CN114984053B - 一种用于治疗脊髓损伤的组合物及其制备方法和用途 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种用于治疗脊髓损伤的组合物及其制备方法和用途。该组合物包含诱导神经干细胞、纤维蛋白、凝血酶，特别适用于完全损伤和全横断的严重脊髓损伤。本发明的组合物便于移植操作，移植细胞损失少，并且其中诱导神经干细胞的分化潜能高，无致瘤性，分化比例高，来源广泛且安全性好。

Description

一种用于治疗脊髓损伤的组合物及其制备方法和用途
技术领域
本发明涉及干细胞领域，具体涉及一种用于治疗脊髓损伤的组合物及其制备方法和用途。
背景技术
脊髓损伤(Spinal cord injury，SCI)是主要由交通事故、高空坠落、重物砸伤等外伤等因素所致的脊髓神经损伤，其导致上行性和下行性神经通路的阻断，并导致严重的功能障碍。脊髓损伤不仅病死率高，致残率也高，给脊髓损伤患者的生活带来极大不便。目前还没有有效的临床治疗方法可治愈脊髓损伤。
按照损伤程度的不同，脊髓损伤可分为完全损伤和不完全损伤。相对应地，研究脊髓损伤的动物模型也相应有脊髓全横断损伤、脊髓半切损伤等类型，其中脊髓的全横断损伤彻底切断了脊髓相应节段头尾端的连接，为损伤程度最高的损伤，其治疗难度最高；而脊髓半切损伤为切除一半脊髓但还有另一半相对完整脊髓的模型，其损伤程度相对较低，由于存在代偿作用，该损伤类型对机体行为影响程度和治疗难度都相对较低。
脊髓损伤后缺血缺氧，使溶酶体内容物过度释放及钙离子依赖的消化酶激活，导致脊髓神经元细胞进一步坏死，可在较短时间甚至数小时内使轴突发生变性、坏死；神经元细胞坏死后各种炎症因子的渗入、自噬启动等均会使细胞微环境发生改变。
为治疗脊髓损伤，研究领域已试验了不同的治疗策略，包括生物材料移植、生长因子和细胞疗法等。其中生物材料移植疗法随着组织工程技术的发展而出现，其修复受损脊髓的机制主要是该材料作为桥梁填补脊髓神经细胞液化坏死后形成的空腔，使断端连接起来，并帮助神经再生时沿着材料生长而避免无序生长。同时，生物材料作为载体也可负载有益于神经生长的物质，例如干细胞、神经营养因子、刺激再生的药物等。生物材料主要包括天然组织材料、人工合成材料、水凝胶等。其中天然组织材料的组织相容性好、降解产物无炎症反应，但存在机械强度小、吸水后易坍塌的问题；人工合成材料的机械强度和降解速率可控，但其降解产物产生局部炎症反应，对细胞亲和力较弱；水凝胶是脊髓损伤修复领域的研究热点，具有三维多孔网状结构，在吸水后膨胀较高，可为神经干细胞分化、再生、繁殖提供微环境，使环境类似细胞外基质，使细胞更好地黏附并生长；同时具有较好的组织相容性，并可控制降解率；可单独应用或作为载体，载入细胞、药物、神经生长因子等(赵兴昌等，生物材料支架在治疗脊髓损伤中的应用，中国组织工程研究，第26卷第28期，第4562-4568页)。
纤维蛋白原(fibrinogen)是由肝细胞合成和分泌的一种水溶性蛋白，其在凝血酶(thrombin)的催化作用下可形成不溶性的具有网状结构的纤维蛋白(fibrin)。已有研究者使用纤维蛋白和凝血酶的组合作为治疗脊髓损伤的生物材料。Rosenzweig等将纤维蛋白-凝血酶负载的人神经祖细胞(neural progenitor cells,NPCs)移植到恒河猴模型的颈脊髓损伤位点时，会成熟为神经元，延长轴突，并与宿主细胞形成突触(E.S.Rosenzweig等，Restorative effects of human neural stem cell grafts on the primate spinalcord,Nat Med 24(4)(2018)484-490)。然而，该方法也存在明显缺陷：首先，从所用细胞的角度来说，Rosenzweig等报导的方法使用的细胞系为来源于8周龄胎儿的下颈椎和上胸椎脊髓的566RSC-UBQT细胞系，存在伦理限制，来源受限且价格昂贵，而且由于所使用的神经祖细胞为彻底分化前的中间细胞，其分化潜能相对较低(分化为神经元比例为50％左右)，并且分裂次数有限；其次，从制备方法的角度来说，Rosenzweig等报导的制备方法为将NPCs和纤维蛋白原混合为溶液1，并稀释凝血酶为溶液2，然后分别吸取等量体积的溶液1和溶液2，在损伤区内同时注入两种溶液，30秒内会聚集成凝胶状；这种操作方法也是类似研究中普遍采用的方法，但该报导的方法可能会由于操作问题造成交联不均匀和细胞分布不均匀，此外，如果交联不够迅速容易导致细胞会由于血流、脑脊液等冲刷或溢出而造成细胞的部分损失，尤其是在反映脊髓损伤为完全损伤的全横断模型中更是如此。
另外，现有研究也显示在SCI动物模型中仅移植细胞移植物也显示出部分有益效果：神经干细胞(NSCs)在移植到NOD-scid小鼠体内时会分化成神经元并促进SCI后的功能恢复(Y.Liu等，Human neural progenitors derived from integration-free iPSCs forSCI therapy,Stem Cell Res 19(2017)55-64)。移植少突胶质前体细胞(OPC)能够改善大鼠挫伤性脊髓损伤后运动功能的恢复(J.Yang等，Oligodendrocyte precursor celltransplantation promotes functional recovery following contusive spinal cordinjury in rats and is associated with altered microRNA expression,Mol Med Rep17(1)(2018)771-782)。然而，仅移植细胞移植物更适用于脊髓损伤类型为不完全损伤的半切损伤模型，且要求损伤对脊髓造成的空洞较小；对于空洞较大的损伤位点，特别是反映完全损伤的全横断模型，仅移植细胞移植物会导致血流等液体将移植物冲散，移植细胞的损失较多，不利于细胞的固定和有序生长。
发明内容
为了解决现有技术中存在的上述问题，提供了本发明的技术方案。
根据本发明的第一方面，本发明第一个目的在于提供一种组合物，包含诱导神经干细胞(induced neural stem cell，iNSC)、纤维蛋白、凝血酶。
根据本发明的一个实施方式，所述诱导神经干细胞为人诱导神经干细胞；更优选地，所述诱导神经干细胞为由人外周血单个核细胞(Peripheral Blood MononuclearCell，PBMC)重编程而获得的人诱导神经干细胞。
根据本发明的一个实施方式，所述组合物为一种用于治疗脊髓损伤的组合物。
根据本发明的一个实施方式，所述组合物用于治疗脊髓损伤，或者用于制备治疗脊髓损伤的医疗用品，或者用于改善脊髓损伤位点的微环境。所述医疗用品可以为药物或医疗器械。
根据本发明的一个实施方式，本发明所述的脊髓损伤为完全损伤和/或不完全损伤。优选地，本发明所述的脊髓损伤为完全损伤。
根据本发明的一个实施方式，所述组合物中诱导神经干细胞的含量为2×106个/mL以上，优选为5×106至5×107个/mL，最优选为约2×107个/mL。我们发现，如果移植的细胞浓度过低，例如低于2×106个/mL，如1×106个/mL或者1×105个/mL时，细胞很少存活，甚至在损伤5天前就检测不到细胞，这样无法起到在损伤早期改善微环境的作用。
根据本发明的第二方面，本发明的第二个目的在于提供本发明所述的组合物的制备方法，包括如下步骤：(1)将纤维蛋白原溶于第一溶液，形成纤维蛋白原溶液；(2)将凝血酶溶于第二溶液，形成凝血酶溶液；(3)将神经干细胞重悬浮于所述凝血酶溶液，形成神经干细胞重悬浮液；(4)将所述纤维蛋白原溶液加入所述神经干细胞重悬浮液，形成含有神经干细胞、纤维蛋白、凝血酶的凝胶状组合物。本发明所述的组合物的制备方法，也可以包括如下步骤：(1)将纤维蛋白原溶于第一溶液，形成纤维蛋白原溶液；(2)将凝血酶溶于第二溶液，形成凝血酶溶液；(3)将神经干细胞重悬浮于所述纤维蛋白原溶液，形成神经干细胞重悬浮液；(4)将所述凝血酶溶液加入所述神经干细胞重悬浮液，形成含有神经干细胞、纤维蛋白、凝血酶的凝胶状组合物。其中，所述第一溶液为盐溶液，第二溶液为蛋白溶液。
根据本发明的一个实施方式，本发明的组合物的制备方法中，所述第一溶液为能够溶解纤维蛋白原且生物相容性良好的溶液，例如为CaCl2、MgCl2、NaCl、KCl等水溶液，其中优选为CaCl2的水溶液，其中CaCl2的浓度为5-40mM，优选为10-30mM，最优选为20mM，或者优选为NaCl的水溶液，其中NaCl的浓度为0.9％(即生理盐水)；所述纤维蛋白原溶液的浓度为10-200mg/mL，优选为50-100mg/mL。
所述第二溶液可以为能够溶解凝血酶且生物相容性良好的任何溶液，例如为牛血清白蛋白(BSA)溶液或生理盐水溶液，其中优选为BSA溶液，其中BSA的浓度为0.1-10mg/mL，优选为0.5-5mg/mL，最优选为1mg/mL；所述凝血酶溶液的浓度为10-200U/mL，优选为50-100U/mL。在本发明中，BSA的溶液浓度也可以用％来表示，1％的BSA溶液的配制方法为取1gBSA加入蒸馏水，定容至100mL即得，即1％的BSA溶液的浓度为10mg/mL；对于其他浓度的BSA溶液，可按比例调整加入的BSA的量或者使用1％溶液稀释即可得到。
根据本发明的一个实施方式，所述神经干细胞在使用前在增殖培养基中培养，所述增殖培养基例如为包括DMEM/F12(Gibco)、Neurobasal A(Gibco)、N2(Gibco)、B27(Gibco)、GlutaMAX(Gibco)、NEAA(Gibco)、CHIR99021(3μM)、SB431542(2μM)、LIF(10ng/ml)的培养基。
根据本发明的第三方面，本发明的第三个目的为提供一种用于治疗脊髓损伤的医疗用品，其中所述医疗用品为药品或医疗器械，且包含根据本发明的组合物或根据本发明的制备方法获得的组合物。所述医疗器械可以例如为生物材料支架、凝胶、或者用于3D打印的生物墨水等。
根据本发明的第四方面，本发明的第四个目的在于提供本发明的组合物在制备用于治疗脊髓损伤的医疗用品中的用途，其中医疗用品为药品或医疗器械且包含本发明的组合物或根据本发明的制备方法获得的组合物。所述医疗器械可以例如为生物材料支架、凝胶、或者用于3D打印的生物墨水等。
根据本发明的一个实施方式，所述治疗脊髓损伤包括促进脊髓损伤后的功能恢复、减小脊髓损伤导致的损伤体积、促进损伤核心位点的Tuj1和NF200的表达、或者改善脊髓损伤位点微环境。
本发明的组合物适用于完全损伤和/或不完全损伤的脊髓损伤，其中特别适用于完全损伤的脊髓损伤。另外，本发明的组合物适用于脊髓的全横断损伤和/或半切损伤，其中特别适用于脊髓的全横断损伤。
本发明所用的诱导神经干细胞可以使用以任何现有技术获得的诱导神经干细胞，其中优选为以人外周血单个核细胞为起始细胞而制备的人诱导神经干细胞。其中，可以采用现有技术中由人外周血单个核细胞诱导产生人诱导神经干细胞的任何方法，例如采用发明人在中国专利201810372724.7中公开的诱导方法。
本发明所用的术语“脊髓损伤”是指由于外伤、炎症、肿瘤等原因引起脊髓损害而导致损伤平面以下运动、感觉、括约肌、自主神经等功能障碍的疾病。
本发明中所用的术语“完全损伤”也称为完全性脊髓损伤(complete spinal cordinjury)，是指损伤平面以下的运动、感觉、括约肌功能完全丧失的一类脊髓损伤，提示脊髓损伤平面发生了完全性横断性损害。
本发明中所用的术语“不完全损伤”也称为不完全性脊髓损伤(incompletespinal cord injury)，是指损伤平面以下保留部分感觉或运动功能的一类脊髓损伤，提示脊髓损伤平面未发生完全性横断性损害。
本发明中所用的术语“全横断损伤”是指脊髓被完全横断的脊髓损伤类型。
本发明中所用的术语“半切损伤”是指脊髓未被完全横断、仅有半横断损伤或部分缺损的脊髓损伤类型。
本发明提供了一种用于治疗脊髓损伤的神经干细胞组合物、该组合物的制备方法、以及该组合物的用途。相对于现有的类似技术，本发明的方案具有以下良好的技术效果：
1.本发明采用的细胞为诱导神经干细胞，相对于现有技术中使用的神经祖细胞或神经前体细胞，神经干细胞的分化潜能高，可分化为脊髓损伤修复所需的多种细胞，例如可分化为脊髓特异的甚至不同脊髓节段特异的神经；可以约70％的高比例向神经元分化(神经祖细胞的神经元分化比例仅有约50％，而神经元的补充对于治疗脊髓损伤是最困难也是最关键的)，且神经干细胞的分裂次数远高于神经祖细胞或神经前体细胞，同样也有利于脊髓损伤的治疗。
2.本发明采用的神经干细胞为由人外周血单个核细胞制备的人诱导神经干细胞，相对于现有的神经干细胞，具有来源容易且丰富的特点，经试验无致瘤性(已验证将iNSC或iNSC衍生的多巴胺能前体体内移植到免疫缺陷小鼠的大脑中不会导致肿瘤形成)，安全性高，传代不同次数之后仍具有稳定性，制备技术相对简单且周期短、成本低，这对于体内移植及临床应用具有极大优势；而且，由于可采用患者自身的外周血单个核细胞制备诱导神经干细胞，可避免产生异体免疫排斥的问题。而现有技术中用于脊髓损伤的生物材料负载的神经祖细胞的来源为8周龄胎儿，有伦理限制，来源受限且价格昂贵。
3.本发明方案适用的脊髓损伤类型更全面，特别适用于损伤程度严重的脊髓损伤，例如完全损伤或全横断损伤，当然对于损伤程度较轻的不完全损伤或半切损伤也同样适用。另外，与现有技术中采用的在脊髓损伤位点混合生物材料的手段不同，本发明预先将组合物制备为柔软的凝胶状固体，移植时便于夹持操作，其中细胞分布均匀，不会发生血流冲散细胞的现象，移植细胞的损失少且不会无序生长，更有利于损伤位点的脊髓再生。
附图说明
附图用来提供对本申请技术方案的进一步理解，并且构成说明书的一部分，与本申请的实施例一起用于解释本申请的技术方案，但并不构成对本申请技术方案的限制。其中，“SCI对照组”指施用安慰剂(vehicle)的SCI大鼠；“单独生物材料组”指仅施用生物材料(即纤维蛋白和凝血酶)的SCI大鼠；“iNSCs+生物材料组”指施用iNSC和生物材料(即纤维蛋白和凝血酶)的SCI大鼠；“正常组”指未经受SCI的大鼠。“dpi”指受伤后天数(days postinjury)，即脊髓损伤造模后的天数，由于脊髓损伤后立即进行移植物的移植，因此dpi也表示移植后天数。
图1显示iNSC在移植后5天的存活状况。A：实验过程的示意图；B：建立脊髓全横断损伤模型的操作过程图；C：移植后5天的iNSC在脊髓损伤处向外侧迁移的示意图，iNSC用圆点表示，生物材料使用网格线条表示；D：在移植后5天时移植的iNSC在损伤位点及周围表达的人核抗原(human nuclear antigen，Hu)情况，DAPI(蓝色)代表宿主和移植物的细胞核，Hu(绿色)代表移植的人类iNSC的细胞核；E：在移植后5天时移植的iNSC在损伤中心共表达Hu和Sox2(一种NSC的标志物)；星号表示生物材料；蓝色为DAPI，绿色为Hu，红色为GFAP，白色为Sox2；F：移植后第5天(5dpi)处死的SCI动物的整体脊髓切面上的人类纤维蛋白原/纤维蛋白的染色图，蓝色为DAPI，绿色为纤维蛋白原，红色为GFAP。D、E和F图的比例尺均为100μm。
图2显示移植iNSC和生物材料可促进SCI大鼠在移植后7个月的电生理恢复和运动改善。A：各组从SCI(第0天)开始直到SCI后7个月的BBB分数，由双盲独立观察者确定(与单独生物材料移植组相比，△表示p≤0.05，△△表示p≤0.01，双因素方差分析)；B：MEP(运动诱发电位)的潜伏期和幅度(与SCI对照组相比，*表示p≤0.05，**表示p≤0.01，单因素方差分析)；C：在不同治疗组和对照组的左右腿中记录MEP。
图3显示移植iNSC和生物材料与SCI对照组或仅移植生物材料相比，移植后7个月的损伤体积减少。A：每组脊髓的代表性图像，方框内表示损伤位点；B：损伤体积分析；C：各组脊髓组织的H&E(苏木精-伊红)染色，左图显示了整个脊髓切片的水平切面的低倍放大图，右图表示左图中黑色方框内的高倍放大图；D：各组脊髓组织的LFB(luxol fast blue)染色，左图显示了整个脊髓切片的水平切面的低倍放大图，右图表示左图中黑色方框内的高倍放大图。
图4显示不同时间点损伤中心的纤维蛋白降解及整个脊髓切片Tuj1和NF200染色。A：SCI后不同时间点的纤维蛋白原染色，SCI后第30天至第7个月检测到少量纤维蛋白，蓝色为DAPI，绿色为人纤维蛋白原(human fibrinogen)，红色为GFAP；B：SCI后7个月的Tuj1(神经元III类β-微管蛋白)和GFAP染色，在iNSC+生物材料移植组的损伤位点检测到更高程度的Tuj1表达，蓝色为DAPI，绿色为Tuj1，红色为GFAP；C.SCI后7个月的NF200(neurofilament-200)和GFAP染色，在iNSC+生物材料移植组的损伤位点检测到更高程度的NF200表达，蓝色为DAPI，绿色为NF200，红色为GFAP；D：通过抗纤维蛋白原抗体识别纤维蛋白，通过在体外不同时间与凝血酶混合将纤维蛋白原转化为纤维蛋白，并用抗纤维蛋白原抗体对混合物进行染色，结果显示在5分钟、30分钟和1小时的染色信号相对稳定，表明抗纤维蛋白原抗体可以识别纤维蛋白原和纤维蛋白，绿色表示人纤维蛋白原，上图为免疫荧光图像，下图为白光图像。A图比例尺为100μm，B和C图比例尺为2000μm，D图比例尺为250μm。
图5显示SCI后7个月，SCI对照组、单独生物材料移植组、iNSC+生物材料移植组的损伤核心和损伤边界周围的Tuj1和NF200表达。A：各组Tuj1在损伤核心和损伤边界周围的表达，蓝色为DAPI，绿色为Tuj1，红色为GFAP；B：各组损伤核心和损伤边界周围Tuj1+细胞的比例。C：各组NF200在损伤核心和损伤边界周围的表达，蓝色为DAPI，绿色为Tuj1，红色为GFAP，白色为NF200；D：各组损伤核心和损伤边界周围Tuj1+/NF200+细胞的比例。E：损伤位点的突触染色，在iNSC+生物材料移植组的损伤核心处检测到具有突触连接的神经元，蓝色为DAPI，绿色为Synapsin，红色为MAP2，指示成熟神经元，左图为低倍率图像，右图为左图中框线中的放大图像。A、C、E(左)图的比例尺为100μm，E(右)图的比例尺为25μm。*表示p≤0.05，**表示p≤0.01(单因素方差分析)。
图6显示SCI对照组、单独生物材料移植组、iNSC+生物材料移植组中的BDNF、TGFβ和TNFα表达。A：各组15dpi的BDNF(脑源性神经营养因子)、TGFβ(转化生长因子-β)和TNFα(肿瘤坏死因子-α)染色，iNSC+生物材料移植组在损伤位点显示出较高水平的TGFβ和较低水平的TNFα表达，蓝色为DAPI，绿色分别为BDNF、TGFβ、TNFα，红色为GFAP；B：15dpi时各组BDNF、TGFβ、和TNFα阳性细胞的比例。A图的比例尺为100μm。*表示p≤0.05，**表示p≤0.01(单因素方差分析)。
图7显示iNSC+生物材料移植组显示SCI后炎症反应减少。A：各组的CD206表达模式，蓝色为DAPI，绿色为CD206，红色为GFAP；B：各组在15dpi时的CD45和CD68表达模式，蓝色为DAPI，绿色分别为CD45、CD68，红色为GFAP；C：各组不同时间点CD206阳性细胞的比例，*，p≤0.05，**，p≤0.01(双因素方差分析)；D：各组不同时间点CD45和CD68阳性细胞的比例，*，p≤0.05，**，p≤0.01(单因素方差分析)。A图和B图的比例尺均为100μm。
图8显示iNSC+生物材料移植组在SCI后7个月不会改变瘢痕组织的类型。A：GFAP/层粘连蛋白的全切片染色，白色方框区域表示损伤区域；B：A图中白色方框区域的放大图，蓝色为DAPI，绿色为层粘连蛋白，红色为GFAP。A和B图的比例尺为2000μm。
具体实施方式
下面将参照附图来详细描述本发明的各种示例性实施例。对示例性实施例的描述仅仅是说明性的，并不作为对本发明及其应用或使用的任何限制。本发明可以以许多不同的形式实现，不限于这里所述的实施例。提供这些实施例是为了使本发明透彻且完整，并且向本领域技术人员充分表达本发明的范围。应注意到：除非另外具体说明，否则在这些实施例中描述的技术手段应被解释为仅是示例性的，而非限制性的。
实施例1人诱导神经干细胞的培养和制备
本发明所用的人诱导神经干细胞可以是根据任何已知方法获得的人诱导神经干细胞(例如发明人在中国专利201810372724.7中公开的诱导方法)。在本实施例中，示例性地使用了Y.Yuan等报导的方法来制备人iNSC(Y.Yuan等，Dopaminergic precursorsdifferentiated from human blood-derived induced neural stem cells improvesymptoms of a mouse Parkinson's disease model，Theranostics 8(17)(2018)4679-4694)。简而言之，通过仙台病毒感染将人外周血单个核细胞(PBMC)重编程为诱导神经干细胞(iNSC)：将300万个PBMNC悬浮在SCF培养基中，然后使用编码OCT3/4、SOX2、KLF4和c-MYC(OSKM)(MOI＝10)的仙台病毒(Life Technologies，卡尔斯巴德，美国)感染。两天后，将这些细胞以2×105/孔的密度铺板在NSC培养基(由DMEM/F12:Neurobasal(1:1)、1×N2、1×B27、2mM GlutaMAX、1％NEAA(Life Technologies)、10ng/mL重组人白血病抑制因子(rhLIF，Millpore，比尔里卡，美国)、3μM CHIR99021和2μM SB431542(均来自GeneOperation，密歇根，美国)。每隔一天更换一次培养基。十天后，上皮样克隆出现在培养物中。在第32至35天，克隆大到足以被拾取并转移到PDL/层粘连蛋白包被的96孔板上进行扩增。为了灭活残留的仙台病毒，当iNSC处于第三代时，将培养箱温度从37℃提高到39℃一周。在较高温度下培养一周导致大约一半的iNSC死亡，并且存活的细胞在PDL/层粘连蛋白涂层的24孔板中传代，然后在细胞群足够大时转移到涂层的6孔板上。
iNSC的增殖培养基例如为包括DMEM/F12(Gibco)、Neurobasal A(Gibco)、N2(Gibco)、B27(Gibco)、glutaMAX(Gibco)、NEAA(Gibco)、CHIR99021(3μM)、SB431542(2μM)、LIF(10ng/ml)的培养基。培养基每2天更换一半，每4-6天传代一次。
实施例2凝胶组合物的制备
iNSC+生物材料移植物的制备：制备包含由纤维蛋白-凝血酶包裹的iNSC移植物(包含4×106个细胞)，具体方法为：在实施例1的iNSC中加入AccutaseTM，在37℃下解离20分钟，将iNSC解离成单细胞，然后以250g离心5分钟；在移植前，用50μL 0.1％BSA重新悬浮4×106个解离的iNSC(即获得50μL的BSA-iNSC)，并进一步与50μL凝血酶(Sigma，T7009，100U/mL)彻底混合(即获得100μL的凝血酶-BSA-iNSC)。同时，将50μL人纤维蛋白原(100mg/mL)溶解在50μL的20mM CaCl2(即获得100μL的纤维蛋白原-CaCl2)中，并与100μL的凝血酶-BSA-iNSC快速混合。纤维蛋白-凝血酶-iNSC会自发地交联成凝胶状的柔软混合物。
对于仅材料移植组，进行与本实施例的上述相同的程序，不同之处在于使用50μL不含iNSC的0.1％BSA溶液。
此外，发明人也尝试使用了其他浓度如200mg/mL的人纤维蛋白原溶液和200U/mL的凝血酶作为原料与iNSC移植物进行混合，发现得到的凝胶状柔软混合物和本实施例中使用100mg/mL的人纤维蛋白原溶液和100U/mL的凝血酶作为原料得到的产物非常类似，材料交联时间、交联后的柔软度和柔韧性没有差异。基于降低成本的角度，以下选择了本实施例的上述浓度的产物(即使用100mg/mL的人纤维蛋白原溶液和100U/mL的凝血酶作为原料得到的产物)进行试验。
实施例3脊髓损伤动物模型的制备
本发明使用的试验动物为雌性SD大鼠(210-230克)，购自Vital River(中国)，饲养在温度和湿度控制的动物区，12小时光照/黑暗周期。所有的动物实验都是按照中国公共卫生部的指南和美国国立卫生研究院的实验动物护理和使用指南进行的。所有涉及动物的研究程序都得到了首都医科大学宣武医院伦理委员会的批准。
研究共使用81只大鼠，其中随机选择6只作为正常组(未进行脊髓损伤造模)，其余75只为实验组(进行脊髓损伤造模)。将实验组的75只大鼠进行脊髓损伤造模的操作后，进一步随机分配至(1)iNSC+生物材料移植组，即移植物含纤维蛋白-凝血酶-iNSC的实验组(n＝25)；(2)单独生物材料移植组，即移植物仅含由纤维蛋白-凝血酶组成的生物材料而不含有iNSC的实验组(n＝25)；(3)SCI对照组，即仅进行脊髓损伤造模处理而不进行任何移植物处理的实验组(n＝25)。
脊髓损伤造模和移植方法：本实施例采用完全脊髓损伤模型，造模方法为：通过腹膜内注射氯胺酮(25mg/mL)、甲苯噻嗪(1.3g/mL)和乙酰丙嗪(0.25mg/mL)的组合以2mL/kg的剂量对动物进行深度麻醉。通过在胸椎8和9(T8-T9)之间对脊髓进行切片，引入2毫米长的间隙，具体操作方法为(图1B)：椎板切除后T8-T9暴露脊髓，去除2毫米长的脊椎组织并按上述分组进行不同处理(如移植iNSC+生物材料或生物材料或不移植，在横断部位使用止血海绵控制出血)，肌肉组织的缝合，缝合皮肤和应用医用碘伏，最后将所有大鼠放回其家笼中进行恢复。
移植方法：在移植之前，按实施例2的方法分别制备组合物——即含iNSC和生物材料组的组合物(用于iNSC移植组)、以及仅含生物材料的组合物(单独材料组)，并各自轻柔但彻底地混合，以各自交联产生软凝块。该两种生物材料(含或不含iNSC细胞)各取200μL，该体积足以填补损伤间隙，即全断型脊髓损伤模型形成的空洞。
在进行SCI造模后立即将含iNSC和生物材料组的组合物或仅含生物材料的组合物移植物放入SCI的损伤位点。移植后，所有大鼠均用抗生素氨苄青霉素治疗一周。在整个实验过程中，在移植前一周开始每天注射环孢菌素D(10mg/kg)，直到处死动物。SCI造模后每天两次手动排空大鼠膀胱直至处死(参见图1A和图1B)。
在75只经历SCI造模大鼠中，共计62只大鼠在损伤后存活。其中，对照组由22只大鼠组成，包括5dpi(days post injury，受伤后天数)、15dpi、30dpi、60dpi(n＝3/时间点)和7mpi(months post injury，受伤后月数，n＝10)；单独材料组由19只大鼠组成，包括5dpi、15dpi、30dpi、60dpi(n＝3/时间点)和7mpi(n＝7)；iNSC移植组由21只大鼠组成，包括5dpi、15dpi、30dpi、60dpi(n＝3/时间点)和7mpi(n＝9)。在研究中分析了至少3只大鼠/时间点/组。
实施例4检测和统计方法
4.1组织收集
用氯胺酮(25mg/mL)、甲苯噻嗪(1.3g/mL)和乙酰丙嗪(0.25mg/mL)的组合按2mL/kg的剂量麻醉大鼠。用冷0.9％盐水经心脏灌注大鼠。在4℃下解剖T6-T10的脊髓并在4％多聚甲醛(PFA)中固定48小时，然后转移到20％蔗糖保持24小时(4℃)，接着转移至30％蔗糖保持24小时(4℃)。然后将这些片段嵌入OCT包埋剂(optimal cutting temperaturecompound)中，并切割成20μm厚的切片(Leica Microsystems)，在-80℃下储存。
4.2免疫荧光染色和定量
每只大鼠取第5张切片进行染色(n≥3只大鼠/组)。切片用在PBS中的0.3％的Triton X-100(PBST)处理10分钟，并在室温下用10％BSA封闭1小时。然后将切片与一抗(1:500稀释度，见表1)在4℃时孵育过夜。将载玻片用PBS洗涤3次，随后与缀合的对应二抗(Invitrogen)在室温下孵育2小时。DAPI(1mg/mL)用于对细胞核进行复染。通过使用共聚焦显微镜Leica SCN400 Slide Scanner(Leica Microsystems)使用相同的设置(例如电压、背景降低和其他参数)捕获图像。为了量化具有典型标记物表达模式的阳性细胞，使用ImageJ软件(美国，NIH)对每个切片的至少9个区域进行采样和分析(放大倍数为200倍)。计算每一大鼠组织的平均阳性细胞百分比作为统计的复制样本。计算阳性细胞的平均百分比，然后使用GraphPad Prism 5软件计算统计的显著性。
表1免疫荧光染色中使用的一抗列表
抗体 公司 货号
BDNF Bioss bs-4989R
CD206 Proteintech 60143-1-lg
CD45 Proteintech 60287-1-lg
CD68 Proteintech 28058-1-AP
GFAP Abcam ab4674
Human Fibrinogen Bioss bsm-1240M
Human nuclei Millipore MAB1281
iba1 Abcam ab955
Laminin Sigma L9393
NF200 Millipore MAB5262
Sox2 GeneTex GTX101507
TGFβ Immunoway YT4632
TNFα Immunoway YT4689
Tuj1 Millipore MAB1637
4.3行为评估
在整个研究过程中，每周评估功能恢复。功能分析由双盲观察员在旷场实验中通过使用Basso、Beattie和Bresnahan(BBB)运动评分量表实施，以评估SCI后大鼠后肢运动功能的恢复情况。
4.4运动诱发电位测试
对每组都进行电生理学研究(n＝6只大鼠/组)。检查前，用氯胺酮(25mg/mL)、甲苯噻嗪(1.3g/mL)和乙酰丙嗪(0.25mg/mL)的组合按2mL/kg麻醉动物。然后用Keypoint-II双通道诱发电位/肌电图测量运动诱发电位(Motor evoked potential，MEP)。刺激电极(针电极)插入大脑运动皮层，记录电极插入对侧后肢腓肠肌。
4.5损伤体积测量
按先前报导的方法进行损伤体积测量(K.G.Sharp等，Salmon fibrin treatmentof spinal cord injury promotes functional recovery and density ofserotonergic innervation,Exp Neurol 235(1)(2012)345-56)。简而言之，损伤体积是根据GFAP染色切片计算的，该方法为更准确确定损伤的手段。具体而言，将每个切面的三个手动追踪的面积进行平均，将每根脊髓以确定间距收集的20到25个连续切片的面积相加，并使用每个切片之间的已知距离来计算每一脊髓的损伤体积(以立方毫米表示)。
4.6组织学分析
收集的组织在4％PFA中固定48小时，然后切成20μm厚的冷冻切片。相邻组织切片用苏木精和伊红(H&E)染色以进行一般观察。按照LFB试剂盒(Solarbio)的说明，使用LuxolFast Blue(LFB)染色显示再生神经组织中的髓鞘。图像由全景扫描仪(3D HISTECH，匈牙利)捕获。
4.7统计分析
本发明实施例中的所有实验和分析都是在研究人员对实验条件不知情的情况下进行的。使用GraphPad Prism 5(Graphpad software,La Jolla,加利福尼亚，美国)计算阳性细胞的相对表达和BBB评分。数据表示为平均值±标准差。三个或更多组的比较使用ANOVA，然后是Tukey事后检验。p值≤0.05为显著的。
实施例5移植后结果
5.1移植后iNSC的存活状况
在发明人之前的研究中，已成功地将人外周血单个核细胞(PBMC)转化为iNSC，重要的是，将iNSC或iNSC衍生的多巴胺能前体体内移植到免疫缺陷小鼠的大脑中不会导致肿瘤形成(Y.Yuan等，Dopaminergic precursors differentiated from human blood-derived induced neural stem cells improve symptoms of a mouse Parkinson'sdisease model,Theranostics 8(17)(2018)4679-4694)。iNSC在增殖培养基中扩增数代，解离成单细胞，然后与生物材料(纤维蛋白原和凝血酶)混合形成软凝块，然后将其移植到全横断脊髓损伤位点(图1A和图1B)。一旦混合后，生物材料和细胞会在室温下迅速固化(通常在3秒内)。对于每只大鼠，将载有4×106个细胞的生物材料的移植到脊髓的损伤位点(T8-T9)。SCI大鼠在损伤后的不同时间点被安乐死，脊髓被切片并染色用于分析。
损伤后5天，在损伤位点检测到Hu+(人细胞核，人细胞的标记物)细胞(图1C和1E)。在损伤位点之外还观察到一些移植的iNSC细胞，主要位于损伤边界的尾部区域，覆盖距离可达2mm(图1C和1D)。此外，Hu+细胞与NSC标记物Sox2共标记，但对GFAP(胶质纤维酸性蛋白，其是星形胶质细胞的标记物，通常在损伤位点染色为阴性，可用于定义损伤边界)呈阴性(图1E)。然而，在损伤后第15天不再能检测到Hu+细胞(数据未显示)。这些结果表明移植后iNSC在脊髓的损伤位点至少存活5天以上，且可以向脊髓损伤位点的外侧(头端和尾端)进行一定程度的扩展。
5.2iNSC+生物材料促进SCI后功能恢复
在本发明的研究中，发明人采用了在T8-T9全横断的SCI模型。如BBB评分结果所示，SCI后通常会出现一定程度的自发恢复(图2A)。与SCI对照组(仅SCI损伤)相比，单独生物材料移植组的SCI大鼠的运动功能显著增强(图2A)。相对于单独材料组，iNSC+生物材料移植组的运动功能进一步增强(图2A)。
为了检查控制运动功能的神经元回路，通过在大脑运动皮层放置一个刺激电极并在后肢的腓肠肌放置一个记录电极来进行电生理分析。分别记录了左右后肢的电生理信号。在未进行脊髓损伤造模的正常组大鼠中，运动皮层的电刺激在后肢中诱发了约4.69ms潜伏期和4.13mv振幅的信号波(图2B和2C)。在经历T8脊髓损伤之后，SCI对照组的潜伏期保持类似水平，但信号振幅几乎完全消失(左右后肢分别为0.01和0.023mV，图2B和2C)。在移植7个月后，与SCI对照组和单独生物材料移植组相比(左右后肢振幅分别为0.023和0.024mV)，iNSC+生物材料移植组振幅均显著增加，可增加至1.42±0.19mv，约为正常大鼠的35％(图2B和2C)。结果表明，使用iNSC和生物材料移植改善了脑脊髓回路的功能中继。
5.3移植iNSC+生物材料减少脊髓损伤体积
为了研究移植iNSC+生物材料对行为和电生理改善的机制，我们在移植后7个月对大鼠实施安乐死，并对脊髓进行病理学分析。测量并计算各组脊髓损伤的长度和体积。在SCI对照组、单独生物材料移植组、和iNSC+生物材料移植组中，损伤的平均长度分别为4.098mm、3.236mm和2.538mm(图3A)。激活的星形胶质细胞是GFAP阳性的，可用于标记脊髓损伤区域的边界。采用GFAP染色计算各组损伤体积。发现iNSC+生物材料移植组显著减少了脊髓损伤体积，显示移植包裹于纤维蛋白-凝血酶的iNSC凝胶移植物有助于功能恢复(图3B)。
此外，进行H&E(苏木精-伊红)染色以检查组织形态(图3C)。脊髓损伤后，脊髓呈现出细胞密度降低的多孔形态(图3C)，通过移植纤维蛋白-凝血酶生物材料(单独生物材料移植组)、或者移植包裹于纤维蛋白-凝血酶的iNSC凝胶移植物(iNSC+生物材料移植组)均可逆转该现象，但移植包裹于纤维蛋白-凝血酶的iNSC凝胶移植物逆转该现象的能力明显更高(图3C)。类似地，用于检查髓鞘形成水平的LFB(Luxol Fast Blue)染色表明，与SCI对照组相比，通过移植纤维蛋白-凝血酶生物材料(单独生物材料移植组)、或者移植包裹于纤维蛋白-凝血酶的iNSC凝胶移植物(iNSC+生物材料移植组)均使得损伤位点的髓鞘形成区域更大，但iNSC+生物材料移植组的髓鞘形成区域明显大于单独生物材料移植组(图3D)。结果表明，移植包裹于纤维蛋白-凝血酶的iNSC凝胶移植物可以减少损伤体积、并改善轴突的髓鞘形成，这可能是功能恢复的原因。
5.4移植iNSC+生物材料促进Tuj1和NF200在损伤位点中的表达
iNSC+生物材料移植组在第5天表现出良好的细胞存活率，但随着时间的推移逐渐减少。从第15天起，在脊髓中未检测到移植的iNSC。为了研究iNSC+生物材料移植组在移植后7个月仍能保持长期功能益处的原因，发明人对所用生物材料的动力学进行了研究。使用凝血酶和纤维蛋白原是因为它们具有良好的生物相容性，并且使用纤维蛋白原特异性抗体可用来指示纤维蛋白(K.G.Sharp等，Salmon fibrin treatment of spinal cord injurypromotes functional recovery and density of serotonergic innervation,ExpNeurol 235(1)(2012)345-56)，从而检查生物材料的动力学(图4A和图4D)。具体而言，在损伤/移植后5天，大量纤维蛋白残留在植入位点(图4A)。随后材料逐渐降解，在15dpi时数量显著减少。从30dpi开始，只能检测到少量材料(图4A)。还研究了损伤位点处神经元轴突的存在。使用GFAP染色来确定损伤边界，我们对脊髓组织切片进行了染色，以确定Tuj1(神经元分化早期未成熟神经元的标志物)和NF200(成熟神经元的标志物)。在较低放大倍率下，与SCI对照组和单独生物材料移植组相比，iNSC+生物材料移植组可以在损伤位点观察到更丰富的Tuj1信号(图4B)和一些NF200信号(图4C)。在更高的放大倍数下(图5)，在损伤位点的中心和边界，在SCI对照组的损伤位点处仅检测到少数Tuj1+或Tuj1+/NF200+细胞，而相对于SCI对照组和单独生物材料移植组，在iNSC+生物材料移植组中检测到更丰富的Tuj1+和Tuj1+/NF200+信号(图5A-D)。此外，通过对成熟神经元标记物MAP2和突触前末端标记物Synapsin进行染色，我们可以在iNSC+生物材料移植组的损伤位点检测到Synapsin+/MAP2+可能受神经支配的轴突，但在对照组中未检测到(图5E)。结果表明，移植iNSC和生物材料能够在损伤位点产生功能性轴突。
5.5移植iNSC+生物材料对损伤位点微环境的影响
移植的iNSC在5dpi时表现出良好的存活率，但随着时间的推移逐渐减少。从第15天起，未检测到移植的iNSC。然而，观察到移植iNSC和生物材料对于运动功能和病理的影响是持久的。一种可能性是，在SCI后的急性和/或亚急性阶段，不利的微环境可能导致不发生参与内源性轴突再生和/或神经发生的关键步骤。早期阶段对微环境的调节可能对病理和功能产生长期影响。为了验证这种可能性，我们在15dpi检查了脊髓组织切片上的微环境成分。营养因子BDNF、IGF1和NT3的染色显示仅检测到BDNF，但在三个进行SCI处理的组之间未观察到显著差异(图6A和6B)。细胞因子IL4、IL6、TNFα和TGFβ的染色显示iNSC材料组中TGFβ表达增加而TNFα表达减少(图6A和6B)；此时损伤位点未检测到IL4+和IL6+细胞。
小胶质细胞是中枢神经系统(CNS)中的常驻免疫细胞，可大致分为M1和M2表型，M2表型通常被认为有利于CNS修复。相比之下，M1型小胶质细胞的慢性激活是SCI后炎症反应的一部分，可引发神经组织的进一步丧失。结果显示，与SCI对照组和单独生物材料移植组相比，iNSC+生物材料移植组在15dpi时CD206+/Iba1+细胞(M2小胶质细胞)的数量更多(图7A和7C)。发明人还通过对CD45和CD68染色来研究浸润性免疫细胞，结果显示，相对于SCI对照组和单独生物材料移植组，iNSC移植组中CD45+和CD68+细胞的数量显著减少(图7B和7D)。先前的研究报道了细胞外分子层粘连蛋白刺激背根神经节(DRG)神经元的神经突生长。层粘连蛋白和GFAP染色(图8)显示移植物没有改变损伤位点活化星形胶质细胞的亚型。这些结果表明，iNSC改善了SCI后的微环境，这对再生是有利的。
5.6针对移植后结果的分析讨论
从上述5.1-5.5的结果可以看出，人iNSC和生物材料仅在移植后的短期内(最多约一周)存在。然而，这种影响似乎是持久的。损伤/移植后七个月，仍可以观察到运动功能和病理的改善。这种现象背后的原因可能是损伤位点微环境的变化以及对原发性创伤事件后病理级联反应的影响。脊髓损伤从最初发生后至损伤继续发展，可分为几个阶段：急性期(0-48小时)、亚急性期(2-14天)、中间期(2周至6个月)和慢性期(超过6月)。不同的阶段实际上由相关的级联组成，一个事件导致下一个事件的发生，特别是，炎症从急性期开始，随着血管破裂以及脐带组织肿胀和压缩后神经胶质细胞的激活和免疫细胞的浸润。在亚急性期，随着神经元和神经胶质细胞的死亡，死亡细胞和释放的物质进一步增强了炎症反应和免疫细胞的入侵，对脊髓造成了进一步的损害。这种增强的前馈循环会增强自身并在亚急性期达到峰值，并在中间期/慢性期逐渐减弱。这些早期炎症级联反应的程度和程度可能决定后续长期功能损伤的水平。反过来，在这些早期阶段的干预可能会抑制放大的级联反应并产生一些持久的影响。
iNSC可以产生神经营养因子和其他可溶性细胞因子/趋化因子，其中一些有助于将损伤位点的微环境重塑为有利于再生过程的微环境。在目前的研究中，iNSC和生物材料的植入与小胶质细胞偏向M2表型、促炎细胞因子TNFα减少和抗炎细胞因子TGFβ增加以及浸润到损伤位点的免疫细胞数量减少有关。这些发现表明，iNSC和/或生物材料可能在SCI后的急性和/或亚急性阶段抑制了炎症级联反应，早期干预可能会打破前馈循环并导致持久的病理和行为效果。
通过上述实施例可以看出，发明人将由人PBMC重编程获得的诱导神经干细胞、凝血酶、以及纤维蛋白组成的组合物移植到受伤的脊髓中，相对于不进行处理或仅移植凝血酶和纤维蛋白的组合物的组来说，更大程度地促进了脊髓损伤后的运动和电生理功能的恢复，并且改善了脊髓损伤位点的微环境，这对于脊髓损伤后的功能恢复起关键作用。

Claims (9)

1.一种组合物在制备用于治疗脊髓损伤的药物或医疗器械中的用途，其中所述脊髓损伤为完全损伤或全横断损伤，所述组合物包含诱导神经干细胞、纤维蛋白、凝血酶，并且所述诱导神经干细胞、所述纤维蛋白以及所述凝血酶交联形成凝胶。
2.根据权利要求1所述的用途，其中所述组合物中所述诱导神经干细胞的含量为2×106个/mL以上。
3.根据权利要求1或权利要求2所述的用途，其中所述诱导神经干细胞为人诱导神经干细胞。
4.根据权利要求3所述的用途，其中所述人诱导神经干细胞为由人外周血单个核细胞重编程而获得的人诱导神经干细胞。
5.根据权利要求1所述的用途，其中所述组合物通过包括如下步骤的方法制备：(1)将纤维蛋白原溶于第一溶液，形成纤维蛋白原溶液；(2)将凝血酶溶于第二溶液，形成凝血酶溶液；(3)将神经干细胞重悬浮于所述凝血酶溶液，形成神经干细胞重悬浮液；(4)将所述纤维蛋白原溶液加入所述神经干细胞重悬浮液，形成含有神经干细胞、纤维蛋白、凝血酶的凝胶状组合物；
其中，所述第一溶液为CaCl2、MgCl2、KCl水溶液或生理盐水溶液，第二溶液为蛋白溶液或生理盐水溶液。
6.根据权利要求1所述的用途，其中所述组合物通过包括如下步骤的方法制备：(1)将纤维蛋白原溶于第一溶液，形成纤维蛋白原溶液；(2)将凝血酶溶于第二溶液，形成凝血酶溶液；(3)将神经干细胞重悬浮于所述纤维蛋白原溶液，形成神经干细胞重悬浮液；(4)将所述凝血酶溶液加入所述神经干细胞重悬浮液，形成含有神经干细胞、纤维蛋白、凝血酶的凝胶状组合物；
其中，所述第一溶液为CaCl2、MgCl2、KCl水溶液或生理盐水溶液，第二溶液为蛋白溶液或生理盐水溶液。
7.根据权利要求5或权利要求6所述的用途，其中所述第一溶液为CaCl2水溶液，其中CaCl2的浓度为5-40mM，或者所述第一溶液为生理盐水溶液；
所述纤维蛋白原溶液的浓度为10-200mg/mL；
所述第二溶液为牛血清白蛋白溶液，其中牛血清白蛋白的浓度为0.1-10mg/mL；
所述凝血酶溶液的浓度为10-200U/mL。
8.根据权利要求1所述的用途，其中所述医疗器械为生物材料支架、凝胶、或者用于3D打印的生物墨水。
9.根据权利要求1所述的用途，其中所述治疗脊髓损伤包括促进脊髓损伤后的功能恢复、减小脊髓损伤导致的损伤体积、促进损伤核心位点的Tuj1和NF200的表达、或者改善脊髓损伤位点微环境。
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