JP4587566B2 - Hlaクラスi分子と付着手段とを含む複合体を用いた、標的細胞に対するt細胞応答を作出又は強化する方法 - Google Patents

Hlaクラスi分子と付着手段とを含む複合体を用いた、標的細胞に対するt細胞応答を作出又は強化する方法 Download PDF

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Description

【0001】
本出願は、免疫原性HLAクラスI分子を付着させることにより、標的細胞に対する免疫応答を作出又は強化する方法に関する。本発明は、癌、白血病、HIVのようなウイルス感染を含む感染症、結核を含むバクテリア感染症、及びマラリアを含む寄生生物感染症等の悪性疾患の予防と治療に有用である。
【0002】
細胞性免疫系における細胞傷害性T細胞は、「外来」マーキングを表出する細胞の認識に関与しており、該細胞に対する免疫応答を誘発する。各細胞傷害性T細胞は、多数の細胞表面認識レセプターを発現し、それら認識レセプターは、それぞれ特定の「外来」ペプチド配列に対して正確な特異性を有しており、T細胞がスキャンした細胞表面上に発現するHLAクラスI分子に結合するよう適応している。HLAクラスI分子は、細胞の外側表面にペプチド結合のための溝(groove)を有する細胞表面分子であり、この溝は通常の条件下では、細胞内側から生じるペプチドに結合する。細胞傷害性T細胞上の認識レセプターが、スキャン細胞表面上におけるHLAクラスI分子に結合すると、該認識レセプターは、HLAクラスI分子の溝と結合したペプチドとの接触が可能になり、そこに含まれるいかなるペプチドとも相互作用する。このペプチドが、該認識レセプターの特異性と適合した場合には、かかるT細胞が、そのスキャンした細胞を認識したことになり、その結果、該スキャン細胞に対する免疫応答を誘発し得る。
【0003】
宿主免疫系における種々の特異性を有する細胞傷害性T細胞は、該宿主細胞のHLAクラスI分子とはアロタイプが異なるHLAクラスI分子を提示する細胞に対する免疫応答を認識し、かつ誘発する。この種の免疫応答は、「アロ反応性」応答として知られている。
【0004】
細胞に対する免疫応答は、通常、該細胞の溶解、及び/又はサイトカインの局所的放出に帰因する。しかし、細胞傷害性T細胞は、いわゆる抗原提示細胞(APCs)の溶解を誘発しないことが明らかになっている。その代わり、T細胞が抗原提示細胞表面のHLAクラスI分子を認識することにより誘発された免疫応答の結果、細胞傷害性T細胞の選択的増殖を直接認めることができる。次いで、このT細胞上の表面認識レセプターが認識する外来ペプチドを提示する何れの細胞に対しても、宿主免疫系は免疫される。
【0005】
細胞性免疫系のエフェクター機序は、悪性の経過をたどる疾患、感染症、癌及び自己免疫疾患などの多くの疾患の予防、及び治療にとって、強力な手段であると考えられてきた。腫瘍細胞表面上の僅かなHLAクラスI分子が、腫瘍細胞において選択的に又は過剰に発現するペプチドに結合し、免疫系の細胞傷害性T細胞によって認識され得る。そのようなペプチドは、非腫瘍細胞のHLAクラスI分子上に稀にしかみられないか、若しくは全くみられないという点において、より腫瘍特異的である。かかる腫瘍特異的ペプチドの一例としては、メラノーマ細胞にみられるHMW−MAA抗原が挙げられる。しかし、一般に腫瘍細胞に対して有効な免疫応答を刺激する、上記ペプチドを提示するHLA分子の数は非常に少ない。更に、上記ペプチドが抗原提示細胞表面においてHLAクラスI分子によって提示されることはまずない。
【0006】
腫瘍細胞に対する細胞性免疫系の応答を強化しようとする試みは、従来、腫瘍細胞免疫原性を増加させることに力点を置いてきた。特に、腫瘍細胞表面に免疫原性HLAクラスI分子を高レベルに発現させようとする、遺伝子療法技術を用いた種々の試みが行われてきた。Kang(Cancer Res. 57, 202-205, 1997)は、HLA分子のリーダー配列における抗原性ペプチドを有するHLAクラスI遺伝子をコードするcDNAの作製について報告している。一方、Stopeck(J Clinical Oncology 15, 341-349, 1997)は、メラノーマ患者のアロHLAクラスIのトランスフェクションについて報告している。その研究においては、臨床試験でのある種の応答について検討しており、遺伝子療法技術を用いたインビボでの、複数の部位における腫瘍細胞を標的にすることの困難さについても強調している。
【0007】
本出願は、標的細胞に対する免疫応答を作出又は強化する改良方法について開示し、癌及び他の悪性の疾病、感染症、又は自己免疫疾患の予防法や治療法をより向上せしめるものである。
【0008】
また、本発明の主題の一つは、HLAクラスI分子又はその断片を含む複合体に関するものであり、該HLAクラスI分子は、T細胞バインディングポーション(binding portion)、及び該HLAクラスI分子又はその断片を標的細胞に選択的に付着せしめる付着手段(attaching means)を有し、該HLAクラスI分子又はその断片が、認識ペプチドに結合又は付着し、かかる認識ペプチドは、該HLAクラスI分子又はその断片に提示されるように構成されていることを特徴としている。
本発明の他の主題は、該HLAクラスI分子又はその断片を標的細胞に付着せしめ、該HLAクラスI分子又はその断片がT細胞バインディングポーションを有し、該HLAクラスI分子又はその断片を該標的細胞に誘導するステップ、及び付着手段を有する点にある。
【0009】
更に、本発明の主題は、HLAクラスI分子又はその断片を含む製剤成分にあり、該HLAクラスI分子又はその断片がT細胞バインディングポーションを有し、即ち該HLAクラスI分子又はその断片を選択的に標的細胞に付着せしめる手段を有し、適当な賦形剤又は担体を含む点にある。
【0010】
HLAクラスI分子又はその断片はペプチドに結合し、該ペプチドは、該HLAクラスI分子又はその断片によるT細胞認識のために構成されている。当該ペプチドは、Garbocziの報告(PNAS 89, 1992, 3429-3433)に記載された手法により、該HLAクラスI分子又はその断片に付着せしめた。
【0011】
該付着手段には、標的細胞表面上の標的細胞特異的な分子に対する高い特異的な親和性を有するリンキングポリペプチドを含むことが望ましい。ここで「標的細胞特異的な分子」とは、標的細胞表面上において、発現又は過剰発現することを特徴とする分子をいう。癌細胞における「標的細胞特異的な分子」には、例えば、癌胎児性抗原、胎盤アルカリホスファターゼ、多型上皮ムチン、ヒト絨毛性性腺刺激ホルモン、CD20、前立腺特異的抗原、ca−125、HMW−MAA、及びその他の腫瘍関連抗原のすべてが含まれる。
【0012】
利便性の点から、リンキングポリペプチドには上記標的細胞特異的な分子に対する抗体、望ましくはモノクローナル抗体が含まれる(Riethmuller and Johnson, Curr. Opin. Immunol. 4, 1992, 647-655)。かかる目的に照らして好適な抗体には、C46、85A12、H17E2、HMFG1、W14、1F5、225.28s(Buraggi 1985, Cancer Res. 45, 3378-3387)等やその他の抗体が含まれる。これらの抗体を産生する不死化ハイブリドーマは、American Type Culture Collection,Rockville MD,USAに寄託されている。更に、抗体の例としては、Maloney et al(Blood 84, 1994, 2457-2466)、Riethmuller et al(Lancet 343, 1994, 1177-1183)、及びHird et al(Br. J. Cancer 68, 1993, 403-406)の文献にそれぞれ記載されている。
【0013】
上記リンキングポリペプチドには、標的細胞特異的な分子に対する抗体や、上記抗体を前記HLAクラスI分子又はその断片にカップリングせしめるカップリングシステムが含まれる。かかるカップリングシステムには、抗体とHLAクラスI分子に連結し、両者間に安定なブリッジを形成するよく特徴づけられた対の低分子の2又は3ステップ鎖が含まれる。ここで使用する対になった低分子としては、ビオチン及びアビジン/ストレプトアビジン(Moro, 1997, Cancer Res. 57, 1922-1928; Altman et al, Science 274, 1996, 94-96)、カルモジュリン及びカルモジュリン結合ペプチド(Neri, 1996, J. Invest. Dermatol. 107, 164-170)を例示することができるが、これらに限定されるものではない。他の上記リンキングポリペプチドとしては、前記HLAクラスI分子又はその断片に、直接付着しうるように適応させた、標的細胞特異的な分子に対する抗体を挙げることができる。
【0014】
更に、本発明の実施の態様として、前記複合体が組換えタンパク質を含み、該組換えタンパク質が、上記HLAクラスI分子又はその断片からなる分子種と上記付着手段からなる分子種を含むものが挙げられる。
【0015】
HLAクラスI分子又はその断片は、血漿又は血小板から精製することにより、あるいは組換えにより作製することにより得ることができる。HLAクラスI分子又はその断片は、T細胞が認識することができるように、更にウイルス、バクテリア、寄生生物、又は腫瘍特異的ペプチド等の特徴づけられた好ましいペプチドを結合及び提示するように構成することができる。上記HLAクラスI分子又はその断片、及び上記付着手段を、上記標的細胞周辺に誘導することにより、該標的細胞にHLAクラスI分子又はその断片を付着させることができる。該標的細胞としては、インビトロでの培養細胞を用いてもよいが、患者の体内から採取した細胞の方が有利に用いることができる。該標的細胞としては、細胞障害性T細胞によって接触されるように構成されているものが望ましく、かかる細胞障害性T細胞は、不適合アロタイプとして、又は外来ペプチドに結合するものとして、該HLAクラスI分子又はその断片を認識するよう適応されており、かつ該標的細胞に対する免疫応答の誘発能を有している。
【0016】
本発明の実施の一形態として、標的細胞に対する免疫応答の結果、溶解するタイプの標的細胞を挙げることができる。かかる標的細胞としては、癌細胞、白血病細胞、HIVウイルス又は他の細菌やウイルス、自己免疫疾患における有害活性に関与している細胞等、患者にとって望ましくない腫瘍細胞、疾患細胞、外来細胞を使用するのがよい。患者の該標的細胞に対する免疫応答誘発を促進するためには、前記HLAクラスI分子及びその断片は、該患者の細胞性免疫系から強力な免疫応答の作出能を有するものが望ましい。従って、上記HLAクラスI分子及びその断片は、ウイルスペプチド又は細菌ペプチド、望ましくは患者が曝されたことがあるウイルスペプチドや細菌ペプチドと結合するものがよい。特に上記HLAクラスI分子及びその断片は、インフルエンザウイルスペプチド、麻疹ウイルスペプチド、エプスタイン−バールウイルスペプチド、その中でも特に溶解タンパク質BZLF1のRAKFFQLLエピトープを含むエプスタイン−バールウイルスペプチド、サイトメガロウイルスペプチド又は破傷風トキソイドペプチドと結合するものが好ましい。その他、既に強力な細胞障害性T細胞応答、若しくは強力な免疫応答誘導能を有する何れのペプチドとの結合性を示す上記HLAクラスI分子及びその断片が挙げられる。上記HLAクラスI分子及びその断片のアロタイプは、患者のHLAクラスI分子及びその断片のアロタイプと付加的に異なるため、上記標的細胞に対するアロ反応応答が、付加的に誘発される。
【0017】
本発明の他の実施形態として、標的細胞として抗原提示細胞(APC)を挙げることができる。細胞障害性T細胞が、該抗原提示細胞に付着したHLAクラスI分子及びその断片を認識する結果、細胞障害性T細胞が直接的及び選択的に増殖する。従って、前述のように特徴づけられた腫瘍特異的ペプチド、ウイルスペプチド、バクテリアペプチド、寄生生物ペプチド、又は、患者にとって望ましくない存在である疾患細胞、悪性細胞又は外来細胞表面上において、HLAクラスI分子が個別的・特徴的に提示する如何なるペプチド等を、上記HLAクラスI分子及びその断片が提示して、T細胞が認識することができるようになっている。悪性疾患に関連したペプチドは、寄生性の起源を有する(Khusmith, 1991, Science 252, 715-718)ものとして特徴づけられている(Brossart, 1998, Cancer Res. 58, 732-736 and Lucas, 1998, Cancer Res. 58, 743-752)。本発明によって、抗原提示細胞にHLAクラスI分子又はその断片を付着させることにより、所定のペプチドを提示する細胞に対するインビボでの免疫や、あるいは特定の特異性を有する細胞障害性T細胞のエックスビボでの作出を行うことができる。
【0018】
標的細胞が、腫瘍細胞又は感染微生物細胞であるとき、本発明の製剤成分を、腫瘍又は微生物性疾患の治療にそれぞれ用いることができ、必要に応じて患者に上記製剤成分を有効量投与することによって、腫瘍又は微生物性疾患の治療を行うことができる。
【0019】
多くのタイプの腫瘍は腫瘍関連抗原を発現するが、その発現レベルは不均一であり、腫瘍細胞の中には抗体の標的にならずに直接溶解するものがある。しかし、アナロガス抗体−超抗原系のインビトロのデータから、活性T細胞が放出するサイトカインの高い局在量が、標的以外の他の腫瘍細胞を死滅させる可能性があることが報告されている(Dohlsten et al, Int. J. Cancer 54, 1993, 482-488)。MHCクラスI/ペプチド複合体を用いた標的システムにおいても同様な結果が生じると推察される。同様に、腫瘍中にサイトカインを放出する活性化細胞障害性T細胞が存在することによって、特異的抗腫瘍免疫応答が強化される可能性もある。
標的細胞が抗原提示細胞であり、HLAクラスI分子又はその断片が、腫瘍特異的ペプチド、又はウイルス、バクテリア、寄生生物又は細菌に感染した細胞表面のHLAクラスI分子が個別的・特徴的に提示するペプチドのいずれかに結合するとき、本発明の製剤成分を、それぞれ腫瘍、又はウイルス、バクテリア、寄生生物、細菌感染の免疫化に用いることができ、必要に応じて患者への該製剤成分の有効量投与を含めた、患者の腫瘍、又はウイルス、バクテリア、寄生生物、細菌感染に対する免疫方法が与えられる。
【0020】
インビボでのサイトカインのサポートにより、又は抗原特異的細胞障害性T細胞をエックスビボで増加させることにより、上記患者の応答性が向上することも考えられる。アビジンブリッジ等のターゲティングシステム構成成分に対する患者の免疫応答を最小化するため、一時的な免疫抑制(Ledermann et al, Int. J. Cancer 47, 1991, 659-664)を行うこともできる。
【0021】
上記製剤成分の投与は、経口、舌下、経皮又は非経口による。
【0022】
上述の製剤成分の有効量は、患者の体質、治療に対する苦痛感、及び患者の体重、年齢や状態による。
【0023】
経口又は非経口投与に際しては、製剤成分を経口剤又は非経口剤等の単位投与量成分とすることが大いに望ましい。
【0024】
混合剤を用い、かかる製剤成分を経口又は非経口投与に適するよう調製する。その形態としては、錠剤、カプセル、経口調剤、粉末剤、顆粒剤、トローチ剤、再構成粉末剤、注射、及び液体浸出溶液剤、懸濁液剤、坐剤等特に制限されない。
【0025】
経口投与のための錠剤とカプセルは、通常単位投与量となっており、結合剤、充填剤、希薄剤、錠剤化剤、潤滑剤、崩壊剤、色素、香味料、及び湿化剤等の従来使用されてきた賦形剤を含む。該錠剤を、既知の手法によってコートすることもできる。
【0026】
適切な充填剤としては、セルロース、マニトール、ラクトース、及び他の類似剤を挙げることができる。適切な崩壊剤としては、スターチ、ポリビニルピロリドン、及びナトリウムスターチグリコール酸塩等のスターチ由来物を挙げることができる。適切な潤滑剤には、例えばステアリン酸マグネシウムがある。製剤上許容できる適切な湿化剤としては、ラウリル硫酸ナトリウムを挙げることができる。
【0027】
かかる固形経口調剤は、従来の方法で混合、充填又は錠剤化を行うことにより調製することができる。反復混合作業を行うことにより、充填剤を大量に使用した活性な薬剤を生産できる。かような作業工程は、勿論従来技術の範疇である。
【0028】
経口液体調剤は、水性又は油性の懸濁液、溶液、乳剤、シロップ、エリキシル、あるいは、服用の前に水や他の適切な賦形剤を使って再構成する乾燥調剤等の形態をとる。かかる液体調剤には、例えばソルビトール、シロップ、メチルセルロース、ゼラチン、ヒドロキシエチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、ステアリン酸アルミニウムジェル又は水素添加食用油等の懸濁剤;レシチン、ソルビタン、モノオレアート、アカシア等の乳化剤;アーモンドオイル、分画ココナッツオイル、グリセリン、プロピレングリコール又はエチルアルコール等のエステルの油性エステル等の非水性賦形剤(食用油を含む);メチル又はプロピルp−ヒドロキシ安息香酸メチル又はプロピル、ソルビン酸等の保存料、必要とあれば従来使用されてきた香味料や色素、上記の添加剤を従来と同様に加えてもよい。
【0029】
経口剤には、腸溶コーティングした錠剤又は顆粒剤等の従来のサステインドリリース製剤が含まれる。
【0030】
非経口調剤としては、滅菌賦形剤を含む液体単位投与の形態で調製できる。調剤成分は、賦形剤と濃度に依存して懸濁しても溶解してもよい。非経口溶液は、通常、適当なバイアル又はアンプルに入れて密封する前に、賦形剤中の調剤成分を滅菌フィルターの中で溶かし調製する。局所麻酔剤、保存剤、緩衝剤等のアジュバントを賦形剤に加えることが好ましい。安定性向上をはかるため、バイアルに充填し、製剤成分を凍結して真空状態で水分を除去することができる。
【0031】
非経口懸濁液は、実質的に同じ製法で作製することができるが、異なる点は、製剤成分を滅菌賦形剤中にに懸濁する前に、溶解してエチレンオキサイドに曝すことにより滅菌する代わりに、賦形剤に懸濁する点である。改良法として、本発明における調剤の均一性を容易ならしめるために、界面活性剤又は湿化剤を製剤成分に含めてもよい。
【0032】
上記調剤を治療に用いる際に、従来、手書き又は印刷した使用法をつけることが一般的である。
【0033】
以下に本発明を実施する際の方法について例に基づき、又は添付の図面を参照して詳述する。
【0034】
実施例1.
以下の材料を用いた。
標的細胞:HLAクラスIアロタイプHLA−A2を保有するヒトメラノーマ細胞株Mel1(Department of Immunology, Institute of Molecular Medicine, Oxfordに寄託)。該細胞株は、標準RPMI組織培養培地で生育したものである。HLAクラスIアロタイプHLA−A2を保有するヒトメラノーマ細胞株Mel2(Department of Immunology, Institute of Molecular Medicine, Oxfordに寄託)。該細胞株は、標準RPMI繊維培養培地で生育したものである。
【0035】
付着手段:ヒトメラノーマ細胞上のHMW−MAA抗原に結合するモノクローナル抗体225.28s(Buraggi, 1985, Cancer Res. 45, 3378-3387)。この抗原にビオチンをBayerの方法(Bayer, 1990, Methods Embryology, 184, 138-160)により、化学的に結合させた。精製鶏卵アビジンは、市販品(Societa Prodotti Antibiotici, Milan, Italy)を使用した。
【0036】
HLA:文献(Altman, 1996, Science 274, 94-96)記載のビオチン結合組換えHLAクラスIアロタイプHLA−A2分子に、更にHIVウイルスの部分である「gag」ペプチドを含んだもの。このペプチドは、アミノ酸配列SLYNTVATLを含む。調製/単離法は、文献(Johnson, 1991, J. Immunol, 147, 1512)記載の方法に基づいた。この「gag」ペプチドを文献(Garboczi, 1992, PNAS, 89, 3429-3433)記載の方法に基づいてHLA−A2分子に付着せしめた。
【0037】
T細胞:文献(Altman, 1994, Science, 274, 94-96)記載の方法でA2+veHIV患者から、HLA−A2/gag特異的細胞障害性T細胞を採取した。
【0038】
Mel2標的細胞表面にHLAクラスI分子をディスプレイする付着手段を分析すべく、先ず約200,000個の細胞を、ビオチン結合モノクローナル抗体225.28sと共に、最終濃度20μg/mlにおいて37℃で30分間インキュベートした。次に、該細胞を組織培養培地(RPMI1640、Gibco, Scotland)で洗浄した。Mel2細胞をアビジンと共に、最終濃度10μg/mlにおいて37℃で10分間インキュベートし、組織培養培地で洗浄した。最後に、該Mel2細胞をビオチン結合HLAクラスIHLA−A2/gag分子と共に、最終濃度20μg/mlにおいて37℃で20分間インキュベートした。
【0039】
処理したMel2細胞に対する組換えHLA−A2の結合を、抗HLA−A2モノクローナル抗体BB7.2(Santos-Aguado, 1988, J. Immunol, 141, 2811-2818)を付着させることによって調べた。次に該細胞を、37℃で30分間最終濃度10μg/mlのBB7.2抗体と共にインキュベートし、組織培養培地で洗浄後、上記細胞をフィコエリトリン結合ウサギ抗マウス抗体(Sigma, Poole, UK)と共に、最終濃度10μg/mlにおいて37℃で10分間インキュベートし、Becton Dickson Facscanを用いて分析した。Mel2細胞表面に付着したHLA−A2分子の存在を示す陽性シグナルが明らかにされた本分析結果を図2に示した。
【0040】
本発明の手法に基づき、HLA−A2/gag特異的T細胞クローンが、HLA−A2/gagをコートしたMel1細胞を、溶解させる能力を分析すべく、クロム放出T細胞細胞障害性アッセイを行った。約106個のMel1細胞を、1.85μBqNa2 51CrO4(Amersham International, Amersham, UK)と共に37℃で1時間プレインキュベーションした。事前インキュベートした該Mel1細胞を、次にビオチン結合モノクローナル抗体225.28sと、最終濃度20μg/mlにおいて37℃で30分間インキュベートし、組織培養培地で洗浄した。次にMel1細胞をアビジンと、最終濃度10μg/mlにおいて37℃で10分間インキュベートし、再び組織培養培地で洗浄した。続いて該Mel1細胞を、37℃で20分間最終濃度20μg/mlのビオチン結合HLAクラスIHLA−A2/gag分子とインキュベートし、組織培養培地で洗浄した。
【0041】
HLAクラスIHLA−A2/gagでコートして、クロム処理したMel1細胞を、HLA−A2/gag特異的細胞障害性T細胞と、エフェクター細胞と標的細胞の比率が0:1から20:1の範囲で、37℃で20時間インキュベートした。Na2 51CrO4で処理したMel1細胞が溶解することによって、放射クロムの放出が生じ、シンチレーションカウンターによって測定できる。HLA−A2/gag特異的細胞障害性T細胞とのインキュベートによって、溶解したMel1細胞のパーセンテージを分析するため、以下の測定法を用いた。▲1▼培地中のMel1細胞からのクロムバックグラウンド放出(“M”)▲2▼T細胞とのインキュベート後のMel1細胞からのクロム放出(“E”)▲3▼5%のトリトンX−100ディタージェントで最終的に処理したMel1細胞からのクロム放出(“T”)。ディタージェントで処理すると、他の無処理のMel1細胞も全て溶解してしまう。
【0042】
細胞障害性T細胞によるMel1溶解のパーセンテージは、以下の式で計算した。
Figure 0004587566
【0043】
本分析は、ビオチン結合225.28s、アビジン及びビオチン結合HLA−A2/gagで処理したMel1細胞を用いて行った。コントロールとして、ビオチン結合225.28sで処理したMel1細胞、及びアビジン単独で、またアビジンで処理したMel1細胞、及びビオチン結合HLA−A2/gag単独でも本分析を行った。
【0044】
本分析の主要な結果を図3に示す。その結果から、HLA−A2/gag特異的細胞障害性T細胞によるMel1細胞の有意溶解量(20%)は、本発明の付着及びデリバリー手段の全構成物を用いてMel1細胞を処理したときに生じることが示される(例えば、ビオチン接合225.28sモノクローナル抗体、アビジン、及びビオチン接合HLA−A2/gag)。コントロールを用いた分析からは、バックグラウンドレベルでの細胞溶解量の有意増加は認められなかった。
【0045】
実施例2.
以下の材料を用いた。
標的細胞:ダウディ細胞株(MHCクラスI陰性)、メラノーマ株SK−mel−29(HLA−A2.1陽性)及び221/A2(HLA−A2.1陽性)を、5%CO2の37℃のインキュベーター内で、10%ウシ胎児血清及び抗生物質と共にRPMI培地で保持した。
付着手段:HMW−MAA抗原に結合するモノクローナル抗体225.28s(Buraggi, 1985, Cancer Res. 45, 3378-3387)及び2H7。ビオチンをこれらの抗体に、文献(Bayer, 1990, Methods Embryology, 184, 138-160)記載の方法で、化学的に接合した。
精製鶏卵アビジンは、市販品(Societa Prodotti Antibiotici, Milan, Italy)を使用した。
【0046】
HLA:組換えMHCクラスIとペプチドとのビオチン化複合体を文献(Altman et al, Science 274, 1996, 94-96, Ogg et al, Science 279, 1998, 2103)記載の方法に従い作製した。ビオチンリガーゼ酵素BirAの標的配列をC末端に付加することにより修飾したB2M及びMHCクラスIヘビーチェインの原核発現に続いて、封入体の精製を行った。特異的ペプチドの周囲に重鎖及びB2Mをリフォールディングした後、ゲル濾過により45kDの複合体を単離し、ATP、Mg2+及びビオチンの存在下でBirAを用いて一晩ビオチン化した。その後ゲル濾過及び陰イオン交換によって精製した。
【0047】
T細胞:ヒト細胞傷害性T細胞クローン010(HLA−A2/gag77−85=SLYNTVATLに特異的(Parker et al, J. Immunol. 149, 1992, 3580-3587))、及びIF9(HLA−A2/melan−A26−35=EAAGIGILTVに特異的(Romero et al, J. Immunol. 159, 1997, 2366))を、5%ヒト血清及び100IU/mlのIL−2を加えた培地で保持した。
【0048】
MHCクラスI/ペプチド複合体の安定性を、先ずELISA法により分析した。HLA−A2/Gag3Y、HLA−A2/Gag3F、HLA−A2/Lmp2、HLA−B35/Env及びHLA−B35/nefを含む種々のMHCクラスI/ペプチド複合体を、上述の手順で調製し、組織培養培地において10ug/ml、37℃で0−20時間プレインキュベーションした。MHCクラスI分子(Parham, 1979)の立体構造を正しく認識するモノクローナル抗体W6/32(pH9.6の炭酸塩緩衝液中5ug/mlで4℃で一晩)でELISAプレートをコートし、1%仔牛血清アルブミンにおいて37℃で2時間インキュベートしてブロックした。MHCクラスI/ペプチド複合体を、ELISAプレート上で室温で30分間インキュベートし、ウサギ抗ヒトB2ミクログロブリンを用い、続いてアルカリホスファターゼ接合ヤギ抗ウサギ免疫グロブリン及び基質を用いて結合性を測定した。全インキュベーション産物はPBSで丁寧に洗浄することにより分離した。
【0049】
600nmにおける吸光度を、Titertec Multiscan ELISA読取り装置を用い測定した。各検体につき3回測定を行い、それらの平均読み取り値を求めた。
【0050】
0、1、4、16及び20時間プレインキュベーションした検体から得た結果を図5に示した。その結果から、HLA−A2/gag複合体は、37℃の培養培地において顕著な安定性を示すことが判明した。24時間を超えるとその安定性は半減すると推測される。
【0051】
HLA−A2/gag複合体を、0.5〜1mg/mlで4℃で保存すると、少なくとも12ヶ月は安定性が持続すると推測される(データは示さず)。
【0052】
ダウディ細胞表面に、MHCクラスIのディスプレイを生じせしめる付着手段能を明らかにするため、MHCクラスI欠損ダウディ細胞を、ビオチン化抗CD20(Ancell, Nottingham, UK, モノクローナル抗体2H7(Berenson et al, Blood 67, 1986, 509-515)1μg/mlで30分間)、鶏卵アビジン(S.P.A., Milan, Italy, 10ug/mlで10分間)、ビオチン化したHLA−A2/gag(10ug/mlで10分間)、及びFITCで標識化した抗MHCクラスI(Ancell, Nottingham, UK; モノクローナル抗体3F10(Eisenbarth et al, J. Immunol. 124, 1980, 1237-1244)を10ug/ml)と連続して4℃でインキュベートした。並行して行ったコントロールでは、1若しくは他のインキュベーションを省略した。各インキュベーションの間で、細胞をPBSで3回洗浄し、2%のホルムアルデヒドを加えたPBSに固定し、フローサイトメトリーで分析した。
【0053】
標識系の3段階全てにおいてインキュベートした細胞は、無処理のダウディ細胞に比べ、その表面に、より多くの測定可能なMHCクラスI/ペプチドを有していた(図6)。標識系3段階の内のいずれか2つの段階だけで処理した細胞からは、無処理の細胞から得たのと同様の蛍光量を検出した(データは示さず)。
【0054】
本発明の手法に則って、ダウディ又はSK−mel−29細胞に対する特異的T細胞クローンの溶解能を分析するために、クロム放出細胞傷害性アッセイを行った。ダウディ又はSK−mel−29細胞を、2μCi/μLの51CrO4と共に37℃で1時間インキュベートしてから、ビオチン化モノクローナル抗体2H7又は225.28s(抗−HMW−MAA)のそれぞれと、更にアビジン、及びビオチン化HLA−A2/gag複合体を、前述の手法により連続してインキュベートした。ペプチドを付加した標的細胞を、gag77−85又はmelan−A26−35ペプチドと共に0.1μMにおいて37℃で1時間インキュベートした。洗浄後、標識した標的細胞を、2500細胞/ウエルになるように96ウエルの丸底プレートに移し、エフェクターと標的の比率(E:T)が種々に変化するように、ヒトCTLを加えた。37℃でインキュベートした後、上清20μlを回収し、51Crの放出量を測定した。各比率のエフェクターと標的で測定して得た細胞傷害性(溶解)の割合は、100×(E−M)/(T−M)の計算式で求めた。Eは実験による放出量、Mは培地での放出量、Tは5%トリトンX−100ディタージェントにおける放出量をそれぞれ意味する。
【0055】
図7に示した結果は、2回ずつ行った実験の結果を平均したものである。これらの結果が示すように、CTLクローン(010)は、HLA−A2陽性標的(.221/A2)をHLA−A2/gagペプチドと共にプレインキュベーションした場合においてのみ、該標的を有効に溶解せしめた。このCTLクローンは、本発明のHLA−A2/gag複合体で標的化したMHCクラスI陰性ダウディ細胞を、同程度まで認識しかつ溶解した。標的化されないダウディ細胞及び標的系の2又は3種の成分によってのみ標的化された細胞は、認識されなかった(エフェクターと標的の比率が80:1までの最大溶解量は4%未満)。
【0056】
異なるHLA−A2制限特異性(HLA−A2/melan−A)を示すコントロールCTLは、HLA−A2/gag複合体で標的化したダウディ細胞を溶解しなかった(図8)が、このことは標的アプローチの厳密な特異性を明示している。
【0057】
gagペプチドだけを加えた無処理のダウディ細胞は、内因性MHCクラスIが、欠損していることから、クローン010によって溶解されなかった(データは示さず)。
【0058】
HLA−A2/gag特異的CTL株によるメラノーマ細胞株SK−mel−29の溶解感度を高める、抗体に指令されたHLA−A2/gag複合体の能力を、図9に示した。エフェクターと標的の各比率において、表面蛋白質に結合した複合体が標的にしたメラノーマ細胞は、標的系3段階の内2つの成分だけと接触したコントロールより、実質的に多く溶解された。更に、HLA−A2を発現しないMM9メラノーマ細胞も、同様に溶解された(データは示さず)。
【図面の簡単な説明】
【図1】 HLA分子を、腫瘍細胞表面にデリバリングする手段/概念を図式化して示した説明図である。
【図2】 ビオチン結合モノクローナル抗体225.28s、アビジン、ビオチン結合HLA−A2/gag複合体、抗HLA−A2モノクローナル抗体BB7.2及びフィコエリトリン結合ウサギ抗マウス抗体で処理したHLA−A2−veMel2メラノーマ細胞のFACs分析を示した説明図である。
【図3】 ビオチン結合モノクローナル抗体225.28s、アビジン、及びビオチン結合HLA−A2/gag複合体のデリバリーシステムで処理したMel1細胞を用いたT細胞の細胞障害性クロム放出アッセイの結果を示した説明図である。これらの細胞を、エフェクター/標的の比率を0:1〜20:1に設定して、HLA−A2/gag特異的細胞障害性T細胞と共に20時間インキュベートした。
【図4】 HLAクラスI/ペプチド複合体を、抗原提示細胞にデリバリングする手法/概念を図式化して示した説明図である。
【図5】 実施例2における各種MHCクラスI/ペプチド複合体の37℃における安定性を調べたELISAアッセイの結果を示した説明図である。
【図6】 HLA−A2が、ビオチン化抗CD20モノクローナル抗体を介して標的にしたHLAクラスI欠損ダウディ細胞のFACS分析の結果を示した説明図である。トレース1(左側)は、無処理の標的化されていないダウディ細胞を示し、トレース2(右側)は、モノクローナル抗体/アビジン/HLA−A2/gag/FITC抗MHCクラスIが標的にしたダウディ細胞を示す。蛍光トレース1の平均値は0.31であり、蛍光トレース2の平均値は24.3(任意の蛍光単位)だった。
【図7】 実施例2におけるクロム放出アッセイを4時間行った結果を示した説明図である。HLA−A2/gagデリバリーシステムの各種構成物が標的にしたHLAクラスI欠損ダウディ細胞を、HLA−A2/gag特異的細胞障害性T細胞クローンと共にインキュベートした。無処理の細胞と、ペプチドを添加した221.A2細胞(HLA−A2+ve)とを比較した。
【図8】 実施例2におけるクロム放出アッセイを4時間行った結果を示した説明図である。HLA−A2/gagが標的にしたダウディ細胞を、HLA−A2/gag特異的細胞障害性T細胞クローン及びHLA−A2/MelanA特異的細胞障害性T細胞クローンと共にインキュベートした。
【図9】 実施例2におけるクロム放出アッセイを20時間行った結果を示した説明図である。HLA−A2+veSK29Mel細胞を、HLA−A2/gag特異的細胞障害性T細胞クローンと共にインキュベートした。

Claims (16)

  1. HLAクラスI分子又はその断片を含む複合体であって、前記HLAクラスI分子又はその断片が、
    (i)T細胞バインディングポーション、及び
    (ii)前記HLAクラスI分子又はその断片を標的細胞に選択的に付着せしめる付着手段
    を含み、
    前記HLAクラスI分子又はその断片が認識ペプチドに結合又は付着し、
    前記認識ペプチドが、T細胞認識のために前記HLAクラスI分子又はその断片に提示されるように構成され、
    前記付着手段が、
    (a)標的細胞表面上の標的細胞特異的な分子に対する高い親和性を有するリンキングポリペプチド、及び
    (b)前記リンキングポリペプチドを前記HLAクラスI分子又はその断片にカップリングせしめるカップリングシステム
    を含み、
    前記カップリングシステムが、
    前記リンキングポリペプチドに結合する第1低分子、及び
    前記HLAクラスI分子に結合する第2低分子を含み、
    前記低分子の相互作用により、前記リンキングポリペプチドとHLAクラスI分子との間に安定なブリッジが形成される、
    複合体。
  2. カップリングシステムが、低分子の3ステップ鎖を含む請求項1記載の複合体。
  3. カップリングシステムが、ビオチン及びアビジン/ストレプトアビジンを含む請求項1又は2記載の複合体。
  4. カップリングシステムが、カルモジュリン及びカルモジュリン結合ペプチドを含む請求項1又は2記載の複合体。
  5. 認識ペプチドが、強い細胞傷害性T細胞応答を誘発するか、又は強力な免疫応答誘導能を有するペプチドを含む請求項1〜4のいずれか記載の複合体。
  6. 認識ペプチドが、腫瘍特異的ペプチド、ウイルスペプチド、バクテリアペプチド、及び寄生生物ペプチドの1又は2以上を含む請求項1〜5のいずれか記載の複合体。
  7. 認識ペプチドが、インフルエンザウイルスペプチド、麻疹ウイルスペプチド、エプスタイン−バールウイルスペプチド、溶解タンパク質BZLF1のRAKFFQLLエピトープを含むペプチド、サイトメガロウイルスペプチド、及び破傷風トキソイドペプチドからなる群から選択されるペプチドを含む請求項1〜6のいずれか記載の複合体。
  8. リンキングポリペプチドが、抗体又はその断片を含む請求項1〜7のいずれか記載の複合体。
  9. 抗体が、モノクローナル抗体である請求項8記載の複合体。
  10. 付着手段が、抗原提示細胞表面上の分子に特異的に結合する請求項1〜9のいずれか記載の複合体。
  11. インビトロで標的細胞にHLAクラスI分子又はその断片及び付着手段を接触させる、標的細胞に請求項1〜9のいずれか記載の複合体を付着せしめる方法。
  12. 請求項1〜10のいずれか記載の複合体をインビトロで標的細胞に付着せしめるステップを含む、標的細胞に対する免疫応答を作出又は強化する方法。
  13. (i)請求項1〜10のいずれかに記載された複合体、及び
    (ii)薬学上許される賦形剤又は担体を含む、医薬組成物
  14. 付着手段が認識する細胞に細胞傷害性T細胞応答を誘導する薬剤の調製における請求項1〜10のいずれかに記載された複合体の使用。
  15. 認識ペプチドに対して被検者を免疫する薬剤の調製における請求項1〜10のいずれか記載の複合体の使用。
  16. 1又は2以上の請求項13記載の医薬組成物と、1又は2以上の前記組成物を被検者に投与するための手書き又は印刷した使用法とを含むキット。
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