KR20210021486A - 사이토카인 융합 단백질 및 이의 용도 - Google Patents

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판 예
매튜 시겔
지안잉 후앙
에릭 리아오
엘라 리
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안위타 바이오사이언시스, 인코포레이티드
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Abstract

본원은 알부민 결합 모이어티에 융합된 사이토카인을 포함하는 융합 단백질을 제공한다. 융합 단백질은 항원 결합 모이어티, 예를 들어 치료 항체를 추가로 포함할 수 있다. 본원은 또한 융합 단백질의 제조 및 사용 방법을 제공한다. 본원은 또한 반감기 연장 도메인에 융합된 사이토카인을 포함하는 융합 단백질 및 제2 제제를 투여함을 포함하는 치료 방법을 제공한다.

Description

사이토카인 융합 단백질 및 이의 용도
관련 출원에 대한 상호참조
본원은 2018년 6월 18일자로 출원된 미국 가 특허출원 제 62/686,481 호 및 2019년 2월 22일자로 출원된 미국 가 특허출원 제 62/809,496 호의 우선권 이득을 주장한다. 이들 출원의 전체 내용은 모든 목적을 위해 본원에 참고로 인용된다.
출원의 분야
본원은 융합 단백질, 이의 제조 방법, 및 융합 단백질의 투여에 의한 질병 또는 질환의 치료 방법에 관한 것이다.
사이토카인 요법은 질병(예를 들어 암 또는 감염)에 대한 면역반응을 유도하도록 면역계를 자극하는데 유효한 전략이다. 그러나, 환자에게 투여되는 사이토카인은 일반적으로 짧은 반감기를 갖는다. 예를 들어, 인터류킨-21은 다양한 면역세포(예를 들어 T, B 및 NK 세포)를 자극하며 항-종양 활성을 증대시킨다. 재조합 IL-21은 정맥내 투여에 이어서 약 1 내지 3시간의 반감기를 갖는 것으로 보고되었다. 문헌[Schmidt H, Clin Cancer Res. 2010 Nov 1; 16 (2l):5312-9]을 참조하시오.
따라서, 질병 치료에 유효한 신규의 사이토카인 요법을 개발할 필요가 있다.
본원에서 지칭되는 모든 공보, 출원, 특허출원 및 공개된 특허출원의 개시내용은 전체가 본원에 참고로 인용된다.
본원은 a) 사이토카인 및 b) 알부민 결합 모이어티(moiety, 예를 들어 알부민에 결합하는 sdAb)를 포함하는 융합 단백질(fusion protein)을 제공한다. 일부 구현예에서, 사이토카인은 IL-21, IL-7, IL-15, IL-15Ra에 결합된 IL-15 또는 이의 단편, IL-33 및 IL-22로 이루어지는 그룹 중에서 선택된다. 일부 구현예에서, 융합 단백질은 항원 결합 모이어티를 추가로 포함한다.
본원은 또한 a) 알부민 결합 모이어티에 융합된 사이토카인("사이토카인-ALBBM") 및 b) 항원 결합 모이어티를 포함하는 융합 단백질을 제공하며, 여기에서 사이토카인-ALBBM과 항원 결합 모이어티간의 결합은 임의로 절단가능하다. 일부 구현예에서, 사이토카인은 IL-21, IL-7, IL-15, IL-15Ra에 결합된 IL-15 또는 이의 단편, IL-33 및 IL-22로 이루어지는 그룹 중에서 선택된다. 일부 구현예에서, 항원 결합 모이어티는 사이토카인-ALBBM의 C-말단에 융합된다. 일부 구현예에서, 항원 결합 모이어티는 사이토카인-ALBBM의 N-말단에 융합된다. 일부 구현예에서, 항원 결합 모이어티를는 제2 링커를 통해 사이토카인-ALBBM에 융합된다. 일부 구현예에서, 제2 링커는 약 1 내지 30 아미노산의 길이를 갖는다. 일부 구현예에서, 제2 링커는 절단가능하다. 일부 구현예에서, 절단가능한 링커는 기질(matrix) 메탈로프로테아제, 레구마인(legumain), 매트립타제, 또는 유로키나제 민감성이다. 일부 구현예에서, 제2 링커는 서열번호 12-45 및 158-159로 이루어지는 그룹 중에서 선택된다. 일부 구현예에서, 항원 결합 모이어티는 종양 항원에 결합한다. 일부 구현예에서, 종양 항원은 메소텔린("MSLN"), GPA33, Her-2, EGFR 및 CD20으로 이루어지는 그룹 중에서 선택된다. 일부 구현예에서, 종양 항원은 CEA, MUC16, MUC1, AFP, EPCAM, CD19, CD21, CD22, CD30, CD33, CD37, CD45, PSMA, 및 BCMA로 이루어지는 그룹 중에서 선택된다. 일부 구현예에서, 항원 결합 모이어티는 항체 또는 이의 단편이다. 일부 구현예에서, 항원 결합 모이어티는 단일 도메인 항체(sdAb)를 포함한다. 일부 구현예에서, 항원 결합 모이어티는 VHH 단일 도메인 항체를 포함한다. 일부 구현예에서, sdAb는 메소텔린에 결합한다.
상술한 융합 단백질 중 어느 하나에 따른 일부 구현예에서, 사이토카인은 IL-21이다. 일부 구현예에서, IL-21은 서열번호 1, 2, 126, 171 또는 172의 아미노산 서열 또는 서열번호 1, 2, 126, 171 또는 172에 적어도 약 80%(예를 들어 적어도 약 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 중 어느 하나)의 서열 동일성(sequence identity)을 포함하는 이의 변이체를 포함한다.
상술한 융합 단백질 중 어느 하나에 따른 일부 구현예에서, 알부민 결합 모이어티는 인간 혈청 알부민(HSA) 및/또는 키노몰구스 원숭이 혈청 알부민(CMSA)에 결합한다.
상술한 융합 단백질 중 어느 하나에 따른 일부 구현예에서, 알부민 결합 모이어티는 알부민 결합 도메인(ABD)을 포함한다.
상술한 융합 단백질 중 어느 하나에 따른 일부 구현예에서, 알부민 결합 도메인은 서열번호 3-11로 이루어지는 그룹 중에서 선택된 아미노산 서열 또는 서열번호 3-11 중 어느 하나에 적어도 약 80%(예를 들어 적어도 약 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 중 어느 하나)의 서열 동일성을 포함하는 이의 변이체를 포함한다.
상술한 융합 단백질 중 어느 하나에 따른 일부 구현예에서, 알부민 결합 모이어티는 단일 도메인 항체(sdAb)를 포함한다. 일부 구현예에서, sdAb는 VhH 단일 도메인 항체이다.
상술한 융합 단백질 중 어느 하나에 따른 일부 구현예에서, 알부민 결합 모이어티는 사이토카인의 C-말단에 융합된다.
상술한 융합 단백질 중 어느 하나에 따른 일부 구현예에서, 알부민 결합 모이어티는 사이토카인의 N-말단에 융합된다.
상술한 융합 단백질 중 어느 하나에 따른 일부 구현예에서, 사이토카인 및 알부민 결합 모이어티는 제1 링커를 통해 연결된다. 일부 구현예에서, 제1 링커는 약 1 내지 30 아미노산의 길이를 갖는다. 일부 구현예에서, 제1 링커는 서열번호 12-26 및 158-159로 이루어지는 그룹 중에서 선택된다.
본원은 또한 상술한 융합 단백질 중 어느 하나를 포함하는 약학 조성물을 제공한다.
본원은 또한 개체(individual)에게 상술한 융합 단백질 약학 조성물 중 어느 하나를 투여함을 포함하는, 상기 개체에서 질병 또는 상태를 치료하는 방법을 제공한다. 일부 구현예에서, 방법은 제2 제제(agent)를 투여함을 추가로 포함한다.
본원은 또한 개체에게 a) i) 사이토카인 및 ii) 사이토카인에 융합된 반감기 연장 도메인을 포함하는 융합 단백질; 및 b) 제2 제제를 투여함을 포함하는, 상기 개체에서 질병 또는 상태를 치료하는 방법을 제공한다. 일부 구현예에서, 반감기 연장 도메인은 알부민 결합 모이어티이다. 일부 구현예에서, 반감기 연장 도메인은 알부민이다. 일부 구현예에서, 반감기 연장 도메인은 Fc 단편이다. 일부 구현예에서, Fc 단편은 IgG1, IgG2, IgG3 및 IgG4 Fc 단편 또는 이의 변이체로 이루어지는 그룹 중에서 선택된다. 일부 구현예에서, Fc 단편은 IgG1 Fc 단편 또는 이의 변이체이다. 일부 구현예에서, IgG1 Fc 단편 또는 이의 변이체는 297번 위치에 돌연변이를 포함하며, 여기에서 297번 위치의 아미노산은 알라닌, 아스파트산 또는 글리신으로 돌연변이된다. 일부 구현예에서, 개체는 인간이다. 일부 구현예에서, 질병 또는 상태는 암, 염증 상태, 및 감염으로 이루어지는 그룹 중에서 선택된다.
상술한 방법 중 어느 하나에 따른 일부 구현예에서, 질병 또는 상태는 염증 질병이다. 일부 구현예에서, 사이토카인은 IL-22이다. 일부 구현예에서, 질병은 궤양성 대장염, 크론병, 또는 궤양성 회장염, 및 장 이식편대 숙주병으로 이루어지는 그룹 중에서 선택된다.
상술한 방법 중 어느 하나에 따른 일부 구현예에서, 질병 또는 상태는 암이다. 일부 구현예에서, 암은 고형 또는 액체 종양이다. 일부 구현예에서, 암은 중피종(mesothelioma), 폐암, 유방암, 난소암, 췌장암, 림프종, 백혈병, 두경부암, 간암, 식도암, 위암 및 결장직장암으로 이루어지는 그룹 중에서 선택된다. 일부 구현예에서, 암은 중피종, 폐암, 난소암 및 위암으로 이루어지는 그룹 중에서 선택된다. 일부 구현예에서, 사이토카인은 IL-21, IL-7, IL-15, IL-15Ra에 결합된 IL-15 또는 이의 단편, 및 IL-33으로 이루어지는 그룹 중에서 선택된다.
상술한 방법 중 어느 하나에 따른 일부 구현예에서, 융합 단백질을 대략 3주마다 1회 내지 1주일에 2회 투여한다.
상술한 방법 중 어느 하나에 따른 일부 구현예에서, 각각의 투여를 위한 융합 단백질의 양은 약 100 ng/㎏ 내지 약 10 ㎎/㎏이다.
상술한 방법 중 어느 하나에 따른 일부 구현예에서, 융합 단백질을 개체에게 비경구로 투여한다. 일부 구현예에서, 융합 단백질을 개체에게 정맥내로 또는 피하로 투여한다.
상술한 방법 중 어느 하나에 따른 일부 구현예에서, 융합 단백질을 각각의 치료 주기에 대해서 적어도 약 1주일 내지 6개월 동안 투여한다.
상술한 방법 중 어느 하나에 따른 일부 구현예에서, 제2 제제는 치료 항체, 면역관문 억제제(immune checkpoint inhibitor), 제2 사이토카인, 화학요법제, 티로신 키나제 억제제, 또는 면역세포를 포함한다. 일부 구현예에서, 제2 제제는 치료 항체이다. 일부 구현예에서, 치료 항체는 종양 항원에 결합한다. 일부 구현예에서, 종양 항원은 메소텔린(MSLN), GPA33, Her-2(ERBB2), EGFR, 및 CD20(MS4A1)로 이루어지는 그룹 중에서 선택된다. 일부 구현예에서, 종양 항원은 CEA, MUC16, MUC1, AFP, EPCAM, CD19, CD21, CD22, CD30, CD33, CD37, CD45, PSMA, 및 BCMA로 이루어지는 그룹 중에서 선택된다. 일부 구현예에서, 종양 항원은 메소텔린이다. 일부 구현예에서, 제2 제제는 항-메소텔린 항체 또는 이의 단편이다. 일부 구현예에서, 항-메소텔린 항체 또는 이의 단편은 항-메소텔린 중쇄 가변 영역(항-MSLN VH)을 포함하는 단쇄 항체를 포함하며, 여기에서 a) 항-MSLN VH는 서열번호 46의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1, 서열번호 47의 아미노산 서열을 포함하는 CDR2, 및 서열번호 48의 아미노산 서열을 포함하는 CDR3, 또는 상기 CDR들 중 총 3, 2 또는 1개 이하의 아미노산 치환을 포함하는 이의 변이체를 포함하거나; 또는 b) 항-MSLN VH는 서열번호 49의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1, 서열번호 50의 아미노산 서열을 포함하는 CDR2, 및 서열번호 51의 아미노산 서열을 포함하는 CDR3, 또는 상기 CDR들 중 총 3, 2 또는 1개 이하의 아미노산 치환을 포함하는 이의 변이체를 포함한다. 일부 구현예에서, 메소텔린에 결합하는 제2 제제는 개월당 약 1회 내지 주당 약 2회 투여된다. 일부 구현예에서, 각각의 투여에 대한 제2 제제의 양은 약 100 ng/㎏ 내지 약 100 ㎎/㎏이다. 일부 구현예에서, 제2 제제는 면역관문 조절제이다. 일부 구현예에서, 면역관문 조절제는 PD-L1, CTLA4, PD-L2, PD-l, CD47, TIGIT, GITR, TIM3, LAG3, CD27, 4-1BB, 및 B7H4로 이루어지는 그룹 중에서 선택된 면역관문 단백질의 억제제이다. 일부 구현예에서, 면역관문 단백질은 PD-1이다. 일부 구현예에서, 제2 제제는 항-PD-1 항체 또는 이의 단편이다. 일부 구현예에서, 각각의 투여에 대한 제2 제제의 양은 약 1 ㎍/㎏ 내지 약 100 ㎎/㎏이다. 일부 구현예에서, 제2 제제는 제2 사이토카인이다. 일부 구현예에서, 융합 단백질 중의 사이토카인은 IL-21이며, 여기에서 제2 사이토카인은 IL-7, IL-15, IL15Ra에 결합된 IL15 또는 이의 반감기 연장된 변이체로 이루어지는 그룹 중에서 선택된다. 일부 구현예에서, 제2 제제는 면역세포이다. 일부 구현예에서, 면역세포는 T 세포 또는 NK 세포를 포함한다. 일부 구현예에서, 면역세포는 키메라 항원 수용체(CAR)를 발현하는 T 세포, 변형된 T 세포 수용체(TCR)를 발현하는 T 세포 또는 종양으로부터 단리된 T 세포를 포함한다. 일부 구현예에서, 제2 제제는 티로신 키나제 억제제이다. 일부 구현예에서, 제2 제제는 개체에게 비경구로 또는 경구로 투여된다. 일부 구현예에서, 제2 제제는 개체에게 비경구로 투여된다. 일부 구현예에서, 제2 제제는 개체에게 정맥내로 투여된다.
상술한 방법 중 어느 하나에 따른 일부 구현예에서, 융합 단백질 및 제2 제제를 개체에게 동시에, 동반하여 또는 순차적으로 투여한다.
도 1은 본원에 제공된 예시적인 IL-21 융합 단백질을 묘사한다.
도 2는 예시적인 IL-21 융합 단백질 발현 벡터의 조립을 묘사하며, 여기에서 알부민 결합 분자는 항-HSA 항체이다.
도 3은 예시적인 IL-21 융합 단백질 발현 벡터의 조립을 묘사하며, 여기에서 알부민 결합 분자는 HSA에 결합하는 ABD이다.
도 4는 인간, 원숭이 또는 마우스 혈청 알부민과 상호작용시의 항-HSA 항체 P367의 KD를 도시한다. P394-hgG1 Fc 융합 단백질을 단백질 A 바이오센서상에 로딩하고 인간, 원숭이 또는 마우스 혈청 알부민내에 침지하였다. 컬러 라인은 400 nM(짙은 청색), 200 nM(짙은 적색) 및 100 nM(밝은 청색)에서 상이한 농도의 혈청 알부민에 대한 결합 반응을 나타낸다. 실험 데이터를 전체 적합(적색)으로 분석하여 KD를 측정하였다.
도 5는 재조합 IL-21과 비교된 항-HSA IL-21 접합체 P390 및 P394 신호전달 효능을 도시한다.
도 6A는 항-메소텔린 항체 P303과 함께 P390, P394 및 P461/P462 존재하의 N87 세포에 대한 PBMC의 ADCC 활성을 도시한다. 도 6B는 H226 세포에 대한 항-메소텔린 항체 P303과 함께 P390, P394 및 P461/P462 존재하의 H226 세포에 대한 PBMC의 ADCC 활성을 도시한다. 도 6C는 3 ng/㎖ P303과 함께 상이한 투여량의 P390, P394, P461/P462 및 P461/P463 존재하의 N87 세포에 대한 PBMC의 ADCC 활성을 도시한다. 도 6D는 20 ng/㎖ P303과 함께 상이한 투여량의 P390, P394, P461/P462 및 P461/P463 존재하의 H226 세포에 대한 PBMC의 ADCC 활성을 도시한다.
도 7A는 IL-21-항-HSA 융합 단백질 변이체 P394, P593, P636, P637, P744, P748, P750, P751 및 P783에 의한 STAT3 신호전달을 도시한다. 도 7B 및 7C는 고정된 용량의 항-MSLN 항체(P303)에서 IL-21-항-HSA 융합 단백질 변이체 P394, P593, P636, P637, P744, P748, P750, P751 및 P783의 적정시 NCI-N87 종양 세포에 대한 NK 세포 매개된 ADCC를 도시한다.
도 8은 마우스에서 3 ㎍의 재조합 인간 IL-21, 3 pg의 P325(인간 IL-21-관련없는 나노바디) 및 3 또는 30 pg의 P394(인간 IL-21-항-HSA)의 약동학의 비교를 묘사한다.
도 9A, 9F 및 9G는 IL-21-항-HSA 융합 단백질 P394(즉 AWT-P394) 및 P593(즉 AWT-P593) 및 P748의 염색을 도시하는 SDS-PAGE 사진을 묘사한다. 도 9F 및 9G에서, 화살표는 온전한 표적 단백질을 가리키고, 별표는 절단된 단백질을 가리킨다. 도 9B는 AWT-P394 IL21-항 HSA 융합 단백질의 전형적인 크로마토그램을 묘사한다. 도 9C는 pH 4.0 및 pH 7.5에서 AWT-P593의 Tonset의 비교를 묘사한다. 도 9D는 AWT-P394 및 AWT-P593의 Tonset을 묘사한다. 도 9E는 IL-21-항-HSA 융합 단백질 AWT-P394 또는 AWT-P593에 대한 인간 IL021 수용체의 결합을 묘사한다.
도 10A는 pH 4.0 및 pH 7.5에서 AWT-P593의 Tonset의 비교를 묘사한다. 도 10B는 AWT-P394 및 AWT-P593의 Tonset의 비교를 묘사한다. 도 10C는 pH 7.4 및 pH 5.5에서 인간화된 항-AWT-P610(즉 P610)과 인간 혈청 알부민 또는 원숭이 혈청 알부민과의 결합을 묘사한다. 도 10D는 항-알부민 항체 AWT-P367 및 이의 인간화된 버전 AWT-P494의 Tonset의 비교를 묘사한다. 도 10E는 항-알부민 항체 AWT-P342 및 이의 인간화된 버전 AWT-P610의 Tonset의 비교를 묘사한다. 도 10D는 항-HSA 항체 AWT-367 및 이의 인간화된 항-AWT-P494와 인간, 원숭이 또는 마우스 알부민과의 결합을 묘사한다. 도 10E는 AWT-P367 또는 AWT-494와 인간, 원숭이 또는 마우스 알부민과의 결합의 KD를 묘사한다.
도 11은 NK 세포 단독 또는 도면에 도시된 바와 같은 연구 약물과 함께 처리후의 N87 세포의 남은 세포수를 묘사한다.
도 12는 NK 세포 단독 또는 a) 허셉틴 단독, b) P303FF(즉 P303F) 단독, c) 허셉틴 및 P303FF, 또는 d) 허셉틴, P303FF, 및 IL-21-항-HSA 융합 단백질 P394와 함께 처리 후의 N87 세포의 남은 세포수를 묘사한다.
도 13은 a) 리툭산, b) 리툭산 및 P394, c) 리툭산 및 IL-15 융합 단백질 P480, 또는 d) 리툭산 및 IL-15와 함께 NK 세포 처리 후의 죽은 프라이퍼(Preiffer) 세포의 백분율을 묘사한다.
도 14는 a) P303F, b) P303F 및 재조합 인간 IL-21(즉 hrIL-21), c) P303F 및 P480, 또는 d) P303F 및 재조합 인간 IL-15(즉 rhIL-15)와 함께 NK 세포 처리 후의 N87 세포의 남은 세포수를 묘사한다.
도 15는 a) P480, b) P597, 또는 c) rIL-l5(상부 패널)와 함께 NK 세포 처리 후의 N87 세포의 남은 세포수 및 3개 약물의 IC50(하부 패널)을 묘사한다.
도 16은 a) 항-메소텔린 항체 P129(즉 R2G12) 및 P126(즉 인간 IL-2l-R2Gl2-IgGl 융합), b) P129 및 IL-21, c) P129 및 P107(인간 IL-2l-IgGl 융합), d) P129 및 P325(인간 IL-21-R2D2 융합), 또는 e) P129 및 P286/288(인간 IL-21-R3C7-IgGl-R2Gl2)과 함께 NK 세포 처리 후의 H226 세포의 남은 세포수를 묘사한다.
도 17은 a) P197 및 P390; 또는 b) P197 및 P394와 함께 NK 세포 처리 후의 N87 세포의 남은 세포수를 묘사한다.
도 18A-18B는 도시된 상이한 약물과의 배양후에 PBMC에 의해 분비된 IFN-감마(도 18A) 및 IL-6(도 18B)의 수준을 묘사한다.
도 19A-19B는 MC38 마우스 동계 종양 모델에서 항-CTLA-4, IL-21-항-HSA 융합 단백질(P394), 항-HSA-IL-15Ra/IL-15 융합 단백질(P597) 또는 이들 제제의 조합과 함께 투여시 종양 부피의 변화를 묘사한다.
도 20은 MC38 동계 마우스 종양 모델에서 IL-21-항-HSA 융합 단백질(P394), 항-HSA-IL-15Ra/IL-15 융합 단백질(P597) 또는 이들 제제의 조합으로 처리 후의 종양 부피의 변화를 묘사한다.
도 21은 MC38 동계 모델의 동물 모델에서 a) 100 ㎍의 항-PD-l 항체, b) 25 pg의 P390, c) 100 pg의 항-PD-l 항체 및 25 pg의 P390 또는 d) 100 pg의 항-PD-1 항체 및 5 pg의 P390으로 처리 후의 종양 부피의 변화를 묘사한다.
도 22는 N87 종양을 갖는 NSG 마우스의 동물 모델에서 a) 25 pg의 P394, b) 100 pg의 P303F, c) 100 pg의 P303F 및 25 pg의 P394, 또는 d) 100 pg의 P303F 및 5 pg의 P394로 처리 후의 종양 부피의 변화를 묘사한다.
도 23은 N87 종양을 갖는 NSG 마우스의 동물 모델에서 a) 25 pg의 P394, b) 20 pg의 허셉틴, c) 20 pg의 허셉틴 및 25 pg의 P394, 또는 d) 20 pg의 허셉틴 및 5 pg의 P394로 처리 후의 종양 부피의 변화를 묘사한다.
도 24는 N87 종양을 갖는 SCID 마우스의 동물 모델에서 100 pg의 P303F 단독 또는 a) 25 pg의 P390 b) 5 pg의 P390, 또는 c) 2.5 pg의 rmIL-2l과 함께 처리 후의 종양 부피의 변화를 묘사한다.
도 25는 MC38 동계 모델의 동물 모델에서 25 pg의 P390 또는 12.5 pg의 rmIL-2l로 처리 후의 종양 부피의 변화를 묘사한다.
도 26은 CT-26/MSLN의 동물 모델에서 항-PD-1 항체 단독, P390 단독, 또는 항-PD-1 항체 및 P390의 조합으로 처리 후의 종양 부피의 변화를 묘사한다.
도 27은 MC38 동계 모델의 동물 모델에서 항-PD-1 항체 단독, P394 단독, 또는 항-PD-1 항체 및 P394의 조합으로 처리 후의 종양 부피의 변화를 묘사한다.
도 28은 마우스 MC38 동계 종양 모델에서 항-HSA-IL-33 융합 단백질(P380)로 처리 후의 종양 부피의 변화를 묘사한다.
도 29A-29B는 P390으로 처리 후의 그랜자임 B 양성 NK 세포(도 29A) 및 CD8 T 세포(도 29B)의 변화 백분율을 묘사한다.
도 30A-30C는 항-PD-1 항체 단독 또는 P390과 함께 항-PD-1 항체로 처리 후의 CD8 T 세포(도 32A), CD4 T 세포(도 32B) 및 NK 세포(도 32C)에서 IL-21 수용체의 발현 수준의 변화를 묘사한다.
도 31은 항-PD-1 항체 단독, P390 단독, 항-PD-1 항체 및 P390의 조합, 또는 항-PD-1 항체 및 rmIL-21의 조합으로 처리 후의 비장에서 IFN-감마 분비 면역세포의 세포수를 묘사한다.
도 32는 마우스 동계 CT26/MSLN 종양 모델에서 IL-21-항-HSA-항-MSLN 융합 단백질(P375)을 사용하는 종양 부피의 변화를 묘사한다.
도 33은 N87 종양을 갖는 NSG 마우스의 동물 모델에서 항-MSLN-항-HSA-IL-15Ra/IL15 융합 단백질(P669)로 처리 후의 종양 부피의 변화를 묘사한다.
도 34는 다양한 IL-21 융합 단백질이 유사한 신호전달 효능을 가짐을 묘사한다.
도 35는 다양한 IL-21 융합 단백질이 유사한 ADCC 활성을 가짐을 묘사한다.
본원은 사이토카인 및 반감기 연장 도메인을 포함하는 융합 단백질에 관한 것이다. 일부 구현예에서, 사이토카인은 IL-21, IL-7, IL-15, IL-15Ra에 결합된 IL-15 또는 이의 단편, IL-33 및 IL-22로 이루어지는 그룹 중에서 선택된다. 일부 구현예에서, 융합 단백질은 a) 알부민 결합 모이어티에 융합된 사이토카인("사이토카인-ALBBM") 및 b) 항원 결합 모이어티를 포함하며; 사이토카인-ALBBM과 항원 결합 모이어티간의 결합은 임의로 절단가능하다.
본원은 또한 상술한 바와 같은 융합 단백질을 투여함을 포함하는 질병 또는 질환(예를 들어 암 또는 염증 질병)의 치료 방법을 제공한다. 일부 구현예에서, 방법은 a) i) 사이토카인 및 ii) 반감기 연장 도메인을 포함하는 융합 단백질; 및 b) 제2 제제를 투여함을 포함한다. 예시적인 제2 제제는 비제한적으로 치료제, 면역관문 억제제, 제2 사이토카인, 티로신 키나제 억제제, 화학요법제, 또는 면역세포를 포함한다.
또한, 본원에 기재된 이중특이성 항체를 포함하는 조성물, 키트 및 제조 물품 및 이의 제조 방법을 제공한다.
I. 정의
"항체"란 용어는 이의 가장 넓은 의미로 사용되며 다양한 항체 구조물, 예를 들어 비제한적으로 단클론 항체, 다클론 항체, 다중특이성 항체(예를 들어 이중특이성 항체), 완전길이 항체, 및 목적하는 항원-결합 활성을 나타내는 한 이의 항원-결합 단편을 포함한다. "항체 부분"이란 용어는 완전길이 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 지칭한다.
"단리된" 항체(또는 구조물)는 이의 생성 환경(예를 들어 천연 또는 재조합)의 성분으로부터 식별, 분리 및/또는 회수된 것이다. 바람직하게, 단리된 폴리펩티드는 이의 생성 환경으로부터의 모든 다른 성분들과 결합되지 않는다. 재조합 형질감염된 세포로부터 생성되는 것과 같은, 이의 생성 환경의 오염 성분은 전형적으로 항체에 대한 연구, 진단 또는 치료 용도를 방해하는 물질이며, 효소, 호르몬 및 다른 단백질성 또는 비-단백질성 용질을 포함할 수 있다. 바람직한 구현예에서, 폴리펩티드는 (1) 예를 들어 로우리법에 의해 측정시 항체의 95 중량% 초과까지, 및 일부 구현예에서 99 중량% 초과까지; (2) 회전컵 서열분석기의 사용에 의해 N-말단 또는 내부 아미노산 서열의 적어도 15개 잔기를 획득하기에 충분한 정도로; 또는 (3) 쿠마씨 블루 또는 바람직하게는 은 색소를 사용하여 비-환원 또는 환원 조건하에서 SDS-PAGE에 의해 동종성으로 정제될 것이다. 단리된 항체(또는 구조물)는 항체의 천연 환경의 적어도 하나의 성분이 존재하지 않을 것이므로 재조합 세포내 제자리 항체를 포함한다. 그러나, 통상적으로, 단리된 폴리펩티드, 항체 또는 구조물은 적어도 하나의 정제 단계에 의해 제조될 것이다.
완전길이 항체는 2개의 중쇄 및 2개의 경쇄를 포함한다. 경쇄 및 중쇄의 가변 영역은 항원 결합을 담당한다. 중쇄 및 경쇄의 가변 도메인을 각각 "VH" 및 "VL"로서 지칭할 수 있다. 상기 두 쇄 모두에서 가변 영역은 일반적으로 상보성 결정 영역(CDR)이라 칭하는 3개의 매우 가변성인 고리(LC-CDR1, LC-CDR2 및 LC-CDR3를 포함한 경쇄(LC) CDR, HC-CDR1, HC-CDR2 및 HC-CDR3를 포함한 중쇄(HC) CDR)를 포함한다. 본원에 개시된 항체 및 항원-결합 단편에 대한 CDR 경계는 Rabat, Chothia, 또는 Al-Lazikani(Al-Lazikani 1997; Chothia 1985; Chothia 1987; Chothia 1989; Rabat 1987; Rabat 1991)의 규약에 의해 정의되거나 식별될 수 있다. 중쇄 또는 경쇄의 3개의 CDR은 프레임워크 영역(FR)(CDR보다 더 고도로 보존되며 고가변 고리를 지지하는 스캐폴드를 형성한다)으로서 공지된 측면인접 신장부 사이에 끼어있다. 중쇄 및 경쇄의 불변 영역은 항원 결합에 관련되지 않지만 다양한 효과기 기능을 나타낸다. 항체는 이의 중쇄의 불변 영역의 아미노산 서열을 기준으로 부류로 할당된다. 항체의 5개의 주요 부류 또는 아이소타입은 IgA, IgD, IgE, IgG 및 IgM이며, 이들은 각각 α, δ, ε, γ 및 μ 중쇄의 존재를 특징으로 한다. 주요 항체 부류 중 다수는 하위 부류, 예를 들어 IgG1(γ1 중쇄), IgG2(γ2 중쇄), IgG3(γ3 중쇄), IgG4(γ4 중쇄), IgA1(a1 중쇄), 또는 IgA2(a2 중쇄)로 분류된다.
"완전길이 항체", "온전한 항체", 또는 "전체 항체"란 용어는 항체 단편과 상반되게, 이의 실질적인 온전한 형태의 항체를 지칭하는 것으로 호환가능하게 사용된다. 구체적으로, 완전길이 4-쇄 항체는 Fc 영역을 포함하는 중쇄 및 경쇄를 갖는 것들을 포함한다. 완전길이 중쇄만의 항체는 중쇄 가변 도메인(예를 들어 VHH) 및 Fc 영역을 포함한다. 불변 도메인은 고유 서열 불변 도메인(예를 들어 인간 고유 서열 불변 도메인) 또는 이의 아미노산 서열 변이체일 수 있다. 일부의 경우에, 온전한 항체는 하나 이상의 효과기 기능을 가질 수 있다.
항체의 "가변 영역" 또는 "가변 도메인"은 항체의 중쇄 또는 경쇄의 아미노-말단 도메인을 지칭한다. 중쇄 및 경쇄의 가변 도메인은 각각 "VH" 및 "VL"로서 지칭될 수 있다. 이들 도메인은 일반적으로 항체의 가장 가변적인 부분(동일한 부류의 다른 항체에 비해)이며, 항원 결합 부위를 함유한다. 카멜리드 종으로부터의 중쇄만의 항체는 단일 중쇄 가변 영역("VHH"로서 지칭된다)을 갖는다. 따라서 VHH는 특별한 유형의 VH이다.
본원에 사용되는 바와 같은 "항원-결합 단편"이란 용어는 예를 들어 디아바디, Fab, Fab', F(ab')2, Fv 단편, 디설파이드 안정화된 Fv 단편(dsFv), (dsFv)2, 이중특이성 dsFv(dsFv-dsFv'), 디설파이드 안정화된 디아바디(ds 디아바디), 단쇄 Fv(scFv), scFv 이량체(2가 디아바디), 하나 이상의 CDR을 포함하는 항체의 부분으로부터 형성된 다중특이성 항체, 카멜화된 단일 도메인 항체, 나노바디, 도메인 항체, 2가 도메인 항체, 또는 항원에 결합하지만 완전한 항체 구조를 포함하지 않는 임의의 다른 항체 단편을 포함한 항체 단편을 지칭한다. 항원-결합 단편은 모 항체 또는 모 항체 단편(예를 들어 모 scFv)이 결합하는 동일한 항원에 결합할 수 있다. 일부 구현예에서, 항원-결합 단편은 하나 이상의 상이한 인간 항체로부터의 프레임워크 영역에 접목된 특정한 인간 항체로부터의 하나 이상의 CDR을 포함할 수 있다.
"Fv"는 완전한 항원-인식 및 -결합 부위를 함유하는 최소 항체 단편이다. 상기 단편은 단단하게 비-공유 결합된, 하나의 중- 및 하나의 경-쇄 가변 영역 도메인의 이량체로 이루어진다. 이들 두 도메인의 폴딩으로부터, 항원 결합을 위한 아미노산 잔기를 제공하고 항체에 항원 결합 특이성을 부여하는 6개의 고가변 고리(각각 중쇄 및 경쇄로부터 3개의 고리)가 나온다. 그러나, 단일 가변 도메인(또는 항원에 특이적인 단지 3개의 CDR만을 포함하는 Fv의 절반)이라도, 전체 결합 부위보다는 낮은 친화성이지만, 항원을 인식하고 결합하는 능력을 갖는다.
"단쇄 Fv"(또한 "sFv" 또는 "scFv"로서 약기됨)는 단일 폴리펩티드 쇄로 연결되는 VH 및 VL 항체 도메인을 포함하는 항체 단편이다. 일부 구현예에서, scFv 폴리펩티드는 상기 scFv가 항원 결합을 위해 목적하는 구조를 형성하게 할 수 있는 VH 및 VL 도메인간의 폴리펩티드 링커를 추가로 포함한다. scFv에 대한 리뷰를 위해서, 문헌[Pluckthun in The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol. 113, Rosenburg and Moore eds., Springer-Verlag, New York, pp. 269-315 (1994)]을 참조하시오.
"중쇄만의 항체" 또는 "HCAb"란 용어는, 중쇄를 포함하지만 경쇄는 없는, 대개는 4-쇄 항체에서 발견되는 기능성 항체를 지칭한다. 카멜리드 동물(예를 들어 낙타, 라마, 또는 알파카)이 HCAb를 생산하는 것으로 알려져 있다.
"단일-도메인 항체", "단일 도메인 항체" 또는 "sdAb"란 용어는 3개의 상보성 결정 영역(CDR)을 갖는 단일 항원-결합 폴리펩티드를 지칭한다. sdAb는 단독으로 상응하는 CDR-함유 폴리펩티드와 짝을 이루지 않고 항원에 결합할 수 있다. 일부의 경우에, 단일-도메인 항체는 카멜리드 HCAb로부터 조작되며, 이의 중쇄 가변 도메인을 본원에서 "VHHS"(중쇄 항체의 중쇄의 가변 도메인)로서 지칭한다. 카멜리드 sdAb는 공지된 가장 작은 항원-결합 항체 단편 중 하나이다(예를 들어 문헌: Hamers-Casterman el al., Nature 363:446-8 (1993); Greenberg et al., Nature 374: 168-73 (1995); Hassanzadeh-Ghassabeh et al., Nanomedicine (Lond), 8: 1013-26 (2013)을 참조하시오). 염기성 VHH는 N-말단에서부터 C-말단으로 하기의 구조를 갖는다: FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4, 여기에서 FR1 내지 FR4는 각각 프레임워크 영역 1 내지 4를 지칭하며, CDR1 내지 CDR3은 상보성 결정 영역 1 내지 3을 지칭한다.
"고가변 영역", "HVR" 또는 "HV"란 용어는 본원에서 사용될 때 서열 중 고가변성이고/이거나 구조적으로 한정된 고리를 형성하는 항체 가변 도메인의 영역을 지칭한다. 일반적으로, 단일-도메인 항체는 3개의 HVR(또는 CDRs): HVR1(또는 CDR1), HVR2(또는 CDR2), 및 HVR3(또는 CDR3)을 포함한다. HVR3(또는 CDR3)은 3개의 HVR 중 가장 큰 다양성을 나타내며 항체에 미세한 특이성을 부여하는 특유의 역할을 하는 것으로 여겨진다. 예를 들어 문헌: Hamers-Casterman et al., Nature 363:446-448 (1993); Sheriff et al, Nature Struct. Biol. 3:733-736 (1996)을 참조하시오.
본원에 사용되는 바와 같이, "CDR" 또는 "상보성 결정 영역"은 중쇄 및 경쇄 폴리펩티드 모두의 가변 영역내에서 발견되는 인접하지 않은 항원 결합 부위를 의미하고자 한다. 이들 특정 영역은 하기의 문헌에 개시되었으며, 여기에서 정의는 서로에 대해 비교될 때 아미노산 잔기의 중복 또는 부분집합을 포함한다: Kabat et al. , J. Biol. Chem. 252:6609-6616 (1977); Kabat et al., U.S. Dept of Health and Human Services, “Sequences of proteins of immunological interest"(1991); Chothia et al., J. ol. Biol. 196:901-917 (1987); Al-Lazikani B. et al., J. Mol. Biol., 273 : 927-948 (1997); MacCallum et al, J. Mol. Biol. 262:732-745 (1996); Abhinandan and Martin, Mol. Immunol., 45: 3832-3839 (2008); Lefranc M.P. et al., Dev. Comp. Immunol., 27: 55-77 (2003); 및 Honegger and Pluckthun, J. Mol. Biol., 309:657-670 (2001). 그럼에도 불구하고, 항체 또는 접목된 항체 또는 이의 변이체의 CDR을 지칭하기 위한 어느 하나의 정의의 적용은 본원에 정의되고 사용된 바와 같은 용어의 범위내에 있고자 한다. 상기에 인용된 각각의 참고문헌에 의해 정의된 바와 같은 CDR을 포함하는 아미노산 잔기를 비교로서 하기 표 1에 제시한다. CDR 예측 알고리즘 및 인터페이스는, 예를 들어 하기의 문헌을 포함하여 당해 분야에 공지되어 있다: Abhinandan and Martin, Mol. Immunol., 45: 3832-3839 (2008); Ehrenmann F. et al., Nucleic Acids Res., 38: D301-D307 (2010); 및 Adolf-Bryfogle J. et al., Nucleic Acids Res., 43 : D432-D438 (2015). 상기 단락에 인용된 참고문헌의 내용은 내용 전체가 본원에서의 사용 및 본원의 하나 이상의 청구항에 가능한 포함을 위해 본원에 참고로 인용된다.
[표 1]
CDR 정의
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잔기 넘버링은 상기 Kabat 등의 명명법에 따른다
2잔기 넘버링은 상기 Chothia 등의 명명법에 따른다
3잔기 넘버링은 상기 MacCallum 등의 명명법에 따른다
4잔기 넘버링은 상기 Lefranc 등의 명명법에 따른다
5잔기 넘버링은 상기 Honegger and Pluckthun의 명명법에 따른다
"Kabat에서와 같은 가변-도메인 잔기-넘버링" 또는 "Kabat에서와 같은 아미노산 위치 넘버링"이란 표현 및 이들의 변형은 상기 Kabat 등에서의 항체 편집의 중쇄 가변 도메인 또는 경쇄 가변 도메인에 사용된 넘버링 시스템을 지칭한다. 상기 넘버링 시스템을 사용하는 경우, 실제 선형 아미노산 서열은 가변 도메인의 FR 또는 HVR의 단축 또는 상기에의 삽입에 상응하는 보다 적은 또는 추가의 아미노산을 함유할 수 있다. 예를 들어, 중쇄 가변 도메인은 H2의 잔기 52 다음에 단일 아미노산 삽입(Kabat에 따른 잔기 52a) 및 중쇄 FR 잔기 82 다음에 삽입된 잔기(예를 들어 Kabat에 따른 잔기 82a, 82b 및 82c 등)를 포함할 수 있다. 잔기의 Kabat 넘버링은 주어진 항체에 대해 "표준" Kabat 넘버링된 서열과 항체 서열의 상동성 부위에서의 정렬에 의해 결정될 수 있다.
본원에서 달리 나타내지 않는 한, 면역글로불린 중쇄 중의 잔기의 넘버링은 상기 Kabat 등에서와 같은 EU 지수의 넘버링이다. "Kabat에서와 같은 EU 지수"는 인간 IgG1 EU 항체의 잔기 넘버링을 지칭한다.
"프레임워크" 또는 "FR" 잔기는 본원에 정의된 바와 같은 CDR 잔기 이외의 가변-도메인 잔기들이다.
비-인간(예를 들어 설치류) 항체의 "인간화된" 형태는 비-인간 항체로부터 유래된 최소 서열을 함유하는 키메라 항체이다. 대개, 인간화된 항체는 수용자의 고가변 영역(HVR)로부터의 잔기가, 목적하는 항체 특이성, 친화성 및 능력을 갖는 비-인간 종(공여자 항체), 예를 들어 마우스, 래트, 토끼 또는 비-인간 영장류의 고가변 영역으로부터의 잔기에 의해 교체된 인간 면역글로불린(수용자 항체)이다. 일부 예에서, 인간 면역글로불린의 프레임워크 영역(FR) 잔기는 상응하는 비-인간 잔기에 의해 교체된다. 더욱 또한, 인간화된 항체는 수용자 항체 또는 공여자 항체에서 발견되지 않는 잔기를 포함할 수 있다. 이러한 변형은 항체 성능을 더욱 개선시킨다. 일반적으로, 인간화된 항체는 고가변 고리의 전부 또는 실질적으로 전부가 비-인간 면역글로불린의 것에 상응하고 FR의 전부 또는 거의 전부가 인간 면역글로불린 서열의 것인 적어도 하나, 및 전형적으로 2개의 가변 도메인을 실질적으로 전부 포함할 것이다. 인간화된 항체는 임의로 또한 면역글로불린 불변 영역(Fc)의 적어도 일부, 전형적으로 인간 면역글로불린의 적어도 일부를 포함할 것이다. 추가의 상세한 내용에 대해서, 하기의 문헌을 참조하시오: Jones et al, Nature 321:522-525 (1986); Riechmann et al, Nature 332:323-329 (1988); 및 Presta, Curr. Op. Struct. Biol. 2:593-596 (1992).
본원에 나타낸 폴리펩티드 및 항체 서열에 관하여 "아미노산 서열 동일성 퍼센트(%)" 또는 "상동성"은, 서열 동일성의 부분으로서 임의의 보존적 치환을 고려하여 서열들을 정렬시킨 후에, 비교되는 폴리펩티드 중의 아미노산 잔기와 일치하는 후보 서열 중의 아미노산 잔기의 백분율로서 정의된다. 아미노산 서열 동일성 퍼센트의 측정을 위한 정렬은 당해 분야의 기술내에 있는 다양한 방식으로, 예를 들어 공개적으로 입수할 수 있는 컴퓨터 소프트웨어, 예를 들어 BLAST, BLAST-2, ALIGN, Megalign(DNASTAR), 또는 MUSCLE 소프트웨어를 사용하여 성취될 수 있다. 당해 분야의 숙련가들은 비교되는 서열들의 전체 길이에 걸쳐 최대의 정렬을 성취하는데 필요한 임의의 알고리즘을 포함하여, 정렬을 측정하기에 적합한 매개변수를 결정할 수 있다. 그러나, 본원의 목적을 위해서, 아미노산 서열 동일성%를 서열 비교 컴퓨터 프로그램 MUSCLE(Edgar, R.C., Nucleic Acids Research 32(5): 1792-1797, 2004; Edgar, R.C., BMC Bioinformatics 5(1): 113, 2004)을 사용하여 생성시킨다.
"상동성"은 2개의 폴리펩티드 또는 2개의 핵산 분자간의 서열 유사성 또는 서열 동일성을 지칭한다. 2개의 비교된 서열 모두 중의 하나의 위치가 동일한 염기 또는 아미노산 단량체 서브유닛에 의해 점유되는 경우, 예를 들어 2개의 각각의 DNA 분자 중의 하나의 위치가 아데닌에 의해 점유되는 경우, 상기 분자들은 상기 위치에서 상동성이다. 2개 서열간의 상동성의 퍼센트는 비교되는 위치의 수로 나눈 상기 2개 서열에 의해 공유된 합치하는 또는 상동성인 위치의 수 x 100의 함수이다. 예를 들어, 2개 서열 중의 위치 10개 중 6개가 합치되거나 상동성인 경우, 상기 두 서열은 60% 상동성이다. 예로서, DNA 서열 ATTGCC 및 TATGGC는 50% 상동성을 공유한다. 일반적으로, 비교는 2개의 서열이 최대의 상동성을 제공하도록 정렬될 때 이루어진다.
"불변 도메인"이란 용어는 면역글로불린의 다른 부분, 항원-결합 부위를 함유하는 가변 도메인에 비해 더 보존된 아미노산 서열을 갖는 면역글로불린 분자의 부분을 지칭한다. 불변 도메인은 중쇄의 CM, CH2 및 CH3 도메인(집합적으로 CH) 및 경쇄의 CHL(또는 CL) 도메인을 함유한다.
임의의 포유동물 종으로부터의 항체(면역글로불린)의 "경쇄"는 이의 불변 도메인의 아미노산 서열을 기준으로, 카파("κ") 및 람다("λ")라 칭하는 2개의 명백히 다른 유형 중 하나로 할당된다.
인간 IgG Fc 영역의 "CH1 도메인"(또한 "H1" 도메인의 "C1"으로서 지칭됨)은 대개 약 아미노산 118에서부터 약 아미노산 215(EU 넘버링 시스템)까지 연장된다.
"힌지 영역"은 일반적으로 인간 IgG1의 Glu216 내지 Pro230에 상응하는 IgG 중의 영역으로서 정의된다(Burton, Mo!ec. Immunol.22: 161-206 (1985)). 다른 IgG 아이소타입의 힌지 영역을, 중쇄-간 S-S 결합을 형성하는 첫 번째 및 마지막 시스테인 잔기를 동일한 위치에 놓음으로써 IgG1 서열과 정렬시킬 수 있다.
인간 IgG Fc 영역의 "CH2 도메인"(또한 "H2" 도메인의 "C2"로서 지칭됨)은 대개 약 아미노산 231에서부터 약 아미노산 340까지 연장된다. CH2 도메인은 또 다른 도메인과 가깝게 짝을 이루지 않는다는 점에서 독특하다. 오히려, 2개의 N-연결된 분지된 탄수화물 쇄가 온전한 고유 IgG 분자의 2개의 CH2 도메인사이에 끼어있다. 탄수화물은 도메인-도메인 짝짓기를 위한 대용물을 제공하고 CH2 도메인의 안정화를 도울 수 있는 것으로 추측되었다. Burton, Molec Immunol. 22: 161-206 (1985).
"CH3 도메인"(또한 "C2" 또는 "H3" 도메인으로서 지칭됨)은 Fc 영역 중의 C-말단 잔기에서 CH2 도메인까지의 신장부(즉, 항체 서열의 약 아미노산 잔기 341에서부터 C-말단 단부, 전형적으로는 IgG의 아미노산 잔기 446 또는 447의 단부까지)를 포함한다.
본원에서 "Fc 영역" 또는 "단편 결정화가능한 영역"이란 용어는 고유-서열 Fc 영역 및 변형 Fc 영역을 포함하여, 면역글로불린 중쇄의 C-말단 영역을 한정하는데 사용된다. 면역글로불린 중쇄의 Fc 영역의 경계는 변할 수 있지만, 인간 IgG 중쇄 Fc 영역은 대개 Cys226번 위치의 아미노산 잔기에서부터 또는 Pro230에서부터 이의 카복시-말단까지 신장하는 것으로 한정된다. Fc 영역의 C-말단 리신(EU 넘버링 시스템에 따라 잔기 447)을, 예를 들어 항체의 생성 또는 정제 중에, 또는 항체의 중쇄를 암호화하는 핵산을 재조합적으로 조작함으로써 제거할 수 있다. 따라서, 온전한 항체의 조성물은 K447 잔기가 모두 제거된 항체 집단, K447 잔기가 제거되지 않은 항체 집단, 및 K447 잔기가 있고 없는 항체들의 혼합물을 갖는 항체 집단을 포함할 수 있다. 분원에 기재된 항체에 사용하기에 적합한 고유-서열 Fc 영역은 인간 IgG1, IgG2(IgG2A, IgG2B), IgG3 및 IgG4를 포함한다.
"Fc 수용체" 또는 "FcR"은 항체의 Fc 영역에 결합하는 수용체를 기재한다. 바람직한 FcR은 고유 서열 인간 FcR이다. 더욱이, 바람직한 FcR은, IgG 항체(감마 수용체)에 결합하고 FcyRI, FcyRII 및 FcyRIII 하위부류의 수용체, 예를 들어 대립유전자 변이체 및 한편으로 상기 수용체의 이어맞춘 형태를 포함하는 것이며, FcyRII 수용체는 주로 세포질 도메인에서 상이한 유사한 아미노산 서열을 갖는 FcyRIIA("활성화 수용체") 및 FcyRIIB("억제 수용체")를 포함한다. 활성화 수용체 FcyRIIA는 이의 세포질 도메인 중에 면역수용체 티로신-계 활성화 동기(ITAM)를 함유한다. 억제 수용체 FcyRIIB는 이의 세포질 도메인 중에 면역수용체 티로신-계 억제 동기(ITIM)를 함유한다(문헌:M. Daeron, Annu. Rev. Immunol. 15:203-234 (1997). FcRs are reviewed in Ravetch and Kinet, Annu. Rev. Immunol. 9: 457-92 (1991); Capel et al., Immunomethods 4: 25-34 (1994); 및 de Haas et al., J. Lab. Clin. Med. 126: 330-41 (1995)을 참조하시오). 차후에 식별되는 것들을 포함하여 다른 FcR들이 본원의 "FcR"이란 용어에 포함된다.
본원에 사용되는 바와 같은 "에피토프"란 용어는 항체 또는 항체 부분이 결합하는 항원상의 원자 또는 아미노산의 특정 그룹을 지칭한다. 2개의 항체 또는 항체 부분은 항원에 대해 경쟁적인 결합을 나타내는 경우 상기 항원내의 동일한 에피토프에 결합할 수 있다.
본원에 사용되는 바와 같이, 제1 항체 또는 이의 단편은, 상기 제1 항체 또는 이의 단편이 제2 항체 또는 이의 단편의 표적 항원 결합을 동몰 농도의 상기 제1 항체 또는 이의 단편의 존재하에서 적어도 약 50%(예를 들어 적어도 약 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98% 또는 99% 중 어느 하나)까지 억제할 때, 또는 이와 역일 때 상기 제2 항체 또는 이의 단편과 표적 항원에 대한 결합에 대해 "경쟁한다". 교차-경쟁에 기반한 항체의 "비닝(binning)"을 위한 대량신속처리 공정은 PCT 공보 제 WO 03/48731 호에 기재되어 있다.
본원에 사용되는 바와 같이, "특이적으로 결합하다", "특이적으로 인식하는" 및 "에 특이적인"이란 용어는 측정가능하고 재현가능한 상호작용, 예를 들어 생물학적 분자를 포함하여 분자의 이종 집단의 존재하에서 표적과 상기 표적의 존재에 결정적인 항체 또는 항체 부분간의 결합을 지칭한다. 예를 들어, 표적(에피토프일 수 있다)을 특이적으로 인식하는 항체 또는 항체 부분은 다른 표적에 대한 결합보다 상기 표적과 더 큰 친화성, 결합활성으로, 더 용이하게, 및/또는 더 큰 지속기간으로 결합하는 항체 또는 항체 부분이다. 일부 구현예에서, 관련없는 표적에의 항체의 결합 정도는, 예를 들어 방사성면역분석(RIA)에 의해 측정시 표적에 대한 상기 항체의 결합의 약 10% 미만이다. 일부 구현예에서, 표적에 특이적으로 결합하는 항체는 ≤10-5 M, ≤10-6 M, ≤10-7 M, ≤10-8 M, ≤10-9 M, ≤10-10 M, ≤10-11 M, 또는 ≤10-12 M의 해리상수(KD)를 갖는다. 일부 구현예에서, 항체는 상이한 종들로부터의 단백질간에 보존되는 단백질상의 에피토프에 특이적으로 결합한다. 일부 구현예에서, 특이적인 결합은 독점적인 결합을 포함할 수 있지만, 이를 요구하지는 않는다. 항체 또는 항원-결합 도메인의 결합 특이성을 당해 분야에 공지된 방법에 의해 실험적으로 측정할 수 있다. 상기와 같은 방법은 비제한적으로 Octet, 웨스턴 블럿, ELISA-, RIA-, ECL-, IRMA-, EIA-, BIACORE™-시험 및 펩티드 스캔을 포함한다.
"결합 친화성"은 일반적으로 하나의 분자(예를 들어 항체)의 단일 결합 부위와 이의 결합 상대(예를 들어 항원)간의 비-공유적 상호작용의 총합의 강도를 지칭한다. 달리 나타내지 않는 한, 본원에 사용되는 바와 같이, "결합 친화성"은 결합쌍의 구성원들간의 1:1 상호작용을 반영하는 본래의 결합 친화성을 지칭한다. 결합 친화성을 Kd, Koff, Kon 또는 Ka에 의해 나타낼 수 있다. 본원에 사용되는 바와 같은 "Koff"란 용어는 동역학적 선택 셋업으로부터 측정되는 바와 같은, s-1 단위로 나타내는, 항체/항원 복합체로부터 항체(또는 항원-결합 도메인)의 해리에 대한 해리상수를 지칭하고자 한다. 본원에 사용되는 바와 같은 "Kon"이란 용어는 M-V1 단위로 나타내는, 항체/항원 복합체를 형성하는 항원에 대한 항체(또는 항원-결합 도메인)의 결합에 대한 결합상수를 지칭하고자 한다. 본원에 사용되는 바와 같은 평형 해리상수 "KD" 또는 "Kd"란 용어는 특정한 항체-항원 상호작용의 해리상수를 지칭하며, 평형시 항체 분자의 용액 중에 존재하는 모든 항체-결합 도메인의 절반을 점유하는데 요구되는 항원의 농도를 기재하고, Koff/Kon와 같으며, M의 단위로 나타낸다. Kd의 측정은 모든 결합제가 용액중에 있음을 전제로 한다. 항체가 세포벽에, 예를 들어 효모 발현 시스템에 묶여있는 경우에, 상응하는 평형속도 상수를 EC50으로서 나타내며, 이는 Kd의 양호한 근사치를 제공한다. 친화성 상수 Ka는 해리상수 Kd의 역이며, M-1의 단위로 나타낸다. 해리상수(KD 또는 Kd)는 항체의 항원에 대한 친화성을 나타내는 지표로서 사용된다. 예를 들어, 다양한 마커제로 표시한 항체를 사용하는 Scatchard 방법뿐만 아니라, 처방전 없이도 살 수 있는 BiacoreX(Amersham Biosciences에 의해 제조됨), 측정 키트 또는 유사한 키트를, 상기 키트에 부착된 사용자 매뉴얼 및 실험 조작 방법에 따라 사용함으로써 용이한 분석이 가능하다. 이들 방법을 사용하여 유도할 수 있는 KD 값을 M(몰)의 단위로 나타낸다. 표적에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 예를 들어 ≤10-5 M, ≤10-6 M, ≤10-7 M, ≤10-8 M, ≤10-9 M, ≤10-10 M, ≤10-11 M, 또는 ≤10-12 M의 해리상수(Kd)를 가질 수 있다.
최대 절반 억제 농도(IC50)는 특정한 생물학적 또는 생화학적 기능을 억제함에 있어서 물질(예를 들어 항체)의 유효성의 척도이다. 상기는 얼마나 많은 특정 약물 또는 다른 물질(억제제, 예를 들어 항체)이 주어진 생물학적 과정(예를 들어 알부민과 CD155, 또는 공정 성분, 즉 효소, 세포, 세포 수용체 또는 미생물간의 결합)을 절반까지 억제하는데 필요한지를 가리킨다. 상기 값을 전형적으로는 몰 농도로서 나타낸다. IC50은 작용물질 약물 또는 다른 물질(예를 들어 항체)에 대한 "EC50"에 필적한다. EC50은 또한 생체내에서 최대 효과의 50%를 획득하는데 필요한 혈장 농도를 나타낸다. 본원에 사용되는 바와 같이, "IC50"은 시험관내에서 항원 생물활성(예를 들어 알부민 생물활성)의 50%를 중화시키는데 필요한 항체(예를 들어 항-알부민 sdAb)의 유효 농도를 가리키는데 사용된다. IC50 또는 EC50을, 예를 들어 FACS 분석(경쟁 결합 분석), 세포기반 사이토카인 방출 분석, 또는 증폭된 발광 근접 동종 분석(AlphaLISA)에 의한 리간드 결합의 억제와 같은 생물분석에 의해 측정할 수 있다.
본원에 사용되는 바와 같이, "사이토카인"이란 용어는 포유동물에서 미리선택된 세포유형, 예를 들어 암세포 또는 바이러스-감염 세포에 대한 세포파괴성 면역반응을 자극하거나 유도할 수 있는 임의의 단백질 또는 펩티드, 이의 유사체 또는 기능성 단편을 의미하는 것으로 이해된다. 따라서, 다양한 사이토카인이 본원에 포함될 수 있는 것으로 고려된다. 유용한 사이토카인은 예를 들어 상기와 같은 세포파괴성 반응을 자극하거나 유도할 수 있는 종양괴사인자(TNF), 인터류킨(IL), 림포카인(L), 콜로니자극인자(CSF), 인터페론(IFN) 및 이의 종 변형, 트렁케이트된(truncated) 유사체를 포함한다. 유용한 종양괴사인자는 예를 들어 TNFa를 포함한다. 유용한 림포카인은 예를 들어 LT를 포함한다. 유용한 콜로니자극인자는 예를 들어 GM-CSF 및 M-CSF를 포함한다. 유용한 인터류킨은 예를 들어 IL-2, IL-4, IL-5, IL-7, IL-12, IL-15, IL-18, IL-21, IL22, 및 IL-33을 포함한다. 유용한 인터페론은 예를 들어 IFN-a, IFN-a 및 IFN-γ를 포함한다. "사이토카인"이란 용어는 또한, 변형을 포함하고 이의 목적하는 기능 중 어느 하나의 적어도 상당한 부분(예를 들어 적어도 약 50%)을 유지하는 야생형 사이토카인(예를 들어 IL-21, IL-7, IL-15 등)의 임의의 변이체를 포함하는 것으로 이해된다.
본원에 사용되는 바와 같은 "트렁케이트된 IL-21"이란 용어는 야생형 IL-21의 C- 및 N-말단 중 하나 또는 둘 다에서 하나 이상의 아미노산의 결실을 갖는 IL-21을 포함하는 단백질 또는 펩티드를 지칭한다. 본원에 기재된 트렁케이트된 IL-21을 포함하는 융합 단백질은 다른 부분 또는 도메인, 예를 들어 항원-결합 모이어티, 링커, 신호 서열, 또는 알부민-결합 모이어티를 가질 수 있지만, 상기 융합 단백질에서 IL-21은 야생형 IL-21보다 적어도 하나의 아미노산을 적게 갖는 트렁케이트된 형태이다. 일부 구현예에서, 야생형 IL-21은 서열번호 1의 아미노산 서열을 갖는다.
본원에 기재된 구조물, 항체, 또는 이의 항원-결합 단편을 암호화하는 "단리된" 핵산 분자는 생성되는 환경에서 통상적으로 결합되는 적어도 하나의 오염 핵산 분자로부터 식별되고 분리된 핵산 분자이다. 바람직하게, 단리된 핵산은 생성 환경과 결합된 모든 성분과의 결합이 없다. 본원에 기재된 폴리펩티드 및 항체를 암호화하는 단리된 핵산은 자연에서 발견되는 형태 또는 환경과 다른 형태이다. 따라서 단리된 핵산 분자는 세포 중에 자연적으로 존재하는 본원에 기재된 폴리펩티드 및 항체를 암호화하는 핵산과 구분된다. 단리된 핵산은 핵산 분자를 통상적으로 함유하는 세포 중에 함유된 핵산 분자를 포함하지만, 상기 핵산 분자는 염색체외에 또는 이의 자연적인 염색체 위치와 상이한 염색체 위치에 존재한다.
"조절 서열"이란 용어는 특정 숙주 유기체에서 작동적으로 연결된 암호화 서열의 발현에 필요한 DNA 서열을 지칭한다. 원핵생물에 적합한 조절 서열은 예를 들어 프로모터, 임의로 오퍼레이터 서열, 및 리보솜 결합 부위를 포함한다. 진핵생물 세포는 프로모터, 폴리아데닐화 신호 및 인헨서를 사용하는 것으로 공지되어 있다.
핵산은 또 다른 핵산 서열과 기능적인 관계로 놓일 때 "작동적으로 연결된다". 예를 들어, 전서열 또는 분비 리더용 DNA는 폴리펩티드의 분비에 관여하는 전단백질로서 발현되는 경우 상기 폴리펩티드에 대한 DNA에 작동적으로 연결되고; 프로모터 또는 인헨서는 암호화 서열의 전사에 영향을 미치는 경우 상기 서열에 작동적으로 연결되며; 또는 리보솜 결합 부위는 번역을 촉진시키기 위해 위치하는 경우 암호화 서열에 작동적으로 연결된다. 일반적으로 "작동적으로 연결된"은 연결되는 DNA 서열이 인접해 있음, 및 분비 리더의 경우에, 인접하고 판독 단계 중에 있음을 의미한다. 그러나, 인헨서는 인접되지 않는다. 연결은 편리한 제한 부위에서의 결찰에 의해 수행된다. 상기와 같은 부위가 존재하지 않는 경우, 합성 올리고뉴클레오티드 어댑터 또는 링커가 통상적인 실시에 따라 사용된다.
본원에 사용되는 바와 같은 "벡터"란 용어는 연결되는 또 다른 핵산을 전파시킬 수 있는 핵산 분자를 지칭한다. 상기 용어는 자기-복제 핵산구조물로서 벡터뿐만 아니라 상기가 도입된 숙주세포의 게놈에 통합된 벡터를 포함한다. 몇몇 벡터는 작동적으로 연결되는 핵산의 발현을 유도할 수 있다. 상기와 같은 벡터를 본원에서 "발현 벡터"로서 지칭한다.
본원에 사용되는 바와 같은 "형질감염된" 또는 "형질전환된" 또는 "형질도입된"이란 용어는 외인성 핵산이 숙주세포내에 전달되거나 도입되는 과정을 지칭한다. "형질감염된" 또는 "형질전환된" 또는 "형질도입된" 세포는 외인성 핵산으로 형질감염되거나, 형질전환되거나 또는 형질도입된 것이다. 세포는 1차 피실험자 세포 및 이의 자손을 포함한다.
"숙주세포", "숙주세포주" 및 "숙주세포 배양물"이란 용어는 호환 가능하게 사용되며 외인성 핵산이 도입된 세포(상기와 같은 세포의 자손 포함)를 지칭한다. 숙주세포는 "형질전환체" 및 "형질전환된 세포"를 포함하며, 이들은 계대수와 상관 없이 1차 형질전환된 세포 및 그로부터 유래된 자손을 포함한다. 자손은 핵산 함량이 모 세포와 완전히 일치하지 않을 수 있고, 돌연변이를 함유할 수도 있다. 최초로 형질전환된 세포에 대해 선별되거나 선택된 바와 동일한 기능 또는 생물학적 활성을 갖는 돌연변이 자손이 본원에 포함된다.
본원에 사용되는 바와 같이, "치료" 또는 "치료하는"은 임상 결과를 포함하여, 이롭거나 목적하는 결과를 획득하기 위한 접근법이다. 본원의 목적을 위해서, 이롭거나 목적하는 임상 결과는 비제한적으로 하기 중 하나 이상을 포함한다: 질병으로부터 생성되는 하나 이상의 증상의 경감, 질병의 정도의 감소, 질병의 안정화(예를 들어 질병의 악화의 예방 또는 지연), 질병의 확산(예를 들어 전이)의 예방 또는 지연, 질병의 재발의 예방 또는 지연, 질병의 진행의 지연 또는 느려짐, 질병 상태의 개선, 질병의 차도(부분적인 또는 전적인) 제공, 질병 치료에 필요한 하나 이상의 다른 약물 용량의 감소, 질병의 진행의 지연, 삶의 질의 증가 또는 개선, 체중 증가의 증가, 및/또는 생존의 연장. 또한 "치료"는 암의 병적인 결과(예를 들어 종양 부피)의 감소를 포함한다. 적용 방법은 이들 치료 태양 중 임의의 하나 이상을 고려한다.
암의 상황에서, "치료하는"이란 용어는 암세포의 성장 억제, 암세포의 복제 억제, 전체 종양 크기의 감소 및 질병과 관련된 하나 이상의 증상의 개선 중 어느 하나 또는 전부를 포함한다.
"억제" 또는 "억제하다"란 용어는 임의의 표현형적 특징의 감소 또는 중지, 또는 상기 특징의 발생, 정도 또는 가능성의 감소 또는 중지를 지칭한다. "감소시킴" 또는 "억제함"은 참조의 경우에 비해 활성, 기능 및/또는 양을 감소시키거나, 줄이거나 저지하는 것이다. 몇몇 구현예에서, "감소시키다" 또는 "억제하다"는 20% 이상의 전체적인 감소를 야기하는 능력을 의미한다. 또 다른 구현예에서, "감소시키다" 또는 "억제하다"는 50% 이상의 전체적인 감소를 야기하는 능력을 의미한다. 더욱 또 다른 구현예에서, "감소시키다" 또는 "억제하다"는 75%, 85%, 90%, 95% 이상의 전체적인 감소를 야기하는 능력을 의미한다.
본원에 사용되는 바와 같은 "참조"는 비교를 목적으로 사용되는 임의의 샘플, 표준, 또는 수준을 지칭한다. 참조는 건강한 및/또는 병들지 않은 샘플로부터 획득될 수 있다. 일부 예에서, 참조를 처리되지 않은 샘플로부터 획득할 수 있다. 일부 예에서, 참조를 개체의 병들지 않은 또는 치료되지 않은 샘플로부터 획득한다. 일부 예에서, 참조를 개체 또는 환자가 아닌 한 명 이상의 건강한 개체로부터 획득한다.
본원에 사용되는 바와 같이, "질병 발생의 지연"은 상기 질병(예를 들어 암)의 발생을 미루거나, 방해하거나, 늦추거나, 지연시키거나, 안정화시키거나, 억제하거나 및/또는 연기시킴을 의미한다. 상기 지연은 질병의 병력 및/또는 치료되는 개체에 따라 다양한 길이의 시간을 가질 수 있다. 당해 분야의 숙련가에게 자명한 바와 같이, 충분한 또는 현저한 지연은 실제로는 개체에서 질병을 발생하지 않는다는 점에서 예방을 포함할 수 있다. 예를 들어, 말기암, 예를 들어 전이의 발생이 지연될 수 있다.
본원에 사용되는 바와 같은 "예방"은 질병의 소인이 있을 수 있지만, 아직 상기 질병으로 진단되지 않은 개체에서 질병의 발생 또는 재발에 관한 예방학을 제공함을 포함한다.
본원에 사용되는 바와 같이, 기능 또는 활성을 "억제하다"는 관심 상태 또는 매개변수를 제외하고 달리 동일한 상태와 비교하거나, 또는 한편으로 또 다른 상태와 비교할 때, 상기 기능 또는 활성을 감소시키는 것이다. 예를 들어, 종양 성장을 억제하는 항체는 상기 항체 부재하에서의 종양의 성장속도에 비해 종양의 성장속도를 감소시킨다.
"피실험자", "개체", 및 "환자"란 용어는 본원에서 포유동물, 예를 들어 비제한적으로 인간, 소, 말, 고양이, 개, 설치류 또는 영장류를 지칭하는데 호환 가능하게 사용된다. 일부 구현예에서, 개체는 인간이다.
제제의 "유효량"은 목적하는 치료학적 또는 예방학적 결과를 성취하는데 필요한 투여량 및 시간에서 유효한 양을 지칭한다. 상기 용어를 또한 본원에 기재된 영상화 방법 중 어느 하나에 의한 검출을 위한 상을 제공하는 용량에 적용한다. 구체적인 용량은 하기 중 하나 이상에 따라 변할 수 있다: 선택된 특정 제제, 수행되는 투여 섭생, 다른 화합물과 병용 투여의 여부, 투여 타이밍, 영상화되는 조직, 및 운반되는 물리적 전달 시스템.
적용 물질/분자, 작용물질 또는 길항물질의 "치료 유효량"은 개체의 질병 상태, 연령, 성별 및 체중, 개체에서 목적하는 반응을 이끌어내는 물질/분자, 작용물질 또는 길항물질의 능력과 같은 인자에 따라 변할 수 있다. 치료 유효량은 또한 치료학적으로 이로운 효과가 상기 물질/분자, 작용물질 또는 길항물질의 임의의 독성 또는 유해 효과를 상회하는 것이다. 치료 유효량은 하나 이상의 투여로 전달될 수 있다.
"예방학적 유효량"은 목적하는 예방학적 결과를 성취하기는데 필요한 투여량 및 시간에서 유효한 양을 지칭한다. 전형적으로, 반드시는 아니지만, 예방학적 용량은 질병에 앞서 또는 질병의 초기 단계에서 피실험자에게 사용되기 때문에, 상기 예방학적 유효량은 치료 유효량보다 적을 것이다.
"약학 제형" 및 "약학 조성물"이란 용어는, 활성 성분(들)의 생물학적 활성을 유효하게 하는 형태로 존재하고 제형이 투여되는 개체에게 허용 가능하지 않게 독성인 추가적인 성분을 함유하지 않는 제제를 지칭한다. 상기와 같은 제형은 멸균성일 수 있다.
"약학적으로 허용 가능한 담체"는 개체에게 투여하기 위한 "약학 조성물"을 함께 포함하는 치료제와 함께 사용하기 위한 당해 분야에 통상적인 무독성 고체, 반고체, 또는 액체 충전제, 희석제, 캡슐화 물질, 제형 보조제 또는 담체를 지칭한다. 약학적으로 허용 가능한 담체는 사용되는 투여량 및 농도에서 수용자에게 무독성이며 제형의 다른 성분과 상용성이다. 약학적으로 허용 가능한 담체는 사용되는 제형에 적합하다.
"멸균" 제형은 무균성이거나 또는 살아있는 미생물 및 이의 포자가 필수적으로 없다.
하나 이상의 추가의 치료제"와 함께" 투여는 동시(동반) 및 임의의 순서의 연속적이거나 순차적인 투여를 포함한다.
"동반하여"란 용어는 본원에서 하나 이상의 치료제의 투여를 지칭하는데 사용되며, 이때 상기 투여의 적어도 일부가 시간상 겹치거나 또는 하나의 치료제의 투여가 다른 치료제의 투여에 대해 단시간내에 있다. 예를 들어, 2개의 이상의 치료제가 약 60분 이내, 예를 들어 약 30, 15, 10, 5 또는 1분 중 어느 하나 이내의 시간 분리로 투여된다.
"순차적으로"란 용어는 하나 이상의 제제(들)의 투여가 하나 이상의 다른 제제(들)의 투여를 중단한 후에 계속되는 2개 이상의 치료제의 투여를 지칭한다. 예를 들어 2개 이상의 치료제의 투여를 약 15분을 초과하여, 예를 들어 약 20, 30, 40, 50 또는 60분, 1일, 2일, 3일, 1주, 2주 또는 1개월 이상 중 어느 하나의 시간 분리로 투여한다.
본원에 사용되는 바와 같이, "와 함께"는 또 다른 치료 양상에 부가되는 하나의 치료 양상의 투여를 지칭한다. 그 자체로, "와 함께"는 개체에게 하나의 치료 양상의, 다른 치료 양상의 투여 전, 투여 중 또는 투여 후의 투여를 지칭한다.
"패키지 삽입물"이란 용어는 치료 제품의 사용에 관한 적응증, 용법, 투여량, 투여, 병용 요법, 배합금기, 및/또는 경고에 관한 정보를 함유하는 상기 치료 제품의 상업적인 패키지안에 통상적으로 포함된 설명서를 지칭하는데 사용된다.
"제조 물품"이란 용어는 적어도 하나의 시약, 예를 들어 질병 또는 질환(예를 들어 암)의 치료를 위한 약제, 또는 본원에 기재된 생물마커를 특이적으로 검출하기 위한 탐침을 포함하는 임의의 제품(예를 들어 패키지 또는 용기) 또는 키트이다. 몇몇 구현예에서, 제품 또는 키트는 본원에 기재된 방법을 수행하기 위한 유닛으로서 홍보되거나, 배급되거나, 또는 판매된다.
본원에 기재된 적용의 구현예는, 구현예로 "이루어지는" 및/또는 "필수적으로 이루어지는"을 포함한다.
본원에서 "약" 값 또는 매개변수에 대한 언급은 상기 값 또는 매개변수 자체에 관한 변화를 포함한다(및 기재한다). 예를 들어, "약 X"를 지칭하는 기재는 "X"의 기재를 포함한다.
본원에 사용되는 바와 같이, 값 또는 매개변수가 "아닌"에 대한 언급은 일반적으로 값 또는 매개변수 "이외의 것"을 의미하고 기재한다. 예를 들어, 방법이 X형의 암을 치료하는데 사용되지 않음은 상기 방법이 X 이외의 유형의 암을 치료하는데 사용됨을 의미한다.
본원에 사용되는 "약 X-Y"란 용어는 "약 X 내지 약 Y"와 동일한 의미를 갖는다.
본원 및 첨부된 청구항에 사용되는 바와 같이, 단수형 "하나", "또는" 및 "상기"는 문맥상 달리 명백히 나타내지 않는한 복수의 지시대상을 포함한다.
II-A. 알부민 결합 모이어티를 포함하는 융합 단백질
본원은 a) 사이토카인 및 b) 알부민 결합 모이어티(예를 들어 알부민에 결합하는 sdAb)를 포함하는 융합 단백질을 제공한다. 일부 구현예에서, 융합 단백질은 a) IL-21, IL-7, IL-15, IL-15Ra에 결합된 IL-15 또는 이의 단편, IL-33 및 IL-22로 이루어지는 그룹 중에서 선택된 사이토카인, 및 b) 알부민 결합 모이어티(예를 들어 알부민에 결합하는 sdAb)를 포함한다. 일부 구현예에서, 알부민 결합 모이어티는 알부민 결합 도메인(ABD)을 포함한다. 일부 구현예에서, 알부민 결합 모이어티는 단일 도메인 항체(dsAb)를 포함한다. 일부 구현예에서, 알부민 결합 모이어티는 사이토카인의 C-말단에 융합된다. 일부 구현예에서, 알부민 결합 모이어티는 사이토카인의 N-말단에 융합된다. 일부 구현예에서, 사이토카인 및 알부민 결합 모이어티는 제1 링커(예를 들어 약 1 내지 30 아미노산의)를 통해 연결된다. 일부 구현예에서, 알부민 결합 모이어티는 단일 도메인 항체(예를 들어 VHH 항체)이다. 비교적 작은 분자량을 갖는 sdAb는 융합 단백질의 암 침투의 증가를 도와, 상기 단백질을 몇몇 암, 예를 들어 고형암의 치료에 적합하게 할 수 있다.
일부 구현예에서, a) IL-21 및 b) 알부민 결합 모이어티(예를 들어 알부민에 결합하는 sdAb)를 포함하는 융합 단백질을 제공한다. 일부 구현예에서, 사이토카인은 알부민 결합 모이어티의 C-말단에 융합된다. 일부 구현예에서, 사이토카인은 알부민 결합 모이어티의 N-말단에 융합된다. 일부 구현예에서, 알부민 결합 모이어티는 사이토카인의 N-말단 및 C-말단 모두에 융합된다. 일부 구현예에서, 제1 사이토카인과 동일하거나 상이한 제2 사이토카인은 일부민 결합 모이어티의 다른 말단에 융합된다. 일부 구현예에서, 알부민 결합 모이어티는 인간 혈청 알부민(HSA) 및/또는 키노몰구스 원숭이 혈청 알부민(CMSA)에 결합한다. 일부 구현예에서, 알부민 결합 모이어티는 알부민 결합 도메인(ABD)을 포함한다. 일부 구현예에서, 일부민 결합 도메인은 서열번호 3-11로 이루어지는 그룹 중에서 선택된 아미노산 서열 또는 서열번호 3-11 중 어느 하나에 적어도 약 80%(예를 들어 적어도 약 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 중 어느 하나)의 서열 동일성을 포함하는 이의 변이체를 포함한다. 일부 구현예에서, 알부민 결합 모이어티는 항-알부민 항체(예를 들어 단일 도메인 항체(sdAb), 예를 들어 VhH 단일 도메인 항체)를 포함한다. 일부 구현예에서, 사이토카인 및 알부민 결합 모이어티는 제1 링커를 통해 연결된다. 일부 구현예에서 제1 링커는 약 1 내지 30 아미노산의 길이를 갖는다. 일부 구현예에서, 제1 링커는 서열번호 12-26 및 158-159로 이루어지는 그룹 중에서 선택된다. 일부 구현예에서, IL-21은 트렁케이트된 IL-21이다. 일부 구현예에서, 트렁케이트된 IL-21은 서열번호 126, 171 또는 172의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 제1 링커는 강성 링커(rigid linker)이다. 일부 구현예에서, 제1 링커는 서열번호 21, 22 및 24로 이루어지는 그룹 중에서 선택된다. 일부 구현예에서, 제1 링커는 가요성 링커(flexible linker)이다. 일부 구현예에서, 제1 링커는 서열번호 12-14로 이루어지는 그룹 중에서 선택된다.
일부 구현예에서, a) IL-21 및 b) 알부민 결합 모이어티(예를 들어 알부민에 결합하는 sdAb)를 포함하는 융합 단백질을 제공하며, 여기에서 IL-21은 서열번호 1, 2, 126, 171 또는 172의 아미노산 서열 또는 서열번호 1, 2, 126, 171 또는 172에 적어도 약 80%(예를 들어 적어도 약 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 중 어느 하나)의 서열 동일성을 포함하는 이의 변이체를 포함하고, 알부민 결합 모이어티는 알부민 결합 도메인을 포함한다. 일부 구현예에서, 사이토카인은 알부민 결합 모이어티의 C-말단에 융합된다. 일부 구현예에서, 사이토카인은 알부민 결합 모이어티의 N-말단에 융합된다. 일부 구현예에서, 알부민 결합 모이어티는 사이토카인의 N-말단 및 C-말단 모두에 융합된다. 일부 구현예에서, 제1 사이토카인과 동일하거나 상이한 제2 사이토카인은 일부민 결합 모이어티의 다른 말단에 융합된다. 일부 구현예에서, 알부민 결합 모이어티는 인간 혈청 알부민(HSA) 및/또는 키노몰구스 원숭이 혈청 알부민(CMSA)에 결합한다. 일부 구현예에서, 일부민 결합 도메인은 서열번호 3-11로 이루어지는 그룹 중에서 선택된 아미노산 서열 또는 서열번호 3-11 중 어느 하나에 적어도 약 80%(예를 들어 적어도 약 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 중 어느 하나)의 서열 동일성을 포함하는 이의 변이체를 포함한다. 일부 구현예에서, 사이토카인 및 알부민 결합 모이어티는 제1 링커를 통해 연결된다. 일부 구현예에서 제1 링커는 약 1 내지 30 아미노산의 길이를 갖는다. 일부 구현예에서, 제1 링커는 서열번호 12-26 및 158-159로 이루어지는 그룹 중에서 선택된다. 일부 구현예에서, IL-21은 트렁케이트된 IL-21이다. 일부 구현예에서, 트렁케이트된 IL-21은 서열번호 126, 171 또는 172의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 제1 링커는 강성 링커이다. 일부 구현예에서, 제1 링커는 서열번호 21, 22 및 24로 이루어지는 그룹 중에서 선택된다. 일부 구현예에서, 제1 링커는 가요성 링커이다. 일부 구현예에서, 제1 링커는 서열번호 12-14로 이루어지는 그룹 중에서 선택된다.
일부 구현예에서, a) IL-21 및 b) 알부민 결합 모이어티(예를 들어 알부민에 결합하는 sdAb)를 포함하는 융합 단백질을 제공하며, 여기에서 IL-21은 서열번호 1, 2, 126, 171 또는 172의 아미노산 서열 또는 서열번호 1, 2, 126, 171 또는 172에 적어도 약 80%(예를 들어 적어도 약 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 중 어느 하나)의 서열 동일성을 포함하는 이의 변이체를 포함하고, 알부민 결합 모이어티는 항-알부민 항체 또는 이의 단편(예를 들어 단일 도메인 항체, 예를 들어 VhH 항체)을 포함한다. 일부 구현예에서, 사이토카인은 알부민 결합 모이어티의 C-말단에 융합된다. 일부 구현예에서, 사이토카인은 알부민 결합 모이어티의 N-말단에 융합된다. 일부 구현예에서, 알부민 결합 모이어티는 사이토카인의 N-말단 및 C-말단 모두에 융합된다. 일부 구현예에서, 제1 사이토카인과 동일하거나 상이한 제2 사이토카인은 일부민 결합 모이어티의 다른 말단에 융합된다. 일부 구현예에서, 알부민 결합 모이어티는 인간 혈청 알부민(HSA) 및/또는 키노몰구스 원숭이 혈청 알부민(CMSA)에 결합한다. 일부 구현예에서, 사이토카인 및 알부민 결합 모이어티는 제1 링커를 통해 연결된다. 일부 구현예에서 제1 링커는 약 1 내지 30 아미노산의 길이를 갖는다. 일부 구현예에서, 제1 링커는 서열번호 12-26 및 158-159로 이루어지는 그룹 중에서 선택된다. 일부 구현예에서, IL-21은 트렁케이트된 IL-21이다. 일부 구현예에서, 트렁케이트된 IL-21은 서열번호 126, 171 또는 172의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 제1 링커는 강성 링커이다. 일부 구현예에서, 제1 링커는 서열번호 21, 22 및 24로 이루어지는 그룹 중에서 선택된다. 일부 구현예에서, 제1 링커는 가요성 링커이다. 일부 구현예에서, 제1 링커는 서열번호 12-14로 이루어지는 그룹 중에서 선택된다.
일부 구현예에서, a) IL-7 및 b) 알부민 결합 모이어티(예를 들어 알부민에 결합하는 sdAb)를 포함하는 융합 단백질을 제공한다. 일부 구현예에서, 사이토카인은 알부민 결합 모이어티의 C-말단에 융합된다. 일부 구현예에서, 사이토카인은 알부민 결합 모이어티의 N-말단에 융합된다. 일부 구현예에서, 알부민 결합 모이어티는 사이토카인의 N-말단 및 C-말단 모두에 융합된다. 일부 구현예에서, 제1 사이토카인과 동일하거나 상이한 제2 사이토카인은 일부민 결합 모이어티의 다른 말단에 융합된다. 일부 구현예에서, 알부민 결합 모이어티는 인간 혈청 알부민(HSA) 및/또는 키노몰구스 원숭이 혈청 알부민(CMSA)에 결합한다. 일부 구현예에서, 알부민 결합 모이어티는 알부민 결합 도메인(ABD)을 포함한다. 일부 구현예에서, 일부민 결합 도메인은 서열번호 3-11로 이루어지는 그룹 중에서 선택된 아미노산 서열 또는 서열번호 3-11 중 어느 하나에 적어도 약 80%(예를 들어 적어도 약 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 중 어느 하나)의 서열 동일성을 포함하는 이의 변이체를 포함한다. 일부 구현예에서, 알부민 결합 모이어티는 항-알부민 항체(예를 들어 단일 도메인 항체(sdAb), 예를 들어 VhH 단일 도메인 항체)를 포함한다. 일부 구현예에서, 사이토카인 및 알부민 결합 모이어티는 제1 링커를 통해 연결된다. 일부 구현예에서 제1 링커는 약 1 내지 30 아미노산의 길이를 갖는다. 일부 구현예에서, 제1 링커는 서열번호 12-26 및 158-159로 이루어지는 그룹 중에서 선택된다. 일부 구현예에서, 제1 링커는 강성 링커이다. 일부 구현예에서, 제1 링커는 서열번호 21, 22 및 24로 이루어지는 그룹 중에서 선택된다. 일부 구현예에서, 제1 링커는 가요성 링커이다. 일부 구현예에서, 제1 링커는 서열번호 12-14로 이루어지는 그룹 중에서 선택된다.
일부 구현예에서, a) IL-7 및 b) 알부민 결합 모이어티(예를 들어 알부민에 결합하는 sdAb)를 포함하는 융합 단백질을 제공하며, 여기에서 IL-7은 서열번호 96-98 중 어느 하나의 아미노산 서열 또는 서열번호 96-98 중 어느 하나에 적어도 약 80%(예를 들어 적어도 약 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 중 어느 하나)의 서열 동일성을 포함하는 이의 변이체를 포함하고, 알부민 결합 모이어티는 알부민 결합 도메인을 포함한다. 일부 구현예에서, 사이토카인은 알부민 결합 모이어티의 C-말단에 융합된다. 일부 구현예에서, 사이토카인은 알부민 결합 모이어티의 N-말단에 융합된다. 일부 구현예에서, 알부민 결합 모이어티는 사이토카인의 N-말단 및 C-말단 모두에 융합된다. 일부 구현예에서, 제1 사이토카인과 동일하거나 상이한 제2 사이토카인은 일부민 결합 모이어티의 다른 말단에 융합된다. 일부 구현예에서, 알부민 결합 모이어티는 인간 혈청 알부민(HSA) 및/또는 키노몰구스 원숭이 혈청 알부민(CMSA)에 결합한다. 일부 구현예에서, 일부민 결합 도메인은 서열번호 3-11로 이루어지는 그룹 중에서 선택된 아미노산 서열 또는 서열번호 3-11 중 어느 하나에 적어도 약 80%(예를 들어 적어도 약 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 중 어느 하나)의 서열 동일성을 포함하는 이의 변이체를 포함한다. 일부 구현예에서, 사이토카인 및 알부민 결합 모이어티는 제1 링커를 통해 연결된다. 일부 구현예에서 제1 링커는 약 1 내지 30 아미노산의 길이를 갖는다. 일부 구현예에서, 제1 링커는 서열번호 12-26 및 158-159로 이루어지는 그룹 중에서 선택된다.
일부 구현예에서, a) IL-7 및 b) 알부민 결합 모이어티(예를 들어 알부민에 결합하는 sdAb)를 포함하는 융합 단백질을 제공하며, 여기에서 IL-7은 서열번호 96-98 중 어느 하나의 아미노산 서열 또는 서열번호 96-98 중 어느 하나에 적어도 약 80%(예를 들어 적어도 약 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 중 어느 하나)의 서열 동일성을 포함하는 이의 변이체를 포함하고, 알부민 결합 모이어티는 항-알부민 항체 또는 이의 단편(예를 들어 단일 도메인 항체, 예를 들어 VhH 항체)을 포함한다. 일부 구현예에서, 사이토카인은 알부민 결합 모이어티의 C-말단에 융합된다. 일부 구현예에서, 사이토카인은 알부민 결합 모이어티의 N-말단에 융합된다. 일부 구현예에서, 알부민 결합 모이어티는 사이토카인의 N-말단 및 C-말단 모두에 융합된다. 일부 구현예에서, 제1 사이토카인과 동일하거나 상이한 제2 사이토카인은 일부민 결합 모이어티의 다른 말단에 융합된다. 일부 구현예에서, 알부민 결합 모이어티는 인간 혈청 알부민(HSA) 및/또는 키노몰구스 원숭이 혈청 알부민(CMSA)에 결합한다. 일부 구현예에서, 사이토카인 및 알부민 결합 모이어티는 제1 링커를 통해 연결된다. 일부 구현예에서 제1 링커는 약 1 내지 30 아미노산의 길이를 갖는다. 일부 구현예에서, 제1 링커는 서열번호 12-26 및 158-159로 이루어지는 그룹 중에서 선택된다.
일부 구현예에서, a) IL-15 및 b) 알부민 결합 모이어티(예를 들어 알부민에 결합하는 sdAb)를 포함하는 융합 단백질을 제공한다. 일부 구현예에서, 사이토카인은 알부민 결합 모이어티의 C-말단에 융합된다. 일부 구현예에서, 사이토카인은 알부민 결합 모이어티의 N-말단에 융합된다. 일부 구현예에서, 알부민 결합 모이어티는 사이토카인의 N-말단 및 C-말단 모두에 융합된다. 일부 구현예에서, 제1 사이토카인과 동일하거나 상이한 제2 사이토카인은 일부민 결합 모이어티의 다른 말단에 융합된다. 일부 구현예에서, 알부민 결합 모이어티는 인간 혈청 알부민(HSA) 및/또는 키노몰구스 원숭이 혈청 알부민(CMSA)에 결합한다. 일부 구현예에서, 알부민 결합 모이어티는 알부민 결합 도메인(ABD)을 포함한다. 일부 구현예에서, 일부민 결합 도메인은 서열번호 3-11로 이루어지는 그룹 중에서 선택된 아미노산 서열 또는 서열번호 3-11 중 어느 하나에 적어도 약 80%(예를 들어 적어도 약 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 중 어느 하나)의 서열 동일성을 포함하는 이의 변이체를 포함한다. 일부 구현예에서, 알부민 결합 모이어티는 항-알부민 항체(예를 들어 단일 도메인 항체(sdAb), 예를 들어 VhH 단일 도메인 항체)를 포함한다. 일부 구현예에서, 사이토카인 및 알부민 결합 모이어티는 제1 링커를 통해 연결된다. 일부 구현예에서 제1 링커는 약 1 내지 30 아미노산의 길이를 갖는다. 일부 구현예에서, 제1 링커는 서열번호 12-26 및 158-159로 이루어지는 그룹 중에서 선택된다. 일부 구현예에서, 사이토카인은 IL-15Ra 또는 IL-15Ra에 결합된 IL-15 또는 이의 단편이며, 여기에서 상기 IL-15Ra 또는 IL-15Ra에 결합된 IL-15 또는 이의 단편은 서열번호 101-108 중 어느 하나의 아미노산 서열 또는 서열번호 101-108 중 어느 하나에 적어도 약 80% 서열 동일성을 포함하는 이의 변이체를 포함한다. 일부 구현예에서, 사이토카인은 IL-15 및 IL-15Ra를 포함한다. 일부 구현예에서, IL-15 및 IL-15Ra는 링커("IL-15와 IL-15Ra 간의 링커")를 통해 연결된다. 일부 구현예에서, IL-15와 IL-15Ra 간의 링커는 절단가능하다. 일부 구현예에서, IL-15와 IL-15Ra 간의 링커는 절단가능하지 않다.
일부 구현예에서, a) IL-15 및 b) 알부민 결합 모이어티(예를 들어 알부민에 결합하는 sdAb)를 포함하는 융합 단백질을 제공하며, 여기에서 IL-15는 서열번호 99, 100 또는 127 중 어느 하나의 아미노산 서열 또는 서열번호 99, 100 또는 127 중 어느 하나에 적어도 약 80%(예를 들어 적어도 약 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 중 어느 하나)의 서열 동일성을 포함하는 이의 변이체를 포함하고, 알부민 결합 모이어티는 알부민 결합 도메인을 포함한다. 일부 구현예에서, 사이토카인은 알부민 결합 모이어티의 C-말단에 융합된다. 일부 구현예에서, 사이토카인은 알부민 결합 모이어티의 N-말단에 융합된다. 일부 구현예에서, 알부민 결합 모이어티는 사이토카인의 N-말단 및 C-말단 모두에 융합된다. 일부 구현예에서, 제1 사이토카인과 동일하거나 상이한 제2 사이토카인은 일부민 결합 모이어티의 다른 말단에 융합된다. 일부 구현예에서, 알부민 결합 모이어티는 인간 혈청 알부민(HSA) 및/또는 키노몰구스 원숭이 혈청 알부민(CMSA)에 결합한다. 일부 구현예에서, 일부민 결합 도메인은 서열번호 3-11로 이루어지는 그룹 중에서 선택된 아미노산 서열 또는 서열번호 3-11 중 어느 하나에 적어도 약 80%(예를 들어 적어도 약 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 중 어느 하나)의 서열 동일성을 포함하는 이의 변이체를 포함한다. 일부 구현예에서, 사이토카인 및 알부민 결합 모이어티는 제1 링커를 통해 연결된다. 일부 구현예에서 제1 링커는 약 1 내지 30 아미노산의 길이를 갖는다. 일부 구현예에서, 제1 링커는 서열번호 12-26 및 158-159로 이루어지는 그룹 중에서 선택된다. 일부 구현예에서, 사이토카인은 IL-15Ra 또는 IL-15Ra에 결합된 IL-15 또는 이의 단편이며, 여기에서 상기 IL-15Ra 또는 IL-15Ra에 결합된 IL-15 또는 이의 단편은 서열번호 101-108 중 어느 하나의 아미노산 서열 또는 서열번호 101-108 중 어느 하나에 적어도 약 80% 서열 동일성을 포함하는 이의 변이체를 포함한다. 일부 구현예에서, 사이토카인은 IL-15 및 IL-15Ra를 포함한다. 일부 구현예에서, IL-15 및 IL-15Ra는 링커("IL-15와 IL-15Ra 간의 링커")를 통해 연결된다. 일부 구현예에서, IL-15와 IL-15Ra 간의 링커는 절단가능하다. 일부 구현예에서, IL-15와 IL-15Ra 간의 링커는 절단가능하지 않다.
일부 구현예에서, a) IL-15 및 b) 알부민 결합 모이어티(예를 들어 알부민에 결합하는 sdAb)를 포함하는 융합 단백질을 제공하며, 여기에서 IL-15는 서열번호 99, 100 또는 127 중 어느 하나의 아미노산 서열 또는 서열번호 99, 100 또는 127 중 어느 하나에 적어도 약 80%(예를 들어 적어도 약 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 중 어느 하나)의 서열 동일성을 포함하는 이의 변이체를 포함하고, 알부민 결합 모이어티는 항-알부민 항체 또는 이의 단편(예를 들어 단일 도메인 항체, 예를 들어 VhH 항체)을 포함한다. 일부 구현예에서, 사이토카인은 알부민 결합 모이어티의 C-말단에 융합된다. 일부 구현예에서, 사이토카인은 알부민 결합 모이어티의 N-말단에 융합된다. 일부 구현예에서, 알부민 결합 모이어티는 사이토카인의 N-말단 및 C-말단 모두에 융합된다. 일부 구현예에서, 제1 사이토카인과 동일하거나 상이한 제2 사이토카인은 일부민 결합 모이어티의 다른 말단에 융합된다. 일부 구현예에서, 알부민 결합 모이어티는 인간 혈청 알부민(HSA) 및/또는 키노몰구스 원숭이 혈청 알부민(CMSA)에 결합한다. 일부 구현예에서, 사이토카인 및 알부민 결합 모이어티는 제1 링커를 통해 연결된다. 일부 구현예에서 제1 링커는 약 1 내지 30 아미노산의 길이를 갖는다. 일부 구현예에서, 제1 링커는 서열번호 12-26 및 158-159로 이루어지는 그룹 중에서 선택된다. 일부 구현예에서, 사이토카인은 IL-15Ra 또는 IL-15Ra에 결합된 IL-15 또는 이의 단편이며, 여기에서 상기 IL-15Ra 또는 IL-15Ra에 결합된 IL-15 또는 이의 단편은 서열번호 101-108 중 어느 하나의 아미노산 서열 또는 서열번호 101-108 중 어느 하나에 적어도 약 80% 서열 동일성을 포함하는 이의 변이체를 포함한다. 일부 구현예에서, 사이토카인은 IL-15 및 IL-15Ra를 포함한다. 일부 구현예에서, IL-15 및 IL-15Ra는 링커("IL-15와 IL-15Ra 간의 링커")를 통해 연결된다. 일부 구현예에서, IL-15와 IL-15Ra 간의 링커는 절단가능하다. 일부 구현예에서, IL-15와 IL-15Ra 간의 링커는 절단가능하지 않다.
일부 구현예에서, a) IL-15R 스시 도메인을 포함하는 사이토카인 및 b) 알부민 결합 모이어티(예를 들어 알부민에 결합하는 sdAb)를 포함하는 융합 단백질을 제공한다. 일부 구현예에서, IL-15R 스시 도메인은 서열번호 127-128 중 어느 하나의 아미노산 서열 또는 서열번호 127-128 중 어느 하나에 적어도 약 80%(예를 들어 적어도 약 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 중 어느 하나)의 서열 동일성을 포함하는 이의 변이체를 포함한다. 일부 구현예에서, 융합 단백질은 IL-15를 포함하지 않는다. 일부 구현예에서, 융합 단백질은 IL-15를 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, IL-15 및 IL-15R 스시 도메인은 링커("IL-15와 IL-15R 스시 도메인간의 링커")를 통해 연결된다. 일부 구현예에서, IL-15와 IL-15R 스시 도메인 간의 링커는 절단가능하다. 일부 구현예에서, IL-15와 IL-15R 스시 도메인 간의 링커는 절단가능하지 않다.
일부 구현예에서, a) IL-15 및 IL-15Ra를 포함하는 IL-15Ra에 결합된 IL-15, 및 b) 알부민 결합 모이어티(예를 들어 알부민에 결합하는 sdAb)를 포함하는 융합 단백질을 제공한다. 일부 구현예에서, 알부민 결합 모이어티는 IL-15 또는 IL-15Ra 중 하나에 융합된다. 일부 구현예에서, 알부민 결합 모이어티는 IL-15 및 IL-15Ra 모두에 융합된다. 일부 구현예에서, 알부민 결합 모이어티는 IL-15Ra의 N- 및/또는 C-말단에 융합된다. 일부 구현예에서, 알부민 결합 모이어티는 IL-15의 N- 및/또는 C-말단에 융합된다. 일부 구현예에서, 알부민 결합 모이어티는 IL-15 및/또는 IL-15Ra의 C-말단에 융합된다. 일부 구현예에서, 알부민 결합 모이어티는 IL-15 및/또는 IL-15Ra의 N-말단에 융합된다. 일부 구현예에서, IL-15는 IL-15Ra에 비-공유 결합된다. 일부 구현예에서, IL-15는 IL-15Ra에 융합된다. 일부 구현예에서, IL-15는 IL-15Ra의 N-말단에 융합된다. 일부 구현예에서, IL-15는 IL-15Ra의 C-말단에 융합된다. 일부 구현예에서, 알부민 결합 모이어티는 제2 사이토카인의 N- 또는 C-말단에 추가로 융합된다. 일부 구현예에서, 알부민 결합 모이어티는 인간 혈청 알부민(HSA) 및/또는 키노몰구스 원숭이 혈청 알부민(CMSA)에 결합한다. 일부 구현예에서, 알부민 결합 모이어티는 알부민 결합 도메인(ABD)을 포함한다. 일부 구현예에서, 일부민 결합 도메인은 서열번호 3-11로 이루어지는 그룹 중에서 선택된 아미노산 서열 또는 서열번호 3-11 중 어느 하나에 적어도 약 80%(예를 들어 적어도 약 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 중 어느 하나)의 서열 동일성을 포함하는 이의 변이체를 포함한다. 일부 구현예에서, 알부민 결합 모이어티는 항-알부민 항체(예를 들어 단일 도메인 항체(sdAb), 예를 들어 VhH 단일 도메인 항체)를 포함한다. 일부 구현예에서, 사이토카인 및 알부민 결합 모이어티는 제1 링커를 통해 연결된다. 일부 구현예에서 제1 링커는 약 1 내지 30 아미노산의 길이를 갖는다. 일부 구현예에서, 제1 링커는 서열번호 12-26 및 158-159로 이루어지는 그룹 중에서 선택된다. 일부 구현예에서, IL-15 및 IL-15Ra는 제2 링커를 통해 융합된다. 일부 구현예에서, 제2 링커는 절단가능한 링커이다. 일부 구현예에서, 제2 링커는 서열번호 27-45로 이루어지는 그룹 중에서 선택된다. 일부 구현예에서, 제2 링커는 서열번호 27의 서열을 갖는다. 일부 구현예에서, 제2 링커는 절단가능하지 않은 링커이다. 일부 구현예에서, 제2 링커는 서열번호 12-26 및 158-159로 이루어지는 그룹 중에서 선택된다. 일부 구현예에서, IL-15Ra에 결합된 IL-15 또는 이의 단편은 서열번호 101-108 중 어느 하나의 아미노산 서열, 또는 서열번호 101-108 중 어느 하나에 적어도 약 80% 서열 동일성을 포함하는 이의 변이체를 포함한다. 일부 구현예에서, IL-15 및 IL-15Ra는 링커("IL-15와 IL-15Ra 간의 링커")를 통해 연결된다. 일부 구현예에서, IL-15와 IL-15Ra 간의 링커는 절단가능하다. 일부 구현예에서, IL-15와 IL-15Ra 간의 링커는 절단가능하지 않다.
일부 구현예에서, a) IL-15 및 IL-15Ra를 포함하는 IL-15Ra에 결합된 IL-15, 및 b) 알부민 결합 모이어티(예를 들어 알부민에 결합하는 sdAb)를 포함하는 융합 단백질을 제공하며, 여기에서 융합 단백질은 N-말단에서부터 C-말단으로 (1) 알부민 결합 모이어티, IL-15, IL-15Ra; (2) 알부민 결합 모이어티, IL-15Ra, IL-15; (3) IL-15, IL-15Ra, 알부민 결합 모이어티; (4) IL-15Ra, IL-15, 알부민 결합 모이어티로 이루어지는 그룹 중에서 선택된 순서로 상기 IL-15, IL-15Ra 및 알부민 결합 모이어티를 포함한다. 일부 구현예에서, 알부민 결합 모이어티는 인간 혈청 알부민(HSA) 및/또는 키노몰구스 원숭이 혈청 알부민(CMSA)에 결합한다. 일부 구현예에서, 알부민 결합 모이어티는 알부민 결합 도메인(ABD)을 포함한다. 일부 구현예에서, 일부민 결합 도메인은 서열번호 3-11로 이루어지는 그룹 중에서 선택된 아미노산 서열 또는 서열번호 3-11 중 어느 하나에 적어도 약 80%(예를 들어 적어도 약 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 중 어느 하나)의 서열 동일성을 포함하는 이의 변이체를 포함한다. 일부 구현예에서, 알부민 결합 모이어티는 항-알부민 항체(예를 들어 단일 도메인 항체(sdAb), 예를 들어 VhH 단일 도메인 항체)를 포함한다. 일부 구현예에서, 사이토카인(IL-15 또는 IL-15Ra) 및 알부민 결합 모이어티는 제1 링커를 통해 연결된다. 일부 구현예에서 제1 링커는 약 1 내지 30 아미노산의 길이를 갖는다. 일부 구현예에서, 제1 링커는 서열번호 12-26 및 158-159로 이루어지는 그룹 중에서 선택된다. 일부 구현예에서, IL-15 및 IL-15Ra는 제2 링커를 통해 융합된다. 일부 구현예에서, 제2 링커는 절단가능한 링커이다. 일부 구현예에서, 제2 링커는 서열번호 27-45로 이루어지는 그룹 중에서 선택된다. 일부 구현예에서, 제2 링커는 서열번호 27의 서열을 갖는다. 일부 구현예에서, 제2 링커는 절단가능하지 않은 링커이다. 일부 구현예에서, 제2 링커는 서열번호 12-26 및 158-159로 이루어지는 그룹 중에서 선택된다. 일부 구현예에서, IL-15Ra에 결합된 IL-15 또는 이의 단편은 서열번호 101-108 중 어느 하나의 아미노산 서열, 또는 서열번호 101-108 중 어느 하나에 적어도 약 80% 서열 동일성을 포함하는 이의 변이체를 포함한다. 일부 구현예에서, IL-15 및 IL-15Ra는 링커("IL-15와 IL-15R 간의 링커")를 통해 연결된다. 일부 구현예에서, IL-15와 IL-15Ra 간의 링커는 절단가능하다. 일부 구현예에서, IL-15와 IL-15Ra 간의 링커는 절단가능하지 않다.
일부 구현예에서, a) IL-15 및 IL-15Ra를 포함하는 IL-15Ra에 결합된 IL-15, 및 b) 알부민 결합 모이어티(예를 들어 알부민에 결합하는 sdAb)를 포함하는 융합 단백질을 제공하며, 여기에서 IL-15는 서열번호 99, 100 또는 127 중 어느 하나의 아미노산 서열 또는 서열번호 99, 100 또는 127 중 어느 하나에 적어도 약 80%(예를 들어 적어도 약 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 중 어느 하나)의 서열 동일성을 포함하는 이의 변이체를 포함하고, 알부민 결합 모이어티는 알부민 결합 도메인을 포함한다. 일부 구현예에서, 사이토카인은 알부민 결합 모이어티의 C-말단에 융합된다. 일부 구현예에서, 사이토카인은 알부민 결합 모이어티의 N-말단에 융합된다. 일부 구현예에서, 알부민 결합 모이어티는 사이토카인의 N-말단 및 C-말단 모두에 융합된다. 일부 구현예에서, 제1 사이토카인과 동일하거나 상이한 제2 사이토카인은 일부민 결합 모이어티의 다른 말단에 융합된다. 일부 구현예에서, 알부민 결합 모이어티는 인간 혈청 알부민(HSA) 및/또는 키노몰구스 원숭이 혈청 알부민(CMSA)에 결합한다. 일부 구현예에서, 일부민 결합 도메인은 서열번호 3-11로 이루어지는 그룹 중에서 선택된 아미노산 서열 또는 서열번호 3-11 중 어느 하나에 적어도 약 80%(예를 들어 적어도 약 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 중 어느 하나)의 서열 동일성을 포함하는 이의 변이체를 포함한다. 일부 구현예에서, 사이토카인 및 알부민 결합 모이어티는 제1 링커를 통해 연결된다. 일부 구현예에서 제1 링커는 약 1 내지 30 아미노산의 길이를 갖는다. 일부 구현예에서, 제1 링커는 서열번호 12-26 및 158-159로 이루어지는 그룹 중에서 선택된다. 일부 구현예에서, IL-15는 IL-15Ra에 비-공유 결합된다. 일부 구현예에서, IL-15는 IL-15Ra에 융합된다. 일부 구현예에서, IL-15는 IL-15Ra의 N-말단에 융합된다. 일부 구현예에서, IL-15는 IL-15Ra의 C-말단에 융합된다. 일부 구현예에서, 융합 단백질은 N-말단에서부터 C-말단으로 (1) 알부민 결합 모이어티, IL-15, IL-15Ra; (2) 알부민 결합 모이어티, IL-15Ra, IL-15; (3) IL-15, IL-15Ra, 알부민 결합 모이어티; (4) IL-15Ra, IL-15, 알부민 결합 모이어티로 이루어지는 그룹 중에서 선택된 순서로 상기 IL-15, IL-15Ra 및 알부민 결합 모이어티를 포함한다. 일부 구현예에서, IL-15 및 IL-15Ra는 제2 링커를 통해 융합된다. 일부 구현예에서, 제2 링커는 절단가능한 링커이다. 일부 구현예에서, 제2 링커는 서열번호 27-45로 이루어지는 그룹 중에서 선택된다. 일부 구현예에서, 제2 링커는 서열번호 27의 서열을 갖는다. 일부 구현예에서, 제2 링커는 절단가능하지 않은 링커이다. 일부 구현예에서, 제2 링커는 서열번호 12-26 및 158-159로 이루어지는 그룹 중에서 선택된다. 일부 구현예에서, IL-15Ra에 결합된 IL-15 또는 이의 단편은 서열번호 101-108 중 어느 하나의 아미노산 서열, 또는 서열번호 101-108 중 어느 하나에 적어도 약 80% 서열 동일성을 포함하는 이의 변이체를 포함한다. 일부 구현예에서, IL-15 및 IL-15Ra는 링커("IL-15와 IL-15Ra 간의 링커")를 통해 연결된다. 일부 구현예에서, IL-15와 IL-15Ra 간의 링커는 절단가능하다. 일부 구현예에서, IL-15와 IL-15Ra 간의 링커는 절단가능하지 않다.
일부 구현예에서, a) IL-15 및 IL-15Ra를 포함하는 IL-15Ra에 결합된 IL-15, 및 b) 알부민 결합 모이어티(예를 들어 알부민에 결합하는 sdAb)를 포함하는 융합 단백질을 제공하며, 여기에서 IL-15는 서열번호 99, 100 또는 127 중 어느 하나의 아미노산 서열 또는 서열번호 99, 100 또는 127 중 어느 하나에 적어도 약 80%(예를 들어 적어도 약 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 중 어느 하나)의 서열 동일성을 포함하는 이의 변이체를 포함하고, 알부민 결합 모이어티는 항-알부민 항체 또는 이의 단편(예를 들어 단일 도메인 항체, 예를 들어 VhH 항체)을 포함한다. 일부 구현예에서, 사이토카인은 알부민 결합 모이어티의 C-말단에 융합된다. 일부 구현예에서, 사이토카인은 알부민 결합 모이어티의 N-말단에 융합된다. 일부 구현예에서, 알부민 결합 모이어티는 사이토카인의 N-말단 및 C-말단 모두에 융합된다. 일부 구현예에서, 제1 사이토카인과 동일하거나 상이한 제2 사이토카인은 일부민 결합 모이어티의 다른 말단에 융합된다. 일부 구현예에서, 알부민 결합 모이어티는 인간 혈청 알부민(HSA) 및/또는 키노몰구스 원숭이 혈청 알부민(CMSA)에 결합한다. 일부 구현예에서, 사이토카인 및 알부민 결합 모이어티는 제1 링커를 통해 연결된다. 일부 구현예에서, 제1 링커는 약 1 내지 30 아미노산의 길이를 갖는다. 일부 구현예에서, 제1 링커는 서열번호 12-26 및 158-159로 이루어지는 그룹 중에서 선택된다. 일부 구현예에서, IL-15는 IL-15Ra에 비-공유 결합된다. 일부 구현예에서, IL-15는 IL-15Ra에 융합된다. 일부 구현예에서, IL-15는 IL-15Ra의 N-말단에 융합된다. 일부 구현예에서, IL-15는 IL-15Ra의 C-말단에 융합된다. 일부 구현예에서, 융합 단백질은 N-말단에서부터 C-말단으로 (1) 알부민 결합 모이어티, IL-15, IL-15Ra; (2) 알부민 결합 모이어티, IL-15Ra, IL-15; (3) IL-15, IL-15Ra, 알부민 결합 모이어티; (4) IL-15Ra, IL-15, 알부민 결합 모이어티로 이루어지는 그룹 중에서 선택된 순서로 상기 IL-15, IL-15Ra 및 알부민 결합 모이어티를 포함한다. 일부 구현예에서, IL-15 및 IL-15Ra는 제2 링커를 통해 융합된다. 일부 구현예에서, 제2 링커는 절단가능한 링커이다. 일부 구현예에서, 제2 링커는 서열번호 27-45로 이루어지는 그룹 중에서 선택된다. 일부 구현예에서, 제2 링커는 서열번호 27의 서열을 갖는다. 일부 구현예에서, 제2 링커는 절단가능하지 않은 링커이다. 일부 구현예에서, 제2 링커는 서열번호 12-26 및 158-159로 이루어지는 그룹 중에서 선택된다. 일부 구현예에서, IL-15Ra에 결합된 IL-15 또는 이의 단편은 서열번호 101-108 중 어느 하나의 아미노산 서열, 또는 서열번호 101-108 중 어느 하나에 적어도 약 80% 서열 동일성을 포함하는 이의 변이체를 포함한다. 일부 구현예에서, IL-15 및 IL-15Ra는 링커("IL-15와 IL-15Ra 간의 링커")를 통해 연결된다. 일부 구현예에서, IL-15와 IL-15Ra 간의 링커는 절단가능하다. 일부 구현예에서, IL-15와 IL-15Ra 간의 링커는 절단가능하지 않다.
일부 구현예에서, a) IL-15 및 IL-15Ra를 포함하는 IL-15Ra에 결합된 IL-15, 및 b) 알부민 결합 모이어티(예를 들어 알부민에 결합하는 sdAb)를 포함하는 융합 단백질을 제공하며, 여기에서 IL-15Ra는 서열번호 101-108 중 어느 하나(예를 들어 서열번호 103-104)의 아미노산 서열 또는 서열번호 101-108 중 어느 하나(예를 들어 서열번호 103-104)에 적어도 약 80%(예를 들어 적어도 약 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 중 어느 하나)의 서열 동일성을 포함하는 이의 변이체를 포함하고, 알부민 결합 모이어티는 알부민 결합 도메인을 포함한다. 일부 구현예에서, 사이토카인은 알부민 결합 모이어티의 C-말단에 융합된다. 일부 구현예에서, 사이토카인은 알부민 결합 모이어티의 N-말단에 융합된다. 일부 구현예에서, 알부민 결합 모이어티는 사이토카인의 N-말단 및 C-말단 모두에 융합된다. 일부 구현예에서, 제1 사이토카인과 동일하거나 상이한 제2 사이토카인은 일부민 결합 모이어티의 다른 말단에 융합된다. 일부 구현예에서, 알부민 결합 모이어티는 인간 혈청 알부민(HSA) 및/또는 키노몰구스 원숭이 혈청 알부민(CMSA)에 결합한다. 일부 구현예에서, 일부민 결합 도메인은 서열번호 3-11로 이루어지는 그룹 중에서 선택된 아미노산 서열 또는 서열번호 3-11 중 어느 하나에 적어도 약 80%(예를 들어 적어도 약 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 중 어느 하나)의 서열 동일성을 포함하는 이의 변이체를 포함한다. 일부 구현예에서, 사이토카인 및 알부민 결합 모이어티는 제1 링커를 통해 연결된다. 일부 구현예에서 제1 링커는 약 1 내지 30 아미노산의 길이를 갖는다. 일부 구현예에서, 제1 링커는 서열번호 12-26 및 158-159로 이루어지는 그룹 중에서 선택된다. 일부 구현예에서, IL-15는 IL-15Ra에 비-공유 결합된다. 일부 구현예에서, IL-15는 IL-15Ra에 융합된다. 일부 구현예에서, IL-15는 IL-15Ra의 N-말단에 융합된다. 일부 구현예에서, IL-15는 IL-15Ra의 C-말단에 융합된다. 일부 구현예에서, 융합 단백질은 N-말단에서부터 C-말단으로 (1) 알부민 결합 모이어티, IL-15, IL-15Ra; (2) 알부민 결합 모이어티, IL-15Ra, IL-15; (3) IL-15, IL-15Ra, 알부민 결합 모이어티; (4) IL-15Ra, IL-15, 알부민 결합 모이어티로 이루어지는 그룹 중에서 선택된 순서로 상기 IL-15, IL-15Ra 및 알부민 결합 모이어티를 포함한다. 일부 구현예에서, IL-15 및 IL-15Ra는 제2 링커를 통해 융합된다. 일부 구현예에서, 제2 링커는 절단가능한 링커이다. 일부 구현예에서, 제2 링커는 서열번호 27-45로 이루어지는 그룹 중에서 선택된다. 일부 구현예에서, 제2 링커는 서열번호 27의 서열을 갖는다. 일부 구현예에서, 제2 링커는 절단가능하지 않은 링커이다. 일부 구현예에서, 제2 링커는 서열번호 12-26 및 158-159로 이루어지는 그룹 중에서 선택된다.
일부 구현예에서, a) IL-15 및 IL-15Ra를 포함하는 IL-15Ra에 결합된 IL-15, 및 b) 알부민 결합 모이어티(예를 들어 알부민에 결합하는 sdAb)를 포함하는 융합 단백질을 제공하며, 여기에서 IL-15Ra는 서열번호 101-108 중 어느 하나(예를 들어 서열번호 103-104)의 아미노산 서열 또는 서열번호 101-108 중 어느 하나(예를 들어 서열번호 103-104)에 적어도 약 80%(예를 들어 적어도 약 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 중 어느 하나)의 서열 동일성을 포함하는 이의 변이체를 포함하고, 알부민 결합 모이어티는 항-알부민 항체 또는 이의 단편(예를 들어 단일 도메인 항체, 예를 들어 VhH 항체)을 포함한다. 일부 구현예에서, 사이토카인은 알부민 결합 모이어티의 C-말단에 융합된다. 일부 구현예에서, 사이토카인은 알부민 결합 모이어티의 N-말단에 융합된다. 일부 구현예에서, 알부민 결합 모이어티는 사이토카인의 N-말단 및 C-말단 모두에 융합된다. 일부 구현예에서, 제1 사이토카인과 동일하거나 상이한 제2 사이토카인은 일부민 결합 모이어티의 다른 말단에 융합된다. 일부 구현예에서, 알부민 결합 모이어티는 인간 혈청 알부민(HSA) 및/또는 키노몰구스 원숭이 혈청 알부민(CMSA)에 결합한다. 일부 구현예에서, 사이토카인 및 알부민 결합 모이어티는 제1 링커를 통해 연결된다. 일부 구현예에서 제1 링커는 약 1 내지 30 아미노산의 길이를 갖는다. 일부 구현예에서, 제1 링커는 서열번호 12-26 및 158-159로 이루어지는 그룹 중에서 선택된다. 일부 구현예에서, IL-15는 IL-15Ra에 비-공유 결합된다. 일부 구현예에서, IL-15는 IL-15Ra에 융합된다. 일부 구현예에서, IL-15는 IL-15Ra의 N-말단에 융합된다. 일부 구현예에서, IL-15는 IL-15Ra의 C-말단에 융합된다. 일부 구현예에서, 융합 단백질은 N-말단에서부터 C-말단으로 (1) 알부민 결합 모이어티, IL-15, IL-15Ra; (2) 알부민 결합 모이어티, IL-15Ra, IL-15; (3) IL-15, IL-15Ra, 알부민 결합 모이어티; (4) IL-15Ra, IL-15, 알부민 결합 모이어티로 이루어지는 그룹 중에서 선택된 순서로 상기 IL-15, IL-15Ra 및 알부민 결합 모이어티를 포함한다. 일부 구현예에서, IL-15 및 IL-15Ra는 제2 링커를 통해 융합된다. 일부 구현예에서, 제2 링커는 절단가능한 링커이다. 일부 구현예에서, 제2 링커는 서열번호 27-45로 이루어지는 그룹 중에서 선택된다. 일부 구현예에서, 제2 링커는 서열번호 27의 서열을 갖는다. 일부 구현예에서, 제2 링커는 절단가능하지 않은 링커이다. 일부 구현예에서, 제2 링커는 서열번호 12-26 및 158-159로 이루어지는 그룹 중에서 선택된다.
일부 구현예에서, a) IL-15 및 IL-15Ra를 포함하는 IL-15Ra에 결합된 IL-15, 및 b) 알부민 결합 모이어티(예를 들어 알부민에 결합하는 sdAb)를 포함하는 융합 단백질을 제공하며, 여기에서 IL-15는 서열번호 99, 100 또는 127 중 어느 하나의 아미노산 서열 또는 서열번호 99, 100 또는 127 중 어느 하나에 적어도 약 80%(예를 들어 적어도 약 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 중 어느 하나)의 서열 동일성을 포함하는 이의 변이체를 포함하고, IL-15Ra는 서열번호 101-108 중 어느 하나(예를 들어 서열번호 103-104)의 아미노산 서열 또는 서열번호 101-108 중 어느 하나(예를 들어 서열번호 103-104)에 적어도 약 80%(예를 들어 적어도 약 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 중 어느 하나)의 서열 동일성을 포함하는 이의 변이체를 포함하고, 알부민 결합 모이어티는 항-알부민 항체 또는 이의 단편(예를 들어 단일 도메인 항체, 예를 들어 VhH 항체)를 포함한다. 일부 구현예에서, 사이토카인은 알부민 결합 모이어티의 C-말단에 융합된다. 일부 구현예에서, 사이토카인은 알부민 결합 모이어티의 N-말단에 융합된다. 일부 구현예에서, 알부민 결합 모이어티는 사이토카인의 N-말단 및 C-말단 모두에 융합된다. 일부 구현예에서, 제1 사이토카인과 동일하거나 상이한 제2 사이토카인은 일부민 결합 모이어티의 다른 말단에 융합된다. 일부 구현예에서, 알부민 결합 모이어티는 인간 혈청 알부민(HSA) 및/또는 키노몰구스 원숭이 혈청 알부민(CMSA)에 결합한다. 일부 구현예에서, 사이토카인 및 알부민 결합 모이어티는 제1 링커를 통해 연결된다. 일부 구현예에서 제1 링커는 약 1 내지 30 아미노산의 길이를 갖는다. 일부 구현예에서, 제1 링커는 서열번호 12-26 및 158-159로 이루어지는 그룹 중에서 선택된다. 일부 구현예에서, IL-15는 IL-15Ra에 비-공유 결합된다. 일부 구현예에서, IL-15는 IL-15Ra에 융합된다. 일부 구현예에서, IL-15는 IL-15Ra의 N-말단에 융합된다. 일부 구현예에서, IL-15는 IL-15Ra의 C-말단에 융합된다. 일부 구현예에서, 융합 단백질은 N-말단에서부터 C-말단으로 (1) 알부민 결합 모이어티, IL-15, IL-15Ra; (2) 알부민 결합 모이어티, IL-15Ra, IL-15; (3) IL-15, IL-15Ra, 알부민 결합 모이어티; (4) IL-15Ra, IL-15, 알부민 결합 모이어티로 이루어지는 그룹 중에서 선택된 순서로 상기 IL-15, IL-15Ra 및 알부민 결합 모이어티를 포함한다. 일부 구현예에서, IL-15 및 IL-15Ra는 제2 링커를 통해 융합된다. 일부 구현예에서, 제2 링커는 절단가능한 링커이다. 일부 구현예에서, 제2 링커는 서열번호 27-45로 이루어지는 그룹 중에서 선택된다. 일부 구현예에서, 제2 링커는 서열번호 27의 서열을 갖는다. 일부 구현예에서, 제2 링커는 절단가능하지 않은 링커이다. 일부 구현예에서, 제2 링커는 서열번호 12-26 및 158-159로 이루어지는 그룹 중에서 선택된다.
일부 구현예에서, a) IL-15 및 IL-15Ra를 포함하는 IL-15Ra에 결합된 IL-15, 및 b) 알부민 결합 모이어티(예를 들어 알부민에 결합하는 sdAb)를 포함하는 융합 단백질을 제공하며, 여기에서 상기 IL-15, IL-15Ra 및 알부민 결합 모이어티는 N-말단에서부터 C-말단으로 알부민 결합 모이어티, IL-15, IL-15Ra의 순서이고, IL-15는 서열번호 99, 100 또는 127 중 어느 하나의 아미노산 서열 또는 서열번호 99, 100 또는 127 중 어느 하나에 적어도 약 80%(예를 들어 적어도 약 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 중 어느 하나)의 서열 동일성을 포함하는 이의 변이체를 포함하고, IL-15Ra는 서열번호 101-108 중 어느 하나(예를 들어 서열번호 103-104)의 아미노산 서열 또는 서열번호 101-108 중 어느 하나(예를 들어 서열번호 103-104)에 적어도 약 80%(예를 들어 적어도 약 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 중 어느 하나)의 서열 동일성을 포함하는 이의 변이체를 포함하고, 알부민 결합 모이어티는 항-알부민 항체 또는 이의 단편(예를 들어 단일 도메인 항체, 예를 들어 VhH 항체)을 포함한다. 일부 구현예에서, 사이토카인은 알부민 결합 모이어티의 C-말단에 융합된다. 일부 구현예에서, 사이토카인은 알부민 결합 모이어티의 N-말단에 융합된다. 일부 구현예에서, 알부민 결합 모이어티는 사이토카인의 N-말단 및 C-말단 모두에 융합된다. 일부 구현예에서, 제1 사이토카인과 동일하거나 상이한 제2 사이토카인은 일부민 결합 모이어티의 다른 말단에 융합된다. 일부 구현예에서, 알부민 결합 모이어티는 인간 혈청 알부민(HSA) 및/또는 키노몰구스 원숭이 혈청 알부민(CMSA)에 결합한다. 일부 구현예에서, 사이토카인 및 알부민 결합 모이어티는 제1 링커를 통해 연결된다. 일부 구현예에서 제1 링커는 약 1 내지 30 아미노산의 길이를 갖는다. 일부 구현예에서, 제1 링커는 서열번호 12-26 및 158-159로 이루어지는 그룹 중에서 선택된다. 일부 구현예에서, IL-15 및 IL-15Ra는 제2 링커를 통해 융합된다. 일부 구현예에서, 제2 링커는 절단가능한 링커이다. 일부 구현예에서, 제2 링커는 서열번호 27-45로 이루어지는 그룹 중에서 선택된다. 일부 구현예에서, 제2 링커는 서열번호 27의 서열을 갖는다. 일부 구현예에서, 제2 링커는 절단가능하지 않은 링커이다. 일부 구현예에서, 제2 링커는 서열번호 12-26 및 158-159로 이루어지는 그룹 중에서 선택된다.
일부 구현예에서, a) IL-33 및 b) 알부민 결합 모이어티(예를 들어 알부민에 결합하는 sdAb)를 포함하는 융합 단백질을 제공한다. 일부 구현예에서, 사이토카인은 알부민 결합 모이어티의 C-말단에 융합된다. 일부 구현예에서, 사이토카인은 알부민 결합 모이어티의 N-말단에 융합된다. 일부 구현예에서, 알부민 결합 모이어티는 사이토카인의 N-말단 및 C-말단 모두에 융합된다. 일부 구현예에서, 제1 사이토카인과 동일하거나 상이한 제2 사이토카인은 일부민 결합 모이어티의 다른 말단에 융합된다. 일부 구현예에서, 알부민 결합 모이어티는 인간 혈청 알부민(HSA) 및/또는 키노몰구스 원숭이 혈청 알부민(CMSA)에 결합한다. 일부 구현예에서, 알부민 결합 모이어티는 알부민 결합 도메인(ABD)을 포함한다. 일부 구현예에서, 일부민 결합 도메인은 서열번호 3-11로 이루어지는 그룹 중에서 선택된 아미노산 서열 또는 서열번호 3-11 중 어느 하나에 적어도 약 80%(예를 들어 적어도 약 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 중 어느 하나)의 서열 동일성을 포함하는 이의 변이체를 포함한다. 일부 구현예에서, 알부민 결합 모이어티는 항-알부민 항체(예를 들어 단일 도메인 항체(sdAb), 예를 들어 VhH 단일 도메인 항체)를 포함한다. 일부 구현예에서, 사이토카인 및 알부민 결합 모이어티는 제1 링커를 통해 연결된다. 일부 구현예에서 제1 링커는 약 1 내지 30 아미노산의 길이를 갖는다. 일부 구현예에서, 제1 링커는 서열번호 12-26 및 158-159로 이루어지는 그룹 중에서 선택된다. 일부 구현예에서, 사이토카인과 알부민 결합 모이어티 사이에 링커가 없다.
일부 구현예에서, a) IL-33 및 b) 알부민 결합 모이어티(예를 들어 알부민에 결합하는 sdAb)를 포함하는 융합 단백질을 제공하며, 여기에서 IL-33은 서열번호 109 및 155-157 중 어느 하나의 아미노산 서열 또는 서열번호 109 및 155-157 중 어느 하나에 적어도 약 80%(예를 들어 적어도 약 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 중 어느 하나)의 서열 동일성을 포함하는 이의 변이체를 포함하고, 알부민 결합 모이어티는 알부민 결합 도메인을 포함한다. 일부 구현예에서, 사이토카인은 알부민 결합 모이어티의 C-말단에 융합된다. 일부 구현예에서, 사이토카인은 알부민 결합 모이어티의 N-말단에 융합된다. 일부 구현예에서, 알부민 결합 모이어티는 사이토카인의 N-말단 및 C-말단 모두에 융합된다. 일부 구현예에서, 제1 사이토카인과 동일하거나 상이한 제2 사이토카인은 일부민 결합 모이어티의 다른 말단에 융합된다. 일부 구현예에서, 알부민 결합 모이어티는 인간 혈청 알부민(HSA) 및/또는 키노몰구스 원숭이 혈청 알부민(CMSA)에 결합한다. 일부 구현예에서, 알부민 결합 도메인은 서열번호 3-11로 이루어지는 그룹 중에서 선택된 아미노산 서열 또는 서열번호 3-11 중 어느 하나에 적어도 약 80%(예를 들어 적어도 약 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 중 어느 하나)의 서열 동일성을 포함하는 이의 변이체를 포함한다. 일부 구현예에서, 사이토카인 및 알부민 결합 모이어티는 제1 링커를 통해 연결된다. 일부 구현예에서 제1 링커는 약 1 내지 30 아미노산의 길이를 갖는다. 일부 구현예에서, 제1 링커는 서열번호 12-26 및 158-159로 이루어지는 그룹 중에서 선택된다. 일부 구현예에서, 사이토카인과 알부민 결합 모이어티 사이에 링커가 없다.
일부 구현예에서, a) IL-33 및 b) 알부민 결합 모이어티(예를 들어 알부민에 결합하는 sdAb)를 포함하는 융합 단백질을 제공하며, 여기에서 IL-33은 서열번호 109 및 155-157 중 어느 하나의 아미노산 서열 또는 서열번호 109 및 155-157 중 어느 하나에 적어도 약 80%(예를 들어 적어도 약 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 중 어느 하나)의 서열 동일성을 포함하는 이의 변이체를 포함하고, 알부민 결합 모이어티는 항-알부민 항체 또는 이의 단편(예를 들어 단일 도메인 항체, 예를 들어 VhH 항체)을 포함한다. 일부 구현예에서, 사이토카인은 알부민 결합 모이어티의 C-말단에 융합된다. 일부 구현예에서, 사이토카인은 알부민 결합 모이어티의 N-말단에 융합된다. 일부 구현예에서, 알부민 결합 모이어티는 사이토카인의 N-말단 및 C-말단 모두에 융합된다. 일부 구현예에서, 제1 사이토카인과 동일하거나 상이한 제2 사이토카인은 일부민 결합 모이어티의 다른 말단에 융합된다. 일부 구현예에서, 알부민 결합 모이어티는 인간 혈청 알부민(HSA) 및/또는 키노몰구스 원숭이 혈청 알부민(CMSA)에 결합한다. 일부 구현예에서, 사이토카인 및 알부민 결합 모이어티는 제1 링커를 통해 연결된다. 일부 구현예에서 제1 링커는 약 1 내지 30 아미노산의 길이를 갖는다. 일부 구현예에서, 제1 링커는 서열번호 12-26 및 158-159로 이루어지는 그룹 중에서 선택된다. 일부 구현예에서, 사이토카인과 알부민 결합 모이어티 사이에 링커가 없다.
일부 구현예에서, a) IL-22 및 b) 알부민 결합 모이어티(예를 들어 알부민에 결합하는 sdAb)를 포함하는 융합 단백질을 제공한다. 일부 구현예에서, 사이토카인은 알부민 결합 모이어티의 C-말단에 융합된다. 일부 구현예에서, 사이토카인은 알부민 결합 모이어티의 N-말단에 융합된다. 일부 구현예에서, 알부민 결합 모이어티는 사이토카인의 N-말단 및 C-말단 모두에 융합된다. 일부 구현예에서, 제1 사이토카인과 동일하거나 상이한 제2 사이토카인은 일부민 결합 모이어티의 다른 말단에 융합된다. 일부 구현예에서, 알부민 결합 모이어티는 인간 혈청 알부민(HSA) 및/또는 키노몰구스 원숭이 혈청 알부민(CMSA)에 결합한다. 일부 구현예에서, 알부민 결합 모이어티는 알부민 결합 도메인(ABD)을 포함한다. 일부 구현예에서, 일부민 결합 도메인은 서열번호 3-11로 이루어지는 그룹 중에서 선택된 아미노산 서열 또는 서열번호 3-11 중 어느 하나에 적어도 약 80%(예를 들어 적어도 약 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 중 어느 하나)의 서열 동일성을 포함하는 이의 변이체를 포함한다. 일부 구현예에서, 알부민 결합 모이어티는 항-알부민 항체(예를 들어 단일 도메인 항체(sdAb), 예를 들어 VhH 단일 도메인 항체)를 포함한다. 일부 구현예에서, 사이토카인 및 알부민 결합 모이어티는 제1 링커를 통해 연결된다. 일부 구현예에서 제1 링커는 약 1 내지 30 아미노산의 길이를 갖는다. 일부 구현예에서, 제1 링커는 서열번호 12-26 및 158-159로 이루어지는 그룹 중에서 선택된다.
일부 구현예에서, a) IL-22 및 b) 알부민 결합 모이어티(예를 들어 알부민에 결합하는 sdAb)를 포함하는 융합 단백질을 제공하며, 여기에서 IL-22는 서열번호 109-110 중 어느 하나의 아미노산 서열 또는 서열번호 99, 100 또는 127 중 어느 하나에 적어도 약 80%(예를 들어 적어도 약 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 중 어느 하나)의 서열 동일성을 포함하는 이의 변이체를 포함하고, 알부민 결합 모이어티는 알부민 결합 도메인을 포함한다. 일부 구현예에서, 사이토카인은 알부민 결합 모이어티의 C-말단에 융합된다. 일부 구현예에서, 사이토카인은 알부민 결합 모이어티의 N-말단에 융합된다. 일부 구현예에서, 알부민 결합 모이어티는 사이토카인의 N-말단 및 C-말단 모두에 융합된다. 일부 구현예에서, 제1 사이토카인과 동일하거나 상이한 제2 사이토카인은 일부민 결합 모이어티의 다른 말단에 융합된다. 일부 구현예에서, 알부민 결합 모이어티는 인간 혈청 알부민(HSA) 및/또는 키노몰구스 원숭이 혈청 알부민(CMSA)에 결합한다. 일부 구현예에서, 알부민 결합 도메인은 서열번호 3-11로 이루어지는 그룹 중에서 선택된 아미노산 서열 또는 서열번호 3-11 중 어느 하나에 적어도 약 80%(예를 들어 적어도 약 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 중 어느 하나)의 서열 동일성을 포함하는 이의 변이체를 포함한다. 일부 구현예에서, 사이토카인 및 알부민 결합 모이어티는 제1 링커를 통해 연결된다. 일부 구현예에서 제1 링커는 약 1 내지 30 아미노산의 길이를 갖는다. 일부 구현예에서, 제1 링커는 서열번호 12-26 및 158-159로 이루어지는 그룹 중에서 선택된다.
일부 구현예에서, a) IL-22 및 b) 알부민 결합 모이어티(예를 들어 알부민에 결합하는 sdAb)를 포함하는 융합 단백질을 제공하며, 여기에서 IL-22는 서열번호 109-110 중 어느 하나의 아미노산 서열 또는 서열번호 109-110 중 어느 하나에 적어도 약 80%(예를 들어 적어도 약 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 중 어느 하나)의 서열 동일성을 포함하는 이의 변이체를 포함하고, 알부민 결합 모이어티는 항-알부민 항체 또는 이의 단편(예를 들어 단일 도메인 항체, 예를 들어 VhH 항체)를 포함한다. 일부 구현예에서, 사이토카인은 알부민 결합 모이어티의 C-말단에 융합된다. 일부 구현예에서, 사이토카인은 알부민 결합 모이어티의 N-말단에 융합된다. 일부 구현예에서, 알부민 결합 모이어티는 사이토카인의 N-말단 및 C-말단 모두에 융합된다. 일부 구현예에서, 제1 사이토카인과 동일하거나 상이한 제2 사이토카인은 일부민 결합 모이어티의 다른 말단에 융합된다. 일부 구현예에서, 알부민 결합 모이어티는 인간 혈청 알부민(HSA) 및/또는 키노몰구스 원숭이 혈청 알부민(CMSA)에 결합한다. 일부 구현예에서, 사이토카인 및 알부민 결합 모이어티는 제1 링커를 통해 연결된다. 일부 구현예에서 제1 링커는 약 1 내지 30 아미노산의 길이를 갖는다. 일부 구현예에서, 제1 링커는 서열번호 12-26 및 158-159로 이루어지는 그룹 중에서 선택된다.
항원 결합 모이어티를 포함하는 융합 단백질
본원은 또한 a) 알부민 결합 모이어티에 융합된 사이토카인("사이토카인-ALBBM") 및 b) 항원 결합 모이어티를 포함하는 융합 단백질을 제공하며, 여기에서 사이토카인-ALBBM과 항원 결합 모이어티간의 결합은 임의로 절단가능하다. 일부 구현예에서, 항원 결합 모이어티는 종양 항원에 결합한다. 상기와 같은 융합 단백질은 다양한 장점을 제공한다. 예를 들어, 일부 구현예에서, 종양 항원에 결합하는 항원 결합 모이어티는 암 가까이에 사이토카인의 국소 전달을 가능하게 하여, 보다 낮은 표적-외 독성 및 증가된 효능을 도출할 수 있다.
몇몇 장점은 상기와 같은 융합 단백질에 의해, 상기 단백질의 3차 구조 및 전체적인 배열 설계로 인해 제공된다. 예를 들어, 일부 구현예에서, 사이토카인(예를 들어 IL-21)은 절단가능한 링커(예를 들어 MMP 민감성 링커)를 통해 알부민 결합 모이어티의 C-말단에 융합되고, 항원 결합 모이어티는 알부민 결합 모이어티의 N-말단에 융합된다. 융합 단백질 중의 사이토카인(예를 들어 IL-21)은, 이의 N-말단(3차 구조에서 C-말단에 가까운)이 사이토카인 수용체(예를 들어 IL-21R)와의 상호작용에 요구될 수 있기 때문에 상기 수용체와의 상호작용을 일시적으로 차단할 수 있다. 융합 단백질이 종양 항원에 결합할 때, 암세포는 다양한 MMP를 분비하는 것으로 공지되어 있으므로, 링커가 MMP에 의해 절단되고 활성화되게 되면 사이토카인(예를 들어 IL-21)이 융합 단백질로부터 방출될 수 있다. MMP 민감성 링커는 전형적으로 보다 높은 MMP 활성을 갖는 암이 활성 사이토카인에 더 많이 노출되게 한다. 따라서, 사이토카인(예를 들어 IL-21)의 불필요한 독성 및 부작용을 피할 수 있다. 또한, 말초 면역세포상에서 사이토카인(예를 들어 IL-21)과 사이토카인 수용체(예를 들어 IL-21Ra)간의 상호작용을 방지함으로써, 융합 단백질의 암 전달 효율을 증가시킬 수 있다.
일부 구현예에서, 알부민 결합 모이어티는 단일 도메인 항체(예를 들어 VHH 항체이다). 일부 구현예에서, 항원 결합 모이어티는 단일 도메인 항체(예를 들어 VHH 항체이다). 일부 구현예에서, 알부민 결합 모이어티 및 항원 결합 모이어티는 모두 단일 도메인 항체(예를 들어 VHH 항체이다).
일부 구현예에서, a) 알부민 결합 모이어티에 융합된 사이토카인("사이토카인-ALBBM") 및 b) 항원 결합 모이어티를 포함하는 융합 단백질을 제공하며, 여기에서 사이토카인-ALBBM과 항원 결합 모이어티간의 연결은 임의로 절단가능하고, 알부민 결합 모이어티는 사이토카인의 N-말단에 융합되며, 항원 결합 모이어티는 사이토카인-ALBBM의 N-말단에 연결된다. 일부 구현예에서, 사이토카인은 IL-21, IL-7, IL-15, IL-15Ra에 결합된 IL-15 또는 이의 단편, IL-33 및 IL-22로 이루어지는 그룹 중에서 선택된다. 일부 구현예에서, 알부민 결합 모이어티는 인간 혈청 알부민(HSA) 및/또는 키노몰구스 원숭이 혈청 알부민(CMSA)에 결합한다. 일부 구현예에서, 알부민 결합 모이어티는 알부민 결합 도메인(ABD)을 포함한다. 일부 구현예에서, 일부민 결합 도메인은 서열번호 3-11로 이루어지는 그룹 중에서 선택된 아미노산 서열 또는 서열번호 3-11 중 어느 하나에 적어도 약 80%(예를 들어 적어도 약 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 중 어느 하나)의 서열 동일성을 포함하는 이의 변이체를 포함한다. 일부 구현예에서, 알부민 결합 모이어티는 단일 도메인 항체(sdAb)를 포함한다. 일부 구현예에서, sdAb는 VhH 단일 도메인 항체이다. 일부 구현예에서, 사이토카인 및 알부민 결합 모이어티는 제1 링커를 통해 연결된다. 일부 구현예에서 제1 링커는 약 1 내지 30 아미노산의 길이를 갖는다. 일부 구현예에서, 제1 링커는 서열번호 12-26 및 158-159로 이루어지는 그룹 중에서 선택된다. 일부 구현예에서, 항원 결합 모이어티는 제2 링커를 통해 사이토카인-ALBBM에 융합된다. 일부 구현예에서, 제2 링커는 약 약 1 내지 약 30 아미노산의 길이를 갖는다. 일부 구현예에서, 제2 링커는 절단가능하다. 일부 구현예에서, 절단가능한 링커는 기질 메탈로프로테아제, 레구마인, 매트립타제, 또는 유로키나제 민감성이다. 일부 구현예에서, 제2 링커는 서열번호 12-45 및 158-159로 이루어지는 그룹 중에서 선택된다. 일부 구현예에서, 항원 결합 모이어티는 종양 항원에 결합한다. 일부 구현예에서, 종양 항원은 메소텔린(MSLN), GPA33, Her-2, EGFR 및 CD20으로 이루어지는 그룹 중에서 선택된다. 일부 구현예에서, 종양 항원은 CEA, MUC16, MUC1, AFP, EPCAM, CD19, CD21, CD22, CD30, CD33, CD37, CD45, PSMA, 및 BCMA로 이루어지는 그룹 중에서 선택된다. 일부 구현예에서, 항원 결합 모이어티는 항체 또는 이의 단편이다. 일부 구현예에서, 항원 결합 모이어티는 단일 도메인 항체(sdAb)를 포함한다. 일부 구현예에서, 항원 결합 모이어티는 VHH 단일 도메인 항체를 포함한다. 일부 구현예에서, sdAb는 메소텔린에 결합한다.
일부 구현예에서, a) 알부민 결합 모이어티에 융합된 사이토카인("사이토카인-ALBBM") 및 b) 항원 결합 모이어티를 포함하는 융합 단백질을 제공하며, 여기에서 사이토카인-ALBBM과 항원 결합 모이어티간의 연결은 임의로 절단가능하고, 알부민 결합 모이어티는 사이토카인의 N-말단에 융합되며, 항원 결합 모이어티는 사이토카인-ALBBM의 N-말단에 연결된다. 일부 구현예에서, 사이토카인은 IL-21, IL-7, IL-15, IL-15Ra에 결합된 IL-15 또는 이의 단편, IL-33 및 IL-22로 이루어지는 그룹 중에서 선택된다. 일부 구현예에서, 알부민 결합 모이어티는 인간 혈청 알부민(HSA) 및/또는 키노몰구스 원숭이 혈청 알부민(CMSA)에 결합한다. 일부 구현예에서, 알부민 결합 모이어티는 알부민 결합 도메인(ABD)을 포함한다. 일부 구현예에서, 일부민 결합 도메인은 서열번호 3-11로 이루어지는 그룹 중에서 선택된 아미노산 서열 또는 서열번호 3-11 중 어느 하나에 적어도 약 80%(예를 들어 적어도 약 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 중 어느 하나)의 서열 동일성을 포함하는 이의 변이체를 포함한다. 일부 구현예에서, 알부민 결합 모이어티는 단일 도메인 항체(sdAb)를 포함한다. 일부 구현예에서, sdAb는 VhH 단일 도메인 항체이다. 일부 구현예에서, 사이토카인 및 알부민 결합 모이어티는 제1 링커를 통해 연결된다. 일부 구현예에서 제1 링커는 약 1 내지 30 아미노산의 길이를 갖는다. 일부 구현예에서, 제1 링커는 서열번호 12-26 및 158-159로 이루어지는 그룹 중에서 선택된다. 일부 구현예에서, 항원 결합 모이어티는 제2 링커를 통해 사이토카인-ALBBM에 융합된다. 일부 구현예에서, 제2 링커는 약 약 1 내지 약 30 아미노산의 길이를 갖는다. 일부 구현예에서, 제2 링커는 절단가능하다. 일부 구현예에서, 절단가능한 링커는 기질 메탈로프로테아제, 레구마인, 매트립타제, 또는 유로키나제 민감성이다. 일부 구현예에서, 제2 링커는 서열번호 12-45 및 158-159로 이루어지는 그룹 중에서 선택된다. 일부 구현예에서, 항원 결합 모이어티는 종양 항원에 결합한다. 일부 구현예에서, 종양 항원은 메소텔린(MSLN), GPA33, Her-2, EGFR 및 CD20으로 이루어지는 그룹 중에서 선택된다. 일부 구현예에서, 종양 항원은 CEA, MUC16, MUC1, AFP, EPCAM, CD19, CD21, CD22, CD30, CD33, CD37, CD45, PSMA, 및 BCMA로 이루어지는 그룹 중에서 선택된다. 일부 구현예에서, 항원 결합 모이어티는 항체 또는 이의 단편이다. 일부 구현예에서, 항원 결합 모이어티는 단일 도메인 항체(sdAb)를 포함한다. 일부 구현예에서, 항원 결합 모이어티는 VHH 단일 도메인 항체를 포함한다. 일부 구현예에서, sdAb는 메소텔린에 결합한다.
일부 구현예에서, a) 알부민 결합 모이어티에 융합된 사이토카인("사이토카인-ALBBM") 및 b) 항원 결합 모이어티를 포함하는 융합 단백질을 제공하며, 여기에서 사이토카인-ALBBM과 항원 결합 모이어티간의 연결은 임의로 절단가능하고, 알부민 결합 모이어티는 사이토카인의 C-말단에 융합되며, 항원 결합 모이어티는 사이토카인-ALBBM의 C-말단에 연결된다. 일부 구현예에서, 사이토카인은 IL-21, IL-7, IL-15, IL-15Ra에 결합된 IL-15 또는 이의 단편, IL-33 및 IL-22로 이루어지는 그룹 중에서 선택된다. 일부 구현예에서, 알부민 결합 모이어티는 인간 혈청 알부민(HSA) 및/또는 키노몰구스 원숭이 혈청 알부민(CMSA)에 결합한다. 일부 구현예에서, 알부민 결합 모이어티는 알부민 결합 도메인(ABD)을 포함한다. 일부 구현예에서, 일부민 결합 도메인은 서열번호 3-11로 이루어지는 그룹 중에서 선택된 아미노산 서열 또는 서열번호 3-11 중 어느 하나에 적어도 약 80%(예를 들어 적어도 약 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 중 어느 하나)의 서열 동일성을 포함하는 이의 변이체를 포함한다. 일부 구현예에서, 알부민 결합 모이어티는 단일 도메인 항체(sdAb)를 포함한다. 일부 구현예에서, sdAb는 VhH 단일 도메인 항체이다. 일부 구현예에서, 사이토카인 및 알부민 결합 모이어티는 제1 링커를 통해 연결된다. 일부 구현예에서 제1 링커는 약 1 내지 30 아미노산의 길이를 갖는다. 일부 구현예에서, 제1 링커는 서열번호 12-26 및 158-159로 이루어지는 그룹 중에서 선택된다. 일부 구현예에서, 항원 결합 모이어티는 제2 링커를 통해 사이토카인-ALBBM에 융합된다. 일부 구현예에서, 제2 링커는 약 약 1 내지 약 30 아미노산의 길이를 갖는다. 일부 구현예에서, 제2 링커는 절단가능하다. 일부 구현예에서, 절단가능한 링커는 기질 메탈로프로테아제, 레구마인, 매트립타제, 또는 유로키나제 민감성이다. 일부 구현예에서, 제2 링커는 서열번호 12-45 및 158-159로 이루어지는 그룹 중에서 선택된다. 일부 구현예에서, 항원 결합 모이어티는 종양 항원에 결합한다. 일부 구현예에서, 종양 항원은 메소텔린(MSLN), GPA33, Her-2, EGFR 및 CD20으로 이루어지는 그룹 중에서 선택된다. 일부 구현예에서, 종양 항원은 CEA, MUC16, MUC1, AFP, EPCAM, CD19, CD21, CD22, CD30, CD33, CD37, CD45, PSMA, 및 BCMA로 이루어지는 그룹 중에서 선택된다. 일부 구현예에서, 항원 결합 모이어티는 항체 또는 이의 단편이다. 일부 구현예에서, 항원 결합 모이어티는 단일 도메인 항체(sdAb)를 포함한다. 일부 구현예에서, 항원 결합 모이어티는 VHH 단일 도메인 항체를 포함한다. 일부 구현예에서, sdAb는 메소텔린에 결합한다.
일부 구현예에서, a) 알부민 결합 모이어티에 융합된 사이토카인("사이토카인-ALBBM") 및 b) 항원 결합 모이어티를 포함하는 융합 단백질을 제공하며, 여기에서 사이토카인-ALBBM과 항원 결합 모이어티간의 연결은 임의로 절단가능하고, 알부민 결합 모이어티는 사이토카인의 C-말단에 융합되며, 항원 결합 모이어티는 사이토카인-ALBBM의 N-말단에 연결된다. 일부 구현예에서, 사이토카인은 IL-21, IL-7, IL-15, IL-15Ra에 결합된 IL-15 또는 이의 단편, IL-33 및 IL-22로 이루어지는 그룹 중에서 선택된다. 일부 구현예에서, 알부민 결합 모이어티는 인간 혈청 알부민(HSA) 및/또는 키노몰구스 원숭이 혈청 알부민(CMSA)에 결합한다. 일부 구현예에서, 알부민 결합 모이어티는 알부민 결합 도메인(ABD)을 포함한다. 일부 구현예에서, 일부민 결합 도메인은 서열번호 3-11로 이루어지는 그룹 중에서 선택된 아미노산 서열 또는 서열번호 3-11 중 어느 하나에 적어도 약 80%(예를 들어 적어도 약 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 중 어느 하나)의 서열 동일성을 포함하는 이의 변이체를 포함한다. 일부 구현예에서, 알부민 결합 모이어티는 단일 도메인 항체(sdAb)를 포함한다. 일부 구현예에서, sdAb는 VhH 단일 도메인 항체이다. 일부 구현예에서, 사이토카인 및 알부민 결합 모이어티는 제1 링커를 통해 연결된다. 일부 구현예에서 제1 링커는 약 1 내지 30 아미노산의 길이를 갖는다. 일부 구현예에서, 제1 링커는 서열번호 12-26 및 158-159로 이루어지는 그룹 중에서 선택된다. 일부 구현예에서, 항원 결합 모이어티는 제2 링커를 통해 사이토카인-ALBBM에 융합된다. 일부 구현예에서, 제2 링커는 약 약 1 내지 약 30 아미노산의 길이를 갖는다. 일부 구현예에서, 제2 링커는 절단가능하다. 일부 구현예에서, 절단가능한 링커는 기질 메탈로프로테아제, 레구마인, 매트립타제, 또는 유로키나제 민감성이다. 일부 구현예에서, 제2 링커는 서열번호 12-45 및 158-159로 이루어지는 그룹 중에서 선택된다. 일부 구현예에서, 항원 결합 모이어티는 종양 항원에 결합한다. 일부 구현예에서, 종양 항원은 메소텔린(MSLN), GPA33, Her-2, EGFR 및 CD20으로 이루어지는 그룹 중에서 선택된다. 일부 구현예에서, 종양 항원은 CEA, MUC16, MUC1, AFP, EPCAM, CD19, CD21, CD22, CD30, CD33, CD37, CD45, PSMA, 및 BCMA로 이루어지는 그룹 중에서 선택된다. 일부 구현예에서, 항원 결합 모이어티는 항체 또는 이의 단편이다. 일부 구현예에서, 항원 결합 모이어티는 단일 도메인 항체(sdAb)를 포함한다. 일부 구현예에서, 항원 결합 모이어티는 VHH 단일 도메인 항체를 포함한다. 일부 구현예에서, sdAb는 메소텔린에 결합한다.
일부 구현예에서, a) 알부민 결합 모이어티에 융합된 사이토카인("사이토카인-ALBBM") 및 b) 항원 결합 모이어티를 포함하는 융합 단백질을 제공하며, 여기에서 사이토카인-ALBBM과 항원 결합 모이어티간의 연결은 임의로 절단가능하고, 알부민 결합 모이어티는 알부민 결합 도메인(ABD)이며, 항원 결합 모이어티는 종양 항원에 결합하는 단일 도메인 항체(예를 들어 종양 항원에 결합하는 VHH 항체)이다. 일부 구현예에서, 알부민 결합 모이어티는 사이토카인의 N- 또는 C-말단에 융합된다. 일부 구현예에서, 항원 결합 모이어티는 사이토카인-ALBBM의 N- 또는 C-말단에 연결된다. 일부 구현예에서, 사이토카인은 IL-21, IL-7, IL-15, IL-15Ra에 결합된 IL-15 또는 이의 단편, IL-33 및 IL-22로 이루어지는 그룹 중에서 선택된다. 일부 구현예에서, 알부민 결합 모이어티는 인간 혈청 알부민(HSA) 및/또는 키노몰구스 원숭이 혈청 알부민(CMSA)에 결합한다. 일부 구현예에서, 일부민 결합 도메인은 서열번호 3-11로 이루어지는 그룹 중에서 선택된 아미노산 서열 또는 서열번호 3-11 중 어느 하나에 적어도 약 80%(예를 들어 적어도 약 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 중 어느 하나)의 서열 동일성을 포함하는 이의 변이체를 포함한다. 일부 구현예에서, 사이토카인 및 알부민 결합 모이어티는 제1 링커를 통해 연결된다. 일부 구현예에서 제1 링커는 약 1 내지 30 아미노산의 길이를 갖는다. 일부 구현예에서, 제1 링커는 서열번호 12-26 및 158-159로 이루어지는 그룹 중에서 선택된다. 일부 구현예에서, 항원 결합 모이어티는 제2 링커를 통해 사이토카인-ALBBM에 융합된다. 일부 구현예에서, 제2 링커는 약 약 1 내지 약 30 아미노산의 길이를 갖는다. 일부 구현예에서, 제2 링커는 절단가능하다. 일부 구현예에서, 절단가능한 링커는 기질 메탈로프로테아제, 레구마인, 매트립타제, 또는 유로키나제 민감성이다. 일부 구현예에서, 제2 링커는 서열번호 12-45 및 158-159로 이루어지는 그룹 중에서 선택된다. 일부 구현예에서, 종양 항원은 메소텔린(MSLN), GPA33, Her-2, EGFR 및 CD20으로 이루어지는 그룹 중에서 선택된다. 일부 구현예에서, 종양 항원은 CEA, MUC16, MUC1, AFP, EPCAM, CD19, CD21, CD22, CD30, CD33, CD37, CD45, PSMA, 및 BCMA로 이루어지는 그룹 중에서 선택된다. 일부 구현예에서, 항원 결합 모이어티는 VHH 단일 도메인 항체를 포함한다. 일부 구현예에서, sdAb는 메소텔린에 결합한다.
일부 구현예에서, a) 알부민 결합 모이어티에 융합된 사이토카인("사이토카인-ALBBM") 및 b) 항원 결합 모이어티를 포함하는 융합 단백질을 제공하며, 여기에서 사이토카인-ALBBM과 항원 결합 모이어티간의 연결은 임의로 절단가능하고, 알부민 결합 모이어티는 단일 도메인 항체("항-알부민 dsAb", 예를 들어 항-알부민 VhH 항체)이며, 항원 결합 모이어티는 종양 항원에 결합하는 단일 도메인 항체(예를 들어 종양 항원에 결합하는 VHH 항체)이다. 일부 구현예에서, 알부민 결합 모이어티는 사이토카인의 N- 또는 C-말단에 융합된다. 일부 구현예에서, 항원 결합 모이어티는 사이토카인-ALBBM의 N- 또는 C-말단에 연결된다. 일부 구현예에서, 사이토카인은 IL-21, IL-7, IL-15, IL-15Ra에 결합된 IL-15 또는 이의 단편, IL-33 및 IL-22로 이루어지는 그룹 중에서 선택된다. 일부 구현예에서, 알부민 결합 모이어티는 인간 혈청 알부민(HSA) 및/또는 키노몰구스 원숭이 혈청 알부민(CMSA)에 결합한다. 일부 구현예에서, 항-알부민 sdAb는 VHH 단일 도메인 항체이다. 일부 구현예에서, 사이토카인 및 알부민 결합 모이어티는 제1 링커를 통해 연결된다. 일부 구현예에서 제1 링커는 약 1 내지 30 아미노산의 길이를 갖는다. 일부 구현예에서, 제1 링커는 서열번호 12-26 및 158-159로 이루어지는 그룹 중에서 선택된다. 일부 구현예에서, 항원 결합 모이어티는 제2 링커를 통해 사이토카인-ALBBM에 융합된다. 일부 구현예에서, 제2 링커는 약 약 1 내지 약 30 아미노산의 길이를 갖는다. 일부 구현예에서, 제2 링커는 절단가능하다. 일부 구현예에서, 절단가능한 링커는 기질 메탈로프로테아제, 레구마인, 매트립타제, 또는 유로키나제 민감성이다. 일부 구현예에서, 제2 링커는 서열번호 12-45 및 158-159로 이루어지는 그룹 중에서 선택된다. 일부 구현예에서, 종양 항원은 메소텔린(MSLN), GPA33, Her-2, EGFR 및 CD20으로 이루어지는 그룹 중에서 선택된다. 일부 구현예에서, 종양 항원은 CEA, MUC16, MUC1, AFP, EPCAM, CD19, CD21, CD22, CD30, CD33, CD37, CD45, PSMA, 및 BCMA로 이루어지는 그룹 중에서 선택된다. 일부 구현예에서, 항원 결합 모이어티는 VHH 단일 도메인 항체를 포함한다. 일부 구현예에서, sdAb는 메소텔린에 결합한다.
일부 구현예에서, a) 알부민 결합 모이어티에 융합된 사이토카인("사이토카인-ALBBM") 및 b) 항원 결합 모이어티를 포함하는 융합 단백질을 제공하며, 여기에서 사이토카인-ALBBM과 항원 결합 모이어티간의 연결은 임의로 절단가능하고, 알부민 결합 모이어티는 단일 도메인 항체("항-알부민 dsAb", 예를 들어 항-알부민 VhH 항체)이며, 항원 결합 모이어티는 종양 항원에 결합하는 단일 도메인 항체(예를 들어 종양 항원에 결합하는 VHH 항체)이다. 일부 구현예에서, 알부민 결합 모이어티는 사이토카인의 N- 또는 C-말단에 융합된다. 일부 구현예에서, 항원 결합 모이어티는 사이토카인-ALBBM의 N- 또는 C-말단에 연결된다. 일부 구현예에서, 사이토카인은 IL-21, IL-7, IL-15, IL-15Ra에 결합된 IL-15 또는 이의 단편, IL-33 및 IL-22로 이루어지는 그룹 중에서 선택된다. 일부 구현예에서, 알부민 결합 모이어티는 인간 혈청 알부민(HSA) 및/또는 키노몰구스 원숭이 혈청 알부민(CMSA)에 결합한다. 일부 구현예에서, 일부민 결합 도메인은 서열번호 3-11로 이루어지는 그룹 중에서 선택된 아미노산 서열 또는 서열번호 3-11 중 어느 하나에 적어도 약 80%(예를 들어 적어도 약 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 중 어느 하나)의 서열 동일성을 포함하는 이의 변이체를 포함한다. 일부 구현예에서, 알부민 결합 모이어티는 VhH 단일 도메인 항체를 포함하는 단일 도메인 항체(sdAb)를 포함한다. 일부 구현예에서, 사이토카인 및 알부민 결합 모이어티는 제1 링커를 통해 연결된다. 일부 구현예에서 제1 링커는 약 1 내지 30 아미노산의 길이를 갖는다. 일부 구현예에서, 제1 링커는 서열번호 12-26 및 158-159로 이루어지는 그룹 중에서 선택된다. 일부 구현예에서, 항원 결합 모이어티는 제2 링커를 통해 사이토카인-ALBBM에 융합된다. 일부 구현예에서, 제2 링커는 약 약 1 내지 약 30 아미노산의 길이를 갖는다. 일부 구현예에서, 제2 링커는 절단가능하다. 일부 구현예에서, 절단가능한 링커는 기질 메탈로프로테아제, 레구마인, 매트립타제, 또는 유로키나제 민감성이다. 일부 구현예에서, 제2 링커는 서열번호 12-45 및 158-159로 이루어지는 그룹 중에서 선택된다.
일부 구현예에서, a) 알부민 결합 모이어티에 융합된 사이토카인("사이토카인-ALBBM") 및 b) 항원 결합 모이어티를 포함하는 융합 단백질을 제공하며, 여기에서 사이토카인-ALBBM과 항원 결합 모이어티간의 연결은 임의로 절단가능하고, 알부민 결합 모이어티는 단일 도메인 항체("항-알부민 dsAb", 예를 들어 항-알부민 VhH 항체)이며, 항원 결합 모이어티는 종양 항원에 결합하는 단일 도메인 항체이고, 사이토카인은 IL-21이다. 일부 구현예에서, 알부민 결합 모이어티는 사이토카인의 N- 또는 C-말단에 융합된다. 일부 구현예에서, 항원 결합 모이어티는 사이토카인-ALBBM의 N- 또는 C-말단에 연결된다. 일부 구현예에서, 알부민 결합 모이어티는 인간 혈청 알부민(HSA) 및/또는 키노몰구스 원숭이 혈청 알부민(CMSA)에 결합한다. 일부 구현예에서, 일부민 결합 도메인은 서열번호 3-11로 이루어지는 그룹 중에서 선택된 아미노산 서열 또는 서열번호 3-11 중 어느 하나에 적어도 약 80%(예를 들어 적어도 약 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 중 어느 하나)의 서열 동일성을 포함하는 이의 변이체를 포함한다. 일부 구현예에서, 알부민 결합 모이어티는 VHH 단일 도메인 항체를 포함하는 단일 도메인 항체(sdAb)를 포함한다. 일부 구현예에서, 사이토카인 및 알부민 결합 모이어티는 제1 링커를 통해 연결된다. 일부 구현예에서 제1 링커는 약 1 내지 30 아미노산의 길이를 갖는다. 일부 구현예에서, 제1 링커는 서열번호 12-26 및 158-159로 이루어지는 그룹 중에서 선택된다. 일부 구현예에서, 항원 결합 모이어티는 제2 링커를 통해 사이토카인-ALBBM에 융합된다. 일부 구현예에서, 제2 링커는 약 약 1 내지 약 30 아미노산의 길이를 갖는다. 일부 구현예에서, 제2 링커는 절단가능하다. 일부 구현예에서, 절단가능한 링커는 기질 메탈로프로테아제, 레구마인, 매트립타제, 또는 유로키나제 민감성이다. 일부 구현예에서, 제2 링커는 서열번호 12-45 및 158-159로 이루어지는 그룹 중에서 선택된다. 일부 구현예에서, 종양 항원은 메소텔린(MSLN), GPA33, Her-2, EGFR 및 CD20으로 이루어지는 그룹 중에서 선택된다. 일부 구현예에서, 종양 항원은 CEA, MUC16, MUC1, AFP, EPCAM, CD19, CD21, CD22, CD30, CD33, CD37, CD45, PSMA, 및 BCMA로 이루어지는 그룹 중에서 선택된다. 일부 구현예에서, 항원 결합 모이어티는 VHH 단일 도메인 항체를 포함한다. 일부 구현예에서, sdAb는 메소텔린에 결합한다.
일부 구현예에서, a) 알부민 결합 모이어티에 융합된 사이토카인("사이토카인-ALBBM") 및 b) 항원 결합 모이어티를 포함하는 융합 단백질을 제공하며, 여기에서 사이토카인-ALBBM과 항원 결합 모이어티간의 결합은 임의로 절단가능하고, 알부민 결합 모이어티는 알부민 결합 도메인 또는 단일 도메인 항체("항-알부민 dsAb", 예를 들어 항-알부민 VhH 항체)이며, 항원 결합 모이어티는 항-메소텔린 중쇄 가변 영역(항-MSLN VH)을 포함하는 항-메소텔린 단일 도메인 항체를 포함하고, 여기에서: a) 항-MSLN VH는 서열번호 46의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1 또는 CDR1에 3, 2 또는 1개 이하의 치환을 포함하는 이의 변이체, 서열번호 47의 아미노산 서열을 포함하는 CDR2 또는 CDR2에 3, 2 또는 1개 이하의 치환을 포함하는 이의 변이체, 및 서열번호 48의 아미노산 서열을 포함하는 CDR3 또는 CDR3에 3, 2 또는 1개 이하의 치환을 포함하는 이의 변이체를 포함하거나; 또는 b) 항-MSLN VH는 서열번호 49의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1 또는 CDR1에 3, 2 또는 1개 이하의 치환을 포함하는 이의 변이체, 서열번호 50의 아미노산 서열을 포함하는 CDR2 또는 CDR2에 3, 2 또는 1개 이하의 치환을 포함하는 이의 변이체, 또는 서열번호 51의 아미노산 서열을 포함하는 CDR3 또는 CDR3에 3, 2 또는 1개 이하의 치환을 포함하는 이의 변이체를 포함한다. 일부 구현예에서, 알부민 결합 모이어티는 사이토카인의 N- 또는 C-말단에 융합된다. 일부 구현예에서, 사이토카인은 IL-21, IL-7, IL-15, IL-15Ra에 결합된 IL-15 또는 이의 단편, IL-33 및 IL-22로 이루어지는 그룹 중에서 선택된다. 일부 구현예에서, 알부민 결합 모이어티는 인간 혈청 알부민(HSA) 및/또는 키노몰구스 원숭이 혈청 알부민(CMSA)에 결합한다. 일부 구현예에서, 일부민 결합 도메인은 서열번호 3-11로 이루어지는 그룹 중에서 선택된 아미노산 서열 또는 서열번호 3-11 중 어느 하나에 적어도 약 80%(예를 들어 적어도 약 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 중 어느 하나)의 서열 동일성을 포함하는 이의 변이체를 포함한다. 일부 구현예에서, 알부민 결합 모이어티는 VHH 단일 도메인 항체를 포함하는 단일 도메인 항체(sdAb)를 포함한다. 일부 구현예에서, 사이토카인 및 알부민 결합 모이어티는 제1 링커를 통해 연결된다. 일부 구현예에서 제1 링커는 약 1 내지 30 아미노산의 길이를 갖는다. 일부 구현예에서, 제1 링커는 서열번호 12-26 및 158-159로 이루어지는 그룹 중에서 선택된다. 일부 구현예에서, 항원 결합 모이어티는 제2 링커를 통해 사이토카인-ALBBM에 융합된다. 일부 구현예에서, 제2 링커는 약 약 1 내지 약 30 아미노산의 길이를 갖는다. 일부 구현예에서, 제2 링커는 절단가능하다. 일부 구현예에서, 절단가능한 링커는 기질 메탈로프로테아제, 레구마인, 매트립타제, 또는 유로키나제 민감성이다. 일부 구현예에서, 제2 링커는 서열번호 12-45 및 158-159로 이루어지는 그룹 중에서 선택된다.
일부 구현예에서, 융합 단백질은 서열번호 120-125, 129-154, 및 160-167 중 어느 하나의 아미노산 서열 또는 서열번호 120-125, 129-154, 및 160-167 중 어느 하나에 적어도 약 80%(예를 들어 적어도 약 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 중 어느 하나)의 서열 동일성을 포함하는 이의 변이체를 포함한다.
A. 융합 단백질 성질
1 혈청 반감기
일부 구현예에서, 융합 단백질의 혈청 반감기는 개체에게 투여시 적어도 약 15일, 약 14일, 약 13일, 약 12일, 약 11일, 약 10일, 약 9일, 약 8일, 약 7일, 약 6일, 약 5일, 약 4일, 약 3일, 약 2일, 약 24시간, 약 24시간, 약 20시간, 약 18시간, 약 16시간, 약 14시간, 약 12시간, 약 10시간, 약 8시간, 약 6시간, 약 4시간, 약 3시간, 약 2시간, 또는 약 1시간이다. 융합 단백질을 다양한 경로를 통해, 예를 들어 정맥내, 경구, 피하 또는 복강내로 투여할 수 있다.
일부 구현예에서, 융합 단백질의 혈청 반감기는 참조 단백질의 경우보다 더 길다(예를 들어 적어도 약 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 또는 90% 더 길다). 일부 구현예에서, 융합 단백질의 혈청 반감기는 참조 단백질의 경우의 적어도 l배, 2배, 3배, 4배, 5배, 6배, 7배, 8배, 9배, lO배, l2배, l5배, 20배, 25배, 30배, 35배, 40배, 45배, 또는 50배이다. 일부 구현에에서, 참조 단백질은 동일한 사이토카인 및/또는 동일한 항원 결합 모이어티를 포함하지만, 알부민 결합 모이어티를 갖지 않는다. 일부 구현에에서, 동일한 사이토카인 및 동일한 항원 결합 모이어티를 융합 단백질과 동일한 순서로 및/또는 동일한 링커를 통해 융합시킨다.
2. 안정성
일부 구현예에서, 융합 단백질은 참조 단백질보다 더 높은 안정성을 갖는다. 일부 구현예에서, 참조 단백질은 동일한 사이토카인 및/또는 동일한 항원 결합 모이어티를 포함하지만 알부민 결합 모이어티를 갖지 않는다. 일부 구현에에서, 동일한 사이토카인 및 동일한 항원 결합 모이어티를 융합 단백질과 동일한 순서로 및/또는 동일한 링커를 통해 융합시킨다.
일부 구현예에서, 안정성은 열 안정성을 포함한다.
일부 구현예에서, 안정성을, 융합 단백질이 한정된 조건하에서 보관후에 허용 가능한 정도의 화학 구조 또는 생물학적 기능을 유지하는 정도에 의해 평가한다. 일부 구현예에서, 융합 단백질은, 상기가 한정된 양의 시간 동안 보관후에 이의 화학 구조 또는 생물학적 기능의 100%를 유지하지는 않는다 하더라도 높은 안정성을 갖는다. 일부 구현예에서, 한정된 양의 시간 동안 보관후에 본원에 기재된 바와 같은 융합 단백질의 구조 또는 기능의 약 90%, 약 95%, 약 96%, 약 97%, 약 98% 또는 약 99%의 유지는 높은 안정성을 갖는 것으로 간주될 수 있다.
안정성을 특히, 한정된 온도에서 한정된 양의 시간 동안 보관후에 제형(액체 또는 환원된) 중에 남아있는 고유(응집되지 않은 또는 분해되지 않은) 융합 단백질의 백분율을 측정함으로써 측정할 수 있다. 고유의 융합 단백질의 백분율을 특히, 크기 배제 크로마토그래피(예를 들어 크기 배제 고성능 액체 크로마토그래피[SE-HPLC])에 의해 측정할 수 있으며, 따라서 고유는 응집되지 않고 분해되지 않음을 의미한다. 일부 구현예에서, 융합 단백질의 고유 형태의 적어도 약 90%(예를 들어 적어도 약 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%)가 주어진 온도에서 한정된 양의 시간 동안 보관후에 제형 중에서 검출될 수 있다. 일부 구현예에서, 융합 단백질의 고유 형태의 적어도 약 90%(예를 들어 적어도 약 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%)가 실온(약 25℃)에서 적어도 약 6시간, 적어도 약 8시간, 적어도 약 10시간, 적어도 약 12시간, 적어도 약 14시간, 적어도 약 16시간, 적어도 약 18시간, 적어도 약 20시간, 적어도 약 22시간, 적어도 약 24시간, 적어도 약 26시간, 적어도 약 28시간, 적어도 약 30시간, 적어도 약 32시간, 적어도 약 34시간, 적어도 약 36시간, 적어도 약 38시간, 적어도 약 40시간, 적어도 약 42시간, 적어도 약 44시간, 적어도 약 46시간, 또는 적어도 약 48시간 동안 보관후에 제형 중에서 검출될 수 있다.
안정성을 특히, 한정된 온도에서 한정된 양의 시간 동안 보관후에 제형(액체 또는 환원된) 내에서 응집체를 형성하는 융합 단백질의 백분율을 측정함으로써 측정할 수 있다. 응집된 융합 단백질의 백분율을 특히, 크기 배제 크로마토그래피(예를 들어 크기 배제 고성능 액체 크로마토그래피[SE-HPLC])에 의해 측정할 수 있다. 일부 구현예에서, 주어진 온도에서 한정된 양의 시간 동안 보관후에 제형 중에 응집체로서 존재하는 융합 단백질의 약 10% 미만(바람직하게는 약 5% 미만)이 존재한다. 일부 구현예에서, 본원에 기재된 융합 단백질은 실질적으로 응집되지 않는다, 예를 들어 기껏해야 융합 단백질의 약 6%, 5%, 4%, 3%, 2%, 1%, 0.5%, 또는 0.1%만이 주어진 온도에서 한정된 양의 시간 동안 보관후에, 예를 들어 실온(약 25℃)에서 적어도 약 6시간, 적어도 약 8시간, 적어도 약 10시간, 적어도 약 12시간, 적어도 약 14시간, 적어도 약 16시간, 적어도 약 18시간, 적어도 약 20시간, 적어도 약 22시간, 적어도 약 24시간, 적어도 약 26시간, 적어도 약 28시간, 적어도 약 30시간, 적어도 약 32시간, 적어도 약 34시간, 적어도 약 36시간, 적어도 약 38시간, 적어도 약 40시간, 적어도 약 42시간, 적어도 약 44시간, 적어도 약 46시간, 또는 적어도 약 48시간 동안 보관후에 제형 중에서 응집체로 검출될 수 있다.
표적(들)에 대한 융합 단백질의 결합 친화성의 측정을 또한 안정성 평가에 사용할 수 있다. 예를 들어, 본원의 융합 단백질은 한정된 양의 시간(예를 들어 6시간, 12시간, 24시간, 36시간, 48시간) 동안 예를 들어 실온(약 25℃)에서 보관후에, 사이토카인 및/또는 항원-결합 도메인이 상기 보관 전의 항체의 결합 친화성의 적어도 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 또는 훨씬 더 많은 친화성을 갖는 경우 안정한 것으로서 간주될 수 있다. 결합 친화성을 임의의 방법, 예를 들어 ELISA 또는 플라스몬 공명에 의해 측정할 수 있다. 상기와 같은 세포에 대한 융합 단백질의 결합을 직접적으로, 예를 들어 FACS 분석을 통해 측정할 수 있다.
3 임상적 성질
일부 구현예에서, 본원에 기재된 융합 단백질은 참조 단백질에 비해 개선된 임상적 성질을 갖는다. 일부 구현예에서, 융합 단백질은 참조 단백질에 비해 개선된 세포독성 활성을 나타낸다. 일부 구현예에서, 융합 단백질은 참조 단백질에 비해 보다 높은 항-종양 효과(예를 들어 종양 크기 감소, 생존 개선 등)를 나타낸다. 일부 구현예에서, 참조 단백질은 동일한 사이토카인 및/또는 동일한 항원 결합 모이어티를 포함하지만, 알부민 결합 모이어티를 갖지 않는다. 일부 구현에에서, 동일한 사이토카인 및 동일한 항원 결합 모이어티를 융합 단백질과 동일한 순서로 및/또는 동일한 링커를 통해 융합시킨다.
세포독성
세포에 대한 본원에 기재된 융합 단백질의 세포독성(예를 들어 ADCC 활성)을 다수의 방식으로 시험할 수 있다. 예를 들어, 융합 단백질 및 효과기 세포(예를 들어 PBMC 세포)에 의해 인식될 수 있는 항원을 발현하는 암 세포주를 96-웰 플레이트에서 함께 혼합한다. 다양한 농도의 융합 단백질을 각 웰에 가한다. 배양후에, EC50(ADCC 활성을 나타냄)을 계산할 수 있다.
일부 구현예에서, 융합 단백질은 참조 단백질에 비해, 세포에 대해 개선된 ADCC 활성을 나타낸다. 일부 구현예에서, 세포에 특이적인 융합 단백질의 EC50은 참조 단백질보다 약 50%, 40%, 30%, 20%, 10% 이하로 적다. 일부 구현예에서, 종양 세포는 중피종, 폐암, 유방암, 난소암, 췌장암, 림프종, 백혈병, 두경부암, 간암, 식도암, 위암 및 결장직장암으로부터 유래한다. 일부 구현예에서, 참조 단백질은 동일한 사이토카인 및/또는 동일한 항원 결합 모이어티를 포함하지만, 알부민 결합 모이어티를 갖지 않는다. 일부 구현에에서, 동일한 사이토카인 및 동일한 항원 결합 모이어티를 융합 단백질과 동일한 순서로 및/또는 동일한 링커를 통해 융합시킨다.
암 치료
일부 구현예에서, 융합 단백질은 개체에서 암을 치료한다(예를 들어 종양 성장을 억제시킴으로써). 일부 구현예에서, 융합은 참조 단백질에 비해, 암에 대해 증대된 항-종양 효과를 나타내었다. 예를 들어, 일부 구현예에서, 융합 단백질의 투여는 참조 단백질에 비해 감소된 종양 크기(예를 들어 적어도 약 10%, 20%, 30%, 40% 또는 50% 적은 종양 부피)를 생성시켰다. 일부 구현예에서, 암은 중피종, 폐암, 유방암, 난소암, 췌장암, 림프종, 백혈병, 두경부암, 간암, 식도암, 위암 및 결장직장암을 포함하는 그룹 중에서 선택된다. 일부 구현예에서, 참조 단백질은 동일한 사이토카인 및/또는 동일한 항원 결합 모이어티를 포함하지만, 알부민 결합 모이어티를 갖지 않는다. 일부 구현에에서, 동일한 사이토카인 및 동일한 항원 결합 모이어티를 융합 단백질과 동일한 순서로 및/또는 동일한 링커를 통해 융합시킨다.
B. 링커
일부 구현예에서, 본원에 기재된 융합 단백질은 사이토카인과 알부민 결합 모이어티 사이에 제1 링커를 포함한다. 일부 구현예에서, 본원에 기재된 융합 단백질은 알부민 결합 모이어티에 융합된 사이토카인("사이토카인-ALBBM")과 항원 결합 모이어티 사이에 제2 링커를 포함한다.
일부 구현예에서, 제1 링커는 강성 링커이다. 일부 구현예에서, 제1 링커는 서열번호 21, 22 및 24로 이루어지는 그룹 중에서 선택된다.
일부 구현예에서, 제1 링커는 가요성 링커이다. 일부 구현예에서, 제1 링커는 서열번호 12-14로 이루어지는 그룹 중에서 선택된다.
일부 구현예에서, 제1 링커는 절단가능하지 않은 링커이다.
일부 구현예에서, 제1 링커는 약 1 내지 40(예를 들어 1 내지 35, 1 내지 30, 1 내지 25, 1 내지 20, 4 내지 20, 또는 4 내지 16) 아미노산의 길이를 갖는다.
일부 구현예에서, 제1 링커는 서열번호 12-26 및 158-159로 이루어지는 그룹 중에서 선택된다.
일부 구현예에서, 제2 링커는 강성 링커이다. 일부 구현예에서, 제2 링커는 서열번호 21, 22 및 24로 이루어지는 그룹 중에서 선택된다.
일부 구현예에서, 제2 링커는 가요성 링커이다. 일부 구현예에서, 제2 링커는 서열번호 12-14로 이루어지는 그룹 중에서 선택된다.
일부 구현예에서, 제2링커는 절단가능한 링커이다. 일부 구현예에서, 제2 링커는 기질 메탈로프로테아제, 레구마인, 매트립타제, 또는 유로키나제 민감성이다.
일부 구현예에서, 제2 링커는 서열번호 12-45 및 158-159로 이루어지는 그룹 중에서 선택된다. 일부 구현예에서, 제2 링커는 서열번호 27-45로 이루어지는 그룹 중에서 선택된다.
일부 구현예에서, 제2 링커는 약 1 내지 40(예를 들어 1 내지 35, 1 내지 30, 1 내지 25, 1 내지 20, 4 내지 20, 또는 4 내지 16, 4 내지 12, 또는 5 내지 9) 아미노산의 길이를 갖는다.
일부 구현예에서, 제1 및/또는 제2 링커는 Gly-Gly-Gly-Gly-Ser 서열을 포함하지 않는다. 일부 구현예에서, 제1 및/또는 제2 링커는 GS 링커가 아니다.
융합 단백질에 사용되는 제1 및/또는 제2 링커(들)의 길이, 가요성의 정도 및/또는 다른 성질은, 비제한적으로 이의 표적에 결합하는 하나 이상의 성분(예를 들어 사이토카인, 알부민-결합 분자, 및/또는 항원 결합 모이어티)에 대한 친화성, 특이성 또는 결합활성을 포함한 성질들에 일부 영향을 미칠 수도 있다. 예를 들어, 2개의 인접한 도메인이 서로 입체적으로 방해되지 않게 하기 위해서 보다 긴 링커를 선택할 수 있다. 일부 구현예에서, 링커(예를 들어 펩티드 링커)는, 인접한 도메인이 서로에 대해 자유롭게 움직이도록 가요성 잔기(예를 들어 글리신 및 세린)를 포함한다. 예를 들어, 글리신-세린 더블릿은 적합한 펩티드 링커일 수 있다. 일부 구현예에서, 링커는 비-펩티드 링커이다. 일부 구현예에서, 링커는 펩티드 링커이다.
다른 링커 고려사항은 생성되는 화합물의 물리적 또는 약동학적 성질, 예를 들어 용해도, 친지성, 친수성, 소수성, 안정성(약간의 안정성뿐만 아니라 계획된 분해), 강성, 가요성, 면역원성, 항체 결합의 조절, 미셀 또는 리포솜내 통합되는 능력 등에 대한 영향을 포함한다.
비-펩티드 링커
상술한 성분들의 커플링을, 2개의 성분이 모두 각각의 활성, 즉 각각 사이토카인 수용체, 알부민, 또는 표적 항원에의 결합을 유지하는 한 상기 두 분자를 결합시키는 임의의 화학 반응에 의해 수행할 수 있다. 상기 연결은 다수의 화학 기전, 예를 들어 공유 결합, 친화성 결합, 삽입, 배위 결합 및 착화를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 결합은 공유 결합이다. 공유 결합은 기존 측쇄의 직접적인 축합이나 외부 가교 분자의 통합에 의해 성취될 수 있다. 다수의 2가 또는 다가 연결제가 상기 상황에서 단백질 분자의 커플링에 유용할 수 있다. 예를 들어, 전형적인 커플링제는 유기 화합물, 예를 들어 티오에스테르, 카보디이미드, 숙신이미드 에스테르, 디이소시아네이트, 글루타르알데히드, 디아조벤젠 및 헥사메틸렌 디아민을 포함할 수 있다. 상기 목록은 당해 분야에 공지된 커플링제의 다양한 부류를 총 망라하고자 하는 것은 아니며, 오히려 보다 통상적인 커플링제의 예시이다(문헌: Killen and Lindstrom, Jour. Immun. 133: 1335-2549 (1984); Jansen et al, Immunological Reviews 62: 185-216 (1982); 및 Vitetta et al. , Science 238: 1098 (1987)을 참조하시오).
본원에 적용될 수 있는 링커는 문헌에 기재되어 있다(예를 들어 MBS(M-말레이미도벤조일-N-하이드록시숙신이미드 에스테르의 용도를 기재하는 문헌[Ramakrishnan, S. et al. , Cancer Res. 44:201-208 (1984)]을 참조하시오). 일부 구현예에서, 본원에 사용되는 비-펩티드 링커는 (i) EDC(1-에틸-3-(3-디메틸아미노-프로필)카보디이미드 하이드로클로라이드; (ii) SMPT(4-숙신이미딜옥시카보닐-알파-메틸-알파-(2-피리딜-디티오)-톨루엔(Pierce Chem. Co., Cat. (21558G)); (iii) SPDP(숙신이미딜-6 [3-(2-피리딜디티오)프로피온아미도] 헥사노에이트(Pierce Chem. Co., Cat. #2165 1G); (iv) 설포-LC-SPDP(설포숙신이미딜 6[3-(2-피리딜디티오)-프로피안아미드] 헥사노에이트(Pierce Chem. Co., Cat. #2165-G); 및 (v) EDC에 접합된 설포-NHS(N-하이드록시설포-숙신이미드; Pierce Chem. Co., Cat. #24510)를 포함한다.
상술한 링커는 상이한 특성을 갖는 성분을 함유하며, 따라서 상이한 물리-화학적 성질을 갖는 융합 단백질을 유도할 수 있다. 예를 들어, 알킬 카복실레이트의 설포-NHS 에스테르는 방향족 카복실레이트의 설포-NHS 에스테르보다 더 안정성이다. NHS-에스테르 함유 링커는 설포-NHS 에스테르보다 덜 용해성이다. 더욱이, 링커 SMPT는 입체 장애 디설파이드 결합을 함유하며 증가된 안정성으로 항체 융합 단백질을 형성할 수 있다. 디설파이드 결합은 일반적으로, 디설파이드 결합이 시험관내에서 절단되어, 입수할 수 있는 항체 융합 단백질을 덜 생성시키므로 다른 결합보다 덜 안정성이다. 설포-NHS는 특히 카보디이미드 커플링의 안정성을 증대시킬 수 있다. 카보디이미드 커플링(예를 들어 EDC)은 설포-NHS와 함께 사용될 때 카보디이미드 커플링 반응 단독보다 더 가수분해에 내성인 에스테르를 형성시킨다.
펩티드 링커
펩티드 링커는 천연 서열, 또는 비-천연 서열을 가질 수 있다. 예를 들어, 중쇄만의 항체의 힌지 영역으로부터 유래된 서열을 링커로서 사용할 수 있다. 예를 들어 WO1996/34103을 참조하시오.
펩티드 링커는 임의의 적합한 길이를 가질 수 있다. 일부 구현예에서, 펩티드 링커는 적어도 약 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 75, 100 이상 아미노산 길이 중 어느 하나이다. 일부 구현예에서, 펩티드 링커는 단지 약 100, 75, 50, 40, 35, 30, 25, 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5 이하 아미노산 길이 중 어느 하나이다. 일부 구현예에서, 펩티드 링커의 길이는 약 1 아미노산 내지 약 10 아미노산, 약 1 아미노산 내지 약 20 아미노산, 약 1 아미노산 내지 약 30 아미노산, 약 5 아미노산 내지 약 15 아미노산, 약 10 아미노산 내지 약 25 아미노산, 약 5 아미노산 내지 약 30 아미노산, 약 10 아미노산 내지 약 30 아미노산 길이, 약 30 아미노산 내지 약 50 아미노산, 약 50 아미노산 내지 약 100 아미노산, 또는 약 1 아미노산 내지 약 100 아미노산 중 어느 하나이다.
상기와 같은 펩티드 링커의 필수적인 기술적 특징은 상기 펩티드 링커가 어떠한 중합 활성도 포함하지 않는다는 것이다. 2차 구조의 촉진을 포함하지 않는 펩티드 링커의 특징은 당해 분야에 공지되어 있으며, 예를 들어 하기의 문헌들에 기재되어 있다: DalTAcqua et al. (Biochem. (1998) 37, 9266-9273), Cheadle et al. (Mol Immunol (1992) 29, 21-30) 및 Raag and Whitlow (FASEB (1995) 9(1), 73-80). "펩티드 링커"의 상황에서 특히 바람직한 아미노산은 Gly이다. 더욱 또한, 어떠한 2차 구조도 촉진하지 않는 펩티드 링커가 바람직하다. 도메인의 서로에의 연결은 예를 들어 유전 공학에 의해 제공될 수 있다. 융합되고 작동적으로 연결된 융합 단백질 성분을 제조하고 이를 포유동물 세포 또는 세균에서 발현시키는 방법은 당해 분야에 주지되어 있다(예를 들어 WO 99/54440, Ausubel, Current Protocols in Molecular Biology, Green Publishing Associates and Wiley Interscience, N. Y. 1989 and 1994 또는 Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N. Y., 2001을 참조하시오).
펩티드 링커는 프로테아제에 의해, 특히 기질 메탈로프로테이나제(MMP)에 의해 절단될 수 없는 안정한 링커일 수 있다.
링커는 또한 가요성 링커일 수 있다. 예시적인 가요성 링커는 글리신 중합체 (G)n, 글리신-세린 중합체(예를 들어 (GS)n, (GSGS)n(서열번호 19), (GGSG),,(서열번호 20), (GGGGS),,(서열번호 14), 여기에서 n은 적어도 1의 정수이다), 글리신-알라닌 중합체, 알라닌-세린 중합체, 및 당해 분야에 공지된 다른 가요성 링커를 포함한다. 글리신 및 글리신-세린 중합체는 비교적 조직화되지 않았으며, 따라서 성분들간에 중립적인 밧줄로서 작용할 수 있다. 글리신은 심지어 알라닌보다 현저하게 더 파이-파이 공간에 접근하며 보다 긴 측쇄를 갖는 잔기보다 훨씬 덜 제한된다(Scheraga, Rev. Computational Chem. 11 173-142 (1992)). 통상적인 숙련가는 항체 융합 단백질의 설계가 전적으로 또는 부분적으로 가요성인 링커를 포함할 수 있으며, 따라서 상기 링커는 가요성 링커 부분뿐만 아니라 덜 가요성인 구조를 부여하는 하나 이상의 부분을 포함하여 목적하는 항체 융합 단백질 구조를 제공할 수 있음을 알 것이다.
C. 사이토카인
본원에 기재된 융합 단백질은 사이토카인을 포함한다. 일부 구현예에서, 사이토카인은 IL-21, IL-7, IL-15, IL-15Ra에 결합된 IL-15 또는 이의 단편, IL-33 및 IL-22로 이루어지는 그룹 중에서 선택된다.
IL-21
IL-21은 광범위한 면역 및 비-면역 세포 유형에 대해 다면발현 작용을 갖는 T 세포 및 자연살해 T 세포에 의해 생성되는 I형 사이토카인이다. 상기 사이토카인은 광범위한 세포 유형, 예를 들어 비제한적으로 CD4+ 및 CD8+ T 세포, B 세포, 대식세포, 단핵세포, 및 수지상 세포(DC)에 대해 다양한 영향을 미친다. IL-21에 대한 기능성 수용체는 IL-21 수용체(IL-21R) 및 공통의 사이토카인 수용체 γ쇄(γc)(상기는 또한 IL-2, IL-4, IL-7, IL-9 및 IL-15에 대한 수용체의 서브유닛이다)로 구성된다.
NK 세포 및 CD8+ T 세포에서 세포독성 프로그램의 활성화는 암 면역요법에 핵심이며, 결과적으로 초기 연구는 IL-21이 상기 질병에 유망한 면역요법제라는 강력한 증거를 제공하였다. IL-21은 성숙화를 촉진하고, 세포독성을 증대시키며, NK 세포에 의한 IFN-y 및 퍼포린의 생성을 유도한다. 상응하게, IL-21에 의해 유도된 세포용해 활성은 B16 흑색종의 성장을 현저하게 억제한다. 더욱이, IL-21은 IL-15와 함께 항원-특이성 CD8+ T-세포수 및 이의 효과기 기능을 확대시켜, 종양 퇴화를 생성시킨다. Leonard et al. FlOOORes. 2016 Feb 26;5. pii: F1000 Faculty Rev-224.
일부 구현예에서, 사이토카인은 IL-21이다. 일부 구현예에서, IL-21은 야생형 IL-21이다. 일부 구현예에서, IL-21은 인간 IL-21로부터 유래된다. 일부 구현예에서, IL-21은 인간 야생형 IL-21이다. 일부 구현예에서, IL-21은 트렁케이트된 IL-21이다.
일부 구현예에서, IL-21은 서열번호 1, 2, 126, 171 또는 172의 아미노산 서열 또는 서열번호 1, 2, 126, 171 또는 172에 적어도 약 80%(예를 들어 적어도 약 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 중 어느 하나)의 서열 동일성을 포함하는 이의 변이체를 포함한다.
일부 구현예에서, IL-21은 트렁케이트된 IL-21이다. 일부 구현예에서, 트렁케이트된 IL-21은 서열번호 126, 171 또는 172의 아미노산 서열을 포함한다.
일부 구현예에서, IL-21 변이체는 C-말단에서 L123 및 S133을 포함하여 이들 사이에 하나 이상의 아미노산이 없다. 일부 구현예에서, IL-21 변이체는 C-말단에서 L123 및 S133을 포함하여 이들 사이에 임의의 하나의 아미노산이 없다. 일부 구현예에서, IL-21 변이체는 C-말단에서 L123 및 S133을 포함하여 이들 사이에 임의의 2개의 아미노산이 없다. 일부 구현예에서, IL-21 변이체는 C-말단에서 L123 및 S133을 포함하여 이들 사이에 임의의 3개의 아미노산이 없다. 일부 구현예에서, IL-21 변이체는 C-말단에서 L123 및 S133을 포함하여 이들 사이에 임의의 4개의 아미노산이 없다. 일부 구현예에서, IL-21 변이체는 C-말단에서 L123 및 S133을 포함하여 이들 사이에 임의의 5개의 아미노산이 없다. 일부 구현예에서, IL-21 변이체는 C-말단에서 L123 및 S133을 포함하여 이들 사이에 임의의 6개의 아미노산이 없다. 일부 구현예에서, IL-21 변이체는 C-말단에서 L123 및 S133을 포함하여 이들 사이에 임의의 7개의 아미노산이 없다. 일부 구현예에서, IL-21 변이체는 C-말단에서 L123 및 S133을 포함하여 이들 사이에 임의의 8개의 아미노산이 없다. 일부 구현예에서, IL-21 변이체는 C-말단에서 L123 및 S133을 포함하여 이들 사이에 임의의 9개의 아미노산이 없다. 일부 구현예에서, IL-21 변이체는 C-말단에서 L123 및 S133을 포함하여 이들 사이에 임의의 10개의 아미노산이 없다. 일부 구현예에서, IL-21 변이체는 C-말단에서 L123 및 S133을 포함하여 이들 사이에 11개의 아미노산이 전부 없다.
일부 구현예에서, IL-21 변이체는 서열번호 1의 C-말단에 11개의 아미노산이 없다. 일부 구현예에서, IL-21 변이체는 서열번호 1의 C-말단에 10개의 아미노산이 없다. 일부 구현예에서, IL-21 변이체는 서열번호 1의 C-말단에 9개의 아미노산이 없다. 일부 구현예에서, IL-21 변이체는 서열번호 1의 C-말단에 8개의 아미노산이 없다. 일부 구현예에서, IL-21 변이체는 서열번호 1의 C-말단에 7개의 아미노산이 없다. 일부 구현예에서, IL-21 변이체는 서열번호 1의 C-말단에 6개의 아미노산이 없다. 일부 구현예에서, IL-21 변이체는 서열번호 1의 C-말단에 5개의 아미노산이 없다. 일부 구현예에서, IL-21 변이체는 서열번호 1의 C-말단에 4개의 아미노산이 없다. 일부 구현예에서, IL-21 변이체는 서열번호 1의 C-말단에 3개의 아미노산이 없다. 일부 구현예에서, IL-21 변이체는 서열번호 1의 C-말단에 2개의 아미노산이 없다. 일부 구현예에서, IL-21 변이체는 서열번호 1의 C-말단에 1개의 아미노산이 없다.
일부 구현예에서, IL-21 변이체는 서열번호 1의 C-말단에 14, 13 또는 12개의 아미노산이 없다.
일부 구현예에서, IL-21 변이체는 서열번호 1의 C-말단에 적어도 9-10, 9-11, 10-12, 또는 12-15개의 연속적인 아미노산이 없다. 일부 구현예에서, IL-21 변이체는 서열번호 1의 C-말단에 적어도 9-14, 10-14, 11-14 또는 12-14개의 연속적인 아미노산이 없다.
일부 구현예에서, 본원에 제공된 IL-21 변이체는 서열번호 2의 아미노산 서열을 가지며, 상기는 C-말단에 10개의 아미노산이 없고 서열번호 1의 Q1 내지 L123의 서열을 나타낸다.
IL-7
IL-7은 IL-2 상과의 구성원 중 하나이다. IL-2 상과는 IL-2, IL-4, IL-7, IL-9, IL-15 및 IL-21을 포함한다. 상기는 공통의 γ쇄 서브유닛을 갖는 수용체에 결합한다. 공통의 γ쇄 서브유닛 외에, IL-7에 대한 수용체(IL-7R)는 결합이 발생하기 위해 쇄 IL-7R을 요한다. 문헌[Lin et al., Anticancer Res. 2017 Mar;37(3):963-967]을 참조하시오.
인터류킨-7(IL-7)은 마우스 및 인간에서 T 세포 발생에 요구되며 활성화된 림프구보다는 기질 조직에 의해 생성된다. 정상적인 조건하에서, IL-7은 T 세포에 대한 제한성 자원이나, 림프구감소 조건 중에 축적된다. IL-7 수용체 α-쇄(IL-7Ra) 및 공통의 사이토카인 수용체 γ-쇄(yc)로 이루어지는 이종이량체성 수용체를 통해 신호를 전달한다. IL-7은 또한 최근에 림프양 조직 유도인자(LTi) 세포를 조절함이 입증되었으며, 상기 세포는 2차 림프양 기관의 발생을 유도하고 출생후 만성 염증의 상황에서 3차 림프양 조직을 유도할 수 있다. 동물에서, IL-7 요법은 암에 대한 입양 면역요법의 유효성을 증대시키고, 백신 반응을 증대시키며, 급성 및 만성 감염의 상황에서 바이러스 제거를 증대시킨다. 문헌[Mackall et al ., Nature Reviews Immunology volume 11, pages 330-342 (2011)]을 참조하시오.
일부 구현예에서, 사이토카인은 IL-7이다. 일부 구현예에서, IL-7은 야생형 IL-7이다. 일부 구현예에서, IL-7은 인간 IL-7로부터 유래된다. 일부 구현예에서, IL-7은 인간 야생형 IL-21이다.
일부 구현예에서, IL-7은 서열번호 96-98 중 어느 하나의 아미노산 서열 또는 서열번호 96-98 중 어느 하나에 적어도 약 80%(예를 들어 적어도 약 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 중 어느 하나)의 서열 동일성을 포함하는 이의 변이체를 포함한다.
IL-15, IL-15Ra, 및 IL-15Ra에 결합된 IL-15
IL-15의 이종삼량체성 수용체는 IL-2 수용체와 IL-2R/IL-15Rβ(CD122) 및 공통 감마(yc) 쇄(CD132)를 공유한다. IL-15 및 IL-2는 T 세포 증식의 자극, 세포독성 T 림프구의 생성, B 세포에 의한 면역글로불린 합성의 자극 및 NK 세포의 생성 및 지속을 포함하는 몇몇 기능을 공유한다. 그러나, 다수의 적응 면역 반응에서, IL-2 및 IL-15는 또한 별개이면서 종종 경쟁적인 역할을 갖는다. IL-2와 달리, IL-15는 항종양 면역 반응을 약화시킬 수 있는 T 조절세포(Treg)의 유지에 필요하지 않다. IL-2는 IL-15와 대조적으로 CD8+ 효과기 T 세포의 활성화-유도된 세포사(AICD)를 통해 T 세포 반응을 억제한다. 그러나, IL-15는 NK, 효과기 CD8+ 및 기억 표현형 CD8+ T 세포의 분화에 요구된다. 또한, 전-임상 연구를 근거로, 이들의 독성은 상이한 것으로 보이며, IL-2와 대조적으로 IL-15에서 혈관 모세관 누출은 거의 관찰되지 않는다. 요약하면, IL-15는 주로 CD8 T 세포 및 NK 세포의 증식 및 세포독성 기능을 자극하여, 증대된 항-종양 반응을 유도한다. 그러나, IL-15의 효능은 초기에는 항암요법으로서 유망한 것으로 보였지만, 이의 짧은 생체내 반감기에 의해 제한되었다. Steel et al., Trends Pharmacol Sci. 2012 Jan; 33(1): 35-41. See Robinson et al, Immunol Lett. 2017 Oct; 190: 159-168.
일부의 경우에, 치료제로서 IL-15의 효능은, IL-15의 생물학적 활성을 안정화시키고 증가시키는데 일체화되어 담당하는 IL-15Ra의 입수성에 의해 제한된다. 결합되지 않은 IL-15는 생체내에서 자연적으로 발견되지 않기 때문에, IL-15Ra에 결합된 IL-15가 IL-15의 생리학적 형태를 닮아 유리 IL-15보다 IL-15Rβ/γC에 대해 더 높은 친화성을 갖는다. 문헌[Robinson et al, Immunol Lett. 2017 Oct; 190: 159-168]을 참조하시오.
일부 구현예에서, 사이토카인은 IL-15이거나 이를 포함한다. 일부 구현예에서, IL-15는 야생형 IL-15이다. 일부 구현예에서, IL-15는 인간 IL-15로부터 유래된다. 일부 구현예에서, IL-15는 인간 야생형 IL-15이다.
일부 구현예에서, 사이토카인은 IL-15Ra이거나 이를 포함한다. 일부 구현예에서, IL-15a는 야생형 IL-15a이다. 일부 구현예에서, IL-15a는 인간 IL-15a로부터 유래된다. 일부 구현예에서, IL-15a는 인간 야생형 IL-15Ra이다. 일부 구현예에서, IL-15Ra는 용해성 IL-15 수용체의 스시 도메인(즉 IL-15R 스시 도메인)이다. 일부 구현예에서, IL-15R 스시 도메인은 서열번호 127-128 중 어느 하나의 아미노산 서열 또는 서열번호 127-128 중 어느 하나에 적어도 약 80%(예를 들어 적어도 약 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 중 어느 하나)의 서열 동일성을 포함하는 이의 변이체를 포함하거나 이들로 이루어진다.
일부 구현예에서, 사이토카인은 IL-15Ra에 결합된 IL-15 또는 이의 단편이다. 일부 구현예에서, IL-15Ra에 결합된 IL-15 또는 이의 단편은 야생형 IL-15 및/또는 야생형 IL-15a이다. 일부 구현예에서, IL-15Ra에 결합된 IL-15 또는 이의 단편은 인간 IL-15로부터 유래된 IL-15 및/또는 인간 IL-15Ra로부터 유래된 인간 IL-15Ra이다. 일부 구현예에서, IL-15Ra에 결합된 IL-15 또는 이의 단편은 인간 야생형 IL-15 및/또는 인간 야생형 IL-15Ra이다. 일부 구현예에서, IL-15Ra에 결합된 IL-15 또는 이의 단편은 마우스 IL-15로부터 유래된 IL-15 및/또는 마우스 IL-15Ra로부터 유래된 IL-15Ra를 포함한다. 일부 구현예에서, IL-15Ra에 결합된 IL-15 또는 이의 단편은 마우스 야생형 IL-15 및/또는 마우스 야생형 IL-15Ra를 포함한다. 일부 구현예에서, IL-15Ra에 결합된 IL-15 또는 이의 단편은 용해성 IL-15 수용체의 스시 도메인(즉 IL-15R 스시 도메인)이다. 일부 구현예에서, IL-15R 스시 도메인은 서열번호 127-128 중 어느 하나의 아미노산 서열 또는 서열번호 127-128 중 어느 하나에 적어도 약 80%(예를 들어 적어도 약 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 중 어느 하나)의 서열 동일성을 포함하는 이의 변이체를 포함하거나 이들로 이루어진다.
일부 구현예에서, IL-15는 IL-15Ra에 비-공유 결합된다. 일부 구현예에서, IL-15는 IL-15Ra에 융합된다. 일부 구현예에서, IL-15는 IL-15Ra의 N-말단에 융합된다. 일부 구현예에서, IL-15는 IL-15Ra의 C-말단에 융합된다. 일부 구현예에서, 융합 단백질은 N-말단에서부터 C-말단으로 (1) 알부민 결합 모이어티, IL-15, IL-15Ra; (2) 알부민 결합 모이어티, IL-15Ra, IL-15; (3) IL-15, IL-15Ra, 알부민 결합 모이어티; (4) IL-15Ra, IL-15, 알부민 결합 모이어티으로 이루어지는 그룹 중에서 선택된 순서로 상기 IL-15, IL-15Ra 및 알부민 결합 모이어티를 포함한다. 일부 구현예에서, IL-15 및 IL-15Ra는 제2 링커를 통해 융합된다. 일부 구현예에서, 제2 링커는 절단가능한 링커이다. 일부 구현예에서, 제2 링커는 서열번호 27-45로 이루어지는 그룹 중에서 선택된다. 일부 구현예에서, 제2 링커는 서열번호 27의 서열을 갖는다. 일부 구현예에서, 제2 링커는 절단가능하지 않은 링커이다. 일부 구현예에서, 제2 링커는 서열번호 12-26 및 158-159로 이루어지는 그룹 중에서 선택된다.
일부 구현예에서, IL-15 또는 IL-15Ra에 결합된 IL-15는 서열번호 99, 100 또는 127 중 어느 하나의 아미노산 서열 또는 서열번호 99, 100 또는 127 중 어느 하나에 적어도 약 80%(예를 들어 적어도 약 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 중 어느 하나)의 서열 동일성을 포함하는 이의 변이체를 포함하는 인간 IL-15를 포함한다.
일부 구현예에서, IL-15 또는 IL-15Ra에 결합된 IL-15는 N72D 돌연변이를 포함하는 인간 IL-15를 포함한다. 문헌[Han el al ., Cytokine. 2011 Dec; 56(3): 804-810]를 참조하시오.
일부 구현예에서, IL-15 또는 IL-15Ra에 결합된 IL-15는 서열번호 101-108 중 어느 하나(예를 들어 서열번호 103-104)의 아미노산 서열 또는 서열번호 101-108 중 어느 하나(예를 들어 서열번호 103-104)에 적어도 약 80%(예를 들어 적어도 약 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 중 어느 하나)의 서열 동일성을 포함하는 이의 변이체를 포함하는 인간 IL-15Ra를 포함한다.
IL-33
인터류킨-33(IL-33)은 IL-1 패밀리의 구성원이다. 상기는 처음에 T 헬퍼 2(TH2) 세포 및 비만세포를 활성화시키는 2형 면역반응의 유도인자로서 기재되었다. 현재, IL-33은 또한 그룹 2 선천적 림프구 세포(ILC2), 조절성 T(Treg) 세포, THI 세포, CD8+ T 세포 및 자연살해(NK) 세포를 효능있게 자극한다는 증거가 쌓이고 있다. 이러한 다면발현 성질은 중추신경계의 조직 및 대사 항상성, 감염, 염증, 암 및 질병에서 IL-33의 역할에 반영된다.
IL-33은 간질 및 장벽 조직에서 넓은 발현을 가지며, 이는 상기를 1형, 2형 및 조절성 면역반응을 형성하는 편재되고 중요한 면역 조절제로 만든다. IL-33은 분비 서열이 없고 핵에 격리되어 있지만, 다양한 프로테아제에 의해 매우 활성인 형태로 방출되고 가공된다. IL-33은, 병원체 제거를 조절할뿐만 아니라 그룹 2 선천적 림프양 세포 및 조절성 T 세포에 의해 매개되는 조직 보수를 지지하는 사이토카인 네트워크에 기여한다. IL-33의 역할은 계속해서 확대되어, 보호 및 병적인 면역반응을 모두 조절할 것으로 예상된다. IL-33의 전달 또는 차단은 면역 항상성의 유지 및 감염성 및 염증성 질병에 대한 보호에 유망한 치료 전략으로서 대두되고 있다. 문헌[Liew, Nature Reviews Immunology volume 16, pages 676-689 (2016)]을 참조하시오.
일부 구현예에서, 사이토카인은 IL-33이다. 일부 구현예에서, IL-33은 야생형 IL-33이다. 일부 구현예에서, IL-33은 인간 IL-33으로부터 유래된다. 일부 구현예에서, IL-33은 인간 야생형 IL-33이다.
일부 구현예에서, IL-33은 서열번호 109 및 155-157 중 어느 하나의 아미노산 서열 또는 서열번호 109 및 155-157 중 어느 하나에 적어도 약 80%(예를 들어 적어도 약 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 중 어느 하나)의 서열 동일성을 포함하는 이의 변이체를 포함한다.
일부 구현예에서, IL-33은 C208S, C227S, C232S 및 C259S 중에서 선택된 하나 이상의 돌연변이를 포함한다. 문헌[Cohen et al ., Nature Communications volume 6, Article number: 8327 (2015)]을 참조하시오.
IL-22
인터류킨-22(IL-22)는 최근에 T-헬퍼(Th)-17 세포, γδ T 세포, NKT 세포 및 새로 기재된 선천적 림프양 세포(ILC)에 의해 생성되는 것으로 기재된 IL-10 패밀리 사이토카인이다. 인간 IL22 유전자는 IFN-γ 및 IL-26을 암호화하는 유전자 부근의 염색체 12ql 5에 위치한다. 사이토카인의 활성의 분비된 형태는 146 아미노산 단백질이다.
IL-22 수용체(IL-22R)는 2형 사이토카인 수용체이며 IL-10, IL-19, IL-20, IL-24, IL-26, IL-28 및 IL-29에 대한 수용체와 함께 IL-10 수용체 패밀리의 구성원이다. 상기는 2개의 이종이량체성 서브유닛, IL-22R1 및 IL-10R2로 구성된다. 연구는 IL-22의 IL-22RI 서브유닛에의 초기 결합이 IL-10R2 서브유닛의 2차 결합을 가능하게 하여, 하류 신호전달을 가능하게 함을 제시한다.
IL-22는 다양한 기능, 가장 현저하게는 비-조혈성 세포, 특히 상피세포에 대해 영양 효과를 갖는다. IL-22는 상피 재생, 및 상황 및/또는 사이토카인 환경에 따라 다수 기관의 병리에 관련된다. 다양한 질병에서 이의 관련성은 상기를 임상 개발에 매력적인 표적이 되게 한다. 문헌[Dudakov et al., Annu Rev Immunol. 2015 Mar 2l; 33: 747-785]를 참조하시오.
일부 구현예에서, 사이토카인은 IL-22이다. 일부 구현예에서, IL-22는 야생형 IL-22이다. 일부 구현예에서, IL-22는 인간 IL-22로부터 유래된다. 일부 구현예에서, IL-22는 인간 야생형 IL-22이다.
일부 구현예에서, IL-22는 서열번호 110-111 중 어느 하나의 아미노산 서열 또는 서열번호 110-111 중 어느 하나에 적어도 약 80%(예를 들어 적어도 약 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 중 어느 하나)의 서열 동일성을 포함하는 이의 변이체를 포함한다.
사이토카인 변이체
일부 구현예에서, 사이토카인 변이체는 본원에 제공된 융합 단백질 중에 있을 수 있다. 변화는 인간 야생형 사이토카인 단백질에 비해 아미노산 서열의 변화를 생성시키는 사이토카인 폴리펩티드를 암호화하는 하나 이상의 코돈의 치환, 결실 또는 삽입일 수 있다. 아미노산 치환은 유사한 구조 및/또는 화학적 성질을 갖는 또 다른 아미노산에 의한 하나의 아미노산의 교체, 예를 들어 세린에 의한 류신의 교체, 예를 들어 보존적 아미노산 교체의 결과일 수 있다. 당해 분야의 숙련가에게 공지된 표준 기법, 예를 들어 아미노산 치환을 생성시키는 부위-지향된 돌연변이유발 및 PCR-매개된 돌연변이유발을 사용하여 본원에 제공된 분자를 암호화하는 뉴클레오티드 서열에 돌연변이를 도입시킬 수 있다. 삽입 또는 결실은 임의로 약 1 내지 10 아미노산의 범위일 수 있다. 몇몇 구현예에서, 치환, 결실 또는 삽입은 원래 분자에 비해 25 아미노산 미만 치환, 20 아미노산 미만 치환, 15 아미노산 미만 치환, 10 아미노산 미만 치환, 5 아미노산 미만 치환, 4 아미노산 미만 치환, 3 아미노산 미만 치환, 또는 2 아미노산 미만 치환을 포함한다. 일부 구현예에서, 치환은 하나 이상의 예측된 불필수 아미노산 잔기에서 수행된 보존적 아미노산 치환이다. 허용되는 변화를, 서열 중 아미노산의 삽입, 결실 또는 치환을 체계적으로 수행하고 완전길이 또는 성숙한 고유 서열에 의해 나타난 활성에 대해 상기 생성된 변이체를 시험함으로써 밝힐 수 있다.
아미노산 서열 삽입은 하나의 잔기 또는 다수 잔기의 길이 범위의 아미노- 및/또는 카복실-말단 융합뿐만 아니라 단일 또는 다수 아미노산 잔기의 서열내 삽입을 포함한다.
"보존적 아미노산 치환"은 아미노산 잔기가 유사한 전하를 갖는 측쇄를 갖는 아미노산 잔기로 교체된 것이다. 유사한 전하를 갖는 측쇄를 갖는 아미노산 잔기의 패밀리는 당해 분야에 정의되어 있다. 이들 패밀리는 염기성 측쇄(예를 들어 리신, 아르기닌, 히스티딘), 산성 측쇄(예를 들어 아스파트산, 글루탐산), 하전되지 않은 극성 측쇄(예를 들어 글리신, 아스파라진, 글루타민, 세린, 쓰레오닌, 티로신, 시스테인), 비극성 측쇄(예를 들어 알라닌, 발린, 류신, 이소류신, 프롤린, 페닐알라닌, 메티오닌, 트립토판), 베타-분지된 측쇄(예를 들어 쓰레오닌, 발린, 이소류신) 및 방향족 측쇄(예를 들어 티로신, 페닐알라닌, 트립토판, 히스티딘)를 갖는 아미노산을 포함한다. 한편으로, 돌연변이를, 예를 들어 포화 돌연변이유발에 의해 암호화 서열의 일부 또는 전부를 따라 무작위로 도입시킬 수 있으며 생성된 돌연변이체를, 활성을 유지하는 돌연변이체 식별을 위해 생물학적 활성(예를 들어 사이토카인 수용체에의 결합)에 대해 선별할 수 있다. 돌연변이유발에 이어서, 암호화된 단백질을 발현시키고 단백질의 활성을 측정할 수 있다.
보존적(예를 들어 유사한 성질 및/또는 측쇄를 갖는 아미노산 그룹내에서) 치환은, 사이토카인의 성질을 유지하거나 또는 그다지 변화시키지 않도록 이루어질 수 있다. 아미노산을 측쇄 성질의 유사성에 따라 분류할 수 있다(예를 들어 문헌[Lehninger, Biochemistry 73-75 (2d ed. 1975)]을 참조하시오): (1) 비-극성: Ala (A), Val (V), Leu (L), He (I), Pro (P), Phe (F), Trp (W), Met (M); (2) 하전되지 않은 극성: Gly (G), Ser (S), Thr (T), Cys (C), Tyr (Y), Asn (N), Gln (Q); (3) 산성: Asp (D), Glu (E); 및 (4) 염기성: Lys (K), Arg (R), His(H).
한편으로, 천연 잔기를 공통의 측쇄 성질을 기준으로 그룹으로 분류할 수 있다: (1) 소수성: 노르류신, Met, Ala, Val, Leu, Ile; (2) 중성 친수성: Cys, Ser, Thr, Asn, Gln; (3) 산성: Asp, Glu; (4) 염기성: His, Lys, Arg; (5) 쇄 배향에 영향을 미치는 잔기: Gly, Pro; 및 (6) 방향족: Trp, Tyr, Phe.
변화를 당해 분야에 공지된 방법, 예를 들어 올리고뉴클레오티드-매개된(부위-지향된) 돌연변이유발, 알라닌 스캐닝, 및 PCR 돌연변이유발을 사용하여 수행할 수 있다. 부위-지향된 돌연변이유발(예를 들어 문헌[Carter, 1986, Biochem J. 237: 1-7]; 및 문헌[Zoller et al, 1982, Nucl. Acids Res. 10:6487-500]을 참조하시오), 카세트 돌연변이유발(예를 들어 Wells et al, 1985, Gene 34:315-23을 참조하시오), 또는 다른 공지된 기법을 클로닝된 DNA상에서 수행하여 폴리펩티드를 생성시킬 수 있다.
D. 알부민 결합 모이어티
본원에 기재된 융합 단백질은 알부민-결합 분자를 포함한다. 알부민-결합 분자 및 상기를 관심 단백질에 연결시키는 방법이 예를 들어 WO 1991/01743, WO 2001/45746, WO 2002/076489, WO 2004/041865, 또는 US20070269422A1에 기재되어 있으며, 이들의 내용은 본원에 참고로 인용된다.
알부민-결합 분자는 예를 들어 WO1991/01743, WO2001/45746, W02002/076489, W02004/041865, US20070269422A1; US20160152686A1; Dennis et al. (2002), JBC 277(38): 35035-35043에 기재된 알부민-결합 분자 중 어느 하나일 수 있다.
일부 구현예에서, 일부민-결합 분자는 인간 혈청 알부민(HSA), 키노몰구스 원숭이 혈청 알부민(CMSA), 및/또는 마우스 혈청 알부민(MSA)에 결합한다.
일부 구현예에서, 알부민 결합 모이어티는 알부민(예를 들어 HAS)에 약 1-1000 nM(예를 들어 약 l-900 nM, l-800 nM, 1-700 nM, 1-600 ηM, 1-500 ηM, 1-400 ηM, 1-300 ηM, 1-200 ηM, 1-1OO ηM, 1-50 ηM, l-25 nM, O.l-l nM)의 KD로 결합한다. 일부 구현예에서, 알부민-결합 단백질은 스트렙토코커스 단백질 G(SPG)의 알부민-결합 도메인(ABD)을 포함한다. 예를 들어 문헌[Nygren et al. J. Mol. Recogn. (1988) 1(2): 69-74]를 참조하시오.
1 알부민 결합 도메인(ABD)
일부 구현예에서, 알부민 결합 모이어티는 알부민 결합 도메인(ABD)을 포함한다. 일부 구현예에서, 알부민 결합 분자는 SPG 균주 G148의 ABD를 포함한다. 일부 구현예에서, 알부민 결합 분자는 SPG 균주 G148의 C-말단 알부민-결합 도메인 3(ABD3)를 포함한다. 예를 들어 문헌[Nilvebrant and Hober (2013), Comput. Struct. Biotechol. J., 6: e20l303009]를 참조하시오.
일부 특정한 구현예에서, ABD는 LAEAK VLANRELDK YGVSDYYKNLINNAKT VEGVK ALIDEIL AALP(서열번호 3)의 아미노산 서열을 가지며, 상기는 약 1.2 nM의 HSA에 대한 KD를 갖는다.
일부 구현예에서, 서열번호 3의 ABD보다 HSA에 대해 비교적 더 낮은 친화성을 갖는 ABD가 바람직하다. 따라서, HSA에 대해 더 낮은 친화성을 갖는 서열번호 3의 변이체가 본 개시내용에 포함된다.
일부 특정한 구현예에서, ABD는 서열번호 4-11 중 어느 하나의 아미노산 서열을 갖는다.
변화는 아미노산 서열의 변화를 생성시키는 서열번호 3-11 중 어느 하나의 ABD 폴리펩티드를 암호화하는 하나 이상의 코돈의 치환, 결실 또는 삽입일 수 있다. 아미노산 치환은 유사한 또는 상이한 구조 및/또는 화학적 성질을 갖는 또 다른 아미노산에 의한 하나의 아미노산의 교체의 결과일 수 있다. 당해 분야의 숙련가에게 공지된 표준 기법, 예를 들어 아미노산 치환을 생성시키는 부위-지향된 돌연변이유발 및 PCR-매개된 돌연변이유발을 사용하여, 본원에 제공된 분자를 암호화하는 뉴클레오티드 서열에 돌연변이를 도입시킬 수 있다.
허용되는 변화를, 서열 중 아미노산의 삽입, 결실 또는 치환을 체계적으로 수행하고 생성된 변이체를 활성에 대해 시험함으로써 밝힐 수 있으며, 일부 구현예에서, HSA에 대해 보다 낮은 친화성을 갖는 변이체를 선택한다. 몇몇 상기와 같은 종류의 변이체를 표 3에 예시한다.
2 항-알부민 항체 또는 이의 단편
본 발명에 따라, 일부민 결합 모이어티는 또한 항-알부민 항체 또는 이의 항원 결합 단편일 수 있다. 일부 구현예에서, 항-알부민 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 항-HSA 항체 또는 이의 항원 결합 단편이다.
HSA의 몇 개의 동형을 하기 표 2에 나열한다(예를 들어 UniProtKB - P02768 (ALBU_HUMAN)을 참조하시오). 일부 구현예에서, 항-알부민 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 서열번호 52-55 중 어느 하나에 결합한다.
[표 2]
Figure pct00002
Figure pct00003
항-알부민 항체 또는 이의 단편은 조류 및 포유동물(예를 들어 인간, 쥐, 당나귀, 양, 토끼, 염소, 기니피그, 낙타, 말 또는 닭)을 포함한 임의의 동물 기원으로부터 유래될 수 있다. 몇몇 구현예에서, 항체는 인간 또는 인간화된 단클론 항체이다. 본원에 사용되는 바와 같이, "인간" 항체는 인간 면역글로불린의 아미노산 서열을 갖는 항체를 포함하며, 인간 면역글로불린 라이브러리로부터 또는 인간 유전자로부터 항체를 발현하는 마우스로부터 단리된 항체를 포함한다.
몇몇 구현예에서, 항-알부민 항체는 완전 인간 항체, 예를 들어 암 항원에 면역특이적으로 결합하는 완전 인간 항체이다. 상기와 같은 완전 인간 항체는 원치않는 또는 불필요한 부작용, 예를 들어 피실험자에게 투여시 완전하지 못한 인간 항체에 대한 면역 반응의 발생을 최소화하는데 완전 마우스(또는 다른 완전 또는 부분 비-인간 종 항체), 인간화된 항체, 또는 키메라 항체보다 유리할 것이다.
본원에 제공된 항-알부민 항체는 단일특이성, 이중특이성, 삼중특이성이거나 또는 보다 큰 다중특이성일 수 있다. 다중특이성 항체는 폴리펩티드의 상이한 에피토프에 특이성이거나 또는 폴리펩티드뿐만 아니라 이종 에피토프, 예를 들어 이종 폴리펩티드 또는 고체 지지체 물질에 대해 특이성일 수 있다. 일부 구현예에서, 본원에 제공된 항체는 폴리펩티드의 주어진 에피토프에 대해 단일특이성이며 다른 에피토프에 면역특이적으로 결합하지 않는다.
본원에 제공된 항-알부민 항체는 단클론 항체이거나 또는 단클론 항체로부터 유래될 수 있다. 항-알부민 항체는 비제한적으로 합성 항체, 단클론 항체, 재조합적으로 생성된 항체, 다중특이성 항체(이중특이성 항체 포함), 인간 항체, 인간화된 항체, 키메라 항체, 인트라바디, 단쇄 Fv(scFv)(예를 들어 단일특이성, 이중특이성 등 포함), 카멜화된 항체 또는 이의 인간화된 버전, Fab 단편, F(ab') 단편, 디설파이드-연결된 Fv(sdFv), 항-이디오타입(항-id) 항체, 및 상기 중 어느 하나의 에피토프-결합 단편일 수 있다.
특히, 본원에 제공된 항-알부민 항체는 면역글로불린 분자 및 면역글로불린 분자의 면역학적으로 활성인 부분, 즉 알부민(예를 들어 HSA)에 면역특이적으로 결합하는 항원 결합 부위를 함유하는 분자의 면역학적으로 활성인 부분을 포함한다. 본원에 제공된 면역글로불린 분자는 면역글로불린 분자의 임의의 유형(예를 들어 IgG, IgE, IgM, IgD, IgA 및 IgY), 부류(예를 들어 IgGl, IgG2, IgG3, IgG4, IgAl 및 IgA2) 또는 하위부류일 수 있다. 일부 구현예에서, 항-알부민 항체는 IgG 항체, 예를 들어 IgG1 항체이다.
알부민의 에피토프에 특이적으로 결합하는 능력을 유지하는 항체 단편을 포함하는 항-알부민 항체의 변이체 및 유도체가 또한 본 개시내용에 포함된다. 예시적인 단편은 Fab 단편(항원-결합 도메인을 함유하고 디설파이드 결합에 의해 가교된 경쇄 및 중쇄의 일부를 포함하는 항체 단편); Fab'(힌지 영역을 통해 중쇄의 추가적인 부분 및 Fab를 포함하는 단일 항-결합 도메인을 함유하는 항체 단편); F(ab')2(중쇄의 힌지 영역 중의 쇄간 디설파이드 결합에 의해 결합된 2개의 Fab' 분자; 상기 Fab' 분자는 동일하거나 상이한 에피토프에 대한 것일 수 있다); 이중특이성 Fab(2개의 항원 결합 도메인을 갖는 Fab 분자, 이들은 각각 상이한 에피토프에 대한 것일 수 있다); 가변 영역을 포함하는 단쇄 Fab 쇄(또한 sFv로서 공지됨)(10-25 아미노산의 쇄에 의해 함께 연결된 항체의 단일 경쇄 및 중쇄의 가변적인, 항원-결합 결정 영역); 디설파이드-연결된 Fv, 또는 dsFv(디설파이드 결합에 의해 함께 연결된 항체의 단일 경쇄 및 중쇄의 가변적인, 항원-결합 결정 영역); 카멜화된 VH(VH 계면의 일부 아미노산이 천연 카멜 항체의 중쇄에서 발견되는 것인 항체의 단일 중쇄의 가변적인, 항원-결합 결정 영역); 이중특이성 sFv(2개의 항원 결합 도메인을 갖는 sFv 또는 dsFv 분자, 이들은 각각 상이한 에피토프에 대한 것일 수 있다); 디아바디(제1 sFv의 VH 도메인이 제2 sFv의 VL 도메인과 조립하고 제1 sFv의 VL 도메인이 제2 sFv의 VH 도메인과 조립할 때 형성되는 이량체화된 sFv; 상기 디아바디의 2개의 항원-결합 영역은 동일하거나 상이한 에피토프에 대한 것일 수 있다); 및 트리아바디(디아바디와 유사한 방식으로 형성되는 삼량체화된 sFv, 그러나, 3개의 항원-결합 도메인이 단일 복합체 중에서 생성되며; 3개의 항원 결합 도메인은 동일하거나 상이한 에피토프에 대한 것일 수 있다)를 포함한다. 항체의 유도체는 또한 항체 결합 부위의 하나 이상의 CDR 서열을 포함한다. CDR 서열은 2개 이상의 CDR 서열이 존재할 때 스캐폴드상에 함께 연결될 수 있다. 몇몇 구현예에서, 본원에 제공된 항-HSA 항체는 단쇄 Fv("scFv")를 포함한다. scFv는 항체의 VH 및 VL 도메인을 포함하는 항체 단편이며, 여기에서 이들 도메인은 단일 폴리펩티드 쇄 중에 존재한다. 일반적으로 scFv 폴리펩티드는, scFv가 항원 결합을 위해 목적하는 구조를 형성할 수 있게 하는, VH 및 VL 도메인 사이에 폴리펩티드 링커를 추가로 포함한다. scFv의 리뷰를 위해서, 문헌[Pluckthun in The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol. 113, Rosenburg and Moore eds. Springer-Verlag, New York, pp. 269-315 (1994)]를 참조하시오.
몇몇 상황에서 전항체보다는 항-알부민 항체 단편을 사용하는 것이 유리하다. 보다 작은 크기의 단편은 빠른 제거를 허용하며, 세포, 조직 또는 기관에의 개선된 접근을 도출할 수 있다. 몇몇 항체 단편의 리뷰에 대해서, 문헌[Hudson et al., 2003, Nature Med. 9: 129-34]를 참조하시오.
다양한 기법이 항체 단편의 생성을 위해 개발되었다. 전통적으로, 이들 단편은 온전한 항체의 단백질분해적 절단을 통해 유래되었다(예를 들어 문헌: Morimoto et al., 1992, J. Biochem. Biophys. Methods 24: 107-17; 및 Brennan et al., 1985, Science 229:81-83을 참조하시오). 그러나, 이들 단편을 현재 재조합 숙주 세포에 의해 직접 생성시킬 수 있다. Fab, Fv 및 scFv 항체 단편은 모두 이 콜라이 또는 효모 세포에서 발현되고 이로부터 분비되어, 이들 단편의 용이한 대량 생산이 허용된다. 항체 단편을 상기 논의된 항체 파지 라이브러리로부터 단리할 수 있다. 한편으로, Fab'-SH 단편을 이 콜라이로부터 직접 회수하고 화학적으로 결합시켜 F(ab')2 단편을 형성시킬 수 있다(Carter et al., 1992, Bio/Technology 10: 163-67). 또 다른 접근법에 따라, F(ab')2 단편을 재조합 숙주 세포 배양물로부터 직접 단리할 수 있다. 구조 수용체 결합 에피토프 잔기를 포함하는 증가된 생체내 반감기를 갖는 Fab 및 F(ab')2 단편이 예를 들어 미국특허 제 5,869,046 호에 기재되어 있다. 항체 단편의 생성을 위한 다른 기법은 숙련가에게 자명할 것이다. 몇몇 구현예에서, 항체는 단쇄 Fv 단편(scFv)이다(예를 들어 WO 93/16185; 미국특허 제 5,571,894 및 5,587,458 호를 참조하시오). Fv 및 scFv는 불변 영역이 없는 온전한 결합 부위를 가지며; 따라서 이들은 생체내 사용 중에 감소된 비특이성 결합에 적합할 수 있다. scFv 융합 단백질을 scFv의 아미노 또는 카복시 말단 중 어느 하나에서 효과기 단백질의 융합을 생성시키도록 구성할 수 있다(예를 들어 상기 문헌[Borrebaeck ed.]를 참조하시오). 항체 단편은 또한, 예를 들어 상기 인용된 참고문헌에 기재된 바와 같이 "선형 항체"일 수 있다. 상기와 같은 선형 항체는 단일특이성 또는 다중특이성, 예를 들어 이중특이성일 수 있다.
단일 도메인 항체(sdAb)
일부 구현예에서, 항체 단편은 단일 도메인 항체(sdAb)이다.
일부 구현예에서, sdAb는 VHH 단일 도메인 항체이다.
일부 구현예에서, sdAb는 알부민(예를 들어 HAS)에 약 1-1000 nM(예를 들어 약 l-900 nM, l-800 nM, 1-700 nM, 1-600 nM, 1-500 ηM, 1-400 ηM, 1-300 ηM, 1-200 ηM, 1-1OO ηM, 1-50 ηM, l-25 nM, 또는 O.l-l nM)의 KD로 결합한다. 다른 구현예에서, sdAb는 알부민(예를 들어 HAS)에 약 1-800 ηM(예를 들어 약 20-500 nM, 50-300 nM 또는 100-200 ηM)의 KD로 결합한다.
일부 구현예에서, sdAb는 알부민(예를 들어 HAS)에 약 5.5의 pH 및/또는 약 7.5의 pH에서 약 1-1000 nM(예를 들어 약 l-900 nM, l-800 nM, 1-700 nM, 1-600 nM, 1-500 nM, 1-400 nM, 1-300 nM, 1-200 nM, 1-1OO nM, 1-50 nM, l-25 nM, 또는 O.l-l nM)의 KD로 결합한다. 일부 구현예에서, sdAb는 알부민(예를 들어 HSA)에 약 5.5의 pH 및 약 7.5의 pH에서 약 1-200 nM의 KD로 결합한다.
일부 구현예에서, 단일 도메인 항체 또는 이의 단편은 서열번호 69, 72, 75, 78, 81, 84, 87, 90, 및 93 중 어느 하나의 아미노산 서열, 또는 약 3개 이하의 아미노산 치환을 포함하는 이의 변이체를 포함하는 CDR1; 서열번호 70, 73, 76, 79, 82, 85, 88, 91, 및 94 중 어느 하나의 아미노산 서열, 또는 약 3개 이하의 아미노산 치환을 포함하는 이의 변이체를 포함하는 CDR2; 및 서열번호 71, 74, 77, 80, 83, 86, 89, 92, 및 95 중 어느 하나의 아미노산 서열, 또는 약 3개 이하의 아미노산 치환을 포함하는 이의 변이체를 포함하는 CDR3를 포함한다.
일부 구현예에서, 단일 도메인 항체 또는 이의 단편은 하기 중 어느 하나를 포함한다: (1) 서열번호 69의 아미노산 서열, 또는 약 3개 이하의 아미노산 치환을 포함하는 이의 변이체를 포함하는 CDR1; 서열번호 70의 아미노산 서열, 또는 약 3개 이하의 아미노산 치환을 포함하는 이의 변이체를 포함하는 CDR2; 및 서열번호 71의 아미노산 서열, 또는 약 3개 이하의 아미노산 치환을 포함하는 이의 변이체를 포함하는 CDR3; (2) 서열번호 72의 아미노산 서열, 또는 약 3개 이하의 아미노산 치환을 포함하는 이의 변이체를 포함하는 CDR1; 서열번호 73의 아미노산 서열, 또는 약 3개 이하의 아미노산 치환을 포함하는 이의 변이체를 포함하는 CDR2; 및 서열번호 74의 아미노산 서열, 또는 약 3개 이하의 아미노산 치환을 포함하는 이의 변이체를 포함하는 CDR3; (3) 서열번호 75의 아미노산 서열, 또는 약 3개 이하의 아미노산 치환을 포함하는 이의 변이체를 포함하는 CDR1; 서열번호 76의 아미노산 서열, 또는 약 3개 이하의 아미노산 치환을 포함하는 이의 변이체를 포함하는 CDR2; 및 서열번호 77의 아미노산 서열, 또는 약 3개 이하의 아미노산 치환을 포함하는 이의 변이체를 포함하는 CDR3; (4) 서열번호 78의 아미노산 서열, 또는 약 3개 이하의 아미노산 치환을 포함하는 이의 변이체를 포함하는 CDR1; 서열번호 79의 아미노산 서열, 또는 약 3개 이하의 아미노산 치환을 포함하는 이의 변이체를 포함하는 CDR2; 및 서열번호 80의 아미노산 서열, 또는 약 3개 이하의 아미노산 치환을 포함하는 이의 변이체를 포함하는 CDR3; (5) 서열번호 81의 아미노산 서열, 또는 약 3개 이하의 아미노산 치환을 포함하는 이의 변이체를 포함하는 CDR1; 서열번호 82의 아미노산 서열, 또는 약 3개 이하의 아미노산 치환을 포함하는 이의 변이체를 포함하는 CDR2; 및 서열번호 83의 아미노산 서열, 또는 약 3개 이하의 아미노산 치환을 포함하는 이의 변이체를 포함하는 CDR3; (6) 서열번호 84의 아미노산 서열, 또는 약 3개 이하의 아미노산 치환을 포함하는 이의 변이체를 포함하는 CDR1; 서열번호 85의 아미노산 서열, 또는 약 3개 이하의 아미노산 치환을 포함하는 이의 변이체를 포함하는 CDR2; 및 서열번호 86의 아미노산 서열, 또는 약 3개 이하의 아미노산 치환을 포함하는 이의 변이체를 포함하는 CDR3; (7) 서열번호 87의 아미노산 서열, 또는 약 3개 이하의 아미노산 치환을 포함하는 이의 변이체를 포함하는 CDR1; 서열번호 88의 아미노산 서열, 또는 약 3개 이하의 아미노산 치환을 포함하는 이의 변이체를 포함하는 CDR2; 및 서열번호 89의 아미노산 서열, 또는 약 3개 이하의 아미노산 치환을 포함하는 이의 변이체를 포함하는 CDR3; (8) 서열번호 90의 아미노산 서열, 또는 약 3개 이하의 아미노산 치환을 포함하는 이의 변이체를 포함하는 CDR1; 서열번호 91의 아미노산 서열, 또는 약 3개 이하의 아미노산 치환을 포함하는 이의 변이체를 포함하는 CDR2; 및 서열번호 92의 아미노산 서열, 또는 약 3개 이하의 아미노산 치환을 포함하는 이의 변이체를 포함하는 CDR3; 또는 (9) 서열번호 93의 아미노산 서열, 또는 약 3개 이하의 아미노산 치환을 포함하는 이의 변이체를 포함하는 CDR1; 서열번호 94의 아미노산 서열, 또는 약 3개 이하의 아미노산 치환을 포함하는 이의 변이체를 포함하는 CDR2; 및 서열번호 95의 아미노산 서열, 또는 약 3개 이하의 아미노산 치환을 포함하는 이의 변이체를 포함하는 CDR3.
일부 구현예에서, 단일 도메인 항체 또는 이의 단편은 서열번호 60-68 및 168-170으로 이루어지는 그룹 중에서 선택된 아미노산 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 단일 도메인 항체 또는 이의 단편은 서열번호 60-68 및 168-170으로 이루어지는 그룹 중에서 선택된 아미노산 서열에 약 또는 적어도 약 80%(예를 들어 적어도 약 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 중 어느 하나)의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 단일 도메인 항체 또는 이의 단편은 서열번호 60-68 및 168-170 중 어느 하나의 아미노산 서열 또는 서열번호 60-68 및 168-170 중 어느 하나에 적어도 약 80%(예를 들어 적어도 약 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 중 어느 하나)의 서열 동일성을 갖는 이의 변이체를 포함하는 VHH 도메인을 포함한다.
일부 구현예에서, 알부민에 결합하는 단일 도메인 항체 또는 이의 단편은, 각각 서열번호 60-68 및 168-170 중 어느 하나에 제시된 서열을 갖는 중쇄 가변 도메인내에 CDR1, CDR2 및 CDR3의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1, CDR2, CDR3를 포함한다.
E. 항원 결합 모이어티
일부 구현예에서, 융합 단백질은 항원 결합 모이어티를 추가로 포함하며, 여기에서 항원 결합 모이어티는 알부민 결합 모이어티에 융합된 사이토카인("사이토카인-ALBBM")의 N- 또는 C-말단에 융합된다.
일부 구현예에서, 항원 결합 모이어티는 종양 항원에 결합한다. 일부 구현예에서, 종양은 고형 또는 액체 종양이다. 일부 구현예에서, 종양은 중피종, 폐암, 유방암, 난소암, 췌장암, 림프종, 백혈병, 두경부암, 간암, 식도암, 위암 및 결장직장암으로 이루어지는 그룹 중에서 선택된 암이다. 일부 구현예에서, 암은 높은 수준의 종양 항원을 발현한다. 예를 들어, 일부 구현예에서, 암은 참조 조직의 수준의 적어도 2배, 5배, 10배, 20배, 30배, 40배, 또는 50배의 수준을 발현한다. 일부 구현예에서, 참조 조직은 동일한 개체에서 암세포를 포함하지 않는 조직이다.
일부 구현예에서, 종양 항원은 메소텔린("MSLN"), GPA33, Her-2, EGFR, 및 CD20으로 이루어지는 그룹 중에서 선택된다. 일부 구현예에서, 종양 항원은 CEA, MUC16, MFJC1, AFP, EPCAM, CD19, CD21, CD22, CD30, CD33, CD37, CD45, PSMA, 및 BCMA로 이루어지는 그룹 중에서 선택된다.
일부 구현예에서, 항원 결합 모이어티는 항체(예를 들어 완전길이 항체) 또는 이의 항원 결합 단편이다. 일부 구현예에서, 본원에 제공된 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 폴리펩티드, 폴리펩티드 단편, 또는 암세포상에서 발현된 항원의 에피토프에 면역특이적으로 결합할 수 있다. 하나의 구현예에서, 항체는 인간 암 항원에 결합한다. 일부 구현예에서, 본원에 제공된 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 암 항원의 세포외 도메인(ECD)에 결합한다. 몇몇 구현예에서, 항체는 암 항원의 ECD 중의 에피토프에 결합한다. 일부 구현예에서, 암 항원은 고형 또는 액체 종양 암세포상에서 발현된다.
본원에 제공된 암 항원에 결합하는 항체는 비제한적으로 합성 항체, 단클론 항체, 재조합적으로 생성된 항체, 다중특이성 항체(이중특이성 항체 포함), 인간 항체, 인간화된 항체, 키메라 항체, 인트라바디, 단쇄 Fv(scFv)(예를 들어 단일특이성, 이중특이성 등 포함), 카멜화된 항체 또는 이의 인간화된 버전, Fab 단편, F(ab') 단편, 디설파이드-연결된 Fv(sdFv), 항-이디오타입(항-id) 항체, 및 상기 중 어느 하나의 에피토프-결합 단편일 수 있다.
일부 구현예에서, 본원에 제공된 항체는 면역글로불린 분자 및 면역글로불린 분자의 면역학적으로 활성인 부분, 즉 암 항원(예를 들어 고형 또는 액체 종양 암 항원)에 면역특이적으로 결합하는 항원 결합 부위를 함유하는 분자의 면역학적으로 활성인 부분을 포함한다. 본원에 제공된 면역글로불린 분자는 면역글로불린 분자의 임의의 유형(예를 들어 IgG, IgE, IgM, IgD, IgA 및 IgY), 부류(예를 들어 IgGl, IgG2, IgG3, IgG4, IgAl 및 IgA2) 또는 하위부류일 수 있다. 일부 구현예에서, 본원에 제공된 항체는 IgG 항체, 예를 들어 IgG1 항체이다.
암 항원의 에피토프에 특이적으로 결합하는 능력을 유지하는 항체 단편을 포함하는 항체의 변이체 및 유도체가 또한 본 개시내용에 포함된다. 예시적인 단편은 Fab 단편; Fab'; F(ab')2; 이중특이성 Fab; 가변 영역을 포함하는 단쇄 Fab 쇄(또한 sFv로서 공지됨); 디설파이드-연결된 Fv, 또는 dsFv; 카멜화된 VH; 이중특이성 sFv; 디아바디; 및 트리아바디를 포함한다. 항체의 유도체는 또한 항체 결합 부위의 하나 이상의 CDR 서열을 포함한다. CDR 서열은 2개 이상의 CDR 서열이 존재할 때 스캐폴드상에 함께 연결될 수 있다. 몇몇 구현예에서, 본원에 제공된 항체는 단쇄 Fv("scFv")를 포함한다. 다양한 기법이 상기 섹션에 간략하게 기재된 바와 같이 항체 단편의 생산을 위해 개발되었다.
일부 구현예에서, 항원 결합 모이어티는 종양 항원에 결합하는 단일 가변 도메인 항체(sdAb)(예를 들어 VhH 항체)이다. 몇몇 유형의 유기체, 카멜리드 및 연골 어류가 이의 면역계의 부분으로서 Fc 균등한 도메인 구조상에 실린 고 친화성 단일 V-형 도메인을 갖는다(Woolven et al., 1999, Immunogenetics 50: 98-101; 및 Streltsov et al., 2004, Proc Natl Acad Sci EISA. 101 : 12444-49). V-형 도메인(카멜리드에서 VHH 및 상어에서 V-NAR이라 칭한다)은 전형적으로 긴 표면 고리를 나타내며, 이는 표적 항원의 공동의 침투를 허용한다. 상기는 또한 소수성 표면 패치를 가림으로써 단리된 VH 도메인을 안정화시킨다.
항-메소텔린 단일 도메인 항체(항-MSLN dsAb)
일부 구현예에서, 항원 결합 모이어티는 항-메소텔린 단일 도메인 항체("항-MSLN dsAb")이다.
본원에 제공된 항-MSLN 항체(예를 들어 sdAb)는 메소텔린 또는 이의 임의의 단편(예를 들어 서열번호 56-59 중 어느 하나)의 동형 중 어느 하나에 결합할 수 있다. 일부 구현예에서, 본원에 제공된 항-MSLN 항체는 서열번호 56-59 중 어느 하나 또는 이의 단편에 결합한다.
일부 구현예에서, 항-MSLN dsAb는 항-메소텔린 중쇄 가변 영역(항-MSLN VH)을 포함하며, 여기에서: a) 항-MSLN VH는 서열번호 46의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1, 서열번호 47의 아미노산 서열을 포함하는 CDR2, 및 서열번호 48의 아미노산 서열을 포함하는 CDR3, 또는 상기 CDR들에서 총 5, 4, 3, 2 또는 1개 이하의 아미노산 치환을 포함하는 이의 변이체를 포함하거나; 또는 b) 항-MSLN VH는 서열번호 49의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1, 서열번호 50의 아미노산 서열을 포함하는 CDR2, 및 서열번호 51의 아미노산 서열을 포함하는 CDR3, 또는 상기 CDR들에서 총 5, 4, 3, 2 또는 1개 이하의 아미노산 치환을 포함하는 이의 변이체를 포함한다.
일부 구현예에서, 항-MSLN dsAb는 항-메소텔린 중쇄 가변 영역(항-MSLN VH)을 포함하며, 여기에서: a) 항-MSLN VH는 서열번호 46의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1 또는 CDR1 중에 3, 2 또는 1개 이하의 치환을 포함하는 이의 변이체, 서열번호 47의 아미노산 서열을 포함하는 CDR2 또는 CDR2 중에 3, 2 또는 1개 이하의 치환을 포함하는 이의 변이체, 및 서열번호 48의 아미노산 서열을 포함하는 CDR3 또는 CDR3 중에 3, 2 또는 1개 이하의 치환을 포함하는 이의 변이체를 포함하거나; 또는 b) 항-MSLN VH는 서열번호 49의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1 또는 CDR1 중에 3, 2 또는 1개 이하의 치환을 포함하는 이의 변이체, 서열번호 50의 아미노산 서열을 포함하는 CDR2 또는 CDR2 중에 3, 2 또는 1개 이하의 치환을 포함하는 이의 변이체, 및 서열번호 51의 아미노산 서열을 포함하는 CDR3 또는 CDR1 중에 3, 2 또는 1개 이하의 치환을 포함하는 이의 변이체를 포함한다. 일부 구현예에서, 항-MSLN dsAb는 항-메소텔린 중쇄 가변 영역(항-MSLN VH)을 포함하며, 여기에서: a) 항-MSLN VH는 서열번호 187의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1 또는 CDR1 중에 3, 2 또는 1개 이하의 치환을 포함하는 이의 변이체, 서열번호 188의 아미노산 서열을 포함하는 CDR2 또는 CDR2 중에 3, 2 또는 1개 이하의 치환을 포함하는 이의 변이체, 및 서열번호 189의 아미노산 서열을 포함하는 CDR3 또는 CDR3 중에 3, 2 또는 1개 이하의 치환을 포함하는 이의 변이체를 포함한다. 일부 구현예에서, 항-MSLN dsAb는 항-메소텔린 중쇄 가변 영역(항-MSLN VH)을 포함하며, 여기에서: a) 항-MSLN VH는 서열번호 190의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1 또는 CDR1 중에 3, 2 또는 1개 이하의 치환을 포함하는 이의 변이체, 서열번호 191의 아미노산 서열을 포함하는 CDR2 또는 CDR2 중에 3, 2 또는 1개 이하의 치환을 포함하는 이의 변이체, 및 서열번호 192의 아미노산 서열을 포함하는 CDR3 또는 CDR3 중에 3, 2 또는 1개 이하의 치환을 포함하는 이의 변이체를 포함한다. 일부 구현예에서, 항-MSLN dsAb는 항-메소텔린 중쇄 가변 영역(항-MSLN VH)을 포함하며, 여기에서: a) 항-MSLN VH는 서열번호 193의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1 또는 CDR1 중에 3, 2 또는 1개 이하의 치환을 포함하는 이의 변이체, 서열번호 194의 아미노산 서열을 포함하는 CDR2 또는 CDR2 중에 3, 2 또는 1개 이하의 치환을 포함하는 이의 변이체, 및 서열번호 195의 아미노산 서열을 포함하는 CDR3 또는 CDR3 중에 3, 2 또는 1개 이하의 치환을 포함하는 이의 변이체를 포함한다.
일부 구현예에서, 항-MSLN sdAb는, 각각 서열번호 173-186 중 어느 하나에 제시된 서열을 갖는 중쇄 가변 도메인내에 CDR1, CDR2 및 CDR3의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1, CDR2, CDR3를 포함한다.
F. 융합 단백질 변이체
일부 구현예에서, 본원에 제공된 융합 단백질의 아미노산 서열 변이체를 고려한다. 예를 들어, 융합 단백질의 전체 또는 임의의 성분(들) 중의 융합 단백질의 결합 친화성 및/또는 다른 생물학적 성질을 개선시키는 것이 바람직할 수 있다. 융합 단백질의 아미노산 서열 변이체를, 융합 단백질을 암호화하는 핵산 서열내에 적합한 변형을 도입시키거나, 또는 펩티드 합성에 의해 제조할 수 있다. 상기와 같은 변형은 예를 들어 융합 단백질의 아미노산 서열내 잔기의 결실 및/또는 삽입 및/또는 치환을 포함한다. 결실, 삽입 및 치환의 임의의 조합을 수행하여 최종 구조물에 도달할 수 있으나, 단 최종 구조물은 목적하는 특징을 가져야 한다.
1 치환, 삽입, 결실 및 변이체
일부 구현예에서, 하나 이상의 아미노산 치환을 갖는 융합 단백질 변이체를 제공한다. 치환 돌연변이유발에 중요한 부위는 알부민-결합 분자 및/또는 항원 결합 모이어티의 HVR 및 FR을 포함한다. 보존적 치환을 표 3에 나타낸다. "예시적인 치환"의 제목 아래, 및 하기에 추가로 기재하는 바와 같이 아미노산 측쇄를 참조하여 보다 많은 실질적인 변화를 제공한다. 아미노산 치환을 융합 단백질의 성분내에 도입시킬 수 있으며 생성물을 목적하는 활성, 예를 들어 유지된/개선된 항원 결합, 감소된 면역원성, 또는 개선된 ADCC 또는 CDC에 대해 선별하였다. 또한 섹션 "V. 제조 방법"하의 서브섹션 "1. 아미노산 서열 변이체"를 참조하시오.
[표 3]
아미노산 치환
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아미노산을 공통의 측쇄 성질에 따라 분류할 수 있다:
(1) 소수성: 노르류신, Met, Ala, Val, Leu, Ile;
(2) 중성 친수성: Cys, Ser, Thr, Asn, Gln;
(3) 산성: Asp, Glu;
(4) 염기성: His, Lys, Arg;
(5) 쇄 배향에 영향을 미치는 잔기: Gly, Pro;
(6) 방향족: Trp, Tyr, Phe.
비-보존적 치환은 이들 부류 중 하나의 구성원의 또 다른 부류에 대한 교환을 수반할 것이다.
한 가지 유형의 치환 변이체는 모 항체(예를 들어 인간화된 또는 인간 항체)의 하나 이상의 고가변 영역의 치환을 수반한다. 일반적으로, 추가의 연구를 위해 선택된 생성 변이체(들)는 모 항체와 비교된 몇몇 생물학적 성질(예를 들어 증가된 친화성, 감소된 면역원성)의 변형(예를 들어 개선)을 갖고/갖거나 모 항체의 몇몇 생물학적 성질을 실질적으로 유지할 것이다. 예시적인 치환 변이체는 친화성 성숙된 항체이며, 이를 편의상, 예를 들어 파지 디스플레이-기반 친화성 성숙화 기법, 예를 들어 본원에 기재된 것을 사용하여 생성시킬 수 있다. 간략히, 하나 이상의 HVR 잔기를 돌연변이시키고, 변이체 항체를 파지상에 디스플레이하고, 특정한 생물학적 활성(예를 들어 결합 친화성)에 대해 선별한다.
변경(예를 들어 치환)을, 예를 들어 항체 친화성을 개선시키기 위해 HVR에서 수행할 수 있다. 상기와 같은 변경은 HVR "핫스폿"에서, 즉 체세포 성숙화 과정 동안 높은 빈도로 돌연변이를 겪는 코돈에 의해 암호화된 잔기(예를 들어 문헌[Chowdhury, Methods Mol. Biol. 207: 179-196 (2008)]을 참조하시오), 및/또는 SDR(a-CDR)에서 이루어질 수 있으며, 이때 생성되는 변이체 VH 또는 VL을 결합 친화성에 대해 시험한다. 2차 라이브러리의 구성 및 재선택에 의한 친화성 성숙화가 예를 들어 문헌[Hoogenboom et al. in Methods in Molecular Biology 178: 1-37 (O'Brien el al., ed., Human Press, Totowa, NJ, (2001)])에 기재되었다. 친화성 성숙화의 일부 구현예에서, 다양한 방법(예를 들어 오류-빈발 PCR, 쇄 셔플링, 또는 올리고뉴클레오티드-지향된 돌연변이유발) 중 어느 하나에 의해, 성숙화를 위해 선택된 가변 유전자내에 다양성을 도입시킨다. 이어서 2차 라이브러리를 생성시킨다. 이어서 목적하는 친화성을 갖는 임의의 항체 변이체를 식별하기 위해 라이브러리를 선별한다. 다양성을 도입시키기 위한 또 다른 방법은 HVR-지향된 접근법을 수반하며, 여기에서 다수의 HVR 잔기(예를 들어 한 번에 4-6 잔기)를 무작위한다. 항원 결합에 수반된 HVR 잔기를, 예를 들어 알라닌 스캐닝 돌연변이유발 또는 모델링을 사용하여 특이적으로 식별할 수 있다. 특히 CDR-H3 및 CDR-L3을 종종 표적화한다.
일부 구현예에서, 치환, 삽입 또는 결실이, 상기와 같은 변경이 항원에 결합하는 항체의 능력을 실질적으로 감소시키지 않는 한, 하나 이상의 HVR내에서 발생할 수 있다. 예를 들어, 결합 친화성을 실질적으로 감소시키지 않는 보존적 변경(예를 들어 본원에 제공된 바와 같은 보존적 치환)이 HVR에서 이루어질 수 있다. 상기와 같은 변경은 HVR "핫스폿" 또는 CDR의 밖에서 있을 수 있다.
돌연변이유발에 표적화될 수 있는 항체의 잔기 또는 영역의 유용한 식별 방법을 "알라닌 스캐닝 돌연변이유발"이라 칭하며 이는 문헌[Cunningham and Wells (1989) Science, 244: 1081-1085]에 기재되어 있다. 상기 방법에서, 표적 잔기(예를 들어 하전된 잔기, 예를 들어 Arg, Asp, His, Lys 및 Glu) 중의 잔기 또는 잔기들의 그룹을 중성 또는 음으로 하전된 아미노산(예를 들어 알라닌 또는 폴리알라닌)에 의해 식별하고 교체하여 항체와 항원과의 상호작용이 영향을 받는지의 여부를 밝힌다. 추가의 치환을 아미노산 위치에 도입시켜, 초기 치환에 대한 기능 민감성을 입증할 수 있다. 한편으로, 또는 추가로, 항원-항체 복합체의 결정 구조로 항체와 항원간의 접촉점을 식별한다. 상기와 같은 접촉 잔기 및 이웃하는 잔기를 치환을 위한 후보로서 표적화하거나 또는 제거할 수 있다. 변이체를, 상기가 목적하는 성질을 함유하는지의 여부를 밝히기 위해 선별할 수 있다.
아미노산 서열 삽입은 하나의 잔기에서 100개 이상의 잔기를 함유하는 폴리펩티드까지의 길이 범위의 아미노- 및/또는 카복실-말단 융합뿐만 아니라 단일 또는 다수의 아미노산 잔기의 서열내 삽입을 포함한다. 말단 삽입의 예는 N-말단 메티오닐 잔기를 갖는 항체를 포함한다. 항체 분자의 다른 삽입 변이체는, 효소(예를 들어 ADEPT를 위한) 또는 항체의 혈청 반감기를 증가시키는 폴리펩티드에 대한 상기 항체의 N- 또는 C-말단에의 융합을 포함한다.
2 유도체
일부 구현예에서, 본원에 제공된 융합 단백질을, 당해 분야에 공지되고 쉽게 입수할 수 있는 추가적인 비-단백질성 부분을 함유하도록 추가로 변형시킬 수 있다. 융합 단백질의 유도체화에 적합한 부분은 비제한적으로 수용성 중합체를 포함한다. 수용성 중합체의 비제한적인 예는 비제한적으로 폴리에틸렌 글리콜(PEG), 에틸렌 글리콜/프로필렌 글리콜의 공중합체, 카복시메틸셀룰로스, 덱스트란, 폴리비닐 알콜, 폴리비닐 피롤리돈, 폴리-1,3-디옥솔란, 폴리-1,3,6-트리옥산, 에틸렌/말레산 무수물 공중합체, 폴리아미노산(단독중합체 또는 무작위 공중합체), 및 덱스트란 또는 폴리(n-비닐 피롤리돈)폴리에틸렌 글리콜, 프로필렌 글리콜 단독중합체, 폴리프로필렌 옥사이드/에틸렌 옥사이드 공중합체, 폴리옥시에틸화된 폴리올(예를 들어 글리세롤), 폴리비닐 알콜, 및 이들의 혼합물을 포함한다. 폴리에틸렌 글리콜 프로피온알데히드는 이의 수 중 안정성으로 인해 제조에 유리할 수 있다. 중합체는 임의의 분자량을 가질 수 있으며, 분지되거나 분지되지 않을 수도 있다. 융합 단백질에 부착된 중합체의 수는 다양할 수 있으며, 하나 초과의 중합체가 부착되는 경우, 이들은 동일하거나 상이한 분자일 수 있다. 일반적으로, 유도체화에 사용되는 중합체의 수 및/또는 유형을, 비제한적으로, 개선시키고자 하는 융합 단백질의 특정한 성질 또는 기능, 융합 단백질 유도체가 한정된 조건하에서 치료법에 사용되는 지의 여부 등을 포함한 고려사항을 근거로 결정할 수 있다.
일부 구현예에서, 방사선에의 노출에 의해 선택적으로 가열될 수 있는 융합 단백질 및 비단백질성 부분의 접합체를 제공한다. 일부 구현에에서, 비단백질성 부분은 탄소 나노튜브이다(Kam et al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 102: 11600-11605 (2005)). 방사선은 임의의 파장의 것일 수 있으며, 비제한적으로 보통의 세포에는 유해하지 않지만 비단백질성 부분을 융합 단백질 비단백질성 부분에 가까운 세포를 사멸시키는 온도로 가열하는 파장을 포함한다.
II-B. 트렁케이트된 IL-21을 포함하는 융합 단백질
본원은 또한 트렁케이트된 인간 IL-21을 포함하는 인간 IL-21 변이체를 포함하는 융합 단백질을 제공한다. 이론에 얽매이고자 하는 것은 아니지만, C-말단에 1-11개 아미노산이 없는 IL-21의 트렁케이트된 형태를 포함하는 융합 단백질이, 야생형 상대, 및 C-말단에 12개 이상의 아미노산이 없는 트렁케이트된 상대보다 개선된 안정성을 갖는 것으로 밝혀졌다. 본원에 기재된 바와 같은 트렁케이트된 IL-21을 포함하는 융합 단백질은 항-알부민 결합 모이어티를 포함하는 융합 단백질로 제한되지 않는 것으로 생각된다.
일부 구현예에서, a) 야생형 IL-21의 C-말단에 약 1-11개 아미노산이 없는 트렁케이트된 IL-21, 및 b) 제2 부분(예를 들어 단일 도메인 항체 부분)을 포함하는 융합 단백질을 제공한다. 일부 구현예에서, IL-21은 인간으로부터 유래된다. 일부 구현예에서, a) 서열번호 126, 171 또는 172의 아미노산 서열을 포함하는 트렁케이트된 IL-21, 및 b) 제2 부분을 포함하는 융합 단백질을 제공한다. 일부 구현예에서, 트렁케이트된 IL-21은 C-말단에서 L123 및 S133을 포함하여 이들 사이에 하나 이상의 아미노산이 없다. 일부 구현예에서, 트렁케이트된 IL-21은 서열번호 1에 제시된 서열을 갖는 IL-21의 C-말단에 L123 및 S133을 포함하여 이들 사이에 임의의 하나, 임의의 둘, 임의의 셋, 임의의 넷, 임의의 다섯, 임의의 여섯, 임의의 일곱, 임의의 여덟, 임의의 아홉, 임의의 열개의 아미노산, 또는 열한개의 아미노산 전부가 없다. 일부 구현예에서, IL-21 변이체는 서열번호 1의 C-말단에 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 또는 1개의 아미노산이 없다. 일부 구현예에서, 트렁케이트된 IL-21은 서열번호 1의 C-말단에 약 5-11, 6-11, 7-11, 8-11, 9-11 또는 10-11개 아미노산(예를 들어 연속적인 아미노산)이 없다.
일부 구현예에서, 융합 단백질은 적어도 약 15 kDa, 18 kDa, 20 kDa, 22 kDa, 25 kDa, 28 kDa의 분자량을 갖는다. 일부 구현예에서, 융합 단백질은 약 1000 kDa, 500 kDa, 250 kDa, 100 kDa, 70 kDa, 50 kDa, 40 kDa, 또는 30 kDa 이하의 분자량을 갖는다. 일부 구현예에서, 융합 단백질은 약 15 kDa 내지 약 1000 kDa, 약 15 kDa 내지 약 500 k Da, 약 15 kDa 내지 약 100 kDa, 약 15 kDa 내지 약 70 kDa, 약 20 kDa 내지 약 50 kDa, 약 25 kDa 내지 약 30 kDa, 또는 약 28 kDa의 분자량을 갖는다.
일부 구현예에서, 제2 부분은 반감기 연장 부분을 포함한다. 일부 구현예에서, 반감기 연장 부분은 알부민 결합 모이어티(예를 들어 알부민 결합 항체 부분, 예를 들어 단일 도메인 알부민 결합 항체 부분)이다. 일부 구현에에서, 반감기 연장 부분은 Fc 도메인(예를 들어 IgG1 Fc 도메인)이다.
일부 구현예에서, 제2 부분은 항원 결합 모이어티를 포함한다. 일부 구현예에서, 항원 결합 모이어티는 약 50 kDa, 40 kDa, 30 kDa, 20 kDa 또는 15 kDa 미만의 분자량을 갖는다. 일부 구현예에서, 항원 결합 모이어티는 단일 도메인 항체 부분을 포함한다. 일부 구현예에서, 항원 결합 모이어티는 알부민에 특이적으로 결합하는 단일 도메인 항체 부분을 포함한다.
일부 구현예에서, 제2 부분은 트렁케이트된 IL-21의 N-말단에 융합된다. 일부 구현예에서, 제2 부분은 트렁케이트된 IL-21의 C-말단에 융합된다.
일부 구현예에서, 제2 부분은 링커(IL-21에 인접하거나 IL-21에 인접하지 않을 수 있다)를 통해 트렁케이트된 IL-21에 융합된다. 일부 구현예에서, 제2 부분은 링커를 통해 트렁케이트된 IL-21의 N- 또는 C-말단에 융합된다. 일부 구현예에서, 링커는 강성 링커이다. 일부 구현예에서, 링커는 가요성 링커이다.
III. 약학 조성물
본원에 기재된 융합 단백질 중 어느 하나, 및 임의로 약학적으로 허용 가능한 담체를 포함하는 약학 조성물을 본원에 의해 추가로 제공한다. 약학 조성물은 목적하는 정도의 순도를 갖는 본원에 기재된 융합 단백질을 임의의 약학적으로 허용 가능한 담체, 부형제 또는 안정제와 혼합함으로써, 동결건조된 제형 또는 수용액의 형태로 제조될 수 있다(Remington's Pharmaceutical Sciences l6th edition, Osol, A. Ed. (1980)).
약학 조성물은 바람직하게는 안정성이며, 여기에서 본원에 기재된 융합 단백질은 보관시 이의 물리적 및 화학적 안정성 및 완전성을 필수적으로 유지한다. 단백질 안정성을 측정하기 위한 다양한 분석 기법을 당해 분야에서 입수할 수 있으며 이는 문헌[Peptide and Protein Drug Delivery, 247-301, Vincent Lee Ed., Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., Pubs. (1991)] 및 [Jones, A. Adv. Drug Delivery Rev. 10: 29-90 (1993)]에 리뷰되어 있다. 안정성을 선택된 기간 동안 선택된 온도에서 측정할 수 있다. 빠른 선별을 위해서, 제형을 2주 내지 1개월(이 시간에 안정성을 측정한다) 동안 40℃에서 유지시킬 수 있다. 제형을 2-8℃에서 보관해야 하는 경우, 일반적으로 제형은 적어도 1개월 동안 30℃ 또는 40℃에서 안정성이고/이거나, 적어도 2년 동안 2-8℃에서 안정성이어야 한다. 제형을 30℃에서 보관해야 하는 경우, 일반적으로 제형은 30℃에서 적어도 2년 동안 안정성이고/이거나, 40℃에서 적어도 6개월 동안 안정성이어야 한다. 예를 들어, 보관 중 응집 정도를 단백질 안정성의 지표로서 사용할 수 있다. 일부 구현예에서, 본원에 기재된 융합 단백질의 안정성 제형은 제형 중에 응집체로서 존재하는 융합 단백질을 약 10% 미만(바람직하게는 약 5% 미만)으로 포함할 수 있다.
허용 가능한 담체, 부형제 또는 안정제는 사용되는 투여량 및 농도에서 수용자에게 무독성이며, 완충제, 산화방지제, 예를 들어 아스코르브산, 메티오닌, 비타민 E, 나트륨 메타비설파이트; 보존제, 등장화제(예를 들어 염화 나트륨), 안정제, 금속 착체(예를 들어 Zn-단백질 착체); 킬레이트제, 예를 들어 EDTA 및/또는 비이온성 계면활성제를 포함한다.
생리학적으로 허용 가능한 담체의 예는 완충제, 예를 들어 포스페이트, 시트레이트, 및 다른 유기산; 산화방지제, 예를 들어 아스코르브산 및 메티오닌; 보존제(예를 들어 옥타데실디메틸벤질 암모늄 클로라이드; 헥사메토늄 클로라이드; 벤즈알코늄 클로라이드, 벤즈에토늄 클로라이드; 페놀, 부틸 또는 벤질 알콜; 알킬 파라벤, 예를 들어 메틸 또는 프로필 파라벤; 카테콜; 레소르시놀; 사이클로헥사놀; 3-펜타놀; 및 m-크레졸); 저분자량(약 10 잔기 미만) 폴리펩티드; 단백질, 예를 들어 혈청 알부민, 젤라틴, 또는 면역글로불린; 친수성 중합체, 예를 들어 폴리비닐피롤리돈; 아미노산, 예를 들어 글리신, 글루타민, 아스파라진, 아르기닌 또는 리신; 모노사카라이드, 디사카라이드, 및 다른 탄수화물, 예를 들어 글루코스, 만노스 또는 덱스트린; 킬레이트제, 예를 들어 EDTA; 당, 예를 들어 슈크로스, 만니톨, 트레할로스 또는 솔비톨; 염-형성 대이온, 예를 들어 나트륨; 금속 착체(예를 들어 Zn-단백질 착체); 및/또는 비이온성 계면활성제, 예를 들어 TWEENTM, 폴리에틸렌 글리콜(PEG), 및 PLEIRONICSTM 또는 폴리에틸렌 글리콜(PEG)을 포함한다.
완충제를 사용하여 pH를, 특히 안정성이 pH 의존성인 경우, 치료 유효성을 최적화하는 범위로 조절한다. 완충제는 바람직하게는 약 50 mM 내지 약 250 mM 범위의 농도로 존재한다. 본원에 사용하기에 적합한 완충제는 유기 및 무기산 모두 및 그들의 염을 포함한다. 예를 들어, 시트레이트, 포스페이트, 숙시네이트, 타르트레이트, 푸마레이트, 글루코네이트, 옥살레이트, 락테이트, 아세테이트. 추가로, 완충제는 히스티딘 및 트리메틸아민염, 예를 들어 트리스를 포함할 수 있다.
보존제를 미생물 생육을 지연시키기 위해 첨가하며, 이는 전형적으로 0.2% 내지 1.0%(w/v)의 범위로 존재한다. 보존제의 첨가는 예를 들어 수회-사용(수회-용량) 제형의 생성을 용이하게 한다. 본원에 사용하기에 적합한 보존제는 옥타데실디메틸벤질 암모늄 클로라이드; 헥사메토늄 클로라이드; 벤즈알코늄 할라이드(예를 들어 클로라이드, 브로마이드, 요오다이드), 벤즈에토늄 클로라이드; 티메로살, 페놀, 부틸 또는 벤질 알콜; 알킬 파라벤, 예를 들어 메틸 또는 프로필 파라벤; 카테콜; 레소르시놀; 사이클로헥사놀, 3-펜타놀 및 m-크레졸을 포함한다.
긴장제(때때로 "안정제"로서 공지됨)는 조성물 중의 액체의 긴장도를 조절하거나 유지하기 위해 존재한다. 단백질 및 항체와 같은 크고, 하전된 생물분자와 함께 사용될 때, 상기 긴장제는 아미노산 측쇄의 하전된 그룹과 상호작용하여, 분자간 및 분자내 상호작용 가능성을 줄일 수 있기 때문에 종종 "안정제"로서 지칭된다. 긴장제는 다른 성분의 상대적인 양을 고려하여, 0.1 내지 25 중량%, 바람직하게는 1 내지 5% 중의 임의의 양으로 존재할 수 있다. 바람직한 긴장제는 다가 당 알콜, 바람직하게는 3가 이상의 당 알콜, 예를 들어 글리세린, 에리쓰리톨, 아라비톨, 자일리톨, 솔비톨 및 만니톨을 포함한다.
추가적인 부형제는 하기 중 하나 이상으로서 작용할 수 있는 제제를 포함한다: (1) 벌크제, (2) 용해도 향상제, (3) 안정제 및 (4) 변성 또는 용기벽에의 부착을 방지하는 제제. 상기와 같은 부형제는 다가 당 알콜(상기에 열거됨); 아미노산, 예를 들어 알라닌, 글리신, 글루타민, 아스파라진, 히스티딘, 아르기닌, 리신, 오르니틴, 류신, 2-페닐알라닌, 글루탐산, 쓰레오닌 등; 유기 당 또는 당 알콜, 예를 들어 슈크로스, 락토스, 락티톨, 트레할로스, 스타키오스, 만노스, 소르보스, 자일로스, 리보스, 리비톨, 마이오이니시토스, 마이오이니시톨, 갈락토스, 갈락티톨, 글리세롤, 사아클리톨(예를 들어 이노시톨), 폴리에틸렌 글리콜; 황 함유 환원제, 예를 들어 우레아, 글루타치온, 티옥트산, 나트륨 티오글리콜레이트, 티오글리세롤, α-모노티오글리세롤 및 나트륨 티오 설페이트; 저분자량 단백질, 예를 들어 인간 혈청 알부민, 소 혈청 알부민, 젤라틴 또는 다른 면역글로불린; 친수성 중합체, 예를 들어 폴리비닐피롤리돈; 모노사카라이드(예를 들어 자일로스, 만노스, 프럭토스, 글루코스; 디사카라이드(예를 들어 락토스, 말토스, 슈크로스); 트리사카라이드, 예를 들어 라피노스; 및 폴리사카라이드, 예를 들어 덱스트린 또는 덱스트란을 포함한다.
비이온성 계면활성제 또는 세제(또한 "습윤제"로서 공지됨)는 치료제의 용해를 도울뿐만 아니라 교반-유발된 응집에 대해 치료 단백질을 보호하기 위해 존재하며, 이는 또한 제형이 활성 치료 단백질 또는 항체의 변성을 야기하지 않으면서 전단 표면 응력에 노출되는 것을 허용한다. 비이온성 계면활성제는 약 0.05 ㎎/㎖ 내지 약 1.0 ㎎/㎖, 바람직하게는 약 0.07 ㎎/㎖ 내지 약 0.2 ㎎/㎖의 범위로 존재한다.
적합한 비이온성 계면활성제는 폴리소르베이트(20, 40, 60, 65, 80 등), 폴리옥사머(184, 188 등), PLURONIC® 폴리올, TRITON®, 폴리옥시에틸렌 솔비탄 모노에테르(TWEEN®-20, TWEEN®-80 등), 라우로마크로골 400, 폴리옥실 40 스테아레이트, 폴리옥시에틸렌 수소화된 피마자 오일 10, 50 및 60, 글리세롤 모노스테아레이트, 슈크로스 지방산 에스테르, 메틸 셀룰로스 및 카복시메틸 셀룰로스를 포함한다. 사용될 수 있는 음이온성 세제는 나트륨 라우릴 설페이트, 디옥틸 나트륨 설포숙시네이트 및 디옥틸 나트륨 설포네이트를 포함한다. 양이온성 세제는 벤즈알코늄 클로라이드 또는 벤즈에토늄 클로라이드를 포함한다.
약학 조성물을 생체내 투여에 사용하기 위해서, 상기 조성물은 멸균성이어야 한다. 약학 조성물을 멸균 여과 멤브레인을 통한 여과에 의해 멸균성으로 만들 수 있다. 본원의 약학 조성물을 일반적으로 멸균 접근 포트를 갖는 용기, 예를 들어 피하주사바늘에 의해 관통될 수 있는 마개를 갖는 정맥내 용액 주머니 또는 바이알에 넣는다.
투여 경로는 공지되고 허용되는 방법에 따른다, 예를 들어 단일 또는 수회 일시주사 또는 적합한 방식으로 장기간에 걸친 주입, 예를 들어 피하, 정맥내, 복강내, 근육내, 동맥내, 병변내 또는 관절내 경로에 의한 주사 또는 주입, 국소 투여, 흡입, 또는 서방성 또는 연장된 방출 수단에 의한다. 일부 구현예에서, 약학 조성물을 국소로, 예를 들어 근육내로, 또는 유리체내로 투여한다.
서방성 제제를 제조할 수 있다. 서방성 제제의 적합한 예는 길항물질을 함유하는 고체 소수성 중합체의 반-투과성 기질을 포함하며, 상기 기질은 성형품, 예를 들어 필름 또는 미세캡슐의 형태이다. 서방성 기질의 예는 폴리에스테르, 하이드로겔(예를 들어, 폴리(2-하이드록시에틸-메트아크릴레이트), 또는 폴리(비닐알콜)), 폴리락티드(ET.S. Pat. No. 3,773,919), L-글루탐산 및 에틸-L-글루타메이트의 공중합체, 비-분해성 에틸렌-비닐 아세테이트, 분해성 락트산-글리콜산 공중합체, 예를 들어 LEIPRON DEPOTTM(락트산-글리콜산 공중합체 및 류프롤리드 아세테이트로 구성된 주사가능한 미소구), 및 폴리-D-(-)-3-하이드록시부티르산을 포함한다.
본원의 약학 조성물은 또한 특정 적응증의 치료에 필요시 하나 초과의 활성 화합물, 바람직하게는 서로에 대해 불리한 영향을 미치지 않는 상보성 활성을 갖는 것들을 또한 함유할 수 있다. 한편으로, 또는 추가로, 조성물은 세포독성제, 화학요법제, 사이토카인, 면역억제제, 또는 생육 억제제를 포함할 수 있다. 상기와 같은 분자는 의도하는 목적에 유효한 양으로 함께 적합하게 존재한다.
활성 성분을 또한, 예를 들어 코아세르베이션 기법에 의해 또는 계면 중합에 의해 제조된 미세캡슐, 예를 들어 각각 콜로이드 약물 전달 시스템(예를 들어 리포솜, 알부민 미소구, 미세유화액, 나노-입자 및 나노캡슐) 중의, 또는 거대유화액 중의 하이드록시메틸셀룰로스 또는 젤라틴-미세캡슐 및 폴리-(메틸메트아크릴레이트) 미세캡슐 중에 포집할 수 있다. 상기와 같은 기법은 문헌[Remington's Pharmaceutical Sciences 18th edition]에 개시되어 있다.
본원에 개시된 항체 융합 단백질을 면역리포솜으로서 제형화할 수 있다. 항체 융합 단백질을 함유하는 리포솜을 당해 분야에 공지된 방법, 예를 들어 문헌: Epstein et ah, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82: 3688 (1985); Hwang et al , Proc. Natl Acad. Sci. USA, 77: 4030 (1980); 및 미국특허 제 4,485,045 및 4,544,545 호에 기재된 방법에 의해 제조한다. 증대된 순환 시간을 갖는 리포솜이 미국특허 제 5,013,556 호에 개시되어 있다.
특히 유용한 리포솜은 포스파티딜콜린, 콜레스테롤, 및 PEG-유도체화된 포스파티딜에탄올아민(PEG-PE)을 포함하는 지질 조성물과 함께 역상 증발 방법에 의해 생성시킬 수 있다. 리포솜을, 목적하는 직경을 갖는 리포솜을 생성시키는 한정된 기공 크기의 필터를 통해 압출시킨다.
일부 구현예에서, 약학 조성물은 단일-사용 바이알, 예를 들어 단일-사용 밀봉 바이알 중에 함유된다. 일부 구현예에서, 약학 조성물은 수회-사용 바이알 중에 함유된다. 일부 구현예에서, 약학 조성물은 용기 중에 벌크로 함유된다. 일부 구현예에서, 약학 조성물은 저온보존된다.
IV. 치료 방법
본원의 하나의 태양은 본원에 기재된 융합 단백질 또는 약학 조성물을 사용하여 개체에서 질병 또는 상태를 치료하는 방법을 제공한다. 예를 들어, 본원에 기재된 융합 단백질은 a) 사이토카인 및 b) 알부민 결합 모이어티(예를 들어 알부민에 결합하는 sdAb)를 포함한다. 일부 구현예에서, 융합 단백질은 a) IL-21, IL-7, IL-15, IL-15Ra에 결합된 IL-15 또는 이의 단편, IL-33 및 IL-22로 이루어지는 그룹 중에서 선택된 사이토카인, 및 b) 알부민 결합 모이어티(예를 들어 알부민에 결합하는 sdAb)를 포함한다. 일부 구현예에서, 알부민 결합 모이어티는 본원에 기재된 바와 같이 알부민에 결합하는 알부민 결합 도메인 또는 단일 도메인 항체(sdAb)를 포함한다. 일부 구현예에서, 방법은 제2 제제를 투여함을 추가로 포함한다.
본원의 또 다른 태양은 개체에게 a) i) 사이토카인 및 ii) 사이토카인에 융합된 반감기 연장 도메인을 포함하는 융합 단백질; 및 b) 제2 제제를 투여함을 포함하는, 상기 개체에서 질병 또는 상태를 치료하는 방법을 제공한다. 일부 구현예에서, 반감기 연장 도메인은 사이토카인의 C-말단에 융합된다. 일부 구현예에서, 반감기 연장 도메인은 사이토카인의 N-말단에 융합된다. 일부 구현예에서, 사이토카인 및 반감기 연장 도메인은 링커를 통해 연결된다. 일부 구현예에서, 링커는 1 내지 40(예를 들어 1 내지 35, 1 내지 30, 1 내지 25, 1 내지 20, 4 내지 20, 또는 4 내지 16) 아미노산의 길이를 갖는다. 일부 구현예에서, 링커는 서열번호 12-26 및 158-159로 이루어지는 그룹 중에서 선택된다. 일부 구현예에서, 사이토카인은 IL-21, IL-7, IL-15, IL-15Ra에 결합된 IL-15 또는 이의 단편, IL-33 및 IL-22로 이루어지는 그룹 중에서 선택된다. 일부 구현예에서, 사이토카인은 IL-21이다. 일부 구현예에서, 반감기 연장 도메인은 알부민 결합 모이어티(예를 들어 알부민 결합 도메인 또는 항-알부민 단일 도메인 항체)이다. 일부 구현에에서, 반감기 연장 도메인은 알부민이다. 일부 구현예에서, 반감기 연장 도메인은 Fc 단편이다. 일부 구현예에서, Fc 단편은 IgG1, IgG2, IgG3 및 IgG4 Fc 단편 또는 이의 변이체로 이루어지는 그룹 중에서 선택된다. 일부 구현예에서, Fc 단편은 IgG1 Fc 단편 또는 이의 변이체이다. 일부 구현예에서, IgG1 Fc 단편 또는 이의 변이체는 297번 위치에 돌연변이를 포함하며, 여기에서 297번 위치의 아미노산은 알라닌, 아스파트산 또는 글리신으로 돌연변이된다. 일부 구현예에서, 개체는 인간이다.
일부 구현예에서, 제2 제제는 치료 항체, 면역관문 억제제, 제2 사이토카인, 화학요법제, 티로신 키나제 억제제 또는 면역세포를 포함한다.
일부 구현예에서, 제2 제제는 치료 항체이다. 일부 구현예에서, 치료 항체는 종양 항원에 결합한다. 일부 구현예에서, 종양 항원은 메소텔린, GPA33, Her-2, EGFR 및 CD20으로 이루어지는 그룹 중에서 선택된다. 일부 구현예에서, 종양 항원은 CEA, MUC16, MUC1, AFP, EPCAM, CD19, CD21, CD22, CD30, CD33, CD37, CD45, PSMA, 및 BCMA로 이루어지는 그룹 중에서 선택된다.
일부 구현예에서, 종양 항원은 메소텔린이다. 일부 구현예에서, 제2 제제는 항-메소텔린 항체 또는 이의 단편이다. 일부 구현예에서, 항-메소텔린 항체 또는 이의 단편은 항-메소텔린 중쇄 가변 영역(항-MSLN VH)을 포함하는 단쇄 항체를 포함하며, 여기에서 항-MSLN VH는 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함하고, 여기에서 a) 서열번호 46의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1, 서열번호 47의 아미노산 서열을 포함하는 CDR2, 및 서열번호 48의 아미노산 서열을 포함하는 CDR3, 또는 상기 CDR들 중 총 3, 2 또는 1개 이하의 아미노산 치환을 포함하는 이의 변이체를 포함하거나; 또는 b) 서열번호 49의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1, 서열번호 50의 아미노산 서열을 포함하는 CDR2, 및 서열번호 51의 아미노산 서열을 포함하는 CDR3, 또는 상기 CDR들 중 총 3, 2 또는 1개 이하의 아미노산 치환을 포함하는 이의 변이체를 포함한다.
일부 구현예에서, 제2 제제는 면역관문 조절제이다. 일부 구현예에서, 면역관문 조절제는 PD-L1, CTLA4, PD-L2, PD-l, CD47, TIGIT, GITR, TIM3, LAG3, 4-1BB, CD27, 및 B7H4로 이루어지는 그룹 중에서 선택된 면역관문 단백질의 억제제이다. 일부 구현예에서, 면역관문 단백질은 PD-1이다. 일부 구현예에서, 제2 제제는 항-PD-1 항체 또는 이의 단편이다.
일부 구현예에서, 제2 제제는 제2 사이토카인이다. 일부 구현예에서, 융합 단백질 중의 사이토카인은 IL-21이며, 여기에서 제2 사이토카인은 IL-7, IL-15, IL15Ra에 결합된 IL15 또는 이의 반감기 연장된 변이체로 이루어지는 그룹 중에서 선택된다.
일부 구현예에서, 제2 제제는 면역세포이다. 일부 구현예에서, 면역세포는 T 세포 또는 NK 세포를 포함한다. 일부 구현예에서, 면역세포는 키메라 항원 수용체(CAR)를 발현하는 T 세포, 변형된 T 세포 수용체(TCR)를 발현하는 T 세포 또는 종양으로부터 단리된 T 세포를 포함한다.
일부 구현예에서, 제2 제제는 티로신 키나제 억제제이다.
일부 구현예서, 제2 제제는 화학요법제(예를 들어 소라페닙)이다.
일부 구현예에서, 개체에게 a) i) IL-21 및 ii) 사이토카인에 융합된 반감기 연장 도메인을 포함하는 융합 단백질; 및 b) 제2 제제를 투여함을 포함하는, 상기 개체에서 질병 또는 상태를 치료하는 방법을 제공한다. 일부 구현예에서, 반감기 연장 도메인은 사이토카인의 N-말단에 융합된다. 일부 구현예에서, 반감기 연장 도메인은 사이토카인의 C-말단에 융합된다. 일부 구현예에서, 제2 제제는 치료 항체(예를 들어 CD20 또는 메소텔린과 같은 종양 항원에 결합하는 치료 항체), 면역관문 억제제(예를 들어 항-PD-1 항체), 제2 사이토카인, 화학요법제, 티로신 키나제 억제제, 또는 면역세포를 포함한다. 일부 구현예에서, 반감기 연장 도메인은 본원에 기재된 바와 같은 항체 또는 이의 단편, 알부민, 결합 단백질(예를 들어 알부민 결합 단백질 또는 IgG 결합 도메인), 항체 유도체, 또는 폴리아미노 서열이다. 일부 구현예에서, 융합 단백질은 항원 결합 모이어티(예를 들어 상술한 바와 같은)를 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 항원 결합 모이어티는 종양 항원(예를 들어 메소텔린)에 결합한다. 일부 구현예에서, 암은 중피종, 폐암, 유방암, 난소암, 췌장암, 림프종(비-호지킨 림프종), 백혈병(예를 들어 급성 골수양 백혈병), 두경부암, 간암, 식도암, 위암 및 결장직장암으로 이루어지는 그룹 중에서 선택된다. 일부 구현예에서, 암은 중피종, 폐암, 난소암 및 위암으로 이루어지는 그룹 중에서 선택된다. 일부 구현예에서, 개체는 인간이다.
일부 구현예에서, 개체에게 a) i) IL-7 및 ii) 사이토카인에 융합된 반감기 연장 도메인을 포함하는 융합 단백질; 및 b) 제2 제제를 투여함을 포함하는, 상기 개체에서 질병 또는 상태를 치료하는 방법을 제공한다. 일부 구현예에서, 반감기 연장 도메인은 사이토카인의 N-말단에 융합된다. 일부 구현예에서, 반감기 연장 도메인은 사이토카인의 C-말단에 융합된다. 일부 구현예에서, 제2 제제는 치료 항체(예를 들어 CD20 또는 메소텔린과 같은 종양 항원에 결합하는 치료 항체), 면역관문 억제제(예를 들어 항-PD-1 항체), 제2 사이토카인, 화학요법제, 티로신 키나제 억제제, 또는 면역세포를 포함한다. 일부 구현예에서, 반감기 연장 도메인은 본원에 기재된 바와 같은 항체 또는 이의 단편, 알부민, 결합 단백질(예를 들어 알부민 결합 단백질 또는 IgG 결합 도메인), 항체 유도체, 또는 폴리아미노 서열이다. 일부 구현예에서, 융합 단백질은 항원 결합 모이어티(예를 들어 상술한 바와 같은)를 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 항원 결합 모이어티는 종양 항원(예를 들어 메소텔린)에 결합한다. 일부 구현예에서, 암은 중피종, 폐암, 유방암, 난소암, 췌장암, 림프종(비-호지킨 림프종), 백혈병(예를 들어 급성 골수양 백혈병), 두경부암, 간암, 식도암, 위암 및 결장직장암으로 이루어지는 그룹 중에서 선택된다. 일부 구현예에서, 암은 중피종, 폐암, 난소암 및 위암으로 이루어지는 그룹 중에서 선택된다. 일부 구현예에서, 개체는 인간이다.
일부 구현예에서, 개체에게 a) i) IL-15 및 ii) 사이토카인에 융합된 반감기 연장 도메인을 포함하는 융합 단백질; 및 b) 제2 제제를 투여함을 포함하는, 상기 개체에서 질병 또는 상태를 치료하는 방법을 제공한다. 일부 구현예에서, 반감기 연장 도메인은 사이토카인의 N-말단에 융합된다. 일부 구현예에서, 반감기 연장 도메인은 사이토카인의 C-말단에 융합된다. 일부 구현예에서, 제2 제제는 치료 항체(예를 들어 CD20 또는 메소텔린과 같은 종양 항원에 결합하는 치료 항체), 면역관문 억제제(예를 들어 항-PD-1 항체), 제2 사이토카인, 화학요법제, 티로신 키나제 억제제, 또는 면역세포를 포함한다. 일부 구현예에서, 반감기 연장 도메인은 본원에 기재된 바와 같은 항체 또는 이의 단편, 알부민, 결합 단백질(예를 들어 알부민 결합 단백질 또는 IgG 결합 도메인), 항체 유도체, 또는 폴리아미노 서열이다. 일부 구현예에서, 융합 단백질은 항원 결합 모이어티(예를 들어 상술한 바와 같은)를 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 항원 결합 모이어티는 종양 항원(예를 들어 메소텔린)에 결합한다. 일부 구현예에서, 암은 중피종, 폐암, 유방암, 난소암, 췌장암, 림프종(비-호지킨 림프종), 백혈병(예를 들어 급성 골수양 백혈병), 두경부암, 간암, 식도암, 위암 및 결장직장암으로 이루어지는 그룹 중에서 선택된다. 일부 구현예에서, 암은 중피종, 폐암, 난소암 및 위암으로 이루어지는 그룹 중에서 선택된다. 일부 구현예에서, 개체는 인간이다.
일부 구현예에서, 개체에게 a) i) IL-15Ra에 결합된 IL-15 또는 이의 단편 및 ii) 사이토카인에 융합된 반감기 연장 도메인을 포함하는 융합 단백질; 및 b) 제2 제제를 투여함을 포함하는, 상기 개체에서 질병 또는 상태를 치료하는 방법을 제공한다. 일부 구현예에서, 반감기 연장 도메인은 사이토카인의 N-말단에 융합된다. 일부 구현예에서, 반감기 연장 도메인은 사이토카인의 C-말단에 융합된다. 일부 구현예에서, 제2 제제는 치료 항체(예를 들어 CD20 또는 메소텔린과 같은 종양 항원에 결합하는 치료 항체), 면역관문 억제제(예를 들어 항-PD-1 항체), 제2 사이토카인, 화학요법제, 티로신 키나제 억제제, 또는 면역세포를 포함한다. 일부 구현예에서, 반감기 연장 도메인은 본원에 기재된 바와 같은 항체 또는 이의 단편, 알부민, 결합 단백질(예를 들어 알부민 결합 단백질 또는 IgG 결합 도메인), 항체 유도체, 또는 폴리아미노 서열이다. 일부 구현예에서, 융합 단백질은 항원 결합 모이어티(예를 들어 상술한 바와 같은)를 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 항원 결합 모이어티는 종양 항원(예를 들어 메소텔린)에 결합한다. 일부 구현예에서, 암은 중피종, 폐암, 유방암, 난소암, 췌장암, 림프종(비-호지킨 림프종), 백혈병(예를 들어 급성 골수양 백혈병), 두경부암, 간암, 식도암, 위암 및 결장직장암으로 이루어지는 그룹 중에서 선택된다. 일부 구현예에서, 암은 중피종, 폐암, 난소암 및 위암으로 이루어지는 그룹 중에서 선택된다. 일부 구현예에서, 개체는 인간이다.
일부 구현예에서, 개체에게 a) i) IL-33 및 ii) 사이토카인에 융합된 반감기 연장 도메인을 포함하는 융합 단백질; 및 b) 제2 제제를 투여함을 포함하는, 상기 개체에서 질병 또는 상태를 치료하는 방법을 제공한다. 일부 구현예에서, 반감기 연장 도메인은 사이토카인의 N-말단에 융합된다. 일부 구현예에서, 반감기 연장 도메인은 사이토카인의 C-말단에 융합된다. 일부 구현예에서, 제2 제제는 치료 항체(예를 들어 CD20 또는 메소텔린과 같은 종양 항원에 결합하는 치료 항체), 면역관문 억제제(예를 들어 항-PD-1 항체), 제2 사이토카인, 화학요법제, 티로신 키나제 억제제, 또는 면역세포를 포함한다. 일부 구현예에서, 반감기 연장 도메인은 본원에 기재된 바와 같은 항체 또는 이의 단편, 알부민, 결합 단백질(예를 들어 알부민 결합 단백질 또는 IgG 결합 도메인), 항체 유도체, 또는 폴리아미노 서열이다. 일부 구현예에서, 융합 단백질은 항원 결합 모이어티(예를 들어 상술한 바와 같은)를 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 항원 결합 모이어티는 종양 항원(예를 들어 메소텔린)에 결합한다. 일부 구현예에서, 암은 중피종, 폐암, 유방암, 난소암, 췌장암, 림프종(비-호지킨 림프종), 백혈병(예를 들어 급성 골수양 백혈병), 두경부암, 간암, 식도암, 위암 및 결장직장암으로 이루어지는 그룹 중에서 선택된다. 일부 구현예에서, 암은 중피종, 폐암, 난소암 및 위암으로 이루어지는 그룹 중에서 선택된다. 일부 구현예에서, 개체는 인간이다.
일부 구현예에서, 개체에게 상술한 바와 같은 IL-21을 포함하는 융합 단백질을 투여함을 포함하는 상기 개체에서 암을 치료하는 방법을 제공한다. 예를 들어 일부 구현예에서, 융합 단백질은 a) IL-21 및 b) 일부민 결합 모이어티(예를 들어 알부민에 결합하는 sdAb)를 포함하며, 여기에서 알부민 결합 모이어티는 IL-21 또는 이의 변이체의 N- 또는 C-말단에 융합된다. 일부 구현예에서, 융합 단백질은 a) 알부민 결합 모이어티에 융합된 IL-21("IL-21-ALBBM") 및 b) 항원 결합 모이어티를 포함하며, 여기에서 사이토카인-ALBBM 및 항원 결합 모이어티간의 연결은 임의로 절단가능하다. 일부 구현예에서, 항원 결합 모이어티는 종양 항원(예를 들어 메소텔린)에 결합한다. 일부 구현예에서, 개체에게 i) IL-21, 및 ii) 반감기 연장 도메인을 포함하는 융합 단백질을 투여함을 포함하는, 상기 개체에서 암을 치료하는 방법을 제공하며, 여기에서 반감기 연장 도메인은 IL-21의 N- 또는 C-말단에 융합된다. 일부 구현예에서, 방법은 제2 제제(예를 들어 CD20 또는 메소텔린과 같은 종양 항원에 결합하는 치료 항체, 화학요법제, 예를 들어 소라페닙, 면역조절제, 예를 들어 항-PD-1 항체)를 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 암은 높은 수준의 종양 항원을 발현한다. 일부 구현예에서, 반감기 연장 도메인은 본원에 기재된 바와 같은 항체 또는 이의 단편, 알부민, 결합 단백질(예를 들어 알부민 결합 단백질 또는 IgG 결합 도메인), 항체 유도체, 또는 폴리아미노 서열이다. 일부 구현예에서, 일부 구현예에서, 암은 중피종, 폐암, 유방암, 난소암, 췌장암, 림프종(비-호지킨 림프종), 백혈병(예를 들어 급성 골수양 백혈병), 두경부암, 간암, 식도암, 위암 및 결장직장암으로 이루어지는 그룹 중에서 선택된다. 일부 구현예에서, 암은 중피종, 폐암, 난소암 및 위암으로 이루어지는 그룹 중에서 선택된다. 일부 구현예에서, 개체는 인간이다.
일부 구현예에서, 개체에게 상술한 바와 같은 IL-7을 포함하는 융합 단백질을 투여함을 포함하는 상기 개체에서 암을 치료하는 방법을 제공한다. 예를 들어 일부 구현예에서, 융합 단백질은 a) IL-7 및 b) 일부민 결합 모이어티(예를 들어 알부민에 결합하는 sdAb)를 포함하며, 여기에서 알부민 결합 모이어티는 IL-7 또는 이의 변이체의 N- 또는 C-말단에 융합된다. 일부 구현예에서, 융합 단백질은 a) 알부민 결합 모이어티에 융합된 IL-7("IL-7-ALBBM") 및 b) 항원 결합 모이어티를 포함하며, 여기에서 사이토카인-ALBBM 및 항원 결합 모이어티간의 연결은 임의로 절단가능하다. 일부 구현예에서, 항원 결합 모이어티는 종양 항원(예를 들어 메소텔린)에 결합한다. 일부 구현예에서, 개체에게 i) IL-7, 및 ii) 반감기 연장 도메인을 포함하는 융합 단백질을 투여함을 포함하는, 상기 개체에서 암을 치료하는 방법을 제공하며, 여기에서 반감기 연장 도메인은 IL-7의 N- 또는 C-말단에 융합된다. 일부 구현예에서, 방법은 제2 제제를 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 암은 높은 수준의 종양 항원을 발현한다. 일부 구현예에서, 반감기 연장 도메인은 본원에 기재된 바와 같은 항체 또는 이의 단편, 알부민, 결합 단백질(예를 들어 알부민 결합 단백질 또는 IgG 결합 도메인), 항체 유도체, 또는 폴리아미노 서열이다. 일부 구현예에서, 암은 중피종, 폐암, 난소암 및 위암으로 이루어지는 그룹 중에서 선택된다. 일부 구현예에서, 개체는 인간이다.
일부 구현예에서, 개체에게 상술한 바와 같은 IL-15를 포함하는 융합 단백질을 투여함을 포함하는 상기 개체에서 암을 치료하는 방법을 제공한다. 예를 들어 일부 구현예에서, 융합 단백질은 a) IL-15 및 b) 일부민 결합 모이어티(예를 들어 알부민에 결합하는 sdAb)를 포함하며, 여기에서 알부민 결합 모이어티는 IL-15 또는 이의 변이체의 N- 또는 C-말단에 융합된다. 일부 구현예에서, 융합 단백질은 a) 알부민 결합 모이어티에 융합된 IL-15("IL-15-ALBBM") 및 b) 항원 결합 모이어티를 포함하며, 여기에서 사이토카인-ALBBM 및 항원 결합 모이어티간의 연결은 임의로 절단가능하다. 일부 구현예에서, 항원 결합 모이어티는 종양 항원(예를 들어 메소텔린)에 결합한다. 일부 구현예에서, 개체에게 i) IL-15, 및 ii) 반감기 연장 도메인을 포함하는 융합 단백질을 투여함을 포함하는, 상기 개체에서 암을 치료하는 방법을 제공하며, 여기에서 반감기 연장 도메인은 IL-15의 N- 또는 C-말단에 융합된다. 일부 구현예에서, 방법은 제2 제제를 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 암은 높은 수준의 종양 항원을 발현한다. 일부 구현예에서, 반감기 연장 도메인은 본원에 기재된 바와 같은 항체 또는 이의 단편, 알부민, 결합 단백질(예를 들어 알부민 결합 단백질 또는 IgG 결합 도메인), 항체 유도체, 또는 폴리아미노 서열이다. 일부 구현예에서, 암은 중피종, 폐암, 난소암 및 위암으로 이루어지는 그룹 중에서 선택된다. 일부 구현예에서, 개체는 인간이다.
일부 구현예에서, 개체에게 상술한 바와 같은 IL-15Ra에 결합하는 IL-15를 포함하는 융합 단백질을 투여함을 포함하는 상기 개체에서 암을 치료하는 방법을 제공한다. 예를 들어 일부 구현예에서, 융합 단백질은 a) IL-15Ra에 결합하는 IL-15 및 b) 일부민 결합 모이어티(예를 들어 알부민에 결합하는 sdAb)를 포함하며, 여기에서 알부민 결합 모이어티는 IL-15Ra에 결합하는 IL-15 또는 이의 변이체의 N- 또는 C-말단에 융합된다. 일부 구현예에서, 융합 단백질은 a) 알부민 결합 모이어티에 융합된 IL-15Ra에 결합된 IL-15("IL-15Ra-ALBBM에 결합된 IL-15") 및 b) 항원 결합 모이어티를 포함하며, 여기에서 사이토카인-ALBBM 및 항원 결합 모이어티간의 연결은 임의로 절단가능하다. 일부 구현예에서, 항원 결합 모이어티는 종양 항원(예를 들어 메소텔린)에 결합한다. 일부 구현예에서, 개체에게 i) IL-15Ra에 결합된 IL-15, 및 ii) 반감기 연장 도메인을 포함하는 융합 단백질을 투여함을 포함하는, 상기 개체에서 암을 치료하는 방법을 제공하며, 여기에서 반감기 연장 도메인은 IL-15Ra에 결합된 IL-15의 N- 또는 C-말단에 융합된다. 일부 구현예에서, 방법은 제2 제제를 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 암은 높은 수준의 종양 항원을 발현한다. 일부 구현예에서, 반감기 연장 도메인은 본원에 기재된 바와 같은 항체 또는 이의 단편, 알부민, 결합 단백질(예를 들어 알부민 결합 단백질 또는 IgG 결합 도메인), 항체 유도체, 또는 폴리아미노 서열이다. 일부 구현예에서, 암은 중피종, 폐암, 난소암 및 위암으로 이루어지는 그룹 중에서 선택된다. 일부 구현예에서, 개체는 인간이다.
일부 구현예에서, 개체에게 상술한 바와 같은 IL-33을 포함하는 융합 단백질을 투여함을 포함하는 상기 개체에서 암을 치료하는 방법을 제공한다. 예를 들어 일부 구현예에서, 융합 단백질은 a) IL-33 및 b) 일부민 결합 모이어티(예를 들어 알부민에 결합하는 sdAb)를 포함하며, 여기에서 알부민 결합 모이어티는 IL-33 또는 이의 변이체의 N- 또는 C-말단에 융합된다. 일부 구현예에서, 융합 단백질은 a) 알부민 결합 모이어티에 융합된 IL-33("IL-33-ALBBM") 및 b) 항원 결합 모이어티를 포함하며, 여기에서 사이토카인-ALBBM 및 항원 결합 모이어티간의 연결은 임의로 절단가능하다. 일부 구현예에서, 항원 결합 모이어티는 종양 항원(예를 들어 메소텔린)에 결합한다. 일부 구현예에서, 개체에게 i) IL-33, 및 ii) 반감기 연장 도메인을 포함하는 융합 단백질을 투여함을 포함하는, 상기 개체에서 암을 치료하는 방법을 제공하며, 여기에서 반감기 연장 도메인은 IL-33의 N- 또는 C-말단에 융합된다. 일부 구현예에서, 방법은 제2 제제를 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 암은 높은 수준의 종양 항원을 발현한다. 일부 구현예에서, 반감기 연장 도메인은 본원에 기재된 바와 같은 항체 또는 이의 단편, 알부민, 결합 단백질(예를 들어 알부민 결합 단백질 또는 IgG 결합 도메인), 항체 유도체, 또는 폴리아미노 서열이다. 일부 구현예에서, 암은 중피종, 폐암, 난소암 및 위암으로 이루어지는 그룹 중에서 선택된다. 일부 구현예에서, 개체는 인간이다.
일부 구현예에서, 개체에게 융합 단백질을 투여함을 포함하는, 상기 개체에서 염증 질병을 치료하는 방법을 제공하며, 여기에서 융합 단백질은 a) IL-22 및 b) 일부민 결합 모이어티(예를 들어 알부민에 결합하는 sdAb)를 포함하고, 여기에서 알부민 결합 모이어티는 IL-22 또는 이의 변이체의 N- 또는 C-말단에 융합된다. 일부 구현예에서, 알부민 결합 모이어티는 본원에 기재된 바와 같은 알부민 결합 도메인 또는 항-알부민 단일 도메인 항체이다. 일부 구현예에서, 개체에게 융합 단백질을 투여함을 포함하는, 상기 개체에서 염증 질병을 치료하는 방법을 제공하며, 여기에서 융합 단백질은 i) IL-22, 및 ii) 반감기 연장 도메인을 포함한다. 일부 구현예에서, 반감기 연장 도메인은 본원에 기재된 바와 같은 항체 또는 이의 단편, 알부민, 결합 단백질(예를 들어 알부민 결합 단백질 또는 IgG 결합 도메인), 항체 유도체, 또는 폴리아미노 서열이다. 일부 구현예에서, 일부 구현예에서, 질병은 궤양성 대장염, 크론병, 또는 궤양성 회장염, 및 장 이식편 대 숙주병으로 이루어지는 그룹 중에서 선택된다. 일부 구현예에서, 개체는 인간이다.
일부 구현예에서, 개체에게 상술한 바와 같은 사이토카인을 포함하는 융합 단백질을 투여함을 포함하는 상기 개체에서 중피종을 치료하는 방법을 제공한다. 예를 들어 일부 구현예에서, 융합 단백질은 a) 사이토카인 및 b) 일부민 결합 모이어티(예를 들어 알부민에 결합하는 sdAb)를 포함하며, 여기에서 알부민 결합 모이어티는 사이토카인의 N- 또는 C-말단에 융합된다. 일부 구현예에서, 융합 단백질은 a) 알부민 결합 모이어티에 융합된 사이토카인("사이토카인-ALBBM") 및 b) 항원 결합 모이어티를 포함하며, 여기에서 사이토카인-ALBBM 및 항원 결합 모이어티간의 연결은 임의로 절단가능하다. 일부 구현예에서, 사이토카인은 IL-21, IL-7, IL-15, IL-15Ra에 결합된 IL-15 또는 이의 단편, IL-33 및 IL-22로 이루어지는 그룹 중에서 선택된다. 일부 구현예에서, 항원 결합 모이어티는 종양 항원(예를 들어 메소텔린)에 결합한다. 일부 구현예에서, 개체에게 i) 사이토카인, 및 ii) 반감기 연장 도메인을 포함하는 융합 단백질을 투여함을 포함하는, 상기 개체에서 중피종을 치료하는 방법을 제공하며, 여기에서 반감기 연장 도메인은 사이토카인의 N- 또는 C-말단에 융합된다. 일부 구현예에서, 방법은 제2 제제(예를 들어 항-메소텔린 항체)를 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 반감기 연장 도메인은 본원에 기재된 바와 같은 항체 또는 이의 단편, 알부민, 결합 단백질(예를 들어 알부민 결합 단백질 또는 IgG 결합 도메인), 항체 유도체, 또는 폴리아미노 서열이다.
일부 구현예에서, 개체에게 상술한 바와 같은 사이토카인을 포함하는 융합 단백질을 투여함을 포함하는 상기 개체에서 폐암을 치료하는 방법을 제공한다. 예를 들어 일부 구현예에서, 융합 단백질은 a) 사이토카인 및 b) 일부민 결합 모이어티(예를 들어 알부민에 결합하는 sdAb)를 포함하며, 여기에서 알부민 결합 모이어티는 사이토카인의 N- 또는 C-말단에 융합된다. 일부 구현예에서, 융합 단백질은 a) 알부민 결합 모이어티에 융합된 사이토카인("사이토카인-ALBBM") 및 b) 항원 결합 모이어티를 포함하며, 여기에서 사이토카인-ALBBM 및 항원 결합 모이어티간의 연결은 임의로 절단가능하다. 일부 구현예에서, 사이토카인은 IL-21, IL-7, IL-15, IL-15Ra에 결합된 IL-15 또는 이의 단편, IL-33 및 IL-22로 이루어지는 그룹 중에서 선택된다. 일부 구현예에서, 항원 결합 모이어티는 종양 항원에 결합한다. 일부 구현예에서, 개체에게 i) 사이토카인, 및 ii) 반감기 연장 도메인을 포함하는 융합 단백질을 투여함을 포함하는, 상기 개체에서 폐암을 치료하는 방법을 제공하며, 여기에서 반감기 연장 도메인은 사이토카인의 N- 또는 C-말단에 융합된다. 일부 구현예에서, 방법은 제2 제제를 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 반감기 연장 도메인은 본원에 기재된 바와 같은 항체 또는 이의 단편, 알부민, 결합 단백질(예를 들어 알부민 결합 단백질 또는 IgG 결합 도메인), 항체 유도체, 또는 폴리아미노 서열이다.
일부 구현예에서, 개체에게 상술한 바와 같은 사이토카인을 포함하는 융합 단백질을 투여함을 포함하는 상기 개체에서 난소암을 치료하는 방법을 제공한다. 예를 들어 일부 구현예에서, 융합 단백질은 a) 사이토카인 및 b) 일부민 결합 모이어티(예를 들어 알부민에 결합하는 sdAb)를 포함하며, 여기에서 알부민 결합 모이어티는 사이토카인의 N- 또는 C-말단에 융합된다. 일부 구현예에서, 융합 단백질은 a) 알부민 결합 모이어티에 융합된 사이토카인("사이토카인-ALBBM") 및 b) 항원 결합 모이어티를 포함하며, 여기에서 사이토카인-ALBBM 및 항원 결합 모이어티간의 연결은 임의로 절단가능하다. 일부 구현예에서, 사이토카인은 IL-21, IL-7, IL-15, IL-15Ra에 결합된 IL-15 또는 이의 단편, IL-33 및 IL-22로 이루어지는 그룹 중에서 선택된다. 일부 구현예에서, 항원 결합 모이어티는 종양 항원에 결합한다. 일부 구현예에서, 개체에게 i) 사이토카인, 및 ii) 반감기 연장 도메인을 포함하는 융합 단백질을 투여함을 포함하는, 상기 개체에서 난소암을 치료하는 방법을 제공하며, 여기에서 반감기 연장 도메인은 사이토카인의 N- 또는 C-말단에 융합된다. 일부 구현예에서, 방법은 제2 제제를 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 반감기 연장 도메인은 본원에 기재된 바와 같은 항체 또는 이의 단편, 알부민, 결합 단백질(예를 들어 알부민 결합 단백질 또는 IgG 결합 도메인), 항체 유도체, 또는 폴리아미노 서열이다.
일부 구현예에서, 개체에게 상술한 바와 같은 사이토카인을 포함하는 융합 단백질을 투여함을 포함하는 상기 개체에서 위암을 치료하는 방법을 제공한다. 예를 들어 일부 구현예에서, 융합 단백질은 a) 사이토카인 및 b) 일부민 결합 모이어티(예를 들어 알부민에 결합하는 sdAb)를 포함하며, 여기에서 알부민 결합 모이어티는 사이토카인의 N- 또는 C-말단에 융합된다. 일부 구현예에서, 융합 단백질은 a) 알부민 결합 모이어티에 융합된 사이토카인("사이토카인-ALBBM") 및 b) 항원 결합 모이어티를 포함하며, 여기에서 사이토카인-ALBBM 및 항원 결합 모이어티간의 연결은 임의로 절단가능하다. 일부 구현예에서, 사이토카인은 IL-21, IL-7, IL-15, IL-15Ra에 결합된 IL-15 또는 이의 단편, IL-33 및 IL-22로 이루어지는 그룹 중에서 선택된다. 일부 구현예에서, 항원 결합 모이어티는 종양 항원에 결합한다. 일부 구현예에서, 개체에게 i) 사이토카인, 및 ii) 반감기 연장 도메인을 포함하는 융합 단백질을 투여함을 포함하는, 상기 개체에서 위암을 치료하는 방법을 제공하며, 여기에서 반감기 연장 도메인은 사이토카인의 N- 또는 C-말단에 융합된다. 일부 구현예에서, 방법은 제2 제제를 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 반감기 연장 도메인은 본원에 기재된 바와 같은 항체 또는 이의 단편, 알부민, 결합 단백질(예를 들어 알부민 결합 단백질 또는 IgG 결합 도메인), 항체 유도체, 또는 폴리아미노 서열이다.
일부 구현예에서, 개체에게 a) 상술한 바와 같은 IL-21을 포함하는 융합 단백질 및 b) IL-7, IL-15, IL-15Ra에 결합된 IL-15 또는 이의 반감기 연장된 변이체를 투여함을 포함하는 상기 개체에서 암을 치료하는 방법을 제공한다. 예를 들어 일부 구현예에서, 융합 단백질은 a) IL-21 및 b) 알부민 결합 모이어티(예를 들어 알부민에 결합하는 sdAb)를 포함하며, 여기에서 알부민 결합 모이어티는 IL-21 또는 이의 변이체의 N- 또는 C-말단에 융합된다. 일부 구현예에서, 융합 단백질은 a) 알부민 결합 모이어티에 융합된 IL-21("IL-21-ALBBM") 및 b) 항원 결합 모이어티를 포함하며, 여기에서 사이토카인-ALBBM 및 항원 결합 모이어티간의 연결은 임의로 절단가능하다. 일부 구현예에서, 항원 결합 모이어티는 종양 항원(예를 들어 메소텔린)에 결합한다. 일부 구현예에서, 개체에게 a) i) IL-21, 및 ii) 반감기 연장 도메인을 포함하는 융합 단백질(여기에서 반감기 연장 도메인은 IL-21의 N- 또는 C-말단에 융합된다); b) IL-7, IL-15, IL-15Ra에 결합된 IL-15 또는 이의 반감기 연장된 변이체로 이루어지는 그룹 중에서 선택된 제2 제제를 투여함을 포함하는, 상기 개체에서 암을 치료하는 방법을 제공한다. 일부 구현예에서, 반감기 연장 도메인은 본원에 기재된 바와 같은 항체 또는 이의 단편, 알부민, 결합 단백질(예를 들어 알부민 결합 단백질 또는 IgG 결합 도메인), 항체 유도체, 또는 폴리아미노 서열이다. 일부 구현예에서, 제1 연장된 반감기 사이토카인은 펩티드 링커를 통해 제2 연장된 반감기 사이토카인에 융합되며, 상기 링커는 임의로 프로테아제 절단가능하다. 일부 구현예에서, 암은 중피종, 폐암, 유방암, 난소암, 췌장암, 림프종(비-호지킨 림프종), 백혈병(예를 들어 급성 골수양 백혈병), 두경부암, 간암, 식도암, 위암 및 결장직장암으로 이루어지는 그룹 중에서 선택된다. 일부 구현예에서, 암은 중피종, 폐암, 난소암 및 위암으로 이루어지는 그룹 중에서 선택된다. 일부 구현예에서, 개체는 인간이다.
질병 치료를 위한 융합 단백질
일부 구현예에서, 질병 또는 상태의 치료를 위한 융합 단백질은 본원(예를 들어 섹션 II에서)에 기재된 융합 단백질 중 어느 하나를 포함한다. 일부 구현예에서, 융합 단백질은 i) 사이토카인 및 ii) 사이토카인에 융합된 반감기 연장 도메인을 포함한다. 일부 구현예에서, 반감기 연장 도메인은 사이토카인의 C-말단에 융합된다. 일부 구현예에서, 반감기 연장 도메인은 사이토카인의 N-말단에 융합된다. 일부 구현예에서, 사이토카인 및 반감기 연장 도메인은 링커를 통해 연결된다. 일부 구현예에서, 링커는 본원(예를 들어 섹션 II-B에서)에 기재된 임의의 링커일 수 있다. 일부 구현예에서, 사이토카인은 IL-21, IL-7, IL-15, IL-15Ra에 결합된 IL-15 또는 이의 단편, IL-33 및 IL-22로 이루어지는 그룹 중에서 선택된다. 일부 구현예에서, 사이토카인은 IL-21이다.
반감기 연장 도메인
일부 구현예에서, 본원에 기재된 바와 같은 질병 또는 상태의 치료를 위한 융합 단백질은 반감기 연장 도메인을 포함한다.
일부 구현예에서, 본원에 제공된 융합 단백질은 항체 및 이의 단편, 알부민, 알부민-결합 단백질, IgG-결합 단백질, 및 폴리아미노산 서열로 이루어지는 그룹 중에서 선택된 반감기 연장 도메인을 포함한다. 당해 분야에서 입수할 수 있는 융합 단백질의 반감기를 연장시키기 위한 다른 기전을 또한 사용할 수 있을 것으로 생각된다.
a) 항체 및 이의 단편
사이토카인을, FcRn-매개된 재순환이 가능한 항체 또는 이의 단편에 연결시킴으로써, 피실험자로부터의 사이토카인의 제거를 감소시키거나 달리 지연시킬 수 있으며, 이에 의해 상기 투여된 사이토카인의 반감기를 연장시킬 수 있다.
일부 구현예에서, 반감기 연장 도메인은 항체 또는 이의 단편을 포함한다. 일부 구현예에서, 항체 또는 이의 단편은 FcRn-매개된 재순환이 가능한 임의의 항체 또는 이의 단편, 예를 들어 FcRn-매개된 재순환이 가능한 임의의 중쇄 폴리펩티드 또는 이의 부분(예를 들어 Fc 도메인 또는 이의 단편)이다. 당해 분야에서, FcRn-매개된 재순환은 FcRn 수용체의 항체 또는 이의 단편의 Fc 영역에의 결합을 필요로 하는 것으로 인식된다. 예를 들어, 연구는 잔기 1253, S254, H435, 및 Y436(Rabat EU 지수 넘버링 시스템에 따른 넘버링)이 인간 Fc 영역과 인간 FcRn 복합체간의 상호작용에 중요함을 입증하였다. 예를 들어, 문헌: Firan, M., et al., Int. Immunol. 13 (2001) 993-1002; Shields, R.L., et al, J. Biol. Chem. 276 (2001) 6591-6604를 참조하시오. 잔기 248-259, 301-317, 376-382, 및 424-437(Rabat EU 지수 넘버링 시스템에 따른 넘버링)이 또한 검사되고 보고되었다. Yeung, Y.A., et al. (J. Immunol. 182 (2009) 7667-7671.
일부 구현예에서, 항체 또는 이의 단편은 중쇄 폴리펩티드 또는 경쇄 폴리펩티드를 포함한다. 일부 구현예에서, 항체 또는 이의 단편은 중쇄 폴리펩티드 또는 경쇄 폴리펩티드 중 어느 하나의 일부를 포함한다. 일부 구현예에서, 항체 또는 이의 단편은 Fc 도메인 또는 이의 단편을 포함한다. 일부 구현예에서, 항체 또는 이의 단편은 CH2 및 CH3 도메인 또는 이의 단편을 포함한다. 일부 구현예에서, 항체 또는 이의 단편은 중쇄 폴리펩티드의 불변 영역을 포함한다. 일부 구현예에서, 항체 또는 이의 단편은 경쇄 폴리펩티드의 불변 도메인을 포함한다. 일부 구현예에서, 항체 또는 이의 단편은 중쇄 폴리펩티드 또는 이의 단편(예를 들어 Fc 도메인 또는 이의 단편)을 포함한다. 일부 구현예에서, 항체 또는 이의 단편은 경쇄 폴리펩티드를 포함한다.
일부 구현예에서, 항체 또는 이의 단편은 Fc 도메인 또는 이의 단편을 포함한다. 일부 구현예에서, Fc 단편은 IgG1, IgG2, IgG3 및 IgG4 Fc 단편 또는 이의 변이체로 이루어지는 그룹 중에서 선택된다. 일부 구현예에서, Fc 단편은 IgG1 Fc 단편 또는 이의 변이체이다. 일부 구현예에서, IgG1 Fc 단편 또는 이의 변이체는 297번 위치에 돌연변이를 포함한다. 일부 구현예에서, 297번 위치의 아미노산은 아스파라진이다. 일부 구현예에서, 297번 위치의 아미노산(예를 들어 아스파라진)을 알라닌, 아스파트산 또는 글리신으로 돌연변이시킨다.
일부 구현예에서, 융합 단백질의 사이토카인은 상기 사이토카인의 제2 사본의 상응하는 반감기 연장 도메인과 디설파이드 결합을 형성하는 사이토카인의 하나의 사본의 반감기 연장 도메인에 의해 이량체를 형성한다.
b) 알부민
알부민은 이의 크기 및 FcRn-매개된 재순환에 대한 이의 감수성(세포내 분해를 방지한다)으로 인해 대략 3주의 연장된 혈청 반감기를 갖는 천연 담체 단백질이다. 따라서, 사이토카인을 알부민에 연결시키는 것은 상기 사이토카인의 반감기를 크게 연장시킬 수 있다. 상기 접근법은 치료학적으로 이로운 단백질의 혈장 반감기를 연장시키는 것으로 간주되었다. 예를 들어 WO 2001/079271A1 및 WO 2003/59934A2(이들의 내용은 본원에 참고로 인용된다)를 참조하시오. HSA의 몇몇 동형을 표 2에 나열하였다.
일부 구현예에서, 융합 단백질은 알부민 폴리펩티드 또는 이의 단편 또는 변이체(본원에서 이후에 "알부민" 또는 "알부민 폴리펩티드"라 칭한다)의 반감기 연장 도메인을 포함한다. 본원에 사용되는 바와 같이, "알부민" 및 "알부민 폴리펩티드"란 용어는 알부민의 단편뿐만 아니라 알부민의 변이체를 포함한다. 알부민 폴리펩티드는 아미노-말단 및 카복시-말단을 포함한다. 알부민 폴리펩티드는 임의의 알부민 폴리펩티드, 및 이의 임의의 단편 또는 변이체, 예를 들어 WO 2001/079271A1; WO 2003/59934A2; US20160152686A1; WO 2012/059486; WO 2011/124718; US20070048282(이들의 내용은 본원에 참고로 인용된다)에 기재된 임의의 알부민 폴리펩티드일 수 있다. 일부 구현예에서, 알부민 폴리펩티드는 HSA이다.
c) 결합 단백질
혈청 중 사이토카인 또는 이의 변이체의 반감기를 연장시키기 위한 추가적인 전략은 사이토카인을 몇몇 결합 단백질, 예를 들어 상술한 바와 같은 알부민-결합 단백질 또는 IgG-결합 단백질에 연결시킴을 포함한다. 결합 단백질은 연장된 반감기를 갖는 혈청 단백질, 예를 들어 알부민 또는 IgG에 결합하는 임의의 단백질일 수 있다. 알부민 및 IgG는 혈청 중에서 긴 반감기를 갖는 것으로 공지된 폴리펩티드이다.
일부 구현예에서, 반감기 연장 도메인은 알부민 결합 단백질을 포함한다. 일부 구현예에서, 융합 단백질은 하나 초과의 알부민 결합 단백질을 포함하며, 이들은 각각 본원에 기재된 알부민 결합 단백질 중 임의의 것일 수 있다.
일부 구현예에서, 알부민 결합 단백질은 본원에 기재된 바와 같은, 알부민에 결합하거나 또는 달리 결합하는 단일 도메인 항체 또는 이의 단편, 예를 들어 나노바디이다. 예를 들어 WO 2004041865A2 및 US20070269422A1(이들의 내용은 본원에 참고로 인용된다)을 참조하시오.
결합 단백질의 또 다른 예는 IgG-결합 단백질이다. IgG-결합 단백질은 보고되었다. 특정한 IgG-결합 단백질 및 이의 용도를 포함한, IgG-결합 단백질의 개요에 대해서, 문헌[Choe et al. (2016) Materials 9(12): 994](이의 내용은 본원에 참고로 인용된다)를 참조하시오.
d) 항체 유도체
본원에 기재된 사이토카인을 한편으로, 비제한적으로 scFv, scFc, 이중-가변 도메인(DVD) 및 CrossMab 접근법에 기반한 항체 유도체를 포함하는 다양한 항체 유도체에 연결시킬 수 있다. 예를 들어 문헌[Klein et al. (2012), MAbs, 4(6): 653-663]; US20070071675A1을 참조하시오. 항체 유도체는 이중특이성 항체 또는 이의 단편으로서 조작된 항체 유도체를 포함한다. 이와 같이, 일부 구현예에서, 반감기 연장 도메인은, 비제한적으로 scFv, scFc, 이중-가변 도메인(DVD), CrossMab 접근법에 기반한 항체 유도체, 및 이중특이성 항체 또는 이의 단편을 포함하는 임의의 항체 유도체, 변이체 또는 이의 융합 생성물을 포함할 수 있다.
e) 폴리아미노산 서열
혈청 중 융합 단백질의 반감기를 연장시키기 위한 추가적인 전략은 융합 단백질을 폴리아미노산 서열에 연결시킴에 의한다. 이와 같이, 일부 구현예에서, 반감기 연장 도메인은 폴리아미노산 서열을 포함한다. 폴리아미노산 서열은 융합 단백질에 연결시 혈청 중 융합 단백질의 반감기를 연장시킬 수 있는 임의의 폴리아미노산 서열일 수 있다. 폴리아미노산 서열의 예는 PAS 폴리펩티드 및 XTEN 폴리펩티드를 포함한다.
f) PEG화 및 글리코실화
본원에 제공된 사이토카인의 반감기를 연장시키기 위한 추가적인 전략은 PEG화 및 추가적인 글리코실화 부위의 조작을 포함한다. 이들 각각의 전략을 하기에 더욱 상세히 논의한다.
"PEG화"는 분자 및 거대구조물, 예를 들어 약물, 치료 단백질, 폴리펩티드, 항체, 항체 단편, 항체 유도체, 또는 본원에 제공된 융합 단백질 또는 성분 중 어느 하나(예를 들어 융합 단백질의 반감기 연장 도메인 및/또는 융합 단백질의 사이토카인 또는 이의 기능성 단편)에 폴리에틸렌 글리콜(PEG) 중합체 쇄의 공유 또는 비-공유 부착 또는 아말감화의 과정이다. PEG화의 이득은 예를 들어 (1) 분자의 겉보기 크기를 사구체 여과 한계 이상으로 증가시키는 중합체의 결과로서 신장 제거의 회피로 인한, 및/또는 세포 제거 기전의 회피를 통한 현저하게 개선된 생체내 순환 반감기, (2) PEG가 부착된 분자의 감소된 항원성 및 면역원성, (3) 개선된 약역학, (4) 개선된 용해도, (5) 개선된 제형 및 투여 옵션, (6) 피하 주사 부위에서 감소된 손실을 통한 개선된 생물학적 이용효능, (7) PEG화된 분자의 개선된 열적 및 기계적 안정성을 포함한다.
다양한 분자 및 거대구조물의 peg화 방법은 당해 분야에 주지되어 있다. 예를 들어 하기의 문헌을 참조하시오: ETS20140256636A1; Fee and Damodaran (2010) European Pharmaceutical Review, 15(1): 18-26; Chapman et al. (1999) Nature Biotechnok, 17: 780-783; Yang et al. (2003), Protein Eng., 16(10): 761-770; Chapman, Adv. Drug. Deliv. Rev. (2002), 54(4): 531-545(이들의 내용은 본원에 참고로 인용된다).
"글리코실화"는 사카라이드 또는 글리코실기의 폴리펩티드에의 부가를 지칭한다. 폴리펩티드의 글리코실화는 전형적으로 N-연결되거나 O-연결된다. N-연결된은 탄수화물 부분의 아스파라진 잔기의 측쇄에의 부착을 지칭한다. 트리펩티드 서열 아스파라진-X-세린(N-X-S) 및 아스파라진-X-쓰레오닌(N-X-T)(여기에서 X는 프롤린(P)을 제외한 임의의 아미노산이다)은 탄수화물 부분의 아스파라진 측쇄에의 효소적 부착을 위한 인식 서열이다. 따라서, 폴리펩티드 중의 이들 트리펩티드 서열 중 어느 하나의 존재는 잠재적인 글리코실화 부위를 생성시킨다. O-연결된 글리코실화는 당(예를 들어 N-아세틸갈락토스아민, 갈락토스, 또는 자일로스) 중 하나의 하이드록시아미노산, 가장 통상적으로는 세린 또는 쓰레오닌에의 부착을 지칭하지만, 5-하이드록시프롤린 또는 5-하이드록시리신도 또한 사용될 수 있다.
천연 글리코실화는 단백질의 분자 안정성을 증가시키는 것으로 입증되었다. 예를 들어 문헌[Sola et al. (2007), Cell. Mol. Life Sci., 64(16): 2133-2152]를 참조하시오. 추가적인 글리코실화 부위의 조작이 대부분의 주요 물리화학적 불안정성에 대해서 다양한 단백질 치료제들을 안정화시키는 것으로 또한 입증되었다. 예를 들어 문헌[Sola and Griebenow (2009), J. Pharm. Sci., 98(4): 1223-1245]를 참조하시오. 글리코실화에 의해 개선되는 것으로 입증된 약학적으로 관련된 단백질 불안정성은 예를 들어 산화; 가교결합; pH-, 화학적-, 열적-, 및 동결-유발된 변성/풀림; 침전; 동역학적 활성화; 및 응집이다. Id.
융합 단백질에의 글리코실화 부위의 부가는 편의상, 상술한 트리펩티드 서열(N-연결된 글리코실화 부위에 대한) 중 하나 이상이 융합 단백질의 아미노산 서열 중에(예를 들어 반감기 연장 도메인 및/또는 사이토카인 또는 이의 기능성 단편의 아미노산 서열 중에) 생성되도록 아미노산 서열을 변경시킴으로써 수행된다. 변경은 또한, 융합 단백질의 아미노산 서열 중에(예를 들어 반감기 연장 도메인 및/또는 사이토카인 또는 이의 기능성 단편의 아미노산 서열 중에)(O-연결된 글리코실화 부위에 대한) 하나 이상의 세린 또는 쓰레오닌 잔기에의 부가 또는 상기 잔기의 치환에 의해 이루어질 수 있다.
g) 이종이량체화 변형
본원에 기재된 반감기 연장 도메인은 2개의 상이한 반감기 연장 도메인의 이종이량체화를 촉진하는 하나 이상의 변형을 포함할 수 있다. 제1 반감기 연장 도메인 및 제2 반감기 연장 도메인을 포함하는 일부 구현예에서, 정확한 이종이량체성 형태의 융합 단백질의 생성이 효율적으로 생성되도록 상기 제1 및 제2 반감기 연장 도메인의 이종이량체화를 촉진시키는 것이 바람직할 수 있다. 이와 같이, 문헌[Klein et al. (2012), MAbs, 4(6): 653-663]에 기재된 바와 같은 임의의 전략을 포함하여, 당해 분야에서 입수할 수 있는 임의의 전략을 사용하여 하나 이상의 아미노산 변형을 제1 반감기 연장 도메인에 대해 수행하고 하나 이상의 아미노산 변형을 제2 반감기 연장 도메인에 대해 수행할 수 있다.
2개의 상이한 반감기 연장 도메인의 이종이량체화를 촉진하기 위한 한 가지 전략은 "구멍에 손잡이"라 칭하는 접근법이다. 일부 구현예에서, 융합 단백질은 제1 반감기 연장 도메인 및 제2 반감기 연장 도메인을 포함하며, 이들은 각각 CH3 도메인을 포함한다. 일부 구현예에서, CH3 도메인을 포함하는 반감기 연장 도메인은 중쇄 폴리펩티드 또는 이의 단편(예를 들어 Fc 도메인 또는 이의 단편)이다. 상기 두 반감기 연장 도메인의 CH3 도메인을 "구멍에 손잡이" 기술에 의해 변경시킬 수 있으며, 상기 기술은 다수의 예가 예를 들어 하기의 문헌에 상세히 기재되어 있다: WO 1996/027011; Ridgway, J.B. et al., Protein Eng. (1996) 9(7): 617-621; Merchant, A.M., et al., Nat. Biotechnol. (1998) 16(7): 677-681. 또한 문헌[Klein et al. (2012), MAbs, 4(6): 653-663]을 참조하시오. 구멍에 손잡이 방법을 사용하여, 상기 두 CH3 도메인의 상호작용 표면을, 2개의 변경된 CH3 도메인을 함유하는 2개의 반감기 연장 도메인의 이종이량체화를 증가시키도록 변경시킨다. 이는 벌키한 잔기를 반감기 연장 도메인 중 하나의 CH3 도메인내에 도입시킴으로써("손잡이"로서 작용한다) 발생한다. 이어서, 벌키한 잔기를 수용하기 위해서, 손잡이를 수용할 수 있는 다른 반감기 연장 도메인 중에 "구멍"을 형성시킨다. 변경된 CH3 도메인 중 어느 하나는 "손잡이"일 수 있는 반면 다른 하나는 "구멍"일 수 있다. 디설파이드 가교의 도입은 이종이량체를 더욱 안정화시킬 뿐만 아니라(Merchant, A.M., et al., Nat. Biotechnol. (1998) 16(7); Atwell, S., et al., J. Mol. Biol. (1997) 270(1): 26-35) 수율을 증가시킨다. "손잡이" 및 "구멍"으로서의 작용을 촉진하는 예시적인 서열이 개시되어 있으며, 예를 들어 서열번호 164-167의 서열 중에 포함된 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, CH3 도메인은 Y349C, T366S, L368A, Y407V, S354C, T366W 중에서 선택된 하나 이상의 돌연변이를 갖는다.
2개의 상이한 반감기 연장 도메인의 이종이량체화를 촉진하기 위한 또 다른 전략은 하전된 잔기의 변형을 통해 이종이량체화에 유리한 이온성 상호작용의 안정화에 의한다. 일부 구현예에서, 융합 단백질은 제1 반감기 연장 도메인 및 제2 반감기 연장 도메인을 포함하며, 이들은 각각 CH3 도메인을 포함한다. 일부 구현예에서, CH3 도메인을 포함하는 반감기 연장 도메인은 중쇄 폴리펩티드 또는 이의 단편(예를 들어 Fc 도메인 또는 이의 단편)이다. 2개의 상이한 Fc 도메인간의 전하 극성의 변경은, 동종이량체화는 억제되면서 이종이량체화에 유리한 이온성 상호작용을 생성시킬 수 있는 것으로 밝혀졌다. 예를 들어 WO 2006/106905A1; 문헌[Gunasekaran et al. (2010) 285(25): 19637-19646]을 참조하시오. 예를 들어, Fc 도메인의 음으로 하전된 E356 쌍은 또 다른 Fc 도메인의 양으로 하전된 K439와 짝을 이루고, 제1 Fc 도메인의 음으로 하전된 E357, E357, 및 D399는 제2 Fc 도메인의 양으로 하전된 K439, K370 및 K409와 각각 짝을 이루는 것으로 밝혀졌다. WO 2006/106905A1; 문헌[Gunasekaran et al. (2010) 285(25): 19637-19646]을 참조하시오. 이와 같이, 제1 Fc 도메인에 E356K, E357K, 및 D399K의 돌연변이, 및 제2 Fc 도메인내에 돌연변이 K370E, K409D, 및 K439E 중 적어도 2개를 도입시킴으로써, 동종이량체 형성은 억제하면서 효율적인 이종이량체화를 성취할 수 있다. Id. 효율적인 이종이량체화는 제1 Fc 쇄에 K392D 및 K409K 돌연변이를 도입시키고, 제2 Fc 쇄에 D399K 및 E356K 돌연변이를 도입시킴으로써 성취되었다. Gunasekaran et al. (2010) 285(25): 19637-19646.
2개의 상이한 반감기 연장 도메인의 이종이량체화를 촉진하기 위한 또 다른 전략은 이종이량체화를 촉진하고/하거나 동종이량체화를 억제할 수 있는 변경을 식별하기 위한 구조- 및 서열-기반 접근법의 사용에 의한다. 이종이량체화를 촉진하는 변경을 식별하는 방법 중에, 문헌[Moore et al. (2011) 3(6): 546-557](이의 내용은 본원에 참고로 인용된다)에서 고려된 접근법과 같이, CH3-CH3 이량체 계면을 가로질러 상호작용하는 잔기에 대한 대응된 변이체 조합의 에너지를 측정하는 구조 계산을 수행함에 의한 것이 있다. Moore 등은, 추가의 분석을 위한 출발점으로서 동종이량체 형태에 비해 이종이량체 형태에서 더 낮은 에너지를 갖는 것으로 예상되는 쌍을 식별하였다. 89%의 이종이량체화 수율이, 제1 Fc 도메인 중에 S364H 및 F405A 돌연변이를 도입시키고 제2 Fc 도메인 중에 Y349T 및 T394F 돌연변이를 도입시킴으로써 성취될 수 있는 것으로 밝혀졌다. Id.
질병 또는 질환
본원에 기재된 방법을 사용하여 질병 또는 질환을 치료할 수 있다. 일부 구현예에서, 질병 또는 질환은 암, 염증 상태 및 감염으로 이루어지는 그룹 중에서 선택된다.
일부 구현예에서, 질병 또는 상태는 염증 질병이다. 일부 구현예에서, 질병은 궤양성 대장염, 크론병, 또는 궤양성 회장염, 및 장 이식편 대 숙주병으로 이루어지는 그룹 중에서 선택된다.
일부 구현예에서, 질병 또는 상태는 염증 질병이다. 일부 구현예에서, 암은 고형 또는 액체 종양이다. 일부 구현예에서, 암은 중피종, 폐암, 유방암, 난소암, 췌장암, 림프종(비-호지킨 림프종), 백혈병(예를 들어 급성 골수양 백혈병), 두경부암, 간암, 식도암, 위암 및 결장직장암으로 이루어지는 그룹 중에서 선택된다. 일부 구현예에서, 암은 중피종, 폐암, 난소암 및 위암으로 이루어지는 그룹 중에서 선택된다.
투여 섭생
융합 단백질 및/또는 제2 제제를 개체에게 임의의 적합한 투여량 및 투여 경로를 사용하여 투여할 수 있다. 일부 구현예에서, 융합 단백질 및/또는 제2 제제를 개체에게 비경구로 투여한다. 투여 경로는 공지되고 허용되는 방법에 따른다, 예를 들어 일정시간에 걸쳐, 적합한 방식으로, 단일 또는 수회 일시주사 또는 주입에 의한다, 예를 들어 피하, 정맥내, 복강내, 근육내, 동맥내, 병변내, 관절내, 종양내 또는 경구 경로에 의한 주사 또는 주입에 의한다.
일부 구현예에서, 융합 단백질 및 제2 제제를 동시에, 동반하여 또는 순차적으로 개체에게 투여한다.
적합한 투여량 또는 투여 경로의 결정은 통상적인 숙련가의 기술내에 있다. 동물 실험은 인간 진단 적용에 대한 유효 용량의 결정을 위한 신뢰할만한 안내를 제공한다. 유효 용량의 종간 스케일링을 하기의 문헌에 규정된 원리에 따라 수행할 수 있다: Mordenti, J. and Chappell, W.“Use of Interspecies Scaling in Toxicokinetics," In Toxicokinetics and New Drug Development, Yacobi et al ., Eds, Pergamon Press, New York 1989, pp. 42-46.
일부 구현예에서, 융합 단백질을 3주마다 약 1회 내지 1주일에 약 2회(예를 들어 3주마다 약 1회 내지 2주마다 약 1회, 2주마다 약 1회 내지 매주 약 1회, 매주 약 1회 내지 1주일에 약 2회) 투여한다. 일부 구현예에서, 융합 단백질을 3주마다 약 1회, 2주마다 약 1회, 매주 약 1회, 1주일에 약 2회 이상 투여한다. 일부 구현예에서, 융합 단백질을 3주마다 약 1회, 2주마다 약 1회, 매주 약 1회, 1주일에 약 2회 이하로 투여한다. 일부 구현예에서, 융합 단백질을 3주마다 약 1회, 2주마다 약 1회, 매주 약 1회, 1주일에 약 2회 투여한다.
일부 구현예에서, 융합 단백질을 각각의 치료 주기에 대해 적어도 약 1주 내지 6개월(예를 들어 1주일 내지 2, 3 또는 4주일, 1주일 내지 1, 2, 3, 4, 5, 또는 6개월, 1개월 내지 2, 3, 4, 5 또는 6개월, 3개월 내지 4, 5, 또는 6개월) 동안 투여한다.
일부 구현예에서, 각각의 투여에 대한 융합 단백질의 양은 약 100 ng/kg 내지 약 10 ㎎/kg(예를 들어 약 100 ng/㎏ 내지 약 500 ng/㎏, 약 500 ng/㎏ 내지 약 1 pg/㎏, 약 1 pg/㎏ 내지 약 5 pg/㎏, 약 5pg/㎏ 내지 약 10 pg/㎏, 약 10 pg/㎏ 내지 약 50 pg/㎏, 약 50 pg/㎏ 내지 약 100 pg/㎏, 약 100 pg/㎏ 내지 약 500 pg/㎏ , 약 500 pg/㎏ 내지 약 1 ㎎/㎏, 약 1 ㎎/㎏ 내지 약 5 ㎎/㎏, 약 5 ㎎/㎏ 내지 약 10 ㎎/㎏)이다.
일부 구현예에서, 제2 제제(예를 들어 메소텔린 또는 PD-1의 억제제에 결합하는 치료 항체)를 개월당 약 1회 내지 주당 약 2회(예를 들어 개월당 약 1회 내지 1개월에 2, 3 또는 4회, 2주마다 약 1회, 3주마다 약 1회, 매주 약 1회, 또는 매주 2회) 투여한다.
일부 구현예에서, 각각의 투여에 대한 제2 제제(예를 들어 메소텔린 또는 PD-1의 억제제에 결합하는 치료 항체)의 양은 약 100 ng/㎏ 내지 약 100 ㎎/㎏(예를 들어 약 100 ng/㎏ 내지 약 500 ng/㎏, 약 500 ng/㎏ 내지 약 1 pg/㎏, 약 1 pg/㎏ 내지 약 5 pg/㎏, 약 5 pg/㎏ 내지 약 10 pg/㎏, 약 10 pg/㎏ 내지 약 50 pg/㎏, 약 50 pg/㎏ 내지 약 100 pg/㎏, 약 100 pg/㎏ 내지 약 500 pg/㎏ , 약 500 pg/㎏ 내지 약 1 ㎎/㎏, 약 1 ㎎/㎏ 내지 약 5 ㎎/㎏, 약 5 ㎎/㎏ 내지 약 10 ㎎/㎏, 약 10 ㎎/㎏ 내지 약 50 ㎎/㎏, 또는 약 50 ㎎/㎏ 내지 약 100 ㎎/㎏)이다.
V. 제조 방법
본원에 기재된 융합 단백질 및 본원에 기재된 융합 단백질의 성분(예를 들어 알부민 결합 모이어티, 사이토카인 또는 이의 변이체, 항원 결합 모이어티)을 당해 분야의 임의의 공지된 단백질 발현 및 정제 방법에 의해 제조할 수 있다.
일부 구현예에서, 본원은 융합 단백질, 알부민 결합 모이어티, 사이토카인 또는 이의 변이체, 또는 항원 결합 모이어티 중 어느 하나의 폴리펩티드 쇄 중 하나 이상을 암호화하는 단리된 핵산을 제공한다. 일부 구현예에서, 단리된 핵산은 서열번호 46-51 및 60-95의 아미노산 서열 중 어느 하나를 암호화하는 핵산 서열을 포함한다.
일부 구현예에서, 단리된 핵산을 벡터, 예를 들어 발현 벡터, 바이러스 벡터, 클로닝 벡터내에 삽입한다. 핵산의 발현을 위해서, 벡터를 숙주 세포내에 도입시켜 숙주세포내에서의 핵산 발현을 허용할 수 있다. 발현 벡터는 발현 조절을 위한 다양한 요소, 예를 들어 비제한적으로 프로모터 서열, 전사 개시 서열, 인헨서 서열, 선택성 마커 및 신호 서열을 함유할 수 있다. 상기 서열을 당해 분야의 숙련가에 의해 적합한 대로 선택할 수 있다. 예를 들어, 프로모터 서열은 벡터 중 폴리뉴클레오티드의 전사를 촉진하기 위해 선택될 수 있다. 적합한 프로모터 서열은 비제한적으로 T7 프로모터, T3 프로모터, SP6 프로모터, 베타-액틴 프로모터, EF1a 프로모터, CMV 프로모터, 및 SV40 프로모터를 포함한다. 인헨서 서열은 핵산의 전사를 증대시키기 위해 선택될 수 있다. 선택성 마커는, 예를 들어 벡터가 없는 숙주세포로부터 벡터가 삽입된 숙주 세포의 선택을 허용하기 위해 선택될 수 있으며, 예를 들어 선택성 마커는 항생제 내성을 부여하는 유전자일 수 있다. 신호 서열은 발현된 폴리펩티드가 숙주세포 밖으로 수송되도록 하기 위해서 선택될 수 있다. 일부 구현예에서, 핵산 분자는 신호 펩티드를 암호화하는 핵산 서열을 추가로 포함한다.
일부 구현예에서, 상술한 벡터를 함유하는 단리된 숙주 세포를 제공한다. 벡터를 함유하는 숙주 세포는 단리된 핵산의 발현 또는 클로닝에 유용할 수 있다. 적합한 숙주 세포는 비제한적으로 원핵생물 세포, 진균 세포, 효모 세포, 또는 포유동물 세포와 같은 보다 고등의 진핵생물 세포를 포함할 수 있다. 원핵생물 세포, 예를 들어 이 콜라이에서 항체 및 항원-결합 단편의 발현은 당해 분야에 잘 확립되어 있다. 리뷰를 위해서 예를 들어 문헌[Pluckthun, A. BioTechnology 9: 545-551 (1991)]을 참조하시오. 배양물 중 진핵생물 세포에서의 발현은 또한 항체 또는 이의 항원-결합 단편의 생성을 위한 옵션으로서 당해 분야의 숙련가들에게 이용가능하며, 최근의 리뷰, 예를 들어 하기의 문헌을 참조하시오: Ref, M. E. (1993) Curr. Opinion Biotech. 4: 573-576; Trill J. J. et al. (1995) Curr. Opinion Biotech 6: 553-560. 보다 고등의 진핵생물 세포, 특히 다세포 유기체로부터 유래된 세포를 글리코실화된 폴리펩티드의 발현에 사용할 수 있다. 적합한 보다 고등의 진핵생물 세포는 비제한적으로 무척추동물 세포 및 곤충 세포, 및 척추동물 세포를 포함한다.
벡터를 당해 분야에 공지된 임의의 적합한 방법, 예를 들어 비제한적으로 DEAE-덱스트란 매개된 전달, 칼슘 포스페이트 침전 방법, 양이온성 지질 매개된 전달, 리포솜 매개된 형질감염, 일렉트로포레이션, 미립자가속장치 충격, 수용체-매개된 유전자 전달, 폴리리신, 히스톤, 키토산 및 펩티드에 의해 매개된 전달을 사용하여 숙주세포에 도입시킬 수 있다. 관심 벡터의 발현을 위한 세포의 표준 형질감염 및 형질전환 방법은 당해 분야에 주지되어 있다. 일부 구현예에서, 숙주 세포는 제1 폴리펩티드를 암호화하는 제1 벡터 및 제2 폴리펩티드를 암호화하는 제2 벡터를 포함한다. 일부 구현예에서, 숙주세포는 제1 폴리펩티드 및 제2 폴리펩티드를 암호화하는 단리된 핵산을 포함하는 단일 벡터를 포함한다.
일부 구현예에서, 본원은 융합 단백질, 알부민 결합 모이어티, 사이토카인 또는 이의 변이체, 또는 본원에 기재된 항원 결합 모이어티 중 어느 하나의 발현 방법을 제공하며, 상기 방법은 벡터를 함유하는 단리된 숙주세포를 배양하고, 세포 배양물로부터 융합 단백질, 알부민 결합 모이어티, 사이토카인 또는 이의 변이체, 또는 항원 결합 모이어티를 회수함을 포함한다. 단리된 숙주세포를, 벡터에 삽입된 단리된 핵산의 발현을 허용하는 조건하에서 배양한다. 폴리뉴클레오티드의 적합한 발현 조건은 비제한적으로 적합한 배지, 배양 배지 중 숙주세포의 적합한 밀도, 필수 영양분의 존재, 보충인자의 존재, 적합한 온도 및 습도, 및 미생물 오염물질의 부재를 포함할 수 있다. 당해 분야의 통상적인 숙련가는 발현 목적에 적합한 조건을 선택할 수 있다.
발현된 폴리펩티드(들)를 임의의 적합한 방법을 사용하여 수집할 수 있다. 폴리펩티드(들)는 세포내에서, 주변세포질 공간에서 발현되거나 또는 세포 밖에서 배지내로 분비될 수 있다. 폴리펩티드가 세포내에서 발현되는 경우, 폴리펩티드를 함유하는 숙주세포를 용해시키고 폴리펩티드를, 원심분리 또는 한외여과에 의해 불필요한 찌꺼기를 제거함으로써 용해물로부터 단리할 수 있다. 폴리펩트디가 이 콜라이의 주변세포질 공간내로 분비되는 경우, 세포 페이스트를 나트륨 아세테이트(pH 3.5), EDTA, 및 페닐메틸설포닐플루오라이드(PMSF)와 같은 제제의 존재하에서 약 30분간 해동시키고, 세포 찌꺼기를 원심분리에 의해 제거할 수 있다(Carter et al., BioTechnology 10: 163-167 (1992)). 폴리펩티드가 배지내로 분비되는 경우, 세포 배양물의 상등액을 수집하고 상업적으로 입수할 수 있는 단백질 농축 필터, 예를 들어 Amincon 또는 Millipore Pellicon 한외여과 유닛을 사용하여 농축시킬 수 있다. 프로테아제 억제제 및/또는 항생제를 상기 수집 및 농축 단계에 포함시켜 단백질 분해 및/또는 오염된 미생물의 생육을 억제할 수 있다.
발현된 폴리펩티드(들)를 적합한 방법, 예를 들어 비제한적으로 친화성 크로마토그래피, 하이드록시아파타이트 크로마토그래피, 크기 배제 크로마토그래피, 젤 전기영동, 투석, 이온 교환 컬럼상에서의 이온 교환 분별, 에탄올 침전, 역상 HPLC, 실리카상 크로마토그래피, 헤파린 세파로스상 크로마토그래피, 음이온 또는 양이온 교환 수지상 크로마토그래피(예를 들어 폴리아스파트산 컬럼), 등전점크로마토그래피, SDS-PAGE, 및 암모늄 설페이트 침전에 의해 추가로 정제시킬 수 있다(리뷰를 위해서 문헌:Bonner, P. L., Protein purification, published by Taylor & Francis. 2007; Janson, J. C., et al, Protein purification: principles, high resolution methods and applications, published by Wiley -VCH, 1998을 참조하시오).
일부 구현예에서, 폴리펩티드를 친화성 크로마토그래피에 의해 정제시킬 수 있다. 일부 구현예에서, 단백질 A 크로마토그래피 또는 단백질 A/G(단백질 A 및 단백질 G의 융합 단백질) 크로마토그래피가 항체 CH2 도메인 및/또는 CH3 도메인 및/또는 VH 및/또는 VHH로부터 유래된 성분을 포함하는 폴리펩티드의 정제에 유용할 수 있다(Lindmark et al., J. Immunol. Meth. 62: 1-13 (1983)); Zettlit, K. A., Antibody Engineering, Part V, 531-535, 2010; Fridy et al. 2015. Analytical Biochemistry 477, 92-94; Henry et al. 2016. PLoS One. 2016; 11(9): e0l63 H3). 일부 구현예에서, 단백질 G 크로마토그래피는 IgG γ3 중쇄를 포함하는 폴리펩티드 및/또는 폴리펩티드 복합체의 정제에 유용할 수 있다(Guss et al., EMBO J. 5: 1567 1575 (1986)). 일부 구현예에서, 단백질 L 크로마토그래피는 κ 경쇄를 포함하는 폴리펩티드 및/또는 폴리펩티드 복합체의 정제에 유용할 수 있다(Sudhir, P., Antigen engineering protocols, Chapter 26, published by Humana Press, 1995; Nilson, B. H. K. at al, J. Biol. Chem., 267, 2234-2239 (1992)). 친화성 리간드가 부착되는 기질은 가장 흔히는 아가로스이나, 다른 기질도 이용할 수 있다. 기계적으로 안정한 기질, 예를 들어 조절된 기공 유리 또는 폴리(스티렌디비닐)벤젠은 아가로스에 의해 성취될 수 있는 것보다 더 빠른 유속 및 더 짧은 처리 시간을 허용한다. 항체가 CH3 도메인을 포함하는 경우, Bakerbond ABX 수지(J. T. Baker, Phillipsburg, N. J.)가 정제에 유용하다.
VI. 제조 물품 및 키트
본 발명의 일부 구현예에서, 개체에게 융합 단백질을 투여하기 위한, 상기 개체에서 질병 또는 상태(예를 들어 암 또는 염증 질병)의 치료에 유용한 물질을 함유하는 제조 물품을 제공한다. 제조 물품은 용기 및 상기 용기상에 또는 상기 용기와 결합된 표지 또는 패키지 삽입물을 포함할 수 있다. 적합한 용기는 예를 들어 병, 바이알, 주사기 등을 포함한다. 용기는 다양한 물질, 예를 들어 유리 또는 플라스틱으로부터 형성될 수 있다. 일반적으로, 용기는 본원에 기재된 질병 또는 질환의 치료에 유효한 조성물을 유지하며 멸균 접근 포트를 가질 수 있다(예를 들어 용기는 피하주사바늘에 의해 관통될 수 있는 마개를 갖는 정맥내 용액 주머니 또는 바이알일 수 있다). 조성물 중의 적어도 하나의 활성제는 본원에 기재된 융합 단백질이다. 표지 또는 패키지 삽입물은 조성물이 특정 상태의 치료에 사용됨을 가리킨다. 표지 또는 패키지 삽입물은 환자에게 융합 단백질을 투여하기 위한 설명서를 추가로 포함할 것이다. 본원에 기재된 병용 요법을 포함하는 제조 물품 및 키트가 또한 고려된다.
패키지 삽입물은 치료 제품의 사용에 관한 적응증, 용법, 투여량, 투여, 배합금기, 및/또는 상기와 같은 치료 제품의 사용에 관한 경고에 관한 정보를 함유하는 상기 치료 제품의 상업적인 패키지안에 통상적으로 포함된 설명서를 지칭한다. 일부 구현예에서, 패키지 삽입물은 조성물이 질병 또는 상태(예를 들어 암 또는 염증 질병)의 치료에 사용됨을 가리킨다.
추가로, 제조 물품은 약학적으로 허용 가능한 완충제, 예를 들어 주사용 정균수(BWFI), 포스페이트 완충된 염수, 링거액 및 덱스트로스 용액을 포함하는 제2 용기를 추가로 포함할 수 있다. 상기는 상업적인 및 사용자 관점에서 바람직한 다른 물질, 예를 들어 다른 완충제, 희석제, 필터, 바늘 및 주사기를 추가로 포함할 수 있다.
다양한 목적, 예를 들어 본원에 기재된 질병 또는 상태(예를 들어 암 또는 염증 질병)의 치료에 유용한, 임의로 제조 물품과 함께 개체에게 융합 단백질을 투여하기 위한 키트를 또한 제공한다. 본 발명의 키트는 융합 단백질 조성물을 포함하는 하나 이상의 용기(또는 단위 투여형 및/또는 제조 물품)을 포함하며, 일부 구현예에서 본원에 기재된 방법 중 어느 하나에 따라 사용하기 위한 또 다른 제제(예를 들어 본원에 기재된 제제) 및/또는 설명서를 추가로 포함한다. 키트는 치료에 적합한 개체의 선택에 대한 설명을 추가로 포함할 수 있다. 본 발명의 키트 중에 공급된 설명서는 전형적으로 표지 또는 패키지 삽입물상의 서면 설명서(예를 들어 키트 중에 포함된 종이 시트)이나, 기계-판독가능한 설명서(예를 들어 자기 또는 광학 저장 디스크상에 실린 설명서)가 또한 허용될 수 있다.
예를 들어, 일부 구현예에서, 키트는 융합 단백질을 포함하는 조성물을 포함한다. 일부 구현예에서, 키트는 a) 융합 단백질을 포함하는 조성물, 및 b) 유효량의 본원에 기재된 바와 같은 적어도 하나의 다른 제제를 포함한다. 일부 구현예에서, 키트는 a) 융합 단백질을 포함하는 조성물, 및 b) 치료를 위해 개체에게 융합 단백질 조성물을 투여하기 위한 설명서를 포함한다. 일부 구현예에서, 키트는 a) 융합 단백질을 포함하는 조성물, b) 유효량의 본원에 기재된 바와 같은 적어도 하나의 다른 제제, 및 c) 치료를 위해 개체에게 융합 단백질 조성물 및 다른 제제(들)를 투여하기 위한 설명서를 포함한다. 융합 단백질 및 다른 제제(들)는 별도의 용기 또는 단일 용기 중에 존재할 수 있다. 예를 들어, 키트는 하나의 별개의 조성물 또는 2개 이상의 조성물(하나의 조성물은 융합 단백질을 포함하고 다른 조성물은 또 다른 제제를 포함한다)을 포함할 수 있다.
본 발명의 키트는 적합한 패키징 중에 있다. 적합한 패키징은 비제한적으로 바이알, 병, 단지, 가요성 패키징(예를 들어 밀봉된 Mylar 또는 플라스틱 주머니) 등을 포함한다. 키트는 임의로 추가적인 성분, 예를 들어 완충제 및 설명이 제공된 정보를 제공할 수 있다. 따라서 본원은 바이알(예를 들어 밀봉 바이알), 병, 단지, 가요성 패키징 등을 포함하는 제조 물품을 또한 제공한다.
융합 단백질 조성물의 용도와 관련된 설명서는 일반적으로 의도된 치료를 위한 투여량, 투여 스케줄, 및 투여 경로에 관한 정보를 포함한다. 용기는 단위 용량, 벌크 패키지(예를 들어 수회-용량 패키지) 또는 서브유닛 용량일 수 있다. 예를 들어, 연장된 기간, 예를 들어 1주일, 8일, 9일, 10일, 11일, 12일, 13일, 2주, 3주, 4주, 6주, 8주, 3개월, 4개월, 5개월, 7개월, 8개월, 9개월 또는 그 이상 중 어느 하나의 기간 동안 개체의 유효 치료를 제공하기에 충분한 투여량의 본원에 개시된 바와 같은 융합 단백질을 함유하는 키트를 제공할 수 있다. 키트는 또한 융합 단백질 및 약학 조성물의 다수의 단위 용량 및 사용 설명서를 포함할 수 있으며 보관에, 및 약국, 예를 들어 병원 약국 및 조제 약국에서 사용하기에 충분한 양으로 패키징될 수 있다.
당해 분야의 숙련가는 다수의 구현예가 본 발명의 범위 및 진의내에서 가능함을 알 것이다. 이제 본 발명을 하기의 비제한적인 실시예를 참조하여 보다 상세히 기재할 것이다. 하기의 실시예는 본 발명을 추가로 예시하나, 이의 범위를 어떠한 방식으로도 제한하는 것으로서 해석해서는 안 됨은 물론이다.
예시적인 구현예
1. a) 사이토카인 및 b) 알부민 결합 모이어티(예를 들어 알부민에 결합하는 sdAb)를 포함하는 융합 단백질로, 여기에서 사이토카인은 IL-21, IL-7, IL-15, IL-15Ra에 결합된 IL-15 또는 이의 단편, IL-33 및 IL-22로 이루어지는 그룹 중에서 선택된다.
2. a) 알부민 결합 모이어티에 융합된 사이토카인("사이토카인-ALBBM") 및 b) 항원 결합 모이어티를 포함하는 융합 단백질로, 여기에서 사이토카인-ALBBM과 항원 결합 모이어티간의 결합은 임의로 절단가능하다.
3. 제2항에 있어서, 사이토카인이 IL-21, IL-7, IL-15, IL-15Ra에 결합된 IL-15 또는 이의 단편, IL-33 및 IL-22로 이루어지는 그룹 중에서 선택되는 융합 단백질.
4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 사이토카인이 IL-21인 융합 단백질.
5. 제4항에 있어서, IL-21이 서열번호 1, 2, 126, 171 또는 172의 아미노산 서열 또는 서열번호 1, 2, 126, 171 또는 172에 적어도 약 80%의 서열 동일성을 포함하는 이의 변이체를 포함하는 융합 단백질.
6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 알부민 결합 모이어티가 인간 혈청 알부민(HSA) 및/또는 키노몰구스 원숭이 혈청 알부민(CMSA)에 결합하는 융합 단백질.
7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 알부민 결합 모이어티가 알부민 결합 도메인(ABD)을 포함하는 융합 단백질.
8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 알부민 결합 도메인이 서열번호 3-11로 이루어지는 그룹 중에서 선택된 아미노산 서열 또는 서열번호 3-11 중 어느 하나에 적어도 약 80%의 서열 동일성을 포함하는 이의 변이체를 포함하는 융합 단백질.
9. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 알부민 결합 모이어티가 단일 도메인 항체(sdAb)를 포함하는 융합 단백질.
10. 제9항에 있어서, sdAb가 VHH 단일 도메인 항체인 융합 단백질.
11. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 알부민 결합 모이어티가 사이토카인의 C-말단에 융합되는 융합 단백질.
12. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 알부민 결합 모이어티가 사이토카인의 N-말단에 융합되는 융합 단백질.
13. 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 사이토카인 및 알부민 결합 모이어티가 제1 링커를 통해 연결되는 융합 단백질.
14. 제13항에 있어서, 제1 링커가 약 1 내지 30 아미노산의 길이를 갖는 융합 단백질.
15. 제13항 또는 제14항에 있어서, 제1 링커가 서열번호 12-26 및 158-159로 이루어지는 그룹 중에서 선택되는 융합 단백질.
16. 제2항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, 항원 결합 모이어티가 사이토카인-ALBBM의 C-말단에 융합되는 융합 단백질.
17. 제2항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, 항원 결합 모이어티가 사이토카인-ALBBM의 N-말단에 융합되는 융합 단백질.
18. 제2항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, 항원 결합 모이어티가 제2 링커를 통해 사이토카인-ALBBM에 융합되는 융합 단백질.
19. 제18항에 있어서, 제2 링커가 약 1 내지 30 아미노산의 길이를 갖는 융합 단백질.
20. 제18항 또는 제19항에 있어서, 제2 링커가 절단가능한 융합 단백질.
21. 제20항에 있어서, 절단가능한 링커가 기질 메탈로프로테아제, 레구마인, 매트립타제, 또는 유로키나제 민감성인 융합 단백질.
22. 제18항 내지 제21항 중 어느 한 항에 있어서, 제2 링커가 서열번호 12-45 및 158-159로 이루어지는 그룹 중에서 선택되는 융합 단백질.
23. 제2항 내지 제22항 중 어느 한 항에 있어서, 항원 결합 모이어티가 종양 항원에 결합하는 융합 단백질.
24. 제23항에 있어서, 종양 항원이 메소텔린("MSLN"), GPA33, Her-2, EGFR 및 CD20으로 이루어지는 그룹 중에서 선택되는 융합 단백질.
25. 제23항에 있어서, 종양 항원이 CEA, MUC16, MUC1, AFP, EPCAM, CD19, CD21, CD22, CD30, CD33, CD37, CD45, PSMA, 및 BCMA로 이루어지는 그룹 중에서 선택되는 융합 단백질.
26. 제2항 내지 제25항 중 어느 한 항에 있어서, 항원 결합 모이어티가 항체 또는 이의 단편인 융합 단백질.
27. 제2항 내지 제26항 중 어느 한 항에 있어서, 항원 결합 모이어티가 단일 도메인 항체(sdAb)를 포함하는 융합 단백질.
28. 제27항에 있어서, 항원 결합 모이어티가 VHH 단일 도메인 항체를 포함하는 융합 단백질.
29. 제27항에 있어서, sdAb가 메소텔린에 결합하는 융합 단백질.
30. 제1항 내지 제29항 중 어느 한 항의 융합 단백질을 포함하는 약학 조성물.
31. 개체에게 제1항 내지 제29항 중 어느 한 항의 융합 단백질 또는 제30항의 약학 조성물을 투여함을 포함하는, 상기 개체에서 질병 또는 상태를 치료하는 방법.
32. 제31항에 있어서, 제2 제제를 투여함을 추가로 포함하는 방법.
33. 개체에게 a) i) 사이토카인 및 ii) 사이토카인에 융합된 반감기 연장 도메인을 포함하는 융합 단백질; 및 b) 제2 제제를 투여함을 포함하는, 상기 개체에서 질병 또는 상태를 치료하는 방법.
34. 제33항에 있어서, 반감기 연장 도메인이 알부민 결합 모이어티인 방법.
35. 제33항에 있어서, 반감기 연장 도메인이 알부민인 방법.
36. 제33항에 있어서, 반감기 연장 도메인이 Fc 단편인 방법.
37. 제36항에 있어서, Fc 단편이 IgG1, IgG2, IgG3 및 IgG4 Fc 단편 또는 이의 변이체로 이루어지는 그룹 중에서 선택되는 방법.
38. 제37항에 있어서, Fc 단편이 IgG1 Fc 단편 또는 이의 변이체인 방법.
39. 제38항에 있어서, IgG1 Fc 단편 또는 이의 변이체가 297번 위치에 돌연변이를 포함하며, 여기에서 297번 위치의 아미노산이 알라닌, 아스파트산 또는 글리신으로 돌연변이되는 방법.
40. 제31항 내지 제39항 중 어느 한 항에 있어서, 개체가 인간인 방법.
41. 제31항 내지 제40항 중 어느 한 항에 있어서, 질병 또는 상태가 암, 염증 상태, 및 감염으로 이루어지는 그룹 중에서 선택되는 방법.
42. 제41항에 있어서, 질병 또는 상태가 염증 질병인 방법.
43. 제42항에 있어서, 사이토카인이 IL-22인 방법.
44. 제42항 또는 제43항에 있어서, 질병이 궤양성 대장염, 크론병, 또는 궤양성 회장염, 및 장 이식편대 숙주병으로 이루어지는 그룹 중에서 선택되는 방법.
45. 제41항에 있어서, 질병 또는 상태가 암인 방법.
46. 제45항에 있어서, 암이 고형 또는 액체 종양인 방법.
47. 제45항에 있어서, 암이 중피종, 폐암, 유방암, 난소암, 췌장암, 림프종, 백혈병, 두경부암, 간암, 식도암, 위암 및 결장직장암으로 이루어지는 그룹 중에서 선택되는 방법.
48. 제47항에 있어서, 암이 중피종, 폐암, 난소암 및 위암으로 이루어지는 그룹 중에서 선택되는 방법.
49. 제45항 내지 제48항 중 어느 한 항에 있어서, 사이토카인이 IL-21, IL-7, IL-15, IL-15Ra에 결합된 IL-15 또는 이의 단편, 및 IL-33으로 이루어지는 그룹 중에서 선택되는 방법.
50. 제31항 내지 제49항 중 어느 한 항에 있어서, 융합 단백질을 대략 3주마다 1회 내지 1주일에 2회 투여하는 방법.
51. 제31항 내지 제50항 중 어느 한 항에 있어서, 각각의 투여를 위한 융합 단백질의 양이 약 100 ng/㎏ 내지 약 10 ㎎/㎏인 방법.
52. 제31항 내지 제51항 중 어느 한 항에 있어서, 융합 단백질을 개체에게 비경구로 투여하는 방법.
53. 제52항에 있어서, 융합 단백질을 개체에게 정맥내로 또는 피하로 투여하는 방법.
54. 제31항 내지 제53항 중 어느 한 항에 있어서, 융합 단백질을 각각의 치료 주기에 대해서 적어도 약 1주일 내지 6개월 동안 투여하는 방법.
55. 제32항 내지 제54항 중 어느 한 항에 있어서, 제2 제제가 치료 항체, 면역관문 억제제, 제2 사이토카인, 화학요법제, 티로신 키나제 억제제, 또는 면역세포를 포함하는 방법.
56. 제55항에 있어서, 제2 제제가 치료 항체인 방법.
57. 제56항에 있어서, 치료 항체가 종양 항원에 결합하는 방법.
58. 제57항에 있어서, 종양 항원이 메소텔린(MSLN), GPA33, Her-2(ERBB2), EGFR, 및 CD20(MS4A1)로 이루어지는 그룹 중에서 선택되는 방법.
59. 제57항에 있어서, 종양 항원이 CEA, MUC16, MUC1, AFP, EPCAM, CD19, CD21, CD22, CD30, CD33, CD37, CD45, PSMA, 및 BCMA로 이루어지는 그룹 중에서 선택되는 방법.
60. 제59항에 있어서, 종양 항원이 메소텔린인 방법.
61. 제60항에 있어서, 제2 제제가 항-메소텔린 항체 또는 이의 단편인 방법.
62. 제61항에 있어서, 항-메소텔린 항체 또는 이의 단편이 항-메소텔린 중쇄 가변 영역(항-MSLN VH)을 포함하는 단쇄 항체를 포함하며, 여기에서
a) 항-MSLN VH가 서열번호 46의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1, 서열번호 47의 아미노산 서열을 포함하는 CDR2, 및 서열번호 48의 아미노산 서열을 포함하는 CDR3, 또는 상기 CDR들 중 총 3, 2 또는 1개 이하의 아미노산 치환을 포함하는 이의 변이체를 포함하거나; 또는
b) 항-MSLN VH가 서열번호 49의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1, 서열번호 50의 아미노산 서열을 포함하는 CDR2, 및 서열번호 51의 아미노산 서열을 포함하는 CDR3, 또는 상기 CDR들 중 총 3, 2 또는 1개 이하의 아미노산 치환을 포함하는 이의 변이체를 포함하는 방법.
63. 제60항 내지 제62항 중 어느 한 항에 있어서, 메소텔린에 결합하는 제2 제제를 개월당 약 1회 내지 주당 약 2회 투여하는 방법.
64. 제60항 내지 제63항 중 어느 한 항에 있어서, 각각의 투여에 대한 제2 제제의 양이 약 100 ng/㎏ 내지 약 100 ㎎/㎏인 방법.
65. 제55항에 있어서, 제2 제제가 면역관문 조절제인 방법.
66. 제65항에 있어서, 면역관문 조절제가 PD-L1, CTLA4, PD-L2, PD-l, 4-1BB, CD47, TIGIT, GITR, TIM3, LAG3, CD27, 및 B7H4로 이루어지는 그룹 중에서 선택된 면역관문 단백질의 억제제인 방법.
67. 제66항에 있어서, 면역관문 단백질이 PD-1인 방법.
68. 제67항에 있어서, 제2 제제가 항-PD-1 항체 또는 이의 단편인 방법.
69. 제67항 또는 제68항에 있어서, 각각의 투여에 대한 제2 제제의 양이 약 1 ㎍/㎏ 내지 약 100 ㎎/㎏인 방법.
70. 제55항에 있어서, 제2 제제가 제2 사이토카인인 방법.
71. 제70항에 있어서, 융합 단백질 중의 사이토카인이 IL-21이며, 제2 사이토카인이 IL-7, IL-15, IL15Ra에 결합된 IL15 또는 이의 반감기 연장된 변이체로 이루어지는 그룹 중에서 선택되는 방법.
72. 제55항에 있어서, 제2 제제가 면역세포인 방법.
73. 제72항에 있어서, 면역세포가 T 세포 또는 NK 세포를 포함하는 방법.
74. 제73항에 있어서, 면역세포가 키메라 항원 수용체(CAR)를 발현하는 T 세포, 변형된 T 세포 수용체(TCR)를 발현하는 T 세포 또는 종양으로부터 단리된 T 세포를 포함하는 방법.
75. 제55항에 있어서, 제2 제제가 티로신 키나제 억제제인 방법.
76. 제32항 내지 제75항 중 어느 한 항에 있어서, 제2 제제를 개체에게 비경구로 또는 경구로 투여하는 방법.
77. 제76항에 있어서, 제2 제제를 개체에게 비경구로 투여하는 방법.
78. 제77항에 있어서, 제2 제제를 개체에게 정맥내로 투여하는 방법.
79. 제32항 내지 제78항 중 어느 한 항에 있어서, 융합 단백질 및 제2 제제를 개체에게 동시에, 동반하여 또는 순차적으로 투여하는 방법.
실시예
하기의 실시예는 순수하게 본원의 예시임이 의도되며 따라서 상기가 본원을 임의의 방식으로 제한하는 것으로 간주해서는 안 된다. 하기의 실시예 및 상세한 설명은 예시로서 제공되며 제한으로서 제공되지 않는다.
실시예 1: 예시적인 IL-21 융합 단백질
본 실시예는 본원에 제공된 몇몇 예시적인 IL-21 융합 단백질을 예시한다. 본 실시예에 기재된 예시적인 IL-21 융합 단백질이 본 발명의 전체 범위를 나타내고자 하는 것은 아님은 물론이다.
본원에 사용되는 IL-21-(HSA 결합 분자)-(항-MSLN)은 몇몇 예시적인 IL-융합 단백질을 나타내며, 1) IL-21 또는 이의 변이체, 예를 들어 트렁케이트된 IL-21; 2) 인간 혈청 알부민(HSA)에 결합하는 펩티드(예를 들어 ABD 또는 sdAb); 3) 종양 항원 메소텔린(MSLN)을 표적화하는 하나 이상의 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 4) IL-21의 C-말단 및 aHSA의 N-말단을 연결하는 4-20 아미노산으로 구성된 제1 링커(L1); 및 5) aHSA의 C-말단 및 항-MSLN의 N-말단을 연결하는 4-20 아미노산으로 구성된 제2 링커(L2)를 포함한다.
IL-21은 서열번호 1의 아미노산 서열을 가질 수 있다. 한편으로, IL-21은 서열번호 2의 아미노산 서열을 갖는 트렁케이트된 인간 IL-21일 수 있다.
HSA 결합 펩티드에 대한 몇 개의 옵션을 나열하는 서열을 참조하시오(서열번호 3 내지 서열번호 11).
예시적인 L1 및 L2 링커는 서열번호 12-45 및 158-159 중에서 독립적으로 선택될 수 있다.
몇몇 예시적인 IL-21 융합 단백질에서, 항-MSLN 기능성 모듈은 메소텔린의 상이한 도메인을 표적화하는 2개의 단일 도메인 항체(sdAb)를 포함하며 상기 2개의 sdAb는 4-20 아미노산으로 구성된 제3 링커(L3)에 의해 연결된다. L3 링커는 서열번호 14 및 19-22 중에서 선택될 수 있다.
본 실시예의 예시적인 IL-21 융합 단백질의 설계는 상술한 IL-21 융합 단백질의 다양한 성분들의 모든 가능한 조합을 고려한다.
실시예 2: 항-MSLN 단일 도메인 항체의 생성
2개의 상이한 항원 펩티드를 사용하여 라마를 면역시켜 항-MSLN 단일 도메인 항체(VHH 항체)를 생성시켰다. 제1 항원 펩티드(MSLN 항원 1)는 세포막 고정된 MSLN을 나타낸다. 제2 항원 펩티드(MSLN 항원 2)는 세포막 고정된 MSLN의 C-말단을 나타낸다. 이들 두 펩티드의 서열은 하기와 같다:
NSLN 항원 1(MSLN 절단된 형태)
Figure pct00005
MSLN 항원 2(MSLN C-말단)
Figure pct00006
면역화 후에, 말초 단핵세포(PBMC)를 RNA 추출을 위해 단리하였다. VHH 항체 파지 디스플레이 라이브러리를 항체 유전자를 암호화하는 mRNA/cDNA로 구성하였다. 구성된 파지 디스플레이 라이브러리를 수회 라운드의 항원과의 친화성 결합을 통해 선별하였다. 양성 클론을 ELISA를 통해 식별하였다. 양성 클론의 항체 유전자를 서열분석하고 CHO 세포 발현을 위해 UCOE 벡터(EMD Millipore)내로 클로닝하였다.
예시적인 항-MSLN 단일 도메인(VHH) 항체를 하기 표 4에 나열한다. 예시적인 항-MSLN 단일 도메인 항체의 CDR 서열을 하기 표 5에 나열한다.
[표 4]
Figure pct00007
Figure pct00008
[표 5]
Figure pct00009
실시예 3: IL-21 융합 단백질의 분자 클로닝
올리고뉴클레오티드 합성
예시적인 올리고뉴클레오티드 합성 과정을 하기에 기재한다. 인간 IL-21 완전길이(서열번호 1), 인간 IL-21 트렁케이트된(서열번호 2), G148-ABD-wt(서열번호 3), 저 면역원성 G148-ABD 변이체(서열번호 4-11), HSA를 표적화하는 인간화된 sdAb, 및 MSLN을 표적화하는 인간화된 sdAb(예를 들어 표 4에 나열된 것들)를 암호화하는 cDNA 서열들을, NgoMIV 제한 효소 부위 및 5'에 부가된 코작 서열 및 3'에 부가된 Sall 제한 효소 부위와 함께 GeneArt 유전자 합성(ThermoFisher Scientific) 또는 gBlocks 유전자 단편(Integrated DNA Technologies)을 사용하는 유전자 합성에 의해 획득하였다. 이들 유전자의 코돈 용법을 중국 햄스터 난소(CHO) 세포에서의 발현에 대해 최적화하였다. 합성된 올리고뉴클레오티드를 NgoMIV/Sall 절단-결찰 방법에 의해 UCOE 발현 벡터 CETl0l9-AS-Puro(CS221284, Millipore Sigma)내에 삽입하였다.
IL-21 융합 단백질 발현 벡터의 구성
IL-21 융합 단백질 발현 벡터의 구성을 본원에 예시한다. IL-21의 C-말단을 펩티드 링커(L1)를 통해 알부민 결합 도메인 또는 알부민 결합 sdAb(aHSA)의 N-말단에 융합시키고, 알부민 결합 도메인 또는 알부민 결합 sdAb의 C-말단을 제2 펩티드 링커(L2)를 통해 메소텔린 결합 sdAb(항-MSLN)와 융합시켰다. 이들 폴리펩티드를 암호화하는 DNA 서열을 Gibson 조립(Synthetic Genomics) 또는 유사한 시험관내 재조합 방법에 의해 함께 무솔기(seamlessly) 조립할 수 있다. Gibson 조립 반응의 경우 이웃하는 단편에 대해 중복 서열을 갖는 DNA 단편을 생성시키기 위해서, L1 또는 L2 링커 펩티드를 암호화하는 20-40 염기쌍(bp) 중복 서열 또는 CET1019-As-Puro 벡터 서열을 프라이머의 5' 단부에 도입시켰다(도 2, 단계 1 참조). 증폭 후에, PCR 생성물을 정제시키고 PureLink Gel 추출 키트(ThermoFisher Scientific)를 사용하여 젤 추출에 의해 수확하였다. 목적하는 유전자-링커-벡터 조합의 정제된 DNA 단편을 혼합하고 제조사의 프로토콜에 따라 Gibson Assembly Master Mix(New England BioLabs) 또는 NEBuilder HiFi DNA Assembly Master Mix(New England BioLabs)에 의해 함께 조립하였다.
유사하게, 도 3은 알부민 결합 분자가 ABD일 때 본원에 제공된 예시적인 IL-21 융합 단백질의 구성을 예시한다.
6His 태그를 항-MSLN sdAb의 C-말단에 임의로 융합시킬 수 있다. 상기와 같은 경우에, 6His를 암호화하는 DNA 서열을, 항-MSLN의 증폭을 위한 역방향 프라이머 및 CET1019 AS-puro 벡터 주쇄의 증폭을 위한 순방향 프라이머의 설계를 위한 중복 서열로서 사용하였다.
조립 반응 후에, 2 ㎕의 조립 생성물을 제조사의 프로토콜에 따라 NEB 5-알파 수용성 이 콜라이 세포(New England BioLabs)의 형질전환에 사용하였다. Amp 선택 플레이트로부터 콜로니를, PureLink Quick Plasmid Miniprep Kit(ThermoFisher Scientific) 및 DNA 서열분석 확인(ELIM Biopharmaceuticals)을 사용하여 후속의 미니-프렙을 위해 피킹하였다.
실시예 4: IL-21 융합 단백질의 발현 및 정제
IL-21 융합 단백질을 암호화하는 DNA 서열을 ExpiCHO 세포에서 일시적으로 발현시킨다. 간단히, -1일째에, CHO 세포를 125 ㎖ 비-배플 플라스크에서 25 ㎖의 일시 형질감염 배지(BalanCD® Transfectory™ CHO, Irvine Scientific, #91147) + 4 mM 글루타민 중에 3-4 x 10e6 세포/㎖로 시딩한다. 0일째에, 22.5 pg의 플라스미드 DNA를 1.5 ㎖ 일시 형질감염 배지 중의 112.5 pg의 PEI와 혼합하고 RT에서 7분간 배양한다. 이어서 혼합물을 세포에 서서히 가한다. 세포를 1일째에 1) 0.5 mM 발프로산(50 ul 내지 25 ㎖), 2) 10% TF-후 보충제(Irvine Scientific #91 148), 3) 1.5 ㎖ 글루코스 스톡(200 g/L), 및 4) 50 g/L TC Yeastolyte가 있는 5% IS 공급물과 함께 1회 공급한다. CHO 세포를 친화성 컬럼상에서 정제를 위해 8일째에 수확한다.
실시예 5: 시험관내 NK 세포 증식 분석
인간 NK 세포를 음성 선택 키트-Kit II(모든 비드는 Miltenyi Biotech, Bergisch Gladbach, Germany로부터 유래한다)를 사용하여 단리한다. 정제를 수동으로 또는 AutoMACS(Miltenyi)로 수행한다. 세포의 순도를 항상 형광-활성화된 세포 분류(FACS)에 의해 조절하며 이는 90%를 넘는다. 단리된 NK 세포를 실시예 1에 상술한 것들을 포함하여 본원에 제공된 융합 단백질로 처리한다. NK 세포의 증식을 FACS 분석을 사용하여 CD69 신호로 모니터한다.
실시예 6: 시험관내 세포독성 분석
인간 폐암종 세포 A549를 새로 단리된 인간 PBMC와 혼합하고 0, 5, 10, 및 50 ng/㎖의 정제된 IL-21 융합 단백질과 함께 배양한다. 이 경우에 MMP 절단가능한 링커가 사용되며, IL-21의 활성화를 위해 추가된 MMP9와 함께 병행 실험을 수립한다. 혼합된 배양물을 72시간까지 배양하고 MTS 방법을 사용하여 본 연구에서 용해된 표적 세포의 백분율을 측정한다.
실시예 7: 생체내 효능 연구
새로운 마우스에 0일째에 A549 암세포를 이식한다. 종양이 대략 50-100 ㎣까지 성장한 후에, 마우스를 무작위 분류하고 본원에 제공된 IL-융합 단백질 및 대조용(예를 들어 PBS 중의 아이소타입 대조용 항체)으로 격일 처리한다. 본원에 제공된 IL-21 융합 단백질은 IL-21 병용 연구(IL-21 및 제2 제제와의 병용 처리의 연구)와 비교할 때 동일한 용량에서 보다 양호한 효능을 나타내거나 또는 훨씬 더 낮은 용량에서 유사한 효능을 성취하는 것으로 예상된다.
종양 크기 및 체중을 투여에 앞서 기준선에서 측정한다. 종양 크기 및 체중을 처리후 2주 동안 주당 3회 측정한다. 종말 혈액 샘플을 PK/PD 분석을 위해 수집한다.
실시예 8. 항-HSA 단일 도메인 항체의 생성
벼로부터 발현된 인간 혈청 알부민(HSA)(Sigma, #A973:1)을 사용하여 라마를 면역시켜 항-HSA 단일 도메인 항체(VHH 항체)를 생성시켰다. 면역화 후에, 말초 단핵세포(PBMC)를 RNA 추출을 위해 단리하였다. VhH 항체 파지 디스플레이 라이브러리를, 항체 유전자를 암호화하는 mRNA/cDNA와 함께 구성하였다. 구성된 파지 디스플레이 라이브러리를 수회 라운드의 항원과의 친화성 결합을 통해 선별하였다. 양성 클론을 Octet 친화성 측정(ForteBio, Octet RED96)을 통해 식별하였다. 양성 클론의 항체 유전자를 서열분석하고 중국 햄스터 난소(CHO) 세포 발현을 위해 UCOE 벡터(EMD Millipore, #CS22:1284)내로 클로닝하였다.
9개의 예시적인 신규의 항-HSA 단일 도메인(VHH) 항체를 상술한 방법에 따라 생성시킨다. 서열번호 60-68을 참조하시오. 이들 9개의 예시적인 신규의 VHH 항체의 CDR 서열을 서열번호 69-95로서 서열 목록 표에 나열한다. 9개의 항체 중에서, 하나의 항체(P367)가 인간, 키노몰구스 원숭이 및 마우스 혈청 알부민과 상호작용한다. 항체의 나머지는 인간 및 키노몰구스 원숭이 혈청 알부민 모두와 상호작용한다.
실시예 9 IL-21-항-HSA 융합 단백질의 분자 클로닝
IL-21-항-HSA 융합 단백질 발현 벡터의 구성을 본원에 예시한다. 인간 IL-21 완전길이(서열번호 1)를 암호화하는 cDNA 서열을 GeneArt 유전자 합성(ThermoFisher Scientific)을 사용하는 유전자 합성에 의해 획득하였다. 이들 유전자의 코돈 용법을 중국 햄스터 난소(CHO) 세포에서의 발현에 대해 최적화하였다. 인간 IL-21의 C-말단을 펩티드 링커를 통해 항-HSA VhH 항체의 N-말단에 융합시켰다. 인간 IL21, 폴리펩티드 링커 및 항-HSA VhH 항체를 암호화하는 DNA 서열들을 조립 클로닝(New England BioLabs, #E5520S) 또는 유사한 시험관내 재조합 방법에 의해 함께 무솔기 조립할 수 있다. IL-21-항-HSA 융합의 올리고뉴클레오시드를 CHO 세포 발현을 위해 UCOE 발현 벡터 CETl0l9-AS-Puro(EMD Millipore, #CS221284)내에 삽입하였다.
표 6은 인간 IL-21의 서열을 나열한다.
[표 6]
인터류킨 21
Figure pct00010
표 7은 인간 IL-21-항-HSA 융합 단백질에 대한 예시적인 폴리펩티드 링커를 나열한다.
[표 7]
Figure pct00011
실시예 10 IL-21 융합 단백질의 발현 및 정제
IL-21 융합 단백질을 암호화하는 DNA 서열을 ExpiCHO 세포에서 일시적으로 발현시킨다. 간단히, -1일째에, ExpiCHO-S 세포(GibcoTM, #A29127)를 환기식 진탕 삼각플라스크에서 ExpiCHO 발현 배지(GibcoTM, #A2910001)에 3-4 x 10e6 세포/㎖로 시딩하고 8% CO2가 있는 37℃ 배양기에서 125 rpm 궤도 진탕기상에 놓는다. 0일째에, 플라스미드 DNA를 Expifectamin CHO 시약(GibcoTM, #29:129)과 혼합한다. 이어서 혼합물을 세포에 서서히 가한다. 16시간 후에, 세포를 5% CO2가 있는 32℃ 배양기로 옮긴다. 세포에 1일 및 5일째에 ExpiCHOTM 공급물(GibcoTM, #29:129)을 2회 공급한다. CHO 세포를 친화성 컬럼상에서 정제를 위해 8-12일째에 수확한다.
도 4에 도시된 바와 같이, 항-HSA 항체 P367은 인간, 원숭이 또는 마우스 혈청 알부민과 상호작용한다. P367-IgG1 Fc 융합 단백질을 단백질 A 바이오센서상에 로딩하고 인간, 원숭이 또는 마우스 혈청 알부민에 침지시켰다. 컬러 라인은 400 nM(짙은 청색), 200 nM(짙은 적색) 및 100 nM(밝은 청색)에서 상이한 농도의 혈청 알부민에 대한 결합 반응을 나타낸다. 1차 실험 데이터를 전체 적합(적색)으로 분석하여 KD를 측정한다.
실시예 11: 항-HSA 접합체 인터류킨 21 신호전달 효능은 재조합 IL21과 유사하다
파이퍼(Pfeiffer) 세포를, 10% 소 태아 혈청 및 페니실린/스트렙토마이신을 함유하는 RPMI-1640에서 유지시켰다. 100,000 파이퍼 세포를, 10 mM HEPES를 함유하는 행크스 균형 염 용액 중에서 37℃, 5% CO2에서 30분간 표시된 농도의 재조합 인간 IL-21(rhIL-21), P390(마우스 IL-21-항-HSA, 서열번호 120의 서열을 갖는다), 또는 P394(인간 IL-21-항-HSA, 서열번호 121의 서열을 갖는다)로 처리하였다. 포스포-STAT3를 제조사의 설명에 따라 포스포-STAT3(Tyr705) 동종 시간 분해 형광(HERE) 분석(Cisbio)을 사용하여 측정하였다. 665 ㎚/620 ㎚의 신호비에 100을 곱하여, 플롯팅하고 용량 반응 곡선(Graphpad Prism)을 사용하여 적합시켜 EC50을 계산하였다.
도 5 및 표 8에 도시된 바와 같이, IL-21-항-HSA 접합체는 재조합 인간 IL-21에 비해 균등한 세포 기반 효능을 나타내었다.
[표 8]
상이한 IL-21 변이체의 EC50
Figure pct00012
실시예. 12 ADCC 분석
NCI-N87 및 NCI-H226 암세포주를 10% 소 태아 혈청 및 페니실린/스트렙토마이신을 함유하는 RPMI-1640에서 유지시켰다. 0일째에, 10,000 NCI-N87 세포/웰 및 5,000 NCI-H226 세포/웰을 96-웰 편평 바닥 플레이트 중의 배양 배지에 도말하였다. 1일째에, NK 세포를 RosetteSep NK 단리 키트(Stemcell Technologies)를 사용하여 인간 버피 코트로부터 단리하고, 100,000 NK 세포/웰을 표시된 처리와 함께 암세포에 가하였다. 플레이트를 37℃, 5% CO2에서 48시간 동안 배양하고, 이어서 세포를 4% 파라포름알데히드로 고정시키고 핵을 Sytox Orange로 염색하였다. 남은 암세포의 수를, Cytation 1(Biotek)을 사용하여 각 웰 중에 남은 암세포 핵의 수를 세어 산정하였다. 보다 낮은 세포수는 보다 양호한 NK 매개된 세포 사멸을 가리켰다. (P303은 항-MSLN 항체이고; P394는 인간 IL-21-항-HSA 융합 단백질이고; P390은 마우스 IL-21-항-HSA 융합 단백질이고; P461/P462는 인간 IL-15/IL-15Ra-항-HSA 융합 단백질이다).
도 6A 및 도 6B에 도시된 바와 같이, mIL-21 및 hIL-21 항-HSA 융합 단백질은 항-MSLN 항체와 병용시 NK 세포 ADCC 활성을 증대시켰다. 증대된 ADCC의 크기는 IL-21 항-HSA 융합 단백질과 rhIL-21간에 유사하였다.
실시예 13. ADCC 용량 반응
NCI-N87 및 NCI-H226 암세포주를 10% 소 태아 혈청 및 페니실린/스트렙토마이신을 함유하는 RPMI-1640에서 유지시켰다. 0일째에, 10,000 NCI-N87 세포/웰 및 5,000 NCI-H226 세포/웰을 96-웰 편평 바닥 플레이트 중의 배양 배지에 도말하였다. 1일째에, NK 세포를 RosetteSep NK 단리 키트(Stemcell Technologies)를 사용하여 인간 버피 코트로부터 단리하고, 100,000 NK 세포/웰을 표시된 처리와 함께 암세포에 가하였다. 항-MSLN 항체 P303을 각 웰에 3 ng/㎖(NCI-N87 세포) 또는 20 ng/㎖(NCI-H226 세포)로 가하였다. 플레이트를 37℃, 5% CO2에서 48시간 동안 배양하고, 이어서 세포를 4% 파라포름알데히드로 고정시키고 핵을 Sytox Orange로 염색하였다. 남은 암세포의 수를, Cytation 1(Biotek)을 사용하여 각 웰 중에 남은 암세포 핵의 수를 세어 산정하였다. 보다 낮은 세포수는 보다 양호한 NK 매개된 세포 사멸을 가리켰다. (P303은 항-MSLN 항체이고; P394는 인간 IL-21-항-HSA 융합 단백질이고; P390은 마우스 IL-21-항-HSA 융합 단백질이고; P461/P462(서열번호 123 및 124) 및 P461/P463(서열번호 123 및 125)은 모두 인간 IL-15/IL-15Ra-항-HSA 융합 단백질이고; rhIL-15는 재조합 인간 IL-15이다).
도 6C 및 도 6D에 도시된 바와 같이, IL-21-항-HSA 및 IL-15-항-HSA는 모두 항-MSLN 항체와 병용시 0.6 ng/㎖ 이하로 낮은 완전한 ADCC 효능을 나타낸다.
실시예 14. 완전길이 및 트렁케이트된 IL-21 융합 단백질, 상이한 링커를 갖는 융합 단백질 및 N-말단 및 C-말단 IL-21 융합 단백질의 활성.
파트 A.
파이퍼 세포를, 10% 소 태아 혈청 및 페니실린/스트렙토마이신을 함유하는 RPMI-1640에서 유지시켰다. 100,000 파이퍼 세포를, 10 mM HEPES를 함유하는 행크스 균형 염 용액 중에서 37℃, 5% CO2에서 30분간 표시된 농도의 재조합 인간 IL-21(rhIL-21), P394(인간 IL-2l-GSG4-항-HSA, 서열번호 121의 서열을 가짐), P593(인간 IL-21(1-l22)-A(EAAAK)4A-항-HSA), P636(인간 IL-2l(l-ll9)-GSG4-항-HSA), P637(인간 IL-2l(l-l20)-GSG4-항-HSA), P744(인간 IL-21(1-122)-A(EAAAK)4 A-항-HSA), P748(항-HSA-A(EAAAK)4A-인간 IL-21(1-122), P750(인간 IL-2l-GSG4-항-HSA), P751(인간 IL-21-A(EAAAK)4A-항-HSA) 및 P783(인간 IL-21(1-122)-A(EAAAK)4 A-항-HSA)로 처리하였다. 포스포-STAT3를 제조사의 설명에 따라 포스포-STAT3(Tyr705) 동종 시간 분해 형광(HERE) 분석(Cisbio)을 사용하여 측정하였다. 665 ㎚/620 ㎚의 신호비에 100을 곱하여, 플롯팅하고 용량 반응 곡선(Graphpad Prism)을 사용하여 적합시켜 EC50을 계산하였다.
모든 융합 단백질은 유사한 IL-21R 신호전달 활성을 나타내며, 이는 시험된 트렝케이트된(truncated) 변이체, 시험된 상이한 링커, 및 시험된 C-말단 대 N-말단 IL-21 융합이 IL-21 신호전달에 영향을 미치지 않음을 암시한다(도 7A).
파트 B.
NCI-N87 암세포주를 10% 소 태아 혈청 및 페니실린/스트렙토마이신을 함유하는 RPMI-1640에서 유지시켰다. 0일째에, 10,000 NCI-N87 세포/웰 및 5,000 NCI-H226 세포/웰을 96-웰 편평 바닥 플레이트 중의 배양 배지에 도말하였다. 1일째에, NK 세포를 RosetteSep NK 단리 키트(Stemcell Technologies)를 사용하여 인간 버피 코트로부터 단리하고, 100,000 NK 세포/웰을 표시된 처리와 함께 암세포에 가하였다. 플레이트를 37℃, 5% CO2에서 48시간 동안 배양하고, 이어서 세포를 4% 파라포름알데히드로 고정시키고 핵을 Sytox Orange로 염색하였다. 남은 암세포의 수를, Cytation 1(Biotek)을 사용하여 각 웰 중에 남은 암세포 핵의 수를 세어 산정하였다. 보다 낮은 세포수는 보다 양호한 NK 매개된 세포 사멸을 가리켰다. (P394(인간 IL-2l-GSG4-항-HSA, 서열번호 121의 서열을 가짐), P593(인간 IL-21(1-l22)-A(EAAAK)4A-항-HSA), P636(인간 IL-2l(l-ll9)-GSG4-항-HSA), P637(인간 IL-2l(l-l20)-GSG4-항-HSA), P744(인간 IL-21(1-122)-A(EAAAK)4 A-항-HSA), P748(항-HSA-A(EAAAK)4A-인간 IL-21(1-122), P750(인간 IL-2l-GSG4-항-HSA), P751(인간 IL-21-A(EAAAK)4A-항-HSA) 및 P783(인간 IL-21(1-122)-A(EAAAK)4 A-항-HSA).
모든 융합 단백질은 항-MSLN 항체와 병용시 유사한 ADCC 기능을 나타내며, 이는 시험된 트렁케이트된 변이체(WT 대 C-말단 트렁케이션), 시험된 상이한 링커(GSG4 대 A(EAAAK)4A), 및 시험된 C-말단 대 N-말단 IL-21 융합이 NK 세포의 IL-21 활성화에 영향을 미치지 않음을 암시한다(도 7B 및 7C).
실시예 15. IL-21-항-HSA 융합 단백질의 약동학적 평가
Balb/cJ 마우스에게 100 ul PBS에서 희석된 rhIL-21, P325 또는 P394를 복강내 주사하였다. 투여-전 채혈에 이어서, P394의 경우 화합물 주사후 0.5, 2, 6, 24, 48, 72, 96시간째에 또는 rhIL-21 및 P325의 경우 화합물 주사후 0.25, 0.5, 1, 2, 6, 24, 48, 72시간째에 마우스를 채혈하였다. 혈액을 응고 방지를 위해 EDTA가 있는 모세관채혈튜브(BD)에 넣었다. IL-21 단백질을 제조사의 설명에 따라 IL-21 ELISA(Life Technologies)를 사용하여 정량분석하였으며, 이때 각각의 화합물은 그 자신의 표준으로서 제공된다.
마우스에서 3 ㎍의 재조합 인간 IL-21, 3 pg의 P325(인간 IL-21-관련없는 나노바디) 및 3 또는 30 pg P394(인간 IL-21-항-HSA)의 약동학적 평가는 P394의 증가된 반감기 및 노출을 나타내었으며, 이는 항-HSA에 의한 IL-21 접합의 영향을 입증한다(도 8).
IL-21에의 항-HSA 접합은 생체내 반감기 및 노출을 증가시킨다.
실시예 16. IL-21 융합 단백질의 특성화
파트 A. HPLC 및 SDS-PAGE
IL-21 융합 단백질의 정제후에, 이의 크기 및 순도를 SDS-PAGE 및/또는 고성능 액체 크로마토그래피(HPLC)에 의해 측정하였다. SDS-PAGE의 경우, NuPAGE 4-12% 비스-트리스 단백질 젤 프리캐스트 젤(Thermofisher)을 사용하고 대략 1 pg의 단백질을 각 웰에 로딩하였다. 전기영동후에, 단백질 젤상에 단백질을 고정시키고 InstantBlue 단백질 색소(Expedeon)로 염색하였다. 도 9A에 도시된 바와 같이, 최적화된 링커와 결합된, 트렁케이트된 IL-21(1-122)-A(EAAAK)4A-항-HSA 융합 단백질(AWT-593)은 완전길이 IL-2l-(GSG)4-항-HSA 융합 단백질(AWT-P394, 레인 1)에 비해 감소된 분해(레인 3)를 나타낸다.
더욱이, 도 9F 및 9G에 도시된 바와 같이, 항-HSA-A(EAAAK)4A-IL21(1-122)(P748)(도 9G에서 레인 1)은 P593(도 9F에서 레인 3) 및 P394(도 9F에서 레인 1)보다 훨씬 더 감소된 분해를 나타내었으며, 이는 항-HSA 항체의 c-말단에의 IL21의 융합이 생성 도중 단백질 절단을 감소시킴을 암시한다.
HPLC의 경우, 분석을 Shimadzu LC-2030C HPLC 시스템상에서 수행하였다. 대략 5 ㎍의 샘플을, 25 mM 나트륨 포스페이트, 500 mM 염화 나트륨 완충제, pH 6.5를 사용하여 0.25 ㎖/분으로 AdvanceBio 30θA, 2.7 μM, 4.6x300 ㎜ 크기 배제 컬럼(Agilent)상에 주입하였다. 데이터를 LabSolutions 소프트웨어(Shimadzu)에 의해 Post-run을 사용하여 분석하였다. >95%의 전체 단백질 샘플로 구성된 단일 피크를 12.5분에서 검출할 수 있다. 도 9B는 AWT-P394 IL-21-항 HSA 융합 단백질의 전형적인 크로마토그램을 도시한다.
파트 B. 제형
상이한 분자 설계의 최고의 제형 조건 및 안정성을 신속하게 평가하기 위해서, 2-단계 정제된 IL-21 융합 단백질을, 0.02% Tween 80과 함께, 상이한 pH(3-7)에서 다양한 양의 히스티딘(5-20 mM) 및 NaCl(0-100 mM)로 구성된 상이한 완충제로 완충제 교환하였다. 단백질 샘플을 40℃에서 80℃로 점진적으로 가열하고 각 샘플의 실시간 단백질 크기 분포를 DynaPro 플레이트 판독기 III(Wyatt Technology)를 사용하여 동적 광산란(DLS)에 의해 측정하였다. 2-단계 정제후에, IL-21-항 HSA 융합 단백질의 99% 초과가 10 nM 미만이다. 온도 상승 동안, 단백질 제형에서 응집을 유도하는데 필요한 최소 온도를 Tonset로서 측정하였다. 모든 시험 조건에서 최고의 Tonset(>80 ℃)을 제공하는 최고의 제형은 pH 4.0에서 5 mM 히스티딘, 25 mM NaCl 및 0.2% Tween 80이었다. 도 9C-9D를 참조하시오.
도 9D에 도시된 바와 같이, IL-21 트렁케이션 및 링커 최적화의 조합이 또한 단백질 안정성의 개선에 기여한다. 완전길이 인간 IL-21-(GSG)4-항 HSA 융합 단백질에 비해, 최적화된 링커를 갖는 트렁케이트된 IL-21(AWT-P593)은 Tonset을 현저하게 증가시켰으며, 이는 표시된 제형 조건에서 크게 개선된 안정성을 가리킨다.
파트 C. 결합 친화성
IL-21-항-HSA 융합 단백질 AWT-P394 또는 AWT-P593에의 인간 IL-21 수용체의 결합. Octet RED96(ForteBio)을 사용하여 상호작용을 특성화하였다. 간단히, 인간 IL-21 수용체-hgG1 Fc 융합 단백질을 AHC 바이오센서상에 로딩하고 AWT-P394 또는 AWT-P593에 100 nM 농도로 침지시켰다. 1차 실험 데이터를 전체 적합으로 분석하여 KD를 측정하였다. 도 9E를 참조하시오.
실시예 17. 항-HSA 항체
알부민은 인간 혈청에서 가장 풍부한 단백질이며 3주의 반감기를 갖는다. 혈청 알부민의 긴 반감기는 주로 신생아 Fc 수용체(FcRn)로부터의 보호에 기여한다. 혈청 알부민은 유동상 음세포작용(pinocytosis)이라 칭하는 과정을 통해 체세포에 의해 흡수될 수 있다. 음세포성 소낭은 후속적으로 엔도솜 구획과 융합하며, 상기 구획의 pH는 4.5 내지 6.5의 범위이다. 소낭 중 단백질이 수용체로부터 배출되는 경우, 상기는 리소솜 분해에 의해 더욱 분류될 것이다. 혈청 알부민과 FcRn 간의 결합은 오직 산성 pH(<6.5)에서만 발생하여, FcRn이 알부민을 엔도솜으로부터 구제하고 이를 다시 혈청으로 재순환되게 한다(Crevys et al., 2018). 따라서, 알부민 의존성 반감기 연장 부분으로서, 항-HSA 항체는 중성 및 산성 pH에서 이의 결합 친화성을 유지할 필요가 있다.
Octet RED96(ForteBio)을 사용하여 pH 7.4 및 pH 5.5에서 AWT-610과 인간 또는 원숭이 혈청 일부민간의 상호작용을 특성화하였다. 간단히, AWT-P610-hgG1 Fc 융합 단백질을 단백질 A 바이오센서상에 로딩하고 pH 7.4(좌측 그래프) 또는 pH 5.5(우측 그래프)에서 인간(청색 라인) 또는 원숭이(짙은 적색 라인) 혈청 알부민에 침지시켰다. 도 10A를 참조하시오.
1차 실험 데이터를 전체 적합(적색)으로 분석하여 KD를 측정하였다. 구체적으로, 3개의 상이한 항-HSA 항체는 pH 7.4 및 pH 5.5에서 인간 및 원숭이 혈청 알부민 모두와 상호작용한다. 결합을 Octet RED96(ForteBio)를 사용하여 측정하였으며 KD를 Octet 데이터 분석 HT 소프트웨어를 사용하여 전체 적합에 의해 측정하였다. 표 9는 pH 5.5 및 pH 7.4 모두에서 산정된 3개의 상이한 Anwita 항-HSA 항체의 KD를 나타낸다. 일반적으로, 항체는 pH 5.5에서 인간 혈청 알부민에의 결합 친화성의 약간의 증가를 보인다.
[표 9]
Figure pct00013
항-HSA 항체 AWX-P367 및 이의 인간화된 버전 AWX-P494의 Tonset을 평가하였다. AWT-P367 및 AWT-P494를 1x PBS pH 7.4로 완충제 교환하였다. 단백질 샘플을 40℃ 내지 80℃로 점진적으로 가열하고 각 샘플의 실시간 단백질 크기 분포를 DynaPro 플레이트 판독기 III(Wyatt Technology)를 사용하여 동적 광산란(DLS)에 의해 측정하였다. 도 10B에 도시된 바와 같이, AWT-P494는 AWT-P367에 비해 약간 증가된 Tonset을 나타낸다.
항-HSA 항체 AWX-P342 및 이의 완전히 인간화된 버전 AWX-P610의 Tonset을 평가하였다. AWT-P342 및 AWT-P610을 1x PBS pH 7.4로 완충제 교환하였다. 단백질 샘플을 40℃ 내지 80℃로 점진적으로 가열하고 각 샘플의 실시간 단백질 크기 분포를 DynaPro 플레이트 판독기 III(Wyatt Technology)를 사용하여 동적 광산란(DLS)에 의해 측정하였다. 도 10C에 도시된 바와 같이, AWT-P610은 AWT-P342에 비해 감소된 Tonset을 나타낸다.
Octet RED96(ForteBio)을 사용하여 항-HSA 항체 AWT-P367 또는 이의 인간화된 버전 AWT-P494와 인간, 원숭이 또는 마우스 알부민간의 상호작용을 특성화하였다. 간단히, AWT-P367 또는 AWT-P494를 AHC 바이오센서상에 로딩하고 200 nM 농도로 인간, 원숭이 또는 마우스 혈청 알부민에 침지하였다. 1차 실험 데이터를 전체 적합으로 분석하여 KD를 측정하였다. 도 10D-10E에 도시된 바와 같이, 인간화된 항-HSA 항체 AWT-P494의 결합 친화성은 이의 원래 클론 AWT-P367과 유사하다.
실시예 18: 암세포를 억제하기 위한 항-메소텔린 항체, 사이토카인 또는 사이토카인 융합 단백질
NCI-N87 암세포주를 10% 소 태아 혈청 및 페니실린/스트렙토마이신을 함유하는 RPMI-1640에서 유지시켰다. 0일째에, 10,000 NCI-N87 세포/웰을 96-웰 편평 바닥 플레이트 중의 배양 배지에 도말하였다. 1일째에, NK 세포를 RosetteSep NK 단리 키트(Stemcell Technologies)를 사용하여 인간 버피 코트로부터 단리하고, 100,000 NK 세포/웰을 표시된 처리와 함께 암세포에 가하였다. 플레이트를 37℃, 5% CO2에서 48시간 동안 배양하고, 이어서 세포를 4% 파라포름알데히드로 고정시키고 핵을 Sytox Orange로 염색하였다. 남은 암세포의 수를, Cytation 1(Biotek)을 사용하여 각 웰 중에 남은 암세포 핵의 수를 세어 산정하였다. 보다 낮은 세포수는 보다 양호한 NK 매개된 세포 사멸을 가리켰다. (P303 - R3C7 항-MSLN 항체, P303F - 감소된 푸코실화를 갖는 R3C7 항-메소텔린 항체, P394 - 인간 IL-21-항-HSA, P390 - 마우스 IL-21-항-HSA, P431/435 - 인간 IL-2l-항-HSA-IgGl-R3C7, P479 - 항-HSA-인간-IL-l5 RA 스시/IL-l5, P480 - 항-HSA-인간-IL-l5 RA 스시/IL-l5, rhIL-21 - 재조합 인간 IL-21, rhfi. - 15 - 재조합 인간 IL-15).
도 11에 도시된 바와 같이, rhIL-2l, mIL-2l(P390) 및 hIL-2l(P394) 항-HSA 융합 단백질은 P303 단독에 비해 항-MSLN 항체 P303(R3C7)과 결합시 유사한 정도로 NK 세포 ADCC 활성을 증대시켰다. 더욱이, rhIL-15 및 hIL-15/IL-15RA 항-HSA 융합 단백질(P479 및 P480)은 P303 단독에 비해 항-MSLN 항체 P303(R3C7)과 결합시 유사한 정도로 NK 세포 ADCC 활성을 증대시켰다. 사이토카인-항-HSA 융합 단백질은 균등한 재조합 사이토카인에 비해 완전한 ADCC 활성을 유지하였다.
실시예 19: 암세포를 억제하기 위한 항-메소텔린 항체 단독 또는 허셉틴과의 조합
NCI-N87 암세포주를 10% 소 태아 혈청 및 페니실린/스트렙토마이신을 함유하는 RPMI-1640에서 유지시켰다. 0일째에, 10,000 NCI-N87 세포/웰을 96-웰 편평 바닥 플레이트 중의 배양 배지에 도말하였다. 1일째에, NK 세포를 RosetteSep NK 단리 키트(Stemcell Technologies)를 사용하여 인간 버피 코트로부터 단리하고, 100,000 NK 세포/웰을 표시된 처리와 함께 암세포에 가하였다. 플레이트를 37℃, 5% CO2에서 48시간 동안 배양하고, 이어서 세포를 4% 파라포름알데히드로 고정시키고 핵을 Sytox Orange로 염색하였다. 남은 암세포의 수를, Cytation 1(Biotek)을 사용하여 각 웰 중에 남은 암세포 핵의 수를 세어 산정하였다. 보다 낮은 세포수는 보다 양호한 NK 매개된 세포 사멸을 가리켰다. (P303F - 감소된 푸코실화를 갖는 Anwita 항-메소텔린 항체, P380 - 인간 IL-33-항-HSA, P394 - 인간 IL-21-항-HSA).
도 12에 도시된 바와 같이, P303F(R3C7 항-메소텔린 항체)는 NK 세포 ADCC에서 허셉틴보다 더 효능있었으며 P303F와 허셉틴과의 조합은 P303F 단독과 유사하였다. P394(인간 IL-21-항-HSA)의 P303F 및 허셉틴에의 부가는 현저하게 개선된 ADCC 기능 및 개선된 효능을 생성시켰다.
실시예 20: 암세포 억제를 위한 사이토카인 융합 단백질
파이퍼 암세포주를 10% 소 태아 혈청 및 페니실린/스트렙토마이신을 함유하는 RPMI-1640에서 유지시켰다. 1일째에, 10,000 파이퍼 세포/웰을 96-웰 편평 바닥 플레이트 중의 배양 배지에 도말하였다. NK 세포를 RosetteSep NK 단리 키트(Stemcell Technologies)를 사용하여 인간 버피 코트로부터 단리하고, 30,000 NK 세포/웰을 표시된 처리와 함께 암세포에 가하였다. 플레이트를 37℃, 5% CO2에서 24시간 동안 배양하고, 이어서 세포를 FACS 분석을 위해 1 uM 프로피디움 요오다이드로 염색하였다. 파이퍼 세포를 FSC 및 SSC 게이팅에 기반하여 NK 세포로부터 분리시키고 전체 파이퍼 세포수를 측정하였다. 죽은 파이퍼 세포를 PI 색소를 사용하여 측정하였다. 전체 생 세포를, 전체 파이퍼 세포수에서 PI 양성을 공제하여 산정하였다. 보다 낮은 세포수는 보다 양호한 NK 매개된 세포 사멸을 가리켰다. (p394 - 인간 IL-21-항-HSA, P480 - 항-HSA-인간-IL-15 RA 스시/IL-15)
도 13에 도시된 바와 같이, 인간 IL-21-항-HSA 융합 단백질(P394), 인간 IL-15/IL-15R 스시-항-HSA 융합 단백질(P480), 및 rhIL-15는 리툭산과 결합시 미만성 큰 B 세포 림프종 세포주 파이퍼에 대한 NK 세포 ADCC 활성을 증대시켰다.
실시예 21: 암세포를 억제하기 위한 항-메소텔린 항체 단독 또는 사이토카인 융합 단백질과의 조합
NCI-N87 암세포주를 10% 소 태아 혈청 및 페니실린/스트렙토마이신을 함유하는 RPMI-1640에서 유지시켰다. 0일째에, 10,000 NCI-N87 세포/웰을 96-웰 편평 바닥 플레이트 중의 배양 배지에 도말하였다. 1일째에, NK 세포를 RosetteSep NK 단리 키트(Stemcell Technologies)를 사용하여 인간 버피 코트로부터 단리하고, 100,000 NK 세포/웰을 표시된 처리와 함께 암세포에 가하였다. 플레이트를 37℃, 5% CO2에서 24시간 동안 배양하고, 이어서 세포를 4% 파라포름알데히드로 고정시키고 핵을 Sytox Orange로 염색하였다. 남은 암세포의 수를, Cytation 1(Biotek)을 사용하여 각 웰 중에 남은 암세포 핵의 수를 세어 산정하였다. 보다 낮은 세포수는 보다 양호한 NK 매개된 세포 사멸을 가리켰다. (P303F - 감소된 푸코실화를 갖는 Anwita 항-메소텔린 IgG1 항체 R3C7, P480 - 항-HSA-인간-IL-15 RA 스시/IL-15, rhIL-21 - 재조합 인간 IL-21, rhIL-15 - 재조합 인간 IL-15)
도 14에 도시된 바와 같이, rhIL-15 및 IL-15-항-HSA(P480)는 P303F, 및 rhIL-21과 P303F보다, 항-MSLN 항체 P303F와 병용시 NK 세포 ADCC 활성을 더 양호하게 증대시켰다. P480(IL-15/IL-15R 스시-항-HSA)은 rhIL-15에 비해 유사한 효능 및 크기로 NK 매개된 ADCC를 증대시켰으며, 이는 완전한 IL-15 활성이 항체 융합 단백질에서 유지됨을 암시한다.
실시예 23: 암세포를 억제하기 위한 IL-15-항-HSA 융합 단백질
NCI-N87 암세포주를 10% 소 태아 혈청 및 페니실린/스트렙토마이신을 함유하는 RPMI-1640에서 유지시켰다. 0일째에, 10,000 NCI-N87 세포/웰을 96-웰 편평 바닥 플레이트 중의 배양 배지에 도말하였다. 1일째에, NK 세포를 RosetteSep NK 단리 키트(Stemcell Technologies)를 사용하여 인간 버피 코트로부터 단리하고, 100,000 NK 세포/웰을 표시된 처리와 함께 암세포에 가하였다. 플레이트를 37℃, 5% CO2에서 48시간 동안 배양하고, 이어서 세포를 4% 파라포름알데히드로 고정시키고 핵을 Sytox Orange로 염색하였다. 남은 암세포의 수를, Cytation 1(Biotek)을 사용하여 각 웰 중에 남은 암세포 핵의 수를 세어 산정하였다. 보다 낮은 세포수는 보다 양호한 NK 매개된 세포 사멸을 가리켰다. (P303 - Anwita 항-메소텔린 항체 R3C7, P480 - 항-HSA-인간-IL-15 RA 스시/IL-15, P597 - 항-HSA-인간-IL-15 RA 스시-펩티드 링커-IL-15, rhIL-15 - 재조합 인간 IL-15)
도 15에 도시된 바와 같이, IL-15R 스시 및 IL-15 사이에 펩티드 링커를 갖는, 항-HSA 융합 단백질 P597은, IL-15R 스시 및 IL-15 사이에 링커가 없는[F2A 링커(P480에 사용된 F2A 링커는 높은 절단 효율(>90%)을 갖는 절단가능한 링커이다. 단백질 합성후에, IL15가 절단된다. 그러나, IL15와 IL15RA 스시간의 높은 친화성으로 인해, 이들은 여전히 단일 단백질로서 결합된 채로 있을 것이다)의 절단 후에] 항-HSA 융합 단백질, P480에 비해 ADCC 활성을 개선시켰다. P597의 ADCC 효능은 rhIL-15와 유사하였으며, 이는 완전한 IL-15 활성이 항체 융합 단백질에서 유지됨을 암시한다.
실시예 24: 암세포를 억제하기 위한 IL-21 융합 단백질
NCI-N87 및 H226 암세포주를 10% 소 태아 혈청 및 페니실린/스트렙토마이신을 함유하는 RPMI-1640에서 유지시켰다. 0일째에, 10,000 NCI-N87 세포/웰, 5000 H226 세포/웰을 96-웰 편평 바닥 플레이트 중의 배양 배지에 도말하였다. 1일째에, NK 세포를 RosetteSep NK 단리 키트(Stemcell Technologies)를 사용하여 인간 버피 코트로부터 단리하고, 100,000 NK 세포/웰을 표시된 처리와 함께 암세포에 가하였다. 플레이트를 37℃, 5% CO2에서 48시간 동안 배양하고, 이어서 세포를 4% 파라포름알데히드로 고정시키고 핵을 Sytox Orange로 염색하였다. 남은 암세포의 수를, Cytation 1(Biotek)을 사용하여 각 웰 중에 남은 암세포 핵의 수를 세어 산정하였다. 보다 낮은 세포수는 보다 양호한 NK 매개된 세포 사멸을 가리켰다. (P129 - Anwita 항-메소텔린 항체 R2G12, P126 - 인간 IL-21-R2G12-IgG1 융합, P107 - 인간 IL-21-IgG1 융합, P325 - 인간 IL-21-R2D2 융합, P286/288-인간 IL-21-R3C7-IgG1-R2G12 융합).
도 16에 도시된 바와 같이, 보다 낮은 농도의 IL-21-Fc 융합 단백질(P107, P126, P288/286)은 항-MSLN 항체 P129(즉 R2G12)와 병용시 NK 세포 ADCC 활성을 증대시켰다. 그러나, 보다 높은 농도(>100 ηM)에서, IL-21-Fc 융합 단백질(P107, P126, P288/286)은 항-MSLN 항체 P129(R2G12)와 병용시 NK 세포 ADCC 활성을 억제하였다. 상기 억제는 IL-21 또는 Fc 도메인이 없는 IL-21 융합 단백질(P325)의 경우에 관찰되지 않았다.
실시예 25: 암세포를 억제하기 위한 항-메소텔린 항체와 병용된 IL-12-항-HSA 융합 단백질
NCI-N87 암세포주를 10% 소 태아 혈청 및 페니실린/스트렙토마이신을 함유하는 RPMI-1640에서 유지시켰다. 0일째에, 10,000 NCI-N87 세포/웰을 96-웰 편평 바닥 플레이트 중의 배양 배지에 도말하였다. 1일째에, NK 세포를 RosetteSep NK 단리 키트(Stemcell Technologies)를 사용하여 인간 버피 코트로부터 단리하고, 100,000 NK 세포/웰을 표시된 처리와 함께 암세포에 가하였다. 플레이트를 37℃, 5% CO2에서 48시간 동안 배양하고, 이어서 세포를 4% 파라포름알데히드로 고정시키고 핵을 Sytox Orange로 염색하였다. 남은 암세포의 수를, Cytation 1(Biotek)을 사용하여 각 웰 중에 남은 암세포 핵의 수를 세어 산정하였다. 보다 낮은 세포수는 보다 양호한 NK 매개된 세포 사멸을 가리켰다. (P197 - Anwita 항-메소텔린 항체 R2G12, P390 - 마우스 IL-21-항-HSA, P394 - 인간 IL-21-항-HSA).
도 17에 도시된 바와 같이, 마우스 및 인간 IL-21-항-HSA 융합 단백질(P390 및 P394)은 모두 항-MSLN 항체 P197(R2G12)과 병용시 NK 세포 ADCC 활성을 효능있게 증대시킨다.
실시예 26: 사이토카인 또는 사이토카인-항-HSA 융합 단백질과 배양후 PBMC의 사이토카인 생성
인간 버피 코트로부터 단리된 동결된 PBMC 세포를 해동시키고 10% 소 태아 혈청 및 페니실린/스트렙토마이신을 함유하는 RPMI-1640에서 증식시켰다. 1일째에, 30,000 PBMC 세포/웰을 표시 처리된 96-웰 플레이트에 가하였다. 플레이트를 37℃, 5% CO2에서 밤새 배양하였다. 2일째에, 배지를 수집하고 원심분리시켜 PBMC 세포를 펠릿화하였다. 25 ul의 배지를 사이토카인 방출에 대한 IFN감마 및 IL-6 ELISA 분석에 사용하였다. (P394 - 인간 IL-21-항-HSA, P597 - 항-HSA-인간-IL-15 RA 스시(플러스)-IL-15).
도 18A-18B에 도시된 바와 같이, 양성 대조용 피토헤마글루티닌(PHA)은 PBMC로부터 확고한 IFNg 및 IL-6 분비를 자극한다. PBMC는 rhIL-21 또는 IL-21-항-HSA 융합 단백질 P394 자극에 반응하여 IFNg 또는 IL-6를 분비하지 않는다. rhIL-15 및 IL-15-항-HSA 융합 단백질 P597은 모두 PBMC에 의한 IFNg 및 IL-6 분비를 유사한 정도로 자극하며, 이는 융합 단백질이 재조합 단백질과 유사한 활성을 가짐을 암시한다. IL-12는 PBMC에 의한 IFNg 분비를 자극하지만, IL-6 분비는 아니다. IL-7 및 IL-2는 최소 수준의 IFNg 및 IL-6 분비를 자극한다.
실시예 27. 암 치료를 위한 IL-21-항-HSA 융합 단백질, 항-HSA-IL-15Ra-IL-15 융합 단백질 및 항-CTLA4 단독 또는 조합
파트 A.
MC38 세포를 10% FBS + 글루타맥스 + NEAA + 나트륨 피루베이트 + Pen/Strep이 보충된 DMEM 배지에서 배양하고 유지시켰다. 세포를 트립신처리하고, 배지로 세척하고 카운트하였다. 이어서 세포를 PBS로 세척하고, 0.5x106 세포(50 ul PBS 중의)를 18-게이지 바늘을 사용하여 마취된 C57BL/6 마우스(Taconic)에게 피하 주사하였다. 스톡 연구 약물을 투여일에 PBS 중에서 적합한 농도로 희석하고, 동물에게 PBS, 25 ㎍ P394(인간 IL-21-항-HSA), 100 pg 항-CTLA-4, 또는 25 pg P394를 100 ul PBS 중의 100 pg 항-CTLA-4와 함께 총 5회 용량으로 주당 2회 IP 투여하였다. 종양 측정(길이(L) 및 너비(W))을 디지털 캘리퍼스를 사용하여 주당 2회 수집하고, 종양 부피를 계산하였다 (LxWxW)/2.
도 19A에 도시된 바와 같이, P394 및 항-CTLA-4 단독요법은 PBS 대조용에 비해 종양 성장을 감소시킬 수 있다. P394 및 항-CTLA-4의 조합은 P394 및 항-CTLA-4 단독요법에 비해 종양 성장을 더욱 감소시킨다.
파트 B.
MC38 세포를 10% FBS + 글루타맥스 + NEAA + 나트륨 피루베이트 + Pen/Strep이 보충된 DMEM 배지에서 배양하고 유지시켰다. 세포를 트립신처리하고, 배지로 세척하고 카운트하였다. 이어서 세포를 PBS로 세척하고, 0.5x106 세포(50 ul PBS 중의)를 18-게이지 바늘을 사용하여 마취된 C57BL/6 마우스(Taconic)에게 피하 주사하였다. 스톡 연구 약물을 투여일에 PBS 중에서 적합한 농도로 희석하고, 동물에게 PBS, 100 pg 항-CTLA-4, 25 pg P394(인간 IL-21-항-HSA)와 함께 100 pg 항-CTLA-4, 5 pg P597(항-HSA-IL-15Ra-IL-15)과 함께 100 pg 항-CTLA-4, 또는 100 ul PBS 중의 25 pg P394 및 5 pg P597과 함께 100 pg 항-CTLA-4를 총 5회 용량으로 주당 2회 IP 투여하였다. 종양 측정(길이(L) 및 너비(W))을 디지털 캘리퍼스를 사용하여 주당 2회 수집하고, 종양 부피를 계산하였다 (LxWxW)/2.
도 19B에 도시된 바와 같이, 항-CTLA-4, P394와 항-CTLA-4 및 P597과 항-CTLA-4는 모두 종양 성장을 감소시키는 반면, P394 및 P597과 함께 항-CTLA-4의 3중 조합은 시험된 모든 조합들 중에서 가장 많이 종양 성장을 감소시켰다.
실시예 28. 암 치료를 위한 IL-21-항-HSA 융합 단백질 및 항-HSA-IL-15Ra-IL-15 융합 단백질 단독 또는 조합
MC38 세포를 10% FBS + 글루타맥스 + NEAA + 나트륨 피루베이트 + Pen/Strep이 보충된 DMEM 배지에서 배양하고 유지시켰다. 세포를 트립신처리하고, 배지로 세척하고 카운트하였다. 이어서 세포를 PBS로 세척하고, 0.5x106 세포(50 ul PBS 중의)를 18-게이지 바늘을 사용하여 마취된 C57BL/6 마우스(Taconic)에게 피하 주사하였다. 스톡 연구 약물을 투여일에 PBS 중에서 적합한 농도로 희석하고, 동물에게 PBS, 25 ㎍ P394(인간 IL-21-항-HSA), 5 pg P597(항-HSA-IL-15Ra-IL-15), 또는 100 ul PBS 중의 5 pg P597과 함께 25 pg P394를 총 5회 용량으로 주당 2회 IP 투여하였다. 종양 측정(길이(L) 및 너비(W))을 디지털 캘리퍼스를 사용하여 주당 2회 수집하고, 종양 부피를 계산하였다 (LxWxW)/2.
P394 및 P597 단독요법은 PBS 대조용에 비해 종양 성장을 감소시킨다. P394 + P597의 조합은 P394 및 P597 단독요법에 비해 종양 성장을 더욱 감소시킨다(도 20).
실시예 29: 동계 마우스 모델에서 생체내 항종양 활성 분석
MC38 쥐 결장암 세포(3x106 세포)를 0일째에 C57BL/6 마우스의 옆구리에 피하 이식하였다. 4, 8, 12 및 16일째에, 마우스를 PBS, 100 pg 항-PD-1, 25 pg P390(mIL-21-항-HSA), 100 pg 항-PD-1 및 25 pg P390, 또는 100 pg 항-PD-1 및 5 pg P390 중 어느 하나로 처리하였다. 종양 크기를 표시된 날에 캘리퍼스를 사용하여 측정하고 종양 부피를 계산하였다.
도 21에 도시된 바와 같이, 마우스 IL-21-항-HSA(P390) 단독요법은 종양 성장을 현저하게 늦춘다. 마우스 IL-21-항-HSA(P390) 및 항-PD-1의 조합은 모든 마우스에서 종양을 제거하거나 수축시킨다.
실시예 30: 암 치료에서 항-메소텔린 항체 및/또는 IL-21-항-HSA 융합 단백질
NCI-N87 세포를 10% FBS + 글루타맥스 + Pen/Strep이 보충된 RPMI 배지에서 배양하고 유지시켰다. 세포를 트립신처리하고, 배지로 세척하고 카운트하였다. 이어서 세포를 PBS로 세척하고, 3x106 세포(100 ul PBS 중의)를 23-게이지 바늘을 사용하여 마취된 NSG 마우스(Jackson)에게 피하 주사하였다. 6일 후에, 10x106 인간 PBMC를 마우스당 100 ul PBS 중에서 꼬리 정맥에 주사하였다. 스톡 연구 약물을 투여일에 PBS 중에서 적합한 농도로 희석하고, 동물에게 100 pg P303F(항-메소텔린 항체), 25 pg P394(인간 IL-21-항-HSA) 또는 100 pg P303F와 25 pg 또는 5 pg P394와의 조합을 총 5회 용량으로 주당 2회 IP 투여하였다. 종양 측정(길이(L) 및 너비(W))을 디지털 캘리퍼스를 사용하여 주당 2회 수집하고, 종양 부피를 계산하였다 (LxWxW)/2.
도 22에 도시된 바와 같이, P303F는 대조용에 비해 종양 성장을 감소시킨다. P394 단독 또는 P303F와의 조합을 수용한 모든 마우스는 PBS 대조용 또는 P303F 단독에 비해 현저하게 감소된 종양 성장을 가졌다.
실시예 31: 암 치료를 위한 IL-21-항-HSA 융합 단백질 단독 또는 허셉틴과 조합
NCI-N87 세포를 10% FBS + 글루타맥스 + Pen/Strep이 보충된 RPMI 배지에서 배양하고 유지시켰다. 세포를 트립신처리하고, 배지로 세척하고 카운트하였다. 이어서 세포를 PBS로 세척하고, 3x106 세포(100 ul PBS 중의)를 23-게이지 바늘을 사용하여 마취된 NSG 마우스(Jackson)에게 피하 주사하였다. 6일 후에, 10x106 인간 PBMC를 마우스당 100 ul PBS 중에서 꼬리 정맥에 주사하였다. 스톡 연구 약물을 투여일에 PBS 중에서 적합한 농도로 희석하고, 동물에게 20 ㎍ 허셉틴(항-HER2 항체), 25 pg P394(인간 IL-21-항-HSA) 또는 20 pg 허셉틴과 25 pg 또는 5 pg P394와의 조합을 총 5회 용량으로 주당 2회 IP 투여하였다. 종양 측정(길이(L) 및 너비(W))을 디지털 캘리퍼스를 사용하여 주당 2회 수집하고, 종양 부피를 계산하였다 (LxWxW)/2.
도 23에 도시된 바와 같이, 허셉틴과 25 pg P394 단독요법은 PBS 대조용에 비해 종양 성장을 감소시켰다. 허셉틴 및 25 pg P394의 조합은 허셉틴 또는 P394 단독요법에 비해 종양 성장을 더욱 감소시키며, 이는 부가적인 항-종양 효과를 나타낸다.
실시예 32: 암 치료에서 항-메소텔린 항체 및/또는 IL-21-항-HSA 융합 단백질
NCI-N87 세포를 10% FBS + 글루타맥스 + Pen/Strep이 보충된 RPMI 배지에서 배양하고 유지시켰다. 세포를 트립신처리하고, 배지로 세척하고 카운트하였다. 이어서 세포를 PBS로 세척하고, 3x106 세포(100 ul PBS 중의)를 18-게이지 바늘을 사용하여 마취된 SCID 마우스(Taconic)에게 피하 주사하였다. 스톡 연구 약물을 투여일에 PBS 중에서 적합한 농도로 희석하고, 동물에게 100 ul PBS 중의 100 pg P303F(항-메소텔린 항체), 또는 P303F와 25 pg P390(마우스 IL-21-항-HSA), 5 pg P390 또는 2.5 pg 재조합 마우스 IL-21(5 pg P390 용량과 균등한 몰농도)과의 조합을 총 5회 용량으로 주당 2회 IP 투여하였다. 종양 측정(길이(L) 및 너비(W))을 디지털 캘리퍼스를 사용하여 주당 2회 수집하고, 종양 부피를 계산하였다 (LxWxW)/2.
도 24에 도시된 바와 같이, P303F 및 25 pg 또는 5 pg P390의 조합은 PBS 대조용, P303F 단독요법, 및 rmIL-21과 병용된 P303F에 비해 현저하게 감소된 종양 성장을 생성시켰다. P303F는 2.5 ㎍ rmIL-21과 함께, P303F와 유사한 종양 성장을 보였으며, 이는 재조합 IL-21이 상기 용량에서 효능이 없음을 암시한다. P303F와 5 pg P390과의 조합은 P303F와 2.5 pg rmIL-21과의 조합에 비해 현저하게 감소된 종양 성장을 보이며, 이는 재조합 사이토카인에 비해 반감기 연장된 IL-21의 개선된 효능을 강조한다.
실시예 33: 암 치료에서 IL-21-항-HSA 융합 단백질
MC38 쥐 결장암 세포(1x106 세포)를 0일째에 C57BL/6 마우스의 옆구리에 피하 이식하였다. 마우스를 PBS, 25 pg P390(마우스 IL-21-항-HSA) 또는 재조합 마우스 IL-21로 2주간 주당 2회(총 4회 용량) 처리하였다. 종양 측정(길이(L) 및 너비(W))을 디지털 캘리퍼스를 사용하여 주당 2회 수집하고, 종양 부피를 계산하였다 (LxWxW)/2.
도 25에 도시된 바와 같이, P390(마우스 IL-21-항-HSA)은 PBS 대조용에 비해 MC38 종양의 종양 성장을 감소시키지만, 몰 당량의 12.5 pg 재조합 마우스 IL-21은 PBS 대조용에 비해 종양 성장에 최소의 효과를 갖는다. IL-21-항-HSA(P390)는 동계 마우스 결장암 모델에서 재조합 IL-21에 비해 우수한 항-종양 효능을 갖는다.
실시예 34: 암을 치료하기 위한 항-PD-1 항체와 병용되는 IL-21-항-HSA 융합 단백질
인간 메소텔린으로 형질감염된 CT26 마우스 세포(CT26/MSLN)를 10% FBS + 글루타맥스 + Pen/Strep이 보충된 RPMI 배지에서 배양하고 유지시켰다. 세포를 트립신처리하고, 배지로 세척하고 카운트하였다. 이어서 세포를 PBS로 세척하고, 1x106 세포(100 ul PBS 중의)를 23-게이지 바늘을 사용하여 마취된 BALB/c 마우스에게 피하 주사하였다. 스톡 연구 약물을 투여일에 PBS 중에서 적합한 농도로 희석하고, 동물에게 5 ㎎/㎏의 항-PD-1 항체, 1.25 ㎎/㎏의 P390(마우스 IL-21-항-HSA) 또는 항-PD-1과 P390과의 조합을 총 4회 용량으로 주당 2회 IP 투여하였다. 종양 측정(길이(L) 및 너비(W))을 디지털 캘리퍼스를 사용하여 주당 2회 수집하고, 종양 부피를 계산하였다 (LxWxW)/2.
도 26에 도시된 바와 같이, 항-PD-1 및 P390 단독요법은 PBS 대조용에 비해 종양 성장에 대해 최소의 효과를 갖는다. 항-PD-1 및 P390의 조합은 종양 성장의 상승작용적 감소를 생성시키며, 이때 4/5 마우스는 22일까지 측정가능한 종양을 갖지 않는다.
실시예 35. 암 치료를 위한 IL-21-항-HSA 융합 단백질과 항-PD-1 항체와의 조합
MC38 세포를 10% FBS + 글루타맥스 + NEAA + 나트륨 피루베이트 + Pen/Strep이 보충된 DMEM 배지에서 배양하고 유지시켰다. 세포를 트립신처리하고, 배지로 세척하고 카운트하였다. 이어서 세포를 PBS로 세척하고, 0.5x106 세포(50 ul PBS 중의)를 18-게이지 바늘을 사용하여 마취된 C57BL/6 마우스(Taconic)에게 피하 주사하였다. 스톡 연구 약물을 투여일에 PBS 중에서 적합한 농도로 희석하고, 동물에게 PBS, 100 ㎍ 항-PD-1 항체, 25 pg P394(인간 IL-21-항-HSA), 또는 100 ul PBS 중의 25 pg P394와 함께 100 pg 항-PD-1을 총 5회 용량으로 주당 2회 IP 투여하였다. 종양 측정(길이(L) 및 너비(W))을 디지털 캘리퍼스를 사용하여 주당 2회 수집하고, 종양 부피를 산정하였다 (LxWxW)/2.
도 27에 도시된 바와 같이, IL-21-항-HSA(P394)와 항-PD-1 항체와의 조합은 동계 마우스 결장암 모델에서 어느 하나의 단독요법보다 종양 성장을 더 양호하게 감소시킨다.
실시예 36: IL-21-항-HSA 융합 단백질의 약동학적 평가
MC38 쥐 결장암 세포(1x106 세포)를 0일째에 C57BL/6 마우스의 옆구리에 피하 이식하였다. 마우스를 PBS 또는 25 pg P380(항-HSA-인간 IL-33)으로 2주간(총 4회 용량) 처리하였다. 종양 측정(길이(L) 및 너비(W))을 디지털 캘리퍼스를 사용하여 주당 3회 수집하고, 종양 부피를 계산하였다 (LxWxW)/2.
도 28에 도시된 바와 같이, 연장된 반감기 IL-33에 의한 처리는 PBS 대조용에 비해 종양 성장을 감소시켰다.
실시예 37: 그랜자임 B 양성 NK 세포 및 CD8 T 세포에 대한 IL-21-항-HSA 융합 단백질의 영향
MC38 쥐 결장암 세포(1x106 세포)를 0일째에 C57BL/6 마우스의 옆구리에 피하 이식하였다. 마우스를 PBS, 100 pg 항-PD-1, 25 pg P390(마우스 IL-21-항-HSA) 또는 100 pg 항-PD-1 + 25 pg P390으로, 5일째에 출발하여 총 5회 용량으로 주당 2회 처리하였다. 24일째에, 마우스를 죽이고 종양을 절제하였다. 종양을 균질화하여 세포를 방출시키고, 세포를 CD45, CD8, NK1.1 및 그랜자임 B에 대해 염색하였다. CD8 T 세포 및 NK 세포 중의 그랜자임 B 양성 세포의 백분율을 플롯팅한다.
도 29A-29B에 도시된 바와 같이, P390 처리는 그랜자임 B 양성 CD8 T 세포 및 NK 세포의 백분율을 증가시킨다.
실시예 38: IL-21 수용체의 발현에 대한 IL-21-항-HSA 융합 단백질 및 항-PD-1 항체의 병용의 영향
MC38 쥐 결장암 세포(1x106 세포)를 0일째에 C57BL/6 마우스의 옆구리에 피하 이식하였다. 마우스를 PBS, 100 ㎍ 항-PD-1, 25 pg P390(마우스 IL-21-항-HSA) 또는 100 pg 항-PD-1 + 25 pg P390으로, 5일째에 출발하여 총 5회 용량으로 주당 2회 처리하였다. 24일째에, 마우스를 죽이고 종양을 절제하였다. 종양을 균질화하여 세포를 방출시키고, 세포를 CD45, CD8, CD4, NK1.1 및 IL-21R에 대해 염색하였다. CD4 T 세포, CD8 T 세포 및 NK 세포 중의 IL-21R 양성 세포의 백분율을 플롯팅한다.
도 30A-30C에 도시된 바와 같이, 항-PD-1 항체에 의한 처리는 CD4 T 세포, CD8 T 세포 및 NK 세포에서 IL-21 수용체의 발현을 증가시키고, P390(마우스 IL-21-항-HSA)과 항-PD-1과의 조합에 의한 처리는 IL-21 수용체 발현을 감소시킨다.
실시예 39: IFN-감마 분비 면역세포에 대한 IL-21-항-HSA 융합 단백질의 영향
MC38 쥐 결장암 세포(1x106 세포)를 0일째에 C57BL/6 마우스의 옆구리에 피하 이식하였다. 마우스를 PBS, 100 pg 항-PD-1, 25 pg P390(마우스 IL-21-항-HSA) 또는 100 pg 항-PD-1 + 25 pg P390으로, 5일째에 출발하여 총 5회 용량으로 주당 2회 처리하였다. 24일째에, 마우스를 죽이고 마우스 비장을 제거하였다. 비장을 균질화하여 비장세포를 방출시키고, 비장세포를 신선한 MC38 세포와 함께 IFN-γ ELISpot 분석에 놓았다. ELISpot 분석을 제조사의 설명에 따라 실행하였으며, MC38 반응성 면역세포의 수를 나타내는 IFN-g 스폿의 수를 카운트하였다.
도 31에 도시된 바와 같이, 연장된 반감기 IL-21에 의한 처리는 비장에서 종양 반응성, IFN-γ 분비 면역세포의 수를 증가시킨다.
실시예 40: 연장된 반감기 IL-21과 항-MSLN 항체와의 융합
인간 메소텔린으로 형질감염된 CT26 마우스 세포(CT26/MSLN)를 10% FBS + 글루타맥스 + Pen/Strep이 보충된 RPMI 배지에서 배양하고 유지시켰다. 세포를 트립신처리하고, 배지로 세척하고 카운트하였다. 이어서 세포를 PBS로 세척하고, 1x106 세포(100 ul PBS 중의)를 23-게이지 바늘을 사용하여 마취된 BALB/c 마우스에게 피하 주사하였다. 스톡 연구 약물을 투여일에 PBS 중에서 적합한 농도로 희석하고, 동물에게 1.25 ㎎/㎏(100 ul)의 P375(IL-21-항-알부민-항-MSLN)을 총 5회 용량으로 주당 2회 IP 투여하였다. 종양 측정(길이(L) 및 너비(W))을 디지털 캘리퍼스를 사용하여 주당 2회 수집하고, 종양 부피를 계산하였다 (LxWxW)/2.
도 32에 도시된 바와 같이, IL-21-항-알부민-항-MSLN 융합 단백질(P375)은 PBS 대조용에 비해 종양 성장을 감소시킬 수 있었다.
실시예 41: 연장된 반감기 IL-15Ra/IL-15와 항-MSLN 항체와의 융합
NCI-N87 세포를 10% FBS + 글루타맥스 + Pen/Strep이 보충된 RPMI 배지에서 배양하고 유지시켰다. 세포를 트립신처리하고, 배지로 세척하고 카운트하였다. 이어서 세포를 PBS로 세척하고, 3x106 세포(100 ul PBS 중의)를 23-게이지 바늘을 사용하여 마취된 NSG 마우스(Jackson)에게 피하 주사하였다. 6일 후에, 10x106 인간 PBMC를 마우스당 100 ul PBS 중에서 꼬리 정맥내에 주사하였다. 스톡 연구 약물 P197을 투여일에 PBS 중에서 적합한 농도로 희석하고, 동물에게 0.25 ㎎/㎏(100 ul)의 P669(항-MSLN-항-알부민-IL-15Ra-IL-15)를 총 5회 용량으로 주당 2회 IP 투여하였다. 종양 측정(길이(L) 및 너비(W))을 디지털 캘리퍼스를 사용하여 주당 2회 수집하고, 종양 부피를 계산하였다 (LxWxW)/2.
도 33에 도시된 바와 같이, 항-MSLN-항-알부민-IL-15Ra-IL-15 융합 단백질(P669)은 PBS 대조용에 비해 종양 성장을 감소시킬 수 있었다.
실시예 42.
파이퍼 세포를, 10% 소 태아 혈청 및 페니실린/스트렙토마이신을 함유하는 RPMI-1640에서 유지시켰다. 100,000 파이퍼 세포를, 10 mM HEPES를 함유하는 행크스 균형 염 용액 중에서 37℃, 5% CO2에서 30분간 표시된 농도의 재조합 인간 P394(IL-2l-(GSG)4-HSA), P593(IL21-A(EAAAK)4A-HAS), P795(IL2l[l-l22]-(GSG)4-HSA), P796(IL21[1-122]-(G4S)3-HSA), P797(IL21[1-122]-HSA), P799(IL21[1-122]-VLLC-HSA), P800(IL21[1-122]-VHCH1-HSA), P750(IL21-(GSG)4-HSA), P751(IL21-A(EAAAK)4A-HSA), 또는 P744(IL2l[l-l22]-A(EAAAK)4A-HSA)로 처리하였다. 포스포-STAT3를 제조사의 설명에 따라 포스포-STAT3(Tyr705) 동종 시간 분해 형광(HERE) 분석(Cisbio)을 사용하여 측정하였다. 665 ㎚/620 ㎚의 신호비에 100을 곱하여, 플롯팅하고 용량 반응 곡선(Graphpad Prism)을 사용하여 적합시켜 EC50을 계산하였다.
도 34에 도시된 바와 같이, 시험된 모든 IL-21 융합 단백질은 유사한 ADCC 활성을 갖는다.
실시예 43.
NCI-N87 암세포주를 10% 소 태아 혈청 및 페니실린/스트렙토마이신을 함유하는 RPMI-1640에서 유지시켰다. 0일째에, 10,000 NCI-N87 세포/웰을 96-웰 편평 바닥 플레이트 중의 배양 배지에 도말하였다. 1일째에, NK 세포를 RosetteSep NK 단리 키트(Stemcell Technologies)를 사용하여 인간 버피 코트로부터 단리하고, 100,000 NK 세포/웰을 표시된 처리와 함께 암세포에 가하였다. 플레이트를 37℃, 5% CO2에서 48시간 동안 배양하고, 이어서 세포를 4% 파라포름알데히드로 고정시키고 핵을 Sytox Orange로 염색하였다. 남은 암세포의 수를, Cytation 1(Biotek)을 사용하여 각 웰 중에 남은 암세포 핵의 수를 세어 산정하였다. 보다 낮은 세포수는 보다 양호한 NK 매개된 세포 사멸을 가리켰다. (P593(IL21-A(EAAAK)4A-HAS), P795(IL21[1-122]-(GSG)4-HSA), P796(IL2l[l-l22]-(G4S)3-HSA), P797(IL21[1-122]-HSA), P799(IL2l[l-l22]-VLLC-HSA), P800(IL2l[l-122]-VHCH1-HSA), P750(IL2l-(GSG)4-HSA), P751(IL21-A(EAAAK)4A-HSA), 또는 P744(IL21[1-122]-A(EAAAK)4A-HS A).
도 35에 도시된 바와 같이, 시험된 모든 IL-21 융합 단백질은 유사한 ADCC 활성을 갖는다.
서열표
Figure pct00014
Figure pct00015
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Figure pct00017
Figure pct00018
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Figure pct00020
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Figure pct00024
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Figure pct00026
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Claims (47)

  1. a) 사이토카인 및 b) 알부민 결합 모이어티(moiety)를 포함하는 융합 단백질(fusion protein)로서, 사이토카인이 IL-21, IL-7, IL-15, IL-15Ra에 결합된 IL-15 또는 이의 단편, IL-33 및 IL-22로 이루어지는 그룹 중에서 선택되는 융합 단백질.
  2. a) 알부민 결합 모이어티에 융합된 사이토카인("사이토카인-ALBBM") 및 b) 항원 결합 모이어티를 포함하는 융합 단백질로서, 사이토카인-ALBBM과 항원 결합 모이어티간의 결합이 임의로 절단가능한 융합 단백질.
  3. 제2항에 있어서,
    사이토카인이 IL-21, IL-7, IL-15, IL-15Ra에 결합된 IL-15 또는 이의 단편, IL-33 및 IL-22로 이루어지는 그룹 중에서 선택되는 융합 단백질.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서,
    사이토카인이 IL-21, IL-33 및 IL-7 중에서 선택되는 융합 단백질.
  5. 제4항에 있어서,
    사이토카인이 IL-21인 융합 단백질.
  6. 제5항에 있어서,
    IL-21이 서열번호 1, 2, 126, 171 또는 172의 아미노산 서열 또는 서열번호 1, 2, 126, 171 또는 172에 적어도 약 80%의 서열 동일성(sequence identity)을 포함하는 이의 변이체(variant)를 포함하는 융합 단백질.
  7. 제5항 또는 제6항에 있어서,
    IL-21이 서열번호 126, 171 또는 172의 아미노산 서열을 포함하는 트렁케이트된(truncated) IL-21인 융합 단백질.
  8. 제4항에 있어서,
    사이토카인이 IL-33인 융합 단백질.
  9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서,
    알부민 결합 모이어티가, 알부민에 특이적으로 결합하는 단일 도메인 항체(sdAb)를 포함하는 융합 단백질.
  10. 제9항에 있어서,
    항-알부민 sdAb가 약 5.5의 pH 및 약 7.5의 pH에서 약 1 내지 약 200 nM의 해리 상수(KD)를 갖는 융합 단백질.
  11. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서,
    알부민 결합 모이어티가 사이토카인의 C-말단에 융합되는 융합 단백질.
  12. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서,
    알부민 결합 모이어티가 사이토카인의 N-말단에 융합되는 융합 단백질.
  13. 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서,
    사이토카인 및 알부민 결합 모이어티가 제1 링커(linker)를 통해 연결되는 융합 단백질.
  14. 제13항에 있어서,
    제1 링커가 서열번호 12-26 및 158-159로 이루어지는 그룹 중에서 선택되는 융합 단백질.
  15. 제13항 또는 제14항에 있어서,
    제1 링커가 가요성 링커(flexible linker)인 융합 단백질.
  16. 제13항 또는 제14항에 있어서,
    제1 링커가 강성 링커(rigid linker)인 융합 단백질.
  17. 제1항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서,
    서열번호 120-125, 129-154, 및 160-167 중 어느 하나의 아미노산 서열, 또는 서열번호 120-125, 129-154, 및 160-167 중 어느 하나에 적어도 약 80%의 서열 동일성을 포함하는 이의 변이체를 포함하는 융합 단백질.
  18. 제2항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서,
    항원 결합 모이어티가 제2 링커를 통해 사이토카인-ALBBM에 융합되는 융합 단백질.
  19. 제18항에 있어서,
    제2 링커가 절단가능한 융합 단백질.
  20. 제19항에 있어서,
    절단가능한 링커가 기질(matrix) 메탈로프로테아제, 레구마인(legumain), 매트립타제, 또는 유로키나제 민감성인 융합 단백질.
  21. 제2항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서,
    항원 결합 모이어티가 종양 항원에 결합하는 융합 단백질.
  22. 제21항에 있어서,
    종양 항원이 메소텔린("MSLN"), GPA33, Her-2, EGFR 및 CD20으로 이루어지는 그룹 중에서 선택되는 융합 단백질.
  23. 제21항에 있어서, 종양 항원이 CEA, MUC16, MUC1, AFP, EPCAM, CD19, CD21, CD22, CD30, CD33, CD37, CD45, PSMA, 및 BCMA로 이루어지는 그룹 중에서 선택되는 융합 단백질.
  24. 제1항 내지 제23항 중 어느 한 항의 융합 단백질을 포함하는 약학 조성물.
  25. 개체(individual)에게 제1항 내지 제23항 중 어느 한 항의 융합 단백질 또는 제24항의 약학 조성물을 투여함을 포함하는, 상기 개체에서 질병 또는 상태를 치료하는 방법.
  26. 제25항에 있어서,
    제2 제제(agent)를 투여함을 또한 포함하는 방법.
  27. 개체에게 a) i) 사이토카인 및 ii) 사이토카인에 융합된 반감기 연장 도메인을 포함하는 융합 단백질; 및 b) 제2 제제를 투여함을 포함하는, 상기 개체에서 질병 또는 상태를 치료하는 방법.
  28. 제26항 또는 제27항에 있어서,
    제2 제제가 치료 항체, 면역관문 억제제(immune checkpoint inhibitor), 제2 사이토카인, 화학요법제, 티로신 키나제 억제제, 또는 면역세포를 포함하는 방법.
  29. 제27항 또는 제28항에 있어서,
    반감기 연장 도메인이 알부민 결합 모이어티인 방법.
  30. 제25항 내지 제29항 중 어느 한 항에 있어서,
    질병 또는 상태가 암인 방법.
  31. 제30항에 있어서,
    암이 중피종, 폐암, 유방암, 난소암, 췌장암, 림프종, 백혈병, 두경부암, 간암, 식도암, 위암 및 결장직장암으로 이루어지는 그룹 중에서 선택되는 방법.
  32. 제31항에 있어서,
    암이 중피종, 폐암, 난소암 및 위암으로 이루어지는 그룹 중에서 선택되는 방법.
  33. 제30항 내지 제32항 중 어느 한 항에 있어서,
    사이토카인이 IL-21, IL-7, IL-15, IL-15Ra에 결합된 IL-15 또는 이의 단편, 및 IL-33으로 이루어지는 그룹 중에서 선택되는 방법.
  34. 제33항에 있어서,
    제2 제제를 투여함을 포함하며, 제2 제제가 치료 항체인 방법.
  35. 제34항에 있어서,
    치료 항체가, 메소텔린(MSLN), GPA33, Her-2(ERBB2), EGFR, 및 CD20(MS4A1)로 이루어지는 그룹 중에서 선택된 종양 항원에 결합하는 방법.
  36. 제34항에 있어서,
    치료 항체가, CEA, MUC16, MUC1, AFP, EPCAM, CD19, CD21, CD22, CD30, CD33, CD37, CD45, PSMA, 및 BCMA로 이루어지는 그룹 중에서 선택된 종양 항원에 결합하는 방법.
  37. 제35항에 있어서,
    치료 항체가 메소텔린에 결합하는 방법.
  38. 제35항에 있어서,
    치료 항체가 Her2에 결합하는 방법.
  39. 제33항에 있어서,
    제2 제제를 투여함을 포함하며, 제2 제제가 면역관문 조절제인 방법.
  40. 제39항에 있어서,
    면역관문 조절제가 PD-L1, CTLA4, PD-L2, PD-l, 4-1BB, CD47, TIGIT, GITR, TIM3, LAG3, CD27, 및 B7H4로 이루어지는 그룹 중에서 선택된 면역관문 단백질의 억제제인 방법.
  41. 제40항에 있어서,
    면역관문 조절제가, PD-1에 결합하는 항체인 방법.
  42. 제40항에 있어서,
    면역관문 조절제가, CTLA4에 결합하는 항체인 방법.
  43. 제33항에 있어서,
    제2 제제를 투여함을 포함하며, 제2 제제가 제2 사이토카인인 방법.
  44. 제43항에 있어서,
    융합 단백질 중의 사이토카인이 IL-21이며, 제2 사이토카인이 IL-7, IL-15, IL15Ra에 결합된 IL15 또는 이의 반감기 연장된 변이체로 이루어지는 그룹 중에서 선택되는 방법.
  45. 제30항에 있어서,
    질병 또는 상태가 염증 질병인 방법.
  46. 제45항에 있어서,
    사이토카인이 IL-22인 방법.
  47. 제25항 내지 제46항 중 어느 한 항에 있어서,
    개체가 인간인 방법.
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