JPH10500670A - ペプチド送達の改良またはペプチド送達との関連 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 真核標的細胞表面成分に対する特異的結合親和性を有する結合部分及び生物学的作用を発揮し得るアミノ酸配列を含有するエフェクター部分から成るキメラポリペプチドであって、ポリペプチドと細胞表面成分との結合がアミノ酸配列にその生物学的作用を発揮させるように少なくともエフェクター部分のインターナリゼーションを誘導するポリペプチド、並びに本発明のキメラポリペプチドを含むワクチン、及びヒト又は動物被験者の免疫応答を調節する方法が開示されている。

Description

【発明の詳細な説明】 ペプチド送達の改良またはペプチド送達との関連 発明の分野 本発明は、標的細胞と結合するように設計されるキメラポリペプチド、キメラ ポリペプチドを含むワクチン、及びヒト又は動物被験者の免疫応答の調節方法に 関する。 特に、本発明は、細胞によるその後のインターナリゼーションのための標的細 胞への１つ又はそれ以上のエフェクター分子の有効な送達に対して設計されるキ メラポリペプチドに関する。特定の実施態様において、本発明は、免疫優性ペプ チド配列を含有し、それによりこれらの抗体分子が、インターナライズする抗原 又は受容体を介して細胞に入り、その後プロセッシングされて抗原提示に対して ペプチドを放出し、免疫応答の誘導又は阻害を引き起こす組換え体抗体分子に関 する。本発明はさらに、これらの新規の種類の組換え体抗体又はタンパク質を用 いて疾患の治療及び予防する方法、並びにこれらの分子を生成する方法に関する 。 発明の背景 Ｔ細胞が主要組織適合性複合体（ＭＨＣ）分子と結合したペプチドとして抗原 を認識するという知見が、特異的抗原に対してＴ細胞を活性化又は寛容化する免 疫優性Ｔ細胞エピトープに対応する限定合成ペプチドを使用する試みのもとにな った。一般に、用いられるアプローチは、ＭＨＣクラスＩ分子とともに提示され るペプチドに対するＣＤ８＋細胞毒性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）による主要反応又は ＭＨＣクラスＩＩ分子とともに提示されるペプチドに対する主要ＣＤ４＋ヘルパ ーＴ細胞反応を含むＴ細胞反応を誘導するための専門的免疫系細胞による有効な プロセッシング及び抗原提示に応答するＴ細胞反応を誘導するために、免疫原性 ペプチドで免疫化することであった。癌の治療に関しては、高率のヒト黒色腫に よって産生されるＭＡＧＥ−１抗原のような腫瘍関連抗原に特異的なＣＴＬの誘 導（又は養子免疫細胞移入）に、目下大きな関心が寄せられている（van der Br uggen et al.，1991，Scicnce254，1643）。自己免疫ペプチドの投与によって寛 容、並びにその後の提示及び過剰刺激を誘導してペプチド特異性ＣＴＬの阻害を 生じ させるために、自己免疫のような疾患に関連したペプチドの同定にも関心が集ま っている（例えば、Alchele et al.，1994 PNAS91，444）。さらに、ＴＨ１誘導 エピトープのペプチド相同体で免疫化することによりＴＨ１反応に対するアレル ゲンにより誘導されるＴＨ２反応の方向を変えるために、アレルギーのような疾 患に関連したペプチドの同定に関心が向けられている。もう一つのアプローチは 、提示時に、結合し得るが特異的Ｔ細胞を活性化せず、したがってこのようなＴ 細胞の有害な反応を相殺する変性ペプチドで免疫化することである。 本発明者らは、疾患過程に関与する抗原に対する特異的Ｔ細胞の活性化又は寛 容化のためのペプチドの直接的使用には３つの主な制限があると考える。第一に 、異所性疾患関連標的細胞のその後の破壊のための細胞毒性Ｔ細胞のペプチド誘 導性活性化は、特異的ペプチドを提示する標的細胞、即ち通常は専門的（構成的 ）又は任意の抗原提示細胞及びＭＡＧＥ−１抗原を発現する癌細胞のような異常 抗原を発現する細胞に限定される。したがって、特異的に選択された種類の細胞 による抗原提示によってＴ細胞の活性化を指示することは現在不可能である。第 二に、ペプチド誘導性活性化又は寛容は、専門的又は任意の抗原提示細胞による ペプチドの有効な取込み及び提示に依っている。提示の有効性は、ペプチド濃度 、並びに異なるペプチドに変わり得るそしていつも特異的Ｔ細胞反応を引き起こ す訳ではないアジュバントを含むペプチド処方物のような因子に大いに依ってい る。第三に、ペプチド提示はＭＨＣ限定性であり、特異的ＨＬＡ型に依っており 、したがって、ある種の免疫優性ペプチドに対するＴ細胞の活性化又は寛容は個 々のＨＬＡ型に依っている。さらに、外生的付加ペプチド（例えばワクチンに用 いられる）は一般に、ＭＨＣクラスＩＩ抗原のみに関連した免疫系に対してそれ らが提示される方法で、細胞に取り込まれ、処理される − 外生的付加ペプチ ドは、ＣＴＬ反応を引き出すのに不可欠なＭＨＣクラスＩ抗原との関連を生じる 処理経路に入らない傾向がある。この問題は、今までのところ満足のいく処理が なされていなかった。 発明の概要 第一の面において、本発明は、真核標的細胞表面成分に対する特異的結合親和 性を有する結合部分及び生物学的作用を発揮し得るアミノ酸配列を含有するエフ ェクター部分を包含するキメラポリペプチドを提供する。それにより、アミノ酸 配列にその生物学的作用を発揮させるように、細胞表面成分へのポリペプチドの 結合が少なくともエフェクター部分のインターナリゼーションを誘導する。 典型的には、キメラポリペプチドの全体がインターナライズされるが、これは 不可欠ではない。 好ましくは、結合部分は、イムノグロブリン分子（例えば抗体）又はそのエフ ェクター部分を包含する。「エフェクター部分」という用語は、ある程度の特異 的結合親和性を保持し、Ｆａｂ、Ｆｖ、ＳＣＡ及びｓｃＦｖ断片を含有するイム ノグロブリン分子の部分を示すものとする。 望ましくは、アミノ酸配列によって媒介される生物学的作用は、免疫調節作用 である。好ましくは、免疫調節作用を発揮し得るアミノ酸配列は免疫優性ペプチ ド、典型的にはＴ細胞エピトープである。エフェクター部分は、免疫調節作用を 発揮し得る単一アミノ酸配列を包含し得るか、又は複数のこのような配列を包含 し得る。キメラポリペプチドのエフェクター部分が、複数のこのようなアミノ酸 配列を包含する場合、それらは連結して単一「ドメイン」様構造を形成し得るか 、又はポリペプチドの異なる点に配置される。同様に、エフェクター部分が複数 のアミノ酸配列を包含する場合、それらは同一配列を反復し得るか又は種々の異 なるアミノ酸配列の単一コピーであってもよい。 エフェクター部分は、アミノ酸配列を特異的細胞区画に向けるシグナルも包含 すると便利であろう。このようなシグナルについては、以下でさらに考察する。 また、本発明は、上記のようなキメラポリペプチドを含むワクチン、及びヒト 又は動物被験者の免疫応答を調節する方法も提供する。本発明はさらに、上記の キメラポリペプチドの製造方法をその範囲内に包含する。 したがって、専門的又は任意の抗原提示細胞に取り込まれており且つ提示され る個々のペプチドに頼る代わりに、本発明は、１つ又はそれ以上のペプチドをこ れらの細胞の内部に送達するためにあらゆる種類の細胞上の抗原又は受容体のイ ンターナリゼーションに特異的な抗体又はタンパク質分子を使用する。組換え体 抗体／タンパク質−ペプチド分子の消化及びプロセッシング時には、ペプチドは 適切なＭＨＣ分子により細胞表面に輸送されて、提示されるか、又は他の細胞内 分子と反応して、細胞内に留まったままである。特に、本発明は、１つ又はそれ 以上の免疫優性ペプチドの配列をタンパク質内に含むために組換えＤＮＡ法によ り産生される新規の種類の抗体又はタンパク質分子に関する。したがって、本発 明は、初めて、提示されるペプチド抗原を含有する（最適には多数コピーで）抗 体又はタンパク質によって結合されるインターナライズ抗原又は受容体の主要な 要件を有する特定の選択細胞を抗原提示の標的にする手段を提供する。 Ｔ細胞の活性化又は寛容に関する本発明の利点は、数倍も優れている。第一に 、免疫優性ペプチドを送達するために抗体又はタンパク質を用いることにより、 これらのペプチドを、インターナライズ抗原を介して、普通はこのようなペプチ ドを提示しない細胞に送達し得る。例えば癌細胞の場合には、癌細胞は、ＣＴＬ を活性化し、その後癌細胞を破壊するように設計された１つ又はそれ以上のペプ チドを提示し得る。ＣＴＬによる自己免疫破壊を受ける正常細胞の場合、これら のペプチドは、通常破壊的ＣＴＬの阻害により寛容を誘導する高用量の正常免疫 優性ペプチドとして、又は疾患関連Ｔ細胞活性化を相殺する変性ペプチドとして インターナライズ抗原又は受容体を介して送達される。第二に、いくつかの異な るペプチド配列又は同一ペプチド配列の多数のコピーが単一の抗体又はタンパク 質分子に関連し、したがって免疫化された個体での適切なＭＨＣハロタイプによ る提示のためのペプチドの選択の可能性、あるいは抗体分子に関する多数コピー を介して高用量のペプチドを有効に送達する可能性を提供する。第三に、免疫優 性ペプチドを送達するために抗体またはタンパク質を用いることにより、これら のペプチドは、これらの細胞による低特異的エンドサイトーシスに代わるものと して、インターナライズ抗原を介して、特異的専門的抗原提示細胞に有効に供給 され得る。したがって、免疫優性ペプチドに対する免疫応答の型をより良好に制 御するために、特異的抗原提示細胞が標的にされる。 本発明の抗体又はタンパク質は、その後ＭＨＣ分子に結合し、それにより提示 されるために、あるいは特異的細胞内分子と結合して細胞内タンパク質−タンパ ク質相互作用（例えば細胞内シグナリングに関与するもの）の遮断のような作用 を生じるために、ペプチドを細胞中に送達するために用いられると理解されるで あろう。本発明は、クラスＩ及びクラスＩＩ ＭＨＣ制限免疫優性ペプチドに適 用でき、そして多数の異なる疾患状態、例えば癌（癌細胞によるＣＴＬの誘導） 、自己免疫（Ｔ細胞活性化又は寛容誘導の拮抗作用）、感染（感染細胞によるＣ ＴＬの誘導、超抗原によるＴヘルパー細胞活性化の拮抗作用）、アレルギー（免 疫優性ペプチドによるＴＨ２のＴＨ１応答への転換）及び炎症（Ｔ細胞活性化の 拮抗作用）における多数の異なる抗原に対する免疫応答の標的化誘導におそらく は適用し得る、と理解されるであろう。さらに、本発明により産生される抗体又 はタンパク質は、高率の個体が既にワクチン接種又は感染により感作されている 可能性がある、いわゆる「普遍的」免疫優性ペプチド（例えば破傷風毒素及びイ ンフルエンザ核タンパク質ペプチド）を含むと理解されるであろう。さらに、本 発明により産生される抗体又はタンパク質によるＭＨＣクラスＩ関連ペプチドの 有効な提示のためには、エンドソーム又は経ゴルジ網のような区画から細胞質内 へのこれらのペプチドの進入を容易にする配列の分子中への含入が必要であり、 ある種のこのような配列（又はドメイン）は文献で既に公知である（例えばシュ ードモナス属細胞外毒素のような毒素の転座（Donnelly et al.,1993 PNAS90，3 530）、ＨＩＶ−１ ｔａｔタンパク質（Fawell et al.，1994 PNAS91，664）、 又はアデノウイルスのようなウイルスのエンドソーム破裂機能（Curicl et al. ，1991 PNAS88，8850））と理解されるであろう。さらに、本発明により産生さ れる抗体又はタンパク質は、異なるＭＨＣクラスＩ又はクラスＩＩ分子と会合す る異なるペプチドの混合物を含み、これにより異なるＨＬＡ型を保有する異なる 母集団群における免疫応答を誘導するより広範な予測を提供すると理解されるで あろう。さらに、本発明の抗体又はタンパク質は、養子免疫療法の前に、ＣＴＬ の誘導のためにex vivoでペプチドを送達し、既に特異的ペプチド又はその類似 体を提示している細胞のＴ細胞活性化、遮断又は阻害能力を増強することを含む いくつかの異なる方法で疾患の治療及び予防に用い得る、と理解されるであろう 。本発明の抗体又はタンパク質は、専門的抗原提示細胞、例えばマクロファージ （例えばＦｃＲＩ受容体を介して）及びＢ細胞（例えば表面イムノグロブリン分 子を介して）を標的にし得る、と理解されるであろう。最後に、本発明の抗体又 はタンパク質は、単独で、又はインターフェロン−γのようなある種類の細胞に おけるクラス Ｉ及びクラスＩＩ ＭＨＣ発現をアップ調節する分子のようなＴ細胞との相互作 用を増強する他の分子と組合せて疾患の治療又は予防に用い得る、あるいは本発 明の抗体又はタンパク質は、最適には多数のコピーとして隣接する免疫優性Ｂ及 びＴ細胞エピトープの含入によりそれ自体ワクチンとして用いられて、専門的抗 原提示細胞を標的にし得ると理解されるであろう。 広範囲のインターナライズ抗原が、特異的細胞の細胞内にペプチドを送達する 場合に本発明のポリペプチドにより標的にされる、と当業者には理解されるであ ろう。例えば、ＭＨＣクラスＩ又はクラスＩＩ分子は、例えば、送達されたペプ チドに対する強力な免疫応答を促進し、アジュバントを用いずにこれらの細胞に ペプチドを送達するために、専門的抗原提示細胞上で標的にされ得る。さらに、 他の専門的抗原提示細胞、例えば粘膜細胞及び樹状細胞が標的にされ、特異的リ ンパ球サブセットは、表面イムノグロブリン（ｓＩｇ）のようなリンパ球表面イ ンターナライズ抗原と結合する抗体の使用により標的にされる。 免疫優性ペプチドは、組換え体ＤＮＡを用いて抗体分子の多数の異なる位置に 含まれる、と当業者には理解されるであろう。これらのペプチドの組込み又は結 合は、必要な場合に、結合親和性及びクリアランス率のような抗体機能が損なわ れないようにするべきである、と理解されるであろう。あるいは、ペプチドは不 完全組換え体抗体断片、例えばＦａｂ、Ｆｖ又はＳＣＡ（一本鎖抗体）断片の一 部として組み込まれると理解されるであろう。適用によっては、循環又は細胞結 合分子による特異的認識からペプチドをマスクするため、又はある免疫認識がイ ンターナライズ抗原により直接取り込まれる代わりとなり得るようペプチドを曝 露するために設計されたタンパク質ドメイン又は構造中に免疫優性ペプチドを含 有するのが好ましい。特に、インターナリゼーション及び提示（特にＭＨＣクラ スＩＩ制限化）後に良好なＢ細胞応答を刺激するペプチドに関しては、免疫系に よる早期クリアランスを避けるために、循環抗体による特異的認識からペプチド をマスクするのが好ましい。最後に、インターナライズ抗原と結合する部分と、 特別な結合特異性を有さないが抗体構造内又は抗体構造（ＣＤＲ（相補性決定領 域）に関する通常部位での免疫優性ペプチド挿入を含む）に付着して免疫優性ペ プチドを含有する別の部分から成る２価（又は多価）抗体を用い得ると理解され るであろう。 添付の図面を参照しながら本発明をさらに説明する。図１〜９は、別々の多ペ プチドドメインにおける（図１〜８）又はＣＤＲを取り替えるために含有される 個々のペプチド配列としての（図９）免疫優性ペプチドを含む抗体に関して多数 の考え得る設計を説明する。これらの図面は、免疫優性ペプチドを含有する抗体 に関する唯一の設計と考えられるべきではなく、本発明の範囲を限定すると考え られるべきでもない。これらの図面に関しては、抗体はＣＤＲ、ＶＨ及びＶＬド メイン、即ち可変領域Ｈ鎖及びＬ鎖ドメイン（ＣＤＲを含む）、ＣＬドメイン、 即ちＬ鎖定常ドメイン、並びにＣＨ１〜３（即ちＨ鎖領域定常ドメイン）から成 るよう描かれている。生物学的作用を発揮し得るアミノ酸配列から成る分子の部 分が点で示されている。 図１は、同一免疫優性ペプチドの多重コピーあるいは多数のペプチドの個々の コピー（例えば異なるＭＨＣハロタイプを網羅する広範な選択を提供することに よりＭＨＣ制限を補うため）を含む免疫優性ペプチドドメインがＣＨ２ドメイン から上流のＨ鎖中のヒンジ（「Ｈ」）部と隣接して融合された抗体を示す。 図２は、Ｆａｂ−ペプチドハイブリッド抗体を作るために免疫優性ペプチドド メインがＨ鎖中のＣＨ２及びＣＨ３ドメインに代えてヒンジ部に隣接して融合さ れた抗体を示す。 図３は、免疫優性ペプチドドメインがＨ鎖中のＣＨ２ドメインに代えてヒンジ 部に隣接して融合された抗体を示す。 図４は、免疫優性ペプチドドメインがリンカー腕を介して組換え体Ｆｖに隣接 して融合されたＳＣＡ（一本鎖抗体）を示す。 図５は、ＣＨ３ドメインが免疫優性ペプチドドメインに取り替えられた抗体を 示す。 図６は、免疫優性ペプチドドメインがＬ鎖中のＣＬドメインに代えてＶＬ部に 隣接して融合された抗体を示す。 図７は、免疫優性ペプチドドメインがＨ鎖中のＶＨ及びＣＨ１ドメイン間並び にＬ鎖中のＶＬ及びＣＬドメイン間に隣接して融合された抗体を示す。 図８は、片方で、免疫優性ドメインがＣＨ２及びＣＨ３ドメインに代えてヒン ジ部に隣接して融合された、抗体Ｈ鎖の混合物の同時発現又はチオール還元／酸 化により作成された二特異的抗体を示す。 図９は、ＣＤＲを取り替えるために、免疫優性ペプチドの６つのコピー（又は ６つの変異体）がＶＨ／ＶＬ部に挿入された抗体を示す。 図１０は、隣接して配置されるいくつかのペプチドコピーが転座ドメイン（Ｄ ）及び場合によってはＣ末端ＫＤＥＬ様配列に融合されるＨＬＡクラスＩ関連ペ プチドに関する免疫優性ペプチドドメインの典型的編成を示す。 上記の図１〜８及び図１０に示したペプチドドメインは、同一免疫優性ペプチ ドの多重反復又は同一ドメイン内の広範な異なる免疫優性ペプチド配列を包含し 得る。各々の場合、ペプチド配列は頭−尾又は頭−頭編成で反復され、好ましく は適切なアミノ酸が、非免疫優性配列により提供される配列反復間に一定の間隔 で並ぶ。各々の場合、Ｈ及びＬ鎖の免疫優性ペプチド含量は同一であっても異な ってもよく、ペプチドドメインは全鎖に付加されるか、あるいは２つのＨ鎖又は ２つのＬ鎖にのみ付加されるか、あるいはＨ及び／又はＬ鎖の１つにだけ付加さ れるか、あるいはペプチドドメインが二特異的抗体を生成するのに用いられる１ つ又はそれ以上の組換え体鎖から得られるだけである二特異的（又は多特異性） 抗体の一部として付加される。ペプチドドメイン中の免疫優性ペプチド配列の配 置はドメインに含まれる異なるペプチドの最適化を要し、抗体様構造の破裂を伴 わずに組換え体抗体の有効な産生を保証するために最適化される必要があるとい うこと、そしてこのような最適化は当業者にとって比較的簡単な試行錯誤である べきである、ということは明らかである。さらに、免疫優性ペプチドドメインの 有効なプロセッシングのための抗体の最適化も必要であるということも理解され るであろう。各々の場合、種々の理由（例えば全分子がミスフォールディングし ないように、あるいはインターナライズ又はエクスターナライズされた免疫優性 ペプチドを球状タンパク質構造に保たせるために）で必要な場合には、最適化は 免疫優性ペプチド間の互いに異なる側面を接したアミノ酸配列（免疫優性ペプチ ド領域外の内部プロセッシングにおける切断を促すための、酸不安定性又はペプ チダーゼ部位のような配列の導入を含む）、並びに他のペプチド又はタンパク質 構造との異なる組合せとともにペプチドの異なる配置を必要とする。ＨＬＡクラ スＩ関連ペプチドに関しては、縦並びペプチドに隣接した転座ドメイン（単数又 は複数）の付加が細胞質中への有効な輸送及び細胞質中でのプロセッシングには 必要であるということも明らかであろう。 以下の実施例では、本発明の抗体の考え得る適用を説明するが、本発明はそれ らに限定されるものではない。 実施例１： ヒト疾患の治療及び予防に用いるのに適した組換え体モノクローナル抗体の生 成は、文献（例えば、Boulianne et al.，1984 Nature 312，643;Morrison et a l.，1984 PNAS81，6851;Reichmann et al.，1988 Nature 332，323;Queen et al .，1989 PNAS, p10029）に包括的に記載されており、哺乳類及びその他の真核細 胞からの全抗体の産生のための、そして大腸菌からの抗体断片（例えば、Ｆｖ、 Ｆａｂ及びＳＣＡ断片）の産生のための方法が開発されてきた。哺乳類細胞から の抗体の生成に関しては、細胞中への供給のためのペプチドをコードする配列を 抗体内に挿入するための１つ又はそれ以上のクローニング工程を含めた従来技術 の方法を用いて、図１〜３及び５〜９に示された抗体設計の全てを産生し得る。 図８に示したような二特異的抗体の生成方法も哺乳類細胞に関する当業界で公知 であり、二特異的抗体断片は細菌からも生成し得る。例により、そして予防接種 用のこのような抗体の用途を説明するために、専門的抗原提示細胞におけるＭＨ ＣクラスＩＩ抗原の不変鎖に特異的な組換え体抗体を生成した。出発点は、欧州 動物細胞培養コレクション（ＥＣＡＣＣ No.90110606）から得られたハイブリド ーマ細胞株ＤＡ６．２３１であった。ＲＰＭＩ１６４０及び10％ウシ胎仔血清中 で細胞を増殖させた。ｍＲＮＡ単離及びｓｃＦｖｓ（一本鎖Ｆｖｓ）のクローニ ングは、「組換え体ファージ抗体系」”Recombinant Phage Antibody System” （Pharmacia,Milton Keynes，UK）で推奨されたプロトコールに依り、ｐＣＡＮ ＴＡＢ５Ｅクローニングベクター及びＫＯ７ヘルパーファージ（いずれもキット 中に含まれる）中へのクローニングに関して製造業者から供給されたキット中の 試薬を用いた。特異的ｓｃＦｖｓの単離に関しては、Heyningem等（1982，Immun ogenetics16，459-469）に従って、ＤＡＵＤＩリンパ芽球腫細胞（ＥＣＡＣＣ No.85011437）から のＭＨＣクラスＩＩ抗原の精製のためにＤＡ６．２３１抗体を用いて、ＭＨＣク ラスＩＩ抗原を調製した。10⁵個の細胞から誘導された可溶性抗原調製物を３ｘ Ｔ２５組織培養フラスコ（Costar）上に吸収させ、その後ファージ粒子をパニン グし、３回のパニング工程後に残留結合ファージを回収した。次いで、９６ウエ ルプラスチック製微小滴定プレート中に吸収されたクラスＩＩ抗原又は無関係な 抗原を用いてＥＬＩＳＡ検定により、回収ファージのクローンをＭＨＣクラスＩ Ｉ抗原に対する特異的結合に関して点検した。Pharmaciaキット中に提供された 場合には、ペルオキシダーゼ標識化抗Ｍ１３抗体を検定用に用いた。抗ＭＨＣＩ Ｉと呼ばれる個々のファージ抗体を最終的に用いてＨＢ２１５１細胞を感染させ て、可溶性組換え体ファージ抗体を生成した。 他のＤＮＡ操作工程はすべて、Sambrook等（Molecular Cloning，A Laborator y Manual，Cold Spring Harbor Laboratory，Cold Spring Harbor，second edit ion，1989）に従って実施した。ペプチド配列挿入のために、Applied Biosystem s 430A合成機を用いて合成オリゴヌクレオチドを合成し、逆相ＨＰＬＣにより精 製した。配列を以下に示す（それぞれ配列番号１〜６）： オリゴヌクレオチドＰ５３−Ｕ及び−Ｌ（ｐ５３ ＣＴＬ反応性ペプチドＫＹ ＩＣＮＳＳＣＭをコードする（Noguchi et al.，1994 Proc．Natl．Acad．Sci． USA 91，3171-3175））、並びにＦＬＵ−Ｕ及び−Ｌ（インフルエンザ特異的Ｃ ＴＬと反応性のインフルエンザＡマトリックスタンパク質ペプチドＧＩＬＧＦＶ ＦＴＬをコードする（Gammon etal.，1992 J Immunol．148，7-12））を、ポリ ヌクレオチドキナーゼ及び³²Ｐ ＡＴＰを用いて³²Ｐで５’標識し、一緒にアニ ーリン グして、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼ（Life Technologies，Paisley UK）を用いて37 ℃で４時間セルフリゲートし、分離用ポリアクリルアミドシーケンシングゲル上 で分析した。Ｐ５３−Ｕ／Ｌ又はＦＬＵ−Ｕ／Ｌの５つのセルフリゲートしてコ ピーを示す180塩基対での帯を精製し、リン酸化ＮｏｔＩリンカー（＃１１２７ ，New England Biolabs，Hitchin，UK）とリゲートし、ＮｏｔＩ（Pharmacia） で消化した。 ｐＣＡＮＴＡＢ５抗ＭＨＣＩＩ ｓｃＦｖファージＤＮＡをＮｏｔＩ（Pharma cia）で消化した。いくつかの標本に、ＴＡＴ−Ｕ及びＴＡＴ−Ｌオリゴヌクレ オチドをアニーリングし、ＮｏｔＩ消化ベクターと直接リゲートし、大腸菌ＴＧ １細胞を形質転換するのに用いた。その後のＰ５３及びＦＬＵ五量体のクローニ ングのために、ＴＡＴ配列を有する組換え体からのＤＮＡをさらにＮｏｔＩ（抗 ＭＨＣＩＩ／ｔａｔ）で消化した。ＮｏｔＩ消化抗ＭＨＣＩＩ又は抗ＭＨＣＩＩ ／ｔａｔをｐ53又はｆｌｕエピトープの精製180塩基対帯とリゲートし、ＴＧ１ 細胞を形質転換するのに用いた。クローニングし、ＥＬＩＳＡによりＭＨＣクラ スＩＩ抗原との結合に関して点検後、Recombinant Phage Antibody Systemの使 用説明書に従って、ＨＢ２１５１細胞のファージ感染により、可溶性抗体を生成 した。 上記のようなｐ５３由来ペプチドに特異的な細胞毒性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）の 調製のために、Noguchi等（上記参照）のin vivoマウスペプチド免疫化及び感作 法に従って、長期ＣＴＬ株を産生した。ＣＴＬ活性を誘導する能力に関して抗体 を試験するために、標的マウスＳｐ２／０細胞（ＡＴＣＣ ＣＲＬ−１５８１） を用いて、ＤＭＥＭ及び10％ウシ胎仔血清中に保持した。ＣＴＬ検定に関しては 、細胞を５ x10⁵細胞／mlで、20μ Ci（7.4 MBq）⁵¹Ｃｒクロム酸塩を用いて一 夜標識した。次に、細胞をペレット化し、培地中で洗浄して、培地＋抗体断片の 希釈物又は10μｇ／mlペプチドＫＹＩＣＮＳＳＣＭ（「ｐ５３ペプチドのみ」） 中で37℃で４時間、５ x10⁵細胞／mlで再懸濁した。次いで、細胞を再ペレット 化し、ＰＢＳ（リン酸塩緩衝食塩水）で２回洗浄して、100μｌのＲＰＭＩ１６ ４０培地＋10％ウシ胎仔血清中に５ x10³細胞で、２４ウエルプレートに培養し た。次に、ＣＴＬ 100μｌを付加して、エフェクター：標的を20：１、10：１ 及び５：１とし、37℃で４時間インキュベートした。インキュベーション後、 培養上清100μｌを各ウエルからエッペンドルフ管中に注意深く取り出して、遠 心分離し、上清の20μｌアリコート３通りをシンチレーション計数器で計数した 。特異的放出率（％）を〔（エフェクター細胞による放出−自発的放出）／（最 大放出−自発的放出）〕x100として算出した。結果を以下に示す： これらの結果は、ＭＨＣクラスＩＩ分子に特異的でｐ５３ペプチド配列を有す る抗体を用いたインキュベーション後の細胞溶解の誘導を立証したが、インフル エンザ核タンパク質ペプチド配列を有する抗ＭＨＣクラスＩＩに対しては立証さ れなかった。さらに結果は、ｔａｔ配列を付加した結果としての溶解の有効性増 大も示した。 実施例２ 癌細胞への直接ＣＴＬに対する組換え体抗体の用途を説明するために、ある種 の癌細胞におけるＭＢｒ１抗原（Menard et al.，1983 Cancer Rcsearch 43，12 95-1300）に特異的な組換え体抗体を生成した。マウス抗体に関するイムノグロ ブリン可変部の配列（Orlandi et al.,1989 Proc．Natl．Acad．Sci．USA 86，3 833-3837）を出発点として使用し、そして標準的方法を用いて、プラスミドＭ１ ３−ＶＨＰＣＲ１及びＭ１３−ＶＫＰＣＲ１（Orlandi et al.,上記）の可変部 の特定部位の突然変異誘発により生成した。ＭＢｒ１ Ｍ１３−ＶＨＰＣＲ１及 びＭ１３−ＶＫ ＰＣＲ１プラスミドをＰｓｔＩ／ＢｓｔＥＩＩ及びＰｖｕＩＩ／ＢｃｌＩでそれ ぞれ消化し、小断片をゲル精製した。次に、これらの断片をPharmacia Phage An tibody Systemを用いてＰＣＲ増幅し、個々のファージクローンをＥＬＩＳＡに よりＭＣＦ７乳癌細胞（ＥＣＡＣＣ No.86012803）との結合に関して抗Ｍ１３抗 体を用いてスクリーニングした。ＨＢ２１５１細胞の感染により、可溶性ｓｃＦ ｖｓを陽性ファージから調製した。次いで、Ｐ５３又はＦＬＵ五量体配列を、上 記の実施例１と同様にｔａｔペプチドを用いた場合と用いない場合とで、ＭＢｒ １特異的ファージ中にクローニングした。 ｆｌｕペプチドＧＩＬＧＦＶＦＴＬに特異的なヒト細胞毒性Ｔリンパ球（ＣＴ Ｌ）を正常ＨＬＡ−Ａ２ドナーから得て、Bednarea等（1991，J．Immunological Methods 139，41-47）が記載しているように保持した。標的ＭＣＦ７細胞に対 するＣＴＬ活性を誘導する能力に関する抗体の試験は、40：１、20：１及び10： １のエフェクター：標的比で実施例１の場合と同様であった。結果を以下に示す ； これらの結果は、ＭＢｒ１分子に特異的でｆｌｕ及びｔａｔペプチド配列を有 する抗体を用いたインキュベーション後の細胞溶解の誘導を立証したが、ｐ５３ ペプチド配列を有する抗体に対しては立証されなかった。ｔａｔ配列を省くと、 ｆｌｕペプチドを有するｓｃＦｖによる細胞溶解の限界的増大が生じただけであ った。 実施例３ 本発明を説明するための別の実施例では、免疫優性ペプチド間に短い一区切り の非免疫優性アミノ酸により提供される適切な間隔で、そして例えばＨＩＶ−１ ｔａｔタンパク質からの転座ドメインを隣接して提供されて、遺伝子ＭＡＧＥ− １、２及び３（van den Eynde et al.，1989 Int．J．Cancer44，643）から得ら れるＣＴＬ誘導性ノナペプチドの直列反復多重コピーを含むように、図１の抗体 を生成し得る。次に、これを、抗体が腫瘍中にインターナライズし、免疫系にＭ ＡＧＥノナペプチドを提示する可能性があるようにインターナライズ抗原（例え ばＬｅｗｉｓ−Ｙ）を伴う癌を有するＨＬＡ−Ａｌのような型の患者に投与し得 る。次いで、これは、その後腫瘍を溶解するＭＡＧＥ特異的ＣＴＬを活性化する か、あるいはＭＡＧＥ特異的ＣＴＬを拡充し、予備活性化するために、ＭＡＧＥ ペプチド又は実施例３に示されるような抗体で患者を予備免疫化し得る。 実施例４： 実施例１に代わるものとして、同様の方法で、しかしクラスＩＩ ＭＨＣ制限 ペプチド、例えば破傷風毒素ペプチドＰ２（Panina-Bordignon et al.，1989 E ur．J．Immunol．19，2237）を含有し、細胞質転座ドメインを除外する抗体を生 成し得る。このような抗体は、Ｐ２の提示のために適切なＨＬＡ−ＤＲ型の癌患 者に投与されるであろう。抗体が癌細胞におけるインターナライズ抗原に特異的 である場合には、抗体は腫瘍中にインターナライズし、免疫系にＰ２ペプチドを 提示する可能性がある。次いで、これはＰ２特異的Ｔヘルパー細胞を活性化して リンフォカインを放出し、Ｂ細胞を活性化して、さらにＣＴＬを活性化して、こ れがその後腫瘍を溶解する。さらに、Ｐ２特異的ＣＴＬを拡充し、予備活性化す るために患者がＰ２ペプチド又は実施例３に示されるような抗体で予備免疫化さ れている場合には、より大きな抗腫瘍反応が生じ得る。 実施例５： 実施例１及び２に代わるものとして、同様の方法で、しかし専門的抗原提示細 胞におけるインターナライズ抗原に対する特異性、例えばＭＨＣクラスＩＩ抗原 に対する特異性、又はＢ細胞における表面Ｉｇに対する特異性を有し、例えば癌 細胞（例えば、ＭＡＧＥ１〜３に関しては、高比率のヒト悪性黒色腫）により提 示されるペプチドを含有する抗体を生成し得る。抗体内に保有されるペプチドの 提示のために適切なＭＨＣ型の癌患者に投与する場合には、抗原提示細胞でこれ らをプロセッシングし、免疫系に対して提示する必要がある。そうすることによ り、提示されたペプチドによって再提示された癌抗原に対する免疫応答が刺激さ れる。さらに、Ｔ細胞の有効な活性化のために標的癌細胞で抗原を有効に提示す るために、実施例１及び２からの抗体を本実施例の抗体の型と組合せて用い得る 。 実施例６： 実施例１〜３に代わるものとして、自己免疫性免疫優性ペプチドが公知である 自己免疫疾患に用いるために、同様の方法で抗体を生成し得る。例えば、疾患に おける正常組織の悪化に関与するＴ細胞は、実施例３と同様に専門的抗体産生細 胞でインターナライズ抗原に特異的な抗体を生成することにより、又は悪化を蒙 る組織の細胞（例えばグレーブズ甲状腺炎に対するＴＳＨ受容体による甲状腺細 胞）を標的にすることにより、欠失又は阻害し得る。各々の場合、抗体は自己免 疫性免疫優性ペプチドの多重コピーを含有して寛容を誘導し、あるいは、提示時 に、有害なＴ細胞と結合するが活性化せず、したがって自己免疫性を阻害する変 性ペプチドを含有する。 実施例７： 実施例３に代わるものとして、専門的抗原提示細胞におけるインターナライズ 抗原に対する特異性、例えばＭＨＣクラスＩＩ抗原に対する特異性又はＢ細胞に おける表面Ｉｇに対する特異性を有し、感染性疾患作因（例えば高比率のＨＩＶ 単離物中に保存されるＨＩＶ Ｖ３ループエピトープ）由来の免疫優性ペプチド を含有する抗体を生成し得る。抗体内に保有されるペプチドの提示のために適切 なＭＨＣ型の感染患者に投与する場合には、感染作因に対する免疫応答を刺激す る抗原提示細胞によりこれらをプロセッシングし、免疫系に提示する必要がある 。 実際、この方法に用いる抗体は、抗原提示細胞により有効にプロセッシングされ ないと思われるペプチド又は生／弱毒化感染作因から成るワクチンに代わるもの として有効なワクチン剤を構成し得る。 実施例８： 実施例３に代わるものとして、専門的抗原提示細胞におけるインターナライズ 抗原に対する特異性を有し、通常はＴＨ２アレルギー反応を誘導するアレルゲン に由来する免疫優性ペプチドを含有する抗体を生成し得る。抗体内に保有される ペプチドの提示のために、好ましくは適切なＭＨＣ型の感作患者の粘膜表面に投 与する場合には、抗原提示細胞でこれらをプロセッシングし、免疫系に提示すべ きであり、これによりその後、ＴＨ２細胞よりもむしろＴＨ１細胞の誘導が刺激 され、したがってアレルゲンに対するアレルギー反応が軽減される。実際、本方 法に使用する抗体は、抗原提示細胞により有効にプロセッシングされるとは思わ れないアレルゲン製剤による予防接種に代わるものとして有効なワクチン剤を構 成し得る。 実施例９： 実施例３に代わるものとして、専門的抗原提示細胞におけるインターナライズ 抗原に対する特異性を有し、通常はＴヘルパー反応を誘導する自己免疫抗原に由 来する免疫優性ペプチドを含有する抗体を生成し得る。抗体内に保有されるペプ チドの提示のために、適切なＭＨＣ型の病気に苦しむ患者に投与する場合には、 抗原提示細胞でこれらをプロセッシングし、免疫系に提示すべきであり、これに より、その後、自己免疫応答に関与するＴヘルパークローンにおける寛容が誘導 される。実際、本方法に使用する抗体は、ペプチドワクチンに代わる有効なワク チン剤を構成し得る。

【手続補正書】特許法第１８４条の８ 【提出日】１９９６年５月２４日 【補正内容】 １．真核標的細胞表面成分に対する実質的特異的結合親和性を有する結合部分 、細胞質ゾル中へキメラポリペプチドを向かわせ得る別の供給源からの任意の転 座ドメイン及び生物学的作用を発揮し得る３０未満のアミノ酸の１つ又はそれ以 上のペプチド単位を含むさらに別の供給源からのエフェクター部分から成るキメ ラポリペプチドであって、ポリペプチドの細胞表面成分との結合がペプチド単位 （単数又は複数）が放出され、且つ生物学的作用を発揮させるようにキメラ分子 のインターナリゼーションを誘導するポリペプチド。 ２．ペプチド単位（単数又は複数）が免疫調節作用を発揮し得る請求項１記載 のボリペプチド。 ３．細胞表面成分が抗原又は受容体分子である請求項１又は２記載のポリペプ チド。 ４．結合部分がイムノグロブリン分子又はそのエフェクター部分を含む請求項 １、２又は３のいずれか一項に記載のポリペプチド。 ５．インターナリゼーション後に、ＣＴＬ反応を調節するようにクラスＩ Ｍ ＨＣ抗原に関連して標的細胞の表面にアミノ酸配列が提示される請求項１、２、 ３又は４のいずれか一項に記載のポリペプチド。 ６．インターナリゼーション後にＴヘルパー細胞反応を調節するようにクラス ＩＩ ＭＨＣ抗原に関連して標的細胞の表面にアミノ酸配列が提示される請求項 １、２、３又は４のいずれか一項に記載のポリペプチド。 ７．エフェクター部分が１つ又はそれ以上の免疫優性Ｔ細胞ペプチドエピトー プを含む請求項１〜６のいずれか一項に記載のポリペプチド。 ８．エフェクター部分が免疫調節作用を発揮し得る同一ペプチド単位（単数又 は複数）の多数の反復を含む請求項１〜７のいずれか一項に記載のポリペプチド 。 ９．異なるペプチド単位（単数又は複数）が異なるハロタイプのそれぞれのＭ ＨＣ抗原によって提示され得るようにエフェクター部分が複数の異なるペプチド 単位（単数又は複数）を含む請求項１〜８のいずれか一項に記載のポリペプチド 。 １０．細胞表面成分がＭＨＣクラスＩ抗原、ＭＨＣクラスＩＩ抗原、ＦｃＲＩ 受容体、Ｂ細胞表面イムノグロブリン、ルイスＹ抗原、ＴＳＨ受容体及びＭＢｒ １抗原から成る群より選択される請求項１〜９のいずれか一項に記載のポリペプ チド。 １１．エフェクター部分がＭＡＧＥ１、２又は３抗原、破傷風毒素Ｐ２ペプチ ド、ＨＩＶ−Ｖ３ループエピトープ、ｐ５３抗腫瘍遺伝子タンパク質、インフル エンザウイルスマトリックスタンパク質及びインフルエンザウイルス核タンパク 質から成る群より選択されるペプチド単位（単数又は複数）を含む請求項１〜１ ０のいずれか一項に記載のポリペプチド。 １２．特定の細胞区画にペプチド単位（単数又は複数）を向かわせるシグナル をさらに含む請求項１〜１１のいずれか一項に記載のポリペプチド。 １３．シグナルが細菌外毒素又はＨＩＶ ｔａｔタンパク質の転座ドメインに あるいはアデノウイルスのエンドソーム破砕機能に由来するものである請求項１ ２記載のポリペプチド。 １４．シグナルがシュードモナス属外毒素の転座ドメインに由来する請求項１ ３記載のポリペプチド。 １５．標的細胞が「専門的」抗原提示細胞（ＡＰＣ）である請求項１〜１４の いずれか一項に記載のポリペプチド。 １６．標的細胞が異所性、ウイルス感染性あるいは罹患細胞である請求項１〜 １４のいずれか一項に記載のポリペプチド。 １７．標的細胞が腫瘍細胞である請求項１６記載のポリペプチド。 １８．細胞表面成分が腫瘍関連抗原である請求項１６又は１７記載のポリペプ チド。 １９．請求項１〜１８のいずれか一項に記載の有効量のポリペプチドを生理学 的に許容可能なキャリア物質とともに含む免疫応答を刺激するためのワクチン。 ２０．請求項１〜１８のいずれか一項に記載の有効量のポリペプチドを被験者 に投与することを含むヒト又は動物被験者の免疫応答の調節方法。 ２１．ポリペプチド投与によって、通常は標的細胞に提示されないアミノ酸配 列をＭＨＣ抗原とともに標的細胞の表面上に提示させる請求項２０記載の方法。 ２２．ポリペプチド投与によって、１２被験者にとって異物であるＣＴＬエピ トープを標的細胞に提示させる請求項２１記載の方法。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ Ｃ１２Ｐ 21/08 9282−4Ｂ Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ //(Ｃ１２Ｐ 21/00 Ｃ１２Ｒ 1:91） (Ｃ１２Ｐ 21/08 Ｃ１２Ｒ 1:91） (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ， ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，Ｍ Ｃ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ， ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ)， ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，Ｃ Ｈ，ＣＮ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ ，ＧＥ，ＨＵ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ， ＫＺ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，Ｍ Ｎ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＴ， ＵＡ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ (72)発明者 カー、フランク、ジョセフ イギリス国、アバーディーンシャー エー ビー23 ８エックスユー、バルメディー、 ザ ホルディングス“バーチェレア”（番 地なし)

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．真核標的細胞表面成分に対する特異的結合親和性を有する結合部分及び生 物学的作用を発揮し得るアミノ酸配列を含有するエフェクター部分から成るキメ ラポリペプチドであって、ポリペプチドとの細胞表面成分との結合がアミノ酸配 列にその生物学的作用を発揮させるように少なくともエフェクター部分のインタ ーナリゼーションを誘導するポリペプチド。 ２．アミノ酸配列が免疫調節作用を発揮し得る請求項１記載のポリペプチド。 ３．細胞表面成分が抗原又は受容体分子である請求項１又は２記載のポリペプ チド。 ４．結合部分がイムノグロブリン分子又はそのエフェクター部分を含む請求項 １、２又は３のいずれか一項に記載のポリペプチド。 ５．インターナリゼーション後に、ＣＴＬ反応を調節するようにクラスＩ Ｍ ＨＣ抗原に関連して標的細胞の表面にアミノ酸配列が提示される請求項１、２、 ３又は４のいずれか一項に記載のポリペプチド。 ６．インターナリゼーション後に、Ｔヘルパー細胞反応を調節するようにクラ スＩＩ ＭＨＣ抗原に関連して標的細胞の表面にアミノ酸配列が提示される請求 項１、２、３又は４のいずれか一項に記載のポリペプチド。 ７．エフェクター部分が１つ又はそれ以上の免疫優性Ｔ細胞ペプチドエピトー プを含む請求項１〜６のいずれか一項に記載のポリペプチド。 ８．エフェクター部分が免疫調節作用を発揮し得る同一アミノ酸配列の多数の 反復を含む請求項１〜７のいずれか一項に記載のポリペプチド。 ９．異なるアミノ酸配列が異なるハロタイプのそれぞれのＭＨＣ抗原によって 提示され得るようにエフェクター部分が複数の異なるアミノ酸配列を含む請求項 １〜８のいずれか一項に記載のポリペプチド。 １０．細胞表面成分がＭＨＣクラスＩ抗原、ＭＨＣクラスＩＩ抗原、ＦｃＲＩ 受容体、Ｂ細胞表面イムノグロブリン、ルイスＹ抗原、ＴＳＨ受容体及びＭＢｒ １抗原から成る群より選択される請求項１〜９のいずれか一項に記載のポリペプ チド。 １１．エフェクター部分がＭＡＧＥ１、２又は３抗原、破傷風毒素Ｐ２ペプチ ド、ＨＩＶ−Ｖ３ループエピトープ、ｐ５３抗腫瘍遺伝子タンパク質、インフル エンザウイルスマトリックスタンパク質及びインフルエンザウイルス核タンパク 質から成る群より選択されるアミノ酸配列を含む請求項１〜１０のいずれか一項 に記載のポリペプチド。 １２．特定の細胞区画にアミノ酸配列を向かわせるシグナルをさらに含む請求 項１〜１１のいずれか一項に記載のポリペプチド。 １３．シグナルが細菌外毒素又はＨＩＶ ｔａｔタンパク質の転座ドメインに あるいはアデノウイルスのエンドソーム破砕機能に由来するものである請求項１ ２記載のポリペプチド。 １４．シグナルがシュードモナス属外毒素の転座ドメインに由来する請求項１ ３記載のポリペプチド。 １５．標的細胞が「専門的」抗原提示細胞（ＡＰＣ）である請求項１〜１４の いずれか一項に記載のポリペプチド。 １６．標的細胞が異所性、ウイルス感染性あるいは罹患細胞である請求項１〜 １４のいずれか一項に記載のポリペプチド。 １７．標的細胞が腫瘍細胞である請求項１６記載のポリペプチド。 １８．細胞表面成分が腫瘍関連抗原である請求項１６又は１７記載のポリペプ チド。 １９．請求項１〜１８のいずれか一項に記載の有効量のポリペプチドを生理学 的に許容可能なキャリア物質とともに含む免疫応答を刺激するためのワクチン。 ２０．請求項１〜１８のいずれか一項に記載の有効量のポリペプチドを被験者 に投与することを含むヒト又は動物被験者の免疫応答の調節方法。 ２１．ポリペプチド投与によって、通常は標的細胞に提示されないアミノ酸配 列をＭＨＣ抗原とともに標的細胞の表面上に提示させる請求項２０記載の方法。 ２２．ポリペプチド投与によって、被験者にとって異物であるＣＴＬエピトー プを標的細胞に提示させる請求項２１記載の方法。