JP2020530285A - 治療的ｐｓｍａ結合分子 - Google Patents

Abstract

本発明は、前立腺特異的膜抗原（ＰＳＭＡ）、特に単一ヒト可変重鎖ドメイン抗体に特異的に結合する改善された結合分子、および癌の処置のための関連する法に関する。

Description

発明の背景

技術分野
本発明は前立腺特異的膜抗原（ＰＳＭＡ）結合分子、および疾患の処置における前記結合分子の使用に関する。

背景技術
前立腺癌は先進国の男性において最もありふれて診断される非皮膚関連悪性腫瘍である。６人の男性に１人が前立腺癌と診断されるだろうと見積もられている。

前立腺癌に対する現在の処置には手術、放射線、アジュバントホルモン療法が含まれる。これらの治療は疾患の早期段階においては比較的有効であるが、最初に限局性前立腺癌と診断された患者の多数は最終的に再発する。化学療法は進行した前立腺癌への対抗において最も幅広く使用される取り組みである一方で、その治療効果は、特異性の欠落および付随する毒性が原因でたいていは不十分である。前立腺癌細胞への標的化送達の欠落は、実現可能な治療効果の達成において主要な障害の一つである。その結果、抗前立腺癌薬剤の選択性の増加のための戦略に対する重要なニーズが残っている（Ｂａｒｖｅ ｅｔ ａｌ、Ｊ Ｃｏｎｔｒｏｌ Ｒｅｌｅａｓｅ、２０１４ Ａｕｇｕｓｔ １０； ０： １１８−１３２）。

前立腺癌の診断は、前立腺特異抗原（ＰＳＡ）等の血清ベースマーカーの使用の後で非常に改良された。加えて、前立腺腫瘍関連抗原は、腫瘍イメージング、診断および標的化治療のための標的を提供する。前立腺特異膜抗原（ＰＳＭＡ）は、マーカーに関連する前立腺腫瘍であるが、前記標的である。

ＰＳＭＡは、前立腺分泌上皮細胞膜に高く限定されている、７５０残基のＩＩ型膜貫通糖タンパク質である。それは前立腺癌細胞および非前立腺固形腫瘍血管新生において高発現しており、健康な前立腺、腎臓、肝臓、小腸および脳を含んでなる他の組織においては低レベルで発現している。ＰＳＭＡの発現は前立腺疾患進行および転移とともに増加し、その発現レベルはしたがって、腫瘍の悪性度と相関する。様々な免疫組織学的研究は、前立腺癌の全症例のほとんどにおける、良性の前立腺上皮細胞におけるそのレベルと比較して増加したＰＳＭＡレベルを証明した。前立腺上皮内腫瘍、後期アンドロゲン非依存性前立腺癌およびリンパ節、骨、軟組織および肺に限局している続発性前立腺腫瘍を含んでなる前記疾患の全段階において強いＰＳＭＡ染色が認められる。ＰＳＭＡはしたがって、前立腺癌細胞のバイオマーカーとして幅広く使用されている。

ＰＳＭＡは３つの部分からなる構造を有している。つまり、１９のアミノ酸の内側部、２４のアミノ酸の膜貫通部、および７０７のアミノ酸の外側部である。それは、神経ペプチドＮ−アセチルアスパルチルグルタミン酸およびグルタミン酸複合葉酸誘導体を処理するためのその能力に基づくグルタミン酸カルボキシペプチダーゼ活性を備える非共有結合のホモ二量体を形成している。ＰＳＭＡは急速におよび効率よくエンドサイトーシス経路により内在化され、急速に細胞膜に戻って再循環する。

抗体に基づいた治療は、がん処置、炎症性および感染性疾患等の分野において増加しているヒト悪性腫瘍の治療の重要要素として表れた。多くの症例において、治療機能の基は、抗体に基づいた薬がその標的となる抗原に対して有する特異性および親和性の高度さである。薬、毒素または放射性核種をあわせた武装したモノクローナル抗体（ｍＡｂｓ）は、未だｍＡｂｓが治療効果を引き起こしてもよい別の戦略である。抗体の標的としている特異性と毒性エフェクター分子の腫瘍殺滅力を組み合わせることにより、免疫複合体は標的と正常組織の間で感度の高い識別を可能としており、それによって、従来の化学療法剤よりもより少ない副作用という結果をもたらす。

しかしながら、その大きさおよび他の物理的特性が原因で、ｍＡｂｓは静脈内または皮下のいずれかで投与されなければならず、結果として、高い全身曝露を有する。したがって、それらの送達経路はしばしば準最適であることができ、非疾患部位において標的抗原に結合している抗体（潜在的に正常、非疾患組織の健常機能を妥協する）という結果、または準最適ＰＫ／ＰＤ特性という結果のいずれかをもたらす。いずれかの結果は、準最適投与経路のために、効果の損失および／または妥協した安全プロフィールという結果をもたらしてもよい。

報告されている第一のＰＳＭＡ特異的ｍＡｂは、ネズミのｍＡｂ ７Ｅ１１であるが、その後に開発され、腫瘍イメージングのための診断薬剤（ＰｒｏｓｔａＳｃｉｎｔ、Ｃｙｔｏｇｅｎ、Ｐｒｉｎｃｅｔｏｎ、Ｎ．Ｊ．）として商業化された。しかしながら、この抗体は、ＰＳＭＡ検出のためのイメージング薬剤としてのその有用性を限定する、細胞死に際して曝露されるＰＳＭＡの細胞内エピトープを認識する。より最近に、Ｊ５９１等のＰＳＭＡの細胞外部分を認識するｍＡｂｓが特定された。

本発明の目的は、前立腺癌の処置における使用のための代替となる抗体に基づいた処置のニーズに取り組むことである。

一つの側面において本発明は、以下、配列番号１を含んでなるＣＤＲ１配列、配列番号２を含んでなるＣＤＲ２配列、および配列番号３を含んでなるＣＤＲ３配列を含んでなる単一Ｖ_Ｈドメイン抗体、配列番号５を含んでなるＣＤＲ１配列、配列番号６を含んでなるＣＤＲ２配列、および配列番号７を含んでなるＣＤＲ３配列を含んでなる単一Ｖ_Ｈドメイン抗体、配列番号９を含んでなるＣＤＲ１配列、配列番号１０を含んでなるＣＤＲ２配列、および配列番号１１を含んでなるＣＤＲ３配列を含んでなる単一Ｖ_Ｈドメイン抗体、配列番号１３を含んでなるＣＤＲ１配列、配列番号１４を含んでなるＣＤＲ２配列、および配列番号１５を含んでなるＣＤＲ３配列を含んでなる単一Ｖ_Ｈドメイン抗体、配列番号１７を含んでなるＣＤＲ１配列、配列番号１８を含んでなるＣＤＲ２配列、および配列番号１９を含んでなるＣＤＲ３配列を含んでなる単一Ｖ_Ｈドメイン抗体、配列番号２１を含んでなるＣＤＲ１配列、配列番号２２を含んでなるＣＤＲ２配列、および配列番号２３を含んでなるＣＤＲ３配列を含んでなる単一Ｖ_Ｈドメイン抗体、配列番号２５を含んでなるＣＤＲ１配列、配列番号２６を含んでなるＣＤＲ２配列、および配列番号２７を含んでなるＣＤＲ３配列を含んでなる単一Ｖ_Ｈドメイン抗体、配列番号２９を含んでなるＣＤＲ１配列、配列番号３０を含んでなるＣＤＲ２配列、および配列番号３１を含んでなるＣＤＲ３配列を含んでなる単一Ｖ_Ｈドメイン抗体、配列番号３３を含んでなるＣＤＲ１配列、配列番号３４を含んでなるＣＤＲ２配列、および配列番号３５を含んでなるＣＤＲ３配列を含んでなる単一Ｖ_Ｈドメイン抗体、または、配列番号３７を含んでなるＣＤＲ１配列、配列番号３８を含んでなるＣＤＲ２配列、および配列番号３９を含んでなるＣＤＲ３配列を含んでなる単一Ｖ_Ｈドメイン抗体の一つから選択される単一ヒト可変重鎖ドメイン（Ｖ_Ｈ）抗体を含んでなる、ヒトＰＳＭＡに結合し得る結合分子に関する。

一つの実施態様において、前記ＣＤＲ１配列は配列番号２５を含み、前記ＣＤＲ２配列は配列番号２６を含み、および前記ＣＤＲ３配列はＶ_Ｈドメイン抗体１．２７（配列番号２８）を含んでなる、またはからなる。一つの実施態様において、前記単一ドメインＶ_Ｈドメイン抗体は配列番号４、８、１２、１６、２０、２４、２８、３２、３６、または４０から選択される配列を含んでなる、またはからなる。一つの実施態様において、前記単一ドメインＶ_Ｈドメイン抗体は配列番号２８を含んでなる、またはからなる。

一つの実施態様において、前記結合分子は、上記で開示されるようなヒトＰＳＭＡに結合し得る第一の単一ヒト重鎖可変免疫グロブリン（Ｖ_Ｈ）ドメイン抗体と、ヒトＰＳＭＡに結合し得る第二の単一Ｖ_Ｈドメイン抗体とを含んでなる。

一つの側面において、本発明は上記で開示されるような結合分子を含んでなる医薬組成物に関する。

一つの側面において、本発明は上記で開示されるような結合分子を含んでなる免疫複合体に関する。

一つの側面において、本発明は、上記で開示されるような、結合分子、免疫複合体または医薬組成物の治療的に有効な量の投与を含んでなる、前立腺癌または前立腺疾患を処置するための方法に関する。

一つの側面において、本発明は、薬剤として使用のために、上記で開示されるような、結合分子、免疫複合体または医薬組成物に関する。

一つの側面において、本発明は前立腺癌または前立腺疾患の処置における使用のために、上記で開示されるような、結合分子、免疫複合体または医薬組成物に関する。

一つの側面において、本発明は前立腺癌または前立腺疾患の処置のための薬剤の製造において、上記の開示にしたがった、結合分子、免疫複合体または医薬組成物の使用に関する。

一つの側面において、本発明は、ヒトＰＳＭＡと上記で開示されるような結合分子の接触を含んでなる、ヒトＰＳＭＡ活性を低減するｉｎ ｖｉｖｏまたはｉｎ ｖｉｔｒｏの方法に関する。

一つの側面において、本発明は、サンプルと上記で開示されるような結合分子および少なくとも一つの検出可能な標識の接触を含んでなる免疫学測定法により、試験サンプルにおけるＰＳＭＡの存在を決定するための方法に関する。

一つの側面において、本発明は、上記で開示されるような結合分子をコードする核酸配列を含んでなる単離された核酸分子に関する。

一つの側面において、本発明は、上記で開示されるような結合分子を含んでなる免疫複合体に関する。

一つの側面において、本発明は、式Ａ−（Ｌ−Ｄ）ｎの免疫複合体に関する。式中Ａは上記に規定するように特異的にヒトＰＳＭＡと結合し得る第一のヒト単一Ｖ_Ｈドメイン抗体を含み、任意に特異的にヒトＰＳＭＡと結合し得る第二のヒト単一Ｖ_Ｈドメイン抗体を含み、および任意に第三のヒト単一Ｖ_Ｈドメイン抗体を含んでなる、抗原結合部位であり、Ｌはリンカーであり、およびＤはアウリスタチンまたはその誘導体であり、ｎは１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０である。

本発明はさらに、以下の非限定的な図において示される。

ＦＭＡＴミラーボール試験における精製した抗ＰＳＭＡ Ｖ_Ｈの結合。１ａ、（黒丸）１．１、（黒四角）３．１、（黒三角）２．１０、（黒逆三角）２．１、１ｂ、（黒丸）２．１、（黒三角）２．１３、（黒逆三角）２．１７、（菱形）２．１５、（白丸）２．１２、（白三角）２．２２、１ｃ、上から下までの記号で示されるように試験された単一ドメイン抗体、（黒丸）１．８、（黒四角）１．１０、（黒三角）１．１１、（黒逆三角）１．１２、１．１３、（白丸）１．１４、１．１６、（白三角）１．１７、１．１８。 Ｏｃｔｅｔ ＲＥＤＤ ３８４により精製した抗ＰＳＭＡ単一ドメイン抗体のｒｈＰＳＭＡへの結合、Ａ．２．１、Ｂ．１．１、Ｃ．３．１。 精製した抗ＰＳＭＡ単一ドメイン抗体のｐＨｒｏｄｏ（商標）Ｇｒｅｅｎの内在化。使用された単一ドメイン抗体（上から下までの凡例における記号）：２．２０、１２．１、３．１、３．２、４．１、５．１、９．１、１４．１、１０．１、７．１。 抗ＰＳＭＡ単一ドメイン抗体、Ａ．Ｖ_Ｈ２．１、Ｂ．Ｖ_Ｈ１．１と合わせたカニクイザルＰＳＭＡおよびヒトＰＳＭＡ ＣＨＯの死滅化。 抗ＰＳＭＡ単一ドメイン抗体と合わせたＬＮＣａｐの死滅化。使用されたｓＤＡｂｓ（上から下までの凡例における記号）、Ｖ_Ｈ１．１、２．１、７．１、３．１、１２．１、４．１。 ４０℃に加熱した後の抗ＰＳＭＡ単一ドメイン抗体のカニクイザルＰＳＭＡ ＣＨＯへの結合、Ａ．Ｖ_Ｈ２．１、Ｂ．Ｖ_Ｈ１．１。 ３７^ｏＣにおける抗ＰＳＭＡ親単一ドメイン抗体の血清安定性、Ａ．Ｖ_Ｈ２．１、Ｂ．Ｖ_Ｈ１．１、Ｃ．Ｖ_Ｈ３．１。 ３７^ｏＣにおける様々な抗ＰＳＭＡ多様体（variant）単一ドメイン抗体の血清安定性。 ｉｎ ｖｉｖｏイメージング。５分〜２４時間のイメージング、ａ）ベンチマークｍＡｂ、ｂ）Ｖ_Ｈ２．１、ｃ）Ｖ_Ｈ２．１−ＭＳＡ、ｄ）Ｖ_Ｈ１．１、ｅ）陰性対照。 ｉｎ ｖｉｖｏイメージング２４時間Ｘ線写真、ａ）ベンチマークｍＡｂ、ｂ）Ｖ_Ｈ２．１、ｃ）Ｖ_Ｈ２．１−ＭＳＡ、ｄ）Ｖ_Ｈ１．１、ｅ）陰性対照。 ５分〜２４時間におけるＰＳＭＡ＋腫瘍、ＰＳＭＡ−腫瘍および血液の体内分布の比較、ａ）Ｖ_Ｈ１．１、ｂ）Ｖ_Ｈ２．１、ｃ）半減期延長Ｖ_Ｈ２．１、ｄ）ベンチマークｍＡｂ、ｅ）ＨＥＬ４対照。 ５分〜２４時間におけるＰＳＭＡ＋腫瘍、膀胱および腎臓の体内分布の比較、ａ）Ｖ_Ｈ１．１、ｂ）Ｖ_Ｈ２．１、ｃ）半減期延長Ｖ_Ｈ２．１、ｄ）ベンチマークｍＡｂ、ｅ）ＨＥＬ４対照。 ５分〜２４時間における肺、心臓、肝臓、筋肉およびＰＳＭＡ発現（ＰＳＭＡ＋）腫瘍の体内分布の比較、ａ）Ｖ_Ｈ１．１、ｂ）Ｖ_Ｈ２．１、ｃ）半減期延長Ｖ_Ｈ２．１、ｄ）ベンチマークｍＡｂ、ｅ）ＨＥＬ４対照。 ５分〜２４時間におけるＰＳＭＡ＋腫瘍のＰＳＭＡ−腫瘍、血液または筋肉に対する割合の比較、ａ）Ｖ_Ｈ１．１、ｂ）Ｖ_Ｈ２．１、ｃ）半減期延長Ｖ_Ｈ２．１、ｄ）ベンチマークｍＡｂ、ｅ）ＨＥＬ４対照。 ５分〜２４時間の全身活性の比較。 ｉｎ ｖｉｔｒｏでの、４８時間インキュベートの時点における、ヒトＰＳＭＡタンパク質が安定して発現しているヒト細胞およびマッチした親細胞（ＰＳＭＡ陰性）における、モノマーＭＭＡＥが複合されたＶ_Ｈ（ＡおよびＢ）、二価のＶ_Ｈ（ＣおよびＤ）およびバイパラトピックＶ_Ｈ（ＥおよびＦ）の細胞毒性を示している。 ｉｎ ｖｉｔｒｏでの、７２時間培養の時点における、ヒトＰＳＭＡタンパク質が安定して発現しているヒト細胞における、ＭＭＡＥ複合Ｖ_Ｈの細胞毒性を示している。 Ｈｕｍａｂｏｄｙ（商標）薬物複合体（ＨＤＣｓ）を調整するために使用されるＨｉＰＥＧ（商標） ｖａｌ−ｃｉｔ−ＰＡＢ−ＭＭＡＥ試薬（分子量＝２８０５ｇ／ｍｏｌ）を示している。 Ｐｒｏ＿００６対照抗体薬物複合体（ＡＤＣ）を生産するために使用されるマレイミドカプロイル−バリン−シトルリン−ｐ−アミノベンゾイルオキシカルボニル−モノメチル アウリスタチンＥ（ｍｃ−ｖａｌ−ｃｉｔ−ＰＡＢ−ＭＭＡＥ）コンジュゲーション試薬（分子量＝１３１７ｇ／ｍｏｌ）を示している。

詳細な説明
本発明が以下にさらに説明する。以下の段落において、本発明の異なる側面がより詳細に規定される。そのように規定された各側面は、明確に反対であると示されない限り、いかなる他の１つのまたは複数の側面と連結されてもよい。特に、好ましいまたは有利であると示されたようないかなる特徴も、好ましいまたは有利であると示されたようないかなる他の１つのまたは複数の特徴と連結されてもよい。

一般的に、ここで開示される、細胞および組織培養、病理学、腫瘍学、分子生物学、免疫学、微生物学、遺伝子およびタンパク質および核酸化学およびハイブリダイゼーションに関連して使用される命名法、およびその技術は、当該技術分野においてよく知られ、かつありふれて使用されるものである。今回の開示の方法および技術は、一般的に、当該技術分野においてよく知られた従来の方法にしたがい、および特に断りがない限り、本明細書全体において引用され、議論された様々な一般的な、およびより具体的な参照に開示されるように実行された。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．， Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ （２ｄ ｅｄ．， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ、Ｎ．Ｙ．（１９８９））を参照。酵素反応および精製技術は、当該技術において一般に遂行されるまたはここで開示されるように、メーカーの仕様書にしたがって実行された。ここで開示される分析化学、有機合成化学、医薬および製薬化学に関連して使用される命名法、および実験室法および技術は、当該技術においてよく知られ、かつありふれて使用されるものである。標準的な技術が、化学合成、化学分析、医薬調整、処方および送達、および患者の処置のために使用される。

本発明は単離されたＰＳＭＡ結合分子、特に、ヒトＰＳＭＡと結合している、少なくとも一つの単一Ｖ_Ｈドメイン抗体、単離された核酸も同様に前記結合分子を含んでなる医薬組成物、組み替え発現ベクターおよび前記タンパク質および小片を作製するための単離された宿主細胞を含んでなるそれらを提供する。また、ヒトＰＳＭＡを検出するため、ｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｉｎ ｖｉｖｏのいずれかでヒトＰＳＭＡを阻害するため、ここで開示された結合タンパク質を使用する方法が提供され、および疾患を処置する方法が提供される。本発明の一つの側面は、単離されたヒト抗ヒトＰＳＭＡ結合分子、具体的には、高い親和性、遅いオフレートでヒトＰＳＭＡと結合した単一Ｖ_Ｈドメイン抗体を含んでなる、またはからなるそれらを提供する。

本発明のＰＳＭＡ結合分子は野生型ヒトＰＳＭＡ（受入番号Ｑ０４６０９）と結合する。モノマーのための配列が以下に示されている（配列番号２５０）。

一つの実施態様において、本発明のＰＳＭＡ結合分子は野生型ヒトＰＳＭＡおよび／またはカニクイザルＰＳＭＡに結合している。ここで使用されるように、用語「ＰＳＭＡ結合分子」、「ＰＳＭＡ結合タンパク質」、「抗ＰＳＭＡ単一ドメイン抗体」または「抗ＰＳＭＡ抗体」はすべて、ヒトＰＳＭＡ抗原に結合し得る分子を表している。結合反応は、例えば、無関係な特異性の抗体の陰性対照試験の参照とともにＰＳＭＡのその受容体への結合の阻害を決定するための結合試験、拮抗試験もしくは生物検定、またはいかなる結合試験を含んでなる標準法（定性分析）により示されてもよい。適切な試験法が例において示される。

本発明の抗体または結合分子は、対象としている抗原、例えばＰＳＭＡと「結合している（結合する）」または「結合可能である」、ここで開示される単一ドメイン抗体および多価または多重特異的結合薬剤を含み、抗原が発現している細胞または組織の標的化における治療において有用であるような十分な親和性でつまり標的、ＰＳＭＡ抗原に結合している１つである。

本発明の結合分子は、ここで開示される単一ドメイン抗体および多価または多重特異的結合薬剤を含み、具体的にはヒトＰＳＭＡに結合している。言い換えれば、ＰＳＭＡ抗原への結合は、非特異的な相互作用とは明らかに異なる。好ましくは、本発明の単一ドメイン抗体はヒトＰＳＭＡ、およびまたカニクイザルＰＳＭＡに結合している。ここで使用されるように、用語「特異的結合の」特定のポリペプチドまたは特定のポリペプチド標的におけるエピトープ、またはこれら「に特異的に結合している」、またはこれら「に対して特異的な」は、少なくとも約１０^−４ Ｍ、あるいは少なくとも約１０^−５ Ｍ、あるいは少なくとも約１０^−６ Ｍ、あるいは少なくとも約１０^−７ Ｍ、あるいは少なくとも約１０^−８ Ｍ、あるいは少なくとも約１０^−９ Ｍ、あるいは少なくとも約１０^−１０ Ｍ、あるいは少なくとも約１０^−１１ Ｍ、あるいは少なくとも約１０^−１２ Ｍ、またはそれ以上である、標的のためにＫＤである分子により表されることが出来る。一つの実施態様において、用語「特異的結合の」は、分子が、実質的にいかなる他のポリペプチドまたはポリペプチドエピトープに結合することなく、特定のポリペプチドまたは特定のポリペプチドにおけるエピトープと結合している結合を表している。

用語「エピトープ」または「抗原決定基」は、免疫グロブリン、抗体または、Ｖ_Ｈ単一ドメイン抗体を含んでいる、抗体小片が特異的に結合している、抗原（例えば、ＰＳＭＡ）の表面における部位を表している。一般的に、抗原はいくつかの、または多数の異なるエピトープを有し、多くの異なる抗体と反応する。用語には、具体的に、線形エピトープおよび立体構造エピトープが含まれる。タンパク質抗原内のエピトープは、連続的アミノ酸（通常、線形エピトープ）またはタンパク質の三次折り畳みにより並列される非連続的アミノ酸（通常、立体構造エピトープ）の両方から形成されることができる。連続的アミノ酸から形成されるエピトープは典型的には、いつでもではないが、変性溶媒にさらされて保持され、一方で、三次折り畳みにより形成されるエピトープは典型的には変性溶媒での処理で失われる。エピトープには典型的には、独特な空間的立体配座において少なくとも３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４または１５のアミノ酸が含まれる。定められた抗体または抗体小片により何のエピトープが結合されているのか決定する方法（つまり、エピトープマッピング）は当該技術において良く知られており、例えば、イムノブロッティングおよび免疫沈降試験が含まれ、ここで、重複または連続したペプチドが、定められた抗体または抗体小片との反応性のために試験される。２つの抗体が同一のまたは立体的に重複するエピトープを認識した時、抗体は参照抗体として「本質的に同じエピトープ」に結合する。２つのエピトープが同一のまたは立体的に重複するエピトープと結合するかを決定する、もっとも広く使用され、素早い方法は競合試験であり、それは、標識された抗原または標識された抗体のいずれかを使用して、異なった形式で構成されることができる。

本発明は、ヒトＰＳＭＡと結合している単離されたＰＳＭＡ結合分子、前記結合分子をコードする単離された核酸を同様に、前記結合分子を含んでなる医薬組成物および処方、組み替え発現ベクター、および前記結合分子を作製するための前記核酸を含んでなる宿主細胞、を提供する。また、本発明により、ヒトＰＳＭＡを検出するため、ｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｉｎ ｖｉｖｏのいずれかでヒトＰＳＭＡを阻害するため、ここで開示された結合分子を使用する方法が提供され、および疾患を処置する方法が提供される。本発明の一つの好ましい側面は、単離されたヒト抗ヒトＰＳＭＡ結合分子、具体的には、高い親和性、遅いオフレートでヒトＰＳＭＡと結合した少なくとも１つの単一ヒトＶ_Ｈドメイン抗体を含んでなるまたはからなるそれらを提供する。

一つの側面において、本発明は単離された単一可変ドメイン抗体、単離された可変単一ドメインまたは単離された免疫グロブリン単一可変ドメインに関し、ここで、前記の単離された単一ドメイン抗体、単離された可変単一ドメインまたは単離された免疫グロブリン単一可変ドメインはヒトＰＳＭＡに結合している。少なくとも１つの単一ドメイン抗体、可変単一ドメインまたは免疫グロブリン単一可変ドメイン、を含んでなる結合分子はまた、本発明の範囲内である。ヒトＰＳＭＡに結合している、単一ドメイン抗体、可変単一ドメインまたは免疫グロブリン単一可変ドメインの小片もまた、本発明の範囲内である。

用語「単一ドメイン抗体、可変単一ドメインまたは免疫グロブリン単一可変ドメイン（ＩＳＶ）」はすべて当該技術において良く知られ、かつ、標的抗体に結合している、単一可変抗体の小片を開示する。これらの用語は、ここで交換可能に使用される。単一重鎖可変ドメイン抗体（Ｖ_Ｈ）は免疫グロブリン軽鎖を含まない。以下で説明されるように、本発明の様々な側面の好ましい態様は、軽鎖の不在でＰＳＭＡ抗原に結合する単一重鎖可変ドメイン抗体／免疫グロブリン重鎖単一可変ドメインに関連する。ヒト重鎖単一可変（Ｖ_Ｈ）ドメイン抗体は特に好ましい。ヒト重鎖単一可変Ｖ_Ｈは、一般的に、Ｖ_Ｈドメインとして略される。単一Ｖ_Ｈドメイン抗体はまた、ここでＨｕｍａｂｏｄｙ（商標）と呼ばれる。Ｈｕｍａｂｏｄｙ（商標）はクレッシェンド バイオロジックス株式会社の登録商標である。

したがって、いくつかの好ましい実施態様において、本発明の単離された結合薬剤／分子は、少なくとも一つの単一ドメイン抗体を含み、またはからなり、ここで、前記ドメインは好ましくはヒト重鎖可変ドメインである。したがって、一つの側面において、本発明の結合薬剤は、Ｖ_Ｌドメインが欠けているが、少なくとも一つのヒト免疫グロブリン単一可変重鎖ドメインを含んでなる、またはからなる。

各単一Ｖ_Ｈドメイン抗体は、Ｎ末端からＣ末端までが以下の順番、ＦＲ１−ＣＤＲ１−ＦＲ２−ＣＤＲ２−ＦＲ３−ＣＤＲ３−ＦＲ４で並べられている、３つのＣＤＲおよび４つのＦＲを含んでなる。したがって、本発明の一つの実施態様において、ドメインは以下の式ＦＲ１−ＣＤＲ１−ＦＲ２−ＣＤＲ２−ＦＲ３−ＣＤＲ３−ＦＲ４を備えるヒト可変重鎖（Ｖ_Ｈ）ドメインである。本発明の一つの実施態様において、結合分子はその抗原結合小片を含んでなる。

用語「単離された」単一ドメイン抗体は、実質的に異なる抗原特異性を有する他の単一ドメイン抗体、抗体または抗体フラグメントがない単一ドメイン抗体を表している。さらに、単離された単一ドメイン抗体は、実質的に他の細胞物質、および／または細胞化学物質がなくてもよい。

「ホモロジー」は一般的に、配列を揃えた後、およびいくつかの実施態様においては、必要であれば、最大割合のホモロジーを達成するためにギャップを導入した後に、比較されているポリペプチド残基と一致している候補配列におけるアミノ酸残基の割合を表しており、配列同一性の一部としてのいかなる保存的置換も考慮されていない。したがって、２つのアミノ酸配列のホモロジーの割合は、２つの配列の間の同一性の割合と同等である。ＮもしくはＣ末端伸張、タグまたは挿入は同一性またはホモロジーの減少と解釈されるべきではない。整列のための方法およびコンピュータープログラムは良く知られている。

用語「抗体」、広くいかなる免疫グロブリン（Ｉｇ）分子またはその抗原結合部位を表しており、Ｉｇ分子の必須なエピトープ結合特性が保持されている４つのポリペプチド鎖、２つの重（Ｈ）鎖および２つの軽（Ｌ）鎖、またはいかなる機能的小片、変異体、多様体、またはその誘導体が含まれる。前記変異体、多様体、または誘導体の抗体の形式は当該技術において知られている。完全長抗体において、各重鎖は、重鎖可変領域（ここで、ＨＣＶＲまたはＶ_Ｈと略される）および重鎖不変領域を含んでいる。前記重鎖不変領域は３つのドメイン、Ｃ_Ｈ１、Ｃ_Ｈ２およびＣ_Ｈ３を含んでいる。各軽鎖は軽鎖可変領域（ここで、ＬＣＶＲまたはＶ_Ｌと略される）および軽鎖不変領域を含んでいる。前記軽鎖不変領域は１つのドメイン、ＣＬを含んでいる。Ｖ_ＨおよびＶ_Ｌ領域はさらに、フレームワーク領域（ＦＲ）と呼ばれる、より保護された領域が組み入れられ、相補性決定領域（ＣＤＲ）と呼ばれる、超可変性の領域に細分化されることができる。各Ｖ_ＨおよびＶ_Ｌ領は３つのＣＤＲおよび４つのＦＲを含んでおり、Ｎ末端からＣ末端まで以下、ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、ＦＲ４の順番で並んでいる。免疫グロブリン分子はいかなるタイプ（例えば、ＩｇＧ、ＩｇＥ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＡおよびＩｇＹ）、クラス（例えば、ＩｇＧ １、ＩｇＧ２、ＩｇＧ ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡｌおよびＩｇＡ２）またはサブクラスでも可能である。

抗体小片は、例えば、Ｆ（ａｂ’）_２、Ｆａｂ、Ｆｖ、ｓＦｖ等の抗体の部分である。完全長抗体の機能的小片は完全長抗体の標的特異性を保持する。Ｆａｂ（小片、抗体）、ｓｃＦｖ（単一鎖可変鎖小片）、および単一ドメイン抗体（ｄＡｂｓ）等の組み替え機能抗体小片は、したがって、２つの可変ドメインＶ_ＨおよびＶ_ＬからなるｍＡｂｓ、ｓｃＦｖ小片（〜２５ｋＤａ）を基にした治療の代替としての治療の開発のために使用されている。当然に、Ｖ_ＨおよびＶ_Ｌドメインは疎水性相互作用を介して非共有的に結合され、解離する傾向にある。しかしながら、単一鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）を作製するために親水性可動性リンカーを備えたドメインの結合によって、安定な小片は設計されることができる。最小抗原結合小片は単一可変小片であり、すなわち、Ｖ_ＨまたはＶ_Ｌドメインである。軽鎖／重鎖の結合する相手はそれぞれ、標的への結合は要求されていない。前記小片は単一ドメイン抗体において使用される。単一ドメイン抗体（１２〜１５ｋＤａまで）は、したがって、Ｖ_ＨまたはＶ_Ｌのいずれかのドメインを有する。

ある実施態様において、本発明の単離された結合分子は、少なくとも一つの単一ドメイン抗体を含み、またはからなり、ここで前記ドメインはＶ_Ｈドメインである。したがって、一つの側面において、本発明の結合分子は、Ｖ_Ｈドメインを有するがＶ_Ｌドメインが欠けている、少なくとも一つの免疫グロブリン単一可変重鎖ドメイン抗体（ｓＶＤ、ｓｄＡｂまたはＩＳＶ）を含んでなる、またはからなる。ここでさらに開示されるように、結合分子は、２以上の単一Ｖ_Ｈドメイン抗体を含んでもよい。前記結合分子は、以下でさらに詳細に説明されるように、単一特異的または多重特異的、一価または多価であってもよい。したがって、本発明のいくつかの好ましい実施態様において、結合分子は軽鎖を含んでなる。いくつかの実施態様において、結合分子は重鎖ドメインＣ_Ｈ２およびＣ_Ｈ３を含まない。いくつかの実施態様において、結合分子は重鎖ドメインＣ_Ｈ１、Ｃ_Ｈ２およびＣ_Ｈ３を含まない。いくつかの実施態様において、結合分子は重鎖ドメインＣ_Ｈ１、ヒンジ領域重鎖ドメイン Ｃ_Ｈ２および重鎖ドメインＣ_Ｈ３を含まない。いくつかの実施態様において、結合分子は軽鎖、重鎖ドメインＣ_Ｈ１、ヒンジ領域重鎖ドメイン Ｃ_Ｈ２および重鎖ドメインＣ_Ｈ３を含まない。

各Ｖ_Ｈドメインは３つのＣＤＲおよび４つのＦＲを含み、アミノ末端から炭素末端まで以下、ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、ＦＲ４の順番で配置されている。Ｖ_Ｈフレームワークへの修飾は結合特性の改善のためになされてもよい。例えば、Ｖ_Ｈドメインは、ＣまたはＮ末端伸張を含んでもよい。一つの実施態様において、Ｖ_Ｈドメインは１〜１０、例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０の追加のアミノ酸のＣ末端伸張を含んでなる。一つの実施態様において、Ｖ_Ｈドメインは１〜１２の、例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０のＣ_Ｈ１ドメインの追加のアミノ酸である、アミノ酸残基のＣ末端伸張を含んでなる。一つの実施態様において、前記伸張は少なくとも一つのアラニン残基、例えば、単一アラニン残基、一対のアラニン残基、または三つ組のアラニン残基を含んでなる。前記伸張されたＶ_Ｈドメインは本発明の範囲内である。追加のＣまたはＮ末端残基、例えば、リンカー残基および／またはＨｉｓタグ、例えば、ヘキサＨｉｓ（配列番号２５１）またはｍｙｃタグ、を含んでなるＶ_Ｈドメインもまた、本発明の範囲内である。例えば、タグに加えて、ベクターの追加残基もまた提供されてもよい。使用される結合分子は追加の残基（配列番号２５２）を有していてもよい。

本発明の様々な側面および実施態様にしたがって、本発明の単一ドメイン抗体の可変ドメインは、好ましくはヒト可変ドメイン（Ｖ_Ｈ）である。ここで使用されるように、ヒトＶ_Ｈドメインは十分にヒト、または実質的に十分にヒトＶ_Ｈドメインを含んでなる。ここで使用されるように、用語ヒトＶ_Ｈドメインはまた、例えば、ＷＯ２０１６／０６２９９０およびその例において開示されるように、十分にヒト免疫グロブリン重鎖遺伝子座が発現しているトランスジェニックマウスにより、特に、対象の抗原への免疫に対する反応において、作製された重鎖単独抗体から単離されたＶ_Ｈドメインを含んでなる。一つの実施態様において、ヒトＶ_Ｈドメインはまた、ヒトＶ_Ｈドメインアミノ酸または前記Ｖ_Ｈドメインをコードする核酸配列に由来する、または基づくＶ_Ｈドメインを含んでなることができる。したがって、前記用語は、ヒト生殖細胞系免疫グロブリン配列に由来、またはコードされる可変重鎖領域を含んでなる。実質的ヒトＶ_Ｈドメイン、またはヒトＶ_Ｈドメインに由来する、または基づくＶ_Ｈドメインはヒト生殖細胞系免疫グロブリン配列（例えば、ｉｎ ｖｉｔｒｏ、例えば、無作為にまたは部位特異的な突然変異誘発で導入された、またはｉｎ ｖｉｖｏで体細胞突然変異により導入された変異体）にコードされないアミノ酸残基を含んでいてもよい。用語「ヒトＶ_Ｈドメイン」はまた、したがって、実質的なヒトＶ_Ｈドメインを含み、ここで、前記ヒトＶ_Ｈドメインは１つまたはそれ以上のアミノ酸残基が修飾されている。例えば、実質的なヒトＶ_Ｈドメインには１０まで、例えば、完全なヒト配列と比較して、１、２、３、４または５のアミノ酸修飾を含んでいてもよい。しかしながら、用語「ヒトＶ_Ｈドメイン」または「実質的なヒトＶ_Ｈドメイン」は、ここで使用されるように、ネズミ等の別の哺乳類種の生殖細胞系に由来するＣＤＲ配列がヒトフレームワーク配列上に移植されている抗体を含んでなることは意図されていない。好ましくは、用語「ヒトＶ_Ｈドメイン」はまた、ここで使用されるように、例えば、１つまたはそれ以上の所定の残基をラクダ化Ｖ_ＨＨで発見されることができる特定の残基に変更するための所定の位置において、ｉｎ ｖｉｔｒｏでＶ_Ｈドメイン配列における所定の位置を選定するため、および１つまたはそれ以上の点突然変異を誘導するための従来の突然変異誘発法で、特異的に修飾されたヒトＶ_Ｈドメインである、ラクダ化Ｖ_Ｈドメインを含んでなることは意図されていない。

ここで使用されるように、用語Ｖ_Ｈまたは「可変ドメイン」は、Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．， Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ、第５版、Ｕ．Ｓ． Ｄｅｐｔ． Ｈｅａｌｔｈ ＆ Ｈｕｍａｎ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ、Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ、Ｄ．Ｃ．（１９９１）により規定される免疫グロブリン可変ドメインを表している。可変ドメイン内のＣＤＲアミノ酸残基のナンバリングとポジショニングは周知のＫａｂａｔナンバリング規則にしたがっている。

さらに具体的には、本発明は単一Ｖ_Ｈドメイン抗体または１つまたはそれ以上の単一Ｖ_Ｈドメイン抗体を含んでなる結合分子を提供し、ここで前記単一Ｖ_Ｈドメイン抗体はさらにここで、特に例において、開示されるような親和性、結合速度定数速度、解離速度定数速度、ＫＤおよび／またはＫＡ、ＥＣ５０およびＩＣ５０の値でヒトＰＳＭＡと結合している。これらの値の測定に適した試験はまた、例において示される。

本発明の結合分子は、特に単一Ｖ_Ｈドメイン抗体において、ここで規定されるような、ＣＤＲ等の、アミノ酸配列および好ましい配列、および／またはその部分、を含んでなる、またはからなる。

用語「ＣＤＲ」は、抗体可変配列内の相補性決定領域を表している。重鎖および軽鎖の各可変領域には３つのＣＤＲがあり、可変領域それぞれのためにＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３が指定されている。用語「ＣＤＲの組」は、抗原と結合し得る単一可変領域において生じる３つのＣＤＲの群を表している。これらのＣＤＲの正確な境界線は異なる体系にしたがって、別に規定されている。Ｋａｂａｔにより開示される体系がここで使用されている。用語「Ｋａｂａｔナンバリング」、「Ｋａｂａｔ定義」および「Ｋａｂａｔ標識」は、ここで交換可能に使用されている。これらの用語は、当該技術において認識されているが、抗体、またはその抗原結合部位の重および軽鎖可変領域における他のアミノ酸残基より可変的（つまり超可変的）なアミノ酸残基のナンバリングの体系を表している（Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．，（１９７１）Ａｎｎ．ＮＹ Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．１９０：３８２−３９１およびＫａｂａｔ，ｅｔ ａｌ．，（１９９１）Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ、第５版、Ｕ．Ｓ．Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ、ＮＩＨ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ Ｎｏ．９１−３２４２）。

実験部分においてより詳細に開示されているように、単一Ｖ_Ｈドメイン抗体は単離され、ＣＤＲ３配列における配列ホモロジーに基づくファミリーにグループ分けされた。最適化の処理を通じて、親ＣＤＲ配列に由来するＣＤＲ配列を備えた多様体単一Ｖ_Ｈドメイン抗体の一団はまた、ＰＳＭＡへの親和性を改善するため、および／または親分子と比較した効力を改善するために、生成された。

一つの側面において、本発明は、表１ａにおいて示されるようなファミリー１のメンバー、または、ここで規定されるように表１ａにおいて示されるように、ファミリー１の多様体であるファミリー１のメンバー様の配列を、含んでなるまたはからなる単一Ｖ_Ｈドメイン抗体を含んでなる、またはからなる、ヒトＰＳＭＡまたはここでＰＳＭＡ結合部分が前記単一Ｖ_Ｈドメイン抗体を含んでなるまたはからなる、に結合し得る結合分子に関する。一つの実施態様において、結合分子は、ここで規定されるように、表１ａに示されるようなファミリー１単一Ｖ_Ｈドメイン抗体、または表１ａにおいて示されるようなファミリー１の多様体を含んでなる少なくとも一つのＰＳＭＡ、好ましくはヒトＰＳＭＡに結合し得る単一Ｖ_Ｈドメイン抗体を含んでなる、またはからなる。したがって、本発明は、ＰＳＭＡ、好ましくはヒトＰＳＭＡに結合し得る単一Ｖ_Ｈドメイン抗体に関し、ここで前記単一Ｖ_Ｈドメイン抗体は、ここで規定されるように、表１ａに示されるようであり、または表１ａにおいて示されるようにファミリー１の多様体である。単一Ｖ_Ｈドメイン抗体は、以下に示すように、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列を含んでもよい。ＣＤＲ配列およびファミリー１ａにおける全長Ｖ_Ｈ配列は、以下に示すように表１ａにしたがって番号付けされた。

表１ａは、本発明の範囲内である単一V_Hドメイン抗体の配列を示している。

表１ｂは、表１ａにおいてリスト化されたファミリーメンバーの配列と同様のＣＤＲ３配列を共有、または有している他のファミリー１のメンバーを示している。

一つの実施態様において、単一Ｖ_Ｈドメイン抗体は、以下に示す通り、ＣＤＲ１、２および３を含んでなる。したがって、本発明にしたがって、前記単一Ｖ_Ｈドメイン抗体は以下、配列番号１を含んでなるＣＤＲ１配列、配列番号２を含んでなるＣＤＲ２配列、および配列番号３を含んでなるＣＤＲ３配列を含んでなる単一Ｖ_Ｈドメイン抗体、配列番号５を含んでなるＣＤＲ１配列、配列番号６を含んでなるＣＤＲ２配列、および配列番号７を含んでなるＣＤＲ３配列を含んでなる単一Ｖ_Ｈドメイン抗体、配列番号９を含んでなるＣＤＲ１配列、配列番号１０を含んでなるＣＤＲ２配列、および配列番号１１を含んでなるＣＤＲ３配列を含んでなる単一Ｖ_Ｈドメイン抗体、配列番号１３を含んでなるＣＤＲ１配列、配列番号１４を含んでなるＣＤＲ２配列、および配列番号１５を含んでなるＣＤＲ３配列を含んでなる単一Ｖ_Ｈドメイン抗体、配列番号１７を含んでなるＣＤＲ１配列、配列番号１８を含んでなるＣＤＲ２配列、および配列番号１９を含んでなるＣＤＲ３配列を含んでなる単一Ｖ_Ｈドメイン抗体、配列番号２１を含んでなるＣＤＲ１配列、配列番号２２を含んでなるＣＤＲ２配列、および配列番号２３を含んでなるＣＤＲ３配列を含んでなる単一Ｖ_Ｈドメイン抗体、配列番号２５を含んでなるＣＤＲ１配列、配列番号２６を含んでなるＣＤＲ２配列、および配列番号２７を含んでなるＣＤＲ３配列を含んでなる単一Ｖ_Ｈドメイン抗体、配列番号２９を含んでなるＣＤＲ１配列、配列番号３０を含んでなるＣＤＲ２配列、および配列番号３１を含んでなるＣＤＲ３配列を含んでなる単一Ｖ_Ｈドメイン抗体、配列番号３３を含んでなるＣＤＲ１配列、配列番号３４を含んでなるＣＤＲ２配列、および配列番号３５を含んでなるＣＤＲ３配列を含んでなる単一Ｖ_Ｈドメイン抗体、配列番号３７を含んでなるＣＤＲ１配列、配列番号３８を含んでなるＣＤＲ２配列、および配列番号３９を含んでなるＣＤＲ３配列を含んでなる単一Ｖ_Ｈドメイン抗体の一つから選択されてもよい。一つの実施態様において、本発明の単一Ｖ_Ｈドメイン抗体は、配列番号２５を含んでなるＣＤＲ１配列、配列番号２６を含んでなるＣＤＲ２配列、および配列番号２７を含んでなるＣＤＲ３配列、を含んでなる。

一つの実施態様において、前記単一Ｖ_Ｈドメイン抗体は配列番号４、８、１２、１６、２０、２４、２８、３２、３６、または４０から選択される配列を含んでなる、またはからなる。一つの実施態様において、単一Ｖ_Ｈドメイン抗体は配列番号４、８、１２、１６、２０、２４、２８、３２、３６、または４０から選択される配列、または少なくとも７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％のそのホモロジーであるが、ここでＣＤＲ２への変更は行われていない配列から選択される配列、を含んでなる、またはからなる。一つの実施態様において、前記単一Ｖ_Ｈドメイン抗体は、配列番号２、６、１０、１４、１８、２２、２６、３０、３４または３８のいずれかに特定されるようなＣＤＲ２を含んでなる。一つの実施態様において、前記ＣＤＲ２は配列番号２６である。一つの実施態様において、前記修飾はＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ３、ＦＲ３、ＦＲ４にある。一つの実施態様において、単一Ｖ_Ｈドメイン抗体は、配列番号４、８、１２、１６、２０、２４、２８、３２、３６、または４０を含んでなる、またはからなるＶ_Ｈドメインを有する。一つの実施態様において、結合分子は、Ｖ_Ｈ単一ドメイン抗体１．２１、１．２２、１．２３、１．２４、１．２５、１．２６、１．２７、１．２８、１．２９または１．３０から選択される。一つの実施態様において、単一Ｖ_Ｈドメイン抗体は、配列番号２８を含んでなる、またはからなるＶ_Ｈドメインを有する。

したがって、いくつかの実施態様において、本発明はまた、表１ａにおいて示されるように親分子１．２１〜１．３０の多様体である多様体Ｖ_Ｈ単一ドメイン抗体を提供し、ここでこれらの多様体は、ＣＤＲ２配列において修飾を有さない。前記多様体は１つまたはそれ以上のアミノ酸置換、欠失、挿入または他の修飾を有し、およびそれは、親単一ドメイン抗体の生物的機能を保持する。したがって、多様体Ｖ_Ｈ単一ドメイン抗体はヒトＰＳＭＡへの結合を保持している。親単一ドメイン抗体は多様体に到達するために設計された配列となることができる。修飾は、天然配列Ｖ_Ｈ単一ドメイン抗体またはポリペプチドと比較したように、アミノ酸配列において変化という結果をもたらす、１つまたはそれ以上の単一ドメイン抗体またはポリペプチドをコードしたコドンの１つまたはそれ以上の置換、欠失または挿入を含んでもよい。アミノ酸の置換は、ロイシンとセリンの置き換え、つまり、保存的アミノ酸置換のように、一つのアミノ酸と同様の構造および／または化学的特性を有する他のアミノ酸の置き換えの結果であることができる。挿入または欠失は、任意に、約１〜５個のアミノ酸の幅の中であってもよい。許される多様性は、体系的に前記配列におけるアミノ酸の挿入、欠失または置換が作製される、および全長または成熟した天然配列により示される活性のために結果多様体を試験することにより決定されてもよい。ここで使用されるように、Ｖ_Ｈ単一ドメイン抗体の多様体は、一般的に、非多様体分子に対して少なくとも７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の配列ホモロジーを有しており、好ましくは、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の配列ホモロジーを有している。表１ａにおいて示されるように、Ｖ_Ｈ単一ドメイン抗体の多様体は、好ましくは、ＣＤＲ２領域においていかなる修飾も有していない。

一つの実施態様において、本発明は配列番号４１または４８に規定するようにＶ_Ｈ単一ドメイン抗体を包含しており、およびそれは６２および６３の部位で修飾を有しているが、５５および５６の部位では修飾は有していない。６２および６３の部位で残基ＤＳは、例えば、ＡＴ、ＤＦ、ＤＮ、ＤＡ、ＡＤ、ＤＶ、ＡＦ、ＤＴ、ＤＡ、ＡＳまたはＡＹで修飾されてもよい。

一つの実施態様において、多様体における修飾は保存的配列修飾である。ここで使用されるように、用語「保存的配列修飾」は、アミノ酸配列を含有する抗体の結合特性に大きくは影響しない、または変更しないアミノ酸修飾を参照することが意図されている。前記保存的修飾は、アミノ酸置換、付加および欠失を含んでなる。修飾は、当該技術において知られている、部位特異的変異導入およびＰＣＲ媒介変異導入等の標準的な技術により、本発明の抗体に導入されることができる。保存的アミノ酸置換は、その中で、アミノ酸残基が、同様の側鎖を有しているアミノ酸残基と置き換えられているものである。同様の側鎖を有するアミノ酸残基のファミリーが当該技術において規定されている。これらのファミリーには、塩基性側鎖を持つアミノ酸（例えば、リジン、アルギニン、ヒスチジン）、酸性側鎖を持つアミノ酸（例えば、アスパラギン酸、グルタミン酸）、非荷電極性側鎖（例えば、グリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、トレオニン、チロシン、システイン、トリプトファン）、非極性側鎖（例えば、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン）、ベータ分岐側鎖（例えば、トレオニン、バリン、イソロイシン）および芳香族側鎖（例えば、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン）が含まれる。したがって、本発明の単一ドメイン抗体のＣＤＲ領域内の１つまたはそれ以上のアミノ酸残基は同じ側鎖ファミリーから他のアミノ酸残基と取りかえられることができ、変更された抗体は、ここで開示される機能試験を使用して、保持された機能（つまり、上で、（ｃ）〜（ｌ）において記載されている機能）のために試験されることができる。

いくつかの実施態様において、修飾されていない単一ドメイン抗体と比較したように、１つまたはそれ以上の配列修飾を含み、結合親和性、特異性、熱安定性、発現レベル、エフェクター機能、グリコシル化、減少した免疫原性、または溶解度等の特性の１つまたはそれ以上において改善点を有する、表１ａにおいて示されるそれらから選択される単一ドメイン抗体の多様体。

当業者は、ｉｎ ｖｉｔｒｏおよびｉｎ ｖｉｖｏの発現ライブラリーを含み、ここで開示されるように、抗原結合分子を特定し、獲得し、および最適化するための異なる方法があることを知るだろう。これはさらに例において開示される。ディスプレイ（例えば、リボソーム、および／またはファージディスプレイ）、および／または変異導入（例えば、エラープローン変異導入）等の当該技術において知られる最適化技術が使用されることができる。本発明は、したがって、また、ここで開示される単一ドメイン抗体の配列最適化多様体を含んでなる。

一つの実施態様において、修飾は単一ドメイン抗体の免疫原性を減少させるためにされることができる。例えば、１つのアプローチは、１つまたはそれ以上のフレームワーク残基を相当するヒト生殖細胞系配列に戻すことである。さらに具体的には、体細胞変異を受けた単一ドメイン抗体は、単一ドメイン抗体が由来されている生殖系細胞配列とは異なるフレームワーク残基を含有してもよい。前記残基は、単一ドメイン抗体フレームワーク配列と単一ドメイン抗体が由来されている生殖系細胞配列を比較することにより、特定されることができる。フレームワーク領域配列におけるアミノ酸残基の１つまたはそれ以上をそれらの生殖系配置に戻すために、例えば、部位特異的変異導入またはＰＣＲ媒介変異導入によって、体細胞変異は生殖系配列に「復帰突然変異」されることができる。

フレームワーク修飾の別の型は、Ｔ細胞エピトープを除去し、それによって抗体の潜在的な免疫原性を削減するために、フレームワーク領域内の、または１つまたはそれ以上のＣＤＲ領域内でさえも、１つまたはそれ以上の残基の変異に関与している。さらに別の実施態様において、抗体のグリコシル化が修飾される。例えば、非グリコシル化抗体が作製されることができる（つまり、抗体はグリコシル化が欠乏している）。グリコシル化は、例えば、抗原に対する抗体の親和性を増加するために、変更されることができる。前記炭水化物の修飾は、例えば、抗体配列内の１つまたはそれ以上のグリコシル化部位の変更によって、達成されることができる。例えば、１つまたはそれ以上の可変領域フレームワークグリコシル化部位の排除という結果をもたらし、それによってその部位におけるグリコシル化を排除するために、１つまたはそれ以上のアミノ酸置換はされることができる。前記非グリコシル化は抗原に対する抗体の親和性を増加してもよい。

ファミリー１、または多様体（ファミリー１様）結合分子は、好ましくは、さらにここで開示される、および例において示されるように、ＫＤ、解離速度定数、ＫＡ、ＫＤ、ＥＣ５０およびＩＣ５０の値を有する。本出願において使用されるように、用語「ＫＤ」は「平衡解離定数」を参照しており、平衡での滴定測定において、または解離速度定数（Ｋｏｆｆ）を結合速度定数（Ｋｏｎ）で割ることにより得られた値を参照している。本出願で使用されるように、「ＫＡ」は親和定数を参照している。結合速度定数、解離速度定数、および平衡解離定数は抗体の抗原への結合親和性を表すために使用されている。結合および解離速度定数を決定するための方法は当該技術において良く知られている。蛍光ベースの技術の使用は、高い感受性および平衡での生理緩衝液においてサンプルを試験する能力を提供する。ＢＩＡｃｏｒｅ（商標）（生体分子相互作用分析）試験および例において開示される試験等の他の実験的アプローチおよび器具は、本発明の結合分子を試験するために使用されることができる。

一つの側面において、本発明はまた、Ｖ_Ｈドメイン１．２１〜１．３０をコードする配列番号６１〜７０から選択される配列を含んでなる、またはからなる単離された核酸配列に関する。一つの実施態様において、配列は配列番号６７である。

核酸は、ＤＮＡおよび／またはＲＮＡを含んでもよい。一つの側面において、本発明はＣＤＲもしくはＣＤＲのセット、または上で規定されるような本発明のＶ_Ｈドメインをコードする核酸を提供する。本発明にしたがった核酸は、ＤＮＡまたはＲＮＡを含んでも良く、全体的にもしくは部分的に合成であっても、または組み替え技術により生産されてもよい。ここで記載されるように、ヌクレオチド配列が言及するものは、文脈上別段の解釈が要求される場合を除いて、特異的な配列のＤＮＡ分子を包含し、配列においてＵがＴを代替している特異的な配列のＲＮＡを包含する。

さらに、本発明は、上で規定する少なくとも一つの核酸、を含んでなる核酸構築物に関する。前記構築物は、プラスミド、ベクター、転写または発現カセットの形状においてあってもよい。本発明はまた、上で開示されるような１つまたはそれ以上の核酸構築物、を含んでなる単離された組み替え宿主細胞に関する。宿主細胞は、細菌、酵母、ウィルス、哺乳類または他の適した宿主細胞であってもよい。一つの実施態様において、細胞は大腸菌細胞である。別の実施態様において、細胞は酵母細胞である。別の実施態様において、細胞はチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞である。

ここで開示される結合分子は、１つまたはそれ以上の追加タンパク質部分との融合タンパク質として提供されてもよい。例えば、単一ドメイン抗体は、ここで開示されるが（第一部分）、第二の部分との融合として提供されてもよい。

第二の部分は、またヒトＰＳＭＡに特異的であり、したがって、二価の結合分子を提供している、Ｖ_Ｈドメインを含んでもよい。一つの実施態様において、前記結合分子は、バイパラトピックである。バイパラトピック結合分子は、異なるエピトープに結合している抗原結合部分を含んでなる。本発明のバイパラトピック結合分子は、公知技術方法を使用して、解釈されることができる。

例えば、二価の結合分子を生じるために、本発明の２つの単一ドメイン抗体は連結されていても良く、前記２つの結合分子は、本発明の結合分子の同じファミリー由来、または異なるファミリー由来でもよい。例えば、上で開示される、および例えば、表１において示されるようなファミリー１単一Ｖ_Ｈドメイン抗体、またはその多様体は、ファミリー２〜１５、またはファミリー２様〜１５様単一Ｖ_Ｈドメイン抗体と連結されていてもよい。ファミリー様単一Ｖ_Ｈドメイン抗体は、ここの他の場所でも規定されるように、多様体を参照している。本発明の一つの実施態様において、単一Ｖ_Ｈドメイン抗体１．２７（配列番号２８）として規定されるようにＶ_Ｈは、ファミリー２または３から選択される別の単一Ｖ_Ｈドメイン抗体、例えば、クローン２．１として規定されるように単一Ｖ_Ｈドメイン抗体と連結されている。２またはそれ以上の単一Ｖ_Ｈドメイン抗体はリンカー、例えば、ポリペプチドリンカーによって連結されていてもよい。例えばリンカーを含んでなる、適切なリンカーには、（Ｇｌｙ_４Ｓｅｒ）_ｎ等のＧＳ残基が含まれ、ここでｎは１〜１０であり、例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０である。

したがって、別の態様において、本発明は、表１ａにおいて示されるような、Ｖ_Ｈ１．２１〜１．３０のいずれかで示されるような、ＣＤＲ１、２または３配列でヒトＰＳＭＡと結合し得る第一の単一Ｖ_Ｈドメイン抗体、またはその多様体（好ましくは、表１ａにおいて記載されるようなＣＤＲ２配列の一つを保持している前記多様体）、およびヒトＰＳＭＡと結合し得る第二の単一Ｖ_Ｈドメイン抗体を含んでなる結合分子に関する。一つの実施態様において、前記第一の単一Ｖ_Ｈドメイン抗体は、配列番号４、８、１２、１６、２０、２４、２８、３２、３６、または４０から選択される配列を含んでなる。

一つの実施態様において、第二のＶ_Ｈドメインは、第一のＶ_Ｈドメイン同じＰＳＭＡのエピトープ、部分、ドメイン、サブユニットまたは配座に結合する。例えば、第二のＶ_Ｈドメインは、ファミリー１、５、６、１２もしくは１３、またはファミリー１、５、６、１２もしくは１３様配列から選択されてもよい。一つの実施態様において、第一のＶ_Ｈドメインは、配列番号２８を含んでなる、またはからなる。

一つの実施態様において、第二のＶ_Ｈドメインは、第一のＶ_Ｈドメインよりも、異なるＰＳＭＡのエピトープ、部分、ドメイン、サブユニットまたは配座に結合する。したがって、分子はバイパラトピックである。第二のＶ_Ｈドメインは、ファミリー２、３、４、７、９、１０、１１もしくは１４、またはファミリー２、３、４、７、９、１０、１１もしくは１４様配列から選択されてもよい。一つの実施態様において、前記第二のＶ_Ｈドメイン抗体は表２から選択される。一つの実施態様において、第一のＶ_Ｈドメインは配列番号２８を含み、第二のＶ_Ｈドメインは配列番号７１を含んでなる。一つの実施態様において、前記第二のＶ_Ｈドメイン抗体は表２から選択される。

一つの実施態様において、第一の単一Ｖ_Ｈドメイン抗体は、ＣまたはＮ末端に位置される。一つの実施態様において、前記第一および第二のＶ_Ｈドメインは、ペプチドにより共有的に結合されている。一つの実施態様において、ペプチドは、３〜５０の間のアミノ酸長である。一つの実施態様において、リンカーはグリシンおよびセリンアミノ酸残基を含んでなる。一つの実施態様において、ペプチドリンカーは式（Ｇｌｙ_４Ｓｅｒ）_ｎからなり、ここでｎは１〜１０である。

ファミリー２〜１５のファミリーメンバー（つまり、配列番号１４９〜２２６）がコードされた核酸は、配列番号６１〜７０のいずれかから選択される核酸とともに二価の結合分子の発現のための構築物において使用されることができる。

別の実施態様において、第二の部分は、二重特異性結合分子を提供するため異なる抗原に特異性がある、Ｖ_Ｈドメインまたは別の抗体小片を含んでもよい。ここで使用されるように、用語「二重特異性」は、したがって、ここで開示されるような、ＰＳＭＡに対する結合特異性を有する結合部位を有する結合分子、および第二の標的に対する結合特異性を有する結合部位を有する第二のポリペプチドドメインを含んでなるポリペプチドを参照する、つまり、二重特異性結合分子は２つの標的に対する特異性を有する。第一の標的および第二の標的は同じでない、つまり異なる標的、例えばタンパク質であり、両方とも細胞表面において存在していてもよい。したがって、ここで開示されるような二重特異性結合分子は、選択的かつ特異的に第一の標的および第二の標的を発現している（または、その細胞表面に提示している）細胞に結合することができる。別の実施態様において、結合分子は、２つ以上の抗原結合部分を含んでなる。

ここで使用されるように、用語、第一および第二は分子の配向を示していない、すなわち、第一のＶ_ＨがＣまたはＮ末端に位置されていてもよい。

別の実施態様において、多重特異的結合分子を提供しながら、２以上の部分が結合される。ここで開示される多重特異的ポリペプチド薬剤は、ＰＳＭＡへの結合に加えて、１つまたはそれ以上追加の標的に結合することができる、つまり、多重特異的ポリペプチドは、少なくとも２、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも６、またはそれ以上の標的と結合でき、ここで、多重特異的ポリペプチド薬剤は、少なくとも２、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも６、またはそれ以上の標的結合部位をそれぞれ有している。

ここで使用されるように、用語「標的」は、結合部位を有しているポリペプチドドメインが選択的に結合することができる生体分子（例えば、抗原、ペプチド、ポリペプチド、タンパク質、脂質、炭水化物）を表している。標的は、例えば、細胞内標的（細胞内タンパク質標的等）、または細胞表面標的（膜タンパク質、例えば、受容体タンパク質等）であることもできる。好ましくは、標的は、細胞表面タンパク質等の、細胞表面標的である。好ましくは、第一の細胞表面標的および第二の細胞表面標的の細胞上に存在している。一つの実施態様において、標的はがん免疫標的である。

本発明の多重特異的抗体は、公知技術方法を使用して、解釈されることができる。必要に応じて、二重特異的または多重特異的結合分子は、Ｃ_Ｈ２およびＣ_Ｈ３の１つまたは両方、および任意にヒンジ領域を含んでなる、抗体Ｆｃ領域またはその小片に結合されることができる。例えば、単一核酸配列としてＦｃ領域またはその小片に連結されている二重特異的または多重特異的結合分子がコードされているベクターは、前記ポリペプチドを調整するために使用されることができる。

一つの実施態様において、第二の部分は結合分子の半減期延長に役に立ってもよい。第二の部分は、タンパク質、例えばおよび血清アルブミン、例えばヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）またはネズミ血清アルブミン（ＭＳＡ）と結合している抗体、またはその部分、を含んでもよい。第二の部分は、血清アルブミン、例えばヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）またはネズミ血清アルブミン（ＭＳＡ）と結合しているＶ_Ｈドメインを含んでもよい。

第二の部分は血清アルブミン、例えばヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）またはＨＳＡ Ｃ３４Ｓ等のその多様体を含んでもよい。さらに、ここで開示されるような、Ｖ_ＨドメインおよびＦｃドメインを含んでなる、結合分子が提供され、例えば、ここで、前記Ｖ_ＨドメインはＦｃドメインと融合される。さらに、第二の抗原に特異的に結合し、第二の抗原がヒトＰＳＭＡ以外の抗原である、第二の可変ドメイン、を含んでなる結合分子が提供される。第二の抗原は分化クラスター（ＣＤ）分子、または主要組織適合複合体（ＭＨＣ）クラスＩＩ分子であってもよい。

一つの実施態様において、本発明の結合分子は検出可能なまたは機能的な標識で標識される。標識は、限定されるものではないが、蛍光体、放射性同位元素標識、酵素、化学発光体、核磁気共鳴活性標識、または光感受性物質を含んでなる、シグナルを生じる、または生じるために誘導されることができるいかなる分子であることもできる。したがって、結合は、蛍光または発光、放射能、酵素活性、または吸光度を検出することによって、検出および／または測定されてもよい。

さらに他の態様において、本発明の結合分子は、薬、酵素または毒素等の、少なくとも一つの治療的部分と連結している。一つの実施態様において、治療的部分は毒素、例えば、細胞毒性放射性核種、化学毒素、またはタンパク質毒素である。例えば、本発明のＰＳＭＡ結合分子はα、β、もしくはγ放射体、またはβおよびγ放射体等の放射性同位体と連結していることができる。

本発明の様々な側面および態様において使用されるような毒素は、カリケアミシン、エスペラミシン、メトトレキサート、ドキソルビシン、メルファラン、クロラムブシル、シタラビン（ＡＲＡ−Ｃ）、ビンデシン、マイトマイシンＣ、シスプラチン、エトポシド、ブレオマイシン、５−フルオロウラシル、エストラムスチン、ビンクリスチン、エトポシド、ドキソルビシン、パクリタキセル、ドセタキシル、ドラスタチン１０、アウリスタチンＥ、およびアウリスタチンＰＨＥ、から選択されてもよい。他の実施態様において、治療的部分は免疫刺激、または免疫調整剤である。

一つの側面において、本発明は、したがって、ここで開示される単一Ｖ_Ｈドメイン抗体を含んでなる免疫複合体を提供する。

一つの側面において、本発明は、式Ａ−（Ｌ−Ｄ）ｎの免疫複合体に関し、式中、Ａは、ここで開示されるように、ヒトＰＳＭＡに特異的に結合し得る、第一のヒト単一重鎖可変免疫グロブリン（Ｖ_Ｈ）ドメイン抗体を含み、任意に、ヒトＰＳＭＡに特異的に結合し得る、第二のヒト単一重鎖可変免疫グロブリン（Ｖ_Ｈ）ドメイン抗体を含み、および任意に、第三のヒト単一重鎖可変免疫グロブリン（Ｖ_Ｈ）ドメイン抗体を含んでなる、抗原結合部位であり、Ｌはリンカーであり、およびＤはアウリスタチンまたはその誘導体であり、およびｎは１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０である。

したがって、ここで開示されるようにＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列を含んでなる、単一Ｖ_Ｈドメイン抗体が、上で開示されるような免疫複合体において使用されることが可能である。前記単一ドメインＶ_Ｈドメイン抗体は、配列番号４、８、１２、１６、２０、２４、２８、３２、３６、または４０から選択される配列から選択される配列を含んでなる。一つの実施態様において、配列は配列番号２８であり、Ｖ_ＨはＶ_Ｈ１．２７である。一つの実施態様において、前記第二の単一ドメインＶ_Ｈドメイン抗体はファミリー２から選択される。

一つの実施態様において、ＤはＭＭＡＥ、ＭＭＡＦまたはそれらの誘導体である。一つの実施態様において、Ｄはバリン−シトルリン（ｖｃ）リンカーを介して抗原結合部位に複合されたＭＭＡＥ（ｖｃ−ＭＭＡＥ）、またはその誘導体である。一つの実施態様において、Ｄはマレイミドカプロイルリンカーを介して抗原結合部位に複合されたＭＭＡＦ（ｍｃ−ＭＭＡＦ）、またはその誘導体である。一つの実施態様において、Ｄはベドチンまたはマフォドチンである。

本発明の免疫複合体は、好ましくは、式Ａ−（Ｌ−Ｄ）ｎであり、式中Ａはアウリスタチンまたはその誘導体である。一つの実施態様において、ＤはＭＭＡＥ、ＭＭＡＦまたはそれらの誘導体である。

アウリスタチンは、抗腫瘍性天然物ドラスタチンの合成アナログである。アウリスタチンはチュブリンの重合反応を阻害することにより細胞分裂を阻害し、抗体−医薬複合体において、毒性低分子薬剤（payloads）として使用されている。アウリスタチンのファミリーには、モノメチルアウリスタチンＥ（ＭＭＡＥ）およびモノメチルアウリスタチンＦ（ＭＭＡＦ）が含まれる。前臨床モデルにおいて、アウリスタチンは、伝統的に使用される化学療法と比較して１００〜１０００倍効果があることが見出されている。

ＭＭＡＥおよびベドチン
モノメチルアウリスタチンＥ（ＭＭＡＥ、デスメチル−アウリスタチンＥ）は、ＩＵＰＡＣ名が（Ｓ）−Ｎ−（（３Ｒ，４Ｓ，５Ｓ）−１−（（Ｓ）−２−（（１Ｒ，２Ｒ）−３−（（（１Ｓ，２Ｒ）−１−ヒドロキシ−１−フェニルプロパン−２−イル）アミノ）−１−メトキシ−２−メチル−３−オキソプロピル）ピロリジン−１−イル）−３−メトキシ−５−メチル−１−オキソヘプタン−４−イル）−Ｎ，３−ジメチル−２−（（Ｓ）−３−メチル−２−（メチルアミノ）ブタンアミド）ブタンアミドである、合成抗有糸分裂性抗腫瘍性薬剤である。

モノメチルアウリスタチンＥまたはＭＭＡＥは、ドキソルビシンよりも１００〜１０００倍効果があるが、その毒性は、それ自身薬として使用されることができないほどである。しかしながら、抗体−医薬複合体またはＡＤＣの一部として使用されており、ここで、ＭＭＡＥは、癌細胞において発現している特異的なマーカーを認識し、ＭＭＡＥを癌細胞に向けるモノクローナル抗体（ｍＡｂ）と結合されている。

ＭＭＡＥは毒性であるため、ＭＭＡＥを癌細胞に向けるためのモノクローナル抗体（ｍＡｂ）が複合された時のみ、治療用として使用されている。ＭＭＡＥ−ｍＡｂ複合体のための国際一般名において、名称「ベドチン」は、その抗体への連結構造を加えたＭＭＡＥを示している。標的となっているｍＡｂがＭＭＡＥに結合している構造には、付着グループ（マレイミド（ｍａｌ）およびカプロン酸（ｃａｐ））、スペーサー（４−アミノ安息香酸）およびカテプシン切断型リンカー（アミノ酸バリン（Ｖａｌ）およびシトルリン（Ｃｉｔ））が含まれてもよい。

ＭＭＡＥとモノクローナル抗体を連結するテザーは細胞外液において安定であるが、抗体−医薬複合体が標的にされた癌細胞抗原に結合し、癌細胞に流入するとすぐに、カテプシンにより切断され、その後、ＡＤＣが毒性のＭＭＡＥを放出し、強い抗有糸分裂メカニズムを活性化する。抗体−医薬複合体は、抗体の抗腫瘍効果を増強し、非常に強力な細胞毒性薬剤の全身の副作用を低減する。

ＭＭＡＦおよびマフォドチン
モノメチルアウリスタチンＦ（ＭＭＡＦ、デスメチル−アウリスタチンＦ）は合成抗腫瘍薬剤である。ＭＭＡＦのＩＵＰＡＣ名は（Ｓ）−２−（（２Ｒ，３Ｒ）−３−（（Ｓ）−１−（（３Ｒ，４Ｓ，５Ｓ）−４−（（Ｓ）−Ｎ，３−ジメチル−２−（（Ｓ）−３−メチル−２−（メチルアミノ）ブタンアミド）ブタンアミド）−３−メトキシ−５−メチルヘプタノイル）ピロリジン−２−イル）−３−メトキシ−２−メチルプロパンアミド）−３−フェニルプロパン酸、である。

ＭＭＡＦは、ボルセツズマブマフォドチンおよびＳＧＮ−ＣＤ１９Ａ等のいくつかの実験的な抗腫瘍抗体−医薬複合体において使用される毒性低分子薬剤である。ＭＭＡＦ−抗体−複合体の国際一般名において、名称マフォドチンは、その抗体への付着構造を加えたＭＭＡＦを表している。付着グループはマレイミドおよびカプロン酸からなってもよい。

アウリスタチンおよびＡＤＣの部分としてのそれらの使用は、「Ｒｅｃｅｎｔ Ａｄｖａｎｃｅｓ ｉｎ ｔｈｅ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｏｆ Ｎｅｗ Ａｕｒｉｓｔａｔｉｎｓ： Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｉｎ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｄｒｕｇ Ｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ」、Ｍｏｌ． Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃｓ， ２０１５， １２ （６）， ｐｐ １７９８−１８１２において、ＭａｄｅｒｎａおよびＬｅｖｅｒｅｔｔにより評価されている。Ｍｅｎｄｅｌｓｏｈｎ等著、「Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎ ｏｆ Ｈｙｄｒｏｐｈｉｌｉｃ Ａｕｒｉｓｔａｔｉｎ Ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅｓ ｆｏｒ Ｕｓｅ ｉｎ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｄｒｕｇ Ｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ」、Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍ、Ａｒｔｉｃｌｅ ＡＳＡＰ ＤＯＩ： １０．１０２１／ａｃｓ．ｂｉｏｃｏｎｊｃｈｅｍ．６ｂ００５３０、公開日（ウェブ）２０１７年１月６日は、ピリジンおよび他の塩基性アミンを含有する天然物ドラスタチン１０の誘導体を開示しており、より親水性のアウリスタチン誘導体がＡＤＣで使用するのに十分強力であることを評価するために調査されている。ピリジン誘導体、モノメチルアウリスタチンＰＹＥ、は、ｉｎ ｖｉｖｏで試験された時に、最も高い効果を示した。

本発明の免疫複合体、組成物および方法は、モノメチルアウリスタチンＥ （ＭＭＡＥ）またはモノメチルアウリスタチンＦ（ＭＭＡＦ）またはそれらの誘導体である、アウリスタチンを特徴としてもよい。

ＭＭＡＥは、バリン−シトルリン（ｖｃ）リンカーを介して抗原結合部位に複合されてもよい（ｖｃ−ＭＭＡＥ）。ＭＭＡＦは、ＨｉＰＥＧ^TM技術（ＷＯ２００９／０４７５００； Ｃｏｎｇ ｅｔ ａｌ．，（２０１２）Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍ．２０１２，２３，２４８−２６３）を使用して、マレイミドカプロイルリンカーを介して抗原結合部位に複合されている（ｍｃ−ＭＭＡＦ）。

したがって、一つの実施態様において、Ｄはバリン−シトルリン（ｖｃ）リンカーを介して抗原結合部位に複合されたＭＭＡＥまたはそれらの誘導体である（ｖｃ−ＭＭＡＥ）。別の実施態様において、Ｄはマレイミドカプロイルリンカーを介して抗原結合部位に複合されたＭＭＡＦまたはそれらの誘導体である（ｍｃ−ＭＭＡＦ）。別の実施態様において、Ｌ−Ｄはベドチンまたはマフォドチンである。Ｌ−Ｄはまた、一つまたはそれ以上のＡおよびＬ−Ｄを連結するＨアミノ酸を含んでもよい。

免疫複合体は、さらに毒性部位、標識、半減期延長または他の部位を含んでもよい。

また、それらを必要としている対象への前記免疫複合体の投与を含んでなる処置の方法も、本発明の範囲内である。さらに、ＰＳＭＡの発現に関連する癌、前立腺癌または前立腺障害の処置のための薬剤の製造において、免疫複合体は使用されてもよい。本発明はまた、ここで開示されるような疾患の処置のために、上で開示されるような免疫複合体に関する。

本発明のＰＳＭＡ結合分子の毒性複合体は、好ましくは、ピコモル濃度において、ＰＳＭＡ発現細胞の特異的細胞殺滅を媒介する。

別の側面において、本発明のＰＳＭＡ結合分子は、例えば化学修飾により、特に、ＰＥＧ化により、またはリポソームへの組み入れにより、または血清アルブミンタンパク質を使用して、半減期を増加させるために修飾される。

一つの実施態様において、本発明の結合分子は共有結合的に修飾される。用語「共有結合的に修飾された／共有結合的な修飾」は、本発明にしたがった、例えば、ここでの特異的な配列の、結合分子の修飾、有機タンパク性または非タンパク性誘導化剤とあわせた、非相同ポリペプチド配列への融合、および翻訳後修飾、を含んでなる。例えば、特異的な配列の、共有結合性の修飾されたペプチドは、さらに、ここで開示されるような機能的特性、例えば、ヒトＰＳＭＡと結合する能力を有する、または、共有結合性の修飾は、一般的に、標的とされたアミノ酸残基と、選択された側鎖または末端残基と反応する能力がある有機誘導化剤が反応することにより、または選択された組み替え宿主細胞において機能している翻訳後修飾のメカニズムを利用することにより、導入される。特定の翻訳後修飾は、発現されたポリペプチドにおける組み替え宿主細胞の活動の結果である。グルタミニルおよびアスパラギニル残基は、しばしば、翻訳後に、相当するグルタミルおよびアスパルチル残基に脱アミド化される。あるいは、これらの残基は弱酸性条件の下、脱アミド化される。他の翻訳後修飾は、プロリンおよびリジンのヒドロキシル化、セリル、チロシンまたはトレオニル残基のヒドロキシルグループのリン酸化、リジン、アルギニンおよびヒスチジン側鎖の［アルファ］アミノグループのメチル化、を含んでなる。共有結合性の修飾は、例えば、本発明にしたがった、例えば、イムノアドヘシン等の特定の配列およびそれらのアミノ酸配列の多様体、ＰＳＭＡ結合分子を含んでなる融合タンパク質、および非相同性のシグナル配列へのＮ末端融合を含んでなる。

本発明の結合分子は、さらに以下で開示されるような特定の機能的特性を有している。これらのおよび他の、本発明の結合分子の薬学的な活性は、例えば、当該技術において開示されるような標準的な試験法において実証されてもよい。

本発明の結合分子は、前立腺特異的膜抗原とともに細胞に内在化されうる。本発明の結合分子は、特異的に、ヒトＰＳＭＡの細胞外ドメインにおけるエピトープに結合する。一つの実施態様において、本発明の結合分子は特異的に、その二量体形におけるＰＳＭＡに結合する。本発明の結合分子は毒性部分と融合されることができ、ＰＳＭＡ発現前立腺または癌細胞を除去または殺滅するために使用されることができる。

本発明の結合分子は、腫瘍細胞または前立腺細胞等、例（例７ｂおよび表１８および１９参照）において示されるようなヒトＰＳＭＡ発現ＣＨＯ細胞、ＬＮＣａＰ細胞等の生きた細胞に結合することができる。さらなる側面において、本発明は、好ましくは、ＦＭＡＴ結合試験において測定されるような、１００ｎＭまたはより低い値の平均ＥＣ５０値等の１００ｎＭ〜１００ｐＭの間のＥＣ５０値で、さらに好ましくは８０、７０、６０、５０、４０、３０、２０、１０、５ｎＭ以下等の、または４、３、２または１ｎＭ以下等のより低い値、または５００、４００、３００、２００、１００ｐＭ以下等のより低い値、または４ｐＭ以下等のより低い値等の９０ｎＭまたはより低い値での平均ＥＣ５０値で、ＰＳＭＡと結合する単一ドメイン抗体を提供する。特に、ＥＣ５０値は表１９において示されている。一つの実施態様において、本発明の結合分子は特異的にヒトＰＳＭＡおよびカニクイザルＰＳＭＡに結合し得る。

効力は通常は、特に明記しない限り、ｎＭ でＩＣ_５０値のように発現される。機能試験において、ＩＣ_５０は、その最大値の５０％までに生体反応を低減する結合メンバーの濃度である。結合メンバー濃度の対数の関数として最大の生物反応の％をプロットすることにより、およびＩＣ_５０値を生じるためにシグモイド関数をデータに適合させるためのソフトウェアプログラムを使用して、ＩＣ_５０は計算されてもよい。ＩＣ_５０を測定するための方法は当該技術においてよく知られている。例えば、ＩＣ_５０を決定するために、ＨＩＳ ＺＡＰ細胞殺滅試験がＩＣ_５０を決定するために作用されてもよい。ＥＣ_５０は半分の最大の有効濃度を示す。

別の側面において、本発明は、ＰＳＭＡ、好ましくはヒトＰＳＭＡに対して向けられた少なくとも１つの免疫グロブリン単一ドメイン抗体を含んでなる、またはからなる結合分子に関し、ここで前記ドメインはヒトＶ_Ｈドメインであり、例において開示されるように試験された時に、約０．２〜約１０００ｎＭまたはそれ以上、例えば、０．２〜９００、０．２〜８００、０．２〜７００、０．２〜６００、０．２〜５００、０．２〜４００、０．２〜３００、０．２〜２００、０．２〜１００、０．２〜５０、０．２〜４０、０．２〜３０、０．２〜２０、０．２〜１０、０．２〜９、０．２〜８、０．２〜７、０．２〜６、０．２〜５、０．２〜４、０．２〜３、０．２〜２、０．２〜１のＩＣ_５０を有する。

加えて、ＰＳＭＡに結合するための本発明のＰＳＭＡ結合分子の結合動力学および親和性（平衡解離定数、ＫＤとして表現された）は、例えば、ＢＩＡｃｏｒｅ（商標）またはＯｃｔｅｔ等の表面プラズモン共鳴を使用して、決定されても良く、またはＫＤはｐＡ２分析より見積もられてもよい。特に、本発明の分子は非常に効果がある（つまり、実験部分においてｐＭの幅において測定されるようなＥＣ５０値）。

さらなる側面において、本発明は、ここで開示されるような単一ドメイン抗体を提供し、ここで前記ｓｄＡｂは前記ＰＳＭＡに、９０ｎＭまたはより低い平均ＫＤ値等の１００ｎＭ〜１０ｐＭの間の平均ＫＤ値で、より好ましくは７０、６０、５０、４０、３０、２０、１０、５ｎＭ以下等の、または４、３、２または１ｎＭ以下等、５００、４００、３００、２００、１００、９０、８０、７０、６０、５０、４０、３０、２０ｐＭ以下等のより低い値、または１０ｐＭ以下等のより低い値等の８０ｎＭまたはより低い平均ＫＤ値で、結合する。好ましくは、ＫＤは例（例８ｂ）において示されるように決定される。

一つの実施態様において、本発明にしたがった結合分子は、少なくとも約１０^７Ｍ^−１、好ましくは約１０^９Ｍ^−１、およびより好ましくは約１０^１０Ｍ^−１〜１０^１１Ｍ^−１またはそれ以上の親和定数で、ＰＳＭＡへの結合親和性を有する。一つの実施態様において、本発明にしたがった結合分子は１．００Ｅ＋０４〜１．００Ｅ＋６（１／Ｍｓ）のＫｏｎを有する。一つの実施態様において、本発明にしたがった結合分子は１．００Ｅ−０３〜１．００Ｅ−０５（１／ｓ）のＫｏｆｆを有する。

本発明の結合分子は、熱および血清安定性を含んでなる優良な安定性を示す（例参照）。さらに、本発明の結合分子は、例において示されるように急速な腫瘍標的化を示す。さらに、本発明の結合分子はまた、ヒトＰＳＭＡに対する高い特異性および非標的組織における低い取り込みを示す（例参照）。

一つの実施態様において、本発明の結合分子は早い血液クリアランスを示す。一つの実施態様において、本発明の結合分子は低い腎臓滞留を示す。一つの実施態様において、結合分子は、例えば競合的に、別の抗体、例えばＪ５９１のヒトＰＳＭＡへの結合を阻害できる。

一つの実施態様において、ここで規定されるように本発明の結合分子は、次の非限定的なリストから選択される１つまたはそれ以上の特性を有していてもよい。
ａ）腫瘍細胞の表面において生じているその天然型においてヒトおよび／またはカニクイザル前立腺特異的膜抗原への高い親和性
ｂ）腫瘍細胞による内在化
ｃ）非標的組織における低い取り込み
ｄ）急速な腫瘍標的化
ｅ）ＬＮＣａＰ細胞への強い結合、しかし、前立腺特異的膜抗原の発現が欠落している細胞へは、ない、または最小限のみ。および／または
ｆ）ＰＳＭＡにおける特異なエピトープへの結合

ｉｎ ｖｉｔｒｏ発現ライブラリーを使用して、ここで開示されるポリペプチド、核酸、宿主細胞、生成物、および組成物の調整または発生のための方法は、次の工程を含んでなることができる。
ａ）アミノ酸配列をコードする核酸配列の、一組のコレクションまたはライブラリーの提供
ｂ）前記組の、ＰＳＭＡに結合することが可能である／ＰＳＭＡに親和性を有するアミノ酸配列のためのコレクションまたはライブラリーのスクリーニング
ｃ）ＰＳＭＡに結合することが可能である／ＰＳＭＡに親和性を有するアミノ酸配列の単離

上記方法において、一組のアミノ酸配列のコレクションまたはライブラリーは、スクリーニングを円滑にするために、ファージ、ファージミド、リボソームまたは安定な微生物（酵母等）において提示されてもよい。アミノ酸配列（一組の、コレクションまたはライブラリー）の提示およびスクリーニングのための適切な方法、技術、および宿主生物は当該技術における当業者に対して明確であるだろう（例えば、Ｐｈａｇｅ Ｄｉｓｐｌａｙ ｏｆ Ｐｅｐｔｉｄｅｓ ａｎｄ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ； 第１版 （１９９６年１０月２８日） Ｂｒｉａｎ Ｋ． Ｋａｙ、Ｊｉｌｌ Ｗｉｎｔｅｒ、Ｊｏｈｎ ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙ参照）。

ここで開示される結合分子は、V_Hドメインを備えた重鎖抗体を含めて、トランスジェニック齧歯類、例えばマウス、において発現されることができる。トランスジェニック齧歯類、例えばマウス、は内因性抗体遺伝子を発現するための減少した能力を有していてもよい。したがって、一つの実施態様において、齧歯類は内因性軽および／または重鎖抗体遺伝子を発現するための減少した能力を有している。齧歯類は、したがって、機能的な軽および／または重鎖が生成されないために、内因性軽および／または重鎖抗体遺伝子の発現を欠損するための修飾を含んでいてもよい。

本発明の別の側面において、本発明にしたがったPSMA結合分子、および任意に、薬学的に許容可能な担体を含んでなる医薬組成物が提供される。本発明の結合分子、または組成物はいかなる便利な経路によっても投与されることができる。化合物は、経口および非経口投与を含んでなる、いかなる経路によって投与されてもよい。非経口投与は、例えば、静脈内、筋肉内、動脈内、腹腔内、鼻腔、直腸、膀胱内、皮内、局所または皮下投与、を含んでなる。組成物は１つまたはそれ以上の単位剤形の形を取ってもよい。

本発明の組成物は液体、例えば、溶液、エマルションまたは懸濁液の形状であることができる。液体は注射、注入（例えば、IV注入）または皮下の送達のために有用であることができる。本発明の液体組成物は、それらが液体、懸濁液または他の同様な形式であろうと、また１つまたはそれ以上の以下、水、食塩水、好ましくは生理食塩水、リンガー溶液、等張食塩水等の滅菌希釈剤、合成モノまたはジグリセリド、ポリエチレングリコール、グリセリンまたは他の溶媒等の不揮発性油、ベンジルアルコールまたはメチルパラベン等の防腐剤、塩化ナトリウムまたはデキストロース等の張度を調整するための薬剤を含んでなることができる。組成物はガラス、プラスチックまたは他の素材製のアンプル、ディスポーザブルシリンジまたは多人数用バイアル内に封入されることができる。

特定の実施態様において、１つまたはそれ以上の本発明の結合分子、または組成物を、局所的に処置が必要とされる領域に、または静脈内注射または注入によって、投与することが望ましいだろう。

特定の障害または条件の処置において有効／活性である本発明の結合分子の量は、障害または条件の性質に依存し、標準的な臨床技術によって決定されることができる。加えて、in vitroまたはin vivoの試験は任意に最適な用量範囲の同定に役立つために用いられることができる。組成物において用いられるために正確な量はまた、投与経路および、疾患または障害の重症度に依存し、医師の判断および各患者の状況にしたがって決定されるべきである。

本発明の組成物は、適切な投与量が得られるように本発明の結合分子の有効量を含んでなる。化合物の正確な投与量は、特定の処方、適用の様式、その特定の部位、宿主、および処置される疾患にしたがって変わるだろう。年齢、体重、性別、食事、投与時間、排泄率、宿主の状況、薬剤の組合せ、反応の感受性および疾患の重篤度のような他の要因も考慮されるべきである。投与は継続的または定期的に最大耐量内で行われることができる。

典型的に、この量は、組成物の重量に対して、本発明の結合分子の少なくとも約0.01%である。

本発明の好ましい組成物は、非経口単位用量が本発明の結合分子の重量約０．０１％〜約２％を含有するように、調整される。

静脈内投与のために、組成物は典型的に、動物の体重の約０．１ｍｇ／ｋｇ〜約２５０ｍｇ／ｋｇ、好ましくは、動物の体重の約０．１ｍｇ／ｋｇ〜約２０ｍｇ／ｋｇの間、およびより好ましくは、動物の体重の約１ｍｇ／ｋｇ〜約１０ｍｇ／ｋｇ、含んでなることができる。

本組成物は、エアロゾル、スプレー、懸濁液または使用のためのいかなる他の適切な形等の適切な担体の形を取ることができる。適切な医薬担体の他の例が、Ｅ．Ｗ．Ｍａｒｔｉｎにより、“Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ”において開示されている。

医薬組成物は、医薬技術においてよく知られた方法論を使用して、調整されることができる。例えば、注射により投与されることが意図された組成物は、本発明の結合分子を、溶液を形成するために水と組み合わせることにより調整されることができる。界面活性剤が均質な溶液または懸濁液の形成を促進するために添加されることができる。

本発明はさらに、本発明の結合分子の患者への投与、を含んでなる、癌、特に前立腺癌の予防および／または処置のための方法に関し、前記方法は本発明の結合分子のおよび／または医薬組成物の医薬的に活性な量の、それを必要としている対象への、投与を含んでなる。特に、本発明は癌、特に前立腺癌の予防および／または処置のための方法に関し、前記方法は本発明の結合分子のまたは医薬組成物の医薬的に活性な量の、それを必要としている対象への、投与を含んでなる。

本発明はまた、疾患の処置における使用のための、本発明の結合分子に関する。本発明はまた、癌、特に前立腺癌または前立腺障害の処置における使用のための、本発明の結合分子に関する。「前立腺癌」は全ての段階および、前立腺の組織より生じた癌の全ての形状を参照している。本発明はまた、ＰＳＭＡの異常な発現により特徴付けられる疾患の処置に関する。

別の側面において、本発明は、疾患の処置における、本発明の結合分子の使用に関する。別の側面において、本発明は、癌、特に前立腺癌または前立腺障害の処置のための薬剤の製造における、本発明の結合分子の使用に関する。

本発明の結合分子はまた、癌、特に前立腺癌または前立腺障害の処置、予防または改善のために有用である。前立腺障害は、男性の生殖システムにおいて前立腺を痛めるいかなる疾患も参照している。前立腺は精巣のホルモン分泌に依存している。ＰＳＭＡの発現は他の癌、より具体的には、これらの癌に関連する血管新生において検出されている。淡明細胞型腎細胞、膀胱移行細胞、精巣胎児性、神経内分泌、結腸および乳房、および異なる型の悪性腫瘍を含んでなる広範囲の癌は、一貫しておよび強く、それらの血管新生において、ＰＳＭＡを発現することが見出された。

本発明の結合分子は、唯一の有効成分としてまたは１つまたはそれ以上の他の治療的および／または細胞毒性部分との組合せで投与されてもよい。一つの実施態様において、結合分子は毒性部分に複合されてもよい。

前立腺障害、例えば、前立腺癌の治療において、抗ＰＳＭＡ結合分子は既存の治療と組み合わせて使用されることができる。一つの実施態様において、単一ドメイン抗体は、既存の治療または治療薬剤、例えば、抗がん治療と組み合わせて使用される。したがって、別の側面において、本発明はまた、単一ドメイン抗体または本発明の医薬組成物の投与、および抗がん治療を含んでなる組み合わせ治療を参照する。抗がん治療は、治療薬剤または放射線治療を含んでも良く、遺伝子治療、ウィルス療法、ＲＮＡ治療骨髄移植、ナノセラピー、標的化抗がん治療または腫瘍崩壊薬を含んでなる。他の治療薬剤の例は、他のチェックポイント阻害剤、抗腫瘍薬、免疫原性物質、減弱された癌細胞、腫瘍抗原、腫瘍由来抗原または核酸でパルスした樹状細胞等の抗原提示細胞、免疫刺激サイトカイン（例えば、ＩＬ−２、ＩＦＮａ２、ＧＭ−ＣＳＦ）、標的化された低分子または生体分子（シグナル伝達経路の部分、例えば、チロシンキナーゼのモジュレーターおよびチロシンキナーゼ受容体の阻害薬、およびＥＧＦＲアンタゴニストを含んでなる腫瘍特異的抗原に結合する薬剤等）、抗炎症薬、細胞毒性薬、放射性毒性薬剤、または免疫抑制剤および免疫刺激サイトカイン（例えば、ＧＭ−ＣＳＦ）をコードした遺伝子がトランスフェクトされた細胞、化学療法を含んでなる。一つの実施態様において、単一ドメイン抗体は手術と組み合わせて使用される。本発明の結合分子は、他の治療のように、例えば、一斉に、別々に、または順次、同じまたは異なる時間に投与されてもよい。

別の側面において、本発明は、本発明の結合分子を含んでなる診断、処置、予後またはモニタリングのため前立腺癌の検出のためのキットを提供する。キットはまた、使用説明書を含んでもよい。キットは上で開示されるように本発明の標識された結合分子および１つまたはそれ以上の標識検出のための部分を含んでもよい。別の側面において、本発明は、凍結乾燥された形状で包装された、または水性媒体において包装された本発明の結合分子を提供する。

本発明はまた、本発明の結合分子を使用する検出方法に関する。ヒトＰＳＭＡへ結合する能力を考慮して、ヒトＰＳＭＡ結合分子は、ここで開示されるように、酵素結合免疫吸着試験法（ＥＬＩＳＡ）、放射免疫測定法（ＲＩＡ）または組織免疫組織化学等の従来の免疫学測定法を使用して、ＰＳＭＡを検出するために（例えば、血清または血漿等の生物学的サンプルにおいて）使用されることができる。特に、本発明はまた、癌、特に前立腺癌の予後の診断またはモニタリングのためのｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｉｎ ｖｉｖｏでの方法に関する。ｉｎ ｖｉｔｒｏでの方法は、試験サンプルにおいてＰＳＭＡタンパク質の存在を検出すること、およびこれを通常対象からの、または標準値、または通常対象のための標準値幅とあわせた、対照サンプルと比較すること、を含んでなる。サンプルは血液、血漿、血清、精液、尿、または組織生検から選択されてもよい。

方法は、（ａ）サンプル（および任意に、参照、陽性および／または陰性対照サンプル）の本発明のＰＳＭＡ結合分子との接触、および（ｂ）ＰＳＭＡに結合している結合分子またはサンプルにおける未結合の結合分子のいずれかを検出し、それにより生物学的サンプルにおけるＰＳＭＡを検出、を含んでもよい。結合分子は、直接的にまたは間接的に、結合のまたは未結合の抗体の検出を円滑にするために検出可能な物質で標識されることができる。適切な検出可能な物質は、様々な酵素、補欠分子族、蛍光物質、発光物質、放射性物質を含んでなる。

Ｉｎ ｖｉｖｏでの方法は、例えば、対象においてのイメージングによりＩｎ ｖｉｖｏでのＰＳＭＡの存在を検出すること、を含んでもよい。この方法において、本発明のＰＳＭＡ結合分子は結合を検出するために標識される。

本発明の結合分子への標識の代わりに、ヒトＰＳＭＡは、生体液において、検出可能な物質で標識されたＰＳＭＡ標準品および非標識ヒトＰＳＭＡ結合分子を活用している競合的免疫学測定法により試験されることができる。この試験において、生物学的サンプル、標識されたＰＳＭＡ標準品およびヒトＰＳＭＡ結合分子は組み合わせられ、非標識結合分子に結合された標識化されたＰＳＭＡ標準品の量が決定される。生物学的サンプルにおけるヒトＰＳＭＡの量は、逆に、ＰＳＭＡ結合分子に結合された標識化されたＰＳＭＡ標準品に比例する。同様に、ヒトＰＳＭＡはまた、生体液において、検出可能な物質で標識化されたＰＳＭＡ標準品および非標識ヒトＰＳＭＡ結合分子とあわせて活用している競合的免疫学測定法により試験されることができる。

ここで開示される結合分子は、例えば、ＰＳＭＡを含有する細胞培養物において、ＰＳＭＡ、ここで開示される結合分子はそれで交さ反応しているが、を有するヒト被験者または他の哺乳類の被験体において、ＰＳＭＡ活性を阻害するために使用されることができる。一つの実施態様において、ＰＳＭＡ活性が阻害され、または増加されるようなＰＳＭＡとここで開示される結合分子の接触を含んでなる、ＰＳＭＡ活性を阻害または増加するための方法が提供される。例えば、ＰＳＭＡを含有する、または含有することが疑われる細胞培養物において、ここで開示される結合分子は、培養において、ＰＳＭＡ活性を阻害するために、培養培地に添加されることができる。

したがって、一つの実施態様において、本発明はまた、ＰＳＭＡが発現している細胞、例えば、癌性または非癌性前立腺細胞を除去または殺滅する方法に関する。本発明の方法は、細胞を除去または殺滅するために十分な量において、細胞と本発明のＰＳＭＡ結合分子の接触、を含んでなる。方法は、例えば、ｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｅｘ ｖｉｖｏでの、培養において、細胞において使用されることができる。

ここで特に定義されていない限り、本開示に関連して使用されている科学および技術用語は、当該技術における通常の技術のそれらによって、一般的に理解される意味を有するべきである。前述の開示は、この発明の製造および使用の方法、それらのベストモードも同様に含んでなる本発明の範囲内に含まれる保護対象の一般的な詳細な説明を提供する一方で、さらに当業者のこの発明の実行、およびその完全な書面による詳細な説明を可能にするために、次の例が提供される。しかしながら、当業者は、これらの例の詳細は本発明の限定として読まれるべきでなく、その範囲は、本開示に添付されたクレームおよびその均等物から把握されるべきであると評価するだろう。本発明の様々なさらなる側面および実施態様は、本開示を考慮することにより当業者には明らかであろう。

本明細書で言及されるすべての文書は、遺伝子アクセッション番号への参照を含め、その全体が引用により、本明細書の開示の範囲とされる。

「および／または」は、ここで使用される場合、２つの特定の特徴または構成要素のそれぞれの特定の開示として、他方の有無にかかわらず解釈されるべきである。例えば、「Ａおよび／またはＢ」は、それぞれがここで個別に示されるように、（ｉ）Ａ、（ｉｉ）Ｂおよび（ｉｉｉ）ＡおよびＢのそれぞれの特定の開示とみなされるべきである。文脈上特段の指示がない限り、上記の特徴の説明および定義は本発明の特定の側面または実施態様に限定されず、開示されるすべての側面および実施態様に等しく適用される。

配列表
本出願はＡＳＣＩＩ形式で電子的に提出された配列表を含有し、引用することにより本明細書の開示の範囲とされる。

本発明は非限定的な例でさらに開示される。

例１ Ｔｇ／ＴＫＯマウスの構築
内因性の重鎖および軽鎖抗体の発現（三重ノックアウト、またはＴＫＯ）に対してサイレンシングされるバックグラウンド内で生殖細胞系構成の重鎖抗体トランスジェニック遺伝子座を保有するマウスは前述のように作製された（ＷＯ２００４／０７６６１８およびＷＯ２００３／０００７３７、Ｒｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｏｍｉｃｓ、８４、６８６、２００４； Ｚｏｕ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１７０，１３５４，２００３、ＷＯ２０１６／０６２９９０）。簡潔に、トランスジェニックマウスは、Ｃ_Ｈ１ドメインが欠落したマウス免疫グロブリン定常領域遺伝子、マウスエンハンサーおよび調節領域を組み合わせた、多数のヒトＶ_Ｈ、ＤおよびＪ遺伝子を含んでなる、酵母人工染色体（ＹＡＣ）を用いた新鮮な受精卵母細胞の前核マイクロインジェクションの後に誘導された。

例２ 免疫のための抗原
免疫は組換え精製タンパク質またはＬＮＣａｐヒト細胞株を使用した。組換えヒトＰＳＭＡはＲ＆Ｄから購入（カタログ番号、４２３４−ＺＮ）し、一方、ＬＮＣａｐ細胞はＳｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈから購入した（カタログ番号、８９１１０２１１−１ＶＬ）。

例３ 免疫プロトコール
簡潔に、８〜１２週齢のＴｇ／ＴＫＯマウスはそれぞれ、完全フロイントアジュバントで乳化されて皮下に送達された、組換え精製ヒトＰＳＭＡタンパク質を合計５０μｇ、または、不完全フロイントアジュバントで乳化され、また皮下に投与され、初回プライミング後に様々な間隔で与えられた、組換えタンパク質１〜１０μｇの増加が続く、腹腔内に送達された、ＰＢＳ中１０００万のＬＮＣａｐ細胞を受けた。組換え精製ヒトＰＳＭＡタンパク質抗原の最終用量を、アジュバントの非存在下で、リン酸緩衝生理食塩水で腹腔内投与した。代替の免疫の経路および手順もまた作用されることができる。例えば、フロイントアジュバントの代わりに、異なるアジュバントまたは免疫増強手順が使用されてもよい。ＤＮＡの免疫はしばしば、筋肉内、またはＧｅｎｅｇｕｎを介して送達される。トランスフェクトされた細胞または前記細胞からの膜調節物はしばしば、排他的ではないが、腹腔内に投与される。

例４ 血清ＥＬＩＳＡ
免疫中および免疫後、マウスから血清を回収され、ＥＬＩＳＡにより免疫抗原に対する重鎖抗体の反応の存在が確認された。Ｎｕｎｃ Ｍａｘｉｓｏｒｐプレート（Ｎｕｎｃカタログ番号、４４３４０４）は、１μｇ組換え抗原／ｍＬＰＢＳ溶液の５０μＬ／ウェルで、４℃で一晩コーティングされた。抗原溶液をデカントした後、０．０５％（ｖ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ（商標）２０（Ｓｉｇｍａ Ｐ１３７９）を補充したＰＢＳ（ＰＢＳ錠剤から調整、Ｏｘｏｉｄカタログ番号、ＢＲ００１４Ｇ）を使用してプレートを洗浄し、続いてＴｗｅｅｎ２０を添加しないＰＢＳで洗浄した。非特異的タンパク質相互作用を阻害するため、３％（ｗ／ｖ）脱脂粉乳（Ｍａｒｖｅｌ（商標））のＰＢＳ溶液がウェルに加えられ、プレートは室温で少なくとも１時間インキュベートされた。３％のＭａｒｖｅｌ^TM／ＰＢＳでの血清の希釈液をポリプロピレンチューブまたはプレートで調整し、室温で少なくとも１時間インキュベートしてから、ブロックされたＥＬＩＳＡプレートに移し、そこでさらに１時間インキュベートされた。次に、ＰＢＳが続く、ＰＢＳ／Ｔｗｅｅｎ２０で繰り返し洗浄を使用して、未結合のタンパク質が洗い流された。次に、ＰＢＳ／３％のＭａｒｖｅｌで調整したビオチン複合ヤギ抗マウスＩｇＧ、Ｆｃガンマサブクラス１特異的抗体（Ｊａｃｋｓｏｎカタログ番号、１１５−０６５−２０５）の溶液が各ウェルに加えられ、さらに室温で少なくとも１時間インキュベートされた。ＰＢＳ／Ｔｗｅｅｎ２０およびＰＢＳを使用して、繰り返し洗浄により、未結合の検出抗体が除去された。次に、３％のＭａｒｖｅｌ／ＰＢＳでのニュートラアビジン−ＨＲＰ溶液（Ｐｉｅｒｃｅカタログ番号３１０３０）がＥＬＩＳＡプレートに添加され、少なくとも３０分間結合させた。さらなる洗浄後、ＴＭＢ基質（Ｓｉｇｍａカタログ番号、 Ｔ０４４０）を使用して、ＥＬＩＳＡが展開され、０．５ＭのＨ_２ＳＯ_４溶液（Ｓｉｇｍａカタログ番号３２０５０１）の添加により、１０分後に反応が停止された。吸光度は、４５０ｎｍの光学密度で読み取ることにより決定された。ＥＬＩＳＰＯＴ試験等の代替試験がまた、免疫誘発重鎖抗体反応を確認するために使用されてもよい。

例５ 免疫されたマウスからのライブラリーの生成
ａ）組織の処理、ＲＮＡ抽出およびｃＤＮＡ製造
脾臓、鼠径部および上腕リンパ節は、各免疫された動物からＲＮＡｌａｔｅ（商標）に回収された。各動物について、脾臓の１／２および４つのリンパ節が別々に処理された。最初に、組織が均質化された、組織をＬｙｓｉｎｇ ｍａｔｒｉｘ Ｄビーズチューブ（ＭＰ Ｂｉｏ．カタログ番号、１１６９８３００１）に移した後、ＭＰ Ｂｉｏ Ｆａｓｔｐｒｅｐ９６ホモジナイザー（カタログ＃ １１６０１０５００）で、１６００ｒｐｍで６０秒間、ホモジナイズする前に、β―メルカプトエタノールを含有する６００μＬのＲＬＴバッファー（Ｑｉａｇｅｎ ＲＮｅａｓ（商標）キットカタログ番号、７４１０４）が添加された。ホモジナイズされた組織を含有するチューブを氷に移し、１２００ｒｐｍで５分間の遠心分離により破片をペレット化した。上清のサンプル４００μｌを取り出し、ＲＴ−ＰＣＲのために使用した。最初に、製造元のプロトコールにしたがって、Ｑｉａｇｅｎ ＲＮｅａｓｙ（商標）キット（カタログ番号、７４１０４）を使用して、ＲＮＡが抽出された。次に、Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ ＩＩＩ ＲＴ−ＰＣＲ高忠実度キット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎカタログ番号、１２５７４−０３５）を使用して、各ＲＮＡサンプルがｃＤＮＡを作成するために使用された。脾臓およびリンパ節の各ＲＮＡサンプルについて、Ｖ_Ｈ１、Ｖ_Ｈ２、Ｖ_Ｈ３、Ｖ_Ｈ４またはＶ_Ｈ６ファミリーのプライマーと組み合わせたＶ_Ｈ＿Ｊ／Ｆ（ロング）プライマーとそれぞれ合わせて、５回のＲＴ−ＰＣＲ反応が実施された。プライマーの詳細は以下にある。

縮重プライマーのヌクレオチド選択のコードは、Ｒ：Ａ、Ｇ、Ｙ：Ｃ、Ｔ、Ｍ：Ａ、Ｃ、Ｋ：Ｇ、Ｔ、Ｓ：Ｃ、Ｇ、Ｗ：Ａ、Ｔ、Ｂ：Ｃ、Ｇ、Ｔ、Ｖ：Ａ、Ｃ、Ｇ、Ｄ：Ａ、Ｇ、Ｔ、Ｎ：Ａ、Ｃ、Ｇ、Ｔである。

ＲＴ−ＰＣＲ反応のためにマスターミックスを調整した。３７０ｂｐの幅の生成物がゲル電気泳動で確認された。

ａ）ファージミドベクターへのクローニング
ファージミドベクター、ｐＵＣＧ３がこれらの研究において用いられた。増幅されたＶ_Ｈ配列からＶ_Ｈファージミドライブラリーを構築するために、ＰＣＲベースの方法が使用された。次の手順が使用された、以下のプライマー、配列番号２４７ｐＵＣＧ３−ｐＨＥＮＡＰｍｕｔ４、配列番号２４８ｐＵＣＧ３−ｐＨＥＮＡＰｍｕｔ５ｍｙｃＨｉｓで、ＰＣＲを使用して、ｐＵＣＧ３の線形型が作製された。

ＧＣバッファー（カタログ番号、Ｆ５３２Ｌ、ＮＥＢ）を含んでなるＰｈｕｓｉｏｎ Ｈｉｇｈ ｆｉｄｅｌｉｔｙ ＰＣＲマスターミックスがＰＣＲ反応のために使用された。ＰＣＲ生成物（３１５２ｂｐ）が、製造元の指示にしたがって、溶出バッファー４０μｌでの最終溶出で、Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ ＧｅｎｅＪｅｔゲル精製キット（カタログ番号、Ｋ０６９１）を使用してゲル精製された。精製されたＶ_Ｈ ＲＴ−ＰＣＲ生成物は、形質転換およびライブラリー作成のためのファージミド産物を得るために、線形化されたｐＵＣＧ３のメガプライマーとして用いられた。

例６ ＰＳＭＡバインダーの単離のための選択戦略
ライブラリーファージストックの調整およびファージディスプレイ選択は、公開された方法（Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ、Ｂｅｎｎｙ Ｌｏ編、第８章、ｐ１６１−１７６、２００４）にしたがって実施した。ほとんどの場合、結合ＶＨドメインを単離するために、パニングアプローチと組み合わせたファージディスプレイが使用された。しかし、可溶性選択およびストレス（例えば、熱）下で実施される選択を含んでなる、さまざまな異なる選択方法が当該技術分野で十分に開示されている。抗ＰＳＭＡ Ｖ_Ｈの内在化を促進するための選択はまた、一価および多価ファージを用いて実施された（米国特許２００９１７０７９２（Ａ１）―２００９−０７−０２）。簡潔に、氷冷細胞培地でブロックされたファージが、２．５ ｘ １０^６のＬｎＣＡＰ細胞を含有する、４ｍｌの氷冷細胞培地に加えられた。ファージと細胞が、時々細胞の凝集を防ぐために混合して、インキュベートされた。氷冷したＰＢＳで５回洗浄することにより、未結合または弱く結合したファージが除去された。その後、４℃で低ｐＨ細胞ストリッピングバッファーで５分間の洗浄工程で細胞の外側に結合したファージを除去する前に、３７^ｏＣで培地での細胞のインキュベートにより、ファージが内在化させられた。次に、トリメチルアミンを使用して、内在化されたファージを収集するために、細胞が溶解された。剥がした画分と内在化された画分の両方が、大腸菌の感染に使用する前にトリス緩衝液で中和された。組換えタンパク質でのパニング選択について開示されているように、ファージ出力が分析された。

例７ 標的結合のための試験
異なる選択からのＶ_Ｈは、ＰＳＭＡに結合し得る特定のＶ_Ｈを同定するために、次の１つまたはそれ以上の試験でスクリーニングされた。

ａ）結合ＥＬＩＳＡ
ライブラリーの選択後、特定のＶ_Ｈ抗体が公開された方法（Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ、ｅｄｉｔｅｄ ｂｙ Ｂｅｎｎｙ Ｌｏ、ｃｈａｐｔｅｒ ８、ｐ１６１−１７６、２００４）にしたがって、ファージＥＬＩＳＡによって特定された。ファージＥＬＩＳＡは、標的タンパク質と対照としての無関係な抗原に対して実施された。ある場合において、ファージＥＬＩＳＡを使用する代わりに、Ｖ_Ｈドメインの精製または粗抽出物がＥＬＩＳＡで試験された。これらの場合、細菌ペリプラズム抽出物または精製Ｖ_Ｈが使用された。

ｂ）ＦＭＡＴ直接細胞結合試験
Ｅ．ｃｏｌｉからのペリプラズム抽出物が、マイクロウェルの底部に固定されたビーズまたは細胞に局在する蛍光を検出する蛍光ベースのプラットフォームであるＦｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ Ｍｉｃｒｏｖｏｌｕｍｅ Ａｓｓａｙ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（ＦＭＡＴ）を使用して、ＰＳＭＡ結合−Ｈｉｓタグ付きＶ_Ｈの産生のために、スクリーニングされた（Ｄｉｅｔｚ ｅｔ ａｌ．，Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ ２３：１７７−１８６（１９９６）、Ｍｉｒａｇｌｉａ ｅｔ ａｌ．，Ｊ． Ｂｉｏｍｏｌ．Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ ４：１９３−２０４（１９９９））。ＣＨＯ ＴＲＥＸヒトおよびカニクイザル細胞株は、標準的な手順を使用して、完全長のヒトおよびカニクイザルＰＳＭＡを使用して、インハウスで発生された。ＬｎＣＡＰ細胞はＳｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈから購入した。

ペリプレップは、ＦＭＡＴ直接結合試験でＣＨＯ親細胞に結合せず、ＣＨＯ ヒトＰＳＭＡ、ＣＨＯ カニクイザルＰＳＭＡおよびＬｎＣＡＰ細胞に特異的に結合するＶ_Ｈの存在の単一ポイントスクリーニングにより試験された。滴定では、末端Ｈｉｓタグを介して精製されたＶＨをＦＭＡＴ試験バッファーで連続希釈し、上で開示されるように、結合が測定された（図１）。改良された多様体は、親ＶＨと同様の特性を示す（図１ｂおよび１ｃ）。

ｂ）ヒトＰＳＭＡ−ＣＨＯへの抗ＰＳＭＡ ＶＨ結合のＥＣ_５０値。使用されたリンカーの長さは６ＧＳ（つまり、（Ｇ_４Ｓ）_６）であった。

配列
上で特定された各個々のＶ_Ｈクローンは、ファージミドから配列決定され、Ｖ_Ｈ生殖細胞系およびＣＤＲ３アミノ酸類似性に基づいて別個のファミリーにグループ分けされた。代表的なクローンがさらに特徴付けられた。生殖系列多様体を含んでなる多様体は、例えば１．１または２．１の親クローンの標準的な方法により発生された。表１は、ファミリー１のクローンファミリーの配列を示す。クローン１．８〜１．３０は１．１の多様体である。クローン１．２１〜１．３０は、ＣＤＲ２配列における信頼される修正がある、改良された配列最適化多様体である。

例８ Ｖ_Ｈの特性評価
ａ）抗ＰＳＭＡの特異性
標的抗原に対する個々のＶ_Ｈの特異性は、以下の例７（ａ）で開示された方法に従ってＥＬＩＳＡにより確認された。Ｖ_ＨはＰＭＳＡへの結合についてテストされ、無関係なタンパク質と交差反応しないことが示された。
ｂ）オクテットを使用した結合速度の測定
ＦｏｒｔｅＢｉｏ Ｏｃｔｅｔ ＲＥＤ ３８４機器で精製された抗ＰＳＭＡ Ｖ_Ｈ抗体の結合速度を測定した。組換えＰＭＳＡは、酢酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ５（ＦｏｒｔｅＢｉｏカタログ番号、１８−１０６９）で２０μｇ／ｍｌに希釈され、アミンカップリング化学（ＮＨＳ−ＥＤＣアミンカップリング、ＦｏｒｔｅＢｉｏカタログ番号、１８−１０６７および１８−１０３３）を使用して、ＡＲＧ２Ｇバイオセンサー（ＦｏｒｔｅＢｉｏカタログ番号、１８−５０９２）に結合され、続いてエタノールアミン（ＦｏｒｔｅＢｉｏカタログ番号、１８−１０７１）で停止された。次に、抗ＰＳＭＡ Ｖ_Ｈ抗体の結合速度は、各Ｖ_Ｈ抗体を希釈系列（通常、最高濃度におけるＶＨ、１５μｇ／ｍｌで始まる１：２希釈系列）で調製し、および次に、異なるＶ_Ｈ濃度のＰＳＭＡ結合バイオセンサーへの結合することにより決定された。Ｖ_Ｈ結合速度は、１：１結合モデルとＦｏｒｔｅＢｉｏ Ｏｃｔｅｔ ＤａｔａＡｎａｌｙｓｉｓソフトウェアを使用して、（空白を差し引いた）センサーグラムトレースから決定された。１〜１５０ｎＭおよびサブナノモル範囲の結合親和性が検出され、Ｏｃｔｅｔプロファイルの例が図２および以下の表１９の、その結合パラメータに示された。

０．３７５μｇ／ｍｌで始まる１：２希釈系列を使用して、以下のように、親分子の特定の多様体のさらなるファミリーメンバーもまた試験された。表２０および２１に示すように、低ナノモルからピコモル範囲の結合親和性が検出された。

Ｎｉ−ＮＴＡクロマトグラフィー（Ｃ末端Ｈｉｓタグを通じて）を使用して、ペリプラズム抽出物から精製した単一ドメイン抗体もまた試験された。結果は以下の表に示される。表２２に示されるように、１〜１５０ｎＭおよび低ナノモル範囲の結合親和性が検出された。

ｃ）蛍光微量試験技術を使用したカニクイザルＰＳＭＡ結合Ｖ_Ｈの内在化の測定
精製Ｖ_Ｈの内在化は、ｐＨ感受性蛍光色素ｐＨｒｏｄｏ（商標）Ｇｒｅｅｎを使用して測定された。製造元の指示にしたがって、抗Ｈｉｓ抗体（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅカタログ番号、０５−９４９）がｐＨｒｏｄｏ（商標）ＧｒｅｅｎＳＴＰエステル（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓカタログ番号、Ｐ３５３６９）で標識された。すべてのサンプルおよび試薬は、ＰＢＳおよび０．１％ウシ血清アルブミンを含有する内在化バッファー（ｐＨ７．４）で調製された。カニクイザルＰＳＭＡを発現しているＣＨＯ細胞を０．１×１０^６細胞／ｍｌで再懸濁され、細胞懸濁液に１２０ｎＭのＤＲＡＱ５が加えられた。Ｖ_Ｈ（１０μｌ）が３８４ウェルの黒色透明底アッセイプレート（Ｃｏｓｔａｒカタログ番号、３６５５）に移され、１０μｌの４０ｎＭのｐＨｒｏｄ（商標）Ｇｒｅｅｎ標識抗−Ｈｉｓ抗体が添加、次いで２０μｌのＤＲＡＱ５染色細胞が添加された。プレートが３７℃で２時間インキュベートされ、室温に平衡化された。ＦＬ２（５０２ｎｍ−５３７ｎｍ）およびＦＬ５（６７７−８００ｎｍ）チャネルの蛍光発光は、４８８ｎｍおよび６４０ｎｍでの励起後、ＴＴＰ Ｍｉｒｒｏｒｂａｌｌプレートリーダーで測定された。データは、ＦＬ５の境界及びピーク強度でゲートされ、ゲートされたデータのＦＬ２平均蛍光強度の中央値が、Ｖ_Ｈ内在化の決定のために使用された（図３）。

上で開示されるように、ｐＨ感受性蛍光色素ｐＨｒｏｄｏ（商標）Ｇｒｅｅｎを使用して単一ドメイン抗体１．１および１．２の多様体の内在化が測定されたが、ＤＲＡＱ５染色ＣＨＯヒトＰＳＭＡクローン１Ａ１０細胞（２０μｌ）の添加前に、連続希釈Ｖ_ＨがｐＨｒｏｄｏ（商標）Ｇｒｅｅｎ標識抗Ｈｉｓ抗体とともに室温で３０分間プレインキュベートされた。プレートが室温で２時間インキュベートされ、次に、蛍光発光を測定された。試験におけるＶ_Ｈの活性が以下の表２３に示される。

ｄ）Ｈｉｓ−ＺＡＰ試験を使用したＰＳＭＡ結合Ｖ_Ｈの内在化の測定
Ｖ_Ｈが結合している、Ｈｉｓタグ付きＰＳＭＡの内在化は、サポリン毒素と複合した抗Ｈｉｓ抗体（Ｈｉｓ−ＺＡＰ、Ａｄｖａｎｃｅｄ ｔａｒｇｅｔｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍｓ、カタログ番号、ＩＴ５２）を使用して、評価された。Ｈｉｓ−ＺＡＰ試薬はＶ_Ｈに結合し、Ｖ_Ｈが細胞表面のＰＳＭＡと相互作用することで内在化される。サポリン毒素はエンドソーム内の複合体から放出され、リボソームを不活性化し、最終的に細胞死という結果をもたらす。

ヒトまたはカニクイザルのＰＳＭＡを発現するＣＨＯ細胞（３０μｌの容量でウェルあたり４００個の細胞）を、１０％ウシ胎児血清、２ｍＭのＬ−グルタミン、１０μｇ／ｍｌのブラストサイジン、３００μｇ／ｍｌのゼオシン、ペニシリン／ストレプトマイシン、１μｇ／ｍｌのテトラサイクリンを含有するＨａｍｓ Ｆ１２（Ｓｉｇｍａカタログ番号、Ｎ６６５８）培地で、３８４ウェルの黒色透明底組織培養処理試験プレート（Ｃｏｓｔａｒカタログ番号、３７１２）に播種し、３７℃のＣＯ２インキュベーターで一晩インキュベートされた。精製されたＶ_Ｈが培地で連続希釈され、次に等量の４０ｎＭのＨｉｓ−ＺＡＰが加えられた。３７℃で３０分間のインキュベート後、Ｖ_Ｈ／Ｈｉｓ−ＺＡＰサンプル（１０μｌ）が細胞試験プレートに移され、３７℃のＣＯ２インキュベーターで７２時間または４８時間のいずれかでインキュベートされた。Ｈｉｓ−ＺＡＰ対照ウェル（Ｈｉｓ−ＺＡＰ試薬と合わせた細胞）およびバックグラウンド対照（培地のみ）が、データの正規化のために各プレートに設定された。Ｃｅｌｌ Ｔｉｔｅｒ−Ｇｌｏ Ｃｅｌｌ Ｖｉａｂｉｌｉｔｙ試験（Ｐｒｏｍｅｇａカタログ番号、Ｇ７５７１）を、製造元の指示にしたがって使用し、７２時間または４８時間いずれかのインキュベーション後、細胞生存率が決定された。相対発光シグナル（ＲＬＵ）が、ＢＭＧ ＰＨＥＲＡｓｔａｒプレートリーダーを使用して測定された。データは、細胞の非存在下で得られたＲＬＵシグナルの減算および、Ｈｉｓ−ＺＡＰ対照ウェルのバックグラウンド補正シグナルの割合としての発現によって、正規化された。例が図４ＡおよびＢに示される。

ＬｎＣＡＰ試験では、１０％ウシ胎児血清、２ｍＭのＬ−グルタミンおよびペニシリン／ストレプトマイシンを含有するＲＰＭＩ１６４０培地で、細胞（１００μｌ容量でウェルあたり２０００）が、９６ウェルＴＣ処理プレート（Ｃｏｓｔａｒカタログ番号、３３４０）に播種された。精製したＶ_Ｈは培地で連続希釈され、等量の６０ｎＭのＨｉｓ−ＺＡＰが加えられた。３７℃で３０分間のインキュベート後、Ｖ_Ｈ／Ｈｉｓ−ＺＡＰサンプル（１００μｌ）が細胞試験プレートに移され、３７℃のＣＯ_２インキュベーターで９６時間インキュベートされた。Ｃｅｌｌ Ｔｉｔｅｒ−Ｇｌｏ Ｃｅｌｌ Ｖｉａｂｉｌｉｔｙ試験を使用して細胞生存率が測定され、上で開示されるようにデータが分析された。例が図５において示される。

毒素を介した細胞死をもたらす、結合したサポリン複合抗Ｈｉｓ抗体とともに内在化されるために、単一ドメイン抗体１．１および２．１の多様体の能力が決定された。ＣＨＯヒトＰＳＭＡクローン１Ａ１０細胞がヒトＰＳＭＡ試験に使用され、細胞生存率を測定する前に、プレートが３７℃のＣＯ_２インキュベーターで７２時間インキュベートされたことを除いて、上で開示されるように試験が実施された。試験で検査した単一ドメイン抗体の活性が以下の表２４に示される。

バイパラトピック分子が試験され、次のＥＣ５０値を示した。

例９ Ｖ_Ｈの安定性
異なるＣＤＲ３ファミリーからのＶ_Ｈが、開発性のために、試験された。

ａ）熱安定性：ＨＰＬＣサイズ排除クロマトグラフィー
精製Ｖ_Ｈがサイズ排除クロマトグラフィーにかけられた。簡潔に、精製Ｖ_Ｈは、ＰＢＳバッファーに４℃または４０℃のいずれかで０〜１４日間保存し、次にＷａｔｅｒｓ ＡＣＱＵＩＴＹ ＢＥＨ１２５ÅＳＥＣカラムでの分離と合わせたＰＤＡ検出器（２８０ｎｍで検出）を含有するＷａｔｅｒｓ Ｈ−Ｃｌａｓｓ Ｂｉｏ ＵＰＬＣを使用して、様々な時点で分析された。サンプルは１０μｌの容量で注入され、２００ｍＭのＮａＣｌ、１００ｍＭのリン酸ナトリウム、ｐＨ７．４＋５％のプロパン−１−オールを含有する移動相で、流速０．４ｍｌ／分で流された。データを６分間収集し、開始時（Ｔ＝０）に存在するものと比較して、保存後に残っているモノマーの割合が計算された。親分子は高い安定性を示した。多様体もまた試験された。さまざまなサンプルの濃度、一価１．１バリアント：５．０ｍｇ／ｍｌ、一価２．１バリアント：３．５ｍｇ／ｍｌ、結果は以下の表に示される。

最大３５日間の長期安定性もまた試験され、良好なプロファイルが示された。

ａ）熱安定性：ミラーボール
精製Ｖ_Ｈサンプルが４０℃で０〜８日間インキュベートされ、次に、例７（ｂ）で詳述されたＦＭＡＴ直接結合試験を使用して、カニクイザルＰＳＭＡを発現するＣＨＯ細胞への結合が試験された（図６ＡおよびＢ）。

ｃ）均一時間分解蛍光（ＨＴＲＦ）試験を使用したＶ_Ｈ血清安定性の評価。
精製Ｖ_Ｈはカニクイザルの血清と混合され、３７℃で０〜７日間インキュベートされた。次に、ＨＴＲＦ試験を使用して、サンプルは、ＰＳＭＡへの結合のため、評価された。簡潔に、ＰＳＭＡ（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍカタログ番号、４２３４−ＺＮ）は、Ｐｉｅｒｃｅ ＥＺ−Ｌｉｎｋ Ｍｉｃｒｏ−Ｓｕｌｆｏ−ＮＨＳ−ＬＣ− Ｂｉｏｔｉｎｙｌａｔｉｏｎキット（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃカタログ番号、２１９３５）を使用して、ビオチン化された。ＨＴＲＦ結合試験のため、全てのサンプルと試薬は、ＰＢＳ、０．１％（ｗ／ｖ）ＢＳＡおよび０．４Ｍフッ化カリウムを含有するＨＴＲＦ試験バッファーで調製された。Ｖ_Ｈ（Ｃ末端Ｈｉｓ−Ｍｙｃタグ）は、３ｎＭのビオチン化ＰＳＭＡ、１．５ｎＭのストレプトアビジンクリプテート（Ｃｉｓｂｉｏカタログ番号、６１０ＳＡＫＬＡ）および１０ｎＭの抗Ｍｙｃ−Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ−６４７（ＡｂＤ Ｓｅｒｏｔｅｃカタログ番号、ＭＣＡ２２００ＡＦ６４７）と、室温で最低３時間、黒い３８４シャローウェルプレート（Ｃｏｓｔａｒカタログ番号、３６７６）で１０μｌの総試験量で、インキュベートされた。ＢＭＧ ＰＨＥＲＡｓｔａｒプレートリーダーにて３３７ｎｍで励起後、６２０ｎｍおよび６６５ｎｍの時間分解蛍光発光が測定され、得られたデータが図７Ａ、ＢおよびＣに示される。

別の実験において、精製Ｖ_Ｈはヒト血清と３７℃で０〜７日間混合され、次に、例７（ｂ）ＦＭＡＴ直接細胞結合試験に開示されているようにｈｕＰＳＭＡ ＣＨＯ １Ａ１０細胞への結合のため、評価された。得られたデータは図８に示され、ＥＣ５０値は以下の表２７および２８に示される。

ｃ）異なるバイパラトピックの組み合わせの血清安定性を評価するために、精製バイパラトピックＶ_Ｈが３７℃で０〜７日間ヒト血清と混合され、例７（ｂ）ＦＭＡＴ直接細胞結合試験に開示されているようにｈｕＰＳＭＡ ＣＨＯ細胞への結合のため、評価された。ＥＣ５０値が得られた。

ｄ）Ｖ_Ｈ熱安定性の評価
ＭｉｃｒｏＣａｌ ＶＰ−Ｃａｐｉｌｌａｒｙ ＤＳＣ（Ｍａｌｖｅｒｎ）を使用して、示差走査熱量測定（ＤＳＣ）が実施された。ＰＢＳにおいて０．２５ｍｇ／ｍｌのタンパク質３００μｌが、１０〜９０℃の間で毎分６０℃のスキャン速度を用いて、実行された。ＭｉｃｒｏＣａｌソフトウェアを使用して、データが分析された。結果は以下の表２９に示されている。

例１０ マウスのイメージング研究
Ｖ_Ｈがマウスに注射された（Ｖ_Ｈ１．１、Ｖ_Ｈ２．１および半減期延長のあるＶ_Ｈ２．１）。マウスはＰＳＭＡ陽性（＋）およびＰＳＭＡ陰性（−）腫瘍を含有する。研究は次のように実施された。
・マウスあたり最大１００ＭＢｑのＴｃ−９９ｍ注射活動
・５分、３０分、６０分、３時間、６時間、２４時間のＳＰＥＣＴ／ＣＴ。
・異なる時点で表示される画像
・生体外での生体内分布およびオートラジオグラフィーのイメージング後
・陰性対照Ｖ_Ｈ（αＨＥＬ４）
半減期が延長されたＶ_Ｈは、以下の配列、配列番号２４９、を持つ抗マウス血清アルブミン（抗ＭＳＡ）Ｖ_Ｈを含んでなる。

実験は、特に対照モノクローナルＩｇＧ抗ＰＳＭＡ抗体と比較して、ＰＳＭＡ発現（ＰＳＭＡ＋）腫瘍への高レベルの特定の腫瘍ターゲティング、より速い浸透、および注入量のより多い蓄積が示している。これは、Ｖ_Ｈの半減期の延長によりさらに改善されることができる。さらに、データは裸の（ｎａｋｅｄ）Ｈｕｍａｂｏｄｙ（商標）Ｖ_Ｈの迅速なクリアランスを示している。結果は図９〜１５に示されている。

例１１ エピトープマッピング
互いにＶ_Ｈを結合するＰＳＭＡのタンデムエピトープマッピングは、Ｏｃｔｅｔ ＲＥＤ ３８４を使用して、実行された。次に、Ｖ_Ｈ結合は、１：１結合モデルおよびＦｏｒｔｅＢｉｏ Ｏｃｔｅｔ ＤａｔａＡｎａｌｙｓｉｓソフトウェアを使用して、（参照センサーを差し引いた）センサーグラムトレースから決定された。例８ｂもまた参照される。エピトープビニングの結果が表３０に示される。いくつかのクローンは部分的なブロッキングを示した。

さらなる実験において、単一ドメイン抗体１．１および２．１の間のエピトープ競合がさらに特徴付けられた。ＰＳＭＡは、アミンカップリング第二世代キット（ＦｏｒｔｅＢｉｏ）を使用してＡＲ２Ｇバイオセンサーにカップリングされ、次に、Ｏｃｔｅｔ ＲＥＤ３８４を使用して実施されたエピトープビニング実験に使用された。これらの実験において、各Ｖ_Ｈが４ｕｇ／ｍｌの濃度に希釈された。ＰＳＭＡへの結合が飽和レベルに達するまで、バイオセンサーは、ＶＨを含まない、または２．１または１．１のいずれかと合わせてロードされた。次に、これらのセンサーは、２回目の関連工程を実施する前に、ＰＢＳ／Ｔｗｅｅｎに短時間浸された。２回目の関連工程は、バイオセンサーを、同じＶ_Ｈのみ、または２．１と１．１の両方を含有するウェルに浸漬することに関連する。後の組み合わせにおいて、第一のＶ_Ｈの存在が、そのＰＳＭＡ結合部位が飽和し続けることを保証した。次に、ＦｏｒｔｅＢｉｏ Ａｎａｌｙｓｉｓソフトウェアを使用して、結合プロファイルが研究された。得られたこれらのデータは、単一ドメイン抗体２．１および１．２がＰＳＭＡにおいて異なるエピトープに結合することを示している。

例１２ イメージング研究
以下の構築物がこれらの研究で試験された。
ＶＨ ２．１
ＶＨ ２．１−ＨＩＳ、１．２ｍｇ／ｍｌ
配列番号２５３
ＶＨ １．１
ＶＨ １．１−ＨＩＳ
配列番号２５４
ＶＨ １．１−Ｈｅｌ４
ＨＥＬ−４−ＨＩＳ
配列番号２５５
ＶＨ ２．１− ＶＨ ２．１
ＶＨ ２．１−６ＧＳ− ＶＨ ２．１ 配列番号２５６
ＶＨ ２．１− ＶＨ １．１
ＶＨ ２．１−６ＧＳ− ＶＨ １．１ 配列番号２５７

この研究で使用されたすべてのＶ_Ｈドメインは、大腸菌で発現された。タンパク質は、例７ａに開示されているように、ニッケルアフィニティークロマトグラフィーおよびサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）を使用して、ろ過された上清から精製された。バッファーを保存バッファーに交換した後、スピン濃縮器を使用して、いくつかのタンパク質が濃縮された。タンパク質の純度は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよび分析ＳＥＣを使用して、分析された。組換えタンパク質および／またはＰＳＭＡ発現細胞を使用して、ＰＳＭＡへの結合が確認された。タンパク質を長時間（一晩から４週間まで）４０℃まで加熱し、タンパク質分解の程度を測定することにより、安定性が確認された。タンパク質のアリコートは、使用するまで−８０℃で保存された。

ＰＳＭＡ発現細胞株における、対象のＶ_Ｈ（一価、二価、およびバイパラトピック形式）、およびエンドサイトーシスＬＡＭＰ−１（リソソームの染色）およびＥＥＡ−１（初期エンドソームの染色）のマーカーとの間の、共局在の発生を試験する共焦点蛍光顕微鏡法。ＰＳＭＡに結合するＩｇＧベンチマーク抗体が陽性対照として使用された。結果は、二価およびバイパラトピックＶ_Ｈ構築物の内在化の改善を示している。

実験プロトコール
使用された細胞株はＣＨＯ Ｔ−ＲＥｘ ｈｕＰＳＭＡ細胞株であった。
１）ＣＨＯ Ｔ−ＲＥｘ ｈｕＰＳＭＡ細胞は、実験の前日にＰＳＭＡ発現のためにテトラサイクリンで誘導され、カバースリップ上にプレートされた。
２）翌日、細胞は５００ｎＭの試験Ｖ_Ｈ（一価、二価またはバイパラトピック形式のいずれか）を含んでなる培地または陽性対照とともにインキュベートされた。
３）サンプルは最初に、エンドサイトーシスをブロックするために、氷上で３０分間インキュベートされ、次に室温で１０分間４％ＰＦＡで固定され、続いてＰＢＳで３回洗浄された。エンドサイトーシスを引き起こすため、重複サンプルがさらに３７℃で２時間インキュベートされ、固定された。
４）固定後、サンプルはバッファーで透過処理された。
５）陽性対照とインキュベートされた細胞は、０．５％ＢＳＡ／ＰＢＳ＋０．０５％Ｔｗｅｅｎで１：２０００に希釈された抗ヒト−４８８抗体を使用して１時間染色され、続いてＰＢＳ＋０．０５％Ｔｗｅｅｎで３回洗浄された（各５分）。
６）一価または二価／バイパラトピックＶ_Ｈでインキュベートされた細胞は、一次抗ＨＩＳ抗体（マウス）を使用して１時間染色され、続いて洗浄され、次に二次抗マウス４８８抗体で１時間インキュベートされ、続いて洗浄された。
７）リソソームおよびエンドソームは、初期エンドソーム抗原１（ＥＥＡ−１）またはリソソーム膜抗原１（ＬＡＭＰ−１）（両方ともウサギ）のいずれかに対する一次抗体を使用して１時間染色された。細胞はさらに抗ウサギ６４７二次抗体とともに１時間室温でインキュベートされ、続いて洗浄された。
８）すべてのサンプルはまた、ＨＯＥＣＨＳＴ１：１０００（０．５ｕｇ／ｍｌ）で５分間染色され、次に洗浄される。
９）カバースリップは凍結されたエンドスライドに取り付けられ、ＮＩＫＯＮ Ａ１Ｒ共焦点システムを使用して、画像化される。
ＮＩＳ−ＥＬＥＭＥＮＴＳ ＡＲプログラムを使用して、写真が撮影された。
使用されたレーザーラインは、４０７．７ｎｍ（ＨＯＥＣＨＳＴ）、４８７．７ｎｍ（ＶＨ／モノクローナルベンチマーク）、６３９．７（ＬＡＭＰ−１、ＥＥＡ−１）であった。
対物：Ａｐｏ ６０ｘ Ｏｉｌ λＳ ＤＩＣ Ｎ２
共焦点モードとして：ピンホールサイズ（ｕｍ）：３９．６、Ｚステップ：０．４９ｕｍ。

１０％のウシ胎児血清、２ｍＭのＬ−グルタミン、１０μｇ／ｍｌのブラスチシジン、３００μｇ／ｍｌのゼオシン、ペニシリン／ストレプトマイシン、１μｇ／ｍｌのテトラサイクリン、を含有するＨａｍｓ Ｆ１２（Ｓｉｇｍａ Ｎ６６５８）培地で、９６ウェルＰｏｌｙ−Ｌ−Ｌｙｓｉｎｅ（Ｓｉｇｍａ Ｐ４７０７）コーティングプレートに播種され、３７℃のＣＯ_２インキュベーターで一晩インキュベートされた、ヒトＰＳＭＡ（１５０００ ／ウェル）発現ＣＨＯ細胞を使用して、さらなるイメージング研究が実施された。ＶＨがプレートに加えられ、４℃で３０分間インキュベートされ、続いて３７℃で２時間インキュベートされた。プレートはＰＢＳで３回洗浄され、次に細胞が４％パラホルムアルデヒドで固定され、０．５％サポニンで透過処理された。内在化ＶＨは、抗Ｈｉｓ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ ０５−９４９）および抗マウスＡＦ４８８（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ １１５−５４５−０９８）で染色することにより検出された。リソソームは、ＬＡＭＰ−１（Ａｂｃａｍ Ａｂ２４１７０）および抗ウサギＡＦ６４７（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ １１１−６０５−００８）で染色された。核は、Ｈｏｅｓｃｈｔ染色（Ｌｉｆｅ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｈ３５７０）を使用して染色された。ＩＮ Ｃｅｌｌ Ａｎａｌｙｚｅｒ ６０００を使用してプレートが画像化され、ＩｍａｇｅＪソフトウェアを使用して画像が処理された。

例１３ ｉｎ ｖｉｔｒｏでの免疫複合体に複合したＭＭＡＥ毒素の効力
ＭＭＡＥ毒素複合Ｖ_ＨがＰＳＭＡ発現細胞に内在化して細胞を殺滅させる能力は、ｉｎ ｖｉｔｒｏ細胞毒性試験を使用して決定された。ヒトＰＳＭＡまたはマッチしたＰＳＭＡ陰性細胞を安定して発現するヒト細胞（ＤＵ−１４５、ＡＴＣＣ ＨＴＢ−８１）が、１０％のウシ胎児血清、２ｍＭのＬ−グルタミン、１Ｘのペニシリン／ストレプトマイシン、を含有するＲＰＭＩ １６４０培地で、ウェルあたり３０００細胞で、３８４ウェルの黒色透明底組織培養処理アッセイプレートに播種され、３７℃のＣＯ_２インキュベーターで一晩インキュベートされた。次に、細胞が、連続希釈したＭＭＡＥ−毒素複合Ｖ_Ｈとともに４８時間または７２時間インキュベートされた。データの正規化のために、未処理の対照ウェル（毒素複合Ｖ_Ｈの非存在下の細胞）およびバックグラウンド対照ウェル（培地のみ）が各プレートに設定された。製造元の指示にしたがって、Ｃｅｌｌ Ｔｉｔｅｒ−Ｇｌｏ Ｃｅｌｌ Ｖｉａｂｉｌｉｔｙ試験（Ｐｒｏｍｅｇａ Ｇ７５７１）を使用して、インキュベーション後、細胞死滅が決定された。相対発光シグナル（ＲＬＵ）は、ＢＭＧ ＰＨＥＲＡｓｔａｒプレートリーダーを使用して、測定された。データは、バックグラウンド対照ウェルで得られたＲＬＵシグナルを差し引くことにより正規化され、次に、未処理の対照ウェルの％（生存率％）として表された。図１６は、代表的な実験（４８時間のインキュベーション）において、ヒトＰＳＭＡ発現ヒト細胞株およびマッチした親（すなわち、トランスフェクトされていない）ＰＳＭＡ陰性細胞株を使用して、得られた用量反応曲線を示す。ＭＭＡＥ複合構築物について得られたＩＣ_５０値および最大細胞殺滅率が表３１において要約される。クレッシェンドのＨｕｍａｂｏｄｙ（商標）Ｖ_Ｈは、ＨｉＰＥＧ^TM技術を使用してＭＭＡＥに複合され（ＷＯ２００９／０４７５００； Ｃｏｎｇ ｅｔ ａｌ（２０１２）Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍ、２０１２、２３、２４８−２６３）、陽性ＡＤＣ対照は、ＴｈｉｏＢｒｉｄｇｅ^TM技術を使用して生成された（ＷＯ２０１６０６３００６； ＷＯ２００５／００７１９７； Ｂａｌａｎ ｅｔ ａｌ、（２００７）Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍ、１８、６１−７６）。抗ＰＳＭＡ−ＭＭＡＥ複合Ｖ_Ｈは、ＰＳＭＡ陰性対照細胞株で観察された細胞死は最小限で、ＰＳＭＡ陽性細胞を特異的に死滅させた。ＰＳＭＡの異なるエピトープを標的とする２つのＶ_Ｈからなるバイパラトピックは、一価または二価のＰＳＭＡのＶ_Ｈ構築物よりも強力であった。ＤＵ１４５試験は、４８時間および７２時間のＨＤＣインキュベーションで実施された。これは、測定されたＩＣ_５０値と最大殺滅率に影響を及ぼしたが、異なるＨＤＣ形式のランキングに影響を与えるとは予想されなかった。スクリーニングでは、スループットをより高めるために４８時間のインキュベーションが好ましい。４８時間のインキュベーションを使用しても、試験した構築物のいずれも１００％の細胞死には達しなかった（試験した最高濃度でさえも）。最大応答はおよそで横ばいになった。７０−８５％（表３１を参照）。表３１はＩＣ_５０値を示し、図１７は、７２時間のインキュベーション時間を使用して、観察されたより高い最大細胞殺滅率（ｎ＝１データ）を示している。

一価構築物について観察された効力の順序は、ＶＨ２．１＞ＶＨ１．１＞ＶＨ３．１であった。

Ｈｕｍａｂｏｄｙ（商標）薬物複合体（ＨＤＣ）の調製手順
コンジュゲーション試薬のストック溶液、ＨｉＰＥＧ（商標） ｖａｌ−ｃｉｔ−ＰＡＢ−ＭＭＡＥ（図１８）は、コンジュゲーション反応を行う前にＭｅＣＮで調製された。Ｈｕｍａｂｏｄｙ（商標）（ＰＢＳ中０．９ｍｇ／ｍＬ、２０ｍＭのＥＤＴＡ、ｐＨ７．５）の溶液はＨｉＰＥＧ（商標） ｖａｌ−ｃｉｔ−ＰＡＢ−ＭＭＡＥ試薬（Ｈｕｍａｂｏｄｙ（商標）あたり１．５当量、５％（ｖ／ｖ）のＭｅＣＮ最終濃度）と穏やかに混合し、２２℃で１９時間インキュベートされた。１９時間後、複合反応物は等容量の６００ｍＭのリン酸ナトリウム緩衝液（１５０ｍＭのＮａＣｌ、２０ｍＭのＥＤＴＡ）とｐＨ７．５で混合され、４℃に冷却された。１ｍｇ／ｍＬのＮａＢＨ４溶液のストック溶液が０．１ＭのＮａＯＨで調製された。ＮａＢＨ_４溶液の各２つのアリコート（試薬あたり１０当量）が、添加の間に３０分間隔で冷却された複合反応物に添加された。さらに３０分間隔の後、ＴＯＳＯＨ ＴｏｙｏＰｅａｒｌ Ｐｈｅｎｙｌ−６５０Ｓカラムを使用して、疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）により粗混合物が精製された。サンプルが結合され、５０ｍＭのリン酸ナトリウム（２ＭのＮａＣｌ）、ｐＨ７、（バッファーＡ）を使用して、カラムにおいて洗浄され、５０ｍＭのリン酸ナトリウム（２０％ｖ／ｖイソプロパノール）の勾配、ｐＨ７（バッファーＢ）を使用して、溶出された。モノロードされた生成品を含有する画分がプールされ、５ｋＤａのＭＷＣＯ ＰＥＳ膜を取り付けたＶｉｖａｓｐｉｎ２０濃縮器を使用して、濃縮された。濃縮画分は、ＰＤ１０カラムを使用して、緩衝液がＤＰＢＳに交換され、緩衝液交換材料が０．２μｍのＰＶＤＦシリンジろ過ユニットを使用して滅菌ろ過された。

ＨｉＰＥＧ ｖａｌ−ｃｉｔ−ＰＡＢ−ＭＭＡＥ部分は、Ｖ_ＨのＣ末端Ｈｉｓ６−ｔａｇを介して結合される。各「ペイロード」毒素分子の付着には２つのヒスチジンが必要である。Ｈｕｍａｂｏｄｙ ＶＨ、ＤＡＲ＝１種は細胞毒性試験で使用するために精製されたが、ある例において、１の正確なＤＡＲは達成されなかった（下表を参照）。ここでの例において、単一のＭＭＡＥ部分が付加されたが、複数のペイロードが可能である（ＤＡＲ＞１）。

薬物を用いた対照ＡＤＣの調製手順：抗体比（ＤＡＲ）３．５
陽性対照抗体Ｐｒｏ＿００６は、ＵＳ８４７０３３０に開示され、抗体００６として例示されている、重および軽鎖配列で構成される抗ＰＳＭＡ抗体である。

複合体１：反応バッファー（２０ｍＭのリン酸ナトリウム、１５０ｍＭのＮａＣｌ、２０ｍＭのＥＤＴＡ、ｐＨ７．５）中のｍＡｂ Ｐｒｏ＿００６（５．０７ｍｇ／ｍＬ）の溶液が１５分間４０℃に加温された。ＴＣＥＰ（５ｍＭ、ｍＡｂあたり２当量）がｍＡｂ溶液に添加され、穏やかに混合され、４０℃で１時間インキュベートされた。コンジュゲーション試薬のストック溶液、ｍｃ−ｖａｌ−ｃｉｔ−ＰＡＢ−ＭＭＡＥ（図１９）が２．８ｍＭのＤＭＦで調製された。還元されたｍＡｂが２２℃に冷却され、反応バッファーで４．２ｍｇ／ｍＬに希釈され、ｍｃ−ｖａｌ−ｃｉｔ−ＰＡＢ−ＭＭＡＥ（ｍＡｂあたり５．２５当量）が加えられた。複合体混合物は２２℃で２時間インキュベートされた。粗複合体混合物が５０ｍＭのＮ−アセチル−Ｌ−システイン（試薬に対して２０当量）で、２２℃で３０分間処理された。反応混合物が、３０ｋＤａ ＭＷＣＯ ＰＥＳ膜を取り付けたＶｉｖａｓｐｉｎ２０濃縮器を使用して、ＤＰＢＳに対してダイアフィルトレーションされた。Ｃｅｎｔｒｉｐｕｒｅ Ｐ５０カラムを使用して、ダイアフィルトレーションされたＡＤＣ溶液がＤＰＢＳにバッファー交換された。サンプルのＤＡＲはＨＩＣによって評価された（平均ＤＡＲ＝３．２１）。

複合体２：反応バッファー（２０ｍＭのリン酸ナトリウム、１５０ｍＭのＮａＣｌ、２０ｍＭのＥＤＴＡ）、ｐＨ７．５のｍＡｂ Ｐｒｏ＿００６（５．０７ｍｇ／ｍＬ）の溶液が４０℃に１５分間加温された。ＴＣＥＰ（５ｍＭ、ｍＡｂあたり２．７５当量）がｍＡｂ溶液に添加され、穏やかに混合され、４０℃で１時間インキュベートされた。コンジュゲーション試薬のストック溶液、ｍｃ−ｖａｌ−ｃｉｔ−ＰＡＢ−ＭＭＡＥ（図１９）は４．０ｍＭのＤＭＦで調製された。還元ｍＡｂは２２℃に冷却され、反応緩衝液で４．２ｍｇ／ｍＬに希釈され、ｍｃ−ｖａｌ−ｃｉｔ−ＰＡＢ−ＭＭＡＥ（ｍＡｂあたり７当量）が加えられた。複合混合物は２２℃で２時間インキュベートされた。粗複合体混合物が５０ｍＭのＮ−アセチル−Ｌ−システイン（試薬に対して２０当量）で、２２℃で３０分間処理された。反応混合物が、３０ｋＤａのＭＷＣＯ ＰＥＳ膜を取り付けたＶｉｖａｓｐｉｎ２０濃縮器を使用して、ＤＰＢＳに対してダイアフィルトレーションされた。Ｃｅｎｔｒｉｐｕｒｅ Ｐ５０カラムを使用して、ダイアフィルトレーションされたＡＤＣ溶液がＤＰＢＳにバッファー交換された。サンプルのＤＡＲはＨＩＣによって評価された（平均ＤＡＲ＝４．５２）。

平均ＤＡＲ３．５ＡＤＣの製造：ＡＤＣ１（ＤＡＲ３．２１）およびＡＤＣ２（ＤＡＲ４．５２）が４：１のモル比で混合され、中間ＤＡＲのＡＤＣが調製された。得られたサンプルは、０．２μｍのＰＶＤＦシリンジろ過ユニットを使用して滅菌ろ過された。サンプルのＤＡＲはＨＩＣによって評価された（平均ＤＡＲ＝３．４５）。

半減期延長ＨＤＣのｉｎ ｖｉｔｒｏでの効力
半減期が延長されたＨＤＣのｉｎ ｖｉｔｒｏでの効力は、ＤＵ１４５細胞殺滅試験（７２時間）を使用して、評価された。

表３４に開示されているこの材料は、半減期延長部分をＨＤＣに加えた効果を試験するために作成された。半減期延長バージョン（ＨＬＥ）は、ＭＳＡ結合Ｖ_Ｈ（配列番号５２８）を使用して作成された。ＤＵ１４５細胞殺滅試験（７２時間）を使用して、ｉｎ ｖｉｔｒｏでの効力が評価された。

Claims (29)

1. 配列番号１を含んでなるＣＤＲ１配列、配列番号２を含んでなるＣＤＲ２配列、および配列番号３を含んでなるＣＤＲ３配列を含んでなる単一Ｖ_Ｈドメイン抗体；配列番号５を含んでなるＣＤＲ１配列、配列番号６を含んでなるＣＤＲ２配列、および配列番号７を含んでなるＣＤＲ３配列を含んでなる単一Ｖ_Ｈドメイン抗体；配列番号９を含んでなるＣＤＲ１配列、配列番号１０を含んでなるＣＤＲ２配列、および配列番号１１を含んでなるＣＤＲ３配列を含んでなる単一Ｖ_Ｈドメイン抗体；配列番号１３を含んでなるＣＤＲ１配列、配列番号１４を含んでなるＣＤＲ２配列、および配列番号１５を含んでなるＣＤＲ３配列を含んでなる単一Ｖ_Ｈドメイン抗体；配列番号１７を含んでなるＣＤＲ１配列、配列番号１８を含んでなるＣＤＲ２配列、および配列番号１９を含んでなるＣＤＲ３配列を含んでなる単一Ｖ_Ｈドメイン抗体；配列番号２１を含んでなるＣＤＲ１配列、配列番号２２を含んでなるＣＤＲ２配列、および配列番号２３を含んでなるＣＤＲ３配列を含んでなる単一Ｖ_Ｈドメイン抗体；配列番号２５を含んでなるＣＤＲ１配列、配列番号２６を含んでなるＣＤＲ２配列、および配列番号２７を含んでなるＣＤＲ３配列を含んでなる単一Ｖ_Ｈドメイン抗体；配列番号２９を含んでなるＣＤＲ１配列、配列番号３０を含んでなるＣＤＲ２配列、および配列番号３１を含んでなるＣＤＲ３配列を含んでなる単一Ｖ_Ｈドメイン抗体；配列番号３３を含んでなるＣＤＲ１配列、配列番号３４を含んでなるＣＤＲ２配列、および配列番号３５を含んでなるＣＤＲ３配列を含んでなる単一Ｖ_Ｈドメイン抗体；または、配列番号３７を含んでなるＣＤＲ１配列、配列番号３８を含んでなるＣＤＲ２配列、および配列番号３９を含んでなるＣＤＲ３配列を含んでなる単一Ｖ_Ｈドメイン抗体の一つから選択される単一ヒト可変重鎖ドメイン（Ｖ_Ｈ）抗体を含んでなる、ヒトＰＳＭＡに結合し得る結合分子。
2. 前記単一ドメインＶ_Ｈドメイン抗体が、配列番号４、８、１２、１６、２０、２４、２８、３２、３６、または４０から選択される配列を含んでなる、請求項１に記載の結合分子。
3. 請求項１または２に記載のヒトＰＳＭＡに結合し得る第一の単一ヒト重鎖可変免疫グロブリン（Ｖ_Ｈ）ドメイン抗体と、ヒトＰＳＭＡに結合し得る、第二の単一Ｖ_Ｈドメイン抗体とを含んでなる、結合分子。
4. 前記第一のＶ_Ｈドメインおよび前記第二のＶ_Ｈドメインが、ヒトＰＳＭＡの同じエピトープに結合する、請求項３に記載の結合分子。
5. 前記第一の単一Ｖ_Ｈドメイン抗体がＰＳＭＡの第一のエピトープに結合し、前記第二の単一Ｖ_Ｈドメイン抗体がＰＳＭＡの第二のエピトープに結合する、前記第一および前記第二のエピトープが同一ではない、請求項３に記載の結合分子。
6. 記第二のＶ_Ｈドメイン抗体が表２から選択される、請求項５に記載の結合分子。
7. 第一の単一Ｖ_Ｈドメイン抗体がＣまたはＮ末端に位置する、請求項３〜５のいずれか一項に記載の結合分子。
8. 前記第一および第二のＶ_Ｈドメインがペプチドにより共有結合されている、請求項３〜６のいずれか一項に記載の結合分子。
9. ペプチドが３〜５０の間のアミノ酸長である、請求項８に記載の結合分子。
10. リンカーがグリシンおよびセリンアミノ酸残基を含んでなる、請求項８または８に記載の結合分子。
11. ペプチドリンカーが式（Ｇｌｙ_４Ｓｅｒ）_ｎからなり、ここでｎ＝１〜１０である、請求項８〜１０のいずれか一項に記載の結合分子。
12. 結合分子が、毒素、酵素、放射性同位体または他の化学部分に複合される、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の結合分子。
13. いかなる機能的な内因性の軽または重鎖も生成しないマウスから獲得される、または獲得可能である、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の結合分子。
14. 請求項１〜１３のいずれか一項に記載の結合分子と、医薬担体とを含んでなる、医薬組成物。
15. 請求項１〜１３のいずれか一項に記載の結合分子、または請求項１４に記載の医薬組成物の治療的に有効な量の投与を含んでなる、前立腺癌または前立腺障害を処置するための方法。
16. 薬剤として使用するための、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の結合分子または請求項１４に記載の医薬組成物。
17. 前立腺癌または前立腺障害の処置において使用するための、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の結合分子または請求項１４に記載の医薬組成物。
18. 前立腺癌または前立腺障害の処置のための薬剤の製造における、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の結合分子または請求項１４に記載の医薬組成物の使用。
19. ヒトＰＳＭＡと、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の結合分子との接触を含んでなる、ヒトＰＳＭＡ活性を低減するためのｉｎ ｖｉｖｏまたはｉｎ ｖｉｔｒｏの方法。
20. 前記サンプルと、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の結合分子および少なくとも一つの検出可能な標識との接触を含んでなる、試験サンプル中のＰＳＭＡの存在を免疫学測定法により決定するための方法。
21. 患者の予防的または治療的処置の効果を診断または評価することを含んでなる、請求項１３に記載の方法。
22. 請求項１〜１３のいずれか一項に記載の結合分子をコードする核酸配列を含んでなる、単離された核酸分子。
23. 請求項２１に記載の核酸を含んでなる、構築物。
24. 請求項２１に記載の核酸、または請求項２３に記載の構築物を含んでなる、宿主細胞。
25. 宿主細胞において前記結合分子をコードする核酸を発現すること、および結合分子を宿主細胞培養物から単離することを含んでなる、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の結合分子を生産するための方法。
26. 請求項１〜１３のいずれか一項に記載の結合分子、または請求項１４に記載の医薬組成物を含んでなる、キット。
27. 請求項１〜１３のいずれか一項に記載の単一Ｖ_Ｈドメイン抗体を含んでなる、多重特異性結合分子。
28. 細胞により内在化されうる、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の結合分子。
29. 請求項１〜１３のいずれか一項に記載の単一Ｖ_Ｈドメイン抗体を含んでなる、免疫複合体。