CN108137674A

CN108137674A - 白蛋白变体和缀合物

Info

Publication number: CN108137674A
Application number: CN201680048107.0A
Authority: CN
Inventors: K·A·德拉海; C·J·A·芬尼斯; K·M·尼克尔斯
Original assignee: Aerbumeidikesi Medical Co
Current assignee: Novozymes Biopharma DK AS
Priority date: 2015-08-20
Filing date: 2016-08-19
Publication date: 2018-06-08
Anticipated expiration: 2036-08-19
Also published as: US10633428B2; CA2989966A1; WO2017029407A1; CN108137674B; US20230039076A1; EP3337816A1; CA2989966C; US20210070839A1; AU2016308504A1; US20180265568A1; MX2018001825A; BR112018003179A2; JP2018527923A; EP3337816B1; JP7007261B2; IL256627A

Abstract

本发明涉及有缀合能力的白蛋白和白蛋白相关多肽及其与至少一个部分的缀合物，并涉及编码其的多核苷酸。

Description

白蛋白变体和缀合物

对序列表的引用

本申请含有计算机可读形式的序列表。在此将计算机可读形式的序列表并入作为参考。

发明领域

本发明涉及有缀合能力(conjugation-competent)的白蛋白和白蛋白相关多肽，以及其与至少一个(例如，若干个)部分的缀合物，并涉及编码其的多核苷酸。

背景技术

血清白蛋白提供有价值的可以融合生物活性分子的支架，其通过基因融合或化学融合来融合，以提高融合分子的特性(Leger,R.等人(2004),Bioorg Med Chem Lett 14(17):4395-8；Thibaudeau,K.等人,(2005).Bioconjug Chem 16(4):1000-8；Balan,V.等人(2006),Antivir Ther 11(1):35-45；EP 0413622；WO 90/13653；EP 1681304；WO 1997/024445)。白蛋白的血清半衰期长，为大约19天，由于该特性，其被提出用于药物递送。

人血清白蛋白(HSA)多肽链具有35个半胱氨酸残基，其形成17个二硫键，并在成熟蛋白质(SEQ ID NO.2)的34位上形成一个未成对(游离)半胱氨酸。半胱氨酸-34已经用于使分子与白蛋白缀合(Leger等人(2004)Bioorg Med Chem Lett 14(17):4395-8；Thibaudeau等人(2005),Bioconjug Chem 16(4):1000-8)，并提供精确、明确的缀合位点。但是，半胱氨酸-34上的缀合仅仅提供用于单个部分连接的一个位点，因此缀合位点没有选择。另外，提供单个缀合位点意味着仅有一个部分可以与每个白蛋白分子缀合。WO 2009/126920和WO2010/059315提出将白蛋白中一个或多个(例如，若干个)所选择的表面暴露的苏氨酸或丝氨酸残基替换成半胱氨酸。但是，并没有公开这些变体的实际产出。WO 2010/092135公开了包括三个或更多个(若干个)有缀合能力的半胱氨酸残基的白蛋白变体：cysteine-34和至少两个另外的半胱氨酸残基；或者其中另一氨基酸替换成半胱氨酸-34、并且具有至少3个另外的游离半胱氨酸的变体。

通常将药物试剂或其前体制备成同一物种，以允许进行质量控制。在HSA中，34位上的游离半胱氨酸位于深度的疏水裂缝中(Cornell CN,Chang R,KaplanLJ.1981.Arch.Biochem.Biophys.209(1):1–6)，被认为不参与HSA的同型二聚。但是，多肽中表面暴露的半胱氨酸残基可以形成稳定的分子间二硫键，如天然界中所发生，例如，在免疫球蛋白的重链和轻链之间。提供二聚体或寡聚体形成倾向低的引入有半胱氨酸残基的白蛋白变体是合意的。

WO 2000/69902公开了药学上有益的化合物与HSA在半胱氨酸-34上的缀合，并发现缀合物保持了白蛋白很长的血浆半衰期。通常认为产生的缀合物的血浆半衰期比单独的药学有益化合物的血浆半衰期要长。而且，白蛋白已经与治疗有益的肽基因融合(WO 2001/79271A和WO 2003/59934)，通常的结果是融合物具有治疗有益肽的活性，并且血浆半衰期显著长于单独的治疗有益肽的血浆半衰期。

白蛋白在体内与其受体初生Fc受体(FcRn)“Brambell”结合，已知该相互作用对于白蛋白的血浆半衰期来说非常重要。FcRn是在许多细胞和组织类型中表达的膜结合蛋白质。已经发现FcRn补救白蛋白的细胞内降解(Roopenian D.C.和Akilesh,S.(2007),Nat.Rev.Immunol 7,715-725)。FcRn是有助于保持哺乳动物例如人体内血浆中IgG和白蛋白的高水平的双功能分子。数据表明，IgG和白蛋白非协同性地与FcRn上的不同位点结合(Andersen等人(2006),Eur.J.Immunol 36,3044-3051；Chaudhury等人(2006),Biochemistry 45,4983-4990)。Andersen等人(2010)在Journal of BiologicalChemistry 285(7):4826-36中说明了人和小鼠FcRn对于人和小鼠白蛋白各自的亲和力(所有可能的组合)。在生理性pH下没有观察到来自任一物种的白蛋白与任一受体的结合。在酸性pH下，观察到结合亲和力存在100倍的差异。

白蛋白中主要的FcRn受体结合位点位于结构域III(DIII，381-585)(Andersen等人(2010),Clinical Biochemistry 43,367-372)。已经显示若干个关键的氨基酸残基在结合中非常重要，值得注意的有人白蛋白的组氨酸H464、H510和H536以及赖氨酸K500(Andersen等人(2010),Nat.Commun.3:610.DOI:10.1038/ncomms1607)。通常，白蛋白对于FcRn的亲和力越高，其血浆半衰期越长。WO 2011/124718公开了一类具有调节的FcRn结合亲和力的变体白蛋白；变体包括白蛋白结构域III以及白蛋白的一个或多个(例如，若干个)其他结构域，并任选地包括一个或多个(例如，若干个)点突变。WO 2012/059486公开了白蛋白变体，其中结构域III的C-端部分交换成不同动物物种白蛋白的相应部分。WO 2013/075066、WO 2011/103076、WO 2012/112188、WO 2011/051489和WO 2014/072481公开了结构域III内的点突变或这些点突变的结合，其改变了白蛋白与FcRn的结合亲和力。

最近已经发现，白蛋白位于结构域I或结构域II内的不同氨基酸残基也影响着其与FcRn的相互作用。WO 2013/135896公开了具有结构域I中的一个或多个(例如，若干个)改变和结构域III中的一个或多个(例如，若干个)改变的白蛋白变体。WO 2015/036579公开了在结构域II中具有一个或多个(例如，若干个)改变的白蛋白变体。

在本说明书中列举或讨论显然在先公开的文件不应当必然视作认可该文件是本领域状态的一部分或者是常见的公知常识。

合意地是提供有一个或多个(例如，若干个)引入的半胱氨酸残基的白蛋白变体，其中引入的游离半胱氨酸残基本身对白蛋白的FcRn结合没有主要影响，或者位置使得配偶体分子与游离半胱氨酸的缀合将在空间上阻碍FcRn结合。这些考虑将会降低在单个白蛋白变体中引入多于一个的游离半胱氨酸的组合时有不可预测的影响的风险。这些变体多肽可以进一步修饰成包括已知影响白蛋白FcRn结合亲和力的改变，使得允许对于特定的应用对多肽或其缀合物的血浆半衰期进行定制。

发明内容

基于与FcRn结合的人血清白蛋白(HSA)三维结构的分析，本发明的发明人已经设计出具有一个或多个(例如，若干个)有缀合能力的半胱氨酸残基的白蛋白变体多肽(突变蛋白质)。本文中使用的术语“硫代-白蛋白(thio-albumin)”是指包括一个或多个(例如，若干个)未成对半胱氨酸残基的白蛋白变体，特别是未成对半胱氨酸残基的一个或多个(例如，若干个)在天然白蛋白变体中不存在的白蛋白变体。因此，硫代-白蛋白是“有缀合能力的白蛋白”。硫代-白蛋白可以称作“白蛋白的半胱氨酸变体”。更具体地，本发明涉及包括与人白蛋白、特别是成熟人白蛋白多肽序列(SEQ ID NO.2)的残基1-585、或其片段的同一性为至少60％的氨基酸序列的有缀合能力的多肽；其中至少一个与选自SEQ ID NO.2的K93、E294、A226、E230、I271、E358、L24、F49、V54、D56、L66、A92、Q94、E97、H128、F156、E227、D237、K240、D259、K262、N267、Q268、L275、E277、L284、E311、K317、A322、E333、D340、E354、K359、A362、E382和L398的位置相当的位置包括有缀合能力的半胱氨酸残基；并且其中有缀合能力的多肽在溶液中作为单体存在的倾向性优选地是多肽SEQ ID NO.2在溶液中作为单体存在的倾向性的至少70％。

更优选地，多肽在溶液中作为单体存在的倾向性是多肽SEQ ID NO.2在溶液中作为单体存在的倾向性的至少75％，并且至少一个与选自K93、E294、A226、E230、I271、E358、L24、F49、V54、D56、A92、Q94、E97、H128、F156、E227、D237、K240、D259、K262、N267、Q268、L275、L284、K317、A322、E333、D340、E354、K359、A362、E382和L398的位置相当的位置包括有缀合能力的半胱氨酸残基。

本发明还涉及包括如上文所定义的氨基酸序列并且与SEQ ID NO.2相比较包括至少一个(例如，若干个)另外的修饰的有缀合能力的多肽，例如另外的修饰导致多肽具有至少一个(例如，若干个)另外的有缀合能力的半胱氨酸，或者改变多肽的FcRn结合亲和力，或者改变多肽的血浆半衰期。本发明还涉及编码上述变体的分离的多核苷酸；包括上述多核苷酸的核酸构建物、载体和宿主细胞；和制造上述变体的方法。

本发明还涉及包括根据本发明的变体白蛋白或其片段以及有益治疗部分的缀合物或缔合物，或者涉及包括本发明的变体白蛋白或其片段以及融合配偶体多肽的融合多肽。

本发明进一步涉及包括变体白蛋白、其片段、包含变体白蛋白或其片段的融合多肽、或者包含根据本发明的变体白蛋白或其片段的缀合物、或者包含根据本发明的变体白蛋白或其片段的缔合物的组合物。组合物优选为药物组合物。

本发明进一步涉及包括变体白蛋白、其片段、包含变体白蛋白或其片段的融合多肽、或者包含变体白蛋白或其片段的缀合物、或者包含变体白蛋白或其片段的缔合物的药物组合物。

本发明还涉及变体、片段、融合多肽、缀合物、缔合物、纳米颗粒和微颗粒的用途。

本发明还涉及变体白蛋白、其片段、包含变体白蛋白或其片段的融合多肽、或者包含变体白蛋白或其片段的缀合物、或者包含变体白蛋白或其片段的缔合物的制备方法。

附图说明

图1.以下氨基酸序列的多重比对：(i)全长成熟HSA(Hu_1_2_3)，(ii)包括HSA结构域I和结构域III的白蛋白变体(Hu_1_3)，(iii)包括HSA结构域II和结构域III的白蛋白变体(Hu_2_3)，(iv)全长猕猴(Macaca mulatta)白蛋白(Mac_mul)，(v)全长褐家鼠(Rattusnorvegicus)白蛋白(大鼠)和(vi)全长小家鼠(Mus musculus)白蛋白(小鼠)。位置500、550和573(相对于全长HSA)由箭头指示。

图2.来自人、绵羊、小鼠、兔和山羊的成熟白蛋白以及来自黑猩猩(“Chimp”)、猕猴、仓鼠、豚鼠、大鼠、牛、马、驴、狗、鸡和猪的不成熟白蛋白的氨基酸序列的多重比对。结构域1、2和3的起始和结束氨基酸(如Dockal等人所定义(The Journal of BiologicalChemistry,1999,Vol.274(41):29303–29310))相对于成熟的人白蛋白示出。

图3.显示20种氨基酸之间种类和关系的维恩图。

图4.A：将包括游离硫醇基的蛋白质用马来酰亚胺-PEG2-生物素进行生物素化的反应示意图。B：说明示意图A中形成的缀合物可能的retro-Michael和琥珀酰亚胺水解反应的示意图。

在A中，马来酰亚胺与硫醇基形成加合物，从而形成具有硫醚键的琥珀酰亚胺部分。

B说明加合物的形成。加合物可以经由retro-Michael途径逆转成马来酰亚胺和游离硫醇。另外可选地，琥珀酰亚胺部分可以通过在pH 9下水解经历稳定化开环形成琥珀酸。缀合物的硫醚键得以保留，琥珀酸部分对于可能存在的其他硫醇化合物没有反应性。当经历水解时，游离的马来酰亚胺也变得对硫醇没有反应性。

图5.与马来酰亚胺-PEG2-生物素缀合的提纯的变体的MS谱(A：C34A+I271C变体；B：C34A+K93C变体)。A：缀合物峰为66924.1。较短的峰是未缀合的蛋白质。相对峰高表明缀合的比例为72％。+MS，7.7-9.2min，基线消减(0.50)，去卷积(MaxEnt)，平滑化(0.00,1，GA)。B：缀合物峰为66908.3，没有游离部分，表明100％缀合。+MS，7.6-9.4min，基线消减(0.50)，去卷积(MaxEnt)，平滑化(0.00,1，GA)。

图6.与马来酰亚胺-PEG2-生物素缀合、并经历受控水解的提纯的白蛋白的MS谱(A：野生型；B：C34A+E294C变体)。在A中，53％的白蛋白作为硫醇稳定的缀合物存在，峰为66978.4；47％在retro-Michael去缀合之后作为游离白蛋白存在。+MS，7.0-9.6min基线消减(0.50)，去卷积(MaxEnt)，平滑化(0.00,1，GA)。在B中，100％的C34A+E294C变体作为硫醇稳定的缀合物存在，峰为66925.7。+MS，7.6-9.5min基线消减(0.50)，去卷积(MaxEnt)，平滑化(0.00,1，GA)。

图7.与马来酰亚胺-PEG2-生物素缀合、并经历受控水解(B和C)的提纯的白蛋白变体的MS谱(A：K93C+E294C；B：K93C+E294C；C：C34A+K93C+E294C)。在A中，K93C+E294C的67967.7的单峰表示与三个游离硫醇的每一个100％缀合。+MS，1.6-2.6min，基线消减(0.40)，去卷积(MaxEnt)，平滑化(0.00,1，GA)。在B中，20％的K93C+E294C的三重缀合物在水解之后是硫醇稳定的。67476.2处的主峰指示两个硫醇稳定的缀合键，通过retro-Michael去缀合丧失一个马来酰亚胺-PEG2-生物素。+MS，1.8-2.9min，基线消减(0.40)，去卷积(MaxEnt)，平滑化(0.00,1，GA)。在C中，C34A+K93C+E294C的双重缀合物是峰67443.1处的主要物种，其他物种是峰66894.6处的单一缀合物。+MS，1.7-2.8min，基线消减(0.40)，去卷积(MaxEnt)，平滑化(0.00,1，GA)。.

图8.提纯的白蛋白变体K93C+E294C+K573P(其包括天然Cys34)的MS谱。A：表示与三个游离硫醇的每一个100％缀合。+MS，7.3-9.7min，基线消减(0.50)，去卷积(MaxEnt)，平滑化(0.00,1，GA)。在B中，23％的K93C+E294C+K573P(其包括天然Cys34)的三重缀合物在水解之后是硫醇稳定的。67447.3处的主峰指示两个硫醇稳定的缀合键，通过retro-Michael去缀合丧失一个马来酰亚胺-PEG2-生物素。+MS，7.4-9.5min，基线消减(0.50)，去卷积(MaxEnt)，平滑化(0.00,1，GA)。

图9.A：说明Alexa 488-PEG4-Lys(一溴马来酰亚胺)-NH2染料的示意图。显示了与Alexa 488-PEG4-Lys(一溴马来酰亚胺)-NH2染料缀合的提纯的白蛋白变体(B：K573P；C：K93C+E294C+K573P)的MS谱。在B中，K573P的67468.5的单峰表明在Cys34处与单一游离硫醇100％缀合。+MS，7.6-9.7min，基线消减(0.50)，去卷积(MaxEnt)，平滑化(0.00,1，GA)。在C中，K93C+E294C+K573P(其包括天然Cys34)的三重缀合物是峰69535.8处的主要物种。较短的峰是较短的缀合物。相对峰高表明分别有58％的三重缀合物和42％的双重缀合物。+MS，7.6-9.3min基线消减(0.50)，去卷积(MaxEnt)，平滑化(0.00,1，GA)。

图10.A：表示5-羧基荧光素-PEG4-Lys(一溴马来酰亚胺)-NH2染料的示意图。显示了与5-羧基荧光素-PEG4-Lys(一溴马来酰亚胺)-NH2染料缀合的提纯的白蛋白变体(B：K573P；C：C34A+K93C+E294C+K573P)的MS谱。在B中，K573P的67310.6的单峰表明在Cys34处与单一游离硫醇100％缀合。+MS，7.2-9.3min，基线消减(0.50)，去卷积(MaxEnt)，平滑化(0.00,1，GA)。在C中，峰68129.7处的C34A+K93C+E294C+K573P的双重缀合物是主要物种。较短的峰是单一缀合的蛋白质。相对峰高表明分别有91％的双重缀合物和9％的单一缀合物蛋白质。+MS，7.3-9.3min，基线消减(0.50)，去卷积(MaxEnt)，平滑化(0.00,1，GA)。

图11.A：显示一溴马来酰亚胺-紫杉醇的示意图。显示了与一溴马来酰亚胺-紫杉醇缀合的提纯的白蛋白变体(B：K573P；C：K93C+E294C+K573P)的MS谱。在B中，K573P的67412.2的峰指示在Cys34处与单一游离硫醇缀合。较短的峰是未缀合的蛋白质。相对峰高表明分别有77％的单一缀合物和23％未缀合蛋白质。+MS，7.1-8.9min，基线消减(0.50)，去卷积(MaxEnt)，平滑化(0.00,1，GA)。在C中，K93C+E294C+K573P的双重缀合物是峰68364.2处的主要物种。较短的峰是三重缀合的蛋白质。相对峰高表明分别有60％的双重缀合物和30％的三重缀合蛋白质。+MS，7.2-9.0min，基线消减(0.50)，去卷积(MaxEnt)，平滑化(0.00,1，GA)。

图12.A：说明一溴马来酰亚胺-PEG2-艾塞那肽(exenatide)肽的示意图。显示了与一溴马来酰亚胺-PEG2-艾塞那肽缀合的提纯的白蛋白变体(B：K573P；C：C34A+K93C+E294C+K573P)的MS谱。在B中，K573P的71018.7的峰指示在Cys34处与单一游离硫醇缀合。66409.2处的主峰是未缀合的蛋白质。相对峰高表明分别有33％的单一缀合物和67％的未缀合蛋白质。+MS，7.2-8.8min，基线消减(0.50)，去卷积(MaxEnt)，平滑化(0.00,1，GA)。在C中，C34A+K93C+E294C+K573P的双重缀合物为75557.3。70941.7处的主峰是单一缀合物。66322.4处的最短的峰是未缀合的蛋白质。相对峰高表明分别有33％的双重缀合物、45％的单一缀合物和22％的未缀合蛋白质。+MS，7.2-9.2min，基线消减(0.50)，去卷积(MaxEnt)，平滑化(0.00,1，GA)。

图13.A：表明马来酰亚胺-丙基-FLAG肽的示意图。显示了与马来酰亚胺-丙基-FLAG肽缀合的提纯的白蛋白变体(B：K573P；C：K93C+E294C+K573P)的MS谱。在B中，K573P的67573.4的峰表明在Cys34处与单一游离硫醇缀合。主峰是未缀合的蛋白质。相对峰高表明分别有29％的单一缀合物和71％的未缀合蛋白质。+MS，7.3-8.7min，基线消减(0.50)，去卷积(MaxEnt)，平滑化(0.00,1，GA)。在C中，K93C+E294C+K573P(包括天然Cys34)的三重缀合物为69850.5。68685.5处的主峰是双重缀合物。67520.3处的峰是单一缀合物。66350.2处较短的峰是未缀合的蛋白质。相对峰高表明分别有29％的三重缀合物、50％的双重缀合物、20％的单一缀合物和2％的未缀合蛋白质。+MS，7.2-8.8min，基线消减(0.50)，去卷积(MaxEnt)，平滑化(0.00,1，GA)。

具体实施方式

定义

变体：术语“变体”是指通过在一个或多个(例如，若干个)位置处进行一个或多个(例如，若干个)改变即替换、插入和/或缺失由亲本白蛋白得到的多肽。替换是指将占据一位置的氨基酸用不同的氨基酸代替；缺失是指除去占据一位置的氨基酸；插入是指紧邻着占据一位置的氨基酸添加一个或多个(例如，若干个)例如1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个、优选1-3个氨基酸。就插入而言，“紧邻着”可以是占据一位置的氨基酸(“所称的氨基酸”)的N-侧(“上游”)或C-侧(“下游”)。因此，对于名称/编号“X”的氨基酸来说，插入可以是在位置“X+1”处(“下游”)，或者在位置“X-1”处(“上游”)。

突变体：术语“突变体”是指编码变体的多核苷酸。

野生型白蛋白：术语“野生型”(WT)白蛋白是指具有如动物或人中天然存在的相同氨基酸序列的白蛋白。

亲本白蛋白：术语“亲本”或“亲本白蛋白”是指人工对其进行改变以产生本发明的白蛋白变体的白蛋白。亲代可以是天然的(野生型)多肽或其等位基因甚或其变体。

白蛋白:白蛋白是蛋白质，构成哺乳动物中的血浆中丰度最高的蛋白质，来自许多种哺乳动物的白蛋白已经通过生化方法和/或序列信息加以表征。若干白蛋白，例如，HSA已经得以晶体学表征，结构得以确定(HSA：He XM,Carter DC(July 1992),"Atomicstructure and chemistry of human serum albumin",Nature 358(6383):209-15；马白蛋白：Ho,J.X.等人(2001).X-ray and primary structure of horse serum albumin(Equus caballus)at 0.27-nm resolution.Eur J Biochem.215(1):205-12)。本发明涉及所有白蛋白及其结构。

术语“白蛋白”是指具有与HSA或HSA结构域相同和/或非常类似的三维(三级)结构的蛋白质，其与HSA或相关的结构域具有类似的特性。类似的三维结构是例如来自本文所述物种的白蛋白的结构。白蛋白的一些主要特性为i)其调节血浆容量的能力(渗透活性)，ii)大约19天±5天的长的血浆半衰期，iii)与FcRn结合，iv)配体结合，例如，结合内源性分子，例如酸性、亲脂性的化合物，包括胆红素、脂肪酸、氯高铁血红素和甲状腺素(另参见Kragh-Hansen等人,2002,Biol.Pharm.Bull.25,695中的表1，在此并入作为参考)，v)结合具有酸性或负电特性的有机小化合物，例如药物，例如华法令(warfarin)、安定、布洛芬和紫杉醇(另外参见Kragh-Hansen等人,2002,Biol.Pharm.Bull.25,695中的表1，在此并入作为参照)，vi)与gp60结合，其也称作清蛋白激活蛋白(albondin)。并不需要满足所有这些性质以便将蛋白质或片段表征为白蛋白。例如，如果一片段不包括用于结合某些配体或有机化合物的结构域，该片段的变体预计也会不具有这些特性。

白蛋白通常具有大约20天或更长的长血浆半衰期，例如，HSA的血浆半衰期为19天。已知HSA的长的血浆半衰期经由与其受体FcRn的相互作用介导，但是，对于HSA长半衰期背后的精确机制的理解或了解并不是本发明必需的。

作为白蛋白蛋白质的例子，作为用于产生根据本发明的白蛋白变体的起始亲本“骨架”的白蛋白蛋白质，可以提到有HSA(例如AAA98797或P02768-1、SEQ ID NO.2(成熟)、SEQ ID NO.3(未成熟))、灵长类血清白蛋白(例如黑猩猩血清白蛋白(例如预测的序列XP_517233.2SEQ ID NO.4)、大猩猩血清白蛋白或猕猴血清白蛋白(例如NP_001182578，SEQ IDNO.5))、啮齿类血清白蛋白(例如仓鼠血清白蛋白(例如A6YF56，SEQ ID NO.6)、豚鼠血清白蛋白(例如Q6WDN9-1，SEQ ID NO.7)、小鼠血清白蛋白(例如AAH49971或P07724-1版本3，SEQID NO.8)和大鼠血清白蛋白(例如AAH85359或P02770-1版本2，SEQ ID NO.9)、牛血清白蛋白(例如奶牛血清白蛋白P02769-1，SEQ ID NO.10)、马类血清白蛋白例如马血清白蛋白(例如P35747-1，SEQ ID NO.11)或驴血清白蛋白(例如Q5XLE4-1，SEQ ID NO.12)、兔血清白蛋白(例如P49065-1版本2，SEQ ID NO.13)、山羊血清白蛋白(例如ACF10391，SEQ ID NO.14)、绵羊血清白蛋白(例如P14639-1，SEQ ID NO.15)、犬血清白蛋白(例如P49822-1，SEQ IDNO.16)、鸡血清白蛋白(例如P19121-1版本2，SEQ ID NO.17)和猪血清白蛋白(例如P08835-1版本2，SEQ ID NO.18)或者与这样的白蛋白的氨基酸同一性为至少70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.2％、99.4％、99.6％或至少99.8％的多肽。白蛋白的其他例子也可以包括在本申请的范围内，其包括卵白蛋白(例如P01012.pro：鸡卵白蛋白；O73860.pro：火鸡卵白蛋白)。成熟白蛋白序列可以使用本领域技术人员已知的技术例如与HSA比对(其成熟和不成熟区已知)从不成熟白蛋白序列鉴别出。例如，不成熟的HSA长度为609个氨基酸，其中氨基酸1-19是信号序列(也称作先导序列或前导序列)，氨基酸20-24是原序列(pro sequence)，氨基酸25-609是成熟蛋白质。图2中的比对使得技术人员可以预测若干动物白蛋白的成熟序列(参见“D1起始”)。

如SEQ ID NO:2所公开的HSA或其任意天然等位基因是根据本发明的优选的亲本白蛋白。HSA是由585个氨基酸残基组成的蛋白质，分子量为67kDa。在其天然形式中，它是未糖基化的。本领域技术人员将会认识到，可以存在有天然等位基因，其性质与HSA基本相同，但是与SEQ ID NO:2相比较具有一个或多个(例如，若干个)氨基酸变化，发明人还预计这些天然等位基因作为根据本发明的亲本白蛋白的用途。

根据本发明的亲本白蛋白、其片段、或者有缀合能力的白蛋白变体、或者包括白蛋白或其片段的融合多肽或缀合物的白蛋白部分，优选地与SEQ ID NO:2所示HSA序列的序列同一性为至少60％，优选至少70％，优选至少80％，优选至少85％，优选至少86％，优选至少87％，优选至少88％，优选至少89％，优选至少90％，优选至少91％，优选至少92％，优选至少93％，优选至少94％，优选至少95％，更优选至少96％，更优选至少97％，更优选至少98％，最优选至少99％，至少99.2％，至少99.4％，至少99.6％或者至少99.8％或100％。优选地，亲本白蛋白保持着白蛋白的至少一种主要特性，或者与白蛋白例如HSA类似的三级结构。序列同一性可以是在SEQ ID NO:2的全长之上，或者可以是在由例如以下的片段组成或包括该片段的分子之上：例如SEQ ID NO:2的一个或多个(例如若干个)结构域，例如由结构域III组成或包括结构域III的分子(例如SEQ ID NO:19)、由结构域II和III组成或包括结构域II和III的分子(例如SEQ ID NO:20)、由结构域I和III组成或包括结构域I和III的分子(例如SEQ ID NO:21)、由两拷贝结构域III组成或包括两拷贝结构域III的分子(例如SEQID NO:22)、由三拷贝结构域III组成或包括三拷贝结构域III的分子(例如SEQ ID NO:23)或者由结构域I和两拷贝结构域III组成或包括结构域I和两拷贝结构域III的分子(例如SEQ ID NO:24)。

根据本发明的亲本白蛋白、其片段、或者有缀合能力的白蛋白变体、或者包括白蛋白或其片段的融合多肽或缀合物的白蛋白部分在折叠时，可以具有若干个，例如，至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16个，适当地为所有17个多肽SEQ ID NO.2的天然二硫键。

亲本优选地包括氨基酸序列SEQ ID NO:3(HSA的未成熟序列)或SEQ ID NO:2(HSA的成熟序列)或者由上述序列组成。

在另一实施方式中，亲本是SEQ ID NO:2成熟多肽的等位变体。

亲本白蛋白可以由以下的多核苷酸编码，该多核苷酸在非常低的严格性条件、低严格性条件、中等严格性条件、中等偏高严格性条件、高严格性条件或非常高的严格性条件下与(i)SEQ ID NO:2的成熟多肽编码序列或(ii)(i)的全长互补链杂交(J.Sambrook,E.F.Fritsch,和T.Maniatis,1989,Molecular Cloning,A Laboratory Manual,第二版,Cold Spring Harbor,New York)。

可以使用SEQ ID NO:1的多核苷酸或其子序列、以及SEQ ID NO.2或SEQ ID NO.3的氨基酸序列或其片段来设计核酸探针，以便根据本领域公知的方法，从不同属或物种的株系中识别和克隆编码亲本的DNA。具体地，这样的探针可以用于遵循标准的DNA印迹方法与所关注的属或物种的基因组或cDNA杂交，以识别和分离其中对应的基因。这样的探针可以显著短于整个序列，但是长度应当至少为14个核苷酸，例如，至少25个、至少35个或至少70个核苷酸。优选地，核酸探针的长度为至少100个核苷酸，例如，长度为至少200个核苷酸、至少300个核苷酸、至少400个核苷酸、至少500个核苷酸、至少600个核苷酸、至少700个核苷酸、至少800个核苷酸或者至少900个核苷酸。DNA和RNA探针均可以使用。通常对探针进行标记，用以检测相应的基因(例如，用³²P、³H、³⁵S、生物素或抗生物素蛋白标记)。这些探针均由本发明包括。

可以对由这些其它有机体制备的基因组DNA或cDNA文库进行筛选，以筛选出与上述探针杂交并编码亲本的DNA。来自这些其它有机体的基因组或其它DNA可以通过琼脂糖或聚丙烯酰胺凝胶电泳或者其它分离技术进行分离。来自文库的DNA或分离出的DNA可以转移并固定化在硝化纤维或其它合适的载体材料上。为了识别与SEQ ID NO:1或其子序列同源的克隆或DNA，在DNA印迹中使用载体材料。

出于本发明的目的，杂交表示在低严格性至非常高的严格性条件下，多核苷酸与对应于SEQ ID NO:1所示的多核苷酸、其互补链或其子序列的标记核苷酸探针杂交。与探针杂交的分子可以使用，例如，X-射线胶片或任何其它本领域已知的检测方式来检测。

核酸探针可以包括以下或者由以下组成：SEQ ID NO:1的成熟多肽编码序列，即SEQ ID NO:1的核苷酸1-1785。核酸探针可以包括以下或者由以下组成：SEQ ID NO.25的多核苷酸(编码HSA的核苷酸序列，该核苷酸序列已经改造成引入限制性内切酶位点)或其片段。

对于长度为至少100个核苷酸的长探针来说，非常低至非常高严格性条件定义为：最佳地遵循标准DNA印迹法，在5X SSPE、0.3％SDS、200微克/ml剪切和变性的鲑鱼精DNA和甲酰胺中在42℃下预杂交并杂交12-24小时，对于非常低和低的严格性，甲酰胺为25％，对于中等和中等偏高严格性，甲酰胺为35％，或者对于高和非常高的严格性，甲酰胺为50％。最后，在45℃(非常低的严格性)、50℃(低严格性)、55℃(中等严格性)、60℃(中等偏高的严格性)、65℃(高严格性)或70℃(非常高的严格性)下，使用2X SSC、0.2％SDS将载体材料洗涤3次，每次15分钟。

对于长度为大约15个核苷酸至大约70个核苷酸的短探针，严格性条件定义为：最佳地遵循标准DNA印迹法，在大约5℃至大约10℃下在使用根据Bolton和McCarthy的计算法(1962,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 48:1390)计算的T_m之下，在0.9M NaCl、0.09M Tris-HClpH 7.6、6mM EDTA、0.5％NP-40、1X Denhardt溶液、1mM焦磷酸钠、1mM磷酸二氢钠、0.1mMATP和0.2mg酵母RNA/ml中预杂交和杂交12-24小时。最后，在5℃至10℃下在计算的T_m之下，将载体材料在6X SCC加0.1％SDS中洗涤一次15分钟，使用6X SSC洗涤两次，每次15分钟。

亲本或有缀合能力的白蛋白可以由编码能够发挥白蛋白作用的多肽的与SEQ IDNO:1的成熟多肽编码序列具有以下序列同一性的多核苷酸编码：至少60％，例如，至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或者100％。在一实施方式中，亲本由包括SEQ ID NO:1或由其组成的多核苷酸编码。

三维(3D)模型

本公开内容参考来自RCSB蛋白质数据库(PDB，可以在http://www.rcsb.org/pdb/浏览)的HSA晶体结构，PDB识别编号为1AO6或1ao6(Sugio,S.,A.Kashima等人,(1999),Protein Eng 12(6):439-46)。与成熟HSA序列(SEQ ID NO.2)相比较，1AO6结构自SEQ IDNO.2的残基S5(结构中没有前4个氨基酸)开始，于A582处结束(结构中没有最后3个氨基酸)。本文用于描述待改变以产生有缀合能力的半胱氨酸的位置的氨基酸位置参考的是SEQID NO.2、而不是1ao6中的位置。另外的白蛋白结构本领域技术人员是可获得的，例如，人白蛋白三级结构的原子坐标可获自GenBank DNA数据库，其可以在www.ncbi.nlm.nih.gov浏览。可以使用适当的软件例如RasM.1Chime(Sayle,TIBS 20,374,1995)来浏览结构。可获得的白蛋白坐标包括：

1AO6，1BM0(Sugio等人(1999),Protein Eng 12(6):439-46)，其在前17个请求的蛋白质当中。

1UOR，He&Carter(1992),Nature 358(6383):209-15.

1bj5和1bke,Curry等人(1998),Nat Struct Biol 5(9):827-35.

1e7a、1e7b、1e7c，Bhattacharya等人(2000),J Biol Chem 275(49):38731-8.

1e7e、1e7f、1e7g、1e7h和1e7i，Bhattacharya等人(2000),J Mol Biol 303(5):721-32.

1GNJ，Petitpas等人(2001),J Mol Biol 314(5):955-60.

1HA2和1H9Z，Petitpas等人(2001),J Biol Chem 276(25):22804-9.

4K71，Schmidt等人(2013),.Structure 21:1966-1978

4N0F和4N0U，Oganesyan等人(2014),J Biol Chem 289(11):7812-24.

白蛋白部分：根据本发明的包括白蛋白变体或其片段的融合多肽、缀合物、缔合物、纳米颗粒或组合物的白蛋白部分可以称作“白蛋白部分”或“白蛋白组份”。根据本发明的多肽可以包括白蛋白部分或者由其组成。

分离的变体：术语“分离的变体”是指处于自然界中不存在的形式或环境中的变体。分离的变体的非限定性例子包括(1)任何非天然存在的变体，(2)至少部分地除去一种或多种(例如若干种)或全部的与其天然相关的天然成份的任何变体；(3)任何相对于其来源多肽(例如，天然发现时的衍生来源多肽)通过人工手段修饰的变体；或(4)任何通过增加变体相对于与其天然相关的其他组分的量而修饰的变体(例如，多拷贝的编码物质的基因；使用比与编码物质的基因天然相关的启动子更强的启动子)。分离的变体可以存在于发酵肉汤样品中。分离的变体可以是重组的或合成的。

基本上纯的变体：术语“基本上纯的变体”是指含有至多10wt％、至多8wt％、至多6wt％、至多5wt％、至多4wt％、至多3wt％、至多2wt％、至多1wt％和至多0.5wt％的与其天然或重组地相关联的其它多肽物质的制剂。优选地，按制剂中存在的全部多肽物质的重量计，变体为至少92％纯，例如，至少94％纯，至少95％纯，至少96％纯，至少97％纯，至少98％纯，至少99％纯，至少99.5％纯，和100％纯。纯度可以通过SDS-PAGE或GP-HPLC测定。本发明的变体优选为基本上纯的形式。例如，通过公知的重组方法制备变体，并通过提纯方法，可以实现这一点。

成熟多肽：术语“成熟多肽”是指翻译和任何翻译后修饰例如N-端加工、C-端截短、糖基化、磷酸化等之后的其最终形式的多肽。成熟多肽可以是SEQ ID NO:2的氨基酸1-585，例如，其包括根据本发明的改变和/或任意的翻译后修饰。

成熟多肽编码序列：术语“成熟多肽编码序列”是指编码成熟白蛋白多肽的多核苷酸。成熟多肽编码序列可以是SEQ ID NO:1的核苷酸1-1758，例如，其具有编码根据本发明的变体所需的改变。

序列同一性：两个氨基酸序列之间或者两个核苷酸序列之间的相关性通过参数“序列同一性”来描述。

出于本发明的目的，两个氨基酸序列之间的序列同一性使用Needleman-Wunsch算法确定(Needleman和Wunsch,1970,J.Mol.Biol.48:443-453)，用EMBOSS软件包(EMBOSS:The European Molecular Biology Open Software Suite,Rice等人,2000,TrendsGenet.16:276-277)中的Needle程序执行，优选3.0.0版或更新版本，更优选5.0.0版或更新版本。使用的参数为：空位开放罚分10，空位扩展罚分0.5，EBLOSUM62(BLOSUM62的EMBOSS版本)替代矩阵。标记为“最长同一性“(使用-nobrief选项获得)的Needle输出用作百分比同一性，计算如下：

(相同残基×100)/(比对长度-比对中的空位总数)

出于本发明的目的，两个脱氧核糖核苷酸序列之间的序列同一性使用Needleman-Wunsch算法确定(Needleman和Wunsch,1970,同上)，用EMBOSS软件包(EMBOSS:TheEuropean Molecular Biology Open Software Suite,Rice等人,2000,同上)中的Needle程序执行，优选3.0.0版或更新版本，更优选5.0.0版或更新版本。使用的参数为：空位开放罚分10，空位扩展罚分0.5，EDNAFULL(NCBI NUC4.4的EMBOSS版本)替代矩阵。标记为“最长同一性“(使用-nobrief选项获得)的Needle输出用作百分比同一性，计算如下：

(相同脱氧核糖核苷酸×100)/(比对长度-比对中的空位总数)

片段：如本文所用，术语“片段”包括全长白蛋白或其变体的任意片段，只要至少一种(例如若干种)基本特性没有显著变化即可，例如，结合活性(类型和比活，例如与胆红素结合)，渗透性(渗透压、胶体渗透压)，在某些pH范围内的表现(pH-稳定性)。在该背景中“显著”是指本领域技术人员将会判断出变体的特性仍有不同，但相对于原始蛋白质的特性将不会是非显而易见的。片段可以由来自HSA的一段不间断序列组成，或者其可以包括两个或更多个(例如若干个)来自HSA的序列。根据本发明的片段大小为大于大约20个氨基酸残基，优选大于30个氨基酸残基，更优选大于40个氨基酸残基，更优选大于50个氨基酸残基，更优选大于75个氨基酸残基，更优选大于100个氨基酸残基，更优选大于200个氨基酸残基，更优选大于300个氨基酸残基，再更优选大于400个氨基酸残基，最优选大于500个氨基酸残基。片段可以包括以下或者由以下组成：白蛋白或者白蛋白结构域的至少50％、60％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％。本发明优选的白蛋白结构域是以下结构域：与由SEQ ID NO.2的氨基酸残基1-194±1-15氨基酸组成的HSA结构域I的同一性为至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％或100％；与由SEQID NO.2的氨基酸残基192-387±1-15氨基酸组成的HSA结构域II的同一性为至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％或100％；并且与由SEQ IDNO.2的氨基酸残基381-585±1-15氨基酸组成的HSA结构域III的同一性为至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％或100％。

结构域I、II和III可以参照HSA(SEQ ID NO:2)定义。例如，HSA结构域I可以由以下氨基酸组成或者包括以下氨基酸：SEQ ID NO:2的氨基酸1至194(±1-15个氨基酸)，HSA结构域II可以由以下氨基酸组成或者包括以下氨基酸：SEQ ID NO:2的氨基酸192(±1-15个氨基酸)至387(±1-15个氨基酸)，结构域III可以由以下氨基酸组成或者包括以下氨基酸：SEQ ID NO:2的氨基酸381(±1-15个氨基酸)至585(±1-15个氨基酸)。“±1-15个氨基酸”是指残基编号可以从所提及的氨基酸位置C-端和/或N-端偏离1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15个氨基酸。Dockal等人(The Journal of Biological Chemistry,1999,Vol.274(41):29303-29310)和Kjeldsen等人(Protein Expression and Purification,1998,Vol 13:163-169)描述了结构域I、II和III的例子，列表显示如下。

表1

片段可以包括以下或者由以下组成：一个或多个(例如若干个)本文所述的白蛋白结构域，例如，DI+DII、DI+DIII、DII+DIII、DIII+DIII、DI+DIII+DIII、DIII+DIII+DIII，或者这些结构域的片段或结构域的组合。

技术人员可以通过与HSA的氨基酸序列比对来识别非人白蛋白中的结构域I、II和III，例如，使用Needleman-Wunsch算法(Needleman和Wunsch,1970,J.Mol.Biol.48:443-453)，用EMBOSS软件包(EMBOSS:The European Molecular Biology Open SoftwareSuite,Rice等人,2000,Trends Genet.16:276-277)中的Needle程序执行，优选3.0.0版或更新版本，更优选5.0.0版或更新版本。使用的可选参数：空位开放罚分为10，空位扩展罚分为0.5，EBLOSUM62(BLOSUM62的EMBOSS版本)替代矩阵。其它适合的软件包括MUSCLE((Multiple sequence comparison by log-expectation,Robert C.Edgar,版本3.6,http://www.drive5.com/muscle；Edgar(2004)Nucleic Acids Research 32(5),1792-97和Edgar(2004)BMC Bioinformatics,5(1):113)，可以使用用户手册中所述的默认设置(3.6版本，2005年9月)。对于本发明任意方面，可以使用比3.6更新的MUSCLE版本)。图1和2中提供了适当的序列比对的例子。

优选地，结构域与HSA(SEQ ID NO:2)的结构域I、II或III的同一性为至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％，或者100％同一性。

此外，可以使用包括上述任意者的单或多异源性融合物；或者与任意这些白蛋白或其变体或片段的单或多异源性融合物。这些融合物包括白蛋白N-端融合物、白蛋白C-端融合物以及共N-端和C-端白蛋白融合物，如WO 01/79271所例示(在此将其并入作为参考)。

相当的氨基酸位置：在本说明书中，氨基酸的位置相对于全长的成熟HSA(即，无前导序列，SEQ ID NO:2)来定义。但是，技术人员应理解到，本发明还涉及非人白蛋白的变体(例如在此公开者)和/或人或非人白蛋白的片段。为清楚起见，对于HSA(SEQ ID NO.2)以外的白蛋白，偏好相当的残基用于突变。通过使用成对(例如ClustalW)或多重(例如MUSCLE)比对对氨基酸序列进行比较，可以识别出HSA片段中、动物白蛋白及片段、融合物和其它衍生物或变体中的相当的位置。例如，图1显示出，与全长HSA中500、550和573相当的位置很容易在HSA的片段中以及在其它物种的白蛋白中识别出来。位置500、550和573由箭头示出。下表2提供了进一步的细节。

表2：识别HSA、动物白蛋白和白蛋白片段中相当的位置的例子

图1使用包括ClustalW 1.81格式的输出的默认参数通过MUSCLE生成。原始输出数据用以下输出格式使用BoxShade 3.21加以阴影(其可获自：http://www.ch.embnet.org/ software/BOX_form.html)：RTF_new；字号：10；一致行：无一致行；序列分数(对于阴影必需满足)：0.5；输入序列格式：ALN。因此，在本说明书全文中，HSA中定义的氨基酸位置也适用于HSA的片段、衍生物或变体以及融合物、来自其它物种的白蛋白及其片段和融合物中的相当的位置。这种相当的位置可以(i)在其天然蛋白质中具有不同的残基编号并且/或者(ii)在其天然蛋白质中具有不同的天然氨基酸。类似地，图2显示出，参照SEQ ID NO:2(HSA)可以在白蛋白片段(例如结构域)中识别出相当的位置。

保守替换：如本文所用，术语“保守”氨基酸替换是指在相同组中进行的替换，其通常基本上不影响蛋白质功能。“保守替换”意指组合，例如Gly、Ala；Val、Ile、Leu；Asp、Glu；Asn、Gln；Ser、Thr；Lys、Arg；和Phe、Tyr。这些变体可以通过本领域公知的技术产生，例如，通过定点诱变，如1981年11月24日授予Stevens的美国专利第4,302,386号所公开，在此将其并入作为参考。

在一实施方式中，图3的维恩图可以用于确定保守氨基酸替换：使用图3，可以计算保守突变分值(范围0-5)。分值0是最高的保守，对于半胱氨酸来说，仅指将半胱氨酸残基用另一半胱氨酸氨基替换。对于将其他氨基酸换成半胱氨酸(或者将半胱氨酸换成其他氨基酸)，分值可以是1、2、3、4、5。分值1是比分值2、3、4或5更为保守的替换。分值5指替换的氨基酸和半胱氨酸之间保守性最低。由图3计算0-5的分值，为从半胱氨酸到适当氨基酸跨过的边界数(即线)。因此，半胱氨酸分值0为没有跨过边界。类似地，天冬氨酸(D)分值为3，因为跨过3个边界。20种不同氨基酸的保守替换分值(就图3而言)定义为(氨基酸使用单字母代码)：A＝1，C＝0，D＝3，E＝4，F＝4，G＝2，H＝5，I＝4，K＝4，L＝4，M＝3，N＝2，P＝3，Q＝3，R＝5，S＝1，T＝1，V＝3，W＝3，Y＝3。

另外可选地，或者额外地，“保守”氨基酸替换是指相同组内进行的替换，例如，以下组内：碱性氨基酸(例如，精氨酸、赖氨酸、组氨酸)，酸性氨基酸(例如，谷氨酸、天冬氨酸)，极性氨基酸(例如，谷氨酰胺和天冬酰胺)，疏水氨基酸(例如，亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸)，芳香性氨基酸(例如，苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸)以及小氨基酸(例如，甘氨酸、丙氨酸、丝氨酸、苏氨酸、蛋氨酸)。

例如，SEQ ID NO.2中丙氨酸-2的保守替换可以包括甘氨酸或丝氨酸。非保守替换包括将一组中的氨基酸替换成另一组中的氨基酸。例如，非保守替换可以包括将极性氨基酸替换成疏水氨基酸。

变体的命名规则

出于本发明的目的，使用SEQ ID NO:2中公开的成熟多肽来确定另一白蛋白中对应的氨基酸残基。将另一白蛋白的氨基酸序列与SEQ ID NO:2中公开的成熟多肽进行比对，基于该序列比对，使用Needleman-Wunsch算法(Needleman和Wunsch,1970,J.Mol.Biol.48:443-453)确定SEQ ID NO:2中公开的成熟多肽中任意氨基酸残基所对应的氨基酸位置编号，用EMBOSS软件包(EMBOSS:The European Molecular Biology Open Software Suite,Rice等人,2000,Trends Genet.16:276-277)中的Needle程序执行，优选3.0.0版或更新版本，更优选5.0.0版或更新版本。所用参数：空位开放罚分为10，空位扩展罚分为0.5，EBLOSUM62(BLOSUM62的EMBOSS版本)替代矩阵。

通过使用若干种计算机程序用其各自的默认参数进行多重多肽序列比对，可以确定或确认另一白蛋白中对应的氨基酸残基的识别，上述计算机程序包括，但不限于，MUSCLE(通过对数期望(log-expectation)的多重序列比对；3.5版或更新版本；Edgar,2004,Nucleic Acids Research 32:1792-1797)，MAFFT(6.857版或更新版本；Katoh和Kuma,2002,Nucleic Acids Research 30:3059-3066；Katoh等人,2005,Nucleic AcidsResearch 33:511-518；Katoh和Toh,2007,Bioinformatics 23:372-374；Katoh等人,2009,Methods in Molecular Biology 537:39-64；Katoh和Toh,2010,Bioinformatics26:1899-1900)，以及使用ClustalW的EMBOSS EMMA(1.83或更新版本；Thompson等人,1994,NucleicAcids Research 22:4673-4680)。

当其它多肽(或蛋白质)偏离于成熟多肽SEQ ID NO:2使得传统的基于序列的比对无法检测到其关系时(Lindahl和Elofsson,2000,J.Mol.Biol.295:613-615)，可以使用其它的成对序列比较算法。使用采用多肽家族(图谱)概率表现的搜索程序来搜索数据库，可以在基于序列的搜索中得到更高的敏感性。例如，PSI-BLAST程序通过迭代数据库搜索方法生成图谱，能够检测到远离的同源物(Atschul等人,1997,Nucleic Acids Res.25:3389-3402)。如果多肽家族或超家族在蛋白质结构数据库中具有一个或多个(例如若干个)代表，则可以实现再更高的敏感性。例如GenTHREADER(Jones,1999,J.Mol.Biol.287:797-815；McGuffin和Jones,2003,Bioinformatics19:874-881)的程序采用来自多种来源(PSI-BLAST、二级结构预测、结构比对图谱和溶解势(solvation potential))的信息，输入至针对查询序列预测结构折叠的神经网络。类似地，可以使用Gough等人,2000,J.Mol.Biol.313:903-919中的方法将未知结构的序列与存在于SCOP数据库中的超家族模型进行比对。这些比对进而可以用来产生多肽的同源性模型，这些模型可以使用出于该目的开发的多种工具进行准确性评价。

对于结构已知的蛋白质，有若干工具和资源可供检索和生成结构比对。例如，已经对SCOP蛋白质超家族进行了结构比对，这些比对是可访问且可下载的。可以使用多种算法，例如距离比对矩阵(Holm和Sander,1998,Proteins 33:88-96)或组合扩展(Shindyalov和Bourne,1998,Protein Engineering 11:739-747)，对两种或更多种(例如，若干种)蛋白质结构进行比对，可以额外地利用这些算法的实施来查询具有所关注结构的结构数据库，以便发现可能的结构同源物(例如，Holm和Park,2000,Bioinformatics 16:566-567)。

在描述本发明的白蛋白变体时，为易于参考，适用下文所述的命名法。采用公认的IUPAC单字母或三字母氨基酸缩写。术语“点突变”和/或“改变”包括缺失、插入和替换。

替换。对于氨基酸替换来说，使用以下命名法：原始氨基酸、位置、替换的氨基酸。因此，在位置226处用丙氨酸来替换苏氨酸被命名为“Thr226Ala”或“T226A”。多个突变(或改变)用加号(“+”)隔开，例如“Gly205Arg+Ser411Phe”或“G205R+S411F”，表示在位置205和411处分别用精氨酸(R)替换甘氨酸(G)以及用苯丙氨酸(F)替换丝氨酸(S)。附图中也使用(“/”)，例如“E492T/N503D”，这应当视作是与(“+”)可互换。

缺失。对于氨基酸缺失来说，使用以下命名法：原始氨基酸、位置*。因此，在位置195处缺失甘氨酸被命名为“Gly195*”或“G195*”。多个缺失(或改变)用加号(“+”)隔开，例如，“Gly195*+Ser411*”或“G195*+S411*”。

插入。如上文所公开，插入可以是在占据一位置的氨基酸(“所指定(或原始)氨基酸”，“X”)的N-侧(“上游”，“X-1”)或C-侧(“下游”，“X+1”)。

对于原始氨基酸(“X”)C-侧(“下游”，“X+1”)的氨基酸插入来说，使用以下命名法：原始氨基酸、位置、原始氨基酸、插入的氨基酸。因此，在位置195处的甘氨酸之后插入赖氨酸被命名为“Gly195GlyLys”或“G195GK”。插入多个氨基酸被命名为[原始氨基酸、位置、原始氨基酸、插入的氨基酸#1、插入的氨基酸#2等]。例如，在位置 195 处的甘氨酸之后插入赖氨酸和丙氨酸被示为“Gly195GlyLysAla”或“G195GKA”。

在这种情况下，插入的氨基酸残基通过在插入的氨基酸残基之前的氨基酸的位置编号上加上小写字母来编号。在上述例子中，由此序列将为：

亲本：	变体：
		195	195 195a 195b
G	G - K - A

对于原始氨基酸(“X”)N侧(“上游”，“X-1”)的氨基酸插入来说，使用以下命名法：原始氨基酸、位置、插入的氨基酸、原始氨基酸。因此，在位置195处的甘氨酸(G)之前插入赖氨酸(K)被命名为“Gly195LysGly”或“G195KG”。插入多个氨基酸被命名为[原始氨基酸、位置、插入的氨基酸#1、插入的氨基酸#2等、原始氨基酸]。例如，在位置195处的甘氨酸之前插入赖氨酸(K)和丙氨酸(A)被示为“Gly195LysAlaGly”或“G195KAG”。在这种情况下，插入的氨基酸残基通过在插入的氨基酸残基之后的氨基酸的位置编号上加上带撇的小写字母来编号。在上述例子中，由此序列将为：

亲本：	变体：
		195	195a’195b’195
G	K - A - G

多个改变。包括多个改变的变体用加号(“+”)隔开，例如，“Arg170Tyr+Gly195Glu”或“R170Y+G195E”表示在位置170和195处分别用酪氨酸和谷氨酸来替换精氨酸和甘氨酸。

不同的改变。当一位置处可以引入不同的改变时，不同的改变用逗号隔开，例如，“Arg170Tyr、Glu”(“Arg170Tyr,Glu”)表示在位置170处用酪氨酸或谷氨酸来替换精氨酸。因此，“Tyr167Gly、Ala+Arg170Gly、Ala”命名了以下变体：“Tyr167Gly+Arg170Gly”、“Tyr167Gly+Arg170Ala”、“Tyr167Ala+Arg170Gly”和“Tyr167Ala+Arg170Ala”。

缀合能力：有缀合能力的半胱氨酸是能够与缀合配偶体、特别是非白蛋白的缀合配偶体形成分子间键的半胱氨酸残基。有缀合能力的多肽即硫代-白蛋白(thio-albumin)能够通过有缀合能力的半胱氨酸残基与缀合配偶体形成分子间键。硫代-白蛋白可以具有或不具有高水平的缀合能力，例如，相对于仅在Cys-34处具有一个有缀合能力的半胱氨酸的由SEQ ID NO.2组成的白蛋白的缀合能力的至少50％、60％、70％、80％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％。缀合能力可以相对于任何所关注的可缀合分子(缀合配偶体)例如生物活性分子或荧光染料来测定。测定可以通过质谱(MS)分析或者生物活性化合物的活性例如其荧光性的定量来进行。白蛋白和生物素或HPR的缀合能力可以通过检验产生的缀合物的质量和/或缀合化合物的酶活性来确定。以下文献说明了通过荧光标记和细胞摄取来进行确定：McGraw等人,(1987),The Journal of Cell Biology,105,207-214；Presley等人,(1993),The Journal of Cell Biology,122,1231-1241。具有高缀合能力的硫代-白蛋白的优势在于其可以允许将分子有效地缀合在硫代-白蛋白上。缀合能力可以相对于时间进行测量。有利的硫代-白蛋白可以是(a)迅速地或(b)缓慢地实现最大缀合的那些。特定半胱氨酸的缀合能力可以通过本领域技术人员已知的方法确定，例如，可以将蛋白质缀合后消化，进行肽图谱分析，确定特定半胱氨酸上缀合的程度。

生物活性剂或生物活性化合物是具有与活的有机体、系统或细胞相互作用的能力的化合物。例如，其可以是生物或化学药剂或化合物。

配体结合：白蛋白的配体结合特性包括与阴离子和中性配体例如长链脂肪酸、胆红素和其他各种配体的结合。已知长链脂肪酸油酸(C18:1)、棕榈酸(C16:0)、亚油酸(C18:2)、硬脂酸(C18:0)、花生四烯酸(C20:4)和棕榈油酸(C16:1)与HSA结合。配体结合研究可以使用已经适当适合于该目的的等温滴定量热法在HSA和硫代-白蛋白上进行。可以通过脱脂对样品进行预处理(Sogami,M.和J.F.Foster(1968).Biochemistry 7(6):2172-82，在此将其并入作为参考)，然后进行硫醇封闭(Sogami,M.,H.A.Petersen等人,(1969).Biochemistry 8(1):49-58，在此将其并入作为参考)，随后进行凝胶渗透色谱。例如，随后可以对硫代-白蛋白和HSA与辛酸酯产生的结合曲线进行比较，建立功能相似性。缀合和/或非缀合的硫代-白蛋白可以具有至少5％、10％、15％、20％、30％、40％或50％、60％、70％、至少80％、90％、95％、100％、105％或更多的与胆红素和/或脂肪酸的HSA受体结合活性(摩尔对摩尔)。

FcRn和shFcRn：术语“FcRn”是指新生儿Fc受体(FcRn)，特别是人新生儿Fc受体。shFcRn是FcRn的可溶重组体形式。shFcRn是SEQ ID NO:26(类似于主要组织相容性复合体类型I的Fc受体(FCGRT)的截短重链)和SEQ ID NO:27(β-2-微球蛋白)的异二聚体。SEQ IDNO:26和27一起形成hFcRn。

缀合-和/或非缀合-的硫代-白蛋白可以具有或不具有改变的FcRn结合亲和力。

硫代-白蛋白或其缀合物可以具有比亲本白蛋白或其缀合物更强或更弱(优选更强)的FcRn结合。

硫代-白蛋白或其缀合物与FcRn(例如shFcRn)的KD可以低于HSA或其缀合物的相应KD。优选地，硫代-白蛋白或其缀合物的KD低于HSA与FcRn的0.9X KD，更优选低于HSA与FcRn的0.5X KD，更优选低于HSA与FcRn的0.1X KD，再更优选低于HSA与FcRn的0.05X KD，再更优选低于HSA与FcRn的0.02X KD，再更优选低于HSA与FcRn的0.01X KD，最优选低于HSA与FcRn的0.001X KD(其中X是指“乘以”)。

对于包括硫代-白蛋白的缀合物，优选地，缀合物的KD低于包括HSA的相应缀合物与FcRn的0.9X KD，更优选低于相应缀合物与FcRn的0.5X KD，更优选低于相应缀合物与FcRn的0.1X KD，再更优选低于缀合物与FcRn的0.05X KD，再更优选低于相应缀合物与FcRn的0.02X KD，再更优选低于相应缀合物与FcRn的0.01X KD，最优选低于相应缀合物与FcRn的0.001X KD(其中X是指“乘以”)。“相应缀合物”是指代替硫代-白蛋白(即白蛋白变体)而包含HSA(例如SEQ ID NO.2)的缀合物。

硫代-白蛋白或其缀合物与FcRn的KD可以高于HSA或其缀合物与FcRn的相应KD。优选地，硫代-白蛋白或其缀合物的KD高于HSA与FcRn的2X KD，更优选高于HSA与FcRn的5XKD，更优选高于HSA与FcRn的10X KD，再更优选高于HSA与FcRn的25X KD，最优选高于HSA与FcRn的50X KD。硫代-白蛋白或其缀合物可以是FcRn的零结合物(null binder)。

对于包括硫代-白蛋白的缀合物，优选地，该缀合物的KD，优选地，包括HSA的相应缀合物的KD高于相应缀合物与FcRn的2X KD，更优选高于相应缀合物与FcRn的5X KD，更优选高于相应缀合物与FcRn的10X KD，再更优选高于缀合物与FcRn的25X KD，最优选高于相应缀合物与FcRn的50X KD。“相应缀合物”是指代替硫代-白蛋白(即白蛋白变体)而包含HSA(例如SEQ ID NO.2)的缀合物。

当确定和/或比较KD时，可以使用以下参数中的一种或多种(例如若干种)(优选其全部)：

仪器：Biacore 3000仪器(GE Healthcare)

Flow cell：CM5传感芯片

FcRn：人FcRn，优选可溶性人FcRn，任选地与标记偶联，标记例如谷胱甘肽S转移酶(GST)或组氨酸(His)，更优选His，例如β-2-微球蛋白C-端的6个组氨酸残基。

FcRn的定量：1200-2500RU

偶联化学：胺偶联化学(例如，如仪器制造商提供的方案中所述)。

偶联方法：偶联可以通过将20μg/mL蛋白质注射到10mM醋酸钠pH 5.0(GEHealthcare)中进行。可以使用pH 5.5的磷酸盐缓冲液(67mM磷酸盐缓冲剂、0.15M NaCl、0.005％Tween 20)作为运行缓冲液和稀释缓冲液。表面的再生可以使用在pH 7.4下注射HBS-EP缓冲液(0.01M HEPES，0.15M NaCl，3mM EDTA，0.005％表面活性剂P20)进行(Biacore AB)。

测试分子(例如HSA或变体)注射的定量为20-0.032μM。

注射流速：恒定，例如30μL/mL

注射温度：25℃

数据评价软件：BIAevaluation 4.1软件(BIAcore AB)。

血浆半衰期：血浆半衰期理想地在合适的个体体内测定。但是，这既耗时且昂贵，而且关于在动物或人体内做实验不可避免有着伦理上的顾虑，因此需要使用体外检验来确定血浆半衰期是延长还是缩短。已知白蛋白与其受体(FcRn)的结合对于血浆半衰期来说十分重要，受体结合和血浆半衰期之间的关系是，白蛋白与其受体的亲和力越高，导致血浆半衰期越长。因此，对于本发明，白蛋白与FcRn的亲和力较高，被视为指示血浆半衰期增加，白蛋白与FcRn的亲和力较低，被视为指示血浆半衰期减少。

白蛋白与其受体FcRn的结合可以使用术语亲和力以及表达“较强”或“较弱”来描述。因此，应当理解为，与FcRn的亲和力比HSA更高的分子被视为与FcRn结合得比HSA更强，与FcRn的亲和力比HSA更低的分子被视为与FcRn结合得比HSA更弱。术语“结合系数”可以代替术语“结合亲和力”使用。

术语“半衰期较长”或“半衰期较短”以及类似的表达应理解成相对于对应的亲本或参照或者对应的白蛋白分子。因此，对于本发明的变体白蛋白来说血浆半衰期较长，是指变体的血浆半衰期比对应的除在此所述的改变以外序列相同的白蛋白要长。

参照：参照是与白蛋白变体、融合物、缀合物、组合物、缔合物、纳米颗粒或微颗粒相比较的白蛋白、融合物、缀合物、组合物、缔合物、纳米颗粒或微颗粒。参照可以包括全长白蛋白(例如HSA或其天然等位基因)或其片段，或者由上述白蛋白或其片段组成。参照还可以称作是与白蛋白变体、融合物、缀合物、组合物、缔合物或纳米颗粒比较的“相应”的白蛋白、融合物、缀合物、组合物、缔合物或纳米颗粒。参照可以包括以下或由以下组成：HSA(SEQID NO:2)或其片段、融合物、缀合物、缔合物、纳米颗粒或微颗粒。优选地，除了白蛋白部分以外，参照与根据本发明的(“被考察的”)的多肽、融合多肽、缀合物、组合物、缔合物、纳米颗粒或微颗粒相同。优选地，参照的白蛋白部分包括白蛋白(例如HSA，SEQ ID NO:2)或其片段，或者由上述白蛋白或其片段组成。比起根据本发明的(“被考察的”)多肽、融合多肽、缀合物、组合物、缔合物、纳米颗粒或微颗粒的白蛋白部分的氨基酸序列，参照的白蛋白部分的氨基酸序列可以更长，更短，或者优选地长度相同(±1-15个氨基酸)。

等位变体：术语“等位变体”是指占据相同染色体基因座的基因的任意两种或更多种(若干种)替代形式。等位变化天然地通过突变产生，可以导致种群内的多态性。基因突变可以是沉默的(编码的多肽无变化)，或者可以编码氨基酸序列改变的多肽。多肽的等位变体是由基因的等位变体编码的多肽。HSA(SEQ ID NO.2)已知的多态性在以下文献中讨论：Minchiotti等人(2008).Hum Mutat 29(8):1007-16and at http://www.uniprot.org/uniprot/P02768。

编码序列：术语“编码序列”是指直接指定其翻译的多肽产物的氨基酸序列的多核苷酸。编码序列的边界通常由可读框决定，其通常起始于ATG起始密码子或另外替代的起始密码子，例如GTG和TTG，并结束于终止密码子，例如TAA、TAG和TGA。编码序列可以是DNA、cDNA、合成或重组的多肽。

cDNA：术语“cDNA”是指可以通过由自真核细胞得到的成熟的、已剪接的mRNA分子逆转录而制备的DNA分子。cDNA缺少相应的基因组DNA中存在的内含子序列。在呈现为成熟的、已剪接的mRNA之前，最初的一级RNA转录物是通过一系列包括剪接在内的步骤加工的mRNA的前体。

核酸构建物：术语“核酸构建物”是指如下的单链或双链核酸分子：其由天然基因分离出，或者以自然界不会存在的方式修饰成含有核酸片段，或者是合成的。当核酸构建物含有表达本发明的编码序列所需的控制序列时，术语核酸构建物与术语“表达盒(cassete)”是同义的。

控制序列：术语“控制序列”是指编码本发明变体的多核苷酸的表达所必需的所有核酸序列。每个控制序列对于编码变体的多核苷酸可以是原生的(native，即来自相同基因)或外源的(foreign，即来自不同的基因)，或者对于彼此是原生的或外源的。这些控制序列包括，但不限于，前导序列、聚腺苷酸化序列、前肽序列、启动子、信号肽序列和转录终止子。最小程度地，控制序列包括启动子以及转录和翻译终止信号。出于引入的限制性酶切位点促进控制序列与编码变体的多核苷酸的编码区连接的目的，控制序列可设有接头(linker)。

可操作连接：术语“可操作连接”是指如下结构：其中控制序列相对于多核苷酸的编码序列位于适当的位置处，使得控制序列指导编码序列的表达。

表达：术语“表达”包括任何参与产生变体的步骤，其包括，但不限于，转录、转录后修饰、翻译、翻译后修饰和分泌。硫代-白蛋白可以能够或不能够由合适的表达系统例如酵母(例如酵母属，如酿酒酵母))以相对于未修饰白蛋白(例如SEQ ID NO.2)的表达为至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或100％的水平得以表达。相对表达水平可以测定如下：例如，表达蛋白质，然后通过SDS-PAGE、GP-HPLC或蛋白质免疫印迹法进行定量。

表达载体：术语“表达载体”是指包括编码变体的多核苷酸、并且与提供用于其表达的控制序列可操作连接的线性或环状DNA分子。

宿主细胞：术语“宿主细胞”是指任何易感于用包括本发明多核苷酸的核酸构建物或表达载体进行转化、转染和转导以及类似过程的细胞类型。术语“宿主细胞”包括由于在复制过程中发生突变而与亲本细胞不同的亲本细胞的任何子代。

发明详述

有缀合能力的多肽I

本发明一方面提供一种有缀合能力的多肽，其包括与人白蛋白、特别是成熟人白蛋白多肽序列SEQ ID NO.2的残基1-585、或其片段的同一性为至少60％的氨基酸序列；

其中至少一个(例如，若干个)与选自SEQ ID NO.2的K93、E294、A226、E230、I271、E358、L24、F49、V54、D56、L66、A92、Q94、E97、H128、F156、E227、D237、K240、D259、K262、N267、Q268、L275、E277、L284、E311、K317、A322、E333、D340、E354、K359、A362、E382和L398的位置相当的位置包括有缀合能力的半胱氨酸残基；

优选地其中有缀合能力的多肽在溶液中作为单体存在的倾向性是亲本多肽(例如SEQ ID NO.2多肽)在溶液中作为单体存在的倾向性的至少70％，更优选为SEQ ID NO.2多肽在溶液中作为单体存在的倾向性的至少75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、至少99％或100％。优选地亲本多肽不含有本文所述的有缀合能力的Cys残基。优选地，亲本多肽不含有本文所述的额外的突变。即，优选地，亲本多肽除引入的半胱氨酸和(如果存在的话)引入的其他突变以外与有缀合能力的多肽相同。

合适地，至少一个(例如若干个)位置选自K93、E294、A226、E230、I271和E358，特别是K93、E294、A226、E230和I271。

优选地，有缀合能力的多肽与SEQ ID NO.2的序列同一性为至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、99.2％、99.4％、99.6％、99.8％。例如，除引入的Cys残基或多个Cys残基以外，有缀合能力的多肽相对于SEQ ID NO.2可以具有至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10(例如若干个)其他突变。另外可选地，除引入的Cys残基或多个Cys残基以外，有缀合能力的多肽相对于SEQ ID NO.2可以具有零个其他突变。

优选地，有缀合能力的多肽在溶液中作为单体存在的倾向性是多肽SEQ ID NO.2在溶液中作为单体存在的倾向性的至少75％，并且至少一个与选自SEQ ID NO.2的K93、E294、A226、E230、I271、E358、L24、F49、V54、D56、A92、Q94、E97、H128、F156、E227、D237、K240、D259、K262、N267、Q268、L275、L284、K317、A322、E333、D340、E354、K359、A362、E382和L398的位置相当的位置包括有缀合能力的半胱氨酸残基。

优选地，多肽是重组多肽。优选地，多肽是分离和/或提纯的多肽。优选地，多肽是合成的，和/或在自然界中不天然存在。

上文定义位置处的有缀合能力的半胱氨酸可以是通过或者不通过插入在白蛋白中产生，例如，在有或没有一个或多个(例如若干个)额外残基、并且没有从白蛋白序列中除去氨基酸残基的情况下添加半胱氨酸；或者通过将一个或多个(例如若干个)相邻的氨基酸用更大数目的含有至少一个(例如若干个)半胱氨酸的残基替换，从而延长多肽的总体长度。例如，半胱氨酸残基可以紧邻于本文识别的白蛋白残基引入。半胱氨酸残基可以作为单个半胱氨酸残基引入或者在多肽内引入。多肽的长度可以是2-50个氨基酸，优选长度为2、10、20、30或40至10、20、30、40或50个氨基酸。

合适地，多肽包括一个或多个(例如，若干个)：

a)氨基酸替换，其为在与SEQ ID NO.2的K93、E294、A226、E230、I271、E358、L24、F49、V54、D56、L66、A92、Q94、E97、H128、F156、E227、D237、K240、D259、K262、N267、Q268、L275、E277、L284、E311、K317、A322、E333、D340、E354、K359、A362、E382和L398、特别是K93、E294、A226、E230和I271中的任意残基相当的位置所对应的位置处，将半胱氨酸以外的氨基酸用半胱氨酸替换；和/或

b)半胱氨酸的插入，其在与SEQ ID NO.2的K93、E294、A226、E230、I271、E358、L24、F49、V54、D56、L66、A92、Q94、E97、H128、F156、E227、D237、K240、D259、K262、N267、Q268、L275、E277、L284、E311、K317、A322、E333、D340、E354、K359、A362、E382和L398、特别是K93、E294、A226、E230和I271中的任意残基相当的位置所对应的氨基酸的N-或C-侧相邻的位置处。

优选为替换，以下对于所选择位置的公开内容应当理解成具体包括替换而不加限定。

适当地，2、3、4、5或更多个(例如若干个)与选自SEQ ID NO.2的K93、E294、A226、E230、I271、E358、L24、F49、V54、D56、L66、A92、Q94、E97、H128、F156、E227、D237、K240、D259、K262、N267、Q268、L275、E277、L284、E311、K317、A322、E333、D340、E354、K359、A362、E382和L398、特别是K93、E294、A226、E230和I271的位置相当的位置包括有缀合能力的半胱氨酸残基。适当地，该2、3、4、5或更多个(例如若干个)位置选自K93、E294、A226、E230、I271和E358，特别是选自K93、E294、A226、E230和I271。

对于在与SEQ ID NO.1的E294位相当的位置处包括Cys的多肽来说，优选地，多肽还可以在与K93、A226、E230、I271、E358、L24、F49、V54、D56、L66、A92、Q94、E97、H128、F156、E227、D237、K240、D259、K262、N267、Q268、L275、E277、L284、E311、K317、A322、E333、D340、E354、K359、A362或E382中的一个或多个相当的位置处包括Cys。

发明人已经发现，在其中选自K93、E294、A226、E230、I271、E358、L24、F49、V54、D56、L66、A92、Q94、E97、H128、F156、E227、D237、K240、D259、K262、N267、Q268、L275、E277、L284、E311、K317、A322、E333、D340、E354、K359、A362和E382的位置处已替换半胱氨酸的HSA变体具有以下有益特性：在溶液中作为单体存在的倾向性是SEQ ID NO.2的HSA多肽在溶液中作为单体存在的倾向性的至少70％。因此，在选择的位置之一处引入的半胱氨酸导致变体在溶液中形成二聚体或更高级寡聚体的倾向性低。这一有益效果在其中多于一个的所选位置处具有半胱氨酸的变体中也得以发现。无意拘泥于任何理论，发明人认为本发明多肽的单体倾向性是由于半胱氨酸替换位点处的区域中多肽链的弹性(flexibility)以及其表面的暴露。这反映了基于多年来蛋白质结构生物学的经验、发明人在选定HSA中进行半胱氨酸替换的位置时采取的选择的创造性工作。

白蛋白或其变体作为单体而不是二聚体或更高级寡聚体的倾向性可以基于在类似条件下对白蛋白或其变体的溶液中单体、二聚体和更高级寡聚体量的测量来确定。

进行这些测量的合适技术包括凝胶渗透高压液相色谱，如实施例中所述。结果通常表达为“单体百分含量”，其计算为：

单体白蛋白的质量X 100/(单体白蛋白的质量+二聚白蛋白的质量+更高级寡聚体的质量)。

另外可选地，可以表示在溶液中形成非单体即二聚体和/或更高级寡聚体的倾向性。“非单体百分含量”是100％减去单体百分含量。

在摇瓶或10L生物反应器中制造之后，或者在2-8℃例如5℃下存储至多或者包括1周、1个月、2个月、3个月或6个月之后，在提纯之后不久(例如，提纯之后24小时内)，可以对样品进行测试。样品典型地在pH大约7.0±0.5的一种或多种(例如更多种)盐的溶液中测试，并任选地存储。溶液可以包括有包含50mM醋酸铵、10mM辛酸钠的缓冲液，pH 7.0，优选地，多肽浓度大约0.2至大约2.5mg/mL。溶液可以包括有包含25mM磷酸钠、215mM氯化钠的缓冲液，pH 6.5，优选地，多肽浓度大约5至大约50mg/mL。

指定白蛋白的单体百分含量可以取决于白蛋白纯度和浓度而变化。摇瓶培养中产生的白蛋白通常使用单个(Prometic Life Sciences Inc.或Albumedix Ltd(前Novozymes Biopharma UK Ltd))色谱步骤提纯，通常以大约0.2-2.0mg/mL、更优选1±0.5mg/mL的浓度和通过SDS还原PAGE>95％的蛋白质纯度获得。是设计用于白蛋白融合蛋白提纯的高效亲和力捕获吸附剂，其包括与基础基体偶联的合成三嗪配体。在这些条件下，已经发现，HSA的单体百分含量为大约87％，在2-8℃例如5℃下存储6个月时升高至大约89％。10L生物反应器培养中产生的白蛋白通常通过色谱步骤提纯，然后进行离子交换色谱，超滤，然后配制成50mg/mL，通过SDS还原PAGE确定蛋白质纯度为>99％。在这些条件下，发现HSA的单体百分含量为大约94％，在2-8℃下存储2个月、和在2-8℃下存储6个月时均很稳定。因此，对于在提纯之后不久或者存储至多2个月或至多6个月之后进行测试的样品来说，当在上文所述的典型摇瓶制造和提纯之后，在溶液中作为单体存在的倾向性为HSA的至少70％的变体可以经发现为单体至少60％，优选单体至少69％(低于40％的非单体，优选低于31％的非单体)。对于在溶液中作为单体存在的倾向性为HSA的至少80％的变体起来说，单体百分含量应当为至少70％，优选至少单体79％，且非单体百分含量低于30％，优选低于21％。对于在提纯之后不久或者存储至多2个月之后进行测试的样品来说，当在上文所述的典型10L生物反应器制造和提纯之后进行测试时，在溶液中作为单体存在的倾向性为HSA的至少70％的变体可以经发现为单体至少65％，优选单体至少69％。对于在溶液中作为单体存在的倾向性为HSA的至少80％的变体起来说，单体百分含量应当为至少75％，优选至少79％。倾向性优选在第0天，例如产生变体的那天进行测量，但是，也可以稍后测量，例如，在第1、2、3、4、5、6、7天或者例如在2-8℃例如5℃下在存储2、3、4、5、6、7周之后或者在1或2个月之后进行测量。合适地，单体百分含量应当在存储至多7周或2个月时稳定，这意味着在提纯之后不久测试和在例如2-8℃例如5℃下存储2个月之后测试之间不会降低大于10、大于9、8、7、6、5、4、3、2或1个百分点。优选地，在提纯之后不久测试和在2-8℃例如5℃下存储7周之后测试之间不会降低大于5个百分点。

变体在溶液中作为单体存在的倾向性可以是SEQ ID NO.2多肽在溶液中作为单体存在的倾向性的至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或至少100％，或者不具有这样的倾向性。该倾向性可以在提纯之后不久测量，或者在例如2-8℃例如5℃下存储至多6个月之后测量。

多肽在溶液中作为单体存在的倾向性可以在2-8℃例如5℃的温度下存储至少7周之后测量、在2-8℃例如5℃的温度下存储至少8周之后测量、在2-8℃例如5℃的温度下存储至少3个月之后测量、在2-8℃例如5℃的温度下存储至少4个月之后测量、在2-8℃例如5℃的温度下存储至少6个月之后测量或者在大约40℃的温度下存储至少3个月之后测量。最优选地，多肽在溶液中作为单体存在的倾向性在2-8℃例如5℃的温度下存储至少3个月之后测量。

多肽在溶液中作为单体存在的倾向性可以在0.2-50mg/mL例如大约5mg/mL的多肽浓度下测量。

多肽在溶液中作为单体存在的倾向性可以在大约6.0、6.1、6.2、6.3、6.4、6.5、6.6、6.7、6.8、6.9、7.0、7.1、7.2、7.3或7.4至大约6.1、6.2、6.3、6.4、6.6、6.7、6.8、6.9、7.0、7.1、7.2、7.3、7.4或7.5、优选大约pH 7的pH下测量。

多肽在溶液中作为单体存在的倾向性可以在pH 7.0的包括50mM醋酸铵、10mM辛酸钠的缓冲液中、并优选在大约0.5至大约5mg/mL的多肽浓度下测量。

多肽在溶液中作为单体存在的倾向性可以在pH 6.5的包括25mM磷酸钠、215mM氯化钠的缓冲液中、并优选在大约5至大约50mg/mL的多肽浓度下测量。

在存储之前，有缀合能力的多肽可以通过以下方法提纯，例如，使用三嗪(例如)色谱基质或DE-FF色谱基质提纯，更优选地通过三嗪(例如)色谱基质提纯，然后用DE-FF色谱基质提纯。合适的方法公开于实施例10中。

多肽样品的存储可以是静态的。多肽样品的存储可以是垂直(vertical)的。

当变体包括多于一个的上文提供的有缀合能力的半胱氨酸时，与不同之处仅在于具有一个更少的这种半胱氨酸的变体相比较，作为单体存在的倾向性可以降低。例如，具有替换E294C+K93C的变体白蛋白作为单体存在的倾向性要低于具有任一单独的替换的变体白蛋白。合适地，变体在选自SEQ ID NO.2的K93、E294、A226、E230、I271、E358、L24、F49、V54、D56、L66、A92、Q94、E97、H128、F156、E227、D237、K240、D259、K262、N267、Q268、L275、E277、L284、E311、K317、A322、E333、D340、E354、K359、A362、E382和L398、特别是K93、E294、A226、E230和I271的两个位置处包括有缀合能力的半胱氨酸残基，其中变体在溶液中作为单体存在的倾向性是不同之处仅在于在两个位置中的仅一个处包括有缀合能力的半胱氨酸残基的变体的倾向性的至少75％。

合适地，变体在选自SEQ ID NO.2的K93、E294、A226、E230、I271、E358、特别是K93、E294、A226、E230和I271的两个位置处包括有缀合能力的半胱氨酸残基，其中变体在溶液中作为单体存在的倾向性是不同之处仅在于在两个位置中的仅一个处包括有缀合能力的半胱氨酸残基的变体的倾向性的至少75％。

优选更高的单体倾向性，例如，至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或至少100％。例如，包括替换E294C+K93C的HSA在溶液中作为单体存在的倾向性是包括替换K93C的HSA在溶液中作为单体存在的倾向性的至少90％，或者是包括替换E294C的HSA的倾向性的至少85％。这些结果在实施例中加以说明，材料由10L生物反应器制剂提纯，并在提纯之后不久测试，或者在2-8℃例如5℃下存储7周或2个月之后测试。在存储6个月之后，相同样品也是稳定的。具有多于一个的有缀合能力的半胱氨酸的白蛋白变体可以通过将另外的有缀合能力的半胱氨酸残基引入到已经具有至少一个(例如若干个)有缀合能力的半胱氨酸残基的变体中来制备。可以优选在溶液中作为单体存在的倾向性是缺少另外的有缀合能力的半胱氨酸残基的参比白蛋白的倾向性的至少75％的包括另外的有缀合能力的半胱氨酸残基的变体。

合适的变体可以在一个或两个或更多个(例如若干个)选自SEQ ID NO.2的K93、E294、A226、E230、I271和E358的位置处包括有缀合能力的半胱氨酸残基。合适的位置组合为SEQ ID NO.2的(i)K93+E294、A226、E230、I271或E358；(ii)E294+K93、A226、E230、I271或E358；(iii)A226+K93、E294、E230、I271或E358；(iv)E230+K93、E294、A226、I271或E358；(v)I271+K93、E294、A226、E230或E358；(vi)K93+E294+A226、E230、I271或E358。合适的变体可以在一个或两个或更多个(例如若干个)选自SEQ ID NO.2的L24、F49、V54、D56、L66、A92、K93、Q94、E97、H128、F156、A226、E227、D237、E230、K240、D259、K262、N267、Q268、I271、L275、E277、L284、E294、E311、K317、A322、E333、D340、E354、E358、K359、A362、E382、L398的位置处包括有缀合能力的半胱氨酸残基。合适的位置组合为：(1)L24+F49、V54、D56、L66、A92、K93、Q94、E97、H128、F156、E227、E230、D237、K240、D259、K262、N267、Q268、I271、L275、E277、L284、E294、E311、K317、A322、E333、D340、E354、E358、K359、A362、E382或L398；(2)F49+L24、V54、D56、L66、A92、K93、Q94、E97、H128、F156、A226、E227、E230、D237、K240、D259、K262、N267、Q268、I271、L275、E277、L284、E294、E311、K317、A322、E333、D340、E354、E358、K359、A362、E382或L398；(3)V54+L24、F49、D56、L66、A92、K93、Q94、E97、H128、F156、A226、E227、E230、D237、K240、D259、K262、N267、Q268、I271、L275、E277、L284、E294、E311、K317、A322、E333、D340、E354、E358、K359、A362、E382或L398；(4)D56+L24、F49、V54、L66、A92、K93、Q94、E97、H128、F156、A226、E227、E230、D237、K240、D259、K262、N267、Q268、I271、L275、E277、L284、E294、E311、K317、A322、E333、D340、E354、E358、K359、A362、E382或L398；(5)L66+L24、F49、V54、D56、A92、K93、Q94、E97、H128、F156、A226、E227、E230、D237、K240、D259、K262、N267、Q268、I271、L275、E277、L284、E294、E311、K317、A322、E333、D340、E354、E358、K359、A362、E382或L398；(6)A92+L24、F49、V54、D56、L66、K93、Q94、E97、H128、F156、A226、E227、E230、D237、K240、D259、K262、N267、Q268、I271、L275、E277、L284、E294、E311、K317、A322、E333、D340、E354、E358、K359、A362、E382或L398；(7)Q94+L24、F49、V54、D56、L66、A92、K93、E97、H128、F156、A226、E227、E230、D237、K240、D259、K262、N267、Q268、I271、L275、E277、L284、E294、E311、K317、A322、E333、D340、E354、E358、K359、A362、E382或L398；(8)E97+L24、F49、V54、D56、L66、A92、K93、Q94、H128、F156、A226、E227、E230、D237、K240、D259、K262、N267、Q268、I271、L275、E277、L284、E294、E311、K317、A322、E333、D340、E354、E358、K359、A362、E382或L398；(9)H128+L24、F49、V54、D56、L66、A92、K93、Q94、E97、F156、A226、E227、E230、D237、K240、D259、K262、N267、Q268、I271、L275、E277、L284、E294、E311、K317、A322、E333、D340、E354、E358、K359、A362、E382或L398；(10)F156+L24、F49、V54、D56、L66、A92、K93、Q94、E97、H128、A226、E227、E230、D237、K240、D259、K262、N267、Q268、I271、L275、E277、L284、E294、E311、K317、A322、E333、D340、E354、E358、K359、A362、E382或L398；(11)E227+L24、F49、V54、D56、L66、A92、K93、Q94、E97、H128、F156、A226、E230、D237、K240、D259、K262、N267、Q268、I271、L275、E277、L284、E294、E311、K317、A322、E333、D340、E354、E358、K359、A362、E382或L398；(12)D237+L24、F49、V54、D56、L66、A92、K93、Q94、E97、H128、F156、A226、E230、E227、K240、D259、K262、N267、Q268、I271、L275、E277、L284、E294、E311、K317、A322、E333、D340、E354、E358、K359、A362、E382或L398；(13)K240+L24、F49、V54、D56、L66、A92、K93、Q94、E97、H128、F156、A226、E230、E227、D237、D259、K262、N267、Q268、I271、L275、E277、L284、E294、E311、K317、A322、E333、D340、E354、E358、K359、A362、E382或L398；(14)D259+L24、F49、V54、D56、L66、A92、K93、Q94、E97、H128、F156、A226、E230、E227、D237、K240、K262、N267、Q268、I271、L275、E277、L284、E294、E311、K317、A322、E333、D340、E354、E358、K359、A362、E382或L398；(15)K262+L24、F49、V54、D56、L66、A92、K93、Q94、E97、H128、F156、A226、E230、E227、D237、K240、D259、N267、Q268、I271、L275、E277、L284、E294、E311、K317、A322、E333、D340、E354、E358、K359、A362、E382或L398；(16)N267+L24、F49、V54、D56、L66、A92、K93、Q94、E97、H128、F156、A226、E230、E227、D237、K240、D259、K262、Q268、I271、L275、E277、L284、E294、E311、K317、A322、E333、D340、E354、E358、K359、A362、E382或L398；(17)Q268+L24、F49、V54、D56、L66、A92、K93、Q94、E97、H128、F156、A226、E227、E230、D237、K240、D259、K262、N267、I271、L275、E277、L284、E294、E311、K317、A322、E333、D340、E354、E358、K359、A362、E382或L398；(18)L275+L24、F49、V54、D56、L66、A92、K93、Q94、E97、H128、F156、A226、E227、E230、D237、K240、D259、K262、N267、Q268、I271、E277、L284、E294、E311、K317、A322、E333、D340、E354、E358、K359、A362、E382或L398；(19)E277+L24、F49、V54、D56、L66、A92、K93、Q94、E97、H128、F156、A226、E227、E230、D237、K240、D259、K262、N267、Q268、I271、L275、L284、E294、E311、K317、A322、E333、D340、E354、E358、K359、A362、E382或L398；(20)L284+L24、F49、V54、D56、L66、A92、K93、Q94、E97、H128、F156、A226、E227、E230、D237、K240、D259、K262、N267、Q268、I271、L275、E277、E294、E311、K317、A322、E333、D340、E354、E358、K359、A362、E382或L398；(21)E311+L24、F49、V54、D56、L66、A92、K93、Q94、E97、H128、F156、A226、E227、E230、D237、K240、D259、K262、N267、Q268、I271、L275、E277、L284、E294、K317、A322、E333、D340、E354、E358、K359、A362、E382或L398；(22)K317+L24、F49、V54、D56、L66、A92、K93、Q94、E97、H128、F156、A226、E227、E230、D237、K240、D259、K262、N267、Q268、I271、L275、E277、L284、E294、E311、A322、E333、D340、E354、E358、K359、A362、E382或L398；(23)A322+L24、F49、V54、D56、L66、A92、K93、Q94、E97、H128、F156、A226、E227、E230、D237、K240、D259、K262、N267、Q268、I271、L275、E277、L284、E294、E311、K317、E333、D340、E354、E358、K359、A362、E382或L398；(24)E333+L24、F49、V54、D56、L66、A92、K93、Q94、E97、H128、F156、A226、E227、E230、D237、K240、D259、K262、N267、Q268、I271、L275、E277、L284、E294、E311、K317、A322、D340、E354、E358、K359、A362、E382或L398；(25)D340+L24、F49、V54、D56、L66、A92、K93、Q94、E97、H128、F156、E227、D237、E230、K240、D259、K262、N267、Q268、I271、L275、E277、L284、E294、E311、K317、A322、E333、E354、E358、K359、A362、E382或L398；(26)E354+L24、F49、V54、D56、L66、A92、K93、Q94、E97、H128、F156、A226、E227、E230、D237、K240、D259、K262、N267、Q268、I271、L275、E277、L284、E294、E311、K317、A322、E333、D340、E358、K359、A362、E382或L398；(27)K359+L24、F49、V54、D56、L66、A92、K93、Q94、E97、H128、F156、A226、E227、E230、D237、K240、D259、K262、N267、Q268、I271、L275、E277、L284、E294、E311、K317、A322、E333、D340、E354、E358、A362、E382或L398；(28)A362+L24、F49、V54、D56、L66、A92、K93、Q94、E97、H128、F156、A226、E227、E230、D237、K240、D259、K262、N267、Q268、I271、L275、E277、L284、E294、E311、K317、A322、E333、D340、E354、E358、K359、E382或L398；(29)E382+L24、F49、V54、D56、L66、A92、K93、Q94、E97、H128、F156、A226、E227、E230、D237、K240、D259、K262、N267、Q268、I271、L275、E277、L284、E294、E311、K317、A322、E333、D340、E354、E358、K359、A362或L398；(30)L398+L24、F49、V54、D56、L66、A92、K93、Q94、E97、H128、F156、A226、E227、E230、D237、K240、D259、K262、N267、Q268、I271、L275、E277、L284、E294、E311、K317、A322、E333、D340、E354、E358、K359、A362或E382；(31)K93+L24、F49、V54、D56、L66、A92、Q94、E97、H128、F156、A226、E227、E230、D237、K240、D259、K262、N267、Q268、I271、L275、E277、L284、E294、E311、K317、A322、E333、D340、E354、E358、K359、A362、E382或L398；(32)E294+L24、F49、V54、D56、L66、A92、K93、Q94、E97、H128、F156、A226、E227、E230、D237、K240、D259、K262、N267、Q268、I271、L275、E277、L284、E311、K317、A322、E333、D340、E354、E358、K359、A362、E382或L398；(33)A226+L24、F49、V54、D56、L66、A92、K93、Q94、E97、H128、F156、E227、E230、D237、K240、D259、K262、N267、Q268、I271、L275、E277、L284、E294、E311、K317、A322、E333、D340、E354、E358、K359、A362、E382或L398；(34)E230+L24、F49、V54、D56、L66、A92、K93、Q94、E97、H128、F156、A226、E227、D237、K240、D259、K262、N267、Q268、I271、L275、E277、L284、E294、E311、K317、A322、E333、D340、E354、E358、K359、A362、E382或L398；(35)I271+L24、F49、V54、D56、L66、A92、K93、Q94、E97、H128、F156、A226、E227、E230、D237、K240、D259、K262、N267、Q268、L275、E277、L284、E294、E311、K317、A322、E333、D340、E354、E358、K359、A362、E382或L398；和(36)E358+L24、F49、V54、D56、L66、A92、K93、Q94、E97、H128、F156、A226、E227、E230、D237、K240、D259、K262、N267、Q268、I271、L275、E277、L284、E294、E311、K317、A322、E333、D340、E354、K359、A362、E382或L398。

优选的多肽与SEQ ID NO.2的同一性可以为至少90％，并在与SEQ ID NO.2中的K93相当的位置处提供有半胱氨酸。

优选的多肽与SEQ ID NO.2的同一性可以为至少90％，并在与SEQ ID NO.2中的E294相当的位置处具有半胱氨酸。

优选的多肽与SEQ ID NO.2的同一性可以为至少90％，并在与SEQ ID NO.2中的A226相当的位置处具有半胱氨酸。

优选的多肽与SEQ ID NO.2的同一性可以为至少90％，并在与SEQ ID NO.2中的E230相当的位置处具有半胱氨酸。

优选的多肽与SEQ ID NO.2的同一性可以为至少90％，并在与SEQ ID NO.2中的I271相当的位置处具有半胱氨酸。

优选的多肽与SEQ ID NO.2的同一性可以为至少90％，并在与SEQ ID NO.2中的E358相当的位置处具有半胱氨酸。

特别优选的多肽与SEQ ID NO.2的同一性可以为至少90％，并在与SEQ ID NO.2中的K93相当的位置处具有半胱氨酸，在与SEQ ID NO.2中的E294相当的位置处具有半胱氨酸。

优选的多肽与SEQ ID NO.2的同一性可以为至少90％，并在与SEQ ID NO.2中的L24相当的位置处具有半胱氨酸。

优选的多肽与SEQ ID NO.2的同一性可以为至少90％，并在与SEQ ID NO.2中的F49相当的位置处具有半胱氨酸。

优选的多肽与SEQ ID NO.2的同一性可以为至少90％，并在与SEQ ID NO.2中的V54相当的位置处具有半胱氨酸。

优选的多肽与SEQ ID NO.2的同一性可以为至少90％，并在与SEQ ID NO.2中的D56相当的位置处具有半胱氨酸。

优选的多肽与SEQ ID NO.2的同一性可以为至少90％，并在与SEQ ID NO.2中的L66相当的位置处具有半胱氨酸。

优选的多肽与SEQ ID NO.2的同一性可以为至少90％，并在与SEQ ID NO.2中的A92相当的位置处具有半胱氨酸。

优选的多肽与SEQ ID NO.2的同一性可以为至少90％，并在与SEQ ID NO.2中的Q94相当的位置处具有半胱氨酸。

优选的多肽与SEQ ID NO.2的同一性可以为至少90％，并在与SEQ ID NO.2中的E97相当的位置处具有半胱氨酸。

优选的多肽与SEQ ID NO.2的同一性可以为至少90％，并在与SEQ ID NO.2中的H128相当的位置处具有半胱氨酸。

优选的多肽与SEQ ID NO.2的同一性可以为至少90％，并在与SEQ ID NO.2中的F156相当的位置处具有半胱氨酸。

优选的多肽与SEQ ID NO.2的同一性可以为至少90％，并在与SEQ ID NO.2中的E227相当的位置处具有半胱氨酸。

优选的多肽与SEQ ID NO.2的同一性可以为至少90％，并在与SEQ ID NO.2中的D237相当的位置处具有半胱氨酸。

优选的多肽与SEQ ID NO.2的同一性可以为至少90％，并在与SEQ ID NO.2中的K240相当的位置处具有半胱氨酸。

优选的多肽与SEQ ID NO.2的同一性可以为至少90％，并在与SEQ ID NO.2中的D259相当的位置处具有半胱氨酸。

优选的多肽与SEQ ID NO.2的同一性可以为至少90％，并在与SEQ ID NO.2中的K262相当的位置处具有半胱氨酸。

优选的多肽与SEQ ID NO.2的同一性可以为至少90％，并在与SEQ ID NO.2中的N267相当的位置处具有半胱氨酸。

优选的多肽与SEQ ID NO.2的同一性可以为至少90％，并在与SEQ ID NO.2中的Q268相当的位置处具有半胱氨酸。

优选的多肽与SEQ ID NO.2的同一性可以为至少90％，并在与SEQ ID NO.2中的L275相当的位置处具有半胱氨酸。

优选的多肽与SEQ ID NO.2的同一性可以为至少90％，并在与SEQ ID NO.2中的E277相当的位置处具有半胱氨酸。

优选的多肽与SEQ ID NO.2的同一性可以为至少90％，并在与SEQ ID NO.2中的L284相当的位置处具有半胱氨酸。

优选的多肽与SEQ ID NO.2的同一性可以为至少90％，并在与SEQ ID NO.2中的E311相当的位置处具有半胱氨酸。

优选的多肽与SEQ ID NO.2的同一性可以为至少90％，并在与SEQ ID NO.2中的K317相当的位置处具有半胱氨酸。

优选的多肽与SEQ ID NO.2的同一性可以为至少90％，并在与SEQ ID NO.2中的A322相当的位置处具有半胱氨酸。

优选的多肽与SEQ ID NO.2的同一性可以为至少90％，并在与SEQ ID NO.2中的E333相当的位置处具有半胱氨酸。

优选的多肽与SEQ ID NO.2的同一性可以为至少90％，并在与SEQ ID NO.2中的D340相当的位置处具有半胱氨酸。

优选的多肽与SEQ ID NO.2的同一性可以为至少90％，并在与SEQ ID NO.2中的E354相当的位置处具有半胱氨酸。

优选的多肽与SEQ ID NO.2的同一性可以为至少90％，并在与SEQ ID NO.2中的K359相当的位置处具有半胱氨酸。

优选的多肽与SEQ ID NO.2的同一性可以为至少90％，并在与SEQ ID NO.2中的A362相当的位置处具有半胱氨酸。

优选的多肽与SEQ ID NO.2的同一性可以为至少90％，并在与SEQ ID NO.2中的E382相当的位置处具有半胱氨酸。

优选的多肽与SEQ ID NO.2的同一性可以为至少90％，并在与SEQ ID NO.2中的L398相当的位置处具有半胱氨酸。

优选的多肽与SEQ ID NO.2的同一性可以为至少90％，在与SEQ ID NO.2中的K93相当的位置处具有半胱氨酸，并在与SEQ ID NO.2中的C34相当的位置处具有半胱氨酸。

特别优选的多肽与SEQ ID NO.2的同一性可以为至少90％，在与SEQ ID NO.2中的E294相当的位置处具有半胱氨酸，并在与SEQ ID NO.2中的C34相当的位置处具有半胱氨酸。

优选的多肽与SEQ ID NO.2的同一性可以为至少90％，在与SEQ ID NO.2中的A226相当的位置处具有半胱氨酸，并在与SEQ ID NO.2中的C34相当的位置处具有半胱氨酸。

优选的多肽与SEQ ID NO.2的同一性可以为至少90％，在与SEQ ID NO.2中的E230相当的位置处具有半胱氨酸，并在与SEQ ID NO.2中的C34相当的位置处具有半胱氨酸。

优选的多肽与SEQ ID NO.2的同一性可以为至少90％，在与SEQ ID NO.2中的I271相当的位置处具有半胱氨酸，并在与SEQ ID NO.2中的C34相当的位置处具有半胱氨酸。

优选的多肽与SEQ ID NO.2的同一性可以为至少90％，在与SEQ ID NO.2中的E358相当的位置处具有半胱氨酸，并在与SEQ ID NO.2中的C34相当的位置处具有半胱氨酸。

优选的多肽与SEQ ID NO.2的同一性可以为至少90％，在与SEQ ID NO.2中的K93相当的位置处具有半胱氨酸，在与SEQ ID NO.2中的C34相当的位置处具有半胱氨酸，并在与SEQ ID NO.2中的E294相当的位置处具有半胱氨酸。

优选的多肽与SEQ ID NO.2的同一性可以为至少90％，在与SEQ ID NO.2中的L24相当的位置处具有半胱氨酸，并在与SEQ ID NO.2中的C34相当的位置处具有半胱氨酸。

优选的多肽与SEQ ID NO.2的同一性可以为至少90％，在与SEQ ID NO.2中的F49相当的位置处具有半胱氨酸，并在与SEQ ID NO.2中的C34相当的位置处具有半胱氨酸。

优选的多肽与SEQ ID NO.2的同一性可以为至少90％，在与SEQ ID NO.2中的V54相当的位置处具有半胱氨酸，并在与SEQ ID NO.2中的C34相当的位置处具有半胱氨酸。

优选的多肽与SEQ ID NO.2的同一性可以为至少90％，在与SEQ ID NO.2中的D56相当的位置处具有半胱氨酸，并在与SEQ ID NO.2中的C34相当的位置处具有半胱氨酸。

优选的多肽与SEQ ID NO.2的同一性可以为至少90％，在与SEQ ID NO.2中的L66相当的位置处具有半胱氨酸，并在与SEQ ID NO.2中的C34相当的位置处具有半胱氨酸。

优选的多肽与SEQ ID NO.2的同一性可以为至少90％，在与SEQ ID NO.2中的A92相当的位置处具有半胱氨酸，并在与SEQ ID NO.2中的C34相当的位置处具有半胱氨酸。

优选的多肽与SEQ ID NO.2的同一性可以为至少90％，在与SEQ ID NO.2中的Q94相当的位置处具有半胱氨酸，并在与SEQ ID NO.2中的C34相当的位置处具有半胱氨酸。

优选的多肽与SEQ ID NO.2的同一性可以为至少90％，在与SEQ ID NO.2中的E97相当的位置处具有半胱氨酸，并在与SEQ ID NO.2中的C34相当的位置处具有半胱氨酸。

优选的多肽与SEQ ID NO.2的同一性可以为至少90％，在与SEQ ID NO.2中的H128相当的位置处具有半胱氨酸，并在与SEQ ID NO.2中的C34相当的位置处具有半胱氨酸。

优选的多肽与SEQ ID NO.2的同一性可以为至少90％，在与SEQ ID NO.2中的F156相当的位置处具有半胱氨酸，并在与SEQ ID NO.2中的C34相当的位置处具有半胱氨酸。

优选的多肽与SEQ ID NO.2的同一性可以为至少90％，在与SEQ ID NO.2中的E227相当的位置处具有半胱氨酸，并在与SEQ ID NO.2中的C34相当的位置处具有半胱氨酸。

优选的多肽与SEQ ID NO.2的同一性可以为至少90％，在与SEQ ID NO.2中的D237相当的位置处具有半胱氨酸，并在与SEQ ID NO.2中的C34相当的位置处具有半胱氨酸。

优选的多肽与SEQ ID NO.2的同一性可以为至少90％，在与SEQ ID NO.2中的K240相当的位置处具有半胱氨酸，并在与SEQ ID NO.2中的C34相当的位置处具有半胱氨酸。

优选的多肽与SEQ ID NO.2的同一性可以为至少90％，在与SEQ ID NO.2中的D259相当的位置处具有半胱氨酸，并在与SEQ ID NO.2中的C34相当的位置处具有半胱氨酸。

优选的多肽与SEQ ID NO.2的同一性可以为至少90％，在与SEQ ID NO.2中的K262相当的位置处具有半胱氨酸，并在与SEQ ID NO.2中的C34相当的位置处具有半胱氨酸。

优选的多肽与SEQ ID NO.2的同一性可以为至少90％，在与SEQ ID NO.2中的N267相当的位置处具有半胱氨酸，并在与SEQ ID NO.2中的C34相当的位置处具有半胱氨酸。

优选的多肽与SEQ ID NO.2的同一性可以为至少90％，在与SEQ ID NO.2中的Q268相当的位置处具有半胱氨酸，并在与SEQ ID NO.2中的C34相当的位置处具有半胱氨酸。

优选的多肽与SEQ ID NO.2的同一性可以为至少90％，在与SEQ ID NO.2中的L275相当的位置处具有半胱氨酸，并在与SEQ ID NO.2中的C34相当的位置处具有半胱氨酸。

优选的多肽与SEQ ID NO.2的同一性可以为至少90％，在与SEQ ID NO.2中的E277相当的位置处具有半胱氨酸，并在与SEQ ID NO.2中的C34相当的位置处具有半胱氨酸。

优选的多肽与SEQ ID NO.2的同一性可以为至少90％，在与SEQ ID NO.2中的L284相当的位置处具有半胱氨酸，并在与SEQ ID NO.2中的C34相当的位置处具有半胱氨酸。

优选的多肽与SEQ ID NO.2的同一性可以为至少90％，在与SEQ ID NO.2中的E311相当的位置处具有半胱氨酸，并在与SEQ ID NO.2中的C34相当的位置处具有半胱氨酸。

优选的多肽与SEQ ID NO.2的同一性可以为至少90％，在与SEQ ID NO.2中的K317相当的位置处具有半胱氨酸，并在与SEQ ID NO.2中的C34相当的位置处具有半胱氨酸。

优选的多肽与SEQ ID NO.2的同一性可以为至少90％，在与SEQ ID NO.2中的A322相当的位置处具有半胱氨酸，并在与SEQ ID NO.2中的C34相当的位置处具有半胱氨酸。

优选的多肽与SEQ ID NO.2的同一性可以为至少90％，在与SEQ ID NO.2中的E333相当的位置处具有半胱氨酸，并在与SEQ ID NO.2中的C34相当的位置处具有半胱氨酸。

优选的多肽与SEQ ID NO.2的同一性可以为至少90％，在与SEQ ID NO.2中的D340相当的位置处具有半胱氨酸，并在与SEQ ID NO.2中的C34相当的位置处具有半胱氨酸。

优选的多肽与SEQ ID NO.2的同一性可以为至少90％，在与SEQ ID NO.2中的E354相当的位置处具有半胱氨酸，并在与SEQ ID NO.2中的C34相当的位置处具有半胱氨酸。

优选的多肽与SEQ ID NO.2的同一性可以为至少90％，在与SEQ ID NO.2中的K359相当的位置处具有半胱氨酸，并在与SEQ ID NO.2中的C34相当的位置处具有半胱氨酸。

优选的多肽与SEQ ID NO.2的同一性可以为至少90％，在与SEQ ID NO.2中的A362相当的位置处具有半胱氨酸，并在与SEQ ID NO.2中的C34相当的位置处具有半胱氨酸。

优选的多肽与SEQ ID NO.2的同一性可以为至少90％，在与SEQ ID NO.2中的E382相当的位置处具有半胱氨酸，并在与SEQ ID NO.2中的C34相当的位置处具有半胱氨酸。

优选的多肽与SEQ ID NO.2的同一性可以为至少90％，在与SEQ ID NO.2中的L398相当的位置处具有半胱氨酸，并在与SEQ ID NO.2中的C34相当的位置处具有半胱氨酸。

优选的多肽与SEQ ID NO.2的同一性可以为至少90％，在与SEQ ID NO.2中的K93相当的位置处具有半胱氨酸，在与SEQ ID NO.2中的C34相当的位置处没有半胱氨酸。

优选的多肽与SEQ ID NO.2的同一性可以为至少90％，在与SEQ ID NO.2中的E294相当的位置处具有半胱氨酸，在与SEQ ID NO.2中的C34相当的位置处没有半胱氨酸。

优选的多肽与SEQ ID NO.2的同一性可以为至少90％，在与SEQ ID NO.2中的A226相当的位置处具有半胱氨酸，在与SEQ ID NO.2中的C34相当的位置处没有半胱氨酸。

优选的多肽与SEQ ID NO.2的同一性可以为至少90％，在与SEQ ID NO.2中的E230相当的位置处具有半胱氨酸，在与SEQ ID NO.2中的C34相当的位置处没有半胱氨酸。

优选的多肽与SEQ ID NO.2的同一性可以为至少90％，在与SEQ ID NO.2中的I271相当的位置处具有半胱氨酸，在与SEQ ID NO.2中的C34相当的位置处没有半胱氨酸。

优选的多肽与SEQ ID NO.2的同一性可以为至少90％，在与SEQ ID NO.2中的E358相当的位置处具有半胱氨酸，在与SEQ ID NO.2中的C34相当的位置处没有半胱氨酸。

优选的多肽与SEQ ID NO.2的同一性可以为至少90％，在与SEQ ID NO.2中的K93相当的位置处具有半胱氨酸，与SEQ ID NO.2中的C34相当的位置处没有半胱氨酸，在与SEQID NO.2中的E294相当的位置处具有半胱氨酸。

优选的多肽与SEQ ID NO.2的同一性可以为至少90％，在与SEQ ID NO.2中的L24相当的位置处具有半胱氨酸，在与SEQ ID NO.2中的C34相当的位置处没有半胱氨酸。

优选的多肽与SEQ ID NO.2的同一性可以为至少90％，在与SEQ ID NO.2中的F49相当的位置处具有半胱氨酸，在与SEQ ID NO.2中的C34相当的位置处没有半胱氨酸。

优选的多肽与SEQ ID NO.2的同一性可以为至少90％，在与SEQ ID NO.2中的V54相当的位置处具有半胱氨酸，在与SEQ ID NO.2中的C34相当的位置处没有半胱氨酸。

优选的多肽与SEQ ID NO.2的同一性可以为至少90％，在与SEQ ID NO.2中的D56相当的位置处具有半胱氨酸，在与SEQ ID NO.2中的C34相当的位置处没有半胱氨酸。

优选的多肽与SEQ ID NO.2的同一性可以为至少90％，在与SEQ ID NO.2中的L66相当的位置处具有半胱氨酸，在与SEQ ID NO.2中的C34相当的位置处没有半胱氨酸。

优选的多肽与SEQ ID NO.2的同一性可以为至少90％，在与SEQ ID NO.2中的A92相当的位置处具有半胱氨酸，在与SEQ ID NO.2中的C34相当的位置处没有半胱氨酸。

优选的多肽与SEQ ID NO.2的同一性可以为至少90％，在与SEQ ID NO.2中的Q94相当的位置处具有半胱氨酸，在与SEQ ID NO.2中的C34相当的位置处没有半胱氨酸。

优选的多肽与SEQ ID NO.2的同一性可以为至少90％，在与SEQ ID NO.2中的E97相当的位置处具有半胱氨酸，在与SEQ ID NO.2中的C34相当的位置处没有半胱氨酸。

优选的多肽与SEQ ID NO.2的同一性可以为至少90％，在与SEQ ID NO.2中的H128相当的位置处具有半胱氨酸，在与SEQ ID NO.2中的C34相当的位置处没有半胱氨酸。

优选的多肽与SEQ ID NO.2的同一性可以为至少90％，在与SEQ ID NO.2中的F156相当的位置处具有半胱氨酸，在与SEQ ID NO.2中的C34相当的位置处没有半胱氨酸。

优选的多肽与SEQ ID NO.2的同一性可以为至少90％，在与SEQ ID NO.2中的E227相当的位置处具有半胱氨酸，在与SEQ ID NO.2中的C34相当的位置处没有半胱氨酸。

优选的多肽与SEQ ID NO.2的同一性可以为至少90％，在与SEQ ID NO.2中的D237相当的位置处具有半胱氨酸，在与SEQ ID NO.2中的C34相当的位置处没有半胱氨酸。

优选的多肽与SEQ ID NO.2的同一性可以为至少90％，在与SEQ ID NO.2中的K240相当的位置处具有半胱氨酸，在与SEQ ID NO.2中的C34相当的位置处没有半胱氨酸。

优选的多肽与SEQ ID NO.2的同一性可以为至少90％，在与SEQ ID NO.2中的D259相当的位置处具有半胱氨酸，在与SEQ ID NO.2中的C34相当的位置处没有半胱氨酸。

优选的多肽与SEQ ID NO.2的同一性可以为至少90％，在与SEQ ID NO.2中的K262相当的位置处具有半胱氨酸，在与SEQ ID NO.2中的C34相当的位置处没有半胱氨酸。

优选的多肽与SEQ ID NO.2的同一性可以为至少90％，在与SEQ ID NO.2中的N267相当的位置处具有半胱氨酸，在与SEQ ID NO.2中的C34相当的位置处没有半胱氨酸。

优选的多肽与SEQ ID NO.2的同一性可以为至少90％，在与SEQ ID NO.2中的Q268相当的位置处具有半胱氨酸，在与SEQ ID NO.2中的C34相当的位置处没有半胱氨酸。

优选的多肽与SEQ ID NO.2的同一性可以为至少90％，在与SEQ ID NO.2中的L275相当的位置处具有半胱氨酸，在与SEQ ID NO.2中的C34相当的位置处没有半胱氨酸。

优选的多肽与SEQ ID NO.2的同一性可以为至少90％，在与SEQ ID NO.2中的E277相当的位置处具有半胱氨酸，在与SEQ ID NO.2中的C34相当的位置处没有半胱氨酸。

优选的多肽与SEQ ID NO.2的同一性可以为至少90％，在与SEQ ID NO.2中的L284相当的位置处具有半胱氨酸，在与SEQ ID NO.2中的C34相当的位置处没有半胱氨酸。

优选的多肽与SEQ ID NO.2的同一性可以为至少90％，在与SEQ ID NO.2中的E311相当的位置处具有半胱氨酸，在与SEQ ID NO.2中的C34相当的位置处没有半胱氨酸。

优选的多肽与SEQ ID NO.2的同一性可以为至少90％，在与SEQ ID NO.2中的K317相当的位置处具有半胱氨酸，在与SEQ ID NO.2中的C34相当的位置处没有半胱氨酸。

优选的多肽与SEQ ID NO.2的同一性可以为至少90％，在与SEQ ID NO.2中的A322相当的位置处具有半胱氨酸，在与SEQ ID NO.2中的C34相当的位置处没有半胱氨酸。

优选的多肽与SEQ ID NO.2的同一性可以为至少90％，在与SEQ ID NO.2中的E333相当的位置处具有半胱氨酸，在与SEQ ID NO.2中的C34相当的位置处没有半胱氨酸。

优选的多肽与SEQ ID NO.2的同一性可以为至少90％，在与SEQ ID NO.2中的D340相当的位置处具有半胱氨酸，在与SEQ ID NO.2中的C34相当的位置处没有半胱氨酸。

优选的多肽与SEQ ID NO.2的同一性可以为至少90％，在与SEQ ID NO.2中的E354相当的位置处具有半胱氨酸，在与SEQ ID NO.2中的C34相当的位置处没有半胱氨酸。

优选的多肽与SEQ ID NO.2的同一性可以为至少90％，在与SEQ ID NO.2中的K359相当的位置处具有半胱氨酸，在与SEQ ID NO.2中的C34相当的位置处没有半胱氨酸。

优选的多肽与SEQ ID NO.2的同一性可以为至少90％，在与SEQ ID NO.2中的A362相当的位置处具有半胱氨酸，在与SEQ ID NO.2中的C34相当的位置处没有半胱氨酸。

优选的多肽与SEQ ID NO.2的同一性可以为至少90％，在与SEQ ID NO.2中的E382相当的位置处具有半胱氨酸，在与SEQ ID NO.2中的C34相当的位置处没有半胱氨酸。

优选的多肽与SEQ ID NO.2的同一性可以为至少90％，在与SEQ ID NO.2中的L398相当的位置处具有半胱氨酸，在与SEQ ID NO.2中的C34相当的位置处没有半胱氨酸。

在与SEQ ID NO.2中的C34相当的位置处“没有半胱氨酸”可以提供如下：例如，通过将C34替换成例如天然氨基酸的氨基酸，例如，A、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W或Y。这种替换可以描述为C34X。优选替换C34A。在与SEQ ID NO.2中的C34相当的位置处“没有半胱氨酸”可以提供如下：例如，通过该位置处半胱氨酸的缺失。

硫代-白蛋白可以包括或者不包括其中一个或多个(例如若干个)天然的游离巯基例如HSA(SEQ ID NO.2)中的半胱氨酸-34被修饰成非半胱氨酸的氨基酸的多肽。例如，半胱氨酸可以用或不用保守分值相对高(例如根据图3计算为1、2或3)的氨基酸例如丙氨酸或丝氨酸取代。硫代-白蛋白可以包括或者不包括其中存在一个或多个(例如若干个)天然的游离巯基例如HSA(SEQ ID NO.2)中的半胱氨酸-34的多肽。因此，任意上述实施方式的有缀合能力的多肽可以在与SEQ ID NO.2的34位相当的位置处包括有缀合能力的半胱氨酸。另外可选地，在与SEQ ID NO.2的34位相当的位置处可以不存在有缀合能力的半胱氨酸。

对于包括两个或更多个(若干个)有缀合能力的半胱氨酸残基的多肽来说，当多肽折叠时，有缀合能力的半胱氨酸残基可以相对均匀或不均匀地在折叠蛋白质的表面上分布。术语“折叠”包括多肽/蛋白质折叠成其天然构象，例如，热力学上最稳定的折叠构象。相对均匀分布的优势在于其允许两个或更多个(若干个)部分以最小空间位阻或者两个或更多个(若干个)缀合部分之间没有位阻地与硫代-白蛋白缀合。这样的优势在于，使得可以缀合在硫代-白蛋白上的相邻部分(缀合配偶体)之间的空间位阻之类的问题造成的潜在活性损失最小化，优选将其消除。这些部分例如生物活性分子可以是相对大体积(bulky)的。

优选地，两个或更多个(若干个)有缀合能力的半胱氨酸在硫代-白蛋白分子的表面上分布成彼此间隔尽可能地远，例如，几何上有可能。优选地，两个或更多个(若干个)有缀合能力的半胱氨酸之间的距离为至少5、10、20、30、40、50、60、70或80埃。优选地，每个有缀合能力的半胱氨酸与分子中一个或若干个或所有其他有缀合能力的半胱氨酸的距离为至少5、10、20、30、40、50、60、70或80埃。两个有缀合能力的半胱氨酸之间的距离优选是折叠白蛋白分子的最长轴长度至少5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或95％、最优选100％的距离，如白蛋白模型所示。例如，如蛋白质结构1AO6所示，SEQ ID NO.2的最长轴为大约85埃。因此，优选地，两个或更多个(若干个)半胱氨酸残基间隔至少65、70、75或最优选80埃。最优选地，每个有缀合能力的半胱氨酸残基的距离为折叠白蛋白分子最长轴长度的至少80％、90％或95％，最优选100％。

优选地，有缀合能力的半胱氨酸的侧链彼此方向远离和/或方向使得缀合在半胱氨酸上的分子将方向远离白蛋白结构的中心。这样提供了防止缀合部分和/或白蛋白部分自身之间相互作用的优势。

参照氨基酸序列，候选氨基酸残基可以使用例如Yasara的软件目测检查(Krieger和Vriend,2014,Bioinformatics 30(20)2981-2982；描述于http://www.yasara.org/)。

合适地，多肽包括在与SEQ ID NO.2的残基K93或E294相当的位置所对应的一个或两个位置处将半胱氨酸以外的氨基酸用半胱氨酸替换。在WT HSA(SEQ ID NO.2)中，C34和K93之间的Cα-Cα距离为C34和E294之间为K93和E294之间为

马来酰亚胺缀合是将缀合配偶体与白蛋白缀合的方便的方式。据信与马来酰亚胺-聚乙二醇2-生物素形成缀合物的能力指示着与其他含有马来酰亚胺基团的缀合配偶体形成缀合物的能力。相反，如果有缀合能力的多肽与马来酰亚胺-聚乙二醇2-生物素缀合的效率低，或者不能缀合，这并不指示几乎不能或不能与不同的化学基团缀合。马来酰亚胺缀合物形成在受控水解时能或者不能稳定化的硫醚键。优选形成稳定的缀合物，使得在存储或使用的过程中，缀合物不会释放出反应性马来酰亚胺缀合配偶体。后者潜在地与在体内遇到的硫醇反应性物种形成有害的缀合物。

如实施例中所示，在半胱氨酸34处具有单个游离硫醇的天然HSA在马来酰亚胺缀合和受控水解时，形成大约50％的稳定缀合物。相反地，本发明的多肽可以更高的效率形成稳定的缀合物。具体地，在选自与SEQ ID NO.2的K93、E294和E358相当的位置处包括游离硫醇基的白蛋白以更高的效率形成稳定的马来酰亚胺缀合物，如实施例中所示。包括两个或更多个(若干个)这种硫醇的白蛋白也可以形成稳定的马来酰亚胺缀合物。

本发明的有缀合能力的多肽可以能够或者不能够以至少90％、优选至少95％的缀合效率与马来酰亚胺-聚乙二醇2-生物素(马来酰亚胺-PEG2-生物素)形成缀合物，该缀合物在受控水解时可以是或者不是至少90％、优选95％稳定的。图4说明了马来酰亚胺-PEG2-生物素与蛋白质游离硫醇的缀合，以及形成的缀合物可能发生的反应。

特定百分比的缀合效率是指在适当的反应条件下白蛋白中的游离硫醇基与马来酰亚胺部分形成加合物的特定百分比。马来酰亚胺基团在6.5-7.5的pH范围与硫醇形成硫醚键，在该pH下与胺的交叉反应性极低。使用pH 7.2的20mM磷酸钠、150mM氯化钠对于该反应效果很好。蛋白质浓度理想地应当在1-10mg/mL范围内。蛋白质浓度降低会导致需要增加试剂的摩尔过量，以获得水平可接受的修饰(Hermanson,Greg T.(2008),BioconjugateTechniques.第2版,Academic Press,San Diego,CA)。形成加合物导致例如通过质谱可以测量的质量增加，如在实施例中那样。方便地，百分比缀合效率与白蛋白的所有游离硫醇有关。当白蛋白具有多于一个的这种游离硫醇，不同的百分比缀合效率可以与每个游离硫醇有关，其可以相对于每个单独的游离硫醇表示，或者对于所有游离硫醇共同表示。因此，如果白蛋白具有两个游离硫醇，一个的缀合效率为50％，另一个的缀合效率为100％，白蛋白总体缀合效率是两个缀合效率的平均值，在这种情况下，为75％。

受控水解时特定百分比的稳定性是指经历开环稳定化的硫醇-马来酰亚胺加合物的特定百分比，即，琥珀酰亚胺环部分水解成琥珀酸部分，并保持缀合物的硫醚键，如图4所示。百分比稳定性可以相对于每个单独的游离硫醇或白蛋白表示，或者对于所有游离硫醇共同表示。受控水解可以在碱性pH和上述环境温度下进行。适当地，将加合物在缓冲盐溶液例如磷酸盐缓冲盐水中在pH 9.0和37℃下孵育至少18小时，优选24小时。琥珀酰亚胺部分通过H₂O的加成水解成琥珀酸部分具有增加例如可以通过质谱测量的缀合物质量的效果，如实施例中那样。当缀合效率不完全时，这点在确定百分比稳定性时须予以考虑。例如，如果50％的具有一个游离硫醇的白蛋白形成缀合物，在受控水解之后40％的白蛋白缀合，这代表稳定性为80％。在这些情形中，50％的白蛋白最初是未缀合的，因此具有指示游离白蛋白的质量。在受控水解时该质量不会变化。在50％的最初未缀合的白蛋白当中，全体白蛋白的40％这部分由于H₂O的加成增加18Da的质量。其他部分即全体白蛋白的10％不会经历水解，因此其质量不发生变化。尽管该白蛋白仍然是缀合的，它在存储或使用过程中会不稳定，因为它可以经由retro-Michael路径经历去缀合，如图4所示。相反地，预计稳定水解的缀合物可以在存储或使用过程中保持稳定(Fontaine,S.等人,Bioconjugate Chem.2015,26,145-152)。

适当地，本发明多肽的缀合效率可以是至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或基本上100％。适当地，本发明多肽的单个游离硫醇的缀合效率可以是至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或基本上100％。多肽缀合物在受控水解时适当的稳定性可以是至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或基本上100％。

如实施例中所示，在半胱氨酸34处具有单个游离硫醇的天然HSA形成大于大约90％的缀合物。在选自与SEQ ID NO.2的K93、E294、E358、L24、V54、H128、E227、K240、K262、Q268、E277、K317、A322、K359和A362的位置相当的位置处包括游离硫醇基的白蛋白形成马来酰亚胺缀合物的效率大于大约90％，在选自与L24、V54、H128、E227、K240、K262、K359和A362相当的位置处具有游离硫醇基的白蛋白形成马来酰亚胺缀合物的效率大于大约95％。

多肽缀合物在受控水解时特定硫醚缀合键适当的稳定性可以是至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或基本上100％。

多肽可以进一步包括或不包括可以连接有诸如生物活性化合物、放射性药物或显像剂的缀合配偶体的额外接头(linker)。理论如，连接部分可以包括伯胺，例如赖氨酸。

优选地，有缀合能力的多肽具有可接受的免疫原性，特别是在人体中。更优选地，有缀合能力的多肽的免疫原性相当于或低于亲本白蛋白例如WT HSA(SEQ ID NO.2)的免疫原性。因此，优选地，提供有缀合能力的半胱氨酸残基的改变相对于亲本白蛋白例如WT HSA不会对多肽的免疫原性产生不利影响。

优选地，为提供有缀合能力的半胱氨酸残基而进行的改变，例如相对于野生型HSA(SEQ ID NO.2)的免疫原性，不会对多肽在人体中的免疫原性产生不利影响。

多肽的免疫原性可以通过进行T-细胞表位和/或B-细胞表位的筛选而确定或预测。筛选可以计算机模拟、体外或离体进行。例如，多肽的免疫原性可以通过离体的T细胞活性检验确定或预测。T细胞活化检验可以包括使用增殖检验例如[3H]-胸苷摄取来测量T细胞反应。优选地，多肽在T细胞增殖检验中的反应性低于10％，优选反应性低于8％、6％、4％或2％，最优选为0％。“反应性”是指观察到阳性反应。因此，反应性10％是指在10％的供体样品中观察到阳性反应。

T细胞活化检验可以包括使用细胞因子分泌检验例如IL-2ELISpot测量T细胞反应。优选地，多肽在细胞因子分泌检验中的反应性低于10％，优选反应性低于8％、6％、4％或2％，最优选为0％。“反应性”是指观察到阳性反应。因此，反应性10％是指在10％的供体样品中观察到阳性反应。

更优选地，有缀合能力的多肽在T细胞增殖检验和在细胞因子分泌检验例如EpiScreen^TM检验(Abzena,Cambridge,UK)中的反应性低于10％。

T细胞检验可以包括CD4+ T分子。

T细胞检验可以使用来自代表欧洲和南美人群(基于HLA同种异型)的一组50名健康供体的外周血单核细胞。

优选地，多肽在人体内不会刺激不利的抗体反应，例如特异性抗体反应。

对于包括有缀合能力的多肽的缀合物，优选地，缀合物的免疫原性相当于或低于包括亲本白蛋白例如WT HSA(SEQ ID NO.2)而不是有缀合能力的多肽的相应缀合物的免疫原性。因此，对于有缀合能力的多肽所提到的特性同样适用于包括有缀合能力的多肽的缀合物，但是，“对照”可以是亲本白蛋白例如WT HSA或者包括亲本白蛋白例如WT HSA的相应的缀合物。

有缀合能力的多肽II

本发明第二个方面提供一种由缀合能力的多肽，其包括根据本发明第一个方面的氨基酸序列，和至少一个(例如，若干个)相比较于SEQ ID NO.2的另外的修饰，例如，导致多肽具有至少一个(例如，若干个)另外的有缀合能力的半胱氨酸、或者改变多肽的FcRn结合亲和力、或者改变多肽的血浆半衰期的另外的修饰。

本发明第二方面使得关于本发明第一方面定义的有利的有缀合能力的半胱氨酸在白蛋白背景下得以与另外的修饰结合，提供为特定应用进一步定制(tailor)白蛋白的选择。

另外的有缀合能力的半胱氨酸

至少一个(例如，若干个)另外的修饰可以导致或者不导致多肽具有至少一个(例如，若干个)另外的有缀合能力的半胱氨酸。多肽可以包括或不包括总计2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个有缀合能力的半胱氨酸残基。多肽可以包括或不包括至少一个(例如，若干个)另外的关于本发明第一方面定义的有缀合能力的半胱氨酸。

在至少一个与选自SEQ ID NO.2的K93、E294、A226、E230、I271、E358、L24、F49、V54、D56、L66、A92、Q94、E97、H128、F156、E227、D237、K240、D259、K262、N267、Q268、L275、E277、L284、E311、K317、A322、E333、D340、E354、K359、A362、E382和L398、特别是K93、E294、A226、E230和I271的位置相当的位置所对应的位置处以外，多肽可以包括或不包括至少一个(例如，若干个)另外的有缀合能力的半胱氨酸。合适的有缀合能力的半胱氨酸公开于WO2010/092135中(并入作为参考，特别是图5和图6)。合适地，在至少一个(例如，若干个)与选自SEQ ID NO.2的D1、A2、H3、S5、A55、S58、C75、T76、T79、E82、T83、E86、C91、D121、V122、C124、T125、D129、C169、C177、A229、T236、E266、D269、S270、S273、S304、K313、D314、C316、N318、A320、C361、A364、C369、A371、N386、Q390、Q397、S435、T478、T496、A504、E505、T506、T508、D549、C558、D562、C567、A581、L585和A578的位置相当的位置处，可包括有缀合能力的半胱氨酸。合适地，多肽可以包括一个或多个(例如，若干个)：(a)氨基酸替换，其为在与SEQID NO.2的D1、A2、H3、S5、A55、S58、C75、T76、T79、E82、T83、E86、C91、D121、V122、C124、T125、D129、C169、C177、A229、T236、E266、D269、S270、S273、S304、K313、D314、C316、N318、A320、C361、A364、C369、A371、N386、Q390、Q397、S435、T478、T496、A504、E505、T506、T508、D549、C558、D562、C567、A581、L585和A578中的任意残基相当的位置所对应的位置处，将半胱氨酸以外的氨基酸用半胱氨酸替换；(b)半胱氨酸的插入，其在与SEQ ID NO.2的D1、A2、H3、S5、A55、S58、C75、T76、T79、E82、T83、E86、C91、D121、V122、C124、T125、D129、C169、C177、A229、T236、E266、D269、S270、S273、S304、K313、D314、C316、N318、A320、C361、A364、C369、A371、N386、Q390、Q397、S435、T478、T496、A504、E505、T506、T508、D549、C558、D562、C567、A581、L585和A578中的任意残基相当的位置所对应的氨基酸的N-或C-侧相邻的位置处，以在C369、C361、C91、C177、C567、C316、C75、C169、C124和C558中的任意处产生有缀合能力的半胱氨酸；和(c)半胱氨酸的添加，其在白蛋白序列的N-端残基的N-侧，或者在白蛋白序列的C-端残基的C-侧。示例性的组合包括位于以下位置的有缀合能力的半胱氨酸：(a)A2+L585；(b)A2+A364+D562+L585C；(c)A2以及相邻于白蛋白C-端的C-侧；(d)T79+A364；(e)A364+D1；(f)T79+D562+A364；(g)D562+A364+D1；(h)T79+D562+A364+A504；(i)T79+D562+A364+L585；(j)T79+D562+A364+D1；(k)T79+D562+A364+L585+D1；(l)E86+D562+A364+A504+A2；(m)S270+A581；(n)S270+D129；(o)S270+A581+E82；(p)S270+A581+D129；(q)S270+A581+E82+D129；(r)S270+A581+E82+D129+Q397；(s)C369+C177；(t)A364+A581；(u)T79+A364+A581；(v)A364+A581+D129；(w)A364+C177；(x)D562+C369；(y)D129+C369；(z)A581+C369；或(aa)D562+D129+C369。

另外的合适的半胱氨酸残基可以如WO 2009/126920或WO 2010/059315所公开引入(在此并入作为参考)。具体地，一个或多个(例如，若干个)表面暴露的氨基酸残基可以替换成半胱氨酸残基，其对应于一个或多个(例如，若干个)SEQ ID NO.2的相应的位置S58、T76、T79、T83、T125、T236、S270、S273、S304、S435、T478、T496、T506和T508。

如关于本发明第一方面所注意到，增加白蛋白变体中有缀合能力的半胱氨酸残基的数目可以降低其在溶液中作为单体存在的倾向性。优选地，本发明第二方面的有缀合能力的多肽在溶液中作为单体存在的倾向性是SEQ ID NO.2多肽在溶液中作为单体存在的倾向性的至少70％，任选为至少75％、至少80％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或至少100％。无论多肽是否包括如关于第二方面所定义的另外的有缀合能力的半胱氨酸，该优先性均适用。然而，仍可以提供在溶液中作为单体存在的倾向性较低的可用的有缀合能力的多肽。由于对于本发明第一方面定义的有缀合能力的半胱氨酸残基本身相对最小程度地有助于非单体的形成，将其一个或多个(例如，若干个)与一个或多个(例如，若干个)另外的有缀合能力的半胱氨酸残基组合，预计可以导致与选自现有技术的具有相同数目有缀合能力的半胱氨酸残基的变体相比较，变体的单体百分含量增加。

FcRn结合改变和/或血浆半衰期改变的白蛋白变体

至少一个(例如若干个)另外的修饰可以改变或不改变白蛋白变体的FcRn结合亲和力和/或改变血浆半衰期。优选地，白蛋白变体与SEQ ID NO.2的序列同一性可以为至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、99.2％、99.4％、99.6％、99.8％。例如，除引入的Cys残基或多个Cys残基以外，白蛋白变体还可以具有至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10个(例如若干个)其他相对于SEQ ID NO.2的突变。另外可选地，除引入的Cys残基或多个Cys残基以外，白蛋白变体相对于SEQ ID NO.2可以具有零个其他突变。

硫代-白蛋白或缀合物的血浆半衰期比亲本白蛋白或其缀合物的血浆半衰期更长或更短，优选更长，或者其FcRn结合更强或更弱，优选更强。优选地，硫代-白蛋白或缀合物的血浆半衰期比HSA或其相应缀合物的半衰期更长。

另外可选地，这可以表达成硫代-白蛋白或缀合物与FcRn(例如shFcRn)的KD低于HSA或其缀合物的相应KD。优选地，硫代-白蛋白或缀合物的KD低于HSA与FcRn的0.9X KD，更优选低于HSA与FcRn的0.5X KD，更优选低于HSA与FcRn的0.1X KD，再更优选低于HSA与FcRn的0.05X KD，再更优选低于HSA与FcRn的0.02X KD，再更优选低于HSA与FcRn的0.01X KD，最优选低于HSA与FcRn的0.001X KD(其中X是指“乘以”)。

对于包括硫代-白蛋白的缀合物，优选地，缀合物的KD低于包括HSA的相应缀合物与FcRn的0.9X KD，更优选低于相应缀合物与FcRn的0.5X KD，更优选低于相应缀合物与FcRn的0.1X KD，再更优选低于相应缀合物与FcRn的0.05X KD，再更优选低于相应缀合物与FcRn的0.02X KD，再更优选低于相应缀合物与FcRn的0.01X KD，最优选低于相应缀合物与FcRn的0.001X KD(其中X是指“乘以”)。“相应缀合物”是指包括HSA(例如SEQ ID NO.2)而不是硫代-白蛋白(即白蛋白变体)的缀合物。

另外可选地，硫代-白蛋白或缀合物的血浆半衰期可以比HSA或其缀合物的要短。

这可以表达成硫代-白蛋白或缀合物与FcRn的KD高于HSA或其缀合物与FcRn的相应KD。优选地，硫代-白蛋白或缀合物的KD高于HSA与FcRn的2X KD，更优选高于HSA与FcRn的5X KD，更优选高于HSA与FcRn的10X KD，再更优选高于HSA与FcRn的25X KD，最优选高于HSA与FcRn的50X KD。硫代-白蛋白或缀合物可以是FcRn的零结合物。

对于包括硫代-白蛋白的缀合物，优选地，该缀合物的KD，优选包括HSA的相应缀合物的KD高于相应缀合物与FcRn的2X KD，更优选高于相应缀合物与FcRn的5X KD，更优选高于相应缀合物与FcRn的10X KD，再更优选高于相应缀合物与FcRn的25X KD，最优选高于相应缀合物与FcRn的50X KD。“相应缀合物”是指包括HSA(例如SEQ ID NO.2)而不是硫代-白蛋白(即白蛋白变体)的缀合物。

硫代-白蛋白或缀合物或者由缔合物、纳米颗粒、微颗粒或脂质体制成的产品的半衰期可以进行定制，以实现满足用户需求的结合亲和力或半衰期。

仪器：Biacore 3000仪器(GE Healthcare)

Flow cell：CM5传感芯片

FcRn的定量：1200-2500RU

测试分子(例如HSA或变体)注射的定量为20-0.032μM。

注射流速：恒定，例如30μL/mL

注射温度：25℃

数据评价软件：BIAevaluation 4.1软件(BIAcore AB)。

白蛋白的结构域III主要负责结合FcRn。有缀合能力的多肽可以包括或不包括以下或者是或不是由其组成：白蛋白结构域III或其变体和至少一个(例如若干个)另外的白蛋白结构域或其片段，例如第二白蛋白结构域III或其变体，如WO 2011/124718中所公开(在此将其并入作为参考)。合适地，多肽包括至少一个(例如，若干个)白蛋白结构域III或其变体或片段，或者由其组成，其中至少一个(例如，若干个)白蛋白结构域III在与SEQ IDNO.2中选自以下的位置对应的位置中包括一个或多个(例如，若干个)替换：573、500、550、417、440、464、490、492、493、494、495、496、499、501、503、504、505、506、510、535、536、537、538、540、541、542、574、575、577、578、579、580、581、582和584，如WO 2011/051489中所公开(在此将其并入作为参考)。合适的替换包括在与SEQ ID NO.2中选自以下的位置对应的位置中的一个或多个(例如，若干个)替换：K573Y、W、P、H、F、V、I、T、N、S、G、M、C、A、E、Q、R、L、D，K500E、G、D、A、S、C、P、H、F、N、W、T、M、Y、V、Q、L、I、R，Q417A，H440A，H464Q，E492G，D494N、Q、A，E495Q、A，T496A，D494E+Q417H，D494N+T496A，E492G+V493P，P499A，E501A、Q，N503H、K，H510Q，H535Q，K536A，P537A，K538A，K541G、D，D550E、N，E492G+K573P、A，或者E492G/N503H/K573P。

在另外可选的实施方式中，多肽可以在两个或更多个(若干个)选自与SEQ IDNO.2中的位置(a)492和580；(b)492和574；(c)492和550；(d)550和573；(e)550和574；(f)550和580对应的位置的那些位置处包括改变，如WO 2014/072481中所公开(在此将其并入作为参考)。

在另外可选的实施方式中，有缀合能力的多肽可以包括：(i)包括第一白蛋白的N-端区，所述第一白蛋白是人白蛋白变体，其中第一白蛋白的N-端包括除C-端2-30氨基酸以外的人白蛋白变体的所有氨基酸；和(ii)第二白蛋白的C-端区，所述第二白蛋白选自猕猴白蛋白、小鼠白蛋白、兔白蛋白、绵羊白蛋白、人白蛋白、山羊白蛋白、黑猩猩白蛋白、仓鼠白蛋白、豚鼠白蛋白、大鼠白蛋白、牛白蛋白、马白蛋白、驴白蛋白、狗白蛋白、鸡白蛋白或猪白蛋白或者它们的变体，其中第二白蛋白或白蛋白变体的C-端包括第二白蛋白或白蛋白变体的C-端2-30氨基酸；其中上述多肽具有(i)与人白蛋白变体相比较有变化的血浆半衰期和/或(ii)与人白蛋白变体相比较有变化的FcRn结合亲和力，如WO 2012/059486中所公开(在此将其并入作为参考)。

在另外可选的实施方式中，多肽可以包括：成熟人白蛋白多肽序列SEQ ID NO.2的结构域I中的一个或多个(例如，若干个)改变；和成熟人白蛋白多肽序列SEQ ID NO.2的结构域III中的一个或多个(例如，若干个)改变，其中一个或多个(例如，若干个)改变导致多肽具有变化的FcRn结合亲和力，如WO 2013/135896中所公开(在此将其并入作为参考)。合适地，结构域I中的改变选自与SEQ ID NO.2的78-120位中的任意位置(例如，78-88位中的任意位置和/或105-120位中的任意位置)对应的位置；结构域III中的改变选自与SEQ IDNO.2的位置425、505、510、512、524、527、531、534、569、573、575中的任意位置对应的位置。合适地，SEQ ID NO.2的位置78-120或425、505、510、512、524、527、531、534、569、573和/或575所对应的位置处的改变是替换；并且改变任选地是选自以下的替换：(i)83N、K或S；(ii)111D、G、H、R、Q或E；或(iii)573P、Y、W、H、F、T、I或V。

在另外可选的实施方式中，多肽可以包括：成熟人白蛋白多肽序列SEQ ID NO.2的结构域II中选自与SEQ ID NO.2中的位置349、342、381、345、384、198、206、340、341、343、344、352、382、348和/或383对应的位置的一个或多个(例如，若干个)改变；其中一个或多个(例如，若干个)改变导致有缀合能力的多肽(i)具有变化的血浆半衰期，和/或(ii)具有变化的FcRn结合亲和力，如WO 2015/036579中所公开(在此将其并入作为参考)。合适地，位置349、342、381、345、384、198、206、340、341、343、344、352、382、348和/或383所对应的位置处的改变是替换；并且改变任选地是选自以下的替换：(i)349F、W、Y、H、P、K或Q，优选F；(ii)342Y、W、F、H、T、N、Q、A、C、I、L、P、V，优选Y；(iii)381G或A，优选G；或(iv)345E、H、I或Q。

在另外可选的实施方式中，多肽可以包括白蛋白的变体结构域III或其片段，其包括突变，例如替换，其对应于SEQ ID NO.2的V418、T420、V424、E505和V547所对应的一个或多个(例如，若干个)位置。这些突变公开于WO 2013/075066中(在此将其并入作为参考)。替换可以位于V418、T420、V424、E505和V547所对应的1个、2个或更多个(若干个，例如2、3、4或5个)位置处；例如，可以具有一个或多个(例如，若干个)选自V418M、T420A、V424I、E505(R/K/G)和V547A的替换。在具体的实施方式中，白蛋白包括替换V418M、T420A和E505R；或者V418M、T420A、E505G和V547A。白蛋白可以在选自N429、M446、A449、T467和A552；例如选自N429D、M446V、A449V、T467M和A552T的位置处包括一个或多个(例如，若干个)另外的替换。

在另外可选的实施方式中，变体可以包括白蛋白的变体结构域III或其片段，其包括1-18个氨基酸替换，以增加多肽的FcRn亲和力和血清半衰期中的一种或两种，如WO2011/103076中所公开(在此将其并入作为参考)。替换可以位于SEQ ID NO.2的位置381、383、391、401、402、407、411、413、414、415、416、424、426、434、442、445、447、450、454、455、456、457、459、463、495、506、508、509、511、512、515、516、517、519、521、523、524、525、526、527、531、535、538、539、541、557、561、566或569所对应的任意一个或多个(例如，若干个)位置处。合适的替换可以选自V381N、V381Q、E383A、E383G、E383I、E383L、E383V、N391A、N391G、N391I、N391L、N391V、Y401D、Y401E、K402A、K402G、K402I、K402L、K402V、L407F、L407N、L407Q、L407W、L407Y、Y411Q、Y411N、K413C、K413S、K413T、K414S、K414T、V415C、V415S、V415T、Q416H、Q416P、V424A、V424G、V424I、V424L、V424N、V424Q、V426D、V426E、V426H、V426P、G434C、G434S、G434T、E442K、E442R、R445F、R445W、R445Y、P447S、P447T、E450D、E450E、S454C、S454M、S454T、V455N、V455Q、V456N、V456Q、L457F、L457W、L457Y、Q459K、Q459R、L463N、L463Q、E495D、T506F、T506W、T506Y、T508K、T508R、T508S、F509C、F509I、F509L、F509M、F509V、F509W、F509Y、A511F、A511W、A511Y、D512F、D512W、D512Y、T515C、T515H、T515N、T515P、T515Q、T515S、L516F、L516S、L516T、L516W、L516Y、S517C、S517F、S517M、S517T、S517W、S517Y、K519A、K519G、K519I、K519L、K519V、R521F、R521W、R521Y、I523A、I523D、I523E、I523F、I523G、I523K、I523L、I523N、I523Q、I523R、I523V、I523W、I523Y、K524A、K524G、K524I、K524L、K524V、K525A、K525G、K525I、K525L、K525V、Q526C、Q526M、Q526S、Q526T、Q526Y、T527F、T527W、T527Y、E531A、E531G、E531I、E531L、E531V、H535D、H535E、H535P、K538F、K538W、K538Y、A539I、A539L、A539V、K541F、K541W、K541Y、K557A、K557G、K557I、K557L、K557V、A561F、A561W、A561Y、T566F、T566W、T566Y、A569H和A569P；例如选自L407N、L407Y、V415T、V424I、V424Q、V426E、V426H、P447S、V455N、V456N、L463N、E495D、T506Y、T508R、F509M、F509W、A511F、D512Y、T515Q、L516T、L516W、S517W、R521W、I523D、I523E、I523G、I523K、I523R、K524L、Q526M、T527Y、H535P和K557G。

变体可以包括白蛋白的变体结构域III或其片段，其在SEQ ID NO.2的以下位置所对应的位置处包括氨基酸替换：(a)残基383和413；(b)残基401和523；(c)残基407和447；(d)残基407和447和539；(e)残基407和509；(f)残基407和526；(g)残基411和535；(h)残基414和456；(i)残基415和569；(j)残基426和526；(k)残基442和450和459；(l)残基463和508；(m)残基508和519和525；(n)残基509和527；(o)残基523和538；(p)残基526和557；(q)残基541和561；(r)残基463和523；(s)残基508和523；(t)残基508和524；(u)残基463、508和523；(v)残基463、508和524；(w)残基508、523和524；(x)残基463、508、523和524；(y)残基463和524；(z)残基523和524；和(aa)残基463、523和524，其中替换增加了多肽的FcRn亲和力和血清半衰期中的一种或两种，如WO 2012/112188中所公开(在此将其并入作为参考)。合适的替换可以选自：(a)L463C、F、G、H、I、N、S或Q；(b)T508C、E、I、K、R或S；(c)I523A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W或Y；(d)K524A、F、G、H、I、L、M、Q、T或V；(e)L463F或N；(f)T508R或S；(g)I523D、E、F、G、K或R；和(h)K524L。

变体白蛋白可以包括成熟人白蛋白多肽序列SEQ ID NO.2中选自与SEQ ID NO.2的位置V418、T420、V424、E505、V547、K573对应的位置处的一个或多个(例如，若干个)改变；其中一个或多个(例如，若干个)改变导致有缀合能力的多肽(i)具有变化的血浆半衰期，和/或(ii)具有变化的FcRn结合亲和力。

变体白蛋白可以包括成熟人白蛋白多肽序列SEQ ID NO.2中选自与SEQ ID NO.2中以下位置对应的位置的一个或多个(例如，若干个)改变：SEQ ID NO.2中的V381，优选V381N或Q；E383，优选E383A、G、I、L或V；N391，优选N391A、G、I、L或V；Y401，优选Y401D或E；K402，优选K402A、G、I、L或V；L407，优选L407F、N、Q、W或Y；Y411，优选Y411Q或N；K413，优选K413C、S或T；K414，优选K414S或T；V415C，优选V415C、S或T；Q416，优选Q416H或P；V424，优选V424A、G、I、L、N或Q；V426D，优选V426D、E、H或P；G434，优选G434C、S或T；E442，优选E442K或R；R445，优选R445F、W或Y；P447，优选P447S或T；E450，优选E450D或E；S454，优选S454C、M或T；V455，优选V455N或Q；V456，优选V456N或Q；L457，优选L457F、W或Y；Q459，优选Q459K或R；L463，优选L463N或Q；E495，优选E495D；T506，优选T506F、W或Y；T508，优选T508K、R或S；F509，优选F509C、I、L、M、V、W或Y；A511，优选A511F、W或Y；D512，优选D512F、W或Y；T515，优选T515C、H、N、P、Q或S；L516，优选L516F、S、T、W或Y；S517，优选S517C、F、M、T、W或Y；K519，优选K519A、G、I、L或V；R521，优选R521F、W或Y；I523，优选I523A、D、E、F、G、K、L、N、Q、R、V、W或Y；K524，优选K524A、G、I、L或V；K525，优选K525A、G、I、L或V；Q526，优选Q526C、M、S、T或Y；T527，优选T527F、W或Y；E531，优选E531A、G、I、L或V；H535，优选H535D、E或P；K538，优选K538F、W或Y；A539，优选A539I、L或V；K541，优选K541F、W或Y；K557，优选K557A、G、I、L或V；A561，优选A561F、W或Y；T566，优选T566F、W或Y；A569，优选A569H或P；其中一个或多个(例如，若干个)改变导致有缀合能力的多肽(i)具有变化的血浆半衰期，和/或(ii)具有变化的FcRn结合亲和力。

变体白蛋白可以包括成熟人白蛋白多肽序列SEQ ID NO.2中选自与SEQ ID NO.2中以下位置对应的位置的一个或多个(例如，若干个)改变：SEQ ID NO.2中的V547，优选V457A；K573，优选K573P或Y；I523，优选I523A或G；T527，优选T527M；K500，优选K500A；或E505，优选E505Q；其中一个或多个(例如，若干个)改变导致有缀合能力的多肽(i)具有变化的血浆半衰期，和/或(ii)具有变化的FcRn结合亲和力。

变体白蛋白可以包括成熟人白蛋白多肽序列SEQ ID NO.2中选自与SEQ ID NO.2中位置573、523、527或505对应的位置的一个或多个(例如，若干个)改变，优选SEQ ID NO.2的K573Y；I523G；I523A；T527M；E505Q；或K573P，例如K573Y和I523G；K573Y、I523G和T527M；K573Y、E505Q和T527M；K573Y和T527M；K573P和I523G；K573P、I523G和T527M；K573P、E505Q和T527M；K573P和T527M；V547A；V547A和K573P；V547A、E505Q、K573P和T527M；或K500A和H510Q。

其他修饰

本发明第二个方面包括其他的修饰。例如，多肽可以包括或不包括至少一个(例如，若干个)减少糖基化的突变。

融合多肽

本发明第三个方面提供一种融合多肽，其包括本发明第一个或第二个方面的有缀合能力的多肽。

本发明的多肽可以与非白蛋白的多肽融合配偶体融合。融合配偶体原则上可以是任何多肽，但通常优选融合配偶体是具有生物活性、治疗性、预防性(包括疫苗)、诊断性、显影或其他有益特性的多肽。这些特性可以称作是“药学上有益的特性”。包括白蛋白或其片段的融合多肽是本领域已知的。已经发现，与单独的未融合融合配偶体多肽相比较，这些包括白蛋白或其片段和融合配偶体多肽的融合多肽具有更长的血浆半衰期。

一种或多种(例如，若干种)生物活性、治疗性、预防性(包括疫苗)、诊断性、显影或其他有益的多肽可以与白蛋白的N-端、C-端融合，插入到白蛋白结构的回环中，或者其任意组合。它可以包括或不包括将融合多肽的不同组分隔开的接头序列。通过非限定性的实施例，融合物可以包括N’-配偶体-白蛋白-C’、N’-白蛋白-配偶体-C’、N’-白蛋白-配偶体-白蛋白-C’、N’-配偶体-白蛋白-配偶体-C’，其中“配偶体”是指融合配偶体。

关于白蛋白或其片段的融合物的教导是本领域已知的，技术人员将会认识到，这些教导也可以应用于本发明。WO 2001/79271(特别是第9页和/或表1)、WO 2003/59934(特别是表1)、WO 03/060071(特别是表1)和WO 01/079480(特别是表1)(在此将其全文并入作为参考)还含有可以与白蛋白或其片段融合的生物活性、治疗性、预防性(包括疫苗)、诊断性、显影或其他有益的多肽，这些实施例也适用于本发明。

使用基因或化学融合的白蛋白的优势在于，促成融合的任一或全部分子可以相对于未融合的分子具有改善的特性(Balan等人(2006),Antivir Ther 11(1):35-45)。白蛋白和白蛋白颗粒对于将药物和前药携带并释放至其作用位点也十分重要(Kratz,F.(2008),Journal of Controlled Release,132(3),p.171-183)。由于药代动力学特性的提高，例如半衰期延长，融合和颗粒技术提供的给药方案得以改善，并可以提高生物利用性，保护融合的缀合配偶体例如生物活性分子、放射性药物或显影剂不被灭活。

多肽也可以与一种或多种(例如若干种)提纯标签例如(Ala-Trp-Trp-Pro)_n、抗生物素蛋白/链霉亲和素/Strep-标签、FLAG^TM肽(DYKDDDDK)、His-标签融合。

本发明第三方面的其他优选方式包括本发明第一和第二方面的优选方式。技术人员会理解，本发明的任意方面可以与本发明另一方面或多个方面和/或本发明方面的一个或多个(例如若干个)优选方式和/或本文做出的其他公开相结合。

多核苷酸

本发明第四方面提供一种多核苷酸，其编码根据本发明第一、第二或第三方面的多肽。

多核苷酸可以是分离的多核苷酸。多核苷酸可以包括在载体(例如质粒)中和/或在宿主细胞中。

多核苷酸相对于由其表达的宿主可以是或不是密码子优化的。SEQ ID NO.1提供了HSA(SEQ ID NO.2)通常的编码序列。SEQ ID NO.28提供了对于由酿酒酵母表达HSA(SEQID NO.1)进行了密码子优化的编码序列。SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.28可以进行突变，以提供编码根据本发明的多肽的多核苷酸。优选地，多核苷酸是合成和/或重组的。优选地，多核苷酸是分离的多核苷酸。多核苷酸可以编码具有或不具有前导序列的HSA。例如，多核苷酸可以编码具有HSA天然前导序列(SEQ ID NO.3的氨基酸1-24)的HSA或者具有融合前导序列(SEQ ID NO.29的氨基酸1-24)的HSA。

多核苷酸可以提供成包括与一个或多个(例如若干个)控制序列可操作连接的编码本发明多肽的多核苷酸的核酸构建物，上述控制序列在合适的宿主细胞中在与该控制序列相容的条件下指导编码序列的表达。

多核苷酸可以通过多种方式操纵，以提供变体的表达。依赖于表达载体，在将多核苷酸插入到载体之前对其进行操纵可以是合意的或必需的。使用重组DNA方法修饰多核苷酸的技术是本领域公知的。

控制序列可以是启动子序列，其被用于多核苷酸表达的宿主细胞识别。启动子序列含有介导变体表达的转录控制序列。启动子可以是任何在宿主细胞中表现出转录活性的核酸序列，包括突变的、截短的和杂合启动子，并且可以从与宿主细胞同源或异源的编码细胞外或细胞内多肽的基因获得。

在酵母宿主中，可用的启动子获自酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)烯醇酶(ENO-1)、酿酒酵母蛋白酶A(PRA1)、酿酒酵母蛋白酶B(PRB1)、酿酒酵母翻译延长因子(TEF1)、酿酒酵母翻译延长因子(TEF2)、酿酒酵母半乳糖激酶(GAL1)、酿酒酵母醇脱氢酶/甘油醛-3磷酸酯脱氢酶(ADH1，ADH2/GAP)、酿酒酵母磷酸丙糖异构酶(TPI)、酿酒酵母金属硫蛋白(CUP1)和酿酒酵母3-磷酸甘油酯激酶的基因。其它可用于酵母宿主细胞的启动子记载于Romanos等人,1992,Yeast 8:423-488。

技术人员知晓可用于大米和哺乳动物细胞例如CHO或HEK的启动子。在大米宿主中，可用的启动子获自花椰菜花叶病毒35S RNA基因(CaMV35S)、玉米酒精脱氢酶(Adh1)和αAmy3。

在哺乳动物宿主细胞例如CHO或HEK中，可用的启动子获自巨细胞病毒(CMV)和CAG杂交启动子(CMV早期增强子元件和鸡β-肌动蛋白启动子的杂交)、猴空泡病毒40(SV40)。

控制序列也可以是合适的转录终止子序列，其由宿主细胞识别，以终止转录。终止子序列与编码变体的多核苷酸的3’-端可操作连接。可以使用任何在宿主细胞中发挥作用的终止子。

优选的酵母宿主细胞的终止子获自酿酒酵母烯醇酶、酿酒酵母细胞色素C(CYC1)、酿酒酵母醇脱氢酶(ADH1)和酿酒酵母甘油醛-3磷酸酯脱氢酶的基因。其它可用于酵母宿主细胞的终止子由Romanos等人,1992,同上描述。技术人员知晓可用于大米和哺乳动物细胞例如CHO或HEK的终止子。例如，在大米宿主中，优选的终止子获自根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)胭脂碱合成酶(Nos)和花椰菜花叶病毒35S RNA基因(CaMV35S)。

控制序列也可以是合适的前导序列——对于宿主细胞翻译来说非常重要的mRNA的未翻译区。前导序列与编码变体的多核苷酸的5’-端可操作连接。可以使用任何在宿主细胞中发挥作用的前导序列。

适合于酵母宿主细胞的前导序列获自酿酒酵母烯醇酶(ENO-1)、酿酒酵母3-磷酸甘油酯激酶、酿酒酵母α-因子和酿酒酵母醇脱氢酶/甘油醛-3磷酸酯脱氢酶(ADH2/GAP)的基因。

控制序列也可以是聚腺苷酸化序列——与变体编码序列的3’-端可操作连接的序列，其在转录时，被宿主细胞识别为在转录的mRNA上增加聚腺苷残基的信号。可以使用任何在宿主细胞中起作用的聚腺苷酸化序列。

Guo和Sherman,1995,Mol.Cellular Biol.15:5983-5990中描述了可用的酵母宿主细胞的聚腺苷酸化序列。

控制序列也可以是信号肽编码区，其编码与变体的N-端连接的信号肽，并指导变体进入细胞分泌途径。多核苷酸编码序列的5’-端可以内在地包含在翻译读框中与编码变体的编码区片段天然连接的信号肽编码序列。另外可选地，编码序列的5’-端可以包含对于编码序列为外源的信号肽编码区。当编码序列并未天然地含有信号肽编码区时，可以需要有外源的信号肽编码区。另外可选地，外源信号肽编码区可以简单地取代天然信号肽编码区，以便提高变体的分泌。但是，可以使用任何指导表达的变体进入宿主细胞分泌途径的信号肽编码区。

可用的酵母宿主细胞的信号肽获自酿酒酵母α-因子和酿酒酵母转化酶的基因。Romanos等人,1992,同上描述了其它可用的信号肽编码序列。技术人员知晓可用于大米和哺乳动物细胞例如CHO或HEK的信号肽。

当信号肽和前肽区二者均存在于变体的N-端时，前肽区的位置紧挨着变体的N-端，信号肽区的位置紧挨着前肽区的N-端。

质粒

本发明第五方面提供一种质粒，其包括本发明第四方面的多核苷酸。质粒可以是基于2微米的质粒，例如WO 2005/061719、WO 2005/061718和WO 2006/067511中所述的质粒(在此将其全部并入作为参考)。质粒可以表现出提高的分子伴侣活性，例如，通过分子伴侣特别是PDI的表达。优选的辅助蛋白质包括PDI1、AHA1、ATP11、CCT2、CCT3、CCT4、CCT5、CCT6、CCT7、CCT8、CNS1、CPR3、CPR6、DER1、DER3、DOA4、ERO1、EUG1、ERV2、EPS1、FKB2、FMO1、HCH1、HRD3、HSP10、HSP12、HSP104、HSP26、HSP30、HSP42、HSP60、HSP78、HSP82、KAR2、JEM1、MDJ1、MDJ2、MPD1、MPD2、PDI1、PFD1、ABC1、APJ1、ATP11、ATP12、BTT1、CDC37、CPR7、HSC82、KAR2、LHS1、MGE1、MRS11、NOB1、ECM10、SCJ1、SSA1、SSA2、SSA3、SSA4、SSB1、SSB2、SSC1、SSE2、SIL1、SLS1、ORM1、ORM2、PER1、PTC2、PSE1、UBC7、UBI4和HAC1或者截短的无内含子的HAC1(Valkonen等人2003,Applied Environ.Micro.,69,2065)。这些辅助蛋白质公开于WO2005/061718、WO 2006/067511和WO 2006/136831中(在此将其全部并入作为参考)。

宿主细胞

本发明第六方面提供一种表达系统例如宿主细胞，其包括根据本发明第四方面的多核苷酸和/或本发明第五方面的质粒。优选地，宿主细胞是哺乳动物细胞，例如人或牛细胞，或者真菌细胞例如酵母细胞。另外可选地，宿主细胞可以是细菌细胞，例如芽孢杆菌(Bacillus)或大肠杆菌(Escherichia coli)，或者病毒细胞，例如杆状病毒，或者植物细胞，例如大米，如水稻(Oryza sativa)。最优选地，细胞是酵母细胞，例如酵母属(Saccharomyces)(例如酿酒酵母)、毕赤酵母(Pichia)或曲霉细胞。

缀合物

本发明的第七方面涉及一种缀合物，其包括缀合配偶体，例如生物活性化合物、放射性药物或显像剂，以及根据本发明第一、第二或第三方面的多肽，其中缀合配偶体通过多肽的有缀合能力的半胱氨酸残基与多肽连接。缀合配偶体可以是生物活性化合物、治疗性、诊断性或显像化合物，例如本文所提到的化合物。缀合物可以包括两个或更多个(若干个，例如，2、3、4、5、6、7、8、9或10个)缀合配偶体，其可以各自不同，和/或可以是相同化合物的多个拷贝。优选地，各个缀合配偶体均通过多肽的有缀合能力的半胱氨酸残基与多肽连接，但缀合配偶体可以通过其他方式连接，例如，通过基因融合或者与非半胱氨酸例如赖氨酸的共价键。

相关方面提供根据本发明的多肽在硫代-白蛋白-缀合物的制造中的用途。

缀合配偶体

术语“缀合配偶体”包括生物活性药剂、显像剂、诊断剂、造影剂、放射性药物或治疗化合物，例如化疗药物和放射性药物。本发明的硫代-白蛋白可以与一个或多个(例如若干个)缀合配偶体缀合。

显影剂、诊断性化合物、造影剂和治疗化合物

诊断剂、显像剂和生物“造影”剂的用途是本领域公知的。诊断剂是任何用作诊断测试一部分(即，与评价测试结果需要的仪器和方法一起使用)的药物产品。诊断剂可以在体内、离体或体外使用。

白蛋白在营养不良的肌肉的受损肌肉纤维中积累的能力已经得以描述。例如，钆-DTPA-白蛋白缀合物可以用作组合诊断和治疗工具，以通过磁共振成像(MRI)观察并检测例如营养不良的肌肉，并用于释放结合在白蛋白上的推定治疗剂，用于有效地靶向营养不良的肌肉(Amthor等人(2004),Neuromuscular Disorders 14912:791-796)。恶性肿瘤常常表现出白蛋白的摄取和代谢增加。已经说明了使用钆-白蛋白缀合物来改善恶性肿瘤的成像，并通过MRI确定对用药物缀合的白蛋白进行治疗敏感的肿瘤(Kiessling等人(2002),Investigative Radiology 37(4):93-198)。

目前的显影剂常常迅速降解，而较持久的显影剂常常有毒性。白蛋白缀合物的使用因为对增加显影剂的半衰期特别有用，因此使得可以在延长的时间内显像。WO 2005/082423(在此并入作为参考)说明了与荧光物质缀合的血清白蛋白用于显像的用途。

本发明的硫代-白蛋白可以与两种或更多种(若干种)选自生物活性药剂、显像剂、诊断剂、治疗化合物和造影剂的分子缀合。

肿瘤(和肌肉退化)表现出白蛋白的摄取提高(EPR：透过和滞留提高)。白蛋白缀合物可以用于增强显像，另外用于评价肿瘤(或其他组织和器官)是否适合于白蛋白缀合的药物。

生物活性化合物

生物活性化合物可以是治疗性或诊断性化合物。治疗性化合物可以是用于癌症化疗的化疗药物。它可以是细胞抑制性或细胞毒性的；它可以是肿瘤抑制剂。

生物活性化合物可以已含有游离硫醇基，例如，含有具有游离硫醇基的半胱氨酸残基的多肽。另外可选地，生物活性化合物可以修饰成含有游离硫醇基。因此，多肽的氨基酸序列可以改变成包括具有游离硫醇基的半胱氨酸残基，或者生物活性化合物可以化学衍生成包括游离硫醇基。

生物活性化合物可以是多肽(蛋白质)，特别是重组蛋白质药物。它可以是用于治疗癌症和其他相关疾病的化疗或放疗药物。

本发明的含有游离硫醇的白蛋白突变蛋白质(硫代-白蛋白)可以经由游离硫醇基、或者如果本发明的白蛋白突变蛋白质含有多于一个游离硫醇则经由多个游离硫醇基，通过本领域已知的方法与至少一种(例如若干种)生物活性化合物缀合。生物活性化合物包括但不限于，肽、多肽或蛋白质(天然的，重组的，或合成的)(Debinski,(2002)CancerInvestigation 20,801-809；O’Keefe和Draper等人,(1985)JBC 260,932-937；Xia等人,(2000)J.Pharmacology Experimental Therapeutics 295,594-600；Kavimandan等人,(2006),Bioconjugate Chem.17,1376-1384；Humphries等人,(1994)J.Tissue CultureMethods 16,239-242；Wenning等人,(1998)Biotech.Bioeng.57,484-496；Yazdi和Murphy,(1994),Cancer Research 54,6387-6394；Weaver和Laske(2003)J.Neuro-Oncology 65,3-13；Widera等人,(2003)Pharmaceutical Research 20,1231-1238；Daniels,T.R.等人(2006)Clinical Immunology 121,159-176及其中包括的参考文献)；治疗性和诊断性药物或化合物(Mishra等人,(2006)J.Drug Targeting 14,45-53；Lim和Shen,(2004)Pharmaceutical Research 21,1985-1992；Fritzer等人,(1996)BiochemicalPharmacology 51,489-493；Lubgan和Jozwiak(2002)Cell.Mol.Biol.Lett.7,98；Daniels,T.R.等人(2006)Clinical Immunology 121,159-176及其中包括的参考文献)；高分子量复合物，其包括但不限于，脂质体、病毒和纳米颗粒(Mishra等人,(2006)J.Drug Targeting14,45-53；Daniels,T.R.等人(2006)Clinical Immunology 121,159-176及其中包括的参考文献)；核酸和放射性核素，包括DNA、RNA(包括siRNA)及其类似物(Lee等人,(2005),Arch.Pharm.Res.28,722-729；Huang等人,(2007)FASEB J.21,1117-1125；Daniels,T.R.等人(2006)Clinical Immunology 121,159-176及其中包括的参考文献)和装置(Humphries,等人,(1994)J.Tissue Culture Methods 16,239-242及其中包括的参考文献)。此外，实体本身可以通过本领域已知的方法修饰。

治疗化合物

治疗化合物的例子包括：4-1BB配体、5-螺旋、人C-C趋化因子、人L105趋化因子、命名为huL105_3的人L105趋化因子、γ-干扰素诱导的单核因子(MIG)、部分CXCR4B蛋白质、血小板碱性蛋白(PBP)、α1-抗胰蛋白酶、ACRP-30同源物、补体成分C1q C、腺样体表达的趋化因子(ADEC)、aFGF、FGF-1、AGF、AGF蛋白质、白蛋白、依托泊苷、血管抑素、炭疽疫苗、脑衰蛋白特异性抗体、antistasin、抗-TGFβ家族抗体、抗凝血酶III、APM-1、ACRP-30、Famoxin、载脂蛋白物种、芳基硫酸酯酶B、b57蛋白质、BCMA、β-血小板球蛋白蛋白质(β-TG)、bFGF、FGF2、凝血因子、BMP加工酶Furin、BMP-10、BMP-12、BMP-15、BMP-17、BMP-18、BMP-2B、BMP-4、BMP-5、BMP-6、BMP-9、骨形态发生蛋白-2、降钙素、钙蛋白酶-10a、钙蛋白酶-10b、钙蛋白酶-10c、癌症疫苗、羧肽酶、C-C趋化因子、MCP2、CCR5变体、CCR7、CCR7、CD11a Mab、CD137、4-1BB受体蛋白质、CD20 Mab、CD27、CD27L、CD30、CD30配体、CD33免疫毒素、CD40、CD40L、CD52 Mab、Cerebus蛋白质、嗜酸细胞活化趋化因子、趋化因子hIL-8、趋化因子hMCP1、趋化因子hMCP1a、趋化因子hMCP1b、趋化因子hMCP2、趋化因子hMCP3、趋化因子hSDF1b、趋化因子MCP-4、趋化因子TECK和TECK变体、成熟和全长的趋化因子样蛋白质IL-8M1、成熟和全长的趋化因子样蛋白质IL-8M10、趋化因子样蛋白质IL-8M3、成熟和全长的趋化因子样蛋白质IL-8M8、成熟和全长的趋化因子样蛋白质IL-8M9、成熟和全长的趋化因子样蛋白质PF4-414、成熟和全长的趋化因子样蛋白质PF4-426、成熟和全长的趋化因子样蛋白质PF4-M2、霍乱疫苗、软骨调节素样蛋白质、c-kit配体、SCF、肥大细胞生长因子、MGF、源自纤维肉瘤的干细胞因子、CNTF及其片段(例如CNTFAx15`(Axokine^TM)、前体和活性形式的凝血因子、胶原蛋白、补体C5 Mab、结缔组织激活蛋白-III、CTAA16.88 Mab、CTAP-III、CTLA4-Ig、CTLA-8、CXCR3、CXC趋化因子受体3、蓝藻抗病毒蛋白-N、Darbepoetin，命名为exodus，命名为huL105_7、DIL-40、脱氧核糖核酸酶、EDAR、EGF受体Mab、ENA-78、内皮细胞抑制素(Endostatin)、嗜酸细胞活化趋化因子(Eotaxin)、上皮细胞中性粒细胞激活蛋白质-78、EPO受体、EPOR、红细胞生成素(EPO)和EPO模拟物、Eutropin、Exodus蛋白质、因子IX、因子VII、因子VIII、因子X和因子XIII、FAS配体抑制蛋白质(DcR3)、FasL、FGF、FGF-12、成纤维细胞生长因子同源因子-1、FGF-15、FGF-16、FGF-18、FGF-3、INT-2、FGF-4、白树毒素、HST-1、HBGF-4、FGF-5、FGF-6、肝素结合分泌转化因子-2、FGF-8、FGF-9、神经胶质激活因子、纤维蛋白原、flt-1、flt-3配体、促卵泡激素α亚基、促卵泡激素β亚基、促卵泡素、分形趋化因子(Fractalkine)、片段、肌原纤维蛋白质肌钙蛋白I、FSH、半乳糖苷酶、半乳凝素-4、G-CSF、GDF-1、基因治疗、源自神经胶质瘤的生长因子、胰高血糖素、胰高血糖素样肽、葡糖脑苷脂酶、葡糖氧化酶、葡糖苷酶、胎盘蛋白-A、黄体酮相关子宫内膜蛋白质、GM-CSF、促性腺激素、粒细胞趋化性蛋白质-2(GCP-2)、粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子、生长激素、生长相关致癌基因-α(GRO-α)、生长相关致癌基因-β(GRO-β)、生长相关致癌基因-γ(GRO-γ)、hAPO-4、TROY、hCG、乙型肝炎表面抗原、乙型肝炎疫苗、HER2受体Mab、水蛭素、HIV gp120、HIV gp41、HIV抑制剂肽、HIV抑制剂肽、HIV抑制剂肽、HIV蛋白酶抑制肽、HIV-1蛋白酶抑制剂、HPV疫苗、人6CKine蛋白质、人Act-2蛋白质、人脂肪形成抑制因子、人B细胞刺激因子-2受体、人β-趋化因子H1305(MCP-2)、人C-C趋化因子DGWCC、人CC趋化因子ELC蛋白质、人CC型趋化因子白介素C、人CCC3蛋白质、人CCF18趋化因子、命名为SLC的人CC-型趋化因子蛋白质(次级淋巴样趋化因子)、人趋化因子β-8短形式、人趋化因子C10、人趋化因子CC-2、人趋化因子CC-3、人趋化因子CCR-2、人趋化因子Ckβ-7、人趋化因子ENA-78、人嗜酸细胞活化趋化因子、人趋化因子GROα、人趋化因子GROα、人趋化因子GROβ、人趋化因子HCC-1、人趋化因子HCC-1、人趋化因子I-309、人趋化因子IP-10、人趋化因子L105_3、人趋化因子L105_7、人趋化因子MIG、人趋化因子MIG-β蛋白质、人趋化因子MIP-1α、人趋化因子MIP1β、人趋化因子MIP-3α、人趋化因子MIP-3β、人趋化因子PF4、人趋化因子蛋白质331D5、人趋化因子蛋白质61164、人趋化因子受体CXCR3、人趋化因子SDF1α、人趋化因子SDF1β、人趋化因子ZSIG-35、人Chr19Kine蛋白质、人CKβ-9、人CX3C 111氨基酸趋化因子、人DNAX白介素-40、人DVic-1C-C趋化因子、人EDIRF I蛋白质序列、人EDIRF II蛋白质序列、人嗜曙红细胞CC型嗜酸细胞活化趋化因子、人嗜酸性粒细胞表达的趋化因子(EEC)、人快速抽搐骨骼肌肌钙蛋白C、人快速抽搐骨骼肌肌钙蛋白I、人快速抽搐骨骼肌肌钙蛋白亚基C、人快速抽搐骨骼肌肌钙蛋白亚基I蛋白质、人快速抽搐骨骼肌肌钙蛋白亚基T、人快速抽搐骨骼肌肌钙蛋白T、人胎儿脾表达的趋化因子、FSEC、人GM-CSF受体、人gro-α趋化因子、人gro-β趋化因子、人gro-γ趋化因子、人IL-16蛋白质、人IL-1RD10蛋白质序列、人IL-1RD9、人IL-5受体α链、人IL-6受体、人IL-8受体蛋白质hIL8RA、人IL-8受体蛋白质hIL8RB、人IL-9受体蛋白质、人IL-9受体蛋白质变体#3、人IL-9受体蛋白质变体片段、人IL-9受体蛋白质变体片段#3、人白介素1δ、人白介素10、人白介素18、人白介素18衍生物、人白介素-1β前体、人白介素-1β前体、人白介素-1受体辅助蛋白、人白介素-1受体拮抗剂β、人白介素-1型-3受体、人白介素-10(前体)、人白介素-11受体、人白介素-1240kD亚基、人白介素-12β-1受体、人白介素-12β-2受体、人白介素-12p35蛋白质、人白介素-12p40蛋白质、人白介素-12受体、人白介素-13α受体、人白介素-13β受体、人白介素-15、来自克隆P1的人白介素-15受体、人白介素-17受体、人白介素-18蛋白质(IL-18)、人白介素-3、人白介素-3受体、人白介素-3变体、人白介素-4受体、人白介素-5、人白介素-6、人白介素-7、人白介素-7、人白介素-8(IL-8)、人细胞内IL-1受体拮抗剂、人IP-10和HIV-1gp120高变区融合蛋白、人IP-10和人Muc-1核心表位(VNT)融合蛋白、人肝和激活调节的趋化因子(LARC)、人Lkn-1全长和成熟蛋白质、全长和成熟的人乳腺相关趋化因子(MACK)蛋白质、人成熟趋化因子Ckβ-7、人成熟gro-α、用于治疗败血症的人成熟gro-γ多肽、人MCP-3和人Muc-1核心表位(VNT)融合蛋白、人MI10蛋白质、人MI1A蛋白质、人单核细胞化学引诱物因子hMCP-1、人单核细胞化学引诱物因子hMCP-3、人单核细胞趋化性原蛋白(MCPP)序列、人神经趋化因子趋化因子样结构域、人非-ELR CXC趋化因子H174、人非-ELR CXC趋化因子IP10、人非-ELR CXC趋化因子Mig、人PAI-1突变体、具有IL-16活性的人蛋白质、具有IL-16活性的人蛋白质、人次级淋巴样趋化因子(SLC)、人SISD蛋白质、人STCP-1、源自人基质细胞的趋化因子、SDF-1、人T细胞混合淋巴细胞反应表达的趋化因子(TMEC)、人胸腺和激活调节的细胞因子(TARC)、人胸腺表达的人TNF-α、人TNF-β(LT-α)、人CC型嗜酸细胞活化趋化因子3蛋白质序列、人II型白介素-1受体、人野生型白介素-4(hIL-4)蛋白质、人ZCHEMO-8蛋白质、人源化抗-VEGF抗体及其片段、人源化抗-VEGF抗体及其片段、透明质酸酶、ICE 10kD亚基、ICE20kD亚基、ICE 22kD亚基、艾杜糖醛酸-2-硫酸酯酶、艾杜糖醛酸酶、IL-1α、IL-1β、IL-1抑制剂(IL-1i)、成熟IL-1、IL-10受体、IL-11、IL-11、IL-12p40亚基、IL-13、IL-14、IL-15、IL-15受体、IL-17、IL-17受体、IL-19、IL-1i片段、IL1-受体拮抗剂、IL-21(TIF)、含有IL-3的融合蛋白、IL-3突变蛋白质、IL-3变体、IL-4、IL-4突变蛋白质、IL-4突变蛋白质Y124G、IL-4突变蛋白质Y124X、IL-5、IL-5突变蛋白质、Il-5受体、IL-6、Il-6受体、IL-7受体克隆、IL-8受体、IL-9成熟蛋白质变体(Met117形式)、免疫球蛋白或基于免疫球蛋白的分子或任一者的片段(例如，小分子ImmunoPharmaceutical^TM(“SMIP”))或dAb、Fab’片段、F(ab’)2、scAb、scFv或scFv片段)，其包括但不限于纤溶酶原、流感疫苗、抑制素α、抑制素β、胰岛素、胰岛素样生长因子、整合素Mab、间-α胰蛋白酶抑制剂、间-α胰蛋白酶抑制剂、干扰素γ-诱导型蛋白质(IP-10)、干扰素(例如，干扰素α物种和亚物种、干扰素β物种和亚物种、干扰素γ物种和亚物种)、白介素6、白介素8(IL-8)受体、白介素8受体B、白介素-1α、白介素-2受体相关蛋白质p43、白介素-3、白介素-4突变蛋白质、白介素-8(IL-8)蛋白质、白介素-9、白介素-9(IL-9)成熟蛋白质(Thr117形式)、白介素(例如，IL10、IL11和IL2)、日本脑炎疫苗、激肽释放酶(Kalikrein)抑制剂、角质形成细胞生长因子、Kunitz结构域蛋白质(例如，抑肽酶、淀粉样前体蛋白质以及WO 03/066824中所述者，有或没有白蛋白融合物)、LACI、乳铁蛋白、潜在TGF-β结合蛋白质II、瘦素、肝表达的趋化因子-1(LVEC-1)、肝表达的趋化因子-2(LVEC-2)、LT-α、LT-β、黄体化激素、莱姆病疫苗、淋巴细胞趋化因子、源自巨噬细胞的趋化因子类似物MDC(n+1)、源自巨噬细胞的趋化因子类似物MDC-eyfy、源自巨噬细胞的趋化因子类似物MDC-yl、源自巨噬细胞的趋化因子(MDC)、Maspin、蛋白酶抑制剂5、MCP-1受体、MCP-1a、MCP-1b、MCP-3、MCP-4受体、M-CSF、黑色素瘤抑制蛋白质、膜结合蛋白质、Met117人白介素9、MIP-3α、MIP-3β、MIP-γ、MIRAP、修饰的Rantes、单克隆抗体、MP52、突变白介素6S176R、肌纤维收缩性蛋白质肌钙蛋白I、排钠利尿肽、神经生长因子-β、神经生长因子-β2、神经纤毛蛋白-1、神经纤毛蛋白-2、神经趋化因子、神经营养因子-3、神经营养因子-4、神经营养因子-4a、神经营养因子-4b、神经营养因子-4c、神经营养因子-4d、中性粒细胞激活肽-2(NAP-2)、NOGO-66受体、NOGO-A、NOGO-B、NOGO-C、命名为PTEC的新型β-趋化因子、N-端修饰的趋化因子GroHEK/hSDF-1α、N-端修饰的趋化因子GroHEK/hSDF-1β、N-端修饰的趋化因子met-hSDF-1α、N-端修饰的趋化因子met-hSDF-1β、OPGL、成骨蛋白质-1(OP-1)、BMP-7、成骨蛋白质-2、OX40、ACT-4、OX40L、催产素(后叶激素运载蛋白I)、甲状旁腺激素、Patched、Patched-2、PDGF-D、百日咳类毒素(Pertussis toxoid)、垂体表达的趋化因子(PGEC)、胎盘生长因子、胎盘生长因子-2、纤溶酶原激活剂抑制剂-1(PAI-1)、纤溶酶原激活剂抑制剂-2(PAI-2)、源自血小板的生长因子、源自血小板的生长因子Bv-sis、源自血小板的生长因子前体A、源自血小板的生长因子前体B、血小板Mab、源自血小板的内皮细胞生长因子(PD-ECGF)、源自血小板的生长因子A链、源自血小板的生长因子B链、用于治疗败血症的多肽、Preproapolipoprotein“milano”变体、Preproapolipoprotein“paris”变体、前凝血酶(pre-thrombin)、灵长类CC趋化因子“ILINCK”、灵长类CXC趋化因子“IBICK”、胰岛素原、催乳素、催乳素2、神经营养肽(prosaptide)、蛋白酶抑制剂肽、蛋白质C、蛋白质S、凝血酶原、尿激酶原、RANTES、RANTES 8-68、RANTES 9-68、RANTES肽、RANTES受体、重组白介素-16、抵抗素、局限曲菌素(restrictocin)、逆转录病毒蛋白酶抑制剂、蓖麻毒素、轮状病毒疫苗、RSV Mab、皂草毒蛋白、八叠球菌(sarcin)、分泌的跨膜多肽、血清胆碱酯酶、血清蛋白质(例如凝血因子)、可溶性BMP受体激酶蛋白质-3、可溶性VEGF受体、干细胞抑制因子、葡萄球菌疫苗、源自基质的因子-1α、源自基质的因子-1β、物质P(速激肽)、T1249肽、T20肽、T4核酸内切酶、TACI、Tarc、TGF-β1、TGF-β2、Thr117人白介素9、凝血酶、促血小板生成素、促血小板生成素衍生物1、促血小板生成素衍生物2、促血小板生成素衍生物3、促血小板生成素衍生物4、促血小板生成素衍生物5、促血小板生成素衍生物6、促血小板生成素衍生物7、胸腺表达的趋化因子(TECK)、促甲状腺激素、蜱抗凝血肽、Tim-1蛋白质、TNF-α前体、TNF-R、TNF-RII、TNF p75受体、死亡受体、组织纤溶酶原激活物(tPA)、转铁蛋白、转化生长因子β、肌钙蛋白肽、截短的单核细胞趋化性蛋白质2(6-76)、截短的RANTES蛋白质(3-68)、肿瘤坏死因子、尿酸氧化酶、尿激酶、加压素(后叶激素运载蛋白II)、VEGF R-3、flt-4、VEGF受体、KDR、flk-1、VEGF-110、VEGF-121、VEGF-138、VEGF-145、VEGF-162、VEGF-165、VEGF-182、VEGF-189、VEGF-206、VEGF-D、VEGF-E、VEGF-X、血管性血友病因子(von Willebrand’s factor)、野生型单核细胞趋化性蛋白质2、ZTGF-β9。

化疗药物

化疗药物的例子包括：13-顺式-视黄酸、2-CdA、2-氯脱氧腺苷、5-阿扎胞苷(5-Azacitidine)、5-氟脲嘧啶、5-FU、6-巯基嘌呤、6-MP、6-TG、6-硫鸟嘌呤、白蛋白结合型紫杉醇(Abraxane)、放线菌素-D、阿地白介素(Aldesleukin)、阿仑单抗(Alemtuzumab)、ALIMTA、Alitretinoin、全反式视黄酸、α干扰素、六甲蜜胺(Altretamine)、氨甲喋呤(Amethopterin)、氨磷汀(Amifostine)、氨鲁米特(Aminoglutethimide)、阿那格雷(Anagrelide)、阿那曲唑(Anastrozole)、阿糖胞嘧啶(Arabinosylcytosine)、Ara-C、三氧化二砷、天冬酰胺酶、ATRA、阿扎胞苷、BCG、BCNU、贝伐单抗(Bevacizumab)、蓓萨罗丁(Bexarotene)、比卡鲁胺(Bicalutamide)、BiCNU、争光霉素(Bleomycin)、硼替佐米(Bortezomib)、白消安(Busulfan)、C225、甲酰四氢叶酸钙、喜树碱-11、卡培他滨(Capecitabine)、Carac^TM、卡铂(Carboplatin)、卡莫司汀(Carmustine)、卡莫司汀晶片、CC-5013、CCNU、CDDP、CeeNU、西妥昔单抗(Cetuximab)、苯丁酸氮芥(Chlorambucil)、顺铂、嗜橙菌因子、克拉屈滨(Cladribine)、可的松(Cortisone)、CPT-11、环磷酰胺、阿糖胞苷(Cytarabine)、阿糖胞苷脂质体、达卡巴嗪(Dacarbazine)、达克金(Dacogen)、放线菌素(Dactinomycin)、达依泊汀α(DarbepoetinAlfa)、达沙替尼(Dasatinib)、正定霉素(Daunomycin)、柔红霉素(Daunorubicin)、柔红霉素盐酸盐、柔红霉素脂质体、地塞米松(Decadron)、地西他滨(Decitabine)、地尼白介素(Denileukin diftitox)、DepoCyt^TM、地塞米松(Dexamethasone)、地塞米松醋酸盐、地塞米松磷酸钠、Dexasone、右雷佐生(Dexrazoxane)、DHAD、DIC、Diodex、多烯紫杉醇(Docetaxel)、阿霉素(Doxorubicin)、阿霉素脂质体、Droxia、DTIC、 Eligard^TM、Ellence^TM、Eloxatin^TM、表阿霉素(Epirubicin)、阿法依泊汀(Epoetin alfa)、Erbitux^TM、厄洛替尼(Erlotinib)、欧文氏菌L-天冬酰胺酶(Erwinia L-asparaginase)、雌氮芥(Estramustine)、氨磷汀(Ethyol)、依托泊苷(Etoposide)、依托泊苷磷酸盐、依西美坦(Exemestane)、非格司亭(Filgrastim)、氟尿苷(Floxuridine)、氟达拉滨(Fludarabine)、氟尿嘧啶(Fluorouracil)、氟甲睾酮(Fluoxymesterone)、氟他胺(Flutamide)、亚叶酸、氟维司群(Fulvestrant)、G-CSF、吉非替尼(Gefitinib)、吉西他滨(Gemcitabine)、吉妥珠单抗奥佐米星(Gemtuzumabozogamicin)、Gleevec^TM、晶片、GM-CSF、戈舍瑞林(Goserelin)、粒细胞-集落刺激因子、粒细胞巨噬细胞集落刺激因子、 Hexadrol、六甲蜜胺、HMM、Hydrocort 氢化可的松、氢化可的松磷酸钠、氢化可的松琥珀酸钠、磷酸氢可酮(HydrocortonePhosphate)、羟基脲、替依莫单抗(Ibritumomab)、泽娃灵(Ibritumomab Tiuxetan)、伊达比星(Idarubicin)、IFN-α、异环磷酰胺、IL-11、IL-2、甲磺酸伊马替尼、咪唑甲酰胺(Imidazole Carboxamide)、干扰素α、干扰素α-2b(PEG缀合物)、干扰素-2、干扰素-11、Intron (干扰素α-2b)、伊力替康(Irinotecan)、异维甲酸、拉帕替尼(Lapatinib)、L-天冬酰胺酶、LCR、来那度胺(Lenalidomide)、来曲唑(Letrozole)、甲酰四氢叶酸(Leucovorin)、苯丁酸氮芥(Leukeran)、Leukine^TM、亮丙瑞林(Leuprolide)、长春新碱(Leurocristine)、Leustatin^TM、脂质体Ara-C、液体洛莫司汀(Lomustine)、L-PAM、L-Sarcolysin、LupronMaxidex、二氯甲基二乙胺(Mechlorethamine)、二氯甲基二乙胺盐酸盐、甲地孕酮(Megestrol)、甲地孕酮醋酸盐、美法仑(Melphalan)、巯嘌呤(Mercaptopurine)、美司钠(Mesna)、Mesnex^TM、氨甲喋呤(Methotrexate)、氨甲喋呤钠、甲基强的松龙(Methylprednisolone)、丝裂霉素、丝裂霉素-C、米托蒽醌(Mitoxantrone)、MTC、MTX、氮芥(Mustine)、 Mylocel^TM、奈拉滨(Nelarabine)、Neulasta^TM、尼鲁米特(Nilutamide)、氮芥(Nitrogen Mustard)、奥曲肽(Octreotide)、奥曲肽醋酸盐、 Onxal^TM、Oprevelkin、奥沙利铂(Oxaliplatin)、紫杉醇(Paclitaxel)、蛋白质结合的紫杉醇、帕米磷酸二钠(Pamidronate)、帕尼单抗(Panitumumab)、 PEG干扰素、培门冬酶(Pegaspargase)、培非格司亭(Pegfilgrastim)、PEG-INTRON^TM、PEG-L-天冬酰胺酶、PEMETREXED、喷司他丁(Pentostatin)、苯丙氨酸氮芥(Phenylalanine Mustard)、Prednisolone、Prednisone、丙卡巴肼(Procarbazine)、具有卡莫司汀植入物的Prolifeprospan 20、雷洛昔芬(Raloxifene)、利妥昔单抗(Rituximab)、(干扰素α-2a)、红比霉素盐酸盐(Rubidomycin hydrochloride)、Sandostatin 沙格司亭(Sargramostim)、索拉非尼(Sorafenib)、SPRYCEL^TM、STI-571、链脲菌素(Streptozocin)、SU11248、舒尼替尼(Sunitinib)、他莫昔芬(Tamoxifen)、替莫唑胺(Temozolomide)、替尼泊苷(Teniposide)、TESPA、沙利度胺(Thalidomide)、硫鸟嘌呤、Thioguanine Thiophosphoamide、噻替派(Thiotepa)、拓扑替康(Topotecan)、托瑞米芬(Toremifene)、托莫西单抗(Tositumomab)、曲妥单抗(Trastuzumab)、Tretinoin、Trexall^TM、TSPA、VCR、Vectibix^TM、 Viadur^TM、长春花碱(Vinblastine)、长春花碱硫酸盐、Vincasar 长春新碱(Vincristine)、长春瑞滨(Vinorelbine)、长春瑞滨酒石酸盐、VLB、VM-26、伏立诺他(Vorinostat)、VP-16、Zevalin^TM、唑来膦酸(Zoledronic acid)、Zolinza、

放射性药物

放射性药物的例子包括：碳-11、碳-14、铬-51、钴-57、钴-58、铒-169、氟-18、镓-67、金-198、铟-111、铟-113m、碘-123、碘-125、碘-131、铁-59、氪-81m、氮-13、氧-15、磷-32、铼-186、铷-82、钐-153、硒-75、锶-89、锝-99m、铊-201、氚、氙-127、氙-133、钇-90。

显像剂

显像剂的例子包括：钆、磁铁矿、锰、锝、I125、I131、P32、TI201、碘帕醇、PET-FDG。

多核苷酸的制备

本发明第八方面提供一种制造多核苷酸的方法，其包括：

(a)提供编码亲本白蛋白或其片段的核酸分子；和

(b)对核酸分子的核酸序列进行修饰，以编码与人白蛋白、特别是成熟的人白蛋白多肽序列SEQ ID NO.2的残基1-585、或其片段的同一性为至少60％的有缀合能力的多肽，其中至少一个(例如，若干个)与选自SEQ ID NO.2的K93、E294、A226、E230、I271、E358、L24、F49、V54、D56、L66、A92、Q94、E97、H128、F156、E227、D237、K240、D259、K262、N267、Q268、L275、E277、L284、E311、K317、A322、E333、D340、E354、K359、A362、E382和L398特别是K93、E294、A226、E230和I271的位置相当的位置包括有缀合能力的半胱氨酸残基。

适当地，对核酸序列进行修饰包括引入改变，使得将步骤(b)中提供的至少一个(例如，若干个)有缀合能力的半胱氨酸被引入到编码的多肽中。优选的改变如本发明第一和第二方面所述。

优选地，亲本白蛋白包括以下或由其组成：

(a)与SEQ ID NO.2成熟多肽的序列同一性为至少70％的多肽；

(b)由在低严格性条件下与(i)SEQ ID NO.2的成熟多肽编码序列或(ii)(i)的全长补体相杂交的多核苷酸所编码的多肽；

(c)由与SEQ ID NO.2的成熟多肽编码序列的同一性为至少60％的多核苷酸编码的多肽；和/或

(d)SEQ ID NO.2的成熟多肽的片段。

合适地，亲本白蛋白包括SEQ ID NO.2的HSA多肽序列或其变体或片段，或者由其组成。

变体多核苷酸可以由本领域技术人员使用本领域已知的任意诱变方法制备，例如定点诱变、合成基因构建、半合成基因构建、随机诱变、改组(shuffling)等。

定点诱变是在编码亲本的多核苷酸中的一个或多个(例如若干个)指定位点处产生一个或多个(例如若干个)突变(改变)的技术。

定点诱变可以通过PCR在体外实现，涉及到使用含有所需突变的寡核苷酸引物。定点诱变也可以通过盒式(cassette)诱变在体外进行，涉及在包括编码亲本的多核苷酸的质粒中在一位点处通过限制酶切割，随后在多核苷酸中连接含有突变的寡核苷酸。通常，消化质粒和寡核苷酸的限制酶是相同的，允许质粒连接，并插入到另一者中。参见，例如，Scherer和Davis,1979,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 76:4949-4955；和Barton等人,1990,Nucleic Acids Res.18:7349-4966。

定点诱变还可以通过本领域已知的方法在体内实现。参见，例如，美国专利申请第2004/0171154号；Storici等人,2001,Nature Biotechnol.19:773-776；Kren等人1998,Nat.Med.4:285-290；以及Calissano和Macino,1996,Fungal Genet.Newslett.43:15-16。

本发明中可以使用任何定点诱变方法。有许多可以用于制备变体的市售试剂盒。

合成基因构建使得需要在体外合成设计的多核苷酸分子，以编码所关注的多肽。基因合成可以采用多种技术进行，例如Tian等人(2004,Nature 432:1050-1054)所述的基于多重微芯片的技术，以及在可光编程微流体芯片上合成并组装寡核苷酸的类似技术。

使用已知的诱变、重组和/或改组方法，然后通过相关的筛选方法，例如Reidhaar-Olson和Sauer,1988,Science 241:53-57；Bowie和Sauer,1989,Proc.Natl.Acad.Sci.USA86:2152-2156；WO 95/17413或WO 95/22625所公开者，可以进行单个或多个氨基酸的替换、缺失和/或插入，并对其进行测试。其它可以使用的方法包括易错PCR、噬菌体展示(例如，Lowman等人,1991,Biochemistry 30:10832-10837；美国专利第5,223,409号；WO 92/06204)和区域定向诱变(Derbyshire等人,1986,Gene 46:145；Ner等人,1988,DNA 7:127)。

诱变/改组方法可以与高通量自动筛选方法组合，以检测宿主细胞表达的克隆、诱变的多肽的活性(Ness等人,1999,Nature Biotechnology 17:893-896)。诱变的编码活性多肽的DNA分子可以从宿主细胞中回收，并使用本领域标准方法快速测序。这些方法使得人们可以迅速确定多肽中单个氨基酸残基的重要性。

半合成基因构建通过将合成基因构建和/或定点诱变和/或随机诱变和/或改组多方面组合起来实现。半合成构建典型的是通过采用合成的多核苷酸片段与PCR技术组合起来的方法。由此可以从头合成基因的给定区域，而其它区域可以使用位点特异性诱变引物进行扩增，同时另外其它的区域可以进行易错PCR或非易错PCR扩增。然后可以对多核苷酸子序列进行改组。

多肽的制造方法

本发明第九方面提供一种制造本发明的多肽的方法，其包括：

(a)在允许多肽表达的条件下培养根据本发明的宿主细胞；和

(b)从宿主细胞和/或从宿主细胞培养基中回收多肽。

本发明可以进一步包括或不包括确定多肽的受体结合能力和/或缀合能力和/或在溶液中作为单体存在的倾向性，并任选地选择具有或不具有受体结合能力和/或缀合能力和/或选定的百分比范围的单体倾向性的多肽。

本发明的变体可以使用技术人员公知的技术制备。一种方便的方式是：克隆编码亲本白蛋白或其片段的核酸分子，根据本发明第八方面的方法对核酸分子的序列进行修饰，制备合适的基因构建物，其中修饰的核酸分子布置成与合适的调节基因元件例如启动子、终止子、活化位点、核糖体结合位点等操作连接，将基因构建物引入到合适的宿主有机体中，在导致变体表达的条件下培养转化的宿主有机体，和回收变体。所有这些技术均是本领域已知的，并且设计合适的制备根据本发明的具体变体的方法在从业者的技能平均水平以内。

本发明的变体多肽也可以与信号序列连接，以便在培养转化的宿主有机体的过程中使变体多肽分泌至生长培养基中。使变体多肽分泌至生长培养基中通常是有利的，以便易于回收和提纯。多肽可以制备成关于本发明第三方面所述的融合多肽。WO 2009/019314中也已公开了变体多肽的制备技术(并入作为参照)，这些技术也可以应用于本发明。

白蛋白已经在一系列宿主中作为重组蛋白质得以成功表达，这些宿主包括真菌(包括但不限于曲霉属(Aspergillus)(WO 06066595)、克鲁维酵母菌属(Kluyveromyces)(Fleer 1991,Bio/technology 9,968-975)、毕赤酵母属(Pichia)(Kobayashi1998Therapeutic Apheresis 2,257-262)和酵母属(Saccharomyces)(Sleep1990,Bio/technology 8,42-46))，细菌(Pandjaitab 2000,J.Allergy Clin.Immunol.105,279-285)，动物(Barash 1993,Transgenic Research 2,266-276)和植物(包括但不限于土豆和烟草(Sijmons 1990,Bio/technology 8,217；和Farran 2002,Transgenic Research 11,337-346)和大米例如水稻(Oryza sativa))，和哺乳动物细胞例如CHO和HEK。本发明的变体多肽优选在合适的宿主细胞中重组产生。原则上可以使用任何适量产生多肽的宿主细胞，根据本发明选择合适的宿主细胞在从业者的平均技术水平之内。优选的宿主有机体是酵母，优选地选自酵母属，更优选为酿酒酵母。

本发明的变体多肽可以使用已知分离技术例如过滤、离心、色谱和亲和力分离技术等的组合从生长培养基中回收并提纯。使用这些已知分离步骤的特定组合来提纯本发明的变体在从业者的平均技术水平之内。作为可以应用于本发明变体的提纯技术的例子，可以提到的有WO 00/44772的教导。

在本发明的方法中，宿主细胞可以表现出或不表现出提高的分子伴侣活性。因此，本发明还提供本发明的多肽(或蛋白质)的制造方法，该方法包括：(a)提供包括编码上文定义的所选择的蛋白质产品的多核苷酸的本发明的宿主细胞；和(b)使宿主细胞生长(例如，在培养基中培养宿主细胞)；从而产生包括所选择的蛋白质产品的细胞培养物或重组有机体，上述所选择蛋白质产物的水平与以下水平相比较是增加的：在相同条件下使没有进行遗传修饰以导致一种或多种(例如若干种)辅助蛋白质过表达的相同宿主细胞生长(例如培养)而实现的所选择蛋白质产物的制造水平。

使宿主细胞生长的步骤可以包括或不包括使源自多细胞有机体的宿主细胞再生长成多细胞的重组有机体(例如植物或动物)，和任选地，由其产生一代或多代(例如若干代)子代。

硫代-白蛋白可以能够或不能以相对于未修饰白蛋白(例如SEQ ID NO.2)的表达至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或100％的水平由合适的表达系统例如酵母(例如酵母菌，例如酿酒酵母)或曲霉属真菌表达。相对表达水平可以测量如下：例如，通过表达蛋白质，然后通过SDS-PAGE、HPLC或蛋白质免疫印迹法进行定量。相对表达水平可以在至少10升的量级下测定。

该方法可以进一步包括或不包括由培养的宿主细胞、重组有机体或培养基提纯由此表达的所选择的蛋白质产品的步骤。

制造方法可以包括通过多肽的有缀合能力的半胱氨酸残基将缀合配偶体与本发明的多肽连接。合适的缀合方法和缀合配偶体如本文所述。

硫代-白蛋白或者硫代-白蛋白与另一蛋白质或多种蛋白质的融合物可以表达为具有降低的N-连接的糖基化的变体。因此，在HSA的情形中，特别有利的是，使用例如通过基因编码序列的破坏使得参与蛋白质O-糖基化的一种或多种(例如若干种)蛋白质甘露糖基转移酶缺乏的酵母。重组表达的蛋白质可以通过产生宿主细胞经历不希望发生的翻译后修饰。甘露糖基化白蛋白将能够与凝集素伴刀豆球蛋白A结合。酵母产生的甘露糖基化白蛋白的量可以通过使用一种或多种(例如，若干种)PMT基因缺乏的酵母菌株降低(WO 94/04687)。实现这一点最方便的方式是产生基因组中具有缺陷使得产生的Pmt蛋白质之一的水平降低的酵母。例如，在编码序列或调节序列中(或者在调节PMT基因之一的表达的另一基因中)可以存在或不存在缺失、插入或转座，使得产生很少或几乎不产生Pmt蛋白质。另外可选地，酵母可以转化成产生抗-Pmt试剂，例如抗-Pmt抗体。另外可选地，酵母可以在抑制PMT基因之一的活性的化合物的存在下培养(Duffy等人,“Inhibition of proteinmannosyltransferase 1(PMT1)activity in the pathogenic yeast Candidaalbicans”,International Conference on Molecular Mechanisms of Fungal CellWall Biogenesis,26-31 August 2001,Monte Verita,Switzerland,Poster AbstractP38)。如果使用酿酒酵母以外的酵母，破坏一种或多种(例如，若干种)与酿酒酵母的PMT基因相当的基因也是有益的，例如，在毕赤酵母或乳酸克鲁维酵母中。可以使用自酿酒酵母分离的PMT1序列(或任何其他PMT基因)用于鉴别或破坏其他真菌物种中编码类似酶活性的基因。WO 94/04687中说明了乳酸克鲁维酵母PMT1同源物的克隆。

本发明的变体多肽可以用于将治疗有益的化合物(包括预防上有益的化合物例如疫苗)递送至对其有需要的动物或人个体。这种治疗有益的化合物包括，但不限于，用于诊断学例如各种成像技术的标签和容易检出的化合物；药学活性化合物，例如药物或特异性结合的部分例如抗体。甚至可以将本发明的变体与两种或更多种(若干种)不同的治疗有益化合物例如抗体和药物连接，使得组合的分子能够特异性地与期望的靶标结合，从而在该特定靶标处提供高浓度的所连接的药物。

该方法可以进一步包括提纯自宿主细胞和/或自宿主细胞生长培养基中回收的多肽的步骤。提纯步骤任选地包括细胞固定化、细胞分离和/或细胞破碎，但总是包括至少一个(例如若干个)与细胞固定化、细胞分离和/或细胞破碎步骤不同的其他提纯步骤。

本发明的硫代-白蛋白可以通过已经发现可用于提纯这些蛋白质的任意技术自培养基提纯。类似地，细胞分离技术例如离心、过滤(例如交叉流动过滤、膨胀床色谱等)是本领域公知的。类似地，细胞破碎方法包括珠磨法、超声、酶暴露等是本领域公知的。

“至少一个(例如若干个)其他提纯步骤”可以是任何本领域已知的适合用于蛋白质提纯的其他步骤。例如，以下文献中公开了用于回收重组表达的白蛋白的提纯技术：WO92/04367，除去源自基体的染料；EP 464590，除去源自酵母的着色剂；EP 319067，碱性沉淀，以及随后将白蛋白应用于亲脂相；和WO 96/37515、US 5 728 553和WO 00/44772，其对完整的提纯步骤加以说明；在此将其均并入作为参考。合适的方法包括硫酸铵或乙醇沉淀、酸或溶剂萃取、阴离子或阳离子交换色谱、磷酸纤维素色谱、疏水相互作用色谱、亲和力色谱、羟磷灰石色谱、凝集素色谱、浓缩、稀释、pH调节、渗滤、超滤、高效液相色谱(“HPLC”)、反相HPLC、导电性调节等。

多肽可以提纯至商业上或工业上可接受的纯度水平。对于商业上或工业上可接受的纯度水平，我们包括提供其中其他物质(例如，一种或多种(例如若干种)污染物)以低于50％、40％、30％、20％、10％、5％、4％、3％、2％、1％、0.5％、0.1％、0.01％、0.001％、0.0001％、0.00001％或0.000001％的水平、最优选以0％的水平存在的硫代-白蛋白和/或硫代-白蛋白-缀合物。

商业上或工业上可接受的纯度水平可以通过相对粗的提纯方法获得，所选择的蛋白质通过上述方法成为适合于其既定目的的形式。除所选择的蛋白质产品以外，已经提纯至商业上或工业上可接受的纯度水平的蛋白质制剂还可以包括，例如，细胞培养基组分，例如宿主细胞或由其产生的碎片。另外可选地，可以除去或不除去高分子量组分(例如宿主细胞或由其产生的碎片)(例如通过过滤或离心)，以得到包括所选择的蛋白质产品和任选的源自细胞培养过程的功能上可接受水平的低分子量污染物的组合物。

可以将蛋白质提纯或不提纯，以实现药学可接受的纯度水平。如果蛋白质基本上不含热原，并且可以用于既定用途，因此可以在不导致与蛋白质活性无关的医疗效果的情况下以药学上有效的量给药，则蛋白质具有药学可接受水平的纯度。

硫代-白蛋白和/或硫代-白蛋白-缀合物可以以至少10^-4g.L^-1、10^-3g.L^-1、0.01g.L^-1、0.02g.L^-1、0.03g.L^-1、0.04g.L^-1、0.05g.L^-1、0.06g.L^-1、0.07g.L^-1、0.08g.L^-1、0.09g.L^-1、0.1g.L^-1、0.2g.L^-1、0.3g.L^-1、0.4g.L^-1、0.5g.L^-1、0.6g.L^-1、0.7g.L^-1、0.8g.L^-1、0.9g.L^-1、1g.L^-1、2g.L^-1、3g.L^-1、4g.L^-1、5g.L^-1、6g.L^-1、7g.L^-1、8g.L^-1、9g.L^-1、10g.L^-1、15g.L^-1、20g.L^-1、25g.L^-1、30g.L^-1、40g.L^-1、50g.L^-1、60g.L^-1、70g.L^-1、80g.L^-1、90g.L^-1、100g.L^-1、150g.L^-1、200g.L^-1、250g.L^-1、300g.L^-1、350g.L^-1、400g.L^-1、500g.L^-1、600g.L^-1、700g.L^-1、800g.L^-1、900g.L^-1、1000g.L^-1的浓度提供。

本发明的方法可以进一步包括或不包括以下步骤：将提纯的所选择的蛋白质产品与载体或稀释剂一起制剂，和任选地将由此制成的蛋白质呈现为单位剂型。

尽管通过本发明的方法得到的治疗上有用的蛋白质可以单独给药，优选地，其作为药物制剂与一种或多种(例如若干种)可接受的载体或稀释剂一起存在。就与所需蛋白质相容而言，载体或稀释剂必须是“可接受”的。典型地，载体或稀释剂将会是无菌且不含热原的水或盐水。另外可选地，本发明的方法可以进一步包括或不包括将由此提纯的所选择的蛋白质产品冻干的步骤。

硫代-白蛋白可以通过以下文献中给出的策略进行制剂：“Protein Formulationand Delivery”,E.J.McNally(Ed.),Marcel Dekker Inc.出版,New York 2000；和“Rational Design of Stable Protein Formulations–Theory and Practice”；J.F.Carpenter和M.C.Manning(Ed.)Pharmaceutical Biotechnology Vol 13.KluwerAcademic/Plenum Publishers,New York 2002；Yazdi和Murphy,(1994),Cancer Research54,6387-6394；Widera等人,(2003)Pharmaceutical Research 20,1231-1238；Lee等人,(2005),Arch.Pharm.Res.28,722-729。制剂方法的例子如下：

方法#1：提纯之后，本发明的含有游离硫醇的白蛋白突变蛋白质或缀合物可以在含有0.01M-0.25M NaCl的0.01M-0.1M磷酸盐缓冲盐水(pH 7.0-8.0)中在4℃、-20℃或-80℃下储存。

方法#2：提纯之后，本发明的含有游离硫醇的白蛋白突变蛋白质或缀合物可以在含有0.01M-0.25M NaCl、并含有10-20mg/L聚山梨醇酯80的0.01M-0.1M磷酸盐缓冲盐水(pH7.0-8.0)中在4℃、-20℃或-80℃下储存。

方法#3：提纯之后，本发明的含有游离硫醇的白蛋白突变蛋白质或缀合物可以在0.01M-0.25M NaCl(pH 7.0-8.0)中在4℃、-20℃或-80℃下储存。

方法#4：提纯之后，本发明的含有游离硫醇的白蛋白突变蛋白质或缀合物可以在含有10-20mg/L聚山梨醇酯80的0.01M-0.25M NaCl(pH 7.0-8.0)中在4℃、-20℃或-80℃下储存。

冻干制剂

方法#5：提纯之后，本发明的含有游离硫醇的白蛋白突变蛋白质或缀合物可以针对水透析、冷冻干燥并在4℃、-20℃或-80℃下储存。

方法#6：提纯之后，本发明的含有游离硫醇的白蛋白突变蛋白质或缀合物可以针对0.01M-0.25M NaCl(pH 7.0-8.0)透析、冻干并在4℃、-20℃或-80℃下储存。

缀合方法

本发明第十方面提供一种制造本发明第七方面的缀合物的方法，该方法包括将本发明第一、第二或第三方面的多肽或者通过本发明第九方面所制造的多肽通过多肽的有缀合能力的半胱氨酸残基与生物活性化合物连接。连接可以使用连接部分进行。

本发明的白蛋白突变蛋白质(硫代-白蛋白)可以通过本领域已知的方法与一种或多种(例如，若干种)缀合配偶体如生物活性化合物共价连接(例如，以下提供的方法：Pierce,Thermo Fisher Scientific,Rockford,IL,USA；https://tools.lifetechnologies.com/content/sfs/brochures/1602163-Crosslink ing-Reagents-Handbook.pdf)。这些包括，但不限于，将硫醇反应性基团引入或改造到缀合配偶体中或其上，例如，通过引入或改造缀合配偶体上存在的另一游离硫醇；或者通过引入或改造缀合配偶体上的吡啶基二硫基；或者通过引入或改造生物活性化合物上的卤代乙酰基或者通过引入或改造缀合配偶体上的马来酰亚胺基团；或者通过引入或改造缀合配偶体上的硫代磺酸酯基团；或者通过引入或改造缀合配偶体上的乙烯基砜基。例如，但不限于，N-乙基马来酰亚胺(NEM，Pierce)、2-氨基-2’-氨基乙硫醇基磺酸酯(Pierce)、N-β-马来酰亚胺基丙酸(BMPA Pierce)、甲基硫代磺酸甲酯(MMTS，Pierce)、荧光素-5-马来酰亚胺(Pierce)、5-碘乙酰胺基-荧光素(5-IAF，Pierce)或N-[6-7-氨基-4-甲基香豆素-3-乙酰胺基)己基]-3'-[2'-吡啶基二硫代]丙酰胺(AMCA-HPDP，Pierce)。

如果缀合配偶体含有至少一个(例如若干个)硫醇基，则缀合配偶体可以与本发明的白蛋白变体蛋白质通过本领域已知的方法交联，上述方法例如，但不限于，氧化，或者通过使用交联剂，例如，但不限于，1,4-双-马来酰亚胺基丁烷(BMB，Pierce)；1,4-双-马来酰亚胺基-2,3-二羟基丁烷(BMDB，Pierce)；双-马来酰亚胺基己烷(BMH，Pierce)；双-马来酰亚胺基乙烷(BMOE，Pierce)；1,8-双-马来酰亚胺基三乙二醇(BM[PEO]3，Pierce)；1,11-双-马来酰亚胺基四乙二醇(BM[PEO]4，Pierce)；1,4-二-[3’-(2’-吡啶基二硫代)-丙酰胺基]丁烷(DPDPB，Pierce)；二硫代-双-马来酰亚胺基乙烷(DTME，Pierce)；1,6-己烷-双-乙烯基砜(HBVS，Pierce)和三-[2-马来酰亚胺基乙基]胺(TMEA，Pierce)。

如果缀合配偶体不含硫醇反应性基团，则可以通过本领域已知的方法进行化学修饰或基因修饰，将其修饰成引入一个或多个(例如若干个)这样的基团(Chapman,A.P.(2002)Adv.Drug Deliv.Rev.,54531–545；Humphreys,D.P.等人Protein Engineering,Design&Selection vol.20no.5pp.227–234,2007)。尽管这两个参考文献说明了将PEG与抗体或抗体片段内经改造的游离硫醇交联的方法学，该技术可以用于将缀合配偶体与本发明的白蛋白变体蛋白质内的改造游离硫醇交联。另外可选地，可以使用ConjuChem Inc.(Montreal,Quebec,Canada,H2X 3Y8)开发的药物亲和力复合(DAC^TM)技术，如WO 200069902中所述。每个DAC^TM构建物有三个部分：1)药物组分(负责生物活性的部分)；2)与药物组分连接的连接部分；和3)连接部分相对端的反应性化学基团，通常是对硫醇有选择性的软性亲电体；马来酰亚胺是最常用的实施方式。其他可适用的缀合方法描述于WO 2007/071068中，在此将其并入作为参考。

如果缀合配偶体不含硫醇反应性基团，但是含有一个或多个(例如若干个)氨基，则可以通过本领域已知的方法通过化学修饰将其修饰成引入一个或多个(例如若干个)硫醇反应性基团，上述方法例如使用交联剂，例如，但不限于，N-5-叠氮基-2-硝基苯甲酰氧基琥珀酰亚胺(AMAS，Pierce)、N-[β-马来酰亚胺基丙氧基]琥珀酰亚胺酯(BMPS，Pierce)、N-η-马来酰亚胺基己酸(EMCA、Pierce)、N-[η-马来酰亚胺基己酰氧基]琥珀酰亚胺酯(EMCS，Pierce)、N-[η-马来酰亚胺基己酰氧基]磺基琥珀酰亚胺酯(sulfo-EMCS，Pierce)、N-[γ-马来酰亚胺基丁酰氧基]琥珀酰亚胺酯(GMBS，Pierce)、N-[γ-马来酰亚胺基丁酰氧基]磺基琥珀酰亚胺酯(sulfo-GMBS，Pierce)、N-κ-马来酰亚胺基十一烷酸(KMUA，Pierce)、N-[κ-马来酰亚胺基十一烷酰氧基]磺基琥珀酰亚胺酯(sulfo-KMUS，Pierce)、间马来酰亚胺基苯甲酰基-N-羟基琥珀酰亚胺(MBS，Pierce)、间马来酰亚胺基苯甲酰基-N-羟基磺基琥珀酰亚胺酯(sulfo-MBS，Pierce)、N-琥珀酰亚胺基S-乙酰基硫代-乙酸酯(SATA，Pierce)、N-琥珀酰亚胺基S-乙酰基硫代丙酸酯(SATP，Pierce)、琥珀酰亚胺基3-[溴乙酰氨基]丙酸酯(SBAP，Pierce)、N-琥珀酰亚胺基碘乙酸酯(SIA，Pierce)、N-琥珀酰亚胺基[4-碘乙酰基]氨基苯甲酸酯(SIAB，Pierce)、磺基琥珀酰亚胺基[4-碘乙酰基]氨基苯甲酸酯(sulfo-SIAB，Pierce)、琥珀酰亚胺基[4-[N-马来酰亚胺基甲基]环己烷-1-甲酸酯(SMCC，Pierce)、磺基琥珀酰亚胺基[4-[N-马来酰亚胺基甲基]环己烷-1-甲酸酯(sulfo-SMCC，Pierce)、琥珀酰亚胺基-[4-[N-马来酰亚胺基甲基]环己烷-1-羧基-[6-氨基己酸酯(LC-SMCC，Pierce)、4-琥珀酰亚胺基氧基羰基-甲基-α[2-吡啶基二硫代]甲苯(SMPT，Pierce)、磺基琥珀酰亚胺基6-[α-甲基-α-(2-吡啶基二硫代)甲苯酰胺基]己酸酯(sulfo-LC-SMPT，Pierce)、琥珀酰亚胺基4-[对马来酰亚胺基苯基]-丁酸酯(SMPB，Pierce)、磺基琥珀酰亚胺基4-[对马来酰亚胺基苯基]-丁酸酯(sulfo-SMPB，Pierce)、琥珀酰亚胺基-6-[(β-马来酰亚胺基丙酰胺基)己酸酯](SMPH，Pierce)、N-琥珀酰亚胺基3-[2-吡啶基二硫代]丙酸酯(SPDP，Pierce)、琥珀酰亚胺基[3-(2-吡啶基二硫代)丙酰胺基]己酸酯](LC-SPDP，Pierce)、磺基琥珀酰亚胺基[3’-(2-吡啶基二硫代)丙酰胺基]己酸酯(sulfo-LC-SPDP，Pierce)和N-琥珀酰亚胺基-[4-乙烯基磺酰基]苯甲酸酯(SVSB，Pierce)。将某些氨基残基封端可以是有利的，如Kavimandan等人,(2006),Bioconjugate Chem.17,1376-1384所述。

合适的连接部分包括溴马来酰亚胺连接部分，例如，一溴马来酰亚胺连接部分。一溴马来酰亚胺是构建稳定缀合物的下一代马来酰亚胺，如Smith等人Organic&Biomolecular Chemistry,(2015),13,pages 7946-7949所述。优选的一溴马来酰亚胺连接部分包括WO 2011/018611中所述者(在此将其并入作为参考)。

如果缀合配偶体不含硫醇反应性基团，但含有一个或多个(例如若干个)羰基(氧化的碳水化合物)，则可以通过本领域已知的方法通过化学修饰将其修饰成引入一个或多个(例如若干个)硫醇反应性基团，例如，使用交联剂，例如，但不限于N-β-马来酰亚胺基丙酸酰肼(BMPH、Pierce)、N-[η-马来酰亚胺基己酸]酰肼(EMCH，Pierce)、4-[N-马来酰亚胺基甲基]环己烷-1羧基酰肼·HCl·1/2二噁烷(MMCCH，Pierce)、3-马来酰亚胺基苯基硼酸(MPBH，Pierce)、N-[κ-马来酰亚胺基十一烷酸]酰肼(KMUH，Pierce)和3-[2-吡啶基二硫代]丙酰肼(PDPH，Pierce)。

如果缀合配偶体不含硫醇反应性基团，但含有一个或多个(例如若干个)羟基，则可以通过本领域已知的方法通过化学修饰将其修饰成引入一个或多个(例如若干个)硫醇反应性基团，例如，使用交联剂，例如，但不限于，N-[对马来酰亚胺基苯基]异氰酸酯(PMPI，Pierce)。

缔合物

本发明的第十一方面提供一种缔合物，其包括本发明第七方面的缀合物和生物活性、治疗性、预防性、诊断性、成像性或其他有益部分。

缀合物可以进一步以“缔合物”的形式使用。在这一方面，术语“缔合物”是指包括白蛋白变体或其片段的缀合物以及另一通过非共价结合与该缀合物结合或缔合的化合物的化合物。作为这种缔合物的例子，可以提到的有由变体白蛋白缀合物和通过疏水相互作用与白蛋白缔合的脂类组成的缔合物。这种缔合物是本领域已知的，并且可以使用公知的技术制备。作为根据本发明的优选缔合物的例子，可以提到的有包括变体白蛋白缀合物和紫杉烷、紫杉醇或紫杉醇衍生物(例如紫杉酚(palitaxel))的缔合物。缔合物的其它例子包括生物活性、治疗性、预防性(包括疫苗)、诊断性、成像性或其它的有益部分。

缔合物的制备方法是本领域技术人员公知的，例如，HSA与脂类-化合物(通过缔合)的制剂描述于Hussain,R.和Siligardi,G.(2006),International Journal ofPeptide Research and Therapeutics,Vol.12,NO:3,pp.311-315。

纳米颗粒、微颗粒或脂质体

本发明第十二方面提供一种纳米颗粒、微颗粒或脂质体，其包括本发明第一、第二或第三方面的多肽、本发明第七方面的缀合物或本发明第十一方面的缔合物。

白蛋白和白蛋白颗粒对于将药物和前药运载并释放至其作用位点来说非常重要(Kratz(2008),Journal of Controlled Release,132(3),p.171-183)。由于药代动力学特性的提高，例如血浆半衰期延长，融合和颗粒技术提供改善的给药方案，并可以提高生物利用性，保护融合的生物活性分子不被灭活。

将分子并入到纳米或微米颗粒中的技术是本领域已知的。可应用于根据本发明的变体白蛋白缀合物或其缔合物的纳米或微米颗粒的优选制备方法公开于WO 2004/071536或WO2008/007146或Oner&Groves(Pharmaceutical Research,Vol 10(9),1993,第1387-1388页)中，在此将其并入作为参考。优选地，纳米颗粒的平均直径为5-1000nm，更优选5、10、20、30、40、50、80、100、130、150、200、300、400、500、600、700、800、900或999至5、10、20、30、40、50、80、100、130、150、200、300、400、500、600、700、800、900或1000nm。直径小于200nm、更具体地小于130nm的微米颗粒的优势在于，其可经受通过0.2μm(微米)滤膜进行过滤灭菌。优选地，微米颗粒的平均直径为1000nm(1μm(微米))至100μm(微米)，更优选为1、2、5、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100至1、2、5、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100μm(微米)。

本发明的硫代-白蛋白(和/或其缀合形式)可以用于制造纳米颗粒和/或封装在纳米颗粒或脂质体中。

本发明的硫代-白蛋白可以与纳米颗粒和/或脂质体一起使用和/或用于其中和/或作为其使用。目前缀合策略的问题在于保持缀合配偶体的药理学活性和免疫活性二者，例如生物活性靶向配体缀合物。有可能存在蛋白质上能缀合的蛋白质靶向配体或生物活性部分(缀合配偶体)的最大数目，如果超过该数目，靶向配体不保持其生物活性。优选地，与本发明的白蛋白缀合不会降低缀合配偶体的生物活性。

脂质体和纳米颗粒可以用于封装(entrap)生物活性分子。他们提供了改善以下特性的机制：药物例如生物活性化合物的递送，或者被目标细胞摄取，和/或会导致治疗指数增加和/或副作用降低的游离生物活性剂对非目标器官的毒性。此外，某些生物活性化合物(例如紫杉烷)的递送所要求的许多基于溶剂的制剂与毒性相关，这限制了可以给予患者的最大剂量。脂质体和纳米颗粒递送对于这些生物活性化合物来说可以是有利的，因为它们会允许生物活性化合物以更大的量释放，同时避免基于溶剂的制剂的一些毒性(Hawkins等人(2008),Advanced Drug Delivery Reviews,60,8,p876-885)。

用于将靶向配体与脂质体和纳米颗粒连接的方法是本领域已知的(综述于Nobs等人(2004),Journal of Pharmaceutical Sciences Vol 93p1980-1992中)，其可以根据本发明使用。连接方法可以是非共价的或共价的。共价反应似乎是有利的，因为共价连接比非共价方法更加稳定。用于将蛋白质、肽或药物与脂质体表面共价或非共价连接的脂类是市售的(例如，Avanti Polar Lipids Inc Alabaster,Alabama,USA)。有三类主要的官能性类型：通过形成二硫键或硫醚、形成酰胺键、或者生物素/链霉亲和素结合来缀合，任意这些均可以用于本发明。

已经说明了许多依赖于经由硫醚键将配体与脂质体表面共价偶联的方法，最常见的是使用马来酰亚胺与硫醇基的高效反应。常常加在脂质体上并且可以在本发明中使用的官能化的脂质锚(lipid anchors)包括，但不限于，含有马来酰亚胺的那些，例如，N-[4-(对马来酰亚胺基苯基)丁酰胺]-PE(N-MPB]-PE)或N-[4-(对马来酰亚胺基甲基)环己烷-甲酰胺)(MCC-PE)，其使得目标部分经由稳定的硫醚键方便地共价偶联(Martin&Papahadjopoulos(1982),J.Biol.Chem.257,286-288)。

方法#7：提纯之后，本发明的含有游离硫醇的白蛋白变体蛋白质或缀合物可以根据已知的纳米颗粒制备方法配制成纳米颗粒，例如WO 2004/071536 A1和WO 2008/007146A1中所述的方法，在此将其均并入作为参考。

类似地，用于配制纳米颗粒的材料，其包括但不限于聚(乳酸)(PLA)、聚(乳酸-co-乙醇酸)(PLGA)和COOH-PLA，它们是市售的，并可以根据已知的关于纳米颗粒配制的文献用马来酰亚胺或其他已知化学基团进行官能团化。任意这些均可以用于本发明或与其一起使用。

将配体与脂质体共价偶联的另一方便的方式包括将两个硫醇缀合，形成二硫键；但在血清中的还原性条件下，可以优选更加稳定的涉及一个游离硫醇基的缀合化学物质。例如(PDP-PE)的化合物允许经由二硫键进行共价偶联。可以对配体进行修饰，引入游离硫醇基或官能团化的连接部分。本发明的硫代-白蛋白的优势在于不需要配体修饰。但是，配体修饰可以任选地在本发明以外额外使用。

硫醇基在蛋白质中常常不存在，或者不以足量存在或不存在于理想的位置。因此，大多数将一种或多种配体经由硫醚键或二硫键与脂质体共价偶联的情形均需要使用异二官能交联剂(本文中参考缀合所述)。一些异二官能交联剂(例如SPDP和SATA)需要去保护步骤。本发明的硫代-白蛋白克服了该额外处理的要求。

另外可选地，可以通过本领域已知的其他化学方法将硫代-白蛋白与脂质体或纳米颗粒缀合。例如，使用具有与配体的伯胺反应的胺或羧基官能团的官能化脂质锚(例子包括DSPE-PEG-COOH)，硫代-白蛋白可以通过酰胺键附接。也可以使用伯胺与脂质体表面的直接交联。硫代-白蛋白的一个或多个(例如若干个)游离硫醇基则可用于与另一缀合配偶体缀合。

缀合之后，缀合配偶体(例如生物活性分子)可以表现出其活性(例如生物活性)的降低。通过提供缀合物、纳米颗粒和/或脂质体，其中缀合配偶体相对于硫代-白蛋白的位置和/或方向使得缀合配偶体保持其未缀合活性的至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或100％，本发明所述的硫代-白蛋白克服了这一问题。

纳米颗粒可以用于，例如，血管生成应用、抗血管生成应用，及用于涂覆医学装置例如支架。纳米颗粒有效地靶向例如非紧密连接处，因此，可以用于靶向肿瘤例如癌性肿瘤。由于纳米颗粒特别易于被吞噬细胞吞噬并呈递，纳米颗粒还可以用于靶向抗原，以激发免疫反应。本发明提供仅有根据本发明的硫代-白蛋白的纳米颗粒，其中硫代-白蛋白可以与部分(缀合配偶体)缀合或不缀合。本发明还提供这样的纳米颗粒，其包括可以与部分缀合或不缀合的根据本发明的硫代-白蛋白，以及一种或多种(例如若干种)可以与白蛋白相关或不相关的其他纳米颗粒组分。在优选的实施方式中，根据本发明的硫代-白蛋白包括至少两个位于多肽表面上的有缀合能力的半胱氨酸残基。这样的硫代-白蛋白可以用于制备纳米颗粒，其中一个或多个(例如若干个)有缀合能力的半胱氨酸残基可以用于形成纳米颗粒，一个或多个(例如若干个)有缀合能力的残基用于与缀合配偶体缀合，例如与生物活性分子缀合。

组合物

本发明第十三方面提供一种组合物，其包括根据本发明的多肽、融合多肽、缀合物、缔合物、纳米颗粒、微颗粒或脂质体和至少一种(例如若干种)药学可接受的载体和/或稀释剂。

本文中关于相应的产品对各种制剂进行了说明。

本发明的相关方面提供一种制造药物成分和/或药物产品的方法，其包括制造根据本发明的硫代-白蛋白，任选地将另外的分子与硫代-白蛋白缀合，任选地将生成的缀合物与药学可接受的稀释剂和/或载体一起配制，和任选地制备单位剂型的产品。

医学用途

本发明第十四方面提供根据本发明的和/或根据本发明的方法制造的多肽、融合多肽、缀合物或者缔合物、纳米颗粒、微颗粒或脂质体用于治疗疾病、病症的治疗和/或诊断的用途。

在此对有关相应产品的各种医学用途进行说明。

此外，在一些实施方式中，硫代-白蛋白或缀合物具有与亲本或对照白蛋白或缀合物相比有变化的FcRn结合亲和力和/或血浆半衰期。这具有以下优势：根据本发明的缀合物、缔合物、纳米颗粒、微颗粒或脂质体的FcRn结合亲和力和/或血浆半衰期可以根据具体的治疗用途而加以选择。半衰期增加的有益效果在于，与使用参照分子或组合物的情形相比较，需要给药的频率较低或者剂量降低(因此副作用较低)。另外可选地，血浆半衰期比参照分子或组合物要短的有益效果在于，与使用参照分子或组合物的情形像比较，可以更高的剂量给药，并且有益效果在于，比起如果使用参照分子或组合物，给予的化合物更加迅速地从赋形剂解除。

例如，对于用于人或动物中显像目的的缀合物、缔合物或融合多肽(其中显像部分的半衰期非常短)，包括HSA的缀合物或融合多肽的血浆半衰期远长于显像目的所需，使用血浆半衰期比其亲本或参照白蛋白或其片段要短的本发明的变体白蛋白或其片段、以提供血浆半衰期对于显像目的来说足够长、但对于从所应用的特定患者的体内清除来说足够短的缀合物或融合多肽将会是有利的。

在另一例子中，对于包含对治疗或减轻对该治疗有需求的患者中的特定病症有效的治疗化合物的缀合物、缔合物或融合多肽来说，使用血浆半衰期比其亲本或参照白蛋白或其片段要长的变体白蛋白或其片段、以提供血浆半衰期较长的缔合物或缀合物或融合多肽将会是有利的，其有益效果在于，与使用亲本或对照白蛋白或其缔合物或其片段的情形相比较，需要给予本发明的缔合物或缀合物或融合多肽的频率会较低，或者剂量降低，副作用较小。例如，本发明提供一种治疗个体中增殖性疾病的方法，其包括对个体施用有效量的根据本发明的缔合物，其中缔合物包括紫杉烷、紫杉醇或紫杉醇衍生物(例如紫杉酚(palitaxel))。

增加半衰期的用途

本发明第十五方面提供本发明任意前述方面定义的多肽用于增加分子半衰期的用途，上述分子例如生物活性药剂、显像剂、诊断剂、造影剂或治疗剂，例如化疗药物或放射性药物。优选地，半衰期相对于单独的分子的半衰期增加至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或至少100％。优选地，半衰期相对于单独的分子的半衰期增加至少2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22小时或者增加至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13或至少14天。

例如，分子的半衰期可以通过以下方式增加：通过将其与本发明任意前述方面定义的多肽缀合，例如经由可缀合的半胱氨酸残基缀合；通过将分子与多肽以基因方式融合；通过将分子与多肽缔合和/或通过将其并入到根据本发明任意前述方面的颗粒中。

发明实施方式

参考以下编号的段落对本发明进行进一步说明：

1.一种有缀合能力的多肽，其包括与人白蛋白、特别是成熟的人白蛋白多肽序列SEQ ID NO.2的残基1-585、或其片段的同一性为至少70％的氨基酸序列；

其中至少一个(例如，若干个)与选自SEQ ID NO.2的K93、E294、A226、E230、I271、E358、L24、F49、V54、D56、L66、A92、Q94、E97、H128、F156、E227、D237、K240、D259、K262、N267、Q268、L275、E277、L284、E311、K317、A322、E333、D340、E354、K359、A362、E382和L398、特别是K93、E294、A226、E230和I271的位置相当的位置包括有缀合能力的半胱氨酸残基；并且

优选地，其中有缀合能力的多肽在溶液中作为单体存在的倾向性是多肽SEQ IDNO.2在溶液中作为单体存在的倾向性的至少70％。

2.段落1的有缀合能力的多肽，其中多肽包括一个或多个(例如，若干个)：

氨基酸替换，其为在与SEQ ID NO.2的K93、E294、A226、E230、I271、E358、L24、F49、V54、D56、L66、A92、Q94、E97、H128、F156、E227、D237、K240、D259、K262、N267、Q268、L275、E277、L284、E311、K317、A322、E333、D340、E354、K359、A362、E382和L398、特别是K93、E294、A226、E230和I271中的任意残基相当的位置所对应的位置处，将半胱氨酸以外的氨基酸用半胱氨酸替换；和/或

半胱氨酸的插入，其在与SEQ ID NO.2的K93、E294、A226、E230、I271、E358、L24、F49、V54、D56、L66、A92、Q94、E97、H128、F156、E227、D237、K240、D259、K262、N267、Q268、L275、E277、L284、E311、K317、A322、E333、D340、E354、K359、A362、E382和L398、特别是K93、E294、A226、E230和I271中的任意残基相当的位置所对应的氨基酸的N-或C-侧相邻的位置处。

3.段落1或2的有缀合能力的多肽，其中2个、3个、4个、5个或更多个(例如，若干个)与选自SEQ ID NO.2的K93、E294、A226、E230、I271、E358、L24、F49、V54、D56、L66、A92、Q94、E97、H128、F156、E227、D237、K240、D259、K262、N267、Q268、L275、E277、L284、E311、K317、A322、E333、D340、E354、K359、A362、E382和L398、特别是K93、E294、A226、E230和I271的位置相当的位置包括有缀合能力的半胱氨酸残基。

4.任意前述段落的有缀合能力的多肽，其中所述多肽在溶液中作为单体存在的倾向性是多肽SEQ ID NO.2在溶液中作为单体存在的倾向性的至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少100％。

5.任意前述段落的有缀合能力的多肽，其中在2-8℃例如5℃的温度下存储至少7周、在2-8℃例如5℃的温度下存储至少8周、在2-8℃例如5℃的温度下存储至少3个月、在2-8℃例如5℃的温度下存储至少4个月、在2-8℃例如5℃的温度下存储至少6个月或者在大约40℃的温度下存储至少3个月之后，测量多肽在溶液中作为单体存在的倾向性。

6.段落5的有缀合能力的多肽，其中在2-8℃例如5℃的温度下存储至少3个月之后，测量多肽在溶液中作为单体存在的倾向性。

7.段落5或6的有缀合能力的多肽，其中在存储之前，使用三嗪(例如)色谱基质或DE-FF色谱基质对多肽进行提纯。

8.段落5、6或7中任一段的有缀合能力的多肽，其中在存储之前，使用三嗪(例如)色谱基质、然后使用DE-FF色谱基质，对多肽进行提纯。

9.段落5-8中任一段的有缀合能力的多肽，其中，在存储之前，使用三嗪(例如)色谱基质、然后使用DE-FF色谱基质，然后通过尺寸排阻(例如尺寸排阻限(Mr)为约5x10³至2.5x10⁵，例如Sephacryl S-200HR)色谱，对多肽进行提纯。

10.段落5-9中任一段的有缀合能力的多肽，其中存储使用的多肽浓度为0.5-50mg/mL。

11.段落5-10中任一段的有缀合能力的多肽，其中存储使用的多肽浓度为大约5mg/mL。

12.段落5-11中任一段的有缀合能力的多肽，其中存储在大约6.0至大约7.5的pH下。

13.段落5-12中任一段的有缀合能力的多肽，其中存储在大约7的pH下。

14.段落5-13中任一段的有缀合能力的多肽，其中存储使用pH 7.0的包括50mM醋酸铵、10mM辛酸钠的缓冲液，优选多肽浓度为大约0.2至大约2.5mg/mL。

15.段落5-14中任一段的有缀合能力的多肽，其中存储使用pH 6.5的包括25mM磷酸钠、215mM氯化钠的缓冲液，优选多肽浓度为大约5至大约50mg/mL。

16.任意前述段落的有缀合能力的多肽，其中至少一个(例如若干个)与选自SEQID NO.2的K93、E294、A226、E230、I271、E358、L24、F49、V54、D56、A92、Q94、E97、H128、F156、E227、D237、K240、D259、K262、N267、Q268、L275、L284、K317、A322、E333、D340、E354、K359、A362、E382和L398、特别是K93、E294、A226、E230和I271的位置相当的位置包括有缀合能力的半胱氨酸残基；其中在溶液中作为单体存在的倾向性是多肽SEQ ID NO.2在溶液中作为单体存在的倾向性的至少75％。

17.任意前述段落的有缀合能力的多肽，其中氨基酸序列与人白蛋白、特别是成熟的人白蛋白多肽序列SEQ ID NO.2的残基1-585或其片段的同一性为至少95％，并且有缀合能力的多肽在溶液中作为单体存在的倾向性是多肽SEQ ID NO.2在溶液中作为单体存在的倾向性的至少80％。

18.任意前述段落的有缀合能力的多肽，其中在与SEQ ID NO.2的34位相当的位置处是有缀合能力的半胱氨酸。

19.段落1-18中任一段的有缀合能力的多肽，其中在与SEQ ID NO.2的34位相当的位置处没有有缀合能力的半胱氨酸。

20.任意前述段落的有缀合能力的多肽，其中多肽包括两个或更多个(若干个)有缀合能力的半胱氨酸残基，其中，当多肽折叠时，至少一对有缀合能力的半胱氨酸残基之间存在至少的距离。

21.任意前述段落的有缀合能力的多肽，其中多肽在与SEQ ID NO.2的残基K93或E294相当的位置所对应的一个或两个位置处包括将半胱氨酸以外的氨基酸替换成半胱氨酸的替换。

22.任意前述段落的有缀合能力的多肽，其能够以至少90％、优选至少95％的缀合效率与马来酰亚胺-聚乙二醇2-生物素形成缀合物，适当地其中缀合物在受控水解时是至少90％、优选至少95％稳定的。

23.段落22的有缀合能力的多肽，其中与马来酰亚胺-聚乙二醇2-生物素形成缀合物的能力通过在pH 7.4的磷酸盐缓冲盐水中在环境温度下孵育过夜测定。

24.段落22或23的有缀合能力的多肽，其中通过在缓冲盐溶液例如磷酸盐缓冲盐水中在pH 9.0和37℃下孵育至少18小时、优选24小时确定稳定性。

25.一种有缀合能力的多肽，其包括与人白蛋白(SEQ ID NO.2)或其片段的同一性为至少70％的氨基酸序列；

其包括至少一个(例如，若干个)另外的有缀合能力的半胱氨酸，或者至少一个(例如，若干个)改变多肽的FcRn结合亲和力或者改变多肽的血浆半衰期的另外的修饰。

26.段落25的有缀合能力的多肽，其中所述至少一个(例如，若干个)另外的修饰包括至少一个(例如，若干个)如段落1、2、3或21中任一段所定义的另外的有缀合能力的半胱氨酸。

27.任意前述段落的有缀合能力的多肽，其中至少一个(例如，若干个)与选自SEQID NO.2的D1、A2、H3、S5、A55、S58、C75、T76、T79、E82、T83、E86、C91、D121、V122、C124、T125、D129、C169、C177、A229、T236、E266、D269、S270、S273、S304、K313、D314、C316、N318、A320、C361、A364、C369、A371、N386、Q390、Q397、S435、T478、T496、A504、E505、T506、T508、D549、C558、D562、C567、A581、L585和A578的位置相当的位置包括有缀合能力的半胱氨酸。

28.任意前述段落的有缀合能力的多肽，其中多肽包括一个或多个(例如，若干个)：

氨基酸替换，其为在与SEQ ID NO.2的D1、A2、H3、S5、A55、S58、C75、T76、T79、E82、T83、E86、C91、D121、V122、C124、T125、D129、C169、C177、A229、T236、E266、D269、S270、S273、S304、K313、D314、C316、N318、A320、C361、A364、C369、A371、N386、Q390、Q397、S435、T478、T496、A504、E505、T506、T508、D549、C558、D562、C567、A581、L585和A578中的任意残基相当的位置所对应的位置处，将半胱氨酸以外的氨基酸用半胱氨酸替换；和/或

半胱氨酸的插入，其在与SEQ ID NO.2的D1、A2、H3、S5、A55、S58、C75、T76、T79、E82、T83、E86、C91、D121、V122、C124、T125、D129、C169、C177、A229、T236、E266、D269、S270、S273、S304、K313、D314、C316、N318、A320、C361、A364、C369、A371、N386、Q390、Q397、S435、T478、T496、A504、E505、T506、T508、D549、C558、D562、C567、A581、L585和A578中的任意残基相当的位置所对应的氨基酸的N-或C-侧相邻的位置处；和/或

半胱氨酸的缺失或替换，其在与SEQ ID NO.2的C360、C316、C75、C168、C558、C361、C91、C124、C169和C567中任一者对应的位置处，以在C369、C361、C91、C177、C567、C316、C75、C169、C124和C558中任意处产生有缀合能力的半胱氨酸；和/或

半胱氨酸的添加，其在白蛋白序列的N-端残基的N-侧，或者在白蛋白序列的C-端残基的C-侧。

29.任意前述段落的有缀合能力的多肽，其中多肽包括位于以下位置处的有缀合能力的半胱氨酸：(a)A2+L585；(b)A2+A364+D562+L585C；(c)A2以及相邻于白蛋白C-端的C-侧；(d)T79+A364；(e)A364+D1；(f)T79+D562+A364；(g)D562+A364+D1；(h)T79+D562+A364+A504；(i)T79+D562+A364+L585；(j)T79+D562+A364+D1；(k)T79+D562+A364+L585+D1；(l)E86+D562+A364+A504+A2；(m)S270+A581；(n)S270+D129；(o)S270+A581+E82；(p)S270+A581+D129；(q)S270+A581+E82+D129；(r)S270+A581+E82+D129+Q397；(s)C369+C177；(t)A364+A581；(u)T79+A364+A581；(v)A364+A581+D129；(w)A364+C177；(x)D562+C369；(y)D129+C369；(z)A581+C369；或(aa)D562+D129+C369。

30.任意前述段落的有缀合能力的多肽，其包括白蛋白结构域III或其变体以及至少一个(例如，若干个)另外的白蛋白结构域或其片段，例如第二白蛋白结构域III或其变体，或者由其组成。

31.任意前述段落的有缀合能力的多肽，其包括至少一个(例如，若干个)白蛋白结构域III或其变体或片段，或者由其组成，其中至少一个(例如，若干个)白蛋白结构域III在与SEQ ID NO.2中选自以下的位置对应的位置中包括一个或多个(例如，若干个)替换：573、500、550、417、440、464、490、492、493、494、495、496、499、501、503、504、505、506、510、535、536、537、538、540、541、542、574、575、577、578、579、580、581、582和584。

32.段落31的有缀合能力的多肽，其中在与SEQ ID NO.2中的上述位置对应的位置中的一个或多个(例如，若干个)替换选自：K573Y、W、P、H、F、V、I、T、N、S、G、M、C、A、E、Q、R、L、D，K500E、G、D、A、S、C、P、H、F、N、W、T、M、Y、V、Q、L、I、R，Q417A，H440A，H464Q，E492G，D494N、Q、A，E495Q、A，T496A，D494E+Q417H，D494N+T496A，E492G+V493P，P499A，E501A、Q，N503H、K，H510Q，H535Q，K536A，P537A，K538A，K541G、D，D550E、N，E492G+K573P、A，或者E492G/N503H/K573P。

33.任意前述段落的有缀合能力的多肽，其中多肽在两个或更多个(例如，若干个)选自以下位置的位置处包括改变，所述位置与SEQ ID NO.2中的位置(a)492和580；(b)492和574；(c)492和550；(d)550和573；(e)550和574；(f)550和580对应。

34.任意前述段落的有缀合能力的多肽，其包括：(i)包括第一白蛋白的N-端区，所述第一白蛋白是人白蛋白变体，其中第一白蛋白的N-端包括除C-端2-30氨基酸以外的人白蛋白变体的所有氨基酸；和

(ii)第二白蛋白的C-端区，所述第二白蛋白选自猕猴白蛋白、小鼠白蛋白、兔白蛋白、绵羊白蛋白、人白蛋白、山羊白蛋白、黑猩猩白蛋白、仓鼠白蛋白、豚鼠白蛋白、大鼠白蛋白、牛白蛋白、马白蛋白、驴白蛋白、狗白蛋白、鸡白蛋白或猪白蛋白或者其变体，其中第二白蛋白或白蛋白变体的C-端包括第二白蛋白或白蛋白变体的C-端2-30氨基酸；

其中多肽具有(i)与人白蛋白变体相比较有变化的血浆半衰期和/或(ii)与人白蛋白变体相比较有变化的FcRn结合亲和力。

35.任意前述段落的有缀合能力的多肽，其包括：成熟的人白蛋白多肽序列SEQ IDNO.2的结构域I中的一个或多个(例如，若干个)改变；和成熟的人白蛋白多肽序列SEQ IDNO.2的结构域III中的一个或多个(例如，若干个)改变，其中该一个或多个(例如，若干个)改变导致多肽具有变化的FcRn结合亲和力。

36.段落35的有缀合能力的多肽，其中结构域I中的改变选自与SEQ ID NO.2的位置78-120中任一者(例如，78-88位置中的任一者和/或105-120位置中的任一者)对应的位置；结构域III中的改变选自与SEQ ID NO.2的位置425、505、510、512、524、527、531、534、569、573、或575中的任一者对应的位置。

37.段落36的有缀合能力的多肽，其中在与选自SEQ ID NO.2中78-120或425、505、510、512、524、527、531、534、569、573和/或575的位置对应的位置处的改变是替换；并且改变任选地是选自以下的替换：(i)83N、K或S；(ii)111D、G、H、R、Q或E；或(iii)573P、Y、W、H、F、T、I或V。

38.任意前述段落的有缀合能力的多肽，其包括：成熟人白蛋白多肽序列SEQ IDNO.2的结构域II中选自与SEQ ID NO.2中的位置349、342、381、345、384、198、206、340、341、343、344、352、382、348和/或383对应的位置的一个或多个(例如，若干个)改变；其中一个或多个(例如，若干个)改变导致有缀合能力的多肽(i)具有变化的血浆半衰期，和/或(ii)具有变化的FcRn结合亲和力。

39.段落38的有缀合能力的多肽，其中与位置349、342、381、345、384、198、206、340、341、343、344、352、382、348和/或383对应的位置处的改变是替换；并且改变任选地是选自以下的替换：(i)349F、W、Y、H、P、K或Q，优选F；(ii)342Y、W、F、H、T、N、Q、A、C、I、L、P、V，优选Y；(iii)381G或A，优选G；或(iv)345E、H、I或Q。

40.任意前述段落的有缀合能力的多肽，其包括成熟人白蛋白多肽序列SEQ IDNO.2中选自与SEQ ID NO.2中的位置V418、T420、V424、E505、V547、K573对应的位置的一个或多个(例如，若干个)改变；其中一个或多个(例如，若干个)改变导致有缀合能力的多肽(i)具有变化的血浆半衰期，和/或(ii)具有变化的FcRn结合亲和力。

41.任意前述段落的有缀合能力的多肽，其包括成熟人白蛋白多肽序列SEQ IDNO.2中选自与SEQ ID NO.2中以下位置对应的位置的一个或多个(例如，若干个)改变：V381，优选V381N或Q；E383，优选E383A、G、I、L或V；N391，优选N391A、G、I、L或V；Y401，优选Y401D或E；K402，优选K402A、G、I、L或V；L407，优选L407F、N、Q、W或Y；Y411，优选Y411Q或N；K413，优选K413C、S或T；K414，优选K414S或T；V415C，优选V415C、S或T；Q416，优选Q416H或P；V424，优选V424A、G、I、L、N或Q；V426D，优选V426D、E、H或P；G434，优选G434C、S或T；E442，优选E442K或R；R445，优选R445F、W或Y；P447，优选P447S或T；E450，优选E450D或E；S454，优选S454C、M或T；V455，优选V455N或Q；V456，优选V456N或Q；L457，优选L457F、W或Y；Q459，优选Q459K或R；L463，优选L463N或Q；E495，优选E495D；T506，优选T506F、W或Y；T508，优选T508K、R或S；F509，优选F509C、I、L、M、V、W或Y；A511，优选A511F、W或Y；D512，优选D512F、W或Y；T515，优选T515C、H、N、P、Q或S；L516，优选L516F、S、T、W或Y；S517，优选S517C、F、M、T、W或Y；K519，优选K519A、G、I、L或V；R521，优选R521F、W或Y；I523，优选I523A、D、E、F、G、K、L、N、Q、R、V、W或Y；K524，优选K524A、G、I、L或V；K525，优选K525A、G、I、L或V；Q526，优选Q526C、M、S、T或Y；T527，优选T527F、W或Y；E531，优选E531A、G、I、L或V；H535，优选H535D、E或P；K538，优选K538F、W或Y；A539，优选A539I、L或V；K541，优选K541F、W或Y；K557，优选K557A、G、I、L或V；A561，优选A561F、W或Y；T566，优选T566F、W或Y；A569，优选A569H或P；其中一个或多个(例如，若干个)改变导致有缀合能力的多肽(i)具有变化的血浆半衰期，和/或(ii)具有变化的FcRn结合亲和力。

42.任意前述段落的有缀合能力的多肽，其包括成熟人白蛋白多肽序列SEQ IDNO.2中选自与SEQ ID NO.2中以下位置对应的位置的一个或多个(例如，若干个)改变：V547，优选V457A；K573，优选K573P或Y；I523，优选I523A或G；T527，优选T527M；K500，优选K500A；或E505，优选E505Q；其中一个或多个(例如，若干个)改变导致有缀合能力的多肽(i)具有变化的血浆半衰期，和/或(ii)具有变化的FcRn结合亲和力。

43.任意前述段落的有缀合能力的多肽，其包括成熟人白蛋白多肽序列SEQ IDNO.2中选自与SEQ ID NO.2中位置573、523、527或505对应的位置的一个或多个(例如，若干个)改变，优选K573Y；I523G；I523A；T527M；E505Q；或K573P。

44.段落43的有缀合能力的多肽，其包括成熟人白蛋白多肽序列SEQ ID NO.2中选自与以下的位置对应的位置的一个或多个(例如，若干个)改变：K573Y和I523G；K573Y、I523G和T527M；K573Y、E505Q和T527M；K573Y和T527M；K573P和I523G；K573P、I523G和T527M；K573P、E505Q和T527M；K573P和T527M；V547A；V547A和K573P；V547A、E505Q、K573P和T527M；或者K500A和H510Q。

45.段落25-44中任一段的有缀合能力的多肽，其中有缀合能力的多肽在溶液中作为单体存在的倾向性是多肽SEQ ID NO.2在溶液中作为单体存在的倾向性的至少70％，任选为至少75％、至少80％、至少90％、至少95％或至少100％。

46.任意前述段落的有缀合能力的多肽，其中多肽与SEQ ID NO.2的序列同一性为至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、99.2％、99.4％、99.6％、99.8％。

47.任意前述段落的有缀合能力的多肽，其中，当多肽折叠时，存在有至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、并优选所有17个多肽SEQ ID NO.2的天然二硫键。

48.任意前述段落的有缀合能力的多肽，其中多肽进一步包括可以连接有生物活性化合物、放射性药物或显像剂的另外的连接部分。

49.任意前述段落的有缀合能力的多肽，其中提供有缀合能力的半胱氨酸残基的改变导致多肽在人体中的免疫原性是可接受的，优选地，免疫原性相当于或低于野生型HSA(SEQ ID NO.2)的免疫原性。

50.任意前述段落的有缀合能力的多肽，其中提供有缀合能力的半胱氨酸残基的改变对多肽在人体内的免疫原性不产生不利影响，例如相对于野生型HSA(SEQ ID NO.2)的免疫原性。

51.段落49或50的有缀合能力的多肽，其中多肽的免疫原性通过进行T-细胞表位和/或B-细胞表位的筛选而确定或预测。

52.段落50-51中任一段的有缀合能力的多肽，其中多肽的免疫原性通过离体T细胞活性检验来确定或预测。

53.段落52的有缀合能力的多肽，其中T细胞活性检验包括使用增殖检验例如[3H]-胸苷摄取来测量T细胞反应。

54.段落52或53的有缀合能力的多肽，其中多肽在T细胞增殖检验中反应性低于10％，优选反应性低于8％、6％、4％或2％，最优选0％。

55.段落52-54中任一段所述的有缀合能力的多肽，其中T细胞活性检验包括使用细胞因子分泌检验例如IL-2ELISpot测量T细胞反应。

56.段落55的有缀合能力的多肽，其中多肽在细胞因子分泌检验中反应性低于10％，优选反应性低于8％、6％、4％或2％，最优选0％。

57.段落49-56中任一段的有缀合能力的多肽，其中多肽在T细胞增殖检验和细胞因子分泌检验中的反应性低于10％。

58.任意前述段落的有缀合能力的多肽，其中多肽在人体内不刺激不利的抗体反应。

59.一种融合多肽，其包括任意前述段落的有缀合能力的多肽和融合配偶体多肽。

60.一种多核苷酸，其编码段落1-59中任一段所述的多肽。

61.一种质粒，其包括段落60的多核苷酸。

62.一种宿主细胞，其包括段落60的多核苷酸和/或段落61的质粒。

63.段落62的宿主细胞，其为酵母细胞，特别是酿酒酵母细胞。

64.一种缀合物，其包括生物活性化合物、放射性药物或显影剂和根据段落1-59中任一段的多肽，其中生物活性化合物是与多肽通过多肽的有缀合能力的半胱氨酸残基连接的放射性药物或显影剂。

65.段落的64的缀合物，其进一步包括一种或多种(例如，若干种)另外的生物活性化合物、放射性药物或显像剂，各生物活性化合物、放射性药物或显像剂均通过多肽的有缀合能力的半胱氨酸残基与多肽连接。

66.一种制造段落60的多核苷酸的方法，其包括：

(a)提供编码亲本白蛋白或其片段的核酸分子；和

(b)对核酸分子的核酸序列进行修饰，以编码与人白蛋白、特别是成熟的人白蛋白多肽序列SEQ ID NO.2的残基1-585或其片段的同一性为至少70％的有缀合能力的多肽，其中至少一个与选自SEQ ID NO.2的K93、E294、A226、E230、I271、E358、L24、F49、V54、D56、L66、A92、Q94、E97、H128、F156、E227、D237、K240、D259、K262、N267、Q268、L275、E277、L284、E311、K317、A322、E333、D340、E354、K359、A362、E382和L398特别是K93、E294、A226、E230和I271的位置相当的位置包括有缀合能力的半胱氨酸残基。

67.一种制造段落1-59中任一段的多肽的方法，其包括：

(a)在使多肽得以表达的条件下培养段落62或63的宿主细胞；和

(b)从宿主细胞和/或宿主细胞生长培养基中回收多肽。

68.段落67的方法，其中宿主细胞表达出提高的分子伴侣活性。

69.段落67或68的方法，其进一步包括对步骤(b)中得到的多肽进行提纯。

70.一种制造段落64或65的缀合物的方法，其包括将段落1-59中任一段的多肽或者通过段落67-69中任一段的方法制造的多肽通过多肽的有缀合能力的半胱氨酸残基与生物活性化合物、放射性药物或显像剂连接。

71.一种缔合物，其包括段落64或65的缀合物和生物活性、治疗性、预防性、诊断性、显像性或其他的有益部分。

72.一种纳米颗粒或微颗粒或脂质体，其包括段落1-59中任一段的多肽、段落64或65的缀合物或者段落71的缔合物。

73.一种组合物，其包括段落64或65的缀合物、段落71的缔合物或者段落72的纳米颗粒或微颗粒或脂质体以及至少一种(例如，若干种)药学可接受的载体或稀释剂。

74.段落64或65的缀合物、段落71的缔合物、段落72的纳米颗粒或微颗粒或脂质体、或者段落73的组合物，其中生物活性分子、放射性药物或显影剂选自本文所述的那些。

75.段落64、65或74的缀合物、或段落71的缔合物、段落72的纳米颗粒或微颗粒或脂质体，其用于治疗疾病、治疗病患和/或用于诊断。

76.段落1-59中任一段所定义的多肽用于增加生物活性分子、放射性药物或显影剂的半衰期的用途。

本发明通过一下实施例进行进一步的说明，这些实施例不应当理解成对本发明的范围加以限定。

实施例

实施例1：变体的制备

制备特异性HSA变体表达质粒

使用标准的分子生物学技术，使用若干种技术实施HSA变体的表达方法，例如，如Sambrook,J.和D.W.Russell,2001(Molecular Cloning:a laboratory manual,第三版.Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,N.Y)中所述。

方法1：

使用诱变正向引物和非诱变反向引物(表3)，将单个氨基酸突变(K93C、A226C、E230C、I271C、E294C和E358C)引入到pDB5155质粒(编码突变的C34A HSA，SEQ ID NO.30)中。使用诱变正向引物和非诱变反向引物(表3)，产生基于质粒pDB5102的编码C34A突变体的pDB5155。pDB5102如WO 2015/036579中所述。甲基化模板DNA制备如下：将大约1.7μg质粒DNA与5μL 10x缓冲液(50mM Tris-HCl mMβ-巯基乙醇、10mM EDTA，25℃下pH 7.5，NewEngland Biolabs)、1μL dam甲基转移酶(New England Biolabs)、12.5μL s-腺苷甲硫氨酸(New England Biolabs，最终浓度80μM)和水混合至最终体积50μl，在37℃下孵育1.5小时。然后使用QIAquick PCR提纯试剂盒(Qiagen)根据制造商说明书对反应混合物进行提纯。PCR反应中使用相关引物(表4和表5所示)，使用dam-甲基化pDB5102作为模板，使用Q5DNA聚合酶(New England Biolabs)。通过将5μl PCR产物在1％TBE琼脂糖胶上进行分析，确认质粒的扩增。将其余PCR产物补充以5μl缓冲液4(50mM醋酸钾、20mM Tris-醋酸盐、10mM醋酸镁、1mM DTT、25℃下pH 7.9，New England Biolabs)和1μl DpnI酶，然后在37℃下孵育2小时。然后使用QIAquick PCR提纯试剂盒(Qiagen)根据制造商说明书对反应混合物进行提纯。将1μl提纯的质粒转化到大肠杆菌(E.coli)10-β细胞(New England Biolabs)中，并平板接种在补充有50μg/mL氨苄青霉素的LB板上(5g/L酵母提取物，10g/L来自酪蛋白的蛋白胨，10g/L NaCl，12g/L琼脂(Millers LB琼脂，Merck Millipore))。使用Qiagen PlasmidPlus试剂盒(Qiagen，根据制造商说明书)将质粒分离，并对其进行测序，以确认HSA序列中所需突变的存在以及将质粒命名为pDB5155。

甲基化pDB5155模板DNA制备如下：将大约3.0μg质粒DNA与5μL 10x缓冲液(50mMTris-HCl mMβ-巯基乙醇、10mM EDTA，25℃下pH 7.5，New England Biolabs)、1μL dam甲基转移酶(New England Biolabs)、12.5μL 80μM s-腺苷甲硫氨酸(New England Biolabs，最终浓度80μM)和水混合至最终体积50μl，在37℃下孵育2小时。然后使用QIAquick PCR提纯试剂盒(Qiagen)根据制造商说明书对反应混合物进行提纯。

PCR反应中使用相关引物(表4和表5所示)，使用dam-甲基化pDB5155作为模板，使用Q5DNA聚合酶(New England Biolabs)。

表3.突变密码子加下划线的用于诱变扩增的寡核苷酸(R＝反向，F＝正向)和产生的蛋白质

表4.PCR反应组分

模板(5ng/μL)	1μL	正向引物(10μM)	2.5μL
				5x缓冲液	10μL	反向引物(10μM)	2.5μL
dNTP(2.5mM)	1μL	Q5聚合酶	0.5μL
				无菌水	32.5μL

表5.PCR反应条件

通过将5μl PCR产物在1％TBE琼脂糖胶上进行分析，确认质粒的扩增。将其余PCR产物补充以4μl缓冲液4(50mM醋酸钾、20mM Tris-醋酸盐、10mM醋酸镁、1mM DTT、25℃下pH7.9，New England Biolabs)和1μl DpnI酶，然后在37℃下孵育1小时。然后使用QIAquick96PCR提纯试剂盒(Qiagen)根据制造商说明书对反应混合物进行提纯。将2μl提纯的质粒转化到感受态大肠杆菌DH5-α细胞上，并在补充有50μg/mL氨苄青霉素的1.2mL LB培养基(1％w/v细菌学胰蛋白胨，0.5％w/v酵母提取物，0.5％w/v NaCl)中在96深孔板中生长，以修复DNA骨架上的缺口。使用QiaPrep 96turbo微制备试剂盒(Qiagen，根据制造商说明书)分离质粒。硫代-白蛋白构建物如表6详述。

制备质粒DNA，用于转化到酿酒酵母中，如WO 2015/036579所述(在此并入作为参考)，见方法4，不同之处在于使用来自pDB4164的9723bp Acc65I-BamHI片段作为缺口的载体片段来代替来自pDB3936的9721bp片段，其具有两个紧接着BamHI位点的额外的碱基GC，以产生NotI限制性酶切位点(额外的碱基为黑体)。pDB3936描述于WO 2011/124718中(在此将其并入作为参考)。pDB4164与pDB3936的不同之处还在于，其在Acc65I和BamHI位点之间含有1368bp序列，含有通过Acc65I和BamHI消化、不用于缺口修复转化的安普霉素抗性可选择标记。用于构建物的宿主菌株是酿酒酵母BXP10cir⁰(WO 2015/036759，在此将其并入作为参考)。将转化的细胞作为单个菌落在选择性琼脂板(BMMD+CSM-Leu或BMMD)上生长，由其挑出分离的菌落，也在选择性琼脂板上生长，用于制备冻存的酵母储液和用于分析的样品。冻存的储液由混合有等体积40％[w/v]海藻糖的5mL 48小时BMMD+CSM-Leu摇瓶培养物制成，将1mL等份转移至冷冻小瓶用于在-80℃下存储。在48-孔微量滴定板孔中的0.5mL BMMD中接种来自点种板(patch plate)的酵母，在30℃震摇下生长4天，如WO2015/036579方法4中所述(在此并入作为参考)。摇瓶培养物由海藻糖储液接种。由摇瓶提纯这些变体如WO 2012/150319中所述(在此将其并入作为参考)。

用于L24C、F49C、V54C、D56C、L66C、A92C、Q94C、E97C、H128C、F156C、E227C、D237C、K240C、D259C、K262C、N267C、Q268C、L275C、E277C、L284C、E311C、K317C、A322C、E333C、D340C、E354C、K359C、A362C、E382C和L398C(所有均在C34A背景下)的表达质粒的制备略不同于上文所述：

使用诱变正向引物和非诱变反向引物(表3)将单个氨基酸突变引入到pDB5155质粒(编码突变的C34A HSA，SEQ ID NO.30)中。

甲基化模板DNA制备如下：将大约2.5μg质粒DNA与5μL 10x缓冲液(50mM Tris-HClmMβ-巯基乙醇、10mM EDTA，25℃下pH 7.5，New England Biolabs)、1μL dam甲基转移酶(New England Biolabs)、12.5μL 80μM s-腺苷甲硫氨酸(New England Biolabs，最终浓度80μM)和水混合至最终体积50μl，在37℃下孵育1小时。然后使用QIAquick PCR提纯试剂盒(Qiagen)根据制造商说明书对反应混合物进行提纯。

PCR反应中使用相关引物(如上表4和5所述)，使用dam-甲基化pDB5155作为模板，使用Q5DNA聚合酶(New England Biolabs)。

通过将5μl PCR产物在1％TBE琼脂糖胶上进行分析，确认质粒的扩增。将其余PCR产物补充以4μl缓冲液4(50mM醋酸钾、20mM Tris-醋酸盐、10mM醋酸镁、1mM DTT、25℃下pH7.9，New England Biolabs)和1μl DpnI酶，然后在37℃下孵育1小时。然后使用QIAquick96 PCR提纯试剂盒(Qiagen)根据制造商说明书对反应混合物进行提纯。将1μl提纯的质粒转化到感受态大肠杆菌DH5-α细胞上，并在补充有50μg/mL氨苄青霉素的1.2mL LB培养基(1％w/v细菌学胰蛋白胨，0.5％w/v酵母提取物，0.5％w/v NaCl)中在96深孔板中生长，以修复DNA骨架上的缺口。使用QiaPrep 96turbo微制备试剂盒(Qiagen，根据制造商说明书)分离质粒。硫代-白蛋白构建物如表6详述。

制备质粒DNA，用于转化到酿酒酵母中，如WO 2015/036579所述(在此并入作为参考)，见方法4。用于构建物的宿主菌株是酿酒酵母DYB7(Payne等人(2008)Applied andEnvironmental Microbiology Vol 74(24):7759-7766)。酵母微滴定板生长与WO 2015/036579所述方法的不同之处在于，转化重复进行两次，初始的生长为2天。通过将50μl培养物转移至含有50μl 40％(w/v)海藻糖的新鲜微滴定板由2天的生长而产生储液。另外将50μl 2天的培养物加入至含有450μL BMMD+CSM-leu的新鲜微滴定板，在30℃下再震摇(200rpm，Eppendorf Innova 44孵育振动器中密封室中100％湿度下，2.5cm轨道)孵育4天。通过在3000rpm下离心5分钟，收获培养上清液，将375μl上清液转移至新鲜的48孔微量滴定板。

制造表达质粒和酵母储液

表达质粒的制备的酿酒酵母的转化如WO 2011/051489和WO 2012/150319中所述通过48小时震摇法进行(在此将其并入作为参考)，使用等体积培养物和海藻糖。用于构建物的宿主菌株为酿酒酵母BXP10 Cir⁰(WO 2015/036759，在此并入作为参考)。除非另外指出，从摇瓶中提纯变体如WO 2012/150319中所述进行。

产生的白蛋白变体总结于表6中。

表6.

实施例2.DTNB孵育的硫代-白蛋白变体的硫醇测定

使用微量滴定板(MTP)生长的培养物小规模测定硫醇白蛋白变体的游离硫醇含量。测试的硫醇白蛋白变体包括C34A替换，因此应当缺少天然白蛋白的硫醇基。这样，预计其仅具有一个游离硫醇。

蛋白质上游离硫醇的数目可以使用Ellman试剂通过光谱法测定。Ellman试剂(5’5’-二硫代-双(2-硝基苯甲酸)(DTNB)是芳香性二硫化物，其与硫醇基反应形成混合的蛋白质二硫化物和一摩尔5-硫代-2-硝基苯甲酸(TNB)(每摩尔蛋白质巯基)。该反应还产生溶液中释放的游离TNB的黄色。另外可选地，蛋白质上游离硫醇的数目可以使用用DTNB试剂处理过的蛋白质样品的质谱分析测定。5-硫代-2-硝基苯甲酸(TNB)的分子量为199Da，因此质量增加197Da(TNB减去在与测试蛋白质上游离硫醇基形成二硫键的过程中损失的H₂)表明在蛋白质样品上存在一个游离硫醇基。

将4μl缓冲液2(4mg/mL DTNB，500mM磷酸钠，pH 7.0)加入到96孔MTP形式的200μL测试蛋白质培养物样品中。使制剂在环境温度(20±5℃)孵育25分钟，使TNB进行标记。通过超高效液相色谱质谱(UPLC-MS)测定蛋白质的完整质量。使用Waters Acquity在BEH 50×2.1mm ACQUITY BEH 1.7μmC4柱子上对10μL样品进行UPLC分离，使用5min缓冲液A0.1％甲酸至缓冲液B 100％乙腈0.1％甲酸的分析梯度。将洗脱的蛋白质经由电喷雾离子化(ESI)源直接引入到Bruker MicrOTOF II质谱仪中。使用BioPharma Compass^TM控制所有仪器控制和样品表格。所有数据均在数据分析中在2.9-3.0分钟之间的蛋白质峰的前缘上进行人工处理。这包括使用设定在0.0765Da的高斯平滑算法的频谱平滑化和平坦性0.8的基线校正设定。使用熵最大算法得到去卷积的完整质谱，所有方法和参数均在BioPharmaCompass^TM内设定。

上述硫代-白蛋白样品硫醇分析的结果总结于表7。经DTNB孵育质量增加197Da预计指示着样品中蛋白质上存在一个游离硫醇基。通过MS实际测得质量增加197±15Da被认为指示着正确的质量。所有变体均成功结合一分子TNB。

表7.质谱DTNB硫醇筛选结果

实施例3.硫代-白蛋白变体的聚集筛选

对变体在溶液中保持为单体的倾向性进行测试。每个单体具有单个游离硫醇基。因此，将其与同样具有单个游离硫醇基的野生型HSA比较进行测试。

如WO 2012/150319中所述(在此将其并入作为参考)进行酿酒酵母的摇瓶培养和提纯，并具有以下改良。将BMMS培养基(10mL)以酿酒酵母接种，并在30℃下在200rpm下轨道震摇生长2天。使用等份的各起始培养物(5mL)对2×200mL BMMS培养基进行接种，在30℃下在200rpm下轨道震摇生长5天。通过0.2μm真空滤膜(Nalgene Sterile Top Filter)通过过滤收获细胞，保留上清液用于提纯。

使用单步色谱法由硫代-白蛋白变体制备提纯的材料。提纯步骤使用装有基体(ProMetic BioSciences Ltd,Cambridge UK或Albumedix Ltd(前Novozymes Biopharma UK Ltd))的柱子(床体积大约2mL)。将其用pH 5.3的50mM醋酸钠平衡，并装以净摇瓶培养物上清液，pH大约5.5-6.5，直至大约20mg蛋白质/mL基质。将柱子用大约10柱子体积的各个pH 5.3的50mM醋酸钠和pH 8.0的50mM醋酸铵分别洗涤。结合的蛋白质使用大约10柱子体积的pH 7.0的50mM醋酸铵、10mM辛酸盐洗脱。全程流速为240cm/h，使用AKTA Explorer系统(GE Healthcare)。洗脱物样品体积为大约20mL。洗脱物样品的浓度和单体百分含量通过凝胶渗透高效液相色谱(GP-HPLC)测定。蛋白质浓度使用ShimadzuVP7.3客户服务器软件控制下的安装有UV检测器的LC2010HPLC系统(Shimadzu)测定。将25μL注射到具有6.0mm内径x 40mm长TSK SW保护柱(Tosoh Bioscience)的7.8mm内径x 300mm长的TSK G3000SWXL柱子(Tosoh Bioscience)中。将样品在pH 7.0的25mM磷酸钠、100mM硫酸钠、0.05％(w/v)叠氮化钠中以1mL.min^-1进行色谱分析，运行时间为15分钟。将样品通过280nm下的UV检测通过峰面积相对于浓度已知(10mg/mL)的重组分白蛋白标准品对样品进行定量。

对样品进行再分析，以确定在2-8℃下存储7周后、在2-8℃下存储6个月后单体百分含量的变化。测定每个样品在相同存储条件下相对于其野生型对照的单体百分含量(括弧中)。结果总结于表8A。最终洗脱物浓度范围为0.6-1.2mg/mL，结果提纯后回收12-24mg蛋白质。所有变体的单体百分含量在T＝0时等于或高于野生型对照，其单体百分含量为87％。对于至少4种变体观察到，在2-8℃下存储7周，变体保持其单体蛋白质百分含量，在2-8℃下存储6个月没有聚集倾向的显著证据。

表8A.GPHPLC聚集筛选结果

ND:未测定

使用之前在实施例3中所述的方法对另外的变体进行分析，或者另外可选地使用Agilent 1260等度UHPLC(超高效液相色谱)仪。对于UHPLC方法，将4μL注射到4.6mm id×150mm长BEH的1.7μm柱子(Waters)中，使用实施例3所述的流动相，以0.5mL.min^-1，运行5分钟时间。通过280nm下的UV检测通过相对于浓度已知(10mg/mL)的重组人白蛋白标准品的峰高对样品进行定量。

在2-8℃下存储8周后，以及在2-8℃下存储4个月后，对样品进行再分析，以确定单体百分含量的变化。测定每个样品在相同存储条件下相对于其野生型对照的单体百分含量(括弧中)。结果总结于表8B。最终的洗脱物浓度范围为0.1-1.0mg/mL，结果提纯之后回收2-20mg蛋白质。大多数变体的单体百分含量在T＝0时等于或高于野生型对照，其单体百分含量为86％。观察到这些变体在2-8℃下存储8周保持其单体蛋白质，在2-8℃下存储4个月没有聚集倾向的显著证据。但是，明显地，变体C34A+L66C、C34A+E277C和C34A+E311C在T＝0时具有相对较低的单体百分含量，因此具有形成聚集体的倾向。

表8B.GPHPLC聚集筛选结果

实施例4.硫代-白蛋白变体的缀合效率和受控水解

使用3.2倍摩尔过量的马来酰亚胺-PEG2-生物素：蛋白质将实施例3的硫代-白蛋白变体与生物素(Thermo Scientific，EZ-Link马来酰亚胺-PEG2-生物素)缀合。反应示意图显示于图4。将硫代-白蛋白洗脱物用pH 7.4的磷酸盐缓冲盐水(PBS缓冲液)稀释，得到0.3mg/mL(45.15nmol)的10mL溶液，并如下表9A所示缀合。

硫代-白蛋白变体C34A+A226C的MS谱表明，在与马来酰亚胺-PEG2-生物素一起孵育过夜之后，没有发生缀合。结果总结于表9A中。硫代白蛋白变体C34A+E230C和C34A+I271C的MS谱表明，在孵育过夜之后发生缀合，当比较缀合和未缀合物种的相对峰高时分别给出大约72％或72％的单缀合物(即单缀合物水平相同)。C34A+I271C的MS谱显示于图5A中。图5B中所示的硫代-白蛋白变体C34A+K93C的MS谱在66908Da处表现出单一物种，其表明硫代-白蛋白变体加上单一添加的马来酰亚胺-PEG2-生物素(+525Da)的正确分子量。这证实了变体具有可用于缀合的单个游离硫醇。硫代-白蛋白变体C34A+E294C和C34A+E358C得到可比较的结果。

表9A.缀合效率结果

*WT对照样品在序列运行过程中未能注射在MS上

对另外的变体进行分析，结果显示于表9B中。对于样品C34A+L66C和C34A+Q94C，蛋白质浓度低，因此，使用0.15mg/mL(22.58nmol)的10mL溶液。通过将5x 200μL等份pH 7.4的PBS缓冲液加入到2个2mg预称重的EZ-Link微管的每一个中，制备2mg/mL生物素储液溶液，将小瓶润洗，使冻干产品的回收最大化。将两个1mL体积合并在带盖的7mL容器中。从生物素储液溶液取38μL(144.5nmol)加入到10mL白蛋白样品中，以得到相对于白蛋白大约3.2-倍摩尔过量的生物素。但是，对于C34A+L66C和C34A+Q94C样品，仅加入19μL生物素，以保持3.2倍过量的马来酰亚胺-PEG2-生物素：蛋白质。将样品轻轻混合，并在环境温度下孵育过夜。孵育之后，对样品进行质谱分析，以根据实施例2中所述的方法确定缀合之后的完整蛋白质质量，但使用15分钟分析梯度，并对大约7和10分钟之间的蛋白质峰数据进行处理。表9B中总结的MS谱结果表明，硫代-白蛋白变体C34A+L66C、C34A+A92C、C34A+Q94C、C34A+D259C、C34A+L275C和C34A+L284C在与马来酰亚胺-PEG2-生物素一起孵育过夜之后没有发生缀合。WT对照和硫代-白蛋白变体C34A+L24C、C34A+V54C、C34A+H128C、C34A+E227C、C34A+K240C、C34A+K262C、C34A+Q268C、C34A+E277C、C34A+K317C、C34A+A322C、C34A+K359C和C34A+A362C的MS谱表明，与马来酰亚胺-PEG2-生物素发生90％或更高的缀合。

表9B:缀合效率结果

马来酰亚胺缀合物键的稳定性并不牢固。琥珀酰亚胺可以经由retro-Michael途径(图4)恢复回马来酰亚胺和游离硫醇。因此，非常不希望发生的是，释放的马来酰亚胺可以在体内与其他硫醇反应性物种反应，释放的硫醇可以与其他化合物反应。为了避免retro-Michael反应性，琥珀酰亚胺可以水解成琥珀酸，有效地带有H₂O(+18Da)，并将缀合物锁定成硫醇稳定性的。通过水解的硫醇稳定性特性是合意的，因为其将会确保在体内各种环境中不发生不希望的硫醇转移。因此，通过增加pH和温度进行琥珀酰亚胺的受控水解。缀合之后，将样品转移至Vivaspin 20离心浓缩器(Sartorius)，并用pH 7.4的PBS缓冲液平衡。将样品在4,500x g下离心15分钟，以将体积降低至大约200μL。将透滤杯安装在Vivaspin 20容器上，随后装有15mL pH 9.0的PBS缓冲液。将样品在4,500x g下第二次离心15分钟。再加入15mL pH 9.0的PBS缓冲液，将样品第三次离心，以确保所有游离马来酰亚胺-PEG2-生物素均从溶液中去除。取剩余的渗余物，用pH 9.0的PBS缓冲液制成至最终体积10mL(即，假设无损失，则浓度至0.3mg/mL)。将样品在37℃下孵育至少24小时，使受控水解发生，以确定硫醚缀合键的稳定性。结果总结于表10。

水解的硫醇稳定性的野生型对照缀合物的收率在53％的量级，可能是因为水解过程中的竞争性retro-Michael去缀合(图6A)。另外观察到+14Da的平均缀合物质量迁移，表明发生了部分水解。显然地，缀合效率最高的硫代-白蛋白变体在受控水解时的缀合稳定性也提高。具体地，反应有利于琥珀酰亚胺的水解而不是tetro-Michael去缀合途径。C34A+E294C的例子显示于图6B中，表明在pH 9.0、37℃下孵育之后没有缀合物的损失。硫代-白蛋白变体C34A+K93C、C34A+E294C和C34A+E358C得到可比较的结果，在受控水解过程中没有显著损失。

表10：受控水解稳定性结果

结合的聚集结果和缀合结果一并总结于表11中。明显地，变体C34A+K93C和C34A+E294C与野生型白蛋白相比较具有改善的聚集图谱，以高百分比与马来酰亚胺-PEG2-生物素缀合，并且在pH 9.0、37℃下受控水解之后损失最小。选择这些变体用于进一步评价。

表11：硫代-白蛋白变体聚集筛选和缀合结果小结

实施例5：组合变体

方法2.

产生组合变体(表12)，在有或没有HSA C34A突变的情况下将所述的突变K93C和E294C结合。简言之，制备包括单个突变的质粒，通过限制酶消化和连接将突变组合起来。

将对应于突变K93C或E294C的方法1中产生的1μl提纯的质粒转化到大肠杆菌NEB5-α(New England Biolabs)中，并平板接种在补充有50μg/mL氨苄青霉素的LB板(如上文所述)上。使用Qiagen Plasmid Plus试剂盒(Qiagen，根据制造商说明书)分离出质粒，并进行测序，以证实HSA序列内存在所需的突变。这些质粒命名为pDB5623(C34A+K93C)和pDB5624(C34A+E294C)。

使用NheI和SphI限制位点从质粒pDB5624取片段，使用QIAquick凝胶提取试剂盒(Qiagen)提纯，并连接到经相同酶消化的pDB5623中，产生构建物pDB5625。通过将用SacII和PstI限制酶消化pDB5102产生的片段插入到类似消化的pDB5623和pDB5624中，构建pDB5626和pDB5627。pDB5102如WO 2015/036579中所述(在此将其并入作为参考)。将连接的质粒均转化到大肠杆菌NEB 5-α中，并平板接种到补充有50μg/mL氨苄青霉素的LB板(如上文所述)上。使用Qiagen Plasmid Plus试剂盒(Qiagen，根据制造商说明书)分离出质粒，并进行测序，以证实HSA序列内存在所需的突变。

为产生pDB5628，使用SacII和PstI限制位点由质粒pDB5102取片段，使用QIAquick凝胶提取试剂盒(Qiagen)提纯，并连接到用相同酶消化的pDB5625中。将连接的质粒均转化到大肠杆菌NEB 5-α中，并平板接种到补充有50μg/mL氨苄青霉素的LB板上。使用QiagenPlasmid Plus试剂盒(Qiagen，根据制造商说明书)分离出质粒，并进行测序，以证实HSA序列内存在所需的突变。

表12：组合变体的信息小结

表达质粒和酵母储液的制造

如WO 2012/150319中所述通过48小时储液法(在此将其并入作为参考)进行表达质粒的制备和酿酒酵母的转化。用于构建物的宿主菌株是酿酒酵母BXP10Cir⁰(WO 2015/036579，在此并入作为参考)。除非另外指出，如WO 2012/150319中所述(在此将其并入作为参考)从摇瓶进行变体的提纯。

实施例6.硫代-白蛋白变体的产生、提纯和缀合

将各为1mL等份的冻存的酵母储液接种到单独的含有100mL BMMS生长培养基(没有氨基酸或(NH₄)₂SO₄的酵母氮基，Difco 1.7g/L；柠檬酸一水合物6.09g/L；Na₂HPO₄.2H₂O25.27g/L；(NH₄)₂SO₄ 5.0g/L；pH 6.5±0.2；蔗糖，加入至20g/L)的摇瓶。当摇瓶中细胞的浓度达到0.8-1.2mg/mL时，将细胞从摇瓶转移至发酵器(10L工作体积，Sartorius Biostat C10-3发酵器)，实现发酵器中细胞接种浓度≥10mg/L(大于或等于10mg/L)。

通过将每个酵母菌株在高细胞密度(HCD)补料分批发酵中进行无菌培养，产生硫代-白蛋白变体。发酵的目的在于，通过控制加料速率添加，使得副产物例如乙醇和乙酸酯(盐)的形成得以避免，实现生物质和产率的最大化。发酵方法的进一步细节描述于WO 96/37515中(在此将其并入作为参考)。温度和pH分别控制在30℃和pH 6.2。通过使用SorvallRC 3C离心机(DuPont)进行离心，收获培养物上清液，提供用于立即提纯的材料，并将其余材料冷冻(-20℃)存储，之后解冻用于随后的提纯。最终产物浓度使用Shimadzu VP7.3客户服务器软件控制下的安装有UV检测器的LC2010HPLC系统(Shimadzu)通过GP-HPLC测定，如实施例3中所述。表13提供了每种硫代-白蛋白变体的收率(以mg/mL培养物上清液为单位)，并表明在所有情形中均获得大于1mg/mL培养物上清液的高产物滴度。

表13：通过GP-HPLC的硫代-白蛋白变体蛋白质浓度

样品说明	硫醇数	通过GPHPLC的浓度(mg/mL)	SEQ ID NO.
				C34A+K93C	1	3.1	111
C34A+E294C	1	4.6	129
				C34A+K93C+E294C	2	2.3	141
K93C	2	1.8	142
				E294C	2	3.9	143
K93C+E294C	3	1.6	144

将变体通过两部色谱法进行大规模提纯。第一提纯步骤使用色谱，如之前实施例3中所述，但将柱子分别用大约4个柱子体积pH 5.3的50mM醋酸钠、10个柱子体积pH 8.0的50mM磷酸钠和10个柱子体积pH 8.0的50mM醋酸铵洗涤。结合的蛋白质使用1-3个柱子体积的pH 7.0的50mM醋酸铵、10mM辛酸钠洗脱。然后将洗脱物使用离子交换色谱经由DE-FF进一步提纯，如Evans等人(2010)，Protein Expression andPurification Volume 73，Issue 2，Pages 113-124中所述。提纯之后，将DE-FF洗脱物样品浓缩，使用分子量截留10,000的Vivacell 100离心浓缩器(Sartorius)使用超滤/渗滤进行缓冲交换。样品在2,000xg下离心30分钟(多次)，以在针对10体积pH 6.5的25mM磷酸钠、215mM氯化钠渗滤之前将体积降低在10mL以下。渗滤之后，样品浓度在124-177mg/mL范围内。将样品在pH 6.5的25mM磷酸钠、215mM氯化钠中稀释至最终制剂浓度为50mg/mL。

如实施例4中所述将硫代-白蛋白变体与马来酰亚胺-PEG2-生物素缀合，但用3.2倍的生物素相对于游离硫醇含量(游离硫醇数)摩尔过量。由于一些变体具有多个可用于缀合的游离硫醇位点，所有生物素缀合排列的预计分子量总结于表14中。具有两个或三个硫醇基的变体分别增加2x 525Da和3x 525Da。每个峰物种的相对峰高用于计算目标缀合物的百分含量，即，单一、双重或三重生物素标记的硫代-白蛋白变体的正确百分含量。K93C+E294C变体总共具有3个游离硫醇残基，该变体的MS谱显示于图7A中。从MS谱中的单峰物种明显看出，变体成功地相对于每摩尔蛋白质缀合3摩尔马来酰亚胺-PEG2-生物素，如1575Da(3x 525Da)到67968Da的质量增加所示(表15)。将样品在37℃、pH 9下孵育至少24小时，用于进行受控水解，以确定硫醚缀合键的稳定性，如之前在实施例4中所述。结果总结于表15。水解的硫醇稳定性K93C+E294C缀合物的收率为20％三重缀合物的量级，原因在于水解过程中竞争性的C34缀合物的retro-Michael去缀合(图7B)。现在主要的物种是水解的质量为67476Da的硫醇稳定性双缀合物，表明水解发生至双缀合物种。明显地，与具有C34A突变的变体相比较，在C34位上含有半胱氨酸的变体在水解过程中具有显著的去缀合。在水解之前，双硫醇变体C34A+K93C+E294C是62％双缀合的，在水解之后，为56％。观察到质量66443Da的峰物种，证实了与在C34处含有半胱氨酸的K93C+E294C缀合物(图7B)相比较，水解以最小的缀合损失发生(图7C)，由其突出的是，当使用马来酰亚胺连接部分时，K93C和E294C变体的缀合稳定性提高。

表14：缀合和水解后预计的分子量

n/a：未适用

表15：缀合效率和受控水解结果

将配制的样品在2-8℃下通过GPHPLC进行6个月的稳定性评价，使用实施例3中所述的方法。。测定每个样品在相同存储条件下相对于其野生型对照的单体百分含量(括弧中)。单体百分含量结果总结于表16中，并表明，当白蛋白变体以50mg/mL配制并在2-8℃下存储6个月时，聚集水平在可接受的限度以内。

表16. 2-8℃下存储之后，50mg/mL下的GPHPLC蛋白质稳定性评价

m＝月

实施例7：具有改变的FcRn结合的组合变体

如WO 201I/051489中所述(在此将其并入作为参考)，具有K573P替换的HSA具有比野生型HSA更高的FcRn亲和力。产生构建物，以将表12中所述变体的突变与来自质粒pDB4673的HSA K573P突变结合起来。

方法3.

使用PstI和XhoI限制位点从质粒pDB5623、5624、5625、5626、5627和5628取片段，使用QIAquick凝胶提取试剂盒(Qiagen)提纯，并连接到用相同的酶消化的pDB4673中，以产生构建物pDB5704、5707、5710、5713、5716和5719(表17)。将连接的质粒均转化到大肠杆菌NEB 5-α(New England Biolabs)中，并平板接种到补充有50μg/mL氨苄青霉素的LB板上。使用Qiagen Plasmid Plus试剂盒(Qiagen，根据制造商说明书)分离质粒，并对其进行测序，以确认HSA序列中存在所需的突变。

表17：FcRn结合改变的变体信息小结

变体	质粒	蛋白质SEQ ID NO.
			K573P	pDB4673	145
C34A+K93C+K573P	pDB5704	146
			C34A+E294C+K573P	pDB5707	147
C34A+K93C+E294C+K573P	pDB5710	148
			K93C+K573P	pDB5713	149
E294C+K573P	pDB5716	150
			K93C+E294C+K573P	pDB5719	151

表达质粒和酵母储液的制造

如WO 2012/150319中所述通过48小时储液法(在此将其并入作为参考)进行表达质粒的制备和酿酒酵母的转化。用于构建物的宿主菌株是酿酒酵母BXP10 Cir⁰(WO 2015/036579，在此并入作为参考)。除非另外指出，如WO 2012/150319中所述(在此将其并入作为参考)从摇瓶进行变体的提纯。

实施例8.FcRn结合改变的组合变体的聚集筛选

如实施例3所述进行酿酒酵母的摇瓶培养和提纯。使用单步AlbuPure色谱法由实施例3所述的6种变体制备提纯的材料。提纯之后，使用Vivaspin离心浓缩器将20mL洗脱物浓缩至小于200μL，如实施例4中所述。浓缩之后，通过加入pH 6.5的10mL 25mM磷酸钠、215mM氯化钠，对样品进行缓冲液交换，并如之前那样将样品离心。回收的最终体积为75μL至200μL。洗脱物样品的浓度和单体百分含量通过凝胶渗透高效液相色谱(GP-HPLC)测定，如实施例3中所述。结果总结于表18中。最终产物浓度在47-154mg/mL范围内。实施例4中典型的野生型白蛋白对照导致1.1mg/mL下单体百分含量为87％(表8A)。即使在显著较高的蛋白质浓度下，经分析的所有变体也均具有等于或大于87％的单体百分含量。这表明所有变体均具有最小的聚集倾向性。

表18.GPHPLC聚集筛选结果

实施例9.FcRn结合改变的组合变体的缀合效率和受控水解

将硫代-白蛋白组合变体(表17)与3.2倍过量的马来酰亚胺-PEG2-生物素缀合，如实施例6中所述。由于一些变体具有多个可用于缀合的游离硫醇位置，所有生物素缀合排列的预计分子量总结于表19中。

表19.缀合和水解后白蛋白变体的预计分子量

n/a：未适用

具有两个或三个硫醇基的变体的分子量分别增加2x 525Da和3x525Da。每个峰物种的相对峰高用于计算目标缀合物的百分含量，即，单一、双重或三重生物素标记的硫代-白蛋白变体的百分含量。K93C+E294C+K573P变体总共具有3个游离硫醇残基(第三个硫醇由天然Cys34提供)；该变体的MS谱显示于图8A中。从MS谱中的单峰物种明显看出，变体成功地每摩尔蛋白质缀合3摩尔马来酰亚胺-PEG2-生物素，如1575Da(3x 525Da)到67940.8Da的质量增加所示。将样品在37℃、pH 9下孵育至少18小时，用于进行受控水解，以确定硫醚缀合键的稳定性，如之前在实施例4中所述。结果总结于表20中。

水解的硫醇稳定性K93C+E294C+K573P缀合物的收率为23％三重缀合物的量级，原因可能在于水解过程中竞争性的C34缀合物的retro-Michael去缀合(图8B)。现在主要的物种是水解的质量为67447.3Da的硫醇稳定性双缀合物，表明水解发生至双缀合物种。明显地，与具有C34A突变的变体相比较，在C34位上含有半胱氨酸的变体在水解过程中经历更深度的去缀合。

表20.缀合效率和受控水解结果

*低强度MS谱，不能对数据进行精确定量

实施例10.与马来酰亚胺-PEG2-生物素缀合物之前和之后，FcRn结合改变的组合变体的表面等离子体共振(SPR)分析

通过补料分批发酵产生表12和17中详述的硫代-白蛋白组合变体，并根据实施例6进行提纯。提纯之后，将样品浓缩，在于缓冲液(25mM磷酸钠、215mM氯化钠，pH6.5)中最终制剂在20mg/mL之前，使用10,000分子量截留的中心切向流动滤膜(Centramate TangentialFlow Filtration Membrane)组件(PALL)针对最小7连续体积pH 6.5的25mM磷酸钠、215mM氯化钠对缓冲液进行交换。随后，进行尺寸排阻色谱步骤( S200，GEHealthcare)。对于每个样品，将25mL等分在两个Vivaspin 20离心浓缩器中，并以4,500x g离心两个20分钟，将总体积减少至5mL。将浓缩的材料装载在483mL S200柱子上，收集单峰，以产生大于98％的单体蛋白质用于通过SPR进行FcRn结合分析。提纯之后，将洗脱物稀释至5mg/mL(±5％)。每个变体对于人FcRn受体的结合亲和力在与马来酰亚胺-PEG2-生物素缀合之前和缀合之后均加以测定。使变体与3.2倍过量的马来酰亚胺-PEG2-生物素缀合，如实施例6中所述。缀合百分比通过MS测定，如实施例2中所述的，但使用15分钟分析梯度，并对大约7和10分钟之间的蛋白质峰进行数据处理。结果显示于表21中，并表明所有样品均取决于硫醇数而缀合至不同程度。

表21：用于SPR的样品的缀合效率

n/a：未适用

使用Biacore 3000仪器(GE healthcare)进行SPR分析。使用胺偶联化学将CM5传感芯片的流动细胞与可溶性人FcRn(1200-1600RU)偶联，如制造商(GE Healthcare)提供的方案所述。偶联可以通过将5μg/mL蛋白质注射到10mM醋酸钠pH 4.5(GE Healthcare)中进行。可以使用pH 5.5的磷酸盐缓冲液(67mM磷酸盐缓冲剂、0.15M NaCl、0.005％Tween 20)作为运行缓冲液和稀释缓冲液。表面的再生可以使用在pH 7.4下注射HBS-EP缓冲液(0.01MHEPES，0.15M NaCl，3mM EDTA，0.005％表面活性剂P20)进行(GE Healthcare)。固定化之后，将芯片用恒定流量(5μL/min)的运行缓冲液稳定化。将芯片表面通过3x注入运行缓冲液、然后3x注入再生缓冲液的注射进行调节。用天然序列HSA作对照来检查表面活性。对于结合动力学的测定，在25℃下以恒定流速(30μL/min)将白蛋白变体的连续稀释液(10-0μM)在固定化的受体上注射。在所有分析中，数据进行零点调节，减去参照细胞。数据评价使用BIAevalution 4.1软件进行(BIAcore AB)。缀合之前和之后的结果分别显示于表22和表23中。

以依赖于pH的可逆的方式在结合到受体的人FcRn上筛选硫代-白蛋白变体。

在缀合之前和之后，与野生型对照(SEQ ID NO.2)相比较，野生型背景的硫代-白蛋白变体(即，仅有的氨基酸改变是引入以影响可缀合半胱氨酸残基数目的改变的那些)给出类似的FcRn结合亲和力增加倍数。在缀合之前和之后，与K573P对照(SEQ ID NO.145)相比较，另外包括K573P突变(以增加白蛋白变体FcRn亲和力)的硫代-白蛋白变体保持了其FcRn亲和力的增加，表明可缀合半胱氨酸残基的变化和缀合配偶体均没有对白蛋白变体的FcRn结合亲和力产生可观察的影响。

表22：缀合之前变体的FcRn亲和力

n/a：未适用

倍数>WT＝KD(μM)WT对照/KD(μM)变体

表23：与马来酰亚胺-PEG2-生物素缀合之后样品的FcRn亲和力

n/a：未适用

倍数>WT＝KD(μM)WT对照/KD(μM)变体

实施例11.FcRn结合变化的组合变体的聚集分析

分析实施例10中以5mg/mL配制的硫代-白蛋白组合变体在溶液中保持为单体的倾向性。如实施例10所述制备WT HSA、变体K573P和变体C34A+L302C，并包括其作为对照。与实施例2的方法类似，在T＝0时和在5℃下存储3个月之后，通过对用DTNB试剂处理过的蛋白质样品进行质谱分析，测定每个变体的游离硫醇含量。对于该实施例，将80μL各变体样品用920μL缓冲液1(100mM Tris-HCl，10mM EDTA，pH 8.0)稀释。向每个变体样品中，加入50μL缓冲液2(4mg/mL DTNB，500mM磷酸钠，pH 7.0)。将产生的制剂在环境温度(20±5℃)下孵育至少25分钟，以进行TNB标记。孵育之后，根据实施例2中所述的方法对样品进行质谱分析，以测定缀合之后的完整蛋白质质量，但使用15分钟分析梯度，对大约7和10分钟之间的蛋白质峰进行数据处理。结果总结于表24A和表24B中。经DTNB孵育质量增加197Da指示着样品中蛋白质存在一个游离硫醇基。增加394Da和591Da分别指示着两个或三个游离硫醇基。在稳定性考察开始时，所有样品均具有高水平的游离硫醇，大多数在5℃下存储3个月之后保持高的游离硫醇水平。

表24A：质谱DTNB游离硫醇结果

表24B：在5℃下存储之后的质谱DTNB游离硫醇结果

如实施例3中所示，将样品在5℃和40℃下存储3个月之后，通过GPHPLC在不同时间点测定聚集图谱。每个样品相对于其在相同存储条件下的野生型对照测定单体百分含量(括弧内)。5℃和40℃的结果分别提供在表25和表26中。在T＝0时，所有变体的单体均大于98％。在5℃下存储3个月过程中，大多数硫代-白蛋白变体保持单体蛋白质百分含量大于或等于97％。相对于分析的其他变体，变体C34A+L302C更易于聚集。另外，明显地，大多数硫代-白蛋白变体在40℃下存储3个月过程中保持大于或等于80％的单体蛋白质百分含量。但是，明显地，在40℃下存储3个月之后，变体C34A+L302C更易于聚集，单体百分含量为73.2％。

表25：在5℃下存储之后，5mg/mL下的GPHPLC蛋白质稳定性评价

表26：在40℃下存储之后，5mg/mL下的GPHPLC蛋白质稳定性评价

实施例12.FcRn结合改变的组合变体与荧光探针的缀合

实施例10中以5mg/mL配制的硫代-白蛋白组合变体在2-8℃下存储6周之后，使用3倍过量的Alexa 488-PEG4-Lys(一溴马来酰亚胺)-NH₂染料(图9A)或5-羧基荧光素-PEG4-Lys(一溴马来酰亚胺)-NH₂染料(图10A)(Almac Group Ltd.,UK，定制合成)缀合。将变体用pH 7.4的PBS缓冲液稀释，得到1mL 1mg/mL的溶液(15.05nmol)。通过将1.6mg材料用1.6mL pH 7.4的PBS缓冲液重构，制备1mg/mL Alexa 488-PEG4-Lys(一溴马来酰亚胺)-NH₂染料的储液。从Alexa 488-PEG4-Lys(一溴马来酰亚胺)-NH₂染料储液取51.5μL(45.15nmol)加入到单硫醇变体中，103μL(90.3nmol)染料储液加入到双硫醇变体中，154.5μL(135.3nmol)染料储液加入到三硫醇变体中，使Alexa 488-PEG4-Lys(一溴马来酰亚胺)-NH₂染料相对于游离硫醇数三倍过量。通过将1.7mg材料用1.7mL二甲亚砜(DMSO)和1.7mL pH 7.4的PBS缓冲液重构，制备5-羧基荧光素-PEG4-Lys(一溴马来酰亚胺)-NH₂染料的0.5mg/mL储液。从5-羧基荧光素-PEG4-Lys(一溴马来酰亚胺)-NH₂染料储液取44.3μL(45.15nmol)加入到单硫醇变体中，88.6μL(90.3nmol)染料储液加入到双硫醇变体中，132.9μL(135.3nmol)染料储液加入到三硫醇变体中，使5-羧基荧光素-PEG4-Lys(一溴马来酰亚胺)-NH₂染料相对于游离硫醇数三倍过量。将样品轻轻混合，并在暗处在环境温度下孵育过夜。孵育之后，通过质谱对样品进行分析，以根据实施例2中所述的MS方法确定缀合之后的完整蛋白质质量，但使用15分钟分析梯度，对大约7和10分钟之间的蛋白质峰进行数据处理。结果总结于表27和表28中。

图9B中显示的FcRn结合改变的变体K573P的MS谱在67468.5Da处表现出单个物种，表明K573P变体加上单个添加的Alexa 488-PEG4-Lys(一溴马来酰亚胺)-NH₂染料的正确分子量(+1058Da)。这确认了变体具有位于Cys34处的可用于缀合的单个游离硫醇。图9C中显示的硫代-白蛋白变体K93C+E294C+K573P表明，在过夜孵育之后发生缀合，当比较缀合物种的相对峰高时，分别得到大约42％二缀合物和58％三缀合物物种。明显地，主峰物种增加了大约3174Da(3x1058Da)至69536Da。这表明变体具有三个可用于缀合的游离硫醇。

图10B中显示的FcRn结合改变的变体K573P的MS谱在67310.6Da处表现出单个物种，表明K573P变体加上单一添加的5-羧基荧光素-PEG4-Lys(一溴马来酰亚胺)-NH₂染料的正确分子量(+901Da)。图10C显示的硫代-白蛋白变体C34A+K93C+E294C+K573P表明，孵育过夜之后发生缀合，在比较缀合物物种的相对峰高时，得到大约9％单缀合物和大约91％双缀合物。明显地，主峰物种增加了大约1802Da(2x 901Da)至68129.7Da。这表明变体具有两个用于缀合的游离硫醇。

表27：硫代-白蛋白变体与Alexa 488-PEG4-Lys(一溴马来酰亚胺)-NH₂染料的缀合效率结果

n/a：未适用

*低强度MS谱，不能对数据进行精确定量

表28：硫代-白蛋白变体与5-羧基荧光素-PEG4-Lys(溴马来酰亚胺)-NH₂染料的缀合效率结果

n/a：未适用

*低强度MS谱，不能对数据进行精确定量

实施例13.FcRn结合改变的组合变体与紫杉醇的缀合

实施例10中以5mg/mL配制的硫代-白蛋白组合变体在2-8℃下存储3月之后，使用1.5倍过量的紫杉醇缀合，其经由酯基被一溴马来酰亚胺部分活化，如图11A所示，产生分子一溴马来酰亚胺-紫杉醇(Almac Group Ltd.,UK定制合成)。将变体用pH 7.4的PBS缓冲液稀释，得到1mL 1mg/mL的溶液(15.05nmol)。通过将6.6mg材料用3.3mL DMSO重构，制备2mg/mL一溴马来酰亚胺-紫杉醇的储液。从一溴马来酰亚胺-紫杉醇储液取12.24μL(22.58nmol)加入到单硫醇变体中，24.47μL(45.15nmol)染料储液加入到双硫醇变体中，36.71μL(67.73nmol)染料储液加入到三硫醇变体中，使一溴马来酰亚胺-紫杉醇相对于游离硫醇数三倍过量。将样品轻轻混合，并在暗处在环境温度下孵育过夜。孵育之后，通过质谱对样品进行分析，以根据实施例2中所述的MS方法确定缀合之后的完整蛋白质质量，但使用15分钟分析梯度，对大约7和10分钟之间的蛋白质峰进行数据处理。结果总结于表29中。

图11B所示的FcRn结合改变的变体K573P的MS谱表明，在过夜孵育之后发生缀合，当比较蛋白质物种的相对峰高时，分别得到大约77％单缀合和23％未缀合的物种。明显地，67412.2Da处的主峰物种由于单一添加有一溴马来酰亚胺-紫杉醇而增加了大约1004Da。图11C所示的硫代-白蛋白变体K93C+E294C+K573P的MS谱表明，在过夜孵育之后发生缀合，当比较缀合物种的相对峰高时，分别得到大约6％单缀合物、大约60％二缀合物和30％三缀合物的物种。明显地，主峰物种已经增加了大约2008Da(2x 1004Da)至68364.2Da，69383.7Da物种指示着3012Da的三加合。

表29：硫代-白蛋白变体与一溴马来酰亚胺-紫杉醇的缀合效率结果。

n/a：未适用

*低强度MS谱，不能对数据进行精确定量

实施例14.FcRn结合改变的组合变体与艾塞那肽(exenatide peptide)的缀合

实施例10中以5mg/mL配制的硫代-白蛋白组合变体在2-8℃下存储3月之后，使用1.5倍过量的一溴马来酰亚胺-PEG2-艾塞那肽缀合，如图12A所示(Almac Group Ltd.,UK,定制合成)。将变体用pH 7.4的PBS缓冲液稀释，得到1mL 1mg/mL的溶液(15.05nmol)。通过将5mg材料用1mL pH 7.4的PBS缓冲液重构，制备5mg/mL一溴马来酰亚胺-PEG2-艾塞那肽的储液。从一溴马来酰亚胺-PEG2-艾塞那肽储液取21.17μL(22.58nmol)加入到单硫醇变体中，42.35μL(45.15nmol)肽储液加入到双硫醇变体中，63.52μL(67.73nmol)染料储液加入到三硫醇变体中，使一溴马来酰亚胺-PEG2-艾塞那肽相对于游离硫醇数为三倍过量。将样品轻轻混合，并在暗处在环境温度下孵育过夜。孵育之后，对样品进行质谱分析，以根据实施例2中所述的MS方法确定缀合之后的完整蛋白质质量，但使用15分钟分析梯度，对大约7和10分钟之间的蛋白质峰进行数据处理。结果总结于表30中。

图12B所示的FcRn结合改变的变体K573P的MS谱表明，在过夜孵育之后发生缀合，当比较蛋白质物种的相对峰高时，分别得到大约33％单缀合和67％未缀合的物种。明显地，66409.2Da处的主峰物种是未缀合的K573P变体。第二物种由于单一添加有一溴马来酰亚胺-PEG2-艾塞那肽而增加了大约4609Da。图12C所示的硫代-白蛋白变体C34A+K93C+E294C+K573P的MS谱表明，在过夜孵育之后发生缀合，当比较蛋白质物种的相对峰高时，分别得到大约33％二缀合物、大约45％单缀合物种和大约22％未缀合物种。明显地，主峰物种增加了大约4609Ka至70941.7Da，75557.3Da物种指示着9218Da的添加，其代表了一溴马来酰亚胺-PEG2-艾塞那肽的双缀合。

表30：硫代-白蛋白变体与艾塞那肽的缀合效率结果

n/a：未适用

*低强度MS谱，不能对数据进行精确定量

实施例15.FcRn结合改变的组合变体与FLAG肽的缀合

实施例10中以5mg/mL配制的硫代-白蛋白组合变体在2-8℃下存储3月之后，使用1.5倍过量的马来酰亚胺-丙基-FLAG肽缀合，如图13A所示(Peptide Protein ResearchLtd.,UK,客户合成)。将变体用pH 7.4的PBS缓冲液稀释，得到1mL 1mg/mL的溶液(15.05nmol)。通过将5.4mg材料用5.4mL pH 7.4的PBS缓冲液重构，制备1mg/mL马来酰亚胺-丙基-FLAG肽的储液。从马来酰亚胺-丙基-FLAG肽储液取26.28μL(22.58nmol)加入到单硫醇变体中，52.56μL(45.15nmol)肽储液加入到双硫醇变体中，78.84μL(67.73nmol)肽储液加入到三硫醇变体中，使马来酰亚胺-丙基-FLAG肽相对于游离硫醇数为三倍过量。将样品轻轻混合，并在环境温度下孵育过夜。孵育之后，对样品进行质谱分析，以根据实施例2中所述的MS方法确定缀合之后的完整蛋白质质量，但使用15分钟分析梯度，对大约7和10分钟之间的蛋白质峰进行数据处理。结果总结于表31中。

图13B所示的FcRn结合改变的变体K573P的MS谱表明，在过夜孵育之后发生缀合，当比较蛋白质物种的相对峰高时，分别得到大约29％单缀合和71％未缀合的物种。明显地，66409.1Da处的主峰物种是未缀合的K573P变体。丰度第二大的峰物种由于单一添加有马来酰亚胺-丙基-FLAG肽而增加了大约1164Da。图13C所示的硫代-白蛋白变体K93C+E294C+K573P的MS谱表明，在过夜孵育之后发生缀合，当比较蛋白质物种的相对峰高时，分别得到大约29％三缀合物物种、大约50％二缀合物物种、大约20％单缀合物种和大约2％未缀合物种。明显地，主峰物种增加了大约2328Ka至68685.5Da，69850.5Da物种指示着3492Da的添加，其代表了马来酰亚胺-丙基-FLAG肽的三缀合。

表31：白蛋白变体与FLAG肽的缀合效率结果

n/a：未适用

*低强度MS谱，不能对数据进行精确定量

实施例16.使用EpiScreen^TM时间进程T细胞检验进行硫代-白蛋白变体的免疫原性评价

如实施例10中所述，制备硫代-白蛋白变体K93C(SEQ ID NO.142)和E294C(SEQ IDNO.143)，连同野生型白蛋白对照(SEQ ID NO.2)一起。与实施例10相反，将尺寸排阻色谱洗脱物稀释至4mg/mL(±5％)。使用EpiScreen^TM时间进程T细胞检验(Abzena,Cambridge UK)评价白蛋白测试样品诱导CD4+ T细胞的能力。简言之，EpiScreen^TM检验进行如下：将来自代表欧洲和北美人群(基于HLA同种异型)的一组50名健康供体的外周血单核细胞与测试样品一起孵育。使用增殖检验([3H]-胸苷摄取)和细胞因子分泌检验(IL-2ELISpot)测量T细胞反应。

对于所有样品，增殖检验中阳性反应的频率低(范围0％至8％)，IL-2ELISpot检验中没有观察到阳性反应，表明所有三种样品的临床免疫原性风险均很低。

序列表

<110> 阿尔布梅迪克斯医疗公司

<120> 白蛋白变体和缀合物

<130> 13148-WO-PCT

<150> EP15181822.6

<151> 2015-08-20

<160> 152

<170> PatentIn 版本 3.5

<210> 1

<211> 1761

<212> DNA

<213> 智人（Homo sapiens）

<400> 1

gacgctcaca agtccgaagt cgctcacaga ttcaaggact tgggtgaaga aaacttcaag 60

gctttggtct tgatcgcttt cgctcaatac ttgcaacaat gtccattcga agatcacgtc 120

aagttggtca acgaagttac cgaattcgct aagacttgtg ttgctgacga atccgcggaa 180

aactgtgaca agtccttgca caccttgttc ggtgataagt tgtgtactgt tgctaccttg 240

agagaaacct acggtgaaat ggctgactgt tgtgctaagc aagaaccaga aagaaacgaa 300

tgtttcttgc aacacaagga cgacaaccca aacttgccaa gattggttag accagaagtt 360

gacgtcatgt gtactgcttt ccacgacaac gaagaaacct tcttgaagaa gtacttgtac 420

gaaattgcta gaagacaccc atacttctac gctccagaat tgttgttctt cgctaagaga 480

tacaaggctg ctttcaccga atgttgtcaa gctgctgata aggctgcttg tttgttgcca 540

aagttggatg aattgagaga cgaaggtaag gctagctccg caaagcaaag attgaagtgt 600

gcttccttgc aaaagttcgg tgaaagagct ttcaaggctt gggctgtcgc tagattgtct 660

caaagattcc caaaggctga attcgctgaa gtttctaagt tggttactga cttgactaag 720

gttcacactg aatgttgtca cggtgacttg ttggaatgtg ctgatgacag agctgacttg 780

gctaagtaca tctgtgaaaa ccaagactct atctcttcca agttgaagga atgttgtgaa 840

aagccattgt tggaaaagtc tcactgtatt gctgaagttg aaaacgatga aatgccagct 900

gacttgccat ctttggctgc tgacttcgtt gaatctaagg acgtttgtaa gaactacgct 960

gaagctaagg acgtcttctt gggtatgttc ttgtacgaat acgctagaag acacccagac 1020

tactccgttg tcttgttgtt gagattggct aagacctacg aaactaccct cgagaagtgt 1080

tgtgctgctg ctgacccaca cgaatgttac gctaaggttt tcgatgaatt caagccattg 1140

gtcgaagaac cacaaaactt gatcaagcaa aactgtgaat tgttcgaaca attgggtgaa 1200

tacaagttcc aaaacgcttt gttggttaga tacactaaga aggtcccaca agtctccacc 1260

ccaactttgg ttgaagtctc tagaaacttg ggtaaggtcg gttctaagtg ttgtaagcac 1320

ccagaagcta agagaatgcc atgtgctgaa gattacttgt ccgtcgtttt gaaccaattg 1380

tgtgttttgc acgaaaagac cccagtctct gatagagtca ccaagtgttg tactgaatct 1440

ttggttaaca gaagaccatg tttctctgct ttggaagtcg acgaaactta cgttccaaag 1500

gaattcaacg ctgaaacttt caccttccac gctgatatct gtaccttgtc cgaaaaggaa 1560

agacaaatta agaagcaaac tgctttggtt gaattggtca agcacaagcc aaaggctact 1620

aaggaacaat tgaaggctgt catggatgat ttcgctgctt tcgttgaaaa gtgttgtaag 1680

gctgatgata aggaaacttg tttcgctgaa gaaggtaaga agttggtcgc tgcttcccaa 1740

gctgccttag gtttgtaata a 1761

<210> 2

<211> 585

<212> PRT

<213> 智人

<400> 2

Asp Ala His Lys Ser Glu Val Ala His Arg Phe Lys Asp Leu Gly Glu

1 5 10 15

Glu Asn Phe Lys Ala Leu Val Leu Ile Ala Phe Ala Gln Tyr Leu Gln

20 25 30

Gln Cys Pro Phe Glu Asp His Val Lys Leu Val Asn Glu Val Thr Glu

35 40 45

Phe Ala Lys Thr Cys Val Ala Asp Glu Ser Ala Glu Asn Cys Asp Lys

50 55 60

Ser Leu His Thr Leu Phe Gly Asp Lys Leu Cys Thr Val Ala Thr Leu

65 70 75 80

Arg Glu Thr Tyr Gly Glu Met Ala Asp Cys Cys Ala Lys Gln Glu Pro

85 90 95

Glu Arg Asn Glu Cys Phe Leu Gln His Lys Asp Asp Asn Pro Asn Leu

100 105 110

Pro Arg Leu Val Arg Pro Glu Val Asp Val Met Cys Thr Ala Phe His

115 120 125

Asp Asn Glu Glu Thr Phe Leu Lys Lys Tyr Leu Tyr Glu Ile Ala Arg

130 135 140

Arg His Pro Tyr Phe Tyr Ala Pro Glu Leu Leu Phe Phe Ala Lys Arg

145 150 155 160

Tyr Lys Ala Ala Phe Thr Glu Cys Cys Gln Ala Ala Asp Lys Ala Ala

165 170 175

Cys Leu Leu Pro Lys Leu Asp Glu Leu Arg Asp Glu Gly Lys Ala Ser

180 185 190

Ser Ala Lys Gln Arg Leu Lys Cys Ala Ser Leu Gln Lys Phe Gly Glu

195 200 205

Arg Ala Phe Lys Ala Trp Ala Val Ala Arg Leu Ser Gln Arg Phe Pro

210 215 220

Lys Ala Glu Phe Ala Glu Val Ser Lys Leu Val Thr Asp Leu Thr Lys

225 230 235 240

Val His Thr Glu Cys Cys His Gly Asp Leu Leu Glu Cys Ala Asp Asp

245 250 255

Arg Ala Asp Leu Ala Lys Tyr Ile Cys Glu Asn Gln Asp Ser Ile Ser

260 265 270

Ser Lys Leu Lys Glu Cys Cys Glu Lys Pro Leu Leu Glu Lys Ser His

275 280 285

Cys Ile Ala Glu Val Glu Asn Asp Glu Met Pro Ala Asp Leu Pro Ser

290 295 300

Leu Ala Ala Asp Phe Val Glu Ser Lys Asp Val Cys Lys Asn Tyr Ala

305 310 315 320

Glu Ala Lys Asp Val Phe Leu Gly Met Phe Leu Tyr Glu Tyr Ala Arg

325 330 335

Arg His Pro Asp Tyr Ser Val Val Leu Leu Leu Arg Leu Ala Lys Thr

340 345 350

Tyr Glu Thr Thr Leu Glu Lys Cys Cys Ala Ala Ala Asp Pro His Glu

355 360 365

Cys Tyr Ala Lys Val Phe Asp Glu Phe Lys Pro Leu Val Glu Glu Pro

370 375 380

Gln Asn Leu Ile Lys Gln Asn Cys Glu Leu Phe Glu Gln Leu Gly Glu

385 390 395 400

Tyr Lys Phe Gln Asn Ala Leu Leu Val Arg Tyr Thr Lys Lys Val Pro

405 410 415

Gln Val Ser Thr Pro Thr Leu Val Glu Val Ser Arg Asn Leu Gly Lys

420 425 430

Val Gly Ser Lys Cys Cys Lys His Pro Glu Ala Lys Arg Met Pro Cys

435 440 445

Ala Glu Asp Tyr Leu Ser Val Val Leu Asn Gln Leu Cys Val Leu His

450 455 460

Glu Lys Thr Pro Val Ser Asp Arg Val Thr Lys Cys Cys Thr Glu Ser

465 470 475 480

Leu Val Asn Arg Arg Pro Cys Phe Ser Ala Leu Glu Val Asp Glu Thr

485 490 495

Tyr Val Pro Lys Glu Phe Asn Ala Glu Thr Phe Thr Phe His Ala Asp

500 505 510

Ile Cys Thr Leu Ser Glu Lys Glu Arg Gln Ile Lys Lys Gln Thr Ala

515 520 525

Leu Val Glu Leu Val Lys His Lys Pro Lys Ala Thr Lys Glu Gln Leu

530 535 540

Lys Ala Val Met Asp Asp Phe Ala Ala Phe Val Glu Lys Cys Cys Lys

545 550 555 560

Ala Asp Asp Lys Glu Thr Cys Phe Ala Glu Glu Gly Lys Lys Leu Val

565 570 575

Ala Ala Ser Gln Ala Ala Leu Gly Leu

580 585

<210> 3

<211> 609

<212> PRT

<213> 智人

<220>

<221> SIGNAL

<222> (1)..(19)

<220>

<221> PROPEP

<222> (20)..(24)

<220>

<221> mat_peptide

<222> (25)..(609)

<400> 3

Met Lys Trp Val Thr Phe Ile Ser Leu Leu Phe Leu Phe Ser Ser Ala

-20 -15 -10

Tyr Ser Arg Gly Val Phe Arg Arg Asp Ala His Lys Ser Glu Val Ala

-5 -1 1 5

His Arg Phe Lys Asp Leu Gly Glu Glu Asn Phe Lys Ala Leu Val Leu

10 15 20

Ile Ala Phe Ala Gln Tyr Leu Gln Gln Cys Pro Phe Glu Asp His Val

25 30 35 40

Lys Leu Val Asn Glu Val Thr Glu Phe Ala Lys Thr Cys Val Ala Asp

45 50 55

Glu Ser Ala Glu Asn Cys Asp Lys Ser Leu His Thr Leu Phe Gly Asp

60 65 70

Lys Leu Cys Thr Val Ala Thr Leu Arg Glu Thr Tyr Gly Glu Met Ala

75 80 85

Asp Cys Cys Ala Lys Gln Glu Pro Glu Arg Asn Glu Cys Phe Leu Gln

90 95 100

His Lys Asp Asp Asn Pro Asn Leu Pro Arg Leu Val Arg Pro Glu Val

105 110 115 120

Asp Val Met Cys Thr Ala Phe His Asp Asn Glu Glu Thr Phe Leu Lys

125 130 135

Lys Tyr Leu Tyr Glu Ile Ala Arg Arg His Pro Tyr Phe Tyr Ala Pro

140 145 150

Glu Leu Leu Phe Phe Ala Lys Arg Tyr Lys Ala Ala Phe Thr Glu Cys

155 160 165

Cys Gln Ala Ala Asp Lys Ala Ala Cys Leu Leu Pro Lys Leu Asp Glu

170 175 180

Leu Arg Asp Glu Gly Lys Ala Ser Ser Ala Lys Gln Arg Leu Lys Cys

185 190 195 200

Ala Ser Leu Gln Lys Phe Gly Glu Arg Ala Phe Lys Ala Trp Ala Val

205 210 215

Ala Arg Leu Ser Gln Arg Phe Pro Lys Ala Glu Phe Ala Glu Val Ser

220 225 230

Lys Leu Val Thr Asp Leu Thr Lys Val His Thr Glu Cys Cys His Gly

235 240 245

Asp Leu Leu Glu Cys Ala Asp Asp Arg Ala Asp Leu Ala Lys Tyr Ile

250 255 260

Cys Glu Asn Gln Asp Ser Ile Ser Ser Lys Leu Lys Glu Cys Cys Glu

265 270 275 280

Lys Pro Leu Leu Glu Lys Ser His Cys Ile Ala Glu Val Glu Asn Asp

285 290 295

Glu Met Pro Ala Asp Leu Pro Ser Leu Ala Ala Asp Phe Val Glu Ser

300 305 310

Lys Asp Val Cys Lys Asn Tyr Ala Glu Ala Lys Asp Val Phe Leu Gly

315 320 325

Met Phe Leu Tyr Glu Tyr Ala Arg Arg His Pro Asp Tyr Ser Val Val

330 335 340

Leu Leu Leu Arg Leu Ala Lys Thr Tyr Glu Thr Thr Leu Glu Lys Cys

345 350 355 360

Cys Ala Ala Ala Asp Pro His Glu Cys Tyr Ala Lys Val Phe Asp Glu

365 370 375

Phe Lys Pro Leu Val Glu Glu Pro Gln Asn Leu Ile Lys Gln Asn Cys

380 385 390

Glu Leu Phe Glu Gln Leu Gly Glu Tyr Lys Phe Gln Asn Ala Leu Leu

395 400 405

Val Arg Tyr Thr Lys Lys Val Pro Gln Val Ser Thr Pro Thr Leu Val

410 415 420

Glu Val Ser Arg Asn Leu Gly Lys Val Gly Ser Lys Cys Cys Lys His

425 430 435 440

Pro Glu Ala Lys Arg Met Pro Cys Ala Glu Asp Tyr Leu Ser Val Val

445 450 455

Leu Asn Gln Leu Cys Val Leu His Glu Lys Thr Pro Val Ser Asp Arg

460 465 470

Val Thr Lys Cys Cys Thr Glu Ser Leu Val Asn Arg Arg Pro Cys Phe

475 480 485

Ser Ala Leu Glu Val Asp Glu Thr Tyr Val Pro Lys Glu Phe Asn Ala

490 495 500

Glu Thr Phe Thr Phe His Ala Asp Ile Cys Thr Leu Ser Glu Lys Glu

505 510 515 520

Arg Gln Ile Lys Lys Gln Thr Ala Leu Val Glu Leu Val Lys His Lys

525 530 535

Pro Lys Ala Thr Lys Glu Gln Leu Lys Ala Val Met Asp Asp Phe Ala

540 545 550

Ala Phe Val Glu Lys Cys Cys Lys Ala Asp Asp Lys Glu Thr Cys Phe

555 560 565

Ala Glu Glu Gly Lys Lys Leu Val Ala Ala Ser Gln Ala Ala Leu Gly

570 575 580

Leu

585

<210> 4

<211> 621

<212> PRT

<213> 黑猩猩（Pan troglodytes）

<400> 4

Met Asn Glu Ser Ser Cys Cys Ser Thr Ser Leu Pro Ala Phe Gly Val

1 5 10 15

Ser Val Leu Asp Ser Gly His Ser Ser Ser Ser Ala Tyr Ser Arg Gly

20 25 30

Val Phe Arg Arg Asp Ala His Lys Ser Glu Val Ala His Arg Phe Lys

35 40 45

Asp Leu Gly Glu Glu Asn Phe Lys Ala Leu Val Leu Val Ala Phe Ala

50 55 60

Gln Tyr Leu Gln Gln Cys Pro Phe Glu Asp His Val Lys Leu Val Asn

65 70 75 80

Glu Val Thr Glu Phe Ala Lys Thr Cys Val Ala Asp Glu Ser Ala Glu

85 90 95

Asn Cys Asp Lys Ser Leu His Thr Leu Phe Gly Asp Lys Leu Cys Thr

100 105 110

Val Ala Thr Leu Arg Glu Lys Tyr Gly Glu Met Ala Asp Cys Cys Ala

115 120 125

Lys Gln Glu Pro Glu Arg Asn Glu Cys Phe Leu Gln His Lys Asp Asp

130 135 140

Asn Pro Asn Leu Pro Arg Leu Val Arg Pro Glu Val Asp Val Met Cys

145 150 155 160

Thr Ala Phe His Asp Asn Glu Gly Thr Phe Leu Lys Lys Tyr Leu Tyr

165 170 175

Glu Val Ala Arg Arg His Pro Tyr Phe Tyr Ala Pro Glu Leu Leu Phe

180 185 190

Phe Ala Glu Arg Tyr Lys Ala Ala Phe Thr Glu Cys Cys Gln Ala Ala

195 200 205

Asp Lys Ala Ala Cys Leu Leu Pro Lys Leu Asp Glu Leu Arg Asp Glu

210 215 220

Gly Lys Ala Ser Ser Ala Lys Gln Arg Leu Lys Cys Ala Ser Leu Gln

225 230 235 240

Lys Phe Gly Glu Arg Ala Phe Lys Ala Trp Ala Val Ala Arg Leu Ser

245 250 255

Gln Arg Phe Pro Lys Ala Glu Phe Ala Glu Val Ser Lys Leu Val Thr

260 265 270

Asp Leu Thr Lys Val His Thr Glu Cys Cys His Gly Asp Leu Leu Glu

275 280 285

Cys Ala Asp Asp Arg Ala Asp Leu Ala Lys Tyr Ile Cys Glu Asn Gln

290 295 300

Asp Ser Ile Ser Ser Lys Leu Lys Glu Cys Cys Glu Lys Pro Leu Leu

305 310 315 320

Glu Lys Ser His Cys Leu Ala Glu Val Glu Asn Asp Glu Met Pro Ala

325 330 335

Asp Leu Pro Ser Leu Ala Ala Asp Phe Val Glu Ser Lys Glu Val Cys

340 345 350

Lys Asn Tyr Ala Glu Ala Lys Asp Val Phe Leu Gly Met Phe Leu Tyr

355 360 365

Glu Tyr Ala Arg Arg His Pro Asp Tyr Ser Val Val Leu Leu Leu Arg

370 375 380

Leu Ala Lys Thr Tyr Glu Thr Thr Leu Glu Lys Cys Cys Ala Ala Ala

385 390 395 400

Asp Pro His Glu Cys Tyr Ala Lys Val Phe Asp Glu Phe Lys Pro Leu

405 410 415

Val Glu Glu Pro Gln Asn Leu Ile Lys Gln Asn Cys Glu Leu Phe Glu

420 425 430

Gln Leu Gly Glu Tyr Lys Phe Gln Asn Ala Leu Leu Val Arg Tyr Thr

435 440 445

Lys Lys Val Pro Gln Val Ser Thr Pro Thr Leu Val Glu Val Ser Arg

450 455 460

Asn Leu Gly Lys Val Gly Ser Lys Cys Cys Lys His Pro Glu Ala Lys

465 470 475 480

Arg Met Pro Cys Ala Glu Asp Tyr Leu Ser Val Val Leu Asn Gln Leu

485 490 495

Cys Val Leu His Glu Lys Thr Pro Val Ser Asp Arg Val Thr Lys Cys

500 505 510

Cys Thr Glu Ser Leu Val Asn Arg Arg Pro Cys Phe Ser Ala Leu Glu

515 520 525

Val Asp Glu Thr Tyr Val Pro Lys Glu Phe Asn Ala Glu Thr Phe Thr

530 535 540

Phe His Ala Asp Ile Cys Thr Leu Ser Glu Lys Glu Arg Gln Ile Lys

545 550 555 560

Lys Gln Thr Ala Leu Val Glu Leu Val Lys His Lys Pro Lys Ala Thr

565 570 575

Lys Glu Gln Leu Lys Ala Val Met Asp Asp Phe Ala Ala Phe Val Glu

580 585 590

Lys Cys Cys Lys Ala Asp Asp Lys Glu Thr Cys Phe Ala Glu Glu Gly

595 600 605

Lys Lys Leu Val Ala Ala Ser Gln Ala Ala Leu Gly Leu

610 615 620

<210> 5

<211> 608

<212> PRT

<213> 猕猴（Macaca mulatta）

<400> 5

Met Lys Trp Val Thr Phe Ile Ser Leu Leu Phe Leu Phe Ser Ser Ala

1 5 10 15

Tyr Ser Arg Gly Val Phe Arg Arg Asp Thr His Lys Ser Glu Val Ala

20 25 30

His Arg Phe Lys Asp Leu Gly Glu Glu His Phe Lys Gly Leu Val Leu

35 40 45

Val Ala Phe Ser Gln Tyr Leu Gln Gln Cys Pro Phe Glu Glu His Val

50 55 60

Lys Leu Val Asn Glu Val Thr Glu Phe Ala Lys Thr Cys Val Ala Asp

65 70 75 80

Glu Ser Ala Glu Asn Cys Asp Lys Ser Leu His Thr Leu Phe Gly Asp

85 90 95

Lys Leu Cys Thr Val Ala Thr Leu Arg Glu Thr Tyr Gly Glu Met Ala

100 105 110

Asp Cys Cys Ala Lys Gln Glu Pro Glu Arg Asn Glu Cys Phe Leu Gln

115 120 125

His Lys Asp Asp Asn Pro Asn Leu Pro Pro Leu Val Arg Pro Glu Val

130 135 140

Asp Val Met Cys Thr Ala Phe His Asp Asn Glu Ala Thr Phe Leu Lys

145 150 155 160

Lys Tyr Leu Tyr Glu Val Ala Arg Arg His Pro Tyr Phe Tyr Ala Pro

165 170 175

Glu Leu Leu Phe Phe Ala Ala Arg Tyr Lys Ala Ala Phe Ala Glu Cys

180 185 190

Cys Gln Ala Ala Asp Lys Ala Ala Cys Leu Leu Pro Lys Leu Asp Glu

195 200 205

Leu Arg Asp Glu Gly Lys Ala Ser Ser Ala Lys Gln Arg Leu Lys Cys

210 215 220

Ala Ser Leu Gln Lys Phe Gly Asp Arg Ala Phe Lys Ala Trp Ala Val

225 230 235 240

Ala Arg Leu Ser Gln Lys Phe Pro Lys Ala Glu Phe Ala Glu Val Ser

245 250 255

Lys Leu Val Thr Asp Leu Thr Lys Val His Thr Glu Cys Cys His Gly

260 265 270

Asp Leu Leu Glu Cys Ala Asp Asp Arg Ala Asp Leu Ala Lys Tyr Met

275 280 285

Cys Glu Asn Gln Asp Ser Ile Ser Ser Lys Leu Lys Glu Cys Cys Asp

290 295 300

Lys Pro Leu Leu Glu Lys Ser His Cys Leu Ala Glu Val Glu Asn Asp

305 310 315 320

Glu Met Pro Ala Asp Leu Pro Ser Leu Ala Ala Asp Tyr Val Glu Ser

325 330 335

Lys Asp Val Cys Lys Asn Tyr Ala Glu Ala Lys Asp Val Phe Leu Gly

340 345 350

Met Phe Leu Tyr Glu Tyr Ala Arg Arg His Pro Asp Tyr Ser Val Met

355 360 365

Leu Leu Leu Arg Leu Ala Lys Ala Tyr Glu Ala Thr Leu Glu Lys Cys

370 375 380

Cys Ala Ala Ala Asp Pro His Glu Cys Tyr Ala Lys Val Phe Asp Glu

385 390 395 400

Phe Gln Pro Leu Val Glu Glu Pro Gln Asn Leu Val Lys Gln Asn Cys

405 410 415

Glu Leu Phe Glu Gln Leu Gly Glu Tyr Lys Phe Gln Asn Ala Leu Leu

420 425 430

Val Arg Tyr Thr Lys Lys Val Pro Gln Val Ser Thr Pro Thr Leu Val

435 440 445

Glu Val Ser Arg Asn Leu Gly Lys Val Gly Ala Lys Cys Cys Lys Leu

450 455 460

Pro Glu Ala Lys Arg Met Pro Cys Ala Glu Asp Tyr Leu Ser Val Val

465 470 475 480

Leu Asn Arg Leu Cys Val Leu His Glu Lys Thr Pro Val Ser Glu Lys

485 490 495

Val Thr Lys Cys Cys Thr Glu Ser Leu Val Asn Arg Arg Pro Cys Phe

500 505 510

Ser Ala Leu Glu Leu Asp Glu Ala Tyr Val Pro Lys Ala Phe Asn Ala

515 520 525

Glu Thr Phe Thr Phe His Ala Asp Met Cys Thr Leu Ser Glu Lys Glu

530 535 540

Lys Gln Val Lys Lys Gln Thr Ala Leu Val Glu Leu Val Lys His Lys

545 550 555 560

Pro Lys Ala Thr Lys Glu Gln Leu Lys Gly Val Met Asp Asn Phe Ala

565 570 575

Ala Phe Val Glu Lys Cys Cys Lys Ala Asp Asp Lys Glu Ala Cys Phe

580 585 590

Ala Glu Glu Gly Pro Lys Phe Val Ala Ala Ser Gln Ala Ala Leu Ala

595 600 605

<210> 6

<211> 608

<212> PRT

<213> 叙利亚仓鼠（Mesocricetus auratus）

<400> 6

Met Lys Trp Val Thr Phe Leu Leu Leu Leu Phe Val Ser Asp Ser Ala

1 5 10 15

Phe Ser Arg Gly Leu Phe Arg Arg Asp Ala His Lys Ser Glu Ile Ala

20 25 30

His Arg Phe Lys Asp Leu Gly Glu Gln His Phe Lys Gly Leu Val Leu

35 40 45

Ile Ala Phe Ser Gln Phe Leu Gln Lys Cys Pro Tyr Glu Glu His Val

50 55 60

Lys Leu Val Asn Glu Val Thr Asp Phe Ala Lys Thr Cys Val Ala Asp

65 70 75 80

Glu Ser Ala Glu Asn Cys Asp Lys Ser Leu His Thr Leu Phe Gly Asp

85 90 95

Lys Leu Cys Ala Ile Pro Thr Leu Arg Asp Ser Tyr Gly Glu Leu Ala

100 105 110

Asp Cys Cys Ala Lys Lys Glu Pro Glu Arg Asn Glu Cys Phe Leu Lys

115 120 125

His Lys Asp Asp His Pro Asn Leu Pro Pro Phe Val Arg Pro Asp Ala

130 135 140

Glu Ala Met Cys Thr Ser Phe Gln Glu Asn Ala Val Thr Phe Met Gly

145 150 155 160

His Tyr Leu His Glu Val Ala Arg Arg His Pro Tyr Phe Tyr Ala Pro

165 170 175

Glu Leu Leu Tyr Tyr Ala Glu Lys Tyr Ser Ala Ile Met Thr Glu Cys

180 185 190

Cys Gly Glu Ala Asp Lys Ala Ala Cys Ile Thr Pro Lys Leu Asp Ala

195 200 205

Leu Lys Glu Lys Ala Leu Ala Ser Ser Val Asn Gln Arg Leu Lys Cys

210 215 220

Ser Ser Leu Gln Arg Phe Gly Gln Arg Ala Phe Lys Ala Trp Ala Val

225 230 235 240

Ala Arg Met Ser Gln Lys Phe Pro Lys Ala Asp Phe Ala Glu Ile Thr

245 250 255

Lys Leu Ala Thr Asp Leu Thr Lys Leu Thr Glu Glu Cys Cys His Gly

260 265 270

Asp Leu Leu Glu Cys Ala Asp Asp Arg Ala Glu Leu Ala Lys Tyr Met

275 280 285

Cys Glu Asn Gln Ala Ser Ile Ser Ser Lys Leu Gln Ala Cys Cys Asp

290 295 300

Lys Pro Val Leu Lys Lys Ser His Cys Leu Ser Glu Val Glu Asn Asp

305 310 315 320

Asp Leu Pro Ala Asp Leu Pro Ser Leu Ala Ala Asp Phe Val Glu Asp

325 330 335

Lys Glu Val Cys Lys Asn Tyr Ala Glu Ala Lys Asp Val Phe Leu Gly

340 345 350

Thr Phe Leu Tyr Glu Tyr Ala Arg Arg His Pro Asp Tyr Ser Val Ala

355 360 365

Leu Leu Leu Arg Leu Ala Lys Lys Tyr Glu Ala Thr Leu Glu Lys Cys

370 375 380

Cys Ala Glu Ala Asp Pro Ser Ala Cys Tyr Gly Lys Val Leu Asp Glu

385 390 395 400

Phe Gln Pro Leu Val Glu Glu Pro Lys Asn Leu Val Lys Ala Asn Cys

405 410 415

Glu Leu Phe Glu Lys Leu Gly Glu Tyr Gly Phe Gln Asn Ala Leu Ile

420 425 430

Val Arg Tyr Thr Gln Lys Ala Pro Gln Val Ser Thr Pro Thr Leu Val

435 440 445

Glu Ala Ala Arg Asn Leu Gly Lys Val Gly Ser Lys Cys Cys Val Leu

450 455 460

Pro Glu Ala Gln Arg Leu Pro Cys Val Glu Asp Tyr Ile Ser Ala Ile

465 470 475 480

Leu Asn Arg Val Cys Val Leu His Glu Lys Thr Pro Val Ser Glu Gln

485 490 495

Val Thr Lys Cys Cys Thr Gly Ser Val Val Glu Arg Arg Pro Cys Phe

500 505 510

Ser Ala Leu Pro Val Asp Glu Thr Tyr Val Pro Lys Glu Phe Lys Ala

515 520 525

Glu Thr Phe Thr Phe His Ala Asp Ile Cys Ser Leu Pro Glu Lys Glu

530 535 540

Lys Gln Met Lys Lys Gln Ala Ala Leu Val Glu Leu Val Lys His Lys

545 550 555 560

Pro Lys Ala Thr Gly Pro Gln Leu Arg Thr Val Leu Gly Glu Phe Thr

565 570 575

Ala Phe Leu Asp Lys Cys Cys Lys Ala Glu Asp Lys Glu Ala Cys Phe

580 585 590

Ser Glu Asp Gly Pro Lys Leu Val Ala Ser Ser Gln Ala Ala Leu Ala

595 600 605

<210> 7

<211> 608

<212> PRT

<213> 豚鼠（Cavia porcellus）

<400> 7

Met Lys Trp Val Thr Phe Ile Ser Leu Leu Phe Leu Phe Ser Ser Val

1 5 10 15

Tyr Ser Arg Gly Val Phe Arg Arg Glu Ala His Lys Ser Glu Ile Ala

20 25 30

His Arg Phe Asn Asp Leu Gly Glu Gly His Phe Lys Gly Leu Val Leu

35 40 45

Ile Thr Leu Ser Gln His Leu Gln Lys Ser Pro Phe Glu Glu His Val

50 55 60

Lys Leu Val Asn Glu Val Thr Asp Phe Ala Lys Ala Cys Val Ala Asp

65 70 75 80

Glu Ser Ala Gln Asn Cys Gly Lys Ala Ile Ala Thr Leu Phe Gly Asp

85 90 95

Lys Val Cys Ala Ile Pro Ser Leu Arg Glu Thr Tyr Gly Glu Leu Ala

100 105 110

Asp Cys Cys Ala Lys Glu Asp Pro Asp Arg Val Glu Cys Phe Leu Gln

115 120 125

His Lys Asp Asp Asn Pro Asn Leu Pro Pro Phe Glu Arg Pro Glu Pro

130 135 140

Glu Ala Leu Cys Thr Ala Phe Lys Glu Asn Asn Asp Arg Phe Ile Gly

145 150 155 160

His Tyr Leu Tyr Glu Val Ser Arg Arg His Pro Tyr Phe Tyr Ala Pro

165 170 175

Glu Leu Leu Tyr Tyr Ala Glu Lys Tyr Lys Asn Ala Leu Thr Glu Cys

180 185 190

Cys Glu Ala Ala Asp Lys Ala Ala Cys Leu Thr Pro Lys Leu Asp Ala

195 200 205

Ile Lys Glu Lys Ala Leu Val Ser Ser Ala Gln Gln Arg Leu Lys Cys

210 215 220

Ala Ser Leu Gln Lys Phe Gly Glu Arg Ala Phe Lys Ala Trp Ser Val

225 230 235 240

Ala Arg Leu Ser Gln Lys Phe Pro Lys Ala Glu Phe Ala Glu Ile Ser

245 250 255

Thr Ile Val Thr Ser Leu Thr Lys Val Thr Lys Glu Cys Cys His Gly

260 265 270

Asp Leu Leu Glu Cys Ala Asp Asp Arg Gln Glu Leu Ala Lys Tyr Met

275 280 285

Cys Glu His Gln Asp Ser Ile Ser Ser Lys Leu Lys Glu Cys Cys Val

290 295 300

Lys Pro Thr Leu Gln Lys Ala His Cys Ile Leu Glu Ile Gln Arg Asp

305 310 315 320

Glu Leu Pro Thr Glu Leu Pro Asp Leu Ala Val Asp Phe Val Glu Asp

325 330 335

Lys Glu Val Cys Lys Asn Phe Ala Glu Ala Lys Asp Val Phe Leu Gly

340 345 350

Thr Phe Leu Tyr Glu Tyr Ser Arg Arg His Pro Glu Tyr Ser Ile Gly

355 360 365

Met Leu Leu Arg Ile Ala Lys Gly Tyr Glu Ala Lys Leu Glu Lys Cys

370 375 380

Cys Ala Glu Ala Asp Pro His Ala Cys Tyr Ala Lys Val Phe Asp Glu

385 390 395 400

Leu Gln Pro Leu Ile Asp Glu Pro Lys Lys Leu Val Gln Gln Asn Cys

405 410 415

Glu Leu Phe Asp Lys Leu Gly Glu Tyr Gly Phe Gln Asn Ala Leu Ala

420 425 430

Val Arg Tyr Thr Gln Lys Ala Pro Gln Val Ser Thr Pro Thr Leu Val

435 440 445

Glu Tyr Ala Arg Lys Leu Gly Ser Val Gly Thr Lys Cys Cys Ser Leu

450 455 460

Pro Glu Thr Glu Arg Leu Ser Cys Thr Glu Asn Tyr Leu Ala Leu Ile

465 470 475 480

Leu Asn Arg Leu Cys Ile Leu His Glu Lys Thr Pro Val Ser Glu Arg

485 490 495

Val Thr Lys Cys Cys Thr Glu Ser Leu Val Asn Arg Arg Pro Cys Phe

500 505 510

Ser Ala Leu His Val Asp Glu Thr Tyr Val Pro Lys Pro Phe His Ala

515 520 525

Asp Ser Phe Thr Phe His Ala Asp Ile Cys Thr Leu Pro Glu Lys Glu

530 535 540

Lys Gln Val Lys Lys Gln Met Ala Leu Val Glu Leu Val Lys His Lys

545 550 555 560

Pro Lys Ala Ser Glu Glu Gln Met Lys Thr Val Met Gly Asp Phe Ala

565 570 575

Ala Phe Leu Lys Lys Cys Cys Asp Ala Asp Asn Lys Glu Ala Cys Phe

580 585 590

Thr Glu Asp Gly Pro Lys Leu Val Ala Lys Cys Gln Ala Thr Leu Ala

595 600 605

<210> 8

<211> 608

<212> PRT

<213> 小家鼠（Mus musculus）

<400> 8

Met Lys Trp Val Thr Phe Leu Leu Leu Leu Phe Val Ser Gly Ser Ala

1 5 10 15

Phe Ser Arg Gly Val Phe Arg Arg Glu Ala His Lys Ser Glu Ile Ala

20 25 30

His Arg Tyr Asn Asp Leu Gly Glu Gln His Phe Lys Gly Leu Val Leu

35 40 45

Ile Ala Phe Ser Gln Tyr Leu Gln Lys Cys Ser Tyr Asp Glu His Ala

50 55 60

Lys Leu Val Gln Glu Val Thr Asp Phe Ala Lys Thr Cys Val Ala Asp

65 70 75 80

Glu Ser Ala Ala Asn Cys Asp Lys Ser Leu His Thr Leu Phe Gly Asp

85 90 95

Lys Leu Cys Ala Ile Pro Asn Leu Arg Glu Asn Tyr Gly Glu Leu Ala

100 105 110

Asp Cys Cys Thr Lys Gln Glu Pro Glu Arg Asn Glu Cys Phe Leu Gln

115 120 125

His Lys Asp Asp Asn Pro Ser Leu Pro Pro Phe Glu Arg Pro Glu Ala

130 135 140

Glu Ala Met Cys Thr Ser Phe Lys Glu Asn Pro Thr Thr Phe Met Gly

145 150 155 160

His Tyr Leu His Glu Val Ala Arg Arg His Pro Tyr Phe Tyr Ala Pro

165 170 175

Glu Leu Leu Tyr Tyr Ala Glu Gln Tyr Asn Glu Ile Leu Thr Gln Cys

180 185 190

Cys Ala Glu Ala Asp Lys Glu Ser Cys Leu Thr Pro Lys Leu Asp Gly

195 200 205

Val Lys Glu Lys Ala Leu Val Ser Ser Val Arg Gln Arg Met Lys Cys

210 215 220

Ser Ser Met Gln Lys Phe Gly Glu Arg Ala Phe Lys Ala Trp Ala Val

225 230 235 240

Ala Arg Leu Ser Gln Thr Phe Pro Asn Ala Asp Phe Ala Glu Ile Thr

245 250 255

Lys Leu Ala Thr Asp Leu Thr Lys Val Asn Lys Glu Cys Cys His Gly

260 265 270

Asp Leu Leu Glu Cys Ala Asp Asp Arg Ala Glu Leu Ala Lys Tyr Met

275 280 285

Cys Glu Asn Gln Ala Thr Ile Ser Ser Lys Leu Gln Thr Cys Cys Asp

290 295 300

Lys Pro Leu Leu Lys Lys Ala His Cys Leu Ser Glu Val Glu His Asp

305 310 315 320

Thr Met Pro Ala Asp Leu Pro Ala Ile Ala Ala Asp Phe Val Glu Asp

325 330 335

Gln Glu Val Cys Lys Asn Tyr Ala Glu Ala Lys Asp Val Phe Leu Gly

340 345 350

Thr Phe Leu Tyr Glu Tyr Ser Arg Arg His Pro Asp Tyr Ser Val Ser

355 360 365

Leu Leu Leu Arg Leu Ala Lys Lys Tyr Glu Ala Thr Leu Glu Lys Cys

370 375 380

Cys Ala Glu Ala Asn Pro Pro Ala Cys Tyr Gly Thr Val Leu Ala Glu

385 390 395 400

Phe Gln Pro Leu Val Glu Glu Pro Lys Asn Leu Val Lys Thr Asn Cys

405 410 415

Asp Leu Tyr Glu Lys Leu Gly Glu Tyr Gly Phe Gln Asn Ala Ile Leu

420 425 430

Val Arg Tyr Thr Gln Lys Ala Pro Gln Val Ser Thr Pro Thr Leu Val

435 440 445

Glu Ala Ala Arg Asn Leu Gly Arg Val Gly Thr Lys Cys Cys Thr Leu

450 455 460

Pro Glu Asp Gln Arg Leu Pro Cys Val Glu Asp Tyr Leu Ser Ala Ile

465 470 475 480

Leu Asn Arg Val Cys Leu Leu His Glu Lys Thr Pro Val Ser Glu His

485 490 495

Val Thr Lys Cys Cys Ser Gly Ser Leu Val Glu Arg Arg Pro Cys Phe

500 505 510

Ser Ala Leu Thr Val Asp Glu Thr Tyr Val Pro Lys Glu Phe Lys Ala

515 520 525

Glu Thr Phe Thr Phe His Ser Asp Ile Cys Thr Leu Pro Glu Lys Glu

530 535 540

Lys Gln Ile Lys Lys Gln Thr Ala Leu Ala Glu Leu Val Lys His Lys

545 550 555 560

Pro Lys Ala Thr Ala Glu Gln Leu Lys Thr Val Met Asp Asp Phe Ala

565 570 575

Gln Phe Leu Asp Thr Cys Cys Lys Ala Ala Asp Lys Asp Thr Cys Phe

580 585 590

Ser Thr Glu Gly Pro Asn Leu Val Thr Arg Cys Lys Asp Ala Leu Ala

595 600 605

<210> 9

<211> 608

<212> PRT

<213> 褐家鼠（Rattus norvegicus）

<400> 9

Met Lys Trp Val Thr Phe Leu Leu Leu Leu Phe Ile Ser Gly Ser Ala

1 5 10 15

Phe Ser Arg Gly Val Phe Arg Arg Glu Ala His Lys Ser Glu Ile Ala

20 25 30

His Arg Phe Lys Asp Leu Gly Glu Gln His Phe Lys Gly Leu Val Leu

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Ile Ala Phe Ser Gln Tyr Leu Gln Lys Cys Pro Tyr Glu Glu His Ile

50 55 60

Lys Leu Val Gln Glu Val Thr Asp Phe Ala Lys Thr Cys Val Ala Asp

65 70 75 80

Glu Asn Ala Glu Asn Cys Asp Lys Ser Ile His Thr Leu Phe Gly Asp

85 90 95

Lys Leu Cys Ala Ile Pro Lys Leu Arg Asp Asn Tyr Gly Glu Leu Ala

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Asp Cys Cys Ala Lys Gln Glu Pro Glu Arg Asn Glu Cys Phe Leu Gln

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His Lys Asp Asp Asn Pro Asn Leu Pro Pro Phe Gln Arg Pro Glu Ala

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Ser Ser Met Gln Arg Phe Gly Glu Arg Ala Phe Lys Ala Trp Ala Val

225 230 235 240

Ala Arg Met Ser Gln Arg Phe Pro Asn Ala Glu Phe Ala Glu Ile Thr

245 250 255

Lys Leu Ala Thr Asp Val Thr Lys Ile Asn Lys Glu Cys Cys His Gly

260 265 270

Asp Leu Leu Glu Cys Ala Asp Asp Arg Ala Glu Leu Ala Lys Tyr Met

275 280 285

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Lys Pro Val Leu Gln Lys Ser Gln Cys Leu Ala Glu Ile Glu His Asp

305 310 315 320

Asn Ile Pro Ala Asp Leu Pro Ser Ile Ala Ala Asp Phe Val Glu Asp

325 330 335

Lys Glu Val Cys Lys Asn Tyr Ala Glu Ala Lys Asp Val Phe Leu Gly

340 345 350

Thr Phe Leu Tyr Glu Tyr Ser Arg Arg His Pro Asp Tyr Ser Val Ser

355 360 365

Leu Leu Leu Arg Leu Ala Lys Lys Tyr Glu Ala Thr Leu Glu Lys Cys

370 375 380

Cys Ala Glu Gly Asp Pro Pro Ala Cys Tyr Gly Thr Val Leu Ala Glu

385 390 395 400

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405 410 415

Glu Leu Tyr Glu Lys Leu Gly Glu Tyr Gly Phe Gln Asn Ala Val Leu

420 425 430

Val Arg Tyr Thr Gln Lys Ala Pro Gln Val Ser Thr Pro Thr Leu Val

435 440 445

Glu Ala Ala Arg Asn Leu Gly Arg Val Gly Thr Lys Cys Cys Thr Leu

450 455 460

Pro Glu Ala Gln Arg Leu Pro Cys Val Glu Asp Tyr Leu Ser Ala Ile

465 470 475 480

Leu Asn Arg Leu Cys Val Leu His Glu Lys Thr Pro Val Ser Glu Lys

485 490 495

Val Thr Lys Cys Cys Ser Gly Ser Leu Val Glu Arg Arg Pro Cys Phe

500 505 510

Ser Ala Leu Thr Val Asp Glu Thr Tyr Val Pro Lys Glu Phe Lys Ala

515 520 525

Glu Thr Phe Thr Phe His Ser Asp Ile Cys Thr Leu Pro Asp Lys Glu

530 535 540

Lys Gln Ile Lys Lys Gln Thr Ala Leu Ala Glu Leu Val Lys His Lys

545 550 555 560

Pro Lys Ala Thr Glu Asp Gln Leu Lys Thr Val Met Gly Asp Phe Ala

565 570 575

Gln Phe Val Asp Lys Cys Cys Lys Ala Ala Asp Lys Asp Asn Cys Phe

580 585 590

Ala Thr Glu Gly Pro Asn Leu Val Ala Arg Ser Lys Glu Ala Leu Ala

595 600 605

<210> 10

<211> 607

<212> PRT

<213> 牛（Bos taurus）

<400> 10

Met Lys Trp Val Thr Phe Ile Ser Leu Leu Leu Leu Phe Ser Ser Ala

1 5 10 15

Tyr Ser Arg Gly Val Phe Arg Arg Asp Thr His Lys Ser Glu Ile Ala

20 25 30

His Arg Phe Lys Asp Leu Gly Glu Glu His Phe Lys Gly Leu Val Leu

35 40 45

Ile Ala Phe Ser Gln Tyr Leu Gln Gln Cys Pro Phe Asp Glu His Val

50 55 60

Lys Leu Val Asn Glu Leu Thr Glu Phe Ala Lys Thr Cys Val Ala Asp

65 70 75 80

Glu Ser His Ala Gly Cys Glu Lys Ser Leu His Thr Leu Phe Gly Asp

85 90 95

Glu Leu Cys Lys Val Ala Ser Leu Arg Glu Thr Tyr Gly Asp Met Ala

100 105 110

Asp Cys Cys Glu Lys Gln Glu Pro Glu Arg Asn Glu Cys Phe Leu Ser

115 120 125

His Lys Asp Asp Ser Pro Asp Leu Pro Lys Leu Lys Pro Asp Pro Asn

130 135 140

Thr Leu Cys Asp Glu Phe Lys Ala Asp Glu Lys Lys Phe Trp Gly Lys

145 150 155 160

Tyr Leu Tyr Glu Ile Ala Arg Arg His Pro Tyr Phe Tyr Ala Pro Glu

165 170 175

Leu Leu Tyr Tyr Ala Asn Lys Tyr Asn Gly Val Phe Gln Glu Cys Cys

180 185 190

Gln Ala Glu Asp Lys Gly Ala Cys Leu Leu Pro Lys Ile Glu Thr Met

195 200 205

Arg Glu Lys Val Leu Ala Ser Ser Ala Arg Gln Arg Leu Arg Cys Ala

210 215 220

Ser Ile Gln Lys Phe Gly Glu Arg Ala Leu Lys Ala Trp Ser Val Ala

225 230 235 240

Arg Leu Ser Gln Lys Phe Pro Lys Ala Glu Phe Val Glu Val Thr Lys

245 250 255

Leu Val Thr Asp Leu Thr Lys Val His Lys Glu Cys Cys His Gly Asp

260 265 270

Leu Leu Glu Cys Ala Asp Asp Arg Ala Asp Leu Ala Lys Tyr Ile Cys

275 280 285

Asp Asn Gln Asp Thr Ile Ser Ser Lys Leu Lys Glu Cys Cys Asp Lys

290 295 300

Pro Leu Leu Glu Lys Ser His Cys Ile Ala Glu Val Glu Lys Asp Ala

305 310 315 320

Ile Pro Glu Asn Leu Pro Pro Leu Thr Ala Asp Phe Ala Glu Asp Lys

325 330 335

Asp Val Cys Lys Asn Tyr Gln Glu Ala Lys Asp Ala Phe Leu Gly Ser

340 345 350

Phe Leu Tyr Glu Tyr Ser Arg Arg His Pro Glu Tyr Ala Val Ser Val

355 360 365

Leu Leu Arg Leu Ala Lys Glu Tyr Glu Ala Thr Leu Glu Glu Cys Cys

370 375 380

Ala Lys Asp Asp Pro His Ala Cys Tyr Ser Thr Val Phe Asp Lys Leu

385 390 395 400

Lys His Leu Val Asp Glu Pro Gln Asn Leu Ile Lys Gln Asn Cys Asp

405 410 415

Gln Phe Glu Lys Leu Gly Glu Tyr Gly Phe Gln Asn Ala Leu Ile Val

420 425 430

Arg Tyr Thr Arg Lys Val Pro Gln Val Ser Thr Pro Thr Leu Val Glu

435 440 445

Val Ser Arg Ser Leu Gly Lys Val Gly Thr Arg Cys Cys Thr Lys Pro

450 455 460

Glu Ser Glu Arg Met Pro Cys Thr Glu Asp Tyr Leu Ser Leu Ile Leu

465 470 475 480

Asn Arg Leu Cys Val Leu His Glu Lys Thr Pro Val Ser Glu Lys Val

485 490 495

Thr Lys Cys Cys Thr Glu Ser Leu Val Asn Arg Arg Pro Cys Phe Ser

500 505 510

Ala Leu Thr Pro Asp Glu Thr Tyr Val Pro Lys Ala Phe Asp Glu Lys

515 520 525

Leu Phe Thr Phe His Ala Asp Ile Cys Thr Leu Pro Asp Thr Glu Lys

530 535 540

Gln Ile Lys Lys Gln Thr Ala Leu Val Glu Leu Leu Lys His Lys Pro

545 550 555 560

Lys Ala Thr Glu Glu Gln Leu Lys Thr Val Met Glu Asn Phe Val Ala

565 570 575

Phe Val Asp Lys Cys Cys Ala Ala Asp Asp Lys Glu Ala Cys Phe Ala

580 585 590

Val Glu Gly Pro Lys Leu Val Val Ser Thr Gln Thr Ala Leu Ala

595 600 605

<210> 11

<211> 607

<212> PRT

<213> 马（Equus caballus）

<400> 11

Met Lys Trp Val Thr Phe Val Ser Leu Leu Phe Leu Phe Ser Ser Ala

1 5 10 15

Tyr Ser Arg Gly Val Leu Arg Arg Asp Thr His Lys Ser Glu Ile Ala

20 25 30

His Arg Phe Asn Asp Leu Gly Glu Lys His Phe Lys Gly Leu Val Leu

35 40 45

Val Ala Phe Ser Gln Tyr Leu Gln Gln Cys Pro Phe Glu Asp His Val

50 55 60

Lys Leu Val Asn Glu Val Thr Glu Phe Ala Lys Lys Cys Ala Ala Asp

65 70 75 80

Glu Ser Ala Glu Asn Cys Asp Lys Ser Leu His Thr Leu Phe Gly Asp

85 90 95

Lys Leu Cys Thr Val Ala Thr Leu Arg Ala Thr Tyr Gly Glu Leu Ala

100 105 110

Asp Cys Cys Glu Lys Gln Glu Pro Glu Arg Asn Glu Cys Phe Leu Thr

115 120 125

His Lys Asp Asp His Pro Asn Leu Pro Lys Leu Lys Pro Glu Pro Asp

130 135 140

Ala Gln Cys Ala Ala Phe Gln Glu Asp Pro Asp Lys Phe Leu Gly Lys

145 150 155 160

Tyr Leu Tyr Glu Val Ala Arg Arg His Pro Tyr Phe Tyr Gly Pro Glu

165 170 175

Leu Leu Phe His Ala Glu Glu Tyr Lys Ala Asp Phe Thr Glu Cys Cys

180 185 190

Pro Ala Asp Asp Lys Leu Ala Cys Leu Ile Pro Lys Leu Asp Ala Leu

195 200 205

Lys Glu Arg Ile Leu Leu Ser Ser Ala Lys Glu Arg Leu Lys Cys Ser

210 215 220

Ser Phe Gln Asn Phe Gly Glu Arg Ala Val Lys Ala Trp Ser Val Ala

225 230 235 240

Arg Leu Ser Gln Lys Phe Pro Lys Ala Asp Phe Ala Glu Val Ser Lys

245 250 255

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260 265 270

Leu Leu Glu Cys Ala Asp Asp Arg Ala Asp Leu Ala Lys Tyr Ile Cys

275 280 285

Glu His Gln Asp Ser Ile Ser Gly Lys Leu Lys Ala Cys Cys Asp Lys

290 295 300

Pro Leu Leu Gln Lys Ser His Cys Ile Ala Glu Val Lys Glu Asp Asp

305 310 315 320

Leu Pro Ser Asp Leu Pro Ala Leu Ala Ala Asp Phe Ala Glu Asp Lys

325 330 335

Glu Ile Cys Lys His Tyr Lys Asp Ala Lys Asp Val Phe Leu Gly Thr

340 345 350

Phe Leu Tyr Glu Tyr Ser Arg Arg His Pro Asp Tyr Ser Val Ser Leu

355 360 365

Leu Leu Arg Ile Ala Lys Thr Tyr Glu Ala Thr Leu Glu Lys Cys Cys

370 375 380

Ala Glu Ala Asp Pro Pro Ala Cys Tyr Arg Thr Val Phe Asp Gln Phe

385 390 395 400

Thr Pro Leu Val Glu Glu Pro Lys Ser Leu Val Lys Lys Asn Cys Asp

405 410 415

Leu Phe Glu Glu Val Gly Glu Tyr Asp Phe Gln Asn Ala Leu Ile Val

420 425 430

Arg Tyr Thr Lys Lys Ala Pro Gln Val Ser Thr Pro Thr Leu Val Glu

435 440 445

Ile Gly Arg Thr Leu Gly Lys Val Gly Ser Arg Cys Cys Lys Leu Pro

450 455 460

Glu Ser Glu Arg Leu Pro Cys Ser Glu Asn His Leu Ala Leu Ala Leu

465 470 475 480

Asn Arg Leu Cys Val Leu His Glu Lys Thr Pro Val Ser Glu Lys Ile

485 490 495

Thr Lys Cys Cys Thr Asp Ser Leu Ala Glu Arg Arg Pro Cys Phe Ser

500 505 510

Ala Leu Glu Leu Asp Glu Gly Tyr Val Pro Lys Glu Phe Lys Ala Glu

515 520 525

Thr Phe Thr Phe His Ala Asp Ile Cys Thr Leu Pro Glu Asp Glu Lys

530 535 540

Gln Ile Lys Lys Gln Ser Ala Leu Ala Glu Leu Val Lys His Lys Pro

545 550 555 560

Lys Ala Thr Lys Glu Gln Leu Lys Thr Val Leu Gly Asn Phe Ser Ala

565 570 575

Phe Val Ala Lys Cys Cys Gly Arg Glu Asp Lys Glu Ala Cys Phe Ala

580 585 590

Glu Glu Gly Pro Lys Leu Val Ala Ser Ser Gln Leu Ala Leu Ala

595 600 605

<210> 12

<211> 607

<212> PRT

<213> 驴（Equus asinus）

<400> 12

Met Lys Trp Val Thr Phe Val Ser Leu Leu Phe Leu Phe Ser Ser Ala

1 5 10 15

Tyr Phe Arg Gly Val Leu Arg Arg Asp Thr His Lys Ser Glu Ile Ala

20 25 30

His Arg Phe Asn Asp Leu Gly Glu Lys His Phe Lys Gly Leu Val Leu

35 40 45

Val Ala Phe Ser Gln Tyr Leu Gln Gln Cys Pro Phe Glu Asp His Val

50 55 60

Lys Leu Val Asn Glu Val Thr Glu Phe Ala Lys Lys Cys Ala Ala Asp

65 70 75 80

Glu Ser Ala Glu Asn Cys Asp Lys Ser Leu His Thr Leu Phe Gly Asp

85 90 95

Lys Leu Cys Thr Val Ala Thr Leu Arg Ala Thr Tyr Gly Glu Leu Ala

100 105 110

Asp Cys Cys Glu Lys Gln Glu Pro Glu Arg Asn Glu Cys Phe Leu Thr

115 120 125

His Lys Asp Asp His Pro Asn Leu Pro Lys Leu Lys Pro Glu Pro Asp

130 135 140

Ala Gln Cys Ala Ala Phe Gln Glu Asp Pro Asp Lys Phe Leu Gly Lys

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Tyr Leu Tyr Glu Val Ala Arg Arg His Pro Tyr Phe Tyr Gly Pro Glu

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Leu Leu Phe His Ala Glu Glu Tyr Lys Ala Asp Phe Thr Glu Cys Cys

180 185 190

Pro Ala Asp Asp Lys Ala Gly Cys Leu Ile Pro Lys Leu Asp Ala Leu

195 200 205

Lys Glu Arg Ile Leu Leu Ser Ser Ala Lys Glu Arg Leu Lys Cys Ser

210 215 220

Ser Phe Gln Lys Phe Gly Glu Arg Ala Phe Lys Ala Trp Ser Val Ala

225 230 235 240

Arg Leu Ser Gln Lys Phe Pro Lys Ala Asp Phe Ala Glu Val Ser Lys

245 250 255

Ile Val Thr Asp Leu Thr Lys Val His Lys Glu Cys Cys His Gly Asp

260 265 270

Leu Leu Glu Cys Ala Asp Asp Arg Ala Asp Leu Thr Lys Tyr Ile Cys

275 280 285

Glu His Gln Asp Ser Ile Ser Gly Lys Leu Lys Ala Cys Cys Asp Lys

290 295 300

Pro Leu Leu Gln Lys Ser His Cys Ile Ala Glu Val Lys Glu Asp Asp

305 310 315 320

Leu Pro Ser Asp Leu Pro Ala Leu Ala Ala Asp Phe Ala Glu Asp Lys

325 330 335

Glu Ile Cys Lys His Tyr Lys Asp Ala Lys Asp Val Phe Leu Gly Thr

340 345 350

Phe Leu Tyr Glu Tyr Ser Arg Arg His Pro Asp Tyr Ser Val Ser Leu

355 360 365

Leu Leu Arg Ile Ala Lys Thr Tyr Glu Ala Thr Leu Glu Lys Cys Cys

370 375 380

Ala Glu Ala Asp Pro Pro Ala Cys Tyr Ala Thr Val Phe Asp Gln Phe

385 390 395 400

Thr Pro Leu Val Glu Glu Pro Lys Ser Leu Val Lys Lys Asn Cys Asp

405 410 415

Leu Phe Glu Glu Val Gly Glu Tyr Asp Phe Gln Asn Ala Leu Ile Val

420 425 430

Arg Tyr Thr Lys Lys Ala Pro Gln Val Ser Thr Pro Thr Leu Val Glu

435 440 445

Ile Gly Arg Thr Leu Gly Lys Val Gly Ser Arg Cys Cys Lys Leu Pro

450 455 460

Glu Ser Glu Arg Leu Pro Cys Ser Glu Asn His Leu Ala Leu Ala Leu

465 470 475 480

Asn Arg Leu Cys Val Leu His Glu Lys Thr Pro Val Ser Glu Lys Ile

485 490 495

Thr Lys Cys Cys Thr Asp Ser Leu Ala Glu Arg Arg Pro Cys Phe Ser

500 505 510

Ala Leu Glu Leu Asp Glu Gly Tyr Ile Pro Lys Glu Phe Lys Ala Glu

515 520 525

Thr Phe Thr Phe His Ala Asp Ile Cys Thr Leu Pro Glu Asp Glu Lys

530 535 540

Gln Ile Lys Lys Gln Ser Ala Leu Ala Glu Leu Val Lys His Lys Pro

545 550 555 560

Lys Ala Thr Lys Glu Gln Leu Lys Thr Val Leu Gly Asn Phe Ser Ala

565 570 575

Phe Val Ala Lys Cys Cys Gly Ala Glu Asp Lys Glu Ala Cys Phe Ala

580 585 590

Glu Glu Gly Pro Lys Leu Val Ala Ser Ser Gln Leu Ala Leu Ala

595 600 605

<210> 13

<211> 608

<212> PRT

<213> 穴兔（Oryctolagus cuniculus）

<400> 13

Met Lys Trp Val Thr Phe Ile Ser Leu Leu Phe Leu Phe Ser Ser Ala

1 5 10 15

Tyr Ser Arg Gly Val Phe Arg Arg Glu Ala His Lys Ser Glu Ile Ala

20 25 30

His Arg Phe Asn Asp Val Gly Glu Glu His Phe Ile Gly Leu Val Leu

35 40 45

Ile Thr Phe Ser Gln Tyr Leu Gln Lys Cys Pro Tyr Glu Glu His Ala

50 55 60

Lys Leu Val Lys Glu Val Thr Asp Leu Ala Lys Ala Cys Val Ala Asp

65 70 75 80

Glu Ser Ala Ala Asn Cys Asp Lys Ser Leu His Asp Ile Phe Gly Asp

85 90 95

Lys Ile Cys Ala Leu Pro Ser Leu Arg Asp Thr Tyr Gly Asp Val Ala

100 105 110

Asp Cys Cys Glu Lys Lys Glu Pro Glu Arg Asn Glu Cys Phe Leu His

115 120 125

His Lys Asp Asp Lys Pro Asp Leu Pro Pro Phe Ala Arg Pro Glu Ala

130 135 140

Asp Val Leu Cys Lys Ala Phe His Asp Asp Glu Lys Ala Phe Phe Gly

145 150 155 160

His Tyr Leu Tyr Glu Val Ala Arg Arg His Pro Tyr Phe Tyr Ala Pro

165 170 175

Glu Leu Leu Tyr Tyr Ala Gln Lys Tyr Lys Ala Ile Leu Thr Glu Cys

180 185 190

Cys Glu Ala Ala Asp Lys Gly Ala Cys Leu Thr Pro Lys Leu Asp Ala

195 200 205

Leu Glu Gly Lys Ser Leu Ile Ser Ala Ala Gln Glu Arg Leu Arg Cys

210 215 220

Ala Ser Ile Gln Lys Phe Gly Asp Arg Ala Tyr Lys Ala Trp Ala Leu

225 230 235 240

Val Arg Leu Ser Gln Arg Phe Pro Lys Ala Asp Phe Thr Asp Ile Ser

245 250 255

Lys Ile Val Thr Asp Leu Thr Lys Val His Lys Glu Cys Cys His Gly

260 265 270

Asp Leu Leu Glu Cys Ala Asp Asp Arg Ala Asp Leu Ala Lys Tyr Met

275 280 285

Cys Glu His Gln Glu Thr Ile Ser Ser His Leu Lys Glu Cys Cys Asp

290 295 300

Lys Pro Ile Leu Glu Lys Ala His Cys Ile Tyr Gly Leu His Asn Asp

305 310 315 320

Glu Thr Pro Ala Gly Leu Pro Ala Val Ala Glu Glu Phe Val Glu Asp

325 330 335

Lys Asp Val Cys Lys Asn Tyr Glu Glu Ala Lys Asp Leu Phe Leu Gly

340 345 350

Lys Phe Leu Tyr Glu Tyr Ser Arg Arg His Pro Asp Tyr Ser Val Val

355 360 365

Leu Leu Leu Arg Leu Gly Lys Ala Tyr Glu Ala Thr Leu Lys Lys Cys

370 375 380

Cys Ala Thr Asp Asp Pro His Ala Cys Tyr Ala Lys Val Leu Asp Glu

385 390 395 400

Phe Gln Pro Leu Val Asp Glu Pro Lys Asn Leu Val Lys Gln Asn Cys

405 410 415

Glu Leu Tyr Glu Gln Leu Gly Asp Tyr Asn Phe Gln Asn Ala Leu Leu

420 425 430

Val Arg Tyr Thr Lys Lys Val Pro Gln Val Ser Thr Pro Thr Leu Val

435 440 445

Glu Ile Ser Arg Ser Leu Gly Lys Val Gly Ser Lys Cys Cys Lys His

450 455 460

Pro Glu Ala Glu Arg Leu Pro Cys Val Glu Asp Tyr Leu Ser Val Val

465 470 475 480

Leu Asn Arg Leu Cys Val Leu His Glu Lys Thr Pro Val Ser Glu Lys

485 490 495

Val Thr Lys Cys Cys Ser Glu Ser Leu Val Asp Arg Arg Pro Cys Phe

500 505 510

Ser Ala Leu Gly Pro Asp Glu Thr Tyr Val Pro Lys Glu Phe Asn Ala

515 520 525

Glu Thr Phe Thr Phe His Ala Asp Ile Cys Thr Leu Pro Glu Thr Glu

530 535 540

Arg Lys Ile Lys Lys Gln Thr Ala Leu Val Glu Leu Val Lys His Lys

545 550 555 560

Pro His Ala Thr Asn Asp Gln Leu Lys Thr Val Val Gly Glu Phe Thr

565 570 575

Ala Leu Leu Asp Lys Cys Cys Ser Ala Glu Asp Lys Glu Ala Cys Phe

580 585 590

Ala Val Glu Gly Pro Lys Leu Val Glu Ser Ser Lys Ala Thr Leu Gly

595 600 605

<210> 14

<211> 583

<212> PRT

<213> 山羊（Capra hircus）

<400> 14

Asp Thr His Lys Ser Glu Ile Ala His Arg Phe Asn Asp Leu Gly Glu

1 5 10 15

Glu Asn Phe Gln Gly Leu Val Leu Ile Ala Phe Ser Gln Tyr Leu Gln

20 25 30

Gln Cys Pro Phe Asp Glu His Val Lys Leu Val Lys Glu Leu Thr Glu

35 40 45

Phe Ala Lys Thr Cys Val Ala Asp Glu Ser His Ala Gly Cys Asp Lys

50 55 60

Ser Leu His Thr Leu Phe Gly Asp Glu Leu Cys Lys Val Ala Thr Leu

65 70 75 80

Arg Glu Thr Tyr Gly Asp Met Ala Asp Cys Cys Glu Lys Gln Glu Pro

85 90 95

Glu Arg Asn Glu Cys Phe Leu Lys His Lys Asp Asp Ser Pro Asp Leu

100 105 110

Pro Lys Leu Lys Pro Glu Pro Asp Thr Leu Cys Ala Glu Phe Lys Ala

115 120 125

Asp Glu Lys Lys Phe Trp Gly Lys Tyr Leu Tyr Glu Val Ala Arg Arg

130 135 140

His Pro Tyr Phe Tyr Ala Pro Glu Leu Leu Tyr Tyr Ala Asn Lys Tyr

145 150 155 160

Asn Gly Val Phe Gln Glu Cys Cys Gln Ala Glu Asp Lys Gly Ala Cys

165 170 175

Leu Leu Pro Lys Ile Glu Thr Met Arg Glu Lys Val Leu Ala Ser Ser

180 185 190

Ala Arg Gln Arg Leu Arg Cys Ala Ser Ile Gln Lys Phe Gly Glu Arg

195 200 205

Ala Leu Lys Ala Trp Ser Val Ala Arg Leu Ser Gln Lys Phe Pro Lys

210 215 220

Ala Asp Phe Thr Asp Val Thr Lys Ile Val Thr Asp Leu Thr Lys Val

225 230 235 240

His Lys Glu Cys Cys His Gly Asp Leu Leu Glu Cys Ala Asp Asp Arg

245 250 255

Ala Asp Leu Ala Lys Tyr Ile Cys Asp His Gln Asp Thr Leu Ser Ser

260 265 270

Lys Leu Lys Glu Cys Cys Asp Lys Pro Val Leu Glu Lys Ser His Cys

275 280 285

Ile Ala Glu Ile Asp Lys Asp Ala Val Pro Glu Asn Leu Pro Pro Leu

290 295 300

Thr Ala Asp Phe Ala Glu Asp Lys Glu Val Cys Lys Asn Tyr Gln Glu

305 310 315 320

Ala Lys Asp Val Phe Leu Gly Ser Phe Leu Tyr Glu Tyr Ser Arg Arg

325 330 335

His Pro Glu Tyr Ala Val Ser Val Leu Leu Arg Leu Ala Lys Glu Tyr

340 345 350

Glu Ala Thr Leu Glu Asp Cys Cys Ala Lys Glu Asp Pro His Ala Cys

355 360 365

Tyr Ala Thr Val Phe Asp Lys Leu Lys His Leu Val Asp Glu Pro Gln

370 375 380

Asn Leu Ile Lys Lys Asn Cys Glu Leu Phe Glu Lys His Gly Glu Tyr

385 390 395 400

Gly Phe Gln Asn Ala Leu Ile Val Arg Tyr Thr Arg Lys Ala Pro Gln

405 410 415

Val Ser Thr Pro Thr Leu Val Glu Ile Ser Arg Ser Leu Gly Lys Val

420 425 430

Gly Thr Lys Cys Cys Ala Lys Pro Glu Ser Glu Arg Met Pro Cys Thr

435 440 445

Glu Asp Tyr Leu Ser Leu Ile Leu Asn Arg Leu Cys Val Leu His Glu

450 455 460

Lys Thr Pro Val Ser Glu Lys Val Thr Lys Cys Cys Thr Glu Ser Leu

465 470 475 480

Val Asn Arg Arg Pro Cys Phe Ser Asp Leu Thr Leu Asp Glu Thr Tyr

485 490 495

Val Pro Lys Pro Phe Asp Gly Glu Ser Phe Thr Phe His Ala Asp Ile

500 505 510

Cys Thr Leu Pro Asp Thr Glu Lys Gln Ile Lys Lys Gln Thr Ala Leu

515 520 525

Val Glu Leu Leu Lys His Lys Pro Lys Ala Thr Asp Glu Gln Leu Lys

530 535 540

Thr Val Met Glu Asn Phe Val Ala Phe Val Asp Lys Cys Cys Ala Ala

545 550 555 560

Asp Asp Lys Glu Gly Cys Phe Leu Leu Glu Gly Pro Lys Leu Val Ala

565 570 575

Ser Thr Gln Ala Ala Leu Ala

580

<210> 15

<211> 607

<212> PRT

<213> 绵羊（Ovis aries）

<400> 15

Met Lys Trp Val Thr Phe Ile Ser Leu Leu Leu Leu Phe Ser Ser Ala

1 5 10 15

Tyr Ser Arg Gly Val Phe Arg Arg Asp Thr His Lys Ser Glu Ile Ala

20 25 30

His Arg Phe Asn Asp Leu Gly Glu Glu Asn Phe Gln Gly Leu Val Leu

35 40 45

Ile Ala Phe Ser Gln Tyr Leu Gln Gln Cys Pro Phe Asp Glu His Val

50 55 60

Lys Leu Val Lys Glu Leu Thr Glu Phe Ala Lys Thr Cys Val Ala Asp

65 70 75 80

Glu Ser His Ala Gly Cys Asp Lys Ser Leu His Thr Leu Phe Gly Asp

85 90 95

Glu Leu Cys Lys Val Ala Thr Leu Arg Glu Thr Tyr Gly Asp Met Ala

100 105 110

Asp Cys Cys Glu Lys Gln Glu Pro Glu Arg Asn Glu Cys Phe Leu Asn

115 120 125

His Lys Asp Asp Ser Pro Asp Leu Pro Lys Leu Lys Pro Glu Pro Asp

130 135 140

Thr Leu Cys Ala Glu Phe Lys Ala Asp Glu Lys Lys Phe Trp Gly Lys

145 150 155 160

Tyr Leu Tyr Glu Val Ala Arg Arg His Pro Tyr Phe Tyr Ala Pro Glu

165 170 175

Leu Leu Tyr Tyr Ala Asn Lys Tyr Asn Gly Val Phe Gln Glu Cys Cys

180 185 190

Gln Ala Glu Asp Lys Gly Ala Cys Leu Leu Pro Lys Ile Asp Ala Met

195 200 205

Arg Glu Lys Val Leu Ala Ser Ser Ala Arg Gln Arg Leu Arg Cys Ala

210 215 220

Ser Ile Gln Lys Phe Gly Glu Arg Ala Leu Lys Ala Trp Ser Val Ala

225 230 235 240

Arg Leu Ser Gln Lys Phe Pro Lys Ala Asp Phe Thr Asp Val Thr Lys

245 250 255

Ile Val Thr Asp Leu Thr Lys Val His Lys Glu Cys Cys His Gly Asp

260 265 270

Leu Leu Glu Cys Ala Asp Asp Arg Ala Asp Leu Ala Lys Tyr Ile Cys

275 280 285

Asp His Gln Asp Ala Leu Ser Ser Lys Leu Lys Glu Cys Cys Asp Lys

290 295 300

Pro Val Leu Glu Lys Ser His Cys Ile Ala Glu Val Asp Lys Asp Ala

305 310 315 320

Val Pro Glu Asn Leu Pro Pro Leu Thr Ala Asp Phe Ala Glu Asp Lys

325 330 335

Glu Val Cys Lys Asn Tyr Gln Glu Ala Lys Asp Val Phe Leu Gly Ser

340 345 350

Phe Leu Tyr Glu Tyr Ser Arg Arg His Pro Glu Tyr Ala Val Ser Val

355 360 365

Leu Leu Arg Leu Ala Lys Glu Tyr Glu Ala Thr Leu Glu Asp Cys Cys

370 375 380

Ala Lys Glu Asp Pro His Ala Cys Tyr Ala Thr Val Phe Asp Lys Leu

385 390 395 400

Lys His Leu Val Asp Glu Pro Gln Asn Leu Ile Lys Lys Asn Cys Glu

405 410 415

Leu Phe Glu Lys His Gly Glu Tyr Gly Phe Gln Asn Ala Leu Ile Val

420 425 430

Arg Tyr Thr Arg Lys Ala Pro Gln Val Ser Thr Pro Thr Leu Val Glu

435 440 445

Ile Ser Arg Ser Leu Gly Lys Val Gly Thr Lys Cys Cys Ala Lys Pro

450 455 460

Glu Ser Glu Arg Met Pro Cys Thr Glu Asp Tyr Leu Ser Leu Ile Leu

465 470 475 480

Asn Arg Leu Cys Val Leu His Glu Lys Thr Pro Val Ser Glu Lys Val

485 490 495

Thr Lys Cys Cys Thr Glu Ser Leu Val Asn Arg Arg Pro Cys Phe Ser

500 505 510

Asp Leu Thr Leu Asp Glu Thr Tyr Val Pro Lys Pro Phe Asp Glu Lys

515 520 525

Phe Phe Thr Phe His Ala Asp Ile Cys Thr Leu Pro Asp Thr Glu Lys

530 535 540

Gln Ile Lys Lys Gln Thr Ala Leu Val Glu Leu Leu Lys His Lys Pro

545 550 555 560

Lys Ala Thr Asp Glu Gln Leu Lys Thr Val Met Glu Asn Phe Val Ala

565 570 575

Phe Val Asp Lys Cys Cys Ala Ala Asp Asp Lys Glu Gly Cys Phe Val

580 585 590

Leu Glu Gly Pro Lys Leu Val Ala Ser Thr Gln Ala Ala Leu Ala

595 600 605

<210> 16

<211> 608

<212> PRT

<213> 犬（canis lupus familiaris）

<400> 16

Met Lys Trp Val Thr Phe Ile Ser Leu Phe Phe Leu Phe Ser Ser Ala

1 5 10 15

Tyr Ser Arg Gly Leu Val Arg Arg Glu Ala Tyr Lys Ser Glu Ile Ala

20 25 30

His Arg Tyr Asn Asp Leu Gly Glu Glu His Phe Arg Gly Leu Val Leu

35 40 45

Val Ala Phe Ser Gln Tyr Leu Gln Gln Cys Pro Phe Glu Asp His Val

50 55 60

Lys Leu Ala Lys Glu Val Thr Glu Phe Ala Lys Ala Cys Ala Ala Glu

65 70 75 80

Glu Ser Gly Ala Asn Cys Asp Lys Ser Leu His Thr Leu Phe Gly Asp

85 90 95

Lys Leu Cys Thr Val Ala Ser Leu Arg Asp Lys Tyr Gly Asp Met Ala

100 105 110

Asp Cys Cys Glu Lys Gln Glu Pro Asp Arg Asn Glu Cys Phe Leu Ala

115 120 125

His Lys Asp Asp Asn Pro Gly Phe Pro Pro Leu Val Ala Pro Glu Pro

130 135 140

Asp Ala Leu Cys Ala Ala Phe Gln Asp Asn Glu Gln Leu Phe Leu Gly

145 150 155 160

Lys Tyr Leu Tyr Glu Ile Ala Arg Arg His Pro Tyr Phe Tyr Ala Pro

165 170 175

Glu Leu Leu Tyr Tyr Ala Gln Gln Tyr Lys Gly Val Phe Ala Glu Cys

180 185 190

Cys Gln Ala Ala Asp Lys Ala Ala Cys Leu Gly Pro Lys Ile Glu Ala

195 200 205

Leu Arg Glu Lys Val Leu Leu Ser Ser Ala Lys Glu Arg Phe Lys Cys

210 215 220

Ala Ser Leu Gln Lys Phe Gly Asp Arg Ala Phe Lys Ala Trp Ser Val

225 230 235 240

Ala Arg Leu Ser Gln Arg Phe Pro Lys Ala Asp Phe Ala Glu Ile Ser

245 250 255

Lys Val Val Thr Asp Leu Thr Lys Val His Lys Glu Cys Cys His Gly

260 265 270

Asp Leu Leu Glu Cys Ala Asp Asp Arg Ala Asp Leu Ala Lys Tyr Met

275 280 285

Cys Glu Asn Gln Asp Ser Ile Ser Thr Lys Leu Lys Glu Cys Cys Asp

290 295 300

Lys Pro Val Leu Glu Lys Ser Gln Cys Leu Ala Glu Val Glu Arg Asp

305 310 315 320

Glu Leu Pro Gly Asp Leu Pro Ser Leu Ala Ala Asp Phe Val Glu Asp

325 330 335

Lys Glu Val Cys Lys Asn Tyr Gln Glu Ala Lys Asp Val Phe Leu Gly

340 345 350

Thr Phe Leu Tyr Glu Tyr Ala Arg Arg His Pro Glu Tyr Ser Val Ser

355 360 365

Leu Leu Leu Arg Leu Ala Lys Glu Tyr Glu Ala Thr Leu Glu Lys Cys

370 375 380

Cys Ala Thr Asp Asp Pro Pro Thr Cys Tyr Ala Lys Val Leu Asp Glu

385 390 395 400

Phe Lys Pro Leu Val Asp Glu Pro Gln Asn Leu Val Lys Thr Asn Cys

405 410 415

Glu Leu Phe Glu Lys Leu Gly Glu Tyr Gly Phe Gln Asn Ala Leu Leu

420 425 430

Val Arg Tyr Thr Lys Lys Ala Pro Gln Val Ser Thr Pro Thr Leu Val

435 440 445

Glu Val Ser Arg Lys Leu Gly Lys Val Gly Thr Lys Cys Cys Lys Lys

450 455 460

Pro Glu Ser Glu Arg Met Ser Cys Ala Glu Asp Phe Leu Ser Val Val

465 470 475 480

Leu Asn Arg Leu Cys Val Leu His Glu Lys Thr Pro Val Ser Glu Arg

485 490 495

Val Thr Lys Cys Cys Ser Glu Ser Leu Val Asn Arg Arg Pro Cys Phe

500 505 510

Ser Gly Leu Glu Val Asp Glu Thr Tyr Val Pro Lys Glu Phe Asn Ala

515 520 525

Glu Thr Phe Thr Phe His Ala Asp Leu Cys Thr Leu Pro Glu Ala Glu

530 535 540

Lys Gln Val Lys Lys Gln Thr Ala Leu Val Glu Leu Leu Lys His Lys

545 550 555 560

Pro Lys Ala Thr Asp Glu Gln Leu Lys Thr Val Met Gly Asp Phe Gly

565 570 575

Ala Phe Val Glu Lys Cys Cys Ala Ala Glu Asn Lys Glu Gly Cys Phe

580 585 590

Ser Glu Glu Gly Pro Lys Leu Val Ala Ala Ala Gln Ala Ala Leu Val

595 600 605

<210> 17

<211> 615

<212> PRT

<213> 原鸡（Gallus gallus）

<400> 17

Met Lys Trp Val Thr Leu Ile Ser Phe Ile Phe Leu Phe Ser Ser Ala

1 5 10 15

Thr Ser Arg Asn Leu Gln Arg Phe Ala Arg Asp Ala Glu His Lys Ser

20 25 30

Glu Ile Ala His Arg Tyr Asn Asp Leu Lys Glu Glu Thr Phe Lys Ala

35 40 45

Val Ala Met Ile Thr Phe Ala Gln Tyr Leu Gln Arg Cys Ser Tyr Glu

50 55 60

Gly Leu Ser Lys Leu Val Lys Asp Val Val Asp Leu Ala Gln Lys Cys

65 70 75 80

Val Ala Asn Glu Asp Ala Pro Glu Cys Ser Lys Pro Leu Pro Ser Ile

85 90 95

Ile Leu Asp Glu Ile Cys Gln Val Glu Lys Leu Arg Asp Ser Tyr Gly

100 105 110

Ala Met Ala Asp Cys Cys Ser Lys Ala Asp Pro Glu Arg Asn Glu Cys

115 120 125

Phe Leu Ser Phe Lys Val Ser Gln Pro Asp Phe Val Gln Pro Tyr Gln

130 135 140

Arg Pro Ala Ser Asp Val Ile Cys Gln Glu Tyr Gln Asp Asn Arg Val

145 150 155 160

Ser Phe Leu Gly His Phe Ile Tyr Ser Val Ala Arg Arg His Pro Phe

165 170 175

Leu Tyr Ala Pro Ala Ile Leu Ser Phe Ala Val Asp Phe Glu His Ala

180 185 190

Leu Gln Ser Cys Cys Lys Glu Ser Asp Val Gly Ala Cys Leu Asp Thr

195 200 205

Lys Glu Ile Val Met Arg Glu Lys Ala Lys Gly Val Ser Val Lys Gln

210 215 220

Gln Tyr Phe Cys Gly Ile Leu Lys Gln Phe Gly Asp Arg Val Phe Gln

225 230 235 240

Ala Arg Gln Leu Ile Tyr Leu Ser Gln Lys Tyr Pro Lys Ala Pro Phe

245 250 255

Ser Glu Val Ser Lys Phe Val His Asp Ser Ile Gly Val His Lys Glu

260 265 270

Cys Cys Glu Gly Asp Met Val Glu Cys Met Asp Asp Met Ala Arg Met

275 280 285

Met Ser Asn Leu Cys Ser Gln Gln Asp Val Phe Ser Gly Lys Ile Lys

290 295 300

Asp Cys Cys Glu Lys Pro Ile Val Glu Arg Ser Gln Cys Ile Met Glu

305 310 315 320

Ala Glu Phe Asp Glu Lys Pro Ala Asp Leu Pro Ser Leu Val Glu Lys

325 330 335

Tyr Ile Glu Asp Lys Glu Val Cys Lys Ser Phe Glu Ala Gly His Asp

340 345 350

Ala Phe Met Ala Glu Phe Val Tyr Glu Tyr Ser Arg Arg His Pro Glu

355 360 365

Phe Ser Ile Gln Leu Ile Met Arg Ile Ala Lys Gly Tyr Glu Ser Leu

370 375 380

Leu Glu Lys Cys Cys Lys Thr Asp Asn Pro Ala Glu Cys Tyr Ala Asn

385 390 395 400

Ala Gln Glu Gln Leu Asn Gln His Ile Lys Glu Thr Gln Asp Val Val

405 410 415

Lys Thr Asn Cys Asp Leu Leu His Asp His Gly Glu Ala Asp Phe Leu

420 425 430

Lys Ser Ile Leu Ile Arg Tyr Thr Lys Lys Met Pro Gln Val Pro Thr

435 440 445

Asp Leu Leu Leu Glu Thr Gly Lys Lys Met Thr Thr Ile Gly Thr Lys

450 455 460

Cys Cys Gln Leu Gly Glu Asp Arg Arg Met Ala Cys Ser Glu Gly Tyr

465 470 475 480

Leu Ser Ile Val Ile His Asp Thr Cys Arg Lys Gln Glu Thr Thr Pro

485 490 495

Ile Asn Asp Asn Val Ser Gln Cys Cys Ser Gln Leu Tyr Ala Asn Arg

500 505 510

Arg Pro Cys Phe Thr Ala Met Gly Val Asp Thr Lys Tyr Val Pro Pro

515 520 525

Pro Phe Asn Pro Asp Met Phe Ser Phe Asp Glu Lys Leu Cys Ser Ala

530 535 540

Pro Ala Glu Glu Arg Glu Val Gly Gln Met Lys Leu Leu Ile Asn Leu

545 550 555 560

Ile Lys Arg Lys Pro Gln Met Thr Glu Glu Gln Ile Lys Thr Ile Ala

565 570 575

Asp Gly Phe Thr Ala Met Val Asp Lys Cys Cys Lys Gln Ser Asp Ile

580 585 590

Asn Thr Cys Phe Gly Glu Glu Gly Ala Asn Leu Ile Val Gln Ser Arg

595 600 605

Ala Thr Leu Gly Ile Gly Ala

610 615

<210> 18

<211> 607

<212> PRT

<213> 猪（Sus scrofa）

<400> 18

Met Lys Trp Val Thr Phe Ile Ser Leu Leu Phe Leu Phe Ser Ser Ala

1 5 10 15

Tyr Ser Arg Gly Val Phe Arg Arg Asp Thr Tyr Lys Ser Glu Ile Ala

20 25 30

His Arg Phe Lys Asp Leu Gly Glu Gln Tyr Phe Lys Gly Leu Val Leu

35 40 45

Ile Ala Phe Ser Gln His Leu Gln Gln Cys Pro Tyr Glu Glu His Val

50 55 60

Lys Leu Val Arg Glu Val Thr Glu Phe Ala Lys Thr Cys Val Ala Asp

65 70 75 80

Glu Ser Ala Glu Asn Cys Asp Lys Ser Ile His Thr Leu Phe Gly Asp

85 90 95

Lys Leu Cys Ala Ile Pro Ser Leu Arg Glu His Tyr Gly Asp Leu Ala

100 105 110

Asp Cys Cys Glu Lys Glu Glu Pro Glu Arg Asn Glu Cys Phe Leu Gln

115 120 125

His Lys Asn Asp Asn Pro Asp Ile Pro Lys Leu Lys Pro Asp Pro Val

130 135 140

Ala Leu Cys Ala Asp Phe Gln Glu Asp Glu Gln Lys Phe Trp Gly Lys

145 150 155 160

Tyr Leu Tyr Glu Ile Ala Arg Arg His Pro Tyr Phe Tyr Ala Pro Glu

165 170 175

Leu Leu Tyr Tyr Ala Ile Ile Tyr Lys Asp Val Phe Ser Glu Cys Cys

180 185 190

Gln Ala Ala Asp Lys Ala Ala Cys Leu Leu Pro Lys Ile Glu His Leu

195 200 205

Arg Glu Lys Val Leu Thr Ser Ala Ala Lys Gln Arg Leu Lys Cys Ala

210 215 220

Ser Ile Gln Lys Phe Gly Glu Arg Ala Phe Lys Ala Trp Ser Leu Ala

225 230 235 240

Arg Leu Ser Gln Arg Phe Pro Lys Ala Asp Phe Thr Glu Ile Ser Lys

245 250 255

Ile Val Thr Asp Leu Ala Lys Val His Lys Glu Cys Cys His Gly Asp

260 265 270

Leu Leu Glu Cys Ala Asp Asp Arg Ala Asp Leu Ala Lys Tyr Ile Cys

275 280 285

Glu Asn Gln Asp Thr Ile Ser Thr Lys Leu Lys Glu Cys Cys Asp Lys

290 295 300

Pro Leu Leu Glu Lys Ser His Cys Ile Ala Glu Ala Lys Arg Asp Glu

305 310 315 320

Leu Pro Ala Asp Leu Asn Pro Leu Glu His Asp Phe Val Glu Asp Lys

325 330 335

Glu Val Cys Lys Asn Tyr Lys Glu Ala Lys His Val Phe Leu Gly Thr

340 345 350

Phe Leu Tyr Glu Tyr Ser Arg Arg His Pro Asp Tyr Ser Val Ser Leu

355 360 365

Leu Leu Arg Ile Ala Lys Ile Tyr Glu Ala Thr Leu Glu Asp Cys Cys

370 375 380

Ala Lys Glu Asp Pro Pro Ala Cys Tyr Ala Thr Val Phe Asp Lys Phe

385 390 395 400

Gln Pro Leu Val Asp Glu Pro Lys Asn Leu Ile Lys Gln Asn Cys Glu

405 410 415

Leu Phe Glu Lys Leu Gly Glu Tyr Gly Phe Gln Asn Ala Leu Ile Val

420 425 430

Arg Tyr Thr Lys Lys Val Pro Gln Val Ser Thr Pro Thr Leu Val Glu

435 440 445

Val Ala Arg Lys Leu Gly Leu Val Gly Ser Arg Cys Cys Lys Arg Pro

450 455 460

Glu Glu Glu Arg Leu Ser Cys Ala Glu Asp Tyr Leu Ser Leu Val Leu

465 470 475 480

Asn Arg Leu Cys Val Leu His Glu Lys Thr Pro Val Ser Glu Lys Val

485 490 495

Thr Lys Cys Cys Thr Glu Ser Leu Val Asn Arg Arg Pro Cys Phe Ser

500 505 510

Ala Leu Thr Pro Asp Glu Thr Tyr Lys Pro Lys Glu Phe Val Glu Gly

515 520 525

Thr Phe Thr Phe His Ala Asp Leu Cys Thr Leu Pro Glu Asp Glu Lys

530 535 540

Gln Ile Lys Lys Gln Thr Ala Leu Val Glu Leu Leu Lys His Lys Pro

545 550 555 560

His Ala Thr Glu Glu Gln Leu Arg Thr Val Leu Gly Asn Phe Ala Ala

565 570 575

Phe Val Gln Lys Cys Cys Ala Ala Pro Asp His Glu Ala Cys Phe Ala

580 585 590

Val Glu Gly Pro Lys Phe Val Ile Glu Ile Arg Gly Ile Leu Ala

595 600 605

<210> 19

<211> 205

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工白蛋白变体：人血清白蛋白结构域3

<400> 19

Val Glu Glu Pro Gln Asn Leu Ile Lys Gln Asn Cys Glu Leu Phe Glu

1 5 10 15

Gln Leu Gly Glu Tyr Lys Phe Gln Asn Ala Leu Leu Val Arg Tyr Thr

20 25 30

Lys Lys Val Pro Gln Val Ser Thr Pro Thr Leu Val Glu Val Ser Arg

35 40 45

Asn Leu Gly Lys Val Gly Ser Lys Cys Cys Lys His Pro Glu Ala Lys

50 55 60

Arg Met Pro Cys Ala Glu Asp Tyr Leu Ser Val Val Leu Asn Gln Leu

65 70 75 80

Cys Val Leu His Glu Lys Thr Pro Val Ser Asp Arg Val Thr Lys Cys

85 90 95

Cys Thr Glu Ser Leu Val Asn Arg Arg Pro Cys Phe Ser Ala Leu Glu

100 105 110

Val Asp Glu Thr Tyr Val Pro Lys Glu Phe Asn Ala Glu Thr Phe Thr

115 120 125

Phe His Ala Asp Ile Cys Thr Leu Ser Glu Lys Glu Arg Gln Ile Lys

130 135 140

Lys Gln Thr Ala Leu Val Glu Leu Val Lys His Lys Pro Lys Ala Thr

145 150 155 160

Lys Glu Gln Leu Lys Ala Val Met Asp Asp Phe Ala Ala Phe Val Glu

165 170 175

Lys Cys Cys Lys Ala Asp Asp Lys Glu Thr Cys Phe Ala Glu Glu Gly

180 185 190

Lys Lys Leu Val Ala Ala Ser Gln Ala Ala Leu Gly Leu

195 200 205

<210> 20

<211> 403

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工白蛋白变体：人血清白蛋白结构域2和

人血清白蛋白结构域3

<400> 20

Asp Glu Leu Arg Asp Glu Gly Lys Ala Ser Ser Ala Lys Gln Arg Leu

1 5 10 15

Lys Cys Ala Ser Leu Gln Lys Phe Gly Glu Arg Ala Phe Lys Ala Trp

20 25 30

Ala Val Ala Arg Leu Ser Gln Arg Phe Pro Lys Ala Glu Phe Ala Glu

35 40 45

Val Ser Lys Leu Val Thr Asp Leu Thr Lys Val His Thr Glu Cys Cys

50 55 60

His Gly Asp Leu Leu Glu Cys Ala Asp Asp Arg Ala Asp Leu Ala Lys

65 70 75 80

Tyr Ile Cys Glu Asn Gln Asp Ser Ile Ser Ser Lys Leu Lys Glu Cys

85 90 95

Cys Glu Lys Pro Leu Leu Glu Lys Ser His Cys Ile Ala Glu Val Glu

100 105 110

Asn Asp Glu Met Pro Ala Asp Leu Pro Ser Leu Ala Ala Asp Phe Val

115 120 125

Glu Ser Lys Asp Val Cys Lys Asn Tyr Ala Glu Ala Lys Asp Val Phe

130 135 140

Leu Gly Met Phe Leu Tyr Glu Tyr Ala Arg Arg His Pro Asp Tyr Ser

145 150 155 160

Val Val Leu Leu Leu Arg Leu Ala Lys Thr Tyr Glu Thr Thr Leu Glu

165 170 175

Lys Cys Cys Ala Ala Ala Asp Pro His Glu Cys Tyr Ala Lys Val Phe

180 185 190

Asp Glu Phe Lys Pro Leu Val Glu Glu Pro Gln Asn Leu Ile Lys Gln

195 200 205

Asn Cys Glu Leu Phe Glu Gln Leu Gly Glu Tyr Lys Phe Gln Asn Ala

210 215 220

Leu Leu Val Arg Tyr Thr Lys Lys Val Pro Gln Val Ser Thr Pro Thr

225 230 235 240

Leu Val Glu Val Ser Arg Asn Leu Gly Lys Val Gly Ser Lys Cys Cys

245 250 255

Lys His Pro Glu Ala Lys Arg Met Pro Cys Ala Glu Asp Tyr Leu Ser

260 265 270

Val Val Leu Asn Gln Leu Cys Val Leu His Glu Lys Thr Pro Val Ser

275 280 285

Asp Arg Val Thr Lys Cys Cys Thr Glu Ser Leu Val Asn Arg Arg Pro

290 295 300

Cys Phe Ser Ala Leu Glu Val Asp Glu Thr Tyr Val Pro Lys Glu Phe

305 310 315 320

Asn Ala Glu Thr Phe Thr Phe His Ala Asp Ile Cys Thr Leu Ser Glu

325 330 335

Lys Glu Arg Gln Ile Lys Lys Gln Thr Ala Leu Val Glu Leu Val Lys

340 345 350

His Lys Pro Lys Ala Thr Lys Glu Gln Leu Lys Ala Val Met Asp Asp

355 360 365

Phe Ala Ala Phe Val Glu Lys Cys Cys Lys Ala Asp Asp Lys Glu Thr

370 375 380

Cys Phe Ala Glu Glu Gly Lys Lys Leu Val Ala Ala Ser Gln Ala Ala

385 390 395 400

Leu Gly Leu

<210> 21

<211> 399

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工白蛋白变体：人血清白蛋白结构域1和

人血清白蛋白结构域3

<400> 21

Asp Ala His Lys Ser Glu Val Ala His Arg Phe Lys Asp Leu Gly Glu

1 5 10 15

Glu Asn Phe Lys Ala Leu Val Leu Ile Ala Phe Ala Gln Tyr Leu Gln

20 25 30

Gln Cys Pro Phe Glu Asp His Val Lys Leu Val Asn Glu Val Thr Glu

35 40 45

Phe Ala Lys Thr Cys Val Ala Asp Glu Ser Ala Glu Asn Cys Asp Lys

50 55 60

Ser Leu His Thr Leu Phe Gly Asp Lys Leu Cys Thr Val Ala Thr Leu

65 70 75 80

Arg Glu Thr Tyr Gly Glu Met Ala Asp Cys Cys Ala Lys Gln Glu Pro

85 90 95

Glu Arg Asn Glu Cys Phe Leu Gln His Lys Asp Asp Asn Pro Asn Leu

100 105 110

Pro Arg Leu Val Arg Pro Glu Val Asp Val Met Cys Thr Ala Phe His

115 120 125

Asp Asn Glu Glu Thr Phe Leu Lys Lys Tyr Leu Tyr Glu Ile Ala Arg

130 135 140

Arg His Pro Tyr Phe Tyr Ala Pro Glu Leu Leu Phe Phe Ala Lys Arg

145 150 155 160

Tyr Lys Ala Ala Phe Thr Glu Cys Cys Gln Ala Ala Asp Lys Ala Ala

165 170 175

Cys Leu Leu Pro Lys Leu Asp Glu Leu Arg Asp Glu Gly Lys Ala Ser

180 185 190

Ser Ala Val Glu Glu Pro Gln Asn Leu Ile Lys Gln Asn Cys Glu Leu

195 200 205

Phe Glu Gln Leu Gly Glu Tyr Lys Phe Gln Asn Ala Leu Leu Val Arg

210 215 220

Tyr Thr Lys Lys Val Pro Gln Val Ser Thr Pro Thr Leu Val Glu Val

225 230 235 240

Ser Arg Asn Leu Gly Lys Val Gly Ser Lys Cys Cys Lys His Pro Glu

245 250 255

Ala Lys Arg Met Pro Cys Ala Glu Asp Tyr Leu Ser Val Val Leu Asn

260 265 270

Gln Leu Cys Val Leu His Glu Lys Thr Pro Val Ser Asp Arg Val Thr

275 280 285

Lys Cys Cys Thr Glu Ser Leu Val Asn Arg Arg Pro Cys Phe Ser Ala

290 295 300

Leu Glu Val Asp Glu Thr Tyr Val Pro Lys Glu Phe Asn Ala Glu Thr

305 310 315 320

Phe Thr Phe His Ala Asp Ile Cys Thr Leu Ser Glu Lys Glu Arg Gln

325 330 335

Ile Lys Lys Gln Thr Ala Leu Val Glu Leu Val Lys His Lys Pro Lys

340 345 350

Ala Thr Lys Glu Gln Leu Lys Ala Val Met Asp Asp Phe Ala Ala Phe

355 360 365

Val Glu Lys Cys Cys Lys Ala Asp Asp Lys Glu Thr Cys Phe Ala Glu

370 375 380

Glu Gly Lys Lys Leu Val Ala Ala Ser Gln Ala Ala Leu Gly Leu

385 390 395

<210> 22

<211> 410

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工白蛋白变体：两个连续拷贝的人血清白蛋白结构域3

<400> 22

Val Glu Glu Pro Gln Asn Leu Ile Lys Gln Asn Cys Glu Leu Phe Glu

1 5 10 15

Gln Leu Gly Glu Tyr Lys Phe Gln Asn Ala Leu Leu Val Arg Tyr Thr

20 25 30

Lys Lys Val Pro Gln Val Ser Thr Pro Thr Leu Val Glu Val Ser Arg

35 40 45

Asn Leu Gly Lys Val Gly Ser Lys Cys Cys Lys His Pro Glu Ala Lys

50 55 60

Arg Met Pro Cys Ala Glu Asp Tyr Leu Ser Val Val Leu Asn Gln Leu

65 70 75 80

Cys Val Leu His Glu Lys Thr Pro Val Ser Asp Arg Val Thr Lys Cys

85 90 95

Cys Thr Glu Ser Leu Val Asn Arg Arg Pro Cys Phe Ser Ala Leu Glu

100 105 110

Val Asp Glu Thr Tyr Val Pro Lys Glu Phe Asn Ala Glu Thr Phe Thr

115 120 125

Phe His Ala Asp Ile Cys Thr Leu Ser Glu Lys Glu Arg Gln Ile Lys

130 135 140

Lys Gln Thr Ala Leu Val Glu Leu Val Lys His Lys Pro Lys Ala Thr

145 150 155 160

Lys Glu Gln Leu Lys Ala Val Met Asp Asp Phe Ala Ala Phe Val Glu

165 170 175

Lys Cys Cys Lys Ala Asp Asp Lys Glu Thr Cys Phe Ala Glu Glu Gly

180 185 190

Lys Lys Leu Val Ala Ala Ser Gln Ala Ala Leu Gly Leu Val Glu Glu

195 200 205

Pro Gln Asn Leu Ile Lys Gln Asn Cys Glu Leu Phe Glu Gln Leu Gly

210 215 220

Glu Tyr Lys Phe Gln Asn Ala Leu Leu Val Arg Tyr Thr Lys Lys Val

225 230 235 240

Pro Gln Val Ser Thr Pro Thr Leu Val Glu Val Ser Arg Asn Leu Gly

245 250 255

Lys Val Gly Ser Lys Cys Cys Lys His Pro Glu Ala Lys Arg Met Pro

260 265 270

Cys Ala Glu Asp Tyr Leu Ser Val Val Leu Asn Gln Leu Cys Val Leu

275 280 285

His Glu Lys Thr Pro Val Ser Asp Arg Val Thr Lys Cys Cys Thr Glu

290 295 300

Ser Leu Val Asn Arg Arg Pro Cys Phe Ser Ala Leu Glu Val Asp Glu

305 310 315 320

Thr Tyr Val Pro Lys Glu Phe Asn Ala Glu Thr Phe Thr Phe His Ala

325 330 335

Asp Ile Cys Thr Leu Ser Glu Lys Glu Arg Gln Ile Lys Lys Gln Thr

340 345 350

Ala Leu Val Glu Leu Val Lys His Lys Pro Lys Ala Thr Lys Glu Gln

355 360 365

Leu Lys Ala Val Met Asp Asp Phe Ala Ala Phe Val Glu Lys Cys Cys

370 375 380

Lys Ala Asp Asp Lys Glu Thr Cys Phe Ala Glu Glu Gly Lys Lys Leu

385 390 395 400

Val Ala Ala Ser Gln Ala Ala Leu Gly Leu

405 410

<210> 23

<211> 615

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> HSA 结构域III + HSA 结构域III + HSA 结构域III

<400> 23

Val Glu Glu Pro Gln Asn Leu Ile Lys Gln Asn Cys Glu Leu Phe Glu

1 5 10 15

Gln Leu Gly Glu Tyr Lys Phe Gln Asn Ala Leu Leu Val Arg Tyr Thr

20 25 30

Lys Lys Val Pro Gln Val Ser Thr Pro Thr Leu Val Glu Val Ser Arg

35 40 45

Asn Leu Gly Lys Val Gly Ser Lys Cys Cys Lys His Pro Glu Ala Lys

50 55 60

Arg Met Pro Cys Ala Glu Asp Tyr Leu Ser Val Val Leu Asn Gln Leu

65 70 75 80

Cys Val Leu His Glu Lys Thr Pro Val Ser Asp Arg Val Thr Lys Cys

85 90 95

Cys Thr Glu Ser Leu Val Asn Arg Arg Pro Cys Phe Ser Ala Leu Glu

100 105 110

Val Asp Glu Thr Tyr Val Pro Lys Glu Phe Asn Ala Glu Thr Phe Thr

115 120 125

Phe His Ala Asp Ile Cys Thr Leu Ser Glu Lys Glu Arg Gln Ile Lys

130 135 140

Lys Gln Thr Ala Leu Val Glu Leu Val Lys His Lys Pro Lys Ala Thr

145 150 155 160

Lys Glu Gln Leu Lys Ala Val Met Asp Asp Phe Ala Ala Phe Val Glu

165 170 175

Lys Cys Cys Lys Ala Asp Asp Lys Glu Thr Cys Phe Ala Glu Glu Gly

180 185 190

Lys Lys Leu Val Ala Ala Ser Gln Ala Ala Leu Gly Leu Val Glu Glu

195 200 205

Pro Gln Asn Leu Ile Lys Gln Asn Cys Glu Leu Phe Glu Gln Leu Gly

210 215 220

Glu Tyr Lys Phe Gln Asn Ala Leu Leu Val Arg Tyr Thr Lys Lys Val

225 230 235 240

Pro Gln Val Ser Thr Pro Thr Leu Val Glu Val Ser Arg Asn Leu Gly

245 250 255

Lys Val Gly Ser Lys Cys Cys Lys His Pro Glu Ala Lys Arg Met Pro

260 265 270

Cys Ala Glu Asp Tyr Leu Ser Val Val Leu Asn Gln Leu Cys Val Leu

275 280 285

His Glu Lys Thr Pro Val Ser Asp Arg Val Thr Lys Cys Cys Thr Glu

290 295 300

Ser Leu Val Asn Arg Arg Pro Cys Phe Ser Ala Leu Glu Val Asp Glu

305 310 315 320

Thr Tyr Val Pro Lys Glu Phe Asn Ala Glu Thr Phe Thr Phe His Ala

325 330 335

Asp Ile Cys Thr Leu Ser Glu Lys Glu Arg Gln Ile Lys Lys Gln Thr

340 345 350

Ala Leu Val Glu Leu Val Lys His Lys Pro Lys Ala Thr Lys Glu Gln

355 360 365

Leu Lys Ala Val Met Asp Asp Phe Ala Ala Phe Val Glu Lys Cys Cys

370 375 380

Lys Ala Asp Asp Lys Glu Thr Cys Phe Ala Glu Glu Gly Lys Lys Leu

385 390 395 400

Val Ala Ala Ser Gln Ala Ala Leu Gly Leu Val Glu Glu Pro Gln Asn

405 410 415

Leu Ile Lys Gln Asn Cys Glu Leu Phe Glu Gln Leu Gly Glu Tyr Lys

420 425 430

Phe Gln Asn Ala Leu Leu Val Arg Tyr Thr Lys Lys Val Pro Gln Val

435 440 445

Ser Thr Pro Thr Leu Val Glu Val Ser Arg Asn Leu Gly Lys Val Gly

450 455 460

Ser Lys Cys Cys Lys His Pro Glu Ala Lys Arg Met Pro Cys Ala Glu

465 470 475 480

Asp Tyr Leu Ser Val Val Leu Asn Gln Leu Cys Val Leu His Glu Lys

485 490 495

Thr Pro Val Ser Asp Arg Val Thr Lys Cys Cys Thr Glu Ser Leu Val

500 505 510

Asn Arg Arg Pro Cys Phe Ser Ala Leu Glu Val Asp Glu Thr Tyr Val

515 520 525

Pro Lys Glu Phe Asn Ala Glu Thr Phe Thr Phe His Ala Asp Ile Cys

530 535 540

Thr Leu Ser Glu Lys Glu Arg Gln Ile Lys Lys Gln Thr Ala Leu Val

545 550 555 560

Glu Leu Val Lys His Lys Pro Lys Ala Thr Lys Glu Gln Leu Lys Ala

565 570 575

Val Met Asp Asp Phe Ala Ala Phe Val Glu Lys Cys Cys Lys Ala Asp

580 585 590

Asp Lys Glu Thr Cys Phe Ala Glu Glu Gly Lys Lys Leu Val Ala Ala

595 600 605

Ser Gln Ala Ala Leu Gly Leu

610 615

<210> 24

<211> 604

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> HSA 结构域I + HSA 结构域III + HSA 结构域III

<400> 24

Asp Ala His Lys Ser Glu Val Ala His Arg Phe Lys Asp Leu Gly Glu

1 5 10 15

Glu Asn Phe Lys Ala Leu Val Leu Ile Ala Phe Ala Gln Tyr Leu Gln

20 25 30

Gln Cys Pro Phe Glu Asp His Val Lys Leu Val Asn Glu Val Thr Glu

35 40 45

Phe Ala Lys Thr Cys Val Ala Asp Glu Ser Ala Glu Asn Cys Asp Lys

50 55 60

Ser Leu His Thr Leu Phe Gly Asp Lys Leu Cys Thr Val Ala Thr Leu

65 70 75 80

Arg Glu Thr Tyr Gly Glu Met Ala Asp Cys Cys Ala Lys Gln Glu Pro

85 90 95

Glu Arg Asn Glu Cys Phe Leu Gln His Lys Asp Asp Asn Pro Asn Leu

100 105 110

Pro Arg Leu Val Arg Pro Glu Val Asp Val Met Cys Thr Ala Phe His

115 120 125

Asp Asn Glu Glu Thr Phe Leu Lys Lys Tyr Leu Tyr Glu Ile Ala Arg

130 135 140

Arg His Pro Tyr Phe Tyr Ala Pro Glu Leu Leu Phe Phe Ala Lys Arg

145 150 155 160

Tyr Lys Ala Ala Phe Thr Glu Cys Cys Gln Ala Ala Asp Lys Ala Ala

165 170 175

Cys Leu Leu Pro Lys Leu Asp Glu Leu Arg Asp Glu Gly Lys Ala Ser

180 185 190

Ser Ala Val Glu Glu Pro Gln Asn Leu Ile Lys Gln Asn Cys Glu Leu

195 200 205

Phe Glu Gln Leu Gly Glu Tyr Lys Phe Gln Asn Ala Leu Leu Val Arg

210 215 220

Tyr Thr Lys Lys Val Pro Gln Val Ser Thr Pro Thr Leu Val Glu Val

225 230 235 240

Ser Arg Asn Leu Gly Lys Val Gly Ser Lys Cys Cys Lys His Pro Glu

245 250 255

Ala Lys Arg Met Pro Cys Ala Glu Asp Tyr Leu Ser Val Val Leu Asn

260 265 270

Gln Leu Cys Val Leu His Glu Lys Thr Pro Val Ser Asp Arg Val Thr

275 280 285

Lys Cys Cys Thr Glu Ser Leu Val Asn Arg Arg Pro Cys Phe Ser Ala

290 295 300

Leu Glu Val Asp Glu Thr Tyr Val Pro Lys Glu Phe Asn Ala Glu Thr

305 310 315 320

Phe Thr Phe His Ala Asp Ile Cys Thr Leu Ser Glu Lys Glu Arg Gln

325 330 335

Ile Lys Lys Gln Thr Ala Leu Val Glu Leu Val Lys His Lys Pro Lys

340 345 350

Ala Thr Lys Glu Gln Leu Lys Ala Val Met Asp Asp Phe Ala Ala Phe

355 360 365

Val Glu Lys Cys Cys Lys Ala Asp Asp Lys Glu Thr Cys Phe Ala Glu

370 375 380

Glu Gly Lys Lys Leu Val Ala Ala Ser Gln Ala Ala Leu Gly Leu Val

385 390 395 400

Glu Glu Pro Gln Asn Leu Ile Lys Gln Asn Cys Glu Leu Phe Glu Gln

405 410 415

Leu Gly Glu Tyr Lys Phe Gln Asn Ala Leu Leu Val Arg Tyr Thr Lys

420 425 430

Lys Val Pro Gln Val Ser Thr Pro Thr Leu Val Glu Val Ser Arg Asn

435 440 445

Leu Gly Lys Val Gly Ser Lys Cys Cys Lys His Pro Glu Ala Lys Arg

450 455 460

Met Pro Cys Ala Glu Asp Tyr Leu Ser Val Val Leu Asn Gln Leu Cys

465 470 475 480

Val Leu His Glu Lys Thr Pro Val Ser Asp Arg Val Thr Lys Cys Cys

485 490 495

Thr Glu Ser Leu Val Asn Arg Arg Pro Cys Phe Ser Ala Leu Glu Val

500 505 510

Asp Glu Thr Tyr Val Pro Lys Glu Phe Asn Ala Glu Thr Phe Thr Phe

515 520 525

His Ala Asp Ile Cys Thr Leu Ser Glu Lys Glu Arg Gln Ile Lys Lys

530 535 540

Gln Thr Ala Leu Val Glu Leu Val Lys His Lys Pro Lys Ala Thr Lys

545 550 555 560

Glu Gln Leu Lys Ala Val Met Asp Asp Phe Ala Ala Phe Val Glu Lys

565 570 575

Cys Cys Lys Ala Asp Asp Lys Glu Thr Cys Phe Ala Glu Glu Gly Lys

580 585 590

Lys Leu Val Ala Ala Ser Gln Ala Ala Leu Gly Leu

595 600

<210> 25

<211> 1758

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 突变以引入限制性酶位点的HSA编码序列

<400> 25

gatgcacaca agagtgaggt tgctcatcgg tttaaagatt tgggagaaga aaatttcaaa 60

gccttggtgt tgattgcctt tgctcagtat cttcagcagt gtccatttga agatcatgta 120

aaattagtga atgaagtaac tgaatttgca aaaacatgtg ttgctgatga gtccgcggaa 180

aattgtgaca aatcacttca tacccttttt ggagacaaat tatgcacagt tgcaactctt 240

cgtgaaacct atggtgaaat ggctgactgc tgtgcaaaac aagaacctga gagaaatgaa 300

tgcttcttgc aacacaaaga tgacaaccca aacctccccc gattggtgag accagaggtt 360

gatgtgatgt gcactgcttt tcatgacaat gaagagacat ttttgaaaaa atacttatat 420

gaaattgcca gaagacatcc ttacttttat gccccggaac tccttttctt tgctaaaagg 480

tataaagctg cttttacaga atgttgccaa gctgctgata aagctgcctg cctgttgcca 540

aagctcgatg aacttcggga tgaagggaag gctagctctg ccaaacagag actcaagtgt 600

gccagtctcc aaaaatttgg agaaagagct ttcaaagcat gggcagtagc tcgcctgagc 660

cagagatttc ccaaagctga gtttgcagaa gtttccaagt tagtgacaga tcttaccaaa 720

gtccacacgg aatgctgcca tggagatctg ctcgagtgtg ctgatgacag ggcggacctt 780

gccaagtata tctgtgaaaa tcaagattcg atctccagta aactgaagga atgctgtgaa 840

aaacctctgt tggaaaaatc ccactgcatt gccgaagtgg aaaatgatga gatgcctgct 900

gacttgcctt cattagctgc tgattttgtt gaaagtaagg atgtttgcaa aaactatgct 960

gaggcaaagg atgtcttcct gggcatgttt ttgtatgaat atgcaagaag gcatcctgat 1020

tactctgtcg tgctgctgct gagacttgcc aagacatatg aaaccactct agagaagtgc 1080

tgtgccgctg ctgatcctca tgaatgctat gccaaagtgt tcgatgaatt taaacctctt 1140

gtggaagagc ctcagaattt aatcaaacaa aattgtgagc tttttgagca gcttggagag 1200

tacaaattcc agaatgcgct attagttcgt tacaccaaga aagtacccca agtgtcaact 1260

ccaactcttg tagaggtctc aagaaaccta ggaaaagtgg gatccaaatg ttgtaaacat 1320

cctgaagcaa aaagaatgcc ctgtgcagaa gactatctat ccgtggtcct gaaccagtta 1380

tgtgtgttgc atgagaaaac gccagtaagt gacagagtca ccaaatgctg cacagaatcc 1440

ttggtgaaca ggcgaccatg cttttcagct ctggaagtcg acgaaacata cgttcccaaa 1500

gagtttaatg ctgaaacatt caccttccat gcagatatat gcacactttc tgagaaggag 1560

agacaaatca agaaacaaac tgcacttgtt gagctcgtga aacacaagcc caaggcaaca 1620

aaagagcaac tgaaagctgt tatggatgat ttcgcagctt ttgtagagaa gtgctgcaag 1680

gctgacgata aggagacctg ctttgccgag gagggtaaaa aacttgttgc tgcaagtcaa 1740

gctgccttag gcttataa 1758

<210> 26

<211> 290

<212> PRT

<213> 智人

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(290)

<223> 主要组织相容性复合体I类样Fc受体(FCGRT)的截短重链

(SEQ ID No. 30和SEQ ID No. 31一起形成FcRN)

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(290)

<223> 主要组织相容性复合体I类样Fc受体(FCGRT)的截短重链

(SEQ ID No. 26和SEQ ID No. 27一起形成FcRN)

<400> 26

Met Gly Val Pro Arg Pro Gln Pro Trp Ala Leu Gly Leu Leu Leu Phe

1 5 10 15

Leu Leu Pro Gly Ser Leu Gly Ala Glu Ser His Leu Ser Leu Leu Tyr

20 25 30

His Leu Thr Ala Val Ser Ser Pro Ala Pro Gly Thr Pro Ala Phe Trp

35 40 45

Val Ser Gly Trp Leu Gly Pro Gln Gln Tyr Leu Ser Tyr Asn Ser Leu

50 55 60

Arg Gly Glu Ala Glu Pro Cys Gly Ala Trp Val Trp Glu Asn Gln Val

65 70 75 80

Ser Trp Tyr Trp Glu Lys Glu Thr Thr Asp Leu Arg Ile Lys Glu Lys

85 90 95

Leu Phe Leu Glu Ala Phe Lys Ala Leu Gly Gly Lys Gly Pro Tyr Thr

100 105 110

Leu Gln Gly Leu Leu Gly Cys Glu Leu Gly Pro Asp Asn Thr Ser Val

115 120 125

Pro Thr Ala Lys Phe Ala Leu Asn Gly Glu Glu Phe Met Asn Phe Asp

130 135 140

Leu Lys Gln Gly Thr Trp Gly Gly Asp Trp Pro Glu Ala Leu Ala Ile

145 150 155 160

Ser Gln Arg Trp Gln Gln Gln Asp Lys Ala Ala Asn Lys Glu Leu Thr

165 170 175

Phe Leu Leu Phe Ser Cys Pro His Arg Leu Arg Glu His Leu Glu Arg

180 185 190

Gly Arg Gly Asn Leu Glu Trp Lys Glu Pro Pro Ser Met Arg Leu Lys

195 200 205

Ala Arg Pro Ser Ser Pro Gly Phe Ser Val Leu Thr Cys Ser Ala Phe

210 215 220

Ser Phe Tyr Pro Pro Glu Leu Gln Leu Arg Phe Leu Arg Asn Gly Leu

225 230 235 240

Ala Ala Gly Thr Gly Gln Gly Asp Phe Gly Pro Asn Ser Asp Gly Ser

245 250 255

Phe His Ala Ser Ser Ser Leu Thr Val Lys Ser Gly Asp Glu His His

260 265 270

Tyr Cys Cys Ile Val Gln His Ala Gly Leu Ala Gln Pro Leu Arg Val

275 280 285

Glu Leu

290

<210> 27

<211> 119

<212> PRT

<213> 智人

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(119)

<223> Beta-2-微球蛋白(SEQ ID No. 30和SEQ ID No. 31一起形成FcRN)

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(119)

<223> Beta-2-微球蛋白(SEQ ID No. 26和SEQ ID No. 27一起形成FcRN)

<400> 27

Met Ser Arg Ser Val Ala Leu Ala Val Leu Ala Leu Leu Ser Leu Ser

1 5 10 15

Gly Leu Glu Ala Ile Gln Arg Thr Pro Lys Ile Gln Val Tyr Ser Arg

20 25 30

His Pro Ala Glu Asn Gly Lys Ser Asn Phe Leu Asn Cys Tyr Val Ser

35 40 45

Gly Phe His Pro Ser Asp Ile Glu Val Asp Leu Leu Lys Asn Gly Glu

50 55 60

Arg Ile Glu Lys Val Glu His Ser Asp Leu Ser Phe Ser Lys Asp Trp

65 70 75 80

Ser Phe Tyr Leu Leu Tyr Tyr Thr Glu Phe Thr Pro Thr Glu Lys Asp

85 90 95

Glu Tyr Ala Cys Arg Val Asn His Val Thr Leu Ser Gln Pro Lys Ile

100 105 110

Val Lys Trp Asp Arg Asp Met

115

<210> 28

<211> 1758

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人血清白蛋白的多核苷酸编码序列(针对在酵母中表达优化的密码子)

<400> 28

gacgctcaca agtccgaagt cgctcacaga ttcaaggact tgggtgaaga aaacttcaag 60

gctttggtct tgatcgcttt cgctcaatac ttgcaacaat gtccattcga agatcacgtc 120

aagttggtca acgaagttac cgaattcgct aagacttgtg ttgctgacga atctgctgaa 180

aactgtgaca agtccttgca caccttgttc ggtgataagt tgtgtactgt tgctaccttg 240

agagaaacct acggtgaaat ggctgactgt tgtgctaagc aagaaccaga aagaaacgaa 300

tgtttcttgc aacacaagga cgacaaccca aacttgccaa gattggttag accagaagtt 360

gacgtcatgt gtactgcttt ccacgacaac gaagaaacct tcttgaagaa gtacttgtac 420

gaaattgcta gaagacaccc atacttctac gctccagaat tgttgttctt cgctaagaga 480

tacaaggctg ctttcaccga atgttgtcaa gctgctgata aggctgcttg tttgttgcca 540

aagttggatg aattgagaga cgaaggtaag gcttcttccg ctaagcaaag attgaagtgt 600

gcttccttgc aaaagttcgg tgaaagagct ttcaaggctt gggctgtcgc tagattgtct 660

caaagattcc caaaggctga attcgctgaa gtttctaagt tggttactga cttgactaag 720

gttcacactg aatgttgtca cggtgacttg ttggaatgtg ctgatgacag agctgacttg 780

gctaagtaca tctgtgaaaa ccaagactct atctcttcca agttgaagga atgttgtgaa 840

aagccattgt tggaaaagtc tcactgtatt gctgaagttg aaaacgatga aatgccagct 900

gacttgccat ctttggctgc tgacttcgtt gaatctaagg acgtttgtaa gaactacgct 960

gaagctaagg acgtcttctt gggtatgttc ttgtacgaat acgctagaag acacccagac 1020

tactccgttg tcttgttgtt gagattggct aagacctacg aaactacctt ggaaaagtgt 1080

tgtgctgctg ctgacccaca cgaatgttac gctaaggttt tcgatgaatt caagccattg 1140

gtcgaagaac cacaaaactt gatcaagcaa aactgtgaat tgttcgaaca attgggtgaa 1200

tacaagttcc aaaacgcttt gttggttaga tacactaaga aggtcccaca agtctccacc 1260

ccaactttgg ttgaagtctc tagaaacttg ggtaaggtcg gttctaagtg ttgtaagcac 1320

ccagaagcta agagaatgcc atgtgctgaa gattacttgt ccgtcgtttt gaaccaattg 1380

tgtgttttgc acgaaaagac cccagtctct gatagagtca ccaagtgttg tactgaatct 1440

ttggttaaca gaagaccatg tttctctgct ttggaagtcg acgaaactta cgttccaaag 1500

gaattcaacg ctgaaacttt caccttccac gctgatatct gtaccttgtc cgaaaaggaa 1560

agacaaatta agaagcaaac tgctttggtt gaattggtca agcacaagcc aaaggctact 1620

aaggaacaat tgaaggctgt catggatgat ttcgctgctt tcgttgaaaa gtgttgtaag 1680

gctgatgata aggaaacttg tttcgctgaa gaaggtaaga agttggtcgc tgcttcccaa 1740

gctgctttgg gtttgtaa 1758

<210> 29

<211> 609

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 具有融合前导序列的HSA

<220>

<221> signal

<222> (1)..(24)

<220>

<221> mat_peptide

<222> (25)..(609)

<400> 29

Met Lys Trp Val Ser Phe Ile Ser Leu Leu Phe Leu Phe Ser Ser Ala

-20 -15 -10

Tyr Ser Arg Ser Leu Asp Lys Arg Asp Ala His Lys Ser Glu Val Ala

-5 -1 1 5

His Arg Phe Lys Asp Leu Gly Glu Glu Asn Phe Lys Ala Leu Val Leu

10 15 20

Ile Ala Phe Ala Gln Tyr Leu Gln Gln Cys Pro Phe Glu Asp His Val

25 30 35 40

Lys Leu Val Asn Glu Val Thr Glu Phe Ala Lys Thr Cys Val Ala Asp

45 50 55

Glu Ser Ala Glu Asn Cys Asp Lys Ser Leu His Thr Leu Phe Gly Asp

60 65 70

Lys Leu Cys Thr Val Ala Thr Leu Arg Glu Thr Tyr Gly Glu Met Ala

75 80 85

Asp Cys Cys Ala Lys Gln Glu Pro Glu Arg Asn Glu Cys Phe Leu Gln

90 95 100

His Lys Asp Asp Asn Pro Asn Leu Pro Arg Leu Val Arg Pro Glu Val

105 110 115 120

Asp Val Met Cys Thr Ala Phe His Asp Asn Glu Glu Thr Phe Leu Lys

125 130 135

Lys Tyr Leu Tyr Glu Ile Ala Arg Arg His Pro Tyr Phe Tyr Ala Pro

140 145 150

Glu Leu Leu Phe Phe Ala Lys Arg Tyr Lys Ala Ala Phe Thr Glu Cys

155 160 165

Cys Gln Ala Ala Asp Lys Ala Ala Cys Leu Leu Pro Lys Leu Asp Glu

170 175 180

Leu Arg Asp Glu Gly Lys Ala Ser Ser Ala Lys Gln Arg Leu Lys Cys

185 190 195 200

Ala Ser Leu Gln Lys Phe Gly Glu Arg Ala Phe Lys Ala Trp Ala Val

205 210 215

Ala Arg Leu Ser Gln Arg Phe Pro Lys Ala Glu Phe Ala Glu Val Ser

220 225 230

Lys Leu Val Thr Asp Leu Thr Lys Val His Thr Glu Cys Cys His Gly

235 240 245

Asp Leu Leu Glu Cys Ala Asp Asp Arg Ala Asp Leu Ala Lys Tyr Ile

250 255 260

Cys Glu Asn Gln Asp Ser Ile Ser Ser Lys Leu Lys Glu Cys Cys Glu

265 270 275 280

Lys Pro Leu Leu Glu Lys Ser His Cys Ile Ala Glu Val Glu Asn Asp

285 290 295

Glu Met Pro Ala Asp Leu Pro Ser Leu Ala Ala Asp Phe Val Glu Ser

300 305 310

Lys Asp Val Cys Lys Asn Tyr Ala Glu Ala Lys Asp Val Phe Leu Gly

315 320 325

Met Phe Leu Tyr Glu Tyr Ala Arg Arg His Pro Asp Tyr Ser Val Val

330 335 340

Leu Leu Leu Arg Leu Ala Lys Thr Tyr Glu Thr Thr Leu Glu Lys Cys

345 350 355 360

Cys Ala Ala Ala Asp Pro His Glu Cys Tyr Ala Lys Val Phe Asp Glu

365 370 375

Phe Lys Pro Leu Val Glu Glu Pro Gln Asn Leu Ile Lys Gln Asn Cys

380 385 390

Glu Leu Phe Glu Gln Leu Gly Glu Tyr Lys Phe Gln Asn Ala Leu Leu

395 400 405

Val Arg Tyr Thr Lys Lys Val Pro Gln Val Ser Thr Pro Thr Leu Val

410 415 420

Glu Val Ser Arg Asn Leu Gly Lys Val Gly Ser Lys Cys Cys Lys His

425 430 435 440

Pro Glu Ala Lys Arg Met Pro Cys Ala Glu Asp Tyr Leu Ser Val Val

445 450 455

Leu Asn Gln Leu Cys Val Leu His Glu Lys Thr Pro Val Ser Asp Arg

460 465 470

Val Thr Lys Cys Cys Thr Glu Ser Leu Val Asn Arg Arg Pro Cys Phe

475 480 485

Ser Ala Leu Glu Val Asp Glu Thr Tyr Val Pro Lys Glu Phe Asn Ala

490 495 500

Glu Thr Phe Thr Phe His Ala Asp Ile Cys Thr Leu Ser Glu Lys Glu

505 510 515 520

Arg Gln Ile Lys Lys Gln Thr Ala Leu Val Glu Leu Val Lys His Lys

525 530 535

Pro Lys Ala Thr Lys Glu Gln Leu Lys Ala Val Met Asp Asp Phe Ala

540 545 550

Ala Phe Val Glu Lys Cys Cys Lys Ala Asp Asp Lys Glu Thr Cys Phe

555 560 565

Ala Glu Glu Gly Lys Lys Leu Val Ala Ala Ser Gln Ala Ala Leu Gly

570 575 580

Leu

585

<210> 30

<211> 585

<212> PRT

<213> 人工

<220>

<223> HSA C34A

<400> 30

Asp Ala His Lys Ser Glu Val Ala His Arg Phe Lys Asp Leu Gly Glu

1 5 10 15

Glu Asn Phe Lys Ala Leu Val Leu Ile Ala Phe Ala Gln Tyr Leu Gln

20 25 30

Gln Ala Pro Phe Glu Asp His Val Lys Leu Val Asn Glu Val Thr Glu

35 40 45

Phe Ala Lys Thr Cys Val Ala Asp Glu Ser Ala Glu Asn Cys Asp Lys

50 55 60

Ser Leu His Thr Leu Phe Gly Asp Lys Leu Cys Thr Val Ala Thr Leu

65 70 75 80

Arg Glu Thr Tyr Gly Glu Met Ala Asp Cys Cys Ala Lys Gln Glu Pro

85 90 95

Glu Arg Asn Glu Cys Phe Leu Gln His Lys Asp Asp Asn Pro Asn Leu

100 105 110

Pro Arg Leu Val Arg Pro Glu Val Asp Val Met Cys Thr Ala Phe His

115 120 125

Asp Asn Glu Glu Thr Phe Leu Lys Lys Tyr Leu Tyr Glu Ile Ala Arg

130 135 140

Arg His Pro Tyr Phe Tyr Ala Pro Glu Leu Leu Phe Phe Ala Lys Arg

145 150 155 160

Tyr Lys Ala Ala Phe Thr Glu Cys Cys Gln Ala Ala Asp Lys Ala Ala

165 170 175

Cys Leu Leu Pro Lys Leu Asp Glu Leu Arg Asp Glu Gly Lys Ala Ser

180 185 190

Ser Ala Lys Gln Arg Leu Lys Cys Ala Ser Leu Gln Lys Phe Gly Glu

195 200 205

Arg Ala Phe Lys Ala Trp Ala Val Ala Arg Leu Ser Gln Arg Phe Pro

210 215 220

Lys Ala Glu Phe Ala Glu Val Ser Lys Leu Val Thr Asp Leu Thr Lys

225 230 235 240

Val His Thr Glu Cys Cys His Gly Asp Leu Leu Glu Cys Ala Asp Asp

245 250 255

Arg Ala Asp Leu Ala Lys Tyr Ile Cys Glu Asn Gln Asp Ser Ile Ser

260 265 270

Ser Lys Leu Lys Glu Cys Cys Glu Lys Pro Leu Leu Glu Lys Ser His

275 280 285

Cys Ile Ala Glu Val Glu Asn Asp Glu Met Pro Ala Asp Leu Pro Ser

290 295 300

Leu Ala Ala Asp Phe Val Glu Ser Lys Asp Val Cys Lys Asn Tyr Ala

305 310 315 320

Glu Ala Lys Asp Val Phe Leu Gly Met Phe Leu Tyr Glu Tyr Ala Arg

325 330 335

Arg His Pro Asp Tyr Ser Val Val Leu Leu Leu Arg Leu Ala Lys Thr

340 345 350

Tyr Glu Thr Thr Leu Glu Lys Cys Cys Ala Ala Ala Asp Pro His Glu

355 360 365

Cys Tyr Ala Lys Val Phe Asp Glu Phe Lys Pro Leu Val Glu Glu Pro

370 375 380

Gln Asn Leu Ile Lys Gln Asn Cys Glu Leu Phe Glu Gln Leu Gly Glu

385 390 395 400

Tyr Lys Phe Gln Asn Ala Leu Leu Val Arg Tyr Thr Lys Lys Val Pro

405 410 415

Gln Val Ser Thr Pro Thr Leu Val Glu Val Ser Arg Asn Leu Gly Lys

420 425 430

Val Gly Ser Lys Cys Cys Lys His Pro Glu Ala Lys Arg Met Pro Cys

435 440 445

Ala Glu Asp Tyr Leu Ser Val Val Leu Asn Gln Leu Cys Val Leu His

450 455 460

Glu Lys Thr Pro Val Ser Asp Arg Val Thr Lys Cys Cys Thr Glu Ser

465 470 475 480

Leu Val Asn Arg Arg Pro Cys Phe Ser Ala Leu Glu Val Asp Glu Thr

485 490 495

Tyr Val Pro Lys Glu Phe Asn Ala Glu Thr Phe Thr Phe His Ala Asp

500 505 510

Ile Cys Thr Leu Ser Glu Lys Glu Arg Gln Ile Lys Lys Gln Thr Ala

515 520 525

Leu Val Glu Leu Val Lys His Lys Pro Lys Ala Thr Lys Glu Gln Leu

530 535 540

Lys Ala Val Met Asp Asp Phe Ala Ala Phe Val Glu Lys Cys Cys Lys

545 550 555 560

Ala Asp Asp Lys Glu Thr Cys Phe Ala Glu Glu Gly Lys Lys Leu Val

565 570 575

Ala Ala Ser Gln Ala Ala Leu Gly Leu

580 585

<210> 31

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> C34A反向引物

<400> 31

ttgttgcaag tattgagcga aagcgatcaa gaccaa 36

<210> 32

<211> 45

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> C34A正向引物

<400> 32

ttcgctcaat acttgcaaca agctccattc gaagatcacg tcaag 45

<210> 33

<211> 50

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> L24C正向引物

<400> 33

gaagaaaact tcaaggcttt ggtctgtatc gctttcgctc aatacttgca 50

<210> 34

<211> 48

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> F49C正向引物

<400> 34

agttggtcaa cgaagttacc gaatgtgcta agacttgtgt tgctgacg 48

<210> 35

<211> 48

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> V54C正向引物

<400> 35

gttaccgaat tcgctaagac ttgttgtgct gacgaatccg cggaaaac 48

<210> 36

<211> 49

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> D56C正向引物

<400> 36

gaattcgcta agacttgtgt tgcttgtgaa tccgcggaaa actgtgaca 49

<210> 37

<211> 48

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> L66C正向引物

<400> 37

cgcggaaaac tgtgacaagt cctgtcacac cttgttcggt gataagtt 48

<210> 38

<211> 49

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> A92C正向引物

<400> 38

cggtgaaatg gctgactgtt gttgtaagca agaaccagaa agaaacgaa 49

<210> 39

<211> 50

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> K93C正向引物

<400> 39

gtgaaatggc tgactgttgt gcttgtcaag aaccagaaag aaacgaatgt 50

<210> 40

<211> 50

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> Q94C正向引物

<400> 40

aaatggctga ctgttgtgct aagtgtgaac cagaaagaaa cgaatgtttc 50

<210> 41

<211> 50

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> E97C正向引物

<400> 41

actgttgtgc taagcaagaa ccatgtagaa acgaatgttt cttgcaacac 50

<210> 42

<211> 50

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> H128C正向引物

<400> 42

ttgacgtcat gtgtactgct ttctgtgaca acgaagaaac cttcttgaag 50

<210> 43

<211> 49

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> F156C正向引物

<400> 43

acttctacgc tccagaattg ttgtgtttcg ctaagagata caaggctgc 49

<210> 44

<211> 51

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> A226C正向引物

<400> 44

agattgtctc aaagattccc aaagtgtgaa ttcgctgaag tttctaagtt g 51

<210> 45

<211> 50

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> A227C正向引物

<400> 45

tgtctcaaag attcccaaag gcttgtttcg ctgaagtttc taagttggtt 50

<210> 46

<211> 50

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> E230C正向引物

<400> 46

gattcccaaa ggctgaattc gcttgtgttt ctaagttggt tactgacttg 50

<210> 47

<211> 51

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> D237C正向引物

<400> 47

gctgaagttt ctaagttggt tacttgtttg actaaggttc acactgaatg t 51

<210> 48

<211> 50

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> K240C正向引物

<400> 48

tctaagttgg ttactgactt gacttgtgtt cacactgaat gttgtcacgg 50

<210> 49

<211> 49

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> D259C正向引物

<400> 49

ggaatgtgct gatgacagag cttgtttggc taagtacatc tgtgaaaac 49

<210> 50

<211> 49

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> K262C正向引物

<400> 50

tgatgacaga gctgacttgg cttgttacat ctgtgaaaac caagactct 49

<210> 51

<211> 51

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> N267C正向引物

<400> 51

gacttggcta agtacatctg tgaatgtcaa gactctatct cttccaagtt g 51

<210> 52

<211> 51

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> Q268C正向引物

<400> 52

ttggctaagt acatctgtga aaactgtgac tctatctctt ccaagttgaa g 51

<210> 53

<211> 51

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> I271C正向引物

<400> 53

tacatctgtg aaaaccaaga ctcttgttct tccaagttga aggaatgttg t 51

<210> 54

<211> 50

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> L275C正向引物

<400> 54

accaagactc tatctcttcc aagtgtaagg aatgttgtga aaagccattg 50

<210> 55

<211> 51

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> E277C正向引物

<400> 55

gactctatct cttccaagtt gaagtgttgt tgtgaaaagc cattgttgga a 51

<210> 56

<211> 51

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> L284C正向引物

<400> 56

aaggaatgtt gtgaaaagcc attgtgtgaa aagtctcact gtattgctga a 51

<210> 57

<211> 50

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> E294C正向引物

<400> 57

aagtctcact gtattgctga agtttgtaac gatgaaatgc cagctgactt 50

<210> 58

<211> 50

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> E311C正向引物

<400> 58

catctttggc tgctgacttc gtttgttcta aggacgtttg taagaactac 50

<210> 59

<211> 49

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> K317C正向引物

<400> 59

ttcgttgaat ctaaggacgt ttgttgtaac tacgctgaag ctaaggacg 49

<210> 60

<211> 50

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> A322C正向引物

<400> 60

gacgtttgta agaactacgc tgaatgtaag gacgtcttct tgggtatgtt 50

<210> 61

<211> 49

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> E333C

<400> 61

gtcttcttgg gtatgttctt gtactgttac gctagaagac acccagact 49

<210> 62

<211> 48

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> D340C正向引物

<400> 62

cgaatacgct agaagacacc catgttactc cgttgtcttg ttgttgag 48

<210> 63

<211> 48

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> E354C正向引物

<400> 63

tgttgagatt ggctaagacc tactgtacta ccctcgagaa gtgttgtg 48

<210> 64

<211> 48

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> E358C正向引物

<400> 64

ctaagaccta cgaaactacc ctctgtaagt gttgtgctgc tgctgacc 48

<210> 65

<211> 46

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> K359C正向引物

<400> 65

gacctacgaa actaccctcg agtgttgttg tgctgctgct gaccca 46

<210> 66

<211> 47

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> A362C正向引物

<400> 66

aaactaccct cgagaagtgt tgttgtgctg ctgacccaca cgaatgt 47

<210> 67

<211> 50

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> E382C正向引物

<400> 67

tcgatgaatt caagccattg gtctgtgaac cacaaaactt gatcaagcaa 50

<210> 68

<211> 51

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> L398C正向引物

<400> 68

gcaaaactgt gaattgttcg aacaatgtgg tgaatacaag ttccaaaacg c 51

<210> 69

<211> 35

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> L24C反向引物

<400> 69

gaccaaagcc ttgaagtttt cttcacccaa gtcct 35

<210> 70

<211> 35

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> F49C反向引物

<400> 70

ttcggtaact tcgttgacca acttgacgtg atctt 35

<210> 71

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> V54C反向引物

<400> 71

acaagtctta gcgaattcgg taacttcgtt gaccaa 36

<210> 72

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> D56C反向引物

<400> 72

agcaacacaa gtcttagcga attcggtaac ttcgtt 36

<210> 73

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> L66C反向引物

<400> 73

ggacttgtca cagttttccg cggattcgtc agc 33

<210> 74

<211> 34

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> A92C反向引物

<400> 74

acaacagtca gccatttcac cgtaggtttc tctc 34

<210> 75

<211> 35

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> K93C反向引物

<400> 75

agcacaacag tcagccattt caccgtaggt ttctc 35

<210> 76

<211> 34

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> Q94C反向引物

<400> 76

cttagcacaa cagtcagcca tttcaccgta ggtt 34

<210> 77

<211> 35

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> E97C反向引物

<400> 77

tggttcttgc ttagcacaac agtcagccat ttcac 35

<210> 78

<211> 35

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> H128C反向引物

<400> 78

gaaagcagta cacatgacgt caacttctgg tctaa 35

<210> 79

<211> 35

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> F156C反向引物

<400> 79

caacaattct ggagcgtaga agtatgggtg tcttc 35

<210> 80

<211> 34

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> A226C反向引物

<400> 80

ctttgggaat ctttgagaca atctagcgac agcc 34

<210> 81

<211> 35

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> E227C反向引物

<400> 81

agcctttggg aatctttgag acaatctagc gacag 35

<210> 82

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> E230C反向引物

<400> 82

agcgaattca gcctttggga atctttgaga caatct 36

<210> 83

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> E237C反向引物

<400> 83

agtaaccaac ttagaaactt cagcgaattc agcctt 36

<210> 84

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> K240C反向引物

<400> 84

agtcaagtca gtaaccaact tagaaacttc agcgaa 36

<210> 85

<211> 34

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> D259C反向引物

<400> 85

agctctgtca tcagcacatt ccaacaagtc accg 34

<210> 86

<211> 34

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> K262C反向引物

<400> 86

agccaagtca gctctgtcat cagcacattc caac 34

<210> 87

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> N267C反向引物

<400> 87

ttcacagatg tacttagcca agtcagctct gtcatc 36

<210> 88

<211> 35

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> Q268C反向引物

<400> 88

gttttcacag atgtacttag ccaagtcagc tctgt 35

<210> 89

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> I271C反向引物

<400> 89

agagtcttgg ttttcacaga tgtacttagc caagtc 36

<210> 90

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> L275C反向引物

<400> 90

cttggaagag atagagtctt ggttttcaca gatgta 36

<210> 91

<211> 37

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> E277C反向引物

<400> 91

cttcaacttg gaagagatag agtcttggtt ttcacag 37

<210> 92

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> E284C反向引物

<400> 92

caatggcttt tcacaacatt ccttcaactt ggaaga 36

<210> 93

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> E294C反向引物

<400> 93

aacttcagca atacagtgag acttttccaa caatgg 36

<210> 94

<211> 34

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> E311C反向引物

<400> 94

aacgaagtca gcagccaaag atggcaagtc agct 34

<210> 95

<211> 34

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> K317C反向引物

<400> 95

acaaacgtcc ttagattcaa cgaagtcagc agcc 34

<210> 96

<211> 37

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> A322C反向引物

<400> 96

ttcagcgtag ttcttacaaa cgtccttaga ttcaacg 37

<210> 97

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> E333C反向引物

<400> 97

gtacaagaac atacccaaga agacgtcctt agcttc 36

<210> 98

<211> 35

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> D340C反向引物

<400> 98

tgggtgtctt ctagcgtatt cgtacaagaa catac 35

<210> 99

<211> 35

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> E354C反向引物

<400> 99

gtaggtctta gccaatctca acaacaagac aacgg 35

<210> 100

<211> 35

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> E358C反向引物

<400> 100

gagggtagtt tcgtaggtct tagccaatct caaca 35

<210> 101

<211> 34

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> K359C反向引物

<400> 101

ctcgagggta gtttcgtagg tcttagccaa tctc 34

<210> 102

<211> 35

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> A362C反向引物

<400> 102

acaacacttc tcgagggtag tttcgtaggt cttag 35

<210> 103

<211> 35

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> E382C反向引物

<400> 103

gaccaatggc ttgaattcat cgaaaacctt agcgt 35

<210> 104

<211> 39

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> L398C反向引物

<400> 104

ttgttcgaac aattcacagt tttgcttgat caagttttg 39

<210> 105

<211> 585

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> HSA C34A_L24C

<400> 105

Asp Ala His Lys Ser Glu Val Ala His Arg Phe Lys Asp Leu Gly Glu

1 5 10 15

Glu Asn Phe Lys Ala Leu Val Cys Ile Ala Phe Ala Gln Tyr Leu Gln

20 25 30

Gln Ala Pro Phe Glu Asp His Val Lys Leu Val Asn Glu Val Thr Glu

35 40 45

Phe Ala Lys Thr Cys Val Ala Asp Glu Ser Ala Glu Asn Cys Asp Lys

50 55 60

Ser Leu His Thr Leu Phe Gly Asp Lys Leu Cys Thr Val Ala Thr Leu

65 70 75 80

Arg Glu Thr Tyr Gly Glu Met Ala Asp Cys Cys Ala Lys Gln Glu Pro

85 90 95

Glu Arg Asn Glu Cys Phe Leu Gln His Lys Asp Asp Asn Pro Asn Leu

100 105 110

Pro Arg Leu Val Arg Pro Glu Val Asp Val Met Cys Thr Ala Phe His

115 120 125

Asp Asn Glu Glu Thr Phe Leu Lys Lys Tyr Leu Tyr Glu Ile Ala Arg

130 135 140

Arg His Pro Tyr Phe Tyr Ala Pro Glu Leu Leu Phe Phe Ala Lys Arg

145 150 155 160

Tyr Lys Ala Ala Phe Thr Glu Cys Cys Gln Ala Ala Asp Lys Ala Ala

165 170 175

Cys Leu Leu Pro Lys Leu Asp Glu Leu Arg Asp Glu Gly Lys Ala Ser

180 185 190

Ser Ala Lys Gln Arg Leu Lys Cys Ala Ser Leu Gln Lys Phe Gly Glu

195 200 205

Arg Ala Phe Lys Ala Trp Ala Val Ala Arg Leu Ser Gln Arg Phe Pro

210 215 220

Lys Ala Glu Phe Ala Glu Val Ser Lys Leu Val Thr Asp Leu Thr Lys

225 230 235 240

Val His Thr Glu Cys Cys His Gly Asp Leu Leu Glu Cys Ala Asp Asp

245 250 255

Arg Ala Asp Leu Ala Lys Tyr Ile Cys Glu Asn Gln Asp Ser Ile Ser

260 265 270

Ser Lys Leu Lys Glu Cys Cys Glu Lys Pro Leu Leu Glu Lys Ser His

275 280 285

Cys Ile Ala Glu Val Glu Asn Asp Glu Met Pro Ala Asp Leu Pro Ser

290 295 300

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<211> 585

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465 470 475 480

Leu Val Asn Arg Arg Pro Cys Phe Ser Ala Leu Glu Val Asp Glu Thr

485 490 495

Tyr Val Pro Lys Glu Phe Asn Ala Glu Thr Phe Thr Phe His Ala Asp

500 505 510

Ile Cys Thr Leu Ser Glu Lys Glu Arg Gln Ile Lys Lys Gln Thr Ala

515 520 525

Leu Val Glu Leu Val Lys His Lys Pro Lys Ala Thr Lys Glu Gln Leu

530 535 540

Lys Ala Val Met Asp Asp Phe Ala Ala Phe Val Glu Lys Cys Cys Lys

545 550 555 560

Ala Asp Asp Lys Glu Thr Cys Phe Ala Glu Glu Gly Pro Lys Leu Val

565 570 575

Ala Ala Ser Gln Ala Ala Leu Gly Leu

580 585

<210> 151

<211> 585

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> HSA K93C_E294C_K573P

<400> 151

Asp Ala His Lys Ser Glu Val Ala His Arg Phe Lys Asp Leu Gly Glu

1 5 10 15

Glu Asn Phe Lys Ala Leu Val Leu Ile Ala Phe Ala Gln Tyr Leu Gln

20 25 30

Gln Cys Pro Phe Glu Asp His Val Lys Leu Val Asn Glu Val Thr Glu

35 40 45

Phe Ala Lys Thr Cys Val Ala Asp Glu Ser Ala Glu Asn Cys Asp Lys

50 55 60

Ser Leu His Thr Leu Phe Gly Asp Lys Leu Cys Thr Val Ala Thr Leu

65 70 75 80

Arg Glu Thr Tyr Gly Glu Met Ala Asp Cys Cys Ala Cys Gln Glu Pro

85 90 95

Glu Arg Asn Glu Cys Phe Leu Gln His Lys Asp Asp Asn Pro Asn Leu

100 105 110

Pro Arg Leu Val Arg Pro Glu Val Asp Val Met Cys Thr Ala Phe His

115 120 125

Asp Asn Glu Glu Thr Phe Leu Lys Lys Tyr Leu Tyr Glu Ile Ala Arg

130 135 140

Arg His Pro Tyr Phe Tyr Ala Pro Glu Leu Leu Phe Phe Ala Lys Arg

145 150 155 160

Tyr Lys Ala Ala Phe Thr Glu Cys Cys Gln Ala Ala Asp Lys Ala Ala

165 170 175

Cys Leu Leu Pro Lys Leu Asp Glu Leu Arg Asp Glu Gly Lys Ala Ser

180 185 190

Ser Ala Lys Gln Arg Leu Lys Cys Ala Ser Leu Gln Lys Phe Gly Glu

195 200 205

Arg Ala Phe Lys Ala Trp Ala Val Ala Arg Leu Ser Gln Arg Phe Pro

210 215 220

Lys Ala Glu Phe Ala Glu Val Ser Lys Leu Val Thr Asp Leu Thr Lys

225 230 235 240

Val His Thr Glu Cys Cys His Gly Asp Leu Leu Glu Cys Ala Asp Asp

245 250 255

Arg Ala Asp Leu Ala Lys Tyr Ile Cys Glu Asn Gln Asp Ser Ile Ser

260 265 270

Ser Lys Leu Lys Glu Cys Cys Glu Lys Pro Leu Leu Glu Lys Ser His

275 280 285

Cys Ile Ala Glu Val Cys Asn Asp Glu Met Pro Ala Asp Leu Pro Ser

290 295 300

Leu Ala Ala Asp Phe Val Glu Ser Lys Asp Val Cys Lys Asn Tyr Ala

305 310 315 320

Glu Ala Lys Asp Val Phe Leu Gly Met Phe Leu Tyr Glu Tyr Ala Arg

325 330 335

Arg His Pro Asp Tyr Ser Val Val Leu Leu Leu Arg Leu Ala Lys Thr

340 345 350

Tyr Glu Thr Thr Leu Glu Lys Cys Cys Ala Ala Ala Asp Pro His Glu

355 360 365

Cys Tyr Ala Lys Val Phe Asp Glu Phe Lys Pro Leu Val Glu Glu Pro

370 375 380

Gln Asn Leu Ile Lys Gln Asn Cys Glu Leu Phe Glu Gln Leu Gly Glu

385 390 395 400

Tyr Lys Phe Gln Asn Ala Leu Leu Val Arg Tyr Thr Lys Lys Val Pro

405 410 415

Gln Val Ser Thr Pro Thr Leu Val Glu Val Ser Arg Asn Leu Gly Lys

420 425 430

Val Gly Ser Lys Cys Cys Lys His Pro Glu Ala Lys Arg Met Pro Cys

435 440 445

Ala Glu Asp Tyr Leu Ser Val Val Leu Asn Gln Leu Cys Val Leu His

450 455 460

Glu Lys Thr Pro Val Ser Asp Arg Val Thr Lys Cys Cys Thr Glu Ser

465 470 475 480

Leu Val Asn Arg Arg Pro Cys Phe Ser Ala Leu Glu Val Asp Glu Thr

485 490 495

Tyr Val Pro Lys Glu Phe Asn Ala Glu Thr Phe Thr Phe His Ala Asp

500 505 510

Ile Cys Thr Leu Ser Glu Lys Glu Arg Gln Ile Lys Lys Gln Thr Ala

515 520 525

Leu Val Glu Leu Val Lys His Lys Pro Lys Ala Thr Lys Glu Gln Leu

530 535 540

Lys Ala Val Met Asp Asp Phe Ala Ala Phe Val Glu Lys Cys Cys Lys

545 550 555 560

Ala Asp Asp Lys Glu Thr Cys Phe Ala Glu Glu Gly Pro Lys Leu Val

565 570 575

Ala Ala Ser Gln Ala Ala Leu Gly Leu

580 585

<210> 152

<211> 585

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> HSA C34A_L302C

<400> 152

Asp Ala His Lys Ser Glu Val Ala His Arg Phe Lys Asp Leu Gly Glu

1 5 10 15

Glu Asn Phe Lys Ala Leu Val Leu Ile Ala Phe Ala Gln Tyr Leu Gln

20 25 30

Gln Ala Pro Phe Glu Asp His Val Lys Leu Val Asn Glu Val Thr Glu

35 40 45

Phe Ala Lys Thr Cys Val Ala Asp Glu Ser Ala Glu Asn Cys Asp Lys

50 55 60

Ser Leu His Thr Leu Phe Gly Asp Lys Leu Cys Thr Val Ala Thr Leu

65 70 75 80

Arg Glu Thr Tyr Gly Glu Met Ala Asp Cys Cys Ala Lys Gln Glu Pro

85 90 95

Glu Arg Asn Glu Cys Phe Leu Gln His Lys Asp Asp Asn Pro Asn Leu

100 105 110

Pro Arg Leu Val Arg Pro Glu Val Asp Val Met Cys Thr Ala Phe His

115 120 125

Asp Asn Glu Glu Thr Phe Leu Lys Lys Tyr Leu Tyr Glu Ile Ala Arg

130 135 140

Arg His Pro Tyr Phe Tyr Ala Pro Glu Leu Leu Phe Phe Ala Lys Arg

145 150 155 160

Tyr Lys Ala Ala Phe Thr Glu Cys Cys Gln Ala Ala Asp Lys Ala Ala

165 170 175

Cys Leu Leu Pro Lys Leu Asp Glu Leu Arg Asp Glu Gly Lys Ala Ser

180 185 190

Ser Ala Lys Gln Arg Leu Lys Cys Ala Ser Leu Gln Lys Phe Gly Glu

195 200 205

Arg Ala Phe Lys Ala Trp Ala Val Ala Arg Leu Ser Gln Arg Phe Pro

210 215 220

Lys Ala Glu Phe Ala Glu Val Ser Lys Leu Val Thr Asp Leu Thr Lys

225 230 235 240

Val His Thr Glu Cys Cys His Gly Asp Leu Leu Glu Cys Ala Asp Asp

245 250 255

Arg Ala Asp Leu Ala Lys Tyr Ile Cys Glu Asn Gln Asp Ser Ile Ser

260 265 270

Ser Lys Leu Lys Glu Cys Cys Glu Lys Pro Leu Leu Glu Lys Ser His

275 280 285

Cys Ile Ala Glu Val Glu Asn Asp Glu Met Pro Ala Asp Cys Pro Ser

290 295 300

Leu Ala Ala Asp Phe Val Glu Ser Lys Asp Val Cys Lys Asn Tyr Ala

305 310 315 320

Glu Ala Lys Asp Val Phe Leu Gly Met Phe Leu Tyr Glu Tyr Ala Arg

325 330 335

Arg His Pro Asp Tyr Ser Val Val Leu Leu Leu Arg Leu Ala Lys Thr

340 345 350

Tyr Glu Thr Thr Leu Glu Lys Cys Cys Ala Ala Ala Asp Pro His Glu

355 360 365

Cys Tyr Ala Lys Val Phe Asp Glu Phe Lys Pro Leu Val Glu Glu Pro

370 375 380

Gln Asn Leu Ile Lys Gln Asn Cys Glu Leu Phe Glu Gln Leu Gly Glu

385 390 395 400

Tyr Lys Phe Gln Asn Ala Leu Leu Val Arg Tyr Thr Lys Lys Val Pro

405 410 415

Gln Val Ser Thr Pro Thr Leu Val Glu Val Ser Arg Asn Leu Gly Lys

420 425 430

Val Gly Ser Lys Cys Cys Lys His Pro Glu Ala Lys Arg Met Pro Cys

435 440 445

Ala Glu Asp Tyr Leu Ser Val Val Leu Asn Gln Leu Cys Val Leu His

450 455 460

Glu Lys Thr Pro Val Ser Asp Arg Val Thr Lys Cys Cys Thr Glu Ser

465 470 475 480

Leu Val Asn Arg Arg Pro Cys Phe Ser Ala Leu Glu Val Asp Glu Thr

485 490 495

Tyr Val Pro Lys Glu Phe Asn Ala Glu Thr Phe Thr Phe His Ala Asp

500 505 510

Ile Cys Thr Leu Ser Glu Lys Glu Arg Gln Ile Lys Lys Gln Thr Ala

515 520 525

Leu Val Glu Leu Val Lys His Lys Pro Lys Ala Thr Lys Glu Gln Leu

530 535 540

Lys Ala Val Met Asp Asp Phe Ala Ala Phe Val Glu Lys Cys Cys Lys

545 550 555 560

Ala Asp Asp Lys Glu Thr Cys Phe Ala Glu Glu Gly Lys Lys Leu Val

565 570 575

Ala Ala Ser Gln Ala Ala Leu Gly Leu

580 585

Claims

1.一种有缀合能力的多肽，其包括与人白蛋白(SEQ ID NO.2)或其片段的同一性为至少70％的氨基酸序列；

其中至少一个(例如，若干个)与选自SEQ ID NO.2的K93、A226、E230、I271、E294、E358、L24、F49、V54、D56、A92、Q94、E97、H128、F156、E227、D237、K240、D259、K262、N267、Q268、L275、L284、K317、A322、E333、D340、E354、K359、A362、E382和L398的位置相当的位置包括有缀合能力的半胱氨酸残基；并且

其中所述有缀合能力的多肽在溶液中作为单体存在的倾向性是SEQ ID NO.2多肽在溶液中作为单体存在的倾向性的至少70％。

2.根据权利要求1所述的有缀合能力的多肽，其中所述多肽包括一个或多个(例如，若干个)：

氨基酸替换，其为在与SEQ ID NO.2的残基K93、A226、E230、I271、E294、E358、L24、F49、V54、D56、L66、A92、Q94、E97、H128、F156、E227、D237、K240、D259、K262、N267、Q268、L275、E277、L284、E311、K317、A322、E333、D340、E354、K359、A362、E382和L398中任一者相当的位置所对应的位置处，将半胱氨酸以外的氨基酸用半胱氨酸替换；和/或

半胱氨酸的插入，其在与SEQ ID NO.2的残基K93、A226、E230、I271、E294、E358、L24、F49、V54、D56、L66、A92、Q94、E97、H128、F156、E227、D237、K240、D259、K262、N267、Q268、L275、E277、L284、E311、K317、A322、E333、D340、E354、K359、A362、E382和L398中任一者相当的位置所对应的氨基酸的N-或C-侧相邻的位置处。

3.根据权利要求1或2所述的有缀合能力的多肽，其中2个、3个、4个、5个或更多个(例如，若干个)与选自SEQ ID NO.2的K93、A226、E230、I271、E294、E358、L24、F49、V54、D56、L66、A92、Q94、E97、H128、F156、E227、D237、K240、D259、K262、N267、Q268、L275、E277、L284、E311、K317、A322、E333、D340、E354、K359、A362、E382和L398的位置相当的位置包括有缀合能力的半胱氨酸残基。

4.根据前述权利要求中任一项所述的有缀合能力的多肽，其中所述多肽在溶液中作为单体存在的倾向性是SEQ ID NO.2多肽在溶液中作为单体存在的倾向性的至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少100％。

5.根据前述权利要求中任一项所述的有缀合能力的多肽，其中在与SEQ ID NO.2的34位相当的位置处为有缀合能力的半胱氨酸。

6.根据权利要求1-4中任一项所述的有缀合能力的多肽，其中在与SEQ ID NO.2的34位相当的位置处没有有缀合能力的半胱氨酸。

7.根据前述权利要求中任一项所述的有缀合能力的多肽，其中所述多肽包括两个或更多个(若干个)有缀合能力的半胱氨酸残基，其中，当所述多肽折叠时，至少两个有缀合能力的半胱氨酸残基之间存在至少的距离。

8.根据前述权利要求中任一项所述的有缀合能力的多肽，其中所述多肽在与SEQ IDNO.2的残基K93或E294相当的位置所对应的一个或两个位置处包括将半胱氨酸以外的氨基酸替换成半胱氨酸的替换。

9.根据前述权利要求中任一项所述的有缀合能力的多肽，其能够以至少95％的缀合效率与马来酰亚胺-聚乙二醇2-生物素形成缀合物，适当地其中缀合物在受控水解时是至少95％稳定的。

10.一种有缀合能力的多肽，其包括与人白蛋白(SEQ ID NO.2)或其片段的同一性为至少70％的氨基酸序列；

其中至少一个(例如，若干个)与选自SEQ ID NO.2的K93、A226、E230、I271、E294、E358、L24、F49、V54、D56、L66、A92、Q94、E97、H128、F156、E227、D237、K240、D259、K262、N267、Q268、L275、E277、L284、E311、K317、A322、E333、D340、E354、K359、A362、E382和L398的位置相当的位置包括有缀合能力的半胱氨酸残基；并且

其相较于SEQ ID NO.2包括至少一个(例如，若干个)另外的修饰，例如，导致多肽具有至少一个(例如，若干个)另外的有缀合能力的半胱氨酸、或者改变多肽的FcRn结合亲和力、或者改变多肽的血浆半衰期的另外的修饰。

11.根据权利要求10所述的有缀合能力的多肽，其中所述至少一个(例如，若干个)另外的修饰包括至少一个(例如，若干个)另外的如权利要求1、2、3或8中任一项所定义的有缀合能力的半胱氨酸。

12.根据前述权利要求中任一项所述的有缀合能力的多肽，其中至少一个(例如，若干个)与选自SEQ ID NO.2的D1、A2、H3、S5、A55、S58、C75、T76、T79、E82、T83、E86、C91、D121、V122、C124、T125、D129、C169、C177、A229、T236、E266、D269、S270、S273、S304、K313、D314、C316、N318、A320、C361、A364、C369、A371、N386、Q390、Q397、S435、T478、T496、A504、E505、T506、T508、D549、C558、D562、C567、A581、L585和A578的位置相当的位置包括有缀合能力的半胱氨酸。

13.根据前述权利要求中任一项所述的有缀合能力的多肽，其中所述多肽包括一个或多个(例如，若干个)：

氨基酸替换，其为在与SEQ ID NO.2的残基D1、A2、H3、S5、A55、S58、C75、T76、T79、E82、T83、E86、C91、D121、V122、C124、T125、D129、C169、C177、A229、T236、E266、D269、S270、S273、S304、K313、D314、C316、N318、A320、C361、A364、C369、A371、N386、Q390、Q397、S435、T478、T496、A504、E505、T506、T508、D549、C558、D562、C567、A581、L585和A578中任一者相当的位置所对应的位置处，将半胱氨酸以外的氨基酸用半胱氨酸替换；和/或

半胱氨酸的插入，其在与SEQ ID NO.2的残基D1、A2、H3、S5、A55、S58、C75、T76、T79、E82、T83、E86、C91、D121、V122、C124、T125、D129、C169、C177、A229、T236、E266、D269、S270、S273、S304、K313、D314、C316、N318、A320、C361、A364、C369、A371、N386、Q390、Q397、S435、T478、T496、A504、E505、T506、T508、D549、C558、D562、C567、A581、L585和A578中任一者相当的位置所对应的氨基酸的N-或C-侧相邻的位置处；和/或

半胱氨酸的缺失或替换，其在与SEQ ID NO.2的C360、C316、C75、C168、C558、C361、C91、C124、C169和C567中任一者对应的位置处，以在C369、C361、C91、C177、C567、C316、C75、C169、C124和C558中任一处产生有缀合能力的半胱氨酸；和/或

14.根据前述权利要求中任一项所述的有缀合能力的多肽，其中所述多肽包括位于以下位置处的有缀合能力的半胱氨酸：(a)A2+L585；(b)A2+A364+D562+L585C；(c)A2和相邻于白蛋白C-端的C-侧；(d)T79+A364；(e)A364+D1；(f)T79+D562+A364；(g)D562+A364+D1；(h)T79+D562+A364+A504；(i)T79+D562+A364+L585；(j)T79+D562+A364+D1；(k)T79+D562+A364+L585+D1；(l)E86+D562+A364+A504+A2；(m)S270+A581；(n)S270+D129；(o)S270+A581+E82；(p)S270+A581+D129；(q)S270+A581+E82+D129；(r)S270+A581+E82+D129+Q397；(s)C369+C177；(t)A364+A581；(u)T79+A364+A581；(v)A364+A581+D129；(w)A364+C177；(x)D562+C369；(y)D129+C369；(z)A581+C369；或(aa)D562+D129+C369。

15.根据前述权利要求中任一项所述的有缀合能力的多肽，其包括白蛋白结构域III或其变体以及至少一个(例如，若干个)另外的白蛋白结构域或其片段例如第二白蛋白结构域III或其变体，或者由它们组成。

16.根据前述权利要求中任一项所述的有缀合能力的多肽，其包括至少一个(例如，若干个)白蛋白结构域III或其变体或片段，或者由其组成，其中至少一个(例如，若干个)白蛋白结构域III在与SEQ ID NO.2中选自以下的位置对应的位置中包括一个或多个(例如，若干个)替换：573、500、550、417、440、464、490、492、493、494、495、496、499、501、503、504、505、506、510、535、536、537、538、540、541、542、574、575、577、578、579、580、581、582和584。

17.根据权利要求16所述的有缀合能力的多肽，其中在与SEQ ID NO.2中所述位置对应的位置中的一个或多个(例如，若干个)替换选自：K573Y、W、P、H、F、V、I、T、N、S、G、M、C、A、E、Q、R、L、D，K500E、G、D、A、S、C、P、H、F、N、W、T、M、Y、V、Q、L、I、R，Q417A，H440A，H464Q，E492G，D494N、Q、A，E495Q、A，T496A，D494E+Q417H，D494N+T496A，E492G+V493P，P499A，E501A、Q，N503H、K，H510Q，H535Q，K536A，P537A，K538A，K541G、D，D550E、N，E492G+K573P、A，或者E492G/N503H/K573P。

18.根据前述权利要求中任一项所述的有缀合能力的多肽，其中所述多肽在两个或更多个(若干个)选自与SEQ ID NO.2中位置(a)492和580；(b)492和574；(c)492和550；(d)550和573；(e)550和574；(f)550和580对应位置的位置处包括改变。

19.根据前述权利要求中任一项所述的有缀合能力的多肽，其包括：

(i)包括第一白蛋白的N-端区，所述第一白蛋白是人白蛋白变体，其中第一白蛋白的N-端包括除C-端2-30氨基酸以外的人白蛋白变体的所有氨基酸；和

(ii)第二白蛋白或者其变体的C-端区，所述第二白蛋白选自猕猴白蛋白、小鼠白蛋白、兔白蛋白、绵羊白蛋白、人白蛋白、山羊白蛋白、黑猩猩白蛋白、仓鼠白蛋白、豚鼠白蛋白、大鼠白蛋白、牛白蛋白、马白蛋白、驴白蛋白、狗白蛋白、鸡白蛋白或猪白蛋白，其中第二白蛋白或白蛋白变体的C-端包括第二白蛋白或白蛋白变体的C-端2-30氨基酸；

其中所述多肽具有(i)与人白蛋白变体相比较而言改变的血浆半衰期和/或(ii)与人白蛋白变体相比较而言改变的FcRn结合亲和力。

20.根据前述权利要求中任一项所述的有缀合能力的多肽，其包括：成熟人白蛋白多肽序列SEQ ID NO.2的结构域I中的一个或多个(例如，若干个)改变；和成熟人白蛋白多肽序列SEQ ID NO.2的结构域III中的一个或多个(例如，若干个)改变，其中所述一个或多个(例如，若干个)改变导致所述多肽具有改变的FcRn结合亲和力。

21.根据权利要求20所述的有缀合能力的多肽，其中结构域I中的改变选自与SEQ IDNO.2的位置78-120中任一者对应的位置，例如，位置78-88中的任一者和/或位置105-120中的任一者；结构域III中的改变选自与SEQ ID NO.2的位置425、505、510、512、524、527、531、534、569、573、575中任一者对应的位置。

22.根据权利要求21所述的有缀合能力的多肽，其中与SEQ ID NO.2的位置78-120或425、505、510、512、524、527、531、534、569、573和/或575对应的位置处的改变是替换；并且改变任选地是选自以下的替换：(i)83N、K或S；(ii)111D、G、H、R、Q或E；或(iii)573P、Y、W、H、F、T、I或V。

23.根据前述权利要求中任一项所述的有缀合能力的多肽，其包括：在成熟人白蛋白多肽序列SEQ ID NO.2的结构域II中选自与SEQ ID NO.2中的位置349、342、381、345、384、198、206、340、341、343、344、352、382、348和/或383对应的位置的一个或多个(例如，若干个)改变；其中所述一个或多个(例如，若干个)改变导致所述有缀合能力的多肽具有(i)改变的血浆半衰期，和/或(ii)改变的FcRn结合亲和力。

24.根据权利要求23所述的有缀合能力的多肽，其中在与位置349、342、381、345、384、198、206、340、341、343、344、352、382、348和/或383对应的位置处的改变是替换；并且改变任选地是选自以下的替换：(i)349F、W、Y、H、P、K或Q，优选F；(ii)342Y、W、F、H、T、N、Q、A、C、I、L、P、V，优选Y；(iii)381G或A，优选G；或(iv)345E、H、I或Q。

25.根据前述权利要求中任一项所述的有缀合能力的多肽，其包括：在成熟人白蛋白多肽序列SEQ ID NO.2中选自与SEQ ID NO.2中的位置V418、T420、V424、E505、V547、K573对应的位置的一个或多个(例如，若干个)改变；其中所述一个或多个(例如，若干个)改变导致所述有缀合能力的多肽具有(i)改变的血浆半衰期，和/或(ii)改变的FcRn结合亲和力。

26.根据前述权利要求中任一项所述的有缀合能力的多肽，其包括：在成熟人白蛋白多肽序列SEQ ID NO.2中选自与SEQ ID NO.2中以下位置对应的位置的一个或多个(例如，若干个)改变：V381，优选V381N或Q；E383，优选E383A、G、I、L或V；N391，优选N391A、G、I、L或V；Y401，优选Y401D或E；K402，优选K402A、G、I、L或V；L407，优选L407F、N、Q、W或Y；Y411，优选Y411Q或N；K413，优选K413C、S或T；K414，优选K414S或T；V415C，优选V415C、S或T；Q416，优选Q416H或P；V424，优选V424A、G、I、L、N或Q；V426D，优选V426D、E、H或P；G434，优选G434C、S或T；E442，优选E442K或R；R445，优选R445F、W或Y；P447，优选P447S或T；E450，优选E450D或E；S454，优选S454C、M或T；V455，优选V455N或Q；V456，优选V456N或Q；L457，优选L457F、W或Y；Q459，优选Q459K或R；L463，优选L463N或Q；E495，优选E495D；T506，优选T506F、W或Y；T508，优选T508K、R或S；F509，优选F509C、I、L、M、V、W或Y；A511，优选A511F、W或Y；D512，优选D512F、W或Y；T515，优选T515C、H、N、P、Q或S；L516，优选L516F、S、T、W或Y；S517，优选S517C、F、M、T、W或Y；K519，优选K519A、G、I、L或V；R521，优选R521F、W或Y；I523，优选I523A、D、E、F、G、K、L、N、Q、R、V、W或Y；K524，优选K524A、G、I、L或V；K525，优选K525A、G、I、L或V；Q526，优选Q526C、M、S、T或Y；T527，优选T527F、W或Y；E531，优选E531A、G、I、L或V；H535，优选H535D、E或P；K538，优选K538F、W或Y；A539，优选A539I、L或V；K541，优选K541F、W或Y；K557，优选K557A、G、I、L或V；A561，优选A561F、W或Y；T566，优选T566F、W或Y；A569，优选A569H或P；其中所述一个或多个(例如，若干个)改变导致所述有缀合能力的多肽具有(i)改变的血浆半衰期，和/或(ii)改变的FcRn结合亲和力。

27.根据前述权利要求中任一项所述的有缀合能力的多肽，其包括：在成熟人白蛋白多肽序列SEQ ID NO.2中选自与SEQ ID NO.2中以下位置对应的位置的一个或多个(例如，若干个)改变：V547，优选V457A；K573，优选K573P或Y；I523，优选I523A或G；T527，优选T527M；K500，优选K500A；或E505，优选E505Q；其中所述一个或多个(例如，若干个)改变导致所述有缀合能力的多肽具有(i)改变的血浆半衰期，和/或(ii)改变的FcRn结合亲和力。

28.根据前述权利要求中任一项所述的有缀合能力的多肽，其包括：在成熟人白蛋白多肽序列SEQ ID NO.2中选自与SEQ ID NO.2中位置573、523、527或505对应的位置的一个或多个(例如，若干个)改变，优选K573Y；I523G；I523A；T527M；E505Q；或K573P。

29.根据权利要求28所述的有缀合能力的多肽，其包括：在成熟人白蛋白多肽序列SEQID NO.2中选自与以下位置对应的位置的一个或多个(例如，若干个)改变：K573Y和I523G；K573Y、I523G和T527M；K573Y、E505Q和T527M；K573Y和T527M；K573P和I523G；K573P、I523G和T527M；K573P、E505Q和T527M；K573P和T527M；V547A；V547A和K573P；V547A、E505Q、K573P和T527M；或者K500A和H510Q。

30.根据权利要求10-29中任一项所述的有缀合能力的多肽，其中所述有缀合能力的多肽在溶液中作为单体存在的倾向性是SEQ ID NO.2多肽在溶液中作为单体存在的倾向性的至少70％，任选为至少75％、至少80％、至少90％、至少95％或至少100％。

31.根据前述权利要求中任一项所述的有缀合能力的多肽，其中所述多肽与SEQ IDNO.2的序列同一性为至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、99.2％、99.4％、99.6％、99.8％。

32.根据前述权利要求中任一项所述的有缀合能力的多肽，其中当所述多肽折叠时，存在有至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16个、并优选所有17个SEQ ID NO.2多肽中的天然二硫键。

33.根据前述权利要求中任一项所述的有缀合能力的多肽，其中所述多肽还包括可以连接有生物活性化合物、放射性药物或显像剂的另外的连接部分。

34.根据前述权利要求中任一项所述的有缀合能力的多肽，其中提供有缀合能力的半胱氨酸残基的改变对所述多肽在人体内的免疫原性不产生不利影响。

35.一种融合多肽，其包括根据前述权利要求中任一项所述的有缀合能力的多肽和融合配偶体多肽。

36.一种多核苷酸，其编码根据权利要求1-35中任一项所述的多肽。

37.一种质粒，其包括根据权利要求36所述的多核苷酸。

38.一种宿主细胞，其包括根据权利要求36所述的多核苷酸和/或根据权利要求37所述的质粒。

39.根据权利要求38所述的宿主细胞，其为酵母细胞，特别是酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)细胞。

40.一种缀合物，其包括(i)生物活性化合物、放射性药物或显像剂和(ii)根据权利要求1-35中任一项所述的多肽，其中生物活性化合物、放射性药物或显像剂通过所述多肽的有缀合能力的半胱氨酸残基与所述多肽连接。

41.根据权利要求40所述的缀合物，其还包括一种或多种(例如，若干种)另外的生物活性化合物、放射性药物或显像剂，各生物活性化合物、放射性药物或显像剂均通过所述多肽的有缀合能力的半胱氨酸残基与所述多肽连接。

42.一种制造权利要求36所述的多核苷酸的方法，其包括：

提供编码亲本白蛋白或其片段的核酸分子；和

对所述核酸分子的核酸序列进行修饰，以编码与人白蛋白、特别是成熟人白蛋白多肽序列SEQ ID NO.2的残基1-585、或其片段的同一性为至少70％的有缀合能力的多肽，其中至少一个与选自SEQ ID NO.2的K93、A226、E230、I271、E294、E358、L24、F49、V54、D56、A92、Q94、E97、H128、F156、E227、D237、K240、D259、K262、N267、Q268、L275、L284、K317、A322、E333、D340、E354、K359、A362、E382、L398的位置相当的位置包括有缀合能力的半胱氨酸残基。

43.一种制造权利要求1-35中任一项所述的多肽的方法，其包括：

(a)在允许所述多肽表达的条件下培养根据权利要求38或39所述的宿主细胞；和

(b)从宿主细胞和/或宿主细胞生长培养基中回收多肽。

44.根据权利要求43所述的方法，其还包括对步骤(b)中得到的多肽进行提纯。

45.一种制造权利要求40或41所述的缀合物的方法，其包括将权利要求1-35中任一项所述的多肽或者通过权利要求43或44所述的方法制造的多肽经所述多肽的有缀合能力的半胱氨酸残基与生物活性化合物、放射性药物或显像剂连接。

46.一种缔合物，其包括权利要求40或41所述的缀合物和生物活性、治疗性、预防性、诊断性、显像性或其他的有益部分。

47.一种纳米颗粒或微颗粒或脂质体，其包括权利要求1-35中任一项所述的多肽、权利要求40或41所述的缀合物或者权利要求46所述的缔合物。

48.一种组合物，其包括权利要求40或41所述的缀合物、权利要求46所述的缔合物或者权利要求47所述的纳米颗粒或微颗粒或脂质体以及至少一种(例如，若干种)药学可接受的载体或稀释剂。

49.权利要求40或41所述的缀合物、权利要求46所述的缔合物、权利要求47所述的纳米颗粒或微颗粒或脂质体或者权利要求48所述的组合物，其中生物活性分子、放射性药物或显像剂选自：

(i)治疗性化合物，例如：4-1BB配体、5-螺旋、人C-C趋化因子、人L105趋化因子、命名为huL105_3的人L105趋化因子、γ-干扰素诱导的单核因子(MIG)、部分CXCR4B蛋白质、血小板碱性蛋白(PBP)、α1-抗胰蛋白酶、ACRP-30同源物、补体成分C1q C、腺样体表达的趋化因子(ADEC)、aFGF、FGF-1、AGF、AGF蛋白质、白蛋白、依托泊苷、血管抑素、炭疽疫苗、脑衰蛋白特异性抗体、antistasin、抗-TGFβ家族抗体、抗凝血酶III、APM-1、ACRP-30、Famoxin、载脂蛋白物种、芳基硫酸酯酶B、b57蛋白质、BCMA、β-血小板球蛋白蛋白质(β-TG)、bFGF、FGF2、凝血因子、BMP加工酶Furin、BMP-10、BMP-12、BMP-15、BMP-17、BMP-18、BMP-2B、BMP-4、BMP-5、BMP-6、BMP-9、骨形态发生蛋白-2、降钙素、钙蛋白酶-10a、钙蛋白酶-10b、钙蛋白酶-10c、癌症疫苗、羧肽酶、C-C趋化因子、MCP2、CCR5变体、CCR7、CCR7、CD11a Mab、CD137、4-1BB受体蛋白质、CD20Mab、CD27、CD27L、CD30、CD30配体、CD33免疫毒素、CD40、CD40L、CD52Mab、Cerebus蛋白质、嗜酸细胞活化趋化因子、趋化因子hIL-8、趋化因子hMCP1、趋化因子hMCP1a、趋化因子hMCP1b、趋化因子hMCP2、趋化因子hMCP3、趋化因子hSDF1b、趋化因子MCP-4、趋化因子TECK和TECK变体、成熟和全长的趋化因子样蛋白质IL-8M1、成熟和全长的趋化因子样蛋白质IL-8M10、趋化因子样蛋白质IL-8M3、成熟和全长的趋化因子样蛋白质IL-8M8、成熟和全长的趋化因子样蛋白质IL-8M9、成熟和全长的趋化因子样蛋白质PF4-414、成熟和全长的趋化因子样蛋白质PF4-426、成熟和全长的趋化因子样蛋白质PF4-M2、霍乱疫苗、软骨调节素样蛋白质、c-kit配体、SCF、肥大细胞生长因子、MGF、源自纤维肉瘤的干细胞因子、CNTF及其片段(例如CNTFAx15`(Axokine^TM)、前体和活性形式的凝血因子、胶原蛋白、补体C5Mab、结缔组织激活蛋白-III、CTAA16.88Mab、CTAP-III、CTLA4-Ig、CTLA-8、CXC3、CXC趋化因子受体3、蓝藻抗病毒蛋白-N、Darbepoetin，命名为exodus，命名为huL105_7、DIL-40、脱氧核糖核酸酶、EDAR、EGF受体Mab、ENA-78、内皮细胞抑制素(Endostatin)、嗜酸细胞活化趋化因子(Eotaxin)、上皮细胞中性粒细胞激活蛋白质-78、EPO受体、EPOR、红细胞生成素(EPO)和EPO模拟物、Eutropin、Exodus蛋白质、因子IX、因子VII、因子VIII、因子X和因子XIII、FAS配体抑制蛋白质(DcR3)、FasL、FGF、FGF-12、成纤维细胞生长因子同源因子-1、FGF-15、FGF-16、FGF-18、FGF-3、INT-2、FGF-4、白树毒素、HST-1、HBGF-4、FGF-5、FGF-6、肝素结合分泌转化因子-2、FGF-8、FGF-9、神经胶质激活因子、纤维蛋白原、flt-1、flt-3配体、促卵泡激素α亚基、促卵泡激素β亚基、促卵泡素、分形趋化因子(Fractalkine)、片段、肌原纤维蛋白质肌钙蛋白I、FSH、半乳糖苷酶、半乳凝素-4、G-CSF、GDF-1、基因治疗、源自神经胶质瘤的生长因子、胰高血糖素、胰高血糖素样肽、葡糖脑苷脂酶、葡糖氧化酶、葡糖苷酶、胎盘蛋白-A、黄体酮相关子宫内膜蛋白质、GM-CSF、促性腺激素、粒细胞趋化性蛋白质-2(GCP-2)、粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子、生长激素、生长相关致癌基因-α(GRO-α)、生长相关致癌基因-β(GRO-β)、生长相关致癌基因-γ(GRO-γ)、hAPO-4、TROY、hCG、乙型肝炎表面抗原、乙型肝炎疫苗、HER2受体Mab、水蛭素、HIV gp120、HIV gp41、HIV抑制剂肽、HIV抑制剂肽、HIV抑制剂肽、HIV蛋白酶抑制肽、HIV-1蛋白酶抑制剂、HPV疫苗、人6CKine蛋白质、人Act-2蛋白质、人脂肪形成抑制因子、人B细胞刺激因子-2受体、人β-趋化因子H1305(MCP-2)、人C-C趋化因子DGWCC、人CC趋化因子ELC蛋白质、人CC型趋化因子白介素C、人CCC3蛋白质、人CCF18趋化因子、命名为SLC的人CC-型趋化因子蛋白质(次级淋巴样趋化因子)、人趋化因子β-8短形式、人趋化因子C10、人趋化因子CC-2、人趋化因子CC-3、人趋化因子CCR-2、人趋化因子Ckβ-7、人趋化因子ENA-78、人嗜酸细胞活化趋化因子、人趋化因子GROα、人趋化因子GROα、人趋化因子GROβ、人趋化因子HCC-1、人趋化因子HCC-1、人趋化因子I-309、人趋化因子IP-10、人趋化因子L105_3、人趋化因子L105_7、人趋化因子MIG、人趋化因子MIG-β蛋白质、人趋化因子MIP-1α、人趋化因子MIP1β、人趋化因子MIP-3α、人趋化因子MIP-3β、人趋化因子PF4、人趋化因子蛋白质331D5、人趋化因子蛋白质61164、人趋化因子受体CXCR3、人趋化因子SDF1α、人趋化因子SDF1β、人趋化因子ZSIG-35、人Chr19Kine蛋白质、人CKβ-9、人CX3C 111氨基酸趋化因子、人DNAX白介素-40、人DVic-1C-C趋化因子、人EDIRF I蛋白质序列、人EDIRF II蛋白质序列、人嗜曙红细胞CC型嗜酸细胞活化趋化因子、人嗜酸性粒细胞表达的趋化因子(EEC)、人快速抽搐骨骼肌肌钙蛋白C、人快速抽搐骨骼肌肌钙蛋白I、人快速抽搐骨骼肌肌钙蛋白亚基C、人快速抽搐骨骼肌肌钙蛋白亚基I蛋白质、人快速抽搐骨骼肌肌钙蛋白亚基T、人快速抽搐骨骼肌肌钙蛋白T、人胎儿脾表达的趋化因子、FSEC、人GM-CSF受体、人gro-α趋化因子、人gro-β趋化因子、人gro-γ趋化因子、人IL-16蛋白质、人IL-1RD10蛋白质序列、人IL-1RD9、人IL-5受体α链、人IL-6受体、人IL-8受体蛋白质hIL8RA、人IL-8受体蛋白质hIL8RB、人IL-9受体蛋白质、人IL-9受体蛋白质变体#3、人IL-9受体蛋白质变体片段、人IL-9受体蛋白质变体片段#3、人白介素1δ、人白介素10、人白介素18、人白介素18衍生物、人白介素-1β前体、人白介素-1β前体、人白介素-1受体辅助蛋白、人白介素-1受体拮抗剂β、人白介素-1型-3受体、人白介素-10(前体)、人白介素-11受体、人白介素-12 40kD亚基、人白介素-12β-1受体、人白介素-12β-2受体、人白介素-12p35蛋白质、人白介素-12p40蛋白质、人白介素-12受体、人白介素-13α受体、人白介素-13β受体、人白介素-15、来自克隆P1的人白介素-15受体、人白介素-17受体、人白介素-18蛋白质(IL-18)、人白介素-3、人白介素-3受体、人白介素-3变体、人白介素-4受体、人白介素-5、人白介素-6、人白介素-7、人白介素-7、人白介素-8(IL-8)、人细胞内IL-1受体拮抗剂、人IP-10和HIV-1gp120高变区融合蛋白、人IP-10和人Muc-1核心表位(VNT)融合蛋白、人肝和激活调节的趋化因子(LARC)、人Lkn-1全长和成熟蛋白质、全长和成熟的人乳腺相关趋化因子(MACK)蛋白质、人成熟趋化因子Ckβ-7、人成熟gro-α、用于治疗败血症的人成熟gro-γ多肽、人MCP-3和人Muc-1核心表位(VNT)融合蛋白、人MI10蛋白质、人MI1A蛋白质、人单核细胞化学引诱物因子hMCP-1、人单核细胞化学引诱物因子hMCP-3、人单核细胞趋化性原蛋白(MCPP)序列、人神经趋化因子趋化因子样结构域、人非-ELR CXC趋化因子H174、人非-ELR CXC趋化因子IP10、人非-ELR CXC趋化因子Mig、人PAI-1突变体、具有IL-16活性的人蛋白质、具有IL-16活性的人蛋白质、人次级淋巴样趋化因子(SLC)、人SISD蛋白质、人STCP-1、源自人基质细胞的趋化因子、SDF-1、人T细胞混合淋巴细胞反应表达的趋化因子(TMEC)、人胸腺和激活调节的细胞因子(TARC)、人胸腺表达的人TNF-α、人TNF-β(LT-α)、人CC型嗜酸细胞活化趋化因子3蛋白质序列、人II型白介素-1受体、人野生型白介素-4(hIL-4)蛋白质、人ZCHEMO-8蛋白质、人源化抗-VEGF抗体及其片段、人源化抗-VEGF抗体及其片段、透明质酸酶、ICE 10kD亚基、ICE 20kD亚基、ICE 22kD亚基、艾杜糖醛酸-2-硫酸酯酶、艾杜糖醛酸酶、IL-1α、IL-1β、IL-1抑制剂(IL-1i)、成熟IL-1、IL-10受体、IL-11、IL-11、IL-12p40亚基、IL-13、IL-14、IL-15、IL-15受体、IL-17、IL-17受体、受体、IL-19、IL-1i片段、IL1-受体拮抗剂、IL-21(TIF)、含有IL-3的融合蛋白、IL-3突变蛋白质、IL-3变体、IL-4、IL-4突变蛋白质、IL-4突变蛋白质Y124G、IL-4突变蛋白质Y124X、IL-5、IL-5突变蛋白质、Il-5受体、IL-6、Il-6受体、IL-7受体克隆、IL-8受体、IL-9成熟蛋白质变体(Met117形式)、免疫球蛋白或基于免疫球蛋白的分子或任一者的片段(例如，小分子ImmunoPharmaceutical^TM(“SMIP”))或dAb、Fab’片段、F(ab’)2、scAb、scFv或scFv片段)，其包括但不限于纤溶酶原、流感疫苗、抑制素α、抑制素β、胰岛素、胰岛素样生长因子、整合素Mab、间-α胰蛋白酶抑制剂、间-α胰蛋白酶抑制剂、干扰素γ-诱导型蛋白质(IP-10)、干扰素(例如，干扰素α物种和亚物种、干扰素β物种和亚物种、干扰素γ物种和亚物种)、白介素6、白介素8(IL-8)受体、白介素8受体B、白介素-1α、白介素-2受体相关蛋白质p43、白介素-3、白介素-4突变蛋白质、白介素-8(IL-8)蛋白质、白介素-9、白介素-9(IL-9)成熟蛋白质(Thr117形式)、白介素(例如，IL10、IL11和IL2)、日本脑炎疫苗、激肽释放酶(Kalikrein)抑制剂、角质形成细胞生长因子、Kunitz结构域蛋白质(例如，抑肽酶、淀粉样前体蛋白质以及WO 03/066824中所述者，有或没有白蛋白融合物)、LACI、乳铁蛋白、潜在TGF-β结合蛋白质II、瘦素、肝表达的趋化因子-1(LVEC-1)、肝表达的趋化因子-2(LVEC-2)、LT-α、LT-β、黄体化激素、莱姆病疫苗、淋巴细胞趋化因子、源自巨噬细胞的趋化因子类似物MDC(n+1)、源自巨噬细胞的趋化因子类似物MDC-eyfy、源自巨噬细胞的趋化因子类似物MDC-yl、源自巨噬细胞的趋化因子(MDC)、Maspin、蛋白酶抑制剂5、MCP-1受体、MCP-1a、MCP-1b、MCP-3、MCP-4受体、M-CSF、黑色素瘤抑制蛋白质、膜结合蛋白质、Met117人白介素9、MIP-3α、MIP-3β、MIP-γ、MIRAP、修饰的Rantes、单克隆抗体、MP52、突变白介素6S176R、肌纤维收缩性蛋白质肌钙蛋白I、排钠利尿肽、神经生长因子-β、神经生长因子-β2、神经纤毛蛋白-1、神经纤毛蛋白-2、神经趋化因子、神经营养因子-3、神经营养因子-4、神经营养因子-4a、神经营养因子-4b、神经营养因子-4c、神经营养因子-4d、中性粒细胞激活肽-2(NAP-2)、NOGO-66受体、NOGO-A、NOGO-B、NOGO-C、命名为PTEC的新型β-趋化因子、N-端修饰的趋化因子GroHEK/hSDF-1α、N-端修饰的趋化因子GroHEK/hSDF-1β、N-端修饰的趋化因子met-hSDF-1α、N-端修饰的趋化因子met-hSDF-1β、OPGL、成骨蛋白质-1(OP-1)、BMP-7、成骨蛋白质-2、OX40、ACT-4、OX40L、催产素(后叶激素运载蛋白I)、甲状旁腺激素、Patched、Patched-2、PDGF-D、百日咳类毒素(Pertussis toxoid)、垂体表达的趋化因子(PGEC)、胎盘生长因子、胎盘生长因子-2、纤溶酶原激活剂抑制剂-1(PAI-1)、纤溶酶原激活剂抑制剂-2(PAI-2)、源自血小板的生长因子、源自血小板的生长因子Bv-sis、源自血小板的生长因子前体A、源自血小板的生长因子前体B、血小板Mab、源自血小板的内皮细胞生长因子(PD-ECGF)、源自血小板的生长因子A链、源自血小板的生长因子B链、用于治疗败血症的多肽、Preproapolipoprotein“milano”变体、Preproapolipoprotein“paris”变体、前凝血酶(pre-thrombin)、灵长类CC趋化因子“ILINCK”、灵长类CXC趋化因子“IBICK”、胰岛素原、催乳素、催乳素2、神经营养肽(prosaptide)、蛋白酶抑制剂肽、蛋白质C、蛋白质S、凝血酶原、尿激酶原、RANTES、RANTES8-68、RANTES 9-68、RANTES肽、RANTES受体、重组白介素-16、抵抗素、局限曲菌素(restrictocin)、逆转录病毒蛋白酶抑制剂、蓖麻毒素、轮状病毒疫苗、RSV Mab、皂草毒蛋白、八叠球菌(sarcin)、分泌的跨膜多肽、血清胆碱酯酶、血清蛋白质(例如凝血因子)、可溶性BMP受体激酶蛋白质-3、可溶性VEGF受体、干细胞抑制因子、葡萄球菌疫苗、源自基质的因子-1α、源自基质的因子-1β、物质P(速激肽)、T1249肽、T20肽、T4核酸内切酶、TACI、Tarc、TGF-β1、TGF-β2、Thr117人白介素9、凝血酶、促血小板生成素、促血小板生成素衍生物1、促血小板生成素衍生物2、促血小板生成素衍生物3、促血小板生成素衍生物4、促血小板生成素衍生物5、促血小板生成素衍生物6、促血小板生成素衍生物7、胸腺表达的趋化因子(TECK)、促甲状腺激素、蜱抗凝血肽、Tim-1蛋白质、TNF-α前体、TNF-R、TNF-RII、TNF p75受体、死亡受体、组织纤溶酶原激活物(tPA)、转铁蛋白、转化生长因子β、肌钙蛋白肽、截短的单核细胞趋化性蛋白质2(6-76)、截短的RANTES蛋白质(3-68)、肿瘤坏死因子、尿酸氧化酶、尿激酶、加压素(后叶激素运载蛋白II)、VEGF R-3、flt-4、VEGF受体、KDR、flk-1、VEGF-110、VEGF-121、VEGF-138、VEGF-145、VEGF-162、VEGF-165、VEGF-182、VEGF-189、VEGF-206、VEGF-D、VEGF-E、VEGF-X、血管性血友病因子(von Willebrand’s factor)、野生型单核细胞趋化性蛋白质2、ZTGF-β9；

(ii)化疗药物，例如：13-顺式-视黄酸、2-CdA、2-氯脱氧腺苷、5-阿扎胞苷(5-Azacitidine)、5-氟脲嘧啶、5-FU、6-巯基嘌呤、6-MP、6-TG、6-硫鸟嘌呤、白蛋白结合型紫杉醇(Abraxane)、放线菌素-D、阿地白介素(Aldesleukin)、阿仑单抗(Alemtuzumab)、ALIMTA、Alitretinoin、Alkaban-全反式视黄酸、α干扰素、六甲蜜胺(Altretamine)、氨甲喋呤(Amethopterin)、氨磷汀(Amifostine)、氨鲁米特(Aminoglutethimide)、阿那格雷(Anagrelide)、阿那曲唑(Anastrozole)、阿糖胞嘧啶(Arabinosylcytosine)、Ara-C、三氧化二砷、天冬酰胺酶、ATRA、阿扎胞苷、BCG、BCNU、贝伐单抗(Bevacizumab)、蓓萨罗丁(Bexarotene)、比卡鲁胺(Bicalutamide)、BiCNU、争光霉素(Bleomycin)、硼替佐米(Bortezomib)、白消安(Busulfan)、C225、甲酰四氢叶酸钙、喜树碱-11、卡培他滨(Capecitabine)、Carac^TM、卡铂(Carboplatin)、卡莫司汀(Carmustine)、卡莫司汀晶片、CC-5013、CCNU、CDDP、CeeNU、西妥昔单抗(Cetuximab)、苯丁酸氮芥(Chlorambucil)、顺铂、嗜橙菌因子、克拉屈滨(Cladribine)、可的松(Cortisone)、CPT-11、环磷酰胺、阿糖胞苷(Cytarabine)、阿糖胞苷脂质体、达卡巴嗪(Dacarbazine)、达克金(Dacogen)、放线菌素(Dactinomycin)、达依泊汀α(DarbepoetinAlfa)、达沙替尼(Dasatinib)、正定霉素(Daunomycin)、柔红霉素(Daunorubicin)、柔红霉素盐酸盐、柔红霉素脂质体、地塞米松(Decadron)、地西他滨(Decitabine)、Delta-地尼白介素(Denileukin diftitox)、DepoCyt^TM、地塞米松(Dexamethasone)、地塞米松醋酸盐、地塞米松磷酸钠、Dexasone、右雷佐生(Dexrazoxane)、DHAD、DIC、Diodex、多烯紫杉醇(Docetaxel)、阿霉素(Doxorubicin)、阿霉素脂质体、Droxia^TM、DTIC、DTIC- Eligard^TM、Ellence^TM、Eloxatin^TM、表阿霉素(Epirubicin)、阿法依泊汀(Epoetin alfa)、Erbitux^TM、厄洛替尼(Erlotinib)、欧文氏菌L-天冬酰胺酶(Erwinia L-asparaginase)、雌氮芥(Estramustine)、氨磷汀(Ethyol)、依托泊苷(Etoposide)、依托泊苷磷酸盐、依西美坦(Exemestane)、非格司亭(Filgrastim)、氟尿苷(Floxuridine)、氟达拉滨(Fludarabine)、氟尿嘧啶(Fluorouracil)、氟甲睾酮(Fluoxymesterone)、氟他胺(Flutamide)、亚叶酸、氟维司群(Fulvestrant)、G-CSF、吉非替尼(Gefitinib)、吉西他滨(Gemcitabine)、吉妥珠单抗奥佐米星(Gemtuzumabozogamicin)、Gleevec^TM、晶片、GM-CSF、戈舍瑞林(Goserelin)、粒细胞-集落刺激因子、粒细胞巨噬细胞集落刺激因子、Hexadrol、六甲蜜胺、HMM、Hydrocort 氢化可的松、氢化可的松磷酸钠、氢化可的松琥珀酸钠、磷酸氢可酮(Hydrocortone Phosphate)、羟基脲、替依莫单抗(Ibritumomab)、泽娃灵(Ibritumomab Tiuxetan)、伊达比星(Idarubicin)、IFN-α、异环磷酰胺、IL-11、IL-2、甲磺酸伊马替尼、咪唑甲酰胺(Imidazole Carboxamide)、干扰素α、干扰素α-2b(PEG缀合物)、干扰素-2、干扰素-11、Intron (干扰素α-2b)、伊力替康(Irinotecan)、异维甲酸、拉帕替尼(Lapatinib)、L-天冬酰胺酶、LCR、来那度胺(Lenalidomide)、来曲唑(Letrozole)、甲酰四氢叶酸(Leucovorin)、苯丁酸氮芥(Leukeran)、Leukine^TM、亮丙瑞林(Leuprolide)、长春新碱(Leurocristine)、Leustatin^TM、脂质体Ara-C、液体洛莫司汀(Lomustine)、L-PAM、L-Sarcolysin、LupronMaxidex、二氯甲基二乙胺(Mechlorethamine)、二氯甲基二乙胺盐酸盐、甲地孕酮(Megestrol)、甲地孕酮醋酸盐、美法仑(Melphalan)、巯嘌呤(Mercaptopurine)、美司钠(Mesna)、Mesnex^TM、氨甲喋呤(Methotrexate)、氨甲喋呤钠、甲基强的松龙(Methylprednisolone)、丝裂霉素、丝裂霉素-C、米托蒽醌(Mitoxantrone)、M-MTC、MTX、氮芥(Mustine)、 Mylocel^TM、奈拉滨(Nelarabine)、Neulasta^TM、尼鲁米特(Nilutamide)、氮芥(Nitrogen Mustard)、奥曲肽(Octreotide)、奥曲肽醋酸盐、 Onxal^TM、Oprevelkin、奥沙利铂(Oxaliplatin)、紫杉醇(Paclitaxel)、蛋白质结合的紫杉醇、帕米磷酸二钠(Pamidronate)、帕尼单抗(Panitumumab)、 PEG干扰素、培门冬酶(Pegaspargase)、培非格司亭(Pegfilgrastim)、PEG-INTRON^TM、PEG-L-天冬酰胺酶、PEMETREXED、喷司他丁(Pentostatin)、苯丙氨酸氮芥(Phenylalanine Mustard)、Platinol-Prednisolone、Prednisone、丙卡巴肼(Procarbazine)、具有卡莫司汀植入物的Prolifeprospan 20、雷洛昔芬(Raloxifene)、利妥昔单抗(Rituximab)、Roferon-(干扰素α-2a)、红比霉素盐酸盐(Rubidomycin hydrochloride)、Sandostatin沙格司亭(Sargramostim)、Solu-Solu-索拉非尼(Sorafenib)、SPRYCEL^TM、STI-571、链脲菌素(Streptozocin)、SU11248、舒尼替尼(Sunitinib)、他莫昔芬(Tamoxifen)、替莫唑胺(Temozolomide)、替尼泊苷(Teniposide)、TESPA、沙利度胺(Thalidomide)、硫鸟嘌呤、Thioguanine Thiophosphoamide、噻替派(Thiotepa)、拓扑替康(Topotecan)、托瑞米芬(Toremifene)、托莫西单抗(Tositumomab)、曲妥单抗(Trastuzumab)、Tretinoin、Trexall^TM、TSPA、VCR、Vectibix^TM、 Viadur^TM、长春花碱(Vinblastine)、长春花碱硫酸盐、Vincasar长春新碱(Vincristine)、长春瑞滨(Vinorelbine)、长春瑞滨酒石酸盐、VLB、VM-26、伏立诺他(Vorinostat)、VP-16、Zevalin^TM、唑来膦酸(Zoledronic acid)、Zolinza、

(iii)放射性药物，例如：碳-11、碳-14、铬-51、钴-57、钴-58、铒-169、氟-18、镓-67、金-198、铟-111、铟-113m、碘-123、碘-125、碘-131、铁-59、氪-81m、氮-13、氧-15、磷-32、铼-186、铷-82、钐-153、硒-75、锶-89、锝-99m、铊-201、氚、氙-127、氙-133、钇-90；和

(iv)显像剂，例如：钆、磁铁矿、锰、锝、I125、I131、P32、TI201、碘帕醇、PET-FDG。

50.根据权利要求40、41或49所述的缀合物或者根据权利要求46所述的缔合物或者根据权利要求47所述的纳米颗粒或微颗粒或脂质体，其用于治疗疾病、治疗病患和/或用于诊断。

51.根据权利要求1-35中任一项所述的多肽用于增加例如生物活性药剂、显像剂、诊断剂、造影剂或治疗化合物的分子的半衰期的用途。