CN117866093A - 抗人b7-h4抗体或其抗原结合片段及其应用 - Google Patents

抗人b7-h4抗体或其抗原结合片段及其应用 Download PDF

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CN117866093A CN202310801588.XA CN202310801588A CN117866093A CN 117866093 A CN117866093 A CN 117866093A CN 202310801588 A CN202310801588 A CN 202310801588A CN 117866093 A CN117866093 A CN 117866093A
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张畅
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Abstract

本发明公开了抗人B7‑H4抗体或其抗原结合片段及其应用，该抗人B7‑H4抗体或其抗原结合片段可高亲和力结合重组B7‑H4抗原，通过对细胞表面B7‑H4的结合诱发ADCC效应，并且具有明确的体内抗肿瘤药效。

Description

抗人B7-H4抗体或其抗原结合片段及其应用
技术领域
本发明涉及医药领域，具体地，涉及抗人B7-H4抗体或其抗原结合片段及其应用，更具体地，涉及抗人B7-H4抗体或其抗原结合片段、编码该抗体的核酸，表达该抗体的载体和细胞，制备该抗体的方法，含有该抗体的药物组合物、以及该抗体在制备药物中的用途。
背景技术
B7-H4，又称VTCN1/B7x/B7S1，被认为是免疫检查点分子，在多种肿瘤细胞表面高表达，如乳腺癌，卵巢癌，胆管癌，子宫内膜癌等，同时表达于肿瘤相关的巨噬细胞(TAM)表面。B7-H4蛋白由282个氨基酸组成，通过糖基磷脂酰肌醇(Glycosyl phosphatidylinositol，GPI)铆定于细胞膜上，也存在可溶性表达形式sB7-H4。受体目前尚不明确，但有研究表明其可能表达于活化的T细胞和中性粒细胞、MDSCs，且不同于CTLA-4、ICOS或PD-1。IFNr、IL-10等细胞因子可以诱导相关免疫细胞表达大量的B7-H4分子，从而导致抗原递呈细胞产生免疫抑制，抑制T细胞增殖与活化，近几年有研究发现了一群新的免疫抑制性细胞，被称为B7-H4+肿瘤相关巨噬细胞，可能与肿瘤细胞免疫监控逃避的功能有关，有利于免疫耐受。
癌症是目前造成人类死亡率最高的疾病之一。抗癌抗体的最新临床和商业成功引起了对基于抗体的疗法的极大兴趣。由此，治疗癌症的抗癌抗体有待进一步研究。
发明内容
本发明旨在至少解决现有技术中存在的技术问题之一。为此，本发明的一个目的在于提出抗人B7-H4抗体或其抗原结合片段及其制备方法和应用。
因而，根据本发明的一个方面，本发明提供了一种抗人B7-H4抗体或其抗原结合片段。根据本发明的实施例，该抗体或其抗原结合片段包括：
重链可变区(VH)，所述VH包括VH CDR1、VH CDR2和VH CDR3；以及
轻链可变区(VL)，所述VL包括VL CDR1、VL CDR2和VL CDR3，
其中，所述VH CDR1、VH CDR2和VH CDR3，以及所述VL CDR1、VL CDR2和VL CDR3选自下列之一：
(1)所述VH CDR1的氨基酸序列如SEQ ID NO：20所示，所述VH CDR2的氨基酸序列如YISYX1X2X3X4YYNPFLRN所示，所述VH CDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO：22所示；且所述VLCDR1的氨基酸序列如SEQ ID NO：17所示，所述VL CDR2的氨基酸序列如SEQ ID NO：18所示，所述VL CDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO：19所示；
(2)所述VH CDR1的氨基酸序列如SEQ ID NO：32所示，所述VH CDR2的氨基酸序列如AISSGGSYTSYPX5X6LKG所示，所述VH CDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO：34所示；且所述VLCDR1的氨基酸序列如HASQGINX7NIG所示，所述VL CDR2的氨基酸序列如HGTNLEX8所示，所述VL CDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO：31所示；
(3)所述VH CDR1的氨基酸序列如SEQ ID NO：26所示，所述VH CDR2的氨基酸序列如27所示，所述VH CDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO：28所示；且所述VL CDR1的氨基酸序列如SEQ ID NO：23所示，所述VL CDR2的氨基酸序列如SEQ ID NO：24所示，所述VL CDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO：25所示，
其中，
X1为D或E；
X2为G或A；
X3为N或Q；
X4为N或Q；
X5为D或T；
X6为S或A；
X7为N或Q；
X8为D或E。
根据本发明实施例的抗人B7-H4抗体或其抗原结合片段可高亲和力结合重组B7-H4抗原，通过对细胞表面B7-H4的强结合诱发ADCC效应，并且具有明确的体内抗肿瘤药效。
另外，根据本发明上述实施例的抗人B7-H4抗体或其抗原结合片段，还可以具有如下附加的技术特征：
根据本发明的实施例，所述VH包括与SEQ ID NO：2具有至少80％一致性的氨基酸序列，且所述VL包括与SEQ ID NO：1具有至少80％一致性的氨基酸序列。
根据本发明的实施例，所述VH包括SEQ ID NO：12所示的氨基酸序列，且所述VL包括SEQ ID NO：11所示的氨基酸序列。
根据本发明的实施例，所述VH包括与SEQ ID NO：4具有至少80％一致性的氨基酸序列，且所述VL包括与SEQ ID NO：3具有至少80％一致性的氨基酸序列。
根据本发明的实施例，所述VH包括SEQ ID NO：14所示的氨基酸序列，且所述VL包括SEQ ID NO：13所示的氨基酸序列。
根据本发明的实施例，所述VH包括与SEQ ID NO：6具有至少80％一致性的氨基酸序列，且所述VL包括与SEQ ID NO：5具有至少80％一致性的氨基酸序列。
根据本发明的实施例，所述VH包括SEQ ID NO：16所示的氨基酸序列，且所述VL包括SEQ ID NO：15所示的氨基酸序列。
根据本发明的实施例，所述抗体或其抗原结合片段是单克隆抗体。
根据本发明的实施例，所述抗体或其抗原结合片段是嵌合抗体。
根据本发明的实施例，所述抗体或其抗原结合片段是特异性结合人B7-H4的抗体片段，且选自Fv、Fab、Fab'、scFv和F(ab')2。
根据本发明的另一方面，本发明提供了一种分离的核酸。根据本发明的实施例，所述核酸编码前述的抗人B7-H4抗体或其抗原结合片段。
根据本发明的另一方面，本发明提供了一种载体。根据本发明的实施例，该载体包括前述的核酸。
根据本发明的另一方面，本发明提供了一种分离的细胞。根据本发明的实施例，该细胞包括前述的载体。
根据本发明的另一方面，本发明提供了一种制备前述的抗人B7-H4抗体或其抗原结合片段的方法。根据本发明的实施例，该方法包括：
(1)在合适的条件下，培养前述的细胞；以及
(2)分离回收前述的抗人B7-H4抗体或其抗原结合片段。
根据本发明的另一方面，本发明提供了一种药物组合物。根据本发明的实施例，该药物组合物包括：
前述的抗人B7-H4抗体或其抗原结合片段；以及
药学上可接受的载体。
根据本发明的另一方面，本发明提供了一种抗体-药物缀合物。根据本发明的实施例，该缀合物包含与治疗剂共价结合的、前述的抗体或其抗原结合片段。
根据本发明的另一方面，本发明提供了前述的抗人B7-H4抗体或其抗原结合片段、前述的药物组合物或前述抗体-药物缀合物在制备药物中的用途，所述药物用于治疗癌症。
根据本发明的实施例，所述癌症为肝癌。
根据本发明的另一方面，本发明提供了一种治疗癌症受试者的方法。根据本发明的实施例，给药所述受试者有效剂量的前述的抗人B7-H4抗体或其抗原结合片段、前述的药物组合物或前述抗体-药物缀合物。
根据本发明的实施例，所述癌症为肝癌。
本发明的附加方面和优点将在下面的描述中部分给出，部分将从下面的描述中变得明显，或通过本发明的实践了解到。
附图说明
本发明的上述和/或附加的方面和优点从结合下面附图对实施例的描述中将变得明显和容易理解，其中：
图1显示了根据本发明一个实施例的ELISA鉴定与重组人和猴B7-H4结合的阳性克隆的结果示意图；
图2显示了根据本发明一个实施例的抗B7-H4抗体与细胞表面B7-H4抗原结合相对活性的结果示意图；
图3显示了根据本发明一个实施例的抗B7-H4抗体ADCC活性分析的结果示意图；
图4显示了根据本发明一个实施例的ELISA鉴定抗体与重组人B7-H4结合情况的结果示意图；
图5显示了根据本发明一个实施例的ELISA鉴定抗体与重组猴B7-H4结合情况的结果示意图；
图6显示了根据本发明一个实施例的ELISA鉴定抗体与重组鼠B7-H4结合情况的结果示意图；
图7显示了根据本发明一个实施例的ELISA鉴定抗体与人B7-H4-IgV截断体的结合情况的结果示意图；
图8显示了根据本发明一个实施例的Hepa1-6皮下移植瘤模型肿瘤生长曲线的结果示意图；
图9显示了根据本发明一个实施例的Hepa1-6皮下移植瘤模型肿瘤瘤重测量结果统计图。
具体实施方式
下面详细描述本发明的实施例，所述实施例的示例在附图中示出，其中自始至终相同或类似的标号表示相同或类似的元件或具有相同或类似功能的元件。下面通过参考附图描述的实施例是示例性的，仅用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。
需要说明的是，术语“第一”、“第二”仅用于描述目的，而不能理解为指示或暗示相对重要性或者隐含指明所指示的技术特征的数量。由此，限定有“第一”、“第二”的特征可以明示或者隐含地包括一个或者更多个该特征。进一步地，在本发明的描述中，除非另有说明，“多个”的含义是两个或两个以上。
定义
为更好理解本发明，首先定义一些术语。其他定义则贯穿具体实施方式部分而列出。
术语“特异性结合”是指，两分子间的非随机的结合反应，如抗体和其所针对的抗原之间的反应。术语“免疫结合”是指发生在抗体分子和抗原(对于该抗原而言抗体为特异性的)之间的特异性结合反应。免疫结合相互作用的强度或亲和力可以相互作用的平衡解离常数(KD)表示，其中KD值越小，表示亲和力越高。两分子间的的免疫结合性质可使用本领域中公知的方法定量。一种方法涉及测量抗原结合位点/抗原复合物形成和解离的速度。指特定抗体-抗原相互作用的“结合速率常数”(Ka或Kon)和“解离速率常数”(Kd或Koff)两者都可通过浓度及缔合和解离的实际速率而计算得出，参见Malmqvist M,1993,Nature,361:186-187。Kd/Ka的比率等于解离常数KD，参见Davies DR等,1990,Annual Rev Biochem.,59:439-473。可用任何有效的方法测量KD、Ka和Kd值。在优选的实施方案中，用生物发光干涉测量法来测量解离常数。在其它优选的实施方案中，可用表面等离子共振技术(例如Biacore)或KinExa来测量解离常数。
本文中的术语“抗体”意在包括全长抗体及其任何抗原结合片段(即，抗原结合部分)或单链。全长抗体是包含至少两条重(H)链和两条轻(L)链的糖蛋白，重链和轻链由二硫键连接。各重链由重链可变区(简称VH)和重链恒定区构成。重链恒定区由三个结构域构成，即CH1、CH2和CH3。各轻链由轻链可变区(简称VL)和轻链恒定区构成。轻链恒定区由一个结构域CL构成。VH和VL区还可以划分为称作互补决定区(CDR)的高变区，其由较为保守的框架区(FR)区分隔开。各VH和VL由三个CDR以及四个FR构成，从氨基端到羧基端以FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4的顺序排布。重链和轻链的可变区包含与抗原相互作用的结合域。抗体的恒定区可以介导免疫球蛋白与宿主组织或因子的结合，包括多种免疫系统细胞(例如，效应细胞)和传统补体系统的第一组分(C1q)。
术语“单克隆抗体”或“单抗”或“单克隆抗体组成”是指单一分子组成的抗体分子制品。单克隆抗体组成呈现出对于特定表位的单一结合特异性和亲和力。
本文中的术语，抗体的“抗原结合片段”(或简称为抗体片段)，是指抗体的保持有特异结合抗原能力的一个或多个片段。已证实，抗体的抗原结合功能可以通过全长抗体的片段来实施。包含在抗体的“抗原结合部分”中的结合片段的例子包括(i)Fab片段，由VL、VH、CL和CH1构成的单价片段；(ii)F(ab′)2片段，包含铰链区二硫桥连接的两个Fab片段的二价片段；(iii)由VH和CH1构成的Fd片段；(iv)由抗体单臂VL和VH构成的Fv片段；(v)由VH构成的dAb片段(Ward et al.，(1989)Nature 341：544-546)；(vi)分离的互补决定区(CDR)；以及(vii)纳米抗体，一种包含单可变结构域和两个恒定结构域的重链可变区。此外，尽管Fv片段的两个结构域VL和VH由不同的基因编码，它们可以通过重组法经由使两者成为单蛋白链的合成接头而连接，其中VL和VH区配对形成单价分子(称为单链Fc(scFv)；参见例如Bird et al.，(1988)Science 242：423-426；and Huston et al.，(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85：5879-5883)。这些单链抗体也意在包括在术语涵义中。这些抗体片段可以通过本领域技术人员已知的常用技术而得到，且片段可以通过与完整抗体相同的方式进行功能筛选。
本发明的抗原结合片段包括能够特异性结合抗原分子的那些。抗体结合片段的实例包括例如但不限于Fab、Fab'、F(ab')2、Fv片段、单链Fv(scFv)片段和单结构域片段。
Fab片段含有轻链的恒定结构域和重链的第一恒定结构域(CH1)。Fab'片段与Fab片段的不同之处在于在重链CH1结构域的羧基末端处的少数残基的添加，包括来自抗体铰链区的一个或多个半胱氨酸。通过切割在F(ab')2胃蛋白酶消化产物的铰链半胱氨酸处的二硫键产生Fab'片段。抗体片段的另外化学偶联是本领域普通技术人员已知的。Fab和F(ab')2片段缺乏完整抗体的片段可结晶(Fc)区，从动物的循环中更快速地清除，并且可能具有比完整抗体更少的非特异性组织结合(参见例如，Wahl等人，1983，J.Nucl.Med.24:316)。
如本领域通常理解的，“Fc”区是不包含抗原特异性结合区的抗体的片段可结晶恒定区。在IgG、IgA和IgD抗体同种型中，Fc区由两个相同的蛋白质片段组成，衍生自抗体的两条重链的第二和第三恒定结构域(分别为CH2和CH3结构域)。IgM和IgE Fc区在每条多肽链中含有三个重链恒定结构域(CH2、CH3和CH4结构域)。
术语“人源化抗体”，人源化抗体主要指鼠源单克隆抗体以基因克隆及DNA重组技术改造，重新表达的抗体，其大部分氨基酸序列为人源序列取代，基本保留亲本鼠单克隆抗体的亲和力和特异性，又降低了其异源性。
术语“嵌合抗体”是指重链和/或轻链的一部分与衍生自特定物种或属于特定抗体类别或亚类的抗体中的相应序列相同或同源，而链的剩余部分与衍生自另一物种或属于另一抗体类别或亚类的抗体中的相应序列相同或同源，以及此类抗体的片段，只要它们展现出期望的生物学活性(美国专利No.4,816,567；Morrison SL,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,81:6851-6855,1984)。例如，术语“嵌合抗体”可包括这样的抗体(例如人鼠嵌合抗体)，其中抗体的重链和轻链可变区来自第一抗体(例如鼠源抗体)，而抗体的重链和轻链恒定区来自第二抗体(例如人抗体)。
术语“重链”，重链(heavy chain，H链)大小约为轻链的2倍，含450～550个氨基酸残基，分子量约为55或75kD。每条H链含有4～5个链内二硫键所组成的环肽。不同的H链由于氨基酸组成的排列顺序、二硫键的数目和位置、含的种类和数量不同，其抗原性也不相同，根据H链抗原性的差异可将其分为5类：μ链、γ链、α链、δ链和ε链，不同H链与L链(κ或λ链)组成完整免疫球蛋白的分子分别称之为IgM、IgG、IgA、IgD和IgE。γ、α和δ链上含有4个肽，μ和ε链含有5个环肽。
术语“轻链”，轻链(light chain，L)指在免疫球蛋白单体分子中相对于重链而论，在分子量上较小的多肽链。每条轻链近氨基末端(N端)1/2区域内的氨基酸组成序列多变处为轻链可变区(VL)，是Ig分子与抗原结合部位的一个组成部分。其余1/2区域内的氨基酸组成及排列顺序相对稳定处为轻链恒定区(CL)。由于轻链恒定区内氨基酸序列存在某些差异，故轻链有k和λ两型。
术语“种系”，又称胚系(germline)，抗体形成细胞具有编码Ig分子的全部基因(即有限数量的C基因和未知数量的V基因，它是通过长期进化形成并通过生殖细胞从亲代传给子代，人免疫球蛋白的重链基因由V-D-J-C基因片段编码而成；轻链基因由V-J-C基因片段编码而成，基因片段的个数不等。人重链基因定位于第14号染色体长臂，跨度约1,100kb，由V、D、J和C四种基因片段组成，包含约95个Va基因片段(分VHl～VH7七个家族，其中功能性基因片段65个、27个D基因片段、6个JH基因片段和9个CH基因片段。Va基因片段位于上游，D基因片段位于VH和JH基因簇之间，JH基因位于DH下游，与下游C基因区相隔7Kb左右，CH基因成簇(cluster)排列，跨度约200kb，P和S基因紧位于JH基因片段下游，C8下游依次是Cγ、Cα和Cε。人轻链基因分为λ和x基因，分别定位于第22号染色体长臂和第2号染色体短臂。功能性VK基因片段约40个，Vc基因片段后是5个功能性J和1个Cκ；Vλ基因片段约30个，4个Jλ基因片段和4个Cλ基因片段。
术语“EC50”，又叫半最大效应浓度，是指引起50％最大效应的抗体浓度。
术语“载体”、“核酸构建体”是指能够运输与其连接的另一种核酸的核酸分子。一种类型的载体是“质粒”，其是指其中可以连接另外的DNA区段的环状双链DNA环。另一种类型的载体是病毒载体，其中额外的DNA区段可以连接到病毒基因组中。某些载体能够在它们被导入的宿主细胞中自主复制(例如，具有细菌复制起点和游离型哺乳动物载体的细菌载体)。其他载体(例如非附加型哺乳动物载体)可以在导入宿主细胞后整合到宿主细胞的基因组中，并由此与宿主基因组一起复制。此外，某些载体能够指导它们有效连接的基因的表达。这种载体在本文中被称为“重组表达载体”(或简称为“表达载体”)。通常，在重组DNA技术中有用的表达载体通常以质粒的形式存在。然而，也包括其他形式的表达载体，如病毒载体(例如，复制缺陷型逆转录病毒，腺病毒和腺伴随病毒)，其起到等同的功能。
术语“核酸分子”旨在包括DNA分子和RNA分子。核酸分子可以是单链或双链的，并且可以是cDNA。
术语“多肽”是指包含至少两个连续连接的氨基酸残基的链，对链的长度没有上限。蛋白质中的一个或多个氨基酸残基可含有修饰，例如但不限于糖基化，磷酸化或二硫键。“蛋白质”可以包含一种或多种多肽。
术语“宿主细胞”在其中载体可以增殖并且其DNA可以表达的细胞，所述细胞可以是原核细胞或者真核细胞。该术语还包括受试宿主细胞的任何后代。应理解，并不是所有的后代都与亲本细胞相同，因为在复制过程中可能会发生突变，这类后代被包括在内。
术语“癌症”和“肿瘤”是指或描述哺乳动物的其中细胞群体的特征在于细胞生长不受调控的生理病状。癌症的实例包括但不限于癌瘤、淋巴瘤、胚细胞瘤、肉瘤、白血病、良性或恶性肿瘤。所述癌症的更特定实例包括鳞状细胞癌、小细胞肺癌、非小细胞肺癌、肺腺癌、肺鳞状癌、腹膜癌、肝细胞癌、胃肠癌、胰腺癌、成胶质细胞瘤、子宫颈癌、卵巢癌、肝癌(liver cancer)、膀胱癌、肝细胞瘤、乳癌、结肠癌、结肠直肠癌、子宫内膜癌或子宫癌、唾液腺癌、肾癌、肝癌、前列腺癌、阴门癌、甲状腺癌、脑癌、肝癌(hepatic carcinoma)和各种类型的头颈部癌、I型或II型神经纤维瘤病。所述癌症的其它实例包括具有疗法抗性、难治性或转移性的那些。
术语“抗体药物偶联物”，简称“缀合物”，由抗体、连接子和药物组成，所述连接子是可断裂连接子组合或不可断裂连接子。抗体是球状蛋白，含有一系列氨基酸位点可用于偶联药物-连接子。由于其三级和四级结构，只有溶剂可及的氨基酸可供偶联。事实上，高收率的偶联通常发生在赖氨酸残基的ε-氨基基团或半胱氨酸残基的巯基基团上。抗体蛋白表面的大量赖氨酸侧链导致大量的位点可供药物偶联，从而导致生成的抗体药物偶联物是混合物，含有不同的药物偶联数量(药物/抗体比值，DAR)和偶联位点。本发明提供的偶联产品，尽管仍然是混合物，但与传统方式偶联得到的抗体药物偶联物相比，其DAR分布范围很窄。其平均DAR值接近4，接近最佳抗体药物偶联物平均DAR值(2-4)范围。此外，偶联产品极少不含有裸抗(DAR＝0)，这一组分对细胞毒杀不起作用。同时，偶联产品也不含有重度偶联产品(DAR＝8),这一组分在体内的清除速度很快，相对于低DAR的组分而言。因此，本发明提供的抗体药物偶联物产品非均一性得到很大的改善。
抗人B7-H4抗体和其抗原结合片段
本发明提供了特异性结合B7-H4的抗体及其抗原结合片段。根据本发明实施例的抗人B7-H4抗体或其抗原结合片段通过对细胞表面B7-H4的强结合诱发ADCC效应，并且具有明确的体内抗肿瘤药效。本发明实施例提供了几种鼠源抗B7-H4抗体，例如418、164和266，及其人源化抗体和突变体。
如通过Kabat编码定义的，418和418衍生抗体(例如人源化抗体)的CDR序列包含重链可变结构域的CDR，SEQ ID NO:20-22，和轻链可变结构域的CDR，SEQ ID NO:17-19。
类似地，如通过Kabat编码定义的，164和164衍生抗体的CDR序列包含重链可变结构域的CDR，SEQ ID NO:26-28，和轻链可变结构域的CDR，SEQ ID NO:23-25。
类似地，如通过Kabat编码定义的，266和266衍生抗体的CDR序列包含重链可变结构域的CDR，SEQ ID NO:32、33和34，和轻链可变结构域的CDR，SEQ ID NO:29、30和31。
本发明实施例还提供了人源化抗体的重链可变区和轻链可变区的氨基酸序列。由于存在不同的使小鼠抗体人源化的方法(例如，序列可以被不同的氨基酸替换)，因此抗体的重链和轻链可以具有多于一种形式的人源化序列。人源化418(hz418)抗体的重链可变区的氨基酸序列在SEQ ID NO:12中示出。人源化418的轻链可变区的氨基酸序列在SEQ IDNO:11中示出。
类似地，人源化266(hz266)抗体的重链可变区的氨基酸序列在SEQ ID NO:16中示出。人源化266(hz266)抗体的轻链可变区的氨基酸序列在SEQ ID NO:15中示出。
类似地，人源化164(hz164)抗体的重链可变区的氨基酸序列在SEQ ID NO:14中示出。人源化164(hz164)抗体的轻链可变区的氨基酸序列在SEQ ID NO:13中示出。
在一些实施方案中，抗体可具有包含互补决定区(CDR)1、2、3的重链可变区(VH)，其中CDR1区包含或由与所选VH CDR1氨基酸序列具有至少80％、85％、90％或95％同一性的氨基酸序列组成，CDR2区包含或由与所选VH CDR2氨基酸序列具有至少80％、85％、90％或95％同一性的氨基酸序列组成，并且CDR3区包含与所选VH CDR3氨基酸序列具有至少80％、85％、90％或95％同一性的氨基酸序列或由其组成；以及包含CDR 1、2、3的轻链可变区(VL)，其中CDR1区包含或由与所选VL CDR1氨基酸序列具有至少80％、85％、90％或95％同一性的氨基酸序列组成，CDR2区包含或由与所选VL CDR2氨基酸序列具有至少80％、85％、90％或95％同一性的氨基酸序列组成，并且CDR3区包含或由与所选VL CDR3氨基酸序列具有至少80％、85％、90％或95％同一性的氨基酸序列组成。
在一些实施方案中，本文所述的抗体或抗原结合片段可包含重链可变结构域，所述重链可变结构域包含以下CDR中的一个、两个或三个：具有0、1或2个氨基酸插入、缺失或替换的SEQ ID NO:20；具有0、1或2个氨基酸插入、缺失或替换的SEQ ID NO:21；具有0、1或2个氨基酸插入、缺失或替换的SEQ ID NO:22，例如，SEQ ID NO:21的突变体可以如SEQ IDNO:35、36、37和38所示。
在一些实施方案中，本文所述的抗体或抗原结合片段可包含轻链可变结构域，所述轻链可变结构域包含以下CDR中的一个、两个或三个：具有0、1或2个氨基酸插入、缺失或替换的SEQ ID NO:17；具有0、1或2个氨基酸插入、缺失或替换的SEQ ID NO:18；具有0、1或2个氨基酸插入、缺失或替换的SEQ ID NO:19。
在一些实施方案中，本文所述的抗体或抗原结合片段可包含重链可变结构域，所述重链可变结构域包含以下CDR中的一个、两个或三个：具有0、1或2个氨基酸插入、缺失或替换的SEQ ID NO:26；具有0、1或2个氨基酸插入、缺失或替换的SEQ ID NO:27；具有0、1或2个氨基酸插入、缺失或替换的SEQ ID NO:28。
在一些实施方案中，本文所述的抗体或抗原结合片段可包含轻链可变结构域，所述轻链可变结构域包含以下CDR中的一个、两个或三个：具有0、1或2个氨基酸插入、缺失或替换的SEQ ID NO:23；具有0、1或2个氨基酸插入、缺失或替换的SEQ ID NO:24；具有0、1或2个氨基酸插入、缺失或替换的SEQ ID NO:25。
在一些实施方案中，本文所述的抗体或抗原结合片段可包含重链可变结构域，所述重链可变结构域包含以下CDR中的一个、两个或三个：具有0、1或2个氨基酸插入、缺失或替换的SEQ ID NO:32；具有0、1或2个氨基酸插入、缺失或替换的SEQ ID NO:33；具有0、1或2个氨基酸插入、缺失或替换的SEQ ID NO:34，例如，SEQ ID NO:33的突变体可以如SEQ IDNO:40或SEQ ID NO:41。
在一些实施方案中，本文所述的抗体或抗原结合片段可包含轻链可变结构域，所述轻链可变结构域包含以下CDR中的一个、两个或三个：具有0、1或2个氨基酸插入、缺失或替换的SEQ ID NO:29；具有0、1或2个氨基酸插入、缺失或替换的SEQ ID NO:30；具有0、1或2个氨基酸插入、缺失或替换的SEQ ID NO:31，例如，SEQ ID NO:29的突变体可以如SEQ IDNO:39所示，SEQ ID NO:30的突变体可以如SEQ ID NO:42所示。
其中，需要说明的是，插入、缺失和替换可在CDR序列内，或在CDR序列的一个或两个末端。
本发明实施例还提供了与B7-H4结合的抗体或其抗原结合片段。该抗体或其抗原结合片段包含：重链可变区(VH)，所述重链可变区(VH)包含与所选VH序列具有至少80％、85％、90％、95％或98％同一性的氨基酸序列或由其组成；以及轻链可变区(VL)，所述轻链可变区(VL)包含与所选VL序列具有至少80％、85％、90％、95％或98％同一性的氨基酸序列或由其组成。在一些实施方案中，所选VH序列是SEQ ID NO:2或12，并且所选VL序列是SEQID NO:1或11。在一些实施方案中，所选VH序列是SEQ ID NO:4或14，并且所选VL序列是SEQID NO:3或13。在一些实施方案中，所选VH序列是SEQ ID NO:6或16，并且所选VL序列是SEQID NO:5或15。
抗体的片段适合用于所提供的方法，只要其保留了全长抗体的期望亲和力和特异性即可。因此，与B7-H4结合的抗体的片段将保留与B7-H4结合的能力。Fv片段是包含完整抗原识别和结合位点的抗体片段。该区域由紧密缔合的一个重链可变结构域和一个轻链可变结构域的二聚体组成，所述缔合在性质上可以是共价的，例如在scFv中。以此配置，每个可变结构域的三个CDR相互作用以限定在VH-VL二聚体的表面上的抗原结合位点。六个CDR或其子集共同为抗体赋予抗原结合特异性。然而，即使单个可变结构域(或Fv的仅包含三个对抗原具有特异性的CDR的一半)也可具有识别和结合抗原的能力，但是通常亲和力低于整个结合位点。
单链Fv或(scFv)抗体片段包含抗体的VH和VL结构域(或区域)，其中这些结构域存在于单个多肽链中。通常，Fv多肽在VH和VL结构域之间还包含多肽接头，其使得scFv能够形成用于抗原结合的期望结构。
Fab片段包含轻链的可变结构域和恒定结构域以及重链的可变结构域和第一恒定结构域(CH1)。F(ab')2抗体片段包含一对Fab片段，它们通常在其羧基末端附近通过其之间的铰链半胱氨酸共价连接。抗体片段的其他化学偶联在本领域中也是已知的。
核酸、载体和细胞
本发明实施例还提供了包含编码多肽的多核苷酸的核酸，所述多肽包含免疫球蛋白重链或免疫球蛋白轻链。当多肽与相应的多肽(例如，相应的重链可变区或相应的轻链可变区)配对时，所述配对的多肽结合B7-H4(例如，人B7-H4)。
本发明实施例还提供了包括本文公开的分离的多核苷酸(例如，编码本文公开的多肽的多核苷酸)的重组载体(例如表达载体)、引入了重组载体的宿主细胞(即，使得所述宿主细胞含有多核苷酸和/或含多核苷酸的载体)、以及通过重组技术产生重组抗体多肽或其片段。
如本文所用，“载体”是当载体被引入宿主细胞时能够将一个或多个目标多核苷酸递送至所述宿主细胞的任何构建体。“表达载体”能够在已引入表达载体的宿主细胞中递送和表达一个或多个目标多核苷酸作为编码的多肽。因此，在表达载体中，目标多核苷酸通过与调控元件诸如启动子、增强子和/或多聚腺苷酸尾可操作地连接而定位于载体中表达，所述调控元件位于载体内或宿主细胞的基因组中的目标多核苷酸的整合位点处或所述整合位点附近或所述整合位点两侧，使得目标多核苷酸将在引入了所述表达载体的宿主细胞中得以翻译。
可以通过本领域已知的方法，例如电穿孔、化学转染(例如DEAE-葡聚糖)、转化、转染以及感染和/或转导(例如用重组病毒)将载体引入到宿主细胞中。因此，载体的非限制性实施例包括病毒载体(可用于产生重组病毒)、裸DNA或RNA、质粒、粘粒、噬菌体载体以及与阳离子缩合剂相关的DNA或RNA表达载体。
本发明实施例提供了用上文描述的载体转化的宿主细胞。宿主细胞可以是原核或真核细胞。优选的原核宿主细胞是大肠杆菌(Escherichia coli)。优选地，真核细胞选自：原生生物细胞、动物细胞、植物细胞和真菌细胞。更优选地，宿主细胞是哺乳动物细胞，包括但不限于CHO和COS细胞。优选的真菌细胞是酿酒酵母。
制备抗B7-H4抗体的方法
可以使用多克隆和单克隆抗体制备的标准技术，将人B7-H4的分离片段用作免疫原以产生抗体。可以通过多次注射(例如皮下或腹腔注射)抗原肽或蛋白质而在动物中产生多克隆抗体。在一些实施方案中，将抗原肽或蛋白质与至少一种佐剂一起注射。在一些实施方案中，可以将抗原肽或蛋白质与待免疫物种中具有免疫原性的药剂缀合。可以多次向动物注射抗原肽或蛋白质。
免疫原通常用于通过免疫合适的受试者(例如表达至少一个人免疫球蛋白基因座的人或转基因动物)来制备抗体。合适的免疫原性制剂可以含有例如重组表达的多肽或化学合成的多肽(例如人B7-H4的片段)。制剂可以进一步包含佐剂，例如弗氏完全或不完全佐剂、或类似的免疫刺激剂。
抗体-药物缀合物、药物组合物和用途及治疗方法
本发明实施例还提供了含有本发明实施例所述的抗体或抗原结合片段中的至少一种(例如，一种、两种、三种或四种)的药物组合物。本文所述的任何抗体或抗原结合片段中的两种或更多种(例如，两种、三种或四种)可以以任何组合存在于药物组合物中。可以以本领域已知的任何方式配制药物组合物。
药物组合物还可以含有药学可接受的载体。如本文使用的，“药学可接受的载体”包括生理上相容的任何和所有溶剂、分散介质、包衣、抗细菌剂和抗真菌剂、等渗剂和吸收延迟剂等等。药学可接受的载体的实例包括水、盐水、磷酸盐缓冲盐水、右旋糖、甘油、乙醇等等中的一种或多种及其组合。在许多情况下，优选在组合物中包含等渗剂，例如糖、多元醇如甘露醇、山梨糖醇或氯化钠。药学可接受的载体可以进一步包含少量辅助物质，例如润湿剂或乳化剂、防腐剂或缓冲剂，其增加抗体的贮存期限或效力。
在一些实施方案中，本发明提供了抗体-药物缀合物，其包含本文中提供的任何抗B7-H4抗体和其它物质，例如治疗剂。在一些实施方案中，治疗剂可以是免疫调节剂，例如抗炎剂或免疫抑制剂。在一些实施方案中，治疗剂选自细胞毒性剂、细胞因子、小分子药物或其他抗体。
在一些实施方案中，适合于B7-H4形成免疫缀合物的治疗剂。
在一些实施方案中，所述免疫缀合物用于预防或治疗B7-H4相关疾病，例如肿瘤或癌症。
在一个方面，本发明提供了前述的抗人B7-H4抗体或其抗原结合片段在制备药物中的用途，所述药物用于治疗癌症。根据本发明的实施例，所述癌症包括肝癌。
本发明提供了一种或多种抗体或其抗原结合片段可以用于多种治疗目的。在一个方面，本公开提供了用于治疗受试者癌症的方法、降低受试者肿瘤体积随时间增加的速率的方法、降低发生转移的风险的方法、或降低受试者发生另外转移的风险的方法。在一些实施方案中，治疗可以停止、减慢、延缓或抑制癌症的进展。在一些实施方案中，治疗可导致受试者癌症的一个或多个症状的数量、严重程度和/或持续时间减少。
在一个方面，本公开的特征在于如下方法，所述方法包括向有需要的受试者(例如，患有、或鉴定为患有或诊断为患有癌症的受试者)施用治疗有效剂量的本文公开的抗体或其抗原结合片段、药物组合物或抗体-药物缀合物，所述癌症例如肝癌。
在一些实施方案中，本文公开的组合物和方法可用于治疗有癌症风险的患者。可以用本领域已知的多种方法来鉴定患有癌症的患者。
下面参考具体实施例，对本发明进行说明，需要说明的是，这些实施例仅仅是说明性的，而不能理解为对本发明的限制。
下面将结合实施例对本发明的方案进行解释。本领域技术人员将会理解，下面的实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体技术或条件的，按照本领域内的文献所描述的技术或条件(例如参考J.萨姆布鲁克等著，黄培堂等译的《分子克隆实验指南》，第三版，科学出版社)或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品，例如可以采购自Sigma公司。
实施例1：抗人B7-H4杂交瘤抗体的制备
采用B7-H4-mFc重组蛋白(序列号：NM_024626.2，29-258aa)免疫Balb/c小鼠，用包被重组人B7-H4-his重组蛋白(序列号：NM_024626.2，29-258aa)、进行血清滴度检测，达到融合要求后进行杂交瘤细胞融合和阳性克隆筛选。获得与人和猴B7-H4重组蛋白均结合的阳性克隆(图1)。选择克隆418、164和266进行基因调取，获得三个特异性抗体序列。其轻重链可变区氨基酸序列分别见SEQ ID NO：1-6。
SEQ ID NO：1 418VL(CDR1、2和3的序列分别为SEQ ID NO：17、18和19)
DIVLTQSPASLAVSLGQRATFSCRASKSVSTSNYNYMNWYQQKPGQPPKLLIKYASNLESGVPARFSGSGSGTDFTLNIHPVEEEDAATYYCQHSREFPYTFGGGTKLEIK
SEQ ID NO：2 418VH(CDR1、2和3的序列分别为SEQ ID NO：20、21和22)
EVQLEESGPGLVKPSQSLSLTCSVTGYSITSGYYWNWIRQFPGNKLEWMGYISYDGNNYYNPFLRNRISITRDTSKNQFFLKLNSVTTEDTATYYCARGNVGFFGSSLFAYWGQGTLVTVSA
SEQ ID NO：3 164VL(CDR1、2和3的序列分别为SEQ ID NO：23、24和25)
QIVLTQSPAIMSASPGEKVTISCSASSSVSYMYWYQQKPGSSPKLWIYRTSNLASGVPPRFSGSGSGTSYSLTISSMEAEDAATYYCQQYHTYPPTWTFGGGTKLEIK
SEQ ID NO：4 164VH(CDR1、2和3的序列分别为SEQ ID NO：26、27和28)
EVQLVESGGGLVKPGGSLKLSCTASGFTFSDYGIHWVRQAPEKGLEWVAYINSGSSTLYYADTVKGRFTISRDNAKNTLFLQMTSLRSEDTAMYYCTRGPGYVFAYWGQGTLVTVSASEQ ID NO：5 266VL(CDR1、2和3的序列分别为SEQ ID NO：29、30和31)
DILMTQSPSSMSVSLGDTVSITCHASQGINNNIGWLQQKPGKSFKGLIYHGTNLEDGVPSRFSGSGSGADYSLTISSLESEDFADYYCVQYAQFPRTFGGGTKLEIK
SEQ ID NO：6 266VH(CDR1、2和3的序列分别为SEQ ID NO：32、33和34)
EVQLVESGGDLVKPGGSLKVSCAASGFTFSDYGMAWVRQTPDKRLEWVAAISSGGSYTSYPDSLKGRFTISRDNAKNTLYLQMSSLKSEDTAIYYCVRGSNFPAYWGQGTTLTVSS
实施例2：嵌合抗体及对照抗体的制备
将实施例1得到的抗体418、164和266以及合成的对照抗体ref1.9可变区基因分别克隆到装有人轻链恒定区(氨基酸序列见SEQ ID NO：7)编码基因和重链恒定区(氨基酸序列见SEQ ID NO：8)编码基因的真核瞬时表达载体pKN019(科诺信诚自构建表达载体，在商业化载体PPT5基础上添加Ck编码基因和相应酶切位点)和pKN041(科诺信诚自构建，在商业化载体PTT5基础上添加人IgG1编码基因和相应酶切位点)中，获得目标抗体轻链和重链重组表达质粒，转染HEK293细胞(293fectin，Cat:12347019，Gibco)进行重组表达。细胞转染后5-6天，取培养上清，利用ProA亲和层析柱对表达上清进行纯化，获得抗体蛋白纯品。Ref1.9氨基酸序列来源于Gentech专利WO2014159835，轻链氨基酸序列见SEQ ID NO：9，重链氨基酸序列见SEQ ID NO：10。
SEQ ID NO：7轻链恒定区氨基酸序列
RTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
SEQ ID NO：8重链恒定区氨基酸序列IgG1序列
ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
SEQ ID NO：9ref1.9 VL
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKASQGFNKYVAWYQQKPGKAPKLLIYYTSTLQPGVPSRFSGSGSGRDYTLTISSLQPEDFATYYCLQYGNLLYAFGQGTKVEIK
SEQ ID NO：10ref1.9 VH
EVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYWIGWVRQAPGQGLEWIGDIYPGGGYTNYNEKFKGRVTITRDTSTSTAYLELSSLRSEDTAVYYCARLDGSSYRGAMDSWGQGTLVTVSS
实施例3：嵌合抗B7-H4抗体分析鉴定
1.Fortebio测定抗体亲和力
利用Fortebio公司的Octet QKe system仪器，采用抗人抗体Fc段的捕获抗体(AHC)生物探针捕获抗体Fc段的方法测定实施例1得到的抗体的亲和力。测定时将抗体用PBS缓冲液稀释至4ug/mL，流经AHC探针(Cat:18-0015，PALL)表面，时间为120s。采用100nM人B7-H4-his重组蛋白作为流动相，结合时间为300s，解离时间为300s。实验完毕，扣除空白对照响应值，用软件进行1：1Langmuir结合模式拟合，计算抗原抗体结合的动力学常数，结果如表1所示，三株嵌合抗体亲和力均明显高于对照抗体ref1.9，其中抗体164由于解离常数超出检测范围，而无法精确拟合，预计亲和力达到pM水平。
表1：抗B7-H4抗体结合解离常数
Loading Sample KD(M) kon(1/Ms) kdis(1/s)
266 4.72E-10 8.30E+05 3.92E-04
164 <1.0E-12 5.37E+05 <1.0E-07
418 2.08E-10 3.31E+05 6.89E-05
Ref.1.9 1.17E-09 9.82E+04 1.15E-04
2.FACS检测抗体与细胞表面人B7-H4抗原的结合活性
将对数生长期的稳定转染人B7-H4的CHO细胞调整为2*105/样品，抗B7-H4抗体稀释至1μg/mL，与细胞4℃共孵育1h，充分洗涤，加入1:100稀释的FITC标记的羊抗人IgG抗体(Cat：F9512，Sigma)，孵育30min后，充分洗涤后通过流式细胞仪(型号B49007AD，SNAW31211，BECKMAN COULTER)检测细胞的平均荧光强度(MFI)，并与对照抗体Ref.1.9的MFI作为参照物，获得每个抗体的MFI值与Ref.1.9的MFI值的比值，4次实验的比值汇总后进行分析，结果如图2所示，几株抗体与细胞表面B7-H4结合能力基本相当。
实施例4：抗体人源化
1.鼠源单克隆抗体的人源化序列
对实施例1的三株鼠源抗体轻重链序列进行综合分析，选择人抗体germline库(http://www2.mrc-lmb.cam.ac.uk/vbase/alignments2.php#VHEX；http://www2.mrc-lmb.cam.ac.uk/vbase/alignments2.php#VHEX)中最相似人源抗体template，对抗体418、164和266轻重链可变区进行人源化，抗体418人源化后的序列分别如SEQ ID NO：11和SEQID NO：12所示；抗体164人源化后的序列分别如SEQ ID NO：13和SEQ ID NO：14所示；抗体266人源化后的序列分别如SEQ ID NO：15和SEQ ID NO：16所示。进一步地，对hz418和hz266的风险位点进行突变设计，突变体突变位点信息见表2和表3所示，主要对CDR区进行突变，另外，对Hz266mut5和Hz266mut5在框架区进行了突变，对与LCDR2的3’末端连接的框架序列进行了突变，将G突变为A，其余框架区均未突变。
SEQ ID NO：11hz418 VL(CDR1、2和3的序列分别为SEQ ID NO：17、18和19)
EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASKSVSTSNYNYMNWYQQKPGQAPRLLIKYASNLESGVPSRFSGSGSGTDFTLTINSLEAEDAATYYCQHSREFPYTFGGGTKLEIK
SEQ ID NO：12hz418 VH(CDR1、2和3的序列分别为SEQ ID NO：20、21和22)
QVQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGYSISSGYYWNWIRQPPGKGLEWMGYISYDGNNYYNPFLRNRVTISVDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCARGNVGFFGSSLFAYWGQGTLVTVSA
SEQ ID NO：13hz164 VL(CDR1、2和3的序列分别为SEQ ID NO：23、24和25)
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCSASSSVSYMYWYQQKPGKVPKLLIYRTSNLASGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQYHTYPPTWTFGQGTKVEIK
SEQ ID NO：14hz164 VH(CDR1、2和3的序列分别为SEQ ID NO：26、27和28)
EVQLVESGGGLVKPGGSLRLSCAASGFTFSDYGIHWVRQAPGKGLEWVAYINSGSSTLYYADTVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARGPGYVFAYWGQGTLVTVSS
SEQ ID NO：15hz266 VL(CDR1、2和3的序列分别为SEQ ID NO：29、30和31)
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCHASQGINNNIGWLQQKPGKAPKLLIYHGTNLEDGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFADYYCVQYAQFPRTFGQGTKLEIK
SEQ ID NO：16hz266 VH(CDR1、2和3的序列分别为SEQ ID NO：32、33和34)
EVQLVESGGGLVKPGGSLRVSCAASGFTFSDYGMAWVRQAPGKGLEWVAAISSGGSYTSYPDSLKGRFTISRDNAKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARGSNFPAYWGQGTLVTVSS
表2.hz418突变体突变位点信息
VH CDR2
hz418-VH YISYDGNNYYNPFLRN(SEQ ID NO：21)
hz418mut1 YISYEGNNYYNPFLRN(SEQ ID NO：35)
hz418mut2 YISYDANNYYNPFLRN(SEQ ID NO：36)
hz418mut3 YISYEAQNYYNPFLRN(SEQ ID NO：37)
hz418mut4 YISYEANQYYNPFLRN(SEQ ID NO：38)
表3.hz266突变体突变位点信息
2.人源化单克隆抗体的重组表达
将人源化设计的418、164和266抗体轻重链可变区序列进行全合成，将人源化的hz418_VH、hz164_VH和hz266_VH通过酶切克隆入真核瞬时表达载体pKN041(科诺信诚自构建，在商业化载体PTT5基础上添加人IgG1编码基因和相应酶切位点)的人IgG1的重链恒定区编码基因的上游；将人源化的hz418_VL、hz164_VL和hz266_VL通过酶切克隆入真核瞬时表达载体pKN019(科诺信诚自构建表达载体，在商业化载体PPT5基础上添加Ck编码基因和相应酶切位点)的人轻链Cκ的编码基因的上游，构建人源化hz418、hz164和hz266轻、重链重组表达载体。进一步地，通过定点突变的方法，分别构建hz418和hz266的风险位点突变体重组表达载体。根据转染试剂293fectin(Cat:12347019，Gibco)的操作说明，将hz418、hz164和hz266轻重链质粒转入HEK293细胞中重组表达。细胞转染后5-6天，取培养上清，利用ProA亲和层析柱对表达上清进行纯化，获得的hz418、hz164和hz266及相应突变体抗体样本。
实施例5人源化抗体亲和力分析
利用Fortebio公司的Octet QKe system仪器，采用抗人抗体Fc段的捕获抗体(AHC)生物探针捕获抗体Fc段的方法测定抗体亲和力。测定时将待测抗体用PBS缓冲液稀释至4ug/mL，流经AHC探针(Cat:18-0015，PALL)表面，时间为120s。人B7-H4-His重组蛋白作为流动相，浓度分别为60nM。结合时间为300s，解离时间为300s。实验完毕，扣除空白对照响应值，用软件进行1：1Langmuir结合模式拟合，计算抗原抗体结合的动力学常数，结果如表4所示，人源化抗体及其突变体均保持了较高的亲和力，其中hz164的亲和力最高，hz418的亲和力次之，hz266的亲和力低于另外两个抗体。
表4.Fortebio测定人源化抗体及其突变体亲和力
Samples KD(M) kon(1/Ms) kdis(1/s)
hz418 3.45E-10 2.80E+05 9.66E-05
hz418mut1 6.51E-10 2.27E+05 1.48E-04
hz418mut2 2.08E-10 3.03E+05 6.28E-05
hz418mut3 2.57E-10 2.82E+05 7.25E-05
hz418mut4 3.21E-10 3.18E+05 1.02E-04
hz266 1.66E-09 3.03E+05 5.01E-04
hz266mut1 1.79E-09 4.13E+05 7.38E-04
hz266mut2 1.42E-09 3.82E+05 5.43E-04
hz266mut3 3.96E-09 4.94E+05 1.96E-03
hz266mut4 1.17E-09 4.54E+05 5.30E-04
hz266mut5 4.80E-10 1.55E+06 7.43E-04
hz266mut6 1.80E-09 1.31E+06 2.36E-03
Hz164 1.75E-10 3.35E+05 5.86E-05
实施例6人源化抗体结合SKBR-3后引发内化和ADCC活性评价
1.内化活性分析
将天然表达人B7-H4的人乳腺癌细胞SKBR-3(ATCC/R○HTB-30TM)，以3×103cells/孔的密度接种于96孔细胞培养板，培养24小时。用PBS洗涤细胞1次，弃上清。将人源化抗体hz418、hz164和hz266和对照抗体Ref1.9，用RPMI 1640(含10％ FBS)稀释至10μg/mL，加入SKBR-3细胞中，一组放37℃电热恒温培养箱，一组放4℃冰箱做为阴性对照；阴性对照孵育1小时后PBS洗涤3次，加入1:200稀释的山羊抗人IgG Fc-FITC二抗，4℃孵育30分钟后，PBS洗涤3次，FACS检测细胞的平均荧光强度(MFI)，37℃实验组孵育5h后，加入1:200稀释的山羊抗人IgG Fc-FITC二抗，4℃孵育30分钟PBS洗涤3次，FACS检测细胞的平均荧光强度(MFI)。根据公式计算抗体的内化效率：内化率％＝100-(37℃孵育样品的MFI×100/4℃孵育对照样品的MFI)。
实验结果(表5)表明人源化体hz418、hz164和hz266和对照抗体Ref1.9在37℃条件下发生内化的比例较低，仅hz418的内化比例达到16％。
表5.抗B7-H4抗体介导细胞表面内化情况
ANTIBODY 内吞百分比(％)
hz164 4.53
hz418 16.15
Ref.1.9 10.07
hz266 2.56
2.ADCC活性分析
对数生长期的SKBR-3为靶细胞，在实验前20-24h，铺板2X104cell/well，100μL；Jurkat ADCC12细胞(购自中检院)为效应细胞，检测抗体1μg/ml开始用RPMI-1640培养基三倍梯度稀释10个梯度，与靶细胞在30℃孵育30min，调整细胞密度4×106cells/ml，加入到效应细胞种，于37℃CO2培养箱中培养16–24h。加入Bio-Glo Luciferase Assay Reagent(Promega/G7940)检测光信号。X轴数据为log转换的Heceptin质量浓度(ng/mL)，Y轴数据为化学发光值(RLU)。使用4参数公式f(x)＝B+(A-B)/(1+10^((C-x)*D))拟合获得ADCCbioassay的回归曲线，计算抗体效应的EC50数值。结果表明(图3)，抗体hz418和hz164均有较强的ADCC活性，EC50与对照抗体ref.1.9无明显差别，但Emax值上，hz164略优于ref.1.9，明显优于hz418，而抗体hz266未检出ADCC活性。
实施例7：三株抗体种属交叉及不同抗体表位竞争分析
ELISA方法检测实施例4的三株抗体hz418、hz164和hz266分别与重组人、猴和鼠B7-H4结合。结果表明(图4-6和表6)，hz418与人、猴及鼠B7-H4均具有良好结合活性，EC50基本相当，且明显高于对照抗体ref.1.9；而hz164和hz266均与猴B7-H4交叉与鼠不交叉，EC50明显优于对照抗体。
同样ELISA方法检测不同抗体与人B7-H4的IgV区结合活性(图7)，发现不同抗体表现差异较大，其中对照抗体和hz266与IgV结合活性基本与全长B7-H4相当，而hz418完全不结合IgV区，164与IgV活性也明显低于全长。上述结果提示三株抗体的结合表位各不相同，且与对照抗体ref.1.9也不相同。
表6.抗B7-H4抗体与人、猴和鼠B7-H4抗原交叉反应结合情况
EC50(ng/ml) Ref 1.9 hz418 hz164 hz266
Human B7-H4 16.3 5.8 5.1 2.0
mouse B7-H4 11.2 3.8 / /
cyno B7-H4 21.0 5.2 3.0 2.9
B7-H4-IgV 30.4 / 140.6 5.5
实施例8：hz418体内抗肿瘤药效评价
由于hz418与鼠B7-H4存在强交叉结合活性，因此在表达鼠B7-H4的鼠肿瘤Hepa1-6皮下移植瘤模型上对其体内抗肿瘤效果进行评价。
具体地，将对数生长期的Hepa1-6肿瘤细胞PBS重悬，浓度为5×107/ml，接种于C57BL/6J小鼠(购自维通利华，6-8周龄)的右侧胁肋部皮下，100μl/鼠。在肿瘤生长至50-100mm3时分组给药(当天记为PG-D0)，每组6只，分别给予hz418和hIgG1，剂量均为200μg/dose，一周2次。每周使用游标卡尺对肿瘤体积进行2次测量，实验结束时，动物安乐死，剥离肿瘤称重。结果如图8和9所示，hz418对肿瘤生长具有明显抑制作用。
在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不一定指的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任何的一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。
尽管已经示出和描述了本发明的实施例，本领域的普通技术人员可以理解：在不脱离本发明的原理和宗旨的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由权利要求及其等同物限定。

Claims (17)

1.一种抗人B7-H4抗体或其抗原结合片段，其特征在于，包括：
重链可变区(VH)，所述VH包括VH CDR1、VH CDR2和VH CDR3；以及
轻链可变区(VL)，所述VL包括VL CDR1、VL CDR2和VL CDR3，
其中，所述VH CDR1、VH CDR2和VH CDR3，以及所述VL CDR1、VL CDR2和VL CDR3选自下列之一：
(1)所述VH CDR1的氨基酸序列如SEQ ID NO：20所示，所述VH CDR2的氨基酸序列如YISYX1X2X3X4YYNPFLRN所示，所述VH CDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO：22所示；且所述VLCDR1的氨基酸序列如SEQ ID NO：17所示，所述VL CDR2的氨基酸序列如SEQ ID NO：18所示，所述VL CDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO：19所示；
(2)所述VH CDR1的氨基酸序列如SEQ ID NO：32所示，所述VH CDR2的氨基酸序列如AISSGGSYTSYPX5X6LKG所示，所述VH CDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO：34所示；且所述VLCDR1的氨基酸序列如HASQGINX7NIG所示，所述VL CDR2的氨基酸序列如HGTNLEX8所示，所述VL CDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO：31所示；
(3)所述VH CDR1的氨基酸序列如SEQ ID NO：26所示，所述VH CDR2的氨基酸序列如27所示，所述VH CDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO：28所示；且所述VL CDR1的氨基酸序列如SEQID NO：23所示，所述VL CDR2的氨基酸序列如SEQ ID NO：24所示，所述VL CDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO：25所示，
其中，
X1为D或E；
X2为G或A；
X3为N或Q；
X4为N或Q；
X5为D或T；
X6为S或A；
X7为N或Q；
X8为D或E。
2.根据权利要求1所述的抗体或其抗原片段，其特征在于，所述VH包括与SEQ ID NO：2具有至少80％一致性的氨基酸序列，且所述VL包括与SEQ ID NO：1具有至少80％一致性的氨基酸序列。
3.根据权利要求2所述的抗体或其抗原片段，其特征在于，所述VH包括SEQ ID NO：12所示的氨基酸序列，且所述VL包括SEQ ID NO：11所示的氨基酸序列。
4.根据权利要求1所述的抗体或其抗原片段，其特征在于，所述VH包括与SEQ ID NO：4具有至少80％一致性的氨基酸序列，且所述VL包括与SEQ ID NO：3具有至少80％一致性的氨基酸序列，
任选地，所述VH包括SEQ ID NO：14所示的氨基酸序列，且所述VL包括SEQ ID NO：13所示的氨基酸序列。
5.根据权利要求1所述的抗体或其抗原片段，其特征在于，所述VH包括与SEQ ID NO：6具有至少80％一致性的氨基酸序列，且所述VL包括与SEQ ID NO：5具有至少80％一致性的氨基酸序列。
6.根据权利要求5所述的抗体或其抗原片段，其特征在于，所述VH包括SEQ ID NO：16所示的氨基酸序列，且所述VL包括SEQ ID NO：15所示的氨基酸序列。
7.根据权利要求1-6所述的抗体或其结合片段，其特征在于，所述抗体或其抗原结合片段是单克隆抗体。
8.根据权利要求1-6任一项所述的抗体或其结合片段，其特征在于，所述抗体或其抗原结合片段是嵌合抗体。
9.根据权利要求1-6任一项所述的抗体或其结合片段，其特征在于，所述抗体或其抗原结合片段是特异性结合人B7-H4的抗体片段，且选自Fv、Fab、Fab'、scFv和F(ab')2。
10.一种分离的核酸，其特征在于，所述核酸编码权利要求1-9任一项所述的抗人B7-H4抗体或其抗原结合片段。
11.一种载体，其特征在于，包括权利要求10所述的核酸。
12.一种分离的细胞，其特征在于，包括权利要求11所述的载体。
13.一种制备权利要求1-9任一项所述的抗人B7-H4抗体或其抗原结合片段的方法，其特征在于，包括：
(1)在合适的条件下，培养权利要求12所述的细胞；以及
(2)分离回收权利要求1-9所述的抗人B7-H4抗体或其抗原结合片段。
14.一种药物组合物，其特征在于，包括：
权利要求1-9任一项所述的抗人B7-H4抗体或其抗原结合片段；以及
药学上可接受的载体。
15.一种抗体-药物缀合物，其特征在于，包含与治疗剂共价结合的、权利要求1-9中任一项所述的抗体或其抗原结合片段。
16.权利要求1-6任一项所述的抗人B7-H4抗体或其抗原结合片段、权利要求14所述的药物组合物或权利要求15所述抗体-药物缀合物在制备药物中的用途，所述药物用于治疗癌症。
17.根据权利要求16所述的用途，其特征在于，所述癌症为肝癌。
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