TWI853818B

TWI853818B - 細胞激素融合蛋白及其用途

Info

Publication number: TWI853818B
Application number: TW108121163A
Authority: TW
Inventors: 子洋鐘; 葉帆; 馬修希格; 嘉寧黃; 艾瑞克廖; 雨敏李
Original assignee: 美商安維塔生物科學股份有限公司
Priority date: 2018-06-18
Filing date: 2019-06-18
Publication date: 2024-09-01

Abstract

本申請案提供融合蛋白，其包含融合至白蛋白結合部分之細胞激素。該等融合蛋白可進一步包含抗原結合部分，諸如治療抗體。本申請案亦提供製造及使用該等融合蛋白之方法。本申請案亦提供治療方法，其包含投與包含融合至半衰期延長域之細胞激素的融合蛋白及第二藥劑。

Description

細胞激素融合蛋白及其用途

本申請案係關於融合蛋白、其製造方法及藉由投與融合蛋白治療疾病或病症之方法。

細胞激素療法為刺激免疫系統誘導針對疾病(諸如癌症或感染)之免疫反應的有效策略。然而，向患者投與之細胞激素一般具有短半衰期。舉例而言，介白素-21刺激各種免疫細胞(諸如T、B及NK細胞)且增強抗腫瘤活性。據報導，重組IL-21之半衰期為靜脈內投藥後約1至3小時。參見Schmidt H, Clin Cancer Res. 2010年11月1日;16 (21):5312-9。

因此，需要開發有效治療疾病之新型細胞激素治療劑。

本文所提及之所有公開案、專利、專利申請案及公開專利申請案之揭示內容特此以全文引用的方式併入本文中。

本申請案提供融合蛋白，其包含：a)細胞激素，及b)白蛋白結合部分(諸如結合至白蛋白之sdAb)。在一些實施例中，細胞激素選自由以下組成之群：IL-21、IL-7、IL-15、結合至IL-15Rα之IL-15或其片段、IL-33及IL-22。在一些實施例中，融合蛋白進一步包含抗原結合部分。

本申請案亦提供融合蛋白，其包含：a)融合至白蛋白結合部分之細胞激素(「細胞激素-ALBBM」)，及b)抗原結合部分，其中細胞激素-ALBBM與抗原結合部分之間的鍵視情況可裂解。在一些實施例中，細胞激素選自由以下組成之群：IL-21、IL-7、IL-15、結合至IL-15Rα之IL-15或其片段、IL-33及IL-22。在一些實施例中，抗原結合部分融合至細胞激素-ALBBM之C端。在一些實施例中，抗原結合部分融合至細胞激素-ALBBM之N端。在一些實施例中，抗原結合部分係經由第二連接子融合至細胞激素-ALBBM。在一些實施例中，第二連接子之長度為約一至三十個胺基酸。在一些實施例中，第二連接子為可裂解的。在一些實施例中，可裂解連接子為基質金屬蛋白酶、豆莢蛋白、間質蛋白酶或尿激酶敏感性的。在一些實施例中，第二連接子選自由SEQ ID NO: 12-45及158-159組成之群。在一些實施例中，抗原結合部分結合至腫瘤抗原。在一些實施例中，腫瘤抗原選自由以下組成之群：間皮素(「MSLN」)、GPA33、Her-2、EGFR及CD20。在一些實施例中，腫瘤抗原選自由以下組成之群：CEA、MUC16、MUC1、AFP、EPCAM、CD19、CD21、CD22、CD30、CD33、CD37、CD45、PSMA及BCMA。在一些實施例中，抗原結合部分為抗體或其片段。在一些實施例中，抗原結合部分包含單域抗體(sdAb)。在一些實施例中，抗原結合部分包含V_H H單域抗體。在一些實施例中，sdAb結合至間皮素。

在根據上文所述之任何融合蛋白的一些實施例中，細胞激素為IL-21。在一些實施例中，IL-21包含SEQ ID NO: 1、2、126、171或172之胺基酸序列，或與SEQ ID NO: 1、2、126、171或172包含至少約80% (諸如至少約80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%中之任一者)序列一致性之其變異體。

在根據上文所述之任何融合蛋白的一些實施例中，白蛋白結合部分結合至人類血清白蛋白(HSA)及/或食蟹獼猴血清白蛋白(CMSA)。

在根據上文所述之任何融合蛋白的一些實施例中，白蛋白結合部分包含白蛋白結合域(ABD)。

在根據上文所述之任何融合蛋白的一些實施例中，白蛋白結合域包含選自由SEQ ID NO: 3-11組成之群的胺基酸序列，或與SEQ ID NO: 3-11中之任一者包含至少約80% (諸如至少約80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%中之任一者)序列一致性之其變異體。

在根據上文所述之任何融合蛋白的一些實施例中，白蛋白結合部分包含單域抗體(sdAb)。在一些實施例中，sdAb為V_H H單域抗體。

在根據上文所述之任何融合蛋白的一些實施例中，白蛋白結合部分融合至細胞激素之C端。

在根據上文所述之任何融合蛋白的一些實施例中，白蛋白結合部分融合至細胞激素之N端。

在根據上文所述之任何融合蛋白的一些實施例中，細胞激素及白蛋白結合部分係經由第一連接子連接。在一些實施例中，第一連接子之長度為約一至三十個胺基酸。在一些實施例中，第一連接子選自由SEQ ID NO: 12-26及158-159組成之群。

本申請案亦提供包含上文所述之融合蛋白中之任一者的醫藥組合物。

本申請案亦提供治療個體之疾病或病況之方法，其包含向該個體投與上文所述之融合蛋白醫藥組合物中之任一者。在一些實施例中，該方法進一步包含投與第二藥劑。

本申請案亦提供治療個體之疾病或病況之方法，其包含向該個體投與a)包含i)細胞激素及ii)融合至細胞激素之半衰期延長域的融合蛋白；及b)第二藥劑。在一些實施例中，半衰期延長域為白蛋白結合部分。在一些實施例中，半衰期延長域為白蛋白。在一些實施例中，半衰期延長域為Fc片段。在一些實施例中，Fc片段選自由以下組成之群：IgG1、IgG2、IgG3及IgG4 Fc片段或其變異體。在一些實施例中，Fc片段為IgG1 Fc片段或其變異體。在一些實施例中，IgG1 Fc片段或其變異體包含位置297處之突變，其中位置297處之胺基酸係突變為丙胺酸、天冬胺酸或甘胺酸。在一些實施例中，個體為人類。在一些實施例中，疾病或病況係選自由以下組成之群：癌症、發炎性病況及感染。

在根據上文所述之任何方法的一些實施例中，疾病或病況為發炎疾病。在一些實施例中，細胞激素為IL-22。在一些實施例中，疾病係選自由以下組成之群：潰瘍性結腸炎、克羅恩氏病(Crohn's disease)或潰瘍性迴腸炎，及腸移植物抗宿主病。

在根據上文所述之任何方法之一些實施例中，疾病或病況為癌症。在一些實施例中，癌症為實體或液體腫瘤。在一些實施例中，癌症係選自由以下組成之群：間皮瘤、肺癌、乳癌、卵巢癌、胰臟癌、淋巴瘤、白血病、頭頸癌、肝癌、食道癌、胃癌及結腸直腸癌。在一些實施例中，癌症係選自由以下組成之群：間皮瘤、肺癌、卵巢癌及胃癌。在一些實施例中，細胞激素係選自由以下組成之群：IL-21、IL-7、IL-15、結合至IL-15Rα之IL-15或其片段及IL-33。

在根據上文所述之任何方法的一些實施例中，融合蛋白約每三週投與一次至約一週投與兩次。

在根據上文所述之任何方法的一些實施例中，每次投與之融合蛋白的量為約100 ng/kg至約10 mg/kg。

在根據上文所述之任何方法的一些實施例中，融合蛋白係非經腸投與至個體。在一些實施例中，融合蛋白係靜脈內或皮下投與至個體。

在根據上文所述之任何方法的一些實施例中，融合蛋白在各治療週期投與至少約一週至六個月。

在根據上文所述之任何方法的一些實施例中，第二藥劑包含治療抗體、免疫檢查點抑制劑、第二細胞激素、化學治療劑、酪胺酸激酶抑制劑或免疫細胞。在一些實施例中，第二藥劑為治療抗體。在一些實施例中，治療抗體結合至腫瘤抗原。在一些實施例中，腫瘤抗原選自由以下組成之群：間皮素(MSLN)、GPA33、Her-2 (ERBB2)、EGFR及CD20 (MS4A1)。在一些實施例中，腫瘤抗原選自由以下組成之群：CEA、MUC16、MUC1、AFP、EPCAM、CD19、CD21、CD22、CD30、CD33、CD37、CD45、PSMA及BCMA。在一些實施例中，腫瘤抗原為間皮素。在一些實施例中，第二藥劑為抗間皮素抗體或其片段。在一些實施例中，抗間皮素抗體或其片段包含有包含抗間皮素重鏈可變區(抗MSLN V_H )之單鏈抗體，其中：a)該抗MSLN V_H 包含有包含SEQ ID NO: 46之胺基酸序列之CDR1、包含SEQ ID NO: 47之胺基酸序列的CDR2及包含SEQ ID NO: 48之胺基酸序列之CDR3，或在CDR中包含至多總共3、2或1個胺基酸取代之其變異體；或b)該抗MSLN V_H 包含有包含SEQ ID NO: 49之胺基酸序列之CDR1、包含SEQ ID NO: 50之胺基酸序列的CDR2及包含SEQ ID NO: 51之胺基酸序列之CDR3，或在CDR中包含至多總共3、2或1個胺基酸取代之其變異體。在一些實施例中，結合至間皮素之第二藥劑約每月投與一次至約每週投與兩次。在一些實施例中，每次投與之第二藥劑的量為約100 ng/kg至約100 mg/kg。在一些實施例中，第二藥劑為免疫檢查點調節劑。在一些實施例中，免疫檢查點調節劑為選自由以下組成之群的免疫檢查點蛋白之抑制劑：PD-L1、CTLA4、PD-L2、PD-1、CD47、TIGIT、GITR、TIM3、LAG3、CD27、4-1BB及B7H4。在一些實施例中，免疫檢查點蛋白為PD-1。在一些實施例中，第二藥劑為抗PD-1抗體或其片段。在一些實施例中，每次投與之第二藥劑的量為約1 μg/kg至約100 mg/kg。在一些實施例中，第二藥劑為第二細胞激素。在一些實施例中，融合蛋白中之細胞激素為IL-21，且其中第二細胞激素選自由以下組成之群：IL-7、IL-15、結合至IL15Rα之IL15或其半衰期延長變異體。在一些實施例中，第二藥劑為免疫細胞。在一些實施例中，免疫細胞包含T細胞或NK細胞。在一些實施例中，免疫細胞包含表現嵌合抗原受體(CAR)之T細胞、表現經修飾T細胞受體(TCR)之T細胞或自腫瘤分離之T細胞。在一些實施例中，第二藥劑為酪胺酸激酶抑制劑。在一些實施例中，第二藥劑係非經腸或經口投與至個體。在一些實施例中，第二藥劑係非經腸投與至個體。在一些實施例中，第二藥劑係靜脈內投與至個體。

在根據上文所述之任何方法的一些實施例中，融合蛋白及第二藥劑係同時、並行或依序投與至個體。

相關申請案之交叉引用

本申請案主張2018年6月18日申請之美國臨時申請案序號62/686,481及2019年2月22日申請之美國臨時申請案序號62/809,496之優先權。此等申請案之全部內容出於所有目的以引用之方式併入本文中。

本申請案係關於包含細胞激素及半衰期延長域之融合蛋白。在一些實施例中，細胞激素選自由以下組成之群：IL-21、IL-7、IL-15、結合至IL-15Rα之IL-15或其片段、IL-33及IL-22。在一些實施例中，融合蛋白包含a)融合至白蛋白結合部分之細胞激素(「細胞激素-ALBBM」)，及b)抗原結合部分；細胞激素-ALBBM與抗原結合部分之間的鍵視情況可裂解。

本申請案另外提供治療疾病或病症(諸如癌症或發炎疾病)之方法，其包含投與如上文所述之融合蛋白。在一些實施例中，該方法包含投與a)包含i)細胞激素及ii)半衰期延長域之融合蛋白，及b)第二藥劑。例示性第二藥劑包括且不限於治療劑、免疫檢查點抑制劑、第二細胞激素、酪胺酸激酶抑制劑、化學治療劑或免疫細胞。

亦提供包含本文所述之雙特異性抗體之組合物、套組及製品及其製造方法。 I. 定義

術語「抗體」係在其最廣泛意義上使用且涵蓋各種抗體結構，包括但不限於單株抗體、多株抗體、多特異性抗體(例如雙特異性抗體)、全長抗體及其抗原結合片段，只要其展現所需抗原結合活性。術語「抗體部分」係指全長抗體或其抗原結合片段。

「經分離」抗體(或構築體)為已自其產生環境之組分鑑別、分離及/或回收之抗體(或構築體)(例如天然或重組)。較佳地，經分離多肽與來自其產生環境之所有其他組分無關聯。其產生環境之污染物組分(諸如由重組轉染細胞產生的組分)為通常將干擾抗體之研究、診斷或治療用途之物質，且可包括酶、激素及其他蛋白質或非蛋白質溶質。在較佳實施例中，多肽將經純化：(1)至超過95重量%之抗體，如藉由例如勞立法(Lowry method)所測定，且在一些實施例中，至超過99重量%；(2)至足以藉由使用旋杯式定序儀獲得N端或內部胺基酸序列之至少15個殘基的程度；或(3)至均質，如藉由SDS-PAGE在非還原或還原條件下使用庫馬斯藍(Coomassie Blue)或較佳銀染色劑。經分離抗體(或構築體)包括重組細胞內之原位抗體，因為抗體之天然環境的至少一種組分將不存在。然而，通常，經分離多肽、抗體或構築體將藉由至少一個純化步驟來製備。

全長抗體包含兩個重鏈及兩個輕鏈。輕鏈及重鏈之可變區負責抗原結合。重鏈及輕鏈之可變域可分別稱為「V_H 」及「V_L 」。兩種鏈中之可變區一般均含有三個高度可變環，稱為互補決定區(CDR)(包括LC-CDR1、LC-CDR2及LC-CDR3之輕鏈(LC) CDR及包括HC-CDR1、HC-CDR2及HC-CDR3之重鏈(HC) CDR)。本文所揭示之抗體及抗原結合片段之CDR邊界可藉由Kabat、Chothia或Al-Lazikani公約(Al-Lazikani 1997；Chothia 1985；Chothia 1987；Chothia 1989；Kabat 1987；Kabat 1991)界定或鑑別。重鏈或輕鏈之三個CDR插入於稱為構架區(FR)之側接伸長部之間，該等側接伸長部比CDR更高度保守且形成支撐高變環之架構。重鏈及輕鏈之恆定區不參與抗原結合，但展現各種效應功能。抗體基於其重鏈之恆定區之胺基酸序列分配至各種類別。五種主要類別或同型之抗體為IgA、IgD、IgE、IgG及IgM，其特徵為分別存在α、δ、ε、γ及μ重鏈。若干主要抗體類別分成子類，如lgG1(γ1重鏈)、lgG2(γ2重鏈)、lgG3(γ3重鏈)、lgG4(γ4重鏈)、lgA1(α1重鏈)或lgA2(α2重鏈)。

術語「全長抗體」、「完整抗體」或「完全抗體」可互換使用以指呈基本上完整形式(與抗體片段相反)之抗體。特定言之，全長4鏈抗體包括具有重鏈及輕鏈(包括Fc區)的抗體。全長僅重鏈抗體包括重鏈可變域(諸如V_H H)及Fc區。恆定域可為原生序列恆定域(例如人類原生序列恆定域)或其胺基酸序列變異體。在一些情況下，完整抗體可具有一或多種效應功能。

抗體之「可變區」或「可變域」係指抗體之重鏈或輕鏈之胺基端域。重鏈及輕鏈之可變域可分別稱為「V_H 」及「V_L 」。此等域一般為抗體變化最大之部分(相對於同種類之其他抗體)且含有抗原結合位點。來自駱駝物種之僅重鏈抗體具有單一重鏈可變區，其稱為「V_H H」。V_H H因此為一類特殊的VH。

如本文所用，術語「抗原結合片段」係指抗體片段，包括例如雙功能抗體、Fab、Fab'、F(ab')2、Fv片段、二硫鍵穩定化Fv片段(dsFv)、(dsFv)2、雙特異性dsFv (dsFv-dsFv')、二硫鍵穩定化雙功能抗體(ds雙功能抗體)、單鏈Fv (scFv)、scFv二聚體(二價雙功能抗體)、由包含一或多個CDR之抗體的一部分形成之多特異性抗體、駱駝化單域抗體、奈米抗體、域抗體、二價域抗體，或結合至抗原但不包含完整抗體結構之任何其他抗體片段。抗原結合片段能夠結合至與親本抗體或親本抗體片段(例如親本scFv)所結合相同之抗原。在一些實施例中，抗原結合片段可包含接枝至來自一或多種不同人類抗體之構架區的來自特定人類抗體之一或多個CDR。

「Fv」為含有完整抗原識別及抗原結合位點之最小抗體片段。此片段由緊密、非共價締合之一個重鏈可變區域與一個輕鏈可變區域之二聚體組成。自此兩個域之摺疊發出六個高變環(各來自重鏈及輕鏈之3個環)，其促進胺基酸殘基之抗原結合且向抗體賦予抗原結合特異性。然而，即使單一可變域(或僅包含三個特異性針對抗原之CDR之Fv之一半)能夠識別及結合抗原，但親和力比整個結合位點低。

「單鏈Fv」(亦縮寫為「sFv」或「scFv」)為包含連接至單一多肽鏈中之V_H 及V_L 抗體域的抗體片段。在一些實施例中，scFv多肽在V_H 與V_L 域之間進一步包含多肽連接體，其使得scFv能夠形成用於抗原結合的所需結構。關於scFv之綜述，參見Plückthun,The Pharmacology of Monoclonal Antibodies , 第113卷, Rosenburg及Moore編, Springer-Verlag, New York, 第269-315頁 (1994)。

術語「僅重鏈抗體」或「HCAb」係指功能抗體，其包含重鏈，但不具有通常發現於4-鏈抗體中之輕鏈。已知駱駝科動物(諸如駱駝、駱馬或羊駝)產生HCAb。

術語「單域抗體(single-domain antibody)」、「單域抗體(single domain antibody)」或「sdAb」係指具有三個互補決定區(CDR)之單一抗原結合多肽。單獨的sdAb能夠在不與對應含CDR之多肽配對的情況下結合至抗原。在一些情況下，單域抗體係自駱駝科HCAb工程化，且其重鏈可變域在本文中稱為「V_H H」(重鏈抗體之重鏈的可變域)。駱駝科sdAb為已知的最小抗原結合抗體片段中之一者(參見例如Hamers-Casterman等人, Nature 363:446-8 (1993)；Greenberg等人, Nature 374:168-73 (1995)；Hassanzadeh-Ghassabeh等人, Nanomedicine (Lond), 8:1013-26 (2013))。基本V_H H自N端至C端具有以下結構：FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4，其中FR1至FR4分別係指構架1至4，且其中CDR1至CDR3係指互補決定區1至3。

當在本文中使用時，術語「高變區」、「HVR」或「HV」係指抗體可變域中序列具有高變性及/或形成結構上界定之環的區域。一般而言，單域抗體包含三種HVR (或CDR)：HVR1 (或CDR1)、HVR2 (或CDR2)及HVR3 (或CDR3)。HVR3 (或CDR3)顯示三種HVR之大部分多樣性，且在賦予抗體精細特異性中起獨特作用。參見例如Hamers-Casterman等人, Nature 363:446-448 (1993)；Sheriff等人, Nature Struct. Biol. 3:733-736 (1996)。

如本文所用，術語「CDR」或「互補決定區」欲意謂重鏈與輕鏈多肽之可變區內存在的非鄰接抗原組合位點。此等特定區已由Kabat等人, J. Biol. Chem. 252:6609-6616 (1977)；Kabat等人, U.S. Dept. of Health and Human Services, 「Sequences of proteins of immunological interest」 (1991)；Chothia等人, J. Mol. Biol. 196:901-917 (1987)；Al-Lazikani B.等人,J . Mol . Biol . , 273: 927-948 (1997)；MacCallum等人, J. Mol. Biol. 262:732-745 (1996)；Abhinandan及Martin,Mol . Immunol ., 45: 3832-3839 (2008)；Lefranc M.P.等人,Dev . Comp . Immunol . , 27: 55-77 (2003)；及Honegger及Plückthun,J . Mol . Biol . , 309:657-670 (2001)描述，其中定義包括當彼此比較時之胺基酸殘基重疊或亞群。儘管如此，使用任一定義來提及抗體或接枝抗體之CDR或其變體意欲屬於如本文所定義及使用之術語的範疇。涵蓋如由上述各參考文獻所定義之CDR的胺基酸殘基闡述於下表1中作為比較。CDR預測演算法及界面為此項技術中已知的，包括例如Abhinandan及Martin,Mol . Immunol . , 45: 3832-3839 (2008)；Ehrenmann F.等人,Nucleic Acids Res . , 38: D301-D307 (2010)；及Adolf-Bryfogle J.等人,Nucleic Acids Res . , 43: D432-D438 (2015)。此段落中所引用之參考文獻之內容以全文引用的方式併入本文中，用於本申請案中且可能包括於本文之一或多個技術方案中。表 1 ： CDR 定義 ¹ 殘基編號遵循Kabat等人, 前述之命名法² 殘基編號遵循Chothia等人, 前述之命名法³ 殘基編號遵循MacCallum等人, 前述之命名法⁴ 殘基編號遵循Lefranc等人, 前述之命名法⁵ 殘基編號遵循Honegger及Plückthun, 前述之命名法

表述「如Kabat中之可變域殘基編號」或「如Kabat中之胺基酸位置編號」及其變體係指Kabat等人,同上文中用於抗體之編譯之重鏈可變域或輕鏈可變域之編號系統。使用此編號系統，實際線性胺基酸序列可含有對應於可變域之FR或HVR之縮短或向其中之插入的較少或額外胺基酸。舉例而言，重鏈可變域可包括H2之殘基52之後的單一胺基酸插入(根據Kabat之殘基52a)及重鏈FR殘基82之後的插入殘基(例如根據Kabat之殘基82a、82b及82c等)。對於既定抗體，可藉由將抗體序列之同源區與「標準」Kabat編號序列比對來確定殘基之Kabat編號。

除非本文另外指明，否則免疫球蛋白重鏈中殘基之編號係如Kabat等人, 前述中之EU索引之編號。「Kabat中之EU指數」係指人類IgG1 EU抗體之殘基編號。

「構架」或「FR」殘基為除如本文所定義之CDR殘基外的彼等可變域殘基。

非人類(例如嚙齒動物)抗體之「人類化」形式為含有源自非人類抗體之最小序列之嵌合抗體。在極大程度上，人類化抗體為人類免疫球蛋白(受體抗體)，其中來自受體的高變區(HVR)之殘基經來自諸如具有期望抗體特異性、親和力及能力之小鼠、大鼠、家兔或非人類靈長類動物之非人類物種(供體抗體)的高變區之殘基置換。在一些情況下，人類免疫球蛋白之構架區(FR)殘基經相應非人類殘基置換。此外，人類化抗體可包含在接受者抗體或供體抗體中未發現之殘基。進行此等修飾以進一步改進抗體效能。一般而言，人類化抗體將包含至少一個且通常兩個可變域中的基本上所有可變域，其中所有或基本上所有高變環對應於非人類免疫球蛋白之高變環且所有或基本上所有FR為人類免疫球蛋白序列之FR。人類化抗體視情況亦將包含免疫球蛋白恆定區(Fc)之至少一部分，通常，人類免疫球蛋白之恆定區的至少一部分。關於其他細節，參見Jones等人,Nature 321:522-525 (1986)；Riechmann等人,Nature 332:323-329 (1988)；及Presta,Curr. Op. Struct. Biol. 2:593-596 (1992)。

關於本文中鑑別之多肽及抗體序列的「胺基酸序列一致性百分比(%)」或「同源性」定義為在序列比對後，在將任何保守取代視為序列一致性之一部分的情況下，候選序列中與所比較多肽中胺基酸殘基一致的胺基酸殘基之百分比。出於測定胺基酸序列一致性百分比目的之比對可以此項技術中之技能範圍內的各種方式達成，例如使用公開可用之電腦軟體，諸如BLAST、BLAST-2、ALIGN、Megalign (DNASTAR)或MUSCLE軟體。熟習此項技術者可確定用於量測比對之適當參數，包括用於達成所比較序列之全長內之最大比對所需的任何演算法。然而，出於本文之目的，使用序列比較電腦程式MUSCLE產生胺基酸序列一致性%值(Edgar, R.C.,Nucleic Acids Research 32(5):1792-1797, 2004；Edgar, R.C.,BMC Bioinformatics 5(1):113, 2004)。

「同源」係指兩個多肽之間或兩個核酸分子之間的序列相似性或序列一致性。當兩個比較序列中之一個位置由相同鹼基或胺基酸單體子單元佔據時，例如若兩個DNA分子中之每一者中的一個位置由腺嘌呤佔據，則該等分子在該位置處同源。兩個序列之間的同源性%為兩個序列共用之匹配或同源位置之數量除以所比較位置之數量乘以100之函數。舉例而言，若兩個序列中之10個位置中有6個匹配或同源，則兩個序列為60%同源。舉例而言，DNA序列ATTGCC及TATGGC共用50%同源性。一般而言，當兩個序列經比對以產生最大百分比同源時進行比較。

術語「恆定域」係指具有比含有抗原結合位點之免疫球蛋白其他部分，即可變域保守之胺基酸序列的免疫球蛋白分子部分。恆定域含有重鏈之C_H 1、C_H 2及C_H 3域(統稱為C_H )及輕鏈之CHL (或C_L )域。

來自任何哺乳動物物種之抗體(免疫球蛋白)之「輕鏈」可基於其恆定域之胺基酸序列而分配至稱為kappa (「κ」)及lambda (「λ」)的兩種明顯不同類型中之一者。

人類IgG Fc區之「CH1域」(亦被稱作「H1」域之「C1」)通常自約胺基酸118延伸至約胺基酸215 (EU編號系統)。

「鉸鏈區」一般定義為IgG中對應於人類IgG1之Glu216至Pro230的區(Burton,Molec . Immunol . 22:161-206 (1985))。其他IgG同型之鉸鏈區可藉由將形成重鏈間S-S鍵之第一個及最後一個半胱胺酸殘基置放在相同位置而與IgG1序列對齊。

人類IgG Fc區之「CH2域」(亦稱為「H2」域之「C2」)通常自約胺基酸231延伸至約胺基酸340。CH2域的獨特之處在於其不與另一域緊密配對。實際上，兩個N連接分支鏈碳水化合物鏈插入於完整天然IgG分子之兩個CH2域之間。已推測碳水化合物可為域-域配對提供替代品且幫助CH2域穩定化。Burton,Molec Immunol. 22:161-206 (1985)。

「CH3域」 (亦稱為「C2」或「H3」域)包含在Fc區中之CH2域之C端的殘基伸長部(亦即約胺基酸殘基341至抗體序列之C端，通常在IgG之胺基酸殘基446或447處)。

術語「Fc區」或「片段可結晶區」在本文中用於定義免疫球蛋白重鏈之C端區，包括原生序列Fc區及變異型Fc區。雖然免疫球蛋白重鏈之Fc區邊界可變化，但人類IgG重鏈Fc區通常定義為自處於位置Cys226之胺基酸殘基或自Pro230至其羧基端伸展。可移除Fc區之C端離胺酸(殘基447，根據EU編號系統)，例如在抗體之製備或純化期間，或藉由以重組方式工程改造編碼抗體之重鏈的核酸。因此，完整抗體之組合物可包含所有K447殘基均被移除之抗體群體、K447殘基未移除之抗體群體及含有具有及不具有K447殘基之抗體之混合物的抗體群體。用於本文所述之抗體之適合之原生序列Fc區包括人類IgG1、IgG2 (IgG2A、IgG2B)、IgG3及IgG4。

「Fc受體」或「FcR」描述結合抗體Fc區之受體。較佳FcR為原生序列人類FcR。此外，較佳FcR為結合IgG抗體之受體(γ受體)且包括FcγRI、FcγRII及FcγRIII子類之受體，包括此等受體之對偶基因變異體及交替剪接形式，FcγRII受體包括FcγRIIA (「活化受體」)及FcγRIIB (「抑制受體」)，其具有主要在其細胞質域中不同的類似胺基酸序列。活化受體FcγRIIA在其胞質域中含有基於免疫受體酪胺酸之活化基元(ITAM)。抑制受體FcγRIIB在其細胞質域中含有免疫受體酪胺酸基抑制基元(ITIM)。(參見M. Daëron,Annu. Rev. Immunol. 15:203-234 (1997)。FcR綜述於Ravetch及Kinet,Annu . Rev . Immunol . 9: 457-92 (1991)；Capel等人,Immunomethods 4: 25-34 (1994)；及de Haas等人,J . Lab . Clin . Med . 126: 330-41 (1995)中。本文之術語「FcR」涵蓋其他FcR，包括將來鑑別之FcR。

如本文所用之術語「抗原決定基」係指抗體或抗體部分所結合之抗原上之特定原子或胺基酸群。若兩個抗體或抗體部分展現對於抗原之競爭性結合，則其可結合抗原內之相同抗原決定基。

如本文所用，當第一抗體或其片段在等莫耳濃度之第一抗體或其片段存在下抑制第二抗體或其片段之目標抗原結合至少約50% (諸如至少約55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、98%或99%中之任一者)時，第一抗體或其片段與第二抗體或其片段「競爭」結合至目標抗原，或反之亦然。基於抗體之交叉競爭而將其「分組(binning)」之高通量方法描述於PCT公開案第WO 03/48731號中。

如本文所用，術語「特異性結合」、「特異性識別」或「特異性針對」係指在異質分子(包括生物分子)群體存在下確定目標之存在的可量測及可再現相互作用，諸如目標與抗體或抗體部分之間的結合。舉例而言，特異性識別目標(其可為抗原決定基)之抗體或抗體部分為結合此目標之親和力、親合力、容易性及/或持續時間大於其結合至其他目標之抗體或抗體部分。在一些實施例中，抗體與無關目標之結合程度小於抗體與目標之結合的約10%，如例如藉由放射免疫分析(RIA)所量測。在一些實施例中，特異性結合目標之抗體具有≤10^- ⁵ M、≤10^- ⁶ M、≤10^- ⁷ M、≤10^- ⁸ M、≤10^- ⁹ M、≤10^- ¹⁰ M、≤10^- ¹¹ M或≤10^- ¹² M之解離常數(K_D )。在一些實施例中，抗體特異性結合蛋白質上之抗原決定基，該抗原決定基在來自不同物種之蛋白質中保守。在一些實施例中，特異性結合可包括排他性結合，但並非必需。抗體或抗原結合域之結合特異性可藉由此項技術中已知之方法以實驗方式測定。此類方法包含但不限於Octet、西方墨點法、ELISA、RIA、ECL、IRMA、EIA、BIACORE^TM 測試及肽掃描。

「結合親和力」通常係指分子(例如抗體)之單一結合位點與其結合搭配物(例如抗原)之間的總非共價相互作用之強度。除非另外指明，否則如本文所用，「結合親和力」係指反映結合對成員之間的1:1相互作用之固有結合親和力。結合親和力可以K_d 、K_off 、K_on 或K_a 指示。如本文所用，術語「K_off 」意欲指抗體(或抗原結合域)自抗體/抗原複合物解離之解離速率常數，如自動力學選擇設定所測定，以單位s^- ¹ 表示。如本文所用，術語「K_on 」意欲指抗體(或抗原結合域)締合至抗原以形成抗體/抗原複合物之締合速率常數，以單位M^- ¹ s^- ¹ 表示。如本文所用，術語平衡解離常數「K_D 」或「K_d 」係指特定抗體-抗原相互作用之解離常數，且描述佔據存在於平衡狀態下之抗體分子溶液中之所有抗體結合域之二分之一所需的抗原之濃度，且等於K_off /K_on ，以單位M表示。K_d 之量測預料所有黏合劑呈溶液狀。在抗體繫栓至細胞壁之情況下，例如在酵母表現系統中，相應平衡速率常數表示為EC50，其為K_d 之良好近似值。親和力常數K_a 為解離常數K_d 之倒數，以單位M^- ¹ 表示。解離常數(K_D 或K_d )係用作顯示抗體對抗原之親和力的指標。舉例而言，藉由史卡查方法(Scatchard method)，使用經多種標記試劑標記之抗體，以及藉由使用非處方量測套組BiacoreX (由Amersham Biosciences製造)或類似套組，根據該套組所附之使用者手冊及實驗操作方法可容易地進行分析。可使用此等方法得到的K_D 值係以莫耳(M)為單位表示。特異性結合於目標之抗體或其抗原結合片段可具有例如≤10^- ⁵ M、≤10^- ⁶ M、≤10^- ⁷ M、≤10^- ⁸ M、≤10^- ⁹ M、≤10^- ¹⁰ M、≤10^- ¹¹ M或≤10^- ¹² M之解離常數(K_d )。

半最大抑制濃度(IC₅₀ )為物質(諸如抗體)在抑制特定生物或生物化學功能中之有效性的量度。其指示需要多少特定藥物或其他物質(抑制劑，諸如抗體)來抑制一半的給定生物過程(例如白蛋白與CD155，或過程組分，亦即酶、細胞、細胞受體或微生物之間的結合)。值通常表示為莫耳濃度。IC₅₀ 與促效劑藥物或其他物質(諸如抗體)之「EC₅₀ 」類似。EC₅₀ 亦表示獲得活體內最大效應之50%所需的血漿濃度。如本文所用，「IC₅₀ 」用於指示中和50%之活體外抗原生物活性(諸如白蛋白生物活性)所需之抗體(諸如抗白蛋白sdAb)之有效濃度。IC₅₀ 或EC₅₀ 可藉由生物分析，諸如藉由FACS分析之配體結合抑制(競爭結合分析)、基於細胞之細胞激素釋放分析或放大發光鄰近均質分析(AlphaLISA)量測。

如本文所用，術語「細胞激素」應理解為意謂任何蛋白質或肽、其類似物或功能片段，其能夠在哺乳動物中刺激或誘導針對預先選擇之細胞類型，例如癌細胞或病毒感染細胞之殺細胞免疫反應。因此，預期多種細胞激素可併入至本申請案中。適用之細胞激素包括例如腫瘤壞死因子(TNFs)、介白素(ILs)、淋巴介質(Ls)、集落刺激因子(CSFs)、干擾素(IFNs)，包括其能夠刺激或誘導此類殺細胞免疫反應之物種變異體、截短類似物。適用之腫瘤壞死因子包括例如TNFα。適用之淋巴介質包括例如LT。適用之集落刺激因子包括例如GM-CSF及M-CSF。適用之介白素包括例如IL-2、IL-4、IL-5、IL-7、IL-12、IL-15、IL-18、IL-21、IL22及IL-33。適用之干擾素包括例如IFN-α、IFN-α及IFN-γ。術語「細胞激素」亦理解為涵蓋野生型細胞激素(諸如IL-21、IL-7、IL-15等)之任何變異體，其包含修飾且維持其所需功能中之任一者之至少大部分(諸如至少約50%)。

如本文所用，術語「截短IL-21」係指包含在野生型IL-21之C端及N端中之一者或兩者處具有一或多個胺基酸缺失之IL-21的蛋白質或肽。包含本文所述之截短IL-21之融合蛋白可具有其他部分或域，諸如抗原結合部分、連接子、信號序列或白蛋白結合部分，儘管融合蛋白中之IL-21為比野生型IL-21少至少一個胺基酸之截短形式。在一些實施例中，野生型IL-21具有SEQ ID NO: 1之胺基酸序列。

編碼本文所述之構築體、抗體或其抗原結合片段之「經分離」核酸分子為自產生其之環境中通常與其相關之至少一種雜質核酸分子鑑別及分離的核酸分子。較佳地，經分離核酸與所有與產生環境有關之組分無關。編碼本文所述之多肽及抗體之經分離核酸分子呈除了其在自然界中所發現之形式或設定以外的形式。因此，經分離核酸分子與本文所述之天然存在於細胞中之編碼多肽及抗體之核酸不同。經分離核酸包括通常含有核酸分子之細胞中所含的核酸分子，但該核酸分子存在於染色體外或在不同於其天然染色體位置之染色體位置處。

術語「控制序列」係指在特定宿主生物體中表現可操作地連接之編碼序列所需之DNA序列。適用於原核生物之控制序列例如包括啟動子、視情況選用之操縱序列及核糖體結合位點。已知真核細胞利用啟動子、聚腺苷酸化信號及增強子。

核酸在其置放為與另一核酸序列具有功能關係時「可操作地連接」。舉例而言，若前序列或分泌引導物之DNA表現為參與多肽分泌之前蛋白，則其與該多肽之DNA係可操作地連接的；若啟動子或強化子影響編碼序列之轉錄，則其與該序列係可操作地連接的；或若核糖體結合位點經定位以便輔助轉譯，則其與編碼序列係可操作地連接。一般而言，「可操作地連接」意謂所連接之DNA序列鄰接且在分泌性前導序列之情況下，鄰接且處於閱讀階段。然而，增強子不必為相鄰的。連接藉由在方便的限制位點處連接來實現。若此類位點不存在，則根據習知實務使用合成寡核苷酸接附子或連接子。

如本文所用，術語「載體」係指一種核酸分子，其能夠傳播其所連接之另一核酸分子。該術語包括呈自我複製核酸結構之載體以及併入已引入其之宿主細胞之基因組中的載體。某些載體能夠導引可操作地連接其之核酸的表現。此類載體在本文中稱為「表現載體」。

如本文所使用，術語「轉染」或「轉型」或「轉導」係指將外源性核酸轉移至或引入宿主細胞中的一種方法。「轉染」或「轉型」或「轉導」細胞為已經外源性核酸轉染、轉型或轉導之細胞。該細胞包括初級個體細胞及其後代。

術語「宿主細胞」、「宿主細胞株」及「宿主細胞培養物」可互換使用且係指已引入外源核酸之細胞，包括此類細胞之後代。宿主細胞包括「轉型體」及「轉型細胞」，其包括初代轉型細胞及由其產生之後代，不考慮繼代次數。後代之核酸含量與母細胞可能不完全相同，但可能含有突變。本文包括針對原始轉型細胞篩檢或選擇具有相同功能或生物活性之突變型後代。

如本文所用，「治療(treatment/treating)」為用於獲得有益或期望結果(包括臨床結果)之方法。出於本申請案之目的，有益或期望臨床結果包括但不限於以下中之一或多者：緩解一或多種產生於疾病之症狀、降低疾病程度、使疾病穩定化(例如預防或延遲疾病惡化)、預防或延遲疾病擴散(例如轉移)、預防或延遲疾病復發、延遲或減緩疾病進展、改善疾病病況、提供疾病緩解(部分或完全)、減少治療疾病所需的一或多種其他藥物之劑量、延遲疾病進展、增加或改善生活品質、增加體重增長及/或延長存活期。「治療」亦涵蓋癌症之病理性結果(諸如腫瘤體積)降低。本申請案之方法涵蓋此等治療態樣中之任何一或多者。

在癌症之情況下，術語「治療」包括以下中之任何或所有：抑制癌細胞生長，抑制癌細胞複製，減輕整體腫瘤負荷及改善與疾病相關的一或多種症狀。

術語「抑制(inhibition)」或「抑制(inhibit)」係指任何表型特徵減少或停止，或彼特徵之發生率、程度或可能性降低或停止。「降低」或「抑制」係使活性、功能及/或量相比於參考物減少、降低或停滯。在某些實施例中，「降低」或「抑制」意謂總體減小20%或更大之能力。在另一實施例中，「降低」或「抑制」意謂總體減小50%或更大之能力。在另一實施例中，「降低」或「抑制」意謂總體減小75%、85%、90%、95%或更大之能力。

如本文所用之「參考」係指出於比較目的使用的任何樣品、標準或程度。參考可自健康及/或無病樣品獲得。在一些實例中，參考可自未經處理之樣品獲得。在一些實例中，參考係獲自無病或未經處理之個體樣品。在一些實施例中，參考係自一或多個不為受試者或患者之健康個體獲得。

如本文所用，「延遲疾病發展」意謂延緩、阻礙、減緩、阻滯、穩定及/或延遲疾病(諸如癌症)之發展。此延遲可具有不同時間長度，視所治療之疾病及/或個體之病史而定。如熟習此項技術者顯而易見，足夠或顯著延遲可實際上涵蓋預防，從而使個體不出現疾病。舉例而言，可延遲晚期癌症，諸如癌轉移發展。

如本文所用，「預防」包括在個體疾病之發病或復發方面提供預防作用，該個體可能易患該疾病但尚未診斷患有該疾病。

如本文所用，「抑止」功能或活性為當與除相關條件或參數以外在其他方面相同之條件相比或者與另一條件相比時，減小功能或活性。舉例而言，抑制腫瘤生長之抗體使腫瘤生長速率相比於在不存在抗體情況下的腫瘤生長速率減小。

術語「個體(subject)」、「個體(individual)」及「患者(patient)」在本文中可互換使用以指哺乳動物，包括但不限於人類、牛類動物、馬、貓類動物、犬類動物、嚙齒類動物或靈長類動物。在一些實施例中，個體為人類。

藥劑之「有效量」係指在所需劑量及時間段下有效達成所需治療或預防結果之量。該術語亦適用於將藉由本文所述之任何成像方法提供用於偵測之影像的劑量。特定劑量可視以下中之一或多者而變化：選擇之特定藥劑、遵循之給藥方案、其是否與其他化合物組合投與、投與時序、待成像之組織及承載其之物理遞送系統。

本申請案之物質/分子、促效劑或拮抗劑之「治療有效量」可根據以下因素而變化：諸如個體之疾病狀態、年齡、性別及體重，以及該物質/分子、促效劑或拮抗劑在個體體內引發所需反應之能力。治療有效量亦為治療學上有利作用超過物質/分子(促效劑或拮抗劑)之任何有毒或有害作用的量。治療有效量可按一或多次投藥傳遞。

「預防有效量」係指以必要的劑量及時間段有效達成所需預防結果之量。通常但不一定，由於個體在患病之前或在疾病早期使用預防劑量，所以預防有效量將小於治療有效量。

術語「醫藥調配物」及「醫藥組成物」係指所呈准許活性成分之生物活性有效之形式，且不含對將投與調配物之個體具有不可接受毒性之其他組分的製劑。此類調配物可為無菌的。

「醫藥學上可接受之載劑」係指與治療劑一起使用之此項技術中習知之無毒固體、半固體或液體填補劑、稀釋劑、囊封材料、調配助劑或載劑，其共同包含用於向個體投與之「醫藥組合物」。醫藥學上可接受之載劑在所用劑量及濃度下對接受者無毒且與調配物之其他成分相容。醫藥學上可接受之載劑適於所用之調配物。

「無菌」調配物無菌或基本上不含活微生物及其孢子。

與一或多種其他治療劑「組合」投與包括同時(並行)及以任何次序連續或依序投與。

術語「並行地」在本文中用以指兩種或兩種以上治療劑之如下投與：其中該投與之至少一部分在時間上重疊或其中一種治療劑之投與相對於其他治療劑之投與落在一段短時間內。舉例而言，兩種或兩種以上治療劑之投與時間相隔不超過約60分鐘，諸如大致不超過以下中之任一者：30、15、10、5或1分鐘。

術語「依序」在本文中用於指如此投與兩種或兩種以上治療劑：其中一或多種藥劑之投與在中斷一或多種其他藥劑之投與之後繼續。舉例而言，兩種或兩種以上治療劑之投與係以大於約15分鐘，諸如約20、30、40、50或60分鐘、1天、2天、3天、1週、2週、或1個月、或更長時間間隔投與。

如本文所使用，「結合」係指除一種治療模式以外亦投與另一種治療模式。因此，「結合」係指在向個體投與一種治療模式之前、期間或之後投與另一種治療模式。

術語「藥品說明書」用以指通常包括於治療性產品之商業包裝中的說明，其含有關於與使用此類治療性產品有關之適應症、用法、劑量、投與、組合療法、禁忌及/或警告的資訊。

「製品」為任何製造品(例如包裝或容器)或套組，其包含至少一種試劑，例如用於治療疾病或病症(例如癌症)之藥劑，或用於特異性偵測本文所述之生物標記之探針。在某些實施例中，製造品或套組係以用於執行本文所述方法之單元形式推銷、分銷或出售。

應瞭解，本文所述之本申請案之實施例包括「由」實施例「組成」及/或「基本上由」實施例「組成」。

本文中，對「約」一個值或參數之參考包括(及描述)針對該值或參數本身之變化。舉例而言，涉及「約X」之描述包括「X」之描述。

如本文所用，提及「不為」一值或參數一般意謂且描述「除一值或參數外」。舉例而言，方法不用於治療X型癌症意指方法用於治療除X以外的類型之癌症。

本文所使用之術語「約X-Y」具有與「約X至約Y」相同之含義。

除非上下文另外明確指示，否則如在本文及所附申請專利範圍中所使用，單數形式「一(a)」、「或(or)」及「該(the)」包括複數個指示物。 II-A. 包含白蛋白結合部分之融合蛋白

本文提供融合蛋白，其包含：a)細胞激素，及b)白蛋白結合部分(諸如結合至白蛋白之sdAb)。在一些實施例中，融合蛋白包含a)選自由以下組成之群的細胞激素：IL-21、IL-7、IL-15、結合至IL-15Rα之IL-15或其片段、IL-33及IL-22，及b)白蛋白結合部分(諸如結合至白蛋白之sdAb)。在一些實施例中，白蛋白結合部分包含白蛋白結合域(ABD)。在一些實施例中，白蛋白結合部分包含單域抗體(sdAb)。在一些實施例中，白蛋白結合部分融合至細胞激素之C端。在一些實施例中，白蛋白結合部分融合至細胞激素之N端。在一些實施例中，細胞激素及白蛋白結合部分係經由第一連接子(諸如具有約一至三十個胺基酸)連接。在一些實施例中，白蛋白結合部分為單域抗體(諸如V_H H抗體)。具有相對較小分子量之sdAb可有助於增加融合蛋白之癌症滲透，從而使其更適合於治療某些癌症，例如實體腫瘤。

在一些實施例中，提供一種融合蛋白，其包含：a) IL-21，及b)白蛋白結合部分(諸如結合至白蛋白之sdAb)。在一些實施例中，細胞激素融合至白蛋白結合部分之C端。在一些實施例中，細胞激素融合至白蛋白結合部分之N端。在一些實施例中，白蛋白結合部分融合至細胞激素之N端及C端兩者。在一些實施例中，第二細胞激素(與第一細胞激素相同或不同)融合至白蛋白結合部分之另一端。在一些實施例中，白蛋白結合部分結合至人類血清白蛋白(HSA)及/或食蟹獼猴血清白蛋白(CMSA)。在一些實施例中，白蛋白結合部分包含白蛋白結合域(ABD)。在一些實施例中，白蛋白結合域包含選自由SEQ ID NO: 3-11組成之群的胺基酸序列，或與SEQ ID NO: 3-11中之任一者包含至少約80% (諸如至少約80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%中之任一者)序列一致性之其變異體。在一些實施例中，白蛋白結合部分包含抗白蛋白抗體(諸如單域抗體(sdAb)，諸如V_H H單域抗體)。在一些實施例中，細胞激素及白蛋白結合部分係經由第一連接子連接。在一些實施例中，第一連接子之長度為約一至三十個胺基酸。在一些實施例中，第一連接子選自由SEQ ID NO: 12-26及158-159組成之群。在一些實施例中，IL-21為截短IL-21。在一些實施例中，截短IL-21包含SEQ ID NO: 126、171或172之胺基酸序列。在一些實施例中，第一連接子為剛性連接子。在一些實施例中，第一連接子選自由SEQ ID NO: 21、22及24組成之群。在一些實施例中，第一連接子為可撓性連接子。在一些實施例中，第一連接子選自由SEQ ID NO: 12-14組成之群。

在一些實施例中，提供一種融合蛋白，其包含：a) IL-21，及b)白蛋白結合部分(諸如結合至白蛋白之sdAb)，其中IL-21包含SEQ ID NO: 1、2、126、171或172之胺基酸序列，或與SEQ ID NO: 1、2、126、171或172包含至少約80% (諸如至少約80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%中之任一者)序列一致性之其變異體，且其中白蛋白結合部分包含白蛋白結合域。在一些實施例中，細胞激素融合至白蛋白結合部分之C端。在一些實施例中，細胞激素融合至白蛋白結合部分之N端。在一些實施例中，白蛋白結合部分融合至細胞激素之N端及C端兩者。在一些實施例中，第二細胞激素(與第一細胞激素相同或不同)融合至白蛋白結合部分之另一端。在一些實施例中，白蛋白結合部分結合至人類血清白蛋白(HSA)及/或食蟹獼猴血清白蛋白(CMSA)。在一些實施例中，白蛋白結合域包含選自由SEQ ID NO: 3-11組成之群的胺基酸序列，或與SEQ ID NO: 3-11中之任一者包含至少約80% (諸如至少約80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%中之任一者)序列一致性之其變異體。在一些實施例中，細胞激素及白蛋白結合部分係經由第一連接子連接。在一些實施例中，第一連接子之長度為約一至三十個胺基酸。在一些實施例中，第一連接子選自由SEQ ID NO: 12-26及158-159組成之群。在一些實施例中，IL-21為截短IL-21。在一些實施例中，截短IL-21包含SEQ ID NO: 126、171或172之胺基酸序列。在一些實施例中，第一連接子為剛性連接子。在一些實施例中，第一連接子選自由SEQ ID NO: 21、22及24組成之群。在一些實施例中，第一連接子為可撓性連接子。在一些實施例中，第一連接子選自由SEQ ID NO: 12-14組成之群。

在一些實施例中，提供一種融合蛋白，其包含：a) IL-21，及b)白蛋白結合部分(諸如結合至白蛋白之sdAb)，其中IL-21包含SEQ ID NO: 1、2、126、171或172之胺基酸序列，或與SEQ ID NO: 1、2、126、171或172包含至少約80% (諸如至少約80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%中之任一者)序列一致性之其變異體，且其中白蛋白結合部分包含抗白蛋白抗體或其片段(諸如單域抗體，諸如V_H H抗體)。在一些實施例中，細胞激素融合至白蛋白結合部分之C端。在一些實施例中，細胞激素融合至白蛋白結合部分之N端。在一些實施例中，白蛋白結合部分融合至細胞激素之N端及C端兩者。在一些實施例中，第二細胞激素(與第一細胞激素相同或不同)融合至白蛋白結合部分之另一端。在一些實施例中，白蛋白結合部分結合至人類血清白蛋白(HSA)及/或食蟹獼猴血清白蛋白(CMSA)。在一些實施例中，細胞激素及白蛋白結合部分係經由第一連接子連接。在一些實施例中，第一連接子之長度為約一至三十個胺基酸。在一些實施例中，第一連接子選自由SEQ ID NO: 12-26及158-159組成之群。在一些實施例中，IL-21為截短IL-21。在一些實施例中，截短IL-21包含SEQ ID NO: 126、171或172之胺基酸序列。在一些實施例中，第一連接子為剛性連接子。在一些實施例中，第一連接子選自由SEQ ID NO: 21、22及24組成之群。在一些實施例中，第一連接子為可撓性連接子。在一些實施例中，第一連接子選自由SEQ ID NO: 12-14組成之群。

在一些實施例中，提供一種融合蛋白，其包含：a) IL-7，及b)白蛋白結合部分(諸如結合至白蛋白之sdAb)。在一些實施例中，細胞激素融合至白蛋白結合部分之C端。在一些實施例中，細胞激素融合至白蛋白結合部分之N端。在一些實施例中，白蛋白結合部分融合至細胞激素之N端及C端兩者。在一些實施例中，第二細胞激素(與第一細胞激素相同或不同)融合至白蛋白結合部分之另一端。在一些實施例中，白蛋白結合部分結合至人類血清白蛋白(HSA)及/或食蟹獼猴血清白蛋白(CMSA)。在一些實施例中，白蛋白結合部分包含白蛋白結合域(ABD)。在一些實施例中，白蛋白結合域包含選自由SEQ ID NO: 3-11組成之群的胺基酸序列，或與SEQ ID NO: 3-11中之任一者包含至少約80% (諸如至少約80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%中之任一者)序列一致性之其變異體。在一些實施例中，白蛋白結合部分包含抗白蛋白抗體(諸如單域抗體(sdAb)，諸如V_H H單域抗體)。在一些實施例中，細胞激素及白蛋白結合部分係經由第一連接子連接。在一些實施例中，第一連接子之長度為約一至三十個胺基酸。在一些實施例中，第一連接子選自由SEQ ID NO: 12-26及158-159組成之群。在一些實施例中，第一連接子為剛性連接子。在一些實施例中，第一連接子選自由SEQ ID NO: 21、22及24組成之群。在一些實施例中，第一連接子為可撓性連接子。在一些實施例中，第一連接子選自由SEQ ID NO: 12-14組成之群。

在一些實施例中，提供一種融合蛋白，其包含：a) IL-7，及b)白蛋白結合部分(諸如結合至白蛋白之sdAb)，其中IL-7包含SEQ ID NO: 96-98中之任一者之胺基酸序列，或與SEQ ID NO: 96-98中之任一者包含至少約80% (諸如至少約80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%中之任一者)序列一致性之其變異體，且其中白蛋白結合部分包含白蛋白結合域。在一些實施例中，細胞激素融合至白蛋白結合部分之C端。在一些實施例中，細胞激素融合至白蛋白結合部分之N端。在一些實施例中，白蛋白結合部分融合至細胞激素之N端及C端兩者。在一些實施例中，第二細胞激素(與第一細胞激素相同或不同)融合至白蛋白結合部分之另一端。在一些實施例中，白蛋白結合部分結合至人類血清白蛋白(HSA)及/或食蟹獼猴血清白蛋白(CMSA)。在一些實施例中，白蛋白結合域包含選自由SEQ ID NO: 3-11組成之群的胺基酸序列，或與SEQ ID NO: 3-11中之任一者包含至少約80% (諸如至少約80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%中之任一者)序列一致性之其變異體。在一些實施例中，細胞激素及白蛋白結合部分係經由第一連接子連接。在一些實施例中，第一連接子之長度為約一至三十個胺基酸。在一些實施例中，第一連接子選自由SEQ ID NO: 12-26及158-159組成之群。

在一些實施例中，提供一種融合蛋白，其包含：a) IL-7，及b)白蛋白結合部分(諸如結合至白蛋白之sdAb)，其中IL-7包含SEQ ID NO: 96-98中之任一者之胺基酸序列，或與SEQ ID NO: 96-98中之任一者包含至少約80% (諸如至少約80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%中之任一者)序列一致性之其變異體，且其中白蛋白結合部分包含抗白蛋白抗體或其片段(諸如單域抗體，諸如V_H H抗體)。在一些實施例中，細胞激素融合至白蛋白結合部分之C端。在一些實施例中，細胞激素融合至白蛋白結合部分之N端。在一些實施例中，白蛋白結合部分融合至細胞激素之N端及C端兩者。在一些實施例中，第二細胞激素(與第一細胞激素相同或不同)融合至白蛋白結合部分之另一端。在一些實施例中，白蛋白結合部分結合至人類血清白蛋白(HSA)及/或食蟹獼猴血清白蛋白(CMSA)。在一些實施例中，細胞激素及白蛋白結合部分係經由第一連接子連接。在一些實施例中，第一連接子之長度為約一至三十個胺基酸。在一些實施例中，第一連接子選自由SEQ ID NO: 12-26及158-159組成之群。

在一些實施例中，提供一種融合蛋白，其包含：a) IL-15，及b)白蛋白結合部分(諸如結合至白蛋白之sdAb)。在一些實施例中，細胞激素融合至白蛋白結合部分之C端。在一些實施例中，細胞激素融合至白蛋白結合部分之N端。在一些實施例中，白蛋白結合部分融合至細胞激素之N端及C端兩者。在一些實施例中，第二細胞激素(與第一細胞激素相同或不同)融合至白蛋白結合部分之另一端。在一些實施例中，白蛋白結合部分結合至人類血清白蛋白(HSA)及/或食蟹獼猴血清白蛋白(CMSA)。在一些實施例中，白蛋白結合部分包含白蛋白結合域(ABD)。在一些實施例中，白蛋白結合域包含選自由SEQ ID NO: 3-11組成之群的胺基酸序列，或與SEQ ID NO: 3-11中之任一者包含至少約80% (諸如至少約80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%中之任一者)序列一致性之其變異體。在一些實施例中，白蛋白結合部分包含抗白蛋白抗體(諸如單域抗體(sdAb)，諸如V_H H單域抗體)。在一些實施例中，細胞激素及白蛋白結合部分係經由第一連接子連接。在一些實施例中，第一連接子之長度為約一至三十個胺基酸。在一些實施例中，第一連接子選自由SEQ ID NO: 12-26及158-159組成之群。在一些實施例中，細胞激素為IL-15Rα或結合至IL-15Rα之IL-15或其片段，且其中IL-15Rα或結合至IL-15Rα之IL-15或其片段包含SEQ ID NO: 101-108中之任一者之胺基酸序列，或與SEQ ID NO: 101-108中之任一者包含至少約80%序列一致性之其變異體。在一些實施例中，細胞激素包含IL-15及IL-15Rα。在一些實施例中，IL-15及IL-15Rα係經由連接子(「IL-15與IL-15Rα之間的連接子」)連接。在一些實施例中，IL-15與IL-15Rα之間的連接子為可裂解的。在一些實施例中，IL-15與IL-15Rα之間的連接子為不可裂解的。

在一些實施例中，提供一種融合蛋白，其包含：a) IL-15，及b)白蛋白結合部分(諸如結合至白蛋白之sdAb)，其中IL-15包含SEQ ID NO: 99、100或127中之任一者之胺基酸序列，或與SEQ ID NO: 99、100或127中之任一者包含至少約80% (諸如至少約80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%中之任一者)序列一致性之其變異體，且其中白蛋白結合部分包含白蛋白結合域。在一些實施例中，細胞激素融合至白蛋白結合部分之C端。在一些實施例中，細胞激素融合至白蛋白結合部分之N端。在一些實施例中，白蛋白結合部分融合至細胞激素之N端及C端兩者。在一些實施例中，第二細胞激素(與第一細胞激素相同或不同)融合至白蛋白結合部分之另一端。在一些實施例中，白蛋白結合部分結合至人類血清白蛋白(HSA)及/或食蟹獼猴血清白蛋白(CMSA)。在一些實施例中，白蛋白結合域包含選自由SEQ ID NO: 3-11組成之群的胺基酸序列，或與SEQ ID NO: 3-11中之任一者包含至少約80% (諸如至少約80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%中之任一者)序列一致性之其變異體。在一些實施例中，細胞激素及白蛋白結合部分係經由第一連接子連接。在一些實施例中，第一連接子之長度為約一至三十個胺基酸。在一些實施例中，第一連接子選自由SEQ ID NO: 12-26及158-159組成之群。在一些實施例中，細胞激素為IL-15Rα或結合至IL-15Rα之IL-15或其片段，且其中IL-15Rα或結合至IL-15Rα之IL-15或其片段包含SEQ ID NO: 101-108中之任一者之胺基酸序列，或與SEQ ID NO: 101-108中之任一者包含至少約80%序列一致性之其變異體。在一些實施例中，細胞激素包含IL-15及IL-15Rα。在一些實施例中，IL-15及IL-15Rα係經由連接子(「IL-15與IL-15Rα之間的連接子」)連接。在一些實施例中，IL-15與IL-15Rα之間的連接子為可裂解的。在一些實施例中，IL-15與IL-15Rα之間的連接子為不可裂解的。

在一些實施例中，提供一種融合蛋白，其包含：a) IL-15，及b)白蛋白結合部分(諸如結合至白蛋白之sdAb)，其中IL-15包含SEQ ID NO: 99、100或127中之任一者之胺基酸序列，或與SEQ ID NO: 99、100或127中之任一者包含至少約80% (諸如至少約80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%中之任一者)序列一致性之其變異體，且其中白蛋白結合部分包含抗白蛋白抗體或其片段(諸如單域抗體，諸如V_H H抗體)。在一些實施例中，細胞激素融合至白蛋白結合部分之C端。在一些實施例中，細胞激素融合至白蛋白結合部分之N端。在一些實施例中，白蛋白結合部分融合至細胞激素之N端及C端兩者。在一些實施例中，第二細胞激素(與第一細胞激素相同或不同)融合至白蛋白結合部分之另一端。在一些實施例中，白蛋白結合部分結合至人類血清白蛋白(HSA)及/或食蟹獼猴血清白蛋白(CMSA)。在一些實施例中，細胞激素及白蛋白結合部分係經由第一連接子連接。在一些實施例中，第一連接子之長度為約一至三十個胺基酸。在一些實施例中，第一連接子選自由SEQ ID NO: 12-26及158-159組成之群。在一些實施例中，細胞激素為IL-15Rα或結合至IL-15Rα之IL-15或其片段，且其中IL-15Rα或結合至IL-15Rα之IL-15或其片段包含SEQ ID NO: 101-108中之任一者之胺基酸序列，或與SEQ ID NO: 101-108中之任一者包含至少約80%序列一致性之其變異體。在一些實施例中，細胞激素包含IL-15及IL-15Rα。在一些實施例中，IL-15及IL-15Rα係經由連接子(「IL-15與IL-15Rα之間的連接子」)連接。在一些實施例中，IL-15與IL-15Rα之間的連接子為可裂解的。在一些實施例中，IL-15與IL-15Rα之間的連接子為不可裂解的。

在一些實施例中，提供一種融合蛋白，其包含a)包含IL-15R壽司域之細胞激素，及b)白蛋白結合部分(諸如結合至白蛋白之sdAb)。在一些實施例中，IL-15R壽司域包含或其組成為SEQ ID NO: 127-128中之任一者之胺基酸序列或與SEQ ID NO: 127-128中之任一者包含至少80% (諸如至少約80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%中之任一者)序列一致性之其變異體。在一些實施例中，融合蛋白不包含IL-15。在一些實施例中，融合蛋白進一步包含IL-15。在一些實施例中，IL-15及IL-15R壽司域係經由連接子(「IL-15與IL-15R壽司域之間的連接子」)連接。在一些實施例中，IL-15與IL-15R壽司域之間的連接子為可裂解的。在一些實施例中，IL-15與IL-15壽司域之間的連接子為不可裂解的。

在一些實施例中，提供一種融合蛋白，其包含：a)結合至IL-15Rα之IL-15，其包含IL-15及IL-15Rα，及b)白蛋白結合部分(諸如結合至白蛋白之sdAb)。在一些實施例中，白蛋白結合部分融合至IL-15或IL-15Rα中之一者。在一些實施例中，白蛋白結合部分融合至IL-15及IL-15Rα兩者。在一些實施例中，白蛋白結合部分融合至IL-15Rα之N端及/或C端。在一些實施例中，白蛋白結合部分融合至IL-15之N端及/或C端。在一些實施例中，白蛋白結合部分融合至IL-15及/或IL-15Rα之C端。在一些實施例中，白蛋白結合部分融合至IL-15及/或IL-15Rα之N端。在一些實施例中，IL-15非共價結合至IL-15Rα。在一些實施例中，IL-15融合至IL-15Rα。在一些實施例中，IL-15融合至IL-15Rα之N端。在一些實施例中，IL-15融合至IL-15Rα之C端。在一些實施例中，白蛋白結合部分另外融合至第二細胞激素之N端或C端。在一些實施例中，白蛋白結合部分結合至人類血清白蛋白(HSA)及/或食蟹獼猴血清白蛋白(CMSA)。在一些實施例中，白蛋白結合部分包含白蛋白結合域(ABD)。在一些實施例中，白蛋白結合域包含選自由SEQ ID NO: 3-11組成之群的胺基酸序列，或與SEQ ID NO: 3-11中之任一者包含至少約80% (諸如至少約80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%中之任一者)序列一致性之其變異體。在一些實施例中，白蛋白結合部分包含抗白蛋白抗體(諸如單域抗體(sdAb)，諸如V_H H單域抗體)。在一些實施例中，細胞激素及白蛋白結合部分係經由第一連接子連接。在一些實施例中，第一連接子之長度為約一至三十個胺基酸。在一些實施例中，第一連接子選自由SEQ ID NO: 12-26及158-159組成之群。在一些實施例中，IL-15及IL-15Rα係經由第二連接子融合。在一些實施例中，第二連接子為可裂解連接子。在一些實施例中，第二連接子選自由SEQ ID NO: 27-45組成之群。在一些實施例中，第二連接子具有SEQ ID NO: 27之序列。在一些實施例中，第二連接子為不可裂解連接子。在一些實施例中，第二連接子選自由SEQ ID NO: 12-26及158-159組成之群。在一些實施例中，結合至IL-15Rα之IL-15或其片段包含SEQ ID NO: 101-108中之任一者之胺基酸序列，或與SEQ ID NO: 101-108中之任一者包含至少約80%序列一致性之其變異體。在一些實施例中，IL-15及IL-15Rα係經由連接子(「IL-15與IL-15Rα之間的連接子」)連接。在一些實施例中，IL-15與IL-15Rα之間的連接子為可裂解的。在一些實施例中，IL-15與IL-15Rα之間的連接子為不可裂解的。

在一些實施例中，提供一種融合蛋白，其包含：a)結合至IL-15Rα之IL-15，其包含IL-15及IL-15Rα，及b)白蛋白結合部分(諸如結合至白蛋白之sdAb)，其中融合蛋白以選自由以下組成之群的次序自N端至C端包含該IL-15、IL-15Rα及白蛋白結合部分：(1)白蛋白結合部分、IL-15、IL-15Rα；(2)白蛋白結合部分、IL-15Rα、IL-15；(3) IL-15、IL-15Rα、白蛋白結合部分；(4) IL-15Rα、IL-15、白蛋白結合部分。在一些實施例中，白蛋白結合部分結合至人類血清白蛋白(HSA)及/或食蟹獼猴血清白蛋白(CMSA)。在一些實施例中，白蛋白結合部分包含白蛋白結合域(ABD)。在一些實施例中，白蛋白結合域包含選自由SEQ ID NO: 3-11組成之群的胺基酸序列，或與SEQ ID NO: 3-11中之任一者包含至少約80% (諸如至少約80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%中之任一者)序列一致性之其變異體。在一些實施例中，白蛋白結合部分包含抗白蛋白抗體(諸如單域抗體(sdAb)，諸如V_H H單域抗體)。在一些實施例中，細胞激素(IL-15或IL-15Rα)及白蛋白結合部分係經由第一連接子連接。在一些實施例中，第一連接子之長度為約一至三十個胺基酸。在一些實施例中，第一連接子選自由SEQ ID NO: 12-26及158-159組成之群。在一些實施例中，IL-15及IL-15Rα係經由第二連接子融合。在一些實施例中，第二連接子為可裂解連接子。在一些實施例中，第二連接子選自由SEQ ID NO: 27-45組成之群。在一些實施例中，第二連接子具有SEQ ID NO: 27之序列。在一些實施例中，第二連接子為不可裂解連接子。在一些實施例中，第二連接子選自由SEQ ID NO: 12-26及158-159組成之群。在一些實施例中，結合至IL-15Rα之IL-15或其片段包含SEQ ID NO: 101-108中之任一者之胺基酸序列，或與SEQ ID NO: 101-108中之任一者包含至少約80%序列一致性之其變異體。在一些實施例中，IL-15及IL-15Rα係經由連接子(「IL-15與IL-15Rα之間的連接子」)連接。在一些實施例中，IL-15與IL-15Rα之間的連接子為可裂解的。在一些實施例中，IL-15與IL-15Rα之間的連接子為不可裂解的。

在一些實施例中，提供一種融合蛋白，其包含：a)結合至IL-15Rα之IL-15，其包含IL-15及IL-15Rα，及b)白蛋白結合部分(諸如結合至白蛋白之sdAb)，其中其IL-15包含SEQ ID NO: 99、100或127中之任一者之胺基酸序列，或與SEQ ID NO: 99、100或127中之任一者包含至少約80% (諸如至少約80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%中之任一者)序列一致性之其變異體，且其中白蛋白結合部分包含白蛋白結合域。在一些實施例中，細胞激素融合至白蛋白結合部分之C端。在一些實施例中，細胞激素融合至白蛋白結合部分之N端。在一些實施例中，白蛋白結合部分融合至細胞激素之N端及C端兩者。在一些實施例中，第二細胞激素(與第一細胞激素相同或不同)融合至白蛋白結合部分之另一端。在一些實施例中，白蛋白結合部分結合至人類血清白蛋白(HSA)及/或食蟹獼猴血清白蛋白(CMSA)。在一些實施例中，白蛋白結合域包含選自由SEQ ID NO: 3-11組成之群的胺基酸序列，或與SEQ ID NO: 3-11中之任一者包含至少約80% (諸如至少約80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%中之任一者)序列一致性之其變異體。在一些實施例中，細胞激素及白蛋白結合部分係經由第一連接子連接。在一些實施例中，第一連接子之長度為約一至三十個胺基酸。在一些實施例中，第一連接子選自由SEQ ID NO: 12-26及158-159組成之群。在一些實施例中，IL-15非共價結合至IL-15Rα。在一些實施例中，IL-15融合至IL-15Rα。在一些實施例中，IL-15融合至IL-15Rα之N端。在一些實施例中，IL-15融合至IL-15Rα之C端。在一些實施例中，融合蛋白以選自由以下組成之群的次序自N端至C端包含該IL-15、IL-15Rα及白蛋白結合部分：(1)白蛋白結合部分、IL-15、IL-15Rα；(2)白蛋白結合部分、IL-15Rα、IL-15；(3) IL-15、IL-15Rα、白蛋白結合部分；(4) IL-15Rα、IL-15、白蛋白結合部分。在一些實施例中，IL-15及IL-15Rα係經由第二連接子融合。在一些實施例中，第二連接子為可裂解連接子。在一些實施例中，第二連接子選自由SEQ ID NO: 27-45組成之群。在一些實施例中，第二連接子具有SEQ ID NO: 27之序列。在一些實施例中，第二連接子為不可裂解連接子。在一些實施例中，第二連接子選自由SEQ ID NO: 12-26及158-159組成之群。在一些實施例中，結合至IL-15Rα之IL-15或其片段包含SEQ ID NO: 101-108中之任一者之胺基酸序列，或與SEQ ID NO: 101-108中之任一者包含至少約80%序列一致性之其變異體。在一些實施例中，IL-15及IL-15Rα係經由連接子(「IL-15與IL-15Rα之間的連接子」)連接。在一些實施例中，IL-15與IL-15Rα之間的連接子為可裂解的。在一些實施例中，IL-15與IL-15Rα之間的連接子為不可裂解的。

在一些實施例中，提供一種融合蛋白，其包含：a)結合至IL-15Rα之IL-15，其包含IL-15及IL-15Rα，及b)白蛋白結合部分(諸如結合至白蛋白之sdAb)，其中其IL-15包含SEQ ID NO: 99、100或127中之任一者之胺基酸序列，或與SEQ ID NO: 99、100或127中之任一者包含至少約80% (諸如至少約80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%中之任一者)序列一致性之其變異體，且其中白蛋白結合部分包含抗白蛋白抗體或其片段(諸如單域抗體，諸如V_H H抗體)。在一些實施例中，細胞激素融合至白蛋白結合部分之C端。在一些實施例中，細胞激素融合至白蛋白結合部分之N端。在一些實施例中，白蛋白結合部分融合至細胞激素之N端及C端兩者。在一些實施例中，第二細胞激素(與第一細胞激素相同或不同)融合至白蛋白結合部分之另一端。在一些實施例中，白蛋白結合部分結合至人類血清白蛋白(HSA)及/或食蟹獼猴血清白蛋白(CMSA)。在一些實施例中，細胞激素及白蛋白結合部分係經由第一連接子連接。在一些實施例中，第一連接子之長度為約一至三十個胺基酸。在一些實施例中，第一連接子選自由SEQ ID NO: 12-26及158-159組成之群。在一些實施例中，IL-15非共價結合至IL-15Rα。在一些實施例中，IL-15融合至IL-15Rα。在一些實施例中，IL-15融合至IL-15Rα之N端。在一些實施例中，IL-15融合至IL-15Rα之C端。在一些實施例中，融合蛋白以選自由以下組成之群的次序自N端至C端包含該IL-15、IL-15Rα及白蛋白結合部分：(1)白蛋白結合部分、IL-15、IL-15Rα；(2)白蛋白結合部分、IL-15Rα、IL-15；(3) IL-15、IL-15Rα、白蛋白結合部分；(4) IL-15Rα、IL-15、白蛋白結合部分。在一些實施例中，IL-15及IL-15Rα係經由第二連接子融合。在一些實施例中，第二連接子為可裂解連接子。在一些實施例中，第二連接子選自由SEQ ID NO: 27-45組成之群。在一些實施例中，第二連接子具有SEQ ID NO: 27之序列。在一些實施例中，第二連接子為不可裂解連接子。在一些實施例中，第二連接子選自由SEQ ID NO: 12-26及158-159組成之群。在一些實施例中，結合至IL-15Rα之IL-15或其片段包含SEQ ID NO: 101-108中之任一者之胺基酸序列，或與SEQ ID NO: 101-108中之任一者包含至少約80%序列一致性之其變異體。在一些實施例中，IL-15及IL-15Rα係經由連接子(「IL-15與IL-15Rα之間的連接子」)連接。在一些實施例中，IL-15與IL-15Rα之間的連接子為可裂解的。在一些實施例中，IL-15與IL-15Rα之間的連接子為不可裂解的。

在一些實施例中，提供一種融合蛋白，其包含：a)結合至IL-15Rα之IL-15，其包含IL-15及IL-15Rα，及b)白蛋白結合部分(諸如結合至白蛋白之sdAb)，其中其IL-15Rα包含SEQ ID NO: 101-108中之任一者(諸如SEQ ID NO: 103-104)之胺基酸序列，或與SEQ ID NO: 101-108中之任一者(諸如SEQ ID NO: 103-104)包含至少約80% (諸如至少約80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%中之任一者)序列一致性之其變異體，且其中白蛋白結合部分包含白蛋白結合域。在一些實施例中，細胞激素融合至白蛋白結合部分之C端。在一些實施例中，細胞激素融合至白蛋白結合部分之N端。在一些實施例中，白蛋白結合部分融合至細胞激素之N端及C端兩者。在一些實施例中，第二細胞激素(與第一細胞激素相同或不同)融合至白蛋白結合部分之另一端。在一些實施例中，白蛋白結合部分結合至人類血清白蛋白(HSA)及/或食蟹獼猴血清白蛋白(CMSA)。在一些實施例中，白蛋白結合域包含選自由SEQ ID NO: 3-11組成之群的胺基酸序列，或與SEQ ID NO: 3-11中之任一者包含至少約80% (諸如至少約80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%中之任一者)序列一致性之其變異體。在一些實施例中，細胞激素及白蛋白結合部分係經由第一連接子連接。在一些實施例中，第一連接子之長度為約一至三十個胺基酸。在一些實施例中，第一連接子選自由SEQ ID NO: 12-26及158-159組成之群。在一些實施例中，IL-15非共價結合至IL-15Rα。在一些實施例中，IL-15融合至IL-15Rα。在一些實施例中，IL-15融合至IL-15Rα之N端。在一些實施例中，IL-15融合至IL-15Rα之C端。在一些實施例中，融合蛋白以選自由以下組成之群的次序自N端至C端包含該IL-15、IL-15Rα及白蛋白結合部分：(1)白蛋白結合部分、IL-15、IL-15Rα；(2)白蛋白結合部分、IL-15Rα、IL-15；(3) IL-15、IL-15Rα、白蛋白結合部分；(4) IL-15Rα、IL-15、白蛋白結合部分。在一些實施例中，IL-15及IL-15Rα係經由第二連接子融合。在一些實施例中，第二連接子為可裂解連接子。在一些實施例中，第二連接子選自由SEQ ID NO: 27-45組成之群。在一些實施例中，第二連接子具有SEQ ID NO: 27之序列。在一些實施例中，第二連接子為不可裂解連接子。在一些實施例中，第二連接子選自由SEQ ID NO: 12-26及158-159組成之群。

在一些實施例中，提供一種融合蛋白，其包含：a)結合至IL-15Rα之IL-15，其包含IL-15及IL-15Rα，及b)白蛋白結合部分(諸如結合至白蛋白之sdAb)，其中IL-15Rα包含SEQ ID NO: 101-108中之任一者(諸如SEQ ID NO: 103-104)之胺基酸序列，或與SEQ ID NO: 101-108中之任一者(諸如SEQ ID NO: 103-104)包含至少約80% (諸如至少約80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%中之任一者)序列一致性之其變異體，且其中白蛋白結合部分包含抗白蛋白抗體或其片段(諸如單域抗體，諸如V_H H抗體)。在一些實施例中，細胞激素融合至白蛋白結合部分之C端。在一些實施例中，細胞激素融合至白蛋白結合部分之N端。在一些實施例中，白蛋白結合部分融合至細胞激素之N端及C端兩者。在一些實施例中，第二細胞激素(與第一細胞激素相同或不同)融合至白蛋白結合部分之另一端。在一些實施例中，白蛋白結合部分結合至人類血清白蛋白(HSA)及/或食蟹獼猴血清白蛋白(CMSA)。在一些實施例中，細胞激素及白蛋白結合部分係經由第一連接子連接。在一些實施例中，第一連接子之長度為約一至三十個胺基酸。在一些實施例中，第一連接子選自由SEQ ID NO: 12-26及158-159組成之群。在一些實施例中，IL-15非共價結合至IL-15Rα。在一些實施例中，IL-15融合至IL-15Rα。在一些實施例中，IL-15融合至IL-15Rα之N端。在一些實施例中，IL-15融合至IL-15Rα之C端。在一些實施例中，融合蛋白以選自由以下組成之群的次序自N端至C端包含該IL-15、IL-15Rα及白蛋白結合部分：(1)白蛋白結合部分、IL-15、IL-15Rα；(2)白蛋白結合部分、IL-15Rα、IL-15；(3) IL-15、IL-15Rα、白蛋白結合部分；(4) IL-15Rα、IL-15、白蛋白結合部分。在一些實施例中，IL-15及IL-15Rα係經由第二連接子融合。在一些實施例中，第二連接子為可裂解連接子。在一些實施例中，第二連接子選自由SEQ ID NO: 27-45組成之群。在一些實施例中，第二連接子具有SEQ ID NO: 27之序列。在一些實施例中，第二連接子為不可裂解連接子。在一些實施例中，第二連接子選自由SEQ ID NO: 12-26及158-159組成之群。

在一些實施例中，提供一種融合蛋白，其包含：a)結合至IL-15Rα之IL-15，其包含IL-15及IL-15Rα，及b)白蛋白結合部分(諸如結合至白蛋白之sdAb)，其中IL-15包含SEQ ID NO: 99、100或127中之任一者之胺基酸序列，或與SEQ ID NO: 99、100或127中之任一者包含至少約80% (諸如至少約80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%中之任一者)序列一致性之其變異體，其中IL-15Rα包含SEQ ID NO: 101-108中之任一者(諸如SEQ ID NO: 103-104)之胺基酸序列，或與SEQ ID NO: 101-108中之任一者(諸如SEQ ID NO: 103-104)包含至少約80% (諸如至少約80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%中之任一者)序列一致性之其變異體，且其中白蛋白結合部分包含抗白蛋白抗體或其片段(諸如單域抗體，諸如V_H H抗體)。在一些實施例中，細胞激素融合至白蛋白結合部分之C端。在一些實施例中，細胞激素融合至白蛋白結合部分之N端。在一些實施例中，白蛋白結合部分融合至細胞激素之N端及C端兩者。在一些實施例中，第二細胞激素(與第一細胞激素相同或不同)融合至白蛋白結合部分之另一端。在一些實施例中，白蛋白結合部分結合至人類血清白蛋白(HSA)及/或食蟹獼猴血清白蛋白(CMSA)。在一些實施例中，細胞激素及白蛋白結合部分係經由第一連接子連接。在一些實施例中，第一連接子之長度為約一至三十個胺基酸。在一些實施例中，第一連接子選自由SEQ ID NO: 12-26及158-159組成之群。在一些實施例中，IL-15非共價結合至IL-15Rα。在一些實施例中，IL-15融合至IL-15Rα。在一些實施例中，IL-15融合至IL-15Rα之N端。在一些實施例中，IL-15融合至IL-15Rα之C端。在一些實施例中，融合蛋白以選自由以下組成之群的次序自N端至C端包含該IL-15、IL-15Rα及白蛋白結合部分：(1)白蛋白結合部分、IL-15、IL-15Rα；(2)白蛋白結合部分、IL-15Rα、IL-15；(3) IL-15、IL-15Rα、白蛋白結合部分；(4) IL-15Rα、IL-15、白蛋白結合部分。在一些實施例中，IL-15及IL-15Rα係經由第二連接子融合。在一些實施例中，第二連接子為可裂解連接子。在一些實施例中，第二連接子選自由SEQ ID NO: 27-45組成之群。在一些實施例中，第二連接子具有SEQ ID NO: 27之序列。在一些實施例中，第二連接子為不可裂解連接子。在一些實施例中，第二連接子選自由SEQ ID NO: 12-26及158-159組成之群。

在一些實施例中，提供一種融合蛋白，其包含：a)結合至IL-15Rα之IL-15，其包含IL-15及IL-15Rα，及b)白蛋白結合部分(諸如結合至白蛋白之sdAb)，其中該IL-15、IL-15Rα及白蛋白結合部分自N端至C端呈白蛋白結合部分、IL-15、IL-15Rα之次序，其中IL-15包含SEQ ID NO: 99、100或127中之任一者之胺基酸序列，或與SEQ ID NO: 99、100或127中之任一者包含至少約80% (諸如至少約80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%中之任一者)序列一致性之其變異體，其中IL-15Rα包含SEQ ID NO: 101-108中之任一者(諸如SEQ ID NO: 103-104)之胺基酸序列，或與SEQ ID NO: 101-108中之任一者(諸如SEQ ID NO: 103-104)包含至少約80% (諸如至少約80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%中之任一者)序列一致性之其變異體，且其中白蛋白結合部分包含抗白蛋白抗體或其片段(諸如單域抗體，諸如V_H H抗體)。在一些實施例中，細胞激素融合至白蛋白結合部分之C端。在一些實施例中，細胞激素融合至白蛋白結合部分之N端。在一些實施例中，白蛋白結合部分融合至細胞激素之N端及C端兩者。在一些實施例中，第二細胞激素(與第一細胞激素相同或不同)融合至白蛋白結合部分之另一端。在一些實施例中，白蛋白結合部分結合至人類血清白蛋白(HSA)及/或食蟹獼猴血清白蛋白(CMSA)。在一些實施例中，細胞激素及白蛋白結合部分係經由第一連接子連接。在一些實施例中，第一連接子之長度為約一至三十個胺基酸。在一些實施例中，第一連接子選自由SEQ ID NO: 12-26及158-159組成之群。在一些實施例中，IL-15及IL-15Rα係經由第二連接子融合。在一些實施例中，第二連接子為可裂解連接子。在一些實施例中，第二連接子選自由SEQ ID NO: 27-45組成之群。在一些實施例中，第二連接子具有SEQ ID NO: 27之序列。在一些實施例中，第二連接子為不可裂解連接子。在一些實施例中，第二連接子選自由SEQ ID NO: 12-26及158-159組成之群。

在一些實施例中，提供一種融合蛋白，其包含：a) IL-33，及b)白蛋白結合部分(諸如結合至白蛋白之sdAb)。在一些實施例中，細胞激素融合至白蛋白結合部分之C端。在一些實施例中，細胞激素融合至白蛋白結合部分之N端。在一些實施例中，白蛋白結合部分融合至細胞激素之N端及C端兩者。在一些實施例中，第二細胞激素(與第一細胞激素相同或不同)融合至白蛋白結合部分之另一端。在一些實施例中，白蛋白結合部分結合至人類血清白蛋白(HSA)及/或食蟹獼猴血清白蛋白(CMSA)。在一些實施例中，白蛋白結合部分包含白蛋白結合域(ABD)。在一些實施例中，白蛋白結合域包含選自由SEQ ID NO: 3-11組成之群的胺基酸序列，或與SEQ ID NO: 3-11中之任一者包含至少約80% (諸如至少約80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%中之任一者)序列一致性之其變異體。在一些實施例中，白蛋白結合部分包含抗白蛋白抗體(諸如單域抗體(sdAb)，諸如V_H H單域抗體)。在一些實施例中，細胞激素及白蛋白結合部分係經由第一連接子連接。在一些實施例中，第一連接子之長度為約一至三十個胺基酸。在一些實施例中，第一連接子選自由SEQ ID NO: 12-26及158-159組成之群。在一些實施例中，在細胞激素與白蛋白結合部分之間不存在連接子。

在一些實施例中，提供一種融合蛋白，其包含：a) IL-33，及b)白蛋白結合部分(諸如結合至白蛋白之sdAb)，其中IL-33包含SEQ ID NO: 109及155-157中之任一者之胺基酸序列，或與SEQ ID NO: 109及155-157中之任一者包含至少約80% (諸如至少約80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%中之任一者)序列一致性之其變異體，且其中白蛋白結合部分包含白蛋白結合域。在一些實施例中，細胞激素融合至白蛋白結合部分之C端。在一些實施例中，細胞激素融合至白蛋白結合部分之N端。在一些實施例中，白蛋白結合部分融合至細胞激素之N端及C端兩者。在一些實施例中，第二細胞激素(與第一細胞激素相同或不同)融合至白蛋白結合部分之另一端。在一些實施例中，白蛋白結合部分結合至人類血清白蛋白(HSA)及/或食蟹獼猴血清白蛋白(CMSA)。在一些實施例中，白蛋白結合域包含選自由SEQ ID NO: 3-11組成之群的胺基酸序列，或與SEQ ID NO: 3-11中之任一者包含至少約80% (諸如至少約80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%中之任一者)序列一致性之其變異體。在一些實施例中，細胞激素及白蛋白結合部分係經由第一連接子連接。在一些實施例中，第一連接子之長度為約一至三十個胺基酸。在一些實施例中，第一連接子選自由SEQ ID NO: 12-26及158-159組成之群。在一些實施例中，在細胞激素與白蛋白結合部分之間不存在連接子。

在一些實施例中，提供一種融合蛋白，其包含：a) IL-33，及b)白蛋白結合部分(諸如結合至白蛋白之sdAb)，其中IL-33包含SEQ ID NO: 109及155-157中之任一者之胺基酸序列，或與SEQ ID NO: 109及155-157中之任一者包含至少約80% (諸如至少約80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%中之任一者)序列一致性之其變異體，且其中白蛋白結合部分包含抗白蛋白抗體或其片段(諸如單域抗體，諸如V_H H抗體)。在一些實施例中，細胞激素融合至白蛋白結合部分之C端。在一些實施例中，細胞激素融合至白蛋白結合部分之N端。在一些實施例中，白蛋白結合部分融合至細胞激素之N端及C端兩者。在一些實施例中，第二細胞激素(與第一細胞激素相同或不同)融合至白蛋白結合部分之另一端。在一些實施例中，白蛋白結合部分結合至人類血清白蛋白(HSA)及/或食蟹獼猴血清白蛋白(CMSA)。在一些實施例中，細胞激素及白蛋白結合部分係經由第一連接子連接。在一些實施例中，第一連接子之長度為約一至三十個胺基酸。在一些實施例中，第一連接子選自由SEQ ID NO: 12-26及158-159組成之群。在一些實施例中，在細胞激素與白蛋白結合部分之間不存在連接子。

在一些實施例中，提供一種融合蛋白，其包含：a) IL-22，及b)白蛋白結合部分(諸如結合至白蛋白之sdAb)。在一些實施例中，細胞激素融合至白蛋白結合部分之C端。在一些實施例中，細胞激素融合至白蛋白結合部分之N端。在一些實施例中，白蛋白結合部分融合至細胞激素之N端及C端兩者。在一些實施例中，第二細胞激素(與第一細胞激素相同或不同)融合至白蛋白結合部分之另一端。在一些實施例中，白蛋白結合部分結合至人類血清白蛋白(HSA)及/或食蟹獼猴血清白蛋白(CMSA)。在一些實施例中，白蛋白結合部分包含白蛋白結合域(ABD)。在一些實施例中，白蛋白結合域包含選自由SEQ ID NO: 3-11組成之群的胺基酸序列，或與SEQ ID NO: 3-11中之任一者包含至少約80% (諸如至少約80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%中之任一者)序列一致性之其變異體。在一些實施例中，白蛋白結合部分包含抗白蛋白抗體(諸如單域抗體(sdAb)，諸如V_H H單域抗體)。在一些實施例中，細胞激素及白蛋白結合部分係經由第一連接子連接。在一些實施例中，第一連接子之長度為約一至三十個胺基酸。在一些實施例中，第一連接子選自由SEQ ID NO: 12-26及158-159組成之群。

在一些實施例中，提供一種融合蛋白，其包含：a) IL-22，及b)白蛋白結合部分(諸如結合至白蛋白之sdAb)，其中IL-22包含SEQ ID NO: 109-110中之任一者之胺基酸序列，或與SEQ ID NO: 99、100或127中之任一者包含至少約80% (諸如至少約80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%中之任一者)序列一致性之其變異體，且其中白蛋白結合部分包含白蛋白結合域。在一些實施例中，細胞激素融合至白蛋白結合部分之C端。在一些實施例中，細胞激素融合至白蛋白結合部分之N端。在一些實施例中，白蛋白結合部分融合至細胞激素之N端及C端兩者。在一些實施例中，第二細胞激素(與第一細胞激素相同或不同)融合至白蛋白結合部分之另一端。在一些實施例中，白蛋白結合部分結合至人類血清白蛋白(HSA)及/或食蟹獼猴血清白蛋白(CMSA)。在一些實施例中，白蛋白結合域包含選自由SEQ ID NO: 3-11組成之群的胺基酸序列，或與SEQ ID NO: 3-11中之任一者包含至少約80% (諸如至少約80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%中之任一者)序列一致性之其變異體。在一些實施例中，細胞激素及白蛋白結合部分係經由第一連接子連接。在一些實施例中，第一連接子之長度為約一至三十個胺基酸。在一些實施例中，第一連接子選自由SEQ ID NO: 12-26及158-159組成之群。

在一些實施例中，提供一種融合蛋白，其包含：a) IL-22，及b)白蛋白結合部分(諸如結合至白蛋白之sdAb)，其中IL-22包含SEQ ID NO: 109-110中之任一者之胺基酸序列，或與SEQ ID NO: 109-110中之任一者包含至少約80% (諸如至少約80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%中之任一者)序列一致性之其變異體，且其中白蛋白結合部分包含抗白蛋白抗體或其片段(諸如單域抗體，諸如V_H H抗體)。在一些實施例中，細胞激素融合至白蛋白結合部分之C端。在一些實施例中，細胞激素融合至白蛋白結合部分之N端。在一些實施例中，白蛋白結合部分融合至細胞激素之N端及C端兩者。在一些實施例中，第二細胞激素(與第一細胞激素相同或不同)融合至白蛋白結合部分之另一端。在一些實施例中，白蛋白結合部分結合至人類血清白蛋白(HSA)及/或食蟹獼猴血清白蛋白(CMSA)。在一些實施例中，細胞激素及白蛋白結合部分係經由第一連接子連接。在一些實施例中，第一連接子之長度為約一至三十個胺基酸。在一些實施例中，第一連接子選自由SEQ ID NO: 12-26及158-159組成之群。包含抗原結合部分之融合蛋白

本文亦提供融合蛋白，其包含：a)融合至白蛋白結合部分之細胞激素(「細胞激素-ALBBM」)，及b)抗原結合部分，其中細胞激素-ALBBM與抗原結合部分之間的鍵視情況可裂解。在一些實施例中，抗原結合部分結合至腫瘤抗原。此類融合蛋白提供各種優勢。舉例而言，在一些實施例中，結合至腫瘤抗原之抗原結合部分使得能夠將細胞激素局部遞送至癌症附近，產生較低脫靶毒性及增加之功效。

某些優勢係歸因於此類融合蛋白之三級結構及總體組態設計而由其提供。舉例而言，在一些實施例中，細胞激素(諸如IL-21)經由可裂解連接子(諸如MMP敏感性連接子)融合至白蛋白結合部分之C端，且抗原結合部分融合至白蛋白結合部分之N端。可暫時阻斷融合蛋白中之細胞激素(諸如IL-21)與細胞激素受體(諸如IL-21R)之相互作用，因為其相互作用可能需要融合蛋白之N端(接近三級結構中之C端)。當融合蛋白結合至腫瘤抗原時，細胞激素(諸如IL-21)可自融合蛋白釋放(若連接子可藉由MMP裂解)且變得具活性，因為已知癌細胞分泌各種MMP。MMP敏感性連接子確保通常具有較高MMP活性之癌症更多地暴露於活性細胞激素。因此，可避免細胞激素(諸如IL-21)之不必要毒性及副作用。另外，藉由阻止外周免疫細胞上的細胞激素(諸如IL-21)與細胞激素受體(諸如IL-21Rα)之間的相互作用，可增加融合蛋白之癌症遞送效率。

在一些實施例中，白蛋白結合部分為單域抗體(諸如V_H H抗體)。在一些實施例中，抗原結合部分為單域抗體(諸如V_H H抗體)。在一些實施例中，白蛋白結合部分及抗原結合部分均為單域抗體(諸如V_H H抗體)。

在一些實施例中，提供一種融合蛋白，其包含：a)融合至白蛋白結合部分之細胞激素(「細胞激素-ALBBM」)，及b)抗原結合部分，其中細胞激素-ALBBM與抗原結合部分之間的鍵視情況可裂解，其中白蛋白結合部分融合至細胞激素之N端，且其中抗原結合部分連接至細胞激素-ALBBM之N端。在一些實施例中，細胞激素選自由以下組成之群：IL-21、IL-7、IL-15、結合至IL-15Rα之IL-15或其片段、IL-33及IL-22。在一些實施例中，白蛋白結合部分結合至人類血清白蛋白(HSA)及/或食蟹獼猴血清白蛋白(CMSA)。在一些實施例中，白蛋白結合部分包含白蛋白結合域(ABD)。在一些實施例中，白蛋白結合域包含選自由SEQ ID NO: 3-11組成之群的胺基酸序列，或與SEQ ID NO: 3-11中之任一者包含至少約80% (諸如至少約80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%中之任一者)序列一致性之其變異體。在一些實施例中，白蛋白結合部分包含單域抗體(sdAb)。在一些實施例中，sdAb為V_H H單域抗體。在一些實施例中，細胞激素及白蛋白結合部分係經由第一連接子連接。在一些實施例中，第一連接子之長度為約一至三十個胺基酸。在一些實施例中，第一連接子選自由SEQ ID NO: 12-26及158-159組成之群。在一些實施例中，抗原結合部分係經由第二連接子融合至細胞激素-ALBBM。在一些實施例中，第二連接子之長度為約一至三十個胺基酸。在一些實施例中，第二連接子為可裂解的。在一些實施例中，可裂解連接子為基質金屬蛋白酶、豆莢蛋白、間質蛋白酶或尿激酶敏感性的。在一些實施例中，第二連接子選自由SEQ ID NO: 12-45及158-159組成之群。在一些實施例中，抗原結合部分結合至腫瘤抗原。在一些實施例中，腫瘤抗原選自由間皮素(MSLN)、GPA33、Her-2、EGFR及CD20組成之群。在一些實施例中，腫瘤抗原選自由以下組成之群：CEA、MUC16、MUC1、AFP、EPCAM、CD19、CD21、CD22、CD30、CD33、CD37、CD45、PSMA及BCMA。在一些實施例中，抗原結合部分為抗體或其片段。在一些實施例中，抗原結合部分包含單域抗體(sdAb)。在一些實施例中，抗原結合部分包含V_H H單域抗體。在一些實施例中，sdAb結合至間皮素。

在一些實施例中，提供一種融合蛋白，其包含：a)融合至白蛋白結合部分之細胞激素(「細胞激素-ALBBM」)，及b)抗原結合部分，其中細胞激素-ALBBM與抗原結合部分之間的鍵視情況可裂解，其中白蛋白結合部分融合至細胞激素之N端，且其中抗原結合部分連接至細胞激素-ALBBM之C端。在一些實施例中，細胞激素選自由以下組成之群：IL-21、IL-7、IL-15、結合至IL-15Rα之IL-15或其片段、IL-33及IL-22。在一些實施例中，白蛋白結合部分結合至人類血清白蛋白(HSA)及/或食蟹獼猴血清白蛋白(CMSA)。在一些實施例中，白蛋白結合部分包含白蛋白結合域(ABD)。在一些實施例中，白蛋白結合域包含選自由SEQ ID NO: 3-11組成之群的胺基酸序列，或與SEQ ID NO: 3-11中之任一者包含至少約80% (諸如至少約80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%中之任一者)序列一致性之其變異體。在一些實施例中，白蛋白結合部分包含單域抗體(sdAb)。在一些實施例中，sdAb為V_H H單域抗體。在一些實施例中，細胞激素及白蛋白結合部分係經由第一連接子連接。在一些實施例中，第一連接子之長度為約一至三十個胺基酸。在一些實施例中，第一連接子選自由SEQ ID NO: 12-26及158-159組成之群。在一些實施例中，抗原結合部分係經由第二連接子融合至細胞激素-ALBBM。在一些實施例中，第二連接子之長度為約一至三十個胺基酸。在一些實施例中，第二連接子為可裂解的。在一些實施例中，可裂解連接子為基質金屬蛋白酶、豆莢蛋白、間質蛋白酶或尿激酶敏感性的。在一些實施例中，第二連接子選自由SEQ ID NO: 12-45及158-159組成之群。在一些實施例中，抗原結合部分結合至腫瘤抗原。在一些實施例中，腫瘤抗原選自由間皮素(MSLN)、GPA33、Her-2、EGFR及CD20組成之群。在一些實施例中，腫瘤抗原選自由以下組成之群：CEA、MUC16、MUC1、AFP、EPCAM、CD19、CD21、CD22、CD30、CD33、CD37、CD45、PSMA及BCMA。在一些實施例中，抗原結合部分為抗體或其片段。在一些實施例中，抗原結合部分包含單域抗體(sdAb)。在一些實施例中，抗原結合部分包含V_H H單域抗體。在一些實施例中，sdAb結合至間皮素。

在一些實施例中，提供一種融合蛋白，其包含：a)融合至白蛋白結合部分之細胞激素(「細胞激素-ALBBM」)，及b)抗原結合部分，其中細胞激素-ALBBM與抗原結合部分之間的鍵視情況可裂解，其中白蛋白結合部分融合至細胞激素之C端，且其中抗原結合部分連接至細胞激素-ALBBM之C端。在一些實施例中，細胞激素選自由以下組成之群：IL-21、IL-7、IL-15、結合至IL-15Rα之IL-15或其片段、IL-33及IL-22。在一些實施例中，白蛋白結合部分結合至人類血清白蛋白(HSA)及/或食蟹獼猴血清白蛋白(CMSA)。在一些實施例中，白蛋白結合部分包含白蛋白結合域(ABD)。在一些實施例中，白蛋白結合域包含選自由SEQ ID NO: 3-11組成之群的胺基酸序列，或與SEQ ID NO: 3-11中之任一者包含至少約80% (諸如至少約80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%中之任一者)序列一致性之其變異體。在一些實施例中，白蛋白結合部分包含單域抗體(sdAb)。在一些實施例中，sdAb為V_H H單域抗體。在一些實施例中，細胞激素及白蛋白結合部分係經由第一連接子連接。在一些實施例中，第一連接子之長度為約一至三十個胺基酸。在一些實施例中，第一連接子選自由SEQ ID NO: 12-26及158-159組成之群。在一些實施例中，抗原結合部分係經由第二連接子融合至細胞激素-ALBBM。在一些實施例中，第二連接子之長度為約一至三十個胺基酸。在一些實施例中，第二連接子為可裂解的。在一些實施例中，可裂解連接子為基質金屬蛋白酶、豆莢蛋白、間質蛋白酶或尿激酶敏感性的。在一些實施例中，第二連接子選自由SEQ ID NO: 12-45及158-159組成之群。在一些實施例中，抗原結合部分結合至腫瘤抗原。在一些實施例中，腫瘤抗原選自由間皮素(MSLN)、GPA33、Her-2、EGFR及CD20組成之群。在一些實施例中，腫瘤抗原選自由以下組成之群：CEA、MUC16、MUC1、AFP、EPCAM、CD19、CD21、CD22、CD30、CD33、CD37、CD45、PSMA及BCMA。在一些實施例中，抗原結合部分為抗體或其片段。在一些實施例中，抗原結合部分包含單域抗體(sdAb)。在一些實施例中，抗原結合部分包含V_H H單域抗體。在一些實施例中，sdAb結合至間皮素。

在一些實施例中，提供一種融合蛋白，其包含：a)融合至白蛋白結合部分之細胞激素(「細胞激素-ALBBM」)，及b)抗原結合部分，其中細胞激素-ALBBM與抗原結合部分之間的鍵視情況可裂解，其中白蛋白結合部分融合至細胞激素之C端，且其中抗原結合部分連接至細胞激素-ALBBM之N端。在一些實施例中，細胞激素選自由以下組成之群：IL-21、IL-7、IL-15、結合至IL-15Rα之IL-15或其片段、IL-33及IL-22。在一些實施例中，白蛋白結合部分結合至人類血清白蛋白(HSA)及/或食蟹獼猴血清白蛋白(CMSA)。在一些實施例中，白蛋白結合部分包含白蛋白結合域(ABD)。在一些實施例中，白蛋白結合域包含選自由SEQ ID NO: 3-11組成之群的胺基酸序列，或與SEQ ID NO: 3-11中之任一者包含至少約80% (諸如至少約80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%中之任一者)序列一致性之其變異體。在一些實施例中，白蛋白結合部分包含單域抗體(sdAb)。在一些實施例中，sdAb為V_H H單域抗體。在一些實施例中，細胞激素及白蛋白結合部分係經由第一連接子連接。在一些實施例中，第一連接子之長度為約一至三十個胺基酸。在一些實施例中，第一連接子選自由SEQ ID NO: 12-26及158-159組成之群。在一些實施例中，抗原結合部分係經由第二連接子融合至細胞激素-ALBBM。在一些實施例中，第二連接子之長度為約一至三十個胺基酸。在一些實施例中，第二連接子為可裂解的。在一些實施例中，可裂解連接子為基質金屬蛋白酶、豆莢蛋白、間質蛋白酶或尿激酶敏感性的。在一些實施例中，第二連接子選自由SEQ ID NO: 12-45及158-159組成之群。在一些實施例中，抗原結合部分結合至腫瘤抗原。在一些實施例中，腫瘤抗原選自由間皮素(MSLN)、GPA33、Her-2、EGFR及CD20組成之群。在一些實施例中，腫瘤抗原選自由以下組成之群：CEA、MUC16、MUC1、AFP、EPCAM、CD19、CD21、CD22、CD30、CD33、CD37、CD45、PSMA及BCMA。在一些實施例中，抗原結合部分為抗體或其片段。在一些實施例中，抗原結合部分包含單域抗體(sdAb)。在一些實施例中，抗原結合部分包含V_H H單域抗體。在一些實施例中，sdAb結合至間皮素。

在一些實施例中，提供一種融合蛋白，其包含：a)融合至白蛋白結合部分之細胞激素(「細胞激素-ALBBM」)，及b)抗原結合部分，其中細胞激素-ALBBM與抗原結合部分之間的鍵視情況可裂解，其中白蛋白結合部分為白蛋白結合域(ABD)，且其中抗原結合部分為結合至腫瘤抗原之單域抗體(諸如結合至腫瘤抗原之V_H H抗體)。在一些實施例中，白蛋白結合部分融合至細胞激素之N端或C端。在一些實施例中，抗原結合部分連接至細胞激素-ALBBM之N端或C端。在一些實施例中，細胞激素選自由以下組成之群：IL-21、IL-7、IL-15、結合至IL-15Rα之IL-15或其片段、IL-33及IL-22。在一些實施例中，白蛋白結合部分結合至人類血清白蛋白(HSA)及/或食蟹獼猴血清白蛋白(CMSA)。在一些實施例中，白蛋白結合域包含選自由SEQ ID NO: 3-11組成之群的胺基酸序列，或與SEQ ID NO: 3-11中之任一者包含至少約80% (諸如至少約80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%中之任一者)序列一致性之其變異體。在一些實施例中，細胞激素及白蛋白結合部分係經由第一連接子連接。在一些實施例中，第一連接子之長度為約一至三十個胺基酸。在一些實施例中，第一連接子選自由SEQ ID NO: 12-26及158-159組成之群。在一些實施例中，抗原結合部分係經由第二連接子融合至細胞激素-ALBBM。在一些實施例中，第二連接子之長度為約一至三十個胺基酸。在一些實施例中，第二連接子為可裂解的。在一些實施例中，可裂解連接子為基質金屬蛋白酶、豆莢蛋白、間質蛋白酶或尿激酶敏感性的。在一些實施例中，第二連接子選自由SEQ ID NO: 12-45及158-159組成之群。在一些實施例中，腫瘤抗原選自由間皮素(MSLN)、GPA33、Her-2、EGFR及CD20組成之群。在一些實施例中，腫瘤抗原選自由以下組成之群：CEA、MUC16、MUC1、AFP、EPCAM、CD19、CD21、CD22、CD30、CD33、CD37、CD45、PSMA及BCMA。在一些實施例中，抗原結合部分包含V_H H單域抗體。在一些實施例中，sdAb結合至間皮素。

在一些實施例中，提供一種融合蛋白，其包含：a)融合至白蛋白結合部分之細胞激素(「細胞激素-ALBBM」)，及b)抗原結合部分，其中細胞激素-ALBBM與抗原結合部分之間的鍵視情況可裂解，其中白蛋白結合部分為單域抗體(「抗白蛋白dsAb」，諸如抗白蛋白V_H H抗體)，且其中抗原結合部分為結合至腫瘤抗原之單域抗體(諸如結合至腫瘤抗原之V_H H抗體)。在一些實施例中，白蛋白結合部分融合至細胞激素之N端或C端。在一些實施例中，抗原結合部分連接至細胞激素-ALBBM之N端或C端。在一些實施例中，細胞激素選自由以下組成之群：IL-21、IL-7、IL-15、結合至IL-15Rα之IL-15或其片段、IL-33及IL-22。在一些實施例中，白蛋白結合部分結合至人類血清白蛋白(HSA)及/或食蟹獼猴血清白蛋白(CMSA)。在一些實施例中，抗白蛋白sdAb為V_H H單域抗體。在一些實施例中，細胞激素及白蛋白結合部分係經由第一連接子連接。在一些實施例中，第一連接子之長度為約一至三十個胺基酸。在一些實施例中，第一連接子選自由SEQ ID NO: 12-26及158-159組成之群。在一些實施例中，抗原結合部分係經由第二連接子融合至細胞激素-ALBBM。在一些實施例中，第二連接子之長度為約一至三十個胺基酸。在一些實施例中，第二連接子為可裂解的。在一些實施例中，可裂解連接子為基質金屬蛋白酶、豆莢蛋白、間質蛋白酶或尿激酶敏感性的。在一些實施例中，第二連接子選自由SEQ ID NO: 12-45及158-159組成之群。在一些實施例中，腫瘤抗原選自由間皮素(MSLN)、GPA33、Her-2、EGFR及CD20組成之群。在一些實施例中，腫瘤抗原選自由以下組成之群：CEA、MUC16、MUC1、AFP、EPCAM、CD19、CD21、CD22、CD30、CD33、CD37、CD45、PSMA及BCMA。在一些實施例中，抗原結合部分包含V_H H單域抗體。在一些實施例中，sdAb結合至間皮素。

在一些實施例中，提供一種融合蛋白，其包含：a)融合至白蛋白結合部分之細胞激素(「細胞激素-ALBBM」)，及b)抗原結合部分，其中細胞激素-ALBBM與抗原結合部分之間的鍵視情況可裂解，其中白蛋白結合部分為白蛋白結合域或單域抗體(「抗白蛋白dsAb」，諸如抗白蛋白V_H H抗體)，且其中抗原結合部分為抗間皮素單域抗體(諸如抗MSLN V_H H抗體)。在一些實施例中，白蛋白結合部分融合至細胞激素之N端或C端。在一些實施例中，抗原結合部分連接至細胞激素-ALBBM之N端或C端。在一些實施例中，細胞激素選自由以下組成之群：IL-21、IL-7、IL-15、結合至IL-15Rα之IL-15或其片段、IL-33及IL-22。在一些實施例中，白蛋白結合部分結合至人類血清白蛋白(HSA)及/或食蟹獼猴血清白蛋白(CMSA)。在一些實施例中，白蛋白結合域包含選自由SEQ ID NO: 3-11組成之群的胺基酸序列，或與SEQ ID NO: 3-11中之任一者包含至少約80% (諸如至少約80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%中之任一者)序列一致性之其變異體。在一些實施例中，白蛋白結合部分包含有包含V_H H單域抗體之單域抗體(sdAb)。在一些實施例中，細胞激素及白蛋白結合部分係經由第一連接子連接。在一些實施例中，第一連接子之長度為約一至三十個胺基酸。在一些實施例中，第一連接子選自由SEQ ID NO: 12-26及158-159組成之群。在一些實施例中，抗原結合部分係經由第二連接子融合至細胞激素-ALBBM。在一些實施例中，第二連接子之長度為約一至三十個胺基酸。在一些實施例中，第二連接子為可裂解的。在一些實施例中，可裂解連接子為基質金屬蛋白酶、豆莢蛋白、間質蛋白酶或尿激酶敏感性的。在一些實施例中，第二連接子選自由SEQ ID NO: 12-45及158-159組成之群。

在一些實施例中，提供一種融合蛋白，其包含：a)融合至白蛋白結合部分之細胞激素(「細胞激素-ALBBM」)，及b)抗原結合部分，其中細胞激素-ALBBM與抗原結合部分之間的鍵視情況可裂解，其中白蛋白結合部分為白蛋白結合域或單域抗體(「抗白蛋白dsAb」，諸如抗白蛋白V_H H抗體)，且其中抗原結合部分為結合至腫瘤抗原之單域抗體，其中細胞激素為IL-21。在一些實施例中，白蛋白結合部分融合至細胞激素之N端或C端。在一些實施例中，抗原結合部分連接至細胞激素-ALBBM之N端或C端。在一些實施例中，白蛋白結合部分結合至人類血清白蛋白(HSA)及/或食蟹獼猴血清白蛋白(CMSA)。在一些實施例中，白蛋白結合域包含選自由SEQ ID NO: 3-11組成之群的胺基酸序列，或與SEQ ID NO: 3-11中之任一者包含至少約80% (諸如至少約80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%中之任一者)序列一致性之其變異體。在一些實施例中，白蛋白結合部分包含有包含V_H H單域抗體之單域抗體(sdAb)。在一些實施例中，細胞激素及白蛋白結合部分係經由第一連接子連接。在一些實施例中，第一連接子之長度為約一至三十個胺基酸。在一些實施例中，第一連接子選自由SEQ ID NO: 12-26及158-159組成之群。在一些實施例中，抗原結合部分係經由第二連接子融合至細胞激素-ALBBM。在一些實施例中，第二連接子之長度為約一至三十個胺基酸。在一些實施例中，第二連接子為可裂解的。在一些實施例中，可裂解連接子為基質金屬蛋白酶、豆莢蛋白、間質蛋白酶或尿激酶敏感性的。在一些實施例中，第二連接子選自由SEQ ID NO: 12-45及158-159組成之群。在一些實施例中，腫瘤抗原選自由間皮素(MSLN)、GPA33、Her-2、EGFR及CD20組成之群。在一些實施例中，腫瘤抗原選自由以下組成之群：CEA、MUC16、MUC1、AFP、EPCAM、CD19、CD21、CD22、CD30、CD33、CD37、CD45、PSMA及BCMA。在一些實施例中，抗原結合部分包含V_H H單域抗體。在一些實施例中，sdAb結合至間皮素。

在一些實施例中，提供一種融合蛋白，其包含：a)融合至白蛋白結合部分之細胞激素(「細胞激素-ALBBM」)，及b)抗原結合部分，其中細胞激素-ALBBM與抗原結合部分之間的鍵視情況可裂解，其中白蛋白結合部分為白蛋白結合域或單域抗體(「抗白蛋白dsAb」，諸如抗白蛋白V_H H抗體)，且其中抗原結合部分包含有包含抗間皮素重鏈可變區(抗MSLN V_H )之抗間皮素單域抗體，其中：a)抗MSLN V_H 包含CDR1，該CDR1包含SEQ ID NO: 46之胺基酸序列或在CDR1中包含至多3、2或1個取代之其變異體，CDR2，該CDR2包含SEQ ID NO: 47之胺基酸序列或在CDR1中包含至多3、2或1個取代之其變異體，CDR3，該CDR3包含SEQ ID NO: 48之胺基酸序列或在CDR1中包含至多3、2或1個取代之其變異體；或b)抗MSLN V_H 包含CDR1，該CDR1包含SEQ ID NO: 49之胺基酸序列或在CDR1中包含至多3、2或1個取代之其變異體，CDR2，該CDR2包含SEQ ID NO: 50之胺基酸序列或在CDR1中包含至多3、2或1個取代之其變異體，CDR3，該CDR3包含SEQ ID NO: 51之胺基酸序列或在CDR1中包含至多3、2或1個取代之其變異體。在一些實施例中，白蛋白結合部分融合至細胞激素之N端或C端。在一些實施例中，抗原結合部分連接至細胞激素-ALBBM之N端或C端。在一些實施例中，細胞激素選自由以下組成之群：IL-21、IL-7、IL-15、結合至IL-15Rα之IL-15或其片段、IL-33及IL-22。在一些實施例中，白蛋白結合部分結合至人類血清白蛋白(HSA)及/或食蟹獼猴血清白蛋白(CMSA)。在一些實施例中，白蛋白結合域包含選自由SEQ ID NO: 3-11組成之群的胺基酸序列，或與SEQ ID NO: 3-11中之任一者包含至少約80% (諸如至少約80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%中之任一者)序列一致性之其變異體。在一些實施例中，白蛋白結合部分包含有包含V_H H單域抗體之單域抗體(sdAb)。在一些實施例中，細胞激素及白蛋白結合部分係經由第一連接子連接。在一些實施例中，第一連接子之長度為約一至三十個胺基酸。在一些實施例中，第一連接子選自由SEQ ID NO: 12-26及158-159組成之群。在一些實施例中，抗原結合部分係經由第二連接子融合至細胞激素-ALBBM。在一些實施例中，第二連接子之長度為約一至三十個胺基酸。在一些實施例中，第二連接子為可裂解的。在一些實施例中，可裂解連接子為基質金屬蛋白酶、豆莢蛋白、間質蛋白酶或尿激酶敏感性的。在一些實施例中，第二連接子選自由SEQ ID NO: 12-45及158-159組成之群。

在一些實施例中，融合蛋白包含SEQ ID NO: 120-125、129-154及160-167中之任一者之胺基酸序列，或與SEQ ID NO: 120-125、129-154及160-167中之任一者包含至少約80% (諸如至少約80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%中之任一者)序列一致性之其變異體。 A. 融合蛋白特性 1 血清半衰期

在一些實施例中，當向個體投與時，融合蛋白之血清半衰期為至少約15天、約14天、約13天、約12天、約11天、約10天、約9天、約8天、約7天、約6天、約5天、約4天、約3天、約2天、約24小時、約24小時、約20小時、約18小時、約16小時、約14小時、約12小時、約10小時、約8小時、約6小時、約4小時、約3小時、約2小時或約1小時。融合蛋白可經由各種途徑投與。例如靜脈內、經口、皮下或腹膜內。

在一些實施例中，融合蛋白之血清半衰期比參考蛋白之血清半衰期長(諸如長至少約20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%或90%)。在一些實施例中，融合蛋白之血清半衰期為參考蛋白之血清半衰期的至少1倍、2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、12倍、15倍、20倍、25倍、30倍、35倍、40倍、45倍或50倍。在一些實施例中，參考蛋白包含相同細胞激素及/或相同抗原結合部分，但不具有白蛋白結合部分。在一些實施例中，相同細胞激素及相同抗原結合部分以與融合蛋白相同之次序及/或經由相同連接子融合。 2 穩定性

在一些實施例中，融合蛋白具有比參考蛋白更高的穩定性。在一些實施例中，參考蛋白包含相同細胞激素及/或相同抗原結合部分，但不具有白蛋白結合部分。在一些實施例中，相同細胞激素及相同抗原結合部分以與融合蛋白相同之次序及/或經由相同連接子融合。

在一些實施例中，穩定性包含熱穩定性。

在一些實施例中，穩定性係藉由融合蛋白在儲存於界定條件下之後保留可接受程度之化學結構或生物功能的程度來評估。在一些實施例中，融合蛋白具有高穩定性，即使其在儲存界定時間量之後不維持100%的其化學結構或生物功能。在一些實施例中，在儲存界定時間量之後維持如本文所述之融合蛋白之結構或功能的約90%、約95%、約96%、約97%、約98%或約99%可視為具有高穩定性。

穩定性可尤其藉由測定在界定溫度下儲存界定時間量之後保持於調配物(液體或復原)中之原生(非聚集或非降解)融合蛋白的百分比來量測。天然融合蛋白之百分比可尤其藉由尺寸排阻層析(例如尺寸排阻高效液相層析[SE-HPLC])測定，使得原生意謂非聚集及非降解。在一些實施例中，在給定溫度下儲存界定時間量之後，可在調配物中偵測到融合蛋白之原生形式的至少約90% (諸如至少約90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%)。在一些實施例中，在室溫(約25℃)下至少約6小時、至少約8小時、至少約10小時、至少約12小時、至少約14小時、至少約16小時、至少約18小時、至少約20小時、至少約22小時、至少約24小時、至少約26小時、至少約28小時、至少約30小時、至少約32小時、至少約34小時、至少約36小時、至少約38小時、至少約40小時、至少約42小時、至少約44小時、至少約46小時或至少約48小時之後，可在調配物中偵測到融合蛋白之原生形式的至少約90% (諸如至少約90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%)。

穩定性可尤其藉由測定在界定溫度下儲存界定時間量之後在調配物(液體或復原)內形成聚集體之融合蛋白的百分比來量測，其中穩定性與形成之聚集體%成反比。聚集融合蛋白之百分比可尤其藉由尺寸排阻層析(例如尺寸排阻高效液相層析[SE-HPLC])測定。在一些實施例中，在給定溫度下儲存界定時間量之後，調配物中以聚集體形式存在之融合蛋白小於約10% (較佳小於約5%)。在一些實施例中，在給定溫度下儲存界定時間量之後，例如在室溫(約25℃)下至少約6小時、至少約8小時、至少約10小時、至少約12小時、至少約14小時、至少約16小時、至少約18小時、至少約20小時、至少約22小時、至少約24小時、至少約26小時、至少約28小時、至少約30小時、至少約32小時、至少約34小時、至少約36小時、至少約38小時、至少約40小時、至少約42小時、至少約44小時、至少約46小時或至少約48小時之後，本文所述之融合蛋白基本上無聚集，例如調配物中可偵測到至多約6%、5%、4%、3%、2%、1%、0.5%或0.1%呈聚集體形式之融合蛋白。

量測融合蛋白與其目標之結合親和力亦可用於評估穩定性。舉例而言，若在例如室溫(約25℃)下儲存界定時間量(例如6小時、12小時、24小時、36小時、48小時)之後，細胞激素及/或抗原結合域之親和力為在該儲存之前該抗體之結合親和力的至少50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%或甚至更多，則本申請案融合蛋白可視為穩定。結合親和力可藉由任何方法，諸如ELISA或電漿子共振測定。融合蛋白與此類細胞之結合可直接量測，諸如經由FACS分析。 3 臨床特性

在一些實施例中，本文所述之融合蛋白具有相對於參考蛋白改良之臨床特性。在一些實施例中，相比於參考蛋白，融合蛋白展現改良之細胞毒性活性。在一些實施例中，相比於參考蛋白，融合蛋白展現較高抗腫瘤作用(諸如減小腫瘤負荷、改善存活期等)。在一些實施例中，參考蛋白包含相同細胞激素及/或相同抗原結合部分，但不具有白蛋白結合部分。在一些實施例中，相同細胞激素及相同抗原結合部分以與融合蛋白相同之次序及/或經由相同連接子融合。細胞毒性

可用許多分析來測試本文所述之融合蛋白針對細胞之細胞毒性(諸如ADCC活性)。舉例而言，表現可藉由融合蛋白識別之抗原的癌細胞株及效應細胞(例如PBMC細胞)在96孔盤中混合在一起。將不同濃度之融合蛋白添加至各孔中。在培育之後，可計算EC50 (表示ADCC活性)。

在一些實施例中，相比於參考蛋白，融合蛋白展現改良的針對細胞之ADCC活性。在一些實施例中，特異性針對細胞之融合蛋白的EC50不超過參考蛋白之約50%、40%、30%、20%、10%或更小。在一些實施例中，細胞為腫瘤細胞。在一些實施例中，腫瘤細胞衍生自間皮瘤、肺癌、乳癌、卵巢癌、胰臟癌、淋巴瘤、白血病、頭頸癌、肝癌、食道癌、胃癌及結腸直腸癌。在一些實施例中，參考蛋白包含相同細胞激素及/或相同抗原結合部分，但不具有白蛋白結合部分。在一些實施例中，相同細胞激素及相同抗原結合部分以與融合蛋白相同之次序及/或經由相同連接子融合。治療癌症

在一些實施例中，融合蛋白治療個體之癌症(例如，藉由抑制腫瘤生長)。在一些實施例中，相比於參考蛋白，融合展現增強的針對癌症之抗腫瘤作用。舉例而言，在一些實施例中，相比於參考蛋白，投與融合蛋白產生減小的腫瘤負荷(諸如腫瘤體積小至少約10%、20%、30%、40%或50%)。在一些實施例中，癌症係選自包含以下之群：間皮瘤、肺癌、乳癌、卵巢癌、胰臟癌、淋巴瘤、白血病、頭頸癌、肝癌、食道癌、胃癌及結腸直腸癌。在一些實施例中，參考蛋白包含相同細胞激素及/或相同抗原結合部分，但不具有白蛋白結合部分。在一些實施例中，相同細胞激素及相同抗原結合部分以與融合蛋白相同之次序及/或經由相同連接子融合。 B. 連接子

在一些實施例中，本文所述之融合蛋白在細胞激素與白蛋白結合部分之間包含第一連接子。在一些實施例中，本文所述之融合蛋白在融合至白蛋白結合部分之細胞激素(「細胞激素-ALBBM」)與抗原結合部分之間包含第二連接子。

在一些實施例中，第一連接子為剛性連接子。在一些實施例中，第一連接子選自由SEQ ID NO: 21、22及24組成之群。

在一些實施例中，第一連接子為可撓性連接子。在一些實施例中，第一連接子選自由SEQ ID NO: 12-14組成之群。

在一些實施例中，第一連接子為不可裂解連接子。

在一些實施例中，第一連接子之長度為約1至40 (諸如1至35、1至30、1至25、1至20、4至20或4至16)個胺基酸。

在一些實施例中，第一連接子選自由SEQ ID NO: 12-26及158-159組成之群。

在一些實施例中，第二連接子為剛性連接子。在一些實施例中，第二連接子選自由SEQ ID NO: 21、22及24組成之群。

在一些實施例中，第二連接子為可撓性連接子。在一些實施例中，第二連接子選自由SEQ ID NO: 12-14組成之群。

在一些實施例中，第二連接子為可裂解連接子。在一些實施例中，第二連接子為基質金屬蛋白酶、豆莢蛋白、間質蛋白酶或尿激酶敏感性的。

在一些實施例中，第二連接子選自由SEQ ID NO: 12-45及158-159組成之群。在一些實施例中，第二連接子選自由SEQ ID NO: 27-45組成之群。

在一些實施例中，第二連接子之長度為約1至40 (諸如1至35、1至30、1至25、1至20、4至20、4至16或5至9)個胺基酸。

在一些實施例中，第一及/或第二連接子不包含Gly-Gly-Gly-Gly-Ser序列。在一些實施例中，第一及/或第二連接子不為GS連接子。

用於融合蛋白中之第一及/或第二連接子之長度、可撓性程度及/或其他特性可對特性具有一些影響，包括但不限於一或多種組分(諸如細胞激素、白蛋白結合分子及/或抗原結合部分)結合其目標之親和力、特異性或親合力。舉例而言，可選擇較長連接子以確保兩個相鄰域在空間上彼此無干擾。在一些實施例中，連接子(諸如肽連接子)包含可撓性殘基(諸如甘胺酸及絲胺酸)以使得相鄰域相對於彼此自由移動。舉例而言，甘胺酸-絲胺酸二聯體可為適合之肽連接子。在一些實施例中，連接子為非肽連接子。在一些實施例中，連接子為肽連接子。

其他連接子考慮因素包括對所得化合物之物理或藥物動力學特性的影響，諸如溶解度、親脂性、親水性、疏水性、穩定性(更穩定或更不穩定以及計劃降解)、剛性、可撓性、免疫原性、抗體結合調節、併入至微胞或脂質體中之能力及其類似特性。非肽連接子

上文所述之組分的偶合可藉由任何將結合兩個分子之化學反應實現，只要兩種組分分別保留其各別活性，亦即結合至細胞激素受體、白蛋白或目標抗原。此連接可包括許多化學機制，例如共價結合、親和力結合、插入、配位結合及錯合。在一些實施例中，結合為共價結合。共價結合可藉由現有側鏈之直接縮合或藉由併入外部橋連分子實現。在此背景下，許多二價或多價鍵聯劑可適用於偶合蛋白分子。舉例而言，代表性偶合劑可包括有機化合物，諸如硫酯、碳化二亞胺、丁二醯亞胺酯、二異氰酸酯、戊二醛、重氮苯及六亞甲基二胺。此清單不意欲窮舉此項技術中已知之偶合劑的各種類別，而是例示更常用偶合劑(參見Killen及Lindstrom, Jour. Immun. 133:1335-2549 (1984)；Jansen等人, Immunological Reviews 62:185-216 (1982)；及Vitetta等人, Science 238:1098 (1987))。

可適用於本申請案中之連接子描述於文獻中(參見例如Ramakrishnan, S.等人, Cancer Res. 44:201-208 (1984)，其描述MBS (M-順丁烯二醯亞胺基苯甲醯基-N-羥基丁二醯亞胺酯)之用途。在一些實施例中，本文所用之非肽連接子包括：(i) EDC (1-乙基-3-(3-二甲胺基-丙基)碳化二亞胺鹽酸鹽；(ii) SMPT (4-丁二醯亞胺基氧基羰基-α-甲基-α-(2-吡啶基-二硫基)-甲苯(Pierce Chem. Co.，目錄號(21558G)；(iii) SPDP (丁二醯亞胺基-6[3-(2-吡啶基二硫基)丙醯胺基]己酸酯(Pierce Chem. Co.，目錄號21651G)；(iv)磺基-LC-SPDP (磺基丁二醯亞胺基6[3-(2-吡啶基二硫基)-丙醯胺]己酸酯(Pierce Chem. Co.，目錄號2165-G)；及(v)與EDC結合之磺基-NHS (N-羥基磺基-丁二醯亞胺：Pierce Chem. Co.，目錄號24510)。

上述連接子含有具有不同屬性之組分，從而可產生具有不同物理化學特性之融合蛋白。舉例而言，烷基羧酸之磺基-NHS酯的穩定性大於芳族羧酸之磺基-NHS酯。含有NHS-酯之連接子溶解性低於磺基-NHS酯。另外，連接子SMPT含有位阻二硫鍵，且可形成穩定性增強之抗體融合蛋白。二硫鍵之穩定性一般小於其他鍵，因為二硫鍵在活體外裂解，使得抗體融合蛋白可用性較差。特定言之，磺基-NHS可增強碳化二亞胺偶合之穩定性。碳化二亞胺偶合(諸如EDC)當結合磺基-NHS使用時，形成的酯對水解之抗性大於單獨碳化二亞胺偶合反應。肽連接子

肽連接子可具有天然存在之序列或非天然存在之序列。舉例而言，源自僅重鏈抗體之鉸鏈區的序列可用作連接子。參見例如WO1996/34103。

肽連接子可具有任何適合之長度。在一些實施例中，肽連接子之長度為以下中之任一者：至少約1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、35、40、50、75、100個或更多個胺基酸。在一些實施例中，肽連接子之長度為以下中之任一者：不超過約100、75、50、40、35、30、25、20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5個或更少個胺基酸。在一些實施例中，肽連接子之長度為以下中之任一者：約1個胺基酸至約10個胺基酸、約1個胺基酸至約20個胺基酸、約1個胺基酸至約30個胺基酸、約5個胺基酸至約15個胺基酸、約10個胺基酸至約25個胺基酸、約5個胺基酸至約30個胺基酸、約10個胺基酸至約30個胺基酸長、約30個胺基酸至約50個胺基酸、約50個胺基酸至約100個胺基酸或約1個胺基酸至約100個胺基酸。

此類肽連接子之基本技術特徵為該肽連接子不包含任何聚合活性。肽連接子之特徵(其包含不存在二級結構之促進)在此項技術中已知且例如描述於Dall'Acqua等人 (Biochem. (1998) 37, 9266-9273)；Cheadle等人 (Mol Immunol (1992) 29, 21-30)及Raag及Whitlow (FASEB (1995) 9(1), 73-80)中。在「肽連接子」之情形下，尤佳胺基酸為Gly。此外，亦不促進任何二級結構之肽連接子為較佳的。域彼此間的連接可藉由例如基因工程化來提供。用於製備融合及可操作連接之融合蛋白組分及在哺乳動物細胞或細菌中表現其之方法為此項技術中熟知的(例如WO 99/54440，Ausubel, Current Protocols in Molecular Biology, Green Publishing Associates and Wiley Interscience, N. Y. 1989及1994或Sambrook等人, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N. Y., 2001)。

肽連接子可為蛋白酶，尤其基質金屬蛋白酶(MMP)不可裂解之穩定連接子。

連接子亦可為可撓性連接子。例示性可撓性連接子包括甘胺酸聚合物(G)_n 、甘胺酸-絲胺酸聚合物(包括例如(GS)_n 、(GSGS)_n (SEQ ID NO: 19)、(GGSG)_n (SEQ ID NO: 20)、(GGGGS)_n (SEQ ID NO: 14)，其中n為至少1之整數)、甘胺酸-丙胺酸聚合物、丙胺酸-絲胺酸聚合物及此項技術中已知之其他可撓性連接子。甘胺酸及甘胺酸-絲胺酸聚合物係相對非結構化的，且因此能夠充當各組分之間的中性繫鏈。甘胺酸甚至比丙胺酸進入顯著更多的φ-ψ空間，且所受限制比具有較長側鏈之殘基少得多(參見Scheraga, Rev. Computational Chem. 11 173-142 (1992))。一般熟習此項技術者應認識到，抗體融合蛋白之設計可包括完全或部分可撓的連接子，使得連接子可包括可撓性連接子部分以及一或多個賦予較小可撓性之結構的部分，以得到所需抗體融合蛋白結構。 C. 細胞激素

本文所述之融合蛋白包含細胞激素。在一些實施例中，細胞激素選自由以下組成之群：IL-21、IL-7、IL-15、結合至IL-15Rα之IL-15或其片段、IL-33及IL-22。 IL-21

IL-21為由T細胞及自然殺手T細胞產生之I型細胞激素，其對大範圍之免疫及非免疫細胞類型具有多效性作用。此細胞激素對大範圍之細胞類型，包括但不限於CD4⁺ 及CD8⁺ T細胞、B細胞、巨噬細胞、單核球及樹突狀細胞(DC)具有多種多樣的作用。IL-21之功能受體由IL-21受體(IL-21R)及共同細胞激素受體γ鏈(γ c)(其亦為IL-2、IL-4、IL-7、IL-9及IL-15之受體的次單位)構成。

NK細胞及CD8⁺ T細胞中之細胞毒性程式的激活對於癌症免疫療法為關鍵的，且因此早期研究提供IL-21為針對此疾病之有前景的免疫治療劑之有力證據。IL-21促進成熟、增強細胞毒性且誘導藉由NK細胞產生IFN-γ及穿孔素。相應地，由IL-21誘導之細胞溶解活性顯著抑制B16黑素瘤生長。此外，IL-21連同IL-15擴展抗原特異性CD8⁺ T細胞數目及其效應功能，導致腫瘤消退。Leonard等人F1000Res . 2016年2月26日;5. pii: F1000 Faculty Rev-224。

在一些實施例中，細胞激素為IL-21。在一些實施例中，IL-21為野生型IL-21。在一些實施例中，IL-21衍生自人類IL-21。在一些實施例中，IL-21為人類野生型IL-21。在一些實施例中，IL-21為截短IL-21。

在一些實施例中，IL-21包含SEQ ID NO: 1、2、126、171或172之胺基酸序列，或與SEQ ID NO: 1、2、126、171或172包含至少約80% (諸如至少約80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%中之任一者)序列一致性之其變異體。

在一些實施例中，IL-21為截短IL-21。在一些實施例中，截短IL-21包含SEQ ID NO: 126、171或172之胺基酸序列。

在一些實施例中，IL-21變異體在C端處在L123與S133之間(且包括端點)缺少一或多個胺基酸。在一些實施例中，IL-21變異體在C端處在L123與S133之間(且包括端點)缺少任一胺基酸。在一些實施例中，IL-21變異體在C端處在L123與S133之間(且包括端點)缺少任何兩個胺基酸。在一些實施例中，IL-21變異體在C端處在L123與S133之間(且包括端點)缺少任何三個胺基酸。在一些實施例中，IL-21變異體在C端處在L123與S133之間(且包括端點)缺少任何四個胺基酸。在一些實施例中，IL-21變異體在C端處在L123與S133之間(且包括端點)缺少任何五個胺基酸。在一些實施例中，IL-21變異體在C端處在L123與S133之間(且包括端點)缺少任何六個胺基酸。在一些實施例中，IL-21變異體在C端處在L123與S133之間(且包括端點)缺少任何七個胺基酸。在一些實施例中，IL-21變異體在C端處在L123與S133之間(且包括端點)缺少任何八個胺基酸。在一些實施例中，IL-21變異體在C端處在L123與S133之間(且包括端點)缺少任何九個胺基酸。在一些實施例中，IL-21變異體在C端處在L123與S133之間(且包括端點)缺少任何十個胺基酸。在一些實施例中，IL-21變異體在C端處在L123與S133之間(且包括端點)缺少所有十一個胺基酸。

在一些實施例中，IL-21變異體在SEQ ID NO: 1之C端處缺少11個胺基酸。在一些實施例中，IL-21變異體在SEQ ID NO: 1之C端處缺少10個胺基酸。在一些實施例中，IL-21變異體在SEQ ID NO: 1之C端處缺少9個胺基酸。在一些實施例中，IL-21變異體在SEQ ID NO: 1之C端處缺少8個胺基酸。在一些實施例中，IL-21變異體在SEQ ID NO: 1之C端處缺少7個胺基酸。在一些實施例中，IL-21變異體在SEQ ID NO: 1之C端處缺少6個胺基酸。在一些實施例中，IL-21變異體在SEQ ID NO: 1之C端處缺少5個胺基酸。在一些實施例中，IL-21變異體在SEQ ID NO: 1之C端處缺少4個胺基酸。在一些實施例中，IL-21變異體在SEQ ID NO: 1之C端處缺少3個胺基酸。在一些實施例中，IL-21變異體在SEQ ID NO: 1之C端處缺少2個胺基酸。在一些實施例中，IL-21變異體在SEQ ID NO: 1之C端處缺少1個胺基酸。

在一些實施例中，IL-21變異體在SEQ ID NO: 1之C端處缺少14、13或12個胺基酸。

在一些實施例中，IL-21變異體在SEQ ID NO: 1之C端處缺少至少9-10、9-11、10-12或12-15個連續胺基酸。在一些實施例中，IL-21變異體在SEQ ID NO: 1之C端處缺少至少9-14、10-14、11-14或12-14個連續胺基酸。

在一些實施例中，本文提供之IL-21變異體具有SEQ ID NO: 2之胺基酸序列，其在C端處缺少10個胺基酸且表示SEQ ID NO: 1之Q1至L123之序列。 IL-7

IL-7為IL-2超家族之成員中之一者。IL-2超家族包括IL-2、IL-4、IL-7、IL-9、IL-15及IL-21。其結合至具有共同γ鏈次單位之受體。除共同γ鏈次單位以外，IL-7之受體(IL-7R)需要IL-7R α鏈以使結合進行。參見Lin等人,Anticancer Res . 2017年3月;37(3):963-967。

介白素-7 (IL-7)為小鼠及人類之T細胞發育所需且由基質組織而非活化淋巴細胞產生。在正常條件下，IL-7為用於T細胞之限制性資源，但其在淋巴細胞減少性條件期間積聚。IL-7經由雜二聚體受體傳信，該雜二聚體受體由IL-7受體α-鏈(IL-7Rα)及共同細胞激素受體γ-鏈(γc)組成。最近亦展示IL-7調節淋巴組織誘導(LTi)細胞，該等細胞誘導周圍淋巴樣器官發育且可在慢性發炎之情況下產後誘導三級淋巴組織。在動物中，IL-7療法增強授受性免疫療法針對癌症之有效性、增強疫苗反應且在急性及慢性感染之情況下增強病毒清除率。參見Mackall等人,Nature Reviews Immunology 第11卷, 第330-342頁 (2011)。

在一些實施例中，細胞激素為IL-7。在一些實施例中，IL-7為野生型IL-7。在一些實施例中，IL-7衍生自人類IL-7。在一些實施例中，IL-7為人類野生型IL-7。

在一些實施例中，IL-7包含SEQ ID NO: 96-98中之任一者之胺基酸序列或與SEQ ID NO: 96-98中之任一者包含至少80% (諸如至少約80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%中之任一者)序列一致性之其變異體。 IL-15、IL-15 Rα及結合至IL-15Rα之IL-15

IL-15之異三聚體受體與IL-2受體共用IL-2R/IL-15Rβ (CD122)及共同γ (γc)鏈(CD132)。IL-15及IL-2共用某些功能，包括刺激T細胞增殖、產生細胞毒性T淋巴細胞、刺激藉由B細胞之免疫球蛋白合成以及產生及續存NK細胞。然而，在許多應變性免疫反應中，IL-2及IL-15亦具有相異且通常競爭性的角色。不同於IL-2，維持可減弱抗腫瘤免疫反應之T調節細胞(Tregs)不需要IL-15。相比於IL-15，IL-2經由CD8+效應T細胞之活化誘導的細胞死亡(AICD)來抑制T細胞反應。然而，NK、效應CD8+及記憶表型CD8+ T細胞之分化需要IL-15。另外，基於臨床前研究，其毒性似乎不同，相比於IL-2，在IL-15之情況下觀測到極小血管毛細血管滲漏。總體而言，IL-15主要刺激CD8 T細胞及NK細胞之增殖及細胞毒性功能，從而導致增強之抗腫瘤反應。然而，儘管起初顯示作為癌症治療劑有前景，但IL-15之功效受其短活體內半衰期限制。Steel等人,Trends Pharmacol Sci . 2012年1月; 33(1): 35-41。參見Robinson等人,Immunol Lett . 2017年10月; 190: 159-168。

在一些情況下，IL-15作為治療劑之功效受IL-15Rα之可用性限制，IL-15Rα在穩定及增加IL-15之生物活性中起不可或缺的作用。由於未在活體內天然地發現未結合IL-15，結合至IL-15Rα之IL-15與IL-15之生理形式類似且相比於游離IL-15具有更高針對IL-15Rβ/γC的親和力。參見Robinson等人,Immunol Lett . 2017年10月; 190: 159-168。

在一些實施例中，細胞激素為或包含IL-15。在一些實施例中，IL-15為野生型IL-15。在一些實施例中，IL-15衍生自人類IL-15。在一些實施例中，IL-15為人類野生型IL-15。

在一些實施例中，細胞激素為或包含IL-15Rα。在一些實施例中，IL-15Rα為野生型IL-15Rα。在一些實施例中，IL-15Rα衍生自人類IL-15Rα。在一些實施例中，IL-15Rα為人類野生型IL-15Rα。在一些實施例中，IL-15Rα為可溶IL-15受體之壽司域(亦即IL-15R壽司域)。在一些實施例中，IL-15R壽司域包含或其組成為SEQ ID NO: 127-128中之任一者之胺基酸序列或與SEQ ID NO: 127-128中之任一者包含至少80% (諸如至少約80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%中之任一者)序列一致性之其變異體。

在一些實施例中，細胞激素為結合至IL-15Rα之IL-15或其片段。在一些實施例中，結合至IL-15Rα之IL-15或其片段包含野生型IL-15及/或野生型IL-15Rα。在一些實施例中，結合至IL-15Rα之IL-15或其片段包含衍生自人類IL-15之IL-15及/或衍生自人類IL-15Rα之IL-15Rα。在一些實施例中，結合至IL-15Rα之IL-15或其片段包含人類野生型IL-15及/或人類野生型IL-15Rα。在一些實施例中，結合至IL-15Rα之IL-15或其片段包含衍生自小鼠IL-15之IL-15及/或衍生自小鼠IL-15Rα之IL-15Rα。在一些實施例中，結合至IL-15Rα之IL-15或其片段包含小鼠野生型IL-15及/或小鼠野生型IL-15Rα。在一些實施例中，結合至IL-15Rα之IL-15或其片段為可溶IL-15受體之壽司域(亦即IL-15R壽司域)。在一些實施例中，IL-15R壽司域包含或其組成為SEQ ID NO: 127-128中之任一者之胺基酸序列或與SEQ ID NO: 127-128中之任一者包含至少80% (諸如至少約80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%中之任一者)序列一致性之其變異體。

在一些實施例中，IL-15非共價結合至IL-15Rα。在一些實施例中，IL-15融合至IL-15Rα。在一些實施例中，IL-15融合至IL-15Rα之N端。在一些實施例中，IL-15融合至IL-15Rα之C端。在一些實施例中，融合蛋白以選自由以下組成之群的次序自N端至C端包含該IL-15、IL-15Rα及白蛋白結合部分：(1)白蛋白結合部分、IL-15、IL-15Rα；(2)白蛋白結合部分、IL-15Rα、IL-15；(3) IL-15、IL-15Rα、白蛋白結合部分；(4) IL-15Rα、IL-15、白蛋白結合部分。在一些實施例中，IL-15及IL-15Rα係經由第二連接子融合。在一些實施例中，第二連接子為可裂解連接子。在一些實施例中，第二連接子選自由SEQ ID NO: 27-45組成之群。在一些實施例中，第二連接子具有SEQ ID NO: 27之序列。在一些實施例中，第二連接子為不可裂解連接子。在一些實施例中，第二連接子選自由SEQ ID NO: 12-26及158-159組成之群。

在一些實施例中，IL-15或結合至IL-15Rα之IL-15包含人類IL-15，其包含SEQ ID NO: 99、100或127中之任一者之胺基酸序列或與SEQ ID NO: 99、100或127中之任一者包含至少80% (諸如至少約80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%中之任一者)序列一致性之其變異體。

在一些實施例中，IL-15或結合至IL-15Rα之IL-15包含有包含N72D突變之人類IL-15。參見Han等人,Cytokine . 2011年12月; 56(3): 804-810。

在一些實施例中，IL-15或結合至IL-15Rα之IL-15包含人類IL-15Rα，其包含SEQ ID NO: 101-108中之任一者(諸如SEQ ID NO: 103-104)之胺基酸序列或與SEQ ID NO: 101-108中之任一者(諸如SEQ ID NO: 103-104)包含至少80% (諸如至少約80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%中之任一者)序列一致性之其變異體。 IL-33

介白素-33 (IL-33)為IL-1家族之成員。其最初描述為2型免疫反應之誘導劑，活化T輔助2 (T_H 2)細胞及肥大細胞。現在，累積的證據表明IL-33亦強力地刺激第2組先天性淋巴細胞(ILC2s)、調節T (T_reg )細胞、T_H 1細胞、CD8⁺ T細胞及自然殺手(NK)細胞。此多效性性質反映於IL-33在中樞神經系統之組織及代謝穩態、感染、發炎、癌症及疾病的作用中。

IL-33在基質及障壁組織中具有廣泛表現，此使其成為塑造1型、2型及調節免疫反應之普遍存在及至關重要的免疫調節物。儘管缺少分泌序列且在細胞核中螯合，IL-33經各種蛋白酶釋放且加工成高活性形式。IL-33促進細胞激素網路，其不僅控制病原體移除，且亦支持由第2組先天性淋巴細胞及調節T細胞介導之組織修復。預期IL-33之作用繼續擴展，調節保護性及病理性免疫反應兩者。遞送或阻斷IL-33正成為新興的用於維持免疫穩態及保護免於感染性及發炎性疾病之有前景的治療策略。參見Liew,Nature Reviews Immunology 第16卷, 第676-689頁 (2016)。

在一些實施例中，細胞激素為IL-33。在一些實施例中，IL-33為野生型IL-33。在一些實施例中，IL-33衍生自人類IL-33。在一些實施例中，IL-33為人類野生型IL-33。

在一些實施例中，IL-33包含SEQ ID NO: 109及155-157中之任一者之胺基酸序列或與SEQ ID NO: 109及155-157中之任一者包含至少80% (諸如至少約80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%中之任一者)序列一致性之其變異體。

在一些實施例中，IL-33包含一或多個選自C208S、C227S、C232S及C259S之突變。參見Cohen等人,Nature Communications 第6卷, 文章編號: 8327 (2015)。 IL-22

介白素-22 (IL-22)最近描述的IL-10家族細胞激素，其由T-輔助(Th)-17細胞、γδ T細胞、NKT細胞及新近描述的先天性淋巴細胞(ILC)產生。人類IL22 基因位於染色體12q15處，在編碼IFN-γ及IL-26之基因附近。細胞激素之活性、分泌形式為146個胺基酸之蛋白質。

連同IL-10、IL-19、IL-20、IL-24、IL-26、IL-28及IL-29之受體，IL-22受體 (IL-22R)為2型細胞激素受體及IL-10受體家族之成員。其由兩個雜二聚體次單位IL-22R1及IL-10R2構成。研究表明IL-22與IL-22R1次單位之初始結合使得IL-10R2次單位能夠二次結合，由此實現下游信號傳導。

IL-22具有多種功能，最值得注意的是其對非造血細胞，尤其上皮細胞的營養作用。取決於背景及/或細胞激素環境，IL-22涉及若干器官中之上皮細胞再生及病理學。其涉及多種疾病使其成為臨床研發之有吸引力的目標。參見Dudakov等人,Annu Rev Immunol . 2015年3月21日; 33: 747-785。

在一些實施例中，細胞激素為IL-22。在一些實施例中，IL-22為野生型IL-22。在一些實施例中，IL-22衍生自人類IL-22。在一些實施例中，IL-22為人類野生型IL-22。

在一些實施例中，IL-22包含SEQ ID NO:110-111中之任一者之胺基酸序列，或與SEQ ID NO: 110-111中之任一者包含至少約80% (諸如至少約80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%中之任一者)序列一致性之其變異體。細胞激素變異體

在一些實施例中，細胞激素變異體可在本文提供之融合蛋白中。變異可為與人類野生型細胞激素蛋白相比，導致胺基酸序列改變的編碼細胞激素多肽之一或多個密碼子之取代、缺失或插入。胺基酸取代可為一個胺基酸經具有類似結構及/或化學特性之另一胺基酸置換的結果，諸如白胺酸經絲胺酸置換，例如保守胺基酸置換。熟習此項技術者已知的標準技術可用於將突變引入編碼本文提供之分子的核苷酸序列中，包括例如引起胺基酸取代的定點突變誘發及PCR介導突變誘發。插入或缺失視情況可在約1至10個胺基酸範圍內。在某些實施例中，相對於原始分子，取代、缺失或插入包括少於25個胺基酸取代、少於20個胺基酸取代、少於15個胺基酸取代、少於10個胺基酸取代、少於5個胺基酸取代、少於4個胺基酸取代、少於3個胺基酸取代，或少於2個胺基酸取代。在一些實施例中，取代為在一或多個所預測之非必需胺基酸殘基處產生的保守胺基酸取代。允許的變異可藉由在序列中系統地產生胺基酸插入、缺失或取代且測試所得變異體之全長或成熟原生序列所展現的活性來確定。

胺基酸序列插入包括長度在一個殘基或多個殘基範圍內之胺基及/或羧基末端融合，以及單個或多個胺基酸殘基之序列內插入。

「保守胺基酸取代」為胺基酸殘基經具有含有類似電荷之側鏈之胺基酸殘基置換的取代。具有含有類似電荷之側鏈的胺基酸殘基家族已在此項技術中定義。此等家族包括具有鹼性側鏈(例如離胺酸、精胺酸、組胺酸)、酸性側鏈(例如天冬胺酸、麩胺酸)、不帶電極性側鏈(例如甘胺酸、天冬醯胺、麩醯胺酸、絲胺酸、蘇胺酸、酪胺酸、半胱胺酸)、非極性側鏈(例如丙胺酸、纈胺酸、白胺酸、異白胺酸、脯胺酸、苯丙胺酸、甲硫胺酸、色胺酸)、β分支鏈側鏈(例如蘇胺酸、纈胺酸、異白胺酸)及芳族側鏈(例如酪胺酸、苯丙胺酸、色胺酸、組胺酸)之胺基酸。或者，可沿全部或部分編碼序列，諸如藉由飽和突變誘發隨機引入突變，且可針對生物活性(例如結合至細胞激素受體)篩選所得突變體以識別保留活性之突變體。突變誘發之後，可表現所編碼蛋白質且可測定蛋白質活性。

可進行保守(例如在具有類似特性及/或側鏈之胺基酸組內)取代，以維持或不顯著改變細胞激素之特性。胺基酸可根據其側鏈特性之類似性分組(參見例如Lehninger, Biochemistry 73-75 (第2版 1975))：(1)非極性：Ala (A)、Val (V)、Leu (L)、Ile (I)、Pro (P)、Phe (F)、Trp (W)、Met (M)；(2)不帶電極性：Gly (G)、Ser (S)、Thr (T)、Cys (C)、Tyr (Y)、Asn (N)、Gln (Q)；(3)酸性：Asp (D)、Glu (E)；及(4)鹼性：Lys (K)、Arg (R)、His (H)。

或者，天然存在之殘基可基於共同的側鏈特性來分組：(1)疏水性：正白胺酸、Met、Ala、Val、Leu、Ile；(2)中性親水性：Cys、Ser、Thr、Asn、Gln；(3)酸性：Asp、Glu；(4)鹼性：His、Lys、Arg；(5)影響鏈取向的殘基：Gly、Pro；及(6)芳族：Trp、Tyr、Phe。

可使用此項技術中已知之方法產生變異，諸如寡核苷酸介導(定點)突變誘發、丙胺酸掃描及PCR突變誘發。可對選殖DNA進行定點突變誘發(參見例如Carter, 1986, Biochem J. 237:1-7；及Zoller等人, 1982, Nucl. Acids Res. 10:6487-500)、卡匣突變誘發(參見例如Wells等人, 1985, Gene 34:315-23)或其他已知技術以產生多肽。 D. 白蛋白結合部分

本文所述之融合蛋白包含白蛋白結合分子。白蛋白結合分子及其連接至所關注之蛋白質之方法描述於例如WO 1991/01743、WO 2001/45746、WO 2002/076489、WO 2004/041865或US20070269422A1中，其內容以引用的方式併入本文中。

白蛋白結合分子可為描述於例如WO1991/01743；WO2001/45746；WO2002/076489；WO2004/041865；US20070269422A1；US20160152686A1；Dennis等人 (2002), JBC 277(38): 35035-35043中之白蛋白結合分子中之任一者。

在一些實施例中，白蛋白結合分子結合至人類血清白蛋白(HSA)、食蟹獼猴血清白蛋白(CMSA)及/或小鼠血清白蛋白(MSA)。

在一些實施例中，白蛋白結合部分以約1-1000 nM之間(諸如約1-900 nM、1-800 nM、1-700 nM、1-600 nM、1-500 nM、1-400 nM、1-300 nM、1-200 nM、1-100 nM、1-50 nM、1-25 nM、0.1-1 nM之間的K_D 結合至白蛋白(諸如HAS)。在一些實施例中，白蛋白結合蛋白包含鏈球菌蛋白G (SPG)之白蛋白結合域(ABD)。參見例如Nygren等人 J. Mol. Recogn. (1988) 1(2): 69-74。 1 白蛋白結合域(ABD)

在一些實施例中，白蛋白結合部分包含白蛋白結合域(ABD)。在一些實施例中，白蛋白結合分子包含SPG菌株G148之ABD。在一些實施例中，白蛋白結合分子包含SPG菌株G148之C端白蛋白結合域3 (ABD3)。參見例如Nilvebrant及Hober (2013), Comput. Struct. Biotechol. J., 6: e201303009。

在一些特定實施例中，ABD具有胺基酸序列LAEAKVLANRELDKYGVSDYYKNLINNAKTVEGVKALIDEILAALP (SEQ ID NO: 3)，其與HSA之K_D 為約1.2 nM。

在一些實施例中，相比於SEQ ID NO: 3之ABD，對HSA具有相對較低親和力之ABD為較佳的。因此，對HSA具有較低親和力之SEQ ID NO: 3之變異體包括於本發明中。

在一些特定實施例中，ABD具有SEQ ID NO: 4-11中之任一者之胺基酸序列。

變異可為導致胺基酸序列改變的編碼SEQ ID NO: 3-11中之任一者之ABD多肽之一或多個密碼子之取代、缺失或插入。胺基酸取代可為經具有類似或不同結構及/或化學特性之另一胺基酸置換一個胺基酸的結果。熟習此項技術者已知的標準技術可用於將突變引入編碼本文提供之分子的核苷酸序列中，包括例如引起胺基酸取代的定點突變誘發及PCR介導突變誘發。

允許的變異可藉由在序列中系統地產生胺基酸插入、缺失或取代且測試所得變異體之活性來確定，且在一些實施例中，選擇對HSA具有較低親和力之變異體。某些此類變異體例示於表3中。 2 抗白蛋白抗體或其片段

根據本發明，白蛋白結合部分亦可為抗白蛋白抗體或其抗原結合片段。在一些實施例中，抗白蛋白抗體或其抗原結合片段為抗HSA抗體或其抗原結合片段。

HSA之一些同功異型物列於下表2中(參見例如UniProtKB-P02768 (ALBU_HUMAN))。在一些實施例中，抗白蛋白抗體或其抗原結合片段結合至SEQ ID NO: 52-55中之任一者。表 2

抗白蛋白抗體或其片段可來自任何動物來源，包括鳥類及哺乳動物(例如人類、鼠類、驢、綿羊、兔、山羊、天竺鼠、駱駝、馬或雞)。在某些實施例中，抗體為人類或人類化單株抗體。如本文所用，「人類」抗體包括具有人類免疫球蛋白之胺基酸序列的抗體且包括自人類免疫球蛋白文庫或自表現來自人類基因之抗體之小鼠中分離的抗體。

在某些實施例中，抗白蛋白抗體為全人類抗體，諸如免疫特異性結合癌症抗原之全人類抗體。此類全人類抗體將優於全小鼠(或其他完全或部分非人類物種抗體)、人類化抗體或嵌合抗體以使非所需或不需要的副作用，諸如當向個體投與時針對非全人類抗體之免疫反應的產生降至最低。

本文所提供之抗白蛋白抗體可為單特異性、雙特異性、三特異性或更大多特異性的。多特異性抗體可特異性針對多肽之不同抗原決定基或可特異性針對多肽以及異源抗原決定基，諸如異源多肽或固體載體物質。在一些實施例中，本文所提供之抗體對於多肽之指定抗原決定基具有單特異性且不會免疫特異性結合至其他抗原決定基。

本文所提供之抗白蛋白抗體可為單株抗體或衍生自單株抗體。抗白蛋白抗體可為但不限於合成抗體、單株抗體、以重組方式產生之抗體、多特異性抗體(包括雙特異性抗體)、人類抗體、人類化抗體、嵌合抗體、胞內抗體、單鏈Fv (scFv)(例如包括單特異性、雙特異性等)、駱駝化抗體或其人類化型式、Fab片段、F(ab')片段、二硫鍵連接的Fv (sdFv)、抗個體基因型(抗Id)抗體及以上中之任一者之抗原決定基結合片段。

特定言之，本文所提供之抗白蛋白抗體包括免疫球蛋白分子及免疫球蛋白分子之免疫活性部分，亦即，含有免疫特異性結合至白蛋白(諸如HSA)之抗原結合位點的分子。本文所提供之免疫球蛋白分子可為免疫球蛋白分子之任何類型(例如IgG、IgE、IgM、IgD、IgA及IgY)、類別(例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1及IgA2)或子類。在一些實施例中，抗白蛋白抗體為IgG抗體，諸如IgG1抗體。

包括保留特異性結合至白蛋白之抗原決定基之能力之抗體片段的抗白蛋白抗體變異體及衍生物亦包括於本發明中。例示性片段包括Fab片段(含有抗原結合域且包含藉由雙硫鍵橋連之輕鏈及部分重鏈的抗體片段)；Fab' (含有單一抗結合域之抗體片段，該單一抗結合域包含Fab及貫穿鉸鏈區之重鏈的額外部分)；F(ab')₂ (在重鏈之鉸鏈區中藉由鏈間二硫鍵接合之兩個Fab'分子；Fab'分子可針對相同或不同抗原決定基)；雙特異性Fab (具有兩個抗原結合域之Fab分子，該等抗原結合域各自可針對不同抗原決定基)；包含可變區之單鏈Fab鏈，亦稱為sFv (藉由10-25個胺基酸之鏈連接在一起的抗體之單一輕鏈及重鏈之可變、抗原結合決定區)；二硫鍵連接的Fv或dsFv (藉由雙硫鍵連接在一起的抗體之單一輕鏈及重鏈之可變、抗原結合決定區)；駱駝化VH (抗體之單一重鏈的可變、抗原結合決定區，其中VH界面處之一些胺基酸為發現於天然存在之駱駝抗體之重鏈中之彼等)；雙特異性sFv (具有兩個抗原結合域之sFv或dsFv分子，該等抗原結合域各自可針對不同抗原決定基)；雙功能抗體(當第一sFv之VH域與第二sFv之VL域組裝且第一sFv在VL域與第二sFv之VH域組裝時形成之二聚sFv；雙功能抗體之兩個抗原結合區可針對相同或不同抗原決定基)；及三功能抗體(三聚sFv，其以與雙功能抗體類似之方式形成，但其中在單一複合物中產生三個抗原結合域；三個抗原結合域可針對相同或不同抗原決定基)。抗體之衍生物亦包括抗體組合位點之一或多個CDR序列。當存在兩個或更多個CDR序列時，CDR序列可在骨架上連接在一起。在某些實施例中，本文所提供之抗HSA抗體包含單鏈Fv (「scFv」)。scFv為包含抗體之VH及VL域的抗體片段，其中此等域存在於單一多肽鏈中。一般而言，scFv多肽進一步在VH與VL域之間包含多肽連接子，其使得scFv能夠形成用於抗原結合之所要結構。關於scFv之綜述，參見Pluckthun,T he P harmacology of Monoclonal Antibodies , 第113卷, Rosenburg及Moore編 Springer-Verlag, New York, 第269-315頁 (1994)。

在某些情形中，使用抗白蛋白抗體片段有優勢，而全抗體則無。較小尺寸之片段允許快速清除，且可引起改良之細胞、組織或器官之進入。關於某些抗體片段之綜述，參見Hudson等人, 2003, Nature Med. 9:129-34。

已開發出用於產生抗體片段的各種技術。傳統地，此等片段係經由完整抗體之蛋白水解消化而得到(參見例如Morimoto等人, 1992, J. Biochem. Biophys. Methods 24:107-17；及Brennan等人, 1985, Science 229:81-83)。然而，此等片段現可藉由重組型宿主細胞直接產生。Fab、Fv及scFv抗體片段均可表現於大腸桿菌或酵母細胞中及由其分泌，從而允許便捷地產生大量的此等片段。抗體片段可自上文所論述之抗體噬菌體文庫分離。或者，Fab'-SH片段可自大腸桿菌直接回收且化學偶合以形成F(ab')₂ 片段(Carter等人, 1992, Bio/Technology 10:163-67)。根據另一方法，F(ab')₂ 片段可自重組宿主細胞培養物直接分離。具有增加之活體內半衰期、包含救助受體結合抗原決定基殘基之Fab及F(ab')₂ 片段描述於例如美國專利第5,869,046號中。用於產生抗體片段之其他技術將為熟習此項技術者顯而易見。在某些實施例中，抗體為單鏈Fv片段(scFv)(參見例如WO 93/16185；美國專利第5,571,894號及第5,587,458號)。Fv及scFv具有不含恆定區之完整組合位點；因此，其可適用於活體內使用期間降低之非特異性結合。可構築scFv融合蛋白，以在scFv之胺基或羧基末端產生效應蛋白之融合物(參見例如Borrebaeck編, 前述)。抗體片段亦可為「線抗體」，例如如上文所引用之參考文獻中所述。此類線抗體可為單特異性或多特異性的，諸如雙特異性的。單域抗體 ( sdAb )

在一些實施例中，抗體片段為單域抗體(sdAb)。

在一些實施例中，sdAb為V_H H單域抗體。

在一些實施例中，sdAb以約1-1000 nM之間(諸如約1-900 nM、1-800 nM、1-700 nM、1-600 nM、1-500 nM、1-400 nM、1-300 nM、1-200 nM、1-100 nM、1-50 nM、1-25 nM或0.1-1 nM之間)的K_D 結合至白蛋白(諸如HSA)。在其他實施例中，sdAb以約10-800 nM之間(諸如約20-500 nM、50-300 nM或100-200 nM之間)的K_D 結合至白蛋白(諸如HSA)。

在一些實施例中，sdAb在約5.5 之pH下及/或在約7.5 之pH下以約1-1000 nM之間(諸如約1-900 nM、1-800 nM、1-700 nM、1-600 nM、1-500 nM、1-400 nM、1-300 nM、1-200 nM、1-100 nM、1-50 nM、1-25 nM或0.1-1 nM之間)的K_D 結合至白蛋白(諸如HSA)。在一些實施例中，sdAb在約5.5 之pH下及在約7.5 之pH下以約1-200 nM之間的K_D 結合至白蛋白(諸如HSA)。

在一些實施例中，單域抗體或其片段包含CDR1，該CDR1包含SEQ ID NO: 69、72、75、78、81、84、87、90及93中之任一者之胺基酸序列，或包含至多約3個胺基酸取代之其變異體；CDR2，該CDR2包含SEQ ID NO: 70、73、76、79、82、85、88、91及94中之任一者之胺基酸序列，或包含至多約3個胺基酸取代之其變異體；及CDR3，該CDR3包含SEQ ID NO: 71、74、77、80、83、86、89、92及95中之任一者之胺基酸序列，或包含至多約3個胺基酸取代之其變異體。

在一些實施例中，單域抗體或其片段包含以下中之任一者：(1) CDR1，該CDR1包含SEQ ID NO: 69之胺基酸序列，或包含至多約3個胺基酸取代之其變異體；CDR2，該CDR2包含SEQ ID NO: 70之胺基酸序列，或包含至多約3個胺基酸取代之其變異體；及CDR3，該CDR3包含SEQ ID NO: 71之胺基酸序列，或包含至多約3個胺基酸取代之其變異體；(2) CDR1，該CDR1包含SEQ ID NO: 72之胺基酸序列，或包含至多約3個胺基酸取代之其變異體；CDR2，該CDR2包含SEQ ID NO: 73之胺基酸序列，或包含至多約3個胺基酸取代之其變異體；及CDR3，該CDR3包含SEQ ID NO: 74之胺基酸序列，或包含至多約3個胺基酸取代之其變異體；(3) CDR1，該CDR1包含SEQ ID NO: 75之胺基酸序列，或包含至多約3個胺基酸取代之其變異體；CDR2，該CDR2包含SEQ ID NO: 76之胺基酸序列，或包含至多約3個胺基酸取代之其變異體；及CDR3，該CDR3包含SEQ ID NO: 77之胺基酸序列，或包含至多約3個胺基酸取代之其變異體；(4) CDR1，該CDR1包含SEQ ID NO: 78之胺基酸序列，或包含至多約3個胺基酸取代之其變異體；CDR2，該CDR2包含SEQ ID NO: 79之胺基酸序列，或包含至多約3個胺基酸取代之其變異體；及CDR3，該CDR3包含SEQ ID NO: 80之胺基酸序列，或包含至多約3個胺基酸取代之其變異體；(5) CDR1，該CDR1包含SEQ ID NO: 81之胺基酸序列，或包含至多約3個胺基酸取代之其變異體；CDR2，該CDR2包含SEQ ID NO: 82之胺基酸序列，或包含至多約3個胺基酸取代之其變異體；及CDR3，該CDR3包含SEQ ID NO: 83之胺基酸序列，或包含至多約3個胺基酸取代之其變異體；(6) CDR1，該CDR1包含SEQ ID NO: 84之胺基酸序列，或包含至多約3個胺基酸取代之其變異體；CDR2，該CDR2包含SEQ ID NO: 85之胺基酸序列，或包含至多約3個胺基酸取代之其變異體；及CDR3，該CDR3包含SEQ ID NO: 86之胺基酸序列，或包含至多約3個胺基酸取代之其變異體；(7) CDR1，該CDR1包含SEQ ID NO: 87之胺基酸序列，或包含至多約3個胺基酸取代之其變異體；CDR2，該CDR2包含SEQ ID NO: 88之胺基酸序列，或包含至多約3個胺基酸取代之其變異體；及CDR3，該CDR3包含SEQ ID NO: 89之胺基酸序列，或包含至多約3個胺基酸取代之其變異體；(8) CDR1，該CDR1包含SEQ ID NO: 90之胺基酸序列，或包含至多約3個胺基酸取代之其變異體；CDR2，該CDR2包含SEQ ID NO: 91之胺基酸序列，或包含至多約3個胺基酸取代之其變異體；及CDR3，該CDR3包含SEQ ID NO: 92之胺基酸序列，或包含至多約3個胺基酸取代之其變異體；或(9) CDR1，該CDR1包含SEQ ID NO: 93之胺基酸序列，或包含至多約3個胺基酸取代之其變異體；CDR2，該CDR2包含SEQ ID NO: 94之胺基酸序列，或包含至多約3個胺基酸取代之其變異體；及CDR3，該CDR3包含SEQ ID NO: 95之胺基酸序列，或包含至多約3個胺基酸取代之其變異體。

在一些實施例中，單域抗體或其片段包含選自由SEQ ID NO: 60-68及168-170組成之群的胺基酸序列。在一些實施例中，單域抗體或其片段包含與選自由SEQ ID NO: 60-68及168-170組成之群的胺基酸序列具有約或至少約80% (諸如至少約80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%中之任一者)序列一致性之胺基酸序列。在一些實施例中，單域抗體或其片段包含V_H H域，該V_H H域包含SEQ ID NO: 60-68及168-170中之任一者之胺基酸序列，或與SEQ ID NO: 60-68及168-170中之任一者具有至少約80% (諸如至少約80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%中之任一者)序列一致性之其變異體。

在一些實施例中，結合至白蛋白之單域抗體或其片段包含CDR1、CDR2、CDR3，其分別在具有SEQ ID NO: 60-68及168-170中之任一者中所闡述之序列的重鏈可變域內包含CDR1、CDR2及CDR3之胺基酸序列。 E. 抗原結合部分

在一些實施例中，融合蛋白進一步包含抗原結合部分，且其中抗原結合部分融合至融合至白蛋白結合部分之細胞激素(「細胞激素-ALBBM」)的N端或C端。

在一些實施例中，抗原結合部分結合至腫瘤抗原。在一些實施例中，腫瘤為實體或液體腫瘤。在一些實施例中，腫瘤為選自由以下組成之群的癌症：間皮瘤、肺癌、乳癌、卵巢癌、胰臟癌、淋巴瘤、白血病、頭頸癌、肝癌、食道癌、胃癌及結腸直腸癌。在一些實施例中，癌症表現高水準之腫瘤抗原。舉例而言，在一些實施例中，癌症表現參考組織之水準之至少2倍、5倍、10倍、20倍、30倍、40倍或50倍的水準。在一些實施例中，參考組織為相同個體中不包含癌細胞之組織。

在一些實施例中，腫瘤抗原選自由以下組成之群：間皮素(「MSLN」)、GPA33、Her-2、EGFR及CD20。在一些實施例中，腫瘤抗原選自由以下組成之群：CEA、MUC16、MUC1、AFP、EPCAM、CD19、CD21、CD22、CD30、CD33、CD37、CD45、PSMA及BCMA。

在一些實施例中，抗原結合部分為抗體(諸如全長抗體)或其抗原結合片段。在一些實施例中，本文提供之抗體或其抗原結合片段可免疫特異性結合至多肽、多肽片段或癌細胞上表現之抗原的抗原決定基。在一個實施例中，抗體結合至人類癌症抗原。在一些實施例中，本文提供之抗體或其抗原結合片段結合至癌症抗原之細胞外域(ECD)。在某些實施例中，抗體結合至癌症抗原之ECD中之抗原決定基。在一些實施例中，癌症抗原表現於實體或液體腫瘤癌細胞上。

結合至本文提供之癌症抗原之抗體可為但不限於合成抗體、單株抗體、以重組方式產生之抗體、多特異性抗體(包括雙特異性抗體)、人類抗體、人類化抗體、嵌合抗體、胞內抗體、單鏈Fv (scFv)(例如包括單特異性、雙特異性等)、駱駝化抗體或其人類化變異體、Fab片段、F(ab')片段、二硫鍵連接的Fv (sdFv)、抗個體基因型(抗Id)抗體及以上中之任一者之抗原決定基結合片段。

在一些實施例中，本文所提供之抗體包括免疫球蛋白分子及免疫球蛋白分子之免疫活性部分，亦即，含有免疫特異性結合至癌症抗原(例如實體或液體腫瘤癌症抗原)之抗原結合位點的分子。本文所提供之免疫球蛋白分子可為免疫球蛋白分子之任何類型(例如IgG、IgE、IgM、IgD、IgA及IgY)、類別(例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1及IgA2)或子類。在一特定實施例中，本文所提供之抗體為IgG抗體，諸如IgG1抗體。

包括保留特異性結合至癌症抗原之抗原決定基之能力之抗體片段的抗體變異體及衍生物亦包括於本發明中。例示性片段包括Fab片段；Fab'；F(ab')₂ ；雙特異性Fab；包含可變區的單鏈Fab鏈，亦稱為sFv；二硫鍵連接的Fv，或dsFv；駱駝化VH；雙特異性sFv；雙功能抗體；及三功能抗體。抗體之衍生物亦包括抗體組合位點之一或多個CDR序列。當存在兩個或更多個CDR序列時，CDR序列可在骨架上連接在一起。在某些實施例中，本文所提供之抗體包含單鏈Fv (「scFv」)。已開發用於產生抗體片段之各種技術，如在以上部分中所簡述。

在一些實施例中，抗原結合部分為結合至腫瘤抗原之單一可變域抗體(sdAb)(諸如V_H H抗體)。某些類型的生物體(駱駝科及軟骨魚)具有固定於Fc等效域結構上之高親和力單一V樣域作為其免疫系統的一部分。(Woolven等人, 1999, Immunogenetics 50: 98-101；及Streltsov等人, 2004, Proc Natl Acad Sci USA. 101:12444-49)。V類域(駱駝中稱為V_H H且鯊魚中稱為V-NAR)通常呈現長表面環，其允許穿透目標抗原之空腔。其亦藉由遮罩疏水性表面貼片使經分離之VH域穩定。抗間皮素單域抗體(抗MSLN dsAb)

在一些實施例中，抗原結合部分為抗間皮素單域抗體(「抗MSLN dsAb」)。

本文提供之抗MSLN抗體(例如sdAb)可結合至間皮素之同功異型物中之任一者或其任何片段(諸如SEQ ID NO 56-59中之任一者)。在一些實施例中，本文所提供之抗MSLN抗體結合至SEQ ID NO: 56-59中之任一者或其片段。

在一些實施例中，抗MSLN dsAb包含抗間皮素重鏈可變區(抗MSLN V_H )，其中：a)該抗MSLN V_H 包含有包含SEQ ID NO: 46之胺基酸序列之CDR1、包含SEQ ID NO: 47之胺基酸序列的CDR2及包含SEQ ID NO: 48之胺基酸序列之CDR3，或在CDR中包含至多總共5、4、3、2或1個胺基酸取代之其變異體；或b)該抗MSLN V_H 包含有包含SEQ ID NO: 49之胺基酸序列之CDR1、包含SEQ ID NO: 50之胺基酸序列的CDR2及包含SEQ ID NO: 51之胺基酸序列之CDR3，或在CDR中包含至多總共5、4、3、2或1個胺基酸取代之其變異體。

在一些實施例中，抗MSLN dsAb包含抗間皮素重鏈可變區(抗MSLN V_H )，其中：a)該抗MSLN V_H 包含CDR1，該CDR1包含SEQ ID NO: 46之胺基酸序列或在CDR1中包含至多3、2或1個取代之其變異體，CDR2，該CDR2包含SEQ ID NO: 47之胺基酸序列或在CDR2中包含至多3、2或1個取代之其變異體，及CDR3，該CDR3包含SEQ ID NO: 48之胺基酸序列或在CDR3中包含至多3、2或1個取代之其變異體；或b)該抗MSLN V_H 包含CDR1，該CDR1包含SEQ ID NO: 49之胺基酸序列或在CDR1中包含至多3、2或1個取代之其變異體，CDR2，該CDR2包含SEQ ID NO: 50之胺基酸序列或在CDR2中包含至多3、2或1個取代之其變異體，及CDR3，該CDR3包含SEQ ID NO: 51之胺基酸序列或在CDR3中包含至多3、2或1個取代之其變異體。在一些實施例中，抗MSLN dsAb包含抗間皮素重鏈可變區(抗MSLN V_H )，其中：a)該抗MSLN V_H 包含CDR1，該CDR1包含SEQ ID NO: 187之胺基酸序列或在CDR1中包含至多3、2或1個取代之其變異體，CDR2，該CDR2包含SEQ ID NO: 188之胺基酸序列或在CDR2中包含至多3、2或1個取代之其變異體，及CDR3，該CDR3包含SEQ ID NO: 189之胺基酸序列或在CDR3中包含至多3、2或1個取代之其變異體。在一些實施例中，抗MSLN dsAb包含抗間皮素重鏈可變區(抗MSLN V_H )，其中：a)該抗MSLN V_H 包含CDR1，該CDR1包含SEQ ID NO: 190之胺基酸序列或在CDR1中包含至多3、2或1個取代之其變異體，CDR2，該CDR2包含SEQ ID NO: 191之胺基酸序列或在CDR2中包含至多3、2或1個取代之其變異體，及CDR3，該CDR3包含SEQ ID NO: 192之胺基酸序列或在CDR3中包含至多3、2或1個取代之其變異體。在一些實施例中，抗MSLN dsAb包含抗間皮素重鏈可變區(抗MSLN V_H )，其中：a)該抗MSLN V_H 包含CDR1，該CDR1包含SEQ ID NO: 193之胺基酸序列或在CDR1中包含至多3、2或1個取代之其變異體，CDR2，該CDR2包含SEQ ID NO: 194之胺基酸序列或在CDR2中包含至多3、2或1個取代之其變異體，及CDR3，該CDR3包含SEQ ID NO: 195之胺基酸序列或在CDR3中包含至多3、2或1個取代之其變異體。

在一些實施例中，抗MSLN sdAb包含CDR1、CDR2、CDR3，其分別在具有SEQ ID NO: 173-186中之任一者中所闡述之序列的重鏈可變域內包含CDR1、CDR2及CDR3之胺基酸序列。 F. 融合蛋白變異體

在一些實施例中，涵蓋本文提供之融合蛋白之胺基酸序列變異體。舉例而言，可能需要改良融合蛋白之整體或任何組分中融合蛋白之結合親和力及/或其他生物特性。融合蛋白之胺基酸序列變異體可藉由將適當修飾引入至編碼融合蛋白之核酸序列中，或藉由肽合成來製備。此類修飾包括例如融合蛋白之胺基酸序列內之殘基的缺失，及/或插入及/或取代。可產生缺失、插入及取代之任何組合以獲得最終構築體，其限制條件為該最終構築體具有所需特徵。 1 取代、插入、缺失及變異體

在一些實施例中，提供具有一或多個胺基酸取代之融合蛋白變異體。用於取代型突變誘發之所關注之位點包括白蛋白結合分子及/或抗原結合部分之HVR及FR。保守取代顯示於表3中。更實質性變化提供於標題「例示性取代」下，且如參考胺基酸側鏈類別在下文進一步描述。胺基酸取代可引入至篩選所需活性，例如保留/改良之抗原結合、降低之免疫原性或改良之ADCC或CDC之融合蛋白及產物的組分中。亦參見章節「V.製備方法」下之子章節「1.胺基酸序列變異體」。表 3 . 胺基酸取代

胺基酸可根據共有側鏈特性進行分組： (1)疏水性：正白胺酸、Met、Ala、Val、Leu、Ile； (2)中性親水性：Cys、Ser、Thr、Asn、Gln； (3)酸性：Asp、Glu； (4)鹼性：His、Lys、Arg； (5)影響鏈定向之殘基：Gly、Pro； (6)芳族：Trp、Tyr、Phe。

非保守取代將必然伴有將此等類別中之一者之成員換成另一類別。

一種類型之取代型變異體涉及取代親本抗體(例如人類化或人類抗體)之一或多個高變區殘基。一般而言，選用於進一步研究之所得變異體相對於親本抗體將在某些生物特性方面具有修飾(例如改善)(例如親和力提高、免疫原性降低)及/或將實質上保留親本抗體之某些生物特性。例示性取代型變異體係親和力成熟抗體，其可例如宜使用基於噬菌體呈現之親和力成熟技術(諸如本文所述之技術)產生。簡言之，使一或多個HVR殘基突變，且在噬菌體上呈現變異型抗體且針對特定生物活性(例如結合親和力)進行篩選。

改變(例如取代)可在HVR中進行以例如改良抗體親和力。此類改變可於HVR「熱點」(亦即在體細胞成熟過程中經歷高頻率突變之由密碼子編碼之殘基)(參見例如Chowdhury,Methods Mol . Biol . 207:179-196 (2008))及/或SDR (a-CDR)中進行，其中對所得變異體VH或VL測試結合親和力。藉由構築二級文庫及自二級文庫再選擇來達成親和力成熟已描述於Hoogenboom等人之Methods in Molecular Biology 178:1-37 (O'Brien等人編, Human Press, Totowa, NJ, (2001))中。在親和力成熟之一些實施例中，藉由多種方法(例如易錯PCR、鏈改組或寡核苷酸定向突變誘發)中之任一者將多樣性引入為了成熟所選之可變基因中。隨後產生二級文庫。隨後篩選該文庫以鑑別具有所需親和力之任何抗體變異體。引入多樣性之另一方法涉及HVR引導途徑，其中將若干HVR殘基(例如一次4-6個殘基)隨機分組。可特異性地鑑別抗原結合所涉及之HVR殘基，例如使用丙胺酸掃描突變誘發或建立模型。尤其通常靶向CDR-H3及CDR-L3。

在一些實施例中，取代、插入或缺失可發生在一或多個HVR內，只要此等改變不實質上降低抗體結合抗原之能力即可。舉例而言，基本上不降低結合親和力之保守性改變(例如，如本文所提供之保守取代)可在HVR中進行。此類改變可在HVR「熱點」或CDR外部。

一種適用於鑑別突變誘發可靶向之抗體殘基或區域的方法稱為「丙胺酸掃描突變誘發」，如由Cunningham及Wells (1989) Science, 244:1081-1085所描述。在此方法中，殘基或目標殘基組(例如帶電殘基，諸如Arg、Asp、His、Lys及Glu)經鑑別且經中性或帶負電胺基酸(例如丙胺酸或聚丙胺酸)置換以確定抗體與抗原之相互作用是否受影響。可在對初始取代展現功能敏感性之胺基酸位置處引入其他取代。或者或另外，利用抗原-抗體複合物之晶體結構來鑑別抗體與抗原之間的接觸點。此類接觸殘基及鄰近殘基可作為取代候選物之標靶或排除在取代候選物之外。可篩選變異體以確定其是否含有所需特性。

胺基酸序列插入包括長度在一個殘基至含有一百個或多於一百個殘基之多肽範圍內的胺基端及/或羧基端融合，以及單個或多個胺基酸殘基之序列內插入。末端插入之實例包括具有N末端甲硫胺醯基殘基之抗體。抗體分子之其他插入變異體包括抗體之N端或C端與酶(例如對於ADEPT而言)或延長抗體之血清半衰期之多肽的融合物。 2 衍生物

在一些實施例中，本文提供之融合蛋白可經進一步修飾以含有此項技術中已知且可易於獲得之額外非蛋白質部分。適用於融合蛋白之衍生作用之部分包括但不限於水溶性聚合物。水溶性聚合物之非限制性實例包括但不限於聚乙二醇(PEG)、乙二醇/丙二醇共聚物、羧甲基纖維素、聚葡萄糖、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯啶酮、聚-1,3-二氧雜環戊烷、聚-1,3,6-三噁烷、乙烯/順丁烯二酸酐共聚物、聚胺基酸(均聚物或無規共聚物)及聚葡萄糖或聚(n-乙烯吡咯啶酮)聚乙二醇、丙二醇均聚物、聚氧化丙烯/氧化乙烯共聚物、聚氧乙烯多元醇(例如甘油)、聚乙烯醇及其混合物。聚乙二醇丙醛因其於水中之穩定性而可在製造中具有優勢。聚合物可具有任何分子量，且可為分支鏈或未分支鏈。連接至融合蛋白之聚合物的數目可變化，且若連接超過一種聚合物，則其可為相同或不同分子。一般而言，用於衍生作用之聚合物的數目及/或類型可基於包括但不限於以下之考慮因素而確定：待改良之融合蛋白之特定特性或功能、融合蛋白衍生物是否將用於界定條件下之療法等。

在一些實施例中，提供融合蛋白與可藉由暴露於輻射選擇性地加熱之非蛋白質部分之結合物。在一些實施例中，非蛋白質部分為碳奈米管(Kam等人,Proc . Natl . Acad . Sci . USA 102: 11600-11605 (2005))。輻射可具有任何波長，且包括但不限於不損害普通細胞但將非蛋白質部分加熱至殺死融合蛋白非蛋白質部分附近之細胞之溫度的波長。 II-B. 包含截短IL-21之融合蛋白

本申請案亦提供包含有包含截短人類IL-21之人類IL-21變異體的融合蛋白。不受理論束縛，發現相比於在C端缺少12個或更多個胺基酸之野生型對應物及截短對應物，包含在C端缺少1-11個胺基酸之IL-21之截短形式的融合蛋白具有改良之穩定性。預期如本文所述之包含截短IL-21之融合蛋白不限於包含抗白蛋白結合部分之融合蛋白。

在一些實施例中，提供一種融合蛋白，其包含a)在野生型IL-21之C端缺少約1-11個胺基酸之截短IL-21，及b)第二部分(諸如單域抗體部分)。在一些實施例中，IL-21源自人類。在一些實施例中，提供一種融合蛋白，其包含a)包含SEQ ID NO: 126、171或172之胺基酸序列的截短IL-21，及b)第二部分。在一些實施例中，截短IL-21在C端處在L123與S133之間(且包括端點)缺少一或多個胺基酸。在一些實施例中，截短IL-21在具有SEQ ID NO: 1中闡述之序列之IL-21的C端處在L123與S133之間(且包括端點)缺少任一個、任何兩個、任何三個、任何四個、任何五個、任何六個、任何七個、任何八個、任何九個、任何十個或所有十一個胺基酸。在一些實施例中，IL-21變異體在SEQ ID NO: 1之C端處缺少11、10、9、8、7、6、5、4、3、2或1個胺基酸。在一些實施例中，截短IL-21在SEQ ID NO: 1之C端處缺少約5-11、6-11、7-11、8-11、9-11或10-11個胺基酸(例如連續胺基酸)。

在一些實施例中，融合蛋白之分子量為至少約15 kDa、18 kDa、20 kDa、22 kDa、25 kDa、28 kDa。在一些實施例中，融合蛋白之分子量為不超過約1000 kDa、500 kDa、250 kDa、100 kDa、70 kDa、50 kDa、40 kDa或30 kDa。在一些實施例中，融合蛋白之分子量為約15 kDa至約1000 kDa、約15 kDa至約500 kDa、約15 kDa至約100 kDa、約15 kDa至約70 kDa、約20 kDa至約50 kDa、約25 kDa至約30 kDa，或約28 kDa。

在一些實施例中，第二部分包含半衰期延長部分。在一些實施例中，半衰期延長部分為白蛋白結合部分(例如白蛋白結合抗體部分，例如單域白蛋白結合抗體部分)。在一些實施例中，半衰期延長部分為Fc域(例如IgG1 Fc域)。

在一些實施例中，第二部分包含抗原結合部分。在一些實施例中，抗原結合部分之分子量為小於約50 kDa、40 kDa、30 kDa、20 kDa或15 kDa。在一些實施例中，抗原結合部分包含單域抗體部分。在一些實施例中，抗原結合部分包含特異性結合於白蛋白之單域抗體部分。

在一些實施例中，第二部分融合至截短IL-21之N端。在一些實施例中，第二部分融合至截短IL-21之C端。

在一些實施例中，第二部分經由連接子(可鄰近於IL-21或部鄰近於IL-21)融合至截短IL-21。在一些實施例中，第二部分經由連接子融合至截短IL-21之N端或C端。在一些實施例中，連接子為剛性連接子。在一些實施例中，連接子為可撓性連接子。 III. 醫藥組合物

本申請案另外提供包含本文所述之融合蛋白中之任一者，及視情況選用之醫藥學上可接受之載劑的醫藥組合物。醫藥組合物可藉由混合具有所需純度之本文所述之融合蛋白與視情況存在之醫藥學上可接受之載劑、賦形劑或穩定劑(Remington's Pharmaceutical Sciences第16版, Osol, A.編 (1980))(呈凍乾調配物或水溶液形式)來製備。

醫藥組合物較佳為穩定的，其中本文所述之融合蛋白在儲存後基本上保留其物理及化學穩定性及完整性。用於量測蛋白質穩定性之各種分析技術可用於此項技術中且綜述於Peptide and Protein Drug Delivery , 247-301, Vincent Lee編, Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., Pubs. (1991)及Jones,A . Adv . Drug Delivery Rev . 10: 29-90 (1993)中。可在所選溫度下持續所選時間段量測穩定性。為進行快速篩選，調配物可保持於40℃下2週至1個月，此時量測穩定性。在調配物欲儲存於2-8℃下時，調配物一般應在30℃或40℃下穩定至少1個月，及/或在2-8℃下穩定至少2年。當調配物欲儲存於30℃下時，調配物一般應在30℃下穩定至少2年，及/或在40℃下穩定至少6個月。舉例而言，在儲存期間之聚集程度可用作蛋白質穩定性之指標。在一些實施例中，本文所述之融合蛋白之穩定調配物可包含小於約10% (較佳小於約5%)以聚集體形式存在於調配物中之融合蛋白。

可接受之載劑、賦形劑或穩定劑在所用劑量及濃度下對接受者無毒性，且包括緩衝劑、抗氧化劑(包括抗壞血酸、甲硫胺酸、維生素E、偏亞硫酸氫鈉)；防腐劑、等張劑(例如氯化鈉)、穩定劑、金屬複合物(例如Zn-蛋白質複合物)；螯合劑，諸如EDTA及/或非離子界面活性劑。

生理學上可接受之載劑之實例包括緩衝劑，諸如磷酸鹽、檸檬酸鹽及其他有機酸；抗氧化劑，包括抗壞血酸及甲硫胺酸；防腐劑(諸如十八烷基二甲基苯甲基氯化銨；氯化六羥季銨；苯紮氯銨、苄索氯銨；酚、丁醇或苯甲醇；對羥基苯甲酸烷基酯，諸如對羥基苯甲酸甲酯或對羥基苯甲酸丙酯；兒茶酚；間苯二酚；環己醇；3-戊醇；及間甲酚)；低分子量(小於約10個殘基)多肽；蛋白質，諸如血清白蛋白、明膠或免疫球蛋白；親水性聚合物，諸如聚乙烯吡咯啶酮；胺基酸，諸如甘胺酸、麩醯胺酸、天冬醯胺、精胺酸或離胺酸；單醣、雙醣及其他碳水化合物，包括葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合劑，諸如EDTA；糖，諸如蔗糖、甘露醇、海藻糖或山梨醇；成鹽相對離子，諸如鈉；金屬複合物(例如Zn-蛋白質複合物)；及/或非離子界面活性劑，諸如TWEEN™、聚乙二醇(PEG)及PLURONICS™或聚乙二醇(PEG)。

緩衝劑用於將pH控制在最佳化治療有效性之範圍內，尤其在穩定性具pH依賴性之情況下。緩衝劑較佳以約50 mM至約250 mM範圍內之濃度存在。適用於本申請案之緩衝劑包括有機酸及無機酸及其鹽。舉例而言，檸檬酸鹽、磷酸鹽、丁二酸鹽、酒石酸鹽、反丁烯二酸鹽、葡糖酸鹽、草酸鹽、乳酸鹽、乙酸鹽。另外，緩衝劑可包含組胺酸及三甲胺鹽，諸如Tris。

添加防腐劑以延緩微生物生長，且通常存在於0.2%-1.0% (w/v)範圍內。防腐劑之添加可例如促進多次使用(多劑量)調配物之生產。適用於本申請案之防腐劑包括十八烷基二甲基苯甲基氯化銨；氯化六羥季銨；苯甲烴銨鹵化物(例如氯化物、溴化物、碘化物)、苄索氯銨；硫柳汞、酚、丁醇或苯甲醇；對羥基苯甲酸烷基酯，諸如對羥基苯甲酸甲酯或對羥基苯甲酸丙酯；兒茶酚；間苯二酚；環己醇、3-戊醇及間甲酚。

存在張力劑(有時稱為「穩定劑」)以調節或維持液體於組合物中之張力。當以大型帶電生物分子(諸如蛋白質及抗體)使用時，通常將其稱為「穩定劑」，因為其可與胺基酸側鏈之帶電基團相互作用，由此減小分子間及分子內相互作用之可能。考慮其他成分之相對量，張力劑可以0.1重量%至25重量%、較佳1重量%至5重量%之間的任何量存在。較佳張力劑包括多羥基糖醇，較佳包括三元醇或高級糖醇，諸如甘油、赤藻糖醇、阿拉伯糖醇、木糖醇、山梨糖醇或甘露糖醇。

額外賦形劑包括可充當以下中之一或多者的藥劑：(1)膨化劑、(2)溶解度增強劑、(3)穩定劑及(4)及防止變性或黏著於容器壁之藥劑。此類賦形劑包括：多羥基糖醇(上文所列舉)；胺基酸，諸如丙胺酸、甘胺酸、麩醯胺酸、天冬醯胺、組胺酸、精胺酸、離胺酸、鳥胺酸、白胺酸、2-苯丙胺酸、麩胺酸及蘇胺酸等；有機糖或糖醇，諸如蔗糖、乳糖、乳糖醇、海藻糖、水蘇糖、甘露糖、山梨糖、木糖、核糖、核糖醇、肌肉肌糖(myoinisitose)、肌肉肌醇(myoinisitol)、半乳糖、半乳糖醇、甘油、環醇(例如肌醇)、聚乙二醇；含硫還原劑，諸如脲、麩胱甘肽、硫辛酸、巰乙酸鈉、硫代甘油、α-單硫代甘油及硫代硫酸鈉；低分子量蛋白質，諸如人類血清白蛋白、牛血清白蛋白、明膠或其他免疫球蛋白；親水性聚合物，諸如聚乙烯吡咯啶酮；單醣(例如木糖、甘露糖、果糖、葡萄糖；雙醣(例如乳糖、麥芽糖、蔗糖)；三醣，諸如棉子糖；及多醣，諸如糊精或聚葡萄糖。

存在非離子界面活性劑或清潔劑(亦稱為「濕潤劑」)以幫助溶解治療劑以及保護治療蛋白免受攪動誘導之聚集，其亦准許調配物暴露於剪切表面應力而不引起活性治療蛋白或抗體之變性。非離子界面活性劑係以約0.05 mg/ml至約1.0 mg/ml、較佳約0.07 mg/ml至約0.2 mg/ml之範圍存在。

適合的非離子界面活性劑包括聚山梨醇酯(20、40、60、65、80等)、泊洛沙姆(polyoxamer)(184、188等)、PLURONIC®多元醇、TRITON®、聚氧乙烯脫水山梨糖醇單醚(TWEEN®-20、TWEEN®-80等)、聚桂醇400、聚乙二醇40硬脂酸酯、聚氧乙烯氫化蓖麻油10、50及60、單硬脂酸甘油酯、蔗糖脂肪酸酯、甲基纖維素及羧甲基纖維素。可使用之陰離子清潔劑包括月桂基硫酸鈉、二辛基磺基丁二酸鈉及二辛基磺酸鈉。陽離子清潔劑包括苯紮氯銨或苄索氯銨。

為了使醫藥組合物用於活體內投與，其必須無菌。可藉由經無菌過濾膜過濾而致使醫藥組合物無菌。一般將本文中之醫藥組合物置放於具有無菌接取口之容器中，例如具有可藉由皮下注射針刺穿之塞子的靜脈溶液袋或小瓶。

投與途徑係根據已知及可接受之方法，諸如藉由以適合之方式在長時段內之單次或多次快速注射或輸注，例如藉由皮下、靜脈內、腹膜內、肌肉內、動脈內、病灶內或關節內途徑之注射或輸注，局部投藥，吸入或藉由持續釋放或緩釋方法。在一些實施例中，醫藥組合物係局部，諸如瘤內或玻璃體內投與。

可製備持續釋放製劑。持續釋放製劑之適合實例包括含有拮抗劑之固體疏水性聚合物之半滲透基質，該等基質呈成形物品形式，例如膜或微囊。持續釋放基質之實例包括聚酯、水凝膠(例如，聚(甲基丙烯酸2-羥乙酯)或聚(乙烯醇))、聚乳酸交酯(美國專利第3,773,919號)、L-麩胺酸與γ-乙基-L-麩胺酸之共聚物、不可降解乙烯-乙酸乙烯酯、諸如LUPRON DEPOT™ (由乳酸-乙醇酸共聚物及乙酸亮丙瑞林(leuprolide acetate)構成之可注射微球體)之可降解乳酸-乙醇酸共聚物及聚-D-(-)-3-羥基丁酸。

本文之醫藥組合物亦可含有超過一種為所治療之特定適應症所必需之活性化合物，較佳為具有不會對彼此產生不利影響之互補活性的活性化合物。或者或另外，組合物可包含細胞毒性劑、化學治療劑、細胞激素、免疫抑制劑或生長抑制劑。此類分子宜以對預期目的有效之量存在於組合中。

亦可例如藉由凝聚技術或藉由界面聚合將活性成分包埋於所製備之微膠囊中，例如羥基甲基纖維素或明膠微膠囊及聚-(甲基丙烯酸甲酯)微膠囊分別包埋於膠狀藥物遞送系統(例如脂質體、白蛋白微球體、微乳液、奈米粒子及奈米囊劑)中或巨乳液中。此類技術揭示於Remington ' s Pharmaceutical Sciences 第18版中。

本文揭示之抗體融合蛋白可調配為免疫脂質體。含有抗體融合蛋白之脂質體係藉由此項技術中已知之方法製備，諸如Epstein等人, Proc. Natl Acad. Sci. USA, 82: 3688 (1985)；Hwang等人, Proc. Natl Acad. Sci. USA, 77: 4030 (1980)；及美國專利第4,485,045號及第4,544,545號中所述之方法。具有延長之循環時間的脂質體揭示於美國專利第5,013,556號中。

尤其適用之脂質體可藉由逆相蒸發法，用包含磷脂醯膽鹼、膽固醇及PEG衍生之磷脂醯乙醇胺(PEG-PE)的脂質組合物產生。脂質體經具有界定孔徑之過濾器擠出以產生具有所要直徑之脂質體。

在一些實施例中，醫藥組合物係包含在單次用小瓶，諸如單次用密封小瓶中。在一些實施例中，該醫藥組合物係包含在多次用小瓶中。在一些實施例中，該醫藥組合物係作為整體包含在容器中。在一些實施例中，該醫藥組合物經低溫保藏。 IV. 治療方法

本申請案之一個態樣提供使用本文所述之融合蛋白或醫藥組合物治療個體之疾病或病況之方法。舉例而言，本文所述之融合蛋白包含：a)細胞激素，及b)白蛋白結合部分(諸如結合至白蛋白之sdAb)。在一些實施例中，融合蛋白包含a)選自由以下組成之群的細胞激素：IL-21、IL-7、IL-15、結合至IL-15Rα之IL-15或其片段、IL-33及IL-22，及b)白蛋白結合部分(諸如結合至白蛋白之sdAb)。在一些實施例中，白蛋白結合部分包含如本文所述之白蛋白結合域或結合至白蛋白之單域抗體(sdAb)。在一些實施例中，該方法進一步包含投與第二藥劑。

本申請案之另一態樣提供治療個體之疾病或病況之方法，其包含向該個體投與a)包含i)細胞激素及ii)融合至細胞激素之半衰期延長域的融合蛋白；及b)第二藥劑。在一些實施例中，半衰期延長域融合至細胞激素之C端。在一些實施例中，半衰期延長域融合至細胞激素之N端。在一些實施例中，細胞激素及半衰期延長域係經由連接子連接。在一些實施例中，連接子之長度為1至40 (諸如1至35、1至30、1至25、1至20、4至20或4至16)個胺基酸。在一些實施例中，連接子選自由SEQ ID NO: 12-26及158-159組成之群。在一些實施例中，細胞激素選自由以下組成之群：IL-21、IL-7、IL-15、結合至IL-15Rα之IL-15或其片段、IL-33及IL-22。在一些實施例中，細胞激素為IL-21。在一些實施例中，半衰期延長域為白蛋白結合部分(諸如白蛋白結合域或抗白蛋白單域抗體)。在一些實施例中，半衰期延長域為白蛋白。在一些實施例中，半衰期延長域為Fc片段。在一些實施例中，Fc片段選自由以下組成之群：IgG1、IgG2、IgG3及IgG4 Fc片段或其變異體。在一些實施例中，Fc片段為IgG1 Fc片段或其變異體。在一些實施例中，IgG1 Fc片段或其變異體包含位置297處之突變，其中位置297處之胺基酸係突變為丙胺酸、天冬胺酸或甘胺酸。在一些實施例中，個體為人類。

在一些實施例中，第二藥劑包含治療抗體、免疫檢查點抑制劑、第二細胞激素、化學治療劑、酪胺酸激酶抑制劑或免疫細胞。

在一些實施例中，第二藥劑為治療抗體。在一些實施例中，治療抗體結合至腫瘤抗原。在一些實施例中，腫瘤抗原選自由以下組成之群：間皮素、GPA33、Her-2、EGFR及CD20。在一些實施例中，腫瘤抗原選自由以下組成之群：CEA、MUC16、MUC1、AFP、EPCAM、CD19、CD21、CD22、CD30、CD33、CD37、CD45、PSMA及BCMA。

在一些實施例中，腫瘤抗原為間皮素。在一些實施例中，第二藥劑為抗間皮素抗體或其片段。在一些實施例中，抗間皮素抗體或其片段包含有包含抗間皮素重鏈可變區(抗MSLN V_H )之單鏈抗體，其中該抗MSLN V_H 包含CDR1、CDR2及CDR3，其中：a) CDR1包含SEQ ID NO: 46之胺基酸序列，CDR2包含SEQ ID NO: 47之胺基酸序列且CDR3包含SEQ ID NO: 48之胺基酸序列，或在CDR中包含至多總共3、2或1個胺基酸取代之其變異體；或b) CDR1包含SEQ ID NO: 49之胺基酸序列，CDR2包含SEQ ID NO: 50之胺基酸序列且CDR3包含SEQ ID NO: 51之胺基酸序列，或在CDR中包含至多總共3、2或1個胺基酸取代之其變異體。

在一些實施例中，第二藥劑為免疫檢查點調節劑。在一些實施例中，免疫檢查點調節劑為選自由以下組成之群的免疫檢查點蛋白之抑制劑：PD-L1、CTLA4、PD-L2、PD-1、CD47、TIGIT、GITR、TIM3、LAG3、4-1BB、CD27及B7H4。在一些實施例中，免疫檢查點蛋白為PD-1。在一些實施例中，第二藥劑為抗PD-1抗體或其片段。

在一些實施例中，第二藥劑為第二細胞激素。在一些實施例中，融合蛋白中之細胞激素為IL-21，且其中第二細胞激素選自由以下組成之群：IL-7、IL-15、結合至IL15Rα之IL15或其半衰期延長變異體。

在一些實施例中，第二藥劑為免疫細胞。在一些實施例中，免疫細胞包含T細胞或NK細胞。在一些實施例中，免疫細胞包含表現嵌合抗原受體(CAR)之T細胞、表現經修飾T細胞受體(TCR)之T細胞或自腫瘤分離之T細胞。

在一些實施例中，第二藥劑為酪胺酸激酶抑制劑。

在一些實施例中，第二藥劑為化學治療劑(諸如索拉非尼)。

在一些實施例中，提供一種治療個體之疾病或病況之方法，其包含向該個體投與a)包含i) IL-21及ii)融合至細胞激素之半衰期延長域的融合蛋白；及b)第二藥劑。在一些實施例中，半衰期延長域融合至細胞激素之N端。在一些實施例中，半衰期延長域融合至細胞激素之C端。在一些實施例中，第二藥劑包含治療抗體(諸如結合至腫瘤抗原(諸如CD20或間皮素)之治療抗體)、免疫檢查點抑制劑(諸如抗PD-1抗體)、第二細胞激素、化學治療劑、酪胺酸激酶抑制劑或免疫細胞。在一些實施例中，半衰期延長域為如本文所述之抗體或其片段、白蛋白、結合蛋白(諸如白蛋白結合蛋白或IgG結合蛋白)、抗體衍生物或聚胺基序列。在一些實施例中，融合蛋白進一步包含抗原結合部分(諸如上文所述)。在一些實施例中，抗原結合部分結合至腫瘤抗原(諸如間皮素)。在一些實施例中，癌症選自由以下組成之群：間皮瘤、肺癌、乳癌、卵巢癌、胰臟癌、淋巴瘤(非霍奇金氏淋巴瘤)、白血病(諸如急性骨髓性白血病)、頭頸癌、肝癌、腎癌、腎臟癌、食道癌、胃癌及結腸直腸癌。在一些實施例中，癌症係選自由以下組成之群：間皮瘤、肺癌、卵巢癌及胃癌。在一些實施例中，個體為人類。

在一些實施例中，提供一種治療個體之疾病或病況之方法，其包含向該個體投與a)包含i) IL-7及ii)融合至細胞激素之半衰期延長域的融合蛋白；及b)第二藥劑。在一些實施例中，半衰期延長域融合至細胞激素之N端。在一些實施例中，半衰期延長域融合至細胞激素之C端。在一些實施例中，第二藥劑包含治療抗體(諸如結合至腫瘤抗原(諸如CD20或間皮素)之治療抗體)、免疫檢查點抑制劑(諸如抗PD-1抗體)、第二細胞激素、化學治療劑、酪胺酸激酶抑制劑或免疫細胞。在一些實施例中，半衰期延長域為如本文所述之抗體或其片段、白蛋白、結合蛋白(諸如白蛋白結合蛋白或IgG結合蛋白)、抗體衍生物或聚胺基序列。在一些實施例中，融合蛋白進一步包含抗原結合部分(諸如上文所述)。在一些實施例中，抗原結合部分結合至腫瘤抗原(諸如間皮素)。在一些實施例中，癌症選自由以下組成之群：間皮瘤、肺癌、乳癌、卵巢癌、胰臟癌、淋巴瘤(非霍奇金氏淋巴瘤)、白血病(諸如急性骨髓性白血病)、頭頸癌、肝癌、腎癌、腎臟癌、食道癌、胃癌及結腸直腸癌。在一些實施例中，癌症係選自由以下組成之群：間皮瘤、肺癌、卵巢癌及胃癌。在一些實施例中，個體為人類。

在一些實施例中，提供一種治療個體之疾病或病況之方法，其包含向該個體投與a)包含i) IL-15及ii)融合至細胞激素之半衰期延長域的融合蛋白；及b)第二藥劑。在一些實施例中，半衰期延長域融合至細胞激素之N端。在一些實施例中，半衰期延長域融合至細胞激素之C端。在一些實施例中，第二藥劑包含治療抗體(諸如結合至腫瘤抗原(諸如CD20或間皮素)之治療抗體)、免疫檢查點抑制劑(諸如抗PD-1抗體)、第二細胞激素、化學治療劑、酪胺酸激酶抑制劑或免疫細胞。在一些實施例中，半衰期延長域為如本文所述之抗體或其片段、白蛋白、結合蛋白(諸如白蛋白結合蛋白或IgG結合蛋白)、抗體衍生物或聚胺基序列。在一些實施例中，融合蛋白進一步包含抗原結合部分(諸如上文所述)。在一些實施例中，抗原結合部分結合至腫瘤抗原(諸如間皮素)。在一些實施例中，癌症選自由以下組成之群：間皮瘤、肺癌、乳癌、卵巢癌、胰臟癌、淋巴瘤(非霍奇金氏淋巴瘤)、白血病(諸如急性骨髓性白血病)、頭頸癌、肝癌、腎癌、腎臟癌、食道癌、胃癌及結腸直腸癌。在一些實施例中，癌症係選自由以下組成之群：間皮瘤、肺癌、卵巢癌及胃癌。在一些實施例中，個體為人類。

在一些實施例中，提供一種治療個體之疾病或病況之方法，其包含向該個體投與a)包含i)結合至IL-15Rα之IL-15或其片段及ii)融合至細胞激素之半衰期延長域的融合蛋白；及b)第二藥劑。在一些實施例中，半衰期延長域融合至細胞激素之N端。在一些實施例中，半衰期延長域融合至細胞激素之C端。在一些實施例中，第二藥劑包含治療抗體(諸如結合至腫瘤抗原(諸如CD20或間皮素)之治療抗體)、免疫檢查點抑制劑(諸如抗PD-1抗體)、第二細胞激素、化學治療劑、酪胺酸激酶抑制劑或免疫細胞。在一些實施例中，半衰期延長域為如本文所述之抗體或其片段、白蛋白、結合蛋白(諸如白蛋白結合蛋白或IgG結合蛋白)、抗體衍生物或聚胺基序列。在一些實施例中，融合蛋白進一步包含抗原結合部分(諸如上文所述)。在一些實施例中，抗原結合部分結合至腫瘤抗原(諸如間皮素)。在一些實施例中，癌症選自由以下組成之群：間皮瘤、肺癌、乳癌、卵巢癌、胰臟癌、淋巴瘤(非霍奇金氏淋巴瘤)、白血病(諸如急性骨髓性白血病)、頭頸癌、肝癌、腎癌、腎臟癌、食道癌、胃癌及結腸直腸癌。在一些實施例中，癌症係選自由以下組成之群：間皮瘤、肺癌、卵巢癌及胃癌。在一些實施例中，個體為人類。

在一些實施例中，提供一種治療個體之疾病或病況之方法，其包含向該個體投與a)包含i) IL-33及ii)融合至細胞激素之半衰期延長域的融合蛋白；及b)第二藥劑。在一些實施例中，半衰期延長域融合至細胞激素之N端。在一些實施例中，半衰期延長域融合至細胞激素之C端。在一些實施例中，第二藥劑包含治療抗體(諸如結合至腫瘤抗原(諸如CD20或間皮素)之治療抗體)、免疫檢查點抑制劑(諸如抗PD-1抗體)、第二細胞激素、化學治療劑、酪胺酸激酶抑制劑或免疫細胞。在一些實施例中，半衰期延長域為如本文所述之抗體或其片段、白蛋白、結合蛋白(諸如白蛋白結合蛋白或IgG結合蛋白)、抗體衍生物或聚胺基序列。在一些實施例中，融合蛋白進一步包含抗原結合部分(諸如上文所述)。在一些實施例中，抗原結合部分結合至腫瘤抗原(諸如間皮素)。在一些實施例中，癌症選自由以下組成之群：間皮瘤、肺癌、乳癌、卵巢癌、胰臟癌、淋巴瘤(非霍奇金氏淋巴瘤)、白血病(諸如急性骨髓性白血病)、頭頸癌、肝癌、腎癌、腎臟癌、食道癌、胃癌及結腸直腸癌。在一些實施例中，癌症係選自由以下組成之群：間皮瘤、肺癌、卵巢癌及胃癌。在一些實施例中，個體為人類。

在一些實施例中，提供一種治療個體之癌症之方法，其包含向該個體投與如上文所述之包含IL-21之融合蛋白。舉例而言，在一些實施例中，融合蛋白包含a) IL-21，及b)白蛋白結合部分(諸如結合至白蛋白之sdAb)，其中白蛋白結合部分融合至IL-21或其變異體之N端或C端。在一些實施例中，融合蛋白包含a)融合至白蛋白結合部分之IL-21 (「IL-21-ALBBM」)及b)抗原結合部分，其中細胞激素-ALBBM與抗原結合部分之間的鍵視情況可裂解。在一些實施例中，抗原結合部分結合至腫瘤抗原(諸如間皮素)。在一些實施例中，提供一種治療個體之癌症之方法，其包含向該個體投與包含i) IL-21及ii)半衰期延長域之融合蛋白，其中半衰期延長域融合至IL-21之N端或C端。在一些實施例中，該方法進一步包含第二藥劑(諸如結合至諸如CD20或間皮素之腫瘤抗原的治療抗體、諸如索拉非尼(sorafenib)之化學治療劑、諸如抗PD-1抗體之免疫調節劑)。在一些實施例中，癌症表現高水準之腫瘤抗原。在一些實施例中，半衰期延長域為如本文所述之抗體或其片段、白蛋白、結合蛋白(諸如白蛋白結合蛋白或IgG結合蛋白)、抗體衍生物或聚胺基序列。在一些實施例中，癌症選自由以下組成之群：間皮瘤、肺癌、乳癌、卵巢癌、胰臟癌、淋巴瘤(非霍奇金氏淋巴瘤)、白血病(諸如急性骨髓性白血病)、頭頸癌、肝癌、腎癌、腎臟癌、食道癌、胃癌及結腸直腸癌。在一些實施例中，癌症係選自由以下組成之群：間皮瘤、肺癌、卵巢癌及胃癌。在一些實施例中，個體為人類。

在一些實施例中，提供一種治療個體之癌症之方法，其包含向該個體投與如上文所述之包含IL-7之融合蛋白。舉例而言，在一些實施例中，融合蛋白包含a) IL-7，及b)白蛋白結合部分(諸如結合至白蛋白之sdAb)，其中白蛋白結合部分融合至IL-7或其變異體之N端或C端。在一些實施例中，融合蛋白包含a)融合至白蛋白結合部分之IL-7 (「IL-7-ALBBM」)及b)抗原結合部分，其中細胞激素-ALBBM與抗原結合部分之間的鍵視情況可裂解。在一些實施例中，抗原結合部分結合至腫瘤抗原(諸如間皮素)。在一些實施例中，提供一種治療個體之癌症之方法，其包含向該個體投與包含i) IL-7及ii)半衰期延長域之融合蛋白，其中半衰期延長域融合至IL-7之N端或C端。在一些實施例中，該方法進一步包含第二藥劑。在一些實施例中，癌症表現高水準之腫瘤抗原。在一些實施例中，半衰期延長域為如本文所述之抗體或其片段、白蛋白、結合蛋白(諸如白蛋白結合蛋白或IgG結合蛋白)、抗體衍生物或聚胺基序列。在一些實施例中，癌症係選自由以下組成之群：間皮瘤、肺癌、卵巢癌及胃癌。在一些實施例中，個體為人類。

在一些實施例中，提供一種治療個體之癌症之方法，其包含向該個體投與如上文所述之包含IL-15之融合蛋白。舉例而言，在一些實施例中，融合蛋白包含a) IL-15，及b)白蛋白結合部分(諸如結合至白蛋白之sdAb)，其中白蛋白結合部分融合至IL-15或其變異體之N端或C端。在一些實施例中，融合蛋白包含a)融合至白蛋白結合部分之IL-15 (「IL-15-ALBBM」)及b)抗原結合部分，其中細胞激素-ALBBM與抗原結合部分之間的鍵視情況可裂解。在一些實施例中，抗原結合部分結合至腫瘤抗原(諸如間皮素)。在一些實施例中，提供一種治療個體之癌症之方法，其包含向該個體投與包含i) IL-15及ii)半衰期延長域之融合蛋白，其中半衰期延長域融合至IL-15之N端或C端。在一些實施例中，該方法進一步包含第二藥劑。在一些實施例中，癌症表現高水準之腫瘤抗原。在一些實施例中，半衰期延長域為如本文所述之抗體或其片段、白蛋白、結合蛋白(諸如白蛋白結合蛋白或IgG結合蛋白)、抗體衍生物或聚胺基序列。在一些實施例中，癌症係選自由以下組成之群：間皮瘤、肺癌、卵巢癌及胃癌。在一些實施例中，個體為人類。

在一些實施例中，提供一種治療個體之癌症之方法，其包含向該個體投與如上文所述之包含結合至IL-15Rα之IL-15之融合蛋白。舉例而言，在一些實施例中，融合蛋白包含a)結合至IL-15Rα之IL-15，及b)白蛋白結合部分(諸如結合至白蛋白之sdAb)，其中白蛋白結合部分融合至結合至IL-15Rα之IL-15或其變異體之N端或C端。在一些實施例中，融合蛋白包含a)融合至白蛋白結合部分之結合至IL-15Rα之IL-15 (「結合至IL-15Rα之IL-15-ALBBM」)及b)抗原結合部分，其中細胞激素-ALBBM與抗原結合部分之間的鍵視情況可裂解。在一些實施例中，抗原結合部分結合至腫瘤抗原(諸如間皮素)。在一些實施例中，提供一種治療個體之癌症之方法，其包含向該個體投與包含i)結合至IL-15Rα之IL-15及ii)半衰期延長域之融合蛋白，其中半衰期延長域融合至結合至IL-15Rα之IL-15之N端或C端。在一些實施例中，該方法進一步包含第二藥劑。在一些實施例中，癌症表現高水準之腫瘤抗原。在一些實施例中，半衰期延長域為如本文所述之抗體或其片段、白蛋白、結合蛋白(諸如白蛋白結合蛋白或IgG結合蛋白)、抗體衍生物或聚胺基序列。在一些實施例中，癌症係選自由以下組成之群：間皮瘤、肺癌、卵巢癌及胃癌。在一些實施例中，個體為人類。

在一些實施例中，提供一種治療個體之癌症之方法，其包含向該個體投與如上文所述之包含IL-33之融合蛋白。舉例而言，在一些實施例中，融合蛋白包含a) IL-33，及b)白蛋白結合部分(諸如結合至白蛋白之sdAb)，其中白蛋白結合部分融合至IL-33或其變異體之N端或C端。在一些實施例中，融合蛋白包含a)融合至白蛋白結合部分之IL-33 (「IL-33-ALBBM」)及b)抗原結合部分，其中細胞激素-ALBBM與抗原結合部分之間的鍵視情況可裂解。在一些實施例中，抗原結合部分結合至腫瘤抗原(諸如間皮素)。在一些實施例中，提供一種治療個體之癌症之方法，其包含向該個體投與包含i) IL-33及ii)半衰期延長域之融合蛋白，其中半衰期延長域融合至IL-33之N端或C端。在一些實施例中，該方法進一步包含第二藥劑。在一些實施例中，癌症表現高水準之腫瘤抗原。在一些實施例中，半衰期延長域為如本文所述之抗體或其片段、白蛋白、結合蛋白(諸如白蛋白結合蛋白或IgG結合蛋白)、抗體衍生物或聚胺基序列。在一些實施例中，癌症係選自由以下組成之群：間皮瘤、肺癌、卵巢癌及胃癌。在一些實施例中，個體為人類。

在一些實施例中，提供一種治療個體之發炎疾病之方法，其包含向該個體投與融合蛋白，其中該融合蛋白包含a) IL-22，及b)白蛋白結合部分(諸如結合至白蛋白之sdAb)，其中白蛋白結合部分融合至IL-22或其變異體之N端或C端。在一些實施例中，白蛋白結合部分為白蛋白結合域或抗白蛋白單域抗體，諸如本文所述之彼等。在一些實施例中，提供一種治療個體之發炎疾病之方法，其包含向該個體投與融合蛋白，其中該融合蛋白包含a) IL-22，及ii)半衰期延長域。在一些實施例中，半衰期延長域為抗體或其片段、白蛋白、結合蛋白(諸如白蛋白結合蛋白或IgG結合蛋白)、抗體衍生物或聚胺基序列。在一些實施例中，疾病選自由以下組成之群：潰瘍性結腸炎、克羅恩氏病或潰瘍性迴腸炎，及腸移植物抗宿主病。在一些實施例中，個體為人類。

在一些實施例中，提供一種治療個體之間皮瘤之方法，其包含向該個體投與如上文所述之包含細胞激素之融合蛋白。舉例而言，在一些實施例中，融合蛋白包含a)細胞激素，及b)白蛋白結合部分(諸如結合至白蛋白之sdAb)，其中白蛋白結合部分融合至細胞激素之N端或C端。在一些實施例中，融合蛋白包含a)融合至白蛋白結合部分之細胞激素(「細胞激素-ALBBM」)及b)抗原結合部分，其中細胞激素-ALBBM與抗原結合部分之間的鍵視情況可裂解。在一些實施例中，細胞激素選自由以下組成之群：IL-21、IL-7、IL-15、結合至IL-15Rα之IL-15或其片段、IL-33及IL-22。在一些實施例中，抗原結合部分結合至腫瘤抗原(諸如間皮素)。在一些實施例中，提供一種治療個體之間皮瘤之方法，其包含向該個體投與包含i)細胞激素及ii)半衰期延長域之融合蛋白，其中半衰期延長域融合至細胞激素之N端或C端。在一些實施例中，該方法進一步包含第二藥劑(諸如抗間皮素抗體)。在一些實施例中，半衰期延長域為如本文所述之抗體或其片段、白蛋白、結合蛋白(諸如白蛋白結合蛋白或IgG結合蛋白)、抗體衍生物或聚胺基序列。

在一些實施例中，提供一種治療個體之肺癌之方法，其包含向該個體投與如上文所述之包含細胞激素之融合蛋白。舉例而言，在一些實施例中，融合蛋白包含a)細胞激素，及b)白蛋白結合部分(諸如結合至白蛋白之sdAb)，其中白蛋白結合部分融合至細胞激素之N端或C端。在一些實施例中，融合蛋白包含a)融合至白蛋白結合部分之細胞激素(「細胞激素-ALBBM」)及b)抗原結合部分，其中細胞激素-ALBBM與抗原結合部分之間的鍵視情況可裂解。在一些實施例中，細胞激素選自由以下組成之群：IL-21、IL-7、IL-15、結合至IL-15Rα之IL-15或其片段、IL-33及IL-22。在一些實施例中，抗原結合部分結合至腫瘤抗原。在一些實施例中，提供一種治療個體之肺癌之方法，其包含向該個體投與包含i)細胞激素及ii)半衰期延長域之融合蛋白，其中半衰期延長域融合至細胞激素之N端或C端。在一些實施例中，該方法進一步包含第二藥劑。在一些實施例中，半衰期延長域為如本文所述之抗體或其片段、白蛋白、結合蛋白(諸如白蛋白結合蛋白或IgG結合蛋白)、抗體衍生物或聚胺基序列。

在一些實施例中，提供一種治療個體之卵巢癌之方法，其包含向該個體投與如上文所述之包含細胞激素之融合蛋白。舉例而言，在一些實施例中，融合蛋白包含a)細胞激素，及b)白蛋白結合部分(諸如結合至白蛋白之sdAb)，其中白蛋白結合部分融合至細胞激素之N端或C端。在一些實施例中，融合蛋白包含a)融合至白蛋白結合部分之細胞激素(「細胞激素-ALBBM」)及b)抗原結合部分，其中細胞激素-ALBBM與抗原結合部分之間的鍵視情況可裂解。在一些實施例中，細胞激素選自由以下組成之群：IL-21、IL-7、IL-15、結合至IL-15Rα之IL-15或其片段、IL-33及IL-22。在一些實施例中，抗原結合部分結合至腫瘤抗原。在一些實施例中，提供一種治療個體之卵巢癌之方法，其包含向該個體投與包含i)細胞激素及ii)半衰期延長域之融合蛋白，其中半衰期延長域融合至細胞激素之N端或C端。在一些實施例中，該方法進一步包含第二藥劑。在一些實施例中，半衰期延長域為如本文所述之抗體或其片段、白蛋白、結合蛋白(諸如白蛋白結合蛋白或IgG結合蛋白)、抗體衍生物或聚胺基序列。

在一些實施例中，提供一種治療個體之胃癌之方法，其包含向該個體投與如上文所述之包含細胞激素之融合蛋白。舉例而言，在一些實施例中，融合蛋白包含a)細胞激素，及b)白蛋白結合部分(諸如結合至白蛋白之sdAb)，其中白蛋白結合部分融合至細胞激素之N端或C端。在一些實施例中，融合蛋白包含a)融合至白蛋白結合部分之細胞激素(「細胞激素-ALBBM」)及b)抗原結合部分，其中細胞激素-ALBBM與抗原結合部分之間的鍵視情況可裂解。在一些實施例中，細胞激素選自由以下組成之群：IL-21、IL-7、IL-15、結合至IL-15Rα之IL-15或其片段、IL-33及IL-22。在一些實施例中，抗原結合部分結合至腫瘤抗原。在一些實施例中，提供一種治療個體之胃癌之方法，其包含向該個體投與包含i)細胞激素及ii)半衰期延長域之融合蛋白，其中半衰期延長域融合至細胞激素之N端或C端。在一些實施例中，該方法進一步包含第二藥劑。在一些實施例中，半衰期延長域為如本文所述之抗體或其片段、白蛋白、結合蛋白(諸如白蛋白結合蛋白或IgG結合蛋白)、抗體衍生物或聚胺基序列。

在一些實施例中，提供一種治療個體之癌症之方法，其包含向該個體投與a)如上文所述之包含IL-21之融合蛋白，及b)選自由以下組成之群的第二細胞激素：IL-7、IL-15、結合至IL15Rα之IL15或其半衰期延長變異體。舉例而言，在一些實施例中，融合蛋白包含a) IL-21，及b)白蛋白結合部分(諸如結合至白蛋白之sdAb)，其中白蛋白結合部分融合至IL-21或其變異體之N端或C端。在一些實施例中，融合蛋白包含a)融合至白蛋白結合部分之IL-21 (「IL-21-ALBBM」)及b)抗原結合部分，其中細胞激素-ALBBM與抗原結合部分之間的鍵視情況可裂解。在一些實施例中，抗原結合部分結合至腫瘤抗原(諸如間皮素)。在一些實施例中，提供一種治療個體之癌症之方法，其包含向該個體投與a)包含i) IL-21及ii)半衰期延長域之融合蛋白，其中半衰期延長域融合至IL-21之N端或C端；b)選自由以下組成之群的第二藥劑：IL-7、IL-15、結合至IL15Rα之IL15或其半衰期延長變異體。在一些實施例中，半衰期延長域為如本文所述之抗體或其片段、白蛋白、結合蛋白(諸如白蛋白結合蛋白或IgG結合蛋白)、抗體衍生物或聚胺基序列。在一些實施例中，第一半衰期延長細胞激素係經由肽連接子(其視情況可經蛋白酶裂解)融合至第二半衰期延長細胞激素。在一些實施例中，癌症選自由以下組成之群：間皮瘤、肺癌、乳癌、卵巢癌、胰臟癌、淋巴瘤(非霍奇金氏淋巴瘤)、白血病(諸如急性骨髓性白血病)、頭頸癌、肝癌、腎癌、腎臟癌、食道癌、胃癌及結腸直腸癌。在一些實施例中，癌症係選自由以下組成之群：間皮瘤、肺癌、卵巢癌及胃癌。在一些實施例中，個體為人類。用於治療疾病之融合蛋白

在一些實施例中，用於治療疾病或病況之融合蛋白包含本文中(諸如在第II部分中)所述之融合蛋白中之任一者。在一些實施例中，融合蛋白包含i)細胞激素及ii)融合至細胞激素之半衰期延長域。在一些實施例中，半衰期延長域融合至細胞激素之C端。在一些實施例中，半衰期延長域融合至細胞激素之N端。在一些實施例中，細胞激素及半衰期延長域係經由連接子連接。在一些實施例中，連接子可為本文中(諸如在第II-B部分中)所述之任何連接子。在一些實施例中，細胞激素選自由以下組成之群：IL-21、IL-7、IL-15、結合至IL-15Rα之IL-15或其片段、IL-33及IL-22。在一些實施例中，細胞激素為IL-21。半衰期延長域

在一些實施例中，如本文所述之用於治療疾病或病況之融合蛋白包含半衰期延長域。

在一些實施例中，本文提供之融合蛋白包含選自由以下組成之群的半衰期延長域：抗體及其片段、白蛋白、白蛋白結合蛋白、IgG結合蛋白及聚胺基酸序列。預期亦可採用此項技術中可用的用於延長融合蛋白之半衰期的其他機制。 a) 抗體及其片段

藉由將細胞激素連接至能夠進行FcRn介導之再循環之抗體或其片段，來自個體之細胞激素之清除率可降低或另外延遲，由此延長投與之細胞激素之半衰期。

在一些實施例中，半衰期延長域包含抗體或其片段。在一些實施例中，抗體或其片段為能夠進行FcRn介導之再循環之任何抗體或其片段，諸如能夠進行FcRn介導之再循環之任何重鏈多肽或其部分(例如Fc域或其片段)。此項技術中公認FcRn介導之再循環需要將FcRn受體結合至抗體之Fc區或其片段。舉例而言，研究已顯示殘基I253、S254、H435及Y436 (根據Kabat EU指數編號系統編號)對於人類Fc區與人類FcRn複合物之間的相互作用重要。參見例如Firan, M.等人, Int. Immunol. 13 (2001) 993-1002；Shields, R.L.等人, J. Biol. Chem. 276 (2001) 6591-6604)。亦已檢查及報導殘基248-259、301-317、376-382及424-437 (根據Kabat EU指數編號系統編號)之各種突變體。Yeung, Y.A.等人 (J. Immunol. 182 (2009) 7667-7671。

在一些實施例中，抗體或其片段包含重鏈多肽或輕鏈多肽。在一些實施例中，抗體或其片段包含重鏈多肽或輕鏈多肽之一部分。在一些實施例中，抗體或其片段包含Fc域或其片段。在一些實施例中，抗體或其片段包含CH2及CH3域或其片段。在一些實施例中，抗體或其片段包含重鏈多肽之恆定域。在一些實施例中，抗體或其片段包含輕鏈多肽之恆定域。在一些實施例中，抗體或其片段包含重鏈多肽或其片段(例如Fc域或其片段)。在一些實施例中，抗體或其片段包含輕鏈多肽。

在一些實施例中，抗體或其片段包含Fc域或其片段。在一些實施例中，Fc片段選自由以下組成之群：IgG1、IgG2、IgG3及IgG4 Fc片段或其變異體。在一些實施例中，Fc片段為IgG1 Fc片段或其變異體。在一些實施例中，IgG1 Fc片段或其變異體包含位置297處之突變。在一些實施例中，位置297處之胺基酸為天冬醯胺。在一些實施例中，位置297處之胺基酸(例如天冬醯胺)係突變為丙胺酸、天冬胺酸或甘胺酸。

在一些實施例中，融合蛋白之細胞激素藉由細胞激素之一個複本之半衰期延長域與細胞激素之第二複本之對應半衰期延長域形成雙硫鍵而形成二聚體。 b) 白蛋白

白蛋白為由於其尺寸及其對FcRn介導之再循環(其防止細胞內降解)之易感性而具有約三週之延長血清半衰期的天然載體蛋白。因此，將細胞激素連接至白蛋白可極大地延長細胞激素之半衰期。此方法已用於延長治療有益蛋白質之血漿半衰期。參見例如WO 2001/079271A1及WO 2003/59934A2，其內容以引用的方式併入本文中。HSA之一些同功異型物列於表2中。

在一些實施例中，融合蛋白包含半衰期延長域，該半衰期延長域包含白蛋白多肽或其片段或變異體(在下文中稱為「白蛋白」或「白蛋白多肽」)。如本文所用，術語「白蛋白」及「白蛋白多肽」包括白蛋白之片段以及白蛋白之變異體。白蛋白多肽包含胺基端及羧基端。白蛋白多肽可為任何白蛋白多肽，包括其任何片段或變異體，諸如WO 2001/079271A1；WO 2003/59934A2；US20160152686A1；WO 2012/059486；WO 2011/124718；US20070048282中所述之任何白蛋白多肽，該等專利之內容以引用的方式併入本文中。在一些實施例中，白蛋白多肽為HSA。 c) 結合蛋白

延長細胞激素或其變異體於血清中之半衰期的額外策略包括將細胞激素連接至某些結合蛋白，諸如如上文所述之白蛋白結合蛋白或IgG結合蛋白。結合蛋白可為結合至具有長半衰期之血清蛋白(諸如白蛋白或IgG)的任何蛋白。白蛋白及IgG為已知在血清中具有長半衰期之多肽。

在一些實施例中，半衰期延長域包含白蛋白結合蛋白。在一些實施例中，融合蛋白包含超過一種白蛋白結合蛋白，其各自可為本文所述之白蛋白結合蛋白中之任一者。

在一些實施例中，白蛋白結合蛋白為單域抗體或其片段，諸如奈米抗體，其與白蛋白(諸如本文所述之彼等)結合或以其他方式締合。參見例如WO 2004041865A2及US20070269422A1，其內容以引用的方式併入本文中。

結合蛋白之另一實例為IgG結合蛋白。已報導IgG結合蛋白。關於IgG結合蛋白之概述，包括特定IgG結合蛋白及其應用，參見例如Choe等人 (2016) Materials 9(12): 994，該文獻之內容以引用的方式併入本文中。 d) 抗體衍生物

或者，本文所述之細胞激素可連接至各種抗體衍生物，包括但不限於scFv、scFc、雙重可變域(DVD)及基於互換單抗法(CrossMab approach)之抗體衍生物。參見例如Klein等人 (2012), MAbs, 4(6): 653-663; US20070071675A1。抗體衍生物包括工程化為雙特異性抗體或其片段之抗體衍生物。因此，在一些實施例中，半衰期延長域可包含任何抗體衍生物、其變異體或融合產物，包括但不限於scFv、scFc、雙重可變域(DVD)、基於互換單抗法之抗體衍生物及雙特異性抗體或其片段。 e) 聚胺基酸序列

用於延長融合蛋白於血清中之半衰期的另一策略為藉由將融合蛋白連接至聚胺基酸序列。因此，在一些實施例中，半衰期延長域包含聚胺基酸序列。聚胺基酸序列可為能夠在其連接至融合蛋白時延長融合蛋白於血清中之半衰期的任何聚胺基酸序列。聚胺基酸序列之實例包括PAS多肽及XTEN多肽。 f) 聚乙二醇化及糖基化

用於延長本文提供之細胞激素之半衰期的額外策略包括聚乙二醇化及額外糖基化位點之工程化。在下文中更詳細地論述此等策略中之每一者。

「聚乙二醇化」係指如下製程：將聚乙二醇(PEG)聚合物鏈共價或非共價連接或融合至分子及宏觀結構，諸如藥物、治療蛋白、多肽、抗體、抗體片段、抗體衍生物，或本文提供之融合蛋白或其組分中之任一者(例如融合蛋白之半衰期延長域及/或融合蛋白之細胞激素或其功能片段)。聚乙二醇化之益處包括例如(1)顯著改良之活體內循環半衰期，其歸因於避免腎清除率(由於聚合物將分子之表觀尺寸增加至高於腎小球濾過限度)及/或經由避免細胞清除機制，(2) PEG所連接之分子之降低之抗原性及免疫原性，(3)改良之藥物動力學，(4)改良之溶解度，(5)改良之調配及給藥選擇，(6)改良之生物可用性，其經由皮下注射部位處減少之損失，(7)聚乙二醇化分子之改良之熱及機械穩定性。

各種分子及宏觀結構之聚乙二醇化方法為此項技術中熟知的。參見例如US20140256636A1；Fee及Damodaran (2010) European Pharmaceutical Review, 15(1): 18-26；Chapman等人 (1999) Nature Biotechnol., 17: 780-783；Yang等人. (2003), Protein Eng., 16(10): 761-770；Chapman, Adv. Drug. Deliv. Rev. (2002), 54(4): 531-545，其內容以引用的方式併入本文中。

「糖基化」係指將醣或糖基基團添加至多肽。多肽之糖基化通常為N連接或O連接。N連接係指碳水化合物部分與天冬醯胺殘基之側鏈連接。三肽序列天冬醯胺-X-絲胺酸(N-X-S)及天冬醯胺-X-蘇胺酸(N-X-T)(其中X為除了脯胺酸(P)之外的任何胺基酸)為用於將碳水化合物部分酶促連接至天冬醯胺側鏈之識別序列。因此，在多肽中此等三肽序列中之任一者的存在產生潛在糖基化位點。O-連接糖基化係指糖(例如N-乙醯半乳胺糖、半乳糖或木糖)中之一者連接至羥基胺基酸，最通常為絲胺酸或蘇胺酸，儘管亦可使用5-羥基脯胺酸或5-羥基離胺酸。

已顯示天然存在之糖基化提高蛋白質之分子穩定性。參見例如Sola等人 (2007), Cell. Mol. Life Sci., 64(16): 2133-2152。亦顯示額外糖基化位點之工程化可針對大部分主要生理化學不穩定性使多種蛋白質治療劑穩定。參見例如Sola及Griebenow (2009), J. Pharm. Sci., 98(4): 1223-1245。在已顯示藉由糖基化改良之醫藥學相關蛋白質不穩定性中包括例如氧化；交聯；pH、化學、熱及冷凍誘導之變性/去摺疊；沈澱；動力學活化；及聚集。Id.

將糖基化位點添加至融合蛋白便利地如下達成：藉由改變胺基酸序列，使得上述三肽序列(用於N連接糖基化位點)中之一或多者在融合蛋白之胺基酸序列中(例如在半衰期延長域及/或細胞激素或其功能片段之胺基酸序列中)產生。亦可藉由融合蛋白之胺基酸序列中(例如半衰期延長域及/或細胞激素或其功能片段之胺基酸序列中)(用於O連接糖基化位點)之一或多個絲胺酸或蘇胺酸殘基之添加或取代來進行改變。 g) 雜二聚修飾

本文所述之半衰期延長域可包括一或多個促進兩種不同半衰期延長域之雜二聚的修飾。在包含第一半衰期延長域及第二半衰期延長域之一些實施例中，期望促進第一及第二半衰期延長域之雜二聚以使得呈其適當雜二聚體形式之融合蛋白之產生係高效地產生。因此，可使用此項技術中可用之任何策略，包括如Klein等人 (2012), MAbs, 4(6): 653-663中所述之任何策略對第一半衰期延長域進行一或多種胺基酸修飾且可對第二半衰期延長域進行一或多種胺基酸修飾。

促進兩種不同半衰期延長域之雜二聚之一種策略為稱為「杵-臼(knobs-into-holes)」之方法。在一些實施例中，融合蛋白包含第一半衰期延長域及第二半衰期延長域，其各自包含CH3域。在一些實施例中，包含CH3域之半衰期延長域為重鏈多肽或其片段(例如Fc域或其片段)。兩個半衰期延長域之CH3域可藉由「杵-臼」技術改變，其藉由若干實例詳細描述於例如WO 1996/027011；Ridgway, J.B.等人, Protein Eng. (1996) 9(7): 617-621；Merchant, A.M.等人, Nat. Biotechnol. (1998) 16(7): 677-681中。亦參見Klein等人 (2012), MAbs, 4(6): 653-663。使用杵-臼方法，兩個CH3域之相互作用表面經改變以增加含有兩個改變CH3域之兩個半衰期延長域之雜二聚。此藉由將大型殘基引入至半衰期延長域中之一者之CH3域中充當「杵」而發生。接著，為了容納大型殘基，在另一半衰期延長域中形成可容納杵之「臼」。經改變CH3域中之任一者可為「杵」，而另一者可為「臼」。引入二硫橋鍵進一步穩定雜二聚體(Merchant, A.M.等人, Nat. Biotechnol. (1998) 16(7)；Atwell, S.等人, J. Mol. Biol. (1997) 270(1): 26-35)以及增加產率。將促進充當「杵」及「臼」之例示性序列揭示於，例如包括SEQ ID NO: 164-167之序列中包括之序列。在一些實施例中，CH3域具有選自Y349C、T366S、L368A、Y407V、S354C、T366W之一或多個突變。

促進兩種不同半衰期延長域之雜二聚之另一策略為藉由穩定化離子相互作用，該等離子相互作用經由改變帶電殘基而有利於雜二聚。在一些實施例中，融合蛋白包含第一半衰期延長域及第二半衰期延長域，其各自包含CH3域。在一些實施例中，包含CH3域之半衰期延長域為重鏈多肽或其片段(例如Fc域或其片段)。已觀測到，改變兩種不同Fc域之間的電荷極性可產生離子相互作用，使得有利於雜二聚，同時抑制均二聚。參見例如WO 2006/106905A1；Gunasekaran等人 (2010) 285(25): 19637-19646。舉例而言，觀測到Fc域之帶負電E356對與另一Fc域之帶正電K439配對，第一Fc域之帶負電E357、E357及D399分別與第二Fc域之帶正電K439、K370及K409配對。參見WO 2006/106905A1；Gunasekaran等人 (2010) 285(25): 19637-19646。因此，藉由向第一Fc域中引入突變E356K、E357K及D399K中之至少兩者，且向第二Fc域中引入突變K370E、K409D及K439E，可達成高效雜二聚，同時抑制均二聚體形成。Id. 已藉由向第一Fc鏈中引入K392D及K409D突變，及藉由向第二Fc鏈中引入D399K及E356K突變而達成高效雜二聚。Gunasekaran等人 (2010) 285(25): 19637-19646。

促進兩種不同半衰期延長域之雜二聚的另一策略為藉由使用基於結構及序列之方法來鑑別可促進雜二聚及/或抑制均二聚之改變。鑑別促進雜二聚之改變的方法中包括藉由進行結構計算以測定配對變異體組合對於跨越CH3-CH3二聚體界面相互作用之殘基的能量，如Moore等人 (2011) 3(6): 546-557中收錄之方法，該文獻之內容以引用的方式併入本文中。Moore等人將預測在雜二聚體形式中具有相對於均二聚體形式之較低能量的配對鑑別為進一步分析之起始點。觀測道89%之雜二聚產率可藉由向第一Fc域中引入S364H及F405A突變及藉由向第二Fc域中引入Y349T及T394F突變來達成。Id. 疾病或病症

本文所描述之方法可用於治療疾病或病症。在一些實施例中，疾病或病況係選自由以下組成之群：癌症、發炎性病況及感染。

在一些實施例中，疾病或病況為發炎疾病。在一些實施例中，疾病選自由以下組成之群：潰瘍性結腸炎、克羅恩氏病或潰瘍性迴腸炎，及腸移植物抗宿主病。

在一些實施例中，疾病或病況為癌症。在一些實施例中，癌症為實體或液體腫瘤。在一些實施例中，癌症選自由以下組成之群：間皮瘤、肺癌、乳癌、卵巢癌、胰臟癌、淋巴瘤(非霍奇金氏淋巴瘤)、白血病(諸如急性骨髓性白血病)、頭頸癌、肝癌、腎癌、腎臟癌、食道癌、胃癌及結腸直腸癌。在一些實施例中，癌症係選自由以下組成之群：間皮瘤、肺癌、卵巢癌及胃癌。給藥方案

融合蛋白及/或第二藥劑可使用任何適合之劑量及投與途徑向個體投與。在一些實施例中，融合蛋白及/或第二藥劑係非經腸投與至個體。投與途徑係根據已知及可接受方法，諸如藉由以適合之方式，例如藉由皮下、靜脈內、腹膜內、肌肉內、動脈內、病灶內、關節內、瘤內或經口途徑注射或輸注而在一段時間內單次或多次快速注射或輸注。

在一些實施例中，融合蛋白及第二藥劑係同時、並行或依序投與至個體。

確定適當劑量或投與途徑完全在一般熟習此項技術者之技能內。動物實驗為確定用於人類診斷應用之有效劑量提供可靠指導。有效劑量之種間按比例調整可遵循由Mordenti, J.及Chappell, W. 「The Use of Interspecies Scaling in Toxicokinetics」,Toxicokinetics and New Drug Development , Yacobi等人編, Pergamon Press, New York 1989, 第42-46頁主張之原理來進行。

在一些實施例中，約每三週一次至約一週兩次(諸如約每三週一次至約每兩週一次、約每兩週一次至約每週一次、約每週一次至約一週兩次)地投與融合蛋白。在一些實施例中，不少於約每三週一次、約每兩週一次、約每週一次、約一週兩次地投與融合蛋白。在一些實施例中，不超過約每三週一次、約每兩週一次、約每週一次、約一週兩次地投與融合蛋白。在一些實施例中，約每三週一次、約每兩週一次、約每週一次、約一週兩次地投與融合蛋白。

在一些實施例中，融合蛋白在各治療週期投與至少約一週至六個月(諸如一週至兩週、三週或四週、一週至一個月、兩個月、三個月、四個月、五個月或六個月、一個月至兩個月、三個月、四個月、五個月或六個月、三個月至四個月、五個月或六個月)。

在一些實施例中，各投與之融合蛋白的量為約100 ng/kg至約10 mg/kg (例如約100 ng/kg至約500 ng/kg、約500 ng/kg至約1 μg/kg、約1 μg/kg至約5 μg/kg、約5μg/kg至約10 μg/kg、約10 μg/kg至約50 μg/kg、約50 μg/kg 至約100 μg/kg、約100 μg/kg 至約500 μg/kg 、約500 μg/kg 至約1 mg/kg、約1 mg/kg至約5 mg/kg、約5 mg/kg至約10 mg/kg)。

在一些實施例中，約每月一次至約每週兩次(諸如約每月一次至每月兩次、三次或四次、約每兩週一次、約每三週一次、約每週一次或每週兩次)地投與第二藥劑(諸如結合至間皮素之治療抗體或PD-1之抑制劑)。

在一些實施例中，各投與之第二藥劑(諸如結合至間皮素之治療抗體或PD-1之抑制劑)的量為約100 ng/kg至約100 mg/kg (例如約100 ng/kg至約500 ng/kg、約500 ng/kg至約1 μg/kg、約1 μg/kg至約5 μg/kg、約5μg/kg至約10 μg/kg、約10 μg/kg至約50 μg/kg、約50 μg/kg 至約100 μg/kg、約100 μg/kg 至約500 μg/kg 、約500 μg/kg 至約1 mg/kg、約1 mg/kg至約5 mg/kg、約5mg/kg至約10 mg/kg、約10 mg/kg至約50 mg/kg或約50 mg/kg至約100 mg/kg)。 V. 製備方法

本文所述之融合蛋白及本文所述之融合蛋白之組分(諸如白蛋白結合部分、細胞激素或其變異體、抗原結合部分)可藉由此項技術中已知之蛋白質表現及純化方法中之任一者製備。

在一些實施例中，本申請案提供編碼融合蛋白、白蛋白結合部分、細胞激素或其變異體或抗原結合部分中之任一者之一或多條多肽鏈的經分離核酸。在一些實施例中，經分離核酸包含編碼SEQ ID NO: 46-51及60-95之胺基酸序列中之任一者的核酸序列。

在一些實施例中，將經分離核酸插入載體，諸如表現載體、病毒載體或選殖載體中。為表現該等核酸，可將載體引入宿主細胞中以允許在該宿主細胞內表現該等核酸。該等表現載體可以含有多種用於控制表現之元件，包括但不限於啟動子序列、轉錄起始序列、強化子序列、可選擇標記物及信號序列。適當時，該等元件可由一般熟習此項技術者選擇。舉例而言，啟動子序列可經選擇以促進聚核苷酸在載體中之轉錄。適合之啟動子序列包括但不限於T7啟動子、T3啟動子、SP6啟動子、β-肌動蛋白啟動子、EF1a啟動子、CMV啟動子及SV40啟動子。強化子序列可經選擇以增進核酸之轉錄。可選擇標記物可經選擇以允許自不含該載體之宿主細胞中選出經插入而含有該載體之宿主細胞，例如可選擇標記物可以為賦予抗生素抗性之基因。信號序列可經選擇以允許將表現之多肽運輸至宿主細胞外。在一些實施例中，分離之核酸進一步包含編碼信號肽之核酸序列。

在一些實施例中，提供含有上文所述之載體的經分離宿主細胞。含有載體之宿主細胞可適用於表現或選殖經分離核酸。適合宿主細胞可包括但不限於原核細胞、真菌細胞、酵母細胞，或高級真核細胞，諸如哺乳動物細胞。抗體及抗原結合片段在諸如大腸桿菌之原核細胞中之表現已在此項技術中良好確立。關於綜述，參見例如Pluckthun, A. BioTechnology 9: 545-551 (1991)。熟習此項技術者亦可用真核細胞於培養物中之表現作為產生抗體或其抗原結合片段之選項，參見最近綜述，例如Ref, M. E. (1993) Curr. Opinion Biotech. 4: 573-576；Trill J. J.等人 (1995) Curr. Opinion Biotech 6: 553-560。高級真核細胞，特別是源自多細胞生物體之細胞可用於表現糖基化多肽。適合的高級真核細胞包括但不限於無脊椎動物細胞及昆蟲細胞，以及脊椎動物細胞。

載體可以使用此項技術中已知之任何適合方法引入宿主細胞中，包括但不限於DEAE-聚葡萄糖介導之遞送、磷酸鈣沈澱法、陽離子性脂質介導之遞送、脂質體介導之轉染、電穿孔、微彈轟擊、受體介導之基因遞送，由聚離胺酸、組蛋白、殼聚糖及肽介導之遞送。用於轉染及轉型細胞以表現所關注載體之標準方法係此項技術中熟知的。在一些實施例中，宿主細胞包含編碼第一多肽之第一載體及編碼第二多肽之第二載體。在一些實施例中，宿主細胞包含單一載體，該載體包含編碼第一多肽及第二多肽的分離之核酸。

在一些實施例中，本申請案提供表現本文所述之融合蛋白、白蛋白結合部分、細胞激素或其變異體或抗原結合部分中之任一者之方法，其包含培養含有載體之經分離宿主細胞及自細胞培養物回收融合蛋白、白蛋白結合部分、細胞激素或其變異體或抗原結合部分。該等經分離宿主細胞係在允許表現插入載體中之分離之核酸之條件下培養。用於表現聚核苷酸之適合條件可包括但不限於適合培養基、培養基中適合的宿主細胞密度、所需養分之存在、補充因子之存在、適合溫度及濕度，以及不存在微生物污染物。一般熟習此項技術者可以選擇適於該表現目的之適合條件。

經表現多肽可使用任何適合之方法收集。多肽可表現於細胞內的周質空間中或分泌至細胞外的培養基中。若多肽表現於細胞內，則含有多肽之宿主細胞可溶解且多肽可藉由經離心或超過濾移除非所需碎片而自溶解物分離。若多肽分泌至大腸桿菌之周質空間中，則細胞糊狀物可在諸如乙酸鈉(pH 3.5)、EDTA及苯甲基磺醯氟(PMSF)之試劑存在下解凍約30分鐘，且可藉由離心移除細胞碎片(Carter等人, BioTechnology 10:163-167 (1992))。若多肽分泌至培養基中，則可收集細胞培養物之上清液且使用市售蛋白質濃縮過濾器，例如Amincon或Millipore Pellicon超過濾單元濃縮。在收集及濃縮步驟中可包括蛋白酶抑制劑及/或抗生素以抑制蛋白質降解及/或受污染微生物之生長。

所表現之多肽可藉由適合方法進一步純化，諸如但不限於親和層析、羥磷灰石層析、尺寸排阻層析、凝膠電泳、透析、離子交換管柱上之離子交換部分分離、乙醇沈澱、逆相HPLC、二氧化矽層析法、肝素瓊脂糖上之層析、陰離子或陽離子交換樹脂(諸如聚天冬胺酸管柱)上之層析、層析聚焦、SDS-PAGE及硫酸銨沈澱(關於綜述，參見Bonner, P. L., Protein purification, Taylor & Francis.出版 2007；Janson, J. C.等人, Protein purification: principles, high resolution methods and applications, Wiley-VCH出版, 1998)。

在一些實施例中，多肽可藉由親和層析純化。在一些實施例中，蛋白A層析或蛋白A /G (蛋白A及蛋白G之融合蛋白)層析可適用於純化包含衍生自抗體CH2域及/或CH3域及/或VH及/或V_H H之組分的多肽(Lindmark等人,J . Immunol . Meth. 62:1-13 (1983))；Zettlit, K. A.,Antibody Engineering , 第V部分, 531-535, 2010；Fridy等人 2015.Analytical Biochemistry 477, 92-94；Henry等人 2016.PLoS One . 2016; 11(9): e0163113)。在一些實施例中，蛋白G層析可適用於純化包含IgG γ3重鏈之多肽及/或多肽複合物(Guss等人, EMBO J. 5:1567 1575 (1986))。在一些實施例中，蛋白L層析可適用於純化包含κ輕鏈之多肽及/或多肽複合物(Sudhir, P., Antigen engineering protocols, 第26章, Humana Press出版, 1995；Nilson, B. H. K.等人, J. Biol. Chem., 267, 2234-2239 (1992))。附接親和力配位體之基質最常為瓊脂糖，但其他基質為可用的。與瓊脂糖可達成者相比，機械穩定性基質(諸如受控微孔玻璃或聚(苯乙烯二乙烯基)苯)允許較快流動速率及較短處理時間。在抗體包含CH3域之情況下，Bakerbond ABX樹脂(J.T. Baker, Phillipsburg, N.J.)適用於純化。 VI. 製品及套組

在本發明之一些實施例中，提供含有適用於治療個體之疾病或病況(諸如癌症或發炎疾病)之材料的製品，用於向該個體投與融合蛋白。該製品可包含容器及容器上或容器隨附之標籤或藥品說明書。適合之容器包括例如瓶子、小瓶、注射器等。容器可由各種材料形成，諸如玻璃或塑膠。一般而言，容器容納對於治療本文所述之疾病或病症有效之組合物，且可具有無菌出入端口(例如容器可為靜脈內溶液袋或具有可藉由皮下注射針刺穿之塞子的小瓶)。組合物中之至少一種活性劑為本文所述之融合蛋白。標籤或藥品說明書指示該組合物用於治療特定病況。標籤或藥品說明書將進一步包含關於向患者投與融合蛋白之說明書。亦涵蓋包含本文中描述之組合療法的製品及套組。

藥品說明書係指市售治療產品封裝中通常所包括之含有關於適應症、使用、劑量、投與、與此類治療產品之使用有關之禁忌之資訊及/或警告的說明書。在一些實施例中，藥品說明書指示組合物係用於治療疾病或病況(諸如癌症或發炎疾病)。

另外，製品可進一步包含第二容器，其包含醫藥學上可接受之緩衝液，諸如抑菌性注射用水(BWFI)、磷酸鹽緩衝鹽水、林格氏溶液(Ringer's solution)及右旋糖溶液。其可進一步包括就商業及使用者觀點而言所需之其他物質，包括其他緩衝劑、稀釋劑、過濾器、針及注射器。

亦提供適用於各種目的之套組，例如用於治療本文所述之疾病或病況(諸如癌症或發炎疾病)、用於向個體投與融合蛋白，視情況與製品組合。本發明之套組包括一或多個包含融合蛋白組合物(或單位劑型及/或製品)之容器，且在一些實施例中，進一步包含另一藥劑(諸如本文所述之藥劑)及/或根據本文所描述之任一方法之使用說明書。套組可進一步包含選擇適合於治療之個體的說明。本發明套組中供應之說明書為通常在標籤或藥品說明書(例如，套組中包括之紙片)上之書面說明書，但機器可讀說明書(例如，磁化或光學儲存盤上載有的說明書)亦為可接受的。

舉例而言，在一些實施例中，套組包含有包含融合蛋白之組合物。在一些實施例中，套組包含a)包含融合蛋白之組合物，及b)有效量的如本文所述之至少一種其他藥劑。在一些實施例中，套組包含a)包含融合蛋白之組合物，及b)關於向個體投與融合蛋白組合物以進行治療之說明書。在一些實施例中，套組包含a)包含融合蛋白之組合物，b)有效量的如本文所述之至少一種其他藥劑，及c)關於向個體投與融合蛋白組合物及一或多種其他藥劑以進行治療之說明書。融合蛋白及一或多種其他藥劑可存在於獨立容器或單一容器中。舉例而言，套組可包含一種獨特組合物或兩種或更多種組合物，其中一種組合物包含融合蛋白且另一組合物包含另一藥劑。

本發明之套組係在適合的包裝中。適合的包裝包括但不限於小瓶、瓶子、罐、可撓性包裝(例如密封Mylar或塑膠袋)及其類似物。套組可視情況提供諸如緩衝劑之額外組分及說明性資訊。本申請案因此亦提供製品，其包括小瓶(諸如密封小瓶)、瓶子、罐、可撓性包裝及其類似者。

與融合蛋白組合物之使用相關的說明書大體上包括關於所期望治療之劑量、給藥時程及投與途徑之資訊。容器可為單位劑量、散裝(例如，多劑量包裝)或次單位劑量。舉例而言，可提供套組，其含有足夠劑量之如本文所揭示之融合蛋白，以在長時段，諸如1週、8天、9天、10天、11天、12天、13天、2週、3週、4週、6週、8週、3個月、4個月、5個月、7個月、8個月、9個月或更久中之任一者內向個體提供有效治療。套組亦可包括多個單位劑量之融合蛋白及醫藥組合物及使用說明書且以對於在藥房，例如醫院藥房及配藥房中儲存及使用而言足夠之量包裝。

熟習此項技術者將認識到，在本發明之範疇及精神內，若干實施例為可能的。現將參照以下非限制性實例來更詳細地描述本發明。以下實例進一步說明本發明，但當然不應解釋為以任何方式限制其範疇。例示性實施例

1. 一種融合蛋白，其包含：a)細胞激素，及b)白蛋白結合部分(諸如結合至白蛋白之sdAb)，其中細胞激素選自由以下組成之群：IL-21、IL-7、IL-15、結合至IL-15Rα之IL-15或其片段、IL-33及IL-22。

2. 一種融合蛋白，其包含：a)融合至白蛋白結合部分之細胞激素(「細胞激素-ALBBM」)，及b)抗原結合部分，其中細胞激素-ALBBM與抗原結合部分之間的鍵視情況可裂解。

3. 如技術方案2之融合蛋白，其中該細胞激素選自由以下組成之群：IL-21、IL-7、IL-15、結合至IL-15Rα之IL-15或其片段、IL-33及IL-22。

4. 如技術方案1至3中任一項之融合蛋白，其中該細胞激素為IL-21。

5. 如技術方案4之融合蛋白，其中該IL-21包含SEQ ID NO: 1、2、126、171或172之胺基酸序列，或與SEQ ID NO: 1、2、126、171或172包含至少約80%序列一致性之其變異體。

6. 如技術方案1至5中任一項之融合蛋白，其中該白蛋白結合部分結合至人類血清白蛋白(HSA)及/或食蟹獼猴血清白蛋白(CMSA)。

7. 如技術方案1至6中任一項之融合蛋白，其中該白蛋白結合部分包含白蛋白結合域(ABD)。

8. 如技術方案1至7中任一項之融合蛋白，其中該白蛋白結合域包含選自由SEQ ID NO: 3-11組成之群的胺基酸序列，或與SEQ ID NO: 3-11中之任一者包含至少約80%序列一致性之其變異體。

9. 如技術方案1至6中任一項之融合蛋白，其中該白蛋白結合部分包含單域抗體(sdAb)。

10. 如技術方案9之融合蛋白，其中該sdAb為VHH單域抗體。

11. 如技術方案1至10中任一項之融合蛋白，其中該白蛋白結合部分融合至細胞激素之C端。

12. 如技術方案1至10中任一項之融合蛋白，其中該白蛋白結合部分融合至細胞激素之N端。

13. 如技術方案1至12中任一項之融合蛋白，其中細胞激素及白蛋白結合部分係經由第一連接子連接。

14. 如技術方案13之融合蛋白，其中第一連接子之長度為約一至三十個胺基酸。

15. 如技術方案13或14之融合蛋白，其中第一連接子選自由SEQ ID NO: 12-26及158-159組成之群。

16. 如技術方案2至15中任一項之融合蛋白，其中抗原結合部分融合至細胞激素-ALBBM之C端。

17. 如技術方案2至15中任一項之融合蛋白，其中抗原結合部分融合至細胞激素-ALBBM之N端。

18. 如技術方案2至17中任一項之融合蛋白，其中抗原結合部分係經由第二連接子融合至細胞激素-ALBBM。

19. 如技術方案18之融合蛋白，其中第二連接子之長度為約一至三十個胺基酸。

20. 如技術方案18或19之融合蛋白，其中第二連接子為可裂解的。

21. 如技術方案20之融合蛋白，其中可裂解連接子為基質金屬蛋白酶、豆莢蛋白、間質蛋白酶或尿激酶敏感性的。

22. 如技術方案18至21中任一項之融合蛋白，其中第二連接子選自由SEQ ID NO: 12-45及158-159組成之群。

23. 如技術方案2至22中任一項之融合蛋白，其中抗原結合部分結合至腫瘤抗原。

24. 如技術方案23之融合蛋白，其中腫瘤抗原選自由以下組成之群：間皮素(「MSLN」)、GPA33、Her-2、EGFR及CD20。

25. 如技術方案23之融合蛋白，其中腫瘤抗原選自由以下組成之群：CEA、MUC16、MUC1、AFP、EPCAM、CD19、CD21、CD22、CD30、CD33、CD37、CD45、PSMA及BCMA。

26. 如技術方案2至25中任一項之融合蛋白，其中抗原結合部分為抗體或其片段。

27. 如技術方案2至26中任一項之融合蛋白，其中該抗原結合部分包含單域抗體(sdAb)。

28. 如技術方案27之融合蛋白，其中抗原結合部分包含VHH單域抗體。

29. 如技術方案27之融合蛋白，其中sdAb結合至間皮素。

30. 一種醫藥組合物，其包含如技術方案1至29中任一項之融合蛋白。

31. 一種治療個體之疾病或病況之方法，其包含向該個體投與如技術方案1至29中任一項之融合蛋白或如技術方案30之醫藥組合物。

32. 如技術方案31之方法，其進一步包含投與第二藥劑。

33. 一種治療個體之疾病或病況之方法，其包含向該個體投與a)包含i)細胞激素及ii)融合至細胞激素之半衰期延長域的融合蛋白；及b)第二藥劑。

34. 如技術方案33之方法，其中該半衰期延長域為白蛋白結合部分。

35. 如技術方案33之方法，其中該半衰期延長域為白蛋白。

36. 如技術方案33之方法，其中該半衰期延長域為Fc片段。

37. 如技術方案36之方法，其中該Fc片段選自由以下組成之群：IgG1、IgG2、IgG3及IgG4 Fc片段或其變異體。

38. 如技術方案37之方法，其中該Fc片段為IgG1 Fc片段或其變異體。

39. 如技術方案38之方法，其中該IgG1 Fc片段或其變異體包含位置297處之突變，其中位置297處之胺基酸係突變為丙胺酸、天冬胺酸或甘胺酸。

40. 如技術方案31至39中任一項之方法，其中該個體為人類。

41. 如技術方案31至40中任一項之方法，其中疾病或病況選自由以下組成之群：癌症、發炎性病況及感染。

42. 如技術方案41之方法，其中該疾病或病況為發炎疾病。

43. 如技術方案42之方法，其中細胞激素為IL-22。

44. 如技術方案42或43之方法，其中該疾病選自由以下組成之群：潰瘍性結腸炎、克羅恩氏病或潰瘍性迴腸炎，及腸移植物抗宿主病。

45. 如技術方案41之方法，其中該疾病或病況為癌症。

46. 如技術方案45之方法，其中癌症為實體或液體腫瘤。

47. 如技術方案45之方法，其中癌症係選自由以下組成之群：間皮瘤、肺癌、乳癌、卵巢癌、胰臟癌、淋巴瘤、白血病、頭頸癌、肝癌、食道癌、胃癌及結腸直腸癌。

48. 如技術方案47之方法，其中癌症係選自由以下組成之群：間皮瘤、肺癌、卵巢癌及胃癌。

49. 如技術方案45至48中任一項之方法，其中細胞激素選自由以下組成之群：IL-21、IL-7、IL-15、結合至IL-15Rα之IL-15或其片段及IL-33。

50. 如技術方案31至49中任一項之方法，其中融合蛋白約每三週投與一次至約一週投與兩次。

51. 如技術方案31至50中任一項之方法，其中各投與之融合蛋白的量為約100 ng/kg至約10 mg/kg。

52. 如技術方案31至51中任一項之方法，其中融合蛋白係非經腸投與至該個體。

53. 如技術方案52之方法，其中融合蛋白係靜脈內或皮下投與至該個體。

54. 如技術方案31至53中任一項之方法，其中融合蛋白在各治療週期投與至少約一週至六個月。

55. 如技術方案32至54中任一項之方法，其中第二藥劑包含治療抗體、免疫檢查點抑制劑、第二細胞激素、化學治療劑、酪胺酸激酶抑制劑或免疫細胞。

56. 如技術方案55之方法，其中第二藥劑為治療抗體。

57. 如技術方案56之方法，其中治療抗體結合至腫瘤抗原。

58. 如技術方案57之方法，其中腫瘤抗原選自由以下組成之群：間皮素(MSLN)、GPA33、Her-2 (ERBB2)、EGFR及CD20 (MS4A1)。

59. 如技術方案57之方法，其中腫瘤抗原選自由以下組成之群：CEA、MUC16、MUC1、AFP、EPCAM、CD19、CD21、CD22、CD30、CD33、CD37、CD45、PSMA及BCMA。

60. 如技術方案59之方法，其中腫瘤抗原為間皮素。

61. 如技術方案60之方法，其中第二藥劑為抗間皮素抗體或其片段。

62. 如技術方案61之方法，其中抗間皮素抗體或其片段包含單鏈抗體，該單鏈抗體包含抗間皮素重鏈可變區(抗MSLN VH)，其中：

a)該抗MSLN VH包含有包含SEQ ID NO: 46之胺基酸序列之CDR1、包含SEQ ID NO: 47之胺基酸序列的CDR2及包含SEQ ID NO: 48之胺基酸序列之CDR3，或在CDR中包含至多總共3、2或1個胺基酸取代之其變異體；或

b)該抗MSLN VH包含有包含SEQ ID NO: 49之胺基酸序列之CDR1、包含SEQ ID NO: 50之胺基酸序列的CDR2及包含SEQ ID NO: 51之胺基酸序列之CDR3，或在CDR中包含至多總共3、2或1個胺基酸取代之其變異體。

63. 如技術方案60至62中任一項之方法，其中結合至間皮素之第二藥劑約每月投與一次至約每週投與兩次。

64. 如技術方案60至63中任一項之方法，其中各投與之第二藥劑的量為約100 ng/kg至約100 mg/kg。

65. 如技術方案55中任一項之方法，其中第二藥劑為免疫檢查點調節劑。

66. 如技術方案65之方法，其中免疫檢查點調節劑為選自由以下組成之群的免疫檢查點蛋白之抑制劑：PD-L1、CTLA4、PD-L2、PD-1、4-1BB、CD47、TIGIT、GITR、TIM3、LAG3、CD27及B7H4。

67. 如技術方案66之方法，其中免疫檢查點蛋白為PD-1。

68. 如技術方案67之方法，其中第二藥劑為抗PD-1抗體或其片段。

69. 如技術方案67或68之方法，其中各投與之第二藥劑的量為約1 μg/kg至約100 mg/kg。

70. 如技術方案55之方法，其中第二藥劑為第二細胞激素。

71. 如技術方案70之方法，其中融合蛋白中之細胞激素為IL-21，且其中第二細胞激素選自由以下組成之群：IL-7、IL-15、結合至IL15Rα之IL15或其半衰期延長變異體。

72. 如技術方案55之方法，其中第二藥劑為免疫細胞。

73. 如技術方案72之方法，其中免疫細胞包含T細胞或NK細胞。

74. 如技術方案73之方法，其中免疫細胞包含表現嵌合抗原受體(CAR)之T細胞、表現經修飾T細胞受體(TCR)之T細胞或自腫瘤分離之T細胞。

75. 如技術方案55之方法，其中第二藥劑為酪胺酸激酶抑制劑。

76. 如技術方案32至75中任一項之方法，其中第二藥劑係非經腸或經口投與至該個體。

77. 如技術方案76之方法，其中第二藥劑係非經腸投與至該個體。

78. 如技術方案77之方法，其中第二藥劑係靜脈內投與至該個體。

79. 如技術方案32至78中任一項之方法，其中融合蛋白及第二藥劑係同時、並行或依序投與至該個體。實例

以下實例意欲僅例示本申請案且因此不應視為以任何方式限制本申請案。以下實例及詳細描述係藉助於說明而非作為限制提供。實例1：例示性IL-21融合蛋白

此實例說明本文提供之某些例示性IL-21融合蛋白。應理解，此實例中所述之例示性IL-21融合蛋白不意欲表示本發明之完整範疇。

IL-21-(HSA結合分子)-(抗MSLN)在本文中用於展示某些例示性IL-融合蛋白，其包含1) IL-21或其變異體，例如截短IL-21；2)結合至人類血清白蛋白(HSA)之肽(例如ABD或sdAb)；3)一或多種靶向腫瘤抗原間皮素(MSLN)之抗體或其抗原結合片段；4)由4-20個胺基酸構成之第一連接子(L1)，其連接IL-21之C端及αHSA之N端；及5)由4-20個胺基酸構成之第二連接子(L2)，其連接αHSA之C端及抗MSLN之N端。

IL-21可具有SEQ ID NO: 1之胺基酸序列。或者，IL-21可為具有SEQ ID NO: 2之胺基酸序列的截短人類IL-21。

關於HSA結合肽之一些選擇(SEQ ID NO: 3至SEQ ID NO: 11)，參見序列表。

例示性L1及L2連接子可獨立地選擇自SEQ ID NO:12-45及158-159。

在某些例示性IL-21融合蛋白中，抗MSLN功能模組包含兩個靶向間皮素之不同域的單域抗體(sdAb)，及兩個由第三連接子(L3)連接之sdAb，該第三連接子由4-20個胺基酸構成。L3連接子可選自SEQ ID NO: 14及19-22。

本發明實例之例示性IL-21融合蛋白之設計涵蓋上文所述之IL-21融合蛋白之各種組分的所有可能組合。實例2：產生抗MSLN單域抗體

兩種不同抗原肽用於對駱馬免疫接種以產生抗MSLN單域抗體(VHH抗體)。第一抗原肽(MSLN抗原1)表示細胞膜錨定MSLN。第二抗原肽(MSLN抗原2)表示細胞膜錨定MSLN之C端。此兩種肽之序列為如下： MSLN抗原1 (MSLN裂解形式) MSLN抗原2 (MSLN C端) VQKLLGPHVEGLKAEERHRPVRDWILRQRQDDLDTLGLGLQGGIPNGYLV

在免疫接種之後，外周單核細胞(PBMC)經分離以用於RNA提取。用編碼抗體基因之mRNA/cDNA構築VHH抗體噬菌體呈現文庫。構築之噬菌體呈現文庫係經由與抗原之多輪親和力結合進行篩選。陽性純系係經由ELISA鑑別。陽性純系之抗體基因經定序且選殖至UCOE載體(EMD Millipore)中用於CHO細胞表現。

例示性抗MSLN單域(VHH)抗體列於下表4中。例示性抗MSLN單域抗體之CDR序列列於下表5中。表 4 表 5 實例3：IL-21融合蛋白之分子選殖寡核苷酸合成

例示性寡核苷酸合成程序描述於下文。編碼人類IL-21全長(SEQ ID NO: 1)、人類IL-21截短(SEQ ID NO: 2)、G148-ABD-wt (SEQ ID NO: 3)、低免疫原性G148-ABD變異體(SEQ ID NO: 4-11)、靶向HSA之人類化sdAb及靶向MSLN之人類化sdAb (例如表4中所列之彼等)之cDNA序列係藉由使用GeneArt Gene Synthesis (ThermoFisher Scientific)或gBlocks Gene Fragments (Integrated DNA Technologies)之基因合成獲得，其中將NgoMIV限制酶位點及Kozak序列添加至5'且將SalI限制酶位點添加至3'。此等基因之密碼子使用針對表現於中國倉鼠卵巢(CHO)細胞中最佳化。合成寡核苷酸係藉由NgoMIV/SalI消化-連接方法插入至UCOE表現載體CET1019-AS-Puro (CS221284，Millipore Sigma)中。構築IL-21融合蛋白表現載體

IL-21融合蛋白表現載體之構築例示於本文中。IL-21之C端係經由肽連接子(L1)融合至白蛋白結合域或白蛋白結合sdAb (αHSA)之N端，且白蛋白結合域或白蛋白結合sdAb之C端係經由第二肽連接子(L2)與間皮素結合sdAb (抗MSLN)融合。編碼此等多肽之DNA序列可藉由Gibson Assembly (Synthetic Genomics)或類似活體外重組方法無縫組裝在一起。為了產生用於Gibson Assembly反應的與其相鄰片段具有重疊序列之DNA片段，在引物之5'端引入編碼L1或L2連接肽之20-40個鹼基對(bp)之重疊序列或CET1019-AS-Puro載體序列(參見圖2，步驟1)。在擴增之後，藉由使用PureLink凝膠提取套組(ThermoFisher Scientific)之凝膠提取來純化及收穫PCR產物。所需基因-連接子-載體組合之純化DNA片段係藉由Gibson Assembly Master Mix (New England BioLabs)或NEBuilder HiFi DNA Assembly Master Mix (New England BioLabs)根據製造商之方案混合及組裝在一起(參見圖2，步驟2)。

類似地，圖3說明當白蛋白結合分子為ABD時，本文提供之例示性IL-21融合蛋白之構築。

6His標籤可視情況融合至抗MSLN sdAb之C端。在此類狀況下，編碼6His之DNA序列係用作重疊序列以設計用於擴增抗MSLN之反向引物及擴增CET1019 AS-puro載體主鏈之正向引物。

在組裝反應之後，2 µl組裝產物用於根據製造商之方案轉型NEB 5-α勝任大腸桿菌細胞(New England BioLabs)。收集來自Amp選擇盤之菌落以使用PureLink Quick Plasmid Miniprep套組(ThermoFisher Scientific)及DNA定序驗證(ELIM Biopharmaceuticals)進行後續小規模製備。實例4：IL-21融合蛋白之表現及純化

編碼IL-21融合蛋白之DNA序列暫時表現於ExpiCHO細胞中。簡言之，在第-1天，在125 ml無擋板燒瓶中將CHO細胞以3-4×10e6個細胞/毫升接種於25 ml瞬時轉染培養基(BalanCD® Transfectory™ CHO，Irvine Scientific，#91147)中，加上4 mM麩醯胺酸。在第0天，將22.5 µg質體DNA與112.5 µg PEI在1.5 ml瞬時轉染培養基中混合且在室溫下培育7分鐘。接著將混合物緩慢添加至細胞。在第1天向細胞餵飼1) 0.5 mM丙戊酸(50 μl至25ml)，2) 10% post-TF補充物(Irvine Scientific #91148)，3) 1.5 ml葡萄糖儲備液(200 g/L)，及4)具有50 g/L TC Yeastolyte之5% IS Feed。在第8天收集CHO細胞用於親和管柱純化。實例5：活體外NK細胞增殖分析

人類NK細胞係使用陰性選擇套組-Kit II分離(所有珠粒獲自Miltenyi Biotech, Bergisch Gladbach, Germany)。純化係手動或用AutoMACS (Miltenyi)進行。細胞之純度始終受螢光活化細胞分選(FACS)控制且大於90%。經分離NK細胞用本文提供之融合蛋白(包括上文實例1中所述之彼等)處理。使用FACS分析用CD69信號監測NK細胞之增殖。實例6：活體外細胞毒性分析

將人類肺癌細胞A549與新近分離之人類PBMC混合且與0、5、10及50 ng/mL之純化IL-21融合蛋白一起培育。在使用MMP可裂解連接子之情況下，藉由添加MMP9以活化IL-21來建立平行實驗組。混合培養物培育至多72小時且MTS方法用於測定研究中裂解目標細胞之百分比。實例7：活體內功效研究

在第0天向Neu小鼠植入A549癌細胞。在腫瘤生長至大致50-100 mm³ 之後，小鼠經隨機分組且每隔一天用本文提供之IL-融合蛋白及對照(例如含同型對照抗體之PBS)治療。預期當相比於IL-21組合研究(用IL-21及第二藥劑組合治療的研究)時，本文提供之IL-21融合蛋白在相同劑量下顯示較好功效或在低得多的劑量下達成類似功效。

腫瘤尺寸及體重係在給藥之前的基線處量測。在治療後每週量測腫瘤尺寸及體重3次，持續兩週。收集末梢血樣品用於PK/PD分析。實例8.產生抗HSA單域抗體

自稻米表現之人類血清白蛋白(HSA)(Sigma, #A9731)用於對駱馬免疫接種以產生抗HSA單域抗體(V_H H抗體)。在免疫接種之後，外周單核細胞(PBMC)經分離以用於RNA提取。用編碼抗體基因之mRNA/cDNA構築VHH抗體噬菌體呈現文庫。構築之噬菌體呈現文庫係經由與抗原之多輪親和力結合進行篩選。陽性純系係經由Octet親和力量測(ForteBio, Octet RED96)鑑別。陽性純系之抗體基因經定序及選殖至UCOE載體(EMD Millipore, #CS221284)中用於中國倉鼠卵巢(CHO)細胞表現。

根據上文所述之方法產生9種例示性新穎抗HSA單域(V_H H)抗體。參見SEQ ID NO: 60-68。此9種例示性新穎V_H H抗體之CDR序列在序列表中列為SEQ ID NO: 69-95。在9種抗體中，一種抗體(P367)與人類、食蟹獼猴及小鼠血清白蛋白相互作用。剩下的抗體與人類及食蟹獼猴血清白蛋白相互作用。實例9 IL-21-抗HSA融合蛋白之分子選殖

IL-21-抗HSA融合蛋白表現載體之構築例示於本文中。編碼人類IL-21全長(SEQ ID NO: 1)之cDNA序列係藉由使用GeneArt Gene Synthesis (ThermoFisher Scientific)之基因合成獲得。此等基因之密碼子使用針對表現於中國倉鼠卵巢(CHO)細胞中最佳化。人類IL-21之C端經由肽連接子融合至抗HSA V_H H抗體之N端。編碼人類IL21、多肽連接子及抗HSA V_H H抗體之DNA序列可藉由組裝選殖(New England BioLabs, #E5520S)或類似活體外重組方法無縫組裝在一起。IL-21-抗HSA融合物之寡核苷係插入至UCOE表現載體CET1019-AS-Puro (EMD Millipore, #CS221284)中用於CHO細胞表現。

表6列出人類IL-21之序列。表 6 . 介白素 21

表7列出人類IL-21-抗HSA融合蛋白之例示性多肽連接子。表 7. 實例10 IL-21融合蛋白之表現及純化

編碼IL-21融合蛋白之DNA序列暫時表現於ExpiCHO細胞中。簡言之，在第-1天，ExpiCHO-S細胞(Gibco™，#A29127)以3-4×10e6個細胞/毫升ExpiCHO表現培養基(Gibco™，#A2910001)在通風錐形搖瓶中接種且置於125 rpm定軌振盪器上之具有8% CO₂ 之37℃培育箱中。在第0天，將質體DNA與Expifectamine CHO試劑(Gibco™，#A29129)混合。接著將混合物緩慢添加至細胞。在16小時之後，將細胞轉移至具有5% CO₂ 之32℃培育箱。在第1天及第5天向細胞餵飼ExpiCHO™ Feed (Gibco™，#A29129)兩次。在第8-12天收集CHO細胞用於親和管柱純化。

如圖4中所示，抗HSA抗體P367與人類、猴或小鼠血清白蛋白相互作用。P367-IgG1 Fc融合蛋白係裝載至蛋白A生物感測器上且浸入人類、猴或小鼠血清白蛋白中。著色線表示針對400 nM (深藍色)、200 nM (深紅色)及100 nM (淺藍色)之不同濃度之血清白蛋白的結合反應。原始實驗資料係藉由全局擬合(紅色)分析以測定KD。實例11：抗HSA結合物介白素21信號傳導效能與重組IL21類似

將Pfeiffer細胞維持於含有10%胎牛血清及青黴素/鏈黴素之RPMI-1640中。將100,000個Pfeiffer細胞在37C、5% CO₂ 下在含有10 mM HEPES之Hanks平衡鹽溶液中用指定濃度之重組人類IL-21 (rhIL-21)、P390 (小鼠IL-21-抗HSA，具有SEQ ID NO: 120之序列)或P394 (人類IL-21-抗HSA，具有SEQ ID NO: 121之序列)處理30分鐘。二氧磷基-STAT3係使用二氧磷基-STAT3 (Tyr705)均相時間分辨螢光(HTRF)分析(Cisbio)根據製造商說明書來量測。將665 nm/620 nm之信號比乘以1000、使用劑量反應曲線(Graphpad Prism)標繪且擬合以計算EC50。

如圖5及表8中所示，IL-21-抗HSA結合物顯示相對於重組人類IL-21等效的基於細胞之效能。表 8 . 不同 IL - 21 變異體之 EC50 實例12. ADCC分析

將NCI-N87及NCI-H226癌細胞株維持於含有10%胎牛血清及青黴素/鏈黴素之RPMI-1640中。在第0天，將10,000個NCI-N87細胞/孔及5,000個NCI-H226細胞/孔塗鋪於96孔平底盤中之培養基中。在第1天，NK細胞使用RosetteSep NK分離套組(Stemcell Technologies)自人類白血球層分離，且將100,000個NK細胞/孔連同指定治療劑添加至癌細胞。將盤在37C、5% CO₂ 下培育48小時，且細胞接著用4%三聚甲醛固定且用Sytox Orange進行細胞核染色。剩餘癌細胞之數目係藉由使用Cytation 1 (Biotek)計數各孔中剩餘之癌細胞核之數目來計算。較低細胞計數指示較好NK介導之細胞殺滅。(P303為抗MSLN抗體；P394為人類IL-21-抗HSA融合蛋白；P390為小鼠IL-21-抗HSA融合蛋白；P461/P462為人類IL-15/IL-15Rα-抗HSA融合蛋白)。

如圖6A及圖6B中所示，mIL-21及hIL-21抗HSA融合蛋白在與抗MSLN抗體組合時增強NK細胞ADCC活性。經增強ADCC之量值在IL-21抗HSA融合蛋白與rhIL-21之間類似。實例13. ADCC劑量反應

將NCI-N87及NCI-H226癌細胞株維持於含有10%胎牛血清及青黴素/鏈黴素之RPMI-1640中。在第0天，將10,000個NCI-N87細胞/孔及5,000個NCI-H226細胞/孔塗鋪於96孔平底盤中之培養基中。在第1天，NK細胞使用RosetteSep NK分離套組(Stemcell Technologies)自人類白血球層分離，且將100,000個NK細胞/孔連同指定治療劑添加至癌細胞。抗MSLN抗體P303以3 ng/ml (NCI-N87細胞)或20 ng/ml (NCI-H226細胞)添加至各孔中。將盤在37C、5% CO₂ 下培育48小時，且細胞接著用4%三聚甲醛固定且用Sytox Orange進行細胞核染色。剩餘癌細胞之數目係藉由使用Cytation 1 (Biotek)計數各孔中剩餘之癌細胞核之數目來計算。較低細胞計數指示較好NK介導之細胞殺滅。(P303為抗MSLN抗體；P394為人類IL-21-抗HSA融合蛋白；P390為小鼠IL-21-抗HSA融合蛋白；P461/P462 (SEQ ID NO: 123及124)及P461/P463 (SEQ ID NO: 123及125)均為人類IL-15/IL-15Rα-抗HSA融合蛋白；rhIL-15為重組人類IL-15)。

如圖6C及6D中所示，IL-21-抗HSA及IL-15-抗HSA均在與抗MSLN抗體組合時顯示降至0.6 ng/ml或更低之完全ADCC功效。實例14.全長及截短IL-21融合蛋白、具有不同連接子之融合蛋白以及N端及C端IL-21融合蛋白之活性。 A部分.

將Pfeiffer細胞維持於含有10%胎牛血清及青黴素/鏈黴素之RPMI-1640中。將100,000個Pfeiffer細胞在37C、5%CO2下在含有10 mM HEPES之Hanks平衡鹽溶液中用指定濃度之重組人類IL-21 (rhIL-21)、P394 (人類IL-21-GSG4-抗HSA，具有SEQ ID NO: 121之序列)、P593 (人類IL-21(1-122)-A(EAAAK)4A-抗HSA)、P636 (人類IL-21(1-119)-GSG4-抗HSA)、P637 (人類IL-21(1-120)-GSG4-抗HSA)、P744 (人類IL-21(1-122)-A(EAAAK)4A-抗HSA)、P748 (抗HSA-A(EAAAK)4A-人類IL-21 (1-122)、P750 (人類IL-21-GSG4-抗HSA)、P751 (人類IL-21-A(EAAAK)4A-抗HSA)及P783 (人類IL-21 (1-122)-A(EAAAK)4A-抗HSA)處理30分鐘。二氧磷基-STAT3係使用二氧磷基-STAT3 (Tyr705)均相時間分辨螢光(HTRF)分析(Cisbio)根據製造商說明書來量測。將665 nm/620 nm之信號比乘以1000、使用劑量反應曲線(Graphpad Prism)標繪且擬合以計算EC50。

所有融合蛋白顯示類似IL-21R信號傳導活性，表明測試之截短變異體、測試之不同連接子及測試之C端相對於N端IL-21融合物不影響IL-21信號傳導(圖7A)。 B部分.

將NCI-N87癌細胞株維持於含有10%胎牛血清及青黴素/鏈黴素之RPMI-1640中。在第0天，將10,000個NCI-N87細胞/孔及5,000個NCI-H226細胞/孔塗鋪於96孔平底盤中之培養基中。在第1天，NK細胞使用RosetteSep NK分離套組(Stemcell Technologies)自人類白血球層分離，且將100,000個NK細胞/孔連同指定治療劑添加至癌細胞。將盤在37C、5% CO₂ 下培育48小時，且細胞接著用4%三聚甲醛固定且用Sytox Orange進行細胞核染色。剩餘癌細胞之數目係藉由使用Cytation 1 (Biotek)計數各孔中剩餘之癌細胞核之數目來計算。較低細胞計數指示較好NK介導之細胞殺滅。(P394 (人類IL-21-GSG4-抗HSA，具有SEQ ID NO:121之序列)、P593 (人類IL-21(1-122)-A(EAAAK)4A-抗HSA)、P636 (人類IL-21(1-119)-GSG4-抗HSA)、P637 (人類IL-21(1-120)-GSG4-抗HSA)、P744 (人類IL-21(1-122)-A(EAAAK)4A-抗HSA)、P748 (抗HSA-A(EAAAK)4A-人類IL-21 (1-122)、P750 (人類IL-21-GSG4-抗HSA)、P751 (人類IL-21-A(EAAAK)4A-抗HSA)及P783 (人類IL-21 (1-122)-A(EAAAK)4A-抗HSA))。

所有融合蛋白在與抗MSLN抗體組合時顯示類似ADCC功能，表明測試之截短變異體(WT相對於C端截短)、測試之不同連接子(GSG4相對於A(EAAAK)4A)及測試之C端相對於N端IL-21融合物不影響NK細胞之IL-21活化(圖7B及7C)。實例15. IL-21-抗HSA融合蛋白之藥物動力學評估

向Balb/cJ小鼠腹膜內注射在100 ul PBS中稀釋之rhIL-21、P325或P394。在給藥前抽血之後，小鼠在化合物注射之後的0.5、2、6、24、48、72、96小時(對於P394)或在化合物注射之後的0.25、0.5、1、2、6、24、48、72小時(對於rhIL-21及P325)抽血。將血液置於具有EDTA之微採血器(BD)中以防止凝血。IL-21蛋白使用IL-21 ELISA (Life Technologies)根據製造商說明書以各化合物充當其自身標準來定量。

3 µg 重組人類IL-21、3 µg P325 (人類IL-21無關奈米抗體)及3或30 µg P394 (人類IL-21-抗HSA)於小鼠中之藥物動力學評估顯示P394增加之半衰期及暴露，表明IL-21與抗HSA結合之影響。(圖8)

抗HSA與IL-21結合增加活體內半衰期及暴露。實例16. IL-21融合蛋白之表徵 A部分. HPLC及SDS-PAGE

在純化IL-21融合蛋白之後，其尺寸及純度係藉由SDS-PAGE及/或高效液相層析(HPLC)測定。對於SDS-PAGE，使用NuPAGE 4-12% Bis-Tris蛋白質凝膠預製凝膠(Thermofisher)且將大約1 µg之蛋白質裝載至各孔中。在電泳之後，蛋白質凝膠上之蛋白質經固定且用InstantBlue Protein Stain (Expedeon)染色。如圖9A中所示，與最佳化連接子組合，截短IL-21(1-122)-A(EAAAK)4A-抗HSA融合蛋白(AWT-593)相比於全長IL-21-(GSG)4-抗HSA融合蛋白(AWT-P394，通道1)顯示減少之降解(通道3)。

此外，如圖9F及9G中所示，P748，抗HSA-A(EAAAK)4A-IL21(1-122) (P748)(圖9G中之通道1)顯示比P593 (圖9F中之通道3)及P394 (圖9F中之通道1)更減少之降解，其表明在抗HSA抗體之c端的IL21融合物降低生產期間的蛋白質分裂。

對於HPLC，該分析係在Shimadzu LC-2030C HPLC系統上進行。使用25 mM磷酸鈉、500 mM氯化鈉緩衝液，pH 6.5將大約5 µg樣品以0.25 mL/min注射至AdvanceBio 300Å，2.7 µM，4.6×300 mm尺寸排阻管柱(Agilent)上。資料係藉由LabSolutions軟體(Shimadzu)使用運行後(Post-run)進行分析。可在12.5分鐘處偵測到由＞95%總蛋白質樣品構成之單峰。圖9B顯示AWT-P394 IL-21-抗HSA融合蛋白之代表性層析圖。 B部分.調配物

為了快速評估不同分子設計之最佳調配條件及穩定性，二步純化之IL-21融合蛋白係緩衝液更換至由不同pH (3-7)下之不同量之組胺酸(5-20 mM)及NaCl (0-100 mM)與0.02% Tween 80構成之不同緩衝液中。將蛋白質樣品自40℃逐漸加熱至80℃且各樣品之即時蛋白質尺寸分佈係藉由使用DynaPro Plate Reader III (Wyatt Technology)之動態光散射(DLS)測定。在二步純化之後，超過99%之IL-21-抗HSA融合蛋白小於10 nM。在溫度勻變期間，在蛋白質調配物中誘導聚集所需之最低溫度測定為T_起始。在所有測試條件下給出最高T_起始 (＞80℃)之最佳調配物為pH 4.0下之5 mM組胺酸、25 mM NaCl及0.02% Tween 80。參見圖9C-9D。

如圖9D中所示，IL-21截短及連接子最佳化之組合亦促進蛋白質穩定性之改良。相比於全長人類IL-21-(GSG)4-抗HSA融合蛋白，具有最佳化連接子之截短IL-21顯著(AWT-P593)增加T_起始，指示指定調配條件下極大改良之穩定性。 C部分.結合親和力

人類IL-21受體結合至IL-21-抗HSA融合蛋白AWT-P394或AWT-P593。Octet RED96 (ForteBio)係用於表徵相互作用。簡言之，人類IL-21受體-hgG1 Fc融合蛋白係裝載至AHC生物感測器上且浸入100 nM濃度之AWT-P394或AWT-P593中。原始實驗資料係藉由全局擬合分析以測定K_D 。參見圖9E。實例17.抗HSA抗體

白蛋白為人類血清中最豐富之蛋白質且其具有三週之半衰期。血清白蛋白之長半衰期在很大程度上歸因於新生兒Fc受體(FcRn)之保護。血清白蛋白可經由稱為流體相胞飲之過程經體細胞吸收。胞飲小泡隨後與內體區室融合，其中pH在4.5-6.5範圍內。若小泡中之蛋白質自其受體釋放，則其將針對溶酶體降解進一步分選。血清白蛋白與FcRn之間的結合僅在酸性pH (＜6.5)下出現，允許FcRn自核內體解救白蛋白且將其再循環回血清中(Grevys等人, 2018)。因此，作為白蛋白依賴性半衰期延長部分，抗HSA抗體需要保留其在中性及酸性pH兩者下之結合親和力。

Octet RED96 (ForteBio)用於表徵在pH 7.4及pH 5.5下的AWT-610與人類或猴血清白蛋白之間的相互作用。簡言之，將AWT-P610-hgG1 Fc融合蛋白裝載至蛋白A生物感測器上且浸入pH 7.4 (左圖)或pH 5.5 (右圖)下之人類(藍色線)或猴(深紅色線)血清白蛋白中。參見圖10A。

原始實驗資料係藉由全局擬合(紅色)分析以測定K_D 。特定言之，三種不同抗HSA抗體與pH 7.4及pH 5.5下之人類及猴血清白蛋白相互作用。結合係使用Octet RED96 (ForteBio)來量測且K_D 係藉由使用Octet Data Analysis HT軟體之全局擬合測定。表9顯示pH 5.5及pH 7.4下之三種不同Anwita抗HSA抗體之計算KD。一般而言，抗體顯示與pH 5.5下之人類血清白蛋白之結合親和力的略微增加。表 9

評估抗HSA抗體AWT-P367及其人類化型式AWT-P494之T_起始。AWT-P367及AWT-P494係緩衝液更換至1× PBS pH 7.4中。將蛋白質樣品自40℃逐漸加熱至80℃且各樣品之即時蛋白質尺寸分佈係藉由使用DynaPro盤讀取器III (Wyatt Technology)之動態光散射(DLS)測定。如圖10B中所示，AWT-P494顯示相比於AWT-P367略微增加之T_起始。

評估抗HSA抗體AWT-P342及其全人類化型式AWT-P610之T_起始。AWT-P342及AWT-P610係緩衝液更換至1× PBS pH 7.4中。將蛋白質樣品自40℃逐漸加熱至80℃且各樣品之即時蛋白質尺寸分佈係藉由使用DynaPro盤讀取器III (Wyatt Technology)之動態光散射(DLS)測定。如圖10C中所示，AWT-P610顯示相比於AWT-P342減小之T_起始。

Octet RED96 (ForteBio)用於表徵抗HSA抗體AWT-P367或其人類化型式AWT-P494與人類、猴或小鼠白蛋白之間的相互作用。簡言之，AWT-P367或AWT-P494係裝載至AHC生物感測器上且浸入200 nM濃度之人類、猴或小鼠血清白蛋白中。原始實驗資料係藉由全局擬合分析以測定K_D 。如圖10D-10E中所示，人類化抗HSA抗體AWT-P494之結合親和力與其原始純系AWT-P367類似。實例18：用於抑制癌細胞之抗間皮素抗體、細胞激素或細胞激素融合蛋白

將NCI-N87癌細胞株維持於含有10%胎牛血清及青黴素/鏈黴素之RPMI-1640中。在第0天，將10,000個NCI-N87細胞/孔塗鋪於96孔平底盤中之培養基中。在第1天，NK細胞使用RosetteSep NK分離套組(Stemcell Technologies)自人類白血球層分離，且將100,000個NK細胞/孔連同指定治療劑添加至癌細胞。將盤在37C、5% CO₂ 下培育48小時，且細胞接著用4%三聚甲醛固定且用Sytox Orange進行細胞核染色。剩餘癌細胞之數目係藉由使用Cytation 1 (Biotek)計數各孔中剩餘之癌細胞核之數目來計算。較低細胞計數指示較好NK介導之細胞殺滅。(P303-R3C7抗MSLN抗體、具有減少之岩藻糖基化之P303F-R3C7抗間皮素抗體、P394-人類IL-21-抗HSA、P390-小鼠IL-21-抗HSA、P431/435-人類IL-21-抗HSA-IgG1-R3C7、P479-抗HSA-人類-IL-15 RA Sushi/IL-15、P480-抗HSA-人類-IL-15 RA Sushi/IL-15、rhIL-21-重組人類IL-21、rhIL -15-重組人類IL-15)

如圖11中所示，相比於單獨的P303，rhIL-21、mIL-21 (P390)及hIL-21 (P394)抗HSA融合蛋白在與抗MSLN抗體P303 (R3C7)組合時在類似程度上增強NK細胞ADCC活性。此外，相比於單獨的P303，rhIL-15及hIL-15/IL-15RA抗HSA融合蛋白(P479及P480)在與抗MSLN抗體P303 (R3C7)組合時在類似程度上增強NK細胞ADCC活性。細胞激素-抗HSA融合蛋白相比於等效重組細胞激素維持完全ADCC活性。實例19：用於抑制癌細胞之單獨或與賀癌平組合之抗間皮素抗體

將NCI-N87癌細胞株維持於含有10%胎牛血清及青黴素/鏈黴素之RPMI-1640中。在第0天，將10,000個NCI-N87細胞/孔塗鋪於96孔平底盤中之培養基中。在第1天，NK細胞使用RosetteSep NK分離套組(Stemcell Technologies)自人類白血球層分離，且將100,000個NK細胞/孔連同指定治療劑添加至癌細胞。將盤在37C、5% CO2下培育48小時，且細胞接著用4%三聚甲醛固定且用Sytox Orange進行細胞核染色。剩餘癌細胞之數目係藉由使用Cytation 1 (Biotek)計數各孔中剩餘之癌細胞核之數目來計算。較低細胞計數指示較好NK介導之細胞殺滅。(P303F-具有減少之岩藻糖基化的Anwita抗間皮素抗體，P380-人類IL-33-抗HSA，P394-人類IL-21-抗HSA)

如圖12中所示，P303F (R3C7抗間皮素抗體)比賀癌平在NK細胞ADCC中更強力且P303F及賀癌平之組合與單獨的P303F類似。添加P394 (人類IL-21-抗HSA)至P303F及賀癌平產生顯著改良之ADCC功能及改良之效能。實例20：用於抑制癌細胞之細胞激素融合蛋白

將Pfeiffer癌細胞株維持於含有10%胎牛血清及青黴素/鏈黴素之RPMI-1640中。在第1天，將10,000個Pfeiffer細胞/孔塗鋪於96孔平底盤中之培養基中。NK細胞使用RosetteSep NK分離套組(Stemcell Technologies)自人類白血球層分離，且將30,000個NK細胞/孔連同指定治療劑添加至癌細胞。將盤在37C、5% CO2下培育24小時，且細胞接著用1 μM碘化丙錠染色以用於FACS分析。Pfeiffer細胞係基於FSC及SSC閘控與NK細胞分離且測定總Pfeiffer細胞計數。使用PI染色測定Pfeiffer死細胞。總活細胞係藉由自總Pfeiffer細胞計數減去PI陽性來計算。較低活細胞計數指示較好NK介導之細胞殺滅。(p394-人類IL-21-抗HSA，P480-抗HSA-人類-IL-15 RA Sushi/IL-15)

如圖13中所示，相對於彌漫性大B細胞淋巴瘤細胞株Pfeiffer，人類IL-21-抗HSA融合蛋白(P394)、人類IL-15/IL-15R sushi-抗HSA融合蛋白(P480)及rhIL-15在與美羅華(Rituxan)組合時增強NK細胞ADCC活性。實例21：用於抑制癌細胞之單獨或與細胞激素融合蛋白組合之抗間皮素抗體

將NCI-N87癌細胞株維持於含有10%胎牛血清及青黴素/鏈黴素之RPMI-1640中。在第0天，將10,000個NCI-N87細胞/孔塗鋪於96孔平底盤中之培養基中。在第1天，NK細胞使用RosetteSep NK分離套組(Stemcell Technologies)自人類白血球層分離，且將100,000個NK細胞/孔連同指定治療劑添加至癌細胞。將盤在37C、5% CO2下培育24小時，且細胞接著用4%三聚甲醛固定且用Sytox Orange進行細胞核染色。剩餘癌細胞之數目係藉由使用Cytation 1 (Biotek)計數各孔中剩餘之癌細胞核之數目來計算。較低細胞計數指示較好NK介導之細胞殺滅。(P303F-具有減少之岩藻糖基化的Anwita抗間皮素IgG1抗體R3C7，P480-抗HSA-人類-IL-15 RA Sushi/IL-15，rhIL-21-重組人類IL-21，rhIL -15-重組人類IL-15)

如圖14中所示，相比於P303F及P303F與rhIL-21，rhIL-15及IL-15-抗HSA (P480)在與抗MSLN抗體P303F組合時更好地增強NK細胞ADCC活性。P480 (IL-15/IL-15R sushi-抗HSA)以相比於rhIL-15類似的效能及量值增強NK介導之ADCC，表明在抗體融合蛋白中保留完全IL-15活性。實例23：用於抑制癌細胞之IL-15-抗HSA融合蛋白

將NCI-N87癌細胞株維持於含有10%胎牛血清及青黴素/鏈黴素之RPMI-1640中。在第0天，將10,000個NCI-N87細胞/孔塗鋪於96孔平底盤中之培養基中。在第1天，NK細胞使用RosetteSep NK分離套組(Stemcell Technologies)自人類白血球層分離，且將100,000個NK細胞/孔連同指定治療劑添加至癌細胞。將盤在37C、5% CO2下培育48小時，且細胞接著用4%三聚甲醛固定且用Sytox Orange進行細胞核染色。剩餘癌細胞之數目係藉由使用Cytation 1 (Biotek)計數各孔中剩餘之癌細胞核之數目來計算。較低細胞計數指示較好NK介導之細胞殺滅。(P303-Anwita抗間皮素抗體R3C7，P480-抗HSA-人類-IL-15 RA Sushi/IL-15，P597-抗HSA-人類-IL-15 RA Sushi-肽連接子-IL-15，rhIL-15-重組人類IL-15)。

如圖15中所示，相比於P480 (一種在IL-15R sushi與IL-15之間無連接子(在分裂F2A連接子^[1] 之後)之抗HSA融合蛋白)，在IL-15R sushi與IL-15之間具有肽連接子之抗HSA融合蛋白P597改良ADCC活性。P597之ADCC效能與rhIL-15類似，表明在融合蛋白中保留完全IL-15活性。實例24：用於抑制癌細胞之IL-21融合蛋白

將NCI-N87及H226癌細胞株維持於含有10%胎牛血清及青黴素/鏈黴素之RPMI-1640中。在第0天，將10,000個NCI-N87細胞/孔、5000個H226細胞/孔塗鋪於96孔平底盤中之培養基中。在第1天，NK細胞使用RosetteSep NK分離套組(Stemcell Technologies)自人類白血球層分離，且將100,000個NK細胞/孔連同指定治療劑添加至癌細胞。將盤在37C、5% CO2下培育48小時，且細胞接著用4%三聚甲醛固定且用Sytox Orange進行細胞核染色。剩餘癌細胞之數目係藉由使用Cytation 1 (Biotek)計數各孔中剩餘之癌細胞核之數目來計算。較低細胞計數指示較好NK介導之細胞殺滅。(P129-Anwita抗間皮素抗體R2G12，P126-人類IL-21-R2G12-IgG1融合物，P107-人類IL-21-IgG1融合物，P325-人類IL-21-R2D2融合物，P286/288-人類IL-21-R3C7-IgG1-R2G12融合物)。

如圖16中所示，較低濃度之IL-21-Fc融合蛋白(P107、P126、P288/286)在與抗MSLN抗體P129 (亦即，R2G12)組合時增強NK細胞ADCC活性。然而，在較高濃度(＞100nM)下，IL-21-Fc融合蛋白(P107、P126、P288/286)在與抗MSLN抗體P129 (R2G12)組合時抑制NK細胞ADCC活性。未針對無Fc域之IL-21或IL-21融合蛋白(P325)觀測到此抑制。實例25：用於抑制癌細胞之IL-21-抗HSA融合蛋白與抗間皮素抗體之組合

將NCI-N87癌細胞維持於含有10%胎牛血清及青黴素/鏈黴素之RPMI-1640中。在第0天，將10,000個NCI-N87細胞/孔塗鋪於96孔平底盤中之培養基中。在第1天，NK細胞使用RosetteSep NK分離套組(Stemcell Technologies)自人類白血球層分離，且將100,000個NK細胞/孔連同指定治療劑添加至癌細胞。將盤在37C、5% CO2下培育48小時，且細胞接著用4%三聚甲醛固定且用Sytox Orange進行細胞核染色。剩餘癌細胞之數目係藉由使用Cytation 1 (Biotek)計數各孔中剩餘之癌細胞核之數目來計算。較低細胞計數指示較好NK介導之細胞殺滅。(P197-Anwita抗間皮素抗體R2G12，P390-小鼠IL-21-抗HSA，P394-人類IL-21-抗HSA)

如圖17中所示，小鼠及人類IL-21-抗HSA融合蛋白(P390及P394)均在與抗MSLN抗體P197 (R2G12)組合時有力地增強NK細胞ADCC活性。實例26：PBMC在與細胞激素或細胞激素-抗HSA融合蛋白一起培育之後的細胞激素產生

自人類白血球層分離之冷凍PBMC細胞經解凍且在含有10%胎牛血清及青黴素/鏈黴素之RPMI-1640中生長。在第1天，將30,000個PBMC細胞/孔與指定治療劑一起添加至96孔盤。將盤在37C、5% CO₂ 下培育隔夜。在第2天，收集培養基且離心以將PBMC細胞製成集結粒。在IFNγ及IL-6 ELISA分析中測試25 μl培養基之細胞激素釋放。(P394-人類IL-21-抗HSA，P597-抗HSA-人類-IL-15 RA Sushi(plus)-IL-15)

如圖18A-18B中所示，陽性對照植物血球凝集素(PHA)刺激自PBMC之穩定IFNg及IL-6分泌。PBMC不回應於rIL-21或IL-21-抗HSA融合蛋白P394刺激而分泌IFNg或IL-6。rIL-15及IL-15-抗HSA融合蛋白P597在類似程度上藉由PBMC刺激IFNg及IL-6分泌，表明融合蛋白具有針對重組蛋白之類似活性。IL-12藉由PBMC刺激IFNg分泌，但不刺激IL-6分泌。IL-7及IL-2刺激極小水準之IFNg及IL-6分泌。實例27.用於治療癌症之單獨或呈組合形式之IL-21-抗HSA融合蛋白、抗HSA-IL-15Ra-IL-15融合蛋白及抗CTLA4 A部分.

將MC38細胞培養及維持於補充有10% FBS+glutamax+NEAA+丙酮酸鈉+青黴素/鏈黴素之DMEM培養基中。細胞經胰蛋白酶處理、用培養基洗滌且計數。細胞接著用PBS洗滌，且使用18標準尺寸的針將0.5×10⁶ 個細胞(於50 μl PBS中)皮下注射至經麻醉C57BL/6小鼠(Taconic)中。儲備研究藥物在給藥當天於PBS中稀釋至適當濃度，且每週兩次地向動物腹膜內投配PBS，含25 µg P394 (人類IL-21-抗HSA)、100 µg 抗CTLA-4或25 µg P394與100 µg 抗CTLA-4之組合之100 μl PBS，持續總共5個劑量。使用數位卡尺每週兩次地收集腫瘤量測值(長度(L)及寬度(W))，且計算腫瘤體積(L×W×W)/2。

如圖19A中所示，P394及抗CTLA-4單一療法能夠相對於PBS對照降低腫瘤生長。相對於P394及抗CTLA-4單一療法，P394及抗CTLA-4之組合進一步降低腫瘤生長。 B部分.

將MC38細胞培養及維持於補充有10% FBS+glutamax+NEAA+丙酮酸鈉+青黴素/鏈黴素之DMEM培養基中。細胞經胰蛋白酶處理、用培養基洗滌且計數。細胞接著用PBS洗滌，且使用18標準尺寸的針將0.5×10⁶ 個細胞(於50 μl PBS中)皮下注射至經麻醉C57BL/6小鼠(Taconic)中。儲備研究藥物在給藥當天於PBS中稀釋至適當濃度，且每週兩次地向動物腹膜內投配PBS，含100 µg 抗CTLA-4、100 µg 抗CTLA-4與25 µg P394 (人類IL-21-抗HSA)、100 µg 抗CTLA-4與5 µg P597 (抗HSA-IL-15Ra-IL-15)或100 µg 抗CTLA-4與25 µg P394及5 µg P597之100 μl PBS，持續總共5個劑量。使用數位卡尺每週兩次地收集腫瘤量測值(長度(L)及寬度(W))，且計算腫瘤體積(L×W×W)/2。

如圖19B中所示，儘管抗CTLA-4、抗CTLA-4與P394及抗CTLA-4與P597均降低腫瘤生長，但抗CTLA-4與P394及P597之三重組合在所有測試組合中最大程度地降低腫瘤生長。實例28.用於治療癌症之單獨或呈組合形式之IL-21-抗HSA融合蛋白及抗HSA-IL-15Ra-IL-15融合蛋白

將MC38細胞培養及維持於補充有10% FBS+glutamax+NEAA+丙酮酸鈉+青黴素/鏈黴素之DMEM培養基中。細胞經胰蛋白酶處理、用培養基洗滌且計數。細胞接著用PBS洗滌，且使用18標準尺寸的針將0.5×10⁶ 個細胞(於50 μl PBS中)皮下注射至經麻醉C57BL/6小鼠(Taconic)中。儲備研究藥物在給藥當天於PBS中稀釋至適當濃度，且每週兩次地向動物腹膜內投配PBS，含25 µg P394 (人類IL-21-抗HSA)、5 µg P597 (抗HSA-IL-15Ra-IL-15)或25 µg P394與5 µg P597之組合之100 μl PBS，持續總共5個劑量。使用數位卡尺每週兩次地收集腫瘤量測值(長度(L)及寬度(W))，且計算腫瘤體積(L×W×W)/2。

P394及P597單一療法相對於PBS對照降低腫瘤生長。P394加P597之組合療法相對於P394及P597單一療法進一步降低腫瘤生長(圖20)。實例29：同基因型小鼠模型中之活體內抗腫瘤活性分析

將MC38鼠類結腸癌細胞(3×10⁶ 個細胞)在第0天皮下植入至C57BL/6小鼠之側腹中。在第4、8、12及16天，小鼠用PBS、100 µg 抗PD-1、25 µg P390 (mIL-21-抗HSA)、100 µg 抗PD-1及25 µg P390或100 µg 抗PD-1及5 µg P390治療。腫瘤尺寸係在指定天數使用卡尺量測且計算腫瘤體積。

如圖21中所示，小鼠IL-21-抗HSA (P390)單一療法顯著減緩腫瘤生長。小鼠IL-21-抗HSA (P390)及抗PD-1之組合消除或縮小所有小鼠之腫瘤。實例30：用於治療癌症之抗間皮素抗體及/或IL-21-抗HSA融合蛋白

將NCI-N87細胞培養及維持於補充有10% FBS+glutamax+青黴素/鏈黴素之RPMI培養基中。細胞經胰蛋白酶處理、用培養基洗滌且計數。細胞接著用PBS洗滌，且使用23標準尺寸的針將3×10⁶ 個細胞(於100 μl PBS中)皮下注射至經麻醉NSG小鼠(Jackson)中。在6天之後，將10×10⁶ 個人類PBMC在100 μL PBS中注射至每隻小鼠之尾部靜脈中。儲備研究藥物在給藥當天於PBS中稀釋至適當濃度，且每週兩次地向動物腹膜內投配100 μg P303F (抗間皮素抗體)、25 μg P394 (人類IL-21-抗HSA)或100 μg P303F與25 μg或5 μg P394之組合，持續總共5個劑量。使用數位卡尺每週兩次地收集腫瘤量測值(長度(L)及寬度(W))，且計算腫瘤體積(L×W×W)/2。

如圖22中所示，P303F相對於對照降低腫瘤生長。相對於PBS對照或單獨的P303F，所有接受單獨或與P303F組合之P394之小鼠的腫瘤生長顯著降低。實例31：用於治療癌症之單獨或與賀癌平組合之IL-21-抗HSA融合蛋白

將NCI-N87細胞培養及維持於補充有10% FBS+glutamax+青黴素/鏈黴素之RPMI培養基中。細胞經胰蛋白酶處理、用培養基洗滌且計數。細胞接著用PBS洗滌，且使用23標準尺寸的針將3×10⁶ 個細胞(於100 μl PBS中)皮下注射至經麻醉NSG小鼠(Jackson)中。在6天之後，將10×10⁶ 個人類PBMC在100 μL PBS中注射至每隻小鼠之尾部靜脈中。儲備研究藥物在給藥當天於PBS中稀釋至適當濃度，且每週兩次地向動物腹膜內投配20 µg賀癌平(抗Her2抗體)、25 μg P394 (人類IL-21-抗HSA)或20 µg賀癌平與25 μg或5 μg P394之組合，持續總共5個劑量。使用數位卡尺每週兩次地收集腫瘤量測值(長度(L)及寬度(W))，且計算腫瘤體積(L×W×W)/2。

如圖23中所示，相對於PBS對照，賀癌平及25 µg P394單一療法降低腫瘤生長。相比於賀癌平或P394單一療法，賀癌平及25 µg P394之組合進一步降低腫瘤生長，顯示加性抗腫瘤效應。實例32：用於治療癌症之抗間皮素抗體及/或IL-21-抗HSA融合蛋白

將NCI-N87細胞培養及維持於補充有10% FBS+glutamax+青黴素/鏈黴素之RPMI培養基中。細胞經胰蛋白酶處理、用培養基洗滌且計數。細胞接著用PBS洗滌，且使用18標準尺寸的針將3×10⁶ 個細胞(於100 μl PBS中)皮下注射至經麻醉SCID小鼠(Taconic)中。儲備研究藥物在給藥當天於PBS中稀釋至適當濃度，且每週兩次地向動物腹膜內投配含100 μg P303F (抗間皮素抗體)或P303F與25 μg P390 (小鼠IL-21-抗HSA)、5 μg P390或2.5 μg重組小鼠IL-21 (等效於5 μg P390劑量之莫耳濃度)之組合之100 μl PBS，持續總共5個劑量。使用數位卡尺每週兩次地收集腫瘤量測值(長度(L)及寬度(W))，且計算腫瘤體積(L×W×W)/2。

如圖24中所示，相比於PBS對照、P303F單一療法及P303F與rmIL-21之組合，P303F及25 μg或5 μg P390之組合產生顯著降低之腫瘤生長。P303F與2.5 μg rmIL-21顯示與P303F類似之腫瘤生長，表明重組IL-21在此劑量下無效。相比於P303F與2.5 μg rmIL-21，P303F與5 μg P390之組合顯示顯著降低之腫瘤生長，突出半衰期延長IL-21相比於重組細胞激素改良之功效。實例33：用於治療癌症之IL-21-抗HSA融合蛋白

將MC38鼠類結腸癌細胞(1×10⁶ 個細胞)在第0天皮下植入至C57BL/6小鼠之側腹中。小鼠每週兩次地用PBS、25 µg P390 (小鼠IL-21-抗HSA)或重組小鼠IL-21治療，持續2週(4個總劑量)。使用數位卡尺每週三次地收集腫瘤量測值(長度(L)及寬度(W))，且計算腫瘤體積(L×W×W)/2。

如圖25中所示，P390 (小鼠IL-21-抗HSA)相比於PBS對照降低MC38腫瘤之腫瘤生長，但等效莫耳濃度之12.5 µg重組小鼠IL-21相對於PBS對照對腫瘤生長具有極小效應。相對於重組IL-21，IL-21-抗HSA (P390)在同基因型小鼠結腸癌模型中具有優良抗腫瘤功效。實例34：用於治療癌症之IL-21-抗HSA融合蛋白與抗PD-1抗體之組合

將經人類間皮素轉染之CT26小鼠細胞(CT26/MSLN)培養及維持於補充有10% FBS+glutamax+青黴素/鏈黴素之RPMI培養基中。細胞經胰蛋白酶處理、用培養基洗滌且計數。細胞接著用PBS洗滌，且使用23標準尺寸的針將1×10⁶ 個細胞(於100 μl PBS中)皮下注射至經麻醉BALB/C小鼠中。儲備研究藥物在給藥當天於PBS中稀釋至適當濃度，且每週兩次地向動物腹膜內投配5 mg/kg抗PD-1抗體、1.25 mg/kg P390 (小鼠IL-21-抗HSA)或抗PD-1與P390之組合，持續總共4個劑量。使用數位卡尺每週兩次地收集腫瘤量測值(長度(L)及寬度(W))，且計算腫瘤體積(L×W×W)/2。

如圖26中所示，抗PD-1及P390單一療法相對於PBS對照對腫瘤生長具有極小效應。抗PD-1及P390之組合產生腫瘤生長之協同降低，其中5隻小鼠中之4隻在第22天不具有可量測腫瘤。實例35：用於治療癌症之IL-21-抗HSA融合蛋白與抗PD-1抗體之組合

將MC38細胞培養及維持於補充有10% FBS+glutamax+NEAA+丙酮酸鈉+青黴素/鏈黴素之DMEM培養基中。細胞經胰蛋白酶處理、用培養基洗滌且計數。細胞接著用PBS洗滌，且使用18標準尺寸的針將0.5×10⁶ 個細胞(於50 μl PBS中)皮下注射至經麻醉C57BL/6小鼠(Taconic)中。儲備研究藥物在給藥當天於PBS中稀釋至適當濃度，且每週兩次地向動物腹膜內投配PBS，含100 µg抗PD-1抗體、25 µg P394 (人類IL-21-抗HSA)或100 µg 抗PD-1與25 µg P394之組合之100 μl PBS，持續總共5個劑量。使用數位卡尺每週兩次地收集腫瘤量測值(長度(L)及寬度(W))，且計算腫瘤體積(L×W×W)/2。

如圖27中所示，IL-21-抗HSA (P394)與抗PD-1抗體之組合比任一單一療法更好地降低同基因型小鼠結腸癌模型中之腫瘤生長。實例36：IL-21-抗HSA融合蛋白之藥物動力學評估

將MC38鼠類結腸癌細胞(1×10⁶ 個細胞)在第0天皮下植入至C57BL/6小鼠之側腹中。小鼠用PBS或25 µg P380 (抗HSA-人類IL-33)治療2週(4個總劑量)。使用數位卡尺每週三次地收集腫瘤量測值(長度(L)及寬度(W))，且計算腫瘤體積(L×W×W)/2。

如圖28中所示，相對於PBS對照，用延長半衰期IL-33治療降低腫瘤生長。實例37：IL-21-抗HSA融合蛋白對顆粒酶B陽性NK細胞及CD8 T細胞之影響

將MC38鼠類結腸癌細胞(1×10⁶ 個細胞)在第0天皮下植入至C57BL/6小鼠之側腹中。小鼠每週兩次地用PBS、100 µg 抗PD-1、25 µg P390 (小鼠IL-21-抗HSA)或100 µg 抗PD-1+25 µg P390治療，在第5天開始，持續總共5個劑量。在第24天，將小鼠處死且切除腫瘤。腫瘤經均質化以釋放細胞，且細胞針對CD45、CD8、NK1.1及顆粒酶B染色。標繪CD8 T細胞及NK細胞中顆粒酶B陽性細胞之百分比。

如圖29A-29B中所示，P390治療增加顆粒酶B陽性CD8 T細胞及NK細胞之百分比。實例38：組合使用IL-21-抗HSA融合蛋白及抗PD-1抗體對IL-21受體表現之影響

將MC38鼠類結腸癌細胞(1×10⁶ 個細胞)在第0天皮下植入至C57BL/6小鼠之側腹中。小鼠每週兩次地用PBS、100 µg 抗PD-1、25 µg P390 (小鼠IL-21-抗HSA)或100 µg 抗PD-1+25 µg P390治療，在第5天開始，持續總共5個劑量。在第24天，將小鼠處死且切除腫瘤。腫瘤經均質化以釋放細胞，且細胞針對CD45、CD8、CD4、NK1.1及IL-21R染色。標繪CD4 T細胞、CD8 T細胞及NK細胞中IL-21R陽性細胞之百分比。

如圖30A-30C中所示，用抗PD-1抗體治療增加CD4 T細胞、CD8 T細胞及NK細胞中之IL-21受體表現，且用P390 (小鼠IL-21-抗HSA)與抗PD-1之組合治療降低IL-21受體表現。實例39：IL-21-抗HSA融合蛋白對IFN-γ分泌免疫細胞之影響

將MC38鼠類結腸癌細胞(1×10⁶ 個細胞)在第0天皮下植入至C57BL/6小鼠之側腹中。小鼠每週兩次地用PBS、100 µg 抗PD-1、25 µg P390 (小鼠IL-21-抗HSA)或100 µg 抗PD-1+25 µg P390治療，在第5天開始，持續總共5個劑量。在第24天，將小鼠處死，且移除小鼠脾臟。脾臟經均質化以釋放脾細胞，且將脾細胞與新鮮MC38細胞一起置於IFN-γ ELISpot分析中。ELISpot分析係根據製造商之說明書運行，且計數表示MC38反應性免疫細胞之數目的IFN-g點數目。

如圖31中所示，用延長半衰期IL-21治療導致脾臟中腫瘤反應性、IFN-γ分泌免疫細胞之數目增加。實例40：延長半衰期IL-21與抗MSLN抗體之融合物

將經人類間皮素轉染之CT26小鼠細胞(CT26/MSLN)培養及維持於補充有10% FBS+glutamax+青黴素/鏈黴素之RPMI培養基中。細胞經胰蛋白酶處理、用培養基洗滌且計數。細胞接著用PBS洗滌，且使用23標準尺寸的針將1×10⁶ 個細胞(於100 μl PBS中)皮下注射至經麻醉BALB/C小鼠中。儲備研究藥物在給藥當天於PBS中稀釋至適當濃度，且每週兩次地向動物腹膜內投配1.25 mg/kg (100 μl) P375 (IL-21-抗白蛋白-抗MSLN)，持續總共5個劑量。使用數位卡尺每週兩次地收集腫瘤量測值(長度(L)及寬度(W))，且計算腫瘤體積(L×W×W)/2。

如圖32中所示，相對於PBS對照，IL-21-抗白蛋白-抗MSLN融合蛋白(P375)能夠降低腫瘤生長。實例41：延長半衰期IL-15Ra/IL-15與抗MSLN抗體之融合物

將NCI-N87細胞培養及維持於補充有10% FBS+glutamax+青黴素/鏈黴素之RPMI培養基中。細胞經胰蛋白酶處理、用培養基洗滌且計數。細胞接著用PBS洗滌，且使用23標準尺寸的針將3×10⁶ 個細胞(於100 μl PBS中)皮下注射至經麻醉NSG小鼠(Jackson)中。在6天之後，將10×10⁶ 個人類PBMC在100 μL PBS中注射至每隻小鼠之尾部靜脈中。儲備研究藥物P197在給藥當天於PBS中稀釋至適當濃度，且每週兩次地向動物腹膜內投配0.25 mg/kg (100 μl) P669 (抗MSLN-抗白蛋白-IL-15Ra-IL-15)，持續總共5個劑量。使用數位卡尺每週兩次地收集腫瘤量測值(長度(L)及寬度(W))，且計算腫瘤體積(L×W×W)/2。

如圖33中所示，相對於PBS對照，抗MSLN-抗白蛋白-IL-15Ra-IL-15融合蛋白(P669)能夠降低腫瘤生長。實例42.

將Pfeiffer細胞維持於含有10%胎牛血清及青黴素/鏈黴素之RPMI-1640中。100,000個Pfeiffer細胞在37C、5% CO₂ 下在含有10 mM HEPES之Hanks平衡鹽溶液中用指定濃度之重組人類P394 (IL-21-(GSG)4-HSA)、P593 (IL21-A(EAAAK)4A-HAS)、P795 (IL21[1-122]-(GSG)4-HSA)、P796 (IL21[1-122]-(G4S)3-HSA)、P797 (IL21[1-122]-HSA)、P799 (IL21[1-122]-VLLC-HSA)、P800 (IL21[1-122]-VHCH1-HSA)、P750 (IL21-(GSG)4-HSA)、P751 (IL21-A(EAAAK)4A-HSA)或P744 (IL21[1-122]-A(EAAAK)4A-HSA)處理30分鐘。二氧磷基-STAT3係使用二氧磷基-STAT3 (Tyr705)均相時間分辨螢光(HTRF)分析(Cisbio)根據製造商說明書來量測。將665 nm/620 nm之信號比乘以1000、使用劑量反應曲線(Graphpad Prism)標繪且擬合以計算EC50。

如圖34中所示，所有測試之IL-21融合蛋白具有類似ADCC活性。實例43.

將NCI-N87癌細胞株維持於含有10%胎牛血清及青黴素/鏈黴素之RPMI-1640中。在第0天，將10,000個NCI-N87細胞/孔塗鋪於96孔平底盤中之培養基中。在第1天，NK細胞使用RosetteSep NK分離套組(Stemcell Technologies)自人類白血球層分離，且將100,000個NK細胞/孔連同指定治療劑添加至癌細胞。將盤在37C、5% CO₂ 下培育48小時，且細胞接著用4%三聚甲醛固定且用Sytox Orange進行細胞核染色。剩餘癌細胞之數目係藉由使用Cytation 1 (Biotek)計數各孔中剩餘之癌細胞核之數目來計算。較低細胞計數指示較好NK介導之細胞殺滅。(P593 (IL21-A(EAAAK)4A-HAS)、P795 (IL21[1-122]-(GSG)4-HSA)、P796 (IL21[1-122]-(G4S)3-HSA)、P797 (IL21[1-122]-HSA)、P799 (IL21[1-122]-VLLC-HSA)、P800 (IL21[1-122]-VHCH1-HSA)、P750 (IL21-(GSG)4-HSA)、P751 (IL21-A(EAAAK)4A-HSA)或P744 (IL21[1-122]-A(EAAAK)4A-HSA) )。

如圖35中所示，所有測試之IL-21融合蛋白具有類似ADCC活性。序列表

圖1描繪本文提供之例示性IL-21融合蛋白。

圖2描繪例示性IL-21融合蛋白表現載體之組裝，其中白蛋白結合分子為抗HSA抗體。

圖3描繪例示性IL-21融合蛋白表現載體之組裝，其中白蛋白結合分子為結合至HSA之ABD。

圖4顯示抗HSA抗體P367在與人類、猴或小鼠血清白蛋白相互作用時之KD。P394-hgG1 Fc融合蛋白係裝載至蛋白A生物感測器上且浸入人類、猴或小鼠血清白蛋白中。著色線表示針對400 nM (深藍色)、200 nM (深紅色)及100 nM (淺藍色)之不同濃度之血清白蛋白的結合反應。實驗資料係藉由全局擬合(紅色)分析以測定KD。

圖5顯示相比於重組IL-21之抗HSA IL-21結合物P390及P394信號傳導效能。

圖6A顯示在P390、P394及P461/P462與抗間皮素抗體P303之組合存在下，PBMC針對N87細胞之ADCC活性。圖6B顯示在P390、P394及P461/P462與抗間皮素抗體P303之組合(針對H226細胞)存在下，PBMC針對H226細胞之ADCC活性。圖6C顯示在不同劑量之P390、P394、P461/P462及P461/P463與3 ng/mL P303之組合存在下，PBMC針對N87細胞之ADCC活性。圖6D顯示在不同劑量之P390、P394、P461/P462及P461/P463與20 ng/mL P303之組合存在下，PBMC針對H226細胞之ADCC活性。

圖7A顯示藉由IL-21-抗HSA融合蛋白變異體P394、P593、P636、P637、P744、P748、P750、P751及P783之STAT3信號傳導。圖7B及圖7C顯示當以固定劑量之抗MSLN抗體(P303)滴定IL-21-抗HSA融合蛋白變異體P394、P593、P636、P637、P744、P748、P750、P751及P783時，NCI-N87腫瘤細胞上之NK細胞介導之ADCC。

圖8顯示描繪3 µg重組人類IL-21、3 µg P325 (人類IL-21無關奈米抗體)及3或30 µg P394 (人類IL-21-抗HSA)於小鼠中之藥物動力學的比較。

圖9A、9F及9G描繪SDS-PAGE圖片，其顯示IL-21-抗HSA融合蛋白P394 (亦即，AWT-P394)及P593 (亦即，AWT-P593)及P748之染色。在圖9F及9G中，箭頭指示完整目標蛋白質，且星號指示裂解蛋白質。圖9B描繪AWT-P394 IL21-抗HSA融合蛋白之代表性層析圖。圖9C描繪pH 4.0及pH 7.5下之AWT-P593之T_起始的比較。圖9D描繪AWT-P394及AWT-P593之T_起始。圖9E描繪人類IL021受體與IL-21-抗HSA融合蛋白AWT-P394或AWT-P593之結合。

圖10A描繪人類化抗AWT-P610 (亦即，P610)與人類血清白蛋白或猴血清白蛋白在pH 7.4及pH 5.5下之結合。圖10B描繪抗白蛋白抗體AWT-P367及其人類化型式AWT-P494之T起始的比較。圖10C描繪抗白蛋白抗體AWT-P342及其人類化型式AWT-P610之T起始的比較。圖10D描繪抗HSA抗體AWT-367及其人類化抗AWT-P494與人類、猴或小鼠白蛋白之結合。圖10E描繪AWT-P367或AWT-494與人類、猴或小鼠白蛋白之結合的KD。

圖11描繪在用單獨或與如圖中所示之研究藥物組合之NK細胞處理後，N87細胞之剩餘細胞數目。

圖12描繪在用單獨或與a)單獨的賀癌平、b)單獨的P303FF (亦即，P303F)、c)賀癌平及P303FF或d)賀癌平、P303FF及IL-21-抗HSA融合蛋白P394組合之NK細胞處理後，N87細胞之剩餘細胞數目。

圖13描繪在用與a)美羅華、b)美羅華及P394、c)美羅華及IL-15融合蛋白P480或d)美羅華及IL-15組合之NK細胞處理後，死Preiffer細胞之百分比。

圖14描繪在用與a) P303F、b) P303F及重組人類IL-21 (亦即，rhIL-21)、c) P303F及P480或d) P303F及重組人類IL-15 (亦即，rhIL -15)組合之NK細胞處理後，N87細胞之剩餘細胞數目。

圖15描繪在用與a) P480、b) P597或c) rIL-15組合之NK細胞處理後，N87細胞之剩餘細胞數目(上圖)及三種藥物之IC50 (下圖)。

圖16描繪在用與a)抗間皮素抗體P129 (亦即，R2G12)及P126 (亦即，人類IL-21-R2G12-IgG1融合物)、b) P129及IL-21、c) P129及P107 (人類IL-21-IgG1融合物)、d) P129及P325 (人類IL-21-R2D2融合物)或e) P129及P286/288 (人類IL-21-R3C7-IgG1-R2G12)組合之NK細胞處理後，H226細胞之剩餘細胞數目。

圖17描繪在用與a) P197及P390；或b) P197及P394組合之NK細胞處理後，N87細胞之剩餘細胞數目。

圖18A-18B描繪在與如所示之不同藥物一起培育之後，藉由PBMC分泌之IFN-γ (圖18A)及IL-6 (圖18B)之水準。

圖19A-19B描繪當投配抗CTLA-4、IL-21-抗HSA融合蛋白(P394)、抗HSA-IL-15Ra/IL-15融合蛋白(P597)或此等藥劑之組合時，MC38小鼠同基因型腫瘤模型中腫瘤體積之變化。

圖20描繪在用IL-21-抗HSA融合蛋白(P394)、抗HSA-IL-15Ra/IL-15融合蛋白(P597)或此等藥劑之組合治療後，MC38同基因型小鼠腫瘤模型中腫瘤體積之變化。

圖21描繪在用a) 100 µg抗PD-1抗體、b) 25 µg P390、c) 100 µg抗PD-1抗體及25 µg P390或d) 100 µg抗PD-1抗體及5 µg P390治療後，MC38同基因型模型之動物模型中腫瘤體積之變化。

圖22描繪在用a) 25 µg P394、b) 100 µg P303F、c) 100 µg P303F及25 µg P394或d) 100 µg P303F及5 µg P394治療後，具有N87腫瘤之NSG小鼠動物模型中之腫瘤體積的變化。

圖23描繪在用a) 25 µg P394、b) 20 µg賀癌平、c) 20 µg賀癌平及25 µg P394或d) 20 µg賀癌平及5 µg P394治療後，具有N87腫瘤之NSG小鼠動物模型中腫瘤體積之變化。

圖24描繪在用單獨或與a) 25 µg P390、b) 5 µg P390或c) 2.5 µg rmIL-21組合之100 µg P303F治療後，具有N87腫瘤之SCID小鼠動物模型中腫瘤體積的變化。

圖25描繪在用25 µg P390或12.5 µg rmIL-21治療後，MC38同基因型模型之動物模型中腫瘤體積之變化。

圖26描繪在用單獨的抗PD-1抗體、單獨的P390或抗PD-1抗體及P390之組合治療後，CT-26/MSLN動物模型中腫瘤體積之變化。

圖27描繪在用單獨的抗PD-1抗體、單獨的P394或抗PD-1抗體及P394之組合治療後，MC38同基因型模型之動物模型中腫瘤體積之變化。

圖28描繪在用抗HSA-IL-33融合蛋白(P380)治療後，小鼠MC38同基因型腫瘤模型中腫瘤體積之變化。

圖29A-29B描繪在用P390處理後，顆粒酶B陽性NK細胞(圖29A)及CD8 T細胞(圖29B)之百分比變化。

圖30A-30C描繪在用單獨的抗PD-1抗體或抗PD-1抗體與P390之組合處理後，IL-21受體於CD8 T細胞(圖32A)、CD4 T細胞(圖32B)及NK細胞(圖32C)中之表現量的變化。

圖31描繪在用單獨的抗PD-1抗體、單獨的P390、抗PD-1抗體及P390之組合或抗PD-1抗體及rmIL-21之組合處理後，脾臟中之IFN-γ分泌免疫細胞之細胞數目。

圖32描繪使用IL-21-抗HSA-抗MSLN融合蛋白(P375)之小鼠同基因型CT26/MSLN腫瘤模型中腫瘤體積之變化。

圖33描繪在用抗MSLN-抗HSA-IL-15Ra/IL15融合蛋白(P669)治療後，具有N87腫瘤之NSG小鼠動物模型中腫瘤體積之變化。

圖34描繪具有類似信號傳導效能之各種IL-21融合蛋白

圖35描繪具有類似ADCC活性之各種IL-21融合蛋白。

Claims

一種融合蛋白，其包含：a)IL-21，及b)白蛋白結合部分；其中該白蛋白結合部分包含特異性結合於白蛋白之單域抗體(sdAb)；以及其中該抗白蛋白sdAb包含：(1)包含SEQ ID NO：69之胺基酸序列之CDR1；包含SEQ ID NO：70之胺基酸序列之CDR2；及包含SEQ ID NO：71之胺基酸序列之CDR3；(2)包含SEQ ID NO：72之胺基酸序列之CDR1；包含SEQ ID NO：73之胺基酸序列之CDR2；及包含SEQ ID NO：74之胺基酸序列之CDR3；(3)包含SEQ ID NO：75之胺基酸序列之CDR1；包含SEQ ID NO：76之胺基酸序列之CDR2；及包含SEQ ID NO：77之胺基酸序列之CDR3；(4)包含SEQ ID NO：78之胺基酸序列之CDR1；包含SEQ ID NO：79之胺基酸序列之CDR2；及包含SEQ ID NO：80之胺基酸序列之CDR3；(5)包含SEQ ID NO：81之胺基酸序列之CDR1；包含SEQ ID NO：82之胺基酸序列之CDR2；及包含SEQ ID NO：83之胺基酸序列之CDR3；(6)包含SEQ ID NO：84之胺基酸序列之CDR1；包含SEQ ID NO：85之胺基酸序列之CDR2；及包含SEQ ID NO：86之胺基酸序列之CDR3； (7)包含SEQ ID NO：87之胺基酸序列之CDR1；包含SEQ ID NO：88之胺基酸序列之CDR2；及包含SEQ ID NO：89之胺基酸序列之CDR3；(8)包含SEQ ID NO：90之胺基酸序列之CDR1；包含SEQ ID NO：91之胺基酸序列之CDR2；及包含SEQ ID NO：92之胺基酸序列之CDR3；或(9)包含SEQ ID NO：93之胺基酸序列之CDR1；包含SEQ ID NO：94之胺基酸序列之CDR2；及包含SEQ ID NO：95之胺基酸序列之CDR3；及/或其中該抗白蛋白sdAb包含SEQ ID NO：60-68及168-170中之任一者之胺基酸序列。
如請求項1之融合蛋白，其中該抗白蛋白sdAb包含：包含SEQ ID NO：90之胺基酸序列之CDR1、包含SEQ ID NO：91之胺基酸序列之CDR2、及包含SEQ ID NO：92之胺基酸序列之CDR3。
如請求項1之融合蛋白，其中該抗白蛋白sdAb包含SEQ ID NO：168之胺基酸序列。
如請求項1之融合蛋白，其中該IL-21包含SEQ ID NO：1、2、126、171或172之胺基酸序列；或其中該IL-21為包含SEQ ID NO：126、171或172之胺基酸序列之截短IL-21。
如請求項1之融合蛋白，其中該IL-21包含SEQ ID NO：1之胺基酸序列。
如請求項1之融合蛋白，其中該白蛋白結合部分融合至該IL-21之C端。
如請求項1之融合蛋白，其中該IL-21及該白蛋白結合部分係經由第一連接子連接。
如請求項7之融合蛋白，其中該第一連接子選自由SEQ ID NO：12-26及158-159組成之群；及/或其中該第一連接子為可撓性連接子；或其中該第一連接子為剛性連接子。
如請求項1之融合蛋白，其中該融合蛋白包含SEQ ID NO：120、121、129-150及163中之任一者之胺基酸序列。
如請求項1之融合蛋白，其中該融合蛋白包含SEQ ID NO：132-150中之任一者之胺基酸序列。
如請求項1之融合蛋白，其中該融合蛋白包含SEQ ID NO：140之胺基酸序列。
一種醫藥組合物，其包含如請求項1至11中任一項之融合蛋白及醫藥學上可接受之載劑。
一種如請求項1至11中任一項之融合蛋白或如請求項12之醫藥組合物之用途，其用於製造用以治療癌症之藥劑。
如請求項13之用途，其中該藥劑係用於與第二藥劑合併投與。
如請求項14之用途，其中該第二藥劑包含治療抗體、免疫檢查點抑制劑、第二細胞激素、化學治療劑、酪胺酸激酶抑制劑或免疫細胞。
如請求項13之用途，其中該癌症為間皮瘤、肺癌、乳癌、卵巢癌、胰臟癌、淋巴瘤、白血病、頭頸癌、肝癌、食道癌、胃癌或結腸直腸癌；或其中該癌症為間皮瘤、肺癌、卵巢癌或胃癌。
如請求項15之用途，其中該治療抗體結合至選自由以下組成之群的腫瘤抗原：間皮素(MSLN)、GPA33、Her-2(ERBB2)、EGFR及CD20(MS4A1)；或其中該治療抗體結合至選自由以下組成之群的腫瘤抗原：CEA、MUC16、MUC1、AFP、EPCAM、CD19、CD21、CD22、CD30、CD33、CD37、CD45、PSMA及RCMA；或其中該治療抗體結合至間皮素；或其中該治療抗體結合至Her2。
如請求項15之用途，其中該免疫檢查點調節劑為選自由以下組成之群的免疫檢查點蛋白之抑制劑：PD-L1、CTLA4、PD-L2、PD-1、4-1BB、CD47、TIGIT、GITR、TIM3、LAG3、CD27及B7H4；或其中該免疫檢查點調節劑係結合至PD-1之抗體；或其中該免疫檢查點調節劑係結合至CTLA4之抗體。