CN110234660B - 睫状神经营养因子受体配体结合剂及其使用方法 - Google Patents

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Abstract

提供了特异性结合睫状神经营养因子受体(CNTFR)配体的药剂。在某些方面，本公开的药剂是可溶性CNTFR多肽。可溶性CNTFR多肽可以对一种或多种配体‑CNTFR复合物亚基具有改变的(例如，降低的)结合亲和力，对一种或多种CNTFR配体具有改变的(例如，增加的)结合亲和力，或其任何组合。还提供了包含本公开的药剂的组合物，以及使用所述药剂的方法(例如，用于治疗细胞增殖性病症)和鉴定个体具有与CNTFR信号传导相关的细胞增殖性病症的方法。

Description

睫状神经营养因子受体配体结合剂及其使用方法
相关申请的交叉引用
本申请要求2016年12月6日提交的美国临时专利申请62/430,757和2017年4月3日提交的美国临时专利申请62/481,027的权益，这些申请通过引用整体并入本文。
引言
睫状神经营养因子(CNTF)被确定为鸡睫状神经元的存活因子，并且属于结构相关的血液和神经生成细胞因子(IL-6、IL-11、心肌营养素样细胞因子1)(CLCF1)、白血病抑制因子(LIF)、制瘤素M(OSM)、心肌营养素-1(CT-1)的白细胞介素(IL)-6家族。CNTF和IL-6型细胞因子的细胞应答由不同的多单元受体复合物引发，所述复合物包括跨膜的130-kDa糖蛋白gp130。CNTF首先以1：1的化学计量与GPI锚定的CNTF受体(CNTFR)结合，其不参与信号转导。CNTF与膜结合或可溶性CNTFR的结合诱导信号转导β-受体gp130和LIF受体(LIFR)的异二聚体，其触发细胞内信号传导级联反应。
癌症在微环境中启动和发展，微环境本身由于致瘤过程而改变。与癌细胞接触的基质细胞分泌生长因子和细胞因子，其可通过向肿瘤细胞发信号直接起作用或通过募集其他基质成分间接起作用以促进肿瘤进展。该过程的一个重要方面是癌症相关成纤维细胞(CAF)的扩增。CAF是多种基质细胞，在不同的肿瘤和组织中具有不同的特征。
CAF通过分泌刺激肿瘤细胞生长的可溶性因子来支持体内癌细胞(例如肺癌细胞)的生长。一种这样的可溶性因子是心肌营养素样细胞因子1(CLCF1)。由基质中的细胞产生的CLCF1作为生长信号被表达该蛋白的受体-CNTFR的肿瘤细胞接收。例如，功能研究已经确定了CLCF1-CNTFR信号传导在促进非小细胞肺癌(NSCLC)生长中的作用。
发明内容
提供了特异性结合睫状神经营养因子受体(CNTFR)配体的药剂。在某些方面，本公开的药剂是可溶性CNTFR多肽。可溶性CNTFR多肽可以对一种或多种配体-CNTFR复合物亚基具有改变的(例如，降低的)结合亲和力，对一种或多种CNTFR配体具有改变的(例如，增加的)结合亲和力，或其任何组合。还提供了包含本公开的药剂的组合物，以及使用所述药剂的方法(例如，用于治疗细胞增殖性病症)和鉴定个体具有与CNTFR信号传导相关的细胞增殖性病症的方法。
附图说明
图1示意性地示出了根据本公开的一个实施方案抑制下游CNTFR信号传导途径的策略。在该实施方案中，特异性结合CNTFR配体的药剂是可溶性CNTFR“诱饵受体”，其抑制CLCF1与膜结合的CNTFR相互作用，阻止CLCF1-CNTFR介导的信号传导途径的活化，例如JAKSTAT途径和MAPK/ERK途径。
图2提供了证明重组CLCF1激活STAT3的数据。图A：在处理后15分钟和30分钟检测到NSCLC细胞系A549中Tyr705处的p-STAT3水平。图B：在通过CNTFR表达标准化后定量p-STAT3信号的强度。图C：在其他NSCLC细胞系如H23和H358中检测到STAT3活化。
图3显示了证明CLCF1处理对A549和H23细胞存活的影响的数据。在无血清条件下饥饿24小时后，将细胞用无血清培养基中的CLCF1处理72小时。CLCF1以浓度依赖性方式增加A549(图A)和H23(图B)细胞存活。
图4CNTFR的酵母表面展示。图A：CNTFR显示为与酵母表面蛋白Aga2p的融合物。展示的蛋白质含有c-末端c-myc标签，可以测量表达水平。图B：流式细胞术散点图，显示当用20nM CLCF1处理时，表达CNTFR的酵母群体具有增加的CLCF1结合信号。
图5酵母展示的CNTFR在CLCF1存在下与β受体结合。散点图显示CNTFR显示与仅抗cMyc抗体(图A)，与LIFR-Fc(图B)，与CLCF1和LIFR-Fc(图C)以及与CLCF1、LIFR-Fc和gp130-HIS(图D)孵育的酵母。荧光标记的第二抗体用于通过流式细胞术检测各种组分的结合。图E：来自图B、C和D的图的叠加。
图6酵母展示的CNTFR-CLCF1可以在没有LIFR的情况下与gp130结合。散点图显示CNTFR显示与仅抗cMyc抗体(图A)，与gp130-Fc(图B)，与CLCF1和gp130-Fc(图C)以及与CLCF1、gp130-Fc和LIFR-HIS(图D)孵育的酵母。荧光标记的第二抗体用于通过流式细胞术检测各种组分的结合。图E：来自图B、C和D的图的叠加。
图7显示了在针对CLCF1的随机诱变的CNTFR文库的3轮分选后从中间亲和群体分离的变体。
图8显示了在针对CLCF1的随机诱变的CNTFR文库的3轮分选后从最高亲和力群体分离的变体。
图9显示了在针对CLCF1的改组CNTFR文库的3轮分选后从最高亲和力群体分离的变体。
图10亲和力成熟的CNTFR变体的表征。图A：CLCF1与表达从亲和力成熟筛选分离的CNTFR构建体的酵母结合。图B：酵母展示的CNTFR构建体的表观Kd值。图C：CNTF与酵母的结合显示野生型CNTFR和变体4。图D：除hCLCF1外还与mCLCF1结合的变体4。
图11含有T268A和D269A突变的CNTFR变体结合到CLCF1和LIFR，但不是gp130。CNTFR T268A D269A构建与CLCF1(图A)、gp130-Fc(图B)和LIFR-Fc(图C)的结合信号。
图12对不与LIFR结合的CNTFR变体的文库筛选。在对高亲和力CLCF1结合物进行初始筛选后，分离出具有低LIFR-Fc信号的群体(图A)。然后对CLCF1结合物进行另一次筛选(图C)并筛选非LIFR结合物。图D：经过6轮分选后，筛选的文库显示LIFR结合降低，而CLCF1结合未改变。上图A、下图B和下图C中的门代表每轮分类中的孤立种群。
图13不结合LIFR的CNTFR变体的表征。图A：从使用针对LIFR的阴性分类(负序分类)的文库筛选方法分离的变体具有两个共有突变，Y177H和K178N。图B：这两种突变在组合时显示出对降低LIFR结合亲和力的累加效应。V4＝来自图10的变体4。
图14可溶性eCNTFR构建体的表征。图A：与wtCNTFR蛋白相比，溶解表达的eCNTFR-HIS和eCNTFR-Fc显示出与CLCF1的显著改善的结合。图B：可溶性eCNTFR构建体显示与可溶性gp130和LIFR的最小结合(对于每种条件，从左至右：wtCNTFR-HIS；wtCNTFR-Fc；eCNTFR-HIS；eCNTFR-Fc)。
图15eCNTFR-Fc对细胞信号传导和存活的影响。图A：用10nM CNTFR-Fc变体处理A549非小细胞肺癌细胞20分钟，并进行蛋白质印迹以检测pSTAT3。eCNTFR-Fc处理抑制CLCF1在A549(图B)和H23细胞(图C)中的存活增强作用。对于图B和C，对于每种浓度，CLCF1的结果在左侧，而CLCF1+eCNTFR-Fc的结果在右侧。
图16由eCNTFR-Fc隔离CLCF1抑制在A549异种移植模型中的肿瘤生长。图A：在1mg/kg体重剂量后48小时内CLCF1隔离和清除eCNTFR-Fc。图B：A549NSCLC细胞的异种移植模型中的肿瘤负荷。用PBS、1mg/kg体重或10mg/kg体重eCNTFR-Fc每周两次(箭头)处理小鼠17天(圆圈：PBS，正方形：1mg/kg eCNTFR-Fc，三角形：10mg/kg eCNTFR-Fc)。图C：从时间0标准化的各个肿瘤大小的瀑布图。
图17eCNTFR-Fc抑制H23异种移植模型中的肿瘤生长。图A：H23NSCLC细胞的异种移植模型中的肿瘤负荷。在39天内使用PBS(圆圈)、10mg/kg体重wtCNTFR-Fc(正方形)或eCNTFR-Fc(三角形)每周处理小鼠三次。图B：个体肿瘤的瀑布图。
图18，图A和B，显示了证明在工程化CLCF1捕获剂(eCNTFR)中增加的特异性和体外功效的数据。显示的是eCNTFR-Fc+mCLCF1(圆圈)；wtCNTFR-Fc+CNTF(三角形)；wtCNTFR-Fc+mCLCF1(菱形)；和eCNTFR-Fc+CNTF。STAT3磷酸化的抑制用于证明抑制作用。
图19，图A-I，提供显示eCNTFR的体内作用的数据。图A：在NOD/SCID/γ小鼠中腹膜内(ip)给予10mg/kg eCNTFR-Fc后的血液清除率和CLCF1隔离。注射后收集血清样品，并使用eCNTFR-Fc作为捕获剂，通过ELISA测量未结合的CLCF1。载体处理的小鼠用于确定基线CLCF1水平。使用抗Fc抗体作为捕获剂，通过ELISA定量血液中的eCNTFR-Fc水平。图B：A549异种移植物的肿瘤体积定量[除了PBS之外n＝8个肿瘤(在最后时间点n＝6个肿瘤)，一个实验]。使用双向ANOVA，*P<0.05；**P<0.01；***P<0.001。数据表示为平均值±s.e.m。图C：最终时间点A549异种移植物最终时间点的肿瘤体积定量。晶须识别为最大值和最小值；框表示第75个和第25个百分位和行中值。使用双向ANOVA，*p<0.05，**p<0.01图D：瀑布图显示A549异种移植物的肿瘤百分比从基线的变化。图E：源自患者的异种移植物(PDTX)模型的肿瘤体积定量。使用双向ANOVA，**P<0.01；****P<0.0001。数据表示为平均值±s.e.m。图F：PDTX模型最终时间点的肿瘤体积定量。晶须识别为最大值和最小值；框表示第75个和第25个百分位和行中值。**使用双尾未配对学生t检验，P<0.01。图G：瀑布图显示PDTX模型的肿瘤百分比从基线的变化。图H：PDTX肿瘤的代表性图像。比例尺，1厘米。图I：磷酸-组蛋白H3(PH3)和裂解的半胱天冬酶-3(CC3)的代表性H&E染色和IHC。比例尺，50μm。定量PH3和CC3阳性病灶(右图)。使用单因素方差分析，*P<0.05；****P<0.0001。数据表示为平均值±s.e.m。
图20，图A-D，提供了证明CLCF1和CNTFR在非小细胞肺癌(NSCLC)中表达的数据。
具体实施方式
提供了特异性结合睫状神经营养因子受体(CNTFR)配体的药剂。在某些方面，本公开的药剂是可溶性CNTFR多肽。可溶性CNTFR多肽可以对一种或多种配体-CNTFR复合物亚基具有改变的(例如，降低的)结合亲和力，对一种或多种CNTFR配体具有改变的(例如，增加的)结合亲和力，或其任何组合。还提供了包含本公开的药剂的组合物，以及使用所述药剂的方法(例如，用于治疗细胞增殖性病症)和鉴定个体具有与CNTFR信号传导相关的细胞增殖性病症的方法。
在更详细地描述本公开的药剂、组合物和方法之前，应理解药剂、组合物和方法不限于所描述的特定实施例，因此当然可以对其进行改变。还应理解，本文使用的术语仅用于描述特定实施例，并不旨在限制，因为药剂、组合物和方法的范围仅受所附权利要求的限制。
在提供值的范围的情况下，应理解的是，除非上下文另有明确规定，否则在该范围的上限和下限之间的每个中间值，至下限单位的十分之一和所述范围内的任何其它所述或中间值均涵盖在药剂、组合物和方法中。这些较小范围的上限和下限可以独立地包括在较小范围内，并且还涵盖在药剂、组合物和方法中，受所述范围内的任何具体排除的界限。在所述范围包括一个或两个界限的情况下，排除那些包括的界限之一或两者的范围也包括在药剂、组合物和方法中。
某些范围在本文以前面出现术语“约”的数值呈现。术语“约”在本文中用于提供其后面的确切数字的字面支持，以及接近或近似该术语后面的数字的数字。在确定数字是否接近或近似具体记载的数字时，接近或近似未记载的数字可以是在其呈现的上下文中提供具体记载的数字的实质等同物的数字。
除非另外定义，否则本文使用的所有技术和科学术语均具有与药剂、组合物和方法所属领域的普通技术人员通常理解的含义相同的含义。尽管任何与本文所述那些相似或等同的缀合物、组合物和方法也可用于药剂、组合物和方法的实践或测试，但现在描述代表性的示例性药剂、组合物和方法。
本说明书中引用的所有出版物和专利均通过引用并入本文，如同每个单独的出版物或专利被具体和单独地指出通过引用并入并且通过引用并入本文以公开和描述与引用所述出版物相关的材料和/或方法。任何出版物的引用均为其在申请日之前的公开，并且不应被解释为承认本药剂、组合物和方法无权先于此类出版物，因为所提供的出版日期可能与可能需要独立确认的实际出版日期不同。
应注意，除非上下文另有明确说明，否则如本文和所附权利要求中所使用的单数形式“一”、“一个”和“所述”包括复数指示物。还应注意，可以撰写权利要求以排除任何任选元素。这样，本陈述旨在用作使用这种排除性术语，如结合权利要求要素而叙述的“唯一”、“仅仅”等，或使用“否定”限制的前置基础。
应理解，为了清楚起见，在单独的实施例的上下文中描述的药剂、组合物和方法的某些特征也可以以组合形式提供在单个实施例中。相反，为了简洁起见，在单个实施例的上下文中描述的药剂、组合物和方法的各种特征也可以单独提供或以任何合适的子组合提供。实施例的所有组合由本公开具体包括，并且在本文中公开，就好像每一个组合被单独和明确地公开，在这个意义上这种组合包括可操作的方法和/或组合物。另外，描述这种变量的实施例中列出的所有子组合也由本药剂、组合物和方法具体包括，并且在本文中公开，就好像每一个这种子组合在本文中单独和明确地公开。
本领域技术人员在阅读本公开时将理解，本文描述和示例的每个单独实施例具有离散的组件和特征，其可以容易地与任何其它几个实施例的特征分离或组合而不脱离本方法的范围或精神。任何记载的方法可以按照所记载事件的顺序或以逻辑上可能的任何其它顺序进行。
CNTFR配体结合剂
如上所概述，本公开的方面包括特异性结合睫状神经营养因子受体(CNTFR)配体的药剂。CNTFR(也称为CNTF受体亚基α)是1型细胞因子受体家族的成员。CNTFR是睫状神经营养因子(CNTF)的三联受体，以及其他配体如心肌营养素样细胞因子1(CLCF1)和神经蛋白(NP)的配体特异性组分。配体与CNTFR的结合募集受体的跨膜组分gp130和白血病抑制因子受体(LIFR)，促进信号转导。
如本文所用，“特异性结合睫状神经营养因子受体(CNTFR)配体的药剂”是对一种或多种CNTFR配体(例如，CLCF1、CNTFR和/或NP中的一种或多种)表现出结合亲和力的药剂，其KD小于或等于约10-5M，小于或等于约10-6M，小于或等于约10-7M，小于或等于约10-8M，或小于或等于约10-9M、10-10M、10-11M或10-12M或更小。可以使用常规技术容易地确定这种亲和力，例如通过平衡透析；通过使用表面等离子共振(SPR)技术(例如，BIAcore 2000仪器，使用制造商概述的一般程序)；通过放射免疫测定；或通过下面实施例中提出的或者技术人员知道的另一种方法。
本公开的试剂可以是特异性结合CNTFR配体的任何合适类型的试剂，包括但不限于适体、抗体等。在某些方面，该试剂是可溶性CNTFR多肽。
现在将详细描述本公开的CNTFR配体结合剂的非限制性实施方案。
可溶性CNTFR多肽
如上所述，在某些方面，特异性结合CNTFR配体的试剂是可溶性CNTFR多肽。“可溶性CNTFR多肽”是指未整合到细胞膜中的CNTFR多肽。野生型人CNTFR氨基酸序列(UniProtKB-P26992)提供于下表1中。
表1：野生型人CNTFR氨基酸序列(不可溶)
根据某些实施方案，借助于具有一种或多种赋予溶解度的突变的多肽，可溶性CNTFR多肽不整合到细胞膜中。如在整个本公开中所使用的，“突变”可以包括在相关多肽例如本公开的CNTFR多肽中的一个或多个氨基酸取代，一个或多个氨基酸缺失(例如截短)，一个或多个氨基酸插入，或其任何组合。
一种或多种赋予溶解度的突变可位于CNTFR多肽的任何合适的区域中。在某些方面，可溶性CNTFR多肽在将野生型CNTFR锚定至细胞膜的结构域中包含一个或多个赋予溶解度的突变。该结构域含有脂质化位点(S342)，其用糖基磷脂酰肌醇(GPI)进行翻译后修饰，其将蛋白质锚定在细胞膜上。将CNTFR锚定至细胞膜的野生型人CNTFR结构域可以定义为由SEQ ID NO：1中所示的氨基酸343-372组成(在表1中加下划线)。在某些条件下，CNTFR的这部分被酶促修饰以从细胞膜释放CNTFR。根据一些实施方案，本公开的可溶性CNTFR多肽包括S342处的取代突变，其排除了GPI的翻译后修饰，从而赋予溶解度。野生型人CNTFR还包括由SEQ ID NO：1的氨基酸1-22组成的信号肽(在表1中加下划线)。
根据某些实施方案，将CNTFR锚定至细胞膜的CNTFR结构域包括一个或多个氨基酸取代，其导致CNTFR多肽丧失其锚定至细胞膜的能力，从而赋予溶解性。替代地或者另外，可溶性CNTFR多肽可包括截短(例如，在将CNTFR锚定至细胞膜的CNTFR结构域中)，其导致CNTFR多肽丧失其锚定至细胞膜的能力，从而赋予溶解性。在某些方面，可溶性CNTFR多肽缺乏将CNTFR锚定至细胞膜的CNTFR结构域。例如，可溶性CNTFR多肽可缺少SEQ ID NO：1中所示的氨基酸343-372。
除了任选地包括一种或多种赋予溶解度的突变之外，本公开的可溶性CNTFR多肽还可以包括一种或多种赋予多肽一种或多种其他所需特性的突变。感兴趣的其他期望的性质包括但不限于改变(例如，更大)对CNTFR配体的结合亲和力，与一种或多种其他CNTFR配体相比，对特定的目标CNTFR配体改变的(例如，更大的)特异性，相对于野生型CNTF受体，例如具有SEQ ID NO：1所述氨基酸序列或其成熟形式的受体，改变的(例如，降低的)对配体-CNTFR复合物亚基(例如，gp130、LIFR和/或类似物)的结合亲和力。
“更大的结合亲和力”或“增加的结合亲和力”是指与野生型CNTF受体相比，可溶性CNTFR多肽与分子(例如，CNTFR配体如CLCF1)表现出更紧密的结合(如较低的KD值所示)。“较低的结合亲和力”或“降低的结合亲和力”是指与野生型CNTF受体相比，可溶性CNTFR多肽与分子(例如，配体-CNTFR复合物亚基，例如LIFR、gp130或两者)表现出较不紧密结合(如较高的KD值所示)。
方法可用于测量CNTFR配体结合剂(例如，可溶性CNTFR多肽)与目标分子的结合亲和力，例如CNTFR配体、配体-CNTFR复合物亚基，例如LIFR、gp130等。例如，表面等离子共振(SPR)技术(例如，使用BIAcoreTM 2000仪器)、动力学排除测定(SapidyneInstruments)、生物层干涉测量(BLI)技术(例如，ForteBio />)或其他类似测定/技术可以用于确定CNTFR配体结合剂是否表现出所需的结合亲和力。在本公开的上下文中用于测量结合亲和力的合适方法包括例如Hunter,S.A.和Cochran,J.R.(2016)MethodsEnzymol.580:21-44中描述的那些。
在一些实施方案中，在直接结合测定中，可以使用缀合至荧光团或放射性同位素的CNTFR多肽或含有N-或C-末端表位标签的CNTFR多肽测量平衡结合常数(KD)以供通过标记的抗体进行检测。如果标记或标签不可行或不是期望的，可以使用竞争结合试验来确定半数最大抑制浓度(IC50)——可检测到标记的竞争物的最大信号的50％的未标记CNTFR多肽的量。然后可以从测量的IC50值计算KD值。
如上所述，在某些方面，本公开的可溶性CNTFR多肽包括一种或多种突变，其相对于野生型CNTF受体，例如，具有SEQ ID NO：1所示氨基酸序列的受体或其成熟形式，改变了(例如，降低了)可溶性CNTFR多肽对配体-CNTFR复合物亚基的结合亲和力。“配体-CNTFR复合物亚基”是指在CNTFR与配体结合后与野生型CNTFR缔合的蛋白质。配体-CNTFR复合物亚基的非限制性实例包括白血病抑制因子受体(LIFR)和糖蛋白130(gp130)。在某些方面，一种或多种突变降低可溶性CNTFR多肽对LIFR、gp130或两者的结合亲和力。这样的一个或多个突变可以防止可溶性CNTFR多肽在与配体结合时充当激动剂，例如，当期望减少CNTFR介导的信号传导(例如，减少细胞增殖)时。
根据某些实施方案，当可溶性CNTFR多肽对配体-CNTFR复合物亚基表现出降低的结合亲和力时，可溶性CNTFR多肽的结合亲和力在10nM CLCF1存在下具有100nM或更高的KD值。
在某些方面，相对于具有SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列的CNTFR多肽，本公开的可溶性CNTFR多肽具有降低的对LIFR的结合亲和力并且包括在氨基酸位置177、178或两者处的突变(例如，氨基酸取代)。177位的示例突变是Y177H。177位的另一个示例突变是Y177A。位置178的示例突变是K178N。178位的另一个示例突变是K178A。如下面的实施例部分所证明的，本发明人已经确定这种突变导致可溶性CNTFR多肽是CNTFR信号传导的抑制剂，而对配体-CNTFR复合物亚基具有未改变的亲和力的可溶性CNTFR多肽由于它能够在结合配体后募集例如LIFR和gp130而起激动剂的作用。在某些方面，本公开的可溶性CNTFR多肽包括突变Y177H和K178N，或突变Y177A和K178A，或突变Y177H和K178A，或突变Y177A和K178N。
根据某些实施方案，相对于具有SEQ ID NO：1中所示的氨基酸序列的CNTFR多肽，本公开的可溶性CNTFR多肽具有降低的对gp130的结合亲和力并且包括在氨基酸位置268、269或两者处的突变(例如，氨基酸取代)。位置268处的示例突变是T268A。位置269处的示例突变是D269A。在某些方面，本公开的可溶性CNTFR多肽包括突变T268A和D269A。
如上所概述，本公开的可溶性CNTFR多肽可以包括一种或多种突变，相对于野生型CNTF受体，例如，具有SEQ ID NO：1所示氨基酸序列的受体或其成熟形式，其改变了(例如，增加了)可溶性CNTFR多肽对目标CNTFR配体(例如，CLCF1、NP、CNTF或另一种感兴趣的CNTFR配体)的结合亲和力和/或特异性。根据某些实施方案，当可溶性CNTFR多肽对CNTFR配体表现出增加的结合亲和力时，可溶性CNTFR多肽对配体的结合亲和力具有10nM或更低的KD值。
根据某些实施方案，本公开的可溶性CNTFR多肽包括一种或多种增加CLCF1的结合亲和力和/或特异性的突变。在某些方面，相对于具有SEQ ID NO：1所述氨基酸序列的CNTFR多肽，这种可溶性CNTFR多肽包括在氨基酸位置110、174、237、287或其任何组合的突变(例如，氨基酸取代)。位置110处的示例突变是R110Q。位置174处的示例突变是T174P。位置237处的示例突变是S237F。位置237处的另一个示例突变是S237Y。位置287处的示例突变是I287F。在某些方面，本公开的可溶性CNTFR多肽包括突变R110Q、T174P、S237F/S237Y和I287F中的一种或任何组合(例如，每种)。
在一些实施方案中，相对于具有SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列的CNTFR多肽，本公开的可溶性CNTFR多肽包括在氨基酸位置110、174、177、178、237、268、269、287或其任何组合的突变(例如，氨基酸取代)。
在某些方面，本公开的可溶性CNTFR多肽包括突变R110Q、T174P、Y177H/Y177A、K178N/K178A、S237F/S237Y、T268A、D269A和I287F中的一种或任何组合(例如，每种)。
根据本公开的一个实施方案的可溶性CNTFR多肽包括下表2中列出的氨基酸序列(SEQ ID NO：2)。在表2中，突变是粗体/下划线。在该实例中，可溶性CNTFR多肽包括相对于具有SEQ ID NO：1所示氨基酸序列的野生型CNTF受体的氨基酸343-372的C-末端截短。在某些方面，这种可溶性CNTFR多肽不包括信号肽(在表2中加下划线)。
表2：实施例可溶性CNTFR多肽的氨基酸序列
本公开的可溶性CNTFR多肽包括(或对应于)以下实验部分和图7、图8和图9中的任何一个中呈现的任何CNTFR多肽。
根据某些实施方案，本公开的可溶性CNTFR多肽包含与SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2的氨基酸23-342或其片段(例如长度为250至319个氨基酸、250至260个氨基酸、260至270个氨基酸、270至280个氨基酸、280至290个氨基酸、290至300个氨基酸、300至310个氨基酸、或310至319个氨基酸的片段)具有70％或更高、75％或更高、80％或更高、85％或更高、90％或更高、95％或更高、具有99％或更高的同一性的氨基酸序列。除了可溶之外，这样的CNTFR多肽可以还包括一种或多种期望的特征，例如对一种或多种配体-CNTFR复合物亚基(例如，LIFR、gp130或两者)的结合亲和力降低，对CNTFR配体(例如，CLCF1)的结合亲和力/特异性增加，对CNTFR配体(例如，CNTF、NP等)的结合亲和力降低，以及它们的任何组合。
抗体
在某些方面，特异性结合CNTFR配体的药剂是抗体。术语“抗体”和“免疫球蛋白”包含任何同种型的抗体或免疫球蛋白，完整抗体(例如，由四聚体组成的抗体，而四聚体又由重链和轻链多肽的两个二聚体组成)；单链抗体；保留与CNTFR配体(例如CLCF1、NP和/或CNTF)结合的抗体片段(例如，完整或单链抗体片段)，包含但不限于Fab、Fab’、Fv、scFv和双体；嵌合抗体；和人源化抗体，例如，人源化全抗体或人源化抗体片段。
“Fab”片段含有轻链的恒定结构域和重链的第一恒定结构域(CH1)。Fab片段与Fab'片段的不同之处在于在重链CH1结构域的羧基末端添加了少数残基，包括来自抗体铰链区的一个或多个半胱氨酸。Fab'-SH是本文中Fab'的名称，其中恒定结构域的半胱氨酸残基带有游离巯基。F(ab')2抗体片段最初是作为Fab'片段对产生的，它们之间具有铰链半胱氨酸。抗体片段的其他化学偶联也是已知的。
“单链Fv”或“scFv”抗体片段包含抗体的VH和VL结构域，其中这些结构域存在于单一多肽链中。在一些实施方案中，Fv多肽还包含VH和VL结构域之间的多肽接头，其使sFv能够形成用于抗原结合的所需结构。
在某些方面，与CNTF或NP1相比，特异性结合CNTFR配体的抗体优先特异性结合CLCF1。根据某些实施方案，特异性结合CNTFR配体的抗体特异性结合CLCF1而非CNTF或NP1。
CNTFR配体结合剂的工程化/开发和生产
本公开还提供了工程化/开发具有一种或多种所需功能的另外的CNTFR配体结合剂的方法。CNTFR配体结合剂的形成方式可以变化。可以使用合理和组合方法来设计具有新特性的CNTFR配体结合剂，所述新特性例如对一种或多种配体-CNTFR复合物亚基(例如，LIFR、gp130或两者)的结合亲和力降低，对CNTFR配体(例如，CLCF1)的结合亲和力和/或特异性增加，对CNTFR配体(例如，CNTF、NP等)的结合亲和力降低，以及它们的任何组合。例如，为了开发可溶性CNTFR多肽或抗体，可以创建和筛选CNTFR多肽或抗体文库，例如通过细菌展示、噬菌体展示、酵母表面展示、荧光激活细胞分选(FACS)和/或任何其他合适的筛选方法。
酵母表面展示是一种强大的组合技术，已被用于设计具有新型分子识别特性、增加的靶结合亲和力、适当折叠和改善稳定性的蛋白质。在该平台中，产生蛋白质变体文库并以高通量方式筛选以分离具有所需生物化学和生物物理特性的突变体。如下文实施例部分所证明的，本发明人已经成功地使用酵母表面展示来以期望的方式改造具有改变的CLCF1、LIFR和gp130的结合亲和力的CNTFR多肽。酵母表面展示受益于真核分泌途径的质量控制机制、伴侣辅助折叠和有效的二硫键形成。
用于开发具有所需感兴趣性质的可溶性CNTFR多肽的一个示例性方法涉及将CNTFR多肽遗传融合至酵母交配凝集素蛋白Aga2p，其通过两个二硫键与酵母细胞壁蛋白Aga1p结合。该Aga2p-融合构建体和染色体整合的Aga1p表达盒可以在合适的启动子控制下表达，例如半乳糖诱导型启动子。可以包括N-或C-末端表位标签，以通过使用荧光标记的一抗或二抗的流式细胞术测量细胞表面表达水平。该构建体代表最广泛使用的展示形式，其中CNTFR多肽(或待改造的其他蛋白质)的N末端与Aga2融合，但已描述了酵母表面展示质粒的几种可选变体并且可用于开发本公开的可溶性CNTFR多肽。与用于噬菌体或mRNA展示的基于淘选的方法相比，该筛选平台的益处之一是双色FACS可用于定量区分对特定靶标的结合亲和力差异小至两倍的克隆。
为了在DNA水平上选择性地突变CNTFR，一种示例性方法是易错PCR，其可用于通过任何数量的改变的反应条件引入突变，包括使用不具有校正(即外切核酸酶)活性的聚合酶，使用核苷类似物的三磷酸盐衍生物的混合物，使用改变的dNTP比例，不同浓度的镁或锰等。或者，可以使用例如重叠延伸PCR通过寡核苷酸组装引入简并密码子。接下来，可以使用侧翼引物扩增遗传物质，所述侧翼引物与酵母展示载体充分重叠，用于酵母中的同源重组。这些方法允许以相对低的成本和努力创建CNTFR库。已经开发了合成文库和最近的方法，其允许对文库组成的限定性控制。
在某些方面，通过FACS筛选展示文库(例如，酵母展示文库)与目标靶标(例如，感兴趣的CNTFR配体，例如CLCF1)的结合。双色FACS可用于文库筛选，其中一种荧光标记可用于检测c-myc表位标签，另一种荧光标记用于测量CNTFR多肽与目标结合靶标的相互作用。不同的仪器激光器和/或滤光器组可用于测量单细胞分辨率下两种荧光团的激发和发射性质。这使酵母表达水平能够通过结合进行标准化。也就是说，表现出差的酵母表达但结合大量靶标的CNTFR多肽可以与高水平表达但与靶标弱结合的CNTFR多肽区分开。因此，表达与结合的二维流式细胞术图将导致与靶抗原结合的对角线酵母细胞群。可以使用库分类门隔离高亲和力结合剂。或者，在初始分类轮次中，清除不表达全长蛋白质的不期望克隆的文库可能是有用的。
在富集CNTFR文库用于编码感兴趣的CNTFR多肽的克隆后，回收酵母质粒并测序。可以在增加的分选严格性下进行额外轮次的FACS。然后可以测量单个酵母展示的CNTFR克隆的结合亲和力或动力学解离速率。
一旦通过表面展示(例如，酵母表面展示)鉴定了感兴趣的CNTFR多肽，就可以使用合适的方法产生工程化的CNTFR多肽。根据某些实施方案，CNTFR多肽通过固相肽合成产生。可以在自动合成仪上使用固相肽化学合成CNTFR多肽序列。例如，可以使用标准的基于9-芴基甲氧基羰基(Fmoc)的固相肽化学。固相合成之后可以进行纯化，例如通过反相高效液相色谱(RP-HPLC)。
在某些方面，使用重组DNA方法产生可溶性CNTFR多肽。已经开发了用于在多种宿主细胞类型中使用重组方法产生诸如CNTFR多肽的蛋白质的策略。例如，功能性可溶性CNTFR多肽可以用barnase作为遗传融合伴侣产生，其促进大肠杆菌周质空间中的折叠并且用作有用的纯化手柄。根据某些实施方案，工程化的可溶性CNTFR多肽在酵母(例如，酵母菌株巴斯德毕赤酵母或酿酒酵母)或哺乳动物细胞(例如人胚肾细胞或中国仓鼠卵巢细胞)中表达。表达构建体可以编码一个或多个标签(例如，用于通过例如金属螯合色谱(Ni-NTA)纯化的C-末端六吖庚啶标签)。然后可以使用尺寸排阻色谱法去除聚集体、错误折叠的多聚体等。
本公开的方面包括编码本公开的CNTFR配体结合剂的核酸。即，提供了编码本文所述的任何CNTFR配体结合剂(例如，本文所述的任何可溶性CNTFR多肽、抗体等)的核酸。在某些方面，这种核酸存在于表达载体中。表达载体包括与编码试剂的核酸(例如，可溶性CNTFR多肽)可操作地连接的启动子，该启动子基于选择用于表达试剂的宿主细胞的类型进行选择。合适的表达载体通常可以作为附加体或作为宿主染色体DNA的组成部分在宿主生物中复制。通常，表达载体含有选择标记(例如，氨苄青霉素抗性，潮霉素抗性，四环素抗性，卡那霉素抗性，新霉素抗性等)，以允许检测用所需DNA序列转化的那些细胞。
还提供了宿主细胞，其包括编码本文所述的任何CNTFR配体结合剂的核酸(例如，本文所述的任何可溶性CNTFR多肽、抗体等)，以及包括其的任何表达载体。大肠杆菌是原核宿主细胞的实例，其可用于克隆编码本公开的CNTFR配体结合剂的核酸。适合使用的其他微生物宿主包括杆菌，例如枯草芽孢杆菌，和其他肠杆菌科，例如沙门氏菌、沙雷氏菌和各种假单胞菌属物种。在这些原核宿主中，还可以制备表达载体，其通常含有与宿主细胞相容的表达控制序列(例如，复制起点)。此外，将存在任何数量的众所周知的启动子，例如乳糖启动子系统、色氨酸(trp)启动子系统、β-内酰胺酶启动子系统或来自噬菌体λ的启动子系统。启动子通常将控制表达，任选地具有操纵基因序列，并具有核糖体结合位点序列等，用于启动和完成转录和翻译。
其他微生物，如酵母，也可用于表达。酵母菌(例如，酿酒酵母)和毕赤酵母属是合适的酵母宿主细胞的实例，其合适的载体具有如期望的表达控制序列(例如，启动子)、复制起点、终止序列等。典型的启动子包括3-磷酸甘油酸激酶和其他糖酵解酶。诱导型酵母启动子包括来自醇脱氢酶、异细胞色素C和负责麦芽糖和半乳糖利用的酶的启动子，等等。
除微生物外，哺乳动物细胞(例如，在体外细胞培养中生长的哺乳动物细胞)也可用于表达和产生本公开的CNTFR配体结合剂。合适的哺乳动物宿主细胞包括人细胞系、非人灵长类细胞系、啮齿动物(例如小鼠、大鼠)细胞系等。合适的哺乳动物细胞系包括但不限于HeLa细胞(例如，美国典型培养物保藏中心(ATCC)编号CCL-2)，CHO细胞(例如，ATCC编号CRL9618、CCL61、CRL9096)，293细胞(例如，ATCC编号CRL-1573)，Vero细胞，NIH 3T3细胞(例如，ATCC编号CRL-1658)，Huh-7细胞，BHK细胞(例如，ATCC编号CCL10)，PC12细胞(ATCC编号CRL1721)，COS细胞，COS-7细胞(ATCC编号CRL1651)，RAT1细胞，小鼠L细胞(ATCC编号CCLI.3)，人胚肾(HEK)细胞(ATCC编号CRL1573)，HLHepG2细胞等。这些细胞的表达载体可包括表达控制序列，例如复制起点、启动子和增强子，以及必需的加工信息位点，例如核糖体结合位点、RNA剪接位点、多腺苷酸化位点和转录终止子序列。合适的表达控制序列的实例是衍生自免疫球蛋白基因、SV40、腺病毒、牛乳头瘤病毒、巨细胞病毒等的启动子。
一旦合成(化学或重组)，可以根据本领域已知的标准程序纯化CNTFR配体结合剂，包括硫酸铵沉淀、亲和柱、柱色谱、高效液相色谱(HPLC)纯化、凝胶电泳等。主题CNTFR配体结合剂可以是基本上纯的，例如，至少约80％至85％纯，至少约85％至90％纯，至少约90％至95％纯，或98％至99％，或更纯，例如，没有污染物，如细胞碎片、CNTFR配体结合剂以外的大分子等。
融合蛋白和结合物
在某些方面，提供了与异源部分稳定结合(例如，融合、缀合或以其他方式连接)的CNTFR配体结合剂(例如，本文所述的任何可溶性CNTFR多肽或抗体)。
在一些实施方案中，提供了融合蛋白，其中多肽CNTFR配体结合剂(例如，本公开内容的的任何可溶性CNTFR多肽或抗体)与异源多肽融合。感兴趣的异源多肽包括但不限于Fc结构域(例如，人或小鼠Fc结构域)，白蛋白，转铁蛋白，XTEN，同型氨基酸聚合物，脯氨酸-丙氨酸-丝氨酸聚合物，弹性蛋白样肽或其任何组合。在某些方面，与不融合异源多肽的相同的CNTFR配体结合剂相比，异源多肽在向有需要的个体施用时增加CNTFR配体结合剂的稳定性和/或血清半衰期。在某些方面，提供了融合蛋白，其包括与人Fc结构域融合的本公开的任何可溶性CNTFR多肽(例如，全长人Fc结构域或其片段)。根据某些实施方案，这种融合蛋白可用于例如根据本公开内容的方法给予有需要的个体(例如，具有与CNTFR信号传导相关的细胞增殖性疾病的个体)。可以与本公开的任何可溶性CNTFR多肽融合的人Fc结构域的非限制性实例是具有下表3中列出的序列的人IgG1Fc结构域(SEQ ID NO：3)，或其片段。
表3：实施例人Fc结构域的氨基酸序列
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根据某些实施方案，提供了缀合物，其中本公开的CNTFR配体结合剂与部分缀合。感兴趣的部分包括但不限于聚乙二醇(PEG)、抗癌药物、可检测标记及其组合。
感兴趣的抗癌药物包括抑制细胞增殖和/或杀死癌细胞的药剂。这种试剂可以变化，并且包含细胞抑制剂和细胞毒性剂(例如，能够杀死靶细胞组织，内化到或未内化到靶细胞中的试剂)。在某些方面，治疗剂是细胞毒性剂，其选自烯二炔、lexitropsin、duocarmycin、紫杉烷、嘌呤霉素、海兔毒素、美登木素生物碱和长春花生物碱。在一些实施方案中，细胞毒性剂是紫杉醇、多西紫杉醇、CC-1065、CPT-11(SN-38)、拓扑替康、多柔比星、吗啉代-多柔比星、根瘤毒素、氰基吗啉代-多柔比星、多拉菌素-10、棘霉素、考布他汀、加利车霉素、美登素、美登素DM1、美登素DM4、DM-1、瑞奥西汀或其它海兔毒素衍生物，如瑞奥西汀E或瑞奥西汀F、AEB(AEB-071)、AEVB(5-苯甲酰基戊酸-AE酯)、AEFP(抗体-内皮抑素融合蛋白)、MMAE(单甲基尿嘧啶E)、MMAF(单甲基尿嘧啶F)、吡咯并苯并二氮杂卓(PBD)、五加素、纺锤菌素或其任何组合。根据某些实施方案，所述试剂是选自半胱氨酸和哈米特林(hemiasterlin)类似物如HTI-286的蛋白质毒素(例如，参见USPN 7,579,323；WO 2004/026293；和USPN 8,129,407，其全部公开内容通过引用并入本文)、相思子毒素(abrin)、布鲁辛(brucine)、毒芹素(cicutoxin)、白喉毒素、蟾毒素(batrachotoxin)、肉毒杆菌毒素、志贺毒素、内毒素、假单胞菌外毒素、假单胞菌内毒素、破伤风毒素、百日咳毒素、炭疽毒素、霍乱毒素、falcarinol、伏马菌素B1、伏马菌素B2、阿夫罗毒素、毛蕊素、agitoxin、charybdotoxin、马拉毒素、树懒毒素、锡拉毒素、河豚毒素、钙化脓毒毒素、泰卡毒素、calcicludine、格尔达那霉素、格洛宁、洛塔菌素、ocratoxin A、棒曲霉素、蓖麻毒素、马钱子碱、三氯乙烯、玉米烯酮和四点毒素。可以使用的酶活性毒素及其片段包括白喉A链、白喉毒素的非结合活性片段、外毒素A链(来自铜绿假单胞菌)、蓖麻毒蛋白A链、相思子毒素A链、蒴莲素A链、α-帚曲霉素、油桐蛋白、石竹素蛋白、美洲商陆(Phytolaca americana)蛋白(PAPI、PAPII和PAP-S)、苦瓜苦参碱抑制剂、麻风树毒蛋白、巴豆毒蛋白、肥皂草抑制剂、白树毒素、米托洁林(mitogellin)、局限曲霉素、酚霉素、依诺霉素和单端孢霉烯族化合物(tricothecenes)。
可检测标记包括可在感兴趣的应用(例如体外和/或体内研究和/或临床应用)中检测的标记。可检测的感兴趣标记包括放射性同位素，产生可检测产物的酶(例如，辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶等)，荧光蛋白，顺磁原子等。在某些方面，CNTFR配体结合剂与可检测标记的特异性结合配偶体缀合(例如，与生物素缀合，使得可通过包含抗生物素蛋白/链霉抗生物素蛋白的可检测标记进行检测)。
根据某些实施方案，所述试剂是可用于体内成像的标记试剂，例如近红外(NIR)光学成像，单光子发射计算机断层扫描(SPECT)/CT成像，正电子发射断层扫描(PET)，核磁共振(NMR)光谱学等。可用于此类应用的标记试剂包括但不限于荧光标记、放射性同位素等。在某些方面，标记试剂是多模式体内成像剂，其允许使用两种或更多种成像方法进行体内成像(例如，参见Thorp-Greenwood和Coogan(2011)Dalton Trans.40：6129-6143)。
在某些方面，标记试剂是体内成像剂，其可用于近红外(NIR)成像应用，该试剂选自Kodak X-SIGHT染料，Pz 247，DyLight 750和800Fluors，Cy 5.5和7Fluors，Alexa Fluor680和750染料，IRDye 680和800CW Fluors。根据某些实施方案，标记试剂是可用于SPECT成像应用的体内成像剂，该试剂选自99mTc、111In、123In、201Tl和133Xe。在某些方面，标记试剂是体内成像剂，其可用于正电子发射断层扫描(PET)成像应用，该试剂选自11C、13N、15O、18F、64Cu、62Cu、124I、76Br、82Rb和68Ga。
可用于本发明的缀合物的接头包括酯接头、酰胺接头、马来酰亚胺或马来酰亚胺基接头；缬氨酸-瓜氨酸接头；腙接头；N-琥珀酰亚胺基-4-(2-吡啶基二硫基)丁酸酯(SPDB)接头；琥珀酰亚胺基-4-(N-马来酰亚胺基甲基)环己烷-1-甲酸酯(SMCC)接头；乙烯基砜基接头；包括聚乙二醇(PEG)的接头，例如但不限于四甘醇；包括丙酸的接头；包括癸烯酸的接头，和包括其任何组合的接头。
许多策略可用于通过接头将CNTFR配体结合剂与目标部分连接。例如，可以通过将接头共价连接至药物来衍生目标部分，其中接头具有能够与CNTFR配体结合剂上的“化学柄”反应的官能团。接头上的官能团可以变化，并且可以基于与CNTFR配体结合剂上的化学柄的相容性来选择。根据一个实施方案，通过将具有化学柄的非天然氨基酸掺入CNTFR配体结合剂中来提供CNTFR配体结合剂上的化学柄。这种非天然氨基酸可以通过化学合成或重组方法掺入CNTFR配体结合剂中(例如，使用合适的正交氨基酰基tRNA合成酶-tRNA对在宿主细胞翻译期间掺入非天然氨基酸)。
存在于CNTFR配体结合剂中的非天然氨基酸的官能团可以是叠氮化物、炔烃、烯烃、氨基氧基、肼、醛、硝酮、氧化腈、环丙烯、降冰片烯、异氰化物、芳基卤化物、硼酸或其它合适的官能团，并选择接头上的官能团与非天然氨基酸的官能团反应(或反之亦然)。
组合物
还提供了包含本公开的CNTFR配体结合剂的组合物。组合物可包括本文所述的任何CNTFR配体结合剂，包括本文所述的任何可溶性CNTFR多肽和抗体。
在某些方面，组合物包含存在于液体介质中的本公开的CNTFR配体结合剂。液体介质可以是水性液体介质，例如水、缓冲溶液等。一种或多种添加剂，例如盐(例如NaCl、MgCl2、KCl、MgSO4)、缓冲剂(Tris缓冲剂、N-(2-羟乙基)哌嗪-N'-(2-乙磺酸)(HEPES)、2-(N-吗啉代)乙磺酸(MES)、2-(N-吗啉代)乙磺酸钠盐(MES)、3-(N-吗啉代)丙磺酸(MOPS)、N-三[羟基甲基]甲基-3-氨基丙磺酸(TAPS)等)、蛋白酶抑制剂、甘油等可以存在于这种组合物中。
还提供了药物组合物。药物组合物包括本公开的任何CNTFR配体结合剂(例如，任何可溶性CNTFR多肽和本公开的抗体)和药学上可接受的载体。药物组合物通常包含治疗有效量的CNTFR配体结合剂。“治疗有效量”是指足以产生所需结果的剂量，例如足以实现有益或所需治疗(包括预防)结果的量，例如具有与CNTFR信号相关细胞增殖性疾病的个体中细胞增殖的减少。
本公开的CNTFR配体结合剂可以掺入各种用于治疗性施用的制剂中。更特别地，CNTFR配体结合剂可以通过与适当的药学上可接受的赋形剂或稀释剂组合配制成药物组合物，并且可以配制成固体、半固体、液体或气体形式的制剂，例如片剂、胶囊剂、粉剂、颗粒剂、软膏、溶液剂、注射剂、吸入剂和喷雾剂。
适于施用个体(例如，适合于人类施用)的本发明的CNTFR配体结合剂的制剂通常是无菌的，并且可以进一步不含可检测的热原或根据选择的施用途径忌用于个体的其它污染物。
在药物剂型中，CNTFR配体结合剂可以单独给药或以适当的组合给药，以及与其他药学活性化合物组合给药。以下方法和载体/赋形剂仅仅是实例，决不是限制性的。
对于口服制剂，CNTFR配体结合剂可单独使用或与适当的添加剂组合使用，以制备片剂、粉剂、颗粒剂或胶囊剂，例如，与常规添加剂，如乳糖、甘露醇、玉米淀粉或马铃薯淀粉；与粘合剂，如结晶纤维素、纤维素衍生物、阿拉伯树胶、玉米淀粉或明胶；与崩解剂，如玉米淀粉、马铃薯淀粉或羧甲基纤维素钠；与润滑剂，如滑石或硬脂酸镁；并且如果需要，与稀释剂、缓冲剂、润湿剂、防腐剂和调味剂组合使用。
通过将其溶解、悬浮或乳化在水性或非水性溶剂中，例如植物油或其它类似油、合成脂肪酸甘油酯、高级脂肪酸酯或丙二醇，可将CNTFR配体结合剂配制成注射用制剂；并且如果需要，可使用常规添加剂如增溶剂、等渗剂、悬浮剂、乳化剂、稳定剂和防腐剂。
药物组合物可以是液体形式、冻干形式或从冻干形式重构的液体形式，其中冻干制剂在施用前用无菌溶液重构。重构冻干组合物的标准方法是加回一定体积的纯水(通常相当于冻干过程中除去的体积)；然而，包含抗菌剂的溶液可用于产生用于肠胃外施用的药物组合物。
CNTFR配体结合剂的水性制剂可以在pH缓冲溶液中制备，例如，pH范围为约4.0至约7.0，或约5.0至约6.0，或者约5.5。适合于该范围内的pH的缓冲剂的实例包括磷酸盐-、组氨酸-、柠檬酸盐-、琥珀酸-、乙酸盐-缓冲剂和其它有机酸缓冲剂。缓冲剂浓度可为约1mM至约100mM，或约5mM至约50mM，这取决于例如缓冲剂和制剂的所需张力。
使用方法
还提供了使用本公开的CNTFR配体结合剂和组合物的方法。根据某些实施方案，提供了包括施用治疗有效量的CNTFR配体结合剂或本公开的药物组合物给予有此需要的个体的方法，其中所述试剂与所述配体结合抑制配体与CNTFR的结合。在某些方面，有此需要的个体患有与CNTFR信号传导相关的细胞增殖性疾病，并且该给药有效治疗细胞增殖性疾病。在某些方面，细胞增殖性疾病是癌症。
例如，在一些实施方案中，CNTFR配体结合剂或本公开的药物组合物当CNTFR配体结合剂或药物组合物以有效量给药时抑制在宿主中癌症细胞的生长、转移和/或侵袭。“癌细胞”是指表现出肿瘤细胞表型的细胞，其特征可以是例如异常细胞生长、异常细胞增殖、密度依赖性生长抑制丧失、非贴壁依赖性生长潜力、促进免疫受损的非人动物模型中的肿瘤生长和/或发育的能力，和/或任何适当的细胞转化指标中的一种或多种。“癌细胞”在本文中可与“肿瘤细胞”、“恶性细胞”或“癌性细胞”互换使用，并且包括实体瘤、半实体瘤、原发性肿瘤、转移性肿瘤等的癌细胞。
可以使用本公开的方法治疗的癌症包括但不限于实体瘤，肺癌(例如，非小细胞肺癌(NSCLC)，乳腺癌，前列腺癌，胰腺癌，结肠直肠癌，肾细胞癌，霍奇金淋巴瘤，非霍奇金淋巴瘤，间变性大细胞淋巴瘤，急性髓性白血病，多发性骨髓瘤和可使用本公开的CNTFR配体结合剂或药物组合物治疗的任何其他类型的癌症。
所述CNTFR配体结合剂可以单独给予(例如，在单一疗法中)或与一种或多种另外的治疗剂组合(例如，在组合治疗中)。
在一些实施方案中，有效量的CNTFR配体结合剂(或包括它们的药物组合物)是这样的量，当以一剂或多剂单独给予(例如在单一疗法中)或与一种或多种其他治疗剂组合(例如在组合治疗中)施用时，相比于在不存在用CNTFR配体结合剂或药物组合物治疗的个体的症状，可有效地将个体中细胞增殖性病症(例如癌症)的症状减少至少约5％，至少约10％，至少约15％，至少约20％，至少约25％，至少约30％，至少约40％，至少约50％，至少约60％，至少约70％，至少约80％，至少约90％或更多。
在某些方面，当CNTFR配体结合剂或药物组合物以有效量施用时，本公开方法抑制个体中癌细胞的生长、转移和/或侵袭。
所述CNTFR配体结合剂或药物组合物可使用任何可用的方法和适合于药物递送的途径，包括体内和离体方法，以及给药的全身性和局部途径施用给个体。常规和药学上可接受的施用途径包括鼻内、肌内、气管内、皮下、皮内、局部应用、眼、静脉内、动脉内、鼻、口服和其它肠和肠胃外施用途径。如果需要，可以组合施用途径，或根据CNTFR配体结合剂和/或所需效果调节施用途径。所述CNTFR配体结合剂或药物组合物可以以单剂量或以多剂量施用。在一些实施方案中，CNTFR配体结合剂或药物组合物静脉内给药。在一些实施方案中，通过注射例如用于全身递送(例如，静脉内输注)或注射至局部部位来施用CNTFR配体结合剂。
根据主题方法可治疗各种个体。通常这种对象是“哺乳动物”或“哺乳类动物”，其中这些术语广泛用于描述哺乳纲内的生物体，包括食肉目(例如狗和猫)，啮齿目(例如小鼠、豚鼠和大鼠)和灵长目(例如人、黑猩猩和猴)。在一些实施方案中，个体将是人。
“治疗”是指至少缓解与个体的细胞增生性病症(例如癌症)相关的症状，其中缓解在广义上用于指至少减少与正在被治疗的细胞增生性病症相关的参数例如症状的大小。因此，治疗还包括细胞增生性病症或至少与其相关的症状被完全抑制(例如防止发生)或停止(例如终止)的状况，使得个体不再患有细胞增生性病症，或至少不再患有表征细胞增生性病症的症状。
给药取决于待治疗的疾病状态的严重性和反应性。可以根据患者体内的药物累积的测量来计算最佳给药方案。施用医师可以确定最佳剂量、给药方法和重复率。最佳剂量可以根据单独CNTFR配体结合剂的相对效力而变化，并且通常可以基于发现在体外和体内动物模型等中有效的EC50来估计。通常，剂量为0.01μg至100g/kg体重，并且可以每天、每周、每月或每年给予一次或多次。治疗医师可以基于测量的停留时间和体液或组织中药物的浓度来估计给药的重复率。成功治疗后，可能需要让受试者经受维持疗法以预防疾病状态的复发，其中CNTFR配体结合剂或药物组合物以维持剂量，范围从0.01μg至100g/kg体重，每日一次或多次，至每几个月一次，每六个月一次，每年一次，或以任何其它合适的频率施用。
本发明的治疗方法可包括施用单一类型的CNTFR配体结合剂给受试者，或者可以包括通过施用不同CNTFR配体结合剂的混合物施用两种或更多种类型的CNTFR配体结合剂给受试者，其中CNTFR配体结合剂被工程改造以结合例如不同的CNTFR配体。
在一些实施方案中，所述方法包括在施用“CNTFR配体结合剂”或“药物组合物”之前，将所述个体鉴定为患有与CNTFR信号传导相关的细胞增殖性疾病。将个体鉴定为具有与CNTFR信号传导相关的细胞增殖性疾病可以使用多种方法及其组合进行。在某些方面，鉴定基于从个体获得的样品中的CNTFR配体丰度。CNTFR配体可以是CNTF、CLCF1、NP等中的一种或多种，以及它们的任何组合。在某些方面，样品包括癌症相关成纤维细胞(CAF，例如正常肺成纤维细胞(NLF))，并且鉴定个体具有与CNTFR信号传导相关的细胞增殖性病症是基于CAF中CLCF1表达的水平。在一些实施方案中，使用可溶性CNTFR多肽作为CNTFR配体捕获剂(例如，本公开的任何可溶性CNTFR多肽)来定量CNTFR配体丰度。例如，用作CNTFR配体捕获剂的可溶性CNTFR多肽可以是本文所述的任何可溶性CNTFR多肽。
根据某些实施方案，鉴定是基于从个体获得的样品中CNTFR丰度和/或CNTFR-gp130-LIFR三联受体复合物的丰度。在某些方面，鉴定基于从个体获得的样品中CNTFR信号传导的水平。CNTFR信号传导的水平可以基于一种或多种CNTFR信号传导途径分子的磷酸化状态。例如，本发明人已经确定CNTFR与CLCF1的结合导致Jak-STAT和Ras-Raf-MEK-ERK信号传导途径的激活。因此，可以评估Jak、STAT、Ras、Raf、MEK、ERK或其任何组合中的任何一种的丰度、活性、磷酸化状态等，以确定个体中的异常CNTFR信号传导。
鉴定可以基于使用任何合适方法定量的配体、CNTFR分子、CNTFR-gp130-LIFR三联受体复合物等。根据某些实施方案，鉴定基于免疫测定。可获得多种合适的免疫测定形式，包括ELISA、流式细胞术测定、组织切片样品上的免疫组织化学、组织切片样品上的免疫荧光、蛋白质印迹分析和/或类似物。
在一些实施方案中，鉴定基于核酸测序。例如，对应于编码目的蛋白质的mRNA的测序读数的数量可用于确定蛋白质的表达水平。在某些方面，使用下一代测序系统进行测序，例如在提供的测序平台上(例如，HiSeqTM、MiSeqTM和/或Genome AnalyzerTM测序系统)；Ion TorrentTM(例如，Ion PGMTM和/或Ion ProtonTM测序系统)；PacificBiosciences(太平洋生物科学)(例如，PACBIO RS II测序系统)；Life TechnologiesTM(例如，SOLiD测序系统)；Roche(例如，454GS FLX+和/或GS Junior测序系统)；或感兴趣的任何其它测序平台。用于从组织或流体样品中分离核酸的方案，以及用于制备具有适合于所需测序平台的测序衔接子的测序文库的方案是容易获得的。
在一些实施方案中，包括将个体鉴定为具有与CNTFR信号传导相关的细胞增殖性病症的方法还包括从个体获得样品。
还提供了包括将个体鉴定为患有与CNTFR信号传导相关的细胞增殖性疾病的方法。将个体鉴定为具有与CNTFR信号传导相关的细胞增殖性疾病可以使用多种方法及其组合进行。在某些方面，鉴定基于从个体获得的样品中的CNTFR配体丰度。CNTFR配体可以是CNTF、CLCF1、NP等中的一种或多种，以及它们的任何组合。在某些方面，样品包括癌症相关成纤维细胞(CAF，例如正常肺成纤维细胞(NLF))，并且鉴定个体具有与CNTFR信号传导相关的细胞增殖性病症是基于CAF中CLCF1表达的水平。在一些实施方案中，使用可溶性CNTFR多肽作为CNTFR配体捕获剂(例如，本公开的任何可溶性CNTFR多肽)来定量CNTFR配体丰度。例如，用作CNTFR配体捕获剂的可溶性CNTFR多肽可以是本文所述的任何可溶性CNTFR多肽。根据某些实施方案，鉴定是基于从个体获得的样品中CNTFR丰度和/或CNTFR-gp130-LIFR三联受体复合物的丰度。在某些方面，鉴定基于从个体获得的样品中CNTFR信号传导的水平。CNTFR信号传导的水平可以基于一种或多种CNTFR信号传导途径分子的磷酸化状态。例如，本发明人已经确定CNTFR与CLCF1的结合导致Jak-STAT和Ras-Raf-MEK-ERK信号传导途径的激活。因此，可以评估Jak、STAT、Ras、Raf、MEK、ERK或其任何组合中的任何一种的丰度、活性、磷酸化状态等，以确定个体中的异常CNTFR信号传导。鉴定可以基于使用任何合适方法定量的配体、CNTFR分子、CNTFR-gp130-LIFR三联受体复合物等，使用任何合适的方法定量，例如通过免疫测定、核酸测序等。在一些实施方案中，该方法还包括从个体获得样品。
从个体获得的样品可以是适于确定个体是否患有与CNTFR信号传导相关的细胞增殖性疾病的任何样品。在某些方面，样品是流体样品，例如全血、血清、血浆等。在一些实施方案中，样品是组织样品。感兴趣的组织样品包括但不限于肿瘤活组织检查样品等。
试剂盒
本公开还提供了试剂盒。根据某些实施方案，所述试剂盒包括治疗有效量的任何本文所述的CNTFR配体结合剂，或本文所述任何药物组合物，和用于施用CNTFR配体结合剂或药物组合物至有此需要的个体(例如，鉴定为具有与CNTFR信号传导相关的细胞增殖性疾病的个体)的说明书。在某些方面，所述试剂盒包括本发明的CNTFR配体结合剂或药物组合物，其存在于容器中。容器可以是管、小瓶等。根据某些实施方案，所述试剂盒包括存在于一个或多个单位剂量中的CNTFR配体-结合剂或药物组合物，如1个、2个或更多、3个或更多、4个或更多、5个或更多等单位剂量。
试剂盒的组分可以存在于单独的容器中，或者多个组分可以存在于单一容器中。
施用CNTFR配体结合剂或药物组合物至个体的说明书可以记录在合适的记录介质上。例如，说明可以印刷在基材上，例如纸或塑料等。因此，说明可以作为包装说明书存在于试剂盒中，存在于试剂盒或其组件(即，与包装或分包装相关)的容器的标签中。在其它实施例中，说明作为存在于合适的计算机可读存储介质上的电子存储数据文件存在，所述计算机可读存储介质为例如便携式闪存驱动器、DVD、CD-ROM、软盘等。在又其它实施例中，实际说明不存在于试剂盒中，而是提供了例如通过互联网从远程源获得说明的方法。该实施例的实例是包括网址的试剂盒，其中可以查看说明和/或可以从其下载说明。与说明一样，用于获得说明的方法记录在合适的基板上。
在一些实施方案中，提供了包含CNTFR配体捕获剂的试剂盒和使用捕获剂定量生物样品中存在的CNTFR配体丰度的说明书。CNTFR配体可以是CNTF、CLCF1、NP等中的一种或多种，以及它们的任何组合。在一些实施方案中，使用可溶性CNTFR多肽作为CNTFR配体捕获剂(例如，本公开的任何可溶性CNTFR多肽)来定量CNTFR配体丰度。例如，用作CNTFR配体捕获剂的可溶性CNTFR多肽可以是本文所述的任何可溶性CNTFR多肽。
提供以下实施例是作为说明而不是作为限制。
试验
引言
上皮细胞与其下层基质之间的通讯是生物体生物学中一个重要但知之甚少的方面。如果异常调节，这些相互作用可证明是致瘤的。尽管已知癌症相关成纤维细胞(CAF)促进和维持肿瘤的生长，但其潜在机制仍未完全了解。本发明人已经鉴定了一种新的通讯机制，其中CAF分泌心肌营养素样细胞因子1(CLCF1)，一种在肿瘤细胞上结合睫状神经营养因子受体(CNTFR)并促进肿瘤生长的细胞因子。
假设可溶性CNTFR多肽可用作减少CNTFR信号传导的治疗剂，并且与野生型CNTFR相比，对CLCF1具有更高结合亲和力的可溶性CNTFR多肽是理想的。为了改造对CLCF1具有更高结合亲和力的可溶性CNTFR多肽，通过易错PCR将突变随机引入CNTFR。得到的文库在酵母细胞表面上显示为融合蛋白(在图4中图A示意性地示出)，其中子集保持与CLCF1的结合。
实施例1-功能性CLCF1的重组表达
将CLCF1克隆到细菌表达质粒pET28b中并转化到Rosetta-gami 2(DE)3细胞中。表达时，重组CLCF1在包涵体中积累，其在含有5mM DTT的60％ddH2O、40％乙腈、0.1％TFA中溶解。反相高效液相色谱用于纯化CLCF1。用CLCF1处理人非小细胞肺癌细胞系A549在几分钟内在Tyr705诱导STAT3的磷酸化(图2，图A)。还在另外两种细胞系H23和H358中检测到STAT3的活化(图2，图B)。这些结果表明CLCF1引发STAT3中Tyr705磷酸化的增加。
实施例2-重组CLCF1增加细胞存活
已显示细胞因子介导的STAT3活化可保护细胞免于凋亡。为了测试CLCF1是否也可以增加细胞存活，在血清饥饿24小时后用CLCF1处理A549细胞。培养72小时后，显示CLCF1以浓度依赖性方式增加细胞存活(图3，图A)。当在H23细胞上测试时，更高的CLCF1浓度导致存活增加(图3，图B)。当血清包括在测定中时未观察到CLCF1治疗的这种作用，表明该效应在应激物诱导的病症如血清饥饿中更明显。
实施例3-酵母展示的CNTFR与重组表达的CLCF1结合
将CNTFR的细胞外结构域克隆到酵母表面展示质粒pCTCON2中，并转化到酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)菌株EBY 100中。该质粒能够通过与酵母凝集素蛋白Aga2p的遗传连锁在酵母细胞表面上表达CNTFR(图4，图A)。CNTFR侧翼为N-末端血凝素(HA)和C-末端c-Myc标签，其允许通过抗体标记和流式细胞术检测来检测全长蛋白质。诱导酵母表现出50％的表达百分比，并且当与20nM CLCF一起温育时，表达群体主要结合重组表达的CLCF1，如通过使用二抗的流式细胞术测量的(图4，图B)。
实施例4-酵母展示的CNTFR与CLCF1、gp130和LIFR形成三联受体复合物
如前所述，CNTFR-CLCF1复合物与gp130和LIFR结合形成三联受体复合物。因此，当与CLCF1孵育时，预期完全功能的CNTFR与两个β亚基结合。为了制备LIFR和gp130的可溶性构建体，将细胞外结构域克隆到哺乳动物表达质粒Add2中并转染到人胚肾(HEK)293悬浮细胞中。将构建体制备为His-标签和小鼠IgG2a融合物以促进纯化。使用镍亲和层析纯化His-标记的构建体，并使用蛋白A亲和层析纯化Fc-融合构建体。当酵母展示的CNTFR与LIFR-Fc一起温育时，未检测到结合信号，这是预期的，因为没有CLCF1，CNTFR不与β受体结合以激活下游信号传导途径(图5，图A和B)。然而，在添加CLCF1后，LIFR-Fc结合信号传导增加，表明在CLCF1存在下，CNTFR确实与LIFR相互作用(图5，图C)。当酵母展示的CNTFR与CLCF1和gp130一起温育时，LIFR-Fc结合信号甚至更高，表明gp130进一步有助于LIFR和CNTFR之间的结合(图5，图D和E)。
先前的几项研究表明，CNTFR与β受体的相互作用可能以特定的顺序发生。例如，已经提出CNTF首先结合CNTFR，然后募集gp130，最后与LIFR复合。上述实验表明，只要CLCF1首先结合，CNTFR与LIFR的结合可以在不存在gp130时发生。另外，没有CLCF1，gp130-Fc显示与酵母展示的CNTFR没有可检测的结合(图6，图A和B)。加入CLCF1后，gp130-Fc信号显著增加，表明gp130可以在没有LIFR的情况下与CNTFR结合(图6，图C)。当添加LIFR时，gp130结合信号略微增加。总之，图6中显示的一组结合实验表明LIFR和gp130与CNTFR-CLCF1之间存在协同或附加的结合(图6，图D和E)。
实施例5-使用酵母表面展示将CNTFR亲和力成熟为CLCF1
设计了蛋白质工程策略，其中使用易错PCR将突变随机引入CNTFR的细胞外结构域(20-342)。如前所述，所得文库具有约1×108个转化体的估计多样性，在酵母细胞表面上显示为融合蛋白。使用平衡结合条件并通过流式细胞术分选(FACS)筛选，使文库富集显示增加的CLCF1结合的变体，针对给定量的c-Myc表达标准化。通过在每个连续轮次的分选中降低与文库一起温育的CLCF1的浓度来赋予筛选严格性。在使用FACS进行3轮筛选后，观察到具有不同水平的CLCF1结合信号的三个酵母群。共有突变出现在两个最高CLCF1结合群体中：在中间亲和群体中观察到T174P，而在最高亲和力群体中观察到S237F(图7和图8)。
实施例6-筛选改组的CNTFR文库以鉴定高亲和力CLCF1变体
尽管富集的共有突变，分选的文库仍然包含大量的多样性。为了测试在两个较高结合群体中发现的突变的累加效应，使用交错延伸过程(StEP)方法对克隆进行改组。为了增加该文库的严格性，使用平衡结合和动态解离速率筛选的组合。在3轮筛选后，出现了四种突变(R110Q、T174P、S237F和I287F)的组合(图9)。定性酵母展示的结合研究表明这些突变中的每一个都有助于对CLCF1的结合亲和力，因此选择含有所有四种突变的克隆(变体4)用于进一步的实验(图10，图A和B)。有趣的是，虽然酵母展示了与CNTF结合的野生型CNTFR，但变体4不与CNTF结合，表明定向进化过程导致对CLCF1的特异性增加(图10，图C)。除了hCLCF1之外，变体4仍然与mCLCF1结合(图10，图D)。
实施例7-亲和力成熟的CNTFR的负筛选以降低与LIFR的结合
先前显示CNTFR氨基酸残基268和269处的丙氨酸取代降低了CNTFR与β受体的相互作用。当将T268A和D269A引入酵母细胞表面上展示的CNTFR时，我们发现这些突变降低了对gp130的结合，但仍然显著结合LIFR(图11)。因此，为了进一步改造CNTFR以降低其对LIFR的结合，使用易错PCR的另一随机突变引入图10图B的变体4中。结果文库再次在酵母上展示，但这次筛选了在CLCF1存在下LIFR结合信号降低的群体。为了保持对CLCF1的结合亲和力，通过在CLCF1结合的阳性选择和LIFR的阴性选择之间交替进行筛选(图12)。在六轮分选后，出现两个共有突变(Y177H和K178N)(图13，图A)。因为这些突变附加地有助于降低LIFR结合，所以选择具有两种突变的克隆(命名为eCNTFR)用于进一步表征。eCNTFR含有四个突变，这些突变赋予变体4高亲和力CLCF1结合，以及两个降低与LIFR结合的新突变。
实施例8-可溶性工程CNTFR的表征
将eCNTFR变体克隆到Add2哺乳动物表达载体中并转染到HEK293细胞中以产生与His-标签和小鼠IgG2a Fc融合的可溶性构建体。虽然野生型CNTFR(wtCNTFR)每升细胞培养物产生8毫克，但eCNTFR每升产生4毫克。为了测量可溶性CNTFR构建体的结合亲和力，首先将它们与CLCF1在室温下孵育4小时。然后使用涂有抗his抗体或抗小鼠Fc抗体的微量滴定板捕获复合物。使用兔抗CLCF1一抗，然后使用HRP标记的抗兔二抗，能够测量CLCF1和可溶性CNTFR之间的结合相互作用。His标记的和Fc融合的eCNTFR均显示出对CLCF1的皮摩尔结合亲和力(图14，图B)。相比之下，CLCF1结合亲和力太弱而不能量化wtCNTFR。使用相同的方法来表征与β受体的结合相互作用。在这些实验中，与结合两种受体的wtCNTFR不同，eCNTFR-His和eCNTFR-Fc对gp130和LIFR没有显示出可检测的结合信号(图13，图B)。这些结果与从酵母展示的构建体观察到的结果一致。因为增加小蛋白质的大小以避免肾小球滤过可以显著增加血清半衰期，我们选择与小鼠IgG2a Fc结构域融合的eCNTFR-Fc，用于评估CLCF1抑制的下游效应。该Fc融合体也将受益于FcRn介导的再循环，用于体内半衰期延长。
实施例可溶性CNTFR多肽-Fc融合体(“eCNTFR-Fc”-SEQ ID NO：4)的氨基酸序列列于下表4中。在该实施例中，SEQ ID NO：2的可溶性CNTFR多肽与全长小鼠Fc区融合(在表4中加下划线)。
表4：实施例可溶性CNTFR多肽-Fc融合的氨基酸序列
实施例9-eCNTFR-Fc抑制人NSCLC细胞中的STAT3活化
为了确定eCNTFR-Fc是否能有效中和CLCF1并抑制STAT3磷酸化，我们测试了其对两种人NSCLC细胞系A549和H23的作用。在存在和不存在可溶性CNTFR构建体的情况下，用CLCF1刺激细胞。引人注目的是，wtCNTFR-Fc增加了STAT3(Tyr705)的磷酸化，而用eCNTFR-Fc处理有效地降低了STAT3磷酸化(图15，图A)。此外，与eCNTFR-Fc一起温育在A549和H23细胞中的血清饥饿条件下抑制CLCF1介导的细胞存活(分别为图15，图B和C)。
实施例10-eCNTFR-Fc降低小鼠异种移植模型中的肿瘤生长
接下来，我们测试了eCNTFR-Fc是否保留其螯合CLCF1并减少体内肿瘤生长的能力。给予非荷瘤小鼠1mg/kg体重的单剂量eCNTFR-Fc，并使用eCNTFR-Fc作为捕获剂，用ELISA测量不同时间点血清中未结合的CLCF1的量。收集血清样品并在注射后6、12、24、36和48小时进行分析。通过注射的eCNTFR-Fc快速隔离血清CLCF1，但在48小时后，CLCF1水平接近未处理的基线(图16，图A)。从注射后6小时开始，测量的eCNTFR-Fc水平降低，估计的半衰期为约48小时，其与血清CLCF1的螯合相关。
为了测试eCNTFR-Fc是否可以影响体内肿瘤生长，用eCNTFR-Fc处理两种不同的非小细胞肺癌模型。在第一个模型中，将A549细胞皮下注射并在每只小鼠的两个相对侧面上生长。在肿瘤大小增加至约100mm3后，给小鼠注射10mg/kg或1mg/kg体重或盐水对照，每周两次，持续4周。与盐水对照相比，用两种浓度的eCNTFR-Fc处理显著降低了治疗17天后的肿瘤生长(图16，图B和C)。
使用具有H23细胞的异种移植模型以类似方式进行另一个实验。这次，将10mg/kg的eCNTFR-Fc处理与wtCNTFR-Fc处理和盐水对照进行比较，并且注射频率每周增加至三次，持续39天。观察到类似的结果，其中eCNTFR-Fc在研究结束时显著降低肿瘤体积，而wtCNTFR-Fc似乎略微增加肿瘤大小，尽管这些结果在统计学上是不显著的(图17)。
实施例11-工程化CLCF1捕获剂(eCNTFR)的特异性
CNTF(睫状神经营养因子)是CNTFR的另一种配体，其与CLCF1共有CNTFR的配体结合基序。由于CNTF介导的信号传导对于神经元细胞存活是重要的并且可能具有由损伤诱导的细胞保护作用，因此eCNTFR-Fc对CLCF1的结合亲和力优于CNTF可有利于防止抑制CNTF的副作用。当使用ELISA测量eCNTFR-Fc对重组产生的CNTF的结合亲和力时，虽然wtCNTFR-Fc显示出对CNTF的实质性结合，但eCNTFR-Fc在测试浓度下丧失了对CNTF的亲和力。另一方面，eCNTFR-Fc对小鼠CLCF1(mCLCF1)显示出高亲和力，这对于体内小鼠模型实验可能是关键的，因为小鼠CLCF1可以磷酸化人细胞中的STAT3。数据显示在图18图A中。
为了确定eCNTFR-Fc是否能够有效中和CLCF1并抑制STAT3磷酸化，在两种人NSCLC细胞系：A549和H23上测试其效果。在存在和不存在可溶性CNTFR构建体的情况下，用CLCF1刺激细胞。虽然wtCNTFR-Fc增加STAT3(Tyr705)的磷酸化，但eCNTFR-Fc有效地降低了两种细胞系中的磷酸化。数据显示在图18图B中。
实施例12-CLCF1隔离和eCNTFR-Fc清除的药代动力学
为了测试eCNTFR-Fc是否保留其在体内隔离CLCF1的能力，定量在NOD/SCID/γ小鼠中腹膜内(i.p.)给予10mg/kg eCNTFR-Fc后的血液清除率和CLCF1隔离。注射后收集血清样品，并使用eCNTFR-Fc作为捕获剂，通过ELISA测量未结合的CLCF1(正方形)。载体处理的小鼠用于确定基线CLCF1水平。使用抗Fc抗体作为捕获剂，通过ELISA定量血液中的eCNTFR-Fc水平(圆圈)。通过注射的eCNTFR-Fc快速隔离血清CLCF1，然而，在72小时，CLCF1水平接近未治疗的基线。(图19，图A)。这些数据表明eCNTFR-Fc有效地结合小鼠CLCF1并且表明在小鼠中应该观察到体内任何显著的毒性。
实施例13-eCNTFR-Fc抑制体内肿瘤生长
为了测试体内eCNTFR的药理学功效，将NSCLC细胞系植入免疫缺陷小鼠中。使原发性肿瘤生长至约100-150mm3的大小。最初，将小鼠随机分为四组：载体(PBS)、野生型CNTFR(wtCNTFR-Fc)、低剂量(1mg/kg)eCNTFR-Fc和高剂量(10mg/kg)eCNTFR-Fc(图21，图B)。通过腹膜内(i.p.)注射每周两次注射小鼠18天。eCNTFR-Fc的施用证实了剂量依赖性肿瘤抑制(图19，图B-D)。在第二个NSCLC细胞系中观察到可比较的作用。
越来越多的证据表明，PDTX忠实地概括了人类肿瘤生物学并预测了对治疗的反应。已知通过从人类手术切除的肿瘤直接植入小鼠获得的PDTX维持形态学相似性并重现原始肿瘤的分子谱。因此，为了验证我们在临床相关环境中的发现，我们生成NSCLC PDTX模型以测试eCNTFR-Fc。一个LUAD PDTX模型显示出通过腹膜内注射每周三次持续三周的eCNTFR-Fc处理后显著的肿瘤生长抑制或直到对照(PBS)小鼠显示出发病迹象(图19，图E-H)。
在每个异种移植模型中，分别通过PH3和CC3免疫染色测定响应于eCNTFR的增殖和凋亡。在用eCNTFR-Fc处理后观察到增殖的显著降低和细胞凋亡的增加(图19，图I)。在图I的左下和右下方条形图中，从左到右提供PBS、WT CNTFR、eCNTFR(1mg/kg)和eCNTFR(10mg/kg)的结果。总之，这些结果表明使用eCNTFR可以有效地实现肿瘤细胞中CLCF1诱导的信号传导的破坏。
实施例15-CLCF1和CNTFR在肺癌中的表达
虽然癌相关成纤维细胞(CAF)表达CLCF1并且可能是体内该细胞因子的来源，但本研究确定NSCLC细胞系也分泌CLCF1，表明该细胞因子存在旁分泌和自分泌信号传导机制(图20，图A)。还确定CLCF1的受体CNTFR在所有NSCLC细胞系和测试的患者衍生的异种移植物(PDTX)模型上表达(图20，图B和C)。在PDTX模型中和在KrasG12D；P53f/f基因工程小鼠模型中产生的肿瘤中也通过免疫组织化学观察CNTFR的表达(图20，图D)。总之，这些结果表明CLCF1-CNTFR信号传导轴在肺腺癌中具有活性，并且它可能在肿瘤发生中起作用，特别是在由致癌Kras驱动的肿瘤中。
虽然附上了权利要求，但是本公开也由下述条款限定：
1.一种药物组合物，其包括：
特异性结合睫状神经营养因子受体(CNTFR)配体的药剂；和
药学上可接受的载体。
2.条款1所述的药物组合物，其中所述特异性结合CNTFR配体的药剂特异性结合选自下组的配体：睫状神经营养因子(CNTF)、心肌营养素样细胞因子1(CLCF1)、神经蛋白(NP)及其任意组合。
3.条款1或条款2所述的药物组合物，其中所述特异性结合CNTFR配体的药剂是可溶性CNTFR多肽。
4.条款3所述的药物组合物，其中所述可溶性CNTFR多肽包含相对于野生型CNTFR多肽降低所述可溶性CNTFR多肽对配体-CNTFR复合物亚基的结合亲和力的突变。
5.条款4所述的药物组合物，其中所述配体-CNTFR复合物亚基是糖蛋白130(gp130)、白血病抑制因子受体(LIFR)或两者。
6.条款5所述的药物组合物，其中所述配体-CNTFR复合物亚基是LIFR。
7.条款6所述的药物组合物，其中相对于具有SEQ ID NO：1所示氨基酸序列的CNTFR多肽，降低对LIFR的结合亲和力的所述突变位于氨基酸位置177、178或两者。
8.条款5所述的药物组合物，其中所述配体-CNTFR复合物亚基是gp130。
9.条款8所述的药物组合物，其中相对于具有SEQ ID NO：1所示氨基酸序列的CNTFR多肽，降低对gp130的结合亲和力的所述突变位于氨基酸位置268、269或两者。
10.条款3-9中任一项所述的药物组合物，其中所述可溶性CNTFR多肽在将野生型CNTFR锚定至细胞膜的结构域中包含赋予溶解度的突变。
11.条款10所述的药物组合物，其中所述可溶性CNTFR多肽包含在将野生型CNTFR锚定至细胞膜的结构域中的截短。
12.条款10所述的药物组合物，其中所述可溶性CNTFR多肽缺乏将野生型CNTFR锚定至细胞膜的结构域。
13.条款3-12中任一项所述的药物组合物，其中所述可溶性CNTFR多肽包含相对于野生型CNTFR多肽增加所述可溶性CNTFR多肽对CNTFR配体的结合亲和力的突变。
14.条款13所述的药物组合物，其中所述CNTFR配体选自：睫状神经营养因子(CNTF)、心肌营养素样细胞因子1(CLCF1)、神经蛋白(NP)及其任意组合。
15.条款13所述的药物组合物，其中所述CNTFR配体是CLCF1。
16.条款15所述的药物组合物，其中相对于具有SEQ ID NO：1所示氨基酸序列的CNTFR多肽，增加对CLCF1的结合亲和力的所述突变位于氨基酸位置110、174、237、287或其任何组合。
17.条款1或条款2所述的药物组合物，其中所述药剂是抗体。
18.条款1-17中任一项所述的药物组合物，其中所述药剂是与异源多肽融合的多肽。
19.条款18所述的药物组合物，其中所述异源多肽是Fc结构域、白蛋白、转铁蛋白、XTEN、同型氨基酸聚合物、脯氨酸-丙氨酸-丝氨酸聚合物、弹性蛋白样肽或其任何组合。
20.条款19所述的药物组合物，其中所述异源多肽是Fc结构域。
21.条款20所述的药物组合物，其中所述Fc结构域是人Fc结构域。
22.条款1-21中任一项所述的药物组合物，其中所述药剂与部分缀合。
23.条款22所述的药物组合物，其中所述部分是聚乙二醇(PEG)、抗癌药物、可检测标记或其任何组合。
24.一种方法，其包括：
向有需要的个体施用治疗有效量的条款1-23中任一项所述的药物组合物或条款58-74中任一项所述的可溶性多肽CNTFR，其中所述药剂与所述配体的结合抑制了所述配体与CNTFR的结合。
25.根据条款24所述的方法，其中所述有此需要的个体患有与CNTFR信号传导相关的细胞增殖性疾病，并且所述施用有效治疗所述细胞增殖性疾病。
26.根据条款24或条款25所述的方法，还包括：在施用前，鉴定所述个体为具有与CNTFR信号传导相关的细胞增殖性病症。
27.根据条款26所述的方法，其中所述鉴定基于从所述个体获得的样品中的CNTFR配体丰度。
28.根据条款27所述的方法，其中所述丰度是选自下述的CNTFR配体的：CNTF、CLCF1、NP及其任何组合。
29.根据条款27或条款28所述的方法，其中使用可溶性CNTFR多肽作为CNTFR配体捕获剂来量化所述CNTFR配体丰度。
30.根据条款29所述的方法，其中用作配体CNTFR捕获剂的所述可溶性CNTFR多肽是条款58-74中任一项所述的可溶性CNTFR多肽。
31.根据条款26所述的方法，其中所述鉴定基于从所述个体获得的样品中的CNTFR丰度。
32.根据条款26所述的方法，其中所述鉴定基于从所述个体获得的样品中的CNTFR信号传导的水平。
33.根据条款32所述的方法，其中量化样品中的CNTFR信号传导包括量化一种或多种CNTFR信号传导途径分子的磷酸化状态。
34.根据条款27至33中任一项所述的方法，其中所述鉴定基于免疫测定。
35.根据条款27至33中任一项所述的方法，其中所述鉴定基于核酸测序。
36.根据条款27至35中任一项所述的方法，其中所述样品是组织样品。
37.根据条款27至35中任一项所述的方法，其中所述样品是流体样品。
38.根据条款27至37中任一项所述的方法，还包括从所述个体获得所述样品。
39.根据条款25至38中任一项所述的方法，其中所述细胞增殖性疾病是癌症。
40.根据条款39所述的方法，其中所述癌症是肺癌。
41.根据条款40所述的方法，其中所述肺癌是非小细胞肺癌(NSCLC)。
42.一种方法，其包括：
将个体鉴定为患有与CNTFR信号传导相关的细胞增殖性疾病。
43.根据条款42所述的方法，其中所述鉴定基于从所述个体获得的样品中的CNTFR配体丰度。
44.根据条款43所述的方法，其中所述丰度是选自下述的CNTFR配体的：CNTF、CLCF1、NP及其任何组合。
45.根据条款42或条款43所述的方法，其中使用可溶性CNTFR多肽作为CNTFR配体捕获剂来量化所述CNTFR配体丰度。
46.根据条款45所述的方法，其中用作配体CNTFR捕获剂的所述可溶性CNTFR多肽是条款58-74中任一项所述的可溶性CNTFR多肽。
47.根据条款42所述的方法，其中所述鉴定基于从所述个体获得的样品中的CNTFR丰度。
48.根据条款42所述的方法，其中所述鉴定基于从所述个体获得的样品中的CNTFR信号传导的水平。
49.根据条款48所述的方法，其中基于一种或多种CNTFR信号传导途径分子的磷酸化状态确定样品中CNTFR信号传导的水平。
50.根据条款42至49中任一项所述的方法，其中所述鉴定基于免疫测定。
51.根据条款42至49中任一项所述的方法，其中所述鉴定基于核酸测序。
52.根据条款42至51中任一项所述的方法，其中所述样品是组织样品。
53.根据条款42至51中任一项所述的方法，其中所述样品是流体样品。
54.根据条款43至53中任一项所述的方法，还包括从所述个体获得所述样品。
55.根据条款42至54中任一项所述的方法，其中所述细胞增殖性疾病是癌症。
56.根据条款55所述的方法，其中所述癌症是肺癌。
57.根据条款56所述的方法，其中所述肺癌是非小细胞肺癌(NSCLC)。
58.一种可溶性CNTFR多肽，其包括：
相对于野生型CNTFR多肽降低所述可溶性CNTFR多肽对配体-CNTFR复合物亚基的结合亲和力的突变，
相对于野生型CNTFR多肽增加所述可溶性CNTFR多肽对CNTFR配体的结合亲和力的突变，或
两者。
59.条款58所述的可溶性CNTFR多肽，其中所述可溶性CNTFR多肽包含相对于野生型CNTFR多肽降低所述可溶性CNTFR多肽对配体-CNTFR复合物亚基的结合亲和力的突变，并且其中所述配体-CNTFR复合物亚基是糖蛋白130(gp130)、白血病抑制因子受体(LIFR)或两者。
60.条款59所述的可溶性CNTFR多肽，其中所述配体-CNTFR复合物亚基是LIFR。
61.条款60所述的可溶性CNTFR多肽，其中相对于具有SEQ ID NO：1所示氨基酸序列的CNTFR多肽，降低对LIFR的结合亲和力的所述突变位于氨基酸位置177、178或两者。
62.条款59所述的可溶性CNTFR多肽，其中所述配体-CNTFR复合物亚基是gp130。
63.条款62所述的可溶性CNTFR多肽，其中相对于具有SEQ ID NO：1所示氨基酸序列的CNTFR多肽，降低对gp130的结合亲和力的所述突变位于氨基酸位置268、269或两者。
64.条款58-63中任一项所述的可溶性CNTFR多肽，其中所述可溶性CNTFR多肽在将野生型CNTFR锚定至细胞膜的结构域中包含赋予溶解度的突变。
65.条款64所述的可溶性CNTFR多肽，其中所述可溶性CNTFR多肽包含在将野生型CNTFR锚定至细胞膜的结构域中的截短。
66.条款64所述的可溶性CNTFR多肽，其中所述可溶性CNTFR多肽缺乏将野生型CNTFR锚定至细胞膜的结构域。
67.条款58-66中任一项所述的可溶性CNTFR多肽，其中所述可溶性CNTFR多肽包含相对于野生型CNTFR多肽增加所述可溶性CNTFR多肽对CNTFR配体的结合亲和力的突变。
68.条款67所述的可溶性CNTFR多肽，其中所述CNTFR配体选自：睫状神经营养因子(CNTF)、心肌营养素样细胞因子1(CLCF1)、神经蛋白(NP)及其任意组合。
69.条款67所述的可溶性CNTFR多肽，其中所述CNTFR配体是CLCF1。
70.条款69所述的可溶性CNTFR多肽，其中相对于具有SEQ ID NO：1所示氨基酸序列的CNTFR多肽，增加对CLCF1的结合亲和力的所述突变位于氨基酸位置110、174、237、287或其任何组合。
71.条款58-70中任一项所述的可溶性CNTFR多肽，其中所述可溶性CNTFR多肽与异源多肽融合。
72.条款71所述的可溶性CNTFR多肽，其中所述异源多肽是Fc结构域、白蛋白、转铁蛋白、XTEN、同型氨基酸聚合物、脯氨酸-丙氨酸-丝氨酸聚合物、弹性蛋白样肽或其任何组合。
73.条款71所述的可溶性CNTFR多肽，其中所述异源多肽是Fc结构域。
74.条款73所述的可溶性CNTFR多肽，其中所述Fc结构域是人Fc结构域。
75.一种核酸，其编码条款58-74中任一项所述的可溶性CNTFR多肽。
76.一种表达载体，其包含条款75所述的核酸。
77.一种宿主细胞，其包括条款58-70中任一项所述的可溶性CNTFR多肽、条款75所述的核酸、条款76所述的表达载体、或其任何组合。
78.根据条款77所述的宿主细胞，其中所述宿主细胞是原核细胞。
79.根据条款77所述的宿主细胞，其中所述宿主细胞是真核细胞。
80.根据条款79所述的宿主细胞，其中所述真核细胞是哺乳动物细胞。
81.根据条款80所述的宿主细胞，其中所述哺乳动物细胞是人体细胞。
82.一种核酸，其编码与细胞表面展示蛋白融合的CNTFR多肽。
83.条款82所述的核酸，其中所述CNTFR多肽包含相对于具有SEQ ID NO：1所示氨基酸序列的CNTFR多肽的一个或多个突变。
84.条款83所述的核酸，其中所述细胞表面展示蛋白选自：细菌表面展示蛋白、噬菌体展示蛋白和酵母展示蛋白。
85.条款84所述的核酸，其中所述细胞表面展示蛋白是酵母展示蛋白。
86.条款85所述的核酸，其中所述酵母展示蛋白是Aga2p。
87.一种表达载体，其包含条款82-86中任一项所述的核酸。
88.一种宿主细胞，其包括条款82-86中任一项所述的的核酸、或条款87所述的表达载体。
89.一种CNTFR多肽，其由条款82-86中任一项所述的的核酸或条款87所述的表达载体编码。
因此，前面仅说明了本公开的原理。应当理解，本领域技术人员将能够设计各种布置，所述布置虽然未在本文中明确描述或示出，但体现了本发明的原理并且包括在其精神和范围内。更进一步，本文叙述的所有实例和条件语言主要旨在帮助读者理解由发明人为将来的技术所贡献的本发明的原理和概念，并且应解释为但不限于这种具体叙述的实例和条件。而且，本文叙述本发明的原理、方面和实施例以及其具体实例的描述旨在涵盖结构和其功能等同方案两者。额外地，期望这种等同方案包含目前已知的等同方案和将来发展的等同方案，即，发展的执行相同功能的任何要素，无论结构如何。因此，本发明的范围不旨在限于示出的示例性实施例和本文所述的。相反，本发明的范围和精神由所附权利要求体现。
序列表
<110> 小利兰·斯坦福大学理事会
<120> 睫状神经营养因子受体配体结合剂及其使用方法
<130> STAN-1370WO
<150> US 62/430,757
<151> 2016-12-06
<150> US 62/481,027
<151> 2017-04-03
<160> 4
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 372
<212> PRT
<213> 智人
<400> 1
Met Ala Ala Pro Val Pro Trp Ala Cys Cys Ala Val Leu Ala Ala Ala
1 5 10 15
Ala Ala Val Val Tyr Ala Gln Arg His Ser Pro Gln Glu Ala Pro His
20 25 30
Val Gln Tyr Glu Arg Leu Gly Ser Asp Val Thr Leu Pro Cys Gly Thr
35 40 45
Ala Asn Trp Asp Ala Ala Val Thr Trp Arg Val Asn Gly Thr Asp Leu
50 55 60
Ala Pro Asp Leu Leu Asn Gly Ser Gln Leu Val Leu His Gly Leu Glu
65 70 75 80
Leu Gly His Ser Gly Leu Tyr Ala Cys Phe His Arg Asp Ser Trp His
85 90 95
Leu Arg His Gln Val Leu Leu His Val Gly Leu Pro Pro Arg Glu Pro
100 105 110
Val Leu Ser Cys Arg Ser Asn Thr Tyr Pro Lys Gly Phe Tyr Cys Ser
115 120 125
Trp His Leu Pro Thr Pro Thr Tyr Ile Pro Asn Thr Phe Asn Val Thr
130 135 140
Val Leu His Gly Ser Lys Ile Met Val Cys Glu Lys Asp Pro Ala Leu
145 150 155 160
Lys Asn Arg Cys His Ile Arg Tyr Met His Leu Phe Ser Thr Ile Lys
165 170 175
Tyr Lys Val Ser Ile Ser Val Ser Asn Ala Leu Gly His Asn Ala Thr
180 185 190
Ala Ile Thr Phe Asp Glu Phe Thr Ile Val Lys Pro Asp Pro Pro Glu
195 200 205
Asn Val Val Ala Arg Pro Val Pro Ser Asn Pro Arg Arg Leu Glu Val
210 215 220
Thr Trp Gln Thr Pro Ser Thr Trp Pro Asp Pro Glu Ser Phe Pro Leu
225 230 235 240
Lys Phe Phe Leu Arg Tyr Arg Pro Leu Ile Leu Asp Gln Trp Gln His
245 250 255
Val Glu Leu Ser Asp Gly Thr Ala His Thr Ile Thr Asp Ala Tyr Ala
260 265 270
Gly Lys Glu Tyr Ile Ile Gln Val Ala Ala Lys Asp Asn Glu Ile Gly
275 280 285
Thr Trp Ser Asp Trp Ser Val Ala Ala His Ala Thr Pro Trp Thr Glu
290 295 300
Glu Pro Arg His Leu Thr Thr Glu Ala Gln Ala Ala Glu Thr Thr Thr
305 310 315 320
Ser Thr Thr Ser Ser Leu Ala Pro Pro Pro Thr Thr Lys Ile Cys Asp
325 330 335
Pro Gly Glu Leu Gly Ser Gly Gly Gly Pro Ser Ala Pro Phe Leu Val
340 345 350
Ser Val Pro Ile Thr Leu Ala Leu Ala Ala Ala Ala Ala Thr Ala Ser
355 360 365
Ser Leu Leu Ile
370
<210> 2
<211> 342
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列
<400> 2
Met Ala Ala Pro Val Pro Trp Ala Cys Cys Ala Val Leu Ala Ala Ala
1 5 10 15
Ala Ala Val Val Tyr Ala Gln Arg His Ser Pro Gln Glu Ala Pro His
20 25 30
Val Gln Tyr Glu Arg Leu Gly Ser Asp Val Thr Leu Pro Cys Gly Thr
35 40 45
Ala Asn Trp Asp Ala Ala Val Thr Trp Arg Val Asn Gly Thr Asp Leu
50 55 60
Ala Pro Asp Leu Leu Asn Gly Ser Gln Leu Val Leu His Gly Leu Glu
65 70 75 80
Leu Gly His Ser Gly Leu Tyr Ala Cys Phe His Arg Asp Ser Trp His
85 90 95
Leu Arg His Gln Val Leu Leu His Val Gly Leu Pro Pro Gln Glu Pro
100 105 110
Val Leu Ser Cys Arg Ser Asn Thr Tyr Pro Lys Gly Phe Tyr Cys Ser
115 120 125
Trp His Leu Pro Thr Pro Thr Tyr Ile Pro Asn Thr Phe Asn Val Thr
130 135 140
Val Leu His Gly Ser Lys Ile Met Val Cys Glu Lys Asp Pro Ala Leu
145 150 155 160
Lys Asn Arg Cys His Ile Arg Tyr Met His Leu Phe Ser Pro Ile Lys
165 170 175
His Asn Val Ser Ile Ser Val Ser Asn Ala Leu Gly His Asn Ala Thr
180 185 190
Ala Ile Thr Phe Asp Glu Phe Thr Ile Val Lys Pro Asp Pro Pro Glu
195 200 205
Asn Val Val Ala Arg Pro Val Pro Ser Asn Pro Arg Arg Leu Glu Val
210 215 220
Thr Trp Gln Thr Pro Ser Thr Trp Pro Asp Pro Glu Phe Phe Pro Leu
225 230 235 240
Lys Phe Phe Leu Arg Tyr Arg Pro Leu Ile Leu Asp Gln Trp Gln His
245 250 255
Val Glu Leu Ser Asp Gly Thr Ala His Thr Ile Ala Ala Ala Tyr Ala
260 265 270
Gly Lys Glu Tyr Ile Ile Gln Val Ala Ala Lys Asp Asn Glu Phe Gly
275 280 285
Thr Trp Ser Asp Trp Ser Val Ala Ala His Ala Thr Pro Trp Thr Glu
290 295 300
Glu Pro Arg His Leu Thr Thr Glu Ala Gln Ala Ala Glu Thr Thr Thr
305 310 315 320
Ser Thr Thr Ser Ser Leu Ala Pro Pro Pro Thr Thr Lys Ile Cys Asp
325 330 335
Pro Gly Glu Leu Gly Ser
340
<210> 3
<211> 227
<212> PRT
<213> 智人
<400> 3
Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly
1 5 10 15
Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met
20 25 30
Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His
35 40 45
Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val
50 55 60
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65 70 75 80
Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly
85 90 95
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100 105 110
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115 120 125
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130 135 140
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145 150 155 160
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165 170 175
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180 185 190
Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met
195 200 205
His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser
210 215 220
Pro Gly Lys
225
<210> 4
<211> 578
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列
<400> 4
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1 5 10 15
Ala Ala Val Val Tyr Ala Gln Arg His Ser Pro Gln Glu Ala Pro His
20 25 30
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35 40 45
Ala Asn Trp Asp Ala Ala Val Thr Trp Arg Val Asn Gly Thr Asp Leu
50 55 60
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65 70 75 80
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85 90 95
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100 105 110
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Lys Phe Phe Leu Arg Tyr Arg Pro Leu Ile Leu Asp Gln Trp Gln His
245 250 255
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Glu Pro Arg His Leu Thr Thr Glu Ala Gln Ala Ala Glu Thr Thr Thr
305 310 315 320
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325 330 335
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Lys Lys Asn Trp Val Glu Arg Asn Ser Tyr Ser Cys Ser Val Val His
545 550 555 560
Glu Gly Leu His Asn His His Thr Thr Lys Ser Phe Ser Arg Thr Pro
565 570 575
Gly Lys

Claims (10)

1. 一种可溶性CNTFR多肽，所述可溶性CNTFR多肽特异性结合心肌营养素样细胞因子1(CLCF1)，其中相对于氨基酸序列在SEQ ID NO: 1示出的CNTFR多肽，所述可溶性CNTFR多肽中的突变为R110Q、T174P、S237F、I287F、Y177H、K178N、T268A和D269A并且缺失氨基酸343-372。
2.根据权利要求1所述的可溶性CNTFR多肽，其中所述可溶性CNTFR多肽与异源多肽融合，其中所述异源多肽是Fc结构域。
3.根据权利要求2所述的可溶性CNTFR多肽，其中所述Fc结构域是人Fc结构域。
4.根据权利要求1所述的可溶性CNTFR多肽，其中所述可溶性CNTFR多肽与聚乙二醇(PEG)、抗癌药物、可检测标记或其任何组合缀合。
5.一种药物组合物，所述药物组合物包含根据权利要求1-4中任一项所述的可溶性CNTFR多肽和药学上可接受的载体。
6.根据权利要求1-4中任一项所述的可溶性CNTFR多肽在制备用于治疗以肿瘤微环境中的癌症相关成纤维细胞(CAF)分泌CLCF1为特征的癌症的药物组合物中的用途，其中所述癌症是非小细胞肺癌(NSCLC)。
7.一种核酸，其编码根据权利要求1-4中任一项所述的可溶性CNTFR多肽。
8.一种表达载体，其包含根据权利要求7所述的核酸。
9.一种宿主细胞，其包括根据权利要求7所述的核酸。
10.一种宿主细胞，其包括根据权利要求8所述的表达载体。
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