CN103347893A

CN103347893A - 白蛋白变体

Info

Publication number: CN103347893A
Application number: CN2011800638125A
Authority: CN
Inventors: A.普鲁姆里德格; J.卡梅伦; I.桑德里; J.T.安德森; E.P.弗里斯
Original assignee: Novozymes Biopharma DK AS
Current assignee: Novozymes Biopharma DK AS
Priority date: 2010-11-01
Filing date: 2011-11-01
Publication date: 2013-10-09
Also published as: US20130225496A1; EP2635598A1; WO2012059486A1

Abstract

本发明涉及白蛋白的变体。本发明亦涉及编码所述变体的多核苷酸；包含所述多核苷酸的核酸构建体、载体和宿主细胞；和制备所述变体的方法，并涉及使用所述变体的方法。

Description

白蛋白变体

涉及序列表

本申请包含计算机可读形式的序列表，其通过提述并入本文。

发明背景

技术领域

本发明涉及白蛋白的变体或其片段，或包含变体白蛋白或其片段的融合多肽，其与所述变体所来源的白蛋白，其片段，或包含白蛋白或其片段的融合多肽相比，或与另一种参照白蛋白相比，半寿期具有变化。本发明特别涉及白蛋白的分子，其中所述分子基于第一白蛋白的氨基酸序列，且该第一白蛋白C末端由第二白蛋白的C末端所替代。本发明允许根据用户或应用的需要和期望定制(tailor)白蛋白的半寿期。

背景技术

白蛋白是天然见于哺乳动物血浆中的蛋白，在血浆中，其为最丰富的蛋白。白蛋白在维持血液理想的渗透压方面，以及在血流中转运多种物质方面发挥重要作用。

白蛋白含有三个域：域I(DI)，域II(DII)，和域III(DIII)。已从多种物种包括人、猪、小鼠、大鼠、兔和山羊表征了白蛋白，且它们共享高度序列和结构同源性。

白蛋白在体内与其受体，即新生儿Fc受体(FcRn)“Brambell受体”结合，且已知该相互作用对于白蛋白的血浆半寿期是重要的。FcRn是膜结合蛋白，在多种细胞和组织类型中表达。已发现FcRn拯救白蛋白免受胞内降解(Roopenian D.C.和Akilesh,S.(2007),Nat.Rev.Immunol7,715-725.)。FcRn是参与在哺乳动物如人类血清中维持高水平的IgG和白蛋白的双功能性分子。

尽管现有技术中已表征了FcRn免疫球蛋白(IgG)相互作用，对FcRn-白蛋白相互作用的表征尚不充分。主要FcRn结合位点位于DIII内(381-585)(Andersen等(2010)Clinical Biochemistry43,367-372)。数据表明IgG和白蛋白非协同性结合于FcRn上的不同位点(Andersen等(2006),Eur.J.Immunol36,3044-3051;Chaudhury等(2006),Biochemistry45,4983-4990)。

已知小鼠FcRn结合来自小鼠和人类的IgG，而人FcRn表现得更加挑剔(Ober等(2001)Int.Immunol13,1551-1559)。Andersen等(2010).Journal ofBiological Chemistry285(7):4826-36描述了人和小鼠FcRn对小鼠和人白蛋白两者(所有可能的组合)的亲和力。未在生理pH观察到来自任一物种的白蛋白对任一受体的任何结合。在酸性pH，观察到结合亲和力存在100倍差异。在所有情况下，来自任一物种的白蛋白和IgG对两种受体的结合是加合性的。

人类血清白蛋白(HSA)已充分表征为585个氨基酸的多肽，其序列可见于Peters,T.,Jr.(1996)All about Albumin:Biohemistry,Genetics and Medical,Applications pp10,Academic Press,Inc.,Orlando(ISBN0-12-552110-3)。其具有对其受体FcRn的特征性结合，其中其在pH6.0结合，但不在pH7.4结合。

已发现HSA的血浆半寿期为大约19日。已鉴定出了具有较低血浆半寿期的天然变体(Peach,R.J.和Brennan,S.O.,(1991)Biochim BiophysActa.1097:49-54)，其具有取代D494N。该取代在此变体中生成N-糖基化位点，该位点不存在于野生型白蛋白中。不知道该糖基化或氨基酸变化是否导致血浆半寿期的变化。

由于其具有长血浆半寿期，已提出将白蛋白其用于药物递送。已将白蛋白缀合于药学上有益的化合物(WO2000/69902A)，并已发现该缀合物保持白蛋白的长血浆半寿期。因此，所得的缀合物血浆半寿期一般显著长于有益的治疗化合物本身的血浆半寿期。

此外，已将白蛋白遗传融合于治疗上有益的肽(WO2001/79271A和WO2003/59934A)，这通常导致蛋白融合物具有所述治疗上有益的肽的活性和相对于所述治疗上有益的肽本身的血浆半寿期显著较长的血浆半寿期。

Otagiri等(2009),Biol.Pharm,Bull.32(4),527-534公开了已知77个白蛋白变体，其中25个在域III中具有突变。已显示缺乏羧基端的C端175个氨基酸的天然变体具有减少的半寿期(Andersen等(2010),Clinical Biohemistry43,367-372)。Iwao等(2007)使用小鼠模型研究了天然出现的人白蛋白变体的半寿期，并发现K541E和K560E具有减少的半寿期，E501K和E570K具有增加的半寿期，而K573E对半寿期几乎无作用(Iwao等(2007)B.B.A.Proteinsand Proteomics1774,1582-1590)。

Galliano等(1993)Biochim.Biophys.Acta1225,27-32公开了天然变体E505K。Minchiotti等(1990)公开了天然变体K536E。Minchiotti等(1987)Biochim.Biophys.Acta916,411-418公开了天然变体K574N。Takahashi等(1987)Proc.Natl.Acad.Sci.USA84,4413-4417公开了天然变体D550G。Carlson等(1992).Proc.Nat.Acad.Sci.USA89,8225-8229公开了天然变体D550A。

白蛋白具有结合多种配体的能力，这些配体与白蛋白相缔合(缔合物)。已利用该特性以延长具有非共价结合于白蛋白的能力的药物的血浆半寿期。这亦可通过将几乎不具或不具白蛋白结合特性的药学上有益的化合物与具有白蛋白结合特性的模块相结合来实现。参见综述文献Kratz(2008).Journal ofControlled Release132,171-183及其中的参考文献。

白蛋白用于制备药学上有益的化合物，其中此种制备物可例如但不限于白蛋白的纳米颗粒或微米颗粒。在这些实例中，药学上有益的化合物或化合物的混合物的递送可受益于白蛋白对其受体亲和力的改变，其中对于递送手段而言，已显示所述有益化合物与白蛋白相缔合。

尚不清楚形成的缔合物(例如，但不限于

,Kurtzhals P等Biochem.J.1995;312:725-731)、缀合物或融合多肽的血浆半寿期由何决定，但其似为白蛋白与选定的药学上有益的化合物/多肽之组合的结果。为了能够根据对于意图治疗的临床适应症所需的体内水平而设计特定药物，期望能够控制给定白蛋白缀合物、缔合物或白蛋白融合多肽的血浆半寿期，从而使得可获得与所述缔合物、缀合物或融合物的组分所给出的血浆半寿期相比更长或更短的血浆半寿期。

已知白蛋白在肿瘤中蓄积并发生分解代谢，亦显示其在类风湿性关节炎患者的发炎的关节中蓄积。参见Kratz(2008)Journal of Controlled Release132,171-183的综述文献和其中的参考文献。预计针对FcRn亲和力增加的HSA变体对于药学上有益的化合物的递送会是有利的。

甚至可期望获得对FcRn几乎无或无结合的白蛋白变体，以供提供较短的半寿期或受控的血清药代动力学，如Kenanova等(2009)J.Nucl.Med.;50(Supplement2):1582)所述。

国际专利申请PCT/EP10/066572(WO2011/051489)公开了第一类变体白蛋白，其由在白蛋白序列中一个或多个点突变的存在而具有经调节(即增加或减少)的对FcRn受体的结合亲和力。国际专利申请PCT/EP2011/055577(WO2011/124718)公开了第二类变体白蛋白，其具有经调节的对FcRn受体的结合亲和力，所述变体包含白蛋白的域III以及白蛋白的一个或多个其它域，并任选地包含一个或多个点突变。

本发明提供了另一类变体，其具有经调节的对FcRn受体的结合亲和力，并且，通过提供多种分子(白蛋白变体)，其允许根据需求定制结合亲和力(及因此)半寿期。此种定制可涵盖半寿期的大量增加至半寿期的少量增加，半寿期的少量减少至半寿期的大量减少。白蛋白模块可因此用于定制包含白蛋白模块的融合多肽、缀合物、缔合物、纳米颗粒、微粒和组合物的半寿期。

发明内容

本发明提供了新类型的亲本白蛋白的变体，其与亲本(或参照)相比具有改善的性质。具体而言，本发明提供了亲本白蛋白的变体，其与其亲本(或参照)相比具有改变的血浆半寿期，和/或改变的对FcRn的结合亲和力。

本发明亦涉及编码所述变体的分离的多核苷酸；包含所述多核苷酸的核酸构建体、载体和宿主细胞；以及产生变体的方法。此外，本发明涉及变体的用途，变体的融合物，变体的缀合物，变体的缔合物，和涉及组合物如药物组合物，其包含根据本发明的变体，融合物，缀合物或缔合物。

附图简述

图1：下述氨基酸序列的多重比对：(i)全长成熟(Hu_1_2_3)，(ii)包含HSA的域I和域III的白蛋白变体(Hu_1_3)，(iii)包含HSA的域II和域III的白蛋白变体(Hu_2_3)，(iv)全长恒河猴(Macaca mulatta)白蛋白(Mac_mul)，(v)全长褐家鼠(Rattus norvegicus)白蛋白(Rat)和(vi)全长小家鼠(Mus musculus)白蛋白(小鼠)。位置500，550和573(相对于全长HSA)由箭头标出。

图2：来自人、绵羊、小鼠、兔和山羊的成熟白蛋白以及来自黑猩猩(“Chimp”)、恒河猴、仓鼠、豚鼠、大鼠、牛、马、驴、狗、鸡和猪的不成熟白蛋白的氨基酸序列的多重比对。域1、2和3(如Dockal等所定义(TheJournal of Biological Chemistry,1999,Vol.274(41):29303–29310))的起始和终止氨基酸相对于成熟人白蛋白标出。

图3：(1)包含N(N1)和C(C1)区的第一白蛋白、变体或其片段；(2)包含N(N2)和C(C2)区的第二白蛋白、变体或其片段；和(3)包含第一白蛋白、白蛋白变体或其片段的N端区(N1)和第二白蛋白、白蛋白变体或其片段的C端区(C2)的多肽的示意图。

图4：代表性SPR传感谱，其显示C端截短的HSA变体对shFcRn的结合。将10μM的每种变体在pH6.0注射于经固定化的shFcRn(2000RU)之上。

图5：显示C段截短的HSA变体相对于野生型(WT)HSA的结合亲和力的条形图。KD(b)：使用简单一级(1:1)二分子相互作用模型的动力学速率常数(动力学值代表一式两次的平均值)，KD(c)：使用BIAevaluation4.1软件提供的平衡(Req)结合模型获得的稳态亲和常数。

发明详述

本发明涉及亲本白蛋白的白蛋白或其片段的分离的变体，其中所述变体包含(i)第一(亲本)白蛋白、白蛋白变体或其片段的N端区；和(ii)第二(亲本)白蛋白、白蛋白变体或其片段的C端区，其中：(a)所述第一(亲本)白蛋白、白蛋白变体或其片段的N端区包含其来源的分子除了C端1至205个氨基酸之外的氨基酸；而(b)所述第二(亲本)白蛋白、白蛋白变体或其片段的C端区包含所述第二(亲本)白蛋白、白蛋白变体或其片段的的C端1至205个氨基酸；和

(c)所述多肽与所述第一(亲本)白蛋白、白蛋白变体或其片段或与另一种参照如HSA相比具有改变的半寿期和/或改变的FcRn结合亲和力。

此外，本发明涉及白蛋白变体或其片段的融合物，缀合物(conjugation)(亦称作缀合物(conjugate))和缔合物。本发明亦涉及编码白蛋白，变体或融合物的多核苷酸，其包括载体如质粒，并涉及包含此类多核苷酸的宿主细胞。本发明亦包括产生和/或使用所述白蛋白变体，片段，融合物，缀合物，缔合物，多核苷酸，载体和宿主细胞的方法。

下述定义适用于本发明，且可在说明书中进行进一步定义。

定义

变体：术语“变体”意指通过在一个或多个(几个)位置的一个或多个改变，即取代、插入和/或缺失而从亲本白蛋白衍生的多肽。取代意指用不同氨基酸替代占据某位置的氨基酸；缺失意指去除占据某位置的氨基酸；而插入意指紧接着占据某位置的氨基酸添加一个或多个，优选1-3个氨基酸。

突变体：术语“突变体”意指编码变体的多核苷酸。

野生型白蛋白：术语“野生型”(WT)白蛋白意指具有与天然见于动物如人中的相同的氨基酸序列的白蛋白。

亲本或亲本白蛋白：术语“亲本”或“亲本白蛋白”意指经人力造成改变以产生本发明的白蛋白变体的白蛋白。所述亲本可为天然出现的(野生型)多肽或其等位基因(allele)，或甚至其变体，如PCT/EP2010/066572(WO2011/066572)中描述的变体或PCT/EP2011/055577(WO2011/124718)中描述的变体或衍生物。在本说明书中，可存在一个或两个亲本白蛋白。

FcRn和shFcRn：术语“FcRn”意指人新生儿Fc受体(FcRn)。shFcRn是FcRn的可溶性重组形式。

hFcRn是SEQ ID NO:30(主要组织相容性复合物类型I样Fc受体(FCGRT)的截短的重链)和SEQ ID NO:31(β-2-微球蛋白)的杂二聚体。SEQ IDNO:30和31一同形成hFcRn。shFcRn，例如GST标记的shFcRn，可根据下述方法制备。分离的变体：术语“分离的变体”意指经人力修饰并完全或部分从与其天然出现的至少一种成分分离的变体。根据SDS-PAGE或GP-HPLC确定该变体可至少是1%纯的，例如至少是5%纯的，至少是10%纯的，至少是20%纯的，至少是40%纯的，至少是60%纯的，至少是80%纯的，至少是90%纯的，至少是95%纯的，至少是96%纯的，至少是97%纯的，至少是98%纯的，或至少是90%纯的。

基本上(substantially)纯的变体：术语“基本上纯的变体”意指一种制备物，其包含至多10%，至多8%，至多6%，至多5%，至多4%，至多3%，至多2%，至多1%，和至多0.5%以重量计的与其天然或重组结合的其他多肽物质。优选地，所述变体是以存在于该制备物中的总多肽物质重量计至少92%纯的，例如至少94%纯的，至少95%纯的，至少96%纯的，至少97%纯的，至少98%纯的，至少99%纯的，至少99.5%纯的，和100%纯的。本发明的变体优选为基本上纯的形式。其可通过，例如，以公知的重组方法和纯化方法制备该变体而达成。

成熟多肽：术语“成熟多肽”意指经翻译和任何翻译后修饰，如N末端加工、C末端截短、糖基化、磷酸化等之后的最终形式的多肽。所述成熟多肽可包含或组成为根据本发明的第一个或第四个方面的多肽，包含任何翻译后修饰。

成熟多肽编码序列：术语“成熟多肽编码序列”意指编码成熟白蛋白多肽的多核苷酸。

序列同一性：两个氨基酸序列间或两个核苷酸序列间的相关性由参数”序列同一性”所描述。

就本发明而言，两个氨基酸序列之间的序列同一性程度使用Needleman-Wunsch算法(Needleman和Wunsch，1970，J.Mol.Biol.48：443-453)确定，如EMBOSS软件包(EMBOSS：欧洲分子生物学开放软件组(TheEuropean Molecular Biology Open Software Suite)，Rice等，2000，Trends Genet.16:276-277)的Needle程序，优选为3.0.0版或之后的版本中执行的。所用的可选参数为缺口开放罚分(gap open penalty)10，缺口延伸罚分(gap extensionpenalty)0.5，和EBLOSUM62(BLOSUM62的EMBOSS版)取代矩阵。使用标记为“最长同一性”的Needle输出(使用-nobrief选项获得)作为百分比同一性并如下计算：

(相同的残基×100)/(比对长度-比对中缺口总数)

就本发明而言，两个脱氧核糖核苷酸序列之间的序列同一性程度使用Needleman-Wunsch算法(Needleman和Wunsch，1970，见上)确定，如EMBOSS软件包(EMBOSS：欧洲分子生物学开放软件组(The European MolecularBiology Open Software Suite)，Rice等，2000，见上)的Needle程序，优选为3.0.0版或之后的版本中执行的。所用的可选参数为缺口开放罚分10，缺口延伸罚分0.5，和EDNAFULL(NCBI NUC4.4的EMBOSS版)取代矩阵。使用标记为”最长同一性”的Needle输出(使用-nobrief选项获得)作为百分比同一性并如下计算：

(相同的脱氧核糖核苷酸×100)/(比对长度–比对中缺口总数)

可使用其它比对工具，例如本文中所述的MUSCLE。

片段：术语“片段”意指从白蛋白的氨基和/或羧基端，和/或白蛋白的内部区具有一个或多个(几个)氨基酸缺失，并保留结合于FcRn的能力的多肽。片段可由来源于HSA的一个未中断的序列组成，或其可包含两个或更多个来源于HSA的序列。本发明的片段具有超过大约20个氨基酸残基的大小，优选超过30个氨基酸残基，更优选超过40个氨基酸残基，更优选超过50个氨基酸残基，更优选超过75个氨基酸残基，更优选超过100个氨基酸残基，更优选超过200个氨基酸残基，更优选超过300个氨基酸残基，甚至更优选超过400个氨基酸残基，且最优选超过500个氨基酸残基的大小。

等位变体(allelic variant)：术语“等位变体”意指占据相同染色体基因座的基因的任何两种以上可选形式。等位变异通过突变天然地发生，并且可导致种群内的多态性。基因突变(改变)可以是沉默的(在编码的多肽中无变化)或可以编码具有改变的氨基酸序列的多肽。多肽的等位变体是由基因的等位变体编码的多肽。

分离的多核苷酸：术语“分离的多核苷酸”意指经人力修饰的多核苷酸。在一个方面，如通过琼脂糖电泳测定的，所述多核苷酸为至少1%纯，例如至少5%纯，至少10%纯，至少20%纯，至少40%纯，至少60%纯，至少80%纯，至少90%纯，和至少95%纯。所述多核苷酸可以是基因组、cDNA、RNA、半合成、合成来源的，或它们的任何组合。

基本上纯的多核苷酸：术语“基本上纯的多核苷酸”意指多核苷酸制备物，其不含其它外来的或不期望的核苷酸，并且处于适合在遗传工程多肽生产体系中使用的形式。因此，基本上纯的多核苷酸含有按重量计至多10%，例如至多8%，至多6%，至多5%，至多4%，至多3%，至多2%，至多1%，至多0.5%的与其天然或重组结合的其它多核苷酸材料。然而，基本上纯的多核苷酸可以包括天然存在的5’和3’非翻译区，如启动子和终止子。优选基本上纯的多核苷酸是按重量计至少90%纯，例如至少92%纯，至少94%纯，至少95%纯，至少96%纯，至少97%纯，至少98%纯，至少99%，和至少99.5%纯的。所述多核苷酸优选为基本上纯的形式。

编码序列：术语“编码序列”意指直接指定其翻译得到的多肽产物的氨基酸序列的多核苷酸。编码序列的边界通常由开读框确定，所述开读框通常以ATG起始密码子或可供选择的起始密码子如GTG和TTG开始，并且以终止密码子如TAA、TAG和TGA结束。编码序列可以是DNA、cDNA、合成的或重组的多核苷酸。

cDNA：术语“cDNA”意指能够通过反转录从得自真核细胞的成熟的、已剪接的mRNA分子制备的DNA分子。cDNA缺少可存在于相应基因组DNA中的内含子序列。起始的(initial)、初级的RNA转录物是mRNA的前体，其通过一系列的步骤加工(包括剪接)然后作为成熟的已剪接的mRNA出现。

核酸构建体：术语“核酸构建体”意指单链或双链的核酸分子，所述核酸分子分离自天然存在的基因，或将所述核酸分子以本来不存在于(nototherwise exist)自然界中的方式修饰以含有核酸的区段或所述核酸分子是合成的。当所述核酸构建体含有表达本发明的编码序列所需的调控序列时，术语核酸构建体与术语“表达盒”同义。

调控序列(control sequence)：术语“调控序列”意指编码本发明变体的多核苷酸表达所必需的所有组分。各个调控序列对于编码所述变体的多核苷酸可以是天然的或外源的，或各个调控序列对于彼此可以是天然的或外源的。这些调控序列包括但不限于前导序列、聚腺苷酸化序列、前肽序列、启动子、信号肽序列和转录终止子。最少的情况，调控序列包括启动子和转录和翻译的终止信号。调控序列可以和用于引入特异性限制位点的接头一起提供，所述特异性限制位点促进调控序列在编码变体的多核苷酸编码区内的连接。

可操作地连接：术语“可操作地连接”意指这样的构型，其中将调控序列置于相对于多核苷酸的编码序列的适当位置，使得调控序列指导编码序列的表达。

表达：术语“表达”包括涉及变体产生的任何步骤，其包括但不限于转录、转录后修饰、翻译、翻译后修饰和分泌。

表达载体：术语“表达载体”意指线性的或环状的DNA分子，其包含编码变体的多核苷酸，并与供用于其表达的额外核苷酸可操作地连接。

宿主细胞：术语“宿主细胞”意指对于用包含本发明多核苷酸的核酸构建体或表达载体的转化、转染、转导等是易感的(susceptible)任何细胞类型。术语“宿主细胞”涵盖由于在复制过程中发生的突变而与亲本细胞不完全相同的亲本细胞的任何后代。

血浆半寿期：理想地，血浆半寿期应在合适个体中在体内确定。然而，由于这样消耗时间，成本昂贵，并不可避免地存在对动物和人进行实验带来的伦理问题，因此期望使用体外测定以确定血浆半寿期是否延长或缩短。已知白蛋白对其受体FcRn的结合对于血浆半寿期是重要的，且受体结合和血浆半寿期之间的关联是白蛋白对其受体的更高亲和力导致更长的血浆半寿期。因此对于本发明，白蛋白对FcRn的较高的亲和力被视为指示增加的血浆半寿期，而白蛋白对其受体的较低亲和力被视为指示减少的血浆半寿期。

在本申请和权利要求书中，白蛋白对其受体FcRn的结合使用术语亲和力(KD)和表述“较强”或“较弱”来描述。因此，应理解的是与HSA相比具有对FcRn较高亲和力的分子被视作与HSA相比较强地结合于FcRn，而与HSA相比具有对FcRn较低亲和力的分子被视作与HSA相比较弱地结合于FcRn。较强结合可定义(相对于合适的参照)为白蛋白-FcRn相互作用，其具有的结合亲和力(KD)少于HSA-FcRn或“参照分子”-FcRn的结合亲和力，例如少于HSA或参照分子的0.9X KD，更优选少于0.5X KD，少于0.1X KD，少于0.05X，0.02X KD且最优选少于HSA或参照分子的0.01X KD。较弱结合可类似地，例如，定义为多于HSA或参照分子的1.1X KD，更优选至少5X KD，至少10X KD，或至少HSA或参照分子的100X。KD可通过任何合适的方法，如本文中定义的方法来确定。结合亲和力可针对任何FcRn，特别是人FcRn，例如shFcRn如本文中所述的GST标记的FcRn，来确定。

术语“较长的血浆半寿期”或“较短的血浆半寿期”以及类似的表述应理解为相对于相应的亲本(或参照)白蛋白分子。因此，对于本发明的白蛋白变体，较长的血浆半寿期意指所述变体与对应白蛋白(即第一(亲本)白蛋白)相比具有较长的血浆半寿期。

例如在血中的例如多肽，变体，融合物，缀合物或缔合物的“长的”或“短的”血浆半寿期是相对于“参照分子”。所述参照分子可选自：(i)野生型白蛋白(或其片段)，(ii)白蛋白变体(或其片段)，(iii)融合于感兴趣的多肽的白蛋白(或其片段)，(iv)白蛋白(或其片段)的缀合物，(v)白蛋白(或其片段)的缔合物。更具体地，参照分子的“白蛋白”优选为本文中定义的第一(亲本)白蛋白。

例如，长的血浆半寿期可为比参照分子长至少5%，优选长至少10%，20%，30%，40%，50%，60%，70%，80%，90%，100%，150%，200%，250%，300%，350%，400%，450%，500%。长血浆半寿期包括至少5至100日，例如至少5，6，7，8，9，10，14，15，20，21，28，30，35，40，42，50，60，70，80，90，100日。短血浆半寿期可为比参照分子短至少5%，更优选短至少10%，20%，30%，40%，50%，60%，70%，80%，90%，95%，96%，97%，98%或99%。短血浆半寿期包括至多5，4，3，2，1，0.5，或0.25日。

白蛋白变体对FcRn的结合亦可使用动力学因子(kinetic factor)，特别是“结合速率(on-rate)”(ka)和“解离速率(off-rate)”(kd)来描述，它们分别描述了当本发明的白蛋白变体与FcRn结合或解离时的反应速率。本发明人进一步意识到当白蛋白变体与FcRn相互作用时的动力学可对血浆半寿期具有影响，并意识到具有缓慢解离速率的白蛋白变体与具有较快解离速率的类似分子相比具有较高血浆半寿期。

本发明人基于本发明所属技术领域的现有技术意识到白蛋白变体对FcRn受体的结合与血浆半寿期之间的相关性。

一种确定白蛋白变体的亲和力与野生型白蛋白相比是更高或是更低的方法是使用如下文中所述的表面等离子共振测定法(Surface Plasmon Resonance，SPR)。本领域技术人员会理解其它方法可用于确定白蛋白变体对FcRn的亲和力与相应的参照白蛋白对FcRn的亲和力相比是更高或是更低，例如，确定并比较结合常数KD。因此，根据本发明，具有与天然HSA的KD相比较低KD的白蛋白变体视为与HSA相比具有更高血浆半寿期，而具有与天然HSA的KD相比较高KD的白蛋白变体视为与HSA相比具有更低血浆半寿期。

参照：参照为白蛋白变体，融合物，缀合物，组合物，缔合物，纳米颗粒或微粒与之相比的白蛋白，融合物，缀合物，组合物，缔合物，纳米颗粒或微粒。参照可包含或组成为全长白蛋白(如HSA或其天然等位基因)或其片段。参照亦可称作“对应的”白蛋白，融合物，缀合物，组合物，缔合物，纳米颗粒或微粒，对其白蛋白变体，融合物，缀合物，组合物，缔合物，纳米颗粒或微粒。参照可包含或组成为HSA(SEQ ID NO:2)或其片段，融合物，缀合物，缔合物，纳米颗粒或微粒。优选地，所述参照与根据本发明的(“正在研究的”)多肽，融合多肽，缀合物，组合物，缔合物，纳米颗粒或微粒除了白蛋白模块之外完全相同。优选地参照的白蛋白模块包含或组成为白蛋白(例如HSA，SEQ ID NO:2)或其片段。参照的白蛋白模块的氨基酸序列可与根据本发明的(“正在研究的”)多肽，融合多肽，缀合物，组合物，缔合物，纳米颗粒或微粒的白蛋白模块的氨基酸序列具有更长，更短，或优选相同(±1至15个氨基酸)的长度。

等同的氨基酸位置：在本说明书中，氨基酸位置相对于全长成熟人血清白蛋白(即不含前导序列)来定义。然而，等同位置可通过使用成对(例如ClustalW)或多重(例如MUSCLE)比对比较氨基酸序列来在人血清白蛋白的片段中，在动物白蛋白中，和在其片段，融合物和其它衍生物或变体中鉴定出。例如，图1显示等同于全长人血清白蛋白中的500，550和573的位置在人血清白蛋白的片段中和在其它物种的白蛋白中容易地鉴定出。位置500，550和573通过箭头标出。进一步细节提供于下表1：

表1：来自不同动物的白蛋白，显示等同于HSA的500，550和573的位置

图1通过MUSCLE使用缺省参数(包括以ClustalW1.81格式输出)生成。原始输出数据使用BoxShade3.21(http://www.ch.embnet.org/software/BOX_form.html)使用输出格式：RTF_new；字号：10；共有线(Consensus Line)：无共有线；序列的部分(Fraction of sequences)(对于加阴影而言必须一致)：0.5；输入序列合适：ALN来加阴影。因此，在本说明书中，在人血清白蛋白中定义的氨基酸位置亦适用于人血清白蛋白的片段，衍生物或变体和融合物，来自其它物种的动物及其片段和融合物中的等同位置。此类等同位置可具有(i)在其天然蛋白中不同的残基编号和/或(ii)在其天然蛋白中不同的天然氨基酸。

类似地，图2显示等同位置可在白蛋白的片段(例如域)中相对于SEQ IDNO:2(HSA)鉴定出。图2通过如对于上图1所述的MUSCLE生成。

变体命名规则：

就本发明而言，将公开于SEQ ID NO:2中的成熟多肽用于确定在其他白蛋白中对应的氨基酸残基。将其他白蛋白的氨基酸序列与公开于SEQ ID NO:2中的成熟多肽进行比对，并基于该比对，使用如EMBOSS包(EMBOSS:TheEuropean Molecular Biology Open Software Suite,Rice等,2000,Trends Genet.16:276-277)的Needle程序(优选版本3.0.0或更新)中执行的Needleman-Wunsch算法(Needleman和Wunsch,1970,J.Mol.Biol.48:443-453)确定了SEQ ID NO:2所公开的成熟多肽中任何氨基酸残基对应的氨基酸位置编号。

在其他白蛋白中鉴定对应的氨基酸残基可通过使用“ClustalW”(Larkin等,2007,Bioinformatics23:2947-2948)比对多个多肽序列来确认。

当其他多肽(或蛋白)从SEQ ID NO:2的成熟多肽分歧到传统的基于序列的比较无法检测出其关系的程度时(Lindahl和Elofsson,2000,J.Mol.Biol.295:613-615)，可使用其他逐对序列比较算法。在基于序列的搜索中较高的敏感度可使用采用多肽家族的概率表现(probabilistic representation)(序型)来搜索数据库的搜索程序获得。举例而言，PSI-BLAST程序通过迭代的(iterative)数据库搜索过程来产生序型，并能够检测出较远的同源物(Atschul等,1997,NucleicAcids Res.25:3389-3402)。当多肽的家族或超家族在蛋白质结构数据库中具有一个或多个代表时，甚至可达成更高的敏感度。程序如GenTHREADER(Jones1999,J.Mol.Biol.287:797-815;McGuffin和Jones,2003,Bioinformatics19:874-881)使用来自多个来源(PSI-BLAST、二级结构预测(secondary structureprediction)、结构比对序型(structural alignment profile)以及溶解势(solvationpotential))的信息作为向预测查询序列(query sequence)的结构折叠(structuralfold)的神经网络的输入。类似地，Gough等,2000,J.Mol.Biol.313:903-919的方法可用于将未知结构的序列在存在于SCOP数据库中的超家族模型内进行比对。这些比对继而能够用于生成关于多肽的同源性模型，且上述模型可就准确度使用多种为此目的开发的工具加以评价。

对于已知结构的蛋白质，可用数种工具和资源以供找回(retrieve)和生成结构比对。举例而言，已将SCOP超家族的蛋白质进行了结构比对，且这些比对是可获取并可下载的。两个或更多蛋白质结构可使用多种算法，如距离比对矩阵(distance alignment matrix)(Holm和Sander,1998,Proteins33:88-96)或组合延伸(combinatorial extension)(Shindyalov和Bourne,1998,ProteinEngineering11:739-747)进行比对，且这些算法的执行可另外用于查询具有目标结构的结构数据库，以发现可能的结构同源物(例如Holm和Park,2000,Bioinformatics16:566-567)。

在描述本发明的白蛋白变体时，为了参照方便起见，采用了下述的命名法。使用通用的IUPAC单字母或三字母氨基酸缩写。术语“点突变”和/或“改变”包括缺失、插入和取代。

取代。对于氨基酸取代，使用下述命名法：初始氨基酸，位置，取代氨基酸。相应地，例如在226位用丙氨酸取代苏氨酸命名为“Thr226Ala”或“T226A”。多重突变(改变)用加号(“+”)分开，例如，“Gly205Arg+Ser411Phe”或“G205R+S411F”，代表在205和411位分别用精氨酸(R)取代甘氨酸(G)，以及用苯丙氨酸(F)取代丝氨酸(S)。

缺失。对于氨基酸缺失，使用了如下命名法：初始氨基酸，位置*。相应地，在位置195缺失甘氨酸命名为“Gly195*”或“G195*”。多个缺失由加号(“+”)分开，例如“Gly195*+Ser411*”或“G195*+S411*”。

插入。对于氨基酸插入，使用了如下的命名法：初始氨基酸，位置，初始氨基酸，插入的氨基酸。因此，在位置195的甘氨酸之后插入赖氨酸命名为“Gly195GlyLys”或“G195GK”。多个氨基酸的插入命名为[初始氨基酸，位置，初始氨基酸，插入的氨基酸#1，插入的氨基酸#2；等等]。例如，在位置195的甘氨酸之后插入赖氨酸和丙氨酸记为“Gly195GlyLysAla”或“G195GKA”。

在此情况下，通过在插入的氨基酸残基前的氨基酸残基的位置号添加小写字母而对插入的氨基酸残基进行编号。因此，在上一例子中序列为：

亲本：	变体：
		195	195 195a 195b
G	G-K-A

多重改变。包含多重改变的变体由加号(“+”)分开，例如“Arg170Tyr+Gly195Glu”或“R170Y+G195E”代表在位置170和195分别用酪氨酸和谷氨酸取代精氨酸和甘氨酸。

不同的取代。当可在一个位置导入不同取代时，不同的取代由逗号分开，例如“Arg170Tyr,Glu”代表在位置170用酪氨酸或谷氨酸取代精氨酸。因此，“Tyr167Gly,Ala+Arg170Gly,Ala”指下述变体：

“Tyr167Gly+Arg170Gly”，“Tyr167Gly+Arg170Ala”，“Tyr167Ala+Arg170Gly”和“Tyr167Ala+Arg170Ala”。

白蛋白模块

包含根据本发明的白蛋白变体或其片段的融合多肽，缀合物，缔合物，纳米颗粒，微粒或组合物的白蛋白部分可称作“白蛋白模块”。根据本发明的多肽可包含或组成为白蛋白模块。

亲本白蛋白

白蛋白是蛋白，并构成哺乳动物中血浆中最丰富的蛋白，且来自多种哺乳动物的白蛋白已通过生物化学方法和/或通过序列信息表征。几种白蛋白，例如人血清白蛋白(HSA)，和马白蛋白已通过晶体学方法表征，且其结构已确定。(HSA：He XM,Carter DC(July1992)."Atomic structure and chemistry ofhuman serum albumin".Nature358(6383):209–15；马白蛋白：Ho,J.X.等(2001).X-ray and primary structure of horse serum albumin(Equus caballus)at0.27-nm resolution.Eur J Biochem.215(1):205-12)。

HSA是根据本发明优选的第一或第二(亲本)白蛋白，并为由585个氨基酸残基组成并具有67kDa的分子量的蛋白。在其天然形式，其未经糖基化。HSA的氨基酸序列示于SEQ ID NO:2。本领域技术人员会理解可能存在与HSA具有基本上相同特性，但与SEQ ID NO:2相比具有一个或多个氨基酸变化的天然等位基因，且本发明人亦涵盖使用此类天然等位基因作为本发明的亲本白蛋白。

白蛋白一般具有大约20日或更久的长血浆半寿期，例如，HSA具有19日的血浆半寿期。已知HSA的长血浆半寿期是通过与其受体FcRn的相互作用来介导的，然而，对于HSA的长半寿期背后的确切机制的理解或知识对于本发明不是必需的。

根据本发明，术语“白蛋白”意指与HSA具有相同或非常类似的三维结构，并具有长血浆半寿期的蛋白。术语“白蛋白”亦意指与HSA或HSA域具有相同的和/或非常类似的三维结构，并具有类似性质的蛋白。类似的三维结构例如为来自在亲本白蛋白中提及的物种的白蛋白的结构。一些主要的白蛋的性质为其调节血浆体积的能力(因为其承担正常血浆的渗透作用的85%)，约19日±5日的长血浆半寿期，配体结合例如内源分子如酸性、亲脂性化合物包括胆红素(billirubin)脂肪酸、血晶质(hemin)和thyoxine的结合(亦参见Kragh-Hansen等，2002，Biol.Pharm.Bull.25，695的表1，其通过提述并入本文)，具有酸性或电负性(electronegative)特征的小有机化合物例如药物如华法林(warfarin)、布洛芬(ibuprofen)和紫杉醇(paclitaxel)的结合(亦参见Kragh-Hansen等，2002，Biol.Pharm.Bull.25，695的表1，通过提述并入本文)。并不需要满足所有这些性质才能表征蛋白或片段为白蛋白。作为根据白蛋白的白蛋白蛋白的实例，可提及人血清白蛋白(例如AAA98797或P02768-1，SEQ ID NO:2(成熟)，SEQ ID NO:4(不成熟))，灵长类血清白蛋白(如黑猩猩血清白蛋白(例如预测序列XP_517233.2SEQ ID NO:5)，大猩猩血清白蛋白或恒河猴血清白蛋白(例如e.g.NP_001182578，SEQ ID NO:6))，啮齿类血清白蛋白(如仓鼠血清白蛋白(例如A6YF56，SEQ ID NO:7)，豚鼠血清白蛋白(例如Q6WDN9-1，SEQ ID NO:8)，小鼠血清白蛋白(例如AAH49971或P07724-1Version3，SEQ ID NO:9)和大鼠血清白蛋白(例如AAH85359或P02770-1Version2，SEQ ID NO:10)))，牛类血清白蛋白(例如牛血清白蛋白P02769-1，SEQ ID NO:11)，马类血清白蛋白如马血清白蛋白(例如P35747-1，SEQ ID NO:12)或驴血清白蛋白(例如Q5XLE4-1，SEQ ID NO:13)，兔血清白蛋白(例如P49065-1Version2，SEQ ID NO:14)，山羊血清白蛋白(例如ACF10391，SEQ ID NO:15)，绵羊血清白蛋白(例如P14639-1，SEQ ID NO:16)，犬血清白蛋白(例如P49822-1，SEQ ID NO:17)，鸡血清白蛋白(例如P19121-1Version2，SEQ ID NO:18)和猪血清白蛋白(例如P08835-1Version2，SEQ ID NO:19)或与此种白蛋白具有至少70，75，80，85，90，95，96，97，98或至少99%氨基酸同一性的多肽。其它白蛋白的实例(其亦包含于本申请的范围)，包括卵清蛋白(例如P01012.pro：鸡卵清蛋白；O73860.pro：火鸡卵清蛋白)。成熟白蛋白序列可从不成熟白蛋白序列使用本领域技术人员已知的技术鉴定出，所述技术例如与HSA比对(对于HSA已知成熟和不成熟区)。例如，不成熟HSA为609个氨基酸长，其中氨基酸1至19是信号序列(亦称作前导序列或前序列(pre sequence))，氨基酸20至24是前肽序列(prosequence)，而氨基酸25至609是成熟蛋白。图2中的比对允许本领域技术人员对于数种动物白蛋白预测成熟序列(参见“D1起始”)。公开于序列表2的HSA或其任何天然存在的等位基因是根据本发明优选的白蛋白。

本发明的第一(亲本)白蛋白和/或第二(亲本)白蛋白，其片段，或包含白蛋白或其片段的融合多肽的白蛋白部分一般与野生型白蛋白(如本文中描述的那些)的序列，优选与SEQ ID NO:2中所示的HSA的序列具有至少60%，优选至少70%，优选至少80%，优选至少85%，优选至少86%，优选至少87%，优选至少88%，优选至少89%，优选至少90%，优选至少91%，优选至少92%，优选至少93%，优选至少94%，优选至少95%，更优选至少96%，更优选至少97%，更优选至少98%，并且最优选至少99%或100%的序列同一性。所述序列同一性可为针对SEQ ID NO:2的全长，或针对组成为或包含片段如SEQ ID NO:2的一个或多个域的分子，如组成为或包含域III的分子(例如SEQ ID NO:27)，组成为或包含域II和域III的分子(例如SEQ ID NO:25)，组成为或包含域I和域III的分子(例如SEQ ID NO:24)，组成为或包含两个拷贝的域III的分子(例如SEQ ID NO:26)，组成为或包含三个拷贝的域III的分子(例如SEQ ID NO:28)，或组成为或包含域I和两个拷贝的域III的分子(例如SEQ ID NO:29)。

所述第一或第二(亲本)白蛋白优选包含或组成为SEQ ID NO:4的氨基酸序列。所述第一或第二(亲本)白蛋白可包含或组成为SEQ ID NO:2的成熟多肽。

在另一个实施方案中，所述第一或第二(亲本)白蛋白是SEQ ID NO:2的成熟多肽的等位变体。

白蛋白的氨基酸序列显示下述与HSA(SEQ ID NO:2)的同一性：黑猩猩(98.8%)，恒河猴(93.3%)，犬(80%)，驴(76.3%)，马(76.3%)，仓鼠(76.2%)，牛(75.8%)，猪(75.1%)，山羊(74.8%)，绵羊(74.6%)，兔(74.3%)，大鼠(73.3%)，小鼠(72.3%)，豚鼠(72.1%)，鸡(47%)。所述同一性使用上述的Needleman-Wunsch算法，使用图2的氨基酸序列来确定。人和黑猩猩白蛋白在对应于HSA(SEQ IDNO:2)的573的位置具有K，所有其它上述分析的物种在对应于HSA(SEQ IDNO:2)的573的位置具有P。因此，在一个优选实施方案中：

(i)所述第一白蛋白与HSA(SEQ ID NO:2)具有至少94%氨基酸序列同一性，如至少94，95，96，97，98，99，99.5%，更优选至少98%同一性。所述第一白蛋白可为HSA(SEQ ID NO:2)或黑猩猩白蛋白(SEQ ID NO:5的成熟序列)。优选所述第一白蛋白在对应于HSA(SEQ ID NO:2)中573的位置并不具有P残基。更优选所述第一白蛋白在对应于HSA(SEQ ID NO:2)中573的位置573具有K残基；和

(ii)所述第二白蛋白与HSA(SEQ ID NO:2)具有45至98%，如45至70，71，72，73，74，75，76，77，78，79，80，85，90，91，92，93，94，95，96，97，98%，更优选70至94%的氨基酸序列同一性。优选所述第二白蛋白在对应于HSA(SEQ ID NO:2)中573的位置并不具有K残基。更优选所述第二白蛋白在对应于HSA(SEQ ID NO:2)中573的位置具有P残基。

特别优选所述第一白蛋白与HSA(SEQ ID NO:2)具有至少94%氨基酸序列同一性和所述第二白蛋白与HSA(SEQ ID NO:2)具有少于94%氨基酸序列同一性，甚至更优选所述第一白蛋白与HSA(SEQ ID NO:2)具有至少98%氨基酸序列同一性和所述第二白蛋白与HSA(SEQ ID NO:2)具有少于94%氨基酸序列同一性。

所述第一和/或第二(亲本)白蛋白可由多核苷酸编码，所述多核苷酸在非常低严格条件，低严格条件，中等严格条件，中-高严格条件，高严格条件或非常高严格条件下与以下杂交：(i)SEQ ID NO:1的成熟多肽编码序列；(ii)SEQ ID NO:1的成熟多肽编码序列；或(iii)(i)或(ii)的全长互补链(J.Sambrook,E.F.Fritsch,和T.Maniatis,1989,Molecular Cloning,A Laboratory Manual,第2版,Cold Spring Harbor,New York)。

SEQ ID NO:1的多核苷酸或其亚序列，以及SEQ ID NO:2的氨基酸序列或其片段，可用于设计核酸探针，以根据本领域内公知的方法从不同属和种的菌株鉴定和克隆编码亲本的DNA。具体而言，根据标准的Southern印迹方法，可将这些探针用于与感兴趣的属或种的基因组或cDNA杂交，以鉴定和从其中分离相应的基因。这些探针可明显短于完整序列，但长度上应为至少14，例如至少25，至少35，或至少70个核苷酸。优选地，所述核酸探针是至少100个核苷酸长度，例如，至少200个核苷酸，至少300个核苷酸，至少400个核苷酸，至少500个核苷酸，至少600个核苷酸，至少700个核苷酸，至少800个核苷酸，或至少900个核苷酸的长度。DNA和RNA探针二者均可使用。通常将探针标记以检测相应的基因(例如，用³²P、³H、³⁵S、生物素或抗生物素蛋白(avidin)标记)。本发明涵盖此类探针。

可从由这些其它生物体制备的基因组DNA或cDNA文库中筛选与上述探针杂交并编码亲本的DNA。可以通过琼脂糖或聚丙烯酰胺凝胶电泳，或通过其它分离技术分离来自这些其它生物体的基因组或其它DNA。可以将来自文库的DNA或分离的DNA转移至硝化纤维素(nitrocellulose)或其它合适的载体材料并且固定于其上。为了鉴定与SEQ ID NO:1或其亚序列同源的克隆或DNA，将所述载体材料用在Sounthern印迹中。

就本发明而言，杂交表示多核苷酸在非常低至非常高的严格条件下与标记的核苷酸探针杂交，所述核苷酸探针对应于SEQ ID NO:1中所示的多核苷酸，其互补链，或其亚序列。可使用例如X射线片(X-ray film)或任何其他本领域中已知的检测手段来检测与所述探针杂交的分子。

所述核酸探针可包含或组成为SEQ ID NO:1的成熟多肽编码序列，即SEQ ID NO:1的核苷酸1至1785。所述核酸探针可包含或组成为编码SEQ IDNO:2的多肽或其片段的多核苷酸。对于长度至少100个核苷酸的长探针，将非常低至非常高的严格条件定义为在42℃，在5X SSPE、0.3%SDS、200μg/ml已剪切并且变性的鲑精DNA中，并且对于非常低和低严格性为25%的甲酰胺、对于中和中-高严格性为35%的甲酰胺、或对于高和非常高严格性为50%的甲酰胺，根据标准的Southern印迹法进行预杂交和杂交最佳12至24小时。使用2X SSC、0.2%SDS在45℃(非常低严格性)，在50℃(低严格性)，在55℃(中严格性)，在60℃(中-高严格性)，在65℃(高严格性)，或70℃(非常高严格性)将载体材料最终洗涤三次，每次15分钟。

对于长度大约15个核苷酸至大约70个核苷酸的短探针，将严格条件定义为在比使用根据Bolton和McCarthy的计算法(1962,Proc。Natl。Acad。Sci。USA48:1390)计算出的T_m低大约5℃至大约10℃，在0.9M NaCl，0.09MTris-HCl pH7.6，6mM EDTA，0.5%NP-40，1×Denhardt溶液，1mM焦磷酸钠(sodium pyrophosphate)，1mM磷酸二氢钠(sodium monobasic phosphate)，0.1mM ATP和0.2mg每ml的酵母RNA中，根据标准的Southern印迹步骤进行预杂交和杂交最佳12至24小时。将所述载体材料在6×SSC加0.1%SDS中最终洗涤一次15分钟，并用6×SSC在比计算的T_m低5℃至10℃的温度洗涤两次，每次15分钟。

所述亲本可由具有与SEQ ID NO:1的成熟多肽编码序列具有至少60%，例如，至少65%，至少70%，至少75%，至少80%，至少85%，至少90%，至少95%，至少96%，至少97%，至少98%，至少99%或100%序列同一性的序列的多核苷酸编码，所述多核苷酸编码能够发挥白蛋白功能的多肽。在一个实施方案中，所述亲本由包含或组成为SEQ ID NO:1的多核苷酸编码。

本发明的具体方面讨论如下：

本发明的第一个方面涉及多肽，其包含(i)第一(亲本)白蛋白、白蛋白变体或其片段的N端区；和(ii)第二(亲本)白蛋白、白蛋白变体或其片段的C端区，其中：(a)第一(亲本)白蛋白、白蛋白变体或其片段的N端区包含除了C端1至205个氨基酸之外的其来源的分子的氨基酸；和(b)第二(亲本)白蛋白、白蛋白变体或其片段的C端区包含C端1至205个氨基酸；和(c)所述多肽与第一(亲本)白蛋白、白蛋白变体或其片段相比具有改变的半寿期，和/或与第一白蛋白、白蛋白变体或其片段相比具有改变的结合亲和力。所述第一白蛋白与第二白蛋白并不相同。在整个说明书中，术语‘第一(亲本)白蛋白’可与‘第一白蛋白物种’互换且术语‘第二(亲本)白蛋白’可与‘第二白蛋白物种’互换。就此而言，术语物种可作为分类学含意或非分类学含意使用。优选地，所述第一白蛋白的C端区最多205，204，203，202，201，200，175，150，125，100，70，60，55，50，45，40，35，30，25，20，19，18，17，16，15，14，13，12，11，10，9，8，7，6，5，4，3，2或1个氨基酸长。因此，所述C端区可为1，2，3，4，5，6，7，8，9，10，11，12，13，14，15，16，17，18，19，20，25，30，35，40，45，50，55，60，70，100，125，150，175，200，201，202，203，204或205个氨基酸长至1，2，3，4，5，6，7，8，9，10，11，12，13，14，15，16，17，18，19，20，25，30，35，40，45，50，55，60，70，100，125，150，175，200，201，202，203，204或205个氨基酸长。更优选地，所述第一白蛋白的C端区为1至100，2至85，2至30，10至30和最优选地12至20个氨基酸长，如12或13个氨基酸长。优选地，所述第二白蛋白的C端区为1，2，3，4，5，6，7，8，9，10，11，12，13，14，15，16，17，18，19，20，25，30，35，40，45，50，55，60，70，100，125，150，175，200，201，202，203，204或205个氨基酸长至1，2，3，4，5，6，7，8，9，10，11，12，13，14，15，16，17，18，19，20，25，30，35，40，45，50，55，60，70，100，125，150，175，200，201，202，203，204或205个氨基酸长。更优选地，所述第二白蛋白的C端区为1至100，2至85，2至30，10至30，2至20，和最优选地12或13个氨基酸长。

图3是本发明的第一个方面的示意图。显示了第一(1)和第二(2)白蛋白，其变体或片段。亦显示了根据本发明的多肽，即“嵌合”白蛋白(3)，其包含第一白蛋白，变体或其片段的N端区(N1)，和第二白蛋白，变体或其片段的C端区(C2)。与本发明公开的发明一致，所述第一白蛋白可视为“受体”白蛋白，而所述第二白蛋白可视为“供体”白蛋白。

本发明的该第一个方面亦可定义为多肽，其包含(i)第一(亲本)白蛋白、白蛋白变体或其片段的N端区；和(ii)第二(亲本)白蛋白、白蛋白变体或其片段的C端区，其中：(a)第一(亲本)白蛋白、白蛋白变体或其片段的N端区包含其来源的白蛋白、白蛋白变体或片段的至少65至100%；和(b)第二(亲本)白蛋白、白蛋白变体或其片段包含的C端区所述第二白蛋白的C段至少0.1至35%，(c)所述多肽具有与第一(亲本)白蛋白、白蛋白变体或其片段相比改变的半寿期和/或与相比改变的对FcRn的结合亲和力第一白蛋白、白蛋白变体或其片段。

优选地，所述第一白蛋白的N端区为其来源的白蛋白的长度的至少65，65.1，65.2，65.3，65.4，65.5，65.6，65.7，65.8，65.9，66，67，68，69，70，80，81，82，83，84，85，86，87，88，89，90，95，96，97，98，99，99.5，99.6，99.7，99.8，99.9%或100%。更优选地，所述第一白蛋白的N端区是其来源的白蛋白的长度的83至99.5%，95至98%和最优选地96.5至98%。优选地所述第二白蛋白的C端区为其来源的白蛋白的长度的至少0.1，0.2，0.3，0.4，0.5，1，2，3，4，5，6，7，8，9，10，11，12，13，1415，16，17，18，19，20，25，30，31，32，33，34，34.1，34.2，34.3，34.4，34.5，34.6，34.7，34.8，34.9或35%。更优选地，所述第二白蛋白的C端区为其来源的白蛋白的长度的0.1至17%，0.5至17%，2至5%和最优选地2至3.5%。

所述第二(亲本)白蛋白可位于第一(亲本)白蛋白、白蛋白变体或其片段的C端或第一(亲本)白蛋白、白蛋白变体或其片段的N端。优选地，所述第二(亲本)白蛋白、白蛋白变体或其片段位于第一(亲本)白蛋白、白蛋白变体或其片段的C端。

所述第一和/或第二白蛋白可选自任何白蛋白如人血清白蛋白(例如AAA98797或P02768-1，SEQ ID NO:2(成熟)，SEQ ID NO:4(不成熟))，灵长类血清白蛋白，(如黑猩猩血清白蛋白(例如预测序列XP_517233.2SEQ ID NO:5)，大猩猩血清白蛋白或恒河猴血清白蛋白(例如NP_001182578，SEQ ID NO:6)，啮齿类血清白蛋白(如仓鼠血清白蛋白(例如A6YF56，SEQ ID NO:7)，豚鼠血清白蛋白(例如Q6WDN9-1，SEQ ID NO:8)，小鼠血清白蛋白(例如AAH49971或P07724-1Version3，SEQ ID NO:9)和大鼠血清白蛋白(例如AAH85359或P02770-1Version2，SEQ ID NO:10)))，牛类血清白蛋白(例如牛血清白蛋白P02769-1，SEQ ID NO:11)，马类血清白蛋白如马血清白蛋白(例如P35747-1，SEQ ID NO:12)或驴血清白蛋白(例如Q5XLE4-1，SEQ ID NO:13)，兔血清白蛋白(例如P49065-1Version2，SEQ ID NO:14)，山羊血清白蛋白(例如ACF10391，SEQ ID NO:15)，绵羊血清白蛋白(例如P14639-1，SEQ ID NO:16)，犬血清白蛋白(例如P49822-1，SEQ ID NO:17)，鸡血清白蛋白(例如P19121-1Version2，SEQ ID NO:18)和猪血清白蛋白(例如P08835-1Version2，SEQ ID NO:19)或与此种白蛋白具有至少70，75，80，85，90，95，96，97，98或至少99%氨基酸同一性的多肽。所述第一和/或第二白蛋白可为不成熟(即具有前序列和/或前肽序列)或成熟形式。所述第一白蛋白与第二白蛋白并不相同。

优选地，所述多肽包含第一白蛋白、白蛋白变体或其片段的所有氨基酸，除了C端1至205个氨基酸，如C端2，3，4，5，6，7，8，9，10，11，12，13，14，15，16，17，18，19，20，25，30，35，40，45，50，55，60，70，100，125，150，175，200，201，202，203，204或205至3，4，5，6，7，8，9，10，11，12，13，14，15，16，17，18，19，20，25，30，35，40，45，50，55，60，70，100，125，150，175，200，201，202，203，204或205个氨基酸之外。优选地，所述多肽包含至少第一白蛋白、白蛋白变体或其片段的65，65.1，65.2，65.3，65.4，65.5，65.6，65.7，65.8，65.9，66，67，68，69，70，80，90，95，96，97，98，99，99.5，99.6，99.7，99.8，99.9或100%。片段可包含或组成为全长白蛋白的至少N端65，65.1，65.2，65.3，65.4，65.5，65.6，65.7，65.8，65.9，66，67，68，69，70，80，85，90，95，96，97，98或99%和/或包含或组成为至少全长白蛋白，如上述公开的白蛋白的N端20，50，100，200，300，400，450，475，500，525，550，560，565，566，567，568，569，570，571，572，573，574，575，576，577，578，579，580，581，582，583或584个氨基酸。所述片段可能包含或可能不包含如下所提及的一个或多个(几个)点突变。

根据本发明特别优选的多肽在位置573(相对于野生型HSA编号)的位置573包含Pro残基。本领域技术人员可在其它白蛋白和/或在片段中通过序列比对，如上所述那些，特别是提供于图1和图2中的那些，来鉴定等同于573的位置。

所述多肽可与其来源的第一(亲本)或第二(亲本)白蛋白(或变体或其片段)相比更长，相同长度，或更短。例如，所述多肽可为180至700个氨基酸长如180，200，250，300，350，400，450，500，550，600，650，700至180，200，250，300，350，400，450，500，550，600，650，700个氨基酸长。优选地，本发明的第一个方面的多肽与其来源的第一(亲本)白蛋白为相同长度，加或减1，2，3，4，5，6，7，8，9，10，11，12，13，14或15个氨基酸，更优选相同长度，加或减1或2个氨基酸。

所述第一(亲本)白蛋白可包含或组成为(i)白蛋白的域III，(ii)一种或多种白蛋白的域I和域III，(iii)一种或多种白蛋白的域II和域II，或(iv)描述于(i)、(ii)或(iii)的一种或多种域的片段。此种片段可为或可包含域III的C端至少80，85，90，91，92，93，94，95，96，97，98或99%和/或域III的C端至少165，170，175，180，185，190，192，194，196，198，200，201，202，203，204或205个氨基酸。域I，II和III可相对于HSA(SEQ ID NO:2)定义。例如，HSA域I可包含或组成为SEQ ID NO:2的氨基酸1至194(±1至15个氨基酸)，HSA域II可包含或组成为SEQ ID NO:2的氨基酸192(±1至15个氨基酸)至387(±1至15个氨基酸)和域III可包含或组成为SEQ ID NO:2的氨基酸残基381(±1至15氨基酸)至585(±1至15氨基酸)。“±1至15个氨基酸”意指残基数量可因对于所述氨基酸位置的C端和/或N端加减1，2，3，4，5，6，7，8，9，10，11，12，13，14，或15个氨基酸而偏差。域I，II和III的实例由Dockal等(The Journal of Biological Chemistry，1999，Vol.274(41):29303-29310)和Kjeldsen等(Protein Expression and Purification，1998，Vol13:163-169)描述，并列于下表。

本领域技术人员可通过与HSA的氨基酸序列比对来在非人白蛋白中鉴定域I，II和III，所述比对例如使用Needleman-Wunsch算法(Needleman和Wunsch，1970，J.Mol.Biol.48：443-453)确定，如EMBOSS软件包(EMBOSS：欧洲分子生物学开放软件组(The European Molecular Biology Open SoftwareSuite)，Rice等，2000，Trends Genet.16:276-277)的Needle程序，优选为3.0.0版或之后的版本中执行的。所用的可选参数为缺口开放罚分(gap open penalty)10，缺口延伸罚分(gap extension penalty)0.5，和EBLOSUM62(BLOSUM62的EMBOSS版)取代矩阵。其它合适的软件包括MUSCLE(通过log期待的多重序列比较(Multiple sequence comparison by log-expectation)，Robert C.Edgar，版本3.6，http://www.drive5.com/muscle;Edgar(2004)Nucleic Acids Research32(5)，1792-97和Edgar(2004)BMC Bioinformatics，5(1):113)，其可以用户手册中描述的缺省设定来使用(版本3.6，2005年9月)。比3.6更迟的MUSCLE版本亦可用于本发明的任何方面。合适的比对的实例提供于PCT/EP2011/055577(WO2011/124718，其通过全文提述并入本文)的图4和5。

本发明的(嵌合)多肽可包含第一白蛋白、白蛋白变体或其片段的N端区；和(ii)第二白蛋白、白蛋白变体或其片段的C端区，如本文中所述，其中，当将第一白蛋白和第二白蛋白的氨基酸序列进行比对时，第二白蛋白的C段的第一个氨基酸起始于第一白蛋白的N端区的最后氨基酸紧接着下游处的氨基酸。例如，所述多肽可包含成熟HSA的氨基酸1至572(即第一白蛋白的C端)和成熟恒河猴白蛋白的氨基酸573至584或成熟绵羊白蛋白的氨基酸572至583(即第二白蛋白的N端)。即，基于第一和第二白蛋白的比对(例如图1或2)，优选第一白蛋白的N端区和第二白蛋白的C端区之间的交叉是在等同的氨基酸位置进行的。

所述第一或第二白蛋白，或变体或其片段，在一个或多个(几个)下述位置上可能包含或可能不包含点突变：417，440，464，490，492，493，494，495，496，499，500，501，503，504，505，506，510，535，536，537，538，540，541，542，550，573，574，575，577，578，579，580，581，582和584。所述位置相对于全长HSA(SEQ ID NO:2)定义。本领域技术人员可在来自其它物种的全长白蛋白和/或来自任何物种的白蛋白的变体或片段中，例如通过使用多重比对软件，如上述那些，来鉴定等同位置。合适的比对的实例提供于图1和2。

如SEQ ID NO:2中公开的HSA或其任何天然存在的等位基因，是根据本发明优选的第一白蛋白。此外，HSA(SEQ ID NO:2)是“较长”或“较短”的本申请或结合亲和力可加以比较的优选参照。

所述第一和/或第二白蛋白可能包含或可能不包含导入了一个或多个可缀合的Cys残基的白蛋白(“硫代白蛋白”)，如描述于WO2010/092135的那些(通过提述并入本文)。“可缀合的”意指可使用该Cys进行缀合，例如其不二硫键合于白蛋白内部的另一个Cys残基。

根据本发明的第一个方面的多肽可具有(i)与所述第一白蛋白，变体或其片段相比较短的半寿期，或更优选地，(ii)与所述第一白蛋白，变体或其片段相比较长的半寿期。术语“较长”和“较短”如上所定义。根据本发明第一个方面的多肽可具有(i)与所述第一白蛋白，变体或其片段相比较弱的对FcRn的结合亲和力，或更优选地，(ii)与所述第一白蛋白，变体或其片段相比较强的对FcRn的结合亲和力。术语“较强”和“较弱”如上所定义。

本发明的第二个方面涉及编码本发明第一个方面的多核苷酸。所述多核苷酸可为或可不为载体如质粒的一部分。所述多核苷酸可或可不包含于宿主细胞或宿主生物中。因此，本发明亦涉及编码任何本发明的变体的分离的多核苷酸。此外，本发明亦涉及包含编码本发明的变体的多核苷酸的核酸构建体，所述分离的多核苷酸与一个或多个(几个)调控序列可操作地连接，所述调控序列在合适的宿主细胞中在与该调控序列相容的条件下指导编码序列的表达。

可以用许多方式操作多核苷酸以提供变体的表达。依赖于表达载体，在将多核苷酸插入载体之前对其进行操作可能是理想的或必需的。使用重组DNA方法修饰多核苷酸的技术是本领域熟知的。

调控序列可以是启动子序列，其由宿主细胞识别以供表达多核苷酸。启动子序列含有介导变体的表达的转录调控序列。启动子可以是在宿主细胞中显示转录活性的任何核酸序列，包括突变的、截短的和杂合的启动子，并且可以从编码与宿主细胞同源或异源的胞外或胞内多肽的基因获得。

在酵母宿主中，有用的启动子从如下酶的基因获得：酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)烯醇化酶(ENO-1)、酿酒酵母蛋白酶A(PRA1)、酿酒酵母蛋白酶B(PRB1)、酿酒酵母翻译延伸因子(TEF1)、酿酒酵母翻译延伸因子(TEF2)、酿酒酵母半乳糖激酶(GAL1)、酿酒酵母醇脱氢酶/甘油醛-3-磷酸脱氢酶(ADH1,ADH2/GAP)、酿酒酵母丙糖磷酸异构酶(TPI)、酿酒酵母金属硫蛋白(CUP1)和酿酒酵母3-磷酸甘油酸激酶。对于酵母宿主细胞有用的其它启动子由Romanos等,1992,Yeast8:423-488描述。

本领域技术人员已知供用于稻米和哺乳动物细胞如CHO或HEK的有用的启动子。例如，在稻米宿主中，优选的终止子获得自花椰菜花叶病毒35SRNA基因(CaMV35S)，玉米醇脱氢酶(Adh1)和αAmy3。

在哺乳动物宿主细胞如CHO或HEK中，有用的启动子可获得自巨细胞病毒(CMV)和CAG杂合启动子(CMV早期增强子元件和鸡β-肌动蛋白启动子)，猿猴空泡病毒40(SV40)。

调控序列也可以是合适的转录终止子序列，其由宿主细胞识别以终止转录。所述终止子序列与编码所述变体的多核苷酸的3’末端可操作地连接。可使用在宿主细胞中有功能的任何终止子。

对于酵母宿主细胞优选的终止子从如下酶的基因获得：酿酒酵母烯醇化酶、酿酒酵母细胞色素C(CYC1)、酿酒酵母醇脱氢酶(ADH1)和酿酒酵母甘油醛-3-磷酸脱氢酶。对于酵母宿主细胞有用的其它终止子由Romanos等,1992,见上描述。本领域技术人员已知供用于稻米和哺乳动物细胞如CHO或HEK的有用的终止子。例如，在稻米宿主中，优选的终止子获得自根癌土壤杆菌(Agrobacterium tumefaciens)蓝曙红(nopaline)合酶(Nos)和花椰菜花叶病毒35SRNA基因(CaMV35S)。

调控序列还可以是合适的前导序列，其是对于宿主细胞的翻译重要的mRNA非翻译区。前导序列可操作地连接于编码变体的多核苷酸的5’末端。可使用在宿主细胞中有功能的任何前导序列。

对于酵母宿主细胞合适的前导序列从如下酶的基因获得：酿酒酵母烯醇化酶(ENO-1)、酿酒酵母3-磷酸甘油酸激酶、酿酒酵母α因子和酿酒酵母醇脱氢酶/甘油醛-3-磷酸脱氢酶(ADH2/GAP)。

调控序列也可以是聚腺苷酸化序列，其是与变体编码序列的3’末端可操作地连接的序列，并且在转录时，宿主细胞将其识别为向转录的mRNA添加聚腺苷残基的信号。可使用在宿主细胞中有功能的任何聚腺苷酸化序列。

对于酵母宿主细胞有用的聚腺苷酸化序列由Guo和Sherman,1995,Mol.Cellular Biol.15:5983-5990描述。

调控序列还可以是信号肽编码区，其编码与变体的N端相连的信号肽，并且指导变体进入细胞分泌途径。多核苷酸的编码序列5’端可固有地包含信号肽编码区，该信号肽编码区与编码变体的编码区的区段一起天然地连接在翻译阅读框中。或者，编码序列5’端可含有对于所述编码区为外源的信号肽编码序列。外源信号肽编码区在编码序列不天然地含有信号肽编码区时可为必需的。或者，外源信号肽编码区可以简单地取代天然信号肽编码区以增强变体的分泌。然而，可使用指导表达的变体进入宿主细胞的分泌途径的任何信号肽编码区。

对于酵母宿主细胞有用的信号肽从酿酒酵母α因子和酿酒酵母转化酶的基因获得。其它有用的信号肽编码序列描述于Romanos等，1992，见上。本领域技术人员知道供用于稻米和哺乳动物细胞如CHO或HEK的有用的信号肽。

当信号肽和前肽区二者均出现在变体的N端时，使前肽区的位置紧接着(next to)变体N端，并且使信号肽区的位置紧接着前肽区的N端。

所述多核苷酸，无论是否在载体如质粒内，可包含于宿主细胞，如本文中公开的那些中。

本发明的第三个方面涉及产生根据本发明的多肽的方法。所述方法适用于本发明的所有方面，包括白蛋白，及其变体、片段和融合物。如下所述，本领域技术人员知道如何产生多肽的融合物、缀合物、缔合物和组合物，并因此可产生白蛋白，其变体和片段的融合物、缀合物、缔合物和组合物。此种方法可包括：

(a)提供编码所述白蛋白，其变体、片段和/或融合物的核酸；

(b)在合适的细胞中表达核酸；和

(c)回收白蛋白，其变体、片段和/或融合物。

此类方法对于本领域技术人员是已知的，并在参考文献如(J.Sambrook,E.F.Fritsch和T.Maniatis,1989,Molecular Cloning,A Laboratory Manual,第2版,Cold Spring Harbor,New York)中给出。

用于制备白蛋白的变体，其片段，包含所述变体或片段的融合多肽的方法可包括：

i)提供编码第一(亲本)白蛋白、白蛋白变体或其片段的N端区和第二(亲本)白蛋白、白蛋白变体或其片段的C端区的多核苷酸，且其中所述多核苷酸任选地在所得白蛋白的N和/或C段编码一种或多种(几种)融合伴侣多肽；其中：

(a)第一(亲本)白蛋白、白蛋白变体或其片段的N端区包含除了C端1至205个氨基酸之外其来源的分子的氨基酸；和(b)第二(亲本)白蛋白、白蛋白变体或其片段的C端区包含C端1至205个氨基酸；和(c)所述多肽具有与第一(亲本)白蛋白、白蛋白变体或其片段相比改变的半寿期和/或与所述第一白蛋白、白蛋白变体或其片段相比改变的对FcRn的结合亲和力；

和/或

(a)第一(亲本)白蛋白、白蛋白变体或其片段的N端区包含其来源的白蛋白、白蛋白变体或片段的至少65至100%；和(b)第二(亲本)白蛋白、白蛋白变体或其片段的C端区包含所述第二白蛋白的C端至少0.5至35%，(c)所述多肽具有与第一(亲本)白蛋白、白蛋白变体或其片段或其它参照如HSA相比改变的半寿期和/或与所述第一(亲本)白蛋白、白蛋白变体或其片段或其它参照如HSA相比改变的对FcRn的结合亲和力；

ii)在宿主细胞中表达所述多核苷酸；和

iii)回收所得的多肽或融合多肽。

优选地，所得多肽的性质为根据本发明的第一和/或第四方面，例如N和C段相对于彼此的位置；亲本白蛋白而来源和/或序列，所得的白蛋白的长度。

本领域技术人员理解对于本发明的第一个方面的偏好，特别是所述第一和/或第二白蛋白的C’和/或N’段的参数亦适用于本发明的第三个方面。本领域技术人员亦理解本发明的任何方面可与本发明的一个或多个其它方面和/或一个或多个权利要求相组合。

本发明亦涉及用于改变分子半寿期的方法，其包括：

(a)当所述分子是多肽时，将该分子融合于根据本发明的多肽或将该分子缀合于根据本发明的多肽或融合多肽；

(b)当所述分子并非多肽时，将该分子缀合于根据本发明的多肽或融合多肽。

“分子”的实例包括可用于治疗、预防(包括作为活性药物成分或作为赋形剂用于疫苗的那些)、成像和诊断，如本文中所述的那些。

所述核酸可包含于基因构建体，其中经修饰的核酸与合适的调节遗传元件如启动子、终止子、激活位点、核糖体结合位点等可操作地连接。可将所述基因构建体导入合适的宿主生物，在导致所述变体表达的条件下培养经转化的宿主生物，并回收所述变体。所有这些技术在本领域是公知的，且一般技术人员具有设计合适的方法以供制备本发明的具体变体的能力。

亦可将本发明的变体多肽连接于信号肽以使得所述变体多肽在经转化的宿主生物培养过程中分泌入生长培养基。使得变体多肽分泌入生长培养基以便回收和纯化一般是有利的。

用于制备变体多肽的技术亦公开于WO2009019314(通过提述并入)，且这些技术亦可适用于本发明。

白蛋白已成功地作为重组蛋白在多种宿主包括真菌(包括但不限于曲霉属(Aspergillus)(WO06066595)、克鲁维酵母属(Kluyveromyces)(Fleer1991,Bio/technology9,968-975)，毕赤酵母属(Pichia)(Kobayashi1998TherapeuticApheresis2,257-262)和酵母属(Saccharomyces)(Sleep1990,Bio/technology8,42-46))，细菌(Pandjaitab2000,J.Allergy Clin.Immunol.105,279-285))，动物(Barash1993,Transgenic Research2,266-276)和植物(包括但不限于马铃薯和烟草(Sijmons1990,Bio/technology8,217和Farran2002,Transgenic Research11,337-346)和稻米例如稻(Oryza sativa)，和哺乳动物细胞如CHO和HEK中得到表达。本发明的变体多肽优选在合适的宿主细胞中通过重组产生。原则上，任何能够以合适量产生多肽的宿主细胞均可使用，且一般技术人员具有根据本发明选择合适宿主的能力。优选的宿主生物是酵母，优选选自酵母属(Saccharomycacae)，更优选为酿酒酵母。

可使用已知的分离技术如过滤、离心、层析和亲和分离技术等的组合从生长培养基回收和纯化本发明的变体多肽。一般技术人员有使用此类已知分离步骤的特定组合纯化所述变体的能力。作为可应用于本发明的变体的纯化技术的实例，可提及WO0044772的教导。

本发明的变体多肽可用于将治疗或预防(包括疫苗)上有益的化合物递送至有此需要的动物或人类个体。此类治疗或预防上有益的化合物包括但不限于用于诊断如多种显影技术的标记和容易检测的化合物；药学活性化合物如药物，或特异性结合模块如抗体。本发明的变体甚至可连接至两种或更多种不同的治疗或预防上有益的化合物，例如一种抗体和一种药物，这赋予组合分子特异性结合于所需的靶的能力，并由此对于该特定靶提供高浓度的所连接的药物。

本发明的第四个方面涉及根据本发明的白蛋白，变体或片段的融合物，并涉及产生和/或使用此类融合物的方法。

根据本发明的融合多肽包含白蛋白，变体或其片段以及“融合伴侣”。融合优选为基因融合，例如单个开读框编码融合物的白蛋白部分和融合伴侣两者。所述融合伴侣原则上可为任何多肽，但一般优选所述融合伴侣是具有治疗、预防或诊断特性的多肽。包含白蛋白的融合多肽在本领域中是已知的。已发现此种包含或组成为白蛋白以及融合伴侣多肽的融合多肽与未融合的伴侣多肽本身相比具有较长的血浆半寿期。根据本发明，可改变本发明的融合多肽相对于现有技术的相应融合多肽的血浆半寿期。关于与融合伴侣多肽融合的白蛋白和合适的融合伴侣多肽的进一步教导可见于WO01/79271A(特别是第9页和/或表1)，WO03/59934A(特别是表1)和WO01/078480(特别是表1)(其每一个均通过全文提述并入本文)。根据本发明的白蛋白融合物的半寿期与融合伴侣多肽本身的半寿期相比可较长或较短。根据本发明的白蛋白融合物的半寿期可与包含或组成为天然HSA(而非根据本发明的白蛋白变体或衍生物)和融合伴侣的类似/等同的白蛋白融合物的半寿期相比较长或较短。优选地，所述融合伴侣并非白蛋白，变体或其片段。

本发明的第五个方面涉及根据本发明的白蛋白，变体或片段的缀合物(缀合)，并涉及产生和/或使用此类缀合物的方法。因此，可将根据本发明的白蛋白，其变体或片段使用本领域中已知的技术缀合于第二分子(“缀合伴侣”)。所述第二分子可包含治疗、预防(例如疫苗)或诊断模块。在一个具体实施方案中所述缀合可用作如在显影中的诊断工具，或所述第二分子可为治疗或预防化合物，且在该实施方案中所述缀合可用于治疗或预防目的，其中所述缀合物具有所述治疗或预防化合物的治疗或预防特性以及白蛋白的较长血浆半寿期。白蛋白和治疗或预防分子的缀合物在本领域中是已知的，且已验证正如此，此类缀合与未缀合的游离的治疗或预防分子相比具有较长的血浆半寿期。根据本发明，可改变根据本发明的缀合物与现有技术的对应缀合物相比的血浆半寿期。“改变”包括增加血浆半寿期和减少血浆半寿期。增加血浆半寿期是优选的。所述缀合物可方便地通过HSA表面上存在的游离硫基团(成熟HSA的氨基酸残基34)使用公知的化学方法来连接。

在一个特别优选的方面，将所述变体白蛋白及其片段缀合于有益的治疗或预防(例如疫苗)化合物，并将该缀合物用于治疗或预防有此需要的患者中的病状，其中所述病状响应该特别选定的治疗或预防化合物。用于将此种治疗或预防化合物缀合于变体白蛋白或其片段的技术在本领域中是已知的。WO2009/019314公开了适于将治疗或预防化合物缀合于多肽的技术的实例，且该技术亦可适用于本发明。此外，WO2009/019314公开了可缀合于取代的转铁蛋白的化合物和模块的实例，且这些实例亦可应用于本发明。WO2009/019314的教导通过提述并入本文。

HSA以其天然形式含有一个硫醇基团，其可方便地用于缀合。作为该方面中的具体实施方案，所述变体白蛋白或其片段可进一步包含提供用于在其表面生成其他游离硫醇基团的修饰。这具有下述益处：使得所述变体白蛋白或其片段的有效负载增加，从而可将超过一个分子的治疗或预防化合物缀合于每分子的变体白蛋白或其片段，或可将两个或更多个不同的治疗或预防化合物缀合于每分子的变体白蛋白或其片段，例如，将具有靶向特性的化合物如对例如肿瘤具特异性的抗体；以及细胞杀伤药物缀合于变体白蛋白或其片段，由此构建针对肿瘤的高度特异性药物。对可修饰以在表面提供更多游离硫醇基团的特定残基的教导亦可见于共同待决的专利申请WO2010/092135，其通过提述并入本文。优选地，所述缀合伴侣并非白蛋白，变体或其片段。

本发明的第六个方面涉及根据本发明的白蛋白，变体或片段的缔合物，且涉及产生和/或使用此类缔合物的方法。在此情况下，术语“缔合物”旨在意指包含白蛋白变体或其片段以及另一种通过非共价结合连接或缔合于所述变体白蛋白或其片段的另一种化合物的化合物。作为此种缔合物的实例，可提及由变体白蛋白和通过疏水相互作用缔合于白蛋白的脂质的缔合物。此类缔合物在本领域是已知的，且其可使用公知技术制备。作为本发明优选的缔合物的实例，可提及包含变体白蛋白和紫杉醇的缔合物。缔合物的进一步的实例包括治疗、预防(包括疫苗)、诊断、成像或其它有益的模块，如本文中所述的那些。

根据本发明的白蛋白缔合物的本申请可与所述“其它化合物”本身的本申请相比较长或较短。根据本发明的白蛋白缔合物的本申请可与包含或组成为参照白蛋白如天然HSA(而非根据本发明的白蛋白变体或衍生物)和所述“其它化合物”的类似/等同的白蛋白缔合物的半寿期相比较长或较短。用于制备缔合物的方法对于本领域技术人员是公知的，例如，用脂质化合物(Lipo-compound)配制(通过缔合)HSA描述于Hussain,R.和Siligardi,G.(2006)International Journal ofPeptide Research and Therapeutics,Vol.12,NO:3,pp.311-315。

对于本发明的所有方面，融合伴侣多肽和/或缀合物可包含下述一种或多种(几种)：4-1BB配体，5-螺旋，人C-C趋化因子，人L105趋化因子，命名为huL105_3.的人L105趋化因子，由γ-干扰素诱导的单核因子(MIG)，部分CXCR4B蛋白，血小板碱性蛋白(PBP)，α1-抗胰蛋白酶，ACRP-30类似物；补体成分C1q C，腺样-表达的趋化因子(ADEC)，aFGF；FGF-1，AGF，AGF蛋白，白蛋白，依托泊苷(etoposide)，血管他丁(angiostatin)，炭疽疫苗，对脑衰蛋白有特异性的抗体，antistasin，抗TGFβ家族抗体，抗凝血酶III(antithrombin III)，APM-1；ACRP-30；Famoxin，载脂蛋白物种(apo-lipoprotein species)，芳基硫酸酯酶B(ArylsulfataseB)，b57蛋白，BCMA，Β-血小板球蛋白(β-TG)，bFGF；FGF2，凝血因子，BMP加工酶Furin，BMP-10，BMP-12，BMP-15，BMP-17，BMP-18，BMP-2B，BMP-4，BMP-5，BMP-6，BMP-9，骨形态形成蛋白-2，降钙素(calcitonin)，钙激活中性蛋白酶-10a，钙激活中性蛋白酶-10b，钙激活中性蛋白酶-10c，癌症疫苗，羧肽酶，C-C趋化因子，MCP2，CCR5变体，CCR7，CCR7，CD11a Mab，CD137；4-1BB受体蛋白，CD20Mab，CD27，CD27L，CD30，CD30配体，CD33免疫毒素，CD40，CD40L，CD52Mab，Cerebus蛋白，嗜酸细胞活化趋化因子(Chemokine Eotaxin)，趋化因子hIL-8，趋化因子hMCP1，趋化因子hMCP1a，趋化因子hMCP1b，趋化因子hMCP2，趋化因子hMCP3，趋化因子hSDF1b，趋化因子MCP-4，趋化因子TECK和TECK变体，趋化因子样蛋白IL-8M1全长和成熟，趋化因子样蛋白IL-8M10全长和成熟，趋化因子样蛋白IL-8M3，趋化因子样蛋白IL-8M8全长和成熟，趋化因子样蛋白IL-8M9全长和成熟，趋化因子样蛋白PF4-414全长和成熟，趋化因子样蛋白PF4-426全长和成熟，趋化因子样蛋白PF4-M2全长和成熟，霍乱疫苗，Chondromodulin样蛋白，c-kit配体；SCF；肥大细胞生长因子；MGF；纤维肉瘤来源的干细胞因子，CNTF及其片段(如CNTFAx15`(Axokine^TM))，前体或活性形式的凝血因子，胶原，补体C5Mab，结缔组织活化蛋白-III，CTAA16.88Mab，CTAP-III，CTLA4-Ig，CTLA-8，CXC3，CXC3，CXCR3；CXC趋化因子受体3，cyanovirin-N，Darbepoetin，命名为exodus，命名为huL105_7.，DIL-40，DNA酶，EDAR，EGF受体Mab，ENA-78，内皮他丁(Endostatin)，嗜酸细胞活化趋化因子(Eotaxin)，上皮嗜中性粒细胞活化蛋白-78，EPO受体；EPOR，红细胞生成素(erythropoietin)(EPO)和EPO模拟物，优托品(Eutropin)，Exodus蛋白，因子IX，因子VII，因子VIII，因子X和因子XIII，FAS配体抑制蛋白(DcR3)，FasL，FasL，FasL，FGF，FGF-12；成纤维细胞生长因子同源因子-1，FGF-15，FGF-16，FGF-18，FGF-3；INT-2，FGF-4；白树霉素(gelonin)，HST-1；HBGF-4，FGF-5，FGF-6；肝素结合分泌的转化因子-2(Heparinbinding secreted transforming factor-2)，FGF-8，FGF-9；神经胶质活化因子，纤维蛋白原(fibrinogen)，flt-1，flt-3配体，促卵泡激素α亚基，促卵泡激素β亚基，促卵泡素(Follitropin)，Fractalkine，片段，肌纤维蛋白肌钙蛋白I(Troponin I)，FSH，半乳糖苷酶(Galactosidase)，半乳凝素-4(Galectin-4)，G-CSF，GDF-1，基因疗法，神经胶质瘤-衍生的生长因子，胰高血糖素，胰高血糖素样肽，葡糖脑苷酯酶(Glucocerebrosidase)，葡糖氧化酶(glucose oxidase)，葡糖苷酶(Glucosidase)，Glycodelin-A；黄体酮相关子宫内膜蛋白，GM-CSF，促性腺素(gonadotropin)，粒细胞趋化蛋白-2(GCP-2)，粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子，生长激素，生长相关癌基因-α(GRO-α)，生长相关癌基因β(GRO-β)，生长相关癌基因γ(GRO-γ)，hAPO-4；TROY，hCG，乙型肝炎表面抗原，乙型肝炎疫苗，HER2受体Mab，水蛭素(hirudin)，HIV gp120，HIV gp41，HIV抑制肽，HIV抑制肽，HIV抑制肽，HIV蛋白酶抑制肽，HIV-1蛋白酶抑制剂，HPV疫苗，人6CKine蛋白，人Act-2蛋白，人脂肪形成抑制因子，人B细胞刺激因子-2受体，人β-趋化因子H1305(MCP-2)，人C-C趋化因子DGWCC，人CC趋化因子ELC蛋白，人CC型趋化因子白细胞介素C，人CCC3蛋白，人CCF18趋化因子，命名为SLC(二级淋巴趋化因子)的人CC-型趋化因子蛋白，人趋化因子β-8短形式(short form)，人趋化因子C10，人趋化因子CC-2，人趋化因子CC-3，人趋化因子CCR-2，人趋化因子Ckβ-7，人趋化因子ENA-78，人趋化因子嗜酸细胞活化趋化因子，人趋化因子GROα，人趋化因子GROα，人趋化因子GROβ，人趋化因子HCC-1，人趋化因子HCC-1，人趋化因子I-309，人趋化因子IP-10，人趋化因子L105_3，人趋化因子L105_7，人趋化因子MIG，人趋化因子MIG-β蛋白，人趋化因子MIP-1α，人趋化因子MIP1β，人趋化因子MIP-3α，人趋化因子MIP-3β，人趋化因子PF4，人趋化因子蛋白331D5，人趋化因子蛋白61164，人趋化因子受体CXCR3，人趋化因子SDF1α，人趋化因子SDF1β，人趋化因子ZSIG-35，人Chr19Kine蛋白，人CKβ-9，人CKβ-9，人CX3C111氨基酸趋化因子，人DNAX白细胞介素-40，人DVic-1C-C趋化因子，人EDIRF I蛋白序列，人EDIRF II蛋白序列，人嗜曙红细胞CC型趋化因子嗜酸细胞活化趋化因子，人嗜曙红细胞-表达的趋化因子(EEC)，人快速颤搐骨骼肌肌钙蛋白C(Human fast twitch skeletal muscle troponinC)，人快速颤搐骨骼肌肌钙蛋白I，人快速颤搐骨骼肌肌钙蛋白亚基C，人快速颤搐骨骼肌肌钙蛋白亚基I蛋白，人快速颤搐骨骼肌肌钙蛋白亚基T，人快速颤搐骨骼肌肌钙蛋白T，人胎儿脾脏表达的趋化因子，FSEC，人GM-CSF受体，人gro-α趋化因子，人gro-β趋化因子，人gro-γ趋化因子，人IL-16蛋白，人IL-1RD10蛋白序列，人IL-1RD9，人IL-5受体α链，人IL-6受体，人IL-8受体蛋白hIL8RA，人IL-8受体蛋白hIL8RB，人IL-9受体蛋白，人IL-9受体蛋白变体#3，人IL-9受体蛋白变体片段，人IL-9受体蛋白变体片段#3，人白细胞介素1δ，人白细胞介素10，人白细胞介素10，人白细胞介素18，人白细胞介素18衍生物，人白细胞介素-1β前体，人白细胞介素-1β前体，人白细胞介素-1受体辅助蛋白，人白细胞介素-1受体拮抗剂β，人白细胞介素-1型-3受体，人白细胞介素-10(前体)，人白细胞介素-10(前体)，人白细胞介素-11受体，人白细胞介素-1240kD亚基，人白细胞介素-12β-1受体，人白细胞介素-12β-2受体，人白细胞介素-12p35蛋白，人白细胞介素-12p40蛋白，人白细胞介素-12受体，人白细胞介素-13α受体，人白细胞介素-13β受体，人白细胞介素-15，来自克隆P1的人白细胞介素-15受体，人白细胞介素-17受体，人白细胞介素-18蛋白(IL-18)，人白细胞介素-3，人白细胞介素-3受体，人白细胞介素-3变体，人白细胞介素-4受体，人白细胞介素-5，人白细胞介素-6，人白细胞介素-7，人白细胞介素-7，人白细胞介素-8(IL-8)，人胞内IL-1受体拮抗剂，人IP-10和HIV-1gp120超变区融合蛋白，人IP-10和人Muc-1核心表位(VNT)融合多肽，人肝和活化调节趋化因子(LARC)，人Lkn-1全长和成熟蛋白，人乳腺相关趋化因子(MACK)蛋白全长和成熟，人成熟趋化因子Ckβ-7，人成熟gro-α，用于治疗败血病的人成熟gro-γ多肽，人MCP-3和人Muc-1核心表位(VNT)融合蛋白，人MI10蛋白，人MI1A蛋白，人单核细胞化学引诱物因子hMCP-1，人单核细胞化学引诱物因子hMCP-3，人单核细胞趋化前蛋白(MCPP)序列，人神经趋化因子(neurotactin)趋化因子样域，人非-ELR CXC趋化因子H174，人非-ELR CXC趋化因子IP10，人非-ELR CXC趋化因子Mig，人PAI-1突变体，具有IL-16活性的人蛋白，具有IL-16活性的人蛋白，人二级淋巴样趋化因子(SLC)，人SISD蛋白，人STCP-1，人基质细胞衍生的趋化因子，SDF-1，人T细胞混合淋巴细胞反应表达的趋化因子(TMEC)，人胸腺和活化调节细胞因子(TARC)，人胸腺表达的，人TNF-α，人TNF-α，人TNF-β(LT-α)，人类型CC趋化因子嗜酸细胞活化趋化因子3蛋白序列，人类型II白细胞介素-1受体，人野生型白细胞介素-4(hIL-4)蛋白，人ZCHEMO-8蛋白，人源化抗VEGF抗体，及其片段，人源化抗VEGF抗体，及其片段，透明质酸酶(Hyaluronidase)，ICE10kD亚基，ICE20kD亚基，ICE22kD亚基，艾杜糖醛酸2-硫酸酯酶(Iduronate-2-sulfatase)，艾杜糖苷酸酶(Iduronidase)，IL-1α，IL-1β，IL-1抑制剂(IL-1i)，IL-1成熟，IL-10受体，IL-11，IL-11，IL-12p40亚基，IL-13，IL-14，IL-15，IL-15受体，IL-17，IL-17受体，Il-17受体，Il-17受体，IL-19，IL-1i片段，IL1-受体拮抗剂，IL-21(TIF)，含IL-3的融合多肽，IL-3突变体蛋白，IL-3变体，IL-3变体，IL-4，IL-4突变蛋白，IL-4突变蛋白Y124G，IL-4突变蛋白Y124X，IL-4突变蛋白，Il-5受体，IL-6，Il-6受体，IL-7受体克隆，IL-8受体，IL-9成熟蛋白变体(Met117型)，免疫球蛋白或基于免疫球蛋白的分子，或任一者的片段(例如Small Modular ImmunoPharmaceutical^TM(“SMIP”)或dAb，Fab’片段，F(ab’)2，scAb，scFv或scFv片段)，包括但不限于纤溶酶原，流感疫苗，抑制素(Inhibin)α，抑制素β，胰岛素，胰岛素样生长因子，整联蛋白Mab，间-α胰蛋白酶抑制剂，间-α胰蛋白酶抑制剂，干扰素γ-诱导蛋白(IP-10)，干扰素(如干扰素α种和亚种，干扰素β种和亚种，干扰素γ种和亚种)，干扰素(如干扰素α种和亚种，干扰素β种和亚种，干扰素γ种和亚种)，白细胞介素6，白细胞介素8(IL-8)受体，白细胞介素8受体B，白细胞介素-1α，白细胞介素-2受体相关蛋白p43，白细胞介素-3，白细胞介素-4突变蛋白，白细胞介素-8(IL-8)蛋白，白细胞介素-9，白细胞介素-9(IL-9)成熟蛋白(Thr117型)，白细胞介素(如IL10，IL11和IL2)，白细胞介素(如IL10，IL11和IL2)，日本脑炎疫苗，Kalikrein抑制剂，角质细胞生长因子，Kunitz域蛋白(如抑肽酶(aprotinin)，淀粉状前体蛋白和WO03/066824中所述那些，具有或不具有白蛋白融合)，Kunitz域蛋白(如抑肽酶(aprotinin)，淀粉状蛋白前体蛋白和WO03/066824中所述那些，具有或不具有白蛋白融合)，LACI，乳铁蛋白(lactoferrin)，潜在的TGF-β结合蛋白II，来普汀/瘦素(leptin)，肝表达的趋化因子-1(LVEC-1)，肝表达的趋化因子-2(LVEC-2)，LT-α，LT-β，黄体化激素，莱姆病疫苗，淋巴细胞趋化因子(Lymphotactin)，巨噬细胞衍生的趋化因子类似物MDC(n+1)，巨噬细胞衍生的趋化因子类似物MDC-eyfy，巨噬细胞衍生的趋化因子类似物MDC-yl，巨噬细胞衍生的趋化因子，MDC，巨噬细胞衍生的趋化因子(MDC)，Maspin；蛋白酶抑制剂5，MCP-1受体，MCP-1a，MCP-1b，MCP-3，MCP-4受体，M-CSF，黑素瘤抑制蛋白，膜结合蛋白，Met117人白细胞介素9，MIP-3α，MIP-3β，MIP-Γ，MIRAP，修饰的Rantes，单克隆抗体，MP52，突变白细胞介素6S176R，肌纤维收缩蛋白肌钙蛋白I，利钠肽(Natriuretic Peptide)，神经生长因子-β，神经生长因子-β2，神经菌毛素(Neuropilin)-1，神经菌毛素-2，神经趋化因子，神经营养因子-3，神经营养因子-4，神经营养因子-4a，神经营养因子-4b，神经营养因子-4c，神经营养因子-4d，嗜中性粒细胞活化肽-2(NAP-2)，NOGO-66受体，NOGO-A，NOGO-B，NOGO-C，命名为PTEC的新β-趋化因子，N-端修饰趋化因子GroHEK/hSDF-1α，N-端修饰趋化因子GroHEK/hSDF-1β，N-端修饰趋化因子met-hSDF-1α，N-端修饰趋化因子met-hSDF-1β，OPGL，成骨蛋白-1；OP-1；BMP-7，成骨蛋白-2，OX40；ACT-4，OX40L，催产素(神经垂体素运载蛋白I)，甲状旁腺素，Patched，Patched-2，PDGF-D，百日咳类毒素(Pertussistoxoid)，垂体表达的趋化因子(PGEC)，胎盘生长因子，胎盘生长因子-2，纤溶酶原活化物抑制剂-1；PAI-1，纤溶酶原活化物抑制剂-2；PAI-2，纤溶酶原活化物抑制剂-2；PAI-2，血小板衍生的生长因子，血小板衍生的生长因子Bv-sis，血小板衍生的生长因子前体A，血小板衍生的生长因子前体B，血小板Mab，血小板衍生的内皮细胞生长因子(PD-ECGF)，血小板衍生的生长因子A链，血小板衍生的生长因子B链，用于治疗败血病的多肽，前原载脂蛋白“米兰”变体(Preproapolipoprotein“milano”variant)，前原载脂蛋白“巴黎”变体，前凝血酶(pre-thrombin)，灵长类CC趋化因子"ILINCK"，灵长类CXC趋化因子"IBICK"，胰岛素原，促乳素(Prolactin)，促乳素2，prosaptide，蛋白酶抑制肽，蛋白C，蛋白S，凝血酶原，尿激酶原，RANTES，RANTES8-68，RANTES9-68，RANTES肽，RANTES受体，重组白细胞介素-16，抵抗素(Resistin)，局限曲菌素(restrictocin)，逆转录病毒蛋白酶抑制剂，蓖麻毒蛋白(ricin)，轮状病毒疫苗，RSV Mab，皂草素(saporin)，八叠球菌(sarcin)，分泌和跨膜多肽，分泌和跨膜多肽，血清胆碱酯酶，血清蛋白(如凝血因子)，可溶性BMP受体激酶蛋白-3，可溶性VEGF受体，干细胞抑制因子，葡萄球菌疫苗，基质衍生的因子-1α，基质衍生的因子-1β，物质P(速激肽)，T1249肽，T20肽，T4内切核酸酶，TACI，Tarc，TGF-β1，TGF-β2，Thr117人白细胞介素9，凝血酶，促血小板生成素(thrombopoietin)，促血小板生成素衍生物1，促血小板生成素衍生物2，促血小板生成素衍生物3，促血小板生成素衍生物4，促血小板生成素衍生物5，促血小板生成素衍生物6，促血小板生成素衍生物7，胸腺表达的趋化因子(TECK)，促甲状腺激素(Thyroid stimulating Hormone)，蜱抗凝肽，Tim-1蛋白，TNF-α前体，TNF-R，TNF-RII；TNF p75受体；死亡受体，tPA，转铁蛋白(transferrin)，转化生长因子β，肌钙蛋白肽，截短的单核细胞趋化蛋白2(6-76)，截短的单核细胞趋化蛋白2(6-76)，截短的RANTES蛋白(3-68)，肿瘤坏死因子，尿酸氧化酶，尿激酶，加压素(Vasopressin)(神经垂体素运载蛋白(Neurophysin II))，VEGFR-3；flt-4，VEGF受体；KDR；flk-1，VEGF-110，VEGF-121，VEGF-138，VEGF-145，VEGF-162，VEGF-165，VEGF-182，VEGF-189，VEGF-206，VEGF-D，VEGF-E；VEGF-X，von Willebrand因子，野生型单核细胞趋化蛋白2，野生型单核细胞趋化蛋白2，ZTGF-β9；其它抗体框架例如anticalin，adnectin，纤维蛋白原(fibrinogen)片段，纳米抗体(nanobody)如驼类纳米抗体，infestin，和/或任何WO01/79271(特别是第9页和/或表1)、WO2003/59934(特别是表1)、WO03/060071(特别是表1)或WO01/079480(特别是表1)(其每一个均通过全文提述并入本文)中提及的分子。

此外，缀合物可包含一种或多种(几种)化疗药如：13-顺-视黄酸(13-cis-Retinoic Acid)，2-CdA，2-氯脱氧腺苷(2-Chlorodeoxyadenosine)，5-阿扎胞苷(5-Azacitidine)，5-氟尿嘧啶(5-Fluorouracil)，5-FU，6-巯基嘌呤(6-Mercaptopurine)，6-MP，6-TG，6-硫代鸟嘌呤(6-Thioguanine)，A，Abraxane，放线菌素-D(Actinomycin-D)，阿霉素

阿地白介素(Aldesleukin)，阿仑单抗(Alemtuzumab)，ALIMTA，阿利维A酸(Alitretinoin)，爱克兰全反视黄酸(All-transretinoic Acid)，α干扰素，六甲蜜胺(Altretamine)，甲氨蝶呤(Amethopterin)，氨磷汀(Amifostine)，氨鲁米特(Aminoglutethimide)，阿那格雷(Anagrelide)，阿那曲唑(Anastrozole)，阿糖胞苷(Arabinosylcytosine)，Ara-C，

三氧化二砷(Arsenic Trioxide)，天冬酰胺酶(Asparaginase)，ATRA，

阿扎胞苷(Azacitidine)，BCG，BCNU，贝伐单抗(Bevacizumab)，贝沙罗汀(Bexarotene)，

比卡鲁胺(Bicalutamide)，BiCNU，

博来霉素(Bleomycin)，Bortezomib，白消安(Busulfan)，

C225，亚叶酸钙(CalciumLeucovorin)，

喜树碱-11(Camptothecin-11)，卡培他滨(Capecitabine)，Carac^TM，卡铂(Carboplatin)，卡莫司汀(Carmustine)，CarmustineWafer，康士德

CC-5013，CCNU，CDDP，CeeNU，

西妥昔单抗(Cetuximab)，苯丁酸氮芥(Chlorambucil)，顺铂(Cisplatin)，亚叶酸因子(Citrovorum Factor)，克拉屈滨(Cladribine)，可的松(Cortisone)，

CPT-11，环磷酰胺(Cyclophosphamide)，

阿糖胞苷(Cytarabine)，阿糖胞苷脂质体(Cytarabine Liposomal)，赛德萨

达卡巴嗪(Dacarbazine)，Dacogen，更生霉素(Dactinomycin)，Darbepoetin Alfa，Dasatinib，柔红霉素(Daunomycin)，柔红霉素(Daunorubicin)，盐酸柔红霉素(DaunorubicinHydrochloride)，柔红霉素脂质体(Daunorubicin Liposomal)，

地卡特隆(Decadron)，地西他滨(Decitabine)，

地尼白介素-毒素连接物(Denileukin diftitox)，DepoCyt^TM，地塞米松(Dexamethasone)，醋酸地塞米松(Dexamethasone acetate)，地塞米松磷酸钠(Dexamethasone SodiumPhosphate)，地塞米松(Dexasone)，右雷佐生(Dexrazoxane)，DHAD，DIC，Diodex，多西紫杉醇(Docetaxel)，

多柔比星(Doxorubicin)，多柔比星脂质体(Doxorubicin liposomal)，Droxia^TM，DTIC，

Eligard^TM，Ellence^TM，乐沙定(Eloxatin)^TM，

表柔比星(Epirubicin)，阿法依伯汀(Epoetin alfa)，Erbitux^TM，Erlotinib，欧文氏菌属L-天冬酰胺酶(Erwinia L-asparaginase)，雌莫司汀(Estramustine)，氨磷汀(Ethyol)，

依托泊苷(Etoposide)，磷酸依托泊苷(Etoposide Phosphate)，

依西美坦(Exemestane)，法乐通

非格司亭(Filgrastim)，氟尿苷(Floxuridine)，

氟达拉滨(Fludarabine)，

氟尿嘧啶(Fluorouracil)，氟尿嘧啶(Fluorouracil)(乳膏)，氟甲睾酮(Fluoxymesterone)，氟他胺(Flutamide)，亚叶酸(Folinic Acid)，

氟维司群(Fulvestrant)，G-CSF，Gefitinib，吉西他滨(Gemcitabine)，吉姆单抗(Gemtuzumab)奥佐米星(ozogamicin)，健择

Gleevec^TM，

GM-CSF，戈舍瑞林(Goserelin)，粒细胞集落刺激因子，粒细胞巨噬细胞集落刺激因子，

地塞米松(Hexadrol)，克瘤灵

六甲蜜胺(Hexamethylmelamine)，HMM，和美新

羟基脲

醋酸氢化可的松

氢化可的松(Hydrocortisone)，氢化可的松磷酸钠(Hydrocortisone Sodium Phosphate)，氢化可的松琥珀酸钠(Hydrocortisone Sodium Succinate)，氢化可的松磷酸(HydrocortonePhosphate)，羟脲(Hydroxyurea)，替伊莫单抗(Ibritumomab)，替伊莫单抗(Ibritumomab Tiuxetan)，

伊达比星(Idarubicin)，IFN-α，异环磷酰胺(Ifosfamide)，IL-11，IL-2，甲磺酸伊马替尼(Imatinib mesylate)，咪唑羧酰胺(Imidazole Carboxamide)，干扰素alfa，干扰素Alfa-2b(PEG缀合物)，白细胞介素-2，白细胞介素-11，

(干扰素alfa-2b)，

伊立替康(Irinotecan)，异维A酸(Isotretinoin)，

Lapatinib，L-天冬酰胺酶，LCR，Lenalidomide，来曲唑(Letrozole)，亚叶酸钙(Leucovorin)，苯丁酸氮芥(Leukeran)，Leukine^TM，亮丙瑞林(Leuprolide)，长春新碱(Leurocristine)，Leustatin^TM，脂质体Ara-C，

洛莫司汀(Lomustine)，L-PAM，L-沙可来新(L-Sarcolysin)，

Maxidex，氮芥(Mechlorethamine)，盐酸氮芥(Mechlorethamine Hydrochloride)，美卓乐

梅格施

甲地孕酮(Megestrol)，醋酸甲地孕酮(Megestrol Acetate)，美法仑(Melphalan)，巯嘌呤(Mercaptopurine)，美司钠(Mesna)，Mesnex^TM，甲氨蝶呤(Methotrexate)，甲氨蝶呤钠(Methotrexate Sodium)，甲泼尼龙(Methylprednisolone)，

丝裂霉素(Mitomycin)，丝裂霉素-C(Mitomycin-C)，米托蒽醌(Mitoxantrone)，

MTC，MTX，

氮芥(Mustine)，马利兰

Mylocel^TM，

诺维本萘拉滨(Nelarabine)，

Neulasta^TM，

优保津

尼鲁米特(Nilutamide)，

氮芥(Nitrogen Mustard)，

能灭瘤

奥曲肽(Octreotide)，醋酸奥曲肽(Octreotide acetate)，

安可平

Onxal^TM，Oprevelkin，

奥沙利铂(Oxaliplatin)，紫杉醇(Paclitaxel)，蛋白结合紫杉醇，帕米磷酸(Pamidronate)，Panitumumab，

伯尔定

PEG干扰素，培门冬酶(Pegaspargase)，PEG菲格司亭(Pegfilgrastim)，PEG-INTRON^TM，PEG-L-天冬酰胺酶，培美曲塞(PEMETREXED)，喷司他丁(Pentostatin)，苯丙氨酸氮芥(Phenylalanine Mustard)，

泼尼松龙(Prednisolone)，泼尼松(Prednisone)，

丙卡巴肼(Procarbazine)，

具有卡莫司汀(Carmustine)植入物的Prolifeprospan20，

R，雷洛昔芬(Raloxifene)，

利妥昔单抗(Rituximab)，

(干扰素Alfa-2a)，柔红霉素盐酸盐(Rubidomycinhydrochloride)，善得定

沙格司亭(Sargramostim)，

Sorafenib，SPRYCEL^TM，STI-571，链佐星(Streptozocin)，SU11248，Sunitinib，

他莫昔芬(Tamoxifen)，

泰素泰索帝

替莫唑胺(Temozolomide)，替尼泊苷(Teniposide)，TESPA，沙利度胺(Thalidomide)，

硫鸟嘌呤(Thioguanine)，

Thiophosphoamide，

塞替派(Thiotepa)，

托泊替康(Topotecan)，托瑞米芬(Toremifene)，托西莫单抗(Tositumomab)，曲妥单抗(Trastuzumab)，维A酸(Tretinoin)，Trexall^TM，TSPA，

VCR，Vectibix^TM，

凡毕士

Viadur^TM，

长春碱(Vinblastine)，硫酸长春碱(Vinblastine Sulfate)，Vincasar

长春新碱(Vincristine)，长春瑞滨(Vinorelbine)，酒石酸长春瑞滨(Vinorelbinetartrate)，VLB，VM-26，Vorinostat，VP-16，威猛

希罗达

Zevalin^TM，

诺雷德，唑来膦酸(Zoledronic acid)，Zolinza，

放射性药品如：碳-11，碳-14，铬-51，钴-57，钴-58，铒-169，氟-18，镓-67，金-198，铟-111，铟-113m，碘-123，碘-125，碘-131，铁-59，氪-81m，氮-13，氧-15，磷-32，铼-186，铷-82，钐-153，硒-75，锶-89，锝-99m，铊-201，氚，氙-127，氙-133，钇-90；显像剂如钆，磁铁矿/磁石(magnetite)，锰，锝，I125，I131，P32，Tl201，碘帕醇(Iopamidol)，PET-FDG。

根据本发明的进一步的融合伴侣，缀合伴侣和/或供包含于纳米颗粒、微粒、缔合物或组合物的分子包括：肢端肥大症(acromegaly)药例如促生长素抑制素(somatuline)，兰瑞肽(lanreotide)，奥曲肽(octreotide)，善得定(Sandostatin)；抗血栓药例如比伐卢定(bivalirudin)，Angiomax，达肝素(dalteparin)，法安明(Fragmin)，依诺肝素(enoxaparin)，Lovenox，Drotrecogin alfa(例如活化的)，Xigris，肝素；辅助生育治疗化合物例如绒毛膜促性腺激素(choriogonadotropin)，Ovidrel，促卵泡素，alpha/beta；酶例如透明质酸酶(hyaluronidase)，Hylenex；糖尿病药例如exenatide，Byetta，胰高血糖素(glucagon)，胰岛素(insulin)，liraglutide，GLP-1激动剂；可用于诊断的化合物例如普罗瑞林(protirelin)，Thyrel TRH Thypinone，胰泌素(例如合成的人类胰泌素)，Chirhostim，促甲状腺激素(thyrotropin)(例如alpha)，Thyrogen’，红细胞生成药例如Darbepoetin alfa，Aranesp，阿法依泊汀(Epoetin alfa)，Epogen，Eprex，用于治疗遗传缺陷的药例如培加酶(pegademase)，用于治疗生长不足的药例如Adagen，美卡舍明(mecasermin)，rinfabate，用于治疗囊性纤维化病(cystic fibrosis)的药例如阿法链道酶(Dornase alfa)，Pulmozyme，用于治疗代谢障碍的药例如Agalsidase beta，Fabrazyme，alglucosidase alpha，Myozyme，Laronidase，Aldurazyme，用于治疗生殖器疣内部损伤(genital wart intralesional)的药例如干扰素alfa-n3，Alferon N，用于治疗肉芽肿病的药例如干扰素gamma-1b，Actimmune；用于治疗生长不足的药例如培维索蒙(pegvisomant)，Somavert，生长激素(somatropin)，健高宁(Genotropin)，Nutropin，优猛茁(Humatrope)，Serostim，普兰品(Protropin)；用于治疗心力衰竭的药例如萘西立肽(nesiritide)，Natrecor；用于治疗血友病的药例如凝血因子例如因子VIII，Helixate FS，Kogenate FS，因子IX，BeneFIX，因子VIIa，Novoseven，去氨加压素(desmopressin)，Stimate，DDAVP；造血药(hemopoetic drug)例如非格司亭(Filgrastim)(G-CSF)，优保津(Neupogen)，奥普瑞白介素(Oprelvekin)，Neumega，Pegfilgrastim，Neulasta，沙格司亭(Sargramostim)，Leukine；用于治疗丙型肝炎的药例如干扰素alfa-2a，罗荛愫(Roferon A)，干扰素alfa-2b，甘乐能(Intron A)，干扰素alfacon-1，干复津(Infergen)，Peginterferon alfa-2a，Pegasys，Peginterferon alfa-2b，PEG-Intron；用于治疗HIV的药例如enfuvirtide，Fuzeon；Fab例如Fab(抗凝血酶(antithrombin))，阿昔单抗(Abciximab)，ReoPro；单克隆抗体例如达珠单抗(Daclizumab)，塞尼哌(Zenapax)；抗病毒单克隆抗体例如帕利珠单抗(Palivizumab)，Synagis；用于治疗哮喘的单克隆抗体例如Omalizumab，Xolair；供用于诊断成像的单克隆抗体例如阿西莫单抗(Arcitumomab)，CEA-Scan，卡罗单抗喷地肽(Capromab Pendetide)，ProstaScint，沙妥莫单抗喷地肽(Satumomab Pendetide)，瘤辛特(OncoScint CR/OV)，供用于诊断成像的Fab例如若莫单抗(Nofetumomab)，巯诺莫单抗制剂(Verluma)，免疫抑制性单克隆抗体例如巴利昔单抗(Basiliximab)，Simulect，莫罗单抗-CD3(Muromonab-CD3)，Orthoclone OKT3；用于治疗恶性肿瘤的单克隆抗体例如阿仑单抗(Alemtuzumab)，Campath，替伊莫单抗(Ibritumomab tiuxetan)，Zevalin，利妥昔单抗(Rituximab)，Rituxan，曲妥单抗(Trastuzumab)，赫赛汀(Herceptin)；用于治疗类风湿性关节炎(RA)的单克隆抗体例如阿达木单抗(Adalimumab)，Humira，英夫利昔单抗(Infliximab)，Remicade；供用于放射免疫治疗剂的单克隆抗体例如托西莫单抗(Tositumomab)和碘I¹³¹，托西莫单抗，Bexxar；用于治疗黄斑变性的药例如Pegaptanib，Macugen；用于治疗恶性肿瘤的药例如阿地白介素(Aldesleukin)，Proleukin，白介素-2，门冬酰胺酶(Asparaginase)，Elspar，拉布立酶(Rasburicase)，Elitek，地尼白介素-毒素连接物(Denileukin diftitox)，Ontak，培门冬酶(Pegaspargase)，Oncaspar，戈舍瑞林(goserelin)，亮丙瑞林(leuprolide)；用于治疗多发性硬化(MS)的药例如Glatiramer acetate(例如共聚物-1)，Copaxone，干扰素beta-1a，Avonex，干扰素beta-1a，Rebif，干扰素beta-1b，Betaseron；用于治疗粘膜炎的药例如palifermin，Kepivance；用于治疗张力失常的药例如神经毒素(neurotoxin)，A型肉毒毒素(Botulinum Toxin Type B)，MYOBLOC；用于治疗骨质疏松的药例如特立帕肽(teriparatide)，Forteo；用于治疗银屑病的药例如Alefacept，Amevive；用于治疗RA的药例如abatacept，Orencia，阿那白滞素(Anakinra)，Kineret，依那西普(Etanercept)，Enbrel；溶栓剂例如阿替普酶(Alteplase)，Activase，rtPA，阿尼普酶(Anistreplase)，依米那酶(Eminase)，瑞替普酶(Reteplase)，Retavase，链激酶(Streptokinase)，Streptase，替奈普酶(Tenecteplase)，TNKase，尿激酶(Urokinase)，雅激酶(Abbokinase)，Kinlytic；用于治疗骨质疏松的药例如降钙素(calcitonin)(例如鲑降钙素)，Miacalcin，Fortical，用于治疗皮肤溃疡的药例如贝卡普勒明(Becaplermin)，Regranex，胶原酶(Collagenase)，Santyl。

此类多肽和化学化合物可称作诊断模块，治疗模块，预防模块或有益模块。

一个或多个(几个)治疗性或预防性多肽可融合于白蛋白的N端，C端，插入白蛋白结构中的环，或其任意组合。其可包含或不包含将融合多肽的不同组分分开的接头序列。

涉及白蛋白或其片段的融合物的教导在本领域中是已知的，且本领域技术人员会理解此类教导亦可适用于本发明。WO2001/79271A和WO2003/59934A(通过提述并入本文)亦含有可融合于白蛋白或其片段的治疗性和预防性多肽的实例，且这些实例亦适用于本发明。

本发明的第七个方面涉及包含人本文中所述的白蛋白，其变体、片段、融合物、缀合物或缔合物，并涉及此类组合物的制备。所述组合物优选为药物组合物。因此，所述组合物优选包含白蛋白，其变体、片段、融合物、缀合物或缔合物，和药学上可接受的载体。所述组合物可使用本领域已知技术，如公开于药学领域内公认的手册的技术来制备。因为白蛋白，其变体、片段、融合物、缀合物或缔合物具有与参照分子(如上所定义)相比经调节的(即较长或较短)的血浆半寿期，所述组合物亦相对于包含替代如本文中所述的白蛋白，其变体、片段、融合物、缀合物或缔合物的参照分子的等同组合物具有经调节的血浆半寿期。所述植物可为疫苗。根据本发明的多肽可为活性药剂或赋形剂。任选地，所述组合物以单位剂量形式提供。

优选地，白蛋白，其变体、片段、融合物、缀合物或缔合物具有与参照分子的血浆半寿期相比较长的血浆半寿期，所述参照分子例如为相同的组合物，除了其白蛋白组分(例如白蛋白，其变体、片段、融合物、缀合物或缔合物)是野生型(例如HSA)或其变体、片段、融合物、缀合物或缔合物。

或者，这可表现为白蛋白，其变体、片段、融合物、缀合物或缔合物具有的对FcRn结合亲和力(KD)与对于HSA或参照分子对应的KD相比较低。优选地，对于白蛋白，其变体、片段、融合物、缀合物或缔合物的KD为少于0.9X对于HSA或参照分子的KD，更优选0.5X KD，少于0.1X KD，少于0.05X，0.02X KD和最优选少于0.01X对于HSA或参照分子的KD。白蛋白或其片段，或包含变体白蛋白或其片段的多肽，其片段，缀合物，纳米颗粒，微粒，缔合物或组合物的KD可处于野生型白蛋白(例如SEQ ID NO:2)对于FcRn的KD和HSA K573P(SEQ ID NO:3)对FcRn的KD之间。

白蛋白，其变体、片段、融合物、缀合物或缔合物优选根据本发明。

在一个具体实施方案中，所述组合物包含根据本发明的白蛋白，其变体、片段、融合物、缀合物或缔合物，和化合物(其包含药学上有益的模块和白蛋白结合域(ABD))。根据本发明，ABD意指能够结合于体内的循环白蛋白并因此使得ABD和任何结合于所述ABD的化合物或模块能够在循环中转运的位点，模块或域。ABD在本领域中是已知的，并显示非常紧密地结合于白蛋白，因此包含结合于白蛋白的ABD的化合物会在一定程度上表现为单个分子。本发明人意识到通过将根据本发明的白蛋白，其变体、片段、融合物、缀合物或缔合物与包含药学上有益的模块和ABD的化合物一同使用，可以与其中所述化合物照原样注入有此需要的患者，或在包含天然白蛋白或其片段的制剂中施用的情况相比，改变该包含药学上有益的模块和ABD的化合物的血浆半寿期。

白蛋白，其变体、片段、融合物、缀合物或缔合物亦可使用本领域内公知的技术并入纳米颗粒或微粒。用于制备可适用于根据本发明的白蛋白，其变体、片段、融合物、缀合物或缔合物的纳米颗粒或微粒的优选方法公开于WO2004/071536或WO2008/007146或Oner & Groves(PharmaceuticalResearch，Vol10(9)，1993，第1387至1388页)，其通过提述并入本文。优选地，纳米颗粒的平均直径为5至1000nm，更优选5，10，20，30，40，50，80，100，130，150，200，300，400，500，600，700，800，900，或999至5，10，20，30，40，50，80，100，130，150，200，300，400，500，600，700，800，900，或1000nm。少于200nm直径，更特别是少于130nm直径的微粒的优点在于其适于通过经由0.2μm(微米)过滤器过滤灭菌。优选地，微粒的平均直径为1000nm(1μm(微米))至100μm(微米)，更优选1，2，5，10，20，30，40，50，60，70，80，90，100至1，2，5，10，20，30，40，50，60，70，80，90，100μm(微米)。

本发明的第八个方面涉及如本文中所述的白蛋白，其变体、片段、融合物、缀合物或缔合物用于成像的用途或使用方法。例如，对于在动物或人中用于成像目的的缀合物、缔合物或融合多肽，当成像模块具有非常短的半寿期或包含HSA的融合多肽具有的血浆半寿期远长于成像目的所需时，使用与亲本白蛋白或其片段或其它参照如HSA相比具有较短血浆半寿期的本发明的变体白蛋白或其片段，以提供融合多肽的缀合物，其具有的血浆半寿期对于成像目的而言充分长而但短至足以从其施用的特定患者的身体中清除，会是有利的。

本发明的第九个方面涉及治疗或预防或诊断方法，其包括如本文中定义的白蛋白，其变体、片段、融合物、缀合物或缔合物或组合物。在一些情况下，使用与参照分子或组合物相比具有较长血浆半寿期的白蛋白，其变体、片段、融合物、缀合物或缔合物或组合物会是有利的，因为这会具有下述益处：与当使用参照分子或组合物的情况相比，将较不频繁地或以减少剂量需要白蛋白，其变体、片段、融合物、缀合物或缔合物或组合物的施用(并因此具有较少副作用)。

本发明的第十个方面涉及使用本文中公开的白蛋白的变体，其片段，或包含所述变体白蛋白或其片段，其缀合物，其缔合物或其组合物的融合多肽以改变治疗、预防、诊断、成像或其它有益模块优选在血浆中的半寿期。

本发明的一个优点是其允许定制白蛋白，白蛋白的变体或其片段，或包含变体白蛋白或其片段的融合多肽，其片段，缀合物，纳米颗粒，微粒，缔合物或组合物的半寿期以达成满足用户需要的结合亲和力或半寿期。本发明特别适用于药物。一些药物受益于长半寿期，例如为了增加剂量间隔。一些药物受益于短血浆半寿期，例如为了加速从患者身体的清除。因此，根据本发明的白蛋白模块在药物中的用途允许视需要定制药物的半寿期。

本领域技术人员理解本发明的任何方面可以与其它本发明的方面和/或本发明的方面的一个或多个优选方面和/或其它本文中进行的公开相结合。

本发明进一步通过下述实施例描述，其不应视为对本发明范围的限制。

实施例

下述方法用于制备和分析根据本发明的白蛋白变体：

方法1：白蛋白在C段的变体的制备

白蛋白的变体使用本领域技术人员已知的技术制备。其总结提供于下。

(i)质粒构建

白蛋白变体使用HSA(SEQ ID NO:2)的氨基酸序列(作为“第一亲本白蛋白”)和多种不同白蛋白的氨基酸序列(每个均作为”第二亲本白蛋白”)来制备。为了生成根据本发明的白蛋白，将HSA中从位置573至585的C端氨基酸串(KKLVAASQAALGL)(SEQ ID NO:2)突变为恒河猴(PKFVAASQAALA)(SEQ ID NO:6)，小鼠(PNLVTRCKDALA)(SEQ ID NO:9)，兔(PKLVESSKATLG)(SEQ ID NO:14)和绵羊(PKLVASTQAALA)(SEQ ID NO:16)血清白蛋白中的那些。用于导入每个氨基酸取代的密码子在表2中给出。

表3总结了构建的质粒连同为了生成根据本发明的白蛋白而对HSA进行的氨基酸取代。

表2：用于将氨基酸取代导入HSA的密码子

表3：白蛋白在C端的变体

(HSA：人血清白蛋白；Mac：恒河猴血清白蛋白；在pDB4540中，X585L代表插入，因为恒河猴血清白蛋白为584个氨基酸长但HSA为585个氨基酸长)

为了生成表3中所述的HSA C段变体，通过基因汇编生成(DNA2.0Inc，USA)了合成DNA片段(SacI/SphI)(合成片段编码未变化的氨基酸(即野生型)的核苷酸序列与pDB3927中的相同)，并亚克隆入经SacI/SphI消化的pDB3927以产生质粒pDB4114至4117(表3)。质粒pDB4114至pDB4117的构建描述于WO2011/051489。pDB3927描述于WO2010/092135(通过提述并入本文)。

恒河猴白蛋白C端变体可以以类似于上述的HSA C段变体的方式制备。然而，另一种合适的方法使用PCR，并用于制备恒河猴白蛋白C端变体，如下文方法3中所述。

表达质粒在体内生成(即通过在酿酒酵母(S.cerevisiae)中的同源重组；该技术称作缺口修复或体内克隆，参见Orr-Weaver & Szostak.1983.Proc.Natl.Acad.Sci.USA.80:4417-4421)。将列于表3的修饰的质粒用BstEII/BsrBI或NsiI/PvuI消化，并将经直链化的DNA分子使用标准方法纯化。将各一百ng的经BstEII/BsrBI或NsiI/PvuI消化的、使用Qiagen PCR-Purification kit遵循生产商的指示纯化的DNA，分别与100ng Acc65I/BamHI消化的pDB3936(公开于WO2010/092135)混合，并用于如下所述直接转化酿酒酵母BXP10cir⁰。

(ii)酿酒酵母的转化

将酿酒酵母BXP10cir⁰(如之前在WO2001/079480中所述)划线于YEPD平板(1%(w/v)酵母提取物，2%(w/v)细菌用蛋白胨(Bactopeptone)，2%(w/v)葡萄糖)，1.5%琼脂)上，并在转化之前允许在30℃生长4日。对于缺口修复，将100ng BstEII/BsrBI或NsiI/PvuI消化的质粒(其含有白蛋白变体表达盒)，和100ng Acc65I/BamHI消化的pDB3936用于使用Sigma Yeast Transformation试剂盒使用修饰的乙酸锂方法(Sigma Yeast Transformation Kit,YEAST-1,规程2;Ito等(1983)J.Bacteriol.,153,16;Elble,(1992)Biotechniques,13,18)转化酿酒酵母。略微修改了实验方案，即在热激之前将转化物在室温温育4小时。在热激之后，将细胞短暂离心，然后重悬于200μl 1M山梨醇，然后铺板于BMMD琼脂平板上，BMMD的组成描述于Sleep等(2001)，Yeast，18，403。将平板在30℃温育4日，然后将单个克隆缀于新鲜BMMD平板上。

如下所述对于每个所得的酵母菌株制备储备：将50ml烧瓶中的10mlBMMD培养液用一大环各酵母缀片(patch)接种，并在30℃在200rpm定轨振荡生长24小时。细胞通过在Sorval RT600离心机中以1900×g离心5分钟来收获，去除5mL上清，并用海藻糖40%(w/v)替代。将细胞重悬并转移至冷冻小瓶(1mL)以供在-80℃储藏。

(iii)酿酒酵母的烧瓶生长

将BMMD(配方：0.17%(w/v)不含氨基酸和硫酸铵的酵母氮基(Difco)，37.8mM硫酸铵，29mM柠檬酸，142mM无水正磷酸氢二钠(disodium hydrogenorthophosphate dehydrate)pH6.5，2%(w/v)葡萄糖)培养基用每种酵母菌株接种，并在30℃在200rpm定轨振荡生长48小时(2日)。使用每种起始培养物(4mL)的等分试样以接种500ml摇瓶中的2×200mL BMMD培养基，并在30℃在200rpm定轨振荡生长96小时(4日)。细胞通过藉由包含GF-D预滤器(Whatman)的0.2μm真空过滤膜(Stericup，Millipore)的过滤来收获，并保留上清以供纯化。

(iv)初级浓缩

保留的培养上清使用Tangential Flow Filtration使用配置有Omega 10KD(0.093m²)过滤器(LV CentramateTM cassette，Pall Filtron)的Pall Filtron LV系统以20psi的跨膜压力和180mL.min^-1的再循环速率来浓缩。

(v)GP-HPLC定量

纯化的白蛋白变体如下所述通过GP-HPLC和定量进行分析：向具有6.0mm id(内径)x40mm长TSK SW保护柱(Tosoh Bioscience)的7.8mm id(内径)x300mm长TSK G3000SWXL柱(Tosoh Bioscience)注入25μL。将样品在25mM磷酸钠，100mM硫酸钠，0.05%(w/v)叠氮化钠，pH7.0中以1mL/分钟进行层析。通过在280nm进行UV检测，以峰面积相对于已知浓度(10mg/mL)的重组人白蛋白标样对样品进行定量，并针对其相对消光系数校正。可使用相同的方法分析白蛋白融合物和缀合物。

(vi)从烧瓶纯化白蛋白变体

将白蛋白变体使用单一的层析步骤使用白蛋白亲和基质(AlbuPure^TM-ProMetic BioSciences,Inc.)从烧瓶纯化(培养上清或浓缩的培养上清)。层析从头到尾以240cm/h的恒定线性速度进行。将培养上清施于用50mM乙酸钠pH5.3预平衡的6cm床高、2.0mL填充床。在加载之后，将柱用10柱体积(CV)的平衡缓冲液，然后用50mM乙酸铵pH8.0(10CV)洗涤。产物用50mM乙酸铵-10mM辛酸盐/酯pH8.0，50mM乙酸铵-30mM辛酸钠200mM氯化钠pH7.0或200mM硫氰酸钾来洗脱。将柱用0.5M NaOH(3cv)和20mM NaOH(3.5cv)清洗。将来自每个白蛋白变体的洗脱物级分浓缩，并针对10体积的50mM氯化钠(具有任选的渗滤杯的Vivaspin2010,000MWCO PES，Sartorius)进行渗滤。纯化的白蛋白变体如上所述通过GP-HPLC定量。

方法2：白蛋白变体的受体(shFcRn)结合性质的确定

shFcRn根据WO2011/051489的方法产生。用于生成shFcRn表达质粒，表达和纯化shFcRn杂二聚体的方法亦可见于Berntzen等(2005)J.Immunol.Methods298:93-104)和Andersen等(2010)J.Biol.Chem.,285:4826-4836。

使用Biacore3000装置(GE Healthcare)进行SPR测定。将CM5传感器芯片的流动室(flow cell)通过胺偶联化学如生产商提供的实验方案所述偶联于shFcRn-HIS(GeneArt)(1500-2500RU)。偶联通过将10μg/ml的蛋白注入10mM乙酸钠pH5.0(GE Healthcare)来进行。使用磷酸盐缓冲液(67mM磷酸盐缓冲液，0.15M NaCl，0.005%Tween20，在pH6.0)作为运行缓冲液和稀释缓冲液。使用将HBS-EP缓冲液(0.01M HEPES，0.15M NaCl，3mM EDTA，0.005%表面活性剂P20)在pH7.4注入进行表面的再生。对于对固定化的shFcRn-GST的结合，将1.0-0.5mM的各HSA衍生物或变体在表面上以恒定流速(40μl/min)在25℃注入。在所有实验中，将数据调零校正，并减去参照室(reference cell)。数据评价使用BIAevaluation4.1软件(BIAcore AB)进行。

方法3：恒河猴白蛋白C端变体的制备

对于恒河猴白蛋白C端变体(恒河猴白蛋白(1至572)和来自人(SEQ IDNO:2的573至585；KKLVAASQAALGL)，小鼠(573至584(其对应于不成熟序列即SEQ ID NO:9的597至608)；PNLVTRCKDALA)，兔(573至584(其对应于不成熟序列即SEQ ID NO:14的597至608)；PKLVESSKATLG)或绵羊(573至583(其对应于不成熟序列即SEQ ID NO:16的596至607)；PKLVASTQAALA)白蛋白)的C端氨基酸的表达盒通过将恒河猴白蛋白的C端区[所述‘第一白蛋白’，SEQ ID NO:6]用所述‘第二白蛋白’(例如人，小鼠，兔和绵羊)的C端区替代来制备(表3)。

特别地，编码来自如上所述的白蛋白的C端氨基酸的核苷酸序列通过PCR使用表4和5中所述的寡核苷酸对和模板DNA来扩增。对于所有PCR遵循生产商的指示使用Phusion聚合酶(New England Biolabs)。PCR片段用SpeI/HindIII消化并使用标准技术连接入SpeI/HindIII消化的pDB4118

表4：用于生成PCR片段的寡核苷酸和模板DNA

质粒pDB3927描述于WO2010/092135(通过提述并入本文)。质粒pDB4115至pDB4117公开于WO2011/051489(通过提述并入本文)。

表5：寡核苷酸序列

用于表达恒河猴白蛋白的质粒如下所述制备。1.780kb BglII/HindIII合成DNA片段(含有编码修饰的融合前导序列的DNA的3’区(公开于WO2010/092135)，编码恒河猴白蛋白(密码子经优化以供在酿酒酵母中表达)的DNA序列，和mADHt的5’区)通过基因汇编生成(DNA2.0，USA，SEQ ID NO:36)。将所述合成的BglII/HindIII片段克隆入BglII/HindIII消化的pDB4081以产生pDB4118。

pDB4081通过将合成的、经BsaI/SphI消化的DNA片段连接入HindIII/SphI消化的pDB4005(公开于WO2011/051489)来制备，所述片段通过基因汇编生成(DNA2.0Inc，USA)(SEQ ID NO:37，含有PRB1启动子的3’区，修饰的融合前导序列，编码HSA的核苷酸序列，和修饰的ADH1终止子的5’区)。

最终的恒河猴表达质粒通过体内克隆/缺口修复如下所述生成：将质粒pDB4118用BstEII/BsrBI消化，使用Qiagen PCR-纯化试剂盒遵循生产商的指示纯化，并将100ng的纯化的DNA与100ng Acc65I/BamHI消化的pDB3936合并，并如前所述用于共转化酿酒酵母BXP10cir⁰。

使用连接物使用标准技术转化大肠杆菌DH5α，且所得的质粒pDB4540，pDB4541，pDB4542和pDB4543列于表2。将质粒pDB4540至44543用NsiII/PvuI消化，并使用Qiagen PCR纯化试剂盒遵循生产商的指示纯化。将纯化的NsiII/PvuI消化的质粒(100ng)，连同100ng Acc65I/BamHI消化的pDB3936，用于通过如上所述的缺口修复直接共转化酿酒酵母BXP10cir⁰。如上所述对于酵母菌株制备海藻糖储备物。

方法4：截短的HSA突变体的构建

用于截短的HSA突变体(图6，见下)的表达构建体通过PCR和缺口修复来生成。这通过根据生产商的指示使用Phusion Polymerase(New EnglandBiolabs)生成PCR产物，pDB3927(描述于WO2010/092135(通过提述并入本文)和寡核苷酸(表6和7)来实现。这得到了其中特定密码子(即氨基酸568和572至585，排除位置573)用翻译终止密码子氨基酸TAA来替代的DNA。将这些PCR产物克隆入质粒，并用于通过缺口修复在酵母中形成表达质粒。

表6：截短的HSA分子

分子	寡核苷酸对	质粒
			HSA585终止	xAP265/xAP294	pDB4544
HSA584终止	xAP265/xAP295	pDB4545
			HSA583终止	xAP265/xAP296	pDB4546
HSA582终止	xAP265/xAP297	pDB4547
			HSA581终止	xAP314/xAP298	pDB4548
HSA580终止	xAP314/xAP299	pDB4549
			HSA579终止	xAP314/xAP300	pDB4550
HSA578终止	xAP314/xAP301	pDB4551
			HSA577终止	xAP314/xAP302	pDB4552
HSA576终止	xAP314/xAP303	pDB4553
			HSA575终止	xAP314/xAP304	pDB4554
HSA574终止	xAP314/xAP305	pDB4555
			HSA572终止	xAP314/xAP306	pDB4556
HSA568终止	xAP314/xAP307	pDB4557

在表6中，如此命名白蛋白变体，使得“HSA585终止”为其中在位置585的天然氨基酸用终止密码子取代的HSA变体。

具体地，对于HSA568终止表达构建体，使用寡核苷酸xAP314和xAP307从pDB3927根据生产商的指示扩增493bp片段，其含有编码HSA DIII的DNA序列。将终止密码子工程改造入寡核苷酸xAP307使得编码HSA的DNA序列的翻译在氨基酸567之后终止。将PCR片段用AvrII/Bsu36I消化，使用Qiagen PCR-清洁试剂盒纯化(根据生产商的指示)，并连接入AvrII/Bsu36I消化的pDB3927。将连接物转化入大肠杆菌DH5α，接着使用Qiagen微量制备试剂盒将质粒从转化体分离(根据生产商的指示)，并通过选择性分析鉴定正确的构建体。这产生HSA568终止表达构建体pDB4557。

HSA572终止和HSA574终止至HSA581终止表达构建体以与HSA568终止构建体相同的方式，使用列于表7的寡核苷酸制备，以产生质粒pDB4548至pDB4556(表6)。

对于HSA582至HSA585终止构建体(1.122kb)片段，将片段从pDB3927使用表7中列出的寡核苷酸PCR扩增。将PCR片段分别用BglII/HindIII消化，分离并连接入pDB2923(Finnis,C.J.等(2010)High-level production ofanimal-free recombinant transferrin from Saccharomyces cerevisiae.Microb CellFact9,87)，以分别产生质粒#10D，#11B，#12C和#13D。将质粒#10D至#13D用AvrII/SphI消化，并从每个分离出666bp片段(含有编码白蛋白C末端的DNA)，并将其连接入AvrII/SphI消化的pDB3927以分别产生缺口修复构建体pDB4544-pDB4547(表6)。

将质粒pDB4544-pDB4557用NsiI/PvuI修复，在使用之前，DNA使用Qiagen PCR纯化试剂盒如生产商的指示纯化，以连同Acc65I/BamHI消化的pDB3936如上所述共转化酿酒酵母BXP10cir⁰，在酵母中通过缺口修复生成表达质粒。

如前所述对于每个所得的菌株制备储备。

产生HSA573终止变体的菌株之前已制备，如WO2011/0541489中所述(通过提述并入本文)。

表7：用于制备截短的HSA突变体的寡核苷酸序列

实施例1：包含HSA的N端和HSA，恒河猴白蛋白，小鼠白蛋白，兔白蛋白或绵羊白蛋白的C端的变体

生成下述变体，且其对shFcRn的结合如方法1和2中所述确定。结果表示于表8

表8：HSA C端交换的变体与shFcRn相互作用的动力学。

a：在固定化的shFcRn(～1500RU)上注入HSA变体的稀释。

b：动力学速率常数使用简单的一级(1:1)二分子相互作用模型来获得。

由于弱结合而未确定(ND)

*HSA-SheepC的总长度为584个氨基酸。

本实施例说明对于所有经测试的C端交换为人白蛋白的情况，观察到相对于供体白蛋白在结合方面的增加和相对于受体白蛋白(即HSA)在结合方面的增加。所有供体序列在位置573含有Pro。这显示交换白蛋白的C端允许调节所述多肽的结合亲和力，因此允许根据需要“定制”结合亲和力。

实施例2(比较例)：HSA的C端的截短调节对shFcRn的结合

制备了下述白蛋白变体，并分别如上述方法4和2所述确定其对shFcRn的结合。结果表示于表9和图4。

表9：HSA的C端的截短在pH6.0调节对shFcRn的结合

白蛋白变体^a	Ka(10³/Ms)	kd(10^-3/s)	KD^b(μM)	KD^c(μM)
					WT	6.6±0.1	9.1±0.1	1.3	2.4
584终止	8.6±0.0	32.0±0.1	3.7	ND
					582终止	13.0±0.2	65.0±0.0	5.0	ND
581终止	3.6±0.0	32.0±0.1	9.0	ND
					580终止	9.8±0.1	60±0.0	6.1	13.2
579终止	ND	ND	ND	17.0
					578终止	ND	ND	ND	19.9
577终止	ND	ND	ND	23.0
					573终止	ND	ND	ND	14.1
572终止	ND	ND	ND	10.4
					568终止	ND	ND	ND	23.0

a：在固定化的shFcRn(～2000RU)上注入HSA变体的稀释。

b：动力学速率常数使用简单的一级(1:1)二分子相互作用模型来获得。动力学值代表一式两次的平均值。

c：稳态亲和常数使用BIAevaluation4.1软件提供的平衡(Req)结合模型获得。

d：未确定(ND)。

表9和图4的数据显示HSA的C端在对shFcRn的pH依存性结合方面的重要性。令人惊讶的是，HSA的最后氨基酸(Leu585)的去除与野生型HSA相比使对受体的结合减少50%，且进一步截短增加该作用(图4)。KD的确定显示C端截短的剧烈影响(表9)。

图5显示一般趋势，其中增加白蛋白变体C端截短的程度减少相对于野生型HSA对FcRn的结合亲和力，白蛋白变体对FcRn的结合亲和力。

这些数据显示从白蛋白的C端去除1至17个氨基酸减少白蛋白对FcRn的结合亲和力。这显示白蛋白的C端在白蛋白对FcRn的结合方面具有重要作用。

HSA为585个氨基酸长。与之相对，动物白蛋白通常较短，例如恒河猴，小鼠和兔HSA各为584个氨基酸长，而绵羊白蛋白为583个氨基酸长。实施例1显示恒河猴，小鼠和兔白蛋白的每一个对人FcRn的结合亲和力与HSA对人FcRn的结合亲和力相比较强。而且，HSA和恒河猴，小鼠，兔或绵羊白蛋白的嵌合体对人FcRn的结合比野生型人，恒河猴，小鼠，兔或绵羊白蛋白对人FcRn的结合较强，在此表明白蛋白的C末端的重要性。实施例2的数据显示HSA的C端的去除减少对FcRn的结合亲和力。实施例1的数据显示截短的白蛋白的结合亲和力可通过用另一个白蛋白如本文中所述的动物白蛋白的C端替代HSA的C端来恢复。所有测试的动物白蛋白在位置573具有Pro。与之相对，HSA在位置573具有Lys。这表明573在白蛋白对FcRn的结合方面具有重要的积极作用。

实施例1和2的数据表明第一白蛋白(例如HSA)的C端的去除，和将其用第二白蛋白(例如动物白蛋白)的C端替代得到嵌合白蛋白，其与所述第一白蛋白的FcRn结合亲和力相比具有改变的FcRn结合亲和力，说明白蛋白的C端在对人FcRn的结合方面的重要性。嵌合体-FcRn结合亲和力与C端截短的白蛋白对FcRn的结合亲和力相比较强。然而，因为嵌合体的结合亲和力不同于第一和第二白蛋白，这显示除了C端之外的白蛋白的部分亦涉及对人FcRn的结合。

本文描述和要求保护的本发明并不局限于本文公开的具体方面的范围内，因为这些方面旨在作为本发明几个方面的说明。旨在将任何等同的方面包含于本发明的范围内。实际上，从前面的说明中，除本文所显示和描述的之外，本发明的多种修改对于本领域的技术人员来说是显而易见的。这些修改也旨在落入所附的权利要求的范围内。在冲突的情况下，以包括定义部分的本公开为准。

Claims

1.一种多肽，其包含：

(i)第一白蛋白、白蛋白变体或其片段的N端区；和

(ii)第二白蛋白、白蛋白变体或其片段的C端区

其中：

(a)第一白蛋白、白蛋白变体或其片段的N端区包含其来源的分子除了C端1至100个氨基酸之外的氨基酸；和

(b)第二白蛋白、白蛋白变体或其片段的C端区包含第二白蛋白、白蛋白变体或其片段的C端1至100个氨基酸；和

(c)所述多肽具有(i)与第一白蛋白、白蛋白变体或其片段相比改变的半寿期和/或(ii)与第一白蛋白、白蛋白变体或其片段相比改变的对FcRn的结合亲和力。

2.权利要求1的多肽，其包含：

(i)第一白蛋白、白蛋白变体或其片段的N端区；和

(ii)第二白蛋白、白蛋白变体或其片段的C端区

其中：

(a)第一白蛋白、白蛋白变体或其片段的N端区包含其来源的白蛋白、白蛋白变体或片段的83至100%；和

(b)第二白蛋白、白蛋白变体或其片段的C端区包含白蛋白、白蛋白变体或片段的C端0.5%至17%氨基酸

(c)所述多肽具有(i)与第一白蛋白、白蛋白变体或其片段相比改变的半寿期和/或(ii)与所述第一白蛋白、白蛋白变体或其片段相比改变的对FcRn的结合亲和力。

3.权利要求1或2所述的多肽，其中与所述多肽的半寿期和/或FcRn结合亲和力相比较的第一白蛋白，是野生型白蛋白或天然存在的白蛋白，优选为HSA(SEQ ID NO:2)。

4.权利要求1，2或3任一项所述的多肽，其中第一白蛋白、白蛋白变体或其片段的N端区包含除了C端2至30个氨基酸之外，其来源的分子的所有氨基酸。

5.权利要求1至4任一项所述的多肽，其中第一白蛋白、白蛋白变体或其片段的N端区包含除了C端12至20个氨基酸，最优选C端13个氨基酸之外，其来源的分子的所有氨基酸。

6.权利要求1至5任一项所述的多肽，其中第一白蛋白、白蛋白变体或其片段的N端区包含其来源的白蛋白、白蛋白变体或片段的至少97%。

7.权利要求1至6任一项所述的多肽，其中第一白蛋白、白蛋白变体或其片段的N端区包含其来源的白蛋白、白蛋白变体或片段的至少98%。

8.权利要求1至7任一项所述的多肽，其中第二白蛋白、白蛋白变体或其片段的C端区包含C端2至30个氨基酸，更优选C端12个20氨基酸，最优选地C端13个氨基酸。

9.权利要求1至8任一项所述的多肽，其中第二白蛋白、白蛋白变体或其片段的C端区包含第二白蛋白、白蛋白变体或其片段的C端1至3%。

10.权利要求1至9任一项所述的多肽，其中所述第一白蛋白选自人白蛋白，恒河猴白蛋白，兔白蛋白，小鼠白蛋白，绵羊白蛋白，山羊白蛋白，黑猩猩白蛋白，仓鼠白蛋白，豚鼠白蛋白，大鼠白蛋白，牛白蛋白，马白蛋白，驴白蛋白，犬白蛋白，鸡白蛋白，或猪白蛋白。

11.权利要求1至10任一项所述的多肽，其中所述第一白蛋白包含白蛋白的域III或由白蛋白的域III组成。

12.权利要求1至11任一项所述的多肽，其中所述第二白蛋白选自恒河猴白蛋白，小鼠白蛋白，兔白蛋白，绵羊白蛋白，人白蛋白，山羊白蛋白，黑猩猩白蛋白，仓鼠白蛋白，豚鼠白蛋白，大鼠白蛋白，牛白蛋白，马白蛋白，驴白蛋白，犬白蛋白，鸡白蛋白，或猪白蛋白。

13.权利要求1至12任一项所述的多肽，其与所述第一白蛋白、白蛋白变体或其片段相比具有较长的半寿期和/或较强的对FcRn的结合亲和力。

14.权利要求1至12任一项所述的多肽，其与所述第一白蛋白、白蛋白变体或其片段相比具有较短的半寿期和/或较弱的对FcRn的结合亲和力。

15.权利要求1至14任一项所述的多肽，其中所述第一白蛋白或白蛋白变体与SEQ ID NO:2相比，在存在于所述多肽的第一白蛋白的N端区的长度上具有多于80%，优选地，多于90%，更优选多于95%，更优选多于96%，甚至更优选多于97%，更优选多于98%和最优选多于99%同一性。

16.权利要求1至15任一项所述的多肽，其中所述第一白蛋白、白蛋白变体或其片段的N端区包含SEQ ID NO:2的氨基酸1至565、566、567、568、569、570、571、572、573、574或575。

17.权利要求1至16任一项所述的多肽，其中所述第一白蛋白片段：

(i)与SEQ ID NO:24，SEQ ID NO:25，SEQ ID NO:26，SEQ ID NO:27，SEQ ID NO:28或SEQ ID NO:29相比，在存在于所述多肽的第一白蛋白的N端区上具有多于80%，优选地，多于90%，更优选多于95%，更优选多于96%，甚至更优选多于97%，更优选多于98%和最优选多于99%同一性；和/或

(ii)包含至少20，优选地，至少50，优选地，至少100，更优选至少200，更优选至少300，更优选至少400和最优选至少500个来自天然白蛋白如SEQID NO:2的连续的氨基酸。

18.权利要求1至17任一项所述的多肽，其中所述多肽包含SEQ ID NO:20，SEQ ID NO:21，SEQ ID NO:22或SEQ ID NO:23或由SEQ ID NO:20，SEQ ID NO:21，SEQ ID NO:22或SEQ ID NO:23组成。

19.一种融合多肽，其包含根据权利要求1至18任一项所述的多肽和融合伴侣多肽。

20.一种缀合物，其包含权利要求1至19任一项所述的多肽和缀合伴侣如药学上有益的模块如治疗模块，预防模块或诊断模块。

21.一种组合物，其包含权利要求1至20任一项所述的多肽、融合多肽或缀合物，和药学上可接受的载体。

22.权利要求21的组合物，其包含化合物，所述化合物包含抗体结合域(ABD)和药学上有益的模块如治疗模块，预防模块或诊断模块。

23.一种多核苷酸，其编码权利要求1至19任一项所述的多肽或融合多肽。

24.一种载体，其包含权利要求23的多核苷酸。

25.一种宿主细胞，其包含权利要求23的多核苷酸或权利要求24的载体。

26.一种预防、治疗或诊断方法，其包括将权利要求1至23任一项所述的多肽、融合多肽、缀合物、组合物或多核苷酸施于受试者。

27.一种制备白蛋白的变体、其片段或包含所述变体或片段的融合多肽的方法，所述方法包括：

i)提供多核苷酸，其编码第一白蛋白、白蛋白变体或其片段的N端区和第二白蛋白、白蛋白变体或其片段的C端区和任选地编码融合伴侣多肽；

其中(a)第一白蛋白、白蛋白变体或其片段的N端区包含其来源的分子除了C端1至100个氨基酸之外的氨基酸；和(b)第二白蛋白、白蛋白变体或其片段的C端区包含第二白蛋白、白蛋白变体或其片段的C端1至100个氨基酸；和(c)由所述多核苷酸编码的多肽或融合多肽具有与包含第一白蛋白、白蛋白变体或其片段的多肽或融合多肽相比改变的半寿期和/或与第一白蛋白、白蛋白变体或其片段相比改变的对FcRn的结合亲和力。

ii)在宿主细胞中表达所述多核苷酸；和

iii)回收所得的多肽或融合多肽。

28.权利要求27的制备白蛋白的变体、其片段或包含所述变体或片段的融合多肽的方法，所述方法包括：

其中(a)第一白蛋白、白蛋白变体或其片段的N端区包含其来源的白蛋白、白蛋白变体或片段的83至99.5%；和(b)第二白蛋白、白蛋白变体或其片段的C端区包含第二白蛋白、白蛋白变体或其片段的C端0.5%至17%的氨基酸；和(c)由所述多核苷酸编码的多肽或融合多肽具有与包含第一白蛋白、白蛋白变体或其片段的多肽或融合多肽相比改变的半寿期和/或与第一白蛋白、白蛋白变体或其片段相比改变的对FcRn的结合亲和力。

ii)在宿主细胞中表达所述多核苷酸；和

iii)回收所得的多肽或融合多肽。

29.一种改变分子的半寿期的方法，其包括：

(a)当所述分子是多肽时，将所述分子融合于权利要求1至18任一项所述的多肽，或将所述分子缀合于权利要求1至19任一项所述的多肽或融合多肽，或将所述分子缔合于权利要求1至19任一项所述的多肽，或将所述分子并入包含权利要求1至19任一项所述的多肽或由权利要求1至19任一项所述的多肽组成的纳米颗粒或微粒；

(b)当所述分子并非多肽时，将所述分子缀合于权利要求1至19任一项所述的多肽或融合多肽，或将所述分子缔合于权利要求1至19任一项所述的多肽，或将所述分子并入包含权利要求1至19任一项所述的多肽或由权利要求1至19任一项所述的多肽组成的纳米颗粒或微粒。

30.一种纳米颗粒或微粒，其包含权利要求1至18任一项所述的多肽、权利要求19的融合多肽和/或权利要求20的缀合物。

31.一种缔合物，其包含权利要求1至18任一项所述的多肽，权利要求19的融合多肽和/或权利要求20的缀合物，和非白蛋白模块。

32.前述任一项权利要求所述的白蛋白变体或衍生物的融合物、缀合物、缔合物、组合物、纳米颗粒和/或微粒，其中所述融合物或缀合物或缔合物或组合物、纳米颗粒或微粒包含一种或多种本文中所述的模块。

33.权利要求1至22或31至32任一项的白蛋白的变体、其片段或包含所述变体白蛋白或其片段的融合多肽，其缀合物，其缔合物，或其组合物改变治疗、预防、诊断、成像或其它有益模块的半寿期，优选在血浆中的半寿期的用途。