Zellen zu expandieren; wodurch T-Zelltherapeutika hergestellt werden.
Babad, J. et al., Clinical and Experimental Immunology, 179, 2014, S. 398-413 „Generation of β cell-specific human cytotoxic T cells by lentiviral transduction and their survival in immunodeficient human leucocyte antigen-transgenic mice“ beschreiben die Herstellung β-zellspezifischer humaner zytotoxischer T-Zellen durch lentivirale Transduktion sowie ihr Überleben in immundefizienten humanen Leukozytenantigen-transgenen Mäusen.
Petersen, Ch. et al., Blood Advances, Vol. 2, No. 3, 2018 „Improving T-cell expansion and function for adoptive T-cell therapy using ex vivo treatment with PI3Kδ inhibitors and VIP antagonists‟ beschreiben eine Verbesserung der T-Zell-Expansion und - Funktion für die adoptive T-Zell-Therapie durch Ex-vivo-Behandlung mit PI3K-Inhibitoren und VIP-Antagonisten.
Verbesserte Strategien sind notwendig, um Zellpopulationen in vitro zu transduzieren, die genügend T-Zellen für Zwecke der Forschung, Diagnose und Therapie erzeugen könnten. Eine Lösung für dieses technische Problem ist im vorliegenden Dokument enthalten.
KURZE ZUSAMMENFASSUNG
In einem Aspekt bezieht sich die vorliegende Offenbarung auf ein Verfahren zum Transduzieren von T-Zellen, einschließlich des Auftauens von gefrorenen mononuklearen Zellen des peripheren Bluts (PBMC), Ruhen der aufgetauten PBMC während etwa 4 bis etwa 6 Stunden, Aktivieren der T-Zellen in der PBMC-Kultur mit einem Anti-CD3-Antikörper und einem Anti-CD28-Antikörper, Transduzieren der aktivierten T-Zellen mit einem viralen Vektor, Expansion der transduzierten T-Zellen und Erhalten der expandierten T-Zellen.
In einem Aspekt wird die T-Zelle in kultiviertem PBMC mit einem Anti-CD3-Antikörper und einem auf einem Festphasenträger immobilisierten Anti-CD28-Antikörper aktiviert.
In einem anderen Aspekt kann der Ruheschritt innerhalb eines Zeitraums von nicht mehr als etwa 4 Stunden, nicht mehr als etwa 5 Stunden oder nicht mehr als etwa 6 Stunden durchgeführt werden.
In einem weiteren Aspekt kann die Ruhezeit innerhalb eines Zeitraums von etwa 4 bis etwa 5 Stunden durchgeführt werden.
In einem weiteren Aspekt kann der Ruheschritt innerhalb eines Zeitraums von ca. 4 Stunden, ca. 5 Stunden oder ca. 6 Stunden, durchgeführt werden.
In einem Aspekt ist die Größenordnung der Expansion von T-Zellen, die mit einem Ruheschritt von etwa 1 Stunde, etwa 2 Stunden, etwa 3 Stunden, etwa 4 Stunden, etwa 5 Stunden, etwa 6 Stunden, etwa 7 Stunden, etwa 8 Stunden, etwa 9 Stunden, etwa 10 Stunden, etwa 2 Stunden bis etwa 5 Stunden, etwa 3 Stunden bis etwa 5 Stunden, etwa 3 Stunden bis etwa 4 Stunden, oder etwa 4 bis etwa 5 Stunden produziert werden, etwa gleich (etwa 1:1); mindestens etwa 1,1 mal, mindestens etwa 1,2 mal, mindestens etwa 1,3 mal, mindestens etwa 1,5 mal, mindestens etwa 1,7 mal oder mindestens etwa 2,0 mal größer als die Größenordnung der Expansion von T-Zellen, die bei einem Ruheschritt von etwa 16 Stunden, etwa 17 Stunden, etwa 18 Stunden, etwa 19 Stunden, etwa 20 Stunden, etwa 24 Stunden oder etwa 16 bis etwa 20 Stunden produziert werden. In einem bevorzugten Aspekt ist die Größenordnung der Expansion von T-Zellen, die mit einem Ruheschritt von etwa 4 Stunden produziert werden, mindestens etwa 1,5 mal größer als die Größenordnung der Expansion von T-Zellen, die mit einem Ruheschritt von etwa 16 Stunden (z. B. über Nacht) produziert werden. In einem Aspekt besteht der einzige Unterschied zwischen der Produktion der T-Zellen in der verkürzten Ruhezeit.
In einem Aspekt ist die Anzahl der T-Zellen, die mit einem Ruheschritt von etwa 1 Stunde, etwa 2 Stunden, etwa 3 Stunden, etwa 4 Stunden, etwa 5 Stunden, etwa 6 Stunden, etwa 7 Stunden, etwa 8 Stunden, etwa 9 Stunden, etwa 10 Stunden, etwa 2 Stunden bis etwa 5 Stunden, etwa 3 Stunden bis etwa 5 Stunden, etwa 3 Stunden bis etwa 4 Stunden oder etwa 4 bis etwa 5 Stunden produziert werden, etwa gleich (etwa 1:1); mindestens etwa 1,1 mal, mindestens etwa 1,2 mal, mindestens etwa 1,3 mal, mindestens etwa 1,5 mal, mindestens etwa 1,7 mal, oder mindestens etwa 2,0 mal mehr als die Anzahl der T-Zellen, die bei einem Ruheschritt von etwa 16 Stunden, etwa 17 Stunden, etwa 18 Stunden, etwa 19 Stunden, etwa 20 Stunden, etwa 24 Stunden oder etwa 16 bis etwa 20 Stunden produziert werden. In einem bevorzugten Aspekt ist die Anzahl der mit einem Ruheschritt von etwa 4 Stunden produzierten T-Zellen mindestens etwa 1,5 mal oder etwa 1,3 mal bis etwa 2,0 mal größer als die Größenordnung der Expansion der mit einem Ruheschritt von etwa 16 Stunden produzierten T-Zellen (z. B. über Nacht). In einem Aspekt besteht der einzige Unterschied zwischen der Produktion der T-Zellen in der verkürzten Ruhezeit.
In noch einem weiteren Aspekt können der Anti-CD3-Antikörper und der Anti-CD28-Antikörper jeweils eine Konzentration von nicht mehr als etwa 0,1 µg/ml, nicht mehr als etwa 0,2 µg/ml, nicht mehr als etwa 0,3 µg/ml, nicht mehr als etwa 0,4 µg/ml, nicht mehr als etwa 0,5 µg/ml, nicht mehr als etwa 0,6 µg/ml, nicht mehr als etwa 0,7 µg/ml, nicht mehr als etwa 0,8 µg/ml, nicht mehr als etwa 0,9 µg/ml, nicht mehr als etwa 1,0 µg/ml, nicht mehr als etwa 2,0 µg/ml, nicht mehr als etwa 4,0 µg/ml, nicht mehr als etwa 6,0 µg/ml, nicht mehr als etwa 8,0 µg/ml, oder nicht mehr als etwa 10,0 µg/ml aufweisen.
In noch einem weiteren Aspekt können der Anti-CD3-Antikörper und der Anti-CD28-Antikörper jeweils eine Konzentration von etwa 0,1 µg/ml bis etwa 1,0 µg/ml, etwa 0,1 µg/ml bis etwa 0,8 µg/ml, etwa 0,1 µg/ml bis etwa 0,6 µg/ml, etwa 0,1 µg/ml bis etwa 0,5 µg/ml, etwa 0,1 µg/ml bis etwa 0,25 µg/ml, etwa 0,2 µg/ml bis etwa 0,5 µg/ml, etwa 0.2 µg/ml bis etwa 0,3 µg/ml, etwa 0,3 µg/ml bis etwa 0,5 µg/ml, etwa 0,3 µg/ml bis etwa 0,4 µg/ml, etwa 0,2 µg/ml bis etwa 0,5 µg/ml, etwa 0,1 µg/ml bis etwa 10.0 µg/ml, etwa 0,1 µg/ml bis etwa 8,0 µg/ml, etwa 0,1 µg/ml bis etwa 6,0 µg/ml, etwa 0,1 µg/ml bis etwa 4,0 µg/ml, oder etwa 0,1 µg/ml bis etwa 2,0 µg/ml aufweisen.
In einem Aspekt kann die im vorliegenden Dokument beschriebene Aktivierung innerhalb eines Zeitraums von nicht mehr als etwa 1 Stunde, nicht mehr als etwa 2 Stunden, nicht mehr als etwa 3 Stunden, nicht mehr als etwa 4 Stunden, nicht mehr als etwa 5 Stunden, nicht mehr als etwa 6 Stunden, nicht mehr als etwa 7 Stunden, nicht mehr als etwa 8 Stunden, nicht mehr als etwa 9 Stunden, nicht mehr als etwa 10 Stunden, nicht mehr als etwa 11 Stunden, nicht mehr als etwa 12 Stunden, nicht mehr als etwa 14 Stunden , nicht mehr als etwa 16 Stunden, nicht mehr als etwa 18 Stunden, nicht mehr als etwa 20 Stunden, nicht mehr als etwa 22 Stunden, nicht mehr als etwa 24 Stunden, nicht mehr als etwa 26 Stunden, nicht mehr als etwa 28 Stunden, nicht mehr als etwa 30 Stunden, nicht mehr als etwa 36 Stunden, nicht mehr als etwa 48 Stunden, nicht mehr als etwa 60 Stunden, nicht mehr als etwa 72 Stunden, nicht mehr als etwa 84 Stunden, nicht mehr als etwa 96 Stunden, nicht mehr als etwa 108 Stunden oder nicht mehr als etwa 120 Stunden durchgeführt werden.
In einem weiteren Aspekt kann die im vorliegenden Dokument beschriebene Aktivierung innerhalb eines Zeitraums von etwa 1 Stunde bis etwa 120 Stunden, etwa 1 Stunde bis etwa 108 Stunden, etwa 1 Stunde bis etwa 96 Stunden, etwa 1 Stunde bis etwa 84 Stunden, etwa 1 Stunde bis etwa 72 Stunden, etwa 1 Stunde bis etwa 60 Stunden, etwa 1 Stunde bis etwa 48 Stunden, etwa 1 Stunde bis etwa 36 Stunden, etwa 1 Stunde bis etwa 24 Stunden, etwa 2 Stunden bis etwa 24 Stunden, etwa 4 Stunden bis etwa 24 Stunden, etwa 6 Stunden bis etwa 24 Stunden, etwa 8 Stunden bis etwa 24 Stunden, etwa 10 Stunden bis etwa 24 Stunden, etwa 12 Stunden bis etwa 24 Stunden, etwa 12 Stunden bis etwa 72 Stunden, etwa 24 Stunden bis etwa 72 Stunden, etwa 6 Stunden bis etwa 48 Stunden, etwa 24 Stunden bis etwa 48 Stunden, etwa 6 Stunden bis etwa 72 Stunden oder etwa 1 Stunde bis etwa 12 Stunden durchgeführt werden.
In einem weiteren Aspekt kann eine im vorliegenden Dokument beschriebene Festphase eine Oberfläche eines Beads, einer Platte, eines Kolbens oder eines Beutels sein.
In noch einem weiteren Aspekt kann eine im vorliegenden Dokument beschriebene Platte eine Platte mit 6 Well, 12 Well oder 24 Well sein.
In einem Aspekt kann eine im vorliegenden Dokument beschriebene Kolben eine Keimfläche von mindestens etwa 25 cm², etwa 75 cm², etwa 92,6 cm², etwa 100 cm², etwa 150 cm², etwa 162cm², etwa 175 cm², etwa 225 cm², etwa 235 cm², etwa 300 cm², etwa 1720 cm², etwa 25 cm² bis etwa 75 cm², etwa 25 cm² bis etwa 225 cm² oder etwa 25 cm² bis etwa 1720 cm² aufweisen.
In einem weiteren Aspekt kann ein im vorliegenden Dokument beschriebener Beutel ein Volumen von etwa 50 ml bis etwa 100 Liter, etwa 100 ml bis etwa 100 Liter, etwa 150 ml bis etwa 100 Liter, etwa 200 ml bis etwa 100 Liter, etwa 250 ml bis etwa 100 Liter, etwa 500 ml bis etwa 100 Liter, etwa 1 Liter bis etwa 100 Liter, etwa 1 Liter bis etwa 75 Liter, etwa 1 Liter bis etwa 50 Liter, etwa 1 Liter bis etwa 25 Liter, etwa 1 Liter bis etwa 20 Liter, etwa 1 Liter bis etwa 15 Liter, etwa 1 Liter bis etwa 10 Liter, etwa 1 Liter bis etwa 5 Liter, etwa 1 Liter bis etwa 2,5 Liter oder etwa 1 Liter bis etwa 2 Liter aufweisen.
In noch einem weiteren Aspekt kann die im vorliegenden Dokument beschriebene Aktivierung in Gegenwart des T-Zell-Aktivierungsstimuli durchgeführt werden.
In einem Aspekt können Zytokine, die im vorliegenden Dokument beschrieben sind, Interleukin 7 (IL-7) und/oder Interleukin 15 (IL-15) beinhalten.
In einem weiteren Aspekt kann die Konzentration von IL-7 nicht mehr als etwa 1 ng/ml, nicht mehr als etwa 2 ng/ml, nicht mehr als etwa 3 ng/ml, nicht mehr als etwa 4 ng/ml, nicht mehr als etwa 5 ng/ml, nicht mehr als etwa 6 ng/ml, nicht mehr als etwa 7 ng/ml , nicht mehr als etwa 8 ng/ml, nicht mehr als etwa 9 ng/ml, nicht mehr als etwa 10 ng/ml, nicht mehr als etwa 11 ng/ml, nicht mehr als etwa 12 ng/ml, nicht mehr als etwa 13 ng/ml, nicht mehr als etwa 14 ng/ml, nicht mehr als etwa 15 ng/ml, nicht mehr als etwa 16 ng/ml, nicht mehr als etwa 17 ng/ml, nicht mehr als etwa 18 ng/ml, nicht mehr als etwa 19 ng/ml, nicht mehr als etwa 20 ng/ml, nicht mehr als etwa 25 ng/ml, nicht mehr als etwa 30 ng/ml, nicht mehr als etwa 35 ng/ml, nicht mehr als etwa 40 ng/ml, nicht mehr als etwa 45 ng/ml, nicht mehr als etwa 50 ng/ml, nicht mehr als etwa 60 ng/ml, nicht mehr als etwa 70 ng/ml, nicht mehr als etwa 80 ng/ml, nicht mehr als etwa 90 ng/ml oder nicht mehr als etwa 100 ng/ml betragen.
In einem weiteren Aspekt kann die Konzentration von IL-7 von etwa 1 ng/ml bis 100 ng/ml, etwa 1 ng/ml bis 90 ng/ml, etwa 1 ng/ml bis 80 ng/ml, etwa 1 ng/ml bis 70 ng/ml, etwa 1 ng/ml bis 60 ng/ml, etwa 1 ng/ml bis 50 ng/ml , etwa 1 ng/ml bis 40 ng/ml, etwa 1 ng/ml bis 30 ng/ml, etwa 1 ng/ml bis 20 ng/ml, etwa 1 ng/ml bis 15 ng/ml, etwa 1 ng/ml bis 10 ng/ml, etwa 2 ng/ml bis 10 ng/ml, etwa 4 ng/ml bis 10 ng/ml, etwa 6 ng/ml bis 10 ng/ml oder etwa 5 ng/ml bis 10 ng/ml betragen.
In noch einem weiteren Aspekt kann die Konzentration von IL-15 nicht mehr als etwa 5 ng/ml, nicht mehr als etwa 10 ng/ml, nicht mehr als etwa 15 ng/ml, nicht mehr als etwa 20 ng/ml, nicht mehr als etwa 25 ng/ml, nicht mehr als etwa 30 ng/ml, nicht mehr als etwa 35 ng/ml, nicht mehr als etwa 40 ng/ml, nicht mehr als etwa 45 ng/ml, nicht mehr als etwa 50 ng/ml, nicht mehr als etwa 60 ng/ml , nicht mehr als etwa 70 ng/ml, nicht mehr als etwa 80 ng/ml, nicht mehr als etwa 90 ng/ml, nicht mehr als etwa 100 ng/ml, nicht mehr als etwa 110 ng/ml, nicht mehr als etwa 120 ng/ml, nicht mehr als etwa 130 ng/ml, nicht mehr als etwa 140 ng/ml, nicht mehr als etwa 150 ng/ml, 200 ng/ml, 250 ng/ml, 300 ng/ml, 350 ng/ml, 400 ng/ml, 450 ng/ml oder 500 ng/ml betragen.
In einem weiteren Aspekt kann die Konzentration von IL-15 von etwa 5 ng/ml bis 500 ng/ml, etwa 5 ng/ml bis 400 ng/ml, etwa 5 ng/ml bis 300 ng/ml, etwa 5 ng/ml bis 200 ng/ml, etwa 5 ng/ml bis 150 ng/ml, etwa 5 ng/ml bis 100 ng/ml, etwa 10 ng/ml bis 100 ng/ml, etwa 20 ng/ml bis 100 ng/ml, etwa 30 ng/ml bis 100 ng/ml , etwa 40 ng/ml bis 100 ng/ml, etwa 50 ng/ml bis 100 ng/ml, etwa 60 ng/ml bis 100 ng/ml, etwa 70 ng/ml bis 100 ng/ml, etwa 80 ng/ml bis 100 ng/ml, etwa 90 ng/ml bis 100 ng/ml, etwa 1 ng/ml bis 50 ng/ml, etwa 5 ng/ml bis 50 ng/ml, etwa 10 ng/ml bis 50 ng/ml oder etwa 20 ng/ml bis 50 ng/ml betragen.
In einem Aspekt kann die im vorliegenden Dokument beschriebene Transduktion innerhalb eines Zeitraums von nicht mehr als etwa 1 Stunde, nicht mehr als etwa 2 Stunden, nicht mehr als etwa 3 Stunden, nicht mehr als etwa 4 Stunden, nicht mehr als etwa 5 Stunden, nicht mehr als etwa 6 Stunden, nicht mehr als etwa 7 Stunden, nicht mehr als etwa 8 Stunden, nicht mehr als etwa 9 Stunden, nicht mehr als etwa 10 Stunden, nicht mehr als etwa 11 Stunden, nicht mehr als etwa 12 Stunden, nicht mehr als etwa 14 Stunden, nicht mehr als etwa 16 Stunden, nicht mehr als etwa 18 Stunden , nicht mehr als etwa 20 Stunden, nicht mehr als etwa 22 Stunden, nicht mehr als etwa 24 Stunden, nicht mehr als etwa 26 Stunden, nicht mehr als etwa 28 Stunden, nicht mehr als etwa 30 Stunden, nicht mehr als etwa 36 Stunden, nicht mehr als etwa 42 Stunden, nicht mehr als etwa 48 Stunden, nicht mehr als etwa 54 Stunden, nicht mehr als etwa 60 Stunden, nicht mehr als etwa 66 Stunden, nicht mehr als etwa 72 Stunden, nicht mehr als etwa 84 Stunden, nicht mehr als etwa 96 Stunden, nicht mehr als etwa 108 Stunden oder nicht mehr als etwa 120 Stunden durchgeführt werden.
In noch einem weiteren Aspekt kann die im vorliegenden Dokument beschriebene Transduktion innerhalb eines Zeitraums von etwa 1 Stunde bis etwa 120 Stunden, etwa 1 Stunde bis etwa 108 Stunden, etwa 1 Stunde bis etwa 96 Stunden, etwa 1 Stunde bis etwa 72 Stunden, etwa 1 Stunde bis etwa 48 Stunden, etwa 1 Stunde bis etwa 36 Stunden , etwa 1 Stunde bis etwa 24 Stunden, etwa 1 Stunde bis etwa 12 Stunden, etwa 2 Stunden bis etwa 24 Stunden, etwa 4 Stunden bis etwa 24 Stunden, etwa 12 Stunden bis etwa 24 Stunden, etwa 12 Stunden bis etwa 48 Stunden, etwa 12 Stunden bis etwa 72 Stunden, etwa 24 Stunden bis etwa 72 Stunden oder etwa 36 Stunden bis etwa 72 Stunden durchgeführt werden.
In einem weiteren Aspekt kann der im vorliegenden Dokument beschriebene virale Vektor ein retroviraler Vektor sein, der einen T-Zell-Rezeptor (TCR) exprimiert.
In noch einem weiteren Aspekt kann der im vorliegenden Dokument beschriebene virale Vektor ein lentiviraler Vektor sein, der einen TCR exprimiert.
In einem Aspekt kann die im vorliegenden Dokument beschriebene Transduzierung in Gegenwart des T-Zell-Aktivierungsstimuli durchgeführt werden.
In einem Aspekt kann die im vorliegenden Dokument beschriebene Expansion in Gegenwart des T-Zell-Aktivierungsstimuli durchgeführt werden.
In einem Aspekt kann die im vorliegenden Dokument beschriebene Expansion innerhalb eines Zeitraums von nicht mehr als etwa 1 Tag, nicht mehr als etwa 2 Tage, nicht mehr als etwa 3 Tage, nicht mehr als etwa 4 Tage, nicht mehr als etwa 5 Tage, nicht mehr als etwa 6 Tage, nicht mehr als etwa 7 Tage, nicht mehr als etwa 8 Tage, nicht mehr als etwa 9 Tage, nicht mehr als etwa 10 Tage, nicht mehr als etwa 15 Tage, nicht mehr als etwa 20 Tage, nicht mehr als etwa 25 Tage oder nicht mehr als etwa 30 Tage durchgeführt werden.
In einem weiteren Aspekt kann die im vorliegenden Dokument beschriebene Expansion innerhalb eines Zeitraums von etwa 1 Tag bis etwa 30 Tagen, etwa 1 Tag bis etwa 25 Tagen, etwa 1 Tag bis etwa 20 Tagen, etwa 1 Tag bis etwa 15 Tagen, etwa 1 Tag bis etwa 10 Tagen, etwa 2 Tagen bis etwa 10 Tagen, etwa 3 Tagen bis etwa 10 Tagen, etwa 4 Tagen bis etwa 10 Tagen, etwa 4 Tagen bis etwa 30 Tagen, etwa 6 Tagen bis etwa 25 Tagen, etwa 10 Tagen bis etwa 30 Tagen oder etwa 12 Tagen bis etwa 30 Tagen durchgeführt werden.
In einem Aspekt kann die Anzahl der erhaltenen T-Zellen mindestens etwa 1 x 10⁹ betragen, kann mindestens etwa 2 × 10⁹ betragen, kann mindestens 3 × 10⁹ betragen, kann mindestens 4 × 10⁹ betragen, kann mindestens 5 × 10⁹ betragen, kann mindestens 5 × 10⁹ sein, kann mindestens 6 × 10⁹ sein, kann mindestens 7 × 10⁹ sein, kann mindestens etwa 8 × 10⁹ sein, kann mindestens etwa 9 × 10⁹ sein, kann mindestens etwa 1 × 10¹⁰ sein, kann mindestens 5 × 10¹⁰ sein, kann mindestens 1 × 10¹⁰ sein, kann mindestens 5 × 10¹¹ sein, kann mindestens 1 × 10¹² sein, kann mindestens 5 × 10¹² sein oder kann mindestens 1 × 10¹³ Zellen sein.
In einem weiteren Aspekt kann die Anzahl der erhaltenen T-Zellen von etwa 1 × 10⁹ bis etwa 1 × 10¹³, etwa 1 × 10⁹ bis etwa 5 × 10¹², etwa 1 × 10⁹ bis etwa 1 × 10¹², etwa 1 × 10⁹ bis etwa 5 × 10¹¹, etwa 1 × 10⁹ bis etwa 1 × 10¹¹, etwa 1 × 10⁹ bis etwa 5 × 10¹⁰, etwa 1 × 10⁹ bis etwa 1 × 10¹⁰, etwa 2 × 10⁹ bis etwa 1 × 10¹⁰, etwa 3 × 10⁹ bis etwa 1 × 10¹⁰, etwa 4 × 10⁹ bis etwa 1 × 10¹⁰, etwa 5 × 10⁹ bis etwa 1 × 10¹⁰, etwa 6 × 10⁹ bis etwa 1 × 10¹⁰, etwa 7 × 10⁹ bis etwa 1 × 10¹⁰, etwa 8 × 10⁹ bis etwa 1 × 10¹⁰ oder etwa 9 × 10⁹ bis etwa 1 × 10¹⁰ Zellen betragen.
In einem Aspekt können die erhaltenen T-Zellen eine CD3+ CD8+ T-Zelle sein.
In einem weiteren Aspekt kann PBMC vom Patienten gewonnen werden.
In noch einem weiteren Aspekt bezieht sich die vorliegende Offenbarung auf gentechnisch transduzierte T-Zellen, die nach dem im vorliegenden Dokument beschriebenen Verfahren hergestellt werden.
In einem weiteren Aspekt bezieht sich die vorliegende Offenbarung auf pharmazeutische Zusammensetzungen, die die nach dem im vorliegenden Dokument beschriebenen Verfahren hergestellten genetisch transduzierten T-Zellen und pharmazeutisch akzeptable Träger enthalten.
In einem weiteren Aspekt bezieht sich die vorliegende Offenbarung auf ein Verfahren zur Herstellung einer T-Zellpopulation, einschließlich des Auftauens von gefrorenen mononuklearen Zellen des peripheren Bluts (PBMC), des Ruhens der aufgetauten PBMC, des Aktivierens der T-Zelle in der ruhenden PBMC mit einem Anti-CD3-Antikörper und einem auf einer festen Phase immobilisierten Anti-CD28-Antikörper, der Expansion der aktivierten T-Zelle und des Erhaltens der die erweiterte T-Zelle umfassenden T-Zellpopulation.
In noch einem weiteren Aspekt bezieht sich die vorliegende Offenbarung auf eine T-Zellpopulation, die nach dem im vorliegenden Dokument beschriebenen Verfahren hergestellt wurde.
In einem weiteren Aspekt bezieht sich die vorliegende Offenbarung auf Verfahren zur Behandlung eines Patienten oder einer Person, die an Krebs leidet oder eine Behandlung derselben benötigt, umfassend die Verabreichung einer wirksamen Menge der im vorliegenden Dokument beschriebenen expandierten T-Zellen an den Patienten. In einem Aspekt handelt es sich bei dem Patienten oder der Person, welche die Behandlung benötigt, um einen Krebspatienten. In einem Aspekt wird der zu behandelnde Krebs aus einer oder mehreren Erkrankungen ausgewählt: hepatozelluläres Karzinom [HCC - hepatocellular carcinoma], kolorektales Karzinom [CRC - colorectal carcinoma], Glioblastom (GB), Magenkrebs [GC - gastric cancer], Ösophaguskarzinom, nicht-kleinzelliges Lungenkarzinom [NSCLC - non-small cell lung cancer], Pankreaskrebs [PC - pancreatic cancer], Nierenzellkarzinom [RCC - renal cell carcinoma], gutartige Prostatahyperplasie [BPH - benign prostate hyperplasia], Prostatakrebs [PCA - prostate cancer], Eierstockkrebs [OC - ovarian cancer], Melanom, Brustkrebs, chronische lymphozytische Leukämie [CLL - chronic lymphocytic leukemia], Merkelzellkarzinom [MCC - Merkel cell carcinoma], kleinzelliger Lungenkrebs [SCLC - small cell lung cancer], Non-Hodgkin-Lymphom (NHL), akute myeloische Leukämie (AML), Gallenblasenkrebs und Cholangiokarzinom [GBC, CCC - gallbladder cancer, cholangiocarcinoma], Harnblasen-Karzinom [UBC - urinary bladder cancer], akute lymphatische Leukämie [ALL - acute lymphocytic leukemia] und Gebärmutterkrebs [UEC - uterine cancer] ausgewählt.
In einem weiteren Aspekt kann die Expansion in Gegenwart von mindestens einem Zytokin, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus IL-2, IL-7, IL-12, IL-15 und IL-21, durchgeführt werden.
In einem weiteren Aspekt kann das Auftauen, das Ruhen, das Aktivieren, das Transduzieren, das Expandieren und/oder das Erhalten in einem geschlossenen System durchgeführt werden, vorzugsweise wobei das geschlossene System CliniMACS Prodigy™, WAVE (XURI™) Bioreaktor, WAVE (XURI™) Bioreaktor in Kombination mit BioSafe Sepax™ II, geschlossenes System GatheRex™ oder geschlossenes System GatheRex™ in Kombination mit BioSafe Sepax™ II ist.
Zusammenfassend bezieht sich die Erfindung auf die folgenden Punkte:
Gegenstand 1. Ein Verfahren zum Transduzieren einer T-Zelle, umfassend das Auftauen von gefrorenen mononuklearen Zellen des peripheren Bluts (PBMC), Ruhen der aufgetauten PBMC, Aktivieren der T-Zelle in der ruhenden PBMC-Kultur mit einem Anti-CD3-Antikörper und einem Anti-CD28-Antikörper, Transduzieren der aktivierten T-Zelle mit einem viralen Vektor, Expansion der transduzierten T-Zelle und Erhalten der expandierten T-Zelle.
Gegenstand 2. Verfahren nach Anspruch 1, wobei der Aktivierungsschritt das Immobilisieren der T-Zelle in dem ruhenden PBMC mit dem Anti-CD3-Antikörper und dem Anti-CD28-Antikörper auf einem Festphasenträger umfasst.
Gegenstand 3. Verfahren nach einem der Gegenstände 1-2, wobei der Ruheschritt innerhalb eines Zeitraums von etwa 0,5 Stunden bis etwa 48 Stunden, etwa 0,5 Stunden bis etwa 36 Stunden, etwa 0,5 Stunden bis etwa 24 Stunden, etwa 0,5 Stunden bis etwa 18 Stunden, etwa 0,5 Stunden bis etwa 12 Stunden, etwa 0,5 Stunden bis etwa 6 Stunden, etwa 1 Stunde bis etwa 6 Stunden, etwa 2 Stunden bis etwa 5 Stunden, etwa 3 Stunden bis etwa 5 Stunden, oder etwa 1 Stunde bis etwa 24 Stunden, etwa 12 bis etwa 48 Stunden, etwa 0,5 Stunden bis etwa 120 Stunden, etwa 0,5 Stunden bis etwa 108 Stunden, etwa 0,5 Stunden bis etwa 96 Stunden, etwa 0,5 Stunden bis etwa 84 Stunden, etwa 0,5 Stunden bis etwa 72 Stunden, oder etwa 0,5 Stunden bis etwa 60 Stunden durchgeführt wird.
Gegenstand 4. Verfahren nach einem der Gegenstände 1-3, wobei der Anti-CD3-Antikörper und der Anti-CD28-Antikörper jeweils eine Konzentration von nicht mehr als etwa 0,1 µg/ml, nicht mehr als etwa 0,2 µg/ml, nicht mehr als etwa 0,3 µg/ml, nicht mehr als etwa 0,4 µg/ml, nicht mehr als etwa 0,5 µg/ml, nicht mehr als etwa 0,6 µg/ml, nicht mehr als etwa 0,7 µg/ml, nicht mehr als etwa 0,8 µg/ml, nicht mehr als etwa 0,9 µg/ml, nicht mehr als etwa 1,0 µg/ml, nicht mehr als etwa 2,0 µg/ml, nicht mehr als etwa 4,0 µg/ml, nicht mehr als etwa 6,0 µg/ml, nicht mehr als etwa 8,0 µg/ml oder nicht mehr als etwa 10,0 µg/ml aufweisen.
Gegenstand 5. Verfahren nach einem der Gegenstände 1-3, wobei der Anti-CD3-Antikörper und der Anti-CD28-Antikörper jeweils eine Konzentration von etwa 0,1 µg/ml bis etwa 10,0 µg/ml, etwa 0,1 µg/ml bis etwa 8,0 µg/ml, etwa 0,1 µg/ml bis etwa 6,0 µg/ml, etwa 0,1 µg/ml bis etwa 4,0 µg/ml, etwa 0,1 µg/ml bis etwa 2,0 µg/ml, etwa 0,1 µg/ml bis etwa 2,0 µg/ml, etwa 0,1 µg/ml bis etwa 1,0 µg/ml, etwa 0,1 µg/ml bis etwa 0,8 µg/ml, etwa 0,1 µg/ml bis etwa 0,6 µg/ml, etwa 0,1 µg/ml bis etwa 0,5 µg/ml, etwa 0,1 µg/ml bis etwa 0,25 µg/ml, etwa 0,2 µg/ml bis etwa 0,5 µg/ml, etwa 0,2 µg/ml bis etwa 0,3 µg/ml, etwa 0,3 µg/ml bis etwa 0,4 µg/ml, oder etwa 0,4 µg/ml bis etwa 0,5 µg/ml aufweisen.
Gegenstand 6. Verfahren nach einem der Gegenstände 1-5, wobei die Aktivierung innerhalb eines Zeitraums von nicht mehr als etwa 1 Stunde, etwa 2 Stunden, 3 Stunden, 4 Stunden, 5 Stunden, 6 Stunden, 7 Stunden, 7 Stunden, 8 Stunden, 9 Stunden, 9 Stunden, 10 Stunden, 11 Stunden, 12 Stunden, 14 Stunden, 16 Stunden, 18 Stunden, 20 Stunden, etwa 22 Stunden, etwa 24 Stunden, etwa 26 Stunden, etwa 28 Stunden, etwa 30 Stunden, etwa 36 Stunden, etwa 48 Stunden, etwa 60 Stunden, etwa 72 Stunden, etwa 84 Stunden, etwa 96 Stunden, etwa 108 Stunden oder etwa 120 Stunden durchgeführt wird.
Gegenstand 7. Verfahren nach einem der Gegenstände 1-5, wobei die Aktivierung innerhalb eines Zeitraums von etwa 1 Stunde bis etwa 120 Stunden, etwa 1 Stunde bis etwa 108 Stunden, etwa 1 Stunde bis etwa 96 Stunden, etwa 1 Stunde bis etwa 84 Stunden, etwa 1 Stunde bis etwa 72 Stunden, etwa 1 Stunde bis etwa 60 Stunden, etwa 1 Stunde bis etwa 48 Stunden, etwa 1 Stunde bis etwa 36 Stunden, etwa 1 Stunde bis etwa 24 Stunden , etwa 2 Stunden bis etwa 24 Stunden, etwa 4 Stunden bis etwa 24 Stunden, etwa 6 Stunden bis etwa 24 Stunden, etwa 8 Stunden bis etwa 24 Stunden, etwa 10 Stunden bis etwa 24 Stunden, etwa 12 Stunden bis etwa 24 Stunden, etwa 12 Stunden bis etwa 72 Stunden, etwa 24 Stunden bis etwa 72 Stunden, etwa 6 Stunden bis etwa 48 Stunden, etwa 24 Stunden bis etwa 48 Stunden, etwa 6 Stunden bis etwa 72 Stunden oder etwa 1 Stunde bis etwa 12 Stunden durchgeführt wird.
Gegenstand 8. Verfahren nach einem der Gegenstände 1-7, wobei die Festphase eine Oberfläche eines Beads, einer Platte, eines Kolbens oder eines Beutels ist.
Gegenstand 9. Verfahren nach Gegenstand 8, wobei die Platte eine Platte mit 6 Well, 12 Well oder 24 Well ist.
Gegenstand 10. Verfahren nach Gegenstand 8, wobei der Kolben kann eine Keimfläche von etwa 25 cm² bis etwa 75 cm², etwa 25 cm² bis etwa 100 cm², etwa 25 cm² bis etwa 150 cm² oder etwa 50 cm² bis etwa 1720 cm² aufweisen.
Gegenstand 11. Verfahren nach Gegenstand 8, wobei der Beutel ein Volumen von etwa 5 ml bis etwa 100 Liter, etwa 100 ml bis etwa 100 Liter, etwa 150 ml bis etwa 100 Liter, etwa 200 ml bis etwa 100 Liter, etwa 250 ml bis etwa 100 Liter, etwa 500 ml bis etwa 100 Liter, etwa 1 Liter bis etwa 100 Liter, etwa 1 Liter bis etwa 75 Liter, etwa 1 Liter bis etwa 50 Liter, etwa 1 Liter bis etwa 25 Liter, etwa 1 Liter bis etwa 20 Liter, etwa 1 Liter bis etwa 15 Liter, etwa 1 Liter bis etwa 10 Liter, etwa 1 Liter bis etwa 5 Liter, etwa 1 Liter bis etwa 2,5 Liter, oder etwa 1 Liter bis etwa 2 Liter aufweist.
Gegenstand 12. Verfahren nach einem der Gegenstände 1-11, wobei das Ruhen in Gegenwart von mindestens einem Zytokin durchgeführt wird.
Gegenstand 13. Verfahren nach Gegenstand 12, wobei das mindestens ein Zytokin Interleukin 7 (IL-7) und/oder Interleukin 15 (IL-15) umfasst.
Gegenstand 14. Verfahren nach Gegenstand 13, wobei die Konzentration von IL-7 nicht mehr als etwa 1 ng/ml, nicht mehr als etwa 2 ng/ml, nicht mehr als etwa 3 ng/ml, nicht mehr als etwa 4 ng/ml, nicht mehr als etwa 5 ng/ml, nicht mehr als etwa 6 ng/ml , nicht mehr als etwa 7 ng/ml, nicht mehr als etwa 8 ng/ml, nicht mehr als etwa 9 ng/ml, nicht mehr als etwa 10 ng/ml, nicht mehr als etwa 11 ng/ml, nicht mehr als etwa 12 ng/ml, nicht mehr als etwa 13 ng/ml, nicht mehr als etwa 14 ng/ml, nicht mehr als etwa 15 ng/ml, nicht mehr als etwa 16 ng/ml, nicht mehr als etwa 17 ng/ml, nicht mehr als etwa 18 ng/ml, nicht mehr als etwa 19 ng/ml, nicht mehr als etwa 20 ng/ml, nicht mehr als etwa 25 ng/ml, nicht mehr als etwa 30 ng/ml, nicht mehr als etwa 35 ng/ml, nicht mehr als etwa 40 ng/ml, nicht mehr als etwa 45 ng/ml, nicht mehr als etwa 50 ng/ml, nicht mehr als etwa 60 ng/ml, nicht mehr als etwa 70 ng/ml, nicht mehr als etwa 80 ng/ml, nicht mehr als etwa 90 ng/ml oder nicht mehr als etwa 100 ng/ml beträgt.
Gegenstand 15. Verfahren nach Gegenstand 13, wobei die Konzentration von IL-7 von etwa 1 ng/ml bis 90 ng/ml, etwa 1 ng/ml bis 80 ng/ml, etwa 1 ng/ml bis 70 ng/ml, etwa 1 ng/ml bis 60 ng/ml, etwa 1 ng/ml bis 50 ng/ml , etwa 1 ng/ml bis 40 ng/ml, etwa 1 ng/ml bis 30 ng/ml, etwa 1 ng/ml bis 20 ng/ml, etwa 1 ng/ml bis 15 ng/ml, etwa 1 ng/ml bis 10 ng/ml, etwa 2 ng/ml bis 10 ng/ml, etwa 4 ng/ml bis 10 ng/ml, etwa 6 ng/ml bis 10 ng/ml oder etwa 5 ng/ml bis 10 ng/ml beträgt.
Gegenstand 16. Verfahren nach einem der Gegenstände 13-15, wobei die Konzentration von IL-15 nicht mehr als etwa 5 ng/ml, nicht mehr als etwa 10 ng/ml, nicht mehr als etwa 15 ng/ml, nicht mehr als etwa 20 ng/ml, nicht mehr als etwa 25 ng/ml, nicht mehr als etwa 30 ng/ml, nicht mehr als etwa 35 ng/ml, nicht mehr als etwa 40 ng/ml, nicht mehr als etwa 45 ng/ml, nicht mehr als etwa 50 ng/ml, nicht mehr als etwa 60 ng/ml , nicht mehr als etwa 70 ng/ml, nicht mehr als etwa 80 ng/ml, nicht mehr als etwa 90 ng/ml, nicht mehr als etwa 100 ng/ml, nicht mehr als etwa 110 ng/ml, nicht mehr als etwa 120 ng/ml, nicht mehr als etwa 130 ng/ml, nicht mehr als etwa 140 ng/ml, nicht mehr als etwa 150 ng/ml, 200 ng/ml, 250 ng/ml, 300 ng/ml, 350 ng/ml, 400 ng/ml, 450 ng/ml oder 500 ng/ml beträgt.
Gegenstand 17. Verfahren nach einem der Gegenstände 13-15, wobei die Konzentration von IL-15 von etwa 5 ng/ml bis 500 ng/ml, etwa 5 ng/ml bis 400 ng/ml, etwa 5 ng/ml bis 300 ng/ml, etwa 5 ng/ml bis 200 ng/ml, etwa 5 ng/ml bis 150 ng/ml, etwa 5 ng/ml bis 100 ng/ml, etwa 10 ng/ml bis 100 ng/ml, etwa 20 ng/ml bis 100 ng/ml, etwa 30 ng/ml bis 100 ng/ml , etwa 40 ng/ml bis 100 ng/ml, etwa 50 ng/ml bis 100 ng/ml, etwa 60 ng/ml bis 100 ng/ml, etwa 70 ng/ml bis 100 ng/ml, etwa 80 ng/ml bis 100 ng/ml, etwa 90 ng/ml bis 100 ng/ml, etwa 10 ng/ml bis 50 ng/ml, etwa 20 ng/ml bis 50 ng/ml, etwa 30 ng/ml bis 50 ng/ml oder etwa 40 ng/ml bis 50 ng/ml beträgt.
Gegenstand 18. Verfahren nach einem der Gegenstände 1-16, wobei das Transduzieren innerhalb eines Zeitraums von nicht mehr als etwa 1 Stunde, nicht mehr als etwa 2 Stunden, nicht mehr als etwa 3 Stunden, nicht mehr als etwa 4 Stunden, nicht mehr als etwa 5 Stunden, nicht mehr als etwa 6 Stunden, nicht mehr als etwa 7 Stunden, nicht mehr als etwa 8 Stunden, nicht mehr als etwa 9 Stunden, nicht mehr als etwa 10 Stunden, nicht mehr als etwa 11 Stunden, nicht mehr als etwa 12 Stunden, nicht mehr als etwa 14 Stunden, nicht mehr als etwa 16 Stunden , nicht mehr als etwa 18 Stunden, nicht mehr als etwa 20 Stunden, nicht mehr als etwa 22 Stunden, nicht mehr als etwa 24 Stunden, nicht mehr als etwa 26 Stunden, nicht mehr als etwa 28 Stunden, nicht mehr als etwa 30 Stunden, nicht mehr als etwa 36 Stunden, nicht mehr als etwa 42 Stunden, nicht mehr als etwa 48 Stunden, nicht mehr als etwa 54 Stunden, nicht mehr als etwa 60 Stunden, nicht mehr als etwa 66 Stunden, nicht mehr als etwa 72 Stunden, nicht mehr als etwa 84 Stunden, nicht mehr als etwa 96 Stunden, nicht mehr als etwa 108 Stunden oder nicht mehr als etwa 120 Stunden durchgeführt wird.
Gegenstand 19. Verfahren nach einem der Gegenstände 1-16, wobei das Transduzieren innerhalb eines Zeitraums von etwa 1 Stunde bis 120 Stunden, etwa 1 Stunde bis 108 Stunden, etwa 1 Stunde bis 96 Stunden, etwa 1 Stunde bis 72 Stunden, etwa 1 Stunde bis 48 Stunden, etwa 1 Stunde bis 36 Stunden, etwa 1 Stunde bis 24 Stunden, etwa 2 Stunden bis 24 Stunden, etwa 4 Stunden bis 24 Stunden, etwa 6 Stunden bis 24 Stunden, etwa 8 Stunden bis 24 Stunden, etwa 10 Stunden bis 24 Stunden, etwa 12 Stunden bis 24 Stunden, etwa 14 Stunden 24 Stunden, etwa 16 Stunden bis 24 Stunden, etwa 18 Stunden bis 24 Stunden, etwa 20 Stunden bis 24 Stunden oder etwa 22 Stunden bis 24 Stunden durchgeführt wird.
Gegenstand 20. Verfahren nach einem der Gegenstände 1-19, wobei der virale Vektor ein retroviraler Vektor ist, der einen T-Zell-Rezeptor (TCR) exprimiert.
Gegenstand 21. Verfahren nach einem der Gegenstände 1-20, wobei der virale Vektor ein lentiviraler Vektor ist, der einen TCR exprimiert.
Gegenstand 22. Verfahren nach einem der Gegenstände 1-21, wobei das Transduzieren in Gegenwart von mindestens einem Zytokin durchgeführt wird.
Gegenstand 23. Verfahren nach Gegenstand 22, wobei das mindestens ein Zytokin Interleukin 7 (IL-7) und/oder Interleukin 15 (IL-15) umfasst.
Gegenstand 24. Verfahren nach Gegenstand 23, wobei die Konzentration von IL-7 nicht mehr als etwa 1 ng/ml, nicht mehr als etwa 2 ng/ml, nicht mehr als etwa 3 ng/ml, nicht mehr als etwa 4 ng/ml, nicht mehr als etwa 5 ng/ml, nicht mehr als etwa 6 ng/ml , nicht mehr als etwa 7 ng/ml, nicht mehr als etwa 8 ng/ml, nicht mehr als etwa 9 ng/ml, nicht mehr als etwa 10 ng/ml, nicht mehr als etwa 11 ng/ml, nicht mehr als etwa 12 ng/ml, nicht mehr als etwa 13 ng/ml, nicht mehr als etwa 14 ng/ml, nicht mehr als etwa 15 ng/ml, nicht mehr als etwa 16 ng/ml, nicht mehr als etwa 17 ng/ml, nicht mehr als etwa 18 ng/ml, nicht mehr als etwa 19 ng/ml, nicht mehr als etwa 20 ng/ml, nicht mehr als etwa 25 ng/ml, nicht mehr als etwa 30 ng/ml, nicht mehr als etwa 35 ng/ml, nicht mehr als etwa 40 ng/ml, nicht mehr als etwa 45 ng/ml, nicht mehr als etwa 50 ng/ml, nicht mehr als etwa 60 ng/ml, nicht mehr als etwa 70 ng/ml, nicht mehr als etwa 80 ng/ml, nicht mehr als etwa 90 ng/ml oder nicht mehr als etwa 100 ng/ml beträgt.
Gegenstand 25. Verfahren nach Gegenstand 23, wobei die Konzentration von IL-7 von etwa 1 ng/ml bis 100 ng/ml, etwa 1 ng/ml bis 90 ng/ml, etwa 1 ng/ml bis 80 ng/ml, etwa 1 ng/ml bis 70 ng/ml, etwa 1 ng/ml bis 60 ng/ml, etwa 1 ng/ml bis 50 ng/ml , etwa 1 ng/ml bis 40 ng/ml, etwa 1 ng/ml bis 30 ng/ml, etwa 1 ng/ml bis 20 ng/ml, etwa 1 ng/ml bis 15 ng/ml, etwa 1 ng/ml bis 10 ng/ml, etwa 2 ng/ml bis 10 ng/ml, etwa 4 ng/ml bis 10 ng/ml, etwa 6 ng/ml bis 10 ng/ml, etwa 8 ng/ml bis 10 ng/ml oder etwa 9 ng/ml bis 10 ng/ml beträgt.
Gegenstand 26. Verfahren nach einem der Gegenstände 23-25, wobei die Konzentration von IL-15 nicht mehr als etwa 5 ng/ml, nicht mehr als etwa 10 ng/ml, nicht mehr als etwa 15 ng/ml, nicht mehr als etwa 20 ng/ml, nicht mehr als etwa 25 ng/ml, nicht mehr als etwa 30 ng/ml, nicht mehr als etwa 35 ng/ml, nicht mehr als etwa 40 ng/ml, nicht mehr als etwa 45 ng/ml, nicht mehr als etwa 50 ng/ml, nicht mehr als etwa 60 ng/ml , nicht mehr als etwa 70 ng/ml, nicht mehr als etwa 80 ng/ml, nicht mehr als etwa 90 ng/ml, nicht mehr als etwa 100 ng/ml, nicht mehr als etwa 110 ng/ml, nicht mehr als etwa 120 ng/ml, nicht mehr als etwa 130 ng/ml, nicht mehr als etwa 140 ng/ml, nicht mehr als etwa 150 ng/ml, 200 ng/ml, 250 ng/ml, 300 ng/ml, 350 ng/ml, 400 ng/ml, 450 ng/ml oder 500 ng/ml beträgt.
Gegenstand 27. Verfahren nach einem der Gegenstände 23-25, wobei die Konzentration von IL-15 von etwa 5 ng/ml bis 500 ng/ml, etwa 5 ng/ml bis 400 ng/ml, etwa 5 ng/ml bis 300 ng/ml, etwa 5 ng/ml bis 200 ng/ml, etwa 5 ng/ml bis 150 ng/ml, etwa 5 ng/ml bis 100 ng/ml, etwa 10 ng/ml bis 100 ng/ml, etwa 20 ng/ml bis 100 ng/ml, etwa 30 ng/ml bis 100 ng/ml , etwa 40 ng/ml bis 100 ng/ml, etwa 50 ng/ml bis 100 ng/ml, etwa 60 ng/ml bis 100 ng/ml, etwa 70 ng/ml bis 100 ng/ml, etwa 80 ng/ml bis 100 ng/ml, etwa 90 ng/ml bis 100 ng/ml, etwa 10 ng/ml bis 50 ng/ml, etwa 20 ng/ml bis 50 ng/ml, etwa 30 ng/ml bis 50 ng/ml oder etwa 40 ng/ml bis 50 ng/ml beträgt.
Gegenstand 28. Verfahren nach einem der Gegenstände 1-27, wobei das Expandieren in Gegenwart von mindestens einem Zytokin durchgeführt wird.
Gegenstand 29. Verfahren nach Gegenstand 28, wobei das mindestens ein Zytokin Interleukin 7 (IL-7) und/oder Interleukin 15 (IL-15) umfasst.
Gegenstand 30. Verfahren nach Gegenstand 29, wobei die Konzentration von IL-7 nicht mehr als etwa 1 ng/ml, nicht mehr als etwa 2 ng/ml, nicht mehr als etwa 3 ng/ml, nicht mehr als etwa 4 ng/ml, nicht mehr als etwa 5 ng/ml, nicht mehr als etwa 6 ng/ml , nicht mehr als etwa 7 ng/ml, nicht mehr als etwa 8 ng/ml, nicht mehr als etwa 9 ng/ml, nicht mehr als etwa 10 ng/ml, nicht mehr als etwa 11 ng/ml, nicht mehr als etwa 12 ng/ml, nicht mehr als etwa 13 ng/ml, nicht mehr als etwa 14 ng/ml, nicht mehr als etwa 15 ng/ml, nicht mehr als etwa 16 ng/ml, nicht mehr als etwa 17 ng/ml, nicht mehr als etwa 18 ng/ml, nicht mehr als etwa 19 ng/ml, nicht mehr als etwa 20 ng/ml, nicht mehr als etwa 25 ng/ml, nicht mehr als etwa 30 ng/ml, nicht mehr als etwa 35 ng/ml, nicht mehr als etwa 40 ng/ml, nicht mehr als etwa 45 ng/ml, nicht mehr als etwa 50 ng/ml, nicht mehr als etwa 60 ng/ml, nicht mehr als etwa 70 ng/ml, nicht mehr als etwa 80 ng/ml, nicht mehr als etwa 90 ng/ml oder nicht mehr als etwa 100 ng/ml beträgt.
Gegenstand 31. Verfahren nach Gegenstand 29, wobei die Konzentration von IL-7 von etwa 1 ng/ml bis 100 ng/ml, etwa 1 ng/ml bis 90 ng/ml, etwa 1 ng/ml bis 80 ng/ml, etwa 1 ng/ml bis 70 ng/ml, etwa 1 ng/ml bis 60 ng/ml, etwa 1 ng/ml bis 50 ng/ml , etwa 1 ng/ml bis 40 ng/ml, etwa 1 ng/ml bis 30 ng/ml, etwa 1 ng/ml bis 20 ng/ml, etwa 1 ng/ml bis 15 ng/ml oder etwa 1 ng/ml bis 10 ng/ml.
Gegenstand 32. Verfahren nach einem der Gegenstände 29-31, wobei die Konzentration von IL-15 nicht mehr als etwa 5 ng/ml, 10 ng/ml, 15 ng/ml, 20 ng/ml, 25 ng/ml, 30 ng/ml, 35 ng/ml, 40 ng/ml, 45 ng/ml, 50 ng/ml, 60 ng/ml, 70 ng/ml, 80 ng/ml, 90 ng/ml, 100 ng/ml, 110 ng/ml, 120 ng/ml, 130 ng/ml, 140 ng/ml, 150 ng/ml, 200 ng/ml, 250 ng/ml, 300 ng/ml, 350 ng/ml, 400 ng/ml, 450 ng/ml oder 500 ng/ml beträgt.
Gegenstand 33. Verfahren nach einem der Gegenstände 29-31, wobei die Konzentration von IL-15 von etwa 5 ng/ml bis 500 ng/ml, etwa 5 ng/ml bis 400 ng/ml, etwa 5 ng/ml bis 300 ng/ml, etwa 5 ng/ml bis 200 ng/ml, etwa 5 ng/ml bis 150 ng/ml, etwa 5 ng/ml bis 100 ng/ml, etwa 10 ng/ml bis 100 ng/ml, etwa 20 ng/ml bis 100 ng/ml, etwa 30 ng/ml bis 100 ng/ml , etwa 40 ng/ml bis 100 ng/ml, etwa 50 ng/ml bis 100 ng/ml, etwa 60 ng/ml bis 100 ng/ml, etwa 70 ng/ml bis 100 ng/ml, etwa 80 ng/ml bis 100 ng/ml, etwa 90 ng/ml bis 100 ng/ml, etwa 10 ng/ml bis 50 ng/ml, etwa 20 ng/ml bis 50 ng/ml, etwa 30 ng/ml bis 50 ng/ml oder etwa 40 ng/ml bis 50 ng/ml beträgt.
Gegenstand 34. Verfahren nach einem der Gegenstände 1-33, wobei die Expansion innerhalb eines Zeitraums von nicht mehr als etwa 1 Tag, nicht mehr als etwa 2 Tage, nicht mehr als etwa 3 Tage, nicht mehr als etwa 4 Tage, nicht mehr als etwa 5 Tage, nicht mehr als etwa 6 Tage, nicht mehr als etwa 7 Tage, nicht mehr als etwa 8 Tage, nicht mehr als etwa 9 Tage, nicht mehr als etwa 10 Tage, nicht mehr als etwa 15 Tage, nicht mehr als etwa 20 Tage, nicht mehr als etwa 25 Tage oder nicht mehr als etwa 30 Tage durchgeführt wird.
Gegenstand 35. Verfahren nach einem der Gegenstände 1-33, wobei die Expansion innerhalb eines Zeitraums von etwa 1 Tag bis etwa 30 Tagen, etwa 1 Tag bis etwa 25 Tagen, etwa 1 Tag bis etwa 20 Tagen, etwa 1 Tag bis etwa 15 Tagen, etwa 1 Tag bis etwa 10 Tagen, etwa 2 Tagen bis etwa 10 Tagen, etwa 3 Tagen bis etwa 10 Tagen, etwa 4 Tagen bis etwa 10 Tagen, etwa 5 Tagen bis etwa 10 Tagen, etwa 6 Tagen bis etwa 10 Tagen, etwa 7 Tagen bis etwa 10 Tagen, etwa8 Tagen bis etwa 10 Tagen oder etwa 9 Tagen bis etwa 10 Tagen durchgeführt werden.
Gegenstand 36. Verfahren nach einem der Gegenstände 1-35, wobei die Anzahl der erhaltenen T-Zellen mindestens etwa 1 × 10⁹ ist, kann mindestens etwa 2 × 10⁹ sein, kann mindestens 3 × 10⁹ sein, kann mindestens 4 × 10⁹ sein, kann mindestens 5 × 10⁹ sein, kann mindestens 6 × 10⁹ sein, kann mindestens 7 × 10⁹ sein, kann mindestens etwa 8 × 10⁹ sein, kann mindestens etwa 9 × 10⁹ sein, kann mindestens etwa 1 × 10¹⁰ sein, kann mindestens 5 × 10¹⁰ sein, kann mindestens 1 × 10¹¹ sein, kann mindestens 5 × 10¹¹ sein, kann mindestens 1 × 10¹² sein, kann mindestens 5 × 10¹² sein oder kann mindestens 1 × 10¹³ Zellen sein.
Gegenstand 37. Verfahren nach einem der Gegenstände 1-35, wobei die Anzahl der erhaltenen T-Zellen von etwa 1 × 10⁹ bis etwa 1 × 10¹³, etwa 1 × 10⁹ bis etwa 5 × 10¹², etwa 1 × 10⁹ bis etwa 1 × 10¹², etwa 1 × 10⁹ bis etwa 5 × 10¹¹, etwa 1 × 10⁹ bis etwa 1 × 10¹¹, etwa 1 × 10⁹ bis etwa 5 × 10¹⁰, etwa 1 × 10⁹ bis etwa 1 × 10¹⁰, etwa 2 × 10⁹ bis etwa 1 × 10¹⁰, etwa 3 × 10⁹ bis etwa 1 × 10¹⁰, etwa 4 × 10⁹ bis etwa 1 × 10¹⁰, etwa 5 × 10⁹ bis etwa 1 × 10¹⁰, etwa 6 × 10⁹ bis etwa 1 × 10¹⁰, etwa 7 × 10⁹ bis etwa 1 × 10¹⁰, etwa 8 × 10⁹ bis etwa 1 × 10¹⁰ oder etwa 9 × 10⁹ bis etwa 1 × 10¹⁰ Zellen beträgt.
Gegenstand 38. Verfahren nach einem der Gegenstände 1-37, wobei die erhaltene T-Zelle eine CD3⁺ CD8⁺ T-Zelle ist.
Gegenstand 39. Ein Verfahren zur Behandlung eines an Krebs erkrankten Patienten, umfassend das Verabreichen einer wirksamen Menge der erhaltenen T-Zellen, die durch das Verfahren nach einem der Gegenstände 1-38 hergestellt sind.
Gegenstand 40. Verfahren nach Gegenstand 39, wobei das PBMC vom Patienten erhalten wird.
Gegenstand 41. Genetisch transduzierte T-Zelle, hergestellt durch das Verfahren nach einem der Gegenstände 1-38.
Gegenstand 42. Eine pharmazeutische Zusammensetzung, umfassend die genetisch transduzierte T-Zelle vom Gegenstand 41 und einen pharmazeutisch akzeptablen Träger.
Gegenstand 43. Ein Verfahren zur Herstellung einer T-Zellpopulation, umfassend das Auftauen von gefrorenen mononuklearen Zellen des peripheren Bluts (PBMC), das Ruhen der aufgetauten PBMC, das Aktivieren der T-Zelle in der ruhenden PBMC mit einem Anti-CD3-Antikörper und einem auf einer festen Phase immobilisierten Anti-CD28-Antikörper, die Expansion der aktivierten T-Zelle und das Erhalten der die expandierte T-Zelle umfassenden T-Zellpopulation.
Gegenstand 44. Verfahren nach Gegenstand 43, wobei das Ruhen innerhalb eines Zeitraums von nicht mehr als etwa 1 Stunde, etwa 2 Stunden, 3 Stunden, 4 Stunden, 5 Stunden, 6 Stunden, 7 Stunden, 7 Stunden, 8 Stunden, 9 Stunden, 9 Stunden, 10 Stunden, 11 Stunden, 12 Stunden , 14 Stunden, 16 Stunden, 18 Stunden, 20 Stunden, etwa 22 Stunden, etwa 24 Stunden, etwa 26 Stunden, etwa 28 Stunden, etwa 30 Stunden, etwa 36 Stunden, etwa 48 Stunden, etwa 60 Stunden, etwa 72 Stunden, etwa 84 Stunden, etwa 96 Stunden, etwa 108 Stunden oder etwa 120 Stunden durchgeführt wird.
Gegenstand 45. Verfahren nach Gegenstand 43, wobei das Ruhen innerhalb eines Zeitraums von etwa 1 Stunde bis etwa 120 Stunden, etwa 1 Stunde bis etwa 108 Stunden, etwa 1 Stunde bis etwa 96 Stunden, etwa 1 Stunde bis etwa 84 Stunden, etwa 1 Stunde bis etwa 72 Stunden, etwa 1 Stunde bis etwa 60 Stunden, etwa 1 Stunde bis etwa 48 Stunden, etwa 1 Stunde bis etwa 36 Stunden, etwa 1 Stunde bis etwa 24 Stunden , etwa 2 Stunden bis etwa 24 Stunden, etwa 4 Stunden bis etwa 24 Stunden, etwa 6 Stunden bis etwa 24 Stunden, etwa 8 Stunden bis etwa 24 Stunden, etwa 10 Stunden bis etwa 24 Stunden, etwa 12 Stunden bis etwa 24 Stunden, etwa 12 Stunden bis etwa 72 Stunden, etwa 24 Stunden bis etwa 72 Stunden, etwa 6 Stunden bis etwa 48 Stunden, etwa 24 Stunden bis etwa 48 Stunden, etwa 6 Stunden bis etwa 72 Stunden oder etwa 1 Stunde bis etwa 12 Stunden durchgeführt wird.
Gegenstand 46. Verfahren nach einem der Gegenstände 43-45, wobei der Anti-CD3-Antikörper und der Anti-CD28-Antikörper jeweils eine Konzentration von nicht mehr als etwa 0,1 µg/ml, nicht mehr als etwa 0,2 µg/ml, nicht mehr als etwa 0,3 µg/ml, nicht mehr als etwa 0,4 µg/ml, nicht mehr als etwa 0,5 µg/ml, nicht mehr als etwa 0,6 µg/ml, nicht mehr als etwa 0,7 µg/ml, nicht mehr als etwa 0,8 µg/ml, nicht mehr als etwa 0,9 µg/ml, nicht mehr als etwa 1,0 µg/ml, nicht mehr als etwa 2,0 µg/ml, nicht mehr als etwa 4,0 µg/ml, nicht mehr als etwa 6,0 µg/ml, nicht mehr als etwa 8,0 µg/ml oder nicht mehr als etwa 10,0 µg/ml aufweisen.
Gegenstand 47. Verfahren nach einem der Gegenstände 43-45, wobei der Anti-CD3-Antikörper und der Anti-CD28-Antikörper jeweils eine Konzentration von etwa 0,1 µg/ml bis etwa 10,0 µg/ml, etwa 0,1 µg/ml bis etwa 8,0 µg/ml, etwa 0,1 µg/ml bis etwa 6,0 µg/ml, etwa 0,1 µg/ml bis etwa 4.0 µg/ml, etwa 0,1 µg/ml bis etwa 2,0 µg/ml, etwa 0,1 µg/ml bis etwa 1,0 µg/ml, etwa 0,1 µg/ml bis etwa 0,8 µg/ml, etwa 0,1 µg/ml bis etwa 0,5 µg/ml, etwa 0,1 µg/ml bis etwa 0,25 µg/ml oder etwa 0,2 µg/ml bis etwa 0,5 µg/ml aufweisen.
Gegenstand 48. Verfahren nach einem der Gegenstände 43-47, wobei die Aktivierung innerhalb eines Zeitraums von nicht mehr als etwa 1 Stunde, nicht mehr als etwa 2 Stunden, nicht mehr als etwa 3 Stunden, nicht mehr als etwa 4 Stunden, nicht mehr als etwa 5 Stunden, nicht mehr als etwa 6 Stunden, nicht mehr als etwa 7 Stunden, nicht mehr als etwa 8 Stunden, nicht mehr als etwa 9 Stunden, nicht mehr als etwa 10 Stunden, nicht mehr als etwa 11 Stunden, nicht mehr als etwa 12 Stunden, nicht mehr als etwa 14 Stunden, nicht mehr als etwa 16 Stunden , nicht mehr als etwa 18 Stunden, nicht mehr als etwa 20 Stunden, nicht mehr als etwa 22 Stunden, nicht mehr als etwa 24 Stunden, nicht mehr als etwa 26 Stunden, nicht mehr als etwa 28 Stunden, nicht mehr als etwa 30 Stunden, nicht mehr als etwa 36 Stunden, nicht mehr als etwa 42 Stunden, nicht mehr als etwa 48 Stunden, nicht mehr als etwa 54 Stunden, nicht mehr als etwa 60 Stunden, nicht mehr als etwa 66 Stunden, nicht mehr als etwa 72 Stunden, nicht mehr als etwa 84 Stunden, nicht mehr als etwa 96 Stunden, nicht mehr als etwa 108 Stunden oder nicht mehr als etwa 120 Stunden durchgeführt wird.
Gegenstand 49. Verfahren nach einem der Gegenstände 43-47, wobei die Aktivierung innerhalb eines Zeitraums von etwa 1 Stunde bis etwa 120 Stunden, etwa 1 Stunde bis etwa 108 Stunden, etwa 1 Stunde bis etwa 96 Stunden, etwa 1 Stunde bis etwa 84 Stunden, etwa 1 Stunde bis etwa 72 Stunden, etwa 1 Stunde bis etwa 60 Stunden, etwa 1 Stunde bis etwa 48 Stunden, etwa 1 Stunde bis etwa 36 Stunden, etwa 1 Stunde bis etwa 24 Stunden , etwa 2 Stunden bis etwa 24 Stunden, etwa 4 Stunden bis etwa 24 Stunden, etwa 6 Stunden bis etwa 24 Stunden, etwa 8 Stunden bis etwa 24 Stunden, etwa 10 Stunden bis etwa 24 Stunden, etwa 12 Stunden bis etwa 24 Stunden, etwa 14 Stunden bis etwa 24 Stunden, etwa 16 Stunden bis etwa 24 Stunden, etwa 18 Stunden bis etwa 24 Stunden, etwa 20 Stunden bis etwa 24 Stunden, etwa 22 Stunden bis etwa 24 Stunden oder etwa 23 Stunden bis etwa 24 Stunden durchgeführt wird.
Gegenstand 50. Verfahren nach einem der Gegenstände 43-49, wobei die Festphase eine Oberfläche eines Beads, einer Platte, eines Kolbens oder eines Beutels ist.
Gegenstand 51. Verfahren nach Gegenstand 50, wobei die Platte eine Platte mit 6 Well, 12 Well oder 24 Well ist.
Gegenstand 52. Verfahren nach Gegenstand 50, wobei der Kolben kann eine Keimfläche von etwa 25 cm² bis etwa 75 cm², etwa 25 cm² bis etwa 100 cm², etwa 25 cm² bis etwa 150 cm² oder etwa 50 cm² bis etwa 1720 cm² aufweisen.
53. Verfahren nach Gegenstand 50, wobei der Beutel ein Volumen von etwa 50 ml bis etwa 100 Liter, etwa 100 ml bis etwa 100 Liter, etwa 150 ml bis etwa 100 Liter, etwa 200 ml bis etwa 100 Liter, etwa 250 ml bis etwa 100 Liter, etwa 500 ml bis etwa 100 Liter, etwa 1 Liter bis etwa 100 Liter, etwa 1 Liter bis etwa 75 Liter, etwa 1 Liter bis etwa 50 Liter, etwa 1 Liter bis etwa 25 Liter, etwa 1 Liter bis etwa 20 Liter, etwa 1 Liter bis etwa 15 Liter, etwa 1 Liter bis etwa 10 Liter, etwa 1 Liter bis etwa 5 Liter, etwa 1 Liter bis etwa 2,5 Liter, oder etwa 1 Liter bis etwa 2 Liter aufweist.
Gegenstand 54. Verfahren nach einem der Gegenstände 43-53, wobei die Aktivierung in Gegenwart von mindestens einem Zytokin durchgeführt wird.
Gegenstand 55. Verfahren nach Gegenstand 54, wobei das mindestens ein Zytokin Interleukin 7 (IL-7) und/oder Interleukin 15 (IL-15) umfasst.
Gegenstand 56. Verfahren nach Gegenstand 55, wobei die Konzentration von IL-7 nicht mehr als etwa 1 ng/ml, nicht mehr als etwa 2 ng/ml, nicht mehr als etwa 3 ng/ml, nicht mehr als etwa 4 ng/ml, nicht mehr als etwa 5 ng/ml, nicht mehr als etwa 6 ng/ml , nicht mehr als etwa 7 ng/ml, nicht mehr als etwa 8 ng/ml, nicht mehr als etwa 9 ng/ml, nicht mehr als etwa 10 ng/ml, nicht mehr als etwa 11 ng/ml, nicht mehr als etwa 12 ng/ml, nicht mehr als etwa 13 ng/ml, nicht mehr als etwa 14 ng/ml, nicht mehr als etwa 15 ng/ml, nicht mehr als etwa 16 ng/ml, nicht mehr als etwa 17 ng/ml, nicht mehr als etwa 18 ng/ml, nicht mehr als etwa 19 ng/ml, nicht mehr als etwa 20 ng/ml, nicht mehr als etwa 25 ng/ml, nicht mehr als etwa 30 ng/ml, nicht mehr als etwa 35 ng/ml, nicht mehr als etwa 40 ng/ml, nicht mehr als etwa 45 ng/ml, nicht mehr als etwa 50 ng/ml, nicht mehr als etwa 60 ng/ml, nicht mehr als etwa 70 ng/ml, nicht mehr als etwa 80 ng/ml, nicht mehr als etwa 90 ng/ml oder nicht mehr als etwa 100 ng/ml beträgt.
Gegenstand 57. Verfahren nach Gegenstand 55, wobei die Konzentration von IL-7 von etwa 1 ng/ml bis 100 ng/ml, etwa 1 ng/ml bis 90 ng/ml, etwa 1 ng/ml bis 80 ng/ml, etwa 1 ng/ml bis 70 ng/ml, etwa 1 ng/ml bis 60 ng/ml, etwa 1 ng/ml bis 50 ng/ml , etwa 1 ng/ml bis 40 ng/ml, etwa 1 ng/ml bis 30 ng/ml, etwa 1 ng/ml bis 20 ng/ml, etwa 1 ng/ml bis 15 ng/ml, etwa 1 ng/ml bis 10 ng/ml, etwa 2 ng/ml bis 10 ng/ml, etwa 4 ng/ml bis 10 ng/ml, etwa 6 ng/ml bis 10 ng/ml oder etwa 5 ng/ml bis 10 ng/ml beträgt.
Gegenstand 58. Verfahren nach einem der Gegenstände 55-57, wobei die Konzentration von IL-15 nicht mehr als etwa 5 ng/ml, nicht mehr als etwa 10 ng/ml, nicht mehr als etwa 15 ng/ml, nicht mehr als etwa 20 ng/ml, nicht mehr als etwa 25 ng/ml, nicht mehr als etwa 30 ng/ml, nicht mehr als etwa 35 ng/ml, nicht mehr als etwa 40 ng/ml, nicht mehr als etwa 45 ng/ml, nicht mehr als etwa 50 ng/ml, nicht mehr als etwa 60 ng/ml, nicht mehr als etwa 70 ng/ml, nicht mehr als etwa 80 ng/ml, nicht mehr als etwa 90 ng/ml, nicht mehr als etwa 100 ng/ml, nicht mehr als etwa 110 ng/ml, nicht mehr als etwa 120 ng/ml, nicht mehr als etwa 130 ng/ml, nicht mehr als etwa 140 ng/ml oder 500 ng/ml beträgt.
Gegenstand 59. Verfahren nach einem der Gegenstände 55-57, wobei die Konzentration von IL-15 von etwa 5 ng/ml bis 500 ng/ml, etwa 5 ng/ml bis 400 ng/ml, etwa 5 ng/ml bis 300 ng/ml, etwa 5 ng/ml bis 200 ng/ml, etwa 5 ng/ml bis 150 ng/ml, etwa 5 ng/ml bis 100 ng/ml, etwa 10 ng/ml bis 100 ng/ml, etwa 20 ng/ml bis 100 ng/ml, etwa 30 ng/ml bis 100 ng/ml , etwa 40 ng/ml bis 100 ng/ml, etwa 50 ng/ml bis 100 ng/ml, etwa 60 ng/ml bis 100 ng/ml, etwa 70 ng/ml bis 100 ng/ml, etwa 80 ng/ml bis 100 ng/ml, etwa 90 ng/ml bis 100 ng/ml, etwa 1 ng/ml bis 50 ng/ml, etwa 5 ng/ml bis 50 ng/ml, etwa 10 ng/ml bis 50 ng/ml oder etwa 20 ng/ml bis 50 ng/ml beträgt.
Gegenstand 60. Verfahren nach einem der Gegenstände 43-59, ferner umfassend die Transduktion der aktivierten T-Zelle mit einem viralen Vektor.
Gegenstand 61. Verfahren nach Gegenstand 62, wobei es sich bei dem viralen Vektor um einen retroviralen Vektor handelt, der einen T-Zell-Rezeptor (TCR) exprimiert.
Gegenstand 62. Verfahren nach Gegenstand 60 oder 61, wobei es sich bei dem viralen Vektor um einen lentiviralen Vektor handelt, der einen TCR exprimiert.
Gegenstand 63. Verfahren nach einem der Gegenstände 60-62, wobei das Transduzieren in Gegenwart von mindestens einem Zytokin durchgeführt wird.
Gegenstand 64. Verfahren nach Gegenstand 63, wobei das mindestens ein Zytokin Interleukin 7 (IL-7) und/oder Interleukin 15 (IL-15) umfasst.
Gegenstand 65. Verfahren nach Gegenstand 64, wobei die Konzentration von IL-7 nicht mehr als etwa 1 ng/ml, nicht mehr als etwa 2 ng/ml, nicht mehr als etwa 3 ng/ml, nicht mehr als etwa 4 ng/ml, nicht mehr als etwa 5 ng/ml, nicht mehr als etwa 6 ng/ml , nicht mehr als etwa 7 ng/ml, nicht mehr als etwa 8 ng/ml, nicht mehr als etwa 9 ng/ml, nicht mehr als etwa 10 ng/ml, nicht mehr als etwa 11 ng/ml, nicht mehr als etwa 12 ng/ml, nicht mehr als etwa 13 ng/ml, nicht mehr als etwa 14 ng/ml, nicht mehr als etwa 15 ng/ml, nicht mehr als etwa 16 ng/ml, nicht mehr als etwa 17 ng/ml, nicht mehr als etwa 18 ng/ml, nicht mehr als etwa 19 ng/ml, nicht mehr als etwa 20 ng/ml, nicht mehr als etwa 25 ng/ml, nicht mehr als etwa 30 ng/ml, nicht mehr als etwa 35 ng/ml, nicht mehr als etwa 40 ng/ml, nicht mehr als etwa 45 ng/ml, nicht mehr als etwa 50 ng/ml, nicht mehr als etwa 60 ng/ml, nicht mehr als etwa 70 ng/ml, nicht mehr als etwa 80 ng/ml, nicht mehr als etwa 90 ng/ml oder nicht mehr als etwa 100 ng/ml beträgt.
Gegenstand 66. Verfahren nach Gegenstand 64, wobei die Konzentration von IL-7 von etwa 1 ng/ml bis 100 ng/ml, etwa 1 ng/ml bis 90 ng/ml, etwa 1 ng/ml bis 80 ng/ml, etwa 1 ng/ml bis 70 ng/ml, etwa 1 ng/ml bis 60 ng/ml, etwa 1 ng/ml bis 50 ng/ml , etwa 1 ng/ml bis 40 ng/ml, etwa 1 ng/ml bis 30 ng/ml, etwa 1 ng/ml bis 20 ng/ml, etwa 1 ng/ml bis 15 ng/ml oder etwa 1 ng/ml bis 10 ng/ml.
Gegenstand 67. Verfahren Verfahren nach einem der Gegenstände 64-66, wobei die Konzentration von IL-15 nicht mehr als etwa 5 ng/ml, nicht mehr als etwa 10 ng/ml, nicht mehr als etwa 15 ng/ml, nicht mehr als etwa 20 ng/ml, nicht mehr als etwa 25 ng/ml, nicht mehr als etwa 30 ng/ml, nicht mehr als etwa 35 ng/ml, nicht mehr als etwa 40 ng/ml, nicht mehr als etwa 45 ng/ml, nicht mehr als etwa 50 ng/ml, nicht mehr als etwa 60 ng/ml, nicht mehr als etwa 70 ng/ml, nicht mehr als etwa 80 ng/ml, nicht mehr als etwa 90 ng/ml, nicht mehr als etwa 100 ng/ml, nicht mehr als etwa 110 ng/ml, nicht mehr als etwa 120 ng/ml, nicht mehr als etwa 130 ng/ml, nicht mehr als etwa 140 ng/ml, nicht mehr als etwa 150 ng/ml, nicht mehr als etwa 200 ng/ml, nicht mehr als etwa 250 ng/ml, nicht mehr als etwa 300 ng/ml, nicht mehr als etwa 350 ng/ml, nicht mehr als etwa 400 ng/ml, nicht mehr als etwa 450 ng/ml oder nicht mehr als etwa 500 ng/ml beträgt.
Gegenstand 68. Verfahren nach einem der Gegenstände 64-66, wobei die Konzentration von IL-15 von etwa 5 ng/ml bis 500 ng/ml, etwa 5 ng/ml bis 400 ng/ml, etwa 5 ng/ml bis 300 ng/ml, etwa 5 ng/ml bis 200 ng/ml beträgt, etwa 5 ng/ml bis 150 ng/ml, etwa 5 ng/ml bis 100 ng/ml, etwa 10 ng/ml bis 100 ng/ml, etwa 20 ng/ml bis 100 ng/ml, etwa 30 ng/ml bis 100 ng/ml, etwa 40 ng/ml bis 100 ng/ml oder etwa 50 ng/ml bis 100 ng/ml beträgt.
Gegenstand 69. Eine T-Zellpopulation erhalten durch das Verfahren nach einem der Gegenstände 43-68.
Gegenstand 70. Verfahren nach einem der Gegenstände 1-38 und 43-68, wobei das Expandieren in Gegenwart von mindestens einem Zytokin, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus IL-2, IL-7, IL-12, IL-15 und IL-21, durchgeführt wird.
Gegenstand 71. Verfahren nach Gegenstand 70, wobei das mindestens ein Zytokin IL-2 umfasst.
Gegenstand 72. Verfahren nach Gegenstand 70, wobei das mindestens ein Zytokin IL-7 und IL-15 umfasst.
Gegenstand 73. Ein Verfahren zur Herstellung einer T-Zellpopulation, umfassend das Auftauen von mononuklearen Zellen des peripheren Bluts (PBMC), das Ruhen der aufgetauten PBMC etwa 4 bis etwa 6 Stunden, das Aktivieren der T-Zelle in der ruhenden PBMC mit einem Anti-CD3-Antikörper und einem Anti-CD28-Antikörper, das Transduzieren der aktivierten T-Zelle mit einem viralen Vektor, die Expansion der transduzierten T-Zelle und das Erhalten der expandierten T-Zelle.
Gegenstand 74. Verfahren nach Gegenstand 73, wobei die erhaltenen T-Zellen aus der Gruppe bestehend aus etwa 2- bis 5-fach, etwa 5- bis 10-fach, etwa 5- bis 15-fach, etwa 15- bis 15-fach, etwa 5- bis 20-fach, etwa 5- bis 25-fach, etwa 25- bis 55-fach, etwa 55- bis 50-fach, etwa 50- bis 60-fach, etwa 60- bis 60-fach, etwa 60- bis 100-fach, etwa 65-bis 90-fach, etwa 70- bis 85-fach und etwa 67- bis 88-fach expandiert werden.
Gegenstand 75. Verfahren nach Gegenstand 73, wobei die Größenordnung der Expansion der erhaltenen T-Zellen mit einer Ruhezeit von etwa 4 bis etwa 6 Stunden mindestens etwa das 1,5-fache derjenigen der unter identischen Bedingungen hergestellten erhaltenen T-Zellen mit einer Ruhezeit von etwa 16 bis etwa 20 Stunden beträgt.
Gegenstand 76. Verfahren nach Gegenstand 73, wobei die Anzahl der erhaltenen T-Zellen aus der Gruppe bestehend aus etwa 2 × 10⁹ bis etwa 5 × 10⁹, etwa 5 × 10⁹ bis etwa 10 × 10⁹, etwa 10 × 10⁹ bis etwa 15 × 10⁹, etwa 5 × 10⁹ bis etwa 35 × 10⁹, etwa 5 × 10⁹ bis etwa 30 × 10⁹, etwa 10 × 10⁹ bis etwa 30 × 10⁹, etwa 15 × 10⁹ bis etwa 20 × 10⁹, etwa 20 × 10⁹ bis etwa 35 × 10⁹, etwa 24 × 10⁹ bis etwa 33 × 10⁹ und etwa 24,8 × 10⁹ bis etwa 32,2 × 10⁹ ausgewählt ist.
Gegenstand 77. Verfahren nach Gegenstand 73, wobei die Anzahl der erhaltenen T-Zellen mit einer Ruhezeit von etwa 4 Stunden bis etwa 6 Stunden etwa 1,5 bis etwa 2,0 größer ist als die der unter gleichen Bedingungen hergestellten erhaltenen T-Zellen mit einer Ruhezeit von etwa 16 Stunden bis 20 Stunden.
Gegenstand 78. Verfahren nach einem der Gegenstände 1-38, 43-68 und 70-77, wobei das Auftauen, das Ruhen, die Aktivierung, das Transduzieren, das Expandieren und das Erhalten in einem geschlossenen System durchgeführt werden.
Figurenliste
Für ein weiteres Verständnis des Charakters, der Gegenstände und der Vorteile der vorliegenden Offenbarung sollte Bezug auf die folgende detaillierte Beschreibung genommen werden, die in Zusammenhang mit den folgenden Zeichnungen gelesen wird, während gleiche Referenznummern gleiche Elemente bezeichnen.

1A und 1B zeigen den Verlust vom Phänotyp T_naive/scm und T_cm durch die Verlängerung der ex vivo-Kultivierung von T-Zellen, die von unterschiedlichen Spendern erhalten wurden.
2 zeigt den Rückgang der IFN-γ Sekretion in Zellen, welche nach dem 12. Tag wuchsen, von verschiedenen Spendern.
3 zeigt den Versuchsaufbau, um die Auswirkung von Ruhebedingungen auf die T-Zell-Aktivierung und -Expansion zu testen.
4 zeigt die Expressionsniveaus von CD25, CD69 und hLDL-R in verschiedenen Versuchsgruppen.
5A und 5B zeigen die Größenordnung der Expansion und Lebensfähigkeit der Zellen in verschiedenen Versuchsgruppen jeweils am Tag 7 und Tag 10.
6 zeigt die Größenordnung der Expansion und Lebensfähigkeit von aktivierten T-Zellen, die mit einem viralen Vektor transduziert wurden, in verschiedenen Versuchsgruppen am Tag 9.
7 zeigt die Größenordnung der Expansion und Lebensfähigkeit von aktivierten T-Zellen, die mit einem viralen Vektor transduziert wurden, in verschiedenen Versuchsgruppen am Tag 9.
8 zeigt die Transgenexpression in T-Zellen, welche aus den verschiedenen Ruhezeiten sowie aus der Produktion unterschiedlicher Maßstäbe resultiert.
9 zeigt die Größenordnung der Expansion am Tag 10, welche aus den verschiedenen Ruhezeiten sowie aus der Produktion unterschiedlicher Maßstäbe resultiert.
10 zeigt den Versuchsaufbau, um die Auswirkung der Konzentration von Anti-CD3- und Anti-CD28-Antikörpern auf die T-Zell-Aktivierung zu testen.
11 zeigt die Expression von CD25, CD69 und hLDL-R in T-Zellen, welche durch verschiedene Konzentrationen von Anti-CD3- und Anti-CD28-Antikörpern aktiviert wurden.
12 zeigt, am Tag 10, die Zellanzahl von T-Zellen, welche durch verschiedene Konzentrationen von Anti-CD3- und Anti-CD28-Antikörpern in der Anwesenheit von verschiedenen Konzentrationen von IL-15 aktiviert wurden.
13 zeigt die Tetramerfärbung von rekombinanten TCR-transduzierten T-Zellen, welche durch verschiedene Konzentrationen von Anti-CD3- und Anti-CD28-Antikörpern in der Anwesenheit von verschiedenen Konzentrationen von IL-15 aktiviert wurden.
14A zeigt den Prozentsatz von CD3⁺CD8⁺Tetramer⁺ T-Zellen, der aus der unterschiedlichen Aktivierungsdauer resultiert.
14B zeigt die Transgenexpression, die aus der unterschiedlichen Aktivierungsdauer resultiert.
15 zeigt die Expression von CD25, CD69 und LDL-R in T-Zellen, welche durch die Platte-gebundenen oder Kolben-gebundenen Anti-CD3- und Anti-CD28-Antikörpern aktiviert wurden.
16A zeigt die Niveaus der Transduktion bei Kolben-gebundenen (FB) und Platte-gebundenen (PB) aktivierten T-Zellen.
16B zeigt die Größenordnung der Expansion bei Kolben-gebundenen (FB) und Platte-gebundenen (PB) aktivierten T-Zellen.
17 zeigt Antigen-spezifische IFN-γ-Niveaus, welche durch die Kolben-gebundenen (FB) durch LV-R73 (ein T-Zell-Rezeptor exprimierender lentiviraler Vektor) transduzierten aktivierten T-Zellen und die Platte-gebundenen (PB) aktivierten transduzierten T-Zellen als Reaktion auf tumorassoziierten Antigen (TAA)-exprimierende Tumorzellen in verschiedenen Spendern hervorgerufen wurden.
18 zeigt den Versuchsaufbau, um die Auswirkung der Verwendung von mit Anti-CD3- und Anti-CD28-Antikörpern vorbehandelten Beuteln und Platten auf die T-Zell-Aktivierung zu testen.
19 zeigt die Expression von CD25, CD69 und LDL-R in T-Zellen, welche in Beutel-gebundenen oder Kolben-gebundenen Anti-CD3- und Anti-CD28-Antikörpern aktiviert wurden.
20 zeigt, am Tag 6, die Zellexpansion von T-Zellen, welche durch die Beutel-gebundenen Antikörpern mit verschiedenen Konzentrationen aktiviert wurden, und die Werte von T-Zellen, welche unter FB-Konditionen aktiviert wurden.
21 zeigt, am Tag 10, die Zellexpansion von T-Zellen, welche durch die Beutel-gebundenen Antikörpern mit verschiedenen Konzentrationen aktiviert wurden, und die Werte von T-Zellen, welche unter FB-Konditionen aktiviert wurden.
22 illustriert ein Herstellungsprozess einer T-Zelle gemäß einer Ausführungsform der vorliegenden Offenbarung.
23A illustriert die Größenordnung der Expansion von T-Zellen, welche gemäß einer Ausführungsform der vorliegenden Offenbarung hergestellt wurden.
23B zeigt die Expression von transduziertem TCR von T-Zellen, welche gemäß einer Ausführungsform der vorliegenden Offenbarung hergestellt wurden.
23C zeigt Phänotype von T-Zellen, welche gemäß einer Ausführungsform der vorliegenden Offenbarung hergestellt wurden.
23D zeigt die inhibitorische Aktivität von T-Zellen, welche gemäß einer Ausführungsform der vorliegenden Offenbarung hergestellt wurden, in Bezug auf Tumorzellwachstum.
23E zeigt die inhibitorische Aktivität von T-Zellen, welche gemäß einer anderen Ausführungsform der vorliegenden Offenbarung hergestellt wurden, in Bezug auf Tumorzellwachstum.
23F zeigt die inhibitorische Aktivität von T-Zellen, welche gemäß einer anderen Ausführungsform der vorliegenden Offenbarung hergestellt wurden, in Bezug auf Tumorzellwachstum.
23G zeigt die Tumorzellen tötende Aktivität von T-Zellen, welche gemäß einer anderen Ausführungsform der vorliegenden Offenbarung hergestellt wurden.
23H zeigt die Tumorzellen tötende Aktivität von T-Zellen, welche gemäß einer anderen Ausführungsform der vorliegenden Offenbarung hergestellt wurden.
24 illustriert den Herstellungsprozess von T-Zellen mit der Ruhephase über Nacht (etwa16 Stunden).
25A illustriert die Größenordnung der Expansion von T-Zellen, welche mit einer Ruhephase über Nacht hergestellt wurden (etwa16 Stunden).
25B zeigt die Expression von transduziertem TCR von T-Zellen, welche mit einer Ruhephase über Nacht hergestellt wurden (etwa16 Stunden).
25C zeigt Phänotype von T-Zellen, welche mit einer Ruhephase über Nacht hergestellt wurden (etwa16 Stunden).
25D zeigt die inhibitorische Aktivität von T-Zellen, welche mit einer Ruhephase über Nacht hergestellt wurden (etwa16 Stunden).
25E und 25F zeigen zytotoxische Aktivität von T-Zellen, welche mit einer Ruhephase über Nacht hergestellt wurden (etwa16 Stunden).
26 zeigt das ex vivo-Manipulationsprotokoll in offenen und geschlossenen Systemen.
27 zeigt ein ex vivo-Manipulationsprotokoll im geschlossenen System gemäß einer Ausführungsform der vorliegenden Offenbarung.
28 zeigt ein ex vivo Manipulationsprotokoll im geschlossenen System gemäß einer weiteren Ausführungsform der vorliegenden Offenbarung.
29 zeigt die IFN-γ Freisetzung von T-Zellen, die in offenen und geschlossenen Systemen hergestellt werden.

AUSFÜHRLICHE BESCHREIBUNG
In einem Aspekt umfasst die Offenbarung T-Zellpopulationen, die nach einem Verfahren hergestellt werden, das das Auftauen gefrorener mononuklearer Zellen des peripheren Bluts (PBMC), das Ruhen des aufgetauten PBMC, das Aktivieren der T-Zelle in dem ruhenden PBMC mit einem Anti-CD3-Antikörper und einem auf einer festen Phase immobilisierten Anti-CD28-Antikörper, das Expandieren der aktivierten T-Zelle und das Erhalten der T-Zellpopulation, die die erweiterte T-Zelle umfasst.
In einem Aspekt beinhaltet die Offenbarung Verfahren zur Transduktion einer T-Zelle, einschließlich des Auftauens von gefrorenen mononuklearen Zellen des peripheren Bluts (PBMC), des Ruhens der aufgetauten PBMC, der Aktivierung der T-Zelle in der gezüchteten PBMC mit einem Anti-CD3-Antikörper und einem Anti-CD28-Antikörper, der Transduktion der aktivierten T-Zelle mit einem viralen Vektor, der Expansion der transduzierten T-Zelle und dem Erhalt der erweiterten T-Zellen; Verfahren zur Herstellung einer T-Zellpopulation, einschließlich Auftauen von gefrorenen mononuklearen Zellen des peripheren Bluts (PBMC), Ruhen des aufgetauten PBMC, Aktivieren der T-Zelle in dem ruhenden PBMC mit einem Anti-CD3-Antikörper und einem auf einer festen Phase immobilisierten Anti-CD28-Antikörper, Expandieren der aktivierten T-Zelle und Erhalten der T-Zellpopulation, die die expandierte T-Zelle umfasst; und Verfahren zur Behandlung eines Patienten oder einer Person, die einen Krebs hat oder eine Behandlung derselben benötigt, umfassend das Verabreichen einer wirksamen Menge der hierin beschriebenen expandierten T-Zellen an den Patienten. In einem Aspekt handelt es sich bei dem Patienten oder der Person, welche die Behandlung benötigt, um einen Krebspatienten. In einem Aspekt wird der zu behandelnde Krebs aus einer oder mehreren Erkrankungen ausgewählt: hepatozelluläres Karzinom [HCC - hepatocellular carcinoma], kolorektales Karzinom [CRC - colorectal carcinoma], Glioblastom (GB), Magenkrebs [GC - gastric cancer], Ösophaguskarzinom, nicht-kleinzelliges Lungenkarzinom [NSCLC - non-small cell lung cancer], Pankreaskrebs [PC - pancreatic cancer], Nierenzellkarzinom [RCC - renal cell carcinoma], gutartige Prostatahyperplasie [BPH - benign prostate hyperplasia], Prostatakrebs [PCA - prostate cancer], Eierstockkrebs [OC - ovarian cancer], Melanom, Brustkrebs, chronische lymphozytische Leukämie [CLL - chronic lymphocytic leukemia], Merkelzellkarzinom [MCC - Merkel cell carcinoma], kleinzelliger Lungenkrebs [SCLC - small cell lung cancer], Non-Hodgkin-Lymphom (NHL), akute myeloische Leukämie (AML), Gallenblasenkrebs und Cholangiokarzinom [GBC, CCC - gallbladder cancer, cholangiocarcinoma], Harnblasen-Karzinom [UBC - urinary bladder cancer], akute lymphatische Leukämie [ALL - acute lymphocytic leukemia] und Gebärmutterkrebs [UEC - uterine cancer] ausgewählt.
Die Ziele der T-Zell-basierenden Immuntherapie sind Peptidepitope, die von tumorassoziierten oder tumorspezifischen Proteinen abgeleitet sind, die durch Moleküle des Haupthistokompatibilitätskomplexes (MHC) präsentiert werden. Die Antigene, die von den tumorspezifischen T-Lymphozyten erkannt werden, bzw. deren Epitope, können Moleküle aus sämtlichen Proteinklassen, wie Enzyme, Rezeptoren, Transkriptionsfaktoren, etc. sein, welche exprimiert werden und, im Vergleich zu unveränderten Zellen der gleichen Herkunft, in dem jeweiligen Tumor hochreguliert sind.
Es gibt zwei Klassen von MHC-Molekülen, MHC-Klasse-I und MHC-Klasse-II. MHC Klasse-I-Moleküle bestehen aus einer alpha- schweren Kette und beta-2-Mikroglobulin, MHC Klasse-II-Moleküle bestehen aus einer alpha- und einer beta-Kette. Die dreidimensionale Konformation resultiert in einer Bindungsfurche, welche für die nichtkovalente Wechselwirkung mit Peptiden benutzt wird. MHC-Klasse-I Moleküle können auf den meisten Zellen mit einem Zellkern vorkommen. Sie präsentieren Peptide, die aus einer proteolytischen Spaltung vorwiegend endogener Proteine, defekten ribosomalen Produkten (DRIPs) und größerer Peptide entstehen. Jedoch werden Peptide, die von endosomalen Kompartimenten oder exogenen Quellen abgeleitet sind, häufig auf MHC-Klasse-I-Molekülen gefunden. Dieser nicht-klassische Weg der Klasse-I-Präsentation wird als Kreuzpräsentation bezeichnet. MHC-Kasse-II-Moleküle können vorwiegend auf professionellen Antigen-präsentierenden Zellen (APC) vorkommen und in erster Linie präsentieren Peptide von exogenen oder transmembranen Proteinen, die von den APCs während des Ablaufes der Endozytose aufgenommen und anschließend prozessiert wurden.
Komplexe aus Peptid und MHC-Klasse-I werden von CD8-positiven T-Zellen erkannt, die den adäquaten T-Zellrezeptor (TCR) tragen, wobei Komplexe aus Peptid und MHC-Klasse-II-Molekülen von CD4-positiven T-Helferzellen, die den adäquaten TCR tragen, erkannt werden. Es ist sicher bekannt, dass der TCR, das Peptid und der MHC in einem stöchiometrischen Verhältnis von 1:1:1 vorliegen.
CD4-positive T-Helferzellen spielen eine wichtige Rolle bei der Induzierung und dem Aufrechterhalten von effektiven Antworten durch CD8-positive zytotoxische T-Zellen. Die Identifizierung von CD4-positiven aus tumorassoziierten Antigenen (TAA) abgeleiteten T-Zell-Epitopen ist von großer Bedeutung für die Entwicklung pharmazeutischer Produkte für die Auslösung antitumoraler Immunantworten. An dem Tumor unterstützen T-Helferzellen ein zytotoxisch T-Zellen (CTL)-freundliches Zytokinmilieu und ziehen weitere Effektorzellen an, z. B. CTLs, NK-Zellen, Makrophagen und Granulozyten.
In Abwesenheit einer Entzündung ist die Expression von MHC-Klasse-II-Molekülen hauptsächlich auf Zellen des Immunsystems, besonders auf professionellen Antigen-präsentierenden Zellen (APC), wie zum Beispiel Monozyten, von Monozyten abgeleiteten Zellen, Makrophagen und dendritischen Zellen, begrenzt. Bei Krebspatienten wurde festgestellt, dass Tumorzellen MHC-Klasse-II-Moleküle exprimieren. Verlängerte (längere) Peptide der Beschreibung können als aktive MHC-Klasse-II-Epitope fungieren.
Durch MHC-Klasse-II-Epitope aktiviert T-Helferzellen spielen eine wichtige Rolle beim Steuern der Effektorfunktion der zytotoxischen T-Zellen (CTL) in der antitumoralen Immunität. T-Helferzell-Epitope, die eine T-Helferzellantwort des TH1-Types auslösen, unterstützen die Effektorfunktionen der CD8-positiven Killer-T-Zellen, welche zytotoxische Funktionen gegen Tumorzellen, die tumorassoziierte Peptid/MHC Komplexe auf ihrer Zelloberfläche präsentieren, beinhalten. Auf diese Weise können tumorassoziierte T-Helferzellen Peptid-Epitope für sich allein oder in Kombination mit anderen tumorassoziierten Peptiden, als aktive pharmazeutische Inhaltsstoffe von Impfstoffkompositionen dienen, die antitumorale Immunantworten stimulieren.
Es konnte in Tiermodellen an Säugetieren, z. B. bei Mäusen, gezeigt werden, dass auch in Abwesenheit von zCD8-positive T-Lymphozyten, CD4-positive T-Zellen ausreichend sind, die Manifestation von Tumoren durch Inhibition der Angiogenese durch Sekretion von Interferon-Gamma (IFNγ) zu inhibieren. Es gibt Hinweise auf CD4-positive T-Zellen als direkte Anti-Tumor-Effektoren.
Da die konstitutive Expression von HLA-Klasse-II-Molekülen normalerweise auf Immunzellen beschränkt ist, wurde die Möglichkeit, Klasse-II-Peptide direkt aus primären Tumoren zu isolieren, als unmöglich angesehen. Allerdings konnten Dengjel et al. erfolgreich eine Anzahl von MHC-Klasse-II-Epitopen direkt von Tumoren identifizieren ( WO 2007/028574 , EP 1 760 088 B1 ).
Da beide Arten der Antwort, CD8- und CD4-abhängig, gemeinsam und synergistisch zu dem anti-Tumoreffekt beitragen, ist die Identifizierung und Charakterisierung von tumorassoziierten Antigenen, die entweder durch CD8+ T-Zellen (Ligand: MHC-Klasse-I-Molekül + Peptidepitop) oder durch CD4-positive T-Helferzellen (Ligand: MHC-Klasse-II-Molekül + Peptidepitop) erkannt werden, für die Entwicklung von Tumorvakzinen wichtig.
Damit ein MHC-Klasse-I-Peptid eine zelluläre Immunantwort auslösen (initiieren) kann, muss es auch an ein MHC-Molekül binden. Dieser Vorgang ist vom Allel des MHC-Moleküls und von dem spezifischen Polymorphismus der Aminosäuresequenz des Peptids abhängig. MHC-Klasse-I-bindende Peptide sind in der Regel 8-12 Aminosäurereste lang und enthalten in ihrer Sequenz gewöhnlich zwei konservierte Reste („Anker“), die mit der entsprechenden Bindungsfurche des MHC-Moleküls interagieren. Auf diesem Weg hat jedes MHC-Allel ein „Bindungsmotiv“, welches bestimmt, welche Peptide spezifisch an die Bindungsfurche binden können .
In einer MHC-Klasse-I-abhängigen Immunantwort müssen die Peptide nicht nur in der Lage sein, an spezifische MHC-Klasse-I-Moleküle, die von Tumorzellen exprimiert werden, zu binden, sie müssen anschließend auch noch von T-Zellen, die einen spezifischen T-Zellrezeptor (TCR) tragen, erkannt werden.
Damit die Proteine durch die T-Lymphozyten als tumorspezifisches oder - assoziiertes Antigen erkannt werden, und um somit in einer Therapie eingesetzt werden zu können, müssen bestimmte Voraussetzungen erfüllt sein. Das Antigen soll hauptsächlich von Tumorzellen und nicht oder nur in vergleichsweise geringen Mengen von gesunden Normalgeweben exprimiert werden. In einer bevorzugten Ausführungsform sollte das Peptid im Vergleich zu normalem gesundem Gewebe von Tumorzellen überpräsentiert werden. Weiterhin ist wünschenswert, wenn das betreffende Antigen nicht nur in einer Tumorart, sondern auch in hoher Konzentration vorliegt (z. B. Kopienzahl des entsprechenden Peptids pro Zelle). Tumorspezifische und tumorassoziierte Antigene sind oft aus Proteinen abgeleitet, die direkt, aufgrund ihrer Funktion beispielsweise in der Zellzyklus-Steuerung oder der Suppression der Apoptose, in die Transformation einer normalen Zelle in eine Tumorzelle beteiligt sind. Zusätzlich können nachgeschaltete (downstream) Ziele der Proteine, die direkt für eine Transformation verantwortlich sind, hochreguliert werden und sind somit indirekt tumorassoziiert. Solche indirekt tumorassoziierten Antigene können auch Ziele eines Vakzinierungsansatzes sein. Es ist auch das Vorliegen von Epitopen in der Aminosäuresequenz des Antigens essentiell, damit sichergestellt ist, dass ein solches von einem tumorassoziierten Antigen abgeleitetes Peptid („immunogenes Peptid“) zu einer T-Zellantwort in vitro oder in vivo führt.
TAAs stellen somit ein Ausgangspunkt für die Entwicklung einer T-Zell-basierten Immuntherapie, umfassend aber nicht limitiert auf Tumorvakzinen dar. Die Verfahren zur Identifizierung und Charakterisierung der TAAs beruhen normalerweise zum einen auf dem Einsatz von T-Zellen, die aus Patienten oder gesunden Individuen isoliert werden können, oder basieren auf der Erstellung differentieller Transkriptionsprofile oder differentieller Peptidexpressionsmuster zwischen Tumoren und Normalgeweben. Das Auffinden von Genen, die in Tumorgeweben oder humanen Tumor-Zelllinien überexprimiert sind, oder die in derartigen Geweben oder Zelllinien selektiv exprimiert werden, liefert jedoch keine präzise Information für einen Einsatz der von diesen Genen transkribierten Antigene in einer Immuntherapie. Dies beruht darauf, dass nur eine individuelle Subpopulation der Epitope dieser Antigene für eine solche Anwendung geeignet ist, da eine T-Zelle mit einem entsprechenden TCR vorhanden sein muss und die immunologische Toleranz für dieses bestimmte Epitop muss nicht vorhanden oder minimal sein. In einer sehr bevorzugten Ausführungsform der Beschreibung ist es daher wichtig, nur die über- oder selektiv präsentierten Peptide auszuwählen, gegen die eine funktionelle und/oder eine proliferierende T-Zelle gefunden werden kann. Solch eine funktionelle T-Zelle wird als eine T-Zelle definiert, die bei der Stimulation mit einem spezifischen Antigen klonal expandiert werden kann und in der Lage ist, Effektorfunktionen auszuführen („Effektor-T-Zelle“).
Der im vorliegenden Kontext verwendete Begriff „T-Zell-Rezeptor (TCR)“ bezieht sich auf einen Proteinrezeptor auf T-Zellen, der aus einem Heterodimer einer alpha (α)- und beta (β)-Kette besteht, obwohl der TCR in einigen Zellen aus gamma- und delta (γ/δ)-Ketten besteht. In Ausführungsformen der Offenbarung kann der TCR beispielsweise an jeder Zelle modifiziert werden, die einen TCR umfasst, einschließlich einer T-Helfer-Zelle, einer zytotoxischen T-Zelle, einer T-Gedächtniszelle, einer regulatorischen T-Zelle, einer natürlichen Killer-T-Zelle und einer Gamma-Delta-T-Zelle.
Ein TCR ist ein Molekül, das sich auf der Oberfläche von T-Lymphozyten (oder T-Zellen) befindet und im Allgemeinen für die Erkennung von Antigenen verantwortlich ist, die an Haupthistokompatibilitätskomplexmoleküle (MHC) gebunden sind. Es ist ein Heterodimer, das in 95% der T-Zellen aus einer alpha- und beta-Kette besteht, während 5% der T-Zellen TCRs haben, die aus gamma- und delta-Ketten bestehen. Das Zusammenspiel des TCR mit Antigen und MHC führt durch eine Reihe von biochemischen Ereignissen, die durch assoziierte Enzyme, Co-Rezeptoren und spezielle Hilfsmoleküle vermittelt werden, zur Aktivierung seines T-Lymphozyten . In der Immunologie ist das CD3-Antigen (CD steht für Differenzierungscluster) ein Proteinkomplex, der bei Säugetieren aus vier verschiedenen Ketten (CD3-γ, CD3δ und zweimal CD3ε) besteht, die sich mit Molekülen verbinden, die als T-Zell-Rezeptor (TCR) und ζ-Kette bekannt sind, um ein Aktivierungssignal in T-Lymphozyten zu erzeugen. Der TCR-, die ζ-Kette- und das CD3-Molekül bilden zusammen den TCR-Komplex. Die Ketten CD3-γ, CD35 und CD3ε sind hoch verwandte Zelloberflächenproteine der Immunglobulin-Superfamilie, die eine einzige extrazelluläre Immunglobulindomäne enthalten. Der Transmembranbereich der CD3-Ketten ist negativ geladen, eine Eigenschaft, die es diesen Ketten ermöglicht, sich mit den positiv geladenen TCR-Ketten zu verbinden (TCRα und TCRß). Die intrazellulären Enden der CD3-Moleküle enthalten ein einziges konserviertes Motiv, das als Immunrezeptor-Tyrosinbasiertes Aktivierungsmotiv, kurz ITAM genannt, für die Signalkapazität des TCR unerlässlich ist.
CD28 ist eines der Moleküle, die auf T-Zellen exprimiert werden, die costimulatorische Signale liefern, die für die Aktivierung von T-Zellen erforderlich sind. CD28 ist der Rezeptor für B7.1 (CD80) und B7.2 (CD86). Bei Aktivierung durch Toll-like-Rezeptorliganden wird die B7.1-Expression in antigenpräsentierenden Zellen (APCs) hochreguliert. Die B7.2-Expression auf Antigen-präsentierenden Zellen ist konstitutiv. CD28 ist der einzige B7-Rezeptor, der konstitutiv auf naiven T-Zellen exprimiert wird. Die Stimulation durch CD28 zusätzlich zum TCR kann ein starkes co-stimulatorisches Signal an T-Zellen für die Produktion verschiedener Interleukine (insbesondere IL-2 und IL-6) liefern.
TCR-Konstrukte der vorliegenden Offenbarung können bei Patienten mit Krebs, oder im Verdacht darauf, anwendbar sein, indem sie die Größe eines Tumors reduzieren oder das Wachstum oder das Nachwachsen eines Tumors bei diesen Patienten verhindern. Dementsprechend bezieht sich die vorliegende Offenbarung weiterhin auf ein Verfahren zur Verringerung des Wachstums oder zur Verhinderung der Tumorbildung bei einem Subjekt, indem ein TCR-Konstrukt der vorliegenden Offenbarung in eine isolierte T-Zelle des Subjekts eingeführt und die transformierte T-Zelle in das Subjekt wieder eingeführt wird, wodurch Antitumorreaktionen zur Reduzierung oder Eliminierung von Tumoren bei dem Subjekt bewirkt werden. Zu den geeigneten T-Zellen, die verwendet werden können, gehören zytotoxische Lymphozyten (CTL) oder jede Zelle mit einem T-Zell-Rezeptor, die einer Zersetzung bedarf. Wie einem Fachmann bekannt ist, gibt es verschiedene Verfahren, um diese Zellen aus einem Subjekt zu isolieren. Zum Beispiel durch die Verwendung von Zelloberflächenmarkerexpression oder durch die Verwendung kommerziell erhältlicher Kits (z. B. ISOCELL™ von Pierce, Rockford, III.).
Es ist zu erwarten, dass das TCR-Konstrukt als nackte DNA oder in einem geeigneten Vektor in die eigenen T-Zellen des Probanden eingebracht werden kann. Verfahren zur stabilen Transfektion von T-Zellen durch Elektroporation mit nackter DNA sind in der Technik bekannt. Siehe z.B. US-Patent Nr. 6.410.319 . Nackte DNA bezieht sich im Allgemeinen auf DNA, die eine TCR der vorliegenden Offenbarung kodiert, die in einem Plasmid-Expressionsvektor in der richtigen Orientierung für die Expression enthalten ist. Vorteilhafterweise reduziert die Verwendung von nackter DNA die Zeit, die benötigt wird, um T-Zellen herzustellen, die den TCR der vorliegenden Offenbarung exprimieren.
Alternativ kann ein viraler Vektor (z. B. ein retroviraler Vektor, adenoviraler Vektor, adeno-assoziierter viraler Vektor oder lentiviraler Vektor) verwendet werden, um das TCR-Konstrukt in T-Zellen einzubringen. Geeignete Vektoren zur Verwendung gemäß dem Verfahren der vorliegenden Offenbarung sind in den T-Zellen des Probanden nicht replikationsfähig. Es ist eine große Anzahl von Vektoren bekannt, die auf Viren basieren, wobei die Kopienzahl des in der Zelle gehaltenen Virus niedrig genug ist, um die Lebensfähigkeit der Zelle zu erhalten. Beispiele für Vektoren sind die pFB-Neovektoren (STRATAGENE®) sowie Vektoren auf Basis von HIV, SV40, EBV, HSV oder BPV.
Sobald festgestellt wird, dass die transfizierte oder transduzierte T-Zelle in der Lage ist, das TCR-Konstrukt als Oberflächenmembranprotein mit der gewünschten Regulation und auf einem gewünschten Niveau zu exprimieren, kann bestimmt werden, ob der TCR in der Wirtszelle funktionsfähig ist, um für die gewünschte Signalinduktion zu sorgen. Anschließend werden die transduzierten T-Zellen wieder in den Patienten eingeführt oder ihm verabreicht, um die Antitumorreaktionen im Patienten zu aktivieren.
Um die Verabreichung zu erleichtern, können die transduzierten T-Zellen gemäß der Offenbarung zu einer pharmazeutischen Zusammensetzung oder zu einem für die Verabreichung in vivo geeigneten Implantat mit geeigneten Trägern oder Verdünnungsmitteln verarbeitet werden, die ferner pharmazeutisch akzeptabel sein können. Die Mittel zur Herstellung einer solchen Zusammensetzung oder eines Implantats wurden in der Fachliteratur beschrieben (siehe zum Beispiel Remington's Pharmaceutical Sciences, 16th Ed., Mack, ed. (1980)). Gegebenenfalls können die transduzierten T-Zellen in eine Zubereitung in halbfester oder flüssiger Form, wie beispielsweise einer Kapsel, Lösung, Injektion, Inhalationsmittel oder Aerosol, in der für ihrer jeweiligen Verabreichungsroute üblichen Weise formuliert werden. Mittel, die in der Technik bekannt sind, können verwendet werden, um die Freisetzung und Absorption der Zusammensetzung zu verhindern oder zu minimieren, bis sie das Zielgewebe oder -organ erreicht, oder um eine zeitlich begrenzte Freisetzung der Zusammensetzung zu gewährleisten. Es ist jedoch wünschenswert, dass eine pharmazeutisch akzeptable Form verwendet wird, die die Zellen, die der TCR exprimieren, nicht beeinträchtigt. Somit können die transduzierten T-Zellen wünschenswerterweise zu einer pharmazeutischen Zusammensetzung verarbeitet werden, die eine ausgewogene Salzlösung, vorzugsweise die ausgewogene Salzlösung nach Hanks, oder eine normale Kochsalzlösung enthält.
In bestimmten Aspekten beinhaltet die Erfindung ein Verfahren zur Herstellung und/oder Erweiterung der antigenspezifisch-verlagerten T-Zellen, das die Transfektion von T-Zellen mit einem Expressionsvektor umfasst, der ein DNA-Konstrukt enthält, das TCR kodiert, und dann gegebenenfalls die Stimulation der Zellen mit antigenpositiven Zellen, rekombinantem Antigen oder einem Antikörper gegen den Rezeptor, um die Zellen zur Proliferation zu veranlassen.
In einem weiteren Aspekt wird ein Verfahren zur stabilen Transfektion und Verlagerung von T-Zellen durch Elektroporation oder anderen nicht-viralen Gentransfer (z. B., aber nicht beschränkt auf die Sonoporation) unter Verwendung von nackter DNA bereitgestellt. Die meisten Forscher haben virale Vektoren verwendet, um heterologe Gene in T-Zellen zu übertragen. Durch die Verwendung von nackter DNA kann die Zeit, die für die Herstellung verlagerter T-Zellen benötigt wird, reduziert werden. Als „Nackte DNA“ wird die DNA bezeichnet, welche für einen TCR kodiert, der in einer Expressionskassette oder einem Vektor in der richtigen Ausrichtung für die Expression enthalten ist. Die Elektroporationsverfahren dieser Offenbarung erzeugt stabile Transfektanten, die den TCR exprimieren und auf ihren Oberflächen tragen.
In bestimmten Aspekten sind die T-Zellen primäre menschliche T-Zellen, wie z. B. T-Zellen, die aus mononukleären Zellen des menschlichen peripheren Blutes (PBMC) gewonnen werden, PBMC, die nach Stimulation mit G-CSF, Knochenmark oder Nabelschnurblut entnommen werden. Zu den Bedingungen gehören die Verwendung von mRNA und DNA sowie die Elektroporation. Nach der Transfektion können die Zellen sofort injiziert oder gelagert werden. In bestimmten Aspekten können die Zellen nach der Transfektion für Tage, Wochen oder Monate ex vivo als Massenpopulation innerhalb von etwa 1, 2, 3, 4, 5 Tagen oder mehr nach dem Gentransfer in Zellen vermehrt werden. In einem weiteren Aspekt werden nach der Transfektion die Transfektanten geklont und ein Klon, der das Vorhandensein einer einzelnen integrierten oder episomal erhaltenen Expressionskassette oder eines Plasmids nachweist, und die Expression des TCR wird ex vivo vermehrt. Der für die Expansion ausgewählte Klon zeigt die Fähigkeit, peptidexprimierende Zielzellen spezifisch zu erkennen und zu lysieren. Die rekombinanten T-Zellen können durch Stimulation mit IL-2 oder anderen Zytokinen, die an die gemeinsame gamma-Kette binden (z. B. IL-7, IL-12, IL-15, IL-21 und andere), expandiert werden. Die rekombinanten T-Zellen können durch Stimulation mit künstlichen antigenpräsentierenden Zellen expandiert werden. Die rekombinanten T-Zellen können auf einer künstlichen antigenpräsentierenden Zelle oder mit einem Antikörper, wie z. B. OKT3, der CD3 auf der T-Zelloberfläche vernetzt, expandiert werden. Untergruppen der rekombinanten T-Zellen können auf einer künstlichen antigenpräsentierenden Zelle oder mit einem Antikörper, wie beispielsweise Campath, der CD52 auf der T-Zelloberfläche bindet, deletiert werden. In einem weiteren Aspekt können die genetisch veränderten Zellen kryokonserviert werden.
Eine Zusammensetzung der vorliegenden Erfindung kann in einer Dosierungseinheitsform bereitgestellt werden, wobei jede Dosierungseinheit, z. B. eine Injektion, eine vorbestimmte Menge der Zusammensetzung enthält, allein oder in geeigneter Kombination mit anderen Wirkstoffen. Der im vorliegenden Kontext verwendete Begriff der Dosierungseinheitsform bezieht sich auf physikalisch diskrete Einheiten, die als Einheitsdosierungen für Menschen und Tiere geeignet sind, wobei jede Einheit eine vorbestimmte Menge der Zusammensetzung der vorliegenden Erfindung allein oder in Kombination mit anderen Wirkstoffen enthält, berechnet in einer Menge, die ausreicht, um die gewünschte Wirkung zu erzielen, gegebenenfalls in Verbindung mit einem pharmazeutisch annehmbaren Verdünnungsmittel, Träger oder Trägerstoff. Die Spezifikationen für die neuartigen Dosierungseinheitsformen der vorliegenden Erfindung hängen von der besonderen Pharmakodynamik ab, die mit der pharmazeutischen Zusammensetzung des jeweiligen Subjekts verbunden ist.
Es ist wünschenswert, dass eine wirksame Menge oder eine ausreichende Anzahl der isolierten transduzierten T-Zellen in der Zusammensetzung vorhanden ist und in das Subjekt eingeführt wird, so dass langfristige, spezifische Antitumorreaktionen festgestellt werden, um die Größe eines Tumors zu reduzieren oder das Tumorwachstum oder Neuwachstum zu eliminieren, als es sonst ohne eine solche Behandlung möglich wäre. Wünschenswerterweise verursacht die Menge der wieder in das Subjekt eingebrachten transduzierten T-Zellen eine Verminderung der Tumorgröße um etwa 10%, etwa 20%, etwa 30%, etwa 40%, etwa 50%, etwa 60%, etwa 70%, etwa 80%, etwa 90%, etwa 90%, etwa 95%, etwa 98% oder etwa 99% im Vergleich zu sonst gleichen Bedingungen, bei denen die transduzierten T-Zellen nicht vorhanden sind.
Dementsprechend sollte die Menge der verabreichten transduzierten T-Zellen die Verabreichungsroute berücksichtigen und so bemessen sein, dass eine ausreichende Anzahl der transduzierten T-Zellen eingeführt wird, um das gewünschte therapeutische Ergebnis zu erzielen. Darüber hinaus können die Mengen der einzelnen Wirkstoffe, die in den im vorliegenden Kontext beschriebenen Zusammensetzungen enthalten sind (z. B. die Menge pro jede zu kontaktierender Zelle oder die Menge pro bestimmtes Körpergewicht), je nach Anwendung variieren. Im Allgemeinen sollte die Konzentration der transduzierten T-Zellen vorzugsweise ausreichen, um bei der zu behandelnden Person mindestens etwa 1 × 10⁶ bis etwa 1 × 10⁹ transduzierte T-Zellen/m² (oder kg) eines Patienten, noch bevorzugter, etwa 1 × 10⁷ bis etwa 5×10⁸ transduzierte T-Zellen/m² (oder kg) eines Patienten, obwohl jede geeignete Menge sowohl oberhalb, z. B. mehr als 5× 10⁸ Zellen/m² (oder kg) eines Patienten, oder darunter, z. B. weniger als 1 × 10⁷ Zellen/m² (oder kg) eines Patienten, verwendet werden kann, bereitzustellen. Der Verabreichungsroute kann auf etablierten zellbasierten Therapien basieren (siehe z. B. US-Pat. Nr. 4.690.915 ) oder es kann eine alternative kontinuierliche Infusionsstrategie angewendet werden.
Diese Werte bieten eine allgemeine Orientierungshilfe für den Bereich der transduzierten T-Zellen, die vom Arzt bei der Optimierung des Verfahrens der vorliegenden Erfindung für die Ausführung der Erfindung verwendet werden sollen. Die im vorliegenden Kontext enthaltene Aufzählung solcher Bereiche schließt keineswegs die Verwendung einer höheren oder niedrigeren Menge einer Komponente aus, wie sie in einer bestimmten Anwendung gerechtfertigt sein könnte. So kann beispielsweise die tatsächliche Dosis und der Zeitplan variieren, je nachdem, ob die Zusammensetzungen in Kombination mit anderen pharmazeutischen Zusammensetzungen verabreicht werden, oder je nach interindividuellen Unterschieden in Pharmakokinetik, Arzneimitteldisposition und Stoffwechsel. Ein Fachmann kann jederzeit alle notwendigen Anpassungen an die Erfordernisse der jeweiligen Situation vornehmen.
Die Begriffe „T-Zelle“ oder „T-Lymphozyt“ sind von der Fachwelt anerkannt und sollen Thymozyten, naive T-Lymphozyten, unreife T-Lymphozyten, reife T-Lymphozyten, ruhende T-Lymphozyten oder aktivierte T-Lymphozyten umfassen. Veranschaulichende Populationen von T-Zellen, die für die Verwendung in bestimmten Ausführungsformen geeignet sind, sind unter anderem, aber nicht begrenzt auf, T-Helferzellen (HTL; CD4+ T-Zelle), eine zytotoxische T-Zelle (CTL; CD8+ T-Zelle), CD4+CD8+ T-Zelle, CD4-CD8- T-Zelle oder eine andere Teilmenge von T-Zellen. Andere veranschaulichende Populationen von T-Zellen, die für die Verwendung in bestimmten Ausführungsformen geeignet sind, beinhalten, sind aber nicht beschränkt auf T-Zellen, die einen oder mehrere der folgenden Marker exprimieren: CD3, CD4, CD8, CD27, CD28, CD45RA, CD45RO, CD62L, CD127, CD197 und HLA-DR und können auf Wunsch durch Positiv- oder Negativauswahltechniken weiter isoliert werden.
Eine mononukleare Zelle des peripheren Bluts (PBMC) ist definiert als jede Blutzelle mit einem runden Kern (d. h. ein Lymphozyt, ein Monozyt oder ein Makrophag). Diese Blutzellen sind ein wichtiger Bestandteil des Immunsystems, um Infektionen zu bekämpfen und sich an Eindringlinge anzupassen. Die Lymphozytenpopulation besteht aus CD4+ und CD8+ T-Zellen, B-Zellen und natürlichen Killer-Zellen, CD14+ Monozyten und Basophilen/Neutrophilen/Eosinophilen/dendritischen Zellen. Diese Zellen werden oft vom Vollblut oder von Leukopacks unter FICOLL™, einem hydrophilen Polysaccharid, das Blutschichten trennt, getrennt, wobei Monozyten und Lymphozyten unter einer Plasmaschicht einen „Buffy Coat“ bilden. In einer Ausführungsform bezieht sich der Begriff „PBMCs“ auf eine Population von Zellen, die mindestens T-Zellen und gegebenenfalls NK-Zellen umfasst, und antigenpräsentierende Zellen.
Der Begriff „Aktivierung“ bezieht sich auf den Zustand einer T-Zelle, die ausreichend stimuliert wurde, um eine nachweisbare Zellproliferation zu induzieren. In bestimmten Ausführungsformen kann die Aktivierung auch mit induzierter Zytokinproduktion und nachweisbaren Effektorfunktionen verbunden sein. Der Begriff „aktivierte T-Zellen“ bezieht sich unter anderem auf T-Zellen, die proliferieren. Die über die TCR erzeugten Signale allein reichen nicht aus, um die T-Zelle vollständig zu aktivieren, und es werden auch ein oder mehrere sekundäre oder kostimulatorische Signale benötigt. Somit umfasst die T-Zell-Aktivierung ein primäres Stimulationssignal durch den TCR/CD3-Komplex und ein oder mehrere sekundäre kostimulatorische Signale. Die Kostimulation kann durch Proliferation und/oder Zytokinproduktion von T-Zellen nachgewiesen werden, die ein primäres Aktivierungssignal erhalten haben, wie beispielsweise die Stimulation durch den CD3/TCR-Komplex oder durch CD2.
Wie im vorliegenden Kontext verwendet, bedeutet eine ruhende T-Zelle eine T-Zelle, die sich nicht teilt und keine Zytokine produziert. Die ruhenden T-Zellen sind klein (ca. 6-8 Mikron) im Vergleich zu aktivierten T-Zellen (ca. 12-15 Mikron).
Wie im vorliegenden Kontext verwendet, ist eine geprimte T-Zelle eine ruhende T-Zelle, die zuvor mindestens einmal aktiviert wurde und für mindestens etwa 1 Stunde, mindestens etwa 2 Stunden, mindestens etwa 3 Stunden, mindestens etwa 4 Stunden, mindestens etwa 5 Stunden, mindestens etwa 6 Stunden, mindestens etwa 12 Stunden, mindestens etwa 24 Stunden, mindestens etwa 48 Stunden, mindestens etwa 60 Stunden, mindestens 72 Stunden, mindestens etwa 84 Stunden, mindestens etwa 96 Stunden, mindestens etwa 108 Stunden oder mindestens etwa 120 Stunden aus dem Aktivierungsstimulus entfernt wurde. Alternativ kann die Ruhezeit innerhalb eines Zeitraums von etwa 0,5 Stunden bis etwa 120 Stunden, etwa 0,5 Stunden bis etwa 108 Stunden, etwa 0,5 Stunden bis etwa 96 Stunden, etwa 0,5 Stunden bis etwa 84 Stunden, etwa 0,5 Stunden bis etwa 72 Stunden, etwa 0.5 Stunden bis etwa 60 Stunden, etwa 0,5 Stunden bis etwa 48 Stunden, etwa 0,5 Stunden bis etwa 36 Stunden, etwa 0,5 Stunden bis etwa 24 Stunden, etwa 0,5 Stunden bis etwa 18 Stunden, etwa 0,5 bis etwa 12 Stunden, etwa 0,5 Stunde bis etwa 6 Stunden, etwa 1 bis etwa 6 Stunden, etwa 2 bis etwa 5 Stunden, etwa 3 Stunden bis etwa 5 Stunden, oder etwa 4 Stunden bis etwa 5 Stunden durchgeführt werden. Geprimte T-Zellen haben in der Regel einen Memoryphänotyp.
Beispiele
Beispiel 1
Herstellungsprozess von autologen T-Zellen
Adoptive Zellübertragung von gereinigten naiven (T_n), Stammzellgedächtnis (T_scm) und zentralen Gedächtnis (T_cm) T-Zelluntergruppen verursacht eine überlegene Tumorregression im Vergleich zur Übertragung der stärker differenzierten Effektorspeicher (T_em) und Effektor (T_eff) T-Zellen. Der traditionelle Herstellungsprozess für ein technisches T-Zell-Produkt kann 10-15 Tage dauern. Ein Prozess, der länger als etwa 12 Tage, z. B. 14 Tage dauert, kann jedoch zu einer verminderten Aktivität der Zellen, z. B. zu einer geringeren Anzahl von effektiveren Zellen T_n, T_scm, und T_cm T Zelluntergruppen und noch weniger effektiven T_em und T_eff T Zelluntergruppen führen. 1A zeigt beispielsweise eine Verlängerung der ex-vivo-Kultivierung von T-Zellen, z. B. 14 Tage, von zwei gesunden Spendern, z. B. Spender 6 und Spender 8, bei der die gewünschten T_em T-Zelluntergruppen gegenüber denen, die 0, 6 oder 10 Tage kultivierten wurden, reduziert wurden. Auf der anderen Seite wurden die differenzierteren und weniger persistenten T_em T-Zelluntergruppen gegenüber denjenigen, die 0, 6 oder 10 Tage kultiviert wurden, erhöht. 1B zeigt eine Verlängerung der ex vivo Kultivierung von T-Zellen, z. B. 14 Tage, von drei Patienten, z. B. Patient 864, Patient 453 und Patient 265, bei denen die gewünschten T_em T-Zelluntergruppen gegenüber denen, die 0, 6 oder 10 Tage kultiviert wurden, reduziert wurden. Auf der anderen Seite wurden die differenzierteren und weniger persistenten T_em T-Zelluntergruppen gegenüber denjenigen, die 0, 6 oder 10 Tage kultiviert wurden, erhöht.
Weniger effektivere T_n, T_scm, und T_cm T-Zelluntergruppen können zu weniger effektiv aktivierten T-Zellen führen, die Zytokine ausscheiden, z. B. Interferon-gamma (INF-γ). 2 zeigt eine reduzierte INF-γ-Sekretion durch mononukleare Zellen des peripheren Blutes (PBMC), die von drei gesunden Spendern gewonnen wurden, z. B. Spender 6 (D6), Spender 7 (D7) und Spender 8 (D8), die 15 Tage lang aktiviert und kultiviert wurden, verglichen mit denjenigen, die 10 Tage lang aktiviert und kultiviert wurden.
Um den Herstellungsprozess zu verkürzen, beinhalten die Ausführungsformen der vorliegenden Offenbarung einen etwa 7- bis etwa 10-tägigen Prozess, der zur Herstellung von über 10 Milliarden (10 × 10⁹) Zellen ohne Verlust der Aktivität führt. Darüber hinaus können die Konzentrationen mehrerer Rohstoffe optimiert werden, um die Kosten für die Ware um 30% zu senken.
Einfluss der Eliminierung oder Modifizierung von Ruhebedingungen im Herstellungsprozess von autologen T-Zellen auf die T-Zell-Aktivierung
3 zeigt den verwendeten Versuchsaufbau, um die Auswirkung von Ruhebedingungen auf die T-Zell-Aktivierung und -Expansion zu testen. Zusammenfassend, stellt die Gruppe A eine erste Charge PBMC dar, die am Tag 0 aufgetaut wurden, gefolgt von einer Ruhephase ohne Zytokine über Nacht (O/N), d. h. 24 Stunden, gefolgt von der Aktivierung des ruhenden PBMC mit Anti-CD3- und Anti-CD28-Antikörpern, die auf mit Nicht-Gewebekultur behandelten Platten immobilisiert sind. IL-7 ist ein homöostatisches Zytokin, das das Überleben von T-Zellen fördert, indem es die Apoptose verhindert. IL-7 kann während der Ruhephase zu den PBMC hinzugefügt werden. Die Gruppen B1-B3 stellen eine zweite Charge PBMC dar, die am 1. Tag aufgetaut wurden, gefolgt von einer Ruhephase für 4-6 Stunden in Gegenwart von IL-7 (Gruppe B1) oder in Gegenwart von IL-7 + IL-15 (Gruppe B2) oder ohne Zytokin (Gruppe B3), gefolgt von einer Aktivierung des ruhenden PBMC mit Anti-CD3- und Anti-CD28-Antikörpern, die auf mit Nicht-Gewebekultur behandelten Platten immobilisiert wurden. Gruppe C stellt eine dritte Charge PBMC dar, die am 1. Tag aufgetaut wurde (ohne Ruhephase und ohne Zytokin), gefolgt von der Aktivierung des aufgetauten PBMC mit auf Gewebekulturplatten immobilisierten Anti-CD3- und Anti-CD28-Antikörpern.
CD25 und CD69 sind Aktivierungsmarker auf der Oberfläche von zytokin- oder mitogenaktivierten Lymphozyten. Die Bindung und Einbringung der pseudotypisierten lentiviralen Vektoren des VSV-G, wie z. B. LV-R73, wurde durch Interaktion des VSV-G Hüllproteins mit dem Lipoproteinrezeptor (LDL-R) niedriger Dichte auf den Wirtszellen nachgewiesen. Ruhende T-Zellen exprimieren LDL-R nicht, aber die Aktivierung mit Anti-CD3- und Anti-CD28-Antikörpern induziert die LDL-R-Expression auf T-Zellen und ermöglicht eine effiziente lentivirale Transduktion. Dies deutet darauf hin, dass die Kinetik der LDL-R-Expression, die durch den Grad der Aktivierung reguliert wird, die Transduktionseffizienz mit dem VSV-G lentiviralen Vektor beeinflussen kann.
4 zeigt, dass die Expressionsniveaus CD25, CD69 und hLDL-R zwischen den Gruppen A, B1-B3 und C vergleichbar sind, was darauf hindeutet, dass die Ruhezeit verkürzt werden kann, z. B. von 24 Stunden auf 4-6 Stunden, ohne die Aktivierung der T-Zellen signifikant zu reduzieren
Einfluss der Eliminierung oder Modifizierung von Ruhebedingungen im Herstellungsprozess von autologen T-Zellen auf die T-Zell-Expansion
5A und 5B zeigen, dass die Größenordnung der Expansion und Lebensfähigkeit der Zellen in den Gruppen A und B1-B3 jeweils am Tag 7 und Tag 10 vergleichbar sind. Die Gruppe C, die ohne Ruhephase ist, hat jedoch die geringste Expansion an Tag 7 (5-fach) (5A) und Tag 10 (16-fach) (5B). Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass die Ruhephase verkürzt werden kann, z. B. von 24 Stunden auf 4-6 Stunden, ohne die T-Zell-Expansion signifikant zu reduzieren.
6 und 7 zeigen die Größenordnung der Expansion und Lebensfähigkeit von aktivierten T-Zellen, die mit einem viralen Vektor, der TCR exprimiert, z. B. LV-R73, in 2 Spendern, d. h. Spender 1 (6) oder Spender 2 (7), in den Gruppen A, B1-B3 und C am Tag 9 transduziert wurden. Die Gruppen B1 und B2 zeigen eine bessere Zellexpansion als die Gruppen A, B3 und C, was darauf hindeutet, dass eine kurze Ruhezeit, z. B. 5 Stunden, in Gegenwart von Zytokinen, z. B. IL-7 oder IL-7 + IL-15, die Expansion von transduzierten T-Zellen erhöhen kann. Rep1 und Rep2 stellen 2 Wiederholungsdurchläufe dar. Diese Ergebnisse untermauern die Verwendung einer verkürzten Ruhephase, z. B. von 24 Stunden auf 4-6 Stunden, bei dem Herstellungsprozess von autologen T-Zellen in Gegenwart von Zytokinen, z. B. IL-7 und/oder IL-15, ohne die T-Zell-Expansion signifikant zu reduzieren.
Einfluss der Eliminierung oder Modifizierung von Ruhebedingungen im Herstellungsprozess von autologen T-Zellen auf die Transgenexpression in T-Zellen
Unter Verwendung von mit Peptid/MHC-Komplex beladenen Tetrameren zum Nachweis von T-Zellen, die transduzierten TCR exprimieren, das spezifisch an den Peptid/MHC-Komplex bindet, zeigt 8 eine vergleichbare transgene Expression, z. B. rekombinante TCR-Expression, in T-Zellen, die 4 Stunden (mit IL-7) und 24 Stunden (ohne Zytokin) in einem T75-Gewebekulturkolben oder 4 Stunden (mit IL-7) in G-Rex 100-Kolben in einem großtechnischen Produktionslauf für Spender 13, Spender 14 und Spender 16 ruhen. Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass die Ruhezeit, z. B. von 24 Stunden auf 4-6 Stunden in einem Scale-up-Herstellungsprozess verkürzt werden kann, ohne die Transgenexpression in transduzierten T-Zellen signifikant zu reduzieren. Darüber hinaus kann die Verwendung eines G-Rex 100 Kolbens den Ruheprozess weiter vereinfachen, indem er mehrere T75 Kolben ersetzt.
9 zeigt eine vergleichbare Größenordnung der Expansion am Tag 10 in T-Zellen, die 4-6 Stunden, 6 Stunden oder 24 Stunden in kleinem oder großtechnischen Produktionslauf für Spender 13, Spender 14 und Spender 16 ruhen. Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass die Ruhezeit in einem Scale-up-Fertigungsprozess verkürzt werden kann, z. B. von 24 Stunden auf 4-6 Stunden, ohne die Expansion der transduzierten T-Zellen signifikant zu beeinträchtigen.
Einfluss der Konzentration von Anti-CD3- und Anti-CD28-Antikörpern im Herstellungsprozess von autologen T-Zellen auf die T-Zell-Aktivierung
Die Aktivierung ist ein kritischer Schritt im Herstellungsprozess von autologen T-Zellen, da sowohl die Transduktionseffizienz als auch die Expansionsrate von der Aktivierung der T-Zellen abhängen. Die Stimulation von T-Zellen durch den Einsatz eines CD3-Rezeptors und eines Co-Rezeptors, wie beispielsweise CD28, mit Antikörpern ist ein gängiges Verfahren zur Aktivierung von T-Zellen. Die Aktivierung der T-Zellen dient als vorbereitender Schritt für die Transduktion mit viralen Vektoren, wie beispielsweise dem lentiviralen Vektor.
10 zeigt den verwendeten Versuchsaufbau, um die Auswirkung der Konzentration von Anti-CD3- und Anti-CD28-Antikörpern auf die T-Zell-Aktivierung zu testen. Zusammenfassend, am Tag 0, wurden PBMC aufgetaut und kultiviert oder ohne Aktivierung durch Zytokine über Nacht oder 24 Stunden ruhen gelassen. Am ersten Tag wurden die ruhenden PBMCs durch Inkubation in zwei 24-Well-Platten aktiviert, die mit unterschiedlichen Konzentrationen beschichtet waren, z. B. 0,1 µg/ml, 0,25 µg/ml, 0,5 µg/ml, 1,0 µg/ml, Anti-CD3- und Anti-CD28-Antikörper in Gegenwart von IL-7 + IL-15. Am 2. Tag wurden die aktivierten T-Zellen auf CD25-, CD69- und hLDL-R-Expression analysiert und mit VSV-G pseudotypisierten lentiviralen Vektoren, z. B. 1xEng LV-R73, transduziert. An den Tagen 6/7 und 9 wurden Analysen wie Zellzahlbestimmung, Lebensfähigkeit und fluoreszenzaktivierte Zellsortierung (FACS) mit Dextrameren (Dex) durchgeführt, bei denen es sich um Multimere handelt, die auf einem Dextran-Grundgerüst mit mehreren Fluoreszein- und Peptid/MHC-Komplexen zum Nachweis von T-Zellen, die rekombinante TCR exprimieren, basieren.
11 zeigt - vor der viralen Transduktion - dass T-Zellen, die mit 0,5 µg/ml und 1,0 µg/ml Anti-CD3- und Anti-CD28-Antikörpern aktiviert wurden, vergleichbare Mengen an CD25-, CD69- und hLDL-R-Expression bei jedem Spender 16 und Spender 14 aufweisen. Diese Expressionsniveaus sind jedoch signifikant höher als die von T-Zellen, die mit niedrigeren Konzentrationen, z. B. 0,1 µg/ml und 0,25 µg/ml, von Anti-CD3- und Anti-CD28-Antikörpern aktiviert wurden. Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass die Konzentration von Anti-CD3- und Anti-CD28-Antikörpern reduziert werden kann, z. B. von 1,0 µg/ml auf 0,5 µg/ml, ohne die Aktivierung der T-Zellen signifikant zu reduzieren.
Einfluss der Konzentration von Anti-CD3- und Anti-CD28-Antikörpern und Zytokinen im Herstellungsprozess von autologen T-Zellen auf die T-Zell-Expansion
12 zeigt am Tag 10, dass die Zellzahlen von T-Zellen, die durch 0,5 µg/ml oder 1,0 µg/ml von Anti-CD3- und Anti-CD28-Antikörpern in Gegenwart verschiedener Konzentrationen aktiviert wurden, z. B. 25 ng/ml, 50 ng/ml oder 100 ng/ml von IL-15, bei jedem Spender 16, Spender 13 und Spender 14 vergleichbar sind. Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass die Konzentration von Anti-CD3- und Anti-CD28-Antikörpern reduziert werden kann, z. B. von 1,0 µg/ml auf 0,5 µg/ml, und die Konzentration von IL-15 kann reduziert werden, z. B. von 100 ng/ml auf 25 ng/ml, ohne die T-Zell-Expansion signifikant zu reduzieren.
13 zeigt eine Tetramerfärbung von rekombinanten TCR-transduzierten T-Zellen, die durch 0,5 µg/ml oder 1,0 µg/ml von Anti-CD3- und Anti-CD28-Antikörpern in Gegenwart verschiedener Konzentrationen aktiviert wurden, z. B. 25 ng/ml, 50 ng/ml oder 100 ng/ml IL-15 bei jedem Spender 16, Spender 13 und Spender 14 vergleichbar sind. Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass die Konzentration von Anti-CD3- und Anti-CD28-Antikörpern reduziert werden kann, z. B. von 1,0 µg/ml auf 0,5 µg/ml, und die Konzentration von IL-15 reduziert werden kann, z. B. von 100 ng/ml auf 25 ng/ml, ohne die Virustransduktion von T-Zellen signifikant zu reduzieren.
Zusammengenommen deuten diese Ergebnisse darauf hin, dass (1) die Ruhezeit nach dem Auftauen von PBMC verkürzt werden kann, z. B. von 24 Stunden auf 4-6 Stunden, ohne die T-Zell-Aktivierung, die Transgenexpression und die T-Zell-Expansion signifikant zu reduzieren; und (2) die Konzentrationen von Anti-CD3- und Anti-CD28-Antikörpern reduziert werden können, z. B. von 1,0 µg/ml auf 0,5 µg/ml, und die Konzentrationen von Zytokinen können reduziert werden, wie z. B. IL-15, z. B. von 100 ng/ml auf 25 ng/ml, ohne die T-Zell-Aktivierung, die Transgenexpression und die T-Zell-Expansion signifikant zu reduzieren.
Einfluss der Aktivierungsdauer im Herstellungsprozess von autologen T-Zellen auf die Transduktionseffizienz mit lentiviralem Vektor
Eines der Hauptziele bei der Entwicklung eines Herstellungsprozesses von autologen T-Zellen ist die Verbesserung der Transduktionsrate, die in primären menschlichen T-Zellen mit dem lentiviralen Konstrukt, das TCR kodiert, erreicht wird. Im Gegensatz zu Gamma-Retroviren, die nur teilende Zellen transduzieren können, können Lentiviren theoretisch sowohl sich teilende als auch sich nicht teilende Zellen transduzieren. Die Transduzierung von ruhenden T-Zellen mit Lentiviren hat jedoch zu schlechten Transduktionsleistungen geführt. Die Aktivierung von T-Zellen erleichtert nachweislich deren Transduktion mit einem Lentivirus. So ist die Stimulation von T-Zellen mit Anti-CD3- und Anti-CD28-Antikörpern in immobilisierter, Bead- oder löslicher Form zu einer Voraussetzung für die Durchführung lentiviraler Transduktionen geworden und gehört zum Standard bei der Herstellung gentechnisch veränderter T-Zellen für die adoptive Zelltherapie.
Da der T-Zell-Aktivierungsschritt eine entscheidende Rolle bei der Vorbereitung von T-Zellen für die Transduktion spielt, muss die effektive Aktivierungsdauer mit Anti-CD3- und Anti-CD28-Antikörpern möglicherweise optimiert werden.
Um die optimale Aktivierungsdauer zu bestimmen, wurde eine Zeitverlaufsstudie durchgeführt, die den Einfluss verschiedener Aktivierungsdauer auf die Transduktionseffizienz untersucht. Die Ergebnisse zeigen, dass das optimale Fenster für die Transduktion von T-Zellen nach 16-24h der Aktivierung mit Anti-CD3- und Anti-CD28-Antikörpern sein kann. So kann die Zeit für die T-Zell-Aktivierung vor der Transduktion von 48h auf 16-24h für alle weiteren Prozessentwicklungen und die klinische Fertigung reduziert werden.
In einer weiteren Ausführungsform der vorliegenden Offenbarung kann für frische PBMC, d. h. nicht gefrorene, keine Ruhepause erforderlich sein. So können frische PBMC, ohne zu ruhen, durch Anti-CD3-Antikörper und Anti-CD28-Antikörper aktiviert werden, gefolgt von einer viralen Vektortransduktion, um transduzierte T-Zellen zu erhalten.
Obwohl Verfahren zur Transduktion von T-Zellen sequentielle Schritte der Aktivierung von T-Zellen in Gewebekultur beinhalten können, gefolgt von der Übertragung der aktivierten T-Zellen in verschiedene Gewebekulturen, bei denen die Transduktion von aktivierten T-Zellen mit viralen Vektoren stattfindet, können Aktivierungs- und Transduktionsschritte jedoch gleichzeitig durchgeführt werden. Während beispielsweise T-Zellen durch Anti-CD3- und Anti-CD28-Antikörper aktiviert werden, können transduzierende aktivierte T-Zellen gleichzeitig in derselben Kultur durchgeführt werden. Dadurch kann der gesamte T-Zell-Transduzierungsprozess, d. h. von der Bereitstellung von PBMC bis zur Gewinnung von transduzierten T-Zellen, auf beispielsweise 3-4 Tage verkürzt werden.
Beispiel 2
Bestimmung der optimalen Dauer der T-Zell-Aktivierung zur Verbesserung der Transduktionseffizienz mit lentiviralem Konstrukt

PBMC von gesunden Spendern wurde mit Anti-CD3- und Anti-CD28-Antikörpern für verschiedene Zeitintervalle zur Vorbereitung der Transduktion aktiviert. Aktivierte T-Zellen aus PBMC wurden mit konzentrierten Überständen behandelt, die unter Verwendung verschiedener lentiviraler Konstrukte erzeugt wurden, die TAA-exprimierend auf R7P1 D5 TCR gerichtet sind. Transduzierte Zellen wurden in der Anwesenheit von IL-7 und IL-15 expandiert. Die Produkte wurden auf der Grundlage der Transgenexpression vom R7P1 D5 TCR verglichen, die durch Durchflusszytometrie mit spezifischem Dextramer/Tetramer bestimmt wurde. Repräsentative Materialien und Methoden

Verbrauchsmaterial	Hersteller	Katalognr.
TexMACS media	Miltenyi Biotec	130-097-196
Menschliches AB-Serum	Gemini	100-512
PBS/EDTA	Lonza	BE02-017F
IL-7	Peprotech	200-07
IL-15	Peprotech	200-15
Anti-CD3-Antikörper	Ebioscience	16-0037-85
Anti-CD28-Antikörper	Ebioscience	16-0289-85
24-Well-Nicht-GewebeKulturplatten	Co-star	3738
G-Rex 24-Well-Platte	Wilson Wolf	80192M
Konisches 15 ml-Röhrchen	Falcon	352097
Konische 50 ml-Röhrchen	Corning	430290
Serologische Pipette 5 ml	BD	53300-421
Serologische Pipette 10 ml	BD	53300-523
Serologische Pipette 25 ml	BD	53300-567
Pipettenspitzen1000 ul	Rainin	17007954
Pipettenspitzen200 ul	Rainin	17007961
Pipettenspitzen 20 µl	Rainin	17007957
Mikrozentrifugenröhrchen 1,5 ml	Fisher	02-681-5
Färbungslösung AOPI	Nexcelom	CS2-0106
PBS ohne Mg und Ca	Lonza	17-516F/24
96-Well-Platte	Corning	3799
P-20 Micropipettor	Rainin	17014382
P-200 Micropipettor	Rainin	17014391
P-1000 Micropipettor	Rainin	17017382
Pipettierhilfe	Drummond	193970L
Kolben T75	BD Falcon	BD353136
Kolben T25	Corning	430372
Benzonase	Sigma	E1014
Protaminsulfat	McKesson	804514
Lentivirus	Lentigen	LV-R73, R78, R72, R22
Lebend/tot-Farbstoff in wässriger Lösung	Thermo Fisher	L-34966
ABC Comp Beads	Thermo Fisher	A10497
CD3-BV421	BD	562426
CD8-APC	Biolegend	301014
TAA Tetramer-PE	Immatics	N/A

Repräsentative Verfahren
Um die unterschiedlichen Laufzeiten der T-Zell-Aktivierung zu vergleichen, wurden die im vorliegenden Kontext beschriebenen repräsentativen Experimente nach einem standardisierten T-Zell-Erzeugungsprozess in kleinem Maßstab durchgeführt, der beispielsweise 4 Schritte umfasst: Auftauen/Ruhen, Aktivierung, Transduktion und Expansion.
Auftauen und Ruhen
Gefrorenes PBMC von gesunden Spendern (n=3, D3, D4, D9) wurde im warmen TexMACS-Medium, ergänzt mit 5% humanem AB-Serum, aufgetaut. Die Zellen wurden 15 Minuten lang bei 37°C mit Benzonase-Nuklease (50U/ml) behandelt, gewaschen, gezählt und im kompletten TexMACS-Medium über Nacht ruhen gelassen.
Aktivierung
An einem Tag, an dem die Zellen aufgetaut wurden, wurden 24-Well-Nicht-Gewebe-Kulturplatten mit Anti-CD3- und Anti-CD28-Antikörpern beschichtet, die in PBS (1 µg/ml) verdünnt waren, versiegelt und über Nacht bei 4°C inkubiert. Am nächsten Tag wurden ruhende PBMCs in der Konzentration von 1 × 10⁶/ml geerntet, gezählt, gewaschen und resuspendiert. Die Antikörperlösung wurde abgesaugt und die Wells wurden mit komplettem Medium gewaschen, gefolgt von der Zugabe von 2 × 10⁶ Zellen zu jedem Well. Die Aktivierung erfolgte bei 37°C für die angegebenen Zeitintervalle.
Transduktion
Aktivierte T-Zellen wurden geerntet, gewaschen und gezählt. Transduktionsgemische mit konzentrierten Virusüberständen, Protaminsulfat (10 µg/ml), IL-7 (10 ng/ml) und IL-15 (100 ng/ml) wurden hergestellt. Für jede Transduktion wurden 1,0 × 10⁶ Zellen in ein steriles Mikrozentrifugenröhrchen aufgeteilt und 5 Minuten lang bei 400 × g zentrifugiert. Jedes Zellpellet wurde in 0,5 ml des Transduktionsgemisches, das einem bestimmten MOI entspricht, resuspendiert. Die Zellsuspension wurde in ein entsprechend beschriftetes Well aus einer 24-Well G-Rex-Platte eingebracht. Nach 24 Stunden Inkubation bei 37°C und 5% CO₂ wurden 1,5 ml Medium, ergänzt durch IL-7 (10 ng/ml) und IL-15 (100 ng/ml), in jedes Well gegeben. Sechsundneunzig Stunden nach der Transduktion wurde die Transgenexpression durch die Durchflusszytometrie bestimmt. Multimere MHC-Peptidkomplexe (Dextramer oder Tetramer) wurden verwendet, um die Oberflächenexpression von transgenem TCR mittels FACS zu überwachen.
Durchflusszytometrie
In Kürze wurden 1,0 × 10⁶ Zellen, die bei gegebener lentiviraler Mehrfachinfektion (Multiplicity of Infection, MOI) transduziert wurden, gemäß den Arbeitsanweisungen gefärbt. Für die Tetramerfärbung wurden die Zellen mit 1 µl TAA-Tetramer in 50 µl Flow-Puffer für 15 Minuten bei RT im Dunkeln inkubiert. Nach der Tetramerfärbung erfolgte die Färbung mit Antikörpern gegen T-Zellen-Oberflächenmarker (z. B. CD3, CD4, CD8 etc.). Die Proben wurden mit einer Autokompensationsmatrix aufgenommen, die von Kompensations-Beads abgeleitet wurde.
Ergebnisse
PBMC, die von 2 Spendern (D3 und D4) erhalten wurde, wurde für 16, 24 und 48 Stunden mit plattengebundenen Anti-CD3- und CD28-Antikörpern aktiviert. Die Zellen wurden mit 3 verschiedenen lentiviralen Konstrukten (R72, R21 und R22) transduziert.
14A zeigt % CD3⁺CD8⁺Tetramer⁺ T-Zellen, die mit zunehmender Dauer der Aktivierung in der Reihenfolge von 16h > 24h > 48h graduell zurückgehen. Diese Reihenfolge wurde sowohl bei den getesteten Konstrukten als auch bei den Spendern konsistent beobachtet.
Eine Zeitverlaufsstudie wurde durchgeführt, um die optimale Aktivierungsdauer für die virale Transduktion zu bestimmen, die zu einer hohen Transgenexpression führen kann. PBMC von einem Spender (D9) wurde mit plattengebundenen Anti-CD3- und Anti-CD28-Antikörpern für die angegebene Aktivierungsdauer, z. B. von 0 bis 48 Stunden, aktiviert und mit jeweils zwei verschiedenen lentiviralen Konstrukten, die R7P1D5 TCR kodieren, d. h. LV-R73 und LV-R78, transduziert.
14B zeigt, dass die Transgenexpression in Zellen, die für 16-20 Stunden aktiviert wurden, am höchsten ist. Die Ergebnisse stellen das Niveau der Transgenexpression dar, gemessen als % CD3⁺CD8⁺Tetramer⁺ T-Zellen mittels Durchflusszytometrie 96 Stunden nach der Transduktion. Das Zeitfenster für die optimale Aktivierung wurde auf etwa 16 bis etwa 20 Stunden festgelegt und kann auf das Maximum von 24 Stunden verlängert werden, um die Flexibilität für die GMP-Produktion zu erhöhen.
Insgesamt können diese Ergebnisse eine der Ursachen für niedrige Transduktionsraten erklären, die bei 48 Stunden aktivierten T-Zellen beobachtet wurden, und zeigen, dass eine kürzere Aktivierung für 16 bis 24 Stunden optimal für die Durchführung einer lentiviralen Transduktion sein kann. Obwohl eine robuste Expansion, die durch die 48-Stunden-Aktivierung erreicht wird, durch die Begrenzung der Aktivierungszeit auf 16 bis 24 Stunden beeinflusst werden kann, kann diese Änderung als sehr vorteilhaft für das Produkt angesehen und für die gesamte weitere Prozessentwicklung und in die klinische Fertigung umgesetzt werden.
Beispiel 3
Wie alle Bioprozesse ist auch die Skalierung der T-Zell-Herstellung ein anspruchsvoller Teil der Prozessentwicklung. Die Aufrechterhaltung der Funktion und Qualität der T-Zellen zur Erhaltung der Produktwirksamkeit ist von größter Bedeutung in allen Phasen des Scale-up. Für den Herstellungsprozess der autologen T-Zellen identifizierten die jetzigen Erfinder die kritischen Schritte und unterteilten das Scale-Up in zwei Teile: Das Scale-Up der Aktivierung kann auf einer Nicht-Gewebekulturoberfläche durchgeführt werden und das Scale-up der Transduktion und Expansion kann in einem G-Rex-Gerät durchgeführt werden.
Obwohl Beads oder lösliche Antikörper einfachere Methoden zur Aktivierung von leicht skalierbaren Zellen darstellen, erbrachten Herstellungsverfahren der autologen T-Zellen, die immobilisierte Antikörper auf einer Nicht-Gewebekulturoberfläche (24-Well-Platte) zur Aktivierung verwenden, die besten Transduktions- und Expansionsraten mit dem Lentivirus. Die Gewinnung aktivierter Zellen aus mehreren mit Antikörper beschichteten 24-Well-Nicht-Gewebekulturplatten stellte jedoch einen mühsamen, zeitaufwändigen Schritt dar, der einen ansonsten einfachen Prozess noch komplexer machte. Betrachtet man beispielsweise die Aktivierung von bis zu 1 × 10⁹ PBMC, so können etwa 20 Platten und 480 Manipulationen erforderlich sein, um aktivierte Zellen in jedem Fertigungslauf zu gewinnen.
Herkömmliche Verfahren zur Aktivierung von T-Zellen können ein offenes System und einen arbeitsintensiven Prozess beinhalten, bei dem entweder kommerziell erhältliche Beads oder vorbehandelte, mit Anti-CD3- und Anti-CD28-Antikörpern („plattengebunden“) in einer Konzentration von jeweils 1 ug/ml beschichtete 24- oder 6-Well-Nicht-Gewebekulturplatten verwendet werden. Verfahren mit offenem System können jedoch relativ lange Zeit in Anspruch nehmen, z. B. etwa 8 Stunden. Um das offene System und den arbeitsintensiven Prozess zu vereinfachen, können Ausführungsformen der vorliegenden Offenbarung einen einfachen Prozess beinhalten, der an ein geschlossenes System angepasst werden kann, das mit Behältern, z. B. Beuteln, eines handelsüblichen geschlossenen Systems, z. B. G-Rex™-System und Xuri™-Zellerweiterungssystem, kombiniert werden kann, was zu einem vergleichbaren T-Zellen-Aktivierungsprofil, der Transduzierbarkeit von T-Zellen und der Funktionalität des Endprodukts mit der von T-Zellen führt, die mit den herkömmlichen Verfahren aktiviert werden. Darüber hinaus können Verfahren der vorliegenden Offenbarung, z. B. das kolbengebundene Verfahren, eine relativ kurze Zeit, z. B. etwa 1 Stunde, in Anspruch nehmen, was etwa 8 mal schneller ist als die herkömmlichen Verfahren.
Optimierungen für die Entwicklung des Herstellungsprozesses für autologe T-Zellen wurden in kleinem Maßstab mit 24-Well Nicht-Gewebe-Kulturplatten zur Aktivierung und 24-Well G-Rex-Platten zur Transduktion und Expansion durchgeführt. In dieser Größenordnung wurden 1-2 Millionen T-Zellen, die am zweiten Tag transduziert wurden, bis zum 10. Tag von einer 30-fachen auf eine 40-fache Expansion umgestellt, um zum Zeitpunkt der Ernte 30-80 Millionen Zellen zu erhalten. Das Ziel des endgültigen Prozesses kann jedoch sein, 250-400 Millionen aktivierte Zellen zu transduzieren und auf über 10 Milliarden lebensfähige CD3+ T-Zellen zu erweitern, wobei der Herstellungszeitraum von 10 Tagen eingehalten wird. Daher wird im vorliegenden Kontext in einem Aspekt die Skalierung des gesamten Prozesses bereitgestellt.
Für Ausführungsformen der vorliegenden Offenbarung, einschließlich Verfahren zur Aktivierung einer größeren Anzahl von Zellen, bieten die mit Nicht-Gewebekultur behandelten T175cm²-Kolben eine größere Oberfläche und eine einfachere Plattform, die nur sehr wenige Manipulationen erfordert. Nach der Optimierung führte der Einsatz von kolbengebundenen Antikörpern zur Aktivierung von T-Zellen zu einer Expansion und Transduktion, die mit plattengebundenen Antikörpern vergleichbar ist. So war die Skalierung des Aktivierungsschritts eine wichtige Entwicklung zur Vereinfachung des Herstellungsprozesses von autologen T-Zellen für die klinische Fertigung. Basierend auf größeren Zellzahlen wurden Transduktion und Expansion von der G-Rex-24 Well-Platte auf G-Rex 100 hochskaliert. Die Verwendung von G-Rex-Geräten kann eine nahezu lineare Skalierung der Schritte nach der Aktivierung ermöglichen, insbesondere in Bezug auf die Saatdichte. Andere Parameter, wie die Anzahl der Nährmedienzuführungen und Aufteilung, können standardisiert werden, um maximale Expansionsraten und Lebensfähigkeit zu erreichen. Die Validierung des gesamten Scale-Up-Prozesses in Full-Scale PD-Läufen stellt einen erfolgreichen Technologietransfer des IMA201-Prozesses in GMP sicher.
Plattengebundene im Vergleich zu kolbengebundenen Systemen
Die Aktivierung der T-Zellen, gefolgt von Transduktion und Expansion, sind kritische Schritte der T-Zellherstellung. Um die Bedingungen für die Skalierung dieser Schritte zu optimieren, stellte die Verwendung von T175cm²-Kolben eine geeignete Plattform für die Aktivierung mit größerer Oberfläche und weniger Manipulationen dar, um 24-well-Platten zu ersetzen, die mit Anti-CD3- und Anti-CD28-Antikörpern beschichtet sind. In einer Vergleichsstudie nach der Optimierung kritischer Parameter in T175cm²-Kolben zeigten Zellen, die mit Antikörpern aktiviert wurden, die auf einem Kolben beschichtet waren (kolbengebunden), vergleichbare Werte für Aktivierung, Transduktion und Expansion zu Zellen, die mit Antikörpern aktiviert wurden, die auf 24-Well-Platten (plattengebunden) in mehreren Spendern beschichtet waren.
Weiterhin wurden die Transduktions- und Expansionsschritte von kleinem Maßstab (G-Rex-24 Well Platte) über mittleren Maßstab (2-6 G-Rex10 oder 1 G-Rex100) bis zum Vollmaßstab (5-8 G-Rex100) skaliert. Der gesamte Scale-up-Prozess kann in 2 Läufen in vollem Maßstab der Prozessentwicklung (PD) validiert werden. Alle Produkte, die im finalen Prozess hergestellt wurden, bestanden die klinischen Freigabekriterien in Form von %Dex⁺ CD3⁺CD8⁺ Zellen und erzeugten Zellzahlen, die ausreichen, um die klinischen Dosen zu erfüllen.
Vergleich zwischen T-Zellen, die durch das plattengebundene Verfahren und das kolbengebundene Verfahren aktiviert wurden (ein mit Nicht-Gewebekultur behandelter Kolben wird mit Anti-CD3- und Anti-CD28-Antikörpern beschichtet), in Bezug auf Aktivierungsgrad (Durchflusszytometrie), Transduzibilität (Dextramer-Färbung, FACS), Expansion (Zellzahlen) und Funktionalität (IFN-y ELISA).
PBMC von gesunden Spendern wurde mit Anti-CD3- und Anti-CD28-Antikörpern unter Verwendung von Nicht- Gewebekultur behandelten T175cm²-Kolben oder 24-Well-Platten zur Vorbereitung der Transduktion aktiviert. Aktivierte T-Zellen wurden mit einem lentiviralen Konstrukt, das für R7P1 D5 TCR kodiert, transduziert und in G-Rex 24-Well-Platten oder G-Rex10/G-Rex100-Kolben gesät. Transduzierte T-Zellen wurden in der Anwesenheit von IL-7 und IL-15 expandiert und am 10. Tag des Prozesses geerntet. In-Prozess- und Endkontrolle wurden an den Produkten durchgeführt, um Zellzahlen, Lebensfähigkeit und Prozentsatz der transduzierten CD8+ T-Zellen zu bestimmen.

Repräsentative Materialien und Methoden

Verbrauchsmaterial	Hersteller	Katalognr.
TexMACS media	Miltenyi Biotec	130-097-196
Menschliches AB-Serum	Gemini	100-512
IL-7	Peprotech	200-07
IL-15	Peprotech	200-15
Anti-CD3-Antikörper	Ebioscience	16-0037-85
Anti-CD28-Antikörper	Ebioscience	16-0289-85
24-Well-Nicht-Gewebe-Kulturplatten	Co-star	3738
T175cm² Nicht-Gewebe-Kulturplatten	Corning	431466
G-Rex 24-Well-Platte	Wilson Wolf	80192M
G-Rex10	Wilson Wolf	80040S
G-Rex100	Wilson Wolf	80500S
Konisches 15 ml-Röhrchen	Falcon	352097
Konische 50 ml-Röhrchen	Corning	430290
Serologische Pipette 5 ml	BD	53300-421
Serologische Pipette 10 ml	BD	53300-523
Serologische Pipette 25 ml	BD	53300-567
Pipettenspitzen1000 ul	Rainin	17007954
Pipettenspitzen200 ul	Rainin	17007961
Pipettenspitzen 20 µι	Rainin	17007957
Mikrozentrifugenröhrchen 1,5 ml	Fisher	02-681-5
Färbungslösung AOPI	Nexcelom	CS2-0106
PBS ohne Mg und Ca	Lonza	17-516F/24
96-Well-Platte	Corning	3799
P-20 Micropipettor	Rainin	17014382
P-200 Micropipettor	Rainin	17014391
P-1000 Micropipettor	Rainin	17017382
Pipettierhilfe	Drummond	193970L
Kolben T75	BD Falcon	BD353136
Benzonase	Sigma	E1014
Protaminsulfat	McKesson	804514
Lentivirus	Lentigen	LV-R73, R78
Lebend/tot-Farbstoff in wässriger Lösung	Thermo Fisher	L-34966
ABC Comp Beads	Thermo Fisher	A10497
CD3-BV421	BD	562426
CD8-APC	Biolegend	301014
CD4-PerCPCy5.5	BD	560650
TAA Dextramer-PE	Immudex	N/A

Verfahren
Die Experimente wurden nach dem standardmäßigen Herstellungsprozess von autologen T-Zellen in 4 Schritten durchgeführt: Auftauen/Ruhen, Aktivierung, Transduktion und Expansion, jedoch in unterschiedlichen Größenordnungen.
Auftauen und Ruhen
Gefrorenes PBMC von gesunden Spendern wurde im warmen TexMACS-Medien aufgetaut, ergänzt durch 5% humanes AB-Serum (komplettes Material). Die Zellen wurden 15 Minuten lang bei 37°C mit Benzonase-Nuklease (50U/ml) behandelt, gewaschen, gezählt und in kompletten TexMACS-Medium über Nacht zum Ruhen gebracht.
Aktivierung
Am Tag des Auftauens der Zellen wurden 24-Well-Nicht-Gewebe-Kulturplatten oder T175cm²-Kolben mit Anti-CD3- und Anti-CD28-Antikörpern beschichtet, die in PBS (1 µg/ml) verdünnt waren, versiegelt und über Nacht bei 4°C inkubiert. Am nächsten Tag wurden ruhende PBMCs in der Konzentration von 1 × 10⁶/ml geerntet, gezählt, gewaschen und resuspendiert. Die Antikörperlösung wurde abgesaugt und die Wells wurden mit komplettem Medium gewaschen, gefolgt von der Zugabe von 2 × 10⁶ Zellen zu jedem Well. Die Aktivierung erfolgte bei 37°C für die angegebenen Zeitintervalle.
Transduktion
Aktivierte T-Zellen wurden geerntet, gewaschen und gezählt. Transduktionsgemische, die präklinische lentivirale Überstände (berechnet auf Basis eines bestimmten MOI), Protaminsulfat (10 µg/ml) und IL-7 (10 ng/ml) und IL-15 (100 ng/ml) enthalten. Für jede Transduktion wurden aktivierte Zellen getrennt und 5 Minuten lang bei 400 × g zentrifugiert. Jedes Zellpellet wurde in der Transduktions-Mischung (1 ml pro 2 × 10⁶ Zellen) resuspendiert und in einen entsprechend großen G-Rex-Kolben gesät. Nach 24 Stunden Inkubation bei 37°C und 5% CO₂ wurde das Kulturvolumen in jeder G-Rex-Kolben auf die halbe oder die volle Kapazität gebracht, je nach Spezifikation, mit Medien, die mit IL-7 (10 ng/ml) und IL-15 (100 ng/ml) ergänzt waren. Die Zellzahlen und die Lebensfähigkeit wurden bis zum 10. Tag des Prozesses regelmäßig überwacht. Multimere MHC-Peptidkomplexe (Dextramer oder Tetramer) wurden verwendet, um die Oberflächenexpression von transgenem TCR mittels FACS zu überwachen.
Durchflusszytometrie
Zusammenfassend, wurden 1,0 × 10⁶ transduzierte Zellen nach den Arbeitsanweisungen gefärbt. Nach der Tetramerfärbung erfolgte die Färbung mit Antikörpern gegen T-Zellen-Oberflächenmarker. Die Proben wurden mit einer Autokompensationsmatrix aufgenommen, die von Kompensations-Beads abgeleitet wurde.
Ergebnisse
Um Nicht-Gewebekultur behandelten T175cm²-Kolben als Alternative zu 24-Well-Platten zur Beschichtung von Anti-CD3- und Anti-CD28-Antikörpern zur Aktivierung von T-Zellen zu evaluieren, wurde die Antikörperkonzentration wie im Kleinformat beibehalten, andere Parameter wie Beschichtungsvolumen, Zelldichte und Saatvolumen wurden für eine größere Fläche in einem Kolben optimiert.
Um die Lebensfähigkeit und Expression der Aktivierungsmarker CD25 und CD69 und LDL-R in plattengebundenem (PB) und kolbenengebundenem (FB) aktiviertem PBMC zu vergleichen, wurden FACS-Färbung und -Akquisition 16-24 Stunden nach der Aktivierung mit FB- oder PB-Anti-CD3- und CD28-Antikörpern durchgeführt. Nicht stimuliertes PBMC wurde als Negativkontrolle eingesetzt.
15 zeigt, dass unter optimierten Bedingungen T-Zellen, die in T175cm²-Kolben (kolbengebunden, FB) aktiviert wurden, vergleichbare Expressionsniveaus der Aktivierungsmarker CD25 und CD69 und LDL-R aufweisen wie T-Zellen, die unter plattengebundenen (PB) Bedingungen aktiviert wurden. Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass eine Scale-up-Aktivierung mit FB-Antikörpern angesichts der vergleichbaren Aktivierungsniveaus, die sich aus FB- und PB-aktivierten T-Zellen ergeben, möglich sein könnte.
Um die Transgenexpression und -expansion in den am 10. Tag geernteten T-Zellprodukten (von Spender 6, Spender 7 und Spender 8) mit PB- oder FB-Antikörpern zur Aktivierung zu vergleichen, wurde die Oberflächenexpression von R7P1D5 TCR durch Durchflusszytometrie unter Verwendung von TAA-spezifischen Dextramer oder transgenen TCR β-Ketten-spezifischen Antikörpern bestimmt. Die Expansion wurde auf der Grundlage der Anzahl von lebensfähigen Zellen berechnet, die zum Zeitpunkt der Transduktion (Tag 2) und zum Tag der Ernte (Tag 10) in die G-Rex-Platte oder -Kolben gesät wurden. 16A und 16B zeigen vergleichbare Werte der Transduktion bzw. Größenordnung der Expansion in FB- und PB-aktivierten T-Zellen. Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass eine Scale-Up-Transduktion und -Expansion mit FB-Antikörpern angesichts der vergleichbaren Transduktions- und Expansionsraten, die sich aus FB- und PB-aktivierten T-Zellen ergeben, möglich sein könnte.
Für die weitere Validierung der erfolgreichen Skalierung der Aktivierung wurde die Funktionalität von T-Zell-Produkten, die durch FB- und PB-Aktivierungsverfahren erzeugt wurden, verglichen. Um die Induktion von antigenspezifischem IFN-y durch LV-R73 transduzierte T-Zell-Produkte zu evaluieren, die mit PB- oder FB-Antikörpern zur Aktivierung erzeugt wurden, wurde IFN-y, das im Überstand von T-Zellen freigesetzt wurde, die mit Tumorzelllinien (Target+ve, Target-ve) co-kultiviert wurden, mit einem kommerziell erhältlichen ELISA-Kit quantifiziert.
17 zeigt, dass FB-aktivierte LV-R73-transduzierte T-Zellen vergleichbare Mengen antigenspezifischer IFN-y mit denen von PB-aktivierten transduzierten T-Zellen als Reaktion auf Tumorzellen, die TAA in jedem der Spender 6, Spender 7 und Spender 8 exprimieren, sekretiert haben. Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass eine Scale-up von IFN-y- sekretierenden T-Zellen mit FB-Antikörpern angesichts der vergleichbaren Niveaus der IFN-γ-Sekretion, die sich aus FB- und PB-aktivierten T-Zellen ergeben, möglich sein könnte.
Für die Scale-up des restlichen Prozesses wurden 2,5 × 10⁸ - 4,0 × 10⁸ aktivierte T-Zellen transduziert und mit einer optimalen Saatdichte von 0,5 × 10⁶ pro cm² der Oberfläche des G-Rex100-Kolbens ausgesät. Mehrere G-Rex100-Kolben wurden verwendet, um die transduzierten Zellen mit der optimalen Dichte zu säen. Zusätzliche Parameter, wie z. B. die Bedingungen für die Nährmedienzuführung und Aufteilung der Zellen, wurden ebenfalls optimiert, um eine maximale Expansion zu erreichen (Daten nicht dargestellt). Der endgültige Herstellungsprozess wurde in 2 Full-Scale-Läufen der Prozessentwicklung (PD) getestet. Alle Produkte, die mit dem endgültigen Prozess generiert wurden, bestanden die Freigabekriterien in Bezug auf %Dextramer und Integrationskopienanzahl. Die in diesen Herstellungsläufen erzeugten Zellzahlen entsprachen der klinischen Dosis auf allen Kohortenstufen. Die Ergebnisse der PD-Skalierungsläufe sind in der folgenden Tabelle 1 zusammengefasst.
Tabelle 1: Zusammenfassung der Produktcharakterisierung von 2 Full-Scale PD-Läufen, die durchgeführt wurden.

Scale-Up-Lauf Nr. Spender %CD3 %CD8 %Dextramer⁺ Integration Kopienzahl Zellzahl

1 Spender 6 99,5% 66,9% 21,6% 0,96 1,01x10¹⁰

2 Spender 9 96,2% 57,7% 23,1% 1,21 1,05x10¹°
Die GMP-Produktion mit dem oben genannten Verfahren hat für einige wenige Spender über 20 Milliarden Zellen erbracht.
Kolbengebunden im Vergleich zu beutelgebunden
Vergleich zwischen T-Zellen, die durch das kolbengebundene Verfahren und das beutelgebundene Verfahren (z. B. Saint-Gobain VueLife AC Beutel, der mit Anti-CD3- und Anti-CD28-Antikörpern beschichtet ist) aktiviert wurden, in Bezug auf Aktivierungsgrad (Durchflusszytometrie), Transduzibilität (Dextramer-Färbung, FACS) und Expansion (Zellzahl).
Um die Aktivierung von T-Zellen mit anti-CD3- und anti-CD28-Antikörperbeschichteten Beuteln im Vergleich zu Platten zu vergleichen, zeigt 18 das experimentelle Design, mit dem die Wirkung von anti-CD3- und anti-CD28-Antikörperbeschichteten Beuteln und Platten auf die T-Zell-Aktivierung getestet wird. Zusammenfassend, am Tag 0, wurden PBMC aufgetaut und über Nacht (24 Stunden) ruhen gelassen. Am ersten Tag wurden die ruhenden PBMC aktiviert, indem sie auf Kolben, z. B. T175cm²-Kolben, oder Beutel, z. B. Saint-Gobain VueLife AC-Beutel, die mit Anti-CD3- und Anti-CD28-Antikörpern beschichtet waren, für 16-20 Stunden gesät wurden. Am 2. Tag wurden die aktivierten T-Zellen auf CD25-, CD69- und hLDL-R-Expression analysiert und mit VSV-G pseudotypisierten lentiviralen Vektoren, z. B. 1xEng LV-R73, transduziert. An den Tagen 6/7 und 10 wurden Analysen wie Zellzahlbestimmung, Lebensfähigkeit und fluoreszenzaktivierte Zellsortierung (FACS) mit Dextramern (Dex) durchgeführt.
19 zeigt unter optimierten Bedingungen T-Zellen (von Spender 16 und Spender 14), die in Beuteln aktiviert sind, die mit Antikörpern in Konzentrationen von 1 µg/ml oder 2 µg/ml verbunden sind, eine vergleichbare Expression der Aktivierungsmarker CD25 und CD69 und hLDL-R-Expression wie unter kolbengebundenen (T175cm²-Kolben, markiert als „Standard“) Bedingungen. Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass eine Scale-Up-Aktivierung mit beutelgebundenen (Bag) Antikörpern angesichts der vergleichbaren Aktivierungsniveaus, die sich aus beutelgebundenen (Bag) und kolbengebundenen (FB) aktivierten T-Zellen ergeben, möglich sein könnte.
20 und 21 zeigen am Tag 6 bzw. 10 der Expansion T-Zellen (von Spender 16 und Spender 14), die in Beuteln aktiviert sind, die mit Antikörpern in Konzentrationen von 1 µg/ml oder 2 µg/ml gebunden sind, vergleichbare T-Zellzahlen, d. h. Zellexpansion, mit denen von T-Zellen, die unter FB-Bedingungen aktiviert wurden. Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass eine Scale-Up-Expansion mit beutelgebundenen Antikörpern angesichts der vergleichbaren Expansionsniveaus, die sich aus beutelgebundenen und kolbengebundenen aktivierten T-Zellen ergeben, möglich sein könnte.
Beispiel 4
Kurze Ruhephase in Vergleich mit der Ruhephase über Nacht im T-Zell-Herstellungsprozess
22 zeigt einen T-Zellen-Herstellungsprozess 220 durch Ruhen von PBMC für einen Zeitraum von etwa 4 Stunden gemäß einer Ausführungsform der vorliegenden Offenbarung. So kann beispielsweise ein T-Zell-Herstellungsprozess 220 die Isolierung und Kryokonservierung von PBMC aus der Leukapherese (221) beinhalten, in dem die Sterilität getestet werden kann; Auftauen, Ruhen (z. B, ca. 4 Stunden) und Aktivieren von T-Zellen (222); Transduktion mit einem viralen Vektor (223); Expansion mit Zytokinen (224); Zellen aufspalten/Nährmedium zuführen (225), in denen Zellzahl und Immunphänotypisierung getestet werden können; Ernten und Kryokonservieren von Arzneimittelzellen (226), in denen Zellzahl und Mykoplasma getestet werden können, und Freisetzen nach der Kryokonservierung (227), in denen Lebensfähigkeit, Sterilität, Endotoxin, Immunphänotypisierung, Kopienzahl des integrierten Vektors und vesikuläres Stomatitisvirus Glykoprotein G (VSV-g) getestet werden können.
Tabelle 2 zeigt die Eigenschaften von T-Zellen, die durch drei verschiedene Qualifikationsläufe des T-Zell-Herstellungsprozesses 220 hergestellt wurden, indem PBMC für einen kurzen Zeitraum, z. B. etwa 4 bis etwa 6 Stunden, in Gegenwart von IL-7 gemäß einer Ausführungsform der vorliegenden Offenbarung ruhen gelassen wird.

Tabelle 2: Qualifikationsläufe (QR) des T-Zell-Herstellungsprozesses 220 durch kurzzeitiges Ruhen von PBMC, z. B. etwa 4 bis etwa 6 Stunden, vorzugsweise etwa 4 Stunden (im GMP-Reinraum).

	QR1	QR2	QR3	Durchschnitt
% CD3+	99,6	99,7	99,8	99,7
% CD8+	33,5	51,5	75,2	53,4
% Dex+/CD3+CD8+	35,5	72,7	83,0	63,7
% Lebensfähigkeit	92,0	92,2	91,7	92,0
Verbleibende VSV-g	< 50 Kopien/µg	< 50 Kopien/µg	< 50 Kopien/µg	< 50 Kopien/µg
Durchschnittliche Kopienzahl (pro Zelle)	1,0	3,0	4,2	2,7
Gesamtzahl der lebensfähigen Zellen	24,8 × 10⁹	32,2 × 10⁹	26,8 × 10⁹	28,0 × 10⁹
Transduzierte Zellen	2,95 × 10⁹	12,1 × 10⁹	16,73 × 10⁹	10,6 × 10⁹
Herstellungstage	10	8	8	8,7
Zellen bei der Transduktion	281 × 10⁶	400 × 10⁶ (max)	400 × 10⁶ (max)	360 × 10⁶
Größenordnung der Expansion	88-fach	81-fach	67-fach	78,7-fach
LV-Charge	ENG	ENG	GMP	NA

23A und Tabelle 2 zeigen, dass die durchschnittliche Größenordnung der Expansion von T-Zellen (n = 7), die durch die nächtliche Ruhephase von PBMC hergestellt wurden, etwa 78,7-fach ist.
Um zu bestimmen, ob transduzierter TCR auf der Zelloberfläche von expandierten T-Zellen exprimiert wird, wurden expandierte T-Zellen mit Peptid-/MHCkomplexgeladenen Dextramern gefärbt, die spezifisch an transduziertes TCR binden, gefolgt von einer Durchflusszytometrie zur Identifizierung von CD8+ T-Zellen, die transduzierten TCR exprimieren. 23B und Tabelle 2 zeigen, dass der Durchschnitt von % Dex+/CD8+ T-Zellen (n = 7), die durch kurze Ruhephase hergestellt werden, etwa 53,4% beträgt, was darauf hindeutet, dass transduzierter TCR auf der Zelloberfläche von expandierten T-Zellen exprimiert wird.
Um zu bestimmen, welche T-Zell-Phänotypen in erweiterten T-Zellen vorhanden sind, die transduzierten TCR exprimieren, wurden die Zellen mit verschiedenen Oberflächenmarkern der Immunzellen gefärbt, gefolgt von der Durchflusszytometrie zur Identifizierung von T-Zell-Phänotypen, z. B. T_n/scm, T_cm, Tem und T_eff. Unter ihnen kann T_n/scm für die Immuntherapie wünschenswerter sein als andere, da T_n/SCm Eigenschaften wie lymphoides Homing, Proliferationspotenzial, Selbsterneuerung und Multipotenz aufweisen kann. 23C zeigt einen Durchschnitt von etwa 50% der expandierten T-Zellen, die transduzierte TCR (n = 4) exprimieren, die T_n/scm-Phänotypen aufweisen.
Um die zytotoxische Aktivität von expandierten T-Zellen zu bestimmen, die transduzierten TCR exprimieren, wurden Tumorzellen, die mit unterschiedlicher Konzentration des Zielpeptids gepulst wurden, mit expandierten T-Zellen inkubiert, die transduzierten TCR exprimieren, das spezifisch den Zielpeptid/MHC-Komplex erkennt, gefolgt von der Messung des Tumorzellwachstums. 23D zeigt, dass expandierte T-Zellen, die transduzierten TCR exprimieren, das Wachstum von Tumorzellen auf peptidkonzentrationsabhängige Weise hemmen.
Die zytotoxischen Aktivitäten von expandierten T-Zellen, die transduzierte TCR exprimieren, scheinen vergleichbar zu sein mit PBMC, die von verschiedenen gesunden Spendern erhalten wurden, z. B. von den Spendern 7, 13, 17, 18 und 21 (23E), und mit denen von verschiedenen Patienten, z. B. den Patienten 312, 319, 351, 472 und 956 (23F).
Um das zytotoxische Potenzial der erweiterten T-Zellen zu bestimmen, die transduzierten TCR exprimieren, wurden Tumorzellen, die das Zielpeptid exprimieren, mit expandierten T-Zellen, die transduzierten TCR exprimieren (220-T), die spezifisch den Zielpeptid/MHC-Komplex erkennen, inkubiert, gefolgt von einer Messung der Größenordnung des Wachstums von Tumorzellen. 23G und 23H zeigen eine erhöhte Regression oder Unterdrückung des Tumorwachstums durch Inkubation mit expandierten T-Zellen, die transduzierten TCR (220-T) (Effektoren) bei Effektoren zu Tumorzellen im Verhältnis von 10:1 und 3:1 exprimieren, im Vergleich zu den nichttransduzierten T-Zellen ohne zielspezifischen TCR (NT).
24 illustriert den T-Zell-Herstellungsprozess 240 mit der Ruhephase von PBMC über Nacht (etwa16 Stunden). So kann beispielsweise der T-Zell-Herstellungsprozess 240 die Isolierung von PBMC (241) beinhalten, wobei die PBMC frisch oder gefroren bis zur Gebrauchsfertigkeit verwendet werden können, oder als Ausgangsmaterial für die T-Zell-Herstellung verwendet werden können und auch die Auswahl von Lymphozytenpopulationen (z. B. CD8, CD4 oder beides) möglich sein kann; Auftauen und Ruhen von Lymphozyten über Nacht, z. B, ca. 16 Stunden, (242), was das Absterben apoptotischer Zellen und die Wiederherstellung der T-Zellfunktionalität ermöglichen kann (dieser Schritt ist möglicherweise nicht erforderlich, wenn frische Materialien verwendet werden); Aktivierung von Lymphozyten (243), wobei die Anti-CD3- und Anti-CD28-Antikörper (löslich oder oberflächengebunden z. B, magnetische oder biologisch abbaubare Beads) verwendet werden können; Transduktion mit CAR oder TCR (244), wobei die lentivirale oder retrovirale Konstrukte verwendet werden können, die CAR und TCR kodieren, oder nicht-virale Verfahren verwendet werden können; und Expansion von Lymphozyten, Ernte und Kryokonservierung (245), die in Gegenwart von Zytokin(en), Serum (ABS oder FBS) und/oder Kryokonservierungsmedien durchgeführt werden können.
Tabelle 3 zeigt die Eigenschaften von T-Zellen, die durch drei verschiedene Qualifikationsläufe eines T-Zellen-Herstellungsprozesses (240) hergestellt wurden, indem PBMC über Nacht, z. B. etwa 16 Stunden, ruhen gelassen wurde.

Tabelle 3: Qualifizierungsläufe (QR) eines T-Zellen-Herstellungsprozesses durch Ruhen von PBMC über Nacht (im GMP-Reinraum)

	QR1	QR2	QR3	Durchschnitt
% CD3+	99,2	99,6	99,7	99,5
% CD8+	47,9	46,9	60,9	51,9
% Dex+/CD3+CD8+	36,7	57,3	64,9	53,0
% Lebensfähigkeit	85,6	86,8	85,5	86,0
Verbleibende VSV-g	< 50 Kopien/µg	< 50 Kopien/µg	< 50 Kopien/µg	< 50 Kopien/µg
Durchschnittliche Kopienzahl (pro Zelle)	2,7	3,2	3,6	3,2
Gesamtzahl der lebensfähigen Zellen	8,7 × 10⁹	24,3 × 10⁹	14,2 × 10⁹	15,7 × 10⁹
Transduzierte Zellen	1,3 × 10⁹	5,65 × 10⁹	4,8 × 10⁹	3,9 × 10⁹
Herstellungstage	8	9	8	8,3
Zellen bei der Transduktion	231 × 10⁶	400 × 10⁶	400 × 10⁶	344 × 10⁶
Größenordnung der Expansion	38-fach	61-fach	36-fach	45-fach
LV-Charge	ENG	ENG	GMP	NA

Im Gegensatz zum T-Zellen-Herstellungsprozess mit kurzer Ruhezeit, z. B. ca. 4 Stunden, erbrachten T-Zellen mit einer Ruhephase von ca. 16 Stunden einen geringeren Ausmaß an Expansion der T-Zellen. 25A und Tabelle 3 zeigen, dass die durchschnittliche Größenordnung der Expansion von T-Zellen (n = 7), die durch Ruhen von PBMC für etwa 16 Stunden hergestellt wurden, etwa 45-fach ist, verglichen mit etwa 78,7-fach mit kurzen Ruhezeiten von etwa 4 Stunden (Tabelle 2). TT und PQ stehen für Technologietransfer bzw. Prozessqualifikationsläufe.
Eine nächtliche Ruhezeit (ca. 16 Stunden) ergab weniger expandierte T-Zellen, die transduzierten TCR exprimierten, als eine Ruhezeit von ca. 4 Stunden. 25B und Tabelle 3 zeigen, dass der Durchschnitt der % Dex⁺/CD8⁺ T-Zellen (n = 7), die durch Ruhen von PBMC über Nacht für etwa 16 Stunden hergestellt wurden, etwa 51,9% verglichen mit etwa 53,4% mit einer Ruhezeit von etwa 4 Stunden (Tabelle 2) ist.
Eine nächtliche Ruhezeit von etwa 16 Stunden ergab weniger expandierte T-Zellen, die transduzierten TCR mit Tn/scm-Phänotyp exprimierten, als eine Ruhezeit von etwa 4 Stunden. 25C zeigt den Durchschnitt von etwa 40% der expandierten T-Zellen (n = 5) mit Tn/scm-Phänotypen, verglichen mit etwa 50% mit der Ruhephase von etwa 4 Stunden (23C)
25D zeigt deutlich mehr Inhibierung des Tumorzellwachstums durch Inkubation von Tumorzellen mit expandierten T-Zellen, die transduzierten TCR (Effektoren) bei Effektoren zu Tumorzellen-Verhältnis von 10:1, 3:1 und 1:1 exprimieren als die der Negativkontrollen, z. B. Tumorzellen, die mit entweder expandierten T-Zellen inkubiert wurden, die keinen transduzierten TCR (Target-ve) oder keine Effektoren exprimieren. Darüber hinaus scheinen die zytotoxischen Aktivitäten expandierter T-Zellen, die transduzierten TCR exprimieren, zwischen PBMC, das von gesunden Spendern erhalten wurde (n = 5) (25E) und PBMC, das von Krebspatienten erhalten wurde (n = 7) ( 25F), vergleichbar zu sein.

Tabelle 4 fasst die Merkmale von T-Zellen zusammen, die mit einer kurzen Ruhezeit von etwa 4 Stunden gemäß einer Ausführungsform der vorliegenden Offenbarung (Prozess 220) und die mit einer Ruhezeit von etwa 16 Stunden über Nacht (Prozess 240) hergestellt wurden. Tabelle 4

Prozess	Größenordnung der Expansion	Erntemenge (Ausbeute)	Lebensfähigkeit ≥ 70%	% Lebende	% CD8+ von CD3+	% Dex+ von CD8+
				CD3+ ≥ 80%		> 10%
220	78,7	28,0 × 10⁹	92,0	99,7	53,4	63,7
240	45,0	15.7 × 10⁹	86,0	99,5	51,9	53,0

Tabelle 4 zeigt, dass der Prozess mit kurzer Ruhezeit 220 (etwa 4-6 Stunden) einen zusätzlichen Tag in der Expansion ermöglichen kann, z. B. Tag 8 des Prozesses 240 ist Tag 9 für Prozess 220, was zu mehr Zellen führt.
Beispiel 5
T-Zell-Herstellung im geschlossenen System
Wie bereits erwähnt, können die Prozesse 220 und 240 in offenen Systemen, wie beispielsweise G-Rex™, durchgeführt werden. Ex vivo-Manipulation hämatopoetischer Zellen, z. B. T-Zellen, in offenen Systemen kann jedoch das Risiko einer Kontamination mit Infektionserregern bergen und das Transplantationspotenzial sowie die hämatopoetische Fitness verringern. Bei der Herstellung klinischer Zellprodukte können geschlossene Zellkultursysteme bevorzugt werden, da die Sterilität während der gesamten Kultivierungsprozesse gewährleistet ist.
26 zeigt das ex vivo-Manipulationsprotokoll in offenen und geschlossenen Systemen. Geschlossene Systeme können nicht nur Risiken und Verunreinigungen durch externe Prozesse minimieren, sondern auch die Robustheit und Qualität der Produkte fördern und die Produktsicherheit erhöhen, wodurch die Herausforderungen für die Weiterverarbeitung, die Endproduktanalyse und die Prüfung reduziert werden können. Während relativ kleine Zellzahlen, z. B. ≤ 1 × 10⁹, in einem relativ kleinen Volumen im offenen System, z. B. 1 Liter, kultiviert werden können, können relativ große Zellzahlen, z. B. von ca. 1 × 10⁹ bis ca. 2 × 10¹¹, in einem relativ großen Volumen im geschlossenen System, z. B. von 5 Litern (z. B. WAVE (XURI™) Bioreaktorbeutel und G-Rex™-Kolben) bis 50 Liter (z. B. statischer Beutel) kultiviert werden. Diese Zellkulturtechnologien mit geschlossenem System können qualitativ hochwertige, individualisierte Zelltherapien als regulierter, schneller und kostengünstiger Weg der Zellherstellung liefern.
Der T-Zell-Herstellungsprozess der vorliegenden Offenbarung kann in allen geschlossenen Systemen der Zellkultur durchgeführt werden, einschließlich kommerziell verfügbarer Systeme, z. B. CliniMACS Prodigy™ (Miltenyi), WAVE (XURI™) Bioreaktor (GE Biosciences) allein oder in Kombination mit BioSafe Sepax™ II und GatheRex™ geschlossenem System (Wilson Wolf) allein oder in Kombination mit BioSafe Sepax™ II.
CliniMACS Prodigy™ (Miltenyi)
CliniMACS Prodigy™ mit der TCT-Prozesssoftware und dem TS520 Tubing-Set kann eine geschlossene Systemprozessabwicklung für Zellanreicherung, Transduktion, Waschen und Expansion ermöglichen. So können beispielsweise MACS-CD4 und CD8-MicroBeads zur Anreicherung verwendet werden, TransACT-Beads, z. B. CD3/CD28-Reagenzien, zur Aktivierung, lentivirale Vektoren, die einen rekombinanten TCR exprimieren, zur Transduktion, TexMACS medium-3%-HS-IL2 für Zellkultur und phosphatgepufferter Salin/Ethylendiamintetraessigsäurepuffer zum Waschen. Dieses System kann etwa 4-5 × 10⁹ Zellen liefern, automatisierte Protokolle für die Herstellung mit einem Kammermaximum von -300 mL Füllvolumen enthalten und Selektion und Aktivierung (TransACT-Beads), Transduktion und Expansion über einen 10- bis 14-tägigen Prozess durchführen.
WAVE (Xuri™) Bioreaktor (GE Biosciences)
WAVE (Xuri™) Bioreaktor ermöglicht die Kultivierung von T-Zellen in Kulturbeuteln, z. B. Xuri Cellbags, mit und/oder ohne Perfusion. Mittlerer Beutel für das Feeding kann ein 5-Liter-Hyclone Labtainer sein. Der Abfallbeutel kann Mbag sein (erhältlich bei GE Healthcare). Dieses System kann etwa 15-30 × 10⁹ Zellen liefern, verwendet die Unicorn-Software, die eine Kulturkontrolle und -überwachung ermöglicht, enthält ein Kippgefäß, das von etwa 0,3 bis etwa 25 Liter fassen kann, und führt die Perfusionsfunktion aus, um das Kulturvolumen aufrechtzuerhalten, während der Gasaustausch vermittelt und frische Medien und Zytokine in die Zellkultur eingeführt werden.
WAVE (Xuri™) Bioreaktor kann Kulturbodenbeutel zum Auftauen, Ruhen, Aktivieren und Transduzieren beinhalten. WAVE (Xuri™) Bioreaktor kann in Kombination mit anderen Technologien verwendet werden, z. B. Sepax™ Zelltrennsystem (GE Biosciences) für die Zellkulturwäsche und Volumenreduzierung. WAVE (Xuri™) Bioreaktor kann steriles Schweißgerät zum Verbinden von sterilen Beuteln für den Lösungsaustausch und Heißsiegelgerät zum Verschließen von Schläuchen enthalten.
Sepax™ Zelltrennsystem basiert auf einer Trennkammer, die sowohl die Trennung durch Rotation der Spritzenkammer (Zentrifugation) als auch den Komponententransfer durch Verdrängung des Spritzenkolbens ermöglicht. Ein optischer Sensor misst die Lichtabsorptionsfähigkeit der abgetrennten Komponenten und steuert die Strömungsrichtung jeder einzelnen Komponente im richtigen Ausgangsbehälter, z. B. Plasma, Buffy Coat und rote Blutkörperchen können so getrennt und aus Blutproben entnommen werden.
27 zeigt, dass gefrorenes PBMC, das durch das Sepax™-Zelltrennsystem isoliert wurde, am Tag 0 aufgetaut, gewaschen, ruhen gelassen, z. B. über Nacht (O/N) werden kann, und Kulturbodenbeutel, z. B. Xuri Cellbags, können mit Anti-CD3-Antikörper und Anti-CD28-Antikörper beschichtet sein; am 1. Tag kann ruhendes PBMC in den Kulturbodenbeutel übertragen werden, die mit Anti-CD3-Antikörper und Anti-CD28-Antikörper zur Aktivierung beschichtet sind; am 2. Tag können die Zellen gewaschen und die Medien durch das Sepax™-Zelltrennsystemauf ein geeignetes Volumen reduziert werden, das für die virale Transduktion, z. B. mit lentiviralem Vektor, der TCR exprimiert, geeignet ist. Die Zellenexpansion kann in den gleichen Kulturbodenbeuteln auf einem Kippgefäß mit Perfusionsfunktion durchgeführt werden, um das Kulturvolumen, während der Gasaustausch vermittelt wird und frische Medien und Zytokine in die Zellkultur eingebracht werden, aufrechtzuerhalten. Expandierte transduzierte T-Zellen können mit dem Sepax™-Zelltrennsystemgewonnen und gewaschen werden.
GatheRex™ geschlossenes System (Wilson Wolf)
Das GatheRex™ geschlossene System ist ein halbautomatisches System, das es dem Bediener ermöglichen kann, das in der Kultur vorhandene überschüssige Medium abzulassen und Zellen ohne Kontaminationsrisiko zu sammeln. Der Prozess kann in zwei Phasen unterteilt werden: Zellkonzentration und Zellgewinnung. Im Zellkonzentrationsprozess kann das geschlossene GatheRex™-System über eine Luftpumpe betrieben werden, die das G-RexTM-Gerät, z. B. Flaschen, mit steriler Luft bedrückt, so dass 90% des über den Zellen befindlichen Mediums in einen Medium-Sammelbeutel verschoben werden können. Nach Abschluss dieses Vorgangs erkennt ein erster optischer Detektor die Anwesenheit von Luft in der Mediumsammelleitung und stoppt die Pumpe automatisch. Vor Beginn des Gewinnungsprozesses kann der Bediener die Zellen unter Verwendung der restlichen 10% des Mediums resuspendieren, indem er das G-Rex™-Gerät manuell dreht, um Zellen von der gasdurchlässigen Membran zu entfernen. Die Luftpumpe wird dann reaktiviert und die resuspendierten Zellen werden in den Zellsammelbeutel gezogen. Diese Phase kann automatisch enden, sobald ein zweiter optischer Detektor Luft in der Zellsammelleitung erkennt. Dieses System kann etwa 15-20 × 10⁹ Zellen liefern und 5 Liter pro Gefäß aufnehmen.
Das geschlossene System GatheRex™ kann Kulturbodenbeutel zum Auftauen, Ruhen und Aktivieren beinhalten. Das geschlossene System GatheRex™ kann in Kombination mit anderen Technologien verwendet werden, z. B. mit dem Zelltrennsystem Sepax™, um Zellkultur zu waschen und Volumen zu reduzieren. Das geschlossene System GatheRex™ kann steriles Schweißgerät zum Verbinden von sterilem Beutel für den Lösungsaustausch und Heißsiegelgerät zum Verschließen von Schläuchen enthalten.
28 zeigt am Tag 0, dass gefrorenes PBMC, das durch das Sepax™-Zelltrennsystem isoliert wurde, aufgetaut, gewaschen, ruhengelassen, z. B. über Nacht (O/N) werden kann; am 1. Tag können Kulturbeutel mit Anti-CD3-Antikörper und Anti-CD28-Antikörper beschichtet und ausgeruhtes PBMC zur Aktivierung auf die beschichteten Kulturbeutel übertragen werden; am 2. Tag können Zellen gewaschen und Medien durch das Sepax™-Zelltrennsystem auf ein geeignetes Volumen reduziert werden, das für die virale Transduktion, z. B. mit lentiviralem Vektor, der TCR exprimiert, geeignet ist. Die Zellexpansion und -zufuhr kann im G-Rex™-Gerät im geschlossenen System GatheRex™ erfolgen. Expandierte transduzierte T-Zellen können dann mit dem Sepax™-Zelltrennsystem gewonnen und gewaschen werden.

Tabelle 5 zeigt den Vergleich zwischen T-Zellen, die aus offenen Systemen, z. B. G-Rex™, wie in Tabelle 4 dargestellt, d. h. den Prozessen 220 und 240, und T-Zellen, die aus geschlossenen Systemen, z. B. CliniMACS Prodigy™, WAVE (XURI™) Bioreaktor in Kombination mit BioSafe Sepax™ II und geschlossenem System GatheRex™ in Kombination mit BioSafe Sepax™ II, gewonnen werden. Tabelle 5

Prozess	Größenordnung der Expansion	Erntemenge (Ausbeute)	Lebensfähigkeit ≥ 70%	% Lebende CD3+ ≥ 80%	% CD8+ von CD3+	% Dex+ von CD8+ ≥ 10%
220	78,7	28,0 × 10⁹	92,0	99,7	53,4	63,7
240	45,0	15,7 × 10⁹	86,0	99,5	51,9	53,0
CliniMACS Prodigy™	55,0	4,4 × 10⁹	95,4	98,5	55,0	39,7
WAVE (XURI™) Bioreactor in Kombination mit BioSafe Sepax™ II	40,3	16,1 × 10⁹	92,0	99,6	60,8	41,7
GatheRex™ in Kombination mit BioSafe Sepax™ II	46,3	18,5 ×10⁹	89,7	99,4	62,8	49,5

Diese Ergebnisse zeigen, dass der T-Zellen-Herstellungsprozess der vorliegenden Offenbarung leicht in geschlossenen Systemen durchgeführt werden kann, um T-Zellen mit vergleichbaren Eigenschaften wie in offenen Systemen herzustellen, während gleichzeitig externe Verarbeitungsrisiken und Kontamination gemildert die Robustheit und Qualität des Produkts gefördert und die Produktsicherheit erhöht werden, wodurch die Herausforderungen für die Weiterverarbeitung, die Endproduktanalyse und die Prüfung reduziert werden.
Um die funktionellen Eigenschaften von in geschlossenen Systemen hergestellten T-Zellen mit denen in offenen Systemen zu vergleichen, wurden PBMCs vom Spender 17 verarbeitet, um erweiterte transduzierte T-Zellen gemäß dem Prozess der vorliegenden Offenbarung herzustellen. Die expandierten transduzierten T-Zellen, die TCR exprimieren, wurden dann für die IFN-y Freisetzung in Gegenwart oder Abwesenheit des TCR-spezifischen Peptid-/MHC-Komplexes (Target) gemessen.
29 zeigt, dass konstruierte T-Zellen, die in geschlossenen Systemen hergestellt wurden, gemessen durch zwei Durchläufe, Lauf Nr.1 und Lauf Nr.2, deutlich mehr IFN-y in Gegenwart des Targets freigesetzt haben als die im offenen System hergestellten, z. B. Prozess 220. Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass in geschlossenen Systemen hergestellte T-Zellen eine höhere zytotoxische Aktivität aufweisen können als die in offenen Systemen hergestellten.
Vorteile der vorliegenden Offenbarung können Herstellungsprozesse von autologen T-Zellen einschließen, die die Ruhezeit auf z. B. 4-6 Stunden, die Aktivierungszeit auf z. B. 16-20 Stunden, die Transduktionszeit auf z. B. 24 Stunden und die Expansionsphase auf z. B. 5-7 Tage für die klinische Herstellung von modifizierten TCR-T-Zellprodukten verkürzen können. Kritische Parameter, die jeden Schritt beeinflussen, können systematisch ausgewertet und optimiert werden, um über 10 Milliarden junge, tumorreaktive T-Zellen mit einer starken Fähigkeit, Tumorzellen, die die Zielzellen exprimieren, zu erkennen und effizient abzutöten. Neben der Verbesserung der Qualität von T-Zell-Produkten können diese Optimierungen auch zu einer Senkung der Herstellungskosten um 30% führen. Darüber hinaus können Herstellungsprozesse von autologen T-Zellen der vorliegenden Offenbarung unter Verwendung von kolben- und/oder beutelgebundenen Anti-CD3- und Anti-CD28-Antikörpern zur Aktivierung von T-Zellen skaliert werden, um vergleichbare Aktivierungs-, Transduzibilitäts- und Expansionswerte zu erhalten, und diese Skalierungsprozesse können schneller sein als Prozesse, die plattengebundene Antikörper verwenden.
Alle in dieser Patentschrift zitierten Referenzen sind vorliegend durch Hinweis umfasst, als ob gezeigt wurde, dass jeder Hinweis spezifisch und individuell durch Hinweis umfasst ist. Das Zitat von jedem Hinweis ist für dessen Offenbarung vor dem Einreichungsdatum bestimmt und sollte nicht als Erlaubnis ausgelegt werden, dass die vorliegende Offenbarung nicht berechtigt ist, diese Referenz gemäß früherer Erfindungen vorzudatieren.
Es entspricht dem Verständnis, dass jedes der oben beschriebenen Elemente oder zwei oder mehr Elemente zusammen auch eine nützliche Anwendung in anderen Typen von Verfahren finden, die sich vom oben beschriebenen Typ unterscheiden. Ohne weitere Untersuchungen wird das Vorgenannte also das Wesentliche der vorliegenden Offenbarung so vollständig offenbaren, dass andere unter Anwendung von aktuellem Wissen letzteres ohne Weiteres für verschiedene Anwendungen anpassen können, ohne Merkmale auszulassen, die vom Standpunkt des Standes der Technik weitgehend wesentliche Eigenschaften der generischen oder spezifischen Aspekte dieser Offenbarung darstellen, die in den angehängten Ansprüchen niedergelegt sind. Die vorstehenden Ausführungsformen werden nur im Wege von Beispielen dargestellt; der Umfang der vorliegenden Offenbarung darf nur durch die folgenden Ansprüche eingegrenzt werden.

Claims

Verfahren zum Transduzieren von T-Zellen umfassend: Auftauen von gefrorenen mononuklearen Zellen des peripheren Bluts (PBMC), Ruhen der aufgetauten PBMC während etwa 4 bis etwa 6 Stunden, Aktivieren der T-Zellen in den ruhenden PBMC mit einem Anti-CD3 Antikörper und einem Anti-CD28 Antikörper; Transduzieren der aktivierten T-Zellen mit einem viralen Vektor, Expansion der transduzierten T-Zellen, und Erhalten der expandierten T-Zellen.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei der Aktivierungsschritt das Immobilisieren der T-Zelle in dem ruhenden PBMC mit dem Anti-CD3-Antikörper und dem Anti-CD28-Antikörper auf einem Festphasenträger, zum Beispiel auf der Oberfläche eines Beads, einer Platte, eines Kolbens oder eines Beutels umfasst.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1-2, wobei der Anti-CD3-Antikörper und der Anti-CD28-Antikörper jeweils eine Konzentration von nicht mehr als etwa 10,0 pg/ml aufweisen.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1-3, wobei die Aktivierung und/oder das Transduzieren innerhalb eines Zeitraums von nicht mehr als etwa 120 Stunden durchgeführt werden.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1-4, wobei das Ruhen und/oder Transduzieren und/oder Expandieren in Gegenwart von mindestens einem Zytokin, wie Interleukin 7 (IL-7) und/oder Interleukin 15 (IL-15), durchgeführt wird.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1-5, wobei der virale Vektor ein retroviraler Vektor ist, der einen T-Zell-Rezeptor (TCR) exprimiert.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1-6, wobei die Expansion innerhalb eines Zeitraums von nicht mehr als etwa 30 Tage durchgeführt wird.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1-7, wobei die erhaltene T-Zelle eine CD3+ CD8+ T-Zelle ist.