BR112014019116B1 - Kit, moléculas de anticorpo e uso de uma molécula de anticorpo - Google Patents

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Sebastian Kobold
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Abstract

kit, moléculas de anticorpo, composição farmacêutica, métodos de tratamento, usos, vetor, célula hospedeira e método de produção de uma molécula de anticorpo. a presente invenção refere-se a uma molécula de anticorpo (monoclonal) biespecífico com um primeiro domínio de ligação que se liga a um antígeno em células t cd8+ que não ocorre naturalmente em e/ou sobre células t cd8+, e um segundo domínio de ligação que se liga a um antígeno tumor-específico de ocorrência natural na superfície de uma célula tumoral. as moléculas de anticorpo biespecífico (monoclonal) são particularmente úteis em combinação com as células t cd8+ transduzidas compreendendo um antígeno que não ocorre naturalmente em e/ou sobre células t cd8+ e/ou com um receptor de célula t. a invenção também provê o uso das referidas moléculas de anticorpo (biespecífico) como um medicamento, as moléculas de anticorpo (biespecífico) para uso em um método para o tratamento de doenças específicas, bem como uma composição farmacêutica/medicamento compreendendo as referidas moléculas de anticorpo (biespecífico), em que as referidas moléculas de anticorpo (biespecífico) devem ser administradas em combinação com células t cd8+ transduzidas compreendendo um antígeno que não ocorre naturalmente em e/ou sobre células t cd8+ e/ou um receptor de célula t em um regime de tratamento específico. outros aspectos da invenção são sequências de ácidos nucleicos codificantes das referidas moléculas de anticorpo biespecífico (monoclonal), vetores, células hospedeiras, métodos para a produção da molécula de anticorpo (biespecífico), bem como um kit que compreende a molécula de anticorpo (biespecífico).

Description

[0001] A presente invenção refere-se a uma molécula de anticorpo (monoclonal) biespecífico com um primeiro domínio de ligação que se liga a um antígeno em células T CD8+ que não ocorre naturalmente em e/ou sobre células T CD8+, e um segundo domínio de ligação que se liga a um antígeno tumor- específico de ocorrência natural na superfície de uma célula tumoral. Além disso, é fornecida uma sequência de ácido nucleico que codifica uma molécula de anticorpo (monoclonal) biespecífico da invenção. Outros aspectos da invenção são vetores e células hospedeiras compreendendo a referida sequência de ácido nucleico, um processo para a produção da molécula de anticorpo (biespecífico) da invenção e um medicamento/composição compreendendo a referida molécula de anticorpo (biespecífico). Além disso, a invenção refere-se às células T CD8+ transduzidas compreendendo um antígeno que não ocorre naturalmente em e/ou sobre células T CD8+ e/ou um receptor de célula T. A invenção também provê o uso das referidas moléculas de anticorpo (biespecífico) em um método para o tratamento de doenças específicas, bem como uma composição farmacêutica/medicamento compreendendo as referidas moléculas de anticorpo (biespecífico), em que a(s) referida(s) molécula(s) de anticorpo (biespecífico) deve(m) ser administrada(s) em combinação com células T CD8+ transduzidas compreendendo um antígeno que não ocorre naturalmente em e/ou sobre células T CD8+ e/ou um receptor de célula T em um regime de tratamento específico. A invenção também fornece um método para o tratamento de determinadas doenças e um kit compreendendo a molécula de anticorpo (biespecífico) da invenção.
ANTECEDENTES DA INVENÇÃO
[0002] A transfusão de células T (ou seja, Linfócitos T), se refere à terapia celular adotiva com células T, testada para o tratamento do câncer e infecções crônicas. A terapia celular adotiva com células T tem o potencial de aumentar a imunidade antitumoral, aumentar a eficácia da vacina e limitar a doença do enxerto-versus-hospedeiro. A terapia celular adotiva de células T utiliza como fonte de células, inter alia, as células T citotóxicas (CTLs), ou linfócitos que infiltram no tumor (TILs). Os anticorpos biespecíficos podem ser usados para “armar” células T (ativadas), a fim de formar uma ponte entre estas e um antígeno de superfície sobre células tumorais. Os anticorpos biespecíficos que visam, por um lado um marcador/antígeno de superfície sobre células tumorais e por outro lado outro marcador/antígeno que é naturalmente/endogenamente expresso nas ou sobre as células encontram-se descritos, por exemplo, em Gloriuset al., Blood 116 (2010), 1173; Rotheet al., Blood 118 (2011), 1585; Zhengxinget al., Blood 111 (2007), 2211-2219, Herrmannet al., Cancer Research 68 (2008), 1221-1227; Singeret al., Journal of Immunotherapy 33 (2010), 599-608; Brandlet al., Experimental Hematology 27 (1999), 1264-1270; Jameset al., European Journal of Cancer 35 (1999), S343- S344; Chenet al., Clinical Cancer Research 1 (1995), 1319-1325; Valeraet al., Molecular Cancer Therapeutics 9 (2010), 1872-1883; Geldermanet al., European Journal of Immunology 36 (2006), 977-984; Schweizeret al., Cancer Immunology Immunotherapy 51 (2002), 621-629; Friedmanet al., Biotechnology and Applied Biochemistry 54 (2009), 121-131; Schaeferet al., Cancer Cell 20 (2011), 472-486 e Kazuhikoet al., International Journal of Molecular Medicine 25 (2010), 209-215.
[0003] As células T citotóxicas específicas para o antígeno (CTLs), são conhecidas por terem a capacidade de matar células câncer humanas, tal como demonstrado pela regressão de tumores após a transferência adotiva de linfócitos infiltrantes de tumores (TILs) expandidos ex-vivo ou de células T transfectadas com o gene do receptor de células T em pacientes com melanoma (Leen et al., Annu.Rev. Immunol. 115 (2007), 98-104). Uma abordagem conhecida alternativa é o uso de anticorpos biespecíficos com o intuito de redirecionar grandes números de células T endógenas. Esses anticorpos biespecíficos, em que alguns formatos são denominados de BiTE (do inglês “bispecific T-cell engager”), foram construídos de tal modo que eles têm como alvo em um dos lados o marcador de superfície CD3 (que são naturalmente expressos sobre células-T) e no outro lado um antígeno de superfície de células tumorais (ou seja, naturalmente/endogenamente expresso na superfície de células tumorais). Além disso, foi demonstrado em trabalho anterior que anticorpos biespecíficos anti-CD3 desta concepção particular possuíam uma potência excepcionalmente elevada e podiam engajar as células T CD8+ e células T CD4+ para a lise de células de câncer mesmo em relações efetor:alvo (E:A) muito baixas. Dois anticorpos BiTE estão atualmente em ensaios clínicos: O blinatumomab (também conhecido como MT103) que é biespecífico para CD3 e CD19. Ele está atualmente a ser testado em um estudo de fase I em pacientes com linfoma não-Hodgkin (NHL) em estágio avançado, reincidente (Bargou et al., Science 321 (2008). 974-977) e em um estudo de fase II em pacientes com leucemia linfoblástica aguda de células B precursoras (B-ALL) (Toppet al. Blood 112 (2008). 1926). O segundo anticorpo BiTE em estudo de fase I é o MT-110 (Micromet Inc), que tem como alvo o antígeno pan associada ao carcinoma, molécula de adesão celular epitelial (EpCAM ou CD326) e CD3 (Brischwein et al., Mol. Immunol. 43 (2006), 1129-1143). Um anticorpo biespecífico (catumaxumab [Removab®]; biespecífico contra CD3 e EpCAM humano) foi aprovado para comercialização na Europa em 2009.
[0004] Sistemas de anticorpos biespecíficos in vitro e em modelo de camundongos são capazes de ligar uma célula T e uma célula de câncer pela ligação simultânea ao CD3 e a um antígeno alvo, o que provoca a ativação das células T e desencadeando a fusão de grânulos citotóxicos e liberação de citocinas transitórias e granzimas. No entanto, a ativação de um grande número de células T (independentemente da especificidade do antígeno de células T) e/ou o efeito espectador da lise celular do tumor leva a problemas graves pelo uso de tais anticorpos biespecíficos, por exemplo, como parte de um regime terapêutico em seres humanos.
[0005] Um desses problemas é a chamada “síndrome da liberação de citocinas (SLC)”, que no sistema de modelo de camundongos normalmente não causa nenhum efeito, mas pode ter consequências catastróficas em seres humanos (Suntharalingam et al, The New England Journal of Medicine 355 (2006), 1018 -1028). A SLC inclui cefaleia, mialgias, náuseas, diarreia, eritema, vasodilatação e hipotensão. A forma mais grave leva à infiltração pulmonar, lesão pulmonar, insuficiência renal e coagulação intravascular disseminada (Suntharalingam et al, The New England Journal of Medicine 355 (2006), 10181028). Mesmo se a SLC não esteja associada com a aplicação do anticorpo biespecífico, um número significativo de outros efeitos colaterais (mais de 80% de toxicidades de grau três ou mais alto) tem sido observado após a administração do anticorpo biespecífico (Topp et al. Journal of Clinical Oncology 29 (2011), 2093-2098). Esses efeitos colaterais são atribuídos ao envolvimento de células T também e incluem linfopenia, alterações químicas sanguíneas e sintomas eurológicos.
[0006] Devido ao alto perfil de efeito colateral dos anticorpos biespecíficos, não é possível utilizá-los em formatos de anticorpo com uma meia- vida longa, uma vez que no caso de um evento de SLC, a meia-vida longa é indesejável.
[0007] Por isso, o problema técnico da presente invenção foi a disponibilização de meios e métodos para o tratamento de uma doença maligna, tais como câncer de origem epitelial, endotelial ou mesotelial e câncer do sangue pela indução de resposta imune mediada por células T.
DESCRIÇÃO RESUMIDA DA INVENÇÃO
[0008] Estes meios e métodos para o tratamento de uma doença maligna, tal como o câncer de origem epitelial, endotelial ou mesotelial e câncer do sangue, pela indução da resposta imune mediada por células T mencionados acima devem superar a desvantagens conhecidas das terapias baseadas em anticorpo biespecífico mencionadas acima.
[0009] A solução para o referido problema técnico é alcançada pelo fornecimento dos exemplos de realização caracterizados nas reivindicações.
[0010] Consequentemente, a presente invenção refere-se a transdução de células T CD8+ com uma proteína marcadora que não ocorre naturalmente na e/ou sobre a superfície das células T CD8+ e o recrutamento direcionado de uma molécula de anticorpo biespecífica para o tumor (vide as Figuras 7 e 21). No contexto da presente invenção, a transdução de células T CD8+ pode ser efetuada por um sistema retroviral tal como descrito abaixo. A presente invenção refere-se a uma molécula de anticorpo biespecífica que compreende um primeiro domínio de ligação que se liga especificamente a um antígeno sobre células T CD8+ que não ocorre naturalmente e/ou células T CD8+ e um segundo domínio de ligação que se liga a um antígeno tumor-específico que ocorre naturalmente na superfície de uma célula tumoral, em que as referidas células T CD8+ foram transduzidas com um antígeno que não ocorre naturalmente em e/ou sobre células T CD8+. No contexto da presente invenção, a molécula de anticorpo biespecífica que compreende um primeiro domínio de ligação que se liga especificamente a um antígeno em células T CD8+ que não ocorre naturalmente em e/ou sobre células T CD8+ e um segundo domínio de ligação que se liga a um antígeno tumor-específico que ocorre naturalmente sobre a superfície de uma célula tumoral, em que a referida molécula de anticorpo biespecífico é uma molécula de anticorpo (monoclonal). Conforme exibido nos exemplos em anexo, como uma prova do conceito inventivo, foi construído um anticorpo biespecífico, em que o primeiro domínio de ligação interage com/se liga ao EGFR (humano) (que representa o antígeno que não ocorre naturalmente em ou sobre células T (células T CD8+) e o segundo domínio de ligação interagem com/se liga a EpCAM (representando um antígeno tumor- específico que ocorre naturalmente na superfície de uma célula de tumor). O tratamento de tumores pela combinação deste anticorpo biespecífico e com células T transduzidas (células T CD8+) tumor-específicas expressando a proteína del-(humana) hEGFR prolonga significativamente a sobrevida dos camundongos, comparado ao controle do experimento (vide as Figuras 12 e 14). Deste modo, verificou-se surpreendentemente que as células T (células T CD8+) que foram transduzidas com um antígeno (tal como nos Exemplos anexos (como uma prova de conceito) pela sequência da proteína del-hEGFR (humana) mostrada na SEQ ID NO: 12 (tal como codificado pela sequência de cDNA mostrada na SEQ ID NO: 11)) que não ocorre naturalmente em e/ou sobre estas células, podem ser recrutadas especificamente com o uso de uma molécula de anticorpo biespecífico que se liga através de um primeiro domínio de ligação (ao hEGFR (humano)) a um antígeno que não ocorre naturalmente em e/ou sobre células T (células T CD8+), que foi introduzido nas referidas células T (células T CD8) e através de um segundo domínio de ligação a um antígeno tumor- específico (EpCAM) que ocorre naturalmente na superfície de uma célula tumoral.
[0011] Neste contexto, o termo “construção de ligação biespecífica”, tal como utilizado na presente invenção, refere-se especificamente a uma molécula de anticorpo biespecífica capaz de se ligar a um antígeno que não é naturalmente/endogenamente expresso nas ou sobre as células T CD8+ capazes de induzir a eliminação/lise das células alvo (através de um segundo domínio de ligação que se liga a um antígeno tumor-específico que ocorre naturalmente (ou seja, é endogenamente expresso) na superfície de uma célula tumoral). A ligação do antígeno que não ocorre naturalmente em e/ou sobre células T CD8+ (por exemplo, anticorpo, derivados de anticorpos ou fragmentos de anticorpo), pela construção de ligação biespecífica (molécula de anticorpo biespecífico) trás as células T tumor-específicas (células T CD8+ ) em contato físico com as células de tumor (vide as Figuras 7 e 21). Células T não transduzidas ou endógenas (células T CD8+) permanecem inalteradas pela construção de ligação biespecífica (molécula de anticorpo biespecífico). Consequentemente, a molécula de anticorpo biespecífica inventiva tem a capacidade de lisar células alvo in vivo e/ou in vitro. As células alvo correspondentes compreendem células que expressam uma molécula de superfície, que é reconhecida pelo segundo domínio de ligação (derivada de Ig) das moléculas de anticorpo biespecífico da invenção. Tais moléculas de superfície são caracterizadas abaixo.
[0012] A lise da célula alvo pode ser detectada por meio de métodos conhecidos no estado da técnica. Consequentemente, tais métodos compreendem, inter alia, ensaios in vitro fisiológicos. Tais ensaios fisiológicos podem monitorar a morte celular, por exemplo, a perda da integridade da membrana celular (por exemplo, ensaio FACS baseado em iodeto de propídio, ensaio de influxo de azul de tripano, ensaios fotométricos de liberação de enzima (LDH), ensaio radiométrico de liberação de Cr51, ensaios fluorométricos de liberação de európio e de liberação de CalceinAM). Outros ensaios incluem o monitoramento da viabilidade celular, por exemplo, por ensaios fotométricos de MTT, XTT, WST-1 e alamarBlue, ensaios radiométricos de incorporação de H3- Thd, ensaio clonogênico de medição da atividade da divisão celular, e ensaio fluorométrico com Rodamina123 medindo o gradiente transmembranar mitocondrial. Além disso, a apoptose pode ser monitorada, por exemplo, pelo ensaio de exposição à fosfatidilserina baseado em FACS, teste TUNEL baseado em ELISA, ensaio da atividade da caspase (fotométrico, fluorométrico ou baseados em ELISA) ou analisando a alteração da morfologia celular (retração, blebbing (formação de vesículas) da membrana).
[0013] O termo “ligação a” tal como utilizado no contexto da presente invenção, define uma ligação (interação) de pelo menos dois “sítios de interação ao antígeno” entre si. O termo “sítio de interação ao antígeno” define, de acordo com a presente invenção, um motivo de um polipeptídeo que apresenta a capacidade de promover ligação específica a um antígeno específico ou um grupo específico de antígenos. A referida ligação/interação também é entendida para definir um “reconhecimento específico”. O termo “reconhece especificamente” significa, de acordo com a presente invenção, que a construção de anticorpo é capaz de interagir especificamente com e/ou se ligar a pelo menos dois aminoácidos de cada molécula-alvo humana, tal como definido na presente invenção. Os anticorpos podem reconhecer, interagir e/ou se ligar aos diferentes epítopos da mesma molécula alvo. Este termo refere-se a especificidade da molécula de anticorpo, ou seja, a sua capacidade de discriminar entre as regiões específicas da molécula alvo humana, tal como definido na presente invenção. A interação específica do sítio de interação ao antígeno com o seu antígeno específico pode resultar em um sinal inicial, por exemplo, devido à indução de uma alteração na conformação do antígeno, uma oligomerização do antígeno, etc. Assim, um motivo específico na sequência de aminoácidos do sítio de interação ao antígeno e o antígeno se ligam entre si como resultado de suas estruturas primária, secundária ou terciária, assim como pelo resultado de modificações secundárias da referida estrutura.
[0014] O termo “interação específica” conforme utilizado na presente invenção significa que a construção de ligação biespecífica (molécula de anticorpo biespecífico) da presente invenção não reage ou não reage essencialmente de forma cruzada com (poli)peptídeos de estruturas similares. Consequentemente, a construção biespecífica da invenção se liga especificamente a/interage com os marcadores tumorais, marcadores da superfície celular, antígenos que não ocorrem naturalmente em e/ou sobre células T CD8+ que são capazes de, devido ao seu segundo domínio (derivado de Ig), interagir com outros compostos selecionados, antígenos marcadores da superfície celular, marcadores tumorais etc., que não ocorrem naturalmente na superfície das células tumorais. Exemplos específicos de tais moléculas contra os quais os referidos primeiro e segundo domínios derivados do tipo Ig são direcionados são fornecidos abaixo na presente invenção.
[0015] A reatividade cruzada de um painel de construções sob investigação pode ser testada, por exemplo, pela avaliação da ligação do referido painel de construções de anticorpos biespecíficos em condições convencionais (vide, por exemplo, Harlow e Lane, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, (1988) e Using Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, (1999)) para o (poli)peptídeo de interesse (assim como para uma variedade de (poli)peptídeos mais ou menos intimamente relacionados (estruturalmente e/ou funcionalmente). Apenas essas construções (ou seja, anticorpos (biespecíficos) (scFvs) e similares) que se ligam ao (poli)peptídeo/proteína de interesse, mas não se ligam ou não se ligam essencialmente a qualquer um dos outros (poli)peptídeos, que são expressas pela mesmo tecido como o (poli)peptídeo de interesse, por exemplo, células do tecido tumoral, são consideradas específicas para o (poli)peptídeo/proteína de interesse e selecionadas para estudos posteriores, de acordo com o método fornecido na presente invenção. Estes métodos podem compreender, inter alia, estudos de ligação, estudos de bloqueio ou competição com moléculas estruturalmente e/ou funcionalmente relacionadas. Estes estudos de ligação compreendem também a análise FACS, ressonância plasmônica de superfície (SPR, por exemplo, com BIAcore®), ultracentrifugação analítica, calorimetria de titulação isotérmica, anisotropia de fluorescência, espectroscopia de fluorescência, ou ensaios de ligação ao ligante marcado radioativamente. Além disso, podem ser realizados ensaios fisiológicos, tais como ensaios de citotoxicidade e os ensaios mencionados acima. Consequentemente, exemplos para a interação específica de um sítio de ligação ao antígeno com um antígeno específico pode compreender a especificidade de um ligante ao seu receptor. A referida definição compreende particularmente a interação de ligantes que induzem um sinal após a ligação ao seu receptor específico. Exemplos de ligantes correspondentes compreendem citocinas que interagem/se ligam com/às seus receptores de citocina específicos. Também particularmente compreendida por essa definição é a ligação de um sítio de interação ao antígeno para antígenos tais como os antígenos da família das seletinas, integrinas e da família de fatores de crescimento, tal como o EGF. Outro exemplo para a referida interação, que também é particularmente compreendida pela referida definição, é a interação de um determinante antigênico (epítopo) com o sítio de ligação antigênico de um anticorpo.
[0016] O termo “ligação a” não se referem apenas a um epítopo linear, mas pode também relacionar-se a um epítopo conformacional, um epítopo estrutural ou um epítopo descontínuo que consiste em duas regiões das moléculas-alvo humanas ou suas partes. No contexto da presente invenção, um epítopo conformacional é definido por duas ou mais sequências de aminoácidos discretas separadas na sequência primária que se tornam unidas na superfície da molécula quando o polipeptídeo se dobra para formar a proteína nativa (Sela, Science 166 (1969), 1365 e Laver, Cell 61 (1990), 553-536). Além disso, o termo “ligação a” é utilizado de maneira indiferente no contexto da presente invenção com o termo “interação com”.
[0017] Consequentemente, a especificidade pode ser determinada experimentalmente por métodos conhecidos no estado da técnica e métodos como aqueles descritos na presente invenção. Tais métodos compreendem, mas não estão limitados a, Western Blot, ELISA, ECL-, testes-IRMA, e varredura peptídica.
[0018] O termo “primeiro domínio de ligação” (derivado de Ig) refere-se a um “domínio derivado de imunoglobulina”, especificamente a um anticorpo ou fragmentos do mesmo, anticorpos de cadeia única, anticorpos sintéticos, fragmentos de anticorpos, como Fab, F(2 ab)', fragmentos Fv ou scFv, etc, ou uma forma modificada quimicamente derivada de qualquer um destes. Estas moléculas de anticorpos podem ser derivadas de diferentes espécies, ou podem ser de origem quimérica. No contexto da presente invenção (tal como ilustrado nos exemplos anexos), o referido primeiro domínio (derivado de Ig) compreendido na molécula de anticorpo biespecífico da invenção pode ser um anticorpo (monoclonal) ao qual um segundo “domínio de ligação” (derivado de Ig) está fundido.
[0019] O termo “segundo domínio de ligação” (derivado de Ig) refere-se a um “domínio derivado de imunoglobulina”, especificamente a um anticorpo ou fragmentos do mesmo, anticorpos de cadeia única, anticorpos sintéticos, fragmentos de anticorpos, como Fab, F(2 ab)', fragmentos Fv ou scFv, etc, ou uma forma modificada quimicamente derivada de qualquer um destes. Estas moléculas de anticorpos podem ser derivadas de diferentes espécies, ou podem ser de origem quimérica. No contexto da presente invenção (tal como ilustrado nos exemplos anexos), o referido segundo domínio (derivado de Ig) compreendido na molécula de anticorpo biespecífico da invenção pode ser um scFv.
[0020] As moléculas de anticorpo biespecífico de acordo com a invenção são anticorpos (monoclonais) biespecíficos que possuem especificidades de ligação a pelo menos dois sítios diferentes e podem ser de qualquer formato. Uma ampla variedade de formatos de anticorpos recombinantes foi desenvolvida no passado recente, por exemplo, anticorpos biespecíficos bivalentes, trivalentes ou tetravalentes. Exemplos incluem a fusão de um anticorpo do formato IgG e os domínios de cadeia única (de diferentes formatos, vide, por exemplo, Coloma, M.J.,et al., Nature Biotech 15 (1997), 159163; WO 2001/077342; Morrison, S.L., Nature Biotech 25 (2007), 1233-1234; Holliger, P., et. al, Nature Biotech. 23 (2005), 1126-1136; Fischer, N., e Léger, O., Pathobiology 74 (2007), 3-14; Shen, J., et. al., J. Immunol. Methods 318 (2007), 65-74; Wu, C.,et al., Nature Biotech. 25 (2007), 1290-1297). O anticorpo biespecífico ou fragmento deste da invenção também inclui anticorpos biespecíficos bivalentes, trivalentes ou tetravalentes descritos nos documentos WO 2009/080251; WO 2009/080252; WO 2009/080253, WO 2009/080254; WO 2010/112193; WO 2010/115589; WO 2010/136172; WO 2010/145792; WO 2010/145793 e WO 2011/117330.
[0021] Os “anticorpos” da presente invenção têm dois ou mais sítios de ligação e são biespecíficos. Isto é, os anticorpos podem ser biespecíficos, mesmo nos casos em que existam mais do que dois domínios de ligação (ou seja, o anticorpo é trivalente ou multivalente). Os anticorpos biespecíficos da presente invenção incluem, por exemplo, anticorpos multivalentes de cadeia simples, diacorpos (diabodies) e triacorpos (triabodies), bem como anticorpos possuindo a estrutura de domínio constante dos anticorpos de comprimento total à qual os outros domínios de ligação ao antígeno (por exemplo, Fv de cadeia simples, domínio VH e/ou domínio VL, Fab ou (Fab)2,) estão ligados através de um ou mais ligantes peptídicos. Os anticorpos podem ser de comprimento total a partir de uma única espécie, ou seja quimerizados ou humanizados. Para um anticorpo com mais de dois domínios de ligação ao antígeno, alguns domínios de ligação podem ser idênticos, contanto que a proteína tenha domínios de ligação para dois antígenos diferentes.
[0022] O termo “valente”, usado no presente pedido denota a presença de um determinado número de domínios de ligação em uma molécula de anticorpo. Como tal, os termos “bivalente”, “tetravalentes”, e “hexavalentes” denotam a presença de dois domínios de ligação, quatro domínios de ligação e domínios sítios de ligação, respectivamente, em uma molécula de anticorpo. Os anticorpos biespecíficos de acordo com a invenção são, pelo menos, “bivalentes”, e podem ser “trivalentes” ou “multivalentes” (por exemplo, “tetravalentes” ou “hexavalentes”). Preferencialmente, o anticorpo biespecífico de acordo com a invenção é bivalente, trivalente ou tetravalente. Consequentemente, no contexto da presente invenção, o referido anticorpo biespecífico é bivalente. No contexto da presente invenção, o referido anticorpo biespecífico é trivalente. No contexto da presente invenção, o referido anticorpo biespecífico é tetravalente.
[0023] Conforme mencionado acima (e ilustrado na Figura 1), a molécula de anticorpo biespecífico da invenção, mais preferencialmente, compreende um segundo domínio (derivado de Ig) que pode ser um scFv. Deste modo, em um exemplo de realização ilustrativo da presente invenção, para a prova de conceito, uma molécula de anticorpo biespecífico é fornecida com uma especificidade para o EGFR (humano) (pelo primeiro domínio de ligação) e uma outra especificidade que é mediada por um segundo scFv direcionado contra/capaz de interagir com outra molécula/composto. Estas moléculas/compostos adicionais podem compreender moléculas da superfície celular, marcadores tumorais, antígenos tumorais e similares. Tais compostos/moléculas adicionais são exemplificados abaixo.
[0024] Deste modo, as moléculas de ligação biespecíficas no contexto da presente invenção podem se referir a uma molécula de anticorpo que compreende dois domínios de ligação derivados de anticorpos, em que um domínio de ligação pode ser um scFv. Um dos referidos domínios de ligação consiste em regiões variáveis (ou partes destas) de um anticorpo, fragmento de anticorpo ou derivado do mesmo, capaz de se ligar especificamente a/interagir com uma molécula alvo (humana) 1 que não ocorre naturalmente em e/ou sobre células T CD8+ (tal como definido abaixo). O segundo domínio de ligação consiste em regiões variáveis (ou partes destas) de um anticorpo, fragmento de anticorpo ou derivado do mesmo, capaz de se ligar especificamente a/interagir com outro antígeno (humano) (molécula alvo 2), tal como definido a seguir. Consequentemente, o referido segundo domínio de ligação é, de acordo com a presente invenção, o segundo domínio (derivado de Ig) descrito acima, que compreende um sítio de interação ao antígeno com especificidade para uma molécula de superfície celular que ocorre naturalmente sobre a superfície de uma célula tumoral ou um marcador tumor-específico (antígeno) que ocorre naturalmente sobre a superfície de uma célula tumoral. Os referidos dois domínios/regiões na molécula do anticorpo biespecífico estão preferencialmente ligados de maneira covalente entre si. Esta ligação pode ser efetuada diretamente (domínio 1 [específico para uma molécula alvo 1 (humana) que não ocorre naturalmente em ou sobre células T CD8+, compreendendo regiões CDR ou regiões CDR e regiões de arcabouço (framework), tal como definido acima] - domínio 2 [específico para uma molécula de superfície celular e/ou um marcador tumor-específico] ou domínio 1 [específico para uma molécula de superfície celular e/ou um marcador tumor-específico] - domínio 2 [específico para uma molécula-alvo (humana) que não ocorre naturamente nas e/ou sobre as células T CD8+, que compreendem regiões CDR ou regiões CDR e as regiões de arcabouço, tal como definido acima]) ou através de uma sequência ligante polipeptídica adicional (domínio 1 - sequência ligante - domínio 2). No caso em que um ligante é usado, este ligante é, no contexto da presente invenção, uma sequência de comprimento suficiente para assegurar que cada um dos domínios (primeiro e segundo) possa, independentemente um do outro, manter suas especificidades de ligação diferenciais. No contexto da presente invenção, a sequência ligante polipeptídica adicional também pode ser um fragmento do próprio anticorpo, que pode ser, por exemplo, a porção Fc ou um ou mais domínios constantes de um anticorpo.
[0025] No contexto da presente invenção, domínio de ligação 1 também pode ser parte de um braço de anticorpo 1; e domínio de ligação 2 também pode ser parte de um braço de anticorpo 2, ou vice-versa, em que os dois braços do anticorpo estão conectados por meio de uma interface. O braço de anticorpo 1 consiste em regiões variáveis (ou partes destas) de um anticorpo, fragmento de anticorpo ou derivado do mesmo, capaz de se ligar especificamente a/interagir com uma molécula-alvo 1 (humana) que não ocorre naturalmente em ou sobre células T CD8+ conforme definido abaixo. O braço de anticorpo 2 consiste em regiões variáveis (ou partes destas) de um anticorpo, fragmento de anticorpo ou derivado do mesmo, capazes de se ligar especificamente a/interagir com uma molécula de superfície celular que ocorre naturalmente sobre a superfície de uma célula tumoral, ou com um antígeno tumor-específico que ocorre naturalmente sobre a superfície de uma célula tumoral. A “interface” compreende resíduos de aminoácidos de contato (ou outros grupos não aminoácido como, por exemplo, grupos de carboidratos) no primeiro braço de anticorpo que interage com um ou mais resíduos de aminoácidos de “contato” (ou outros grupos não aminoácido) na interface do segundo braço de anticorpo. A interface preferida é um domínio de uma imunoglobulina, tal como um domínio constante (ou regiões deste) das cadeias pesadas do anticorpo, em que a ligação/interação através da interface fornece a heterodimerização dos dois braços de anticorpos (vide, por exemplo, Ridgway, J.B.,et al., Protein Eng. 9 (1996), 617-621; WO 96/027011; Merchant, A.M.,et al., Nature Biotech. 16 (1998), 677-681; Atwell, S.,et al., J. Mol. Biol. 270 (1997), 2635; EP 1 870 459 A1; WO 2007/147901; WO 2009/089004(A1) e WO 2010/129304).
[0026] Anticorpos, construções de anticorpo, moléculas de anticorpo biespecífico, fragmentos de anticorpo, derivados de anticorpo (sendo todos derivados de Ig) a serem utilizados de acordo com a invenção ou sua(s) cadeia(s) de imunoglobulina correspondente(s) podem ser adicionalmente modificados utilizando técnicas convencionais conhecidas no estado da técnica, por exemplo, utilizando deleção(ões), inserção(ões), substituição(ões), adição(ões), e/ou recombinação(ões) e/ou qualquer(quaisquer) modificação(ões) conhecida(s) no estado da técnica, isoladamente ou em combinação. Os métodos para introduzir tais modificações na sequência de DNA subjacente à sequência de aminoácidos de uma cadeia de imunoglobulina são bem conhecidos pelos técnicos hábeis no assunto; vide, por exemplo, Sambrook (1989), loc. cit. do termo “domínio derivado de Ig” (Ig-derived domain) particularmente relacionado às construções de (poli)peptídeos que compreendem pelo menos uma CDR. Os fragmentos ou derivados dos domínios derivados de Ig recitados definem (poli)peptídeos que são partes das moléculas de anticorpo acima e/ou que são modificados por métodos químicos/bioquímicos ou por biologia molecular. Os métodos correspondentes são métodos conhecidos no estado da técnica e estão descritos, inter alia, em manuais de laboratório (vide, Sambrooket al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual; Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2a Edição (1989) e 3a Edição (2001); Gerhardt et al., Methods for General and Molecular Bacteriology ASM Press (1994); Lefkovits, Immunology Methods Manual: The Comprehensive Sourcebook of Techniques; Academic Press (1997); Golemis, Protein-Protein Interactions: A Molecular Cloning Manual Cold Spring Harbor Laboratory Press (2002)).
[0027] O termo “CDR”, tal como utilizado na presente invenção refere-se a “região determinante de complementaridade”, que é bem conhecida no estado da técnica. As CDR são partes de imunoglobulinas que determinam a especificidade das referidas moléculas e fazem contato com um ligante específico. As CDR são a parte mais variável da molécula e contribuem com a diversidade destas moléculas. Existem três regiões CDR; CDR1, CDR2 e CDR3 em cada domínio V. CDR-H representa uma região CDR de uma cadeia pesada variável e CDR-L refere-se a uma região CDR de uma cadeia leve variável. VH significa cadeia pesada variável e VL cadeia leve variável. As regiões CDR de uma região derivada de Ig podem ser determinadas como descrito em Kabat “ Sequences of Proteins of Immunological Interest”, 5a edição. Publicação NIH n° 91-3242 U.S. Department of Health and Human Services (1991); Chothia J. Mol. Biol. 196 (1987), 901-917 ou Chothia, Nature 342 (1989), 877-883.
[0028] Consequentemente, no contexto da presente invenção, a molécula de anticorpo como o anticorpo biespecífico descrito acima é selecionada a partir do grupo consistindo em um anticorpo completo (imunoglobulina, tal como uma IgG1, uma IgG2, uma IgG2b, uma IgG3, uma IgG4, uma IgA, uma IgM, uma IgD ou uma IgE), fragmento F(ab)-, Fab'-SH-, Fv, Fab', F(ab')2 -, um anticorpo quimérico, um anticorpo CDR-enxertado, um anticorpo completamente humano, uma construção-anticorpo bivalente, uma proteína de fusão-anticorpo, um anticorpo sintético, um anticorpo de cadeia única bivalente, um anticorpo de cadeia única trivalente e um anticorpo de cadeia única multivalente.
[0029] O termo “anticorpo completamente humano”, tal como utilizado na presente invenção refere-se a um anticorpo que compreende apenas sequências de proteína da imunoglobulina humana. Um anticorpo completamente humano pode conter cadeias de carboidratos murinas se produzido em um camundongo, em uma célula de camundongo ou em um hibridoma derivado de uma célula de camundongo. Da mesma forma, “anticorpo de camundongo” ou “anticorpo murino” refere-se a um anticorpo que compreende apenas sequências de proteína de imunoglobulina (murina) de camundongo. Alternativamente, um “anticorpo completamente humano” pode conter cadeias de carboidratos de rato, se produzido em um rato, em uma célula de rato, em um hibridoma derivado de uma célula de rato. Da mesma forma, o termo “anticorpo de rato” refere-se a um anticorpo que compreende apenas as sequências de imunoglobulina de rato. Os anticorpos completamente humanos podem ser produzidos, por exemplo, pela exibição por fagos, que é uma tecnologia amplamente utilizada de triagem que permite a produção e triagem de anticorpos completamente humanos. Também anticorpos de fagos podem ser utilizados no contexto da presente invenção. Métodos de apresentação/exibição em fagos são descritos, por exemplo, nas Patentes US 5.403.484. US 5.969,108 e US 5.885,793. Outra tecnologia que permite o desenvolvimento de anticorpos completamente humanos envolve uma modificação da tecnologia de hibridoma de camundongo. Camundongos são tornados transgênicos para conter o locus da imunoglobulina humana em troca dos seus próprios genes de camundongo (vide, por exemplo, a patente US 5.877.397).
[0030] O termo anticorpo, conforme utilizado na presente invenção, compreende também anticorpos quiméricos. O termo “anticorpos quiméricos” refere-se a um anticorpo que compreende uma região variável de uma espécie humana, ou não humana, fundida ou quimerizada com uma região de um anticorpo (por exemplo, região constante) de outra espécie, humana ou não humana (por exemplo, camundongo, cavalo, coelho, cachorro, vaca, frango).
[0031] O termo anticorpo refere-se também a anticorpos humanos recombinantes, anticorpos heterólogos e anticorpos heterohíbridos. O termo “anticorpo humano recombinante” inclui todos os anticorpos de sequência humana que são preparados, expressos, criados ou isolados por meios recombinantes, tais como anticorpos isolados de um animal (por exemplo, um camundongo) que é transgênico para genes de imunoglobulina humana; anticorpos expressos utilizando um vetor de expressão recombinante transfectado em uma célula hospedeira, anticorpos isolados a partir de uma biblioteca de anticorpos humanos combinatorial recombinante, ou anticorpos preparados, expressos, criados ou isolados por qualquer outro meio que envolva a junção de sequências de genes de imunoglobulina humana com outras sequências de DNA. Tais anticorpos humanos recombinantes possuem regiões variáveis e constantes (se presentes) derivadas das sequências de imunoglobulina da linhagem germinativa humana. Tais anticorpos podem, no entanto, ser submetidos à mutagênese in vitro (ou, quando é usado um animal transgênico para sequências de Ig humana, mutagênese somática in vivo) e, portanto, as sequências de aminoácidos das regiões VH e VL dos anticorpos recombinantes são sequências que, apesar de derivadas e relacionadas com as sequências VH e VL da linhagem germinativa humana, pode não existir naturalmente no repertório da linhagem germinativa de anticorpos humanos in vivo.
[0032] Um “anticorpo heterólogo” é definido em relação ao organismo transgênico não humano produzindo tal anticorpo. Este termo refere- se a um anticorpo possuindo uma sequência de aminoácidos ou uma sequência de ácidos nucleicos codificante correspondente àquela encontrada em um organismo que não seja o animal transgênico não humano, e, geralmente, a partir de uma espécie diferente da espécie do animal transgênico não humano.
[0033] O termo “anticorpo heterohíbrido” refere-se a um anticorpo possuindo cadeias leves e pesadas de diferentes origens organismais. Por exemplo, um anticorpo possuindo uma cadeia pesada humana associada a uma cadeia leve murina é um anticorpo heterohíbrido. Exemplos de anticorpos heterohíbridos incluem anticorpos quiméricos e humanizados.
[0034] O termo anticorpo refere-se também a anticorpos humanizados. Formas “humanizadas” de anticorpos não humanos (por exemplo, murino ou de coelho) são imunoglobulinas quiméricas, cadeias de imunoglobulina ou fragmentos destas (tais como Fv, Fab, Fab’, F(ab’)2 ou outras subsequências de anticorpos de ligação ao antígeno) que contêm a sequência mínima derivada da imunoglobulina não humana. Muitas vezes, os anticorpos humanizados são imunoglobulinas humanas (anticorpo receptor), nas quais os resíduos a partir de uma região determinante de complementaridade (CDR) do anticorpo receptor são substituídos por resíduos de uma CDR de espécie não humana (anticorpo doador), tal como camundongo, rato ou coelho que possui a especificidade, afinidade e a capacidade desejada. Em alguns casos, resíduos da região estrutural Fv da imunoglobulina humana são substituídos por resíduos não humanos correspondentes. Além disso, o anticorpo humanizado pode também compreender resíduos que não são encontrados no anticorpo receptor nem nas sequências da CDR ou região de arcabouço importadas. Estas modificações são feitas para refinar e otimizar adicionalmente o desempenho do anticorpo. Em geral, o anticorpo humanizado compreenderá substancialmente todos dentre pelo menos um, e tipicamente dois domínios variáveis, em que todas ou substancialmente todas as regiões CDRs correspondem a de uma imunoglobulina não humana e todas ou substancialmente todas as regiões FR são de uma sequência de imunoglobulina humana. O anticorpo humanizado também pode compreender pelo menos uma porção de uma região constante de imunoglobulina (Fc), tipicamente a de uma imunoglobulina humana. Para detalhes adicionais, vide: Jones, Nature 321 (1986), 522-525; Reichmann Nature 332 (1998), 323-327 e Presta Curr Op Struct Biol 2 (1992), 593-596.
[0035] Um método popular para a humanização de anticorpos envolve o enxerto de CDR, em que um sítio de ligação ao antígeno funcional a partir de um anticorpo não humano 'doador' é enxertado em um anticorpo ‘aceptor’ humano. Métodos de enxerto de CDR são conhecidos métodos conhecidos no estado da técnica e descritos, por exemplo, nas Patentes US 5.225.539, US 5.693,761 e US 6.407.213. Outro método relacionado é a produção de anticorpos humanizados a partir de animais transgênicos que são geneticamente modificados para conter um ou mais loci de imunoglobulina humanizada, que são capazes de sofrer rearranjo de genes e conversão de genes (vide, por exemplo, US 7.129.084).
[0036] Consequentemente, no contexto da presente invenção, o termo “anticorpo” refere-se às moléculas de imunoglobulina completas, bem como partes dessas moléculas de imunoglobulina. Além disso, o termo refere- se, conforme discutido anteriormente, às moléculas de anticorpos modificadas e/ou alteradas. O termo também se refere aos anticorpos gerados/sintetizados de maneira recombinante ou sintética. O termo também diz respeito a anticorpos intactos, bem como a fragmentos de anticorpos derivados deste, como cadeias leve e pesada separadas, Fab, Fab/c, Fv, Fab ', F(ab')2. O termo “anticorpo” também compreende anticorpos bifuncionais, anticorpos trifuncionais, anticorpos completamente humanos, anticorpos quiméricos, anticorpos humanizados e construções de anticorpo, como Fvs de cadeia única (scFv) ou proteínas de fusão-anticorpo.
[0037] Fragmentos de anticorpo “Fv de cadeia única” ou “scFv” possuem, no contexto da presente invenção, os domínios VH e VL de um anticorpo, no qual estes domínios estão presentes em uma única cadeia de polipeptídeo. Geralmente, o polipeptídeo scFv compreende ainda um polipeptídeo ligante entre os domínios VH e VL, permitindo que o scFv forme a estrutura desejada para ligação ao antígeno. As técnicas descritas para a produção de anticorpos de cadeia única encontram-se descritas, por exemplo, em Plückthun em: The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, Rosenburg & Moore eds. Springer-Verlag, NY 113 (1994), 269-315.
[0038] Um “fragmento Fab”, tal como utilizado na presente invenção é constituído por uma cadeia leve e o CH1 e regiões variáveis de uma cadeia pesada. A cadeia pesada de uma molécula Fab não pode formar uma ligação de dissulfeto com outra molécula da cadeia pesada.
[0039] Uma região “Fc” contém dois fragmentos de cadeias pesadas compreendendo os domínios CH2 e CH3 de um anticorpo. Os dois fragmentos de cadeia pesada são mantidos juntos por duas ou mais ligações de dissulfeto e por interações hidrofóbicas dos domínios CH3.
[0040] Um fragmento “Fab” contém uma cadeia leve e uma porção de uma cadeia pesada que contém o domínio VH e o domínio CH1, e também a região entre os domínios CH1 e CH2, de modo a que uma ligação de dissulfeto intercadeias possa ser formada entre as duas cadeias pesadas de dois fragmentos Fab' para formar uma molécula F(ab')2.
[0041] Um “fragmento F(ab')2” contém duas cadeias leves e duas cadeias pesadas contendo uma porção da região constante entre os domínios CH1 e CH2, de tal modo que uma ligação de dissulfeto intercadeias é formada entre as duas cadeias pesadas. Um fragmento F(ab')2 deste modo é constituído por dois fragmentos Fab' que são mantidos juntos por uma ponte de dissulfeto entre as duas cadeias pesadas.
[0042] A “região Fv” compreende as regiões variáveis de ambas as cadeias, pesada e leve, mas falta-lhe as regiões constantes.
[0043] Deve ser observado que a molécula de anticorpo biespecífico da invenção pode compreender, além do primeiro domínio (derivado de Ig) definido no presente e do segundo domínio (derivado de Ig), um(alguns) domínio(s) adicional(ais), por exemplo, para o isolamento e/ou preparação de construções produzidas de forma recombinante.
[0044] Devemos observar que, de acordo com a presente invenção, não só o primeiro domínio descrito acima que interage especificamente com/liga- se a um de antígeno (humano) em células T CD8+ que não ocorre naturalmente em e/ou sobre células T CD8+ da molécula ou construção inventiva (ou seja, a molécula de anticorpo biespecífico descrita no presente) pode ser modificado. Prevê-se também que o primeiro domínio (derivado de Ig), o segundo domínio (derivado de Ig) e/ou uma(algumas) região(ões) ligante(s) ligação é(são) alterado(s), por exemplo, um anticorpo humanizado, um anticorpo CDR- enxertado ou um anticorpo completamente humano.
[0045] As “abordagens de humanização” são bem conhecidas no estado da técnica e descritas em particular para moléculas de anticorpo, por exemplo, moléculas de derivadas de Ig. O termo “humanização” refere-se às formas humanizadas de anticorpos não humanos (por exemplo, murinos), ou fragmentos dos mesmos (tais como Fv, Fab, Fab', F(ab'), scFv, ou outras sequências parciais de ligação ao antígeno de anticorpos) que contêm uma parte da sequência derivada do anticorpo não humano. Anticorpos humanizados incluem imunoglobulinas humanas nas quais resíduos a partir de uma região determinante de complementaridade (CDR) da imunoglobulina humana são substituídos por resíduos de uma CDR de espécie não humana, tal como camundongo, rato ou coelho possuindo a especificidade, afinidade e capacidade de ligação desejada. Em geral, o anticorpo humanizado compreenderá substancialmente todos dentre pelo menos um, e geralmente dois domínios variáveis, em que todas ou substancialmente todas as regiões CDRs correspondem a de uma imunoglobulina não humana e todas ou substancialmente todas as regiões FR são de uma sequência de imunoglobulina humana. O anticorpo humanizado ideal também compreenderá pelo menos, uma porção de uma região constante (Fc) de imunoglobulina, tipicamente, de uma imunoglobulina humana; vide, inter alia, Joneset al, Nature, 321 (1986) 522-525; Presta, Curr. Op. Struct. Biol. 2 (1992),593-596. Métodos para a humanização de anticorpos não humanos são bem conhecidos no estado da técnica. Geralmente, um anticorpo humanizado tem um ou mais aminoácidos de uma fonte que não é humana introduzidos nele, e ainda retêm a atividade de ligação original do anticorpo. Os métodos para a humanização de anticorpos/moléculas de anticorpo estão descritos em maiores detalhes em Joneset al, Nature 321 (1986) 522-525; Reichmannet al, Nature 332 (1988),323-327; e Verhoeyenet al., Science 239 (1988),1534-1536. Exemplos específicos de anticorpos humanizados, por exemplo, anticorpos direcionados contra a EpCAM, são conhecidos no estado da técnica, vide, por exemplo, (LoBuglio, Proceedings of the American Society of Clinical Oncology - Resumo 1562 (1997) e Khor, Proceedings of the American Society of Clinical Oncology - Resumo 847 (1997)).
[0046] Consequentemente, no contexto da presente invenção, são fornecidas em particular as moléculas de anticorpo biespecífico, que são humanizadas e podem ser utilizadas com sucesso em composições farmacêuticas. No contexto da invenção, as moléculas de anticorpo biespecífico (humanizadas) podem ser utilizadas em um kit, tal como definido a seguir.
[0047] No contexto da presente invenção, o primeiro domínio (derivado de Ig) da molécula de anticorpo biespecífico descrita no presente compreende um sítio de interação ao antígeno com especificidade para um antígeno que não ocorre naturalmente em e/ou sobre células T CD8+.
[0048] O termo “antígeno que não ocorre naturalmente em e/ou sobre células T CD8+” conforme utilizado na presente invenção refere-se a moléculas que são incorporadas nas células T CD8+ que não são naturalmente apresentadas na e/ou sobre a superfície das células T CD8+, e que não são (endogenamente) expressas na ou sobre a superfície de células T CD8+ normais (não transduzidas). Assim, o antígeno/marcador que não ocorre naturalmente em e/ou sobre células T CD8+ é artificialmente introduzido nas células T CD8+. No contexto da presente invenção, as referidas células T CD8+ são isoladas/obtidas a partir de um sujeito a ser tratado, tal como definido na presente invenção. No contexto da presente invenção, os peptídeos do antígeno que ocorre naturalmente/que são endogenamente expressos em um receptor de células T de células T CD8+ está excluído do termo “antígeno que não ocorre naturalmente sobre as células T CD8+” referido acima. Consequentemente, estas moléculas que são artificialmente introduzidas e, subsequentemente, apresentadas em e/ou sobre a superfície das referidas células T CD8+, compreendem domínios ou epítopos acessíveis (in vitro ou in vivo) para domínios de ligação (derivados de Ig), de preferência, anticorpos, fragmentos de anticorpos ou derivados destes que não ocorrem naturalmente em e/ou sobre células T CD8+. No contexto da presente invenção, essas moléculas introduzidas artificialmente são apresentadas na e/ou sobre a superfície das referidas células T CD8+ após a transdução (retroviral) conforme descrito abaixo.
[0049] No contexto da presente invenção, o termo “antígeno que não ocorre naturalmente em e/ou sobre células T CD8+” refere-se a um antígeno/marcador que não ocorre naturalmente/que não é expresso endogenamente nas e/ou sobre as células T CD8+ com mais do que 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950 ou 1000 moléculas de antígeno/por célula T CD8+. Assim, o antígeno/marcador não ocorre/não é endogenamente expresso nas e/ou sobre as células T CD8+ em mais do que 1,0, 1,1, 1,2, 1,3, 1,4, 1,5, 1,6, 1,7, 1,8, 1,9 ou 2,0 0/00 (permilagem) de uma população de células T CD8+ (não transduzidas) normais. A presença e quantidade de um antígeno/marcador que ocorre naturalmente em e/ou sobre células T CD8+ pode ser monitorada por métodos conhecidos no estado da técnica, tais como análise FACS, ELISA, microscopia confocal, HPLC analítica, etc.
[0050] Exemplos para estas moléculas compreendem proteínas não imunogênicas, de preferência de origem humana. Alternativamente, as referidas moléculas podem ser per se uma molécula de proteína funcionalmente inerte ou podem ser feitas funcionalmente inertes por meio de técnicas de recombinação gênica conhecidas no estado da técnica (exemplos seriam moléculas de proteína com deleção do domínio de sinalização intracelular (conforme exemplificado nos exemplos anexos pelo EGFR (humano) sem o domínio de sinalização intracelular, referido aqui como construção del-hEGFR (SEQ ID NOs: 11 e 12)) ou mutações pontuais de inativação do domínio extracelular que tornam a molécula funcionalmente inerte). Outro exemplo de uma versão de EGFR (humano) mutante é a construção del-hGFRvIII (SEQ ID NO: 17 como sequência de DNA e SEQ ID NO: 18 como sequência de aminoácidos (codificada)) utilizada nos exemplos anexos. hEGFRvIII é um mutante do receptor do receptor do fator de crescimento epidérmico humano encontrado no glioblastoma e no carcinoma de mama, ovário e pulmão. O receptor mutante tem uma deleção no seu domínio extracelular (Lorimeret al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93:14815-14820 (1996)).
[0051] Exemplos de marcadores que preenchem estes critérios mencionados acima são fornecidos abaixo e compreendem, mas não estão limitados a, cripto (proteína da família críptica), membros da família CD (agrupamento de diferenciação) (células não T), EGFR ou TSH-R.
[0052] No contexto da presente invenção, molécula(s) de anticorpo biespecífico descrita(s) na presente invenção liga(m)-se a um antígeno que não ocorre naturalmente em e/ou sobre células T CD8+ selecionadas a partir do grupo consistindo em cripto (proteína da família críptica), membros da família CD (agrupamento de diferenciação) (células não T), EGFR e TSH-R. Consequentemente, a(s) molécula(s) de anticorpo biespecífico descrita(s) interage(m) com/liga(m)-se aos membros da família CD que (exclusivamente) não ocorre(m) naturalmente em e/ou sobre células T (células T CD8+) (referidas pelo termo “célula não T”), cripto, EGFR ou TSH-R. No contexto da presente invenção, a(s) molécula(s) de anticorpo biespecífico descrita(s) na presente invenção interage(m) com/liga(m)-se aos membros da família CD que não são endogenamente expressos em e/ou sobre a superfície de células T (células T CD8+) (referidas pelo termo “não células T”), cripto, EGFR ou TSH-R.
[0053] A(s) sequência(s) dos membros (humanos) de membros cripto (proteína da família críptica), família CD (agrupamento de diferenciação)- (não células T), EGFR ou TSH-R estão disponíveis no banco de dados UniProtKB/Swiss-Prot e podem ser recuperadas a partir do site http://www.uniprot.org/uniprot/?query=reviewed% 3Ayes. Estas sequências (proteína) também se relacionam com sequências modificadas anotadas. A presente invenção também provê métodos e técnicas em que sequências homólogas, e também variantes alélicas genéticas e similares das sequências concisas fornecidas no presente são utilizadas. Preferencialmente, são usadas tais “variantes” e semelhantes das sequências concisas da presente invenção. De preferência, tais “variantes” são variantes genéticas. O perito no assunto pode facilmente deduzir a região codificante pertinente destas sequências (proteínas) a partir destas referencias de banco de dados, que também pode incluir a referência do DNA genômico, bem como do mRNA/cDNA.
[0054] O termo “família CD - (agrupamento de diferenciação) (não células T)”, tal como é utilizado na presente invenção em conexão com o termo “antígeno que não ocorre naturalmente/que não é expresso endogenamente nas e/ou sobre as células T CD8+” refere-se a qualquer uma das sequências CD selecionadas a partir do grupo consistindo em CD9, CD10, CD11, CD12, CD13, CD14, CD15, CD16, CD17, CD18, CD19, CD20, CD21, CD22, CD23, CD24, CD25, CD26, CD27, CD28, CD29, CD30, CD31, CD32, CD33, CD34, CD35, CD36, CD37, CD38, CD39, CD40, CD41, CD43, CD46, CD48, CD49, CD50, CD51, CD54, CD55, CD56, CD57, CD59, CD61, CD63, CD64, CD66, CD67, CD68, CD70, CD72, CD74, CD75, CD76, CD77, CD79, CD81, CD82, CD83, CD84, CD87, CD88, CD89, CD90, CD91, CD92, CD93, CD94, CD95, CD97, CD98, CD99, CD100, CD101, CD102, CD103, CD104, CD105, CD106, CD107, CD108, CD109, CD110, CD111, CD112, CD113, CD114, CD115, CD116, CD117, CD118, CD119, CD121, CD123, CD124, CD125, CD126, CD130, CD131, CD133, CD134, CD135, CD136, CD137, CD138, CD140, CD141, CD142, CD143, CD144, CD146, CD147, CD148, CD151, CD153, CD155, CD156, CD157, CD158, CD159, CD160, CD161, CD162, CD163, CD164, CD166, CD167, CD168, CD169, CD170, CD171, CD172, CD177,CD178,CD179, CD180, CD181, CD182, CD183, CD184, CD185, CD186, CD191, CD192, CD193, CD200, CD201, CD218, CD220, CD221, CD228, CD230, CD231, CD241, CD242, CD243, CD254, CD256, CD257, CD266, CD267, CD268, CD281, CD282, CD283, CD294, CD295, CD296, CD303, CD304, CD305, CD317, CD318, CD319, CD327, CD328, CD329, CD337, CD338, CD339, CD204, CD206, CD207, CD222, CD223, CD224, CD232, CD233, CD234, CD244, CD246, CD248, CD258, CD261, CD262, CD269, CD270, CD271, CD284, CD286, CD288, CD297, CD298, CD299, CD306, CD309, CD312, CD320, CD321, CD322, CD331, CD332, CD333, CD340, CD344, CD349, CD208, CD209, CD217, CD225, CD226, CD227, CD236, CD238, CD239, CD249, CD252, CD253, CD263, CD264, CD265, CD276, CD277, CD280, CD289, CD290, CD292, CD300, CD301, CD302, CD314, CD315, CD316, CD324, CD325, CD326, CD334, CD335, CD336, CD350, CD351, CD352, CD353, CD354, CD355, CD357, CD358, CD360, CD361, CD362 e CD363.
[0055] A(s) sequência(s) da CD9 (humana) (antígeno CD9) pode(m) ser obtida(s) a partir da base de dados Swiss-Prot número de acesso P21926 (versão de acesso 123, versão da sequência 4); A(s) sequência(s) da CD10 (humana) (Neprilisina) pode(m) ser obtida(s) a partir da base de dados Swiss-Prot número de acesso P08473 (versão de acesso 151, versão da sequência 2); A(s) sequência(s) da CD11 (humana) (Alfa integrina-D) pode(m) ser obtida(s) a partir da base de dados Swiss-Prot número de acesso Q13349 (versão de acesso 110, versão da sequência 2); A(s) sequência(s) da CD13 (humana) (Aminopeptidase N) pode(m) ser obtida(s) a partir da base de dados Swiss-Prot número de acesso P15144 (versão de acesso 145, versão da sequência 4); A(s) sequência(s) da CD14 (humana) (Monócito antígeno de diferenciação CD14) pode(m) ser obtida(s) a partir da base de dados Swiss-Prot número de acesso P08571 (versão de acesso 131, versão da sequência 2); A(s) sequência(s) da CD16 (humana) (receptor Fc-gama IIIb) pode(m) ser obtida(s) a partir da base de dados Swiss-Prot número de acesso Q9ULV2 (versão de acesso 51, versão da sequência 1); A(s) sequência(s) da CD18 (humana) (beta Integrina -2) pode(m) ser obtida(s) a partir da base de dados Swiss-Prot número de acesso P05107 (versão de acesso 162, versão da sequência 2); A(s) sequência(s) da CD19 (humana) (antígeno de linfófito B CD19) pode(m) ser obtida(s) a partir da base de dados Swiss-Prot número de acesso P15391 (versão de acesso 128, versão da sequência 6); A(s) sequência(s) da CD20 (humana) (antígeno de linfócito B CD20) pode(m) ser obtida(s) a partir da base de dados Swiss-Prot número de acesso P11836 (versão de acesso 118, versão da sequência 1); A(s) sequência(s) da CD21 (humana) (receptor de complemento tipo 2) pode(m) ser obtida(s) a partir da base de dados Swiss-Prot número de acesso P20023 (versão de acesso 128, versão da sequência 2); A(s) sequência(s) da CD22 (humana) (receptor de Célula B CD22) pode(m) ser obtida(s) a partir da base de dados Swiss-Prot número de acesso P20273 (versão de acesso 136, versão da sequência 2); A(s) sequência(s) da CD23 (humana) (receptor Fc de imunoglobulina épsilon de baixa afinidade) pode(m) ser obtida(s) a partir da base de dados Swiss-Prot número de acesso P06734 (versão de acesso 133, versão da sequência 1); A(s) sequência(s) da CD24 (humana) (Transdutor de sinal CD24) pode(m) ser obtida(s) a partir da base de dados Swiss-Prot número de acesso P25063 (versão de acesso 106, versão da sequência 2); A(s) sequência(s) da CD26 (humana) (Dipeptídil peptidase 4) pode(m) ser obtida(s) a partir da base de dados Swiss-Prot número de acesso P27487 (versão de acesso 140, versão da sequência 2); A(s) sequência(s) da CD27 (humana) (antígeno CD27) pode(m) ser obtida(s) a partir da base de dados Swiss-Prot número de acesso P26842 (versão de acesso 119, versão da sequência 2); A(s) sequência(s) da CD29 (humana) (Integrina beta-1) pode(m) ser obtida(s) a partir da base de dados Swiss-Prot número de acesso P05556 (versão de acesso 154, versão da sequência 2); A(s) sequência(s) da CD30 (humana) (receptor da superfamília do fator de necrose tumoral membro 8) pode(m) ser obtida(s) a partir da base de dados Swiss-Prot número de acesso P28908 (versão de acesso 129; versão da sequência 1); A(s) sequência(s) da CD31 (humana) (Molécula de aderência celular endotelial-plaquetária) pode(m) ser obtida(s) a partir da base de dados Swiss-Prot número de acesso P16284 (versão de acesso 146, versão da sequência 1); A(s) sequência(s) da CD32 (humana) (Receptor II-b da região Fc da imunoglobulina gama de baixa afinidade) pode(m) ser obtida(s) a partir da base de dados Swiss-Prot número de acesso P31994 (versão de acesso 138, versão da sequência 2); A(s) sequência(s) da CD33 (humana) (antígeno de superfície de célula mieloide CD33) pode(m) ser obtida(s) a partir da base de dados Swiss-Prot número de acesso P20138 (versão de acesso 130, versão da sequência 2); A(s) sequência(s) da CD34 (humana) (antígeno da célula progenitora hematopoiética CD34) pode(m) ser obtida(s) a partir da base de dados Swiss-Prot número de acesso P28906 (versão de acesso 108, versão da sequência 2); A(s) sequência(s) da CD35 (humana) (Receptor do complemento tipo 1) pode(m) ser obtida(s) a partir da base de dados Swiss-Prot número de acesso P17927 (versão de acesso 131, versão da sequência 3); A(s) sequência(s) da CD36 (humana) (Glicoproteína plaquetária 4) pode(m) ser obtida(s) a partir da base de dados Swiss-Prot número de acesso P16671 (versão de acesso 133, versão da sequência 2); A(s) sequência(s) da CD38 (humana) (ADP-ribosil ciclase 1) pode(m) ser obtida(s) a partir da base de dados Swiss-Prot número de acesso P28907 (versão de acesso 126, versão da sequência 2); A(s) sequência(s) da CD39 (humana) (Ectonucleosídeo trifosfota difosfohidrolase 1) pode(m) ser obtida(s) a partir da base de dados Swiss-Prot número de acesso P49961 (versão de acesso 114, versão da sequência 1); A(s) sequência(s) da CD40 (humana) (Receptor da superfamília do fator de necrose tumoral membro 5) pode(m) ser obtida(s) a partir da base de dados Swiss-Prot número de acesso P25942 (versão de acesso 147, versão da sequência 1); A(s) sequência(s) da CD41 (humana) (Alfa integrina-IIb) pode(m) ser obtida(s) a partir da base de dados Swiss-Prot número de acesso P08514 (versão de acesso 158, versão da sequência 3); A(s) sequência(s) da CD43 (humana) (Leucosialina) pode(m) ser obtida(s) a partir da base de dados Swiss-Prot número de acesso P16150 (versão de acesso 110, versão da sequência 1); A(s) sequência(s) da CD46 (humana) (Proteína cofator de membrana) pode(m) ser obtida(s) a partir da base de dados Swiss-Prot número de acesso P15529 (versão de acesso 145, versão da sequência 3); A(s) sequência(s) da CD48 (humana) (antígeno CD48) pode(m) ser obtida(s) a partir da base de dados Swiss-Prot número de acesso P09326 (versão de acesso 137, versão da sequência 2); A(s) sequência(s) da CD49 (humana) (Alfa integrina-4) pode(m) ser obtida(s) a partir da base de dados Swiss-Prot número de acesso P13612 (versão de acesso 128, versão da sequência 3); A(s) sequência(s) da CD50 (humana) (Molécula de adesão intercelular 3) pode(m) ser obtida(s) a partir da base de dados Swiss-Prot número de acesso P32942 (versão de acesso 128, versão da sequência 2); A(s) sequência(s) da CD51 (humana) (alfa integrina-V) pode(m) ser obtida(s) a partir da base de dados Swiss-Prot número de acesso P06756 (versão de acesso 149, versão da sequência 2); A(s) sequência(s) da CD54 (humana) (Molécula de adesão intercelular 1) pode(m) ser obtida(s) a partir da base de dados Swiss- Prot número de acesso P05362 (versão de acesso 160, versão da sequência 2); A(s) sequência(s) da CD55 (humana) (Fator acelerador de decaímento do complemento) pode(m) ser obtida(s) a partir da base de dados Swiss-Prot número de acesso P08174 (versão de acesso 143, versão da sequência 4); A(s) sequência(s) da CD56 (humana) (molécula de adesão da célula neural 1) pode(m) ser obtida(s) a partir da base de dados Swiss-prot com o número de acesso P13591 (versão de acesso 132, versão da sequência 3); A(s) sequência(s) da CD57 (humana) (Superfamília G de Receptores Semelhantes a Lectina de Células NK membro 1) pode(m) ser obtida(s) a partir da base de dados Swiss-Prot número de acesso Q96E93 (versão de acesso 72, versão da sequência 1); A(s) sequência(s) da CD59 (humana) (glicoproteína CD59) pode(m) ser obtida(s) a partir da base de dados Swiss-Prot número de acesso P13987 (versão de acesso 139, informação de sequência 1); A(s) sequência(s) da CD61 (humana) (Integrina beta-3) pode(m) ser obtida(s) a partir da base de dados Swiss-Prot número de acesso P05106 (versão de acesso 175, versão da sequência 2); A(s) sequência(s) da CD63 (humana) (antígeno CD63) pode(m) ser obtida(s) a partir da base de dados Swiss-Prot número de acesso P08962 (versão de acesso 122, versão da sequência 2); A(s) sequência(s) da CD64 (humana) (receptor I de Fc da imunoglobulina gama de Alta Afinidade) pode(m) ser obtida(s) a partir da base de dados Swiss-Prot número de acesso P12314 (versão de acesso 128, versão da sequência 2); A(s) sequência(s) da CD66 (humana) (molécula de adesão celular -1 relacionada com o antígeno carcinoembriônico) pode(m) ser obtida(s) a partir da base de dados Swiss-Prot número de acesso P13688 (versão de acesso 133, versão da sequência 2); A(s) sequência(s) da CD67 (humana) (molécula de adesão celular 8 relacionada com o antígeno carcinoembriônico) pode(m) ser obtida(s) a partir da base de dados Swiss-prot acesso n° P31997 (versão de acesso 115, versão da sequência 2); A(s) sequência(s) da CD68 (humana) (Macrosialina) pode(m) ser obtida(s) a partir da base de dados Swiss-Prot número de acesso P34810 (versão de acesso 106, versão da sequência 2); A(s) sequência(s) da CD70 (humana) (antígeno CD70) pode(m) ser obtida(s) a partir da base de dados Swiss-Prot número de acesso P32970 (versão de acesso 101, versão da sequência 2); A(s) sequência(s) da CD72 (humana) (antígeno de diferenciação de Célula B CD72) pode(m) ser obtida(s) a partir da base de dados Swiss-Prot número de acesso P21854 (versão de acesso 113, versão da sequência 1); A(s) sequência(s) da CD74 (humana) (antígeno de histocompatibilidade HLA classe II cadeia gama) pode(m) ser obtida(s) a partir da base de dados Swiss-Prot número de acesso P04233 (versão de acesso 141, versão da sequência 3); A(s) sequência(s) da CD75 (humana) (Beta-galactoside alfa-2,6-sialiltransferase 1) pode(m) ser obtida(s) a partir da base de dados Swiss-Prot número de acesso P15907 (versão de acesso 130, versão da sequência 1); A(s) sequência(s) da CD77 (humana) (Lactosilceramida 4-alfa-galactosiltransferase) pode(m) ser obtida(s) a partir da base de dados Swiss-Prot acesso n° Q9NPC4 (versão de acesso 100, versão da sequência 1); A(s) sequência(s) da CD79 (humana) (cadeia alfa da proteína associada ao receptor do complexo de antígeno de Célula B) pode(m) ser obtida(s) a partir da base de dados Swiss-Prot acesso n° P11912 (versão de acesso 120, versão da sequência 2); A(s) sequência(s) da CD81 (humana) (antígeno CD81) pode(m) ser obtida(s) a partir da base de dados Swiss-Prot acesso n° P60033 (versão de acesso 82, versão da sequência 1); A(s) sequência(s) da CD82 (humana) (antígeno CD82) pode(m) ser obtida(s) a partir da base de dados Swiss-Prot acesso n° P27701 (versão de acesso 98, versão da sequência 1); A(s) sequência(s) da CD83 (humana) (antígeno CD83) pode(m) ser obtida(s) a partir da base de dados Swiss-Prot acesso n° Q01151 (versão de acesso 113, versão da sequência 1); A(s) sequência(s) da CD84 (humana) (família SLAM membro 5) pode(m) ser obtida(s) a partir da base de dados Swiss- Prot acesso n° Q9UIB8 (versão de acesso 87, versão da sequência 1); A(s) sequência(s) da CD87 (humana) (receptor de superfície do ativador de plasminogênio tipo uroquinase) pode(m) ser obtida(s) a partir da base de dados Swiss-Prot acesso n° Q03405 (versão de acesso 129, versão da sequência 1); A(s) sequência(s) da CD88 (humana) (receptor quimiotático anafilatoxina C5a) pode(m) ser obtida(s) a partir da base de dados Swiss-Prot acesso n° P21730 (versão de acesso 116, versão da sequência 2); A(s) sequência(s) da CD89 (humana) (receptor Fc da Imunoglobulina alfa) pode(m) ser obtida(s) a partir da base de dados Swiss-Prot acesso n° P24071 (versão de acesso 121, versão da sequência 1); A(s) sequência(s) da CD90 (humana) (glicoproteína de membrana Thy-1) pode(m) ser obtida(s) a partir da base de dados Swiss-Prot acesso n° P04216 (versão de acesso 128, versão da sequência 2); A(s) sequência(s) da CD91 (humana) (proteína 1 relacionada ao receptor de lipoproteína de baixa densidade) pode(m) ser obtida(s) a partir da base de dados Swiss-Prot acesso n° Q07954 (versão de acesso 133, versão da sequência 2); A(s) sequência(s) da CD92 (humana) (proteína 1 similar ao transportador de colina) pode(m) ser obtida(s) a partir da base de dados Swiss-Prot acesso n° Q8WWI5 (versão de acesso 79, versão da sequência 1); A(s) sequência(s) da CD93 (humana) (receptor do componente C1q do complemento) pode(m) ser obtida(s) a partir da base de dados Swiss-Prot acesso n° Q9NPY3 (versão de acesso 115, versão da sequência 3); A(s) sequência(s) da CD94 (humana) (antígeno de células NK CD94) pode(m) ser obtida(s) a partir da base de dados Swiss-Prot acesso n° Q13241 (versão de acesso 107, versão da sequência 2); A(s) sequência(s) da CD95 (humana) (Superfamília de ligantes do fator de necrose tumoral membro 6) pode(m) ser obtida(s) a partir da base de dados Swiss-Prot acesso n° P48023 (versão de acesso 134, versão da sequência 1); A(s) sequência(s) da CD97 (humana) (antígeno CD97) pode(m) ser obtida(s) a partir da base de dados Swiss-Prot acesso n° P48960 (versão de acesso 125, versão da sequência 4); A(s) sequência(s) da CD98 (humana) (cadeia pesada do antígeno de superfície celular 4F2) pode(m) ser obtida(s) a partir da base de dados Swiss-Prot acesso n° P08195 (versão de acesso 140, versão da sequência 3); A(s) sequência(s) da CD99 (humana) (antígeno CD99) pode(m) ser obtida(s) a partir da base de dados Swiss-Prot acesso n° P14209 (versão de acesso 117, versão da sequência 1); A(s) sequência(s) da CD100 (humana) (Semaforina-4D) pode(m) ser obtida(s) a partir da base de dados Swiss-Prot acesso n° Q92854 (versão de acesso 125, versão da sequência 1); A(s) sequência(s) da CD101 (humana) (superfamília de Imunoglobulina membro 2) pode(m) ser obtida(s) a partir da base de dados Swiss-Prot acesso n° Q93033 (versão de acesso 89, versão da sequência 2); A(s) sequência(s) da CD102 (humana) (Molécula de adesão intercelular 2) pode(m) ser obtida(s) a partir da base de dados Swiss-Prot acesso n° P13598 (versão de acesso 131, versão da sequência 2); A(s) sequência(s) da CD103 (humana) (Alfa integrina-E) pode(m) ser obtida(s) a partir da base de dados Swiss-Prot acesso n° P38570 (versão de acesso 118, versão da sequência 3); A(s) sequência(s) da CD104 (humana) (Integrina beta-4) pode(m) ser obtida(s) a partir da base de dados Swiss-Prot acesso n° P16144_(versão de acesso 160, versão da sequência 5); A(s) sequência(s) da CD105 (humana) (Endoglina) pode(m) ser obtida(s) a partir da base de dados Swiss-Prot acesso n° P17813 (versão de acesso 133, versão da sequência 2); A(s) sequência(s) da CD106 (humana) (proteína 1 de adesão de célula vascular) pode(m) ser obtida(s) a partir da base de dados Swiss-Prot acesso n° P19320 (versão de acesso 158, versão da sequência 1); A(s) sequência(s) da CD107 (humana) (glicoproteína de membrana 1 associada ao lisossomo) pode(m) ser obtida(s) a partir da base de dados Swiss-Prot acesso n° P11279 (versão de acesso 117, versão da sequência 3); A(s) sequência(s) da CD108 (humana) (Semaforina-7A) pode(m) ser obtida(s) a partir da base de dados Swiss-Prot acesso n° O75326 (versão de acesso 107, versão da sequência 1); A(s) sequência(s) da CD109 (humana) (antígeno CD109) pode(m) ser obtida(s) a partir da base de dados Swiss-Prot acesso n° Q6YHK3 (versão de acesso 64, versão da sequência 2); A(s) sequência(s) da CD110 (humana) (receptor da trombopoietina) pode(m) ser obtida(s) a partir da base de dados Swiss-Prot acesso n° P40238 (versão de acesso 122, versão da sequência 1); A(s) sequência(s) da CD111 (humana) (proteína 1 relacionada ao receptor de poliovírus) pode(m) ser obtida(s) a partir da base de dados Swiss-Prot acesso n° Q15223 (versão de acesso 114, versão da sequência 3); A(s) sequência(s) da CD112 (humana) (proteína 2 relacionada ao receptor de poliovírus) pode(m) ser obtida(s) a partir da base de dados Swiss- Prot acesso n° Q92692 (versão de acesso 123, versão da sequência 1); A(s) sequência(s) da CD113 (humana) (proteína 3 relacionada ao receptor de poliovirus) pode(m) ser obtida(s) a partir da base de dados Swiss-Prot acesso n° Q9NQS3 (versão de acesso 78, versão da sequência 1); A(s) sequência(s) da CD114 (humana) (receptor do fator estimulante de colônias de granulócitos) pode(m) ser obtida(s) a partir da base de dados Swiss-Prot acesso n° Q99062 (versão de acesso 129, versão da sequência 1); A(s) sequência(s) da CD115 (humana) (receptor do fator 1 estimulante de colônias de macrófagos) pode(m) ser obtida(s) a partir da base de dados Swiss-Prot acesso n° P07333 (versão de acesso 145, versão da sequência 2); A(s) sequência(s) da CD116 (humana) (subunidade alfa do receptor do fator estimulante de colônias de granulócitos e macrófagos) pode(m) ser obtida(s) a partir da base de dados Swiss-Prot acesso n° P15509 (versão de acesso 128, versão da sequência 1); A(s) sequência(s) da CD117 (humana) (kit receptor do fator de crescimento de células tronco / mastócito) pode(m) ser obtida(s) a partir da base de dados Swiss-Prot acesso n° P10721 (versão de acesso 150, versão da sequência 1); A(s) sequência(s) da CD118 (humana) (receptor do fator inibidor da leucemia) pode(m) ser obtida(s) a partir da base de dados Swiss-Prot acesso n° P42702 (versão de acesso 115, versão da sequência 1); A(s) sequência(s) da CD119 (humana) (receptor 1 de Interferon gama) pode(m) ser obtida(s) a partir da base de dados Swiss-Prot acesso n° P15260 (versão de acesso 140, versão da sequência 1); A(s) sequência(s) da CD121 (humana) (receptor da Interleucina-1 tipo 1) pode(m) ser obtida(s) a partir da base de dados Swiss-Prot acesso n° P14778 (versão de acesso 151, versão da sequência 1); A(s) sequência(s) da CD123 (humana) (subunidade alfa do receptor da Interleucina-3) pode(m) ser obtida(s) a partir da base de dados Swiss-Prot acesso n° P26951 (versão de acesso 110, versão da sequência 1); A(s) sequência(s) da CD124 (humana) (subunidade alfa do receptor de Interleucina-4) pode(m) ser obtida(s) a partir da base de dados Swiss-Prot acesso n° P24394 (versão de acesso 144, versão da sequência 1); A(s) sequência(s) da CD125 (humana) (subunidade alfa do receptor de Interleucina-5) pode(m) ser obtida(s) a partir da base de dados Swiss-Prot acesso n° Q01344 (versão de acesso 120, versão da sequência 2 A(s) sequência(s) da CD126 (humana) (subunidade alfa do receptor de Interleucina- 6) pode(m) ser obtida(s) a partir da base de dados Swiss-Prot acesso n° P08887 (versão de acesso 143, versão da sequência 1); A(s) sequência(s) da CD130 (humana) (subunidade beta do receptor de Interleucina-6) pode(m) ser obtida(s) a partir da base de dados Swiss-Prot acesso n° P40189 (versão de acesso 142, versão da sequência 2); A(s) sequência(s) da CD131 (humana) (subunidade beta do receptor comum de Citocina) pode(m) ser obtida(s) a partir da base de dados Swiss-Prot acesso n° P32927 (versão de acesso 128, versão da sequência 2); A(s) sequência(s) da CD133 (humana) (Prominina-1) pode(m) ser obtida(s) a partir da base de dados Swiss-Prot acesso n° O43490 (versão de acesso 110, versão da sequência 1); A(s) sequência(s) da CD134 (humana) (Receptor da superfamília do fator de necrose tumoral membro 4) pode(m) ser obtida(s) a partir da base de dados Swiss-Prot acesso n° P43489 (versão de acesso 106, versão da sequência 1); A(s) sequência(s) da CD135 (humana) (Receptor tipo proteína tirosina quinase FLT3) pode(m) ser obtida(s) a partir da base de dados Swiss-Prot acesso n° P36888 (versão de acesso 119, versão da sequência 2); A(s) sequência(s) da CD136 (humana) (receptor da proteína estimulante de macrófagos) pode(m) ser obtida(s) a partir da base de dados Swiss-Prot acesso n° Q04912 (versão de acesso 129, versão da sequência 2); A(s) sequência(s) da CD137 (humana) (Receptor da superfamília do fator de necrose tumoral membro 9) pode(m) ser obtida(s) a partir da base de dados Swiss-Prot acesso n° Q07011 (versão de acesso 109, versão da sequência 1); A(s) sequência(s) da CD138 (humana) (Sindecan-1) pode(m) ser obtida(s) a partir da base de dados Swiss-Prot acesso n° P18827 (versão de acesso 114, versão da sequência 3); A(s) sequência(s) da CD140 (humana) (receptor beta do fator Crescimento derivado de plaquetas) pode(m) ser obtida(s) a partir da base de dados Swiss-Prot acesso n° P09619 (versão de acesso 154, versão da sequência 1); A(s) sequência(s) da CD141 (humana) (Trombomodulina) pode(m) ser obtida(s) a partir da base de dados Swiss-Prot acesso n° P07204 (versão de acesso 162, versão da sequência 2); A(s) sequência(s) da CD142 (humana) (Fator tecidual) pode(m) ser obtida(s) a partir da base de dados Swiss-Prot acesso n° P13726 (versão de acesso 137, versão da sequência 1); A(s) sequência(s) da CD143 (humana) (Enzima conversora de angiotensina) pode(m) ser obtida(s) a partir da base de dados Swiss-Prot acesso n° P12821 (versão de acesso 157, versão da sequência 1); A(s) sequência(s) da CD144 (humana) (Caderina-5) pode(m) ser obtida(s) a partir da base de dados Swiss-Prot acesso n° P33151 (versão de acesso 108, versão da sequência 5); A(s) sequência(s) da CD146 (humana) (Glicoproteína da superfície celular MUC18) pode(m) ser obtida(s) a partir da base de dados Swiss-Prot acesso n° P43121 (versão de acesso 109, versão da sequência 2); A(s) sequência(s) da CD147 (humana) (Basigin) pode(m) ser obtida(s) a partir da base de dados Swiss-Prot acesso n° P35613 (versão de acesso 134, versão da sequência 2); A(s) sequência(s) da CD148 (humana) (Receptor tipo tirosina da proteína fosfatase eta) pode(m) ser obtida(s) a partir da base de dados Swiss-Prot acesso n° Q12913 (versão de acesso 124, versão da sequência 3); A(s) sequência(s) da CD151 (humana) (antígeno CD151) pode(m) ser obtida(s) a partir da base de dados Swiss-Prot acesso n° P48509 (versão de acesso 108, versão da sequência 3); A(s) sequência(s) da CD153 (humana) (Superfamília de ligantes do fator de necrose tumoral membro 8) pode(m) ser obtida(s) a partir da base de dados Swiss-Prot acesso n° P32971 (versão de acesso 90, versão da sequência 1); A(s) sequência(s) da CD155 (humana) (receptor de Poliovírus) pode(m) ser obtida(s) a partir da base de dados Swiss-Prot acesso n° P15151 (versão de acesso 132, versão da sequência 2); A(s) sequência(s) da CD156 (humana) (proteína 8 contendo desintegrina e domínio metaloproteinase) pode(m) ser obtida(s) a partir da base de dados Swiss-Prot acesso n° P78325 (versão de acesso 115, versão da sequência 1); A(s) sequência(s) da CD157 (humana) (ADP-ribosil ciclase 2) pode(m) ser obtida(s) a partir da base de dados Swiss-Prot acesso n° Q10588 (versão de acesso 116, versão da sequência 2); A(s) sequência(s) da CD158 (humana) (Receptores 3DL3 das células assassinas naturais (NK) semelhantes a imunoglobulinas) pode(m) ser obtida(s) a partir da base de dados Swiss-Prot acesso n° Q8N743 (versão de acesso 91, versão da sequência 2); A(s) sequência(s) da CD159 (humana) (proteína de membrana integral NKG2- A/NKG2-B tipo II) pode(m) ser obtida(s) a partir da base de dados Swiss-Prot acesso n° P26715 (versão de acesso 116, versão da sequência 2); A(s) sequência(s) da CD160 (humana) (antígeno CD160) pode(m) ser obtida(s) a partir da base de dados Swiss-Prot acesso n° O95971 (versão de acesso 98, versão da sequência 1); A(s) sequência(s) da CD161 (humana) (receptor da subfamília B membro 1 similar à lectina de células NK) pode(m) ser obtida(s) a partir da base de dados Swiss-Prot acesso n° Q12918 (versão de acesso 81, versão da sequência 1); A(s) sequência(s) da CD162 (humana) (ligante 1 da glicoproteína P-seletina) pode(m) ser obtida(s) a partir da base de dados Swiss- Prot acesso n° Q14242 (versão de acesso 103, versão da sequência 1); A(s) sequência(s) da CD163 (humana) (proteína M130 tipo 1 do receptor Scavenger rico em cisteína ) pode(m) ser obtida(s) a partir da base de dados Swiss-Prot acesso n° Q86VB7 (versão de acesso 77, versão da sequência 2); A(s) sequência(s) da CD164 (humana) (núcleo da proteína 24 Sialomucina) pode(m) ser obtida(s) a partir da base de dados Swiss-Prot acesso n° Q04900 (versão de acesso 89), versão da sequência 2); A(s) sequência(s) da CD166 (humana) (antígeno CD166) pode(m) ser obtida(s) a partir da base de dados Swiss-Prot acesso n° Q13740 (versão de acesso 111, versão da sequência 2); A(s) sequência(s) da CD167 (humana) (receptor 2 contendo o domínio discoidina) pode(m) ser obtida(s) a partir da base de dados Swiss-Prot acesso n° Q16832 (versão de acesso 120, versão da sequência 2); A(s) sequência(s) da CD168 (humana) (receptor de motilidade mediado por hialuronan) pode(m) ser obtida(s) a partir da base de dados Swiss-Prot acesso n° O75330 (versão de acesso 99, versão da sequência 2); A(s) sequência(s) da CD169 (humana) (Sialoadesina) pode(m) ser obtida(s) a partir da base de dados Swiss-Prot acesso n° Q9BZZ2 (versão de acesso 103, versão da sequência 2); A(s) sequência(s) da CD170 (humana) (lectina 5 similar a Ig de ligação ao ácido siálico) pode(m) ser obtida(s) a partir da base de dados Swiss-Prot acesso n° O15389 (versão de acesso 106, versão da sequência 1); A(s) sequência(s) da CD171 (humana) (molécula L1 de adesão a célula neural ) pode(m) ser obtida(s) a partir da base de dados Swiss- Prot acesso n° P32004 (versão de acesso 139, versão da sequência 2); A(s) sequência(s) da CD172 (humana) (proteína beta-1 sinal-regulatória) pode(m) ser obtida(s) a partir da base de dados Swiss-Prot acesso n° 000241 (versão de acesso 112, versão da sequência 5); A(s) sequência(s) da CD177 (humana) (antígeno CD177) pode(m) ser obtida(s) a partir da base de dados Swiss-Prot acesso n° Q8N6Q3 (versão de acesso 65, versão da sequência 2); A(s) sequência(s) da CD178 (humana) (Superfamília de ligantes do fator de necrose tumoral membro 6) pode(m) ser obtida(s) a partir da base de dados Swiss-Prot acesso n° P48023 (versão de acesso 134, versão da sequência 1); A(s) sequência(s) da CD179 (humana) (cadeia iota de Imunoglobulina) pode(m) ser obtida(s) a partir da base de dados Swiss-Prot acesso n° P12018 (versão de acesso 115, versão da sequência 2); A(s) sequência(s) da CD180 (humana) (antígeno CD180) pode(m) ser obtida(s) a partir da base de dados Swiss-Prot acesso n° Q99467 (versão de acesso 101, versão da sequência 2); A(s) sequência(s) da CD181 (humana) (receptor tipo 1 de quimiocina C-X-C) pode(m) ser obtida(s) a partir da base de dados Swiss-Prot acesso n° P25024 (versão de acesso 125, versão da sequência 2); A(s) sequência(s) da CD182 (humana) (receptor tipo 2 de quimiocina) pode(m) ser obtida(s) a partir da base de dados Swiss-Prot acesso n° P25025 (versão de acesso 123, versão da sequência 2); A(s) sequência(s) da CD183 (humana) (receptor tipo 3 de quimiocina C-X-C) pode(m) ser obtida(s) a partir da base de dados Swiss-Prot acesso n° P49682 (versão de acesso 118, versão da sequência 2); A(s) sequência(s) da CD184 (humana) (receptor tipo 4 de quimiocina C-X-C) pode(m) ser obtida(s) a partir da base de dados Swiss-Prot acesso n° P61073 (versão de acesso 95, versão da sequência 1); A(s) sequência(s) da CD185 (humana) (receptor tipo 5 de quimiocina C-X-C) pode(m) ser obtida(s) a partir da base de dados Swiss-Prot acesso n° P32302 (versão de acesso 109, versão da sequência 1); A(s) sequência(s) da CD186 (humana) (receptor tipo 6 de quimiocina C-X-C) pode(m) ser obtida(s) a partir da base de dados Swiss-Prot acesso n° 000574 (versão de acesso 104, versão da sequência 1); A(s) sequência(s) da CD191 (humana) (receptor tipo 1 de quimiocina C-C) pode(m) ser obtida(s) a partir da base de dados Swiss-Prot acesso n° P32246 (versão de acesso 106, versão da sequência 1); A(s) sequência(s) da CD192 (humana) (receptor tipo 2 de quimiocina C-C) pode(m) ser obtida(s) a partir da base de dados Swiss-Prot acesso n° P41597 (versão de acesso 128, versão da sequência 1); A(s) sequência(s) da CD193 (humana) (receptor tipo 3 de quimiocina C-C) pode(m) ser obtida(s) a partir da base de dados Swiss-Prot acesso n° P51677 (versão de acesso 112, versão da sequência 1); A(s) sequência(s) da CD200 (humana) (glicoproteína de membrana OX-2) pode(m) ser obtida(s) a partir da base de dados Swiss-Prot acesso n° P41217 (versão de acesso 110, versão da sequência 4); A(s) sequência(s) da CD201 (humana) (receptor endotelial da da proteína C) pode(m) ser obtida(s) a partir da base de dados Swiss-Prot acesso n° Q9UNN8 (versão de acesso 110, versão da sequência 1); A(s) sequência(s) da CD204 (humana) (receptor scavenger de macrófagos tipos I e II) pode(m) ser obtida(s) a partir da base de dados Swiss-Prot acesso n° P21757 (versão de acesso 122, versão da sequência 1); A(s) sequência(s) da CD206 (humana) (receptor 1 de manose de Macrófagos) pode(m) ser obtida(s) a partir da base de dados Swiss-Prot acesso n° P22897 (versão de acesso 138, versão da sequência 1); A(s) sequência(s) da CD207 (humana) (membro K da família 4 de domínio das lectinas tipo C) pode(m) ser obtida(s) a partir da base de dados Swiss-Prot acesso n° Q9UJ71 (versão de acesso 85, versão da sequência 2); A(s) sequência(s) da CD208 (humana) (glicoproteína de membrana 3 associada aos lisossomos) pode(m) ser obtida(s) a partir da base de dados Swiss-Prot acesso n° Q9UQV4 (versão de acesso 69, versão da sequência 3); A(s) sequência(s) da CD209 (humana) (antígeno CD209) pode(m) ser obtida(s) a partir da base de dados Swiss-Prot acesso n° Q9NNX6 (versão de acesso 103, versão da sequência 1); A(s) sequência(s) da CD217 (humana) (receptor A da Interleucina-17) pode(m) ser obtida(s) a partir da base de dados Swiss-Prot acesso n° Q96F46 (versão de acesso 94, versão da sequência 2); A(s) sequência(s) da CD218 (humana) (receptor 1 da Interleucina-18) pode(m) ser obtida(s) a partir da base de dados Swiss-Prot acesso n° Q13478 (versão de acesso 104, versão da sequência 1); A(s) sequência(s) da CD220 (humana) (receptor de Insulina) pode(m) ser obtida(s) a partir da base de dados Swiss-Prot acesso n° P06213 (versão de acesso 175, versão da sequência 4); A(s) sequência(s) da CD221 (humana) (receptor do fator de crescimento semelhante à insulina tipo 1) pode(m) ser obtida(s) a partir da base de dados Swiss-Prot acesso n° P08069 (versão de acesso 145, versão da sequência 1); A(s) sequência(s) da CD222 (humana) (receptor da manose-6-fosfato independente de cátion) pode(m) ser obtida(s) a partir da base de dados Swiss-Prot acesso n° P11717 (versão de acesso 137, versão da sequência 3); A(s) sequência(s) da CD223 (humana) (proteína do gene 3 de ativação de linfócito) pode(m) ser obtida(s) a partir da base de dados Swiss-Prot acesso n° P18627 (versão de acesso 108, versão da sequência 5); A(s) sequência(s) da CD224 (humana) (Gama-glutamiltranspeptidase 1) pode(m) ser obtida(s) a partir da base de dados Swiss-Prot acesso n° P19440 (versão de acesso 137, versão da sequência 2); A(s) sequência(s) da CD225 (humana) (proteína transmembrana 1 induzida por Interferon) pode(m) ser obtida(s) a partir da base de dados Swiss-Prot acesso n° P13164 (versão de acesso 101, versão da sequência 3); A(s) sequência(s) da CD226 (humana) (antígeno CD226) pode(m) ser obtida(s) a partir da base de dados Swiss-Prot acesso n° Q15762 (versão de acesso 89, versão da sequência 2); A(s) sequência(s) da CD227 (humana) (Mucina-1) pode(m) ser obtida(s) a partir da base de dados Swiss-Prot acesso n° P15941 (versão de acesso 136, versão da sequência 3); A(s) sequência(s) da CD228 (humana) (Melanotransferrina) pode(m) ser obtida(s) a partir da base de dados Swiss-Prot acesso n° P08582 (versão de acesso 124, versão da sequência 2); A(s) sequência(s) da CD230 (humana) (proteína priônica principal) pode(m) ser obtida(s) a partir da base de dados Swiss-Prot acesso n° P04156 (versão de acesso 161, versão da sequência 1); A(s) sequência(s) da CD231 (humana) (Tetraspanina-7) pode(m) ser obtida(s) a partir da base de dados Swiss-Prot acesso n° P41732 (versão de acesso 115, versão da sequência 2); A(s) sequência(s) da CD232 (humana) (Plexina-C1) pode(m) ser obtida(s) a partir da base de dados Swiss-Prot acesso n° O60486 (versão de acesso 80, versão da sequência 1); A(s) sequência(s) da CD233 (humana) (proteína de transporte de anions da banda 3) pode(m) ser obtida(s) a partir da base de dados Swiss-Prot acesso n° P02730 (versão de acesso 167, versão da sequência 3); A(s) sequência(s) da CD234 (humana) (antígeno Duffy/receptor de quimiocina) pode(m) ser obtida(s) a partir da base de dados Swiss-Prot acesso n° Q16570 (versão de acesso 114, versão da sequência 3); A(s) sequência(s) da CD236 (humana) (glicoforina-C) pode(m) ser obtida(s) a partir da base de dados Swiss- Prot acesso n° P04921 (versão de acesso 116, versão da sequência 1); A(s) sequência(s) da CD238 (humana) (glicoproteína Kell de grupo sanguíneo) pode(m) ser obtida(s) a partir da base de dados Swiss-Prot acesso n° P23276 (versão de acesso 124, versão da sequência 2); A(s) sequência(s) da CD239 (humana) (molécula de adesão celular Basal) pode(m) ser obtida(s) a partir da base de dados Swiss-Prot acesso n° P50895 (versão de acesso 117, versão da sequência 2); A(s) sequência(s) da CD241 (humana) (transportador de amônio Rh tipo A) pode(m) ser obtida(s) a partir da base de dados Swiss-Prot acesso n° Q02094 (versão de acesso 98, versão da sequência 2); A(s) sequência(s) da CD242 (humana) (Molécula de adesão intercelular 4) pode(m) ser obtida(s) a partir da base de dados Swiss-Prot acesso n° Q14773 (versão de acesso 106, versão da sequência 1); A(s) sequência(s) da CD243 (humana) (proteína 1 de resistência a multidrogas) pode(m) ser obtida(s) a partir da base de dados Swiss- Prot acesso n° P08183 (versão de acesso 146, versão da sequência 3; A(s) sequência(s) da CD244 (humana) (receptor 2B4 das células NK) pode(m) ser obtida(s) a partir da base de dados Swiss-Prot acesso n° Q9BZW8 (versão de acesso 94, versão da sequência 2); A(s) sequência(s) da CD246 (humana) (receptor ALK tirosina-quinase) pode(m) ser obtida(s) a partir da base de dados Swiss-Prot acesso n° Q9UM73 (versão de acesso 120, versão da sequência 3); A(s) sequência(s) da CD248 (humana) (Endosialina) pode(m) ser obtida(s) a partir da base de dados Swiss-Prot acesso n° Q9HCU0 (versão de acesso 87, versão da sequência 1); A(s) sequência(s) da CD249 (humana) (glutamil aminopeptidase) pode(m) ser obtida(s) a partir da base de dados Swiss-Prot acesso n° Q07075 (versão de acesso 121, versão da sequência 3); A(s) sequência(s) da CD252 (humana) (Superfamília de ligantes do fator de necrose tumoral membro 4) pode(m) ser obtida(s) a partir da base de dados Swiss-Prot acesso n° P23510 (versão de acesso 101, versão da sequência 1); A(s) sequência(s) da CD253 (humana) (Superfamília de ligantes do fator de necrose tumoral membro 10) pode(m) ser obtida(s) a partir da base de dados Swiss-Prot acesso n° P50591 (versão de acesso 118, versão da sequência 1); A(s) sequência(s) da CD254 (humana) (Superfamília de ligantes do fator de necrose tumoral membro 11) pode(m) ser obtida(s) a partir da base de dados Swiss-Prot acesso n° O14788 (versão de acesso 110, versão da sequência 1); A(s) sequência(s) da CD256 (humana) (Superfamília de ligantes do fator de necrose tumoral membro 13) pode(m) ser obtida(s) a partir da base de dados Swiss-Prot acesso n° O75888 (versão de acesso 111, versão da sequência 1); A(s) sequência(s) da CD257 (humana) (Superfamília de ligantes do fator de necrose tumoral membro 13B) pode(m) ser obtida(s) a partir da base de dados Swiss- Prot acesso n° Q9Y275 (versão de acesso 127, versão da sequência 1); A(s) sequência(s) da CD258 (humana) (Superfamília de ligantes do fator de necrose tumoral membro 14) pode(m) ser obtida(s) a partir da base de dados Swiss-Prot acesso n° O43557 (versão de acesso 117, versão da sequência 2); A(s) sequência(s) da CD261 (humana) (Receptor da superfamília do fator de necrose tumoral membro 10A) pode(m) ser obtida(s) a partir da base de dados Swiss- Prot acesso n° 000220 (versão de acesso 112, versão da sequência 3); A(s) sequência(s) da CD262 (humana) (Receptor da superfamília do fator de necrose tumoral membro 10B) pode(m) ser obtida(s) a partir da base de dados Swiss- Prot acesso n° 014763 (versão de acesso 133, versão da sequência 2); A(s) sequência(s) da CD263 (humana) (Receptor da superfamília do fator de necrose tumoral membro 10C) pode(m) ser obtida(s) a partir da base de dados Swiss- Prot acesso n° 014798 (versão de acesso 99, versão da sequência 3); A(s) sequência(s) da CD264 (humana) (Receptor da superfamília do fator de necrose tumoral membro 10D) pode(m) ser obtida(s) a partir da base de dados Swiss- Prot acesso n° Q9UBN6 (versão de acesso 109, versão da sequência 1); A(s) sequência(s) da CD265 (humana) (Receptor da superfamília do fator de necrose tumoral membro 11A) pode(m) ser obtida(s) a partir da base de dados Swiss- Prot acesso n° Q9Y6Q6 (versão de acesso 100, versão da sequência 1); A(s) sequência(s) da CD266 (humana) (Receptor da superfamília do fator de necrose tumoral membro 12A) pode(m) ser obtida(s) a partir da base de dados Swiss- Prot acesso n° Q9NP84 (versão de acesso 89, versão da sequência 1); A(s) sequência(s) da CD267 (humana) (Receptor da superfamília do fator de necrose tumoral membro 13B) pode(m) ser obtida(s) a partir da base de dados Swiss- Prot acesso n° O14836 (versão de acesso 102, versão da sequência 1); A(s) sequência(s) da CD268 (humana) (Receptor da superfamília do fator de necrose tumoral membro 13C) pode(m) ser obtida(s) a partir da base de dados Swiss- Prot acesso n° Q96RJ3 (versão de acesso 91, versão da sequência 1); A(s) sequência(s) da CD269 (humana) (Receptor da superfamília do fator de necrose tumoral membro 17) pode(m) ser obtida(s) a partir da base de dados Swiss-Prot acesso n° Q02223 (versão de acesso 125, versão da sequência 2); A(s) sequência(s) da CD270 (humana) (Receptor da superfamília do fator de necrose tumoral membro 14) pode(m) ser obtida(s) a partir da base de dados Swiss-Prot acesso n° Q92956 (versão de acesso 134, versão da sequência 3); A(s) sequência(s) da CD271 (humana) (Receptor da superfamília do fator de necrose tumoral membro 16) pode(m) ser obtida(s) a partir da base de dados Swiss-Prot acesso n° P08138 (versão de acesso 135, versão da sequência 1); A(s) sequência(s) da CD276 (humana) (antígeno CD276) pode(m) ser obtida(s) a partir da base de dados Swiss-Prot acesso n° Q5ZPR3 (versão de acesso 71, versão da sequência 1); A(s) sequência(s) da CD277 (humana) (membro A1 da subfamília 3 de Butirofilina) pode(m) ser obtida(s) a partir da base de dados Swiss-Prot acesso n° 000481 (versão de acesso 102, versão da sequência 3); A(s) sequência(s) da CD280 (humana) (receptor 2 de manose tipo tipo C) pode(m) ser obtida(s) a partir da base de dados Swiss-Prot acesso n° Q9UBG0 (versão de acesso 79, versão da sequência 2); A(s) sequência(s) da CD281 (humana) (receptor Toll-like 1) pode(m) ser obtida(s) a partir da base de dados Swiss-Prot acesso n° Q15399 (versão de acesso 125, versão da sequência 3); A(s) sequência(s) da CD282 (humana) (receptor Toll-like 2) pode(m) ser obtida(s) a partir da base de dados Swiss-Prot acesso n° 060603 (versão de acesso 129, versão da sequência 1); A(s) sequência(s) da CD283 (humana) (receptor Toll-like 3) pode(m) ser obtida(s) a partir da base de dados Swiss-Prot acesso n° 015455 (versão de acesso 120, versão da sequência 1); A(s) sequência(s) da CD284 (humana) (receptor Toll-like 4) pode(m) ser obtida(s) a partir da base de dados Swiss-Prot acesso n° 000206 (versão de acesso 125, versão da sequência 2); A(s) sequência(s) da CD286 (humana) (receptor Toll-like 6) pode(m) ser obtida(s) a partir da base de dados Swiss-Prot acesso n° Q9Y2C9 (versão de acesso 108, versão da sequência 2); A(s) sequência(s) da CD288 (humana) (receptor Toll-like 8) pode(m) ser obtida(s) a partir da base de dados Swiss-Prot acesso n° Q9NR97 (versão de acesso 103, versão da sequência 1); A(s) sequência(s) da CD289 (humana) (receptor Toll-like 9) pode(m) ser obtida(s) a partir da base de dados Swiss-Prot acesso n° Q9NR96 (versão de acesso 107, versão da sequência 2); A(s) sequência(s) da CD290 (humana) (receptor Toll-like 10) pode(m) ser obtida(s) a partir da base de dados Swiss-Prot acesso n° Q9BXR5 (versão de acesso 105, versão da sequência 2); A(s) sequência(s) da CD292 (humana) (receptor da proteína óssea morfogenética tipo-1A) pode(m) ser obtida(s) a partir da base de dados Swiss- Prot acesso n° P36894 (versão de acesso 146, versão da sequência 2); A(s) sequência(s) da CD294 (humana) (receptor 44 acoplado à proteína G putativa) pode(m) ser obtida(s) a partir da base de dados Swiss-Prot acesso n° Q9Y5Y4 (versão de acesso 91, versão da sequência 3); A(s) sequência(s) da CD295 (humana) (receptor de Leptina) pode(m) ser obtida(s) a partir da base de dados Swiss-Prot acesso n° P48357 (versão de acesso 132, versão da sequência 2); A(s) sequência(s) da CD296 (humana) (NAD(P) (+)-arginina ADP- ribosiltransferase 1 ligada à GPI) pode(m) ser obtida(s) a partir da base de dados Swiss-Prot acesso n° P52961 (versão de acesso 96, versão da sequência 2); A(s) sequência(s) da CD297 (humana) (Ecto-ADP-ribosiltransferase 4) pode(m) ser obtida(s) a partir da base de dados Swiss-Prot acesso n° Q93070 (versão de acesso 106, versão da sequência 2); A(s) sequência(s) da CD298 (humana) (subunidade beta-3 da ATPase transportadora de sódio/potássio) pode(m) ser obtida(s) a partir da base de dados Swiss-Prot acesso n° P54709 (versão de acesso 102, versão da sequência 1); A(s) sequência(s) da CD299 (humana) (membro M da família 4 de domínio das lectinas tipo C) pode(m) ser obtida(s) a partir da base de dados Swiss-Prot acesso n° Q9H2X3 (versão de acesso Q9H2X3 (versão de acesso 108, versão da sequência 1); A(s) sequência(s) da CD300 (humana) (molécula 9 semelhante à CMRF35) pode(m) ser obtida(s) a partir da base de dados Swiss-Prot acesso n° Q6UXG3 (versão de acesso 67, versão da sequência 2); A(s) sequência(s) da CD301 (humana) (membro A da família 10 de domínio das lectinas tipo C) pode(m) ser obtida(s) a partir da base de dados Swiss-Prot acesso n° Q8IUN9 (versão de acesso 80, versão da sequência 1); A(s) sequência(s) da CD302 (humana) (antígeno CD302) pode(m) ser obtida(s) a partir da base de dados Swiss-Prot acesso n° Q8IX05 (versão de acesso 64, versão da sequência 1); A(s) sequência(s) da CD303 (humana) (membro C da família 4 de domínio das lectinas tipo C) ser obtida(s) a partir da base de dados Swiss-Prot acesso n° Q8WTT0 (versão de acesso 82, versão da sequência 1); A(s) sequência(s) da CD304 (humana) (Neuropilina-1) pode(m) ser obtida(s) a partir da base de dados Swiss-Prot acesso n° O14786 (versão de acesso 129, versão da sequência 3); A(s) sequência(s) da CD305 (humana) (receptor 1 semelhante à imunoglobulina associada aos leucócitos) pode(m) ser obtida(s) a partir da base de dados Swiss-Prot acesso n° Q6GTX8 (versão de acesso 70, versão da sequência 1); A(s) sequência(s) da CD306 (humana) (receptor 2 semelhante à imunoglobulina associada aos leucócitos) pode(m) ser obtida(s) a partir da base de dados Swiss-Prot acesso n° Q6ISS4 (versão de acesso 63, versão da sequência 1); A(s) sequência(s) da CD309 (humana) (receptor 2 do fator de crescimento vascular endotelial) pode(m) ser obtida(s) a partir da base de dados Swiss-Prot acesso n° P35968 (versão de acesso 138, versão da sequência 2); A(s) sequência(s) da CD312 (humana) (receptor 2 de hormônio semelhante a mucina contendo módulo similar ao EGF) pode(m) ser obtida(s) a partir da base de dados Swiss-Prot acesso n° Q9UHX3 (versão de acesso 113, versão da sequência 2); A(s) sequência(s) da CD314 (humana) (proteína de membrana integral NKG2-D tipo II) pode(m) ser obtida(s) a partir da base de dados Swiss-Prot acesso n° P26718 (versão de acesso 117, versão da sequência 1); A(s) sequência(s) da CD315 (humana) (regulador negativo do receptor F2 de prostaglandina) pode(m) ser obtida(s) a partir da base de dados Swiss-Prot acesso n° Q9P2B2 (versão de acesso 98, versão da sequência 2); A(s) sequência(s) da CD316 (humana) (Imunoglobulina superfamília membro 8) pode(m) ser obtida(s) a partir da base de dados Swiss-Prot acesso n° Q969P0 (versão de acesso 81, versão da sequência 1); A(s) sequência(s) da CD317 (humana) (antígeno estromal da medula óssea tipo 2) pode(m) ser obtida(s) a partir da base de dados Swiss-Prot acesso n° Q10589 (versão de acesso 95, versão da sequência 1); A(s) sequência(s) da CD318 (humana) (proteína 1 contendo o domínio CUB) pode(m) ser obtida(s) a partir da base de dados Swiss- Prot acesso n° Q9H5V8 (versão de acesso 78, versão da sequência 3; A(s) sequência(s) da CD319 (humana) (membro 7 da família SLAM) pode(m) ser obtida(s) a partir da base de dados Swiss-Prot acesso n° Q9NQ25 (versão de acesso 92, versão da sequência 1); A(s) sequência(s) da CD320 (humana) (antígeno CD320) pode(m) ser obtida(s) a partir da base de dados Swiss-Prot acesso n° Q9NPF0 (versão de acesso 86, versão da sequência 1); A(s) sequência(s) da CD321 (humana) (molécula de adesão juncional A) pode(m) ser obtida(s) a partir da base de dados Swiss-Prot acesso n° Q9Y624 (versão de acesso 124, versão da sequência 1); A(s) sequência(s) da CD322 (humana) (molécula de adesão juncional B) pode(m) ser obtida(s) a partir da base de dados Swiss-Prot acesso n° P57087 (versão de acesso 107, versão da sequência 1); A(s) sequência(s) da CD324 (humana) (Caderina-1) pode(m) ser obtida(s) a partir da base de dados Swiss-Prot acesso n° P12830 (versão de acesso 157, versão da sequência 3); A(s) sequência(s) da CD325 (humana) (Caderina-2) pode(m) ser obtida(s) a partir da base de dados Swiss-Prot acesso n° P19022 (versão de acesso 118, versão da sequência 4), A(s) sequência(s) da CD326 (humana) (molécula de adesão celular epitelial) pode(m) ser obtida(s) a partir da base de dados Swiss-Prot acesso n° P16422 (versão de acesso 118, versão da sequência 2); A(s) sequência(s) da CD327 (humana) (lectina 6 semelhante à imunoglobulina de ligação ao ácido siálico) pode(m) ser obtida(s) a partir da base de dados Swiss-Prot acesso n° O43699 (versão de acesso 107, versão da sequência 2); A(s) sequência(s) da CD328 (humana) (lectina 7 semelhante à imunoglobulina de ligação ao ácido siálico) pode(m) ser obtida(s) a partir da base de dados Swiss-Prot acesso n° Q9Y286 (versão de acesso 111, versão da sequência 1); A(s) sequência(s) da CD329 (humana) (lectina 8 semelhante à imunoglobulina de ligação ao ácido siálico) pode(m) ser obtida(s) a partir da base de dados Swiss-Prot acesso n° Q9NYZ4 (versão de acesso 100, versão da sequência 2); A(s) sequência(s) da CD331 (humana) (receptor tipo 1 do fator de crescimento de fibroblastos) pode(m) ser obtida(s) a partir da base de dados Swiss-Prot acesso n° P11362 (versão de acesso 169, versão da sequência 3); A(s) sequência(s) da CD332 (humana) (receptor tipo 2 do fator de crescimento de fibroblastos) pode(m) ser obtida(s) a partir da base de dados Swiss-Prot acesso n° P21802 (versão de acesso 165, versão da sequência 1); A(s) sequência(s) da CD333 (humana) (receptor tipo 3 do fator de crescimento de fibroblastos) pode(m) ser obtida(s) a partir da base de dados Swiss-Prot acesso n° P22607 (versão de acesso 161, versão da sequência 1); A(s) sequência(s) da CD334 (humana) (receptor tipo 4 do fator de crescimento de fibroblastos) pode(m) ser obtida(s) a partir da base de dados Swiss-Prot acesso n° P22455 (versão de acesso 136, versão da sequência 2); A(s) sequência(s) da CD335 (humana) (receptor tipo 1 desencadeador da citotoxicidade natural) pode(m) ser obtida(s) a partir da base de dados Swiss-Prot acesso n° O76036 (versão de acesso 98, versão da sequência 1); A(s) sequência(s) da CD336 (humana) (receptor tipo 2 desencadeador da citotoxicidade natural) pode(m) ser obtida(s) a partir da base de dados Swiss-Prot acesso n° O95944 (versão de acesso 86, versão da sequência 2); A(s) sequência(s) da CD337 (humana) (receptor tipo 3 desencadeador da citotoxicidade natural) pode(m) ser obtida(s) a partir da base de dados Swiss-Prot acesso n° O14931 (versão de acesso 103, versão da sequência 1); A(s) sequência(s) da CD338 (humana) (membro 2 da subfamília G do cassete de ligação ao ATP) pode(m) ser obtida(s) a partir da base de dados Swiss-Prot acesso n° Q9UNQ0 (versão de acesso 120, versão da sequência 3); A(s) sequência(s) da CD339 (humana) (Proteína jagged-1) pode(m) ser obtida(s) a partir da base de dados Swiss-Prot acesso n° P78504 (versão de acesso (versão de acesso 129; versão da sequência 3); A(s) sequência(s) da CD340 (humana) (Receptor da proteína erbB-2 tipo tirosina -quinase) pode(m) ser obtida(s) a partir da base de dados Swiss-Prot acesso n° P04626 (versão de acesso 162, versão da sequência 1); A(s) sequência(s) da CD344 (humana) (Frizzled-4) pode(m) ser obtida(s) a partir da base de dados Swiss-Prot acesso n° Q9ULV1 (versão de acesso 107, versão da sequência 2); A(s) sequência(s) da CD349 (humana) (Frizzled-9) pode(m) ser obtida(s) a partir da base de dados Swiss-Prot acesso n° 000144 (versão de acesso 103, versão da sequência 1); A(s) sequência(s) da CD350 (humana) (Frizzled-10) pode(m) ser obtida(s) a partir da base de dados Swiss-Prot acesso n° Q9ULW2 (versão de acesso 100, versão da sequência 1); A(s) sequência(s) da CD351 (humana) (receptor de Fc da imunoglobulina mu e imunoglobulina alfa de alta afinidade) pode(m) ser obtida(s) a partir da base de dados Swiss-Prot acesso n° Q8WWV6 (versão de acesso 65, versão da sequência 1); A(s) sequência(s) da CD352 (humana) (membro 6 da família SLAM) pode(m) ser obtida(s) a partir da base de dados Swiss-Prot acesso n° Q96DU3 (versão de acesso 93, versão da sequência 3); A(s) sequência(s) da CD353 (humana) (membro 8 da família SLAM) pode(m) ser obtida(s) a partir da base de dados Swiss-Prot acesso n° Q9P0V8 (versão de acesso 80, versão da sequência 1); A(s) sequência(s) da CD354 (humana) (receptor 1 desencadeador expresso sobre célula mieloides) pode(m) ser obtida(s) a partir da base de dados Swiss-Prot acesso n° Q9NP99 (versão de acesso 93, versão da sequência 1); A(s) sequência(s) da CD355 (humana) (molécula de célula T citotóxica e regulatória) pode(m) ser obtida(s) a partir da base de dados Swiss-Prot acesso n° O95727 (versão de acesso 81, versão da sequência 2); A(s) sequência(s) da CD357 (humana) (Receptor da superfamília do fator de necrose tumoral membro 18) pode(m) ser obtida(s) a partir da base de dados Swiss-Prot acesso n° Q9Y5U5 (versão de acesso 103, versão da sequência 1); A(s) sequência(s) da CD358 (humana) (Receptor da superfamília do fator de necrose tumoral membro 21) pode(m) ser obtida(s) a partir da base de dados Swiss-Prot acesso n° O75509 (versão de acesso 110, versão da sequência 1); A(s) sequência(s) da CD360 (humana) (receptor de Interleucina- 21) pode(m) ser obtida(s) a partir da base de dados Swiss-Prot acesso n° Q9HBE5 (versão de acesso 104, versão da sequência 1); A(s) sequência(s) da CD361 (humana) (Proteína EVI2B) pode(m) ser obtida(s) a partir da base de dados Swiss-Prot acesso n° P34910 (versão de acesso 87, versão da sequência 2); A(s) sequência(s) da CD362 (humana) (Sindecan-2) pode(m) ser obtida(s) a partir da base de dados Swiss-Prot acesso n° P34741 (versão de acesso 105, versão da sequência 2); A(s) sequência(s) da CD363 (humana) (receptor tipo 1 da esfingosina 1-fosfato) pode(m) ser obtida(s) a partir da base de dados Swiss- Prot acesso n° P21453 (versão de acesso 116, versão da sequência 2); A(s) sequência(s) da família de proteína críptica (humana) (Proteína da família críptica 1-B) pode(m) ser obtida(s) a partir da base de dados Swiss-Prot acesso n° P0CG36 (versão de acesso 12, versão da sequência 1); A(s) sequência(s) do receptor de tirotropina (humana) (TSHR) pode(m) ser obtida(s) a partir da base de dados Swiss-Prot acesso n° P16473 (versão de acesso 152, versão da sequência 2); or A(s) sequência(s) do receptor do fator de crescimento epidérmico (humano) (EGFR) pode(m) ser obtida(s) a partir da base de dados Swiss-Prot acesso n° P00533 (versão de acesso 178, versão da sequência 2).
[0056] Conforme mencionado acima, o segundo domínio (derivado de Ig) da molécula de anticorpo biespecífico descrita acima pode compreender um sítio de interação ao antígeno com especificidade para uma molécula de superfície de células que ocorre naturalmente sobre células de tumor.
[0057] O termo “molécula de superfície celular que ocorre naturalmente sobre células de tumor”, tal como utilizado na presente invenção, também indica moléculas que são apresentadas na superfície das células tumorais. O termo “ocorre naturalmente” refere-se às moléculas que são endogenamente expressas na superfície das células tumorais. O termo “molécula de superfície celular” refere-se às moléculas que são (naturalmente/endogenamente) expressas/apresentadas na superfície das células e compreendem domínios ou epítopos acessíveis (in vitro ou in vivo) aos domínios de ligação (derivados de Ig), de preferência anticorpos, fragmentos de anticorpos ou seus derivados. Conforme ilustrado acima, o referido segundo domínio de ligação derivado de Ig pode ser um scFv. Exemplos para as referidas moléculas de superfície celular são proteínas de membrana e transmembrana, moléculas adaptadas para as referidas proteínas ou superfície celular, e etc. Assim, no contexto da invenção, a referida molécula de superfície é um marcador tumor-específico. No contexto da invenção, o referido marcador tumor-específico refere-se a um marcador que é em geral expresso endogenamente na superfície das células tumorais.
[0058] No contexto da presente invenção, o termo “marcador tumor- específico” refere-se às moléculas, que são naturalmente/endogenamente apresentadas e/ou localizadas na superfície de células tumorais, ou que são expressas ubiquamente, mas só são acessíveis para a ligação de anticorpos, fragmentos de anticorpos ou derivados de anticorpos sobre a superfície de células tumorais. Um “marcador tumor-específico”, tal como referido na presente invenção descreve uma proteína, preferencialmente ou exclusivamente expressa em células de tumor. Preferencialmente significa uma expressão relativamente mais elevada em um tumor do que em células somáticas normais enquanto significa exclusivamente uma expressão de uma proteína de uma célula de tumor que não é encontrada em células somáticas por meios convencionais de detecção de proteínas conhecidos. Proteínas que preenchem estes critérios podem, por exemplo, ser identificadas pela triagem de expressão subtrativa ou diferencial, que são bem conhecidos no estado da técnica. O grau ao qual a expressão específica das células de tumor deve ser explorada pelo método de terapia da presente invenção pode ser avaliado por um ensaio celular no qual as células que expressam o antígeno de interesse e células T específicas para este antígeno são incubadas juntos e a especificidade da morte celular induzida é determinada.
[0059] A “expressão preferencial” refere-se às proteínas que são, em comparação com as células normais, altamente expressas nas células tumorais devido à superexpressão de proteínas mediada pela amplificação do gene, regulação positiva da transcrição ou estabilização do mRNA ou mutações que afetam o volume de tais proteínas. Também define as proteínas que são expressas em células tumorais e também em células normais, mas que nas células normais geralmente não são acessíveis para células T ou anticorpos, tal como regiões imunologicamente privilegiadas do corpo humano. Além disso, as proteínas que são expressas em células tumorais, mas não são expressas em células normais dentro do escopo do tratamento se englobam segundo esta definição, tal como proteínas que são expressas exclusivamente durante o desenvolvimento embrionário.
[0060] “Expressão exclusiva” refere-se a proteínas que são encontradas somente nas células de tumor durante o curso do tratamento. De preferência tais proteínas são apresentadas na superfície da célula e carregam mutações pontuais ou deleções em sua parte extracelular que não são encontradas em células normais. Da mesma forma, os neo-epítopos resultantes de atividade tumor-específica de sheddases que pertencem a esta categoria. A expressão exclusiva também inclui glicoestruturas anormais exclusivamente encontrados em tumores, mas não em células normais.
[0061] No contexto da presente invenção, o primeiro domínio de ligação, tal como descrito no presente, e o segundo domínio de ligação, tal como descrito no presente, da molécula de anticorpo biespecífico se ligam a antígenos diferentes.
[0062] Exemplos de marcadores tumorais que ocorrem naturalmente sobre a superfície de células tumorais são fornecidos abaixo e incluem, mas não estão limitados a, EpCAM. HER-1, HER-2, HER-3, CD20, CD22, CD33, CD52, CA-12-5, HLA-DR, MUC-1 (mucina), antígeno A33, PSMA (antígeno de membrana específico da próstata), receptor transferrina, Tenascina ou CA-IX.
[0063] Consequentemente, no contexto da presente invenção, a(s) molécula(s) de anticorpo biespecífico descrita(s) no presente compreende(m) um antígeno/marcador que ocorre naturalmente na superfície de células tumorais selecionado a partir do grupo consistindo em EpCAM, HER-1, HER-2, HER -3, CD20, CD22, CD33, CD52, CA-12-5, HLA-DR, MUC-1 (mucina), antígeno A33, PSMA (antígeno de membrana específico da próstata), receptor transferrina, tenascina e CA-IX. No contexto da presente invenção, a(s) molécula(s) de anticorpo biespecífico descrita(s) no presente compreende(m) um antígeno/marcador que é expresso endogenamente sobre a superfície de células tumorais selecionado a partir do grupo consistindo em EpCAM, HER-1, HER-2, HER -3, CD20, CD22, CD33, CD52, CA-12-5, HLA-DR, MUC-1 (mucina), antígeno A33, PSMA (antígeno de membrana específico da próstata), receptor transferrina, tenascina e CA-IX.
[0064] A(s) sequência(s) dos membros (humanos) de EpCAM, HER-1, HER-2, HER-3, CD20, CD22, CD33, CD52, CA-12-5, HLA-DR, MUC-1 (mucina), antígeno A33, PSMA (antígeno de membrana específico da próstata). receptor de transferrina, Tenascina ou CA-IX estão disponíveis no banco de dados Uni ProtK B / Swiss-Prot e podem ser recuperadas a partir do site http://vAvw.uniprot.org/UniProt/?Query=reviewed%3Ayes. Estas sequências (proteína) também se relacionam com sequências modificadas anotadas. A presente invenção também provê métodos e técnicas em que sequências homólogas, e também variantes alélicas genéticas e similares das sequências concisas fornecidas no presente são utilizadas. Preferencialmente, são usadas tais “variantes” e semelhantes das sequências concisas da presente invenção. De preferência, tais “variantes” são variantes genéticas. O perito no assunto pode facilmente deduzir a região codificante pertinente destas sequências (proteínas) a partir destas referencias de banco de dados, que também pode incluir a referência do DNA genômico, bem como do mRNA/cDNA.
[0065] A(s) sequências da EpCAM (molécula de adesão epitelilal) (humana) pode(m) ser obtidas(s) a partir da base de dados Swiss-prot n° de acesso P16422 (versão de acesso 117, versão de sequência 2); a(s) sequências do HER-1 (receptor do fator de crescimento epidérmico) (humano) pode(m) ser obtidas(s) a partir da base de dados Swiss-prot n° de acesso P00533 (versão de acesso 177, versão de sequência 2); a(s) sequências do HER-2 (receptor erB-2 tipo tirosina quinase) (humano) pode(m) ser obtidas(s) a partir da base de dados Swiss-prot n° de acesso P04626 (versão de acesso 161, versão de sequência 1); a(s) sequências do HER-3 (Receptor erB-3 tipo tirosina quinase) (humano) pode(m) ser obtidas(s) a partir da base de dados Swiss-prot n° de acesso P21860 (versão de acesso 140, versão de sequência 1); a(s) sequências do CD20 (humano) (antígeno CD20 de linfócito B) pode(m) ser obtidas(s) a partir da base de dados Swiss-prot n° de acesso P11836 (versão de acesso 117, versão de sequência 1); a(s) sequências do CD22 (humano) (antígeno CD22 de linfócito B) pode(m) ser obtidas(s) a partir da base de dados Swiss-prot n° de acesso P20273 (versão de acesso 135, versão de sequência 2); a(s) sequências do CD33 (humano) (antígeno CD33 de linfócito B) pode(m) ser obtidas(s) a partir da base de dados Swiss-prot n° de acesso P20138 (versão de acesso 129, versão de sequência 2); a(s) sequências do CA-12-5 (Mucina 16) (humano) pode(m) ser obtidas(s) a partir da base de dados Swiss-prot n° de acesso Q8WXI7 (versão de acesso 66, versão de sequência 2); a(s) sequências do HLA-DR (humano) pode(m) ser obtidas(s) a partir da base de dados Swiss-prot n° de acesso Q29900 (versão de acesso 59, versão de sequência 1); a(s) sequências do MUC- 1 (Mucina-1) (humano) pode(m) ser obtidas(s) a partir da base de dados Swiss- prot n° de acesso P15941 (versão de acesso 135, versão de sequência 3); a(s) sequências do A33 (antígeno A33 de superfície celular) (humano) pode(m) ser obtidas(s) a partir da base de dados Swiss-prot n° de acesso Q99795 (versão de acesso 104, versão de sequência 1); a(s) sequências do PSMA (Glutamato carboxipeptidase 2) (humano) pode(m) ser obtidas(s) a partir da base de dados Swiss-prot n° de acesso Q04609 (versão de acesso 133, versão de sequência 1), a(s) sequências do receptor de transferrina (humano) pode(m) ser obtidas(s) a partir da base de dados Swiss-prot com acessos Q9UP52 (versão de acesso 99, versão de sequência 1) e P02786 (versão de acesso 152, versão de sequência 2); a sequência da Tenascina (humano) pode ser obtidas a partir da base de dados Swiss-prot n° de acesso P24821 (versão de acesso 141, versão de sequência 3); ou a(s) sequências do CA-IX (humano) (anidrase carbônica 9) pode(m) ser obtidas(s) a partir da base de dados Swiss-prot n° de acesso Q16790 (versão de acesso 115, versão de sequência 2).
[0066] No contexto da presente invenção, é descrito um anticorpo biespecífico que compreende um primeiro domínio de ligação a/direcionado contra/ou que interage com ou sobre o Cripto (humano) e um segundo domínio de ligação a/dirigido contra/que interage com EpCAM (humano).
[0067] As moléculas ou construções (ou seja, moléculas de anticorpos biespecíficos descritas no presente) fornecidas na presente invenção são particularmente úteis no contexto médico. Como exemplos, doenças malignas podem ser tratadas com uma construção biespecifica descrita na presente invenção. No contexto da presente invenção, a doença maligna pode ser um câncer/carcinoma de origem epitelial, endotelial ou mesotelial ou um câncer do sangue. No contexto da presente invenção, o câncer/carcinoma é selecionado a partir do grupo que consiste em câncer gastrointestinal, câncer pancreático, câncer colangiocelular, câncer de pulmão, câncer de mama, câncer de ovário, câncer de pele, câncer oral, câncer gástrico, câncer do colo do útero, linfoma de célula B e T, leucemia mieloide, câncer ovariano, leucemia, leucemia linfática, carcinoma de nasofaringe, câncer de cólon, câncer de próstata, câncer de células renais, câncer de cabeça e pescoço, câncer de pele (melanoma), cânceres do trato genitor-urinário, por exemplo, câncer de testículo, câncer de ovário, câncer endotelial, câncer de colo do útero e câncer renal, câncer do ducto biliar, câncer de esôfago, câncer de glândulas salivares e câncer da glândula tireoide ou outras doenças tumorais como os tumores hematológicos, gliomas, sarcomas ou osteossarcomas.
[0068] As moléculas ou construções (ou seja, moléculas de anticorpos biespecíficos descritas no presente) fornecidas na presente invenção são particularmente úteis no contexto médico. Por exemplo, doenças e/ou linfomas tumorais podem ser tratados com uma construção biespecífica direcionada contra estas indicações médicas. A indicação de um anticorpo biespecífico (molécula) é dada pela expressão do antígeno tumoral. Um antígeno tumoral expresso em uma entidade pode ser combinado com quase qualquer marcador de célula T mencionado acima (representando o antígeno que ocorre naturalmente/que é endogenamente expresso na superfície de uma célula tumoral). Por exemplo, o câncer gastrointestinal, câncer pancreático, câncer colangiocelular, câncer de pulmão, câncer de mama, câncer de ovário, câncer de pele e/ou câncer oral podem ser tratados com uma molécula biespecífica ou construção (ou seja, a molécula de anticorpo biespecífico descrita na presente invenção) direcionada contra EpCAM (humano) (como o antígeno tumor- específico que ocorre naturalmente sobre a superfície de uma célula tumoral) por meio do segundo domínio de ligação, e a molécula compreende um primeiro domínio de ligação direcionado contra / que se liga / que interage com um dos antígenos definidos na presente invenção que não ocorre naturalmente em e/ou sobre células T (células T CD8+). Consequentemente, no contexto da presente invenção, uma construção de anticorpo biespecífico direcionada contra EpCAM (humano) (como segundo domínio de ligação) e que compreende um primeiro domínio de ligação direcionado contra/ que se liga a / que interage com o cripto pode ser utilizada no tratamento do câncer gastrointestinal, por exemplo, adenocarcinoma de origem gastrointestinal. O câncer gastrointestinal, câncer pancreático, câncer colangiocelular, câncer de pulmão, câncer de mama, câncer de ovário, câncer de pele e/ou câncer oral podem ser tratados com uma molécula biespecífica ou construção (ou seja, a molécula de anticorpo biespecífico descrita na presente invenção) direcionada contra HER1 (humano) (como o antígeno tumor-específico que ocorre naturalmente sobre a superfície de uma célula tumoral) por meio do segundo domínio de ligação, e a molécula compreende um primeiro domínio de ligação direcionado contra / que se liga / que interage com um dos antígenos definidos na presente invenção que não ocorre naturalmente em e/ou sobre células T (células T CD8+). Câncer gástrico, câncer de mama, e/ou câncer de colo do útero podem ser tratados com uma molécula biespecífica ou construção (ou seja, a molécula de anticorpo biespecífico descrita na presente invenção) direcionada contra HER2 (humano) (como o antígeno tumor-específico que ocorre naturalmente sobre a superfície de uma célula tumoral) por meio do segundo domínio de ligação, e a molécula compreende um primeiro domínio de ligação direcionado contra / que se liga / que interage com um dos antígenos definidos na presente invenção que não ocorre naturalmente em e/ou sobre células T (células T CD8+). Câncer gástrico e/ou câncer de pulmão podem ser tratados com uma molécula biespecífica ou construção (ou seja, a molécula de anticorpo biespecífico descrita na presente invenção) direcionada contra HER3 (humano) (como o antígeno tumor- específico que ocorre naturalmente sobre a superfície de uma célula tumoral) por meio do segundo domínio de ligação, e a molécula compreende um primeiro domínio de ligação direcionado contra / que se liga / que interage com um dos antígenos definidos na presente invenção que não ocorre naturalmente em e/ou sobre células T (células T CD8+). Linfoma de células B e/ou linfoma de células T podem ser tratados com uma molécula biespecífica ou construção (ou seja, a molécula de anticorpo biespecífico descrita na presente invenção) direcionada contra CD20 (humano) (como o antígeno tumor-específico que ocorre naturalmente sobre a superfície de uma célula tumoral) por meio do segundo domínio de ligação, e a molécula compreende um primeiro domínio de ligação direcionado contra / que se liga / que interage com um dos antígenos definidos na presente invenção que não ocorre naturalmente em e/ou sobre células T (células T CD8+). Linfoma de células B e/ou linfoma de células T podem ser tratados com uma molécula biespecífica ou construção (ou seja, a molécula de anticorpo biespecífico descrita na presente invenção) direcionada contra CD22 (humano) (como o antígeno tumor-específico que ocorre naturalmente sobre a superfície de uma célula tumoral) por meio do segundo domínio de ligação, e a molécula compreende um primeiro domínio de ligação direcionado contra / que se liga / que interage com um dos antígenos definidos na presente invenção que não ocorre naturalmente em e/ou sobre células T (células T CD8+). Leucemia mieloide pode ser tratada com uma construção biespecífica direcionada contra CD33 (humano) (como o antígeno tumor-específico que ocorre naturalmente sobre a superfície de uma célula tumoral) por meio do segundo domínio de ligação, e compreende um primeiro domínio de ligação direcionado contra / que se liga / que interage com um dos antígenos definidos na presente invenção que não ocorre naturalmente em e/ou sobre células T (células T CD8+). Câncer de ovário, câncer de pulmão, câncer de mama e/ou câncer gastrointestinal podem ser tratados com uma molécula biespecífica ou construção (ou seja, a molécula de anticorpo biespecífico descrita na presente invenção) direcionada contra Ca12-5 (humano) (como o antígeno tumor-específico que ocorre naturalmente sobre a superfície de uma célula tumoral) por meio do segundo domínio de ligação, e a molécula compreende um primeiro domínio de ligação direcionado contra / que se liga / que interage com um dos antígenos definidos na presente invenção que não ocorre naturalmente em e/ou sobre células T (células T CD8+). Câncer gastrointestinal, leucemia e/ou carcinoma de nasofaringe podem ser tratados com uma molécula biespecífica ou construção (ou seja, a molécula de anticorpo biespecífico descrita na presente invenção) direcionada contra HLA- DR (humano) (como o antígeno tumor-específico que ocorre naturalmente sobre a superfície de uma célula tumoral) por meio do segundo domínio de ligação, e a molécula compreende um primeiro domínio de ligação direcionado contra / que se liga / que interage com um dos antígenos definidos na presente invenção que não ocorre naturalmente em e/ou sobre células T (células T CD8+). Câncer de cólon, câncer de mama, câncer de ovário, câncer de pulmão e/ou câncer pancreático podem ser tratados com uma molécula biespecífica ou construção (ou seja, a molécula de anticorpo biespecífico descrita na presente invenção) direcionada contra MUC-1 (humano) (como o antígeno tumor-específico que ocorre naturalmente sobre a superfície de uma célula tumoral) por meio do segundo domínio de ligação, e a molécula compreende um primeiro domínio de ligação direcionado contra / que se liga / que interage com um dos antígenos definidos na presente invenção que não ocorre naturalmente em e/ou sobre células T (células T CD8+). Câncer de cólon pode ser tratado com uma molécula biespecífica ou construção (ou seja, a molécula de anticorpo biespecífico descrita na presente invenção) direcionada contra A33 (humano) (como o antígeno tumor-específico que ocorre naturalmente sobre a superfície de uma célula tumoral) por meio do segundo domínio de ligação, e a molécula compreende um primeiro domínio de ligação direcionado contra / que se liga / que interage com um dos antígenos definidos na presente invenção que não ocorre naturalmente em e/ou sobre células T (células T CD8+). Câncer de próstata pode ser tratado com uma molécula biespecífica ou construção (ou seja, a molécula de anticorpo biespecífico descrita na presente invenção) direcionada contra PSMA (humano) (como o antígeno tumor-específico que ocorre naturalmente sobre a superfície de uma célula tumoral) por meio do segundo domínio de ligação, e a molécula compreende um primeiro domínio de ligação direcionado contra / que se liga / que interage com um dos antígenos definidos na presente invenção que não ocorre naturalmente em e/ou sobre células T (células T CD8+). Câncer gastrointestinal, câncer pancreático, câncer colangiocelular, câncer de pulmão, câncer de mama, câncer de ovário, câncer de pele e/ou câncer oral podem ser tratados com uma molécula biespecífica ou construção (ou seja, a molécula de anticorpo biespecífico descrita na presente invenção) direcionada contra receptor de transferrina (humano) (como o antígeno tumor-específico que ocorre naturalmente sobre a superfície de uma célula tumoral) por meio do segundo domínio de ligação, e a molécula compreende um primeiro domínio de ligação direcionado contra / que se liga / que interage com um dos antígenos definidos na presente invenção que não ocorre naturalmente em e/ou sobre células T (células T CD8+). Câncer pancreático, câncer de pulmão e/ou câncer de mama podem ser tratados com uma molécula biespecífica ou construção (ou seja, a molécula de anticorpo biespecífico descrita na presente invenção) direcionada contra o receptor de transferrina (humano) (como o antígeno tumor-específico que ocorre naturalmente sobre a superfície de uma célula tumoral) por meio do segundo domínio de ligação, e a molécula compreende um primeiro domínio de ligação direcionado contra / que se liga / que interage com um dos antígenos definidos na presente invenção que não ocorre naturalmente em e/ou sobre células T (células T CD8+). Câncer renal pode ser tratado com uma molécula biespecífica ou construção (ou seja, a molécula de anticorpo biespecífico descrita na presente invenção) direcionada contra CA-IX (humano) (como o antígeno tumor- específico que ocorre naturalmente sobre a superfície de uma célula tumoral) por meio do segundo domínio de ligação, e a molécula compreende um primeiro domínio de ligação direcionado contra / que se liga / que interage com um dos antígenos definidos na presente invenção que não ocorre naturalmente em e/ou sobre células T (células T CD8+).
[0069] Como também ilustrado nos exemplos anexos, como prova de conceito da presente invenção, uma molécula de anticorpo biespecífico da invenção compreende o primeiro domínio de ligação definido acima (derivado de Ig) que é direcionado contra / que se liga / que interage com ou sobre EGFR (humano) e um segundo de domínio (derivado de Ig) direcionado contra / que se liga / que interage com EpCAM (humano).
[0070] A molécula de adesão celular epitelial (EpCAM, também chamada de antígeno 17-1A, KSA, EGP40, GA733-2, 4-ksl ou ESA) é uma glicoproteína integrada à membrana de 40-kDa e 314 aminoácidos, com expressão específica em certos epitélios e em muitos carcinomas humanos (revisado em Balzar, J. Mol.Med. (1999), 77, 699-712). A EpCAM foi descoberta e, subsequentemente, clonada através do seu reconhecimento pelo anticorpo monoclonal murino 17-lA/edrecolomab (Goettlinger, Int J Cancer 38 (1986), 47-53 e Simon, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87 (1990), 2755-2759). A EpCAM serve para aderir as células epiteliais de uma forma orientada e altamente ordenada (Litvinov. J Cell Biol. 139 (1997), 1337-1348). Após a transformação maligna de células epiteliais o rápido crescimento das células tumorais abandona a alta ordem celular do epitélio. Consequentemente, a distribuição superficial da EpCAM torna-se menos restrita e a molécula mais bem exposta sobre as células tumorais e acessível para ligação pelos anticorpos, fragmentos de anticorpos ou derivados de anticorpos sobre a superfície das células tumorais. Devido à sua origem nas células epiteliais, as células tumorais da maioria dos carcinomas ainda expressam EpCAM sobre suas superfícies.
[0071] A expressão de EpCAM in vivo está relacionada ao aumento da proliferação epitelial e se correlaciona negativamente com a diferenciação celular (para revisão vide Balzar, J. Mol. Med. 77 (1999), 699-712). A expressão de EpCAM é essencialmente observada com todos os principais carcinomas (revisto em Balzar, J. Mol. Med. 77 (1999), 699-712 ou documentado, inter alia, em De Bree, Nucl Med Commun. 15 (1994), 613-27; Zhang, Clin Cancer Res. 4 (1998), 295-302). Devido à sua expressão generalizada, a EpCAM é referida como um antígeno “pan-carcinoma”. Em muitos casos, as células tumorais foram observadas por expressarem EpCAM em um grau muito mais elevado do que o seu epitélio parental ou formas menos agressivas dos referidos cânceres. Por exemplo, a expressão aumentada de EpCAM representa um evento precoce no desenvolvimento do câncer da próstata (Poczatek. J. Urol. 162 (1999), 14621644). Além disso, na maioria dos carcinomas escamosos e adenocarcinomas do colo, uma forte expressão de EpCAM correlaciona-se com um aumento da proliferação e o desaparecimento de marcadores da diferenciação terminal (Litvinov, Am. J. Pathol. 148 (1996), 865-75). No câncer de mama, a superexpressão de EpCAM em células tumorais é um preditor de sobrevida (Gastl, Lancet 356 (2000), 1981-1982). EpCAM é um marcador para a detecção de células tumorais disseminadas em pacientes que sofrem de carcinoma de células escamosas de cabeça, pescoço e pulmão (Chaubal, Anticancer Res. 19 (1999), 2237-2242 e Piyathilake, Hum. Pathol. 31 (2000), 482-487). O epitélio escamoso normal, tal como encontrado na epiderme, cavidade oral, epiglote, faringe, laringe e esôfago não expressaram significativamente EpCAM (Quak, Hybridoma 9 (1990), 377-387). EpCAM demonstrou ser expresso na maioria dos NSCLCs (câncer pulmonar de células não pequenas) primários, metastáticos e disseminados (Passlick, Int J Cancer 87 (2000), 548-552)), em adenocarcinoma gástrico e da junção gastro-esofágica (Martin, J. Clin. Pathol. 52 (1999), 701 -4) e nas linhagens de células derivadas de carcinomas colorretais, pancreático e carcinomas de mama (Szala, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87 (1990). 3542-6 e Packeisen, Hybridoma 18 (1999). 37-40).
[0072] Como ilustrativamente mostrado nos Exemplos anexos, como prova de conceito da presente invenção, o anticorpo anti-EGFR (humano) foi combinado com o anti-EpCAM (murino) (G8.8), a fim de formar a construção biespecífica MAb225_scFv_G8.8. A sequência de aminoácidos da cadeia leve do anticorpo anti-EGFR (humano) é mostrada abaixo (referida como SEQ ID NO: 1): Met Arg Cis Leu Ala Glu Fen Leu Gli Leu Leu Val Leu Trp Ile Pro Gli Ala Ile Gli Asp Ile Leu Leu Tre Gln Ser Pro Val Ile Leu Ser Val Ser Pro Gli Glu Arg Val Ser Fen Ser Cis Arg Ala Ser Gln Ser Ile Gli Tre Asn Ile His Trp Tir Gln Gln Arg Tre Asn Gli Ser Pro Arg Leu Leu Ile Lis Tir Ala Ser Glu Ser Ile Ser Gli Ile Pro Ser Arg Fen Ser Gli Ser Gli Ser Gli Tre Asp Fen Tre Leu Ser Ile Asn Ser Val Glu Ser Glu Asp Ile Ala Asp Tir Tir Cis Gln Gln Asn Asn Asn Trp Pro Tre Tre Fen Gli Ala Gli Tre Lis Leu Glu Leu Lis Arg Ala Asp Ala Ala Pro Tre Val Ser Ile Fen Pro Pro Ser Ser Glu Gln Leu Tre Ser Gli Gli Ala Ser Val Val Cis Fen Leu Asn Asn Fen Tir Pro Lis Asp Ile Asn Val Lis Trp Lis Ile Asp Gli Ser Glu Arg Gln Asn Gli Val Leu Asn Ser Trp Tre Asp Gln Asp Ser Lis Asp Ser Tre Tir Ser Met Ser Ser Tre Leu Tre Leu Tre Lis Asp Glu Tir Glu Arg His Asn Ser Tir Tre Cis Glu Ala Tre His Lis Tre Ser Tre Ser Pro Ile Val Lis Ser Fen Asn Arg Asn Glu Cis
[0073] A sequência de aminoácidos da cadeia pesada do anticorpo anti-EGFR (humano) é mostrada abaixo (referida como SEQ ID NO: 2): Met Ala Val Leu Ala Leu Leu Fen Cis Leu Val Tre Fen Pro Ser Cis Val Leu Ser Gln Val Gln Leu Lis Gln Ser Gli Pro Gli Leu Val Gln Pro Ser Gln Ser Leu Ser Ile Tre Cis Tre Val Ser Gli Fen Ser Leu Tre Asn Tir Gli Val His Trp Val Arg Gln Ser Pro Gli Lis Gli Leu Glu Trp Leu Gli Val Ile Trp Ser Gli Gli Asn Tre Asp Tir Asn Tre Pro Fen Tre Ser Arg Leu Ser Ile Asn Lis Asp Asn Ser Lis Ser Gln Val Fen Fen Lis Met Asn Ser Leu Gln Ser Asn Asp Tre Ala Ile Tir Tir Cis Ala Arg Ala Leu Tre Tir Tir Asp Tir Glu Fen Ala Tir Trp Gli Gln Gli Tre Leu Val Tre Val Ser Ala Ala Lis Tre Tre Ala Pro Ser Val Tir Pro Leu Ala Pro Val Cis Gli Asp Tre Tre Gli Ser Ser Val Tre Leu Gli Cis Leu Val Lis Gli Tir Fen Pro Glu Pro Val Tre Leu Tre Trp Asn Ser Gli Ser Leu Ser Ser Gli Val His Tre Fen Pro Ala Val Leu Gln Ser Asp Leu Tir Tre Leu Ser Ser Ser Val Tre Val Tre Ser Ser Tre Trp Pro Ser Gln Ser Ile Tre Cis Asn Val Ala His Pro Ala Ser Ser Tre Lis Val Asp Lis Lis Ile Glu Pro Arg Gli Pro Tre Ile Lis Pro Cis Pro Pro Cis Lis Cis Pro Ala Pro Asn Leu Leu Gli Gli Pro Ser Val Fen Ile Fen Pro Pro Lis Ile Lis Asp Val Leu Met Ile Ser Leu Ser Pro Ile Val Tre Cis Val Val Val Asp Val Ser Glu Asp Asp Pro Asp Val Gln Ile Ser Trp Fen Val Asn Asn Val Glu Val His Tre Ala Gln Tre Gln Tre His Arg Glu Asp Tir Asn Ser Tre Leu Arg Val Val Ser Ala Leu Pro Ile Gln His Gln Asp Trp Met Ser Gli Lis Glu Fen Lis Cis Lis Val Asn Asn Lis Asp Leu Pro Ala Pro Ile Glu Arg Tre Ile Ser Lis Pro Lis Gli Ser Val Arg Ala Pro Gln Val Tir Val Leu Pro Pro Pro Glu Glu Glu Met Tre Lis Lis Gln Val Tre Leu Tre Cis Met Val Tre Asp Fen Met Pro Glu Asp Ile Tir Val Glu Trp Tre Asn Asn Gli Lis Tre Glu Leu Asn Tir Lis Asn Tre Glu Pro Val Leu Asp Ser Asp Gli Ser Tir Fen Met Tir Ser Lis Leu Arg Val Glu Lis Lis Asn Trp Val Glu Arg Asn Ser Tir Ser Cis Ser Val Val His Glu Gli Leu His Asn His His Tre Tre Lis Ser Fen Ser Arg Tre Pro Gli Lis
[0074] A sequência de aminoácidos da cadeia leve do anticorpo anti-EpCAM (murino) (G8.8) é mostrada abaixo (referida como SEQ ID NO: 3): Met Arg Cis Leu Ala Glu Fen Leu Gli Leu Leu Val Leu Trp Ile Pro Gli Ala Ile Gli Asp Ile Gln Met Tre Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ser Ala Ser Leu Gli Glu Tre Val Ser Ile Glu Cis Leu Ala Ser Glu Gli Ile Ser Asn Asp Leu Ala Trp Tir Gln Gln Lis Ser Gli Lis Ser Pro Gln Leu Leu Ile Tir Ala Tre Ser Arg Leu Gln Asp Gli Val Pro Ser Arg Fen Ser Gli Ser Gli Ser Gli Tre Arg Tir Ser Leu Lis Ile Ser Gli Met Gln Pro Glu Asp Glu Ala Asp Tir Fen Cis Gln Gln Ser Tir Lis Tir Pro Trp Tre Fen Gli Gli Gli Tre Lis Leu Glu Leu Lis Arg Ala Asp Ala Ala Pro Tre Val Ser Ile Fen Pro Pro Ser Ser Glu Gln Leu Tre Ser Gli Gli Ala Ser Val Val Cis Fen Leu Asn Asn Fen Tir Pro Lis Asp Ile Asn Val Lis Trp Lis Ile Asp Gli Ser Glu Arg Gln Asn Gli Val Leu Asn Ser Trp Tre Asp Gln Asp Ser Lis Asp Ser Tre Tir Ser Met Ser Ser Tre Leu Tre Leu Tre Lis Asp Glu Tir Glu Arg His Asn Ser Tir Tre Cis Glu Ala Tre His Lis Tre Ser Tre Ser Pro Ile Val Lis Ser Fen Asn Arg Asn Glu Cis
[0075] A sequência de aminoácidos da cadeia pesada do anticorpo anti-EpCAM (murino) (G8.8) é mostrada abaixo (referida como SEQ ID NO: 4): Met Asp Ile Arg Leu Ser Leu Ala Fen Leu Val Leu Fen Ile Lis Gli Val Gln Cis Glu Val Gln Leu Ala Glu Ser Gli Gli Gli Leu Val Gln Pro Gli Arg Ser Met Lis Leu Ser Cis Ala Ala Ser Gli Fen Tre Fen Ser Asn Fen Pro Met Ala Trp Val Arg Gln Ala Pro Tre Lis Gli Leu Glu Trp Val Ala Tre Ile Ser Tre Ser Gli Gli Ser Tre Tir Tir Arg Asp Ser Val Lis Gli Arg Fen Tre Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lis Ser Tre Leu Tir Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ser Glu Asp Tre Ala Tre Tir Tir Cis Tre Arg Tre Leu Tir Ile Leu Arg Val Fen Tir Fen Asp Tir Trp Gli Gln Gli Val Met Val Tre Val Ser Ser Ala Lis Tre Tre Ala Pro Ser Val Tir Pro Leu Ala Pro Val Cis Gli Asp Tre Tre Gli Ser Ser Val Tre Leu Gli Cis Leu Val Lis Gli Tir Fen Pro Glu Pro Val Tre Leu Tre Trp Asn Ser Gli Ser Leu Ser Ser Gli Val His Tre Fen Pro Ala Val Leu Gln Ser Asp Leu Tir Tre Leu Ser Ser Ser Val Tre Val Tre Ser Ser Tre Trp Pro Ser Gln Ser Ile Tre Cis Asn Val Ala His Pro Ala Ser Ser Tre Lis Val Asp Lis Lis Ile Glu Pro Arg Gli Pro Tre Ile Lis Pro Cis Pro Pro Cis Lis Cis Pro Ala Pro Asn Leu Leu Gli Gli Pro Ser Val Fen Ile Fen Pro Pro Lis Ile Lis Asp Val Leu Met Ile Ser Leu Ser Pro Ile Val Tre Cis Val Val Val Asp Val Ser Glu Asp Asp Pro Asp Val Gln Ile Ser Trp Fen Val Asn Asn Val Glu Val His Tre Ala Gln Tre Gln Tre His Arg Glu Asp Tir Asn Ser Tre Leu Arg Val Val Ser Ala Leu Pro Ile Gln His Gln Asp Trp Met Ser Gli Lis Glu Fen Lis Cis Lis Val Asn Asn Lis Asp Leu Pro Ala Pro Ile Glu Arg Tre Ile Ser Lis Pro Lis Gli Ser Val Arg Ala Pro Gln Val Tir Val Leu Pro Pro Pro Glu Glu Glu Met Tre Lis Lis Gln Val Tre Leu Tre Cis Met Val Tre Asp Fen Met Pro Glu Asp Ile Tir Val Glu Trp Tre Asn Asn Gli Lis Tre Glu Leu Asn Tir Lis Asn Tre Glu Pro Val Leu Asp Ser Asp Gli Ser Tir Fen Met Tir Ser Lis Leu Arg Val Glu Lis Lis Asn Trp Val Glu Arg Asn Ser Tir Ser Cis Ser Val Val His Glu Gli Leu His Asn His His Tre Tre Lis Ser Fen Ser Arg Tre Pro Gli Lis
[0076] A sequência de aminoácidos da cadeia leve do produto biespecífico (MAb225_scFv_G8.8) é mostrada abaixo (referida como SEQ ID NO: 5): Met Arg Cis Leu Ala Glu Fen Leu Gli Leu Leu Val Leu Trp Ile Pro Gli Ala Ile Gli Asp Ile Leu Leu Tre Gln Ser Pro Val Ile Leu Ser Val Ser Pro Gli Glu Arg Val Ser Fen Ser Cis Arg Ala Ser Gln Ser Ile Gli Tre Asn Ile His Trp Tir Gln Gln Arg Tre Asn Gli Ser Pro Arg Leu Leu Ile Lis Tir Ala Ser Glu Ser Ile Ser Gli Ile Pro Ser Arg Fen Ser Gli Ser Gli Ser Gli Tre Asp Fen Tre Leu Ser Ile Asn Ser Val Glu Ser Glu Asp Ile Ala Asp Tir Tir Cis Gln Gln Asn Asn Asn Trp Pro Tre Tre Fen Gli Ala Gli Tre Lis Leu Glu Leu Lis Arg Ala Asp Ala Ala Pro Tre Val Ser Ile Fen Pro Pro Ser Ser Glu Gln Leu Tre Ser Gli Gli Ala Ser Val Val Cis Fen Leu Asn Asn Fen Tir Pro Lis Asp Ile Asn Val Lis Trp Lis Ile Asp Gli Ser Glu Arg Gln Asn Gli Val Leu Asn Ser Trp Tre Asp Gln Asp Ser Lis Asp Ser Tre Tir Ser Met Ser Ser Tre Leu Tre Leu Tre Lis Asp Glu Tir Glu Arg His Asn Ser Tir Tre Cis Glu Ala Tre His Lis Tre Ser Tre Ser Pro Ile Val Lis Ser Fen Asn Arg Asn Glu Cis
[0077] A sequência de aminoácidos da cadeia pesada do produto biespecífico (MAb225_scFv_G8.8) é mostrada abaixo (referida como SEQ ID NO: 6): Met Ala Val Leu Ala Leu Leu Fen Cis Leu Val Tre Fen Pro Ser Cis Val Leu Ser Gln Val Gln Leu Lis Gln Ser Gli Pro Gli Leu Val Gln Pro Ser Gln Ser Leu Ser Ile Tre Cis Tre Val Ser Gli Fen Ser Leu Tre Asn Tir Gli Val His Trp Val Arg Gln Ser Pro Gli Lis Gli Leu Glu Trp Leu Gli Val Ile Trp Ser Gli Gli Asn Tre Asp Tir Asn Tre Pro Fen Tre Ser Arg Leu Ser Ile Asn Lis Asp Asn Ser Lis Ser Gln Val Fen Fen Lis Met Asn Ser Leu Gln Ser Asn Asp Tre Ala Ile Tir Tir Cis Ala Arg Ala Leu Tre Tir Tir Asp Tir Glu Fen Ala Tir Trp Gli Gln Gli Tre Leu Val Tre Val Ser Ala Ala Lis Tre Tre Ala Pro Ser Val Tir Pro Leu Ala Pro Val Cis Gli Asp Tre Tre Gli Ser Ser Val Tre Leu Gli Cis Leu Val Lis Gli Tir Fen Pro Glu Pro Val Tre Leu Tre Trp Asn Ser Gli Ser Leu Ser Ser Gli Val His Tre Fen Pro Ala Val Leu Gln Ser Asp Leu Tir Tre Leu Ser Ser Ser Val Tre Val Tre Ser Ser Tre Trp Pro Ser Gln Ser Ile Tre Cis Asn Val Ala His Pro Ala Ser Ser Tre Lis Val Asp Lis Lis Ile Glu Pro Arg Gli Pro Tre Ile Lis Pro Cis Pro Pro Cis Lis Cis Pro Ala Pro Asn Leu Leu Gli Gli Pro Ser Val Fen Ile Fen Pro Pro Lis Ile Lis Asp Val Leu Met Ile Ser Leu Ser Pro Ile Val Tre Cis Val Val Val Asp Val Ser Glu Asp Asp Pro Asp Val Gln Ile Ser Trp Fen Val Asn Asn Val Glu Val His Tre Ala Gln Tre Gln Tre His Arg Glu Asp Tir Asn Ser Tre Leu Arg Val Val Ser Ala Leu Pro Ile Gln His Gln Asp Trp Met Ser Gli Lis Glu Fen Lis Cis Lis Val Asn Asn Lis Asp Leu Pro Ala Pro Ile Glu Arg Tre Ile Ser Lis Pro Lis Gli Ser Val Arg Ala Pro Gln Val Tir Val Leu Pro Pro Pro Glu Glu Glu Met Tre Lis Lis Gln Val Tre Leu Tre Cis Met Val Tre Asp Fen Met Pro Glu Asp Ile Tir Val Glu Trp Tre Asn Asn Gli Lis Tre Glu Leu Asn Tir Lis Asn Tre Glu Pro Val Leu Asp Ser Asp Gli Ser Tir Fen Met Tir Ser Lis Leu Arg Val Glu Lis Lis Asn Trp Val Glu Arg Asn Ser Tir Ser Cis Ser Val Val His Glu Gli Leu His Asn His His Tre Tre Lis Ser Fen Ser Arg Tre Pro Gli Lis Gli Gli Gli Gli Ser Gli Gli Gli Gli Ser Glu Val Gln Leu Ala Glu Ser Gli Gli Gli Leu Val Gln Pro Gli Arg Ser Met Lis Leu Ser Cis Ala Ala Ser Gli Fen Tre Fen Ser Asn Fen Pro Met Ala Trp Val Arg Gln Ala Pro Tre Lis Cis Leu Glu Trp Val Ala Tre Ile Ser Tre Ser Gli Gli Ser Tre Tir Tir Arg Asp Ser Val Lis Gli Arg Fen Tre Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lis Ser Tre Leu Tir Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ser Glu Asp Tre Ala Tre Tir Tir Cis Tre Arg Tre Leu Tir Ile Leu Arg Val Fen Tir Fen Asp Tir Trp Gli Gln Gli Val Met Val Tre Val Ser Ser Gli Gli Gli Gli Ser Gli Gli Gli Gli Ser Gli Gli Gli Gli Ser Asp Ile Gln Met Tre Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ser Ala Ser Leu Gli Glu Tre Val Ser Ile Glu Cis Leu Ala Ser Glu Gli Ile Ser Asn Asp Leu Ala Trp Tir Gln Gln Lis Ser Gli Lis Ser Pro Gln Leu Leu Ile Tir Ala Tre Ser Arg Leu Gln Asp Gli Val Pro Ser Arg Fen Ser Gli Ser Gli Ser Gli Tre Arg Tir Ser Leu Lis Ile Ser Gli Met Gln Pro Glu Asp Glu Ala Asp Tir Fen Cis Gln Gln Ser Tir Lis Tir Pro Trp Tre Fen Gli Cis Gli Tre Lis Leu Glu Leu Lis
[0078] Além disso, conforme ilustrado nas Figuras 20 e 21, como uma (nova) prova de conceito da presente invenção, o anticorpo biespecífico (BiAb) “BsAb EpCAM-EGFRvIII, MR 1.1” com um sítio de ligação para del- hEGFRvIII (humano) sobre um braço e para EpCAM (murino) no outro braço, foi construído; vide o Exemplo 4. A sequência de aminoácidos da cadeia leve do produto biespecífico (BsAb EpCAM-EGFRvIII, MR1.1) é mostrada na Figura 23A (referida como SEQ ID NO: 15). A sequência de aminoácidos da cadeia pesada do produto biespecífico (BsAb EpCAM-EGFRvIII, MR1.1) é mostrada na Figura 23B (referida como SEQ ID NO: 16).
[0079] A invenção também provê sequências de ácidos nucleicos que codificam uma molécula de anticorpo biespecífica da invenção.
[0080] É evidente para o técnico hábil no assunto que sequências regulatórias podem ser adicionadas à molécula de ácido nucleico da invenção. Por exemplo, podem ser utilizados promotores, facilitadores (enhancers) de transcrição e/ou sequências que permitem a expressão induzida do polinucleotídeo da invenção. Um sistema induzível adequado é, por exemplo, a expressão gênica regulada pela tetraciclina, tal como descrito, por exemplo por Gossen e Bujard, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89 (1992). 5547-5551 e Gossenet al. Trends Biotech. 12 (1994), 58-62, ou um sistema de expressão gênica induzível por dexametasona, tal como descrito, por exemplo, por Crook EMBO J. 8 (1989), 513-519.
[0081] Além disso, prevê-se para outros fins que as moléculas de ácido nucleico podem conter, por exemplo, ligações de tioéster e/ou nucleotídeos análogos. Tais modificações podem ser úteis para a estabilização da molécula de ácido nucleico contra endonucleases e/ou exonucleases na célula. As referidas moléculas de ácido nucleico podem ser transcritas por um vetor apropriado contendo um gene quimérico que permite a transcrição da referida molécula de ácido nucleico na célula. A este respeito, também deve ser compreendido que tal polinucleotídeo pode ser utilizado para as abordagens de “marcação de genes” ou de “genes terapêuticos”. Em outro exemplo de realização as referidas moléculas de ácido nucleico são marcadas. Os métodos para a detecção de ácidos nucleicos são bem conhecidos no estado da técnica, por exemplo, Southern e Northern blot, PCR ou extensão de primers. Este exemplo de realização poderá ser útil para métodos triagem para a verificação da introdução bem sucedida das moléculas de ácidos nucleicos descritas acima, durante as abordagens de terapia gênica.
[0082] A(s) referida(s) molécula(s) de ácidos nucleicos pode(m) ser molécula(s) de ácidos nucleicos quimérica(s) produzida(s) de maneira recombinante compreendendo qualquer uma das moléculas de ácidos nucleicos mencionadas acima, seja isoladamente ou em combinação. No contexto da presente invenção, a molécula de ácido nucleico é parte de um vetor.
[0083] Consequentemente, a presente invenção também se refere a um vetor compreendendo a molécula de ácido nucleico descrita na presente invenção.
[0084] Muitos vetores adequados são conhecidos para os especialistas em biologia molecular, e a escolha deles depende da função desejada e incluem plasmídeos, cosmídeos, vírus, bacteriófagos e outros vetores utilizados convencionalmente na área da engenharia genética. Os métodos que são bem conhecidos dos técnicos hábeis no assunto podem ser usados para construir diversos plasmídeos e vetores; vide, por exemplo, as técnicas descritas em Sambrook, et al. (cit. loc.) e Ausubel, Current Protocols in Molecular Biology, Green Publishing Associates & Wiley Interscience, NY (1989), (1994). Alternativamente, os polinucleotídeos e os vetores da invenção podem ser reconstituídos dentro de lipossomos para a entrega às células-alvo. Conforme discutido em maiores detalhes abaixo, um vetor de clonagem foi usado para isolar as sequências individuais de DNA. Sequências relevantes podem ser transferidas para vetores de expressão quando a expressão de um polipeptídeo específico é necessária. Os vetores de clonagem utilizados incluem tipicamente pBluescript SK, pGEM, pUC9, pBR322, pGA18 e pGBT9. Vetores de expressão típicos incluem pTRE, pCAL-n-EK, PESP-1, pOP13CAT.
[0085] A invenção também se refere a um vetor compreendendo uma sequência de ácido nucleico que é uma sequência regulatória operacionalmente ligada à referida sequência de ácido nucleico que codifica uma construção de anticorpo biespecífico (molécula) aqui definida.
[0086] Tais sequências regulatórias (elementos de controle) são conhecidas pelos técnicos hábeis no assunto e podem incluir um promotor, um cassete de splicing, códon de iniciação da tradução, sítio de inserção e tradução para a introdução de uma inserção no vetor. No contexto da presente invenção, a referida molécula de ácido nucleico está operacionalmente ligada às referidas sequências de controle da expressão, permitindo a expressão em células eucariotas ou procariotas.
[0087] Prevê-se que o referido vetor é um vetor de expressão que compreende a molécula de ácido nucleico codificante das construções de anticorpo biespecífico (moléculas) definidas na presente invenção.
[0088] O termo “sequência regulatória” refere-se às sequências de DNA que são necessárias para efetivar a expressão de sequências codificantes às quais estão ligadas. A Natureza de tais sequências de controle difere dependendo do organismo hospedeiro. Nos procariontes, as sequências de controle incluem geralmente promotor, sítio de ligação ao ribossomo, e terminadores. Nos eucariotos as sequências de controle geralmente incluem promotores, terminadores e em alguns casos, facilitadores (enhancers), transativadores ou fatores de transcrição. O termo “sequência de controle” pretende incluir, no mínimo, todos os componentes cuja presença é necessária para a expressão, e pode incluir também componentes adicionais vantajosos.
[0089] O termo “operacionalmente ligado” refere-se a uma justaposição em que os componentes assim descritos estão em uma relação que lhes permite funcionar da maneira pretendida. Uma sequência de controle “operacionalmente ligada” a uma sequência codificante está ligada de tal modo que a expressão da sequência codificante é conseguida sob condições compatíveis com as sequências de controle. No caso quando a sequência de controle é um promotor, é óbvio para um técnico hábil no assunto que o ácido nucleico de dupla fita é preferencialmente usado.
[0090] No contexto da presente invenção, o vetor citado é um vetor de expressão. Um “vetor de expressão” é uma construção que pode ser utilizada para transformar um hospedeiro selecionado e fornecer a expressão de uma sequência codificante no hospedeiro selecionado. Os vetores de expressão podem, por exemplo, ser vetores de clonagem, vetores binários ou vetores de integração. A expressão compreende a transcrição da molécula de ácido nucleico, de preferência na forma de um mRNA traduzível. Os elementos regulatórios que asseguram a expressão em células procarióticas e/ou eucarióticas são bem conhecidos pelos técnicos hábeis no assunto. No caso de células eucarióticas, elas incluem normalmente promotores que asseguram a iniciação da transcrição e, opcionalmente, os sinais poli-A que garantem a terminação da transcrição e a estabilização do transcrito. Possíveis elementos regulatórios que permitem a expressão em células hospedeiras procarióticas compreendem, por exemplo, o promotor PL, lac, trp ou tac em E. coli, e exemplos de elementos regulatórios que permitem a expressão em células hospedeiras eucariotas são o promotor AOX1 ou GAL1 na levedura ou CMV-, SV40-, VSR- (vírus do sarcoma de Rous), CMV-enhancer, SV40-enhancer ou um íntron globina em células de mamíferos e outros animais.
[0091] Ao lado de elementos que são responsáveis pela iniciação da transcrição tais elementos regulatórios podem também compreender sinais de terminação da transcrição, tais como o sítio SV40-poli-A ou sítio tk-poli-A, a jusante do polinucleotídeo. Além disso, dependendo do sistema de expressão utilizado podem ser adicionadas à sequência codificante da sequência de ácido nucleico citada; sequências líderes capazes de direcionar o polipeptídeo para um compartimento celular ou capazes secretar o polipeptídeo para o meio, tais sequências são bem conhecidas no estado da técnica; vide também, por exemplo, os exemplos anexos.
[0092] A(s) sequência(s) líder é(são) montadas em fase adequada com as sequências de tradução, iniciação e terminação e, preferencialmente, uma sequência líder capaz de direcionar a secreção da proteína traduzida, ou uma porção desta, para dentro do espaço periplásmico ou para o meio extracelular. Opcionalmente, a sequência heteróloga pode codificar uma proteína de fusão incluindo um peptídeo de identificação N-terminal conferindo características desejadas, por exemplo, estabilização ou purificação simplificada do produto recombinante expresso; vide supra. Neste contexto, os vetores de expressão adequados que são conhecidos no estado da técnica, tais como cDNA Okavama-Berg vetor de expressão pcDV1 (Pharmacia), pCDM8, pRc/CMV, pcDNAl, pcDNA3 (Invitrogen), pEF-DHFR, pEF-ADA ou pEF-neo (Raumet al. Cancer Immunol Immunother 50 (2001). 141-150) ou pSPORTl (GIBCO BRL).
[0093] No contexto da presente invenção, as sequências de controle da expressão serão sistemas promotores eucarióticos em vetores capazes de transformar ou transfectar células hospedeiras eucarióticas, mas também podem ser utilizadas sequências de controle para hospedeiros procariotas. Uma vez que o vetor tenha sido incorporado ao hospedeiro apropriado, o hospedeiro é mantido sob condições adequadas para a expressão em alto nível das sequências nucleotídicas, e, conforme desejado, a coleta e purificação do polipeptídeo da invenção a seguir; vide, por exemplo, os exemplos anexos.
[0094] Um sistema de expressão alternativo que poderia ser usado para expressar uma proteína que interage com o ciclo celular é um sistema de inseto. Em tal sistema, o vírus de poliedrose nuclear Autographa californica (AcNPV) é utilizado como um vetor para expressar genes estranhos em células de Spodoptera frugiperda ou em larvas de Trichoplusia. A sequência codificante de uma molécula de ácido nucleico recitada pode ser clonada de uma região não essencial do vírus, tal como o gene da poliedrina, e colocadas sob o controle do promotor da poliedrina. A inserção bem sucedida da referida sequência codificante irá processar o gene da poliedrina inativo e produzir vírus recombinantes sem a capa proteica. Os vírus recombinantes são então utilizados para infectar células de S. frugiperda ou larvas de Trichoplusia nos quais a proteína da invenção é expressa (Smith, J. Virol. 46 (1983), 584; Engelhard. Proc. Nat. Acad. Sci. USA 91 (1994). 3.224-3.227).
[0095] Elementos regulatórios adicionais podem incluir transcrição, bem como facilitadores (enhancers) da tradução. De modo vantajoso, os vetores da invenção descrita acima compreendem um marcador selecionável e/ou contável.
[0096] Os genes marcadores selecionáveis úteis para a seleção de células transformadas e, por exemplo, tecido da planta e plantas são bem conhecidos pelos técnicos hábeis no assunto e incluem, por exemplo, a resistência á antimetabolitos como base de seleção para dhfr, que confere resistência ao metotrexato (Reiss, Plant Physiol. (Life Sei. Adv.) 13 (1994), 143-149), npt, que confere resistência aos aminoglicosídeos neomicina, canamicina e paromicina (Herrera-Estrella, EMBO J. 2 (1983), 987-995) e higro, que confere resistência à higromicina (Marsh, Gene 32 (1984), 481-485). Genes selecionáveis adicionais têm sido descritos, nomeadamente, o trpB, que permite que as células utilizem indol em vez de triptofano; hisD, que permite que as células utilizem hislinol no lugar de histidina (Hartman, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85 (1988). 8047); manose-6-fosfato isomerase, que permite que as células utilizem a manose (WO 94/20627) e ODC (ornitina-descarboxilase) que confere resistência ao inibidor da ornitina-descarboxilase, 2-(difluorometil)-DL-ornitina, DFMO ( McConlogue, 1987. Em: Current Communications in Molecular Biology, Cold Spring Harbor Laboratory ed.) ou deaminase de Aspergillus terreus que confere resistência à blasticidina S (Tamura, Biosci. Biotechnol. Biochem. 59 (1995), 2336-2338).
[0097] Marcadores contáveis úteis também são conhecidos pelos técnicos hábeis no assunto e estão disponíveis comercialmente. De maneira vantajosa, o referido marcador é um gene que codifica a luciferase (Giacomin, Pl. Sci. 116 (1996), 59-72; Scikantha, J. Bact. 178 (1996), 121), proteína verde fluorescente (Gerdes, FEBS Lett. 389 (1996), 44-47) ou β-glicuronidase (Jefferson, EMBO J. 6 (1987), 3901-3907). Este exemplo de realização é particularmente útil a triagem simples e rápida de células, tecidos ou organismos que contêm um vetor citado.
[0098] Conforme descrito acima, a molécula de ácido nucleico descrita pode ser utilizada sozinha ou como parte de um vetor para expressar a construção biespecífica codificado em células, por exemplo, para a purificação, mas também para fins de terapia gênica, de preferência em combinação com as células T CD8+ transduzidas. As moléculas de ácidos nucleicos ou vetores contendo a(s) sequência (s) de DNA que codifica(m) qualquer uma das construções biespecíficas descritas acima são introduzidas nas células que, por sua vez, produzem o polipeptídeo de interesse. A terapia gênica, que é baseada na introdução de genes terapêuticos em células por técnicas ex vivo ou in vivo, é uma das aplicações mais importantes da transferência de genes. Os vetores adequados, métodos ou sistemas de entrega de gene para os métodos ou sistemas de entrega de gene para a terapia gênica in vitro ou in vivo encontram- se descritos na literatura e são conhecidos pelos técnicos do assunto; vide, por exemplo, Giordano, Nature Medicine 2 (1996), 534-539; Schaper, Circ. Res. 79 (1996), 911-919; Anderson, Science 256 (1992), 808-813; Verma, Nature 389 (1994), 239; Isner, Lancet 348 (1996), 370-374; Muhlhauser, Circ. Res. 77 (1995), 1077-1086; Onodera, Blood 91 (1998), 30-36; Verma, Gene Ther. 5 (1998), 692-699; Nabel, Ann. N.Y. Acad. Sci. 811 (1997), 289-292; Verzeletti, Hum. Gene Ther. 9 (1998), 2243-51; Wang, Nature Medicine 2 (1996), 714-716; WO 94/29469; WO 97/00957; US 5.580.859; US 5.589.466; ou Schaper, Current Opinion in Biotechnology 7 (1996), 635-640. As moléculas de ácido nucleico e vetores citados podem ser concebidos para introdução direta ou para introdução através de lipossomos, ou vetores virais (por exemplo, adenovirais, retrovirais) na célula. No contexto da presente invenção, a referida célula é uma célula da linhagem germinal, célula embrionária, ou célula de ovo ou derivada destas, mais preferencialmente, a referida célula é uma célula-tronco. Um exemplo de uma célula-tronco embrionária pode ser, inter alia, uma célula tronco, tal como descrito em Nagy, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90 (1993). 8424-8428.
[0099] De acordo com o exposto, a presente invenção refere-se aos métodos para derivar os vetores, particularmente plasmídeos, cosmídeos e bacteriófagos utilizados convencionalmente na engenharia genética, que compreendem uma molécula de ácido nucleico codificante da sequência polipeptídica de uma construção de anticorpo biespecífico definida no presente. No contexto da presente invenção, o referido vetor é um vetor de expressão e/ou uma transferência de genes ou vetor de direcionamento. Vetores de expressão derivados de vírus, como retrovírus, vírus vaccinia, vírus adeno-associado, vírus herpes, ou vírus do papiloma bovino, podem ser utilizados para a entrega dos polinucleotídeos citados ou vetor em populações de células-alvo.
[0100] Os métodos que são bem conhecidos para os técnicos hábeis no assunto podem ser utilizados para construir vetores recombinantes; vide, por exemplo, as técnicas descritas em Sambrook et al. (Loc cit), Ausubel (1989, loc cit. ou outros livros de texto padrão. Alternativamente, as moléculas de ácido nucleico e vetores citados podem ser reconstituídos em lipossomos para distribuição para células alvo. Os vetores que contêm as moléculas de ácido nucleico da invenção podem ser transferidos para a célula hospedeira por meio de métodos bem conhecidos, que variam dependendo do tipo de célula hospedeira. Por exemplo, a transfecção por cloreto de cálcio é comumente utilizada para células procariotas, enquanto o tratamento com fosfato de cálcio ou eletroporação podem ser utilizados para outras células hospedeiras; vide Sambrook. supra. O vetor citados podem ser, inter alia, o pEF-DHFR, pFE-ADA ou pFE-neo. Os vetores de pEF-DHFR, pEF-ADA e pEF-neo foram descritos no estado da técnica, por exemplo, em Mack et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92 (1995), 7021-7025 e Raum et al. Cancer Immunol. Immunother. 50 (2001), 141150.
[0101] A invenção também provê um hospedeiro transformado ou transfectado com um vetor tal como descrito no presente. O referido hospedeiro pode ser produzido pela introdução de pelo menos um do vetor descrito acima, ou pelo menos uma das moléculas de ácido nucleico descritas acima na célula hospedeira. A presença do referido pelo menos um vetor, ou pelo menos uma molécula de ácido nucleico no hospedeiro pode mediar a expressão de um gene que codifica as moléculas de anticorpo biespecífico descrita acima ou construções (ou seja, as moléculas de anticorpo biespecífico descritas na presente invenção).
[0102] A molécula de ácido nucleico ou vetor descrito o qual é introduzido no hospedeiro pode integrar-se no genoma do hospedeiro ou pode ser mantido extracromossomicamente.
[0103] O hospedeiro pode ser qualquer célula procariótica ou eucariótica.
[0104] O termo “procariota” pretende incluir todas as bactérias que podem ser transformadas, transduzidas ou transfectadas com DNA ou moléculas de DNA ou RNA para a expressão de uma proteína da invenção. Os hospedeiros procariotas podem incluir bactérias gram negativas bem como bactérias gram positivas, tais como, por exemplo, E. coli, S. typhimurium, Serratia marcescens e Bacillus subtilis. O termo “eucariótica” pretende incluir células de leveduras, plantas superiores, insetos e preferencialmente células de mamíferos. Dependendo do hospedeiro utilizado em um procedimento de produção recombinante, a proteína codificada pelo polinucleotídeo da presente invenção pode ser glicosilada ou pode ser não glicosilada. É especialmente preferido o uso de um plasmídeo ou vírus que contém a sequência codificante do polipeptídeo da invenção e geneticamente fundido a ela um FLAG-tag N-terminal e/ou His-tag C-terminal. De preferência, o comprimento do referido FLAG-tag é de cerca de 4 a 8 aminoácidos e mais preferencialmente de 8 aminoácidos. Um polinucleotídeo descrito acima pode ser utilizado para transformar ou transfectar o hospedeiro utilizando qualquer técnica normalmente conhecida pelos técnicos hábeis no assunto. Além disso, métodos para a preparação, dos genes operacionalmente ligados fundidos e expressando eles, por exemplo, em células de mamíferos e bactérias, são bem conhecidos no estado da técnica (Sambrook, loc cit).
[0105] No contexto da presente invenção, o hospedeiro (célula) é uma bactéria, uma célula de inseto, célula fúngica, vegetal ou animal.
[0106] É particularmente previsto que o hospedeiro citado pode ser uma célula de mamífero, mais preferencialmente uma célula humana ou linhagem celular humana.
[0107] Células hospedeiras particularmente preferidas compreendem células HEK293, CHO, COS, linhagens de células de mieloma, como SP2/0 ou NS/0. Conforme ilustrado nos exemplos anexos, são particularmente preferidas como hospedeiras as células HEK293.
[0108] Em outra exemplo de realização, a presente invenção refere- se a um método para a produção de uma construção ou molécula de anticorpo biespecífico (ou seja, a molécula de anticorpo biespecífico descrita no presente) descrita acima compreendendo a cultura (cultivo) de uma célula e/ou célula hospedeira da invenção sob condições que permitam a expressão da construção ou molécula de anticorpo biespecífico (ou seja, a molécula de anticorpo biespecífico descrita no presente) e a recuperação da molécula ou construção (ou seja, a molécula de anticorpo biespecífico descrita no presente) a partir da célula e/ou meio de cultura.
[0109] Os hospedeiros transformados podem ser cultivados em fermentadores e cultivados de acordo com técnicas conhecidas no estado da técnica para atingir um crescimento celular ótimo. O polipeptídeo da invenção pode então ser isolado a partir do meio de crescimento. O isolamento e purificação dos polipeptídeos, por exemplo, microbianamente expressos, da invenção podem ser feitos por quaisquer meios convencionais, tais como, por exemplo, separações por cromatografia preparativa e separações imunológicas, tais como aquelas que envolvem o uso de anticorpos monoclonais ou policlonais direcionados, por exemplo, contra uma marcação (tag) do polipeptídeo da invenção ou conforme descrito nos exemplos anexos.
[0110] Além disso, a invenção provê uma composição (medicamento) que compreende uma molécula de anticorpo biespecífico (monoclonal), tal como definido na presente invenção ou uma molécula de anticorpo biespecífico (humano), produzido pelo método descrito acima, uma molécula de ácido nucleico da invenção, um vetor ou hospedeiro da invenção transduzido em células T CD8+. No contexto da presente invenção, a referida composição é uma composição farmacêutica que compreende opcionalmente formulações adequadas de transportadores, estabilizantes e/ou excipientes.
[0111] Além disso, a invenção provê uma molécula de anticorpo biespecífico conforme definido na presente invenção para uso como um medicamento, em que a referida molécula de anticorpo biespecífico deve ser administrada antes, simultaneamente ou após a administração de células T CD8+ transduzidas que compreendem um antígeno que não ocorre naturalmente em ou sobre células T CD8+, e em que as referidas células T CD8+ foram obtidas a partir de um sujeito a ser tratado.
[0112] No contexto da presente invenção, é fornecida uma composição farmacêutica/medicamento que compreende uma molécula de anticorpo biespecífico, tal como definido acima, que deve ser administrada em combinação com células T CD8+ transduzidas compreendendo um antígeno que não ocorre naturalmente em ou sobre células T CD8+, em que a referida molécula de anticorpo biespecífico deve ser administrada antes, simultaneamente ou após a administração das células T CD8+ transduzidas compreendendo um antígeno que não ocorre naturalmente em ou sobre células T CD8+; e em que as referidas células T CD8+ foram obtidas a partir de um sujeito a ser tratado.
[0113] No contexto da presente invenção as células T são transduzidas com um antígeno que não ocorrem naturalmente/que não é expresso endogenamente nas e/ou sobre as células T, tal como definido acima. A invenção também se refere às células T CD8+ que são transduzidas com um antígeno que não ocorre naturalmente/que não é expresso endogenamente nas e/ou sobre as células T CD8+, tal como definido acima. No contexto da presente invenção, estas células T transduzidas (células T CD8+) compreendem ainda um receptor de células T (TCR). Estas células T transduzidas (células T CD8+), são tumor-específicas, seja porque estas células T foram isoladas a partir de um pool natural de células T autólogas e são capazes de lisar células tumorais ou porque estas células T foram cotransduzidas com um receptor de células T (TCR) tumor- específico. As células T (células T CD8+) incluem, no contexto da presente invenção, também aquelas que são capazes de reconhecer um complexo de um receptor de células T, o complexo que é um conjugado de um complexo principal de histocompatibilidade (doravante referido simplesmente como “MHC”) que codifica a molécula antígeno do complexo principal de histocompatibilidade (molécula do MHC, no caso do ser humano que é chamada de “antígeno de leucócito humano” (HLA)) e um peptídeo receptor de células T específicas do antígeno (que é (estruturalmente) diferente do antígeno que não ocorre naturalmente nas células T CD8+, tal como definido acima). Consequentemente, no contexto da presente invenção, a fim de estabelecer uma reação citotóxica, pode ser necessário que (i) um célula T (célula T CD8+) que tem um receptor de células T específico para o tipo HLA de uma célula-alvo (referindo-se a célula tumoral do sujeito a ser tratado) existe e (ii) um antígeno peptídico, de modo que um complexo formado pela ligação da molécula HLA é capaz de ser reconhecido pelo TCR.
[0114] O termo “receptor de célula T”, conforme utilizado no presente refere-se a qualquer receptor de células T, desde que os três critérios seguintes sejam cumpridos: (i) especificidade tumoral, (ii) reconhecimento de (da maioria) células tumorais, o que significa que um antígeno-alvo deve ser expresso nas células de tumor (na maioria); e (iii) que o TCR coincida com o tipo de HLA do sujeito a ser tratado.
[0115] Neste contexto, os receptores de células T apropriados que cumprem os três critérios mencionados acima são conhecidos no estado da técnica, tal como WT1 (antígeno tumor-específico de Wilms 1; para informações de sequência vide, por exemplo, Sugiyama H, Japanese Journal of Clinical Oncology 40 (2010), 377-87), MAGE (para a sequência vide. Por exemplo, WO 2007/032255 e PCT/US2011/57272), SSX (Pedido de Patente US 61/388.983), NY-ESO-1 (para informações de sequência vide, por exemplo, PCT/GB2005/001924) e/ou Her2neu (para informações de sequências vide WO 2011/0280894).
[0116] No contexto da presente invenção, as células T (células T CD8+) são isoladas/obtidas a partir de um sujeito. Os métodos para isolar/obter células T (células T CD8+) a partir de pacientes são bem conhecidos no estado da técnica e incluem, sem se limitar, a leucoferese de um paciente, isolamento/obtenção de células utilizando um aparelho FACSort, a seleção de células vivas a partir de células mortas de biópsias frescas manualmente ou utilizando um micromanipulador (Dudley et al., J. Immunother. 26 (2003), 332-342; Robbinset al., J. Clin. Oncol. 29 (2011), 917-924 e Leisegang, J. Mol. Med. 86 (2008), 573-58). O termo “biopsia fresca do paciente” refere-se ao tecido tumoral removido de um sujeito por meios cirúrgicos ou quaisquer outros meios conhecidos, bem como linhagens de células tumorais ou células (isoladas) a partir de um tecido tumoral/célula de tumor. As células T isoladas/obtidas são subsequentemente cultivadas e expandidas pelo uso de um anticorpo anti-CD3, usando anticorpos anti-CD3 e anti-CD28 monoclonais e/ou utilizando um anticorpo anti-CD3, um anticorpo anti-CD28 e IL- 2 (Dudley et al, J. Immunother. 26 (2003), 332-342; Dudley et al, J. Clin. Oncol. 26 (2008), 5233-5239).
[0117] No contexto da presente invenção, estas células T isoladas/obtidas são células T CD8+. Métodos para identificar antígenos/marcadores na superfície celular de ocorrência natural/endogenamente expressos são conhecidos no estado da técnica e incluem, sem caráter limitativo, citometria de fluxo (Koch et al., Immunity & Ageing 5 (2008), 6), reação em cadeia da polimerase (Fernandes S., Clinical and Diagnostic Laboratory Immunology 12 (2005), 477-483) e microscopia confocal (Kenny E. et al. Immunology 101 (2000), 178-184).
[0118] Em uma etapa subsequente, as células T são artificialmente/geneticamente modificadas/transduzidas por métodos conhecidos no estado da técnica (François M. Lemoine et al., J Gene Med 6 (2004), 374-386). Métodos para a transdução de células T são conhecidos no estado da técnica e incluem, sem se limitar, no caso em que o ácido nucleico ou ácido nucleico recombinante é transduzida, por exemplo, um método de eletroporação, método de fosfato de cálcio, método de lipídeos catiônicos ou método de lipossomos. O nucleico a ser transduzido pode ser transduzido de maneira convencional e altamente eficiente utilizando um reagente de transfecção disponível comercialmente, por exemplo, Lipofectamina (fabricado pela Invitrogen). No caso de ser utilizado um vetor, o vetor pode ser transduzido do mesmo modo que o ácido nucleico mencionado acima, desde que o vetor seja um vetor plasmidial. No contexto do presente pedido, os métodos para a transdução de células T incluem a transdução de células T retroviral ou lentiviral, bem como transfecção de mRNA.
[0119] Neste contexto, vetores (retrovirais) apropriados para transdução de células T (humanas) são conhecidos no estado da técnica, tais como SAMEN CMV/SRa (Clayet al., J. Immunol. 163 (1999), 507-513), LZRS- id3-IHRES (Heemskerket al., J. Exp. Med. 186 (1997), 1597-1602), FeLV (Neilet al., Nature 308 (1984), 814-820), SAX (Kantoffet al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83 (1986), 6563-6567), pDOL (Desiderio, J. Exp. Med. 167 (1988), 372-388), N2 (Kasidet al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87 (1990), 473-477), LNL6 (Tiberghienet al., Blood 84 (1994), 1333-1341), pZipNEO (Chenet al., J. Immunol. 153 (1994), 3630-3638), LASN (Mullenet al., Hum. Gene Ther. 7 (1996), 1123-1129), pG1XsNa (Tayloret al., J. Exp. Med. 184 (1996), 2031-2036), LCNX e LXSN (Sunet al., Hum. Gene Ther. 8 (1997), 1041-1048), SFG (Gallardoet al., Blood 90 (1997), 952-957), HMB-Hb-Hu (Vieillardet al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94 (1997), 11595-11600), pMV7 (Cochloviuset al., Cancer Immunol. Immunother. 46 (1998), 61-66), pSTITCH (Weitjenset al., Gene Ther 5 (1998), 1195-1203), pLZR (Yanget al., Hum. Gene Ther. 10 (1999), 123-132), pBAG (Wuet al., Hum. Gene Ther. 10 (1999), 977-982), rKat.43.267bn (Gilhamet al., J. Immunother. 25 (2002), 139-151), pLGSN (Engels et al., Hum. Gene Ther. 14 (2003), 1155-1168), pMP71 (Engels et al., Hum. Gene Ther. 14 (2003), 1155-1168), pGCSAM (Morgan et al., J. Immunol. 171 (2003), 3287-3295), pMSGV (Zhaoet al., J. Immunol. 174 (2005), 4415-4423), pMX (de Witteet al., J. Immunol. 181 (2008), 5128-5136).
[0120] De acordo com esta invenção, o termo “medicamento” é utilizado de maneira alternada com o termo “composição farmacêutica” e refere- se a uma composição para administração a um paciente, preferivelmente um paciente humano. No contexto da presente invenção, o medicamento/composição farmacêutica é para ser administrado a um paciente a partir do qual as células T CD8+ foram isoladas/obtidas. No contexto da presente invenção, paciente refere-se ao paciente humano. Além disso, no contexto da presente invenção, o paciente sofre de uma doença, em que a referida doença é uma doença maligna, especialmente cânceres/carcinomas de origem epitelial, endotelial ou mesotelial ou um câncer do sangue. No contexto da presente invenção, o câncer/carcinoma é selecionado a partir do grupo consistindo em câncer gastrointestinal, câncer pancreático, câncer colangiocelular, câncer de pulmão, câncer de mama, câncer de ovário, câncer de pele, câncer oral, câncer gástrico, câncer do colo do útero, linfoma de célula B e T, leucemia mieloide, câncer ovariano, leucemia, leucemia linfática, carcinoma de nasofaringe, câncer de cólon, câncer de próstata, câncer de células renais, câncer de cabeça e pescoço, câncer de pele (melanoma), cânceres do trato genitor-urinário, por exemplo, câncer de testículo, câncer endotelial, câncer de colo do útero e câncer renal, câncer do ducto biliar, câncer de esôfago, câncer de glândulas salivares e câncer da glândula tireoide ou outras doenças tumorais como os tumores hematológicos, gliomas, sarcomas ou osteossarcomas.
[0121] Em um exemplo de realização preferido, a composição farmacêutica/medicamento compreende uma molécula de anticorpo biespecífico, tal como definido na presente invenção para uso parenteral, transdérmico, intraluminal, intra-arterial, intratecal ou por injeção direta no tecido ou tumor. No contexto da presente invenção, o composto/medicamento compreende uma molécula de anticorpo biespecífico, tal como definido na presente invenção, que é para ser administrado antes, simultaneamente ou após a administração das células T CD8+ transduzidas que compreendem um antígeno que não é expresso endogenamente/de ocorrência natural em na superfície das células T. No contexto da presente invenção, a composição farmacêutica/medicamento compreendendo uma molécula de anticorpo biespecífico, tal como definido utilizado deve ser administrada em combinação com células T CD8+ transduzidas compreendendo um antígeno que não ocorre naturalmente no interior ou sobre as células T CD8+, em que as referidas células T CD8+ foram obtidas a partir de um sujeito a ser tratado.
[0122] O uso do termo “em combinação” não restringe a ordem em que os componentes do regime de tratamento serão administrados ao sujeito. Consequentemente, a composição farmacêutica/medicamento descrito na presente invenção compreendo a administração de uma molécula de anticorpo biespecífico, tal como definido no presente antes, simultaneamente ou após a administração de células T CD8+ transduzidas que compreendem um antígeno que não ocorre naturalmente/não é expresso endogenamente nas ou sobre as células T CD8+. “Em combinação”, tal como utilizado no presente também não restringe o tempo entre a administração de uma molécula de anticorpo biespecífico, tal como definido no presente antes das células T CD8+ transduzidas, compreendendo um antígeno que não ocorre naturalmente/não é expresso endogenamente nas ou sobre as células T CD8+. Assim, quando os dois componentes não são administrados simultaneamente/ concomitantemente, as administrações podem ser separadas por 1 minuto, 5 minutos, 15 minutos, 30 minutos, 45 minutos, 1 hora, 2 horas, 4 horas, 6 horas, 12 horas, 24 horas, 48 horas ou 72 horas, ou por qualquer tempo diferencial adequado prontamente determinado por um técnico hábil no assunto e/ou descrito na presente invenção.
[0123] No contexto da presente invenção, o termo “em combinação” abrange também a situação em que a molécula de anticorpo biespecífico, tal como definido na presente invenção e as células T CD8+ transduzidas compreendendo um antígeno que não ocorre naturalmente/não é expresso endogenamente nas e/ou sobre células T CD8+ são pré-incubadas juntas, antes da administração ao sujeito. Assim, os dois componentes podem ser pré- incubados antes da administração, por exemplo, por 1 minuto, 5 minutos. 10 minutos, 15 minutos, 30 minutos, 45 minutos ou 1 hora ou por qualquer tempo adequado prontamente determinado por um técnico hábil no assunto. A invenção, em outro exemplo de realização preferido, refere-se a um regime de tratamento em que a molécula de anticorpo biespecífico, tal como definido no presente, e as células T CD8+ transduzidas compreendendo um antígeno/marcador que não ocorre naturalmente/não é expresso endogenamente nas, e/ou sobre as células T CD8+, são administradas simultaneamente / concomitantemente. No contexto da presente invenção, a molécula de anticorpo biespecífico, tal como definido no presente, pode ser administrada após a administração das células T CD8+ transduzidas compreendendo um antígeno que não ocorre naturalmente/não é expresso endogenamente nas e/ou sobre as células T CD8+.
[0124] Além disso, “em combinação” conforme utilizado na presente invenção não restringe os regimes de tratamento descritos para a administração de uma molécula de anticorpo biespecífico, tal como definido no presente e células T CD8+ transduzidas compreendendo um antígeno que não ocorre naturalmente/ não é expresso endogenamente nas ou sobre as células T CD8+ imediatamente após (ou seja, a administração de um dos dois componentes, seguida (depois de certo intervalo de tempo)) a administração do outro, sem a administração e/ou prática de qualquer outro protocolo de tratamento no intervalo entre elas. Portanto, os presentes regimes de tratamento abrangem também a administração separada de uma molécula de anticorpo biespecífico, tal como definido no presente, e células T CD8+ transduzidas compreendendo um antígeno que não ocorre naturalmente/ não é expresso endogenamente nas ou sobre as células T CD8+, em que as administrações são separadas por um ou mais protocolos necessários e/ou adequadas para o tratamento ou prevenção da doença, ou um sintoma desta. Os exemplos de tais protocolos de tratamento intervenientes incluem mas não estão limitados a, administração de analgésicos; administração de agentes quimioterapêuticos, manipulação cirúrgica da doença ou de um sintoma desta. Deste modo, os regimes de tratamento conforme divulgado na presente invenção compreendem a administração de uma molécula de anticorpo biespecífico, tal como definido no presente e células T CD8+ transduzidas compreendendo um antígeno que não ocorre naturalmente/não é expresso endogenamente nas ou sobre as células T CD8+, juntamente com nenhum, um, ou mais do que um protocolo de tratamento adequado para o tratamento ou prevenção de uma doença ou sintoma desta, tal como descrito na presente invenção ou como conhecido no estado da técnica.
[0125] Está particularmente previsto que o referido medicamento/composição farmacêutica é destinado a ser administrado a um paciente por meio de infusão ou injeção. No contexto da presente invenção, as células T CD8+ transduzidas que compreendem um antígeno que não ocorre naturalmente em ou sobre células T CD8+ devem ser administradas a um paciente através de infusão ou injeção. A administração das composições/medicamentos adequados pode ser efetuada por diferentes vias; intravenosa, intraperitoneal, subcutânea, intramuscular, tópica ou intradérmica.
[0126] A composição farmacêutica/medicamento de acordo com a presente invenção pode compreender ainda um veículo farmaceuticamente aceitável. Exemplos de veículos farmacêuticos adequados são bem conhecidos no estado da técnica e incluem soluções salinas tamponadas com fosfato, água, emulsões, tais como emulsões óleo/água, vários tipos de agentes umectantes, soluções estéreis etc. As composições que compreendem tais veículos podem ser formuladas por métodos convencionais bem conhecidos. Estas composições farmacêuticas podem ser administradas ao sujeito em uma dose adequada. O regime de dosagem será determinado pelo médico assistente e fatores clínicos. Conforme conhecido nas técnicas médicas, as dosagens para qualquer paciente dependem de muitos fatores, incluindo o tamanho do paciente, a área de superfície corpórea, idade, composto específico que está sendo administrado, sexo, tempo e via de administração, saúde geral do paciente, e outros medicamentos sendo administrados concomitantemente. Em geral, o regime como uma administração regular da composição farmacêutica deve estar no intervalo de 1 μg a 5 unidades de g por dia. No entanto, uma dosagem mais preferida para infusão contínua pode estar no intervalo de 0,01 μg a 2 mg, preferencialmente de 0,01 μg de 1 mg, mais preferencialmente de 0,01 μg a 100 μg, e ainda mais preferivelmente de 0,01 μg a 50 μg e mais preferivelmente ainda de 0,01 μg a 10 μg por quilograma de peso corporal por hora. As dosagens particularmente preferidas são citadas abaixo. O progresso pode ser monitorado pela avaliação periódica. As dosagens poderão variar, mas uma dosagem preferida para a administração intravenosa de DNA é de aproximadamente 106 a 1012 cópias da molécula de DNA. As composições da invenção podem ser administradas localmente ou sistemicamente. A administração geralmente será por via parenteral, por exemplo, por via intravenosa; o DNA também pode ser administrado diretamente ao local alvo, por exemplo, por entrega biolistica em um sítio alvo interno ou externo ou por cateter para um local em uma artéria. As preparações para administração parenteral incluem soluções estéreis aquosas ou não aquosas, suspensões e emulsões. Exemplos de solventes não aquosos são propileno glicol, polietileno glicol, óleos vegetais tais como óleo de oliva e ésteres orgânicos injetáveis como oleato de etila. Os veículos aquosos incluem água, soluções alcoólicas/aquosas, emulsões ou suspensões, incluindo meios salinos e tamponados. Os veículos parenterais incluem solução de cloreto de sódio, dextrose de Ringer, dextrose e cloreto de sódio, solução de Ringer com lactato, ou óleos fixos. Os veículos intravenosos incluem fluidos e repositores de nutrientes, repositores de eletrólitos (tais como aqueles baseados em dextrose de Ringer), e similares. Conservantes e outros aditivos podem também estar presentes, tais como, por exemplo, antimicrobianos, antioxidantes, agentes quelantes, gases inertes e similares. Além disso, a composição farmacêutica da presente invenção pode compreender transportadores proteicos, como, por exemplo, albumina do soro ou imunoglobulina, preferencialmente de origem humana. Prevê-se que a composição farmacêutica da invenção pode compreender além das construções de anticorpo biespecífico proteicas ou moléculas de ácidos nucleicos ou vetores que codificam as mesmas (tal como descrito na presente invenção), agentes biologicamente ativos adicionais, dependendo do uso ao qual a composição farmacêutica é destinada. Tais agentes podem ser drogas que atuam sobre o sistema gastrointestinal, drogas que atuam como citostáticos, drogas que previnem a hiperuremia, drogas inibidoras de imunoreações (por exemplo, corticosteroides), medicamentos que atuam sobre o sistema circulatório e/ou agentes como moléculas coestimulantes de células T ou citocinas conhecidas no estado da técnica.
[0127] Possível indicação para a administração da(s) composição(s)/medicamento(s) da invenção são doenças malignas epiteliais especialmente cânceres/carcinomas, tais como câncer de mama, câncer de cólon, câncer de próstata, câncer de cabeça e pescoço, câncer de pele (melanoma), câncer do trato genitor-urinário, por exemplo, câncer de ovário, câncer de testículo, câncer endotelial, câncer de colo do útero e câncer de rim, câncer de pulmão, câncer de estômago, câncer do ducto biliar, câncer de esôfago, câncer das glândulas salivares e câncer da glândula tireoide ou outras doenças tumorais, como os tumores hematológicos, gliomas, sarcomas ou osteossarcoma.
[0128] A invenção prevê ainda protocolos de coadministração com outros compostos, por ex. moléculas capazes de fornecer um sinal de ativação para células imuno-efetoras, para a proliferação celular ou para a estimulação celular. A referida molécula pode ser, por exemplo, um sinal de ativação primário de células T (por exemplo, uma molécula coestimuladora adicional: moléculas da família B7, Ox40L, 4.1 BBL, CD40L, anti-CTLA-4, anti-DP-1), ou uma outra citocina interleucina (por exemplo. IL-2).
[0129] A composição da invenção tal como descrito acima pode também ser uma composição de diagnóstico que compreende adicionalmente, opcionalmente, meios e métodos para a detecção.
[0130] As moléculas de ligação biespecíficas ou construções (ou seja, moléculas de anticorpo biespecífico descritas na presente invneção) fornecidas também são adequadas para uso em imunoensaios, nos quais elas podem ser utilizadas em fase líquida ou ligadas a um veículo de fase sólida. Exemplos de imunoensaios que podem utilizar o polipeptídeo da invenção são imunoensaios competitivos e não competitivos em um formato direto ou indireto. Exemplos de tais imunoensaios são; o ensaio imunoadsorvente enzima- associado (ELISA), imunoensaio enzimático (EIA), radioimunoensaio (RIA), ensaio tipo sanduíche (ensaio imunométrico) e o ensaio de Western blot.
[0131] As moléculas de ligação biespecíficas ou construções (ou seja, as moléculas de anticorpos biespecíficos descritas na presente invenção) da presente invenção podem ser ligadas a muitos veículos diferentes e utilizadas para isolar células especificamente ligadas aos referidos polipeptídeos. Exemplos de transportadores bem conhecidos incluem vidro, poliestireno, cloreto de polivinila, polipropileno, polietileno, policarbonato, dextrano, nylon, amilose, celuloses naturais e modificadas, poliacrilamidas, agaroses e magnetita. A Natureza do transportador pode ser solúvel ou insolúvel, por exemplo, como grânulos, para os propósitos da invenção.
[0132] Existem muitos marcadores e métodos de marcação diferentes conhecidos pelos técnicos hábeis no assunto. Exemplos dos tipos de marcadores que podem ser utilizados na presente invenção incluem enzimas, radioisótopos, metais coloidais, compostos fluorescentes, compostos quimioluminescentes e compostos bioluminescentes.
[0133] Em um exemplo de realização mais preferido da presente invenção, prevê-se construções de anticorpo biespecíficos/moléculas da presente invenção para uso como um medicamento. No contexto da presente invenção, são descritas moléculas de anticorpo biespecífico para uso como um medicamento, em que a referida molécula de anticorpo biespecífico é para ser administrada antes, simultaneamente ou após a administração das células T CD8+ transduzidas que compreendem um antígeno que não ocorre naturalmente em ou sobre células T CD8+ e em que as referidas células T CD8+ foram obtidas a partir de um sujeito a ser tratado. O referido medicamento pode ser utilizado em um método de tratamento de doenças malignas, especialmente cânceres/carcinomas de origem epitelial, endotelial ou mesotelial ou do sangue. No contexto da presente invenção, o câncer/carcinoma é selecionado a partir do grupo que consiste em câncer gastrointestinal, câncer pancreático, câncer colangiocelular, câncer de pulmão, câncer de mama, câncer de ovário, câncer de pele, câncer oral, câncer gástrico, câncer do colo do útero, linfoma de célula B e T, leucemia mieloide, câncer ovariano, leucemia, leucemia linfática, carcinoma de nasofaringe, câncer de cólon, câncer de próstata, câncer de células renais, câncer de cabeça e pescoço, câncer de pele (melanoma), cânceres do trato genitor-urinário, por exemplo, câncer de testículo, câncer de ovário, câncer endotelial, câncer de colo do útero e câncer renal, câncer do ducto biliar, câncer de esôfago, câncer de glândulas salivares e câncer da glândula tireoide ou outras doenças tumorais como os tumores hematológicos, gliomas, sarcomas ou osteossarcomas.
[0134] Além disso, no contexto da presente invenção, é prevista uma molécula de anticorpo biespecífico, tal como descrito na presente invenção, que compreende (i) um primeiro domínio de ligação que se liga a um antígeno em células T CD8+ que não ocorre naturalmente em ou sobre células T CD8+; e (ii) um segundo domínio de ligação que se liga a um antígeno tumor-específico que ocorre naturalmente sobre a superfície de uma célula tumoral, para uso em um método de tratamento de uma doença maligna, em que a referida molécula de anticorpo biespecífico é para ser administrada antes, simultaneamente ou após a administração das células T CD8+ transduzidas compreendendo um antígeno que não ocorre naturalmente em ou sobre células T CD8+, e em que as referidas células T CD8+ foram obtidas a partir de um sujeito a ser tratado.
[0135] Além disso, no contexto da presente invenção, é previsto um método de tratamento de uma doença maligna, cujo método compreende a administração de uma molécula de anticorpo biespecífico da presente invenção a um sujeito com essa necessidade, que compreende (i) um primeiro domínio de ligação que se liga a um antígeno em células T CD8+ que não ocorre naturalmente em ou sobre células T CD8+; e (ii) um segundo domínio de ligação que se liga a um antígeno tumor-específico que ocorre naturalmente na superfície de uma célula tumoral, em que a referida molécula de anticorpo biespecífico é para ser administrada antes, simultaneamente ou após a administração das células T CD8+ transduzidas a partir do referido sujeito, compreendendo um antígeno que não ocorre naturalmente em ou sobre células T CD8+. No contexto da presente invenção, o câncer/carcinoma é selecionado a partir do grupo que consiste em câncer gastrointestinal, câncer pancreático, câncer colangiocelular, câncer de pulmão, câncer de mama, câncer de ovário, câncer de pele, câncer oral, câncer gástrico, câncer do colo do útero, linfoma de célula B e T, leucemia mieloide, câncer ovariano, leucemia, leucemia linfática, carcinoma de nasofaringe, câncer de cólon, câncer de próstata, câncer de células renais, câncer de cabeça e pescoço, câncer de pele (melanoma), cânceres do trato genitor-urinário, por exemplo, câncer de testículo, câncer de ovário, câncer endotelial, câncer de colo do útero e câncer renal, câncer do ducto biliar, câncer de esôfago, câncer de glândulas salivares e câncer da glândula tireoide ou outras doenças tumorais como os tumores hematológicos, gliomas, sarcomas ou osteossarcomas.
[0136] Além disso, de acordo com a invenção, uma molécula ou a construção (ou seja, a molécula de anticorpo biespecífico descrita na presente invenção), que compreende EpCAM (humano) (como o antígeno tumor- específico que ocorre naturalmente na superfície de uma célula tumoral) e um dos antígenos aqui definidos que não ocorre naturalmente em e/ou sobre células T (células T CD8+) pode ser utilizado em um método para o tratamento do câncer gastrointestinal, câncer pancreático, câncer colangiocelular, câncer de pulmão, câncer de mama, câncer de ovário, câncer da pele e/ou câncer bucal. No contexto da presente invenção, um molécula de anticorpo biespecífico direcionada contra EpCAM (humano) (como segundo domínio de ligação) e que compreende um primeiro domínio de ligação direcionado contra/ que se liga a / que interage com o Cripto pode ser utilizada no tratamento do câncer gastrointestinal, por exemplo, adenocarcinoma de origem gastrointestinal. Uma molécula ou a construção (ou seja, a molécula de anticorpo biespecífico descrita na presente invenção), que compreende HER1 (humano) (como o antígeno tumor-específico que ocorre naturalmente na superfície de uma célula tumoral) e um dos antígenos aqui definidos que não ocorre naturalmente em e/ou sobre células T (células T CD8+) pode ser utilizado em um método para o tratamento do câncer gastrointestinal, câncer pancreático, câncer colangiocelular, câncer de pulmão, câncer de mama, câncer de ovário, câncer da pele e/ou câncer bucal. Uma molécula ou a construção (ou seja, a molécula de anticorpo biespecífico descrita na presente invenção), que compreende HER2 (humano) (como o antígeno tumor-específico que ocorre naturalmente na superfície de uma célula tumoral) e um dos antígenos aqui definidos que não ocorre naturalmente em e/ou sobre células T (células T CD8+) pode ser utilizado em um método para o tratamento do câncer gástrico, câncer de mama, e/ou câncer do colo uterino. Uma molécula ou a construção (ou seja, a molécula de anticorpo biespecífico descrita na presente invenção), que compreende HER3 (humano) (como o antígeno tumor-específico que ocorre naturalmente na superfície de uma célula tumoral) e um dos antígenos aqui definidos que não ocorre naturalmente em e/ou sobre células T (células T CD8+) pode ser utilizado em um método para o tratamento do câncer gástrico e/ou câncer de pulmão. Uma molécula ou a construção (ou seja, a molécula de anticorpo biespecífico descrita na presente invenção), que compreende CD20 (humano) (como o antígeno tumor-específico que ocorre naturalmente na superfície de uma célula tumoral) e um dos antígenos aqui definidos que não ocorre naturalmente em e/ou sobre células T (células T CD8+) pode ser utilizado em um método para o tratamento de linfoma de células B e/ou linfoma de células T. Uma molécula ou a construção (ou seja, a molécula de anticorpo biespecífico descrita na presente invenção), que compreende CD22 (humano) (como o antígeno tumor-específico que ocorre naturalmente na superfície de uma célula tumoral) e um dos antígenos aqui definidos que não ocorre naturalmente em e/ou sobre células T (células T CD8+) pode ser utilizado em um método para o tratamento de linfoma de células B e/ou linfoma de células T. Uma molécula ou a construção (ou seja, a molécula de anticorpo biespecífico descrita na presente invenção), que compreende CD33 (humano) (como o antígeno tumor-específico que ocorre naturalmente na superfície de uma célula tumoral) e um dos antígenos aqui definidos que não ocorre naturalmente em e/ou sobre células T (células T CD8+) pode ser utilizado em um método para o tratamento da leucemia mieloide. Uma molécula ou a construção (ou seja, a molécula de anticorpo biespecífico descrita na presente invenção), que compreende CA12-5 (humano) (como o antígeno tumor- específico que ocorre naturalmente na superfície de uma célula tumoral) e um dos antígenos aqui definidos que não ocorre naturalmente em e/ou sobre células T (células T CD8+) pode ser utilizado em um método para o tratamento do câncer de ovário, câncer de pulmão, câncer de mama e/ou câncer gastrointestinal. Uma molécula ou a construção (ou seja, a molécula de anticorpo biespecífico descrita na presente invenção), que compreende HLA-DR (humano) (como o antígeno tumor-específico que ocorre naturalmente na superfície de uma célula tumoral) e um dos antígenos aqui definidos que não ocorre naturalmente em e/ou sobre células T (células T CD8+) pode ser utilizado em um método para o tratamento do câncer gastrointestinal, leucemia e/ou carcinoma de nasofaringe. Uma molécula ou a construção (ou seja, a molécula de anticorpo biespecífico descrita na presente invenção), que compreende MUC-1 (humano) (como o antígeno tumor-específico que ocorre naturalmente na superfície de uma célula tumoral) e um dos antígenos aqui definidos que não ocorre naturalmente em e/ou sobre células T (células T CD8+) pode ser utilizado em um método para o tratamento do câncer do cólon, câncer de mama, câncer de ovário, câncer de pulmão e/ou câncer pancreático. Uma molécula ou construção (ou seja, a molécula de anticorpo biespecífico descrita na presente invenção), que compreende A33 (humano) (como o antígeno tumor-específico que ocorre naturalmente na superfície de uma célula tumoral) e um dos antígenos aqui definidos que não ocorre naturalmente em e/ou sobre células T (células T CD8+) pode ser utilizado em um método para o tratamento do câncer de cólon. Uma molécula ou a construção (ou seja, a molécula de anticorpo biespecífico descrita na presente invenção), que compreende PSMA (humano) (como o antígeno tumor-específico que ocorre naturalmente na superfície de uma célula tumoral) e um dos antígenos aqui definidos que não ocorre naturalmente em e/ou sobre células T (células T CD8+) pode ser utilizado em um método para o tratamento do câncer de próstata. Uma molécula ou a construção (ou seja, a molécula de anticorpo biespecífico descrita na presente invenção), que compreende o receptor da transferrina (humano) (como o antígeno tumor-específico que ocorre naturalmente na superfície de uma célula tumoral) e um dos antígenos aqui definidos que não ocorre naturalmente em e/ou sobre células T (células T CD8+) pode ser utilizado em um método para o tratamento do câncer gastrointestinal, câncer pancreático, câncer colangiocelular, câncer de pulmão, câncer de mama, câncer de ovário, câncer da pele e/ou câncer oral. Uma molécula ou a construção (ou seja, a molécula de anticorpo biespecífico descrita na presente invenção), que compreende CA-IX (humano) (como o antígeno tumor-específico que ocorre naturalmente na superfície de uma célula tumoral) e um dos antígenos aqui definidos que não ocorre naturalmente em e/ou sobre células T (células T CD8+) pode ser utilizado em um método para o tratamento do câncer reanal.
[0137] A invenção também se refere a um método para o tratamento de uma doença, uma doença maligna, tal como o câncer de origem epitelial, endotelial ou mesotelial e/ou o câncer do sangue. Tais doenças seriam, entre outras: câncer de esôfago, estômago, cólon, intestino delgado, fígado, pâncreas, mama, pulmões, cérebro, rins, testículos, câncer de pele, leucemias e/ou linfomas compreendendo a administração das células T CD8+ transduzidas para um sujeito. No contexto da presente invenção, o referido sujeito é um ser humano.
[0138] No contexto da presente invenção é descrito um método para o tratamento de uma doença compreendendo as etapas de: (a) isolamento das células T CD8+ a partir de um sujeito; (b) transdução das referidas células T CD8+ isoladas com um antígeno que não ocorre naturalmente nas células T CD8+ conforme descrito acima; e (c) a administração das células T CD8+ transduzidas ao referido sujeito.
[0139] No contexto da presente invenção, as referidas células T CD8+ transduzidas são administradas ao referido sujeito por infusão intravenosa.
[0140] Além disso, a presente invenção fornece um método para o tratamento de uma doença compreendendo as etapas de: (a) isolamento das células T CD8+ a partir de um sujeito; (b) transdução das referidas células T CD8+ isoladas com um antígeno que não ocorre naturalmente nas células T CD8+ conforme descrito acima; (c) a cotransdução das referidas células T CD8+ isoladas com um receptor de células T; (d) a expansão das células T CD8+ por anticorpos anti-CD3 e anti- CD28; e (e) a administração das células T CD8+ transduzidas ao referido sujeito.
[0141] A presente invenção refere-se a células T CD8+ isoladas que são analisadas por métodos a fim de se certificar de que o antígeno (do tumor) que ocorre naturalmente nas células T CD8+ isoladas é idêntico ao antígeno de tumor ao qual o anticorpo biespecífico descrito na presente invenção se liga por meio de seu segundo domínio de ligação. No contexto da presente invenção, as células T CD8+ isoladas/obtidas (que compreendem um antígeno que ocorre naturalmente na superfície das células T CD8+ isoladas) são artificialmente modificadas pela introdução de um antígeno/marcador que não ocorre naturalmente/que não é naturalmente expresso nas e/ou sobre as células T CD8+. No contexto da presente invenção, a modificação artificial das células T CD8+ isoladas/obtidas refere-se aos métodos de transdução descritos na presente invenção. Deste modo, no contexto da presente invenção, o sujeito a ser tratado, refere-se a um sujeito sendo caracterizado por sofrer de uma doença caracterizada por possuir um antígeno tumor-específico que ocorre naturalmente sobre a superfície de uma célula tumoral, tal como descrito acima. No contexto da presente invenção, a administração das células T CD8+ transduzidas obtidas/isoladas a partir do sujeito a ser tratado será realizada por infusão intravenosa.
[0142] Em um exemplo de realização adicional, a presente invenção está relacionada ao tratamento de uma doença compreendendo as etapas de: (a) isolamento de linfócitos infiltrados no tumor (TIL) a partir de um tumor ressecado do paciente; (b) cultivo e transdução de TILs com um antígeno que não ocorre naturalmente nas células T CD8+, tal como descrito acima; (c) seleção de culturas de TIL com base em ensaios funcionais de reconhecimento de tumor; (d) a expansão de TIL por anticorpos anti-CD3 e/ou anti-CD28; e (e) a administração das células T CD8+ transduzidas ao referido sujeito.
[0143] O termo “ensaios funcionais de reconhecimento de tumor”, significa a cocultura de TIL com células autólogas, por exemplo, células tumorais do paciente, ou uma linhagem celular de tipo HLA idêntico. A leitura é a atividade citotóxica para a célula tumoral (LDH, liberação de calceína). Além disso, as leituras do ensaio podem ser a secreção de citocina, citometria de fluxo de células T para a presença de citocinas intracelulares, Ensaios ELISPOT.
[0144] A etapa (d) mencionada acima (referindo-se a etapa de expansão de TIL por anticorpos anti-CD3 e/ou anti-CD28) também pode ser realizada na presença de citocinas (estimulantes), tal como a interleucina-2 e/ou interleucina-15 (IL-15). No contexto da presente invenção, a etapa (d) mencionada acima (referindo-se a etapa de expansão de TIL por anticorpos anti- CD3 e/ou anti-CD28) também pode ser realizada na presença de interleucina-12 (IL-12), interleucina-7 (IL-7) e/ou interleucina-21 (IL-21).
[0145] O método para o tratamento pode também compreender, adicionalmente, a administração do anticorpo biespecífico (monoclonal) da presente invenção. O referido anticorpo (monoclonal) biespecífico pode ser administrado antes, simultaneamente ou após a administração das células T CD8+ transduzidas. No contexto da presente invenção, a administração das células T CD8+ transduzidas será realizada por infusão intravenosa. No contexto da presente invenção, as células T CD8+ são isoladas/obtidas a partir do sujeito a ser tratado.
[0146] A invenção provê um kit compreendendo um anticorpo (monoclonal) biespecífico, uma molécula de ácido nucleico, um vetor ou um hospedeiro da invenção. O referido kit é particularmente útil na preparação de uma composição farmacêutica da presente invenção e pode, inter alia, consistir em um recipiente útil para injeções ou infusões. De maneira vantajosa, o kit da presente invenção compreende ainda, opcionalmente, tampão(ões), soluções de armazenamento e/ou reagentes remanescentes ou materiais necessários para a condução das finalidades médicas ou científicas. A presente invenção refere- se a um kit que compreende (A) uma molécula de anticorpo biespecífico compreendendo; (i) um primeiro domínio de ligação que se liga a um antígeno em células T CD8+ que não ocorre naturalmente em ou sobre células T CD8+; e um segundo domínio de ligação que se liga a um antígeno tumor-específico que ocorre naturalmente sobre a superfície de uma célula tumoral; e (B) o material necessário para a transdução de células T CD8+ isoladas/obtidas a partir do sujeito a ser tratado com um antígeno que não ocorre naturalmente em ou sobre referidas células T CD8+.
[0147] No contexto da presente invenção, o “material necessário para a transdução de células T CD8+” isoladas/obtidas a partir de um sujeito a ser tratado é, pelo menos, um ácido nucleico codificante de um antígeno que não ocorre naturalmente/que não é expresso endogenamente nas e/ou sobre as células T CD8+. O ácido nucleico que codifica um antígeno que não ocorre naturalmente/que não é expresso endogenamente nas e/ou sobre as células T CD8+ pode ser operacionalmente ligado a; (a) sequência(s) regulatória(s) que é(são) geralmente carregada(s) dentro de um vetor (por exemplo, um plasmídeo ou DNA viral), que inclui as sequências necessárias para a seleção in vitro e amplificação do vetor em uma bactéria. Um vetor permitindo a expressão do antígeno, que não ocorre naturalmente/que é não expresso endogenamente nas células T CD8+ é referido aqui como “vetor de expressão”. Assim, outro “material necessário para a transdução de células T CD8+” isoladas/obtidas a partir de um sujeito a ser tratado útil pode ser um vetor/vetor de expressão que compreende pelo menos um ácido nucleico que codifica um antígeno que não ocorre naturalmente em e/ou sobre células T CD8+. Neste contexto, os vetores adequados para a transdução de células T/Células T CD8+ abrangem o vetor selecionado a partir do grupo consistindo em SAMEN CMV/SRa (Clayet al., J. Immunol. 163 (1999), 507-513), LZRS-id3-IHRES (Heemskerket al., J. Exp. Med. 186 (1997), 1597-1602), FeLV (Neilet al., Nature 308 (1984), 814-820), SAX (Kantoffet al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83 (1986), 6563-6567), pDOL (Desiderio, J. Exp. Med. 167 (1988), 372-388), N2 (Kasidet al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87 (1990), 473-477), LNL6 (Tiberghienet al., Blood 84 (1994), 1333-1341), pZipNEO (Chenet al., J. Immunol. 153 (1994), 3630-3638), LASN (Mullenet al., Hum. Gene Ther. 7 (1996), 1123-1129), pG1XsNa (Tayloret al., J. Exp. Med. 184 (1996), 2031-2036), LCNX e LXSN (Sunet al., Hum. Gene Ther. 8 (1997), 1041-1048), SFG (Gallardoet al., Blood 90 (1997), 952-957), HMB-Hb- Hu (Vieillardet al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94 (1997), 11595-11600), pMV7 (Cochloviuset al., Cancer Immunol. Immunother. 46 (1998), 61-66), pSTITCH (Weitjenset al., Gene Ther 5 (1998), 1195-1203), pLZR (Yanget al., Hum. Gene Ther. 10 (1999), 123-132), pBAG (Wuet al., Hum. Gene Ther. 10 (1999), 977-982), rKat.43.267bn (Gilhamet al., J. Immunother. 25 (2002), 139-151), pLGSN (Engels et al., Hum. Gene Ther. 14 (2003), 1155-1168), pMP71 (Engels et al., Hum. Gene Ther. 14 (2003), 1155-1168), pGCSAM (Morgan et al., J. Immunol. 171 (2003), 3287-3295), pMSGV (Zhaoet al., J. Immunol. 174 (2005), 44154423) e pMX (de Witteet al., J. Immunol. 181 (2008), 5128-5136). O “material necessário para a transdução de células T CD8+” pode também incluir uma célula hospedeira transformada ou transfectada com um vetor tal como uma ferramenta para a expressão do antígeno que não ocorre naturalmente/que não é expresso endogenamente nas e/ou sobre as células T CD8+. A referida célula hospedeira pode ser produzida pela introdução de pelo menos um dos vetores mencionados acima, ou pelo menos uma molécula de ácido nucleico que codifica um antígeno que não ocorre naturalmente/que não é expressa endogenamente nas e/ou sobre as células T CD8+ na célula hospedeira. A presença do referido pelo menos um vetor, ou pelo menos um ácido nucleico na célula hospedeira pode mediar a expressão de um gene que codifica o antígeno descrito na presente invenção que não ocorre naturalmente/que não é expresso endogenamente nas e/ou sobre as células T CD8+.
[0148] O material necessário para a transdução das células T CD8+ podem abranger informações detalhadas e/ou equipamentos necessários juntamente com a modificação/transdução genética/artificial destas células T CD8+ isoladas/obtidas. Se um ácido nucleico ou um ácido nucleico recombinante codificante de um antígeno que não ocorre naturalmente/que não é expresso endogenamente em e/ou sobre as células T CD8+ é utilizado para a transdução de células T CD8+, informações e/ou equipamento necessário para um método de eletroporação, método de fosfato de cálcio, método de lípidos catiônicos, método de lipossomos como reagente(s) de transfecção, tampão(ões) e/ou reagentes necessários para a transdução podem ser fornecidos com o kit.
[0149] O material necessário para a transdução das células T CD8+ pode abranger ainda informação e/ou equipamento necessário em relação com a cultura e a expansão das células T CD8+ isoladas/obtidas, tal como um anticorpo anti-CD3, anticorpo monoclonal anti-CD3 e anti-CD28 e/ou um anticorpo anti-CD3, um anticorpo anti-CD28 e IL-2.
[0150] Assim, em resumo, o “material necessário para a transdução de células T CD8+” isoladas/obtidas a partir de um sujeito a ser tratado é, pelo menos, um ácido nucleico codificante de um antígeno que não ocorre naturalmente em e/ou sobre células T CD8+, um vetor/vetor de expressão compreendendo pelo menos um ácido nucleico que codifica um antígeno que não ocorre naturalmente em e/ou sobre células T CD8+, reagente(s) de transfecção, tampão(ões) e/ou o material necessário para a transdução e/ou cultivo das células T CD8+ isoladas/obtidas a partir do sujeito a ser tratado com um antígeno que não ocorre naturalmente em e/ou sobre células T CD8+.
[0151] Além disso, partes do kit da invenção podem ser embaladas individualmente em frascos ou garrafas em combinação em recipientes ou unidades multi-recipientes. Além disso, o kit da presente invenção compreende um sistema de incubação de células em bolsa (fechada) onde as células do paciente, de preferência as células T, conforme descrito acima, podem ser transduzidas e incubadas seguindo as condições de GMP (boas práticas de fabricação, tal como descrito nas diretrizes de boas práticas de fabricação publicada pela Comissão Europeia no site: http://ec.europa.eu/health/documents/eudralex/index_en.htm). Além disso, o kit da presente invenção compreende um sistema de incubação de células em bolsa (fechado) onde as células T CD8+ isoladas/obtidas do paciente podem ser transduzidas e incubadas sob as condições de GMP. Adicionalmente, no contexto da presente invenção, o kit pode também compreender uma molécula de ácido nucleico codificante de um antígeno que não ocorre naturalmente nas células T CD8+, tal como descrito acima e/ou uma molécula de ácido nucleico codificante de um receptor de células T, conforme descrito acima. O kit da presente invenção pode ser vantajosamente utilizado, inter alia, para realizar o método da invenção e pode ser utilizado em uma variedade de aplicações referidas no presente, por exemplo, como ferramenta de pesquisa ou instrumentos médicos. A manufatura dos kits segue preferencialmente procedimentos-padrão que são conhecidos pelos técnicos hábeis no assunto.
[0152] Estes e outros exemplos de realização são descritos e abrangidas pela descrição e pelos Exemplos da presente invenção. A literatura relativa a qualquer um dos anticorpos, métodos, utilizações e compostos a serem empregados de acordo com a presente invenção pode ser recuperada a partir de bibliotecas e bases de dados públicas, utilizando, por exemplo, dispositivos eletrônicos. Por exemplo, o banco de dados público “Medline”, disponível na Internet, pode ser utilizado, por exemplo, sob o endereço eletrônico http://www.ncbi.nlm.nih.gov/PubMed/medline.html. Outras bases de dados e endereços, tal como http://www.ncbi.nlm.nih.gov/, http://www.infobiogen.fr/, http://www.fmi.ch/biology/research_tools.html, http://www.tigr.org/, são do conhecimento dos técnicos hábeis no assunto e podem também ser obtidos utilizando, por exemplo, http://www.lycos.com.
BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS
[0153] Figura 1: Um anticorpo biespecífico representativo que compreende especificidade para EGFR humano, bem como para EpCAM murino (MAb225_scFv_G8.8).
[0154] MAb225 com uma estrutura principal de IgG2a murina tem uma fusão de um fragmento Fv de cadeia única (sc) na extremidade C-terminal das cadeias pesadas.
[0155] Figura 2: Uma imagem de SEC e SDS-PAGE representativa do anticorpo EGFR-específico humano MAb225.
[0156] O anticorpo purificado em proteína A foi submetido a cromatografia de exclusão por tamanho. (A) Perfil de eluição a partir de uma coluna HiLoad Superdex 200. As frações do pico foram reunidas e a pureza da proteína foi analisada por SDS-PAGE. (B) SDS-PAGE não redutor (NR) redutor (R) do anticorpo biespecífico.
[0157] Figura 3: Uma imagem de SEC e SDS-PAGE representativa do anticorpo EpCAM-específico de camundongo G8.8.
[0158] O anticorpo purificado em proteína A foi submetido a cromatografia de exclusão por tamanho. (A) Perfil de eluição a partir de uma coluna HiLoad Superdex 200. As frações do pico foram reunidas e a pureza da proteína foi analisada por SDS-PAGE. (B) SDS-PAGE não redutor (NR) redutor (R) do anticorpo biespecífico.
[0159] Figura 4: Uma imagem de SEC e SDS-PAGE representativa do anticorpo biespecífico MAb225_scFv_G8.8. (A) Perfil de eluição a partir de uma coluna HiLoad Superdex 200. Os números indicados referem-se à fração do anticorpo biespecífico (1) e fração de agregado (2). As frações do pico (1) foram reunidas e a pureza da proteína foi analisada por SDS-PAGE. (B) SDS-PAGE não redutor (NR) redutor (R) do anticorpo biespecífico.
[0160] Figura 5: Cromatografia de afinidade e SDS-PAGE do ECD de EpCAM murino.
[0161] Os sobrenadantes da cultura celular contendo EpCAM murino com uma epítopo marcador Histidina (his-tag) na extremidade C-terminal foram purificados utilizando cromatografia em Ni-quelato. (A) perfil de eluição a partir da coluna HisTrap FF. (B) Análise de SDS-PAGE da proteína dialisada sob condições redutoras. O gel foi corado com o corante Azul de Coomassie.
[0162] Figura 6: Interação da ECD EpCAM murino recombinante com anticorpos específicos para EpCAM.
[0163] EpCAM murino recombinante não interage com G8.8 ou anticorpo biespecífico MAB225_scFv_G8.8. (A) EpCAM recombinante foi imunoprecipitado com G8.8. O asterisco indica EpCAM. (B) EpCAM recombinante foi imunoprecipitado com MAB225_scFv_G8.8. O asterisco indica EpCAM.
[0164] Figura 7: Visão esquemática do novo princípio terapêutico pelo recrutamento de células T tumor-específicas para um tumor por meio de um anticorpo biespecífico.
[0165] As células T (no presente são células T TRC-I murinas transgênicas, células T TCR tg) transportam um receptor de células T para o epítopo 1 imunodominante de um antígeno T grande (TCR T espec.). Estas células T são adicionalmente transduzidas com um antígeno marcador (del- hEGFR; SEQ ID NOs: 11 e 12). A célula tumoral-alvo expressa naturalmente o antígeno T grande, que é apresentado no contexto do complexo principal de histocompatibilidade -(MHC) e antígeno tumoral (EpCAM). Um anticorpo biespecífico (MAb225_scFv_G8.8) com um sítio de ligação ao antígeno para del- hEGFR sobre um braço e para EpCAM (murino) no outro braço une os dois tipos de células. O TCR específico para o peptídeo tumoral, o peptídeo tumoral e o MHC formam uma “sinapse imunológica”.
[0166] Figura 8: Eficiência de transdução de células T primárias com del-hEGFR.
[0167] Células T primárias murinas foram transduzidas por meio retroviral com del-hEGFR (SEQ ID NO: 11 e 12). As análises por citometria de fluxo revelaram uma transdução eficiente com o del-hEGFR (curva escura) em comparação com as células T não transduzidas (curva clara).
[0168] Figura 9: Ligação cruzada de células T transduzidas com células de tumor através de um anticorpo biespecífico.
[0169] A células 4T1 expressando EpCAM foram semeadas e cultivadas até a confluência. Células T B3Z transduzidas com del-hEGFR (linhagem de células permanente, marcadas de forma fluorescente) foram pré- carregadas com o anticorpo biespecífico (MAb225_scFv_G8.8) e subsequentemente incubadas na placa com as células 4T1 aderentes. Após exaustiva lavagem, as células foram lisadas e a fluorescência remanescente foi mensurada. Os anticorpos biespecíficos contra a EpCAM e hEFGR ou anticorpos monoespecíficos (controles anti-EpCAM e anti-hEGFR) foram adicionados. O anticorpo biespecífico reteve significativamente mais células transduzidas no balão do que qualquer um dos controles. ** Indica p < 0,01 para todas as comparações.
[0170] Figura 10: Lise de células tumorais mediada por células T remarcadas pelo anticorpo biespecífico.
[0171] As células T tumor-específicas (TCR-I, células T transgênicas para o receptor de células T que reconhece o epítopo imunodominante do antígeno T grande) foram transduzidas com del-hEGFR (SEQ ID NOs: 11 e 12) e foram pré-incubadas com o anticorpo biespecífico (MAb225_scFv_G8.8 (SEQ ID NOs: 5 e 6)). Células tumorais mGC8 (linhagem de células permanente) que expressam EpCAM e o antígeno T grande ou células tumorais B16 que não expressam estes antígenos foram marcadas por fluorescência (com calceína). As células foram cultivadas juntas nas razões indicadas de célula tumoral para células T (T:E) durante a noite e a lise das células foi quantificada pela medição da fluorescência libertada. Uma lise dependente da razão de células alvo para célula efetora (T:E) foi induzida nas células mGC8 mas não nas células B16.
[0172] Figura 11: O tratamento de tumores estabelecidos pela combinação de um anticorpo biespecífico e células T tumor-específicas transduzidas.
[0173] Os camundongos foram desafiados com um tumor subcutâneo (linhagem de células mGC8). Os camundongos foram tratados (i.v. para a administração de células, i.v. e i.p. para a administração do anticorpo) nos pontos de tempo indicados, com PBS, um anticorpo monoespecífico anti-EpCAM (EpCAM G8.8 (SEQ ID NOs: 3 e 4)) sozinho, células T transduzidas (células T CD8+) com um anticorpo anti-EpCAM monoespecífico (EpCAM G8.8 (SEQ ID NOs: 3 e 4)) e com o anticorpo monoespecífico anti-EGFR (EGFR MAb225 (SEQ ID NOs: 1 e 2)) ou com células T transduzidas (células T CD8+), com o anticorpo biespecífico (MAb225_scFv_G8.8; específicos para EpCAM e EGFR (SEQ ID NOs: 5 e 6)). Este tratamento combinado induziu uma significativa redução e atraso no crescimento do tumor quando comparado com qualquer um dos outros grupos de tratamento. As diferenças no volume do tumor foram significativas a partir do dia 31 para o grupo 1 vs 4, a partir do dia 40 para o grupo 2 vs 4 e a partir do dia 50 para o grupo 3 vs 4 (p < 0,001 para todas as comparações).
[0174] Figura 12: O tratamento de tumores estabelecidos pela combinação de um anticorpo biespecífico com células T tumor-específicas transduzidas prolonga a sobrevida de maneira significativa.
[0175] São mostradas curvas de sobrevida dos grupos de tratamento de camundongos na Figura 11. O ponto de término do presente estudo foi pré-definido para o dia 72. O tratamento combinado prolonga significativamente a sobrevida dos camundongos em comparação com todos os três tratamentos de controle. Diferenças na sobrevida são significantes para o grupo 1 versus 4, 2 versus 4, e 3 versus 4.
[0176] Figura 13: O tratamento de tumores estabelecidos pela combinação de um anticorpo biespecífico e células T tumor-específicas transduzidas (estudo confirmatório).
[0177] Os camundongos foram desafiados com um tumor subcutâneo (mGC8) como no estudo da Figura 11. Os camundongos foram tratados nos pontos de tempo indicados, com PBS, um anticorpo monoespecífico anti-EpCAM sozinho (EpCAM G8.8 (SEQ ID NOs: 3 e 4)), anticorpo biespecífico (MAb225_scFv_G8.8; específico para EpCAM e EGFR (SEQ ID NOs: 5 e 6)), células T transduzidas (células T CD8+), com o anticorpo monoespecífico anti- EpCAM (EpCAM G8.8 SEQ ID NOs: 3 e 4) mais anticorpo monoespecífico anti- EGFR (MAb 225 (SEQ ID NOs: 1 e 2)) ou as células T transduzidas (células T CD8+) com o anticorpo biespecífico (MAb225_scFv_G8.8; específico para EpCAM e EGFR (SEQ ID NOs: 5 e 6)) em duas concentrações diferentes. Este tratamento combinado induziu uma significativa redução e atraso no crescimento do tumor quando comparado com qualquer um dos outros grupos de tratamento. As diferenças no volume do tumor foram significativas a partir do dia 36 para o grupo 1 versus 5, a partir do dia 47 para o grupo 2 versus 5, a partir do dia 54 para o grupo 3 versus 5 e a partir do dia 63 para o grupo 4 versus 5 (p < 0,001 para todas as comparações).
[0178] Figura 14: O tratamento de tumores estabelecidos pela combinação de um anticorpo biespecífico com células T tumor-específicas transduzidas prolonga a sobrevida de maneira significativa (estudo confirmatório).
[0179] São mostradas curvas de sobrevida dos grupos de tratamento de camundongos na Figura 13. Um grupo adicional de três camundongos sem tumor recebeu o tratamento combinado (como controle de toxicidade, denominado “7-sem tumor”). O tratamento combinado prolonga significativamente a sobrevida dos camundongos em comparação com qualquer outro tratamento controle. As diferenças na sobrevida foram significantes para o grupo 1 versus 5, 2 versus 5, 3 versus 5 e 4 versus 5.
[0180] Figura 15: Sequência de proteína EpCAM Murino His-Avitag
[0181] Sequência do ectodomínio com epítopo marcado C- terminalmente (His-Avi) da EpCAM (correspondente a SEQ ID NO: 10) tal como codificado pela sequência do DNA complementar (cDNA) indicada na SEQ ID NO: 9.
[0182] Figura 16: Sequência de cDNA do EpCAM murino.
[0183] Sequência de cDNA do ectodomínio marcado com epítopo na extremidade C-terminal (His-Avi) do EpCAM (SEQ ID NO: 7)
[0184] Figura 17: Mapa do vetor EpCAM ECD
[0185] Mapa esquemático do plasmídeo do vetor de expressão eucarioto que contém o ectodomínio EpCAM (ECD).
[0186] Figura 18: Mapa do vetor da cadeia leve MAB225
[0187] Mapa do plasmídeo esquemático do vetor de expressão eucariota que contém a cadeia leve do MAB225 (SEQ ID NO: 1).
[0188] Figura 19: Mapa do vetor da cadeia pesada MAB225 com a fusão G8.8 scFv.
[0189] Mapa do plasmídeo esquemático do vetor de expressão eucariota que contém a cadeia pesado do MAB225 com uma fusão G8.8 scFv C-terminal (SEQ ID NO: 6).
[0190] Figura 20: Uma imagem de SEC e SDS-PAGE representativa do anticorpo biespecífico BsAb EpCAM-EGFRvIII, MR1.1. (A) cromatografia de exclusão por tamanho analítica de um anticorpo biespecífico direcionado para EGFRvIII (humano) e EpCAM (murino), ou seja, BsAb EpCAM-EGFRvIII, MR1.1. (B) análise por SDS-PAGE não redutor (NR) redutor (R) do referido anticorpo biespecífico BsAb EpCAM-EGFRvIII, MR1.1. Corado com Azul de Coomassie.
[0191] Figura 21: Visão esquemática do novo princípio terapêutico pelo recrutamento de células T tumor-específicas para um tumor por meio do anticorpo biespecífico BsAb EpCAM-EGFRvIII, MR1.1.
[0192] Visão esquemática do novo princípio terapêutico pelo recrutamento de células T tumor-específicas para um tumor por meio de um anticorpo biespecífico: as células T (aqui células T OT-I murinas transgênicas) carregam um receptor de célula T específico para ovalbumina (OVA). Estas células T são adicionalmente transduzidas com um antígeno marcador (del- hEGFRvIII; SEQ ID NOs: 17 e 18). A célula tumoral-alvo (por exemplo, célula B16 expressando Ovalbumina (OVA)) expressa naturalmente o antígeno T grande, que é apresentado no contexto do complexo principal de histocompatibilidade -(MHC) e antígeno tumoral (EpCAM). O MHC sobre as células tumorais-alvo apresenta, neste exemplo, o fragmento de peptídeo SIINFEKL do OVA. Um anticorpo biespecífico (BsAb EpCAM-EGFRvIII, MR 1.1) com um sítio de ligação ao antígeno para del-hEGFRvIII (SEQ ID NOs: 17 e 18) em um dos braços e para EpCAM (murino) no outro braço une os dois tipos celulares. O TCR específico para o peptídeo tumoral, o peptídeo tumoral e o MHC formam uma “sinapse imunológica”.
[0193] Figura 22: Ligação cruzada de células T transduzidas com células de tumor através de um anticorpo biespecífico.
[0194] A células de melanoma B16 expressando EpCAM (marcadas com GFP) foram semeadas e cultivadas até a confluência. Células T B3Z transduzidas com del-hEGFRvIII (linhagem de células permanente) foram pré-carregadas com o anticorpo biespecífico (BiAb) (BsAb EpCAM-EGFRvIII, MR1.1) e subsequentemente incubadas na placa com as células B16 aderentes (coluna n° 5). Após exaustiva lavagem (colunas nos: 1 a 4), as células remanescentes foram tripsinizadas e as células fluorescentes e não fluorescentes foram medidas. O anticorpo biespecífico (BsAb EpCAM-EGFRvIII, MR 1.1) manteve mais células transduzidas no balão (coluna n°: 1) do que qualquer um dos controles com lavagem (coluna nos: 2 a 4).
[0195] Figura 23: Sequências de aminoácidos do anticorpo biespecífico BsAb EpCAM-EGFRvIII, MR1.1 (A) sequência de aminoácidos da cadeia leve do anticorpo biespecífico BsAb EpCAM-EGFRvIII, MR1.1 (sem a sequência líder) referindo- se a SEQ ID NO: 15. (B) sequência de aminoácidos da cadeia pesado do produto biespecífico BsAb EpCAM-EGFRvIII, MR1.1 (sem a sequência líder) referindo- se a SEQ ID NO: 16.
[0196] Figura 24: Sequências do del-hEGFRvIII (A) sequência de DNA do del-hEGFRvIII (que codifica a sequência da proteína da Figura 24 (B)), conforme mostrado na SEQ ID NO: 17. (B) Sequência de proteína do del-hEGFRvIII: correspondendo à SEQ ID NO: 18.
EXEMPLOS QUE ILUSTRAM A INVENÇÃO
[0197] Ilustrativamente, como prova de conceito, nos seguintes exemplos, o anticorpo anti-EGFR humano (MAb225; SEQ ID NOs: 1 e 2) foi combinado com o anti-EpCAM murino (G8.8, SEQ ID NOs: 3 e 4 ) a fim de formar um produto biespecífico (MAb225_scFv_G8.8; SEQ ID NOs: 5 e 6). Além disso, tal como ilustrado nas Figuras 20 e 21, foi construído um anticorpo biespecífico “BsAb EpCAM-EGFRvIII. MR1.1” (SEQ ID NOs: 15 e 16) com um sítio de ligação ao antígeno para del-hEGFRvIII (SEQ ID NOs: 17 e 18) em um dos braços e para EpCAM (murino) no outro braço; vide o Exemplo 4.
EXEMPLO 1 CLONAGEM E EXPRESSÃO DO ANTICORPO BIESPECÍFICO MAB225 SCFV G8.8 TÉCNICAS DE DNA RECOMBINANTE
[0198]Métodos padronizados foram usados para manipular o DNA conforme descrito em Sambrook, J. et al, “Molecular cloning: A laboratory manual”; Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, Nova Iorque, 1989. Os eagents para a biologia molecular foram utilizados de acordo com as instruções dos fabricantes.
ANÁLISE DA SEQUÊNCIA DE DNA E DE PROTEÍNA E GESTÃO DOS DADOS DE SEQUÊNCIA
[0199] Informações gerais sobre as sequências nucleotídicas de cadeias leve e pesada de imunoglobulinas humanas são fornecidas em: Kabat, E.A. et al., (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5a Ed., Publicação NIH N° 91-3242. Os aminoácidos das cadeias de anticorpo são numerados de acordo com o sistema de numeração EU (Edelman, G.M.,et al., PNAS 63 (1969) 78-85; Kabat, E.A., et al., (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5a Ed., Publicação NIH N° 91-3242). O pacote de softwares da GCG (Genetics Computer Group, Madison, Wisconsin) versão 10.2 e Vector NTI Advance suit versão 11,5 da Infomax foram usados para a criação de sequências, mapeamento, análise, anotação e ilustração.
SEQUENCIAMENTO DE DNA
[0200]Os sequenciamentos de DNA foram determinados pelo sequenciamento de fita-dupla realizado na SequiServe (Vaterstetten, Alemanha) e Geneart AG (Regensburg, Alemanha).
SÍNTESE DE GENES
[0201] Os segmentos de genes desejados foram preparados pela Geneart AG (Regensburg, Alemanha) a partir de oligonucleotídeos sintéticos e produtos da PCR pela síntese gênica automatizada. Os segmentos de gene que são flanqueadas por sítios de clivagem por enzimas de restrição únicos foram clonados em plasmídeos pGA18 (ampR). O DNA plasmidial foi purificado a partir de bactérias transformadas e a concentração foi determinada por espectroscopia UV. A sequência de DNA dos fragmentos do gene subclonados foi confirmada pelo sequenciamento do DNA. As sequências de DNA que codificam as cadeias leves foram ordenados abrangendo as regiões de cadeia leve variáveis e constantes com os sítios de restrição por endonuclease 5' Narl e 3' Nhel flanqueando-as. As sequências de DNA que codificam as regiões variáveis de cadeia pesada, além de um fragmento da região CH1 foram ordenadas com sítios de restrição por endonuclease 5’ Kpnl e 3’ BamHI flanqueando-as. A sequência de DNA codificante da construção scFv foi ordenada contendo um fragmento do domínio CH3 com flanqueamento por sítios de restrição por endonucleases 5' BsrGI e 3' Xbal. A sequência de DNA codificante do aminoácido 1-267 do EpCAM murino (SEQ ID NO: 7 (sequência de cDNA) e 8 (sequência de aminoácidos)) foi ordenada como síntese de genes com sítios 5' BamHI e 3' Notl. Todas as construções foram concebidas com uma sequência de DNA com uma extremidade 5' codificante de um peptídeo líder, que direciona as proteínas para a secreção em células eucarióticas.
1.1 CONSTRUÇÃO DOS PLASMÍDEOS DE EXPRESSÃO
[0202] Um vetor de expressão foi usado para a construção de todas as cadeias de anticorpo. O vetor é composto pelos seguintes elementos (tal como mostrado de maneira exemplar na Figura 18 para a cadeia leve do MAb225 (SEQ ID NO: 1)): - uma origem de replicação, oriP, do vírus Epstein-Barr (EBV), - uma origem de replicação a partir do vetor pUC18 para a replicação deste plasmídeo em E. coli; - um gene beta-lactamase que confere resistência à ampicilina em E. coli. - o facilitador (enhancer) e promotor precoce imediato do citomegalovírus humano (HCMV), - a sequência sinal de poliadenilação (“poli-A”) do hormônio de crescimento bovino, e - sítios de restrição por endonuclease únicos Kpnl, BamHI, BsrGI e XbaI (vetor da cadeia pesada), ou - sítios de restrição por endonuclease únicos NarI e NheI (cadeia leve).
[0203] O vetor de expressão codificante para a produção da construção de cadeia pesada continha os seguintes elementos adicionais (tal como mostrado esquematicamente na Figura 19 para a cadeia pesada do MAb225 com fusão G8.8 scFv (SEQ ID NO: 6)): - um cassete de resistência à neomicina (neor), - o promotor precoce do vírus símio 40, e - a sequência sinal de poliadenilação (“poli-A”) do vírus símio 40.
[0204] Os plasmídeos pG18 (ampR) carregando os segmentos de DNA que codificam anticorpos sintetizados e o vetor de expressão foram digeridos com as enzimas de restrição Kpnl e BamUl, no caso do vetor de expressão da cadeia pesada, ou com as enzimas de restrição Narl e Nhel, no caso do vetor da cadeia leve. De modo semelhante, o plasmídeo pG18 c arregando o fragmento scFv foi cortado com as enzimas de restrição BsrGl e Xbal como para o vetor da cadeia pesada. Todos os fragmentos obtidos foram submetidos à eletroforese em gel de agarose. Os s egmentos de DNA purificados foram então ligados com o fragmento KpnI/BamHI, NarI/NheI, ou BsrGI/XbaI do vetor de expressão isolado resultante nos vetores de expressão finais. Os vetores de expressão finais foram transformados em células de E. coli, a expressão do DNA plasmidial foi isolada (Miniprep) e submetida a análise por enzimas de restrição e sequenciamento de DNA. Os clones corretos foram cultivados em 150 ml de meio LB-Amp, e novamente o DNA plasmidial foi isolado (Maxiprep) e utilizado para os experimentos subsequentes.
[0205] Um vetor de expressão foi usado para a construção do ectodomínio recombinante EpCAM murino (referindo-se à sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 10 (conforme codificado pela sequência de cDNA mostrada na SEQ ID NO: 9), enquanto que a sequência de origem foi derivada da base de dados PubMed acesso NM_008532 (NM_008532.2, 01:112293274). O vetor (vide a Figura 17) é composto dos seguintes elementos: - uma origem de replicação, oriP, do vírus Epstein-Barr (EBV); - uma origem de replicação a partir do vetor pUC18 para a replicação deste plasmídeo em E. coli; - um gene beta-lactamase que confere resistência à ampicilina em E. coli.; - um cassete de higromicina-b-fosfotransferase; - o promotor precoce do vírus símio 40; - a sequência sinal de poliadenilação (“poli-A”) do vírus símio 40; - o facilitador (enhancer) e promotor precoce imediato do citomegalovírus humano (HCMV); - um sítio PreScission Plus seguido por uma His-Avitag para a fusão N-terminal do cDNA de interesse; - a sequência sinal de poliadenilação (“poli-A”) do hormônio de crescimento bovino, e - sítio de restrição por endonucleases únicos BamHI e NotI.
[0206] Os plasmídeos pG18 (ampR) que transportam o segmento de DNA codificante do ectodomínio EpCAM sintetizado e o vetor de expressão (vide a Figura 17) foram digeridos com BamHl e Notl. Todos os fragmentos obtidos foram submetidos à eletroforese em gel de agarose. Os segmentos de DNA foram então ligados ao fragmento BamHI/Notl no vetor de expressão Roche isolado resultando no vetor de expressão final. O vetor de expressão final foi transformado em células de E. coli, a expressão do DNA plasmidial foi isolada (Miniprep) e submetida a análise por enzimas de restrição e sequenciamento de DNA. Os clones corretos foram cultivados em 150 ml de meio LB-Amp, e novamente o DNA plasmidial foi isolado (Maxiprep) e utilizado para os experimentos subsequentes.
EXEMPLO 2 EXPRESSÃO E PURIFICAÇÃO DO ECTODOMÍNIO EPCAM EXIBINDO ALTA AFINIDADE DE LIGAÇÃO 2.1 EXPRESSÃO TRANSITÓRIA DE IMUNOGLOBULINA VARIANTES EM CÉLULAS 293 EMBRIONÁRIAS DE RIM HUMANO (HEK293)
[0207] Variantes de imunoglobulinas recombinantes (MAB225, MAB225_scFv_G8.8 e G8.8) foram expressas pela transfecção transitória de células de rim embrionário humano 293-F, utilizando o sistema de expressão FreeStyle 293 Expression System™ de acordo com as instruções do fabricante (Invitrogen, EUA). Resumidamente, células FreeStyle™ 293-F em suspensão foram cultivadas em meio de expressão Freestyle™ 293 a 37 °C/8% CO2. As células foram semeadas em meio fresco a uma densidade de 1x106 células viáveis/mL no dia anterior ao da transfecção. Complexos DNA-293fectina® foram preparadas em meio Opti-MEM® I (Invitrogen, EUA), utilizando 665 μL de Reagente de Transfecção 293-Free® (Novagen, Merck, EUA) e 500 μg de DNA total (incluindo o DNA plasmidial da cadeia leve e o DNA plasmidial da cadeia pesada em uma razão molar de 1:1) para 500 ml de volume de transfecção final. Os sobrenadantes de cultura celular contendo anticorpos foram coletados sete dias após a transfecção por centrifugação a 14000 g durante 3500 minutos e filtrados através de um filtro estéril (0,22 μm). Os sobrenadantes foram armazenados a -80 °C até a purificação. O processo para a produção do ectodomínio EpCAM murino foi semelhante à produção das imunoglobulinas variantes e 500 μg de DNA foram utilizados para um volume de transfecção final de 500 mL.
2.2 PURIFICAÇÃO DE ANTICORPOS
[0208] Os anticorpos foram purificados a partir de sobrenadantes da cultura celular por cromatografia de afinidade utilizando a proteína A- Sepharose® (GE Healthcare, Suécia) e cromatografia de exclusão por tamanho Superdex200. Resumidamente, os sobrenadantes das culturas celulares estéreis por filtração foram aplicados a uma coluna de 5 ml MabSelect Xtra (GE Healthcare) equilibrada com tampão PBS (10 mM de Na2HPO4, 1 mM de KH2PO4, 137 mM de NaCl e 2,7 mM de KCl, pH 7,4). As proteínas não ligadas foram lavadas com tampão de equilíbrio. Anticorpos e variantes de anticorpos foram eluídos com tampão citrato 0,1 M, pH 3,0, e as frações contendo proteína foram neutralizadas com 0,2 M de Tris, pH 9,0. Em seguida, as frações proteicas eluídas foram reunidas, concentradas com um dispositivo tipo filtro de centrifuga Amicon Ultra (MWCO: 30 K, Millipore) para um volume de 3 ml e carregadas em uma coluna de filtração em gel 16/60 ou 26/60 Superdex200 HiLoad 120 ml (GE Healthcare, Suécia ), equilibrada com histidina 20 mM, NaCl 140 mM, pH 6,0. As frações contendo anticorpos purificados com menos de 5% de agregados de alto peso molecular foram reunidas e armazenadas como alíquotas de aproximadamente 1,0 mg/ml a -80°C.
[0209] O ectodomínio do EpCAM murino (SEQ ID NO: 9) foi purificado a partir do sobrenadante da cultura celular por cromatografia de afinidade utilizando cromatografia em Ni-quelato. Resumidamente, os sobrenadantes da cultura de células estéreis por filtração foram aplicados em uma coluna HisTrap FF (GE Healthcare, Suécia) equilibrada com 20 mM de “NaPO4”, NaCl 0,5 M, imidazol 20 mM, pH 7,40. As proteínas não ligadas foram lavadas com tampão de equilíbrio. O ectodomínio de EpCAM (SEQ ID NO: 9) foi eluído com um tampão contendo 20 mM de “NaPO4”, NaCl 0,5 M. Imidazol 500 mM, pH 7,40. As frações do pico foram reunidas e dialisadas durante a noite contra um tampão contendo 20 mM de histidina, 140 mM de NaCl. pH 6,7. A proteína foi armazenada em alíquotas de 17,5 mg/ml a -80 °C.
2.3 ANÁLISE DE PROTEÍNAS PURIFICADAS
[0210] A concentração de proteína de amostras de proteína purificadas foi determinada por meio da medição da densidade óptica (OD) a 280 nm, utilizando o coeficiente de extinção molar calculado com base na sequência de aminoácidos. A pureza e o peso molecular de anticorpos foram analisados por SDS-PAGE na presença e na ausência de um agente redutor (5 mM de 1,4- ditiotreitol) e coloração com azul brilhante de Coomassie). O sistema “NuPAGE® Pre-Cast gel system” (Invitrogen, EUA) foi usado de acordo com as instruções do fabricante (4-12% de géis Bis-Tris). O teor agregado das amostras de anticorpos foi analisado por SEC de alto desempenho utilizando uma coluna TSKgel G3000SW (TOSOH Bioscience, EUA) em 50 mM de “KPO4”, pH 7,5, tampão de corrida com NaCl 300 mM a 25 °C. 25 μg de proteína foram injetados na coluna a uma velocidade de fluxo de 0,8 ml/min e eluídos isocraticamente durante 20 minutos. A integridade da estrutura principal de aminoácidos das cadeias variantes da imunoglobulina reduzida foi verificada por espectrometria de massa com ionizador NanoElectrospray “NanoElectrospray Q-TOF” após a remoção de N-glicanos por tratamento enzimático com Peptídeo-N-glicosidase F (Roche Molecular Biochemicals).
2.4 IMUNOPRECIPITAÇÃO DE EPCAM MURINO RECOMBINANTE
[0211] Uma Imuno precipitação (PI) foi realizada para verificar se os anticorpos G8.8 (SEQ ID NOs: 3 e 4) e o anticorpo biespecífico MAB225_G8.8 (SEQ ID NOs: 5 e 6) se ligam ao ectodomínio do EpCAM murino recombinante (ECD) (SEQ ID NO : 10). Aproximadamente 15 μg de ECD EpCAM e 10 μg de anticorpo foram diluídos até um volume total de 1,5 ml com TBS Tween 0,1% e incubados a 10 min em temperatura ambiente. O anticorpo sem EpCAM foi preparado em paralelo como controle negativo para distinguir as bandas das cadeias pesada e leve. 50 μL de uma suspensão de proteína A a 50% foram adicionados e as amostras foram incubadas durante 40 min sob agitação à temperatura ambiente, lavados com TBS-T, eluídos com tampão citrato, pH 3,0, e carregado sobre um gel Bis-Tris 4-12%. 4 μg de EpCAM ECD recombinante foi carregado como controle. O gel foi corado com o corante Azul de Coomassie.
2.5 ESPECTROMETRIA DE MASSA
[0212]A massa deglicosilada total dos anticorpos foi determinada e confirmada por meio da espectrometria de massas com ionização por electrospray (ESI-MS). Resumidamente, 100 μg de anticorpos purificados foram desglicosilados com 50 mU N-glicosidase F (PNGaseF, Prozyme) em 100 mM de KH2PO4/K2HPO4, pH 7 a 37 °C por 12-24 h em uma concentração de proteína de até 2 mg/ml e posteriormente dessalinizada via HPLC em uma coluna de Sephadex G25 (GE Healthcare). A massa das respectivas cadeias de anticorpos foi determinada por ESI-MS após a desglicosilação e redução. Em resumo, 50 μg de anticorpo em 115 μL foram incubados com 60 μL de TCEP 1M e 50 μl de cloridrato de guanidina 8M e posteriormente dessalinizados. A massa total e a massa das cadeias do anticorpo reduzido foram determinadas por meio da ESI-MS em um sistema Q-Star MS Elite equipado com uma fonte NanoMate. O intervalo de massa registrado depende do peso molecular das amostras. Em geral, para os anticorpos reduzidos o intervalo de massa foi definido a partir de 600-2000 m/z e para anticorpos não reduzidos de 1000-3600 m/z.
2.6 RESSONÂNCIA PLASMÔNICA DE SUPERFÍCIE
[0213] As propriedades de ligação específica do MAb225-EGFR (SEQ ID NOs: 1 e 2) e do anticorpo EpCAM-específico G8.8 (SEQ ID NOs: 3 e 4), bem como do anticorpo biespecífico MAb225_scFv_G8.8 foram analisadas por ressonância plasmônica de superfície (SPR), utilizando um instrumento Biacore (Biacore, GE-Healthcare, Uppsala). Este sistema é bem estabelecido para o estudo de interações de moléculas. Ele permite um monitoramento contínuo em tempo real das ligações entre ligantes/analitos e, portanto, a determinação das constantes de velocidade para a associação (ka), constantes de velocidade de dissociação (kd) e constante de equilíbrio (KD) em diversas configurações de ensaio. A tecnologia da SPR baseia-se na medição do índice de refração próximo a superfície de um chip biossensor revestido de ouro. As alterações no índice de refração indicam alterações de massa sobre a superfície causadas pela interação do ligante imobilizado com o analito injetado em solução. Se as moléculas se ligam ao ligante imobilizado sobre a superfície a massa aumenta, no caso de dissociação a massa diminui. Para a captura, um anticorpo de cabra anti-IgG de camundongo foi imobilizado sobre a superfície de um chip biosensor CM5 usando química de acoplamento de amina de acordo com as instruções do fabricante. As células de fluxo foram ativadas com uma mistura 1:1 de N-hidroxissuccinimida 0,1 M e cloridrato de 1-etil-3-(3- dimetilaminopropil)-carbodi-imida 0,4 M a uma velocidade de fluxo de 5 μL/min a 25 °C. O anticorpo anti-IgG de camundongo foi injetado em 10 mM de acetato de sódio, pH 4.5 a 10 μg/mL. Uma célula de fluxo como controle de referência foi tratada da mesma maneira, mas apenas com tampão ao invés do anticorpo de captura. As superfícies foram bloqueadas com uma injeção de etanolamina 1 M / HCl pH 8,5. Os anticorpos sob avaliação foram diluídos (30 nM de MAb225_scFv_G8.8. 5 nM de MAb225, 8 nM G8.8) em PBS-T + 0,1% de BSA (tampão de diluição) e capturados como ligantes em ciclos separados por injeção a 5 μl/min durante 60 segundos. Todas as interações foram realizadas a 37 °C, utilizando PBS-T como tampão de corrida. Os analitos foram injetados em uma série de concentrações em incrementos de três vezes (EGFR ECD 4,12 - 1000 nM e EpCAM ECD 0,91 - 2000 nM em PBS-T + BSA a 0,1%) com uma velocidade de fluxo de 50 μL/min, 180 segundos de associação, 1200 segundos de dissociação. O anticorpo de captura foi regenerado após cada ciclo com 10 mM de glicina, pH 2,0 em uma velocidade de fluxo de 30 μL/min por 60 segundos. Os sinais foram detectados a uma taxa de um sinal por segundo.
[0214] Um resumo da caracterização bioquímica do anticorpo biespecífico ilustrativo MAb225scFv_G8.8, bem como os anticorpos parentais individuais MAb225 e G8.8 é fornecido na Tabela 1, exibindo que todos os anticorpos ligaram com alta afinidade aos seus respectivo alvos.
EXEMPLO 3 TRANSDUÇÃO DE CÉLULAS T CD8+ E ENSAIO CITOTÓXICO 3.1 CULTURA CELULAR
[0215] O baço foi coletado a partir dos camundongos descritos abaixo no item 3.2. Uma suspensão com célula única foi obtida pelo esmagamento do baço utilizando uma peneira de células 40μm (BD Falcon, Alemanha). A peneira foi lavada 3 vezes com meio para células T simples e um sedimento celular foi liberado a partir de eritrócitos pela solução erilysis (BD Pharmingen. Alemanha) durante 90 segundos. Células T primárias murinas foram mantidas em meio de células T constituído por meio RPMI, 1% de L- glutamina, 1% de penicilina e estreptomicina, 1% Piruvato sódico. HEPES 1 mM (todos PAA. Alemanha) e 10% de SBF (Gibco. EUA). A linhagem de células T B3Z (Leiseganget al., J Mol. Med (2008), 86 (5), 573-583) foi mantida no mesmo meio. A linhagem celular empacotadora (packaging cell line) PLat E (Cell Biolabs, Inc, EUA (www.cellbiolabs.com)) foi mantida em meio DMEM, 1% de L- glutamina, 1% de Penicilina-Estreptomicina (todos PAA, Alemanha), e 10 μg/ml de Puromicina e 1 μg/ml de blasticidina (Sigma, Alemanha). A linhagem celular de câncer gástrico murino foi gentilmente fornecida por W. Zimmermann, Munique e cultivada em meio DMEM, 1% de L-glutamina, 1% de penicilina e estreptomicina, 1% piruvato sódico, 1% aminoácidos não essenciais e 10% de SBF. A linhagem celular de carcinoma mamário 4T1 (ATCC N°: CRL-2539) foi passada em meio RPMI, 1% de L-glutamina. 1% penicilina e estreptomicina, 1% piruvato sódico, 1% de aminoácidos não essenciais e 10% de SBF. A linhagem de células de melanoma murino B16 (ATCC N°: CRL-6322) foi mantida em meio DMEM, 1% de L-glutamina, 1% penicilina e Estreptomicina e 10% de SBF.
3.2 CAMUNDONGOS
[0216] Camundongos C57B1/6 tipo-selvagem foram comprados da Harlan laboratories (Holanda). Os camundongos transgênicos para um receptor de células T específico para o epítopo imunodominante I do antígeno T grande foram comprados da Jackson Laboratory, EUA (B6.Cg-Tg(TcraYl, TcrbYl)416Tev/J), EUA). O camundongo transgênico para um receptor de célula T específico para OVA (Ovalbumina) foi comprado da Jackson Laboratory, EUA (C57B1/6-Tg (TcraTcrb)l100Mjb/j).
3.3 CÉLULAS T: VETOR DE TRANSDUÇÃO E CLONAGEM
[0217] O vetor para a transdução de células T foi o pMP71 (Schambach et al. Mol. Ther (2000), 2 (5).435-45). O receptor do fator de crescimento epidérmico humano truncado (del-EGFR, como um exemplo prototípico de uma proteína imunologicamente inerte inserida na membrana, vide a SEQ ID NO 11 como sequência de cDNA e SEQ ID NO: 12 como a sequência de aminoácido (codificada)) flanqueado pelos sítios de restrição Notl e EcoRI foi criado por síntese de gene. Utilizando estes dois sítios de recombinação, o del EGFR foi clonado no pMP71 por ligação (T4-ligase, Thermo Scientific, Alemanha). O del-EGFR pMP71 foi amplificado em E. coli (DH5α) e a sequência foi verificada por sequenciamento usando as seguintes sequências de primers: primer direto: CAGCATCGTTCTGTGTTGTCT (SEQ ID NO: 13), primer reverso: CATTTAAATGTATACCCAAATCAA (SEQ ID NO: 14). O DNA foi extraído utilizando o kit “Qiagen plasmid maxi kit” (Qiagen, Alemanha). Todas as etapas foram realizadas de acordo com as instruções do fabricante.
3.4 CÉLULAS T PRIMÁRIAS E TRANSDUÇÃO DA LINHAGEM DE CÉLULAS T
[0218] A transdução foi realizada de acordo com o método descrito por Leisegang et al. (J. Mol. Med., (2008) 86, 573-83), com pequenas modificações. Em resumo, a linhagem celular empacotadora (packaging cell line) Plat E (conforme descrito por Morita et al, Gene Ther (2000) 7, 1063-6) foi semeada em placas de 6 poços e cultivadas durante a noite até uma confluência de 70 - 80%. No dia um, 16 μg de DNA foram misturados com 100 mM de CaCl2 (Merck, Alemanha) e 126,7 μM Cloroquina (Sigma, EUA). As células Plat-E foram deixadas em meio com soro a 3% durante 30 minutos e, em seguida, incubadas durante 6 horas com o DNA precipitado. O meio foi em seguida removido e trocado com meio de cultura. No dia dois, os esplenócitos primários foram coletados a partir de camundongos C57B1/6 (Harlan Laboratories). As suspensões de células individuais de baço foram estimuladas com anti-CD3 (clone 145-2c11 BD Pharmingen, EUA), anti-CD28 (clone 37.51, BD Pharmingen, EUA) e IL-2 recombinante murino (Peprotech, Alemanha) em meio de célula T durante a noite. No dia 3, placas de 24 - poços foram revestidas com 12,5 μg/ml de retronectina recombinante (Takara Biotech, Japão) durante 2 h em temperatura ambiente, bloqueadas com 2% de albumina de soro bovino (Roth, Alemanha) durante 30 min a 37 °C e lavada com PBS. O sobrenadante de Plat E foi coletado e passado através de um filtro (40 μm, Millipore, EUA). Meios de células T frescos foram então adicionados às células E Plat. 1 ml de sobrenadante filtrado foi distribuído em cada cavidade e inoculado durante 2 h a 4 °C. O sobrenadante foi então removido da placa de 24 poços. 106 células T foram semeadas em 1 ml de meio de células T suplementado com 10 U de IL-2 e 400000 esferas com anti-CD3 e anti-CD28 (Invitrogen, Alemanha) por poço e centrifugado a 800 g durante 30 min a 32 °C. No dia quatro, o sobrenadante de Plat E foi novamente coletado e filtrado. 1 ml foi adicionado em cada poço da placa de 24 poços e centrifugado a 800g durante 90 minutos a 32 °C. As células foram subsequentemente incubadas durante 6 horas adicionais a 37 °C. 1 ml do sobrenadante foi substituído por meio de células T com IL-2. No dia cinco, as células foram coletadas, contadas e resemeadas em uma densidade de 106 células/ml em meio de células T suplementado com 10 ng de IL-15 por ml (Peprotech, Alemanha). As células T foram mantidas a esta densidade até o 10° dia, quando foram realizadas as análises de células ou ensaios funcionais.
3.5 ENSAIO DE LIGAÇÃO CRUZADA DO ANTICORPO
[0219] Células 4T1 expressando EpCAM foram semeadas em placas de 6 poços e cultivadas até a confluência. Células T del EGFR transduzidas foram marcadas com calceína (Invitrogen. Alemanha) de acordo com as instruções do fabricante e pré-carregadas por 30 min a 37 °C com 20 μg/ml de anticorpo biespecífico EpCAM x EGFR (MAb225_scFv_G8.8). Células foram adicionados à cultura de 4T1 durante 2 horas a 37 °C. O sobrenadante foi completamente removido e a placa lavada cuidadosamente com PBS. As células foram então visualizadas por microscopia de fluorescência ou lisadas e a retenção de calceína foi mensurada em um leitor multimarcadores (Berthold, Alemanha).
3.6 ENSAIO DE MORTE CELULAR
[0220] Células mGC8 (Nockel et al. BMC (2006), 14 6:57) ou B16 foram marcadas com calceína de acordo com as instruções do fabricante. Células T del EGFR transduzidas (a partir das células tipo-selvagem OT-1 ou TCR-I de camundongos) foram pré-carregadas com 20 μg.ml-1 de anticorpo (biespecífico ou anticorpo controle) durante 30 min. a 37 °C. As células T foram então incubadas em diferentes razões de células alvo para células efetoras durante a noite a 37 °C, com as células-alvo. A lise total das células alvo foi induzida pela adição de 6% de Triton X (Firma). A lise em % foi calculada de acordo com a seguinte fórmula: (MFIde interesse-MFIde fundo)/(MFIlise total- MFIde fundo)*100
3.7 TERAPIA IN VIVO
[0221] Camundongos C57B1/6 machos tipo selvagem foram inoculados subcutaneamente com 5,106 células mGC8. Quando os tumores se tornaram palpáveis (pelo dia 15), a transdução de células T foi iniciada e 10 dias mais tarde a terapia foi dada intraperitonealmente (para anticorpos a uma dose de 10 mg/kg) ou intravenosamente (para células T ou células T pré-carregadas em uma dose de 5.106 células por camundongo). Uma semana mais tarde, o tratamento foi repetido. Os camundongos foram monitorados a cada 2-3 dias pela medição do tumor subcutâneo. Os camundongos foram mortos de acordo com os regulamentos em um ponto de tempo pré-definido ou de acordo com os critérios publicados pela GV SOLAS (Morton, Vet Rec (1985) 116, 431-436).
3.8 . ANÁLISE ESTATÍSTICA
[0222] Para a comparação entre os grupos, testes t não pareados foram aplicados. Os volumes tumorais foram comparados por ANOVA bicaudal e as diferenças de sobrevida foram avaliadas pelo teste de log-rank. Todas as análises estatísticas foram realizadas utilizando o software GraphPad Prism (GraphPad software inc.). Os resultados foram considerados significativos quando p < 0,05.
EXEMPLO 4 CLONAGEM E EXPRESSÃO DO ANTICORPO BIESPECÍFICO BSAB EPCAM-EGFRVIII, MR1.1
[0223] De forma análoga ao exemplo 1 e 2 a (A) cromatografia de exclusão por tamanho analítica de um anticorpo biespecífico BsAb EpCAM-EGFRvIII. MR1.1 direcionada contra EGFRvIII (humano) e EpCAM (murino) foi preparada, purificada e caracterizada (vide a Figura 20) (A), cromatografia de exclusão por tamanho analítica, (B) análise SDS-PAGE não redutor (NR) e redutor (R) do referido anticorpo biespecífico. Corado com Azul de Coomassie.
EXEMPLO 5 LIGAÇÃO CRUZADA DE CÉLULAS T TRANSDUZIDAS COM CÉLULAS DE MELANOMA B16 POR MEIO DE UM ANTICORPO BIESPECÍFICO BSAB EPCAM-EGFRVIII, MR1.1 (VIDE O ESQUEMA NA FIGURA 21)
[0224] As células de melanoma B16 expressando EpCAM (marcadas com GFP) (células B16-OVA-mEpCAM) foram semeadas em placas de 12 poços e cultivadas até a confluência durante a noite. No dia seguinte, células T B3Z transduzidas (linhagem de células permanente) com del-hEGFRvIII (del-hEGFRvIII inserido; vide a SEQ ID NO: 17 como a sequência de DNA e SEQ ID NO: 18 como a sequência de aminoácido (codificada) foram pré-incubadas com o anticorpo biespecífico BsAb EpCAM-EGFRvIII, MR1.1 (20 μg) durante 1 hora a 37 °C. O anticorpo biespecífico não ligado remanescente foi subsequentemente lavado. As células T B3Z pré-carregadas com o anticorpo biespecífico (BiaB) foram incubadas com as células tumorais B16 aderentes a 37 ° C (coluna n° 5). Após lavagem com PBS por quatro vezes (colunas n°: 1 a 4), as células remanescentes foram tratadas com tripsina e as células fluorescentes e não fluorescentes foram mensuradas por citometria de fluxo. Como controles as células de melanoma B16 foram tratadas somente com células T B3Z transduzidas com delEGFRvIIl (sem anticorpo BsAb EpCAM-EGFRvIII, vide a coluna n°: 2), apenas com células T B3Z não transduzidas (sem anticorpo BsAb EpCAM-EGFRvIII vide a coluna n°: 3) com e sem lavagem e com células T B3Z não transduzidas com anticorpo biespecífico BsAb EpCAM- EGFRvIII (coluna n°: 4). O anticorpo biespecífico (BiAb) BsAb EpCAM-EGFRvIII manteve mais células transduzidas no balão (coluna n°: 1) do que qualquer um dos controles com lavagem (coluna nos: 2 a 4). Os resultados estão exibidos na Figura 22.

Claims (7)

1. KIT, caracterizado por compreender: (A) molécula de anticorpo biespecífico, que compreende: (i) um primeiro domínio de ligação que se liga a um antígeno sobre células T CD8+, que não ocorre naturalmente em ou sobre células T CD8+, em que o referido antígeo é EGFR; e (ii) um segundo domínio de ligação que se liga a um antígeno tumor-específico que ocorre naturalmente sobre a superfície de uma célula tumoral, em que o referido antígeno é EpCAM; e (B) um vetor que compreende um ácido nucléico que codifica um antígeno que não ocorre naturalmente em ou sobre células T CD8+, conforme definido em (i), para transdução de referidas células T CD8+ obtidas a partir de um sujeito a ser tratado, em que a molécula de anticorpo biespecífico (A) compreende SEQ ID Nos: 5 e 6, e o vetor (B) compreende uma sequência de ácido nucleicos de SEQ ID NO: 9; ou em que a molécula de anticorpo biespecífico (A) compreende SEQ ID Nos: 15 e 16, e o vetor (B) compreende uma sequência de ácido nucleicos de SEQ ID NO: 17.
2. MOLÉCULA DE ANTICORPO biespecífico, caracterizada por compreender: (i) um primeiro domínio de ligação que se liga a um antígeno sobre células T CD8+, que não ocorre naturalmente em ou sobre células T CD8+; em que o referido antígeno é EGFR; e (ii) um segundo domínio de ligação que se liga a um antígeno tumor-específico que ocorre naturalmente sobre a superfície de uma célula tumoral, em que o referido antígeno é EpCAM; em que a molécula de anticorpo biespecífico compreende SEQ ID Nos: 5 e 6 ou 15 e 16; para uso como um medicamento.
3. MOLÉCULA DE ANTICORPO biespecífico, caracterizada por compreender: (i) um primeiro domínio de ligação que se liga a um antígeno sobre as células T CD8+, que não ocorre naturalmente em ou sobre as células T CD8+, em que o referido antígeno é EGFR; e (ii) um segundo domínio de ligação que se liga a um antígeno tumor-específico que ocorre naturalmente sobre a superfície de uma célula tumoral, em que o referido antígeno é selecionado a partir do grupo que consiste em EpCAM; em que a molécula de anticorpo biespecífico compreende SEQ ID Nos: 5 e 6 ou 15 e 16; para uso em um método para tratar uma doença maligna.
4. MOLÉCULA, de acordo com a reivindicação 3, caracterizada por dita doença maligna ser selecionada de câncer de origem epitelial, endotelial ou mesotelial e câncer do sangue.
5. KIT, de acordo com a reivindicação 1, ou molécula de anticorpo biespecífico, de acordo com qualquer uma das reivindicações 2 a 4, caracterizado pela referida molécula de anticorpo biespecífico ser selecionada a partir do grupo consistindo em um anticorpo completo, um fragmento F(ab)-, Fab'-SH-, Fv-, Fab'-, F(ab')2-, um anticorpo quimérico, um anticorpo CDR- enxertado, um anticorpo completamente humano, uma construção-anticorpo bivalente, uma proteína de fusão-anticorpo, um anticorpo sintético, um anticorpo bivalente, um anticorpo trivalente, um anticorpo tetravalente, um anticorpo de cadeia única bivalente, um anticorpo de cadeia única trivalente e um anticorpo de cadeia única multivalente.
6. KIT, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 ou 5, ou molécula de anticorpo biespecífico, de acordo com qualquer uma das reivindicações 2 a 4, caracterizado pelo referido primeiro domínio ser humano e/ou humanizado.
7. USO DE UMA MOLÉCULA DE ANTICORPO biespecífico,conforme definida em qualquer uma das reivindciações 2 a 3, caracterizado por ser para a fabricação de um medicamento para o tratamento de uma doença maligna em um sujeito com essa necessidade, em que a dita doença maligna é selecionada de câncer de origem epitelial, endotelial ou mesotelial e câncer do sangue.
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