KR20140127845A - 항원-형질감염된 t 세포와 함께 사용되는 이중특이적 항체 분자 및 의약에서의 이들의 용도 - Google Patents

항원-형질감염된 t 세포와 함께 사용되는 이중특이적 항체 분자 및 의약에서의 이들의 용도 Download PDF

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Abstract

본 발명은 CD8+ T 세포 내에서 및/또는 상에서 천연적으로 발생하지 않는 CD8+ T 세포 상의 항원에 결합하는 제1 결합 도메인 및 종양 세포의 표면 상에서 천연적으로 발생하는 종양 특이적 항원에 결합하는 제2 결합 도메인을 갖는 이중특이적 (단일클론) 항체 분자에 관한 것이다. 상기 이중특이적 (단일클론) 항체 분자는 CD8+ T 세포 내에서 및/또는 상에서 천연적으로 발생하지 않는 항원 및/또는 T 세포 수용체를 포함하는 형질도입된 CD8+ T 세포와 함께 특히 유용하다. 본 발명은 약제로서의 상기 (이중특이적) 항체 분자의 용도, 특정 질환의 치료 방법에서 사용되는 (이중특이적) 항체 분자, 및 상기 (이중특이적) 항체 분자를 포함하는 약학 조성물/약제를 제공하고, 이때 상기 (이중특이적) 항체 분자는 특정 치료 요법에서 CD8+ T 세포 내에서 및/또는 상에서 천연적으로 발생하지 않는 항원 및/또는 T 세포 수용체를 포함하는 형질도입된 CD8+ T 세포와 함께 투여된다. 본 발명의 추가 양태는 상기 이중특이적 (단일클론) 항체 분자를 코딩하는 핵산 서열, 벡터, 숙주 세포, 상기 (이중특이적) 항체 분자의 제조 방법, 및 본 발명의 (이중특이적) 항체 분자를 포함하는 키트이다.

Description

항원-형질감염된 T 세포와 함께 사용되는 이중특이적 항체 분자 및 의약에서의 이들의 용도{BISPECIFIC ANTIBODY MOLECULES WITH ANTIGEN-TRANSFECTED T-CELLS AND THEIR USE IN MEDICINE}
본 발명은 CD8+ T 세포 내에서 및/또는 상에서 천연적으로 발생하지 않는 CD8+ T 세포 상의 항원에 결합하는 제1 결합 도메인, 및 종양 세포의 표면 상에서 천연적으로 발생하는 종양 특이적 항원에 결합하는 제2 결합 도메인을 갖는 이중특이적 (단일클론) 항체 분자에 관한 것이다. 본 발명의 이중특이적 (단일클론) 항체 분자를 코딩하는 핵산 서열도 제공된다. 본 발명의 추가 양태는 상기 핵산 서열을 포함하는 벡터 및 숙주 세포, 본 발명의 (이중특이적) 항체 분자의 제조 방법, 및 상기 (이중특이적) 항체 분자를 포함하는 약제/조성물이다. 나아가, 본 발명은 CD8+ T 세포 내에서 및/또는 상에서 천연적으로 발생하지 않는 항원 및/또는 T 세포 수용체를 포함하는 형질도입된 CD8+ T 세포에 관한 것이다. 본 발명은 특정 질환의 치료 방법 및 상기 (이중특이적) 항체 분자를 포함하는 약학 조성물/약제에 있어서 상기 (이중특이적) 항체 분자의 용도도 제공하고, 이때 상기 (이중특이적) 항체 분자(들)는 특정 치료 요법에서 CD8+ T 세포 내에서 및/또는 상에서 천연적으로 발생하지 않는 항원 및/또는 T 세포 수용체를 포함하는 형질도입된 CD8+ T 세포와 함께 투여된다. 본 발명은 특정 질환을 치료하는 방법, 및 본 발명의 (이중특이적) 항체 분자를 포함하는 키트도 제공한다.
양자(adoptive) T 세포 치료로도 지칭되는 T 세포(즉, T 림프구)의 수혈은 암 및 만성 감염의 치료용으로 시험되었다. 양자 T 세포 치료는 항종양 면역을 향상시키고 백신 효능을 증강시키고 이식편-대-숙주 질환을 한정하는 잠재력을 갖는다. 양자 T 세포 치료는 특히 세포독성 T 세포(CTL) 또는 종양 침습 림프구(TIL)를 세포 공급원으로서 사용한다. 이중특이적 항체는 (활성화된) T 세포들을 "무장"시켜 이들과 종양 세포 상의 표면 항원 사이에 가교를 형성하는 데에 사용될 수 있다. 종양 세포 상의 표면 마커/항원을 한 면 상에서 표적화하고 세포 내에서 또는 상에서 천연적으로/내생적으로 발현되는 또 다른 마커/항원을 다른 면 상에서 표적화하는 이중특이적 항체는 예를 들면, 문헌(Glorius et al., Blood 116 (2010), 1173); 문헌(Rothe et al., Blood 118 (2011), 1585); 문헌(Zhengxing et al., Blood 111 (2007), 2211-2219); 문헌(Herrmann et al., Cancer Research 68 (2008), 1221-1227); 문헌(Singer et al., Journal of Immunotherapy 33 (2010), 599-608); 문헌(Brandl et al., Experimental Hematology 27 (1999), 1264-1270); 문헌(James et al., European Journal of Cancer 35 (1999), S343-S344); 문헌(Chen et al., Clinical Cancer Research 1 (1995), 1319-1325); 문헌(Valera et al., Molecular Cancer Therapeutics 9 (2010), 1872-1883); 문헌(Gelderman et al., European Journal of Immunology 36 (2006), 977-984); 문헌(Schweizer et al., Cancer Immunology Immunotherapy 51 (2002), 621-629); 문헌(Friedman et al., Biotechnology and Applied Biochemistry 54 (2009), 121-131); 문헌(Schaefer et al., Cancer Cell 20 (2011), 472-486); 및 문헌(Kazuhiko et al., International Journal of Molecular Medicine 25 (2010), 209-215)에 기재되어 있다.
항원 특이적 세포독성 T 세포(CTL)는 생체외 증폭된 종양 침습 림프구(TIL) 또는 T 세포 수용체 유전자-형질감염된 T 세포를 흑색종을 앓고 있는 환자에게 입양 전달한 후 종양 퇴행에 의해 밝혀진 바와 같이 인간 암 세포를 사멸하는 능력을 갖는 것으로 공지되어 있다(Leen et al., Annu. Rev. Immunol. 115 (2007), 98-104). 대안적인 공지된 방법은 다수의 내생성 T 세포를 전용하기 위한 이중특이적 항체의 사용이다. 이들 이중특이적 항체(이들 중 일부 포맷은 BiTE("이중특이적 T 세포 개입유발제(bispecific T-cell engager)")로 지칭됨)는 이들이 (T 세포 상에서 천연적으로 발생하거나/내생적으로 발현되는) 표면 마커 CD3을 한 면 상에서 표적화하고 (종양 세포의 표면 상에서 천연적으로/내생적으로 발현되는) 종양 세포 상의 표면 항원을 다른 면 상에서 표적화하는 방식으로 구축되었다. 나아가, 이 특정 디자인의 항-CD3 항-표적 항원 이중특이적 항체는 예외적으로 높은 효능을 갖고 매우 낮은 이펙터 대 표적(E:T) 비에서 암 세포의 용해를 위해 CD8+ T 세포 및 CD4+ T 세포를 개입시킬 수 있었다는 것이 종래 연구에서 밝혀졌다. 2종의 BiTE 항체들이 임상시험에서 현재 시험되고 있다: 블리나투모맙(MT103으로서도 공지됨)은 CD3 및 CD19에 대한 이중특이성을 나타낸다. 이 항체는 말기 재발된 비-호지킨 림프종(NHL)을 갖는 환자의 I 기 시험(Bargou et al., Science 321 (2008), 974-977), 및 B 전구체 급성 림프모구성 백혈병(B-ALL)을 갖는 환자의 II 기 시험(Topp et al., Blood 112 (2008), 1926)에서 현재 시험되고 있다. I 기 시험에서 제2 BiTE 항체는 범-암종-관련 항원, 상피 세포 부착 분자(EpCAM 또는 CD326) 및 CD3을 표적화하는 MT-110(마이크로멧 인코포레이티드(Micromet Inc.))이다(Brischwein et al., Mol. Immunol. 43 (2006), 1129-1143). 한 이중특이적 항체(카투막수맙[레모밥(Removab)®]; CD3 및 인간 EpCAM에 대한 이중특이성을 나타냄)는 2009년 유럽에서 시판에 대해 승인받았다.
시험관내에서 및 마우스 모델 시스템에서 이중특이적 항체는 CD3 및 표적 항원에 동시적으로 결합하여 T 세포와 암 세포를 연결함으로써, 세포독성 과립 융합 및 일시적인 사이토카인 및 그랜자임 방출을 수반하는 T 세포 활성화를 유발할 수 있다. 그러나, (T 세포 항원 특이성과 무관하게) 다수의 T 세포의 활성화 및/또는 종양 세포 용해의 방관자 효과는 이러한 이중특이적 항체를 예를 들면, 인간에서 치료 요법의 부분으로서 사용할 때 심각한 문제점을 야기한다.
이러한 한 문제점은 마우스 모델 시스템에서 통상적으로 효과를 야기하지 않지만 인간에서 최악의 효과를 가질 수 있는 소위 "사이토카인 방출 증후군(CRS)"이다(Suntharalingam et al., The New England Journal of Medicine 355 (2006), 1018-1028). CRS는 두통, 근육통, 구토, 설사, 홍반, 혈관확장 및 저혈압을 포함한다. 가장 심각한 형태는 폐 침습, 폐 손상, 신부전, 및 산재성 혈관내 응고를 유발한다(Suntharalingam et al.. The New England Journal of Medicine 355 (2006), 1018-1028). CRS가 이중특이적 항체 적용과 관련되어 있지 않은 경우조차도, 이중특이적 항체 투여 후 (80%의 3등급 이상의 독성에 비해) 상당한 수의 다른 부작용이 관찰되었다(Topp et al., Journal of Clinical Oncology 29 (2011), 2093 - 2098). 이러한 부작용도 T 세포 개입에 기인하고 림프구감소증, 혈액 화학 변화 및 신경학적 증상도 포함한다.
이중특이적 항체의 높은 부작용 프로파일로 인해, CRS 부작용의 경우 긴 반감기가 바람직하지 않기 때문에 긴 반감기를 갖는 항체 포맷을 사용할 수 없다.
따라서, 본 발명의 기술적 과제는 악성 질환, 예컨대, 상피, 내피 또는 중피 유래의 암, 및 T 세포 매개 면역 반응의 유도에 의한 혈액 암의 치료를 위한 수단 및 방법의 제공이었다.
악성 질환, 예컨대, 상피, 내피 또는 중피 유래의 암, 및 T 세포 매개 면역 반응의 유도에 의한 혈액 암의 치료를 위한 전술된 수단 및 방법은 공지된 이중특이적 항체에 의거한 치료의 전술된 단점을 극복할 것이다.
상기 기술적 과제에 대한 해결은 특허청구범위에서 특징지어진 실시양태들의 제공에 의해 달성된다.
따라서, 본 발명은 CD8+ T 세포의 표면 내에서 및/또는 상에서 천연적으로 발생하지 않는 마커 단백질을 사용한 CD8+ T 세포의 형질도입, 및 이중특이적 항체 분자에 의한 종양으로의 그들의 표적화된 동원에 관한 것이다(도 7 및 21 참조). 본 발명의 내용에서, CD8+ T 세포의 형질도입은 본원에서 후술된 바와 같이 레트로바이러스 시스템에 의해 수행될 수 있다. 본 발명은 CD8+ T 세포 내에서 및/또는 상에서 천연적으로 발생하지 않는 CD8+ T 세포 상의 항원에 특이적으로 결합하는 제1 결합 도메인, 및 종양 세포의 표면 상에서 천연적으로 발생하는 종양 특이적 항원에 결합하는 제2 결합 도메인을 포함하는 이중특이적 항체 분자에 관한 것으로서, 이때 상기 CD8+ T 세포는 CD8+ T 세포 내에서 및/또는 상에서 천연적으로 발생하지 않는 항원으로 형질도입되어 있다. 본 발명의 내용에서, CD8+ T 세포 내에서 및/또는 상에서 천연적으로 발생하지 않는 CD8+ T 세포 상의 항원에 특이적으로 결합하는 제1 결합 도메인, 및 종양 세포의 표면 상에서 천연적으로 발생하는 종양 특이적 항원에 결합하는 제2 결합 도메인을 포함하는 이중특이적 항체 분자는 (단일클론) 항체 분자이다. 첨부된 실시예에 나타낸 바와 같이, 본 발명의 개념의 증거로서, 제1 결합 도메인이 (T 세포(CD8+ T 세포) 내에서 또는 상에서 천연적으로 발생하지 않는 항원을 대표하는) (인간) EGFR과 상호작용/결합하고 제2 결합 도메인이 (종양 세포의 표면 상에서 천연적으로 발생하는 종양 특이적 항원을 대표하는) EpCAM에 상호작용/결합하는 이중특이적 항체가 구축되었다. 이 이중특이적 항체와, del-(인간) hEGFR 단백질을 발현하는 형질도입된 종양 특이적 T 세포(CD8+ T 세포)의 병용에 의한 종양의 치료는 대조군 실험에 비해 마우스의 생존을 상당히 연장시킨다(도 12 및 14 참조). 따라서, 놀랍게도 T 세포 내에서 및/또는 상에서 천연적으로 발생하지 않는 항원으로 ((개념의 증거로서) 첨부된 실시예에서와 같이 서열번호 12에 나타낸 del-(인간) hEGFR 단백질 서열(서열번호 11에 나타낸 cDNA 서열에 의해 코딩됨)에 의해) 형질도입된 T 세포(CD8+ T 세포)가, 제1 결합 도메인(인간) hEGFR)을 통해 T 세포(CD8+ T 세포) 내에서 및/또는 상에서 천연적으로 발생하지 않지만 상기 T 세포(CD8+ T 세포) 내로 도입되어 있는 항원에 결합하고 제2 결합 도메인을 통해 종양 세포의 표면 상에서 천연적으로 발생하는 종양 특이적 항원(EpCAM)에 결합하는 이중특이적 항체 분자의 사용에 의해 특이적으로 동원될 수 있다는 것을 발견하였다.
도 1: 인간 EGFR에 대한 특이성뿐만 아니라 뮤린 EpCAM에 대한 특이성도 포함하는 대표적인 이중특이적 항체(MAb225_scFv_G8.8)
뮤린 IgG2a 골격을 갖는 MAb225는 중쇄의 C-말단에서 단일 쇄(sc) Fv 단편의 융합을 갖는다.
도 2: 인간 EGFR 특이적 항체 MAb225의 대표적인 SEC 및 SDS-PAGE 사진
단백질 A-정제된 항체를 크기 배제 크로마토그래피로 분석하였다. (A) 하이로드(HiLoad) 수퍼덱스 200 컬럼으로부터의 용출 프로파일. 피크 분획을 모으고 단백질 순도를 SDS-PAGE로 평가하였다. (B) 이중특이적 항체의 비-환원(NR) 및 환원(R) SDS-PAGE.
도 3: 마우스 EpCAM 특이적 항체 G8.8의 대표적인 SEC 및 SDS-PAGE 사진
단백질 A-정제된 항체를 크기 배제 크로마토그래피로 분석하였다. (A) 하이로드 수퍼덱스 200 컬럼으로부터의 용출 프로파일. 피크 분획을 모으고 단백질 순도를 SDS-PAGE로 평가하였다. (B) 이중특이적 항체의 비-환원(NR) 및 환원(R) SDS-PAGE.
도 4: 이중특이적 항체 MAb225_scFv G8.8의 대표적인 SEC 및 SDS-PAGE 사진
(A) 하이로드 수퍼덱스 200 컬럼으로부터의 용출 프로파일. 표시된 숫자는 이중특이적 항체 분획(1) 및 응집체 분획(2)을 지칭한다. 피크 분획(1)을 모으고 단백질 순도를 SDS-PAGE로 평가하였다. (B) 이중특이적 항체의 비-환원(NR) 및 환원(R) SDS-PAGE.
도 5: 뮤린 EpCAM ECD의 친화성 크로마토그래피 및 SDS-PAGE
C-말단 히스티딘 에피토프 태그를 갖는 뮤린 EpCAM을 함유하는 세포 배양 상청액을 Ni-킬레이트 크로마토그래피로 정제하였다. (A) 히스트랩(HisTrap) FF 컬럼으로부터의 용출 프로파일. (B) 환원 조건 하에서의 투석된 단백질의 SDS-PAGE 분석. 겔을 쿠마시 브릴리언트 블루(Coomassie Brilliant Blue) 염료로 염색하였다.
도 6: 재조합 뮤린 EpCAM ECD와 EpCAM 특이적 항체의 상호작용
재조합 뮤린 EpCAM은 G8.8 또는 이중특이적 항체 MAb225_scFv_G8.8과 상호작용한다. (A) 재조합 EpCAM을 G8.8로 면역침전시켰다. 별표시는 EpCAM을 표시한다. (B) 재조합 EpCAM을 MAb225_scFv_G8.8로 면역침전시켰다. 별표시는 EpCAM을 표시한다.
도 7: 이중특이적 항체를 통해 종양 특이적 T 세포를 종양으로 동원하는 신규 치료 원리의 개략적인 개요
T 세포(여기서, 형질전환 뮤린 TCR-I T 세포; TCR tg T 세포)는 큰 T 항원(TCR T 특이적)의 면역우성 에피토프 1에 대한 T 세포 수용체를 보유한다. 이들 T 세포들을 마커 항원(del-hEGFR; 서열번호 11 및 12)으로 더 형질도입한다. 표적화된 종양 세포는 주조직적합성 복합체(MHC) 및 종양 항원(EpCAM)과 함께 제시되는 큰 T 항원을 천연적으로 발현한다. 한 아암(arm) 상에서 del-hEGFR에 대한 항원 결합 부위를 갖고 다른 아암 상에서 (뮤린) EpCAM에 대한 항원 결합 부위를 갖는 이중특이적 항체(MAb225_scFv_G8.8)는 상기 두 종류의 세포들을 회합시킨다. 종양 펩티드 특이적 TCR, 종양 펩티드 및 MHC는 "면역학적 시냅스"를 형성한다.
도 8: del-hEGFR을 사용한 일차 T 세포의 형질도입 효율
레트로바이러스를 통해 일차 뮤린 T 세포를 del-hEGFR(서열번호 11 및 12)로 형질도입하였다. 유세포측정 분석은 비형질도입된 T 세포(밝은 곡선)에 비해 del-hEGFR을 사용한 효율적인 형질도입(어두운 곡선)을 보여주었다.
도 9: 이중특이적 항체를 통한 형질도입된 T 세포와 종양 세포의 가교연결
EpCAM 발현 4T1 세포를 접종하고 전면생장 상태까지 생장시켰다. Del-hEGFR-형질도입된 B3Z T 세포(영구적인 세포주, 형광 표지됨)를 이중특이적 항체(MAb225_scFv_G8.8)로 예비적재한 후, 플레이트에서 부착 4T1과 함께 항온처리하였다. 철저한 세척 후, 남은 세포를 용해시키고 남은 형광을 측정하였다. EpCAM 및 hEFGR에 대한 이중특이적 항체 또는 단일특이적 항체(대조군으로서 항-EpCAM 및 항-hEGFR)를 첨가하였다. 상기 이중특이적 항체는 플라스크 내에서 임의의 대조군보다 유의하게 더 많은 형질도입된 세포를 보유하였다. **는 모든 비교에 대해 p<0.01을 표시한다.
도 10: 종양 세포의 이중특이적 항체-재표적화된 T 세포 매개 용해
종양 특이적 T 세포(TCR-I, 큰 T 항원의 면역우성 에피토프를 인식하는 T 세포 수용체에 대한 형질전환 T 세포)를 del-hEGFR(서열번호 11 및 12)로 형질도입하고 이중특이적 항체(MAb225_scFv_G8.8(서열번호 5 및 6))와 함께 예비항온처리하였다. EpCAM 및 큰 T 항원을 발현하는 mGC8 종양 세포(영구적인 세포주) 또는 둘다를 발현하지 않는 B16 종양 세포를 (칼세인으로) 형광 표지하였다. 세포들을 표시된 종양-대-T 세포 비(T:E)에서 함께 밤새 배양하고, 방출된 형광을 측정함으로써 세포의 용해를 정량하였다. 표적-대-이펙터 비 의존적 용해는 mGC8 세포에서 유도되었으나, B16 세포에서는 유도되지 않았다.
도 11: 이중특이적 항체와 형질도입된 종양 특이적 T 세포의 병용에 의한 확립된 종양의 치료
마우스를 피하 종양(mGC8 세포주)으로 챌린지하였다. 마우스를 표시된 시점에서 PBS; 항-EpCAM 단일특이적 항체(EpCAM G8.8(서열번호 3 및 4)) 단독; 항-EpCAM 단일특이적 항체(EpCAM G8.8(서열번호 3 및 4)) 및 항-EGFR 단일특이적 항체(EGFR MAb225(서열번호 1 및 2))와 함께 형질도입된 T 세포(CD8+ T 세포); 또는 이중특이적 항체(MAb225_scFv_G8.8; EpCAM 및 EGFR(서열번호 5 및 6)에 대한 특이성을 나타냄)와 함께 형질도입된 T 세포(CD8+ T 세포)로 치료하였다(세포 투여의 경우 정맥내; 항체 투여의 경우 정맥내 및 복강내). 이 병용 치료는 임의의 다른 치료군에 비해 종양 성장의 유의한 감소 및 지연을 유도하였다. 종양 부피의 차이는 1군 대 4군의 경우 31일째 날부터, 2군 대 4군의 경우 40일째 날부터, 그리고 3군 대 4군의 경우 50일째 날부터 유의하였다(모든 비교에 대해 p<0.001).
도 12: 이중특이적 항체와 종양 특이적 형질도입된 T 세포를 병용한 확립된 종양의 치료는 생존을 유의하게 연장시킨다.
마우스 치료군들의 생존 곡선은 도 11에 제시되어 있다. 이 연구의 종결 시점은 72일째 날로 예정되었다. 상기 병용 치료는 모든 3개의 대조군 치료들에 비해 마우스의 생존을 유의하게 연장시켰다. 생존의 차이는 1군 대 4군, 2군 대 4군, 및 3군 대 4군의 경우 유의하다.
도 13: 이중특이적 항체와 형질도입된 종양 특이적 T 세포의 병용에 의한 확립된 종양의 치료(확인 연구)
마우스를 도 11의 연구에서와 같이 피하 종양(mGC8)으로 챌린지하였다. 마우스를 표시된 시점에서 두 상이한 농도에서 PBS; 항-EpCAM 단일특이적 항체 단독(EpCAM G8.8(서열번호 3 및 4)); 이중특이적 항체(MAb225_scFv_G8.8; EpCAM 및 EGFR(서열번호 5 및 6)에 대한 특이성을 나타냄); 항-EpCAM 단일특이적 항체(EpCAM G8.8(서열번호 3 및 4)) + 항-EGFR 단일특이적 항체(MAb225(서열번호 1 및 2))와 함께 형질도입된 T 세포(CD8+ T 세포); 또는 이중특이적 항체(MAb225 scFv_ G8.8; EpCAM 및 EGFR(서열번호 5 및 6)에 대한 특이성을 나타냄)와 함께 형질도입된 T 세포(CD8+ T 세포)로 치료하였다. 이 병용 치료는 임의의 다른 치료군에 비해 종양 성장의 유의한 감소 및 지연을 유도하였다. 종양 부피의 차이는 1군 대 5군의 경우 36일째 날부터, 2군 대 5군의 경우 47일째 날부터, 3군 대 5군의 경우 54일째 날부터, 그리고 4군 대 5군의 경우 63일째 날부터 유의하였다(모든 비교에 대해 p<0.001).
도 14: 이중특이적 항체와 종양 특이적 형질도입된 T 세포를 병용한 확립된 종양의 치료는 생존을 유의하게 연장시킨다(확인 연구).
마우스 치료군의 생존 곡선은 도 13에 제시되어 있다. 3마리의 종양 결여 마우스들로 구성된 추가군은 상기 병용 치료(독성 대조군으로서, "7-종양 부재"로 표지됨)를 제공받았다. 상기 병용 치료는 임의의 대조군 치료에 비해 마우스의 생존을 유의하게 연장시켰다. 생존의 차이는 1군 대 5군, 2군 대 5군, 3군 대 5군 및 4군 대 5군의 경우 유의하였다.
도 15: 뮤린 EpCAM His-Avitag 단백질 서열
서열번호 9에 나타낸 카피 DNA(cDNA)에 의해 코딩된, C-말단 에피토프 태그(His-Avi)를 갖는 EpCAM 엑토도메인의 단백질 서열(서열번호 10에 상응함).
도 16: 뮤린 EpCAM cDNA 서열
C-말단 에피토프 태그(His-Avi)를 갖는 EpCAM 엑토도메인의 카피 DNA(cDNA) 서열(서열번호 7).
도 17: EpCAM ECD의 벡터 맵
EpCAM 엑토도메인(ECD)을 함유하는 진핵 발현 벡터의 개략적인 플라스미드 맵.
도 18: 경쇄 MAb225의 벡터 맵
MAb225의 경쇄(서열번호 1)를 함유하는 진핵 발현 벡터의 개략적인 플라스미드 맵.
도 19: G8.8 scFv 융합을 갖는 중쇄 MAb225의 벡터 맵
C-말단 G8.8 scFv 융합(서열번호 6)을 갖는 MAb225의 중쇄를 함유하는 진핵 발현 벡터의 개략적인 플라스미드 맵.
도 20: 이중특이적 항체 BsAb EpCAM-EGFRvIII, MR1.1의 대표적인 SEC 및 SDS-PAGE 사진
(A) (인간) EGFRvIII 및 (뮤린) EpCAM을 표적화하는 이중특이적 항체, 즉 BsAb EpCAM-EGFRvIII, MR1.1의 분석 크기 배제 크로마토그래피. (B) 상기 이중특이적 항체 BsAb EpCAM-EGFRvIII, MR1.1의 비-환원(NR) 및 환원(R) SDS-PAGE 분석. 쿠마시 블루로 염색하였다.
도 21: 이중특이적 항체 BsAb EpCAM-EGFRvIII, MR1.1을 통해 종양 특이적 T 세포를 종양으로 동원하는 신규 치료 원리의 개략적인 개요
이중특이적 항체를 통해 종양 특이적 T 세포를 종양으로 동원하는 신규 치료 원리의 개략적인 개요: T 세포(여기서, 형질전환 뮤린 OT-I T 세포)는 오브알부민(OVA)에 대해 특이적인 T 세포 수용체를 보유한다. 이들 T 세포들은 마커 항원(del-hEGFRvIII; 서열번호 17 및 18)으로 더 형질도입한다. 표적화된 종양 세포(예를 들면, 오브알부민(OVA)을 발현하는 흑색종 B16 세포)는 주조직적합성 복합체(MHC) 및 종양 항원(EpCAM)과 함께 제시되는 큰 T 항원을 천연적으로 발현한다. 표적 종양 세포 상의 MHC는 이 예에서 OVA의 SIINFEKL 펩티드 단편을 제시한다. 한 아암 상에서 del-hEGFRvIII(서열번호 17 및 18)에 대한 항원 결합 부위를 갖고 다른 아암 상에서 (뮤린) EpCAM에 대한 항원 결합 부위를 갖는 이중특이적 항체(BsAb EpCAM-EGFRvIII, MR1.1)는 상기 두 종류의 세포를 회합시킨다. 종양 펩티드 특이적 TCR, 종양 펩티드 및 MHC는 "면역학적 시냅스"를 형성한다.
도 22: 이중특이적 항체를 통한 형질도입된 T 세포와 종양 세포의 가교연결
EpCAM 발현 B16 흑색종 세포(GFP로 표지됨)를 접종하고 전면생장 상태까지 생장시켰다. Del-hEGFRvIII-형질도입된 B3Z T 세포(영구적인 세포주)를 이중특이적 항체(BiAb)(BsAb EpCAM-EGFRvIII, MR1.1)로 예비적재한 후, 플레이트에서 부착 B16과 함께 항온처리하였다(컬럼 번호: 5). 철저한 세척 후(컬럼 번호 1 내지 4), 남은 세포를 트립신으로 처리하고, 형광 세포 및 비-형광 세포를 측정하였다. 이중특이적 항체(BsAb EpCAM-EGFRvIII, MR1.1)(컬럼 번호 1)는 세척을 수행하였을 때 플라스크에서 임의의 대조군(컬럼 번호 2 내지 4)보다 더 많은 형질도입된 세포를 보유하였다.
도 23: 이중특이적 항체 BsAb EpCAM-EGFRvIII, MR1.1의 아미노산 서열
(A) 서열번호 15로 지칭되는 (리더 서열을 갖지 않는) 이중특이적 항체 BsAb EpCAM-EGFRvIII, MR1.1의 경쇄의 아미노산 서열. (B) 서열번호 16으로 지칭되는 (리더 서열을 갖지 않는) 이중특이적 생성물 BsAb EpCAM-EGFRvIII, MR1.1의 중쇄의 아미노산 서열.
도 24: del-hEGFRvIII의 서열
(A) 도 17에 나타낸 (도 24(B)의 단백질 서열을 코딩하는) del-hEGFRvIII의 DNA 서열. (B) 서열번호 18에 상응하는 del-hEGFRvIII의 단백질 서열.
이와 관련하여, 본원에서 사용된 용어 "이중특이적 결합 구축물"은 구체적으로 CD8+ T 세포 내에서 또는 상에서 천연적으로/내생적으로 발현되지 않는 항원에 결합할 수 있고 (종양 세포의 표면 상에서 천연적으로 발생하는(즉, 내생적으로 발현되는) 종양 특이적 항원에 결합하는 제2 결합 도메인을 통해) 표적 세포의 제거/용해를 유도할 수 있는 이중특이적 항체 분자를 지칭한다. 이중특이적 결합 구축물(이중특이적 항체 분자)(예를 들면, 항체, 항체 유도체 또는 항체 단편)을 통한 CD8+ T 세포 내에서 및/또는 상에서 천연적으로 발생하지 않는 항원의 결합은 종양 특이적 T 세포(CD8+ T 세포)를 종양 세포와 물리적으로 접촉시킨다(도 7 및 21 참조). 비형질도입된 또는 내생성 T 세포(CD8+ T 세포)는 이중특이적 결합 구축물(이중특이적 항체 분자)에 의해 영향을 받지 않은 상태로 남아 있다. 따라서, 본 발명의 이중특이적 항체 분자는 생체내에서 및/또는 시험관내에서 표적 세포를 용해시키는 능력을 갖는다. 상응하는 표적 세포는 본 발명의 이중특이적 항체 분자의 (Ig 유래의) 제2 결합 도메인에 의해 인식되는 표면 분자를 발현하는 세포를 포함한다. 이러한 표면 분자는 본원에서 하기에 특징지어져 있다.
표적 세포의 용해는 당분야에서 공지된 방법에 의해 검출될 수 있다. 따라서, 이러한 방법은 특히 생리학적 시험관내 분석을 포함한다. 이러한 생리학적 분석은 예를 들면, 세포 막 통합성의 손실(예를 들면, FACS에 근거한 프로피듐 요오다이드 분석, 트립판 블루 유입 분석, 광측정 효소 방출 분석(LDH), 방사성측정 51Cr 방출 분석, 형광측정 유로퓸 방출 및 칼세인AM 방출 분석)로 세포 사멸을 모니터링할 수 있다. 추가 분석은 예를 들면, 광측정 MTT, XTT, WST-1 및 알라마블루(alamarBlue) 분석, 방사성측정 3H-Thd 도입 분석, 세포 분열 활성을 측정하는 집락형성(clonogenic) 분석, 및 미토콘드리아 경막 구배를 측정하는 형광측정 로다민123 분석에 의한 세포 생존력의 모니터링을 포함한다. 추가로, 세포자멸은 예를 들면, FACS에 근거한 포스파티딜세린 노출 분석, ELISA에 근거한 TUNEL 시험, 캐스파제(caspase) 활성 분석(광측정, 형광측정 또는 ELISA에 근거함), 또는 변화된 세포 형태(수축, 막 기포형성)의 분석에 의해 모니터링될 수 있다.
본 발명의 내용에서 사용된 용어 "결합하는"은 2개 이상의 "항원 상호작용 부위들"이 서로 결합(상호작용)하는 것을 정의한다. 용어 "항원 상호작용 부위"는 본 발명에 따라 특정 항원 또는 특정 항원군과의 특이적 상호작용 능력을 보이는 폴리펩티드의 모티프를 정의한다. 상기 결합/상호작용은 "특이적 인식"을 정의하는 것으로도 이해된다. 용어 "특이적으로 인식하는"은 본 발명에 따라 항체 구축물이 본원에서 정의된 각각의 인간 표적 분자의 2개 이상의 아미노산들과 특이적으로 상호작용할 수 있고/있거나 결합할 수 있다는 것을 의미한다. 항체는 동일한 표적 분자 상의 상이한 에피토프를 인식할 수 있고/있거나, 이러한 에피토프와 상호작용할 수 있고/있거나 이러한 에피토프에 결합할 수 있다. 이 용어는 항체 분자의 특이성, 즉 본원에서 정의된 인간 표적 분자의 특정 영역들을 구별하는 그의 능력을 지칭한다. 항원 상호작용 부위와 그의 특이적 항원의 특이적 상호작용은 예를 들면, 항원의 입체구조의 변화, 항원의 올리고머화 등의 유도로 인해 신호의 개시를 야기할 수 있다. 따라서, 항원 상호작용 부위의 아미노산 서열 내의 특정 모티프와 항원은 그들의 1차, 2차 또는 3차 구조의 결과로서뿐만 아니라 상기 구조의 2차 변경의 결과로서 서로 결합한다.
본 발명에 따라 사용된 용어 "특이적 상호작용"은 본 발명의 이중특이적 결합 구축물(이중특이적 항체 분자)이 유사한 구조의 (폴리)펩티드와 교차반응하지 않거나 본질적으로 교차반응하지 않는다는 것을 의미한다. 따라서, 본 발명의 이중특이적 구축물은 CD8+ T 세포 내에서 및/또는 상에서 천연적으로 발생하지 않는 종양 마커, 세포 표면 마커 또는 항원과 특이적으로 결합/상호작용하고, 그의 (Ig 유래의) 제2 도메인으로 인해 종양 세포의 표면 상에서 천연적으로 발생하는 특이적 선택된 다른 화합물, 항원, 세포 표면 마커, 종양 마커 등과 상호작용할 수 있다. 상기 Ig 유래의 제1 및 제2 도메인의 유도에 사용되는 이러한 분자의 구체적인 예는 본원에서 하기 제시되어 있다.
연구되는 구축물 패널의 교차반응성은 예를 들면, 통상적인 조건(예를 들면, 문헌(Harlow and Lane, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, (1988)) 및 문헌(Using Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, (1999)) 참조) 하에서 이중특이적 항체 구축물의 상기 패널과 관심 있는 (폴리)펩티드의 결합뿐만 아니라 이중특이적 항체 구축물의 상기 패널과 다수의 거의 (구조적으로 및/또는 기능적으로) 밀접히 관련된 (폴리)펩티드의 결합도 평가함으로써 시험될 수 있다. 관심 있는 (폴리)펩티드/단백질에 결합하지만 상기 관심 있는 (폴리)펩티드와 동일한 조직, 예를 들면, 종양 조직의 세포에 의해 발현되는 임의의 다른 (폴리)펩티드에 본질적으로 결합하지 않는 구축물들(즉, 항체, (이중특이적) scFv 등)만이 관심 있는 (폴리)펩티드/단백질에 대한 특이성을 나타내는 것으로 간주되고 본원에서 제공된 방법들에 따라 추가 연구를 위해 선택된다. 이들 방법들은 특히 구조적으로 및/또는 기능적으로 밀접히 관련된 분자들을 사용한 결합 연구, 차단 및 경쟁 연구를 포함할 수 있다. 이들 결합 연구는 FACS 분석, 표면 플라스몬 공명(예를 들면, 비아코어(BIAcore)®를 사용한 SPR), 분석 한외원심분리, 등온 적정 열량측정, 형광 이방성, 형광 분광법 또는 방사성표지된 리간드 결합 분석도 포함한다. 나아가, 생리학적 분석, 예컨대, 세포독성 분석 및 상기 언급된 분석도 수행될 수 있다. 따라서, 항원 상호작용 부위와 특이적 항원의 특이적 상호작용에 대한 예는 그의 수용체에 대한 리간드의 특이성을 포함할 수 있다. 상기 정의는 특히 그의 특이적 수용체와의 결합 시 신호를 유도하는 리간드의 상호작용을 포함한다. 상응하는 리간드에 대한 예는 그의 특이적 사이토카인-수용체와 상호작용하는/결합하는 사이토카인을 포함한다. 특히, 항원 상호작용 부위와 항원, 예컨대, 셀렉틴 패밀리, 인테그린 및 성장인자 패밀리, 예컨대, EGF의 항원의 결합도 상기 정의에 포함된다. 마찬가지로 상기 정의에 특히 포함되는 상기 상호작용에 대한 또 다른 예는 항원성 결정인자(에피토프)와 항체의 항원 결합 부위의 상호작용이다.
용어 "결합하는"은 선형 에피토프와 관련되어 있을 뿐만 아니라, 인간 표적 분자의 2개 영역들 또는 그들의 부분들로 구성된 입체구조적 에피토프, 구조적 에피토프 또는 불연속 에피토프와도 관련되어 있을 수 있다. 본 발명의 내용에서, 입체구조적 에피토프는 1차 서열에서 분리되어 있으나 폴리펩티드가 천연 단백질로 폴딩될 때 분자의 표면 상에 함께 존재하게 되는 2개 이상의 구별되는 아미노산 서열들에 의해 정의된다(Sela, Science 166 (1969), 1365 and Laver, Cell 61 (1990), 553-536). 나아가, 용어 "결합하는"은 본 발명의 내용에서 용어 "상호작용하는"과 상호교환적으로 사용된다.
따라서, 특이성은 당분야에서 공지된 방법 및 본원에 기재된 방법에 의해 실험적으로 측정될 수 있다. 이러한 방법은 웨스턴 블롯, ELISA 시험, RIA 시험, ECL 시험, IRMA 시험 및 펩티드 스캔을 포함하나 이들로 한정되지 않는다.
용어 (Ig 유래의) "제1 결합 도메인"은 "면역글로불린 유래의 도메인", 특히 항체 또는 그의 단편, 단일 쇄 항체, 합성 항체, 항체 단편, 예컨대, Fab, F(ab2)', Fv 또는 scFv 단편 등, 또는 이들 중 임의의 분자의 화학적으로 변경된 유도체를 지칭한다. 이들 항체 분자들은 상이한 종으로부터 유래될 수 있거나 키메라 유래의 항체 분자일 수 있다. (첨부된 실시예에 예시된 바와 같이) 본 발명의 내용에서, 본 발명의 이중특이적 항체 분자에 포함된 상기 (Ig 유래의) 제1 도메인은 (Ig 유래의) 제2 "결합 도메인"과 융합되는 (단일클론) 항체일 수 있다.
용어 (Ig 유래의) "제2 결합 도메인"은 면역글로불린 유래의 도메인, 특히 항체 또는 그의 단편, 단일 쇄 항체, 합성 항체, 항체 단편, 예컨대, Fab, F(ab2)', Fv 또는 scFv 단편 등, 또는 이들 중 임의의 분자의 화학적으로 변경된 유도체를 지칭한다. 이들 항체 분자들은 상이한 종으로부터 유래될 수 있거나 키메라 유래의 항체 분자일 수 있다. (첨부된 실시예에 예시된 바와 같이) 본 발명의 내용에서, 본 발명의 이중특이적 항체 분자에 포함된 상기 (Ig 유래의) 제2 도메인은 scFv일 수 있다.
본 발명에 따른 이중특이적 항체 분자는 2개 이상의 상이한 부위에 대한 결합 특이성을 갖고 임의의 포맷일 수 있는 이중특이적 (단일클론) 항체이다. 매우 다양한 재조합 항체 포맷, 예를 들면, 2가, 3가 또는 4가 이중특이적 항체가 최근 과거에 개발되었다. 이의 예에는 IgG 항체 포맷과 단일 쇄 도메인의 융합체가 포함된다(상이한 포맷에 대해서는 예를 들면, 문헌(Coloma, M.J., et al., Nature Biotech 15 (1997), 159-163); 국제 특허출원 공개 제WO 2001/077342호; 문헌(Morrison, S.L., Nature Biotech 25 (2007), 1233-1234); 문헌(Holliger. P.. et. al, Nature Biotech. 23 (2005), 1126-1136); 문헌(Fischer, N., and Leger, O., Pathobiology 74 (2007), 3-14); 문헌(Shen, J., et. al, J. Immunol. Methods 318 (2007), 65-74); 및 문헌(Wu, C., et al., Nature Biotech. 25 (2007), 1290-1297) 참조). 본원에서 이중특이적 항체 또는 단편은 국제 특허출원 공개 제WO 2009/080251호, 제WO 2009/080252호, 제WO 2009/080253호, 제WO 2009/080254호, 제WO 2010/112193호, 제WO 2010/115589호, 제WO 2010/136172호, 제WO 2010/145792호, 제WO 2010/145793호 및 제WO 2011/117330호에 기재된 2가, 3가 또는 4가 이중특이적 항체도 포함한다.
본 발명의 "항체"는 2개 이상의 결합 도메인을 갖고 이중특이성을 나타낸다. 즉, 상기 항체는 2개 초과의 결합 도메인이 존재하는 경우(즉, 상기 항체가 3가 또는 다가 항체인 경우)조차도 이중특이성을 나타낼 수 있다. 본 발명의 이중특이적 항체는 예를 들면, 다가 단일 쇄 항체, 다이아바디 및 트라이아바디뿐만 아니라, 추가 항원 결합 도메인(예를 들면, 단일 쇄 Fv, VH 도메인 및/또는 VL 도메인, Fab 또는 (Fab)2)이 하나 이상의 펩티드 연결제를 통해 연결되어 있는 전장 항체의 불변 도메인 구조를 갖는 항체도 포함한다. 항체는 단일 종으로부터 유래된 전장 항체일 수 있거나, 키메라화될 수 있거나 인간화될 수 있다. 2개 초과의 항원 결합 도메인을 갖는 항체의 경우, 단백질이 2개의 상이한 항원들에 대한 결합 도메인을 갖는 한, 일부 결합 도메인들은 동일할 수 있다.
본원에서 사용된 용어 "가(valent)"는 특정된 수의 결합 도메인이 항체 분자에 존재한다는 것을 표시한다. 따라서, 용어 "2가", "4가" 및 "6가"는 각각 2개의 결합 도메인, 4개의 결합 도메인 및 6개의 결합 도메인이 항체 분자에 존재한다는 것을 표시한다. 본 발명에 따른 이중특이적 항체는 적어도 "2가" 항체이고, "3가" 또는 "다가"(예를 들면, "4가" 또는 "6가") 항체일 수 있다. 바람직하게는, 본 발명에 따른 이중특이적 항체는 2가, 3가 또는 4가 항체이다. 따라서, 본 발명의 내용에서, 상기 이중특이적 항체는 2가 항체이다. 본 발명의 내용에서, 상기 이중특이적 항체는 3가 항체이다. 본 발명의 내용에서, 상기 이중특이적 항체는 4가 항체이다.
상기 언급된 바와 같이(그리고 도 1에 예시된 바와 같이), 본 발명의 이중특이적 항체 분자는 가장 바람직하게는 scFv일 수 있는 (Ig 유래의) 제2 도메인을 포함한다. 따라서, 본 발명의 예시적 실시양태에서, 개념을 입증하기 위해, (제1 결합 도메인을 통해) (인간) EGFR에 대한 특이성을 갖고 추가 분자/화합물에 대해 유도된/이러한 추가 분자/화합물과 상호작용할 수 있는 제2 scFv에 의해 매개된 추가 특이성을 갖는 이중특이적 항체 분자가 제공된다. 이들 추가 분자/화합물은 세포 표면 분자, 종양 마커, 종양 항원 등을 포함할 수 있다. 이러한 추가 화합물/분자는 본원에서 하기 예시되어 있다.
따라서, 본 발명의 내용에서 이중특이적 결합 분자는 2개의 항체 유래의 결합 도메인을 포함하는 항체 분자를 지칭할 수 있는데, 이때 한 결합 도메인은 scFv일 수 있다. 상기 결합 도메인들 중 하나는 (본원에서 하기 정의된 바와 같이) CD8+ T 세포 내에서 및/또는 상에서 천연적으로 발생하지 않는 (인간) 표적 분자 1과 특이적으로 결합/상호작용할 수 있는 항체, 항체 단편 또는 이의 유도체의 가변 영역(또는 이의 부분)으로 구성된다. 제2 결합 도메인은 본원에서 하기 정의된 바와 같이 또 다른 (인간) 항원(표적 분자 2)과 특이적으로 결합/상호작용할 수 있는 항체, 항체 단편 또는 이의 유도체의 가변 영역(또는 이의 부분)으로 구성된다. 따라서, 본 발명에 따라, 상기 제2 결합 도메인은 종양 세포의 표면 상에서 천연적으로 발생하는 세포 표면 분자 또는 종양 세포의 표면 상에서 천연적으로 발생하는 종양 특이적 마커(항원)에 대한 특이성을 갖는 항원 상호작용 부위를 포함하는 상기 언급된 (Ig 유래의) 제2 도메인이다. 이중특이적 항체 분자에서 상기 2개의 도메인들/영역들은 바람직하게는 서로 공유연결되어 있다. 이 연결은 직접적으로 달성될 수 있거나([상기 정의된 바와 같이 CDR 영역 또는 CDR 영역 및 골격 영역을 포함하는, CD8+ T 세포 내에서 또는 상에서 천연적으로 발생하지 않는 (인간) 표적 분자 1에 대해 특이적인] 도메인 1 - [세포 표면 분자 및/또는 종양 특이적 마커에 대해 특이적인] 도메인 2 또는 [세포 표면 분자 및/또는 종양 특이적 마커에 대해 특이적인] 도메인 1 - [상기 정의된 바와 같이 CDR 영역 또는 CDR 영역 및 골격 영역을 포함하는, CD8+ T 세포 내에서 및/또는 상에서 천연적으로 발생하지 않는 (인간) 표적 분자 1에 대해 특이적인] 도메인 2) 또는 추가 폴리펩티드 연결제 서열을 통해(도메인 1 - 연결제 서열 - 도메인 2) 달성될 수 있다. 연결제가 사용되는 경우, 이 연결제는 본 발명의 내용에서 제1 도메인 및 제2 도메인 각각이 서로 독립적으로 그들의 상이한 결합 특이성을 보유할 수 있게 하기에 충분한 길이 및 서열을 갖는다. 본 발명의 내용에서, 추가 폴리펩티드 연결제 서열은 예를 들면, 항체의 Fc 부분 또는 하나 이상의 불변 도메인일 수 있는 항체 그 자체의 단편일 수도 있다.
본 발명의 내용에서, 결합 도메인 1은 항체 아암 1의 부분일 수도 있고, 결합 도메인 2는 항체 아암 2의 부분일 수도 있고(또는 그 반대의 경우도 성립할 수 있음), 이때 2개의 항체 아암들은 계면을 통해 연결된다. 항체 아암 1은 본원에서 하기 정의된 바와 같이 CD8+ T 세포 내에서 또는 상에서 천연적으로 발생하지 않는 (인간) 표적 분자 1과 특이적으로 결합/상호작용할 수 있는 항체, 항체 단편 또는 이의 유도체의 가변 영역(또는 이의 부분)으로 구성된다. 항체 아암 2는 종양 세포의 표면 상에서 천연적으로 발생하는 세포 표면 분자 또는 종양 세포의 표면 상에서 천연적으로 발생하는 종양 특이적 항원과 특이적으로 결합/상호작용할 수 있는 항체, 항체 단편 또는 이의 유도체의 가변 영역(또는 이의 부분)으로 구성된다. "계면"은 제2 항체 아암의 계면 내의 하나 이상의 "접촉" 아미노산 잔기(또는 다른 비-아미노산 기)와 상호작용하는 제1 항체 아암 내의 접촉 아미노산 잔기(또는 다른 비-아미노산 기, 예들 들면, 탄수화물 기)를 포함한다. 바람직한 계면은 면역글로불린의 도메인, 예컨대, 항체 중쇄의 불변 도메인(또는 이의 영역)이고, 이때 계면을 통한 결합/상호작용은 2개의 항체 아암들의 이종이량체화를 제공한다(예를 들면, 문헌(Ridgway, J.B., et al., Protein Eng. 9 (1996), 617-621); 국제 특허출원 공개 제WO 96/027011호; 문헌(Merchant, A.M., et al., Nature Biotech. 16 (1998), 677-681); 문헌(Atwell, S., et al., J. Mol. Biol. 270 (1997), 26-35); 유럽 특허출원 공개 제1 870 459 A1호; 국제 특허출원 공개 제WO 2007/147901호; 국제 특허출원 공개 제WO 2009/089004(Al)호 및 국제 특허출원 공개 제WO 2010/129304호 참조).
본 발명에 따라 사용될 항체, 항체 구축물, 이중특이적 항체 분자, 항체 단편, 항체 유도체(모두 Ig로부터 유래됨) 또는 이들의 상응하는 면역글로불린 쇄(들)는 당분야에서 공지된 통상적인 기법의 이용, 예를 들면, 단독으로 사용되거나 병용되는 아미노산 결실(들), 삽입(들), 치환(들), 추가(들) 및/또는 재조합(들), 및/또는 당분야에서 공지된 임의의 다른 변경(들)의 이용을 통해 더 변경될 수 있다. 면역글로불린 쇄의 아미노산 서열의 기초가 되는 DNA 서열에 이러한 변경을 도입하는 방법은 당업자에게 잘 공지되어 있다(예를 들면, 인용된 문헌(Sambrook (1989)) 참조). 용어 "Ig 유래의 도메인"은 특히 하나 이상의 CDR을 포함하는 (폴리)펩티드 구축물을 지칭한다. 언급된 Ig 유래의 도메인의 단편 또는 유도체는 상기 항체 분자의 부분이고/이거나 화학/생화학 또는 분자생물학 방법에 의해 변경되는 (폴리)펩티드를 정의한다. 상응하는 방법은 당분야에서 공지되어 있고, 특히 실험 매뉴얼들에 기재되어 있다(예를 들면, 문헌(Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2nd edition (1989) and 3rd edition (2001)); 문헌(Gerhardt et al., Methods for General and Molecular Bacteriology ASM Press (1994)); 문헌(Lefkovits, Immunology Methods Manual: The Comprehensive Sourcebook of Techniques; Academic Press (1997)); 및 문헌(Golemis, Protein-Protein Interactions: A Molecular Cloning Manual Cold Spring Harbor Laboratory Press (2002)) 참조).
본원에서 사용된 용어 "CDR"은 당분야에서 잘 공지된 "상보성 결정 영역"을 지칭한다. CDR은 상기 분자의 특이성을 결정하고 특이적 리간드와 접촉하는 면역글로불린의 부분이다. CDR은 분자의 가장 변화가능한 부분이고 이들 분자의 다양성에 기여한다. 각각의 V 도메인에는 3개의 CDR 영역들, 즉 CDR1, CDR2 및 CDR3이 존재한다. CDR-H는 가변 중쇄의 CDR 영역을 표시하고, CDR-L은 가변 경쇄의 CDR 영역을 표시한다. VH는 가변 중쇄를 의미하고, VL은 가변 경쇄를 의미한다. Ig 유래의 영역의 CDR 영역은 문헌(Kabat "Sequences of Proteins of Immunological Interest", 5th edit. NIH Publication no. 91-3242 U.S. Department of Health and Human Services (1991)), 문헌(Chothia J. Mol. Biol. 196 (1987), 901-917) 또는 문헌(Chothia Nature 342 (1989), 877-883)에 기재된 바와 같이 확인될 수 있다.
따라서, 본 발명의 내용에서, 본원에서 전술된 항체 분자, 예컨대, 이중특이적 항체는 전체 항체(면역글로불린, 예컨대, IgG1, IgG2, IgG2b, IgG3, IgG4, IgA, IgM, IgD 또는 IgE), F(ab) 단편, Fab'-SH 단편, Fv 단편, Fab' 단편, F(ab')2 단편, 키메라 항체, CDR-이식된 항체, 전체 인간 항체, 2가 항체 구축물, 항체-융합 단백질, 합성 항체, 2가 단일 쇄 항체, 3가 단일 쇄 항체 및 다가 단일 쇄 항체로 구성된 군으로부터 선택된다.
본원에서 사용된 용어 "전체 인간 항체"는 인간 면역글로불린 단백질 서열만을 포함하는 항체를 지칭한다. 전체 인간 항체는 마우스, 마우스 세포, 또는 마우스 세포로부터 유래된 하이브리도마에서 생성된 경우 뮤린 탄수화물 쇄를 함유할 수 있다. 유사하게, "마우스 항체" 또는 "뮤린 항체"는 마우스(뮤린) 면역글로불린 단백질 서열만을 포함하는 항체를 지칭한다. 대안적으로, "전체 인간 항체"는 래트, 래트 세포, 또는 래트 세포로부터 유래된 하이브리도마에서 생성된 경우 래트 탄수화물 쇄를 함유할 수 있다. 유사하게, 용어 "래트 항체"는 래트 면역글로불린 서열만을 포함하는 항체를 지칭한다. 전체 인간 항체는 예를 들면, 전체 인간 항체의 생성 및 스크리닝을 가능하게는 널리 이용되는 스크리닝 기술인 파지 디스플레이에 의해 생성될 수 있다. 파지 항체도 본 발명의 내용에서 사용될 수 있다. 파지 디스플레이 방법은 예를 들면, 미국 특허 제5,403,484호, 제5,969,108호 및 제5,885,793호에 기재되어 있다. 전체 인간 항체의 개발을 가능하게 하는 또 다른 기술은 마우스 하이브리도마 기술의 변경을 포함한다. 마우스는 그들 자신의 마우스 유전자 대신에 인간 면역글로불린 좌위를 함유하도록 형질전환된다(예를 들면, 미국 특허 제5,877,397호 참조).
본원에서 사용된 용어 "항체"는 키메라 항체도 포함한다. 용어 "키메라 항체"는 또 다른 인간 또는 비-인간 종(예를 들면, 마우스, 말, 토끼, 개, 소, 닭)으로부터 유래된 항체 영역(예를 들면, 불변 영역)과 융합되어 있거나 이러한 항체 영역으로 키메라화된, 인간 또는 비-인간 종의 가변 영역을 포함하는 항체를 지칭한다.
용어 "항체"는 재조합 인간 항체, 이종 항체 및 이종하이브리드 항체도 지칭한다. 용어 "재조합 인간 항체"는 재조합 수단에 의해 제조된, 발현된, 생성된 또는 단리된 모든 인간 서열 항체, 예컨대, 인간 면역글로불린 유전자에 대한 형질전환 동물(예를 들면, 마우스)로부터 단리된 항체; 숙주 세포 내로 형질감염된 재조합 발현 벡터를 사용함으로써 발현된 항체; 재조합 조합적 인간 항체 라이브러리로부터 단리된 항체; 또는 인간 면역글로불린 유전자 서열을 다른 DNA 서열로 스플라이싱하는 것을 포함하는 임의의 다른 수단에 의해 제조된, 발현된, 생성된 또는 단리된 항체를 포함한다. 이러한 재조합 인간 항체는 (존재하는 경우) 인간 생식세포주 면역글로불린 서열로부터 유래된 가변 영역 및 불변 영역을 갖는다. 그러나, 이러한 항체는 시험관내 돌연변이유발(또는 인간 Ig 서열에 대한 형질전환 동물이 이용되는 경우, 생체내 체세포 돌연변이유발)에 의해 돌연변이될 수 있으므로, 재조합 항체의 VH 영역 및 VL 영역의 아미노산 서열은 인간 생식세포주 VH 서열 및 VL 서열로부터 유래되고 이 서열들과 관련되어 있을지라도 생체내 인간 항체 생식세포주 레퍼토리 내에서 천연적으로 발생하지 않을 수 있는 서열이다.
"이종 항체"는 이러한 항체를 생성하는 형질전환 비-인간 유기체와 관련되어 정의된다. 이 용어는 형질전환 비-인간 동물로 구성되지 않고 일반적으로 형질전환 비-인간 동물의 종 이외의 종으로부터 유래된 유기체에서 발견되는 아미노산 서열 또는 코딩 핵산 서열에 상응하는 아미노산 서열 또는 코딩 핵산 서열을 갖는 항체를 지칭한다.
용어 "이종하이브리드 항체"는 상이한 유기체로부터 유래된 경쇄 및 중쇄를 갖는 항체를 지칭한다. 예를 들면, 뮤린 경쇄와 회합된 인간 중쇄를 갖는 항체는 이종하이브리드 항체이다. 이종하이브리드 항체의 예에는 키메라 항체 및 인간화된 항체가 포함된다.
용어 "항체"는 인간화된 항체도 지칭한다. 비-인간(예를 들면, 뮤린 또는 토끼) 항체의 "인간화된" 형태는 비-인간 면역글로불린으로부터 유래된 최소 서열을 함유하는 키메라 면역글로불린, 면역글로불린 쇄 또는 이들의 단편(예컨대, Fv, Fab, Fab', F(ab')2 또는 항체의 다른 항원 결합 하위서열)이다. 종종, 인간화된 항체는 수용자의 상보성 결정 영역(CDR)으로부터 유래된 잔기가 원하는 특이성, 친화성 및 성능을 갖는 비-인간 종(공여자 항체), 예컨대, 마우스, 토끼 또는 래트 항체의 CDR로부터 유래된 잔기로 치환되어 있는 인간 면역글로불린(수용자 항체)이다. 일부 경우, 인간 면역글로불린의 Fv 골격 잔기는 상응하는 비-인간 잔기로 치환된다. 나아가, 인간화된 항체는 수용자 항체 또는 이입된 CDR 또는 골격 서열에서 발견되지 않는 잔기를 포함할 수 있다. 이들 변경은 항체 성능을 더 다듬고 최적화하기 위해 만들어진다. 일반적으로, 인간화된 항체는 모든 또는 실질적으로 모든 CDR 영역들이 비-인간 면역글로불린의 CDR 영역에 상응하고 모든 또는 실질적으로 모든 FR 영역들이 인간 면역글로불린 컨센서스 서열의 FR 영역인 실질적으로 모든 하나 이상, 전형적으로 2개의 가변 도메인을 포함할 것이다. 인간화된 항체는 면역글로불린 불변 영역(Fc)의 적어도 부분, 전형적으로 인간 면역글로불린의 적어도 부분도 포함할 수 있다. 추가 세부사항에 대해서는 문헌(JonesNature 321 (1986), 522-525); 문헌(Reichmann Nature 332 (1998), 323-327) 및 문헌(Presta Curr Op Struct Biol 2 (1992), 593-596)을 참조한다.
항체를 인간화하는 보편적인 방법은 기능성 항원 결합 부위가 비-인간 "공여자" 항체로부터 인간 "수용자" 항체 상으로 이식되는 CDR 이식을 포함한다. CDR 이식 방법은 당분야에서 공지되어 있고, 예를 들면, 미국 특허 제5,225,539호, 제5,693,761호 및 제6,407,213호에 기재되어 있다. 또 다른 관련된 방법은 유전자 재배열 및 유전자 전환을 겪을 수 있는 하나 이상의 인간화된 면역글로불린 좌위를 함유하도록 유전적으로 조작되어 있는 형질전환 동물로부터의 인간화된 항체의 생성이다(예를 들면, 미국 특허 제7,129,084호 참조).
따라서, 본 발명의 내용에서, 용어 "항체"는 전체 면역글로불린 분자뿐만 아니라 이러한 면역글로불린 분자의 부분을 지칭한다. 나아가, 상기 용어는 상기 논의된 바와 같이 변경된 및/또는 변이된 항체 분자를 지칭한다. 또한, 상기 용어는 재조합적으로 또는 합성적으로 발생된/합성된 항체를 지칭한다. 또한, 상기 용어는 온전한 항체뿐만 아니라 이의 항체 단편, 예컨대, 분리된 경쇄 및 중쇄, Fab, Fab/c, Fv, Fab', F(ab')2도 지칭한다. 용어 "항체"는 이기능성 항체, 삼기능성 항체, 전체 인간 항체, 키메라 항체, 인간화된 항체 및 항체 구축물, 예컨대, 단일 쇄 Fv(scFv) 또는 항체-융합 단백질도 포함한다.
본 발명의 내용에서, "단일 쇄 Fv" 또는 "scFv" 항체 단편은 항체의 VH 도메인 및 VL 도메인을 갖고, 이때 이들 도메인들은 단일 폴리펩티드 쇄에 존재한다. 일반적으로, scFv 폴리펩티드는 VH 도메인과 VL 도메인 사이에 폴리펩티드 연결제를 추가로 포함하여 scFv가 항원 결합을 위해 요구되는 구조를 형성할 수 있게 한다. 단일 쇄 항체의 제조에 대해 기재된 기법들은 예를 들면, 문헌(Pluckthun in The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, Rosenburg and Moore eds. Springer-Verlag, N.Y. 113 (1994), 269-315)에 기재되어 있다.
본원에서 사용된 "Fab 단편"은 1개의 경쇄, 및 1개의 중쇄의 CH1 영역 및 가변 영역으로 구성된다. Fab 분자의 중쇄는 또 다른 중쇄 분자와 다이설파이드 결합을 형성할 수 없다.
"Fc" 영역은 항체의 CH2 도메인 및 CH3 도메인을 포함하는 2개의 중쇄 단편을 함유한다. 상기 2개의 중쇄 단편은 2개 이상의 다이설파이드 결합 및 CH3 도메인들의 소수성 상호작용에 의해 함께 존재한다.
"Fab' 단편"은 쇄간 다이설파이드 결합이 2개의 Fab' 단편들의 2개 중쇄들 사이에서 형성되어 F(ab')2 분자를 형성할 수 있도록 1개의 경쇄; 및 VH 도메인 및 CH1 도메인뿐만 아니라 CH1 도메인과 CH2 도메인 사이의 영역도 함유하는 1개의 중쇄의 부분을 함유한다.
"F(ab')2 단편"은 쇄간 다이설파이드 결합이 2개의 중쇄들 사이에서 형성되도록 2개의 경쇄; 및 CH1 도메인과 CH2 도메인 사이의 불변 영역의 부분을 함유하는 2개의 중쇄를 함유한다. 따라서, F(ab')2 단편은 2개의 중쇄들 사이의 다이설파이드 결합에 의해 함께 존재하는 2개의 Fab' 단편들로 구성된다.
"Fv 영역"은 중쇄 및 경쇄로부터 유래된 가변 영역을 포함하지만, 불변 영역을 결여한다.
본 발명의 이중특이적 항체 분자는 예를 들면, 재조합적으로 제조된 구축물의 단리 및/또는 제조를 위해 본원에서 정의된 (Ig 유래의) 제1 도메인 및 (Ig 유래의) 제2 도메인 이외에 추가 도메인(들)을 포함할 수 있다는 것을 인지한다.
본 발명에 따라 본 발명의 분자 또는 구축물(즉, 본원에 기재된 이중특이적 항체 분자)의 전술된 제1 도메인(CD8+ T 세포 내에서 및/또는 상에서 천연적으로 발생하지 않는 CD8+ T 세포 상의 (인간) 항원과 특이적으로 상호작용/결합함)도 변경될 수 있다는 것을 인지한다. (Ig 유래의) 제1 도메인, (Ig 유래의) 제2 도메인 및/또는 연결하는 연결제 영역(들)이 예를 들면, 인간화된 항체, CDR 이식된 항체 또는 전체 인간 항체를 위해 변경된다는 것도 예상된다.
"인간화 방법"은 당분야에서 잘 공지되어 있고, 특히 항체 분자, 예를 들면, Ig 유래의 분자에 대해 기재되어 있다. 용어 "인간화된"은 비-인간 항체로부터 유래된 서열의 부분을 함유하는 비-인간(예를 들면, 뮤린) 항체 또는 이의 단편(예컨대, Fv, Fab, Fab', F(ab'), scFv, 또는 항체의 다른 항원 결합 부분 서열)의 인간화된 형태를 지칭한다. 인간화된 항체는 인간 면역글로불린의 상보성 결정 영역(CDR)으로부터 유래된 잔기가 원하는 결합 특이성, 친화성 및 성능을 갖는 비-인간 종, 예컨대, 마우스, 래트 또는 토끼의 CDR로부터 유래된 잔기로 치환되어 있는 인간 면역글로불린을 포함한다. 일반적으로, 인간화된 항체는 모든 또는 실질적으로 모든 CDR 영역들이 비-인간 면역글로불린의 CDR 영역들에 상응하고 모든 또는 실질적으로 모든 FR 영역들이 인간 면역글로불린 컨센서스 서열의 FR 영역들인 실질적으로 모든 하나 이상, 일반적으로 2개의 가변 도메인을 포함할 것이다. 인간화된 항체는 최적으로 면역글로불린 불변 영역(Fc)의 적어도 부분, 전형적으로 인간 면역글로불린의 적어도 부분도 포함할 것이다(특히, 문헌(Jones et al., Nature 321 (1986), 522-525), 문헌(Presta, Curr. Op. Struct. Biol. 2 (1992), 593-596) 참조). 비-인간 항체를 인간화하는 방법은 당분야에서 잘 공지되어 있다. 일반적으로, 인간화된 항체는 비-인간인 공급원으로부터 유래된 하나 이상의 아미노산이 도입되어 있지만 항체의 원래의 결합 활성을 여전히 보유한다. 항체/항체 분자의 인간화 방법은 문헌(Jones et al., Nature 321 (1986), 522-525); 문헌(Reichmann et al., Nature 332 (1988), 323-327); 및 문헌(Verhoeyen et al., Science 239 (1988), 1534-1536)에 더 상세히 기재되어 있다. 인간화된 항체, 예를 들면, EpCAM에 대해 유도된 항체의 구체적인 예는 당분야에서 공지되어 있다(예를 들면, 문헌(LoBuglio, Proceedings of the American Society of Clinical Oncology Abstract (1997), 1562) 및 문헌(Khor, Proceedings of the American Society of Clinical Oncology Abstract (1997), 847) 참조).
따라서, 본 발명의 내용에서, 특히 인간화되어 있고 약학 조성물에서 성공적으로 사용될 수 있는 이중특이적 항체 분자가 제공된다. 본 발명의 내용에서, 본원에 기재된 (인간화된) 이중특이적 항체 분자는 본원에서 하기 정의된 바와 같이 키트에서 사용될 수 있다.
본 발명의 내용에서, 본원에 기재된 이중특이적 항체 분자의 (Ig 유래의) 제1 도메인은 CD8+ T 세포 내에서 및/또는 상에서 천연적으로 발생하지 않는 항원에 대한 특이성을 갖는 항원 상호작용 부위를 포함한다.
본원에서 사용된 용어 "CD8+ T 세포 내에서 및/또는 상에서 천연적으로 발생하지 않는 항원"은 CD8+ T 세포의 표면 내에서 및/또는 상에서 천연적으로 제시되지 않고 정상(비형질도입된) CD8+ T 세포 내에서 또는 상에서 (내생적으로) 발현되지 않는, CD8+ T 세포 내로 도입된 분자를 지칭한다. 따라서, CD8+ T 세포 내에서 및/또는 상에서 천연적으로 발생하지 않는 항원/마커는 CD8+ T 세포 내로 인위적으로 도입된다. 본 발명의 내용에서, 상기 CD8+ T 세포는 본원에서 정의된 치료되는 대상체로부터 단리/수득된다. 본 발명의 내용에서, CD8+ T 세포의 T 세포 수용체 상에서 천연적으로 발생하는/내생적으로 발현되는 항원 펩티드는 상기 언급된 용어 "CD8+ T 세포 상에서 천연적으로 발생하지 않는 항원"으로부터 배제된다. 따라서, 상기 CD8+ T 세포의 표면 내에 및/또는 상에 인위적으로 도입된 후 제시되는 이들 분자들은 CD8+ T 세포 내에서 및/또는 상에서 천연적으로 발생하지 않는, (시험관내에서 또는 생체내에서) (Ig 유래의) 결합 도메인, 바람직하게는 항체, 항체 단편 또는 유도체에 접근가능한 도메인 또는 에피토프를 포함한다. 본 발명의 내용에서, 이들 인위적으로 도입된 분자는 본원에서 후술된 (레트로바이러스) 형질도입 후 상기 CD8+ T 세포의 표면 내에 및/또는 상에 제시된다.
본 발명의 내용에서, 용어 "CD8+ T 세포 내에서 및/또는 상에서 천연적으로 발생하지 않는 항원"은 CD8+ T 세포 당 500개, 550개, 600개, 650개, 700개, 750개, 800개, 850개, 900개, 950개 또는 1000개 초과의 항원 분자 수준으로 CD8+ T 세포 내에서 및/또는 상에서 천연적으로 발생하지 않는/내생적으로 발현되지 않는 항원/마커를 지칭한다. 따라서, 항원/마커는 정상(비형질도입된) CD8+ T 세포 집단의 1.0, 1.1, 1.2, 1.3, 1.4, 1.5, 1.6, 1.7, 1.8, 1.9 또는 2.0 0/00(프로마일) 초과의 수준으로 CD8+ T 세포 내에서 및/또는 상에서 발생하지 않는다(내생적으로 발현되지 않는다). CD8+ T 세포 내에서 및/또는 상에서 천연적으로 발생하는 항원/마커의 존재 및 양은 당분야에서 공지된 방법, 예컨대, FACS 분석, ELISA, 공초점 현미경관찰, 분석 HPLC 등에 의해 모니터링될 수 있다.
이들 분자들에 대한 예에는 바람직하게는 인간 유래의 비-면역원성 단백질이 포함된다. 대안적으로, 상기 분자들은 그 자체가 기능적 불활성 단백질 분자일 수 있거나 당분야에서 공지된 유전자 재조합 기법에 의해 기능적으로 불활성을 띠게 될 것이다(그 예는 (본원에 기재된 del-hEGFR 구축물(서열번호 11 및 12)을 지칭하는, 세포내 신호전달 도메인을 갖지 않는 (인간) EGFR에 의해 첨부된 실시예에 예시된) 세포내 신호전달 도메인의 결실 또는 세포외 도메인의 불활성화 점 돌연변이에 의해 기능적으로 불활성을 띠게 된 단백질 분자일 것이다). 돌연변이된 (인간) EGFR 버전의 또 다른 예는 첨부된 실시예에서 사용된 del-hGFRvIII 구축물(DNA로서 서열번호 17, 및 (코딩된) 아미노산 서열로서 서열번호 18)이다. hEGFRvIII은 신경아교모세포종, 및 유방, 난소 및 폐의 암종에서 발견되는 인간 표피 성장인자 수용체의 돌연변이체이다. 상기 돌연변이체 수용체는 그의 세포외 도메인 내에 결실을 갖는다(Lorimer et al., Proc. Natl. Acad. Sci USA 93: 14815-14820 (1996)).
이들 상기 언급된 기준을 충족시키는 마커의 예는 본원에서 하기에 제공되어 있고, cripto(크립틱 패밀리 단백질), CD(분화의 클러스터) 패밀리(비-T 세포)의 구성원, EGFR 또는 TSH-R을 포함하나 이들로 한정되지 않는다.
본 발명의 내용에서, 본원에 기재된 이중특이적 항체 분자(들)는 cripto(크립틱 패밀리 단백질), CD(분화의 클러스터) 패밀리(비-T 세포)의 구성원, EGFR 및 TSH-R로 구성된 군으로부터 선택된, CD8+ T 세포 내에서 및/또는 상에서 천연적으로 발생하지 않는 항원에 결합한다. 따라서, 본원에 기재된 이중특이적 항체 분자(들)는 (용어 "비-T 세포"에 의해 다루어지는 바와 같이) T 세포(CD8+ T 세포) 내에서 및/또는 상에서 (배타적으로) 천연적으로 발생하지 않는 CD 패밀리의 구성원, cripto, EGFR 또는 TSH-R과 상호작용/결합한다. 본 발명의 내용에서, 본원에 기재된 이중특이적 항체 분자(들)는 (용어 "비-T 세포"에 의해 다루어지는 바와 같이) T 세포(CD8+ T 세포)의 표면 내에서 및/또는 상에서 내생적으로 발현되지 않는 CD 패밀리의 구성원, cripto, EGFR 또는 TSH-R과 상호작용/결합한다.
cripto(크립틱 패밀리 단백질)의 (인간) 구성원, CD(분화의 클러스터) 패밀리(비-T 세포)의 구성원, EGFR 또는 TSH-R의 서열(들)은 UniProtKB/Swiss-Prot 데이터베이스에서 입수될 수 있고 웹사이트(http://www.uniprot.org/uniprot/? query=reviewed%3Ayes)로부터 검색될 수 있다. 이들 (단백질) 서열들은 해석된 변경된 서열들과도 관련되어 있다. 본 발명은 본원에서 제공된 간결한 서열의 상동성 서열 및 유전적 대립형질 변이체 등이 사용되는 기법 및 방법도 제공한다. 바람직하게는, 본원의 간결한 서열의 이러한 "변이체" 등이 사용된다. 바람직하게는, 이러한 "변이체"는 유전적 변이체이다. 당업자는 게놈 DNA뿐만 아니라 mRNA/cDNA의 엔트리(entry)도 포함할 수 있는 이들 데이터뱅크 엔트리에서 이들 (단백질) 서열의 관련 코딩 영역을 용이하게 유추할 수 있다.
"CD8+ T 세포 내에서 및/또는 상에서 천연적으로 발생하지 않는/내생적으로 발현되지 않는 항원"과 관련하여 본원에서 사용된 용어 "CD(분화의 클러스터) 패밀리(비-T 세포)는 하기 CD 서열들로 구성된 군으로부터 선택된 CD 서열들 중 어느 하나를 지칭한다: CD9, CD10, CD11, CD12, CD13, CD14, CD15, CD16, CD17, CD18, CD19, CD20, CD21, CD22, CD23, CD24, CD25, CD26, CD27, CD28, CD29, CD30, CD31, CD32, CD33, CD34, CD35, CD36, CD37, CD38, CD39, CD40, CD41, CD43, CD46, CD48, CD49, CD50, CD51, CD54, CD55, CD56, CD57, CD59, CD61, CD63, CD64, CD66, CD67, CD68, CD70, CD72, CD74, CD75, CD76, CD77, CD79, CD81, CD82, CD83, CD84, CD87, CD88, CD89, CD90, CD91, CD92, CD93, CD94, CD95, CD97, CD98, CD99, CD100, CD101, CD102, CD103, CD104, CD105, CD106, CD107, CD108, CD109, CD110, CD111, CD112, CD113, CD114, CD115, CD116, CD117, CD118, CD119, CD121, CD123, CD124, CD125, CD126, CD130, CD131, CD133, CD134, CD135, CD136, CD137, CD138, CD140, CD141, CD142, CD143, CD144, CD146, CD147, CD148, CD151, CD153, CD155, CD156, CD157, CD158, CD159, CD160, CD161, CD162, CD163, CD164, CD166, CD167, CD168, CD169, CD170, CD171, CD172, CD177, CD178, CD179, CD180, CD181, CD182, CD183, CD184, CD185, CD186, CD191, CD192, CD193, CD200, CD201, CD204, CD206, CD207, CD208, CD209, CD217, CD218, CD220, CD221, CD222, CD223, CD224, CD225, CD226, CD227, CD228, CD230, CD231, CD232, CD233, CD234, CD236, CD238, CD239, CD241, CD242, CD243, CD244, CD246, CD248, CD249, CD252, CD253, CD254, CD256, CD257, CD258, CD261, CD262, CD263, CD264, CD265, CD266, CD267, CD268, CD269, CD270, CD271, CD276, CD277, CD280, CD281, CD282, CD283, CD284, CD286, CD288, CD289, CD290, CD292, CD294, CD295, CD296, CD297, CD298, CD299, CD300, CD301, CD302, CD303, CD304, CD305, CD306, CD309, CD312, CD314, CD315, CD316, CD317, CD318, CD319, CD320, CD321, CD322, CD324, CD325, CD326, CD327, CD328, CD329, CD331, CD332, CD333, CD334, CD335, CD336, CD337, CD338, CD339, CD340, CD344, CD349, CD350, CD351, CD352, CD353, CD354, CD355, CD357, CD358, CD360, CD361, CD362 및 CD363.
(인간) CD9(CD9 항원)의 서열(들)은 Swiss-Prot 데이터베이스 엔트리 P21926(엔트리 버전 123, 서열 버전 4)으로부터 입수될 수 있고; (인간) CD10(네프릴라이신(Neprilysin))의 서열(들)은 Swiss-Prot 데이터베이스 엔트리 P08473(엔트리 버전 151, 서열 버전 2)으로부터 입수될 수 있고; (인간) CD11(인테그린 알파-D)의 서열(들)은 Swiss-Prot 데이터베이스 엔트리 Q13349(엔트리 버전 110, 서열 버전 2)로부터 입수될 수 있고; (인간) CD13(아미노펩티다제 N)의 서열(들)은 Swiss-Prot 데이터베이스 엔트리 P15144(엔트리 버전 145, 서열 버전 4)로부터 입수될 수 있고; (인간) CD14(단핵구 분화 항원 CD14)의 서열(들)은 Swiss-Prot 데이터베이스 엔트리 P08571(엔트리 버전 131, 서열 버전 2)로부터 입수될 수 있고; (인간) CD16(Fc-감마 수용체 IIIb)의 서열(들)은 Swiss-Prot 데이터베이스 엔트리 Q9ULV2(엔트리 버전 51, 서열 버전 1)로부터 입수될 수 있고; (인간) CD18(인테그린 베타-2)의 서열(들)은 Swiss-Prot 데이터베이스 엔트리 P05107(엔트리 버전 162, 서열 버전 2)로부터 입수될 수 있고; (인간) CD19(B 림프구 항원 CD19)의 서열(들)은 Swiss-Prot 데이터베이스 엔트리 P15391(엔트리 버전 128, 서열 버전 6)로부터 입수될 수 있고; (인간) CD20(B 림프구 항원 CD20)의 서열(들)은 Swiss-Prot 데이터베이스 엔트리 P11836(엔트리 버전 118, 서열 버전 1)으로부터 입수될 수 있고; (인간) CD21(보체 수용체 타입 2)의 서열(들)은 Swiss-Prot 데이터베이스 엔트리 P20023(엔트리 버전 128, 서열 버전 2)으로부터 입수될 수 있고; (인간) CD22(B 세포 수용체 CD22)의 서열(들)은 Swiss-Prot 데이터베이스 엔트리 P20273(엔트리 버전 136, 서열 버전 2)으로부터 입수될 수 있고; (인간) CD23(저친화성 면역글로불린 엡실론 Fc 수용체)의 서열(들)은 Swiss-Prot 데이터베이스 엔트리 P06734(엔트리 버전 133, 서열 버전 1)로부터 입수될 수 있고; (인간) CD24(신호 전달도입자 CD24)의 서열(들)은 Swiss-Prot 데이터베이스 엔트리 P25063(엔트리 버전 106, 서열 버전 2)으로부터 입수될 수 있고; (인간) CD26(다이펩티딜 펩티다제 4)의 서열(들)은 Swiss-Prot 데이터베이스 엔트리 P27487(엔트리 버전 140, 서열 버전 2)로부터 입수될 수 있고; (인간) CD27(CD27 항원)의 서열(들)은 Swiss-Prot 데이터베이스 엔트리 P26842(엔트리 버전 119, 서열 버전 2)로부터 입수될 수 있고; (인간) CD29(인테그린 베타-1)의 서열(들)은 Swiss-Prot 데이터베이스 엔트리 P05556(엔트리 버전 154, 서열 버전 2)으로부터 입수될 수 있고; (인간) CD30(종양 괴사 인자 수용체 수퍼패밀리 구성원 8)의 서열(들)은 Swiss-Prot 데이터베이스 엔트리 P28908(엔트리 버전 129, 서열 버전 1)로부터 입수될 수 있고; (인간) CD31(혈소판 내피 세포 부착 분자)의 서열(들)은 Swiss-Prot 데이터베이스 엔트리 P16284(엔트리 버전 146, 서열 버전 1)로부터 입수될 수 있고; (인간) CD32(저친화성 면역글로불린 감마 Fc 영역 수용체 II-b)의 서열(들)은 Swiss-Prot 데이터베이스 엔트리 P31994(엔트리 버전 138, 서열 버전 2)로부터 입수될 수 있고; (인간) CD33(골수 세포 표면 항원 CD33)의 서열(들)은 Swiss-Prot 데이터베이스 엔트리 P20138(엔트리 버전 130, 서열 버전 2)로부터 입수될 수 있고; (인간) CD34(조혈 원시세포 항원 CD34)의 서열(들)은 Swiss-Prot 데이터베이스 엔트리 P28906(엔트리 버전 108, 서열 버전 2)으로부터 입수될 수 있고; (인간) CD35(보체 수용체 타입 1)의 서열(들)은 Swiss-Prot 데이터베이스 엔트리 P17927(엔트리 버전 131, 서열 버전 3)로부터 입수될 수 있고; (인간) CD36(혈소판 당단백질 4)의 서열(들)은 Swiss-Prot 데이터베이스 엔트리 P16671(엔트리 버전 133, 서열 버전 2)로부터 입수될 수 있고; (인간) CD38(ADP-리보실 사이클라제 1)의 서열(들)은 Swiss-Prot 데이터베이스 엔트리 P28907(엔트리 버전 126, 서열 버전 2)로부터 입수될 수 있고; (인간) CD39(엑토뉴클레오사이드 트라이포스페이트 다이포스포하이드롤라제 1)의 서열(들)은 Swiss-Prot 데이터베이스 엔트리 P49961(엔트리 버전 114, 서열 버전 1)로부터 입수될 수 있고; (인간) CD40(종양 괴사 인자 수용체 수퍼패밀리 구성원 5)의 서열(들)은 Swiss-Prot 데이터베이스 엔트리 P25942(엔트리 버전 147, 서열 버전 1)로부터 입수될 수 있고; (인간) CD41(인테그린 알파-IIb)의 서열(들)은 Swiss-Prot 데이터베이스 엔트리 P08514(엔트리 버전 158, 서열 버전 3)로부터 입수될 수 있고; (인간) CD43(류코시알린(Leukosialin))의 서열(들)은 Swiss-Prot 데이터베이스 엔트리 P16150(엔트리 버전 110, 서열 버전 1)으로부터 입수될 수 있고; (인간) CD46(막 보조인자 단백질)의 서열(들)은 Swiss-Prot 데이터베이스 엔트리 P15529(엔트리 버전 145, 서열 버전 3)로부터 입수될 수 있고; (인간) CD48(CD48 항원)의 서열(들)은 Swiss-Prot 데이터베이스 엔트리 P09326(엔트리 버전 137, 서열 버전 2)으로부터 입수될 수 있고; (인간) CD49(인테그린 알파-4)의 서열(들)은 Swiss-Prot 데이터베이스 엔트리 P13612(엔트리 버전 128, 서열 버전 3)로부터 입수될 수 있고; (인간) CD50(세포내 부착 분자 3)의 서열(들)은 Swiss-Prot 데이터베이스 엔트리 P32942(엔트리 버전 128, 서열 버전 2)로부터 입수될 수 있고; (인간) CD51(인테그린 알파-V)의 서열(들)은 Swiss-Prot 데이터베이스 엔트리 P06756(엔트리 버전 149, 서열 버전 2)으로부터 입수될 수 있고; (인간) CD54(세포내 부착 분자 1)의 서열(들)은 Swiss-Prot 데이터베이스 엔트리 P05362(엔트리 버전 160, 서열 버전 2)로부터 입수될 수 있고; (인간) CD55(보체 붕괴 가속화 인자)의 서열(들)은 Swiss-Prot 데이터베이스 엔트리 P08174(엔트리 버전 143, 서열 버전 4)로부터 입수될 수 있고; (인간) CD56(신경 세포 부착 분자 1)의 서열(들)은 Swiss-Prot 데이터베이스 엔트리 P13591(엔트리 버전 132, 서열 버전 3)로부터 입수될 수 있고; (인간) CD57(살해 세포 렉틴 유사 수용체 서브패밀리 G 구성원 1)의 서열(들)은 Swiss-Prot 데이터베이스 엔트리 Q96E93(엔트리 버전 72, 서열 버전 1)으로부터 입수될 수 있고; (인간) CD59(CD59 당단백질)의 서열(들)은 Swiss-Prot 데이터베이스 엔트리 P13987(엔트리 버전 139, 서열 정보 1)로부터 입수될 수 있고; (인간) CD61(인테그린 베타-3)의 서열(들)은 Swiss-Prot 데이터베이스 엔트리 P05106(엔트리 버전 175, 서열 버전 2)으로부터 입수될 수 있고; (인간) CD63(CD63 항원)의 서열(들)은 Swiss-Prot 데이터베이스 엔트리 P08962(엔트리 버전 122, 서열 버전 2)로부터 입수될 수 있고; (인간) CD64(고친화성 면역글로불린 감마 Fc 수용체 I)의 서열(들)은 Swiss-Prot 데이터베이스 엔트리 P12314(엔트리 버전 128, 서열 버전 2)로부터 입수될 수 있고; (인간) CD66(암배아 항원 관련 세포 부착 분자 1)의 서열(들)은 Swiss-Prot 데이터베이스 엔트리 P13688(엔트리 버전 133, 서열 버전 2)로부터 입수될 수 있고; (인간) CD67(암배아 항원 관련 세포 부착 분자 8)의 서열(들)은 Swiss-Prot 데이터베이스 엔트리 P31997(엔트리 버전 115, 서열 버전 2)로부터 입수될 수 있고; (인간) CD68(마크로시알린(Macrosialin))의 서열(들)은 Swiss-Prot 데이터베이스 엔트리 P34810(엔트리 버전 106, 서열 버전 2)으로부터 입수될 수 있고; (인간) CD70(CD70 항원)의 서열(들)은 Swiss-Prot 데이터베이스 엔트리 P32970(엔트리 버전 101, 서열 버전 2)으로부터 입수될 수 있고; (인간) CD72(B 세포 분화 항원 CD72)의 서열(들)은 Swiss-Prot 데이터베이스 엔트리 P21854(엔트리 버전 113, 서열 버전 1)로부터 입수될 수 있고; (인간) CD74(HLA 클래스 II 조직적합성 항원 감마 쇄)의 서열(들)은 Swiss-Prot 데이터베이스 엔트리 P04233(엔트리 버전 141, 서열 버전 3)으로부터 입수될 수 있고; (인간) CD75(베타-갈락토사이드 알파-2,6-시알릴트랜스퍼라제 1)의 서열(들)은 Swiss-Prot 데이터베이스 엔트리 P15907(엔트리 버전 130, 서열 버전 1)로부터 입수될 수 있고; (인간) CD77(락토실세라마이드 4-알파-갈락토실트랜스퍼라제)의 서열(들)은 Swiss-Prot 데이터베이스 엔트리 Q9NPC4(엔트리 버전 100, 서열 버전 1)로부터 입수될 수 있고; (인간) CD79(B 세포 항원 수용체 복합체 관련 단백질 알파 쇄)의 서열(들)은 Swiss-Prot 데이터베이스 엔트리 P11912(엔트리 버전 120, 서열 버전 2)로부터 입수될 수 있고; (인간) CD81(CD81 항원)의 서열(들)은 Swiss-Prot 데이터베이스 엔트리 P60033(엔트리 버전 82, 서열 버전 1)으로부터 입수될 수 있고; (인간) CD82(CD82 항원)의 서열(들)은 Swiss-Prot 데이터베이스 엔트리 P27701(엔트리 버전 98, 서열 버전 1)로부터 입수될 수 있고; (인간) CD83(CD83 항원)의 서열(들)은 Swiss-Prot 데이터베이스 엔트리 Q01151(엔트리 버전 113, 서열 버전 1)로부터 입수될 수 있고; (인간) CD84(SLAM 패밀리 구성원 5)의 서열(들)은 Swiss-Prot 데이터베이스 엔트리 Q9UIB8(엔트리 버전 87, 서열 버전 1)로부터 입수될 수 있고; (인간) CD87(유로키나제 플라스미노겐 활성화제 표면 수용체)의 서열(들)은 Swiss-Prot 데이터베이스 엔트리 Q03405(엔트리 버전 129, 서열 버전 1)로부터 입수될 수 있고; (인간) CD88(C5a 아나필라톡신 화학주성 수용체)의 서열(들)은 Swiss-Prot 데이터베이스 엔트리 P21730(엔트리 버전 116, 서열 버전 2)으로부터 입수될 수 있고; (인간) CD89(면역글로불린 알파 Fc 수용체)의 서열(들)은 Swiss-Prot 데이터베이스 엔트리 P24071(엔트리 버전 121, 서열 버전 1)로부터 입수될 수 있고; (인간) CD90(Thy-1 막 당단백질)의 서열(들)은 Swiss-Prot 데이터베이스 엔트리 P04216(엔트리 버전 128, 서열 버전 2)으로부터 입수될 수 있고; (인간) CD91(프롤로우(Prolow)-밀도 지단백질 수용체 관련 단백질 1)의 서열(들)은 Swiss-Prot 데이터베이스 엔트리 Q07954(엔트리 버전 133, 서열 버전 2)로부터 입수될 수 있고; (인간) CD92(콜린 수송자 유사 단백질 1)의 서열(들)은 Swiss-Prot 데이터베이스 엔트리 Q8WWI5(엔트리 버전 79, 서열 버전 1)로부터 입수될 수 있고; (인간) CD93(보체 성분 C1q 수용체)의 서열(들)은 Swiss-Prot 데이터베이스 엔트리 Q9NPY3(엔트리 버전 115, 서열 버전 3)으로부터 입수될 수 있고; (인간) CD94(천연 살해 세포 항원 CD94)의 서열(들)은 Swiss-Prot 데이터베이스 엔트리 Q13241(엔트리 버전 107, 서열 버전 2)로부터 입수될 수 있고; (인간) CD95(종양 괴사 인자 리간드 수퍼패밀리 구성원 6)의 서열(들)은 Swiss-Prot 데이터베이스 엔트리 P48023(엔트리 버전 134, 서열 버전 1)으로부터 입수될 수 있고; (인간) CD97(CD97 항원)의 서열(들)은 Swiss-Prot 데이터베이스 엔트리 P48960(엔트리 버전 125, 서열 버전 4)으로부터 입수될 수 있고; (인간) CD98(4F2 세포 표면 항원 중쇄)의 서열(들)은 Swiss-Prot 데이터베이스 엔트리 P08195(엔트리 버전 140, 서열 버전 3)로부터 입수될 수 있고; (인간) CD99(CD99 항원)의 서열(들)은 Swiss-Prot 데이터베이스 엔트리 P14209(엔트리 버전 117, 서열 버전 1)로부터 입수될 수 있고; (인간) CD100(세마포린(Semaphorin)-4D)의 서열(들)은 Swiss-Prot 데이터베이스 엔트리 Q92854(엔트리 버전 125, 서열 버전 1)로부터 입수될 수 있고; (인간) CD101(면역글로불린 수퍼패밀리 구성원 2)의 서열(들)은 Swiss-Prot 데이터베이스 엔트리 Q93033(엔트리 버전 89, 서열 버전 2)으로부터 입수될 수 있고; (인간) CD102(세포내 부착 분자 2)의 서열(들)은 Swiss-Prot 데이터베이스 엔트리 P13598(엔트리 버전 131, 서열 버전 2)로부터 입수될 수 있고; (인간) CD103(인테그린 알파-E)의 서열(들)은 Swiss-Prot 데이터베이스 엔트리 P38570(엔트리 버전 118, 서열 버전 3)으로부터 입수될 수 있고; (인간) CD104(인테그린 베타-4)의 서열(들)은 Swiss-Prot 데이터베이스 엔트리 P16144(엔트리 버전 160, 서열 버전 5)로부터 입수될 수 있고; (인간) CD105(엔도글린(Endoglin))의 서열(들)은 Swiss-Prot 데이터베이스 엔트리 P17813(엔트리 버전 133, 서열 버전 2)으로부터 입수될 수 있고; (인간) CD106(혈관 세포 부착 단백질 1)의 서열(들)은 Swiss-Prot 데이터베이스 엔트리 P19320(엔트리 버전 158, 서열 버전 1)으로부터 입수될 수 있고; (인간) CD107(라이소좀 관련 막 당단백질 1)의 서열(들)은 Swiss-Prot 데이터베이스 엔트리 P11279(엔트리 버전 117, 서열 버전 3)로부터 입수될 수 있고; (인간) CD108(세마포린-7A)의 서열(들)은 Swiss-Prot 데이터베이스 엔트리 O75326(엔트리 버전 107, 서열 버전 1)으로부터 입수될 수 있고; (인간) CD109(CD109 항원)의 서열(들)은 Swiss-Prot 데이터베이스 엔트리 Q6YHK3(엔트리 버전 64, 서열 버전 2)으로부터 입수될 수 있고; (인간) CD110(트롬보포이에틴 수용체)의 서열(들)은 Swiss-Prot 데이터베이스 엔트리 P40238(엔트리 버전 122, 서열 버전 1)로부터 입수될 수 있고; (인간) CD111(폴리오바이러스 수용체 관련 단백질 1)의 서열(들)은 Swiss-Prot 데이터베이스 엔트리 Q15223(엔트리 버전 114, 서열 버전 3)으로부터 입수될 수 있고; (인간) CD112(폴리오바이러스 수용체 관련 단백질 2)의 서열(들)은 Swiss-Prot 데이터베이스 엔트리 Q92692(엔트리 버전 123, 서열 버전 1)로부터 입수될 수 있고; (인간) CD113(폴리오바이러스 수용체 관련 단백질 3)의 서열(들)은 Swiss-Prot 데이터베이스 엔트리 Q9NQS3(엔트리 버전 78, 서열 버전 1)으로부터 입수될 수 있고; (인간) CD114(과립구 콜로니 자극 인자 수용체)의 서열(들)은 Swiss-Prot 데이터베이스 엔트리 Q99062(엔트리 버전 129, 서열 버전 1)로부터 입수될 수 있고; (인간) CD115(마크로파지 콜로니 자극 인자 1 수용체)의 서열(들)은 Swiss-Prot 데이터베이스 엔트리 P07333(엔트리 버전 145, 서열 버전 2)으로부터 입수될 수 있고; (인간) CD116(과립구-마크로파지 콜로니 자극 인자 수용체 서브유닛 알파)의 서열(들)은 Swiss-Prot 데이터베이스 엔트리 P15509(엔트리 버전 128, 서열 버전 1)로부터 입수될 수 있고; (인간) CD117(비만/줄기 세포 성장인자 수용체 키트)의 서열(들)은 Swiss-Prot 데이터베이스 엔트리 P10721(엔트리 버전 150, 서열 버전 1)로부터 입수될 수 있고; (인간) CD118(백혈병 억제 인자 수용체)의 서열(들)은 Swiss-Prot 데이터베이스 엔트리 P42702(엔트리 버전 115, 서열 버전 1)로부터 입수될 수 있고; (인간) CD119(인터페론 감마 수용체 1)의 서열(들)은 Swiss-Prot 데이터베이스 엔트리 P15260(엔트리 버전 140, 서열 버전 1)으로부터 입수될 수 있고; (인간) CD121(인터류킨-1 수용체 타입 1)의 서열(들)은 Swiss-Prot 데이터베이스 엔트리 P14778(엔트리 버전 151, 서열 버전 1)로부터 입수될 수 있고; (인간) CD123(인터류킨-3 수용체 서브유닛 알파)의 서열(들)은 Swiss-Prot 데이터베이스 엔트리 P26951(엔트리 버전 110, 서열 버전 1)로부터 입수될 수 있고; (인간) CD124(인터류킨-4 수용체 서브유닛 알파)의 서열(들)은 Swiss-Prot 데이터베이스 엔트리 P24394(엔트리 버전 144, 서열 버전 1)로부터 입수될 수 있고; (인간) CD125(인터류킨-5 수용체 서브유닛 알파)의 서열(들)은 Swiss-Prot 데이터베이스 엔트리 Q01344(엔트리 버전 120, 서열 버전 2)로부터 입수될 수 있고; (인간) CD126(인터류킨-6 수용체 서브유닛 알파)의 서열(들)은 Swiss-Prot 데이터베이스 엔트리 P08887(엔트리 버전 143, 서열 버전 1)로부터 입수될 수 있고; (인간) CD130(인터류킨-6 수용체 서브유닛 베타)의 서열(들)은 Swiss-Prot 데이터베이스 엔트리 P40189(엔트리 버전 142, 서열 버전 2)로부터 입수될 수 있고; (인간) CD131(사이토카인 수용체 공통 서브유닛 베타)의 서열(들)은 Swiss-Prot 데이터베이스 엔트리 P32927(엔트리 버전 128, 서열 버전 2)로부터 입수될 수 있고; (인간) CD133(프로미닌-1)의 서열(들)은 Swiss-Prot 데이터베이스 엔트리 O43490(엔트리 버전 110, 서열 버전 1)으로부터 입수될 수 있고; (인간) CD134(종양 괴사 인자 수용체 수퍼패밀리 구성원 4)의 서열(들)은 Swiss-Prot 데이터베이스 엔트리 P43489(엔트리 버전 106, 서열 버전 1)로부터 입수될 수 있고; (인간) CD135(수용체 타입 티로신 단백질 키나제 FLT3)의 서열(들)은 Swiss-Prot 데이터베이스 엔트리 P36888(엔트리 버전 119, 서열 버전 2)로부터 입수될 수 있고; (인간) CD136(마크로파지 자극 단백질 수용체)의 서열(들)은 Swiss-Prot 데이터베이스 엔트리 Q04912(엔트리 버전 129, 서열 버전 2)로부터 입수될 수 있고; (인간) CD137(종양 괴사 인자 수용체 수퍼패밀리 구성원 9)의 서열(들)은 Swiss-Prot 데이터베이스 엔트리 Q07011(엔트리 버전 109, 서열 버전 1)로부터 입수될 수 있고; (인간) CD138(신데칸(Syndecan)-1)의 서열(들)은 Swiss-Prot 데이터베이스 엔트리 P18827(엔트리 버전 114, 서열 버전 3)로부터 입수될 수 있고; (인간) CD140(혈소판 유래의 성장인자 수용체 베타)의 서열(들)은 Swiss-Prot 데이터베이스 엔트리 P09619(엔트리 버전 154, 서열 버전 1)로부터 입수될 수 있고; (인간) CD141(트롬보모듈린(Thrombomodulin))의 서열(들)은 Swiss-Prot 데이터베이스 엔트리 P07204(엔트리 버전 162, 서열 버전 2)로부터 입수될 수 있고; (인간) CD142(조직 인자)의 서열(들)은 Swiss-Prot 데이터베이스 엔트리 P13726(엔트리 버전 137, 서열 버전 1)으로부터 입수될 수 있고; (인간) CD143(안지오텐신 전환 효소)의 서열(들)은 Swiss-Prot 데이터베이스 엔트리 P12821(엔트리 버전 157, 서열 버전 1)로부터 입수될 수 있고; (인간) CD144(캐드헤린-5)의 서열(들)은 Swiss-Prot 데이터베이스 엔트리 P33151(엔트리 버전 108, 서열 버전 5)로부터 입수될 수 있고; (인간) CD146(세포 표면 당단백질 MUC18)의 서열(들)은 Swiss-Prot 데이터베이스 엔트리 P43121(엔트리 버전 109, 서열 버전 2)로부터 입수될 수 있고; (인간) CD147(바시진(Basigin))의 서열(들)은 Swiss-Prot 데이터베이스 엔트리 P35613(엔트리 버전 134, 서열 버전 2)으로부터 입수될 수 있고; (인간) CD148(수용체 타입 티로신 단백질 포스파타제 에타)의 서열(들)은 Swiss-Prot 데이터베이스 엔트리 Q12913(엔트리 버전 124, 서열 버전 3)으로부터 입수될 수 있고; (인간) CD151(CD151 항원)의 서열(들)은 Swiss-Prot 데이터베이스 엔트리 P48509(엔트리 버전 108, 서열 버전 3)로부터 입수될 수 있고; (인간) CD153(종양 괴사 인자 리간드 수퍼패밀리 구성원 8)의 서열(들)은 Swiss-Prot 데이터베이스 엔트리 P32971(엔트리 버전 90, 서열 버전 1)로부터 입수될 수 있고; (인간) CD155(폴리오바이러스 수용체)의 서열(들)은 Swiss-Prot 데이터베이스 엔트리 P15151(엔트리 버전 132, 서열 버전 2)로부터 입수될 수 있고; (인간) CD156(디스인테그린(Disintegrin) 및 메탈로프로테이나제 도메인 함유 단백질 8)의 서열(들)은 Swiss-Prot 데이터베이스 엔트리 P78325(엔트리 버전 115, 서열 버전 1)로부터 입수될 수 있고; (인간) CD157(ADP-리보실 사이클라제 2)의 서열(들)은 Swiss-Prot 데이터베이스 엔트리 Q10588(엔트리 버전 116, 서열 버전 2)로부터 입수될 수 있고; (인간) CD158(살해 세포 면역글로불린 유사 수용체 3DL3)의 서열(들)은 Swiss-Prot 데이터베이스 엔트리 Q8N743(엔트리 버전 91, 서열 버전 2)으로부터 입수될 수 있고; (인간) CD159(NKG2-A/NKG2-B 타입 II 일체형 막 단백질)의 서열(들)은 Swiss-Prot 데이터베이스 엔트리 P26715(엔트리 버전 116, 서열 버전 2)로부터 입수될 수 있고; (인간) CD160(CD160 항원)의 서열(들)은 Swiss-Prot 데이터베이스 엔트리 O95971(엔트리 버전 98, 서열 버전 1)로부터 입수될 수 있고; (인간) CD161(살해 세포 렉틴 유사 수용체 서브패밀리 B 구성원 1)의 서열(들)은 Swiss-Prot 데이터베이스 엔트리 Q12918(엔트리 버전 81, 서열 버전 1)로부터 입수될 수 있고; (인간) CD162(P-셀렉틴 당단백질 리간드 1)의 서열(들)은 Swiss-Prot 데이터베이스 엔트리 Q14242(엔트리 버전 103, 서열 버전 1)로부터 입수될 수 있고; (인간) CD163(스카벤저(Scavenger) 수용체 시스테인 풍부 타입 1 단백질 M130)의 서열(들)은 Swiss-Prot 데이터베이스 엔트리 Q86VB7(엔트리 버전 77, 서열 버전 2)로부터 입수될 수 있고; (인간) CD164(시알로뮤신(Sialomucin) 코어 단백질 24)의 서열(들)은 Swiss-Prot 데이터베이스 엔트리 Q04900(엔트리 버전 89, 서열 버전 2)으로부터 입수될 수 있고; (인간) CD166(CD166 항원)의 서열(들)은 Swiss-Prot 데이터베이스 엔트리 Q13740(엔트리 버전 111, 서열 버전 2)으로부터 입수될 수 있고; (인간) CD167(디스코이딘(Discoidin) 도메인 함유 수용체 2)의 서열(들)은 Swiss-Prot 데이터베이스 엔트리 Q16832(엔트리 버전 120, 서열 버전 2)로부터 입수될 수 있고; (인간) CD168(하이알루로난 매개 이동 수용체)의 서열(들)은 Swiss-Prot 데이터베이스 엔트리 O75330(엔트리 버전 99, 서열 버전 2)으로부터 입수될 수 있고; (인간) CD169(시알로어드헤신(Sialoadhesin))의 서열(들)은 Swiss-Prot 데이터베이스 엔트리 Q9BZZ2(엔트리 버전 103, 서열 버전 2)로부터 입수될 수 있고; (인간) CD170(시알산 결합 Ig 유사 렉틴 5)의 서열(들)은 Swiss-Prot 데이터베이스 엔트리 O15389(엔트리 버전 106, 서열 버전 1)로부터 입수될 수 있고; (인간) CD171(중성 세포 부착 분자 L1)의 서열(들)은 Swiss-Prot 데이터베이스 엔트리 P32004(엔트리 버전 139, 서열 버전 2)로부터 입수될 수 있고; (인간) CD172(신호 조절 단백질 베타-1)의 서열(들)은 Swiss-Prot 데이터베이스 엔트리 O00241(엔트리 버전 112, 서열 버전 5)로부터 입수될 수 있고; (인간) CD177(CD177 항원)의 서열(들)은 Swiss-Prot 데이터베이스 엔트리 Q8N6Q3(엔트리 버전 65, 서열 버전 2)으로부터 입수될 수 있고; (인간) CD178(종양 괴사 인자 리간드 수퍼패밀리 구성원 6)의 서열(들)은 Swiss-Prot 데이터베이스 엔트리 P48023(엔트리 버전 134, 서열 버전 1)으로부터 입수될 수 있고; (인간) CD179(면역글로불린 이오타 쇄)의 서열(들)은 Swiss-Prot 데이터베이스 엔트리 P12018(엔트리 버전 115, 서열 버전 2)로부터 입수될 수 있고; (인간) CD180(CD180 항원)의 서열(들)은 Swiss-Prot 데이터베이스 엔트리 Q99467(엔트리 버전 101, 서열 버전 2)로부터 입수될 수 있고; (인간) CD181(C-X-C 케모카인 수용체 타입 1)의 서열(들)은 Swiss-Prot 데이터베이스 엔트리 P25024(엔트리 버전 125, 서열 버전 2)로부터 입수될 수 있고; (인간) CD182(C-X-C 케모카인 수용체 타입 2)의 서열(들)은 Swiss-Prot 데이터베이스 엔트리 P25025(엔트리 버전 123, 서열 버전 2)로부터 입수될 수 있고; (인간) CD183(C-X-C 케모카인 수용체 타입 3)의 서열(들)은 Swiss-Prot 데이터베이스 엔트리 P49682(엔트리 버전 118, 서열 버전 2)로부터 입수될 수 있고; (인간) CD184(C-X-C 케모카인 수용체 타입 4)의 서열(들)은 Swiss-Prot 데이터베이스 엔트리 P61073(엔트리 버전 95, 서열 버전 1)으로부터 입수될 수 있고; (인간) CD185(C-X-C 케모카인 수용체 타입 5)의 서열(들)은 Swiss-Prot 데이터베이스 엔트리 P32302(엔트리 버전 109, 서열 버전 1)로부터 입수될 수 있고; (인간) CD186(C-X-C 케모카인 수용체 타입 6)의 서열(들)은 Swiss-Prot 데이터베이스 엔트리 O00574(엔트리 버전 104, 서열 버전 1)로부터 입수될 수 있고; (인간) CD191(C-C 케모카인 수용체 타입 1)의 서열(들)은 Swiss-Prot 데이터베이스 엔트리 P32246(엔트리 버전 106, 서열 버전 1)으로부터 입수될 수 있고; (인간) CD192(C-C 케모카인 수용체 타입 2)의 서열(들)은 Swiss-Prot 데이터베이스 엔트리 P41597(엔트리 버전 128, 서열 버전 1)로부터 입수될 수 있고; (인간) CD193(C-C 케모카인 수용체 타입 3)의 서열(들)은 Swiss-Prot 데이터베이스 엔트리 P51677(엔트리 버전 112, 서열 버전 1)로부터 입수될 수 있고; (인간) CD200(OX-2 막 당단백질)의 서열(들)은 Swiss-Prot 데이터베이스 엔트리 P41217(엔트리 버전 110, 서열 버전 4)로부터 입수될 수 있고; (인간) CD201(내피 단백질 C 수용체)의 서열(들)은 Swiss-Prot 데이터베이스 엔트리 Q9UNN8(엔트리 버전 110, 서열 버전 1)로부터 입수될 수 있고; (인간) CD204(마크로파지 스카벤저 수용체 타입 I 및 II)의 서열(들)은 Swiss-Prot 데이터베이스 엔트리 P21757(엔트리 버전 122, 서열 버전 1)로부터 입수될 수 있고; (인간) CD206(마크로파지 만노스 수용체 1)의 서열(들)은 Swiss-Prot 데이터베이스 엔트리 P22897(엔트리 버전 138, 서열 버전 1)로부터 입수될 수 있고; (인간) CD207(C-타입 렉틴 도메인 패밀리 4 구성원 K)의 서열(들)은 Swiss-Prot 데이터베이스 엔트리 Q9UJ71(엔트리 버전 85, 서열 버전 2)로부터 입수될 수 있고; (인간) CD208(라이소좀 관련 막 당단백질 3)의 서열(들)은 Swiss-Prot 데이터베이스 엔트리 Q9UQV4(엔트리 버전 69, 서열 버전 3)로부터 입수될 수 있고; (인간) CD209(CD209 항원)의 서열(들)은 Swiss-Prot 데이터베이스 엔트리 Q9NNX6(엔트리 버전 103, 서열 버전 1)으로부터 입수될 수 있고; (인간) CD217(C인터류킨-17 수용체 A)의 서열(들)은 Swiss-Prot 데이터베이스 엔트리 Q96F46(엔트리 버전 94, 서열 버전 2)으로부터 입수될 수 있고; (인간) CD218(인터류킨-18 수용체 1)의 서열(들)은 Swiss-Prot 데이터베이스 엔트리 Q13478(엔트리 버전 104, 서열 버전 1)로부터 입수될 수 있고; (인간) CD220(인슐린 수용체)의 서열(들)은 Swiss-Prot 데이터베이스 엔트리 P06213(엔트리 버전 175, 서열 버전 4)으로부터 입수될 수 있고; (인간) CD221(인슐린 유사 성장인자 1 수용체)의 서열(들)은 Swiss-Prot 데이터베이스 엔트리 P08069(엔트리 버전 145, 서열 버전 1)로부터 입수될 수 있고; (인간) CD222(양이온 독립성 만노스-6-포스페이트 수용체)의 서열(들)은 Swiss-Prot 데이터베이스 엔트리 P11717(엔트리 버전 137, 서열 버전 3)로부터 입수될 수 있고; (인간) CD223(림프구 활성화 유전자 3 단백질)의 서열(들)은 Swiss-Prot 데이터베이스 엔트리 P18627(엔트리 버전 108, 서열 버전 5)로부터 입수될 수 있고; (인간) CD224(감마-글루타밀트랜스펩티다제 1)의 서열(들)은 Swiss-Prot 데이터베이스 엔트리 P19440(엔트리 버전 137, 서열 버전 2)으로부터 입수될 수 있고; (인간) CD225(인터페론-유도된 경막 단백질 1)의 서열(들)은 Swiss-Prot 데이터베이스 엔트리 P13164(엔트리 버전 101, 서열 버전 3)로부터 입수될 수 있고; (인간) CD226(CD226 항원)의 서열(들)은 Swiss-Prot 데이터베이스 엔트리 Q15762(엔트리 버전 89, 서열 버전 2)로부터 입수될 수 있고; (인간) CD227(뮤신-1)의 서열(들)은 Swiss-Prot 데이터베이스 엔트리 P15941(엔트리 버전 136, 서열 버전 3)로부터 입수될 수 있고; (인간) CD228(멜라노트랜스페린)의 서열(들)은 Swiss-Prot 데이터베이스 엔트리 P08582(엔트리 버전 124, 서열 버전 2)로부터 입수될 수 있고; (인간) CD230(주요 프리온 단백질)의 서열(들)은 Swiss-Prot 데이터베이스 엔트리 P04156(엔트리 버전 161, 서열 버전 1)으로부터 입수될 수 있고; (인간) CD231(테트라스파닌(Tetraspanin)-7)의 서열(들)은 Swiss-Prot 데이터베이스 엔트리 P41732(엔트리 버전 115, 서열 버전 2)로부터 입수될 수 있고; (인간) CD232(플렉신(Plexin)-C1)의 서열(들)은 Swiss-Prot 데이터베이스 엔트리 O60486(엔트리 버전 80, 서열 버전 1)으로부터 입수될 수 있고; (인간) CD233(밴드(Band) 3 음이온 수송 단백질)의 서열(들)은 Swiss-Prot 데이터베이스 엔트리 P02730(엔트리 버전 167, 서열 버전 3)으로부터 입수될 수 있고; (인간) CD234(두피(Duffy) 항원/케모카인 수용체)의 서열(들)은 Swiss-Prot 데이터베이스 엔트리 Q16570(엔트리 버전 114, 서열 버전 3)으로부터 입수될 수 있고; (인간) CD236(글리코포린(Glycophorin)-C)의 서열(들)은 Swiss-Prot 데이터베이스 엔트리 P04921(엔트리 버전 116, 서열 버전 1)로부터 입수될 수 있고; (인간) CD238(켈(Kell) 혈액 군 당단백질)의 서열(들)은 Swiss-Prot 데이터베이스 엔트리 P23276(엔트리 버전 124, 서열 버전 2)으로부터 입수될 수 있고; (인간) CD239(기저 세포 부착 분자)의 서열(들)은 Swiss-Prot 데이터베이스 엔트리 P50895(엔트리 버전 117, 서열 버전 2)로부터 입수될 수 있고; (인간) CD241(암모늄 수송자 Rh 타입 A)의 서열(들)은 Swiss-Prot 데이터베이스 엔트리 Q02094(엔트리 버전 98, 서열 버전 2)로부터 입수될 수 있고; (인간) CD242(세포내 부착 분자 4)의 서열(들)은 Swiss-Prot 데이터베이스 엔트리 Q14773(엔트리 버전 106, 서열 버전 1)으로부터 입수될 수 있고; (인간) CD243(다중약물 내성 단백질 1)의 서열(들)은 Swiss-Prot 데이터베이스 엔트리 P08183(엔트리 버전 146, 서열 버전 3)으로부터 입수될 수 있고; (인간) CD244(천연 살해 세포 수용체 2B4)의 서열(들)은 Swiss-Prot 데이터베이스 엔트리 Q9BZW8(엔트리 버전 94, 서열 버전 2)로부터 입수될 수 있고; (인간) CD246(ALK 티로신 키나제 수용체)의 서열(들)은 Swiss-Prot 데이터베이스 엔트리 Q9UM73(엔트리 버전 120, 서열 버전 3)으로부터 입수될 수 있고; (인간) CD248(엔도시알린(Endosialin))의 서열(들)은 Swiss-Prot 데이터베이스 엔트리 Q9HCU0(엔트리 버전 87, 서열 버전 1)으로부터 입수될 수 있고; (인간) CD249(글루타밀 아미노펩티다제)의 서열(들)은 Swiss-Prot 데이터베이스 엔트리 Q07075(엔트리 버전 121, 서열 버전 3)로부터 입수될 수 있고; (인간) CD252(종양 괴사 인자 리간드 수퍼패밀리 구성원 4)의 서열(들)은 Swiss-Prot 데이터베이스 엔트리 P23510(엔트리 버전 101, 서열 버전 1)으로부터 입수될 수 있고; (인간) CD253(종양 괴사 인자 리간드 수퍼패밀리 구성원 10)의 서열(들)은 Swiss-Prot 데이터베이스 엔트리 P50591(엔트리 버전 118, 서열 버전 1)로부터 입수될 수 있고; (인간) CD254(종양 괴사 인자 리간드 수퍼패밀리 구성원 11)의 서열(들)은 Swiss-Prot 데이터베이스 엔트리 O14788(엔트리 버전 110, 서열 버전 1)로부터 입수될 수 있고; (인간) CD256(종양 괴사 인자 리간드 수퍼패밀리 구성원 13)의 서열(들)은 Swiss-Prot 데이터베이스 엔트리 O75888(엔트리 버전 111, 서열 버전 1)로부터 입수될 수 있고; (인간) CD257(종양 괴사 인자 리간드 수퍼패밀리 구성원 13B)의 서열(들)은 Swiss-Prot 데이터베이스 엔트리 Q9Y275(엔트리 버전 127, 서열 버전 1)로부터 입수될 수 있고; (인간) CD258(종양 괴사 인자 리간드 수퍼패밀리 구성원 14)의 서열(들)은 Swiss-Prot 데이터베이스 엔트리 O43557(엔트리 버전 117, 서열 버전 2)로부터 입수될 수 있고; (인간) CD261(종양 괴사 인자 수용체 수퍼패밀리 구성원 10A)의 서열(들)은 Swiss-Prot 데이터베이스 엔트리 O00220(엔트리 버전 112, 서열 버전 3)으로부터 입수될 수 있고; (인간) CD262(종양 괴사 인자 수용체 수퍼패밀리 구성원 10B)의 서열(들)은 Swiss-Prot 데이터베이스 엔트리 O14763(엔트리 버전 133, 서열 버전 2)으로부터 입수될 수 있고; (인간) CD263(종양 괴사 인자 수용체 수퍼패밀리 구성원 10C)의 서열(들)은 Swiss-Prot 데이터베이스 엔트리 O14798(엔트리 버전 99, 서열 버전 3)로부터 입수될 수 있고; (인간) CD264(종양 괴사 인자 수용체 수퍼패밀리 구성원 10D)의 서열(들)은 Swiss-Prot 데이터베이스 엔트리 Q9UBN6(엔트리 버전 109, 서열 버전 1)으로부터 입수될 수 있고; (인간) CD265(종양 괴사 인자 수용체 수퍼패밀리 구성원 11A)의 서열(들)은 Swiss-Prot 데이터베이스 엔트리 Q9Y6Q6(엔트리 버전 100, 서열 버전 1)으로부터 입수될 수 있고; (인간) CD266(종양 괴사 인자 수용체 수퍼패밀리 구성원 12A)의 서열(들)은 Swiss-Prot 데이터베이스 엔트리 Q9NP84(엔트리 버전 89, 서열 버전 1)로부터 입수될 수 있고; (인간) CD267(종양 괴사 인자 수용체 수퍼패밀리 구성원 13B)의 서열(들)은 Swiss-Prot 데이터베이스 엔트리 O14836(엔트리 버전 102, 서열 버전 1)으로부터 입수될 수 있고; (인간) CD268(종양 괴사 인자 수용체 수퍼패밀리 구성원 13C)의 서열(들)은 Swiss-Prot 데이터베이스 엔트리 Q96RJ3(엔트리 버전 91, 서열 버전 1)으로부터 입수될 수 있고; (인간) CD269(종양 괴사 인자 수용체 수퍼패밀리 구성원 17)의 서열(들)은 Swiss-Prot 데이터베이스 엔트리 Q02223(엔트리 버전 125, 서열 버전 2)으로부터 입수될 수 있고; (인간) CD270(종양 괴사 인자 수용체 수퍼패밀리 구성원 14)의 서열(들)은 Swiss-Prot 데이터베이스 엔트리 Q92956(엔트리 버전 134, 서열 버전 3)으로부터 입수될 수 있고; (인간) CD271(종양 괴사 인자 수용체 수퍼패밀리 구성원 16)의 서열(들)은 Swiss-Prot 데이터베이스 엔트리 P08138(엔트리 버전 135, 서열 버전 1)로부터 입수될 수 있고; (인간) CD276(CD276 항원)의 서열(들)은 Swiss-Prot 데이터베이스 엔트리 Q5ZPR3(엔트리 버전 71, 서열 버전 1)으로부터 입수될 수 있고; (인간) CD277(부티로필린(Butyrophilin) 서브패밀리 3 구성원 A1)의 서열(들)은 Swiss-Prot 데이터베이스 엔트리 O00481(엔트리 버전 102, 서열 버전 3)로부터 입수될 수 있고; (인간) CD280(C-타입 만노스 수용체 2)의 서열(들)은 Swiss-Prot 데이터베이스 엔트리 Q9UBG0(엔트리 버전 79, 서열 버전 2)으로부터 입수될 수 있고; (인간) CD281(톨(Toll) 유사 수용체 1)의 서열(들)은 Swiss-Prot 데이터베이스 엔트리 Q15399(엔트리 버전 125, 서열 버전 3)로부터 입수될 수 있고; (인간) CD282(톨 유사 수용체 2)의 서열(들)은 Swiss-Prot 데이터베이스 엔트리 O60603(엔트리 버전 129, 서열 버전 1)으로부터 입수될 수 있고; (인간) CD283(톨 유사 수용체 3)의 서열(들)은 Swiss-Prot 데이터베이스 엔트리 O15455(엔트리 버전 120, 서열 버전 1)로부터 입수될 수 있고; (인간) CD284(톨 유사 수용체 4)의 서열(들)은 Swiss-Prot 데이터베이스 엔트리 O00206(엔트리 버전 125, 서열 버전 2)으로부터 입수될 수 있고; (인간) CD286(톨 유사 수용체 6)의 서열(들)은 Swiss-Prot 데이터베이스 엔트리 Q9Y2C9(엔트리 버전 108, 서열 버전 2)로부터 입수될 수 있고; (인간) CD288(톨 유사 수용체 8)의 서열(들)은 Swiss-Prot 데이터베이스 엔트리 Q9NR97(엔트리 버전 103, 서열 버전 1)로부터 입수될 수 있고; (인간) CD289(톨 유사 수용체 9)의 서열(들)은 Swiss-Prot 데이터베이스 엔트리 Q9NR96(엔트리 버전 107, 서열 버전 2)으로부터 입수될 수 있고; (인간) CD290(톨 유사 수용체 10)의 서열(들)은 Swiss-Prot 데이터베이스 엔트리 Q9BXR5(엔트리 버전 105, 서열 버전 2)로부터 입수될 수 있고; (인간) CD292(골 형태형성 단백질 수용체 타입-1A)의 서열(들)은 Swiss-Prot 데이터베이스 엔트리 P36894(엔트리 버전 146, 서열 버전 2)로부터 입수될 수 있고; (인간) CD294(잠정적 G-단백질 커플링된 수용체 44)의 서열(들)은 Swiss-Prot 데이터베이스 엔트리 Q9Y5Y4(엔트리 버전 91, 서열 버전 3)로부터 입수될 수 있고; (인간) CD295(렙틴 수용체)의 서열(들)은 Swiss-Prot 데이터베이스 엔트리 P48357(엔트리 버전 132, 서열 버전 2)로부터 입수될 수 있고; (인간) CD296(GPI-연결된 NAD(P)(+)--아르기닌 ADP-리보실트랜스퍼라제 1)의 서열(들)은 Swiss-Prot 데이터베이스 엔트리 P52961(엔트리 버전 96, 서열 버전 2)로부터 입수될 수 있고; (인간) CD297(엑토-ADP-리보실트랜스퍼라제 4)의 서열(들)은 Swiss-Prot 데이터베이스 엔트리 Q93070(엔트리 버전 106, 서열 버전 2)으로부터 입수될 수 있고; (인간) CD298(나트륨/칼륨 수송 ATPase 서브유닛 베타-3)의 서열(들)은 Swiss-Prot 데이터베이스 엔트리 P54709(엔트리 버전 102, 서열 버전 1)로부터 입수될 수 있고; (인간) CD299(C-타입 렉틴 도메인 패밀리 4 구성원 M)의 서열(들)은 Swiss-Prot 데이터베이스 엔트리 Q9H2X3(엔트리 버전 108, 서열 버전 1)으로부터 입수될 수 있고; (인간) CD300(CMRF35 유사 분자 9)의 서열(들)은 Swiss-Prot 데이터베이스 엔트리 Q6UXG3(엔트리 버전 67, 서열 버전 2)으로부터 입수될 수 있고; (인간) CD301(C-타입 렉틴 도메인 패밀리 10 구성원 A)의 서열(들)은 Swiss-Prot 데이터베이스 엔트리 Q8IUN9(엔트리 버전 80, 서열 버전 1)로부터 입수될 수 있고; (인간) CD302(CD302 항원)의 서열(들)은 Swiss-Prot 데이터베이스 엔트리 Q8IX05(엔트리 버전 64, 서열 버전 1)로부터 입수될 수 있고; (인간) CD303(C-타입 렉틴 도메인 패밀리 4 구성원 C)의 서열(들)은 Swiss-Prot 데이터베이스 엔트리 Q8WTT0(엔트리 버전 82, 서열 버전 1)으로부터 입수될 수 있고; (인간) CD304(뉴로필린(Neuropilin)-1)의 서열(들)은 Swiss-Prot 데이터베이스 엔트리 O14786(엔트리 버전 129, 서열 버전 3)으로부터 입수될 수 있고; (인간) CD305(백혈구 관련 면역글로불린 유사 수용체 1)의 서열(들)은 Swiss-Prot 데이터베이스 엔트리 Q6GTX8(엔트리 버전 70, 서열 버전 1)로부터 입수될 수 있고; (인간) CD306(백혈구 관련 면역글로불린 유사 수용체 2)의 서열(들)은 Swiss-Prot 데이터베이스 엔트리 Q6ISS4(엔트리 버전 63, 서열 버전 1)로부터 입수될 수 있고; (인간) CD309(혈관 내피 성장인자 수용체 2)의 서열(들)은 Swiss-Prot 데이터베이스 엔트리 P35968(엔트리 버전 138, 서열 버전 2)로부터 입수될 수 있고; (인간) CD312(EGF 유사 모듈 함유 뮤신 유사 호르몬 수용체 유사 2)의 서열(들)은 Swiss-Prot 데이터베이스 엔트리 Q9UHX3(엔트리 버전 113, 서열 버전 2)으로부터 입수될 수 있고; (인간) CD314(NKG2-D 타입 II 일체형 막 단백질)의 서열(들)은 Swiss-Prot 데이터베이스 엔트리 P26718(엔트리 버전 117, 서열 버전 1)로부터 입수될 수 있고; (인간) CD315(프로스타글란딘 F2 수용체 음성 조절제)의 서열(들)은 Swiss-Prot 데이터베이스 엔트리 Q9P2B2(엔트리 버전 98, 서열 버전 2)로부터 입수될 수 있고; (인간) CD316(면역글로불린 수퍼패밀리 구성원 8)의 서열(들)은 Swiss-Prot 데이터베이스 엔트리 Q969P0(엔트리 버전 81, 서열 버전 1)으로부터 입수될 수 있고; (인간) CD317(골수 간질 항원 2)의 서열(들)은 Swiss-Prot 데이터베이스 엔트리 Q10589(엔트리 버전 95, 서열 버전 1)로부터 입수될 수 있고; (인간) CD318(CUB 도메인 함유 단백질 1)의 서열(들)은 Swiss-Prot 데이터베이스 엔트리 Q9H5V8(엔트리 버전 78, 서열 버전 3)로부터 입수될 수 있고; (인간) CD319(SLAM 패밀리 구성원 7)의 서열(들)은 Swiss-Prot 데이터베이스 엔트리 Q9NQ25(엔트리 버전 92, 서열 버전 1)로부터 입수될 수 있고; (인간) CD320(CD320 항원)의 서열(들)은 Swiss-Prot 데이터베이스 엔트리 Q9NPF0(엔트리 버전 86, 서열 버전 1)으로부터 입수될 수 있고; (인간) CD321(연접 접착 분자 A)의 서열(들)은 Swiss-Prot 데이터베이스 엔트리 Q9Y624(엔트리 버전 124, 서열 버전 1)로부터 입수될 수 있고; (인간) CD322(연접 부착 분자 B)의 서열(들)은 Swiss-Prot 데이터베이스 엔트리 P57087(엔트리 버전 107, 서열 버전 1)로부터 입수될 수 있고; (인간) CD324(캐드헤린-1)의 서열(들)은 Swiss-Prot 데이터베이스 엔트리 P12830(엔트리 버전 157, 서열 버전 3)으로부터 입수될 수 있고; (인간) CD325(캐드헤린-2)의 서열(들)은 Swiss-Prot 데이터베이스 엔트리 P19022(엔트리 버전 118, 서열 버전 4)로부터 입수될 수 있고; (인간) CD326(상피 세포 부착 분자)의 서열(들)은 Swiss-Prot 데이터베이스 엔트리 P16422(엔트리 버전 118, 서열 버전 2)로부터 입수될 수 있고; (인간) CD327(시알산 결합 Ig 유사 렉틴 6)의 서열(들)은 Swiss-Prot 데이터베이스 엔트리 O43699(엔트리 버전 107, 서열 버전 2)로부터 입수될 수 있고; (인간) CD328(시알산 결합 Ig 유사 렉틴 7)의 서열(들)은 Swiss-Prot 데이터베이스 엔트리 Q9Y286(엔트리 버전 111, 서열 버전 1)으로부터 입수될 수 있고; (인간) CD329(시알산 결합 Ig 유사 렉틴 8)의 서열(들)은 Swiss-Prot 데이터베이스 엔트리 Q9NYZ4(엔트리 버전 100, 서열 버전 2)로부터 입수될 수 있고; (인간) CD331(섬유모세포 성장인자 수용체 1)의 서열(들)은 Swiss-Prot 데이터베이스 엔트리 P11362(엔트리 버전 169, 서열 버전 3)로부터 입수될 수 있고; (인간) CD332(섬유모세포 성장인자 수용체 2)의 서열(들)은 Swiss-Prot 데이터베이스 엔트리 P21802(엔트리 버전 165, 서열 버전 1)로부터 입수될 수 있고; (인간) CD333(섬유모세포 성장인자 수용체 3)의 서열(들)은 Swiss-Prot 데이터베이스 엔트리 P22607(엔트리 버전 161, 서열 버전 1)로부터 입수될 수 있고; (인간) CD334(섬유모세포 성장인자 수용체 4)의 서열(들)은 Swiss-Prot 데이터베이스 엔트리 P22455(엔트리 버전 136, 서열 버전 2)로부터 입수될 수 있고; (인간) CD335(천연 세포독성 유발 수용체 1)의 서열(들)은 Swiss-Prot 데이터베이스 엔트리 O76036(엔트리 버전 98, 서열 버전 1)으로부터 입수될 수 있고; (인간) CD336(천연 세포독성 유발 수용체 2)의 서열(들)은 Swiss-Prot 데이터베이스 엔트리 O95944(엔트리 버전 86, 서열 버전 2)로부터 입수될 수 있고; (인간) CD337(천연 세포독성 유발 수용체 3)의 서열(들)은 Swiss-Prot 데이터베이스 엔트리 O14931(엔트리 버전 103, 서열 버전 1)로부터 입수될 수 있고; (인간) CD338(ATP 결합 카세트 서브패밀리 G 구성원 2)의 서열(들)은 Swiss-Prot 데이터베이스 엔트리 Q9UNQ0(엔트리 버전 120, 서열 버전 3)으로부터 입수될 수 있고; (인간) CD339(단백질 재기드(jagged)-1))의 서열(들)은 Swiss-Prot 데이터베이스 엔트리 P78504(엔트리 버전 129, 서열 버전 3)로부터 입수될 수 있고; (인간) CD340(수용체 티로신 단백질 키나제 erbB-2)의 서열(들)은 Swiss-Prot 데이터베이스 엔트리 P04626(엔트리 버전 162, 서열 버전 1)으로부터 입수될 수 있고; (인간) CD344(프리즐드(Frizzled)-4)의 서열(들)은 Swiss-Prot 데이터베이스 엔트리 Q9ULV1(엔트리 버전 107, 서열 버전 2)로부터 입수될 수 있고; (인간) CD349(프리즐드-9)의 서열(들)은 Swiss-Prot 데이터베이스 엔트리 O00144(엔트리 버전 103, 서열 버전 1)로부터 입수될 수 있고; (인간) CD350(프리즐드-10)의 서열(들)은 Swiss-Prot 데이터베이스 엔트리 Q9ULW2(엔트리 버전 100, 서열 버전 1)로부터 입수될 수 있고; (인간) CD351(고친화성 면역글로불린 알파 및 면역글로불린 뮤 Fc 수용체)의 서열(들)은 Swiss-Prot 데이터베이스 엔트리 Q8WWV6(엔트리 버전 65, 서열 버전 1)으로부터 입수될 수 있고; (인간) CD352(SLAM 패밀리 구성원 6)의 서열(들)은 Swiss-Prot 데이터베이스 엔트리 Q96DU3(엔트리 버전 93, 서열 버전 3)으로부터 입수될 수 있고; (인간) CD353(SLAM 패밀리 구성원 8)의 서열(들)은 Swiss-Prot 데이터베이스 엔트리 Q9P0V8(엔트리 버전 80, 서열 버전 1)로부터 입수될 수 있고; (인간) CD354(골수 세포 상에서 발현된 유발 수용체 1)의 서열(들)은 Swiss-Prot 데이터베이스 엔트리 Q9NP99(엔트리 버전 93, 서열 버전 1)로부터 입수될 수 있고; (인간) CD355(세포독성 및 조절 T 세포 분자)의 서열(들)은 Swiss-Prot 데이터베이스 엔트리 O95727(엔트리 버전 81, 서열 버전 2)로부터 입수될 수 있고; (인간) CD357(종양 괴사 인자 수용체 수퍼패밀리 구성원 18)의 서열(들)은 Swiss-Prot 데이터베이스 엔트리 Q9Y5U5(엔트리 버전 103, 서열 버전 1)로부터 입수될 수 있고; (인간) CD358(종양 괴사 인자 수용체 수퍼패밀리 구성원 21)의 서열(들)은 Swiss-Prot 데이터베이스 엔트리 O75509(엔트리 버전 110, 서열 버전 1)로부터 입수될 수 있고; (인간) CD360(인터류킨-21 수용체)의 서열(들)은 Swiss-Prot 데이터베이스 엔트리 Q9HBE5(엔트리 버전 104, 서열 버전 1)로부터 입수될 수 있고; (인간) CD361(단백질 EVI2B)의 서열(들)은 Swiss-Prot 데이터베이스 엔트리 P34910(엔트리 버전 87, 서열 버전 2)으로부터 입수될 수 있고; (인간) CD362(신데칸-2)의 서열(들)은 Swiss-Prot 데이터베이스 엔트리 P34741(엔트리 버전 105, 서열 버전 2)로부터 입수될 수 있고; (인간) CD363(스핑고신 1-포스페이트 수용체 1)의 서열(들)은 Swiss-Prot 데이터베이스 엔트리 P21453(엔트리 버전 116, 서열 버전 2)으로부터 입수될 수 있고; (인간) 크립틱 패밀리 단백질(크립틱 패밀리 단백질 1-B)의 서열(들)은 Swiss-Prot 데이터베이스 엔트리 P0CG36(엔트리 버전 12, 서열 버전 1)으로부터 입수될 수 있고; (인간) 타이로트로핀(Thyrotropin) 수용체(TSHR)의 서열(들)은 Swiss-Prot 데이터베이스 엔트리 P16473(엔트리 버전 152, 서열 버전 2)으로부터 입수될 수 있고; (인간) 표피 성장인자 수용체(EGFR)의 서열(들)은 Swiss-Prot 데이터베이스 엔트리 P00533(엔트리 버전 178, 서열 버전 2)으로부터 입수될 수 있다.
상기 언급된 바와 같이, 전술된 이중특이적 항체 분자의 (Ig 유래의) 제2 도메인은 종양 세포 상에서 천연적으로 발생하는 세포 표면 분자에 대한 특이성을 갖는 항원 상호작용 부위를 포함할 수 있다.
본원에서 사용된 용어 "종양 세포 상에서 천연적으로 발생하는 세포 표면 분자"는 종양 세포의 표면 상에 제시되는 분자도 의미한다. 용어 "천연적으로 발생하는"은 종양 세포의 표면 상에서 내생적으로 발현되는 분자를 의미한다. 용어 "세포 표면 분자"는 세포의 표면 상에서 (천연적으로/내생적으로) 발현/제시되는 분자를 지칭하고, (Ig 유래의) 결합 도메인, 바람직하게는 항체, 항체 단편 또는 유도체에 (시험관내에서 또는 생체내에서) 접근가능한 도메인 또는 에피토프를 포함한다. 상기 예시된 바와 같이, 상기 Ig 유래의 제2 결합 도메인은 scFv일 수 있다. 상기 세포 표면 분자에 대한 예는 막 및 경막 단백질, 상기 단백질 또는 세포 표면에 적응된 분자 등이다. 따라서, 본 발명의 내용에서 상기 세포 표면 분자는 종양 특이적 마커이다. 본 발명의 내용에서, 상기 종양 특이적 마커는 통상적으로 종양 세포의 표면 상에서 내생적으로 발현되는 마커를 지칭한다.
본 발명과 관련하여, 용어 "종양 특이적 마커"는 종양 세포의 표면 상에서 천연적으로/내생적으로 제시되고/되거나 위치하거나, 편재하여 발현되지만 종양 세포의 표면 상에서 항체, 항체 단편 또는 항체 유도체의 결합을 위해서만 접근될 수 있는 분자를 지칭한다. 본원에서 언급된 "종양 특이적 마커"는 종양 세포 상에서 우세하게 또는 배타적으로 발현된 단백질을 기술한다.
"우세하게"는 정상 체세포보다 종양 상에서 상대적으로 더 높은 발현을 의미하지만, "배타적으로"는 당업자에게 공지된 표준 단백질 검출 수단에 의해 체세포 상에서 발견되지 않는, 종양 세포 상에서의 단백질의 발현을 의미한다. 이들 기준을 충족시키는 단백질은 예를 들면, 당분야에서 잘 공지된 차감공제 또는 차등 발현 스크린에 의해 확인될 수 있다. 종양 세포 특이적 발현이 본 발명의 치료 방법에 의해 활용되기 위해 요구되는 정도는 관심 있는 항원을 발현하는 세포 및 이 항원에 대해 특이적인 T 세포가 함께 항온처리되고 유도된 사멸의 특이성이 측정되는 세포 분석에 의해 평가될 수 있다.
"우세한 발현"은 단백질의 전환율에 영향을 미치는 유전자 증폭, 전사 상향조절 또는 mRNA 안정화 또는 돌연변이에 의해 매개된 단백질 과다발현으로 인해 정상 세포에 비해 종양 세포 상에서 고도로 발현되는 단백질을 지칭한다. "우세한"은 종양 세포뿐만 아니라 정상 세포 상에서도 발현되지만 정상 세포에서 통상적으로 T 세포 또는 항체, 예컨대, 인체의 면역 특화된 영역에 접근될 수 없는 단백질도 정의한다. 추가로, 치료 범위 내에서 종양 세포 상에서 발현되지만 정상 세포 상에서 발현되지 않는 단백질, 예컨대, 배아 발달 동안 배타적으로 발현되는 단백질이 이 정의에 포함된다.
"배타적인 발현"은 치료 과정 동안 종양 세포 상에서만 발견되는 단백질을 지칭한다. 바람직하게는, 이러한 단백질은 세포 표면 상에서 표시되고 정상 세포 상에서 발견되지 않는 점 돌연변이 또는 결실을 그들의 세포외 부분 내에 보유한다. 유사하게, 쉐다제(sheddase)의 종양 특이적 활성으로부터 발생되는 신생 에피토프가 이 부류에 속한다. 배타적 발현은 종양 상에서 배타적으로 발견되지만 정상 세포 상에서는 발견되지 않는 비정상적인 당구조물도 포함한다.
본 발명의 내용에서, 본원에 기재된 이중특이적 항체 분자의 본원에 기재된 제1 결합 도메인 및 본원에 기재된 제2 결합 도메인은 상이한 항원에 결합한다.
종양 세포의 표면 상에서 천연적으로 발생하는 종양 마커의 예는 본원에서 하기 제공되어 있고, EpCAM, HER-1, HER-2, HER-3, CD20, CD22, CD33, CD52, CA-12-5, HLA-DR, MUC-1(뮤신), A33-항원, PSMA(전립선 특이적 막 항원), 트랜스페린 수용체, 테나신(Tenascin) 또는 CA-IX를 포함하나 이들로 한정되지 않는다.
따라서, 본 발명의 내용에서, 본원에 기재된 이중특이적 항체 분자(들)는 EpCAM, HER-1, HER-2, HER-3, CD20, CD22, CD33, CD52, CA-12-5, HLA-DR, MUC-1(뮤신), A33-항원, PSMA(전립선 특이적 막 항원), 트랜스페린 수용체, 테나신 및 CA-IX로 구성된 군으로부터 선택된, 종양 세포의 표면 상에서 천연적으로 발생하는 항원/마커를 포함한다. 본 발명의 내용에서, 본원에 기재된 이중특이적 항체 분자(들)는 EpCAM, HER-1, HER-2, HER-3, CD20, CD22, CD33, CD52, CA-12-5, HLA-DR, MUC-1(뮤신), A33-항원, PSMA(전립선 특이적 막 항원), 트랜스페린 수용체, 테나신 및 CA-IX로 구성된 군으로부터 선택된, 종양 세포의 표면 상에서 내생적으로 발현되는 항원/마커를 포함한다.
EpCAM, HER-1, HER-2, HER-3, CD20, CD22, CD33, CD52, CA-12-5, HLA-DR, MUC-1(뮤신), A33-항원, PSMA(전립선 특이적 막 항원), 트랜스페린 수용체, 테나신 또는 CA-IX의 (인간) 구성원의 서열(들)은 UniProtKB/Swiss-Prot 데이터베이스에서 입수될 수 있고 웹사이트(http://www.uniprot.org/uniprot/?query=reviewed%3Ayes)로부터 검색될 수 있다. 이들 (단백질) 서열들은 해석된 변경된 서열들과도 관련되어 있다. 본 발명은 본원에서 제공된 간결한 서열의 상동성 서열 및 유전적 대립형질 변이체 등이 사용되는 기법 및 방법도 제공한다. 바람직하게는, 본원의 간결한 서열의 이러한 "변이체" 등이 사용된다. 바람직하게는, 이러한 "변이체"는 유전적 변이체이다. 당업자는 게놈 DNA뿐만 아니라 mRNA/cDNA의 엔트리도 포함할 수 있는 이들 데이터뱅크 엔트리에서 이들 (단백질) 서열의 관련 코딩 영역을 용이하게 유추할 수 있다.
(인간) EpCAM(상피 세포 부착 분자)의 서열(들)은 Swiss-Prot 데이터베이스 엔트리 P16422(엔트리 버전 117, 서열 버전 2)로부터 입수될 수 있고; (인간) HER-1(표피 성장인자 수용체)의 서열(들)은 Swiss-Prot 데이터베이스 엔트리 P00533(엔트리 버전 177, 서열 버전 2)으로부터 입수될 수 있고; (인간) HER-2(수용체 티로신 단백질 키나제 erbB-2)의 서열(들)은 Swiss-Prot 데이터베이스 엔트리 P04626(엔트리 버전 161, 서열 버전 1)으로부터 입수될 수 있고; (인간) HER-3(수용체 티로신 단백질 키나제 erbB-3)의 서열(들)은 Swiss-Prot 데이터베이스 엔트리 P21860(엔트리 버전 140, 서열 버전 1)으로부터 입수될 수 있고; (인간) CD20(B 림프구 항원 CD20)의 서열(들)은 Swiss-Prot 데이터베이스 엔트리 P11836(엔트리 버전 117, 서열 버전 1)으로부터 입수될 수 있고; (인간) CD22(B 림프구 항원 CD22)의 서열(들)은 Swiss-Prot 데이터베이스 엔트리 P20273(엔트리 버전 135, 서열 버전 2)으로부터 입수될 수 있고; (인간) CD33(B 림프구 항원 CD33)의 서열(들)은 Swiss-Prot 데이터베이스 엔트리 P20138(엔트리 버전 129, 서열 버전 2)로부터 입수될 수 있고; (인간) CA-12-5(뮤신 16)의 서열(들)은 Swiss-Prot 데이터베이스 엔트리 Q8WXI7(엔트리 버전 66, 서열 버전 2)로부터 입수될 수 있고; (인간) HLA-DR의 서열(들)은 Swiss-Prot 데이터베이스 엔트리 Q29900(엔트리 버전 59, 서열 버전 1)으로부터 입수될 수 있고; (인간) MUC-1(뮤신-1)의 서열(들)은 Swiss-Prot 데이터베이스 엔트리 P15941(엔트리 버전 135, 서열 버전 3)로부터 입수될 수 있고; (인간) A33(세포 표면 A33 항원)의 서열(들)은 Swiss-Prot 데이터베이스 엔트리 Q99795(엔트리 버전 104, 서열 버전 1)로부터 입수될 수 있고; (인간) PSMA(글루타메이트 카복시펩티다제 2)의 서열(들)은 Swiss-Prot 데이터베이스 엔트리 Q04609(엔트리 버전 133, 서열 버전 1)로부터 입수될 수 있고; (인간) 트랜스페린 수용체의 서열(들)은 Swiss-Prot 데이터베이스 엔트리 Q9UP52(엔트리 버전 99, 서열 버전 1) 및 P02786(엔트리 버전 152, 서열 버전 2)으로부터 입수될 수 있고; (인간) 테나신의 서열(들)은 Swiss-Prot 데이터베이스 엔트리 P24821(엔트리 버전 141, 서열 버전 3)로부터 입수될 수 있고; (인간) CA-IX(탄산 안하이드라제(carbonic anhydrase) 9)의 서열(들)은 Swiss-Prot 데이터베이스 엔트리 Q16790(엔트리 버전 115, 서열 버전 2)으로부터 입수될 수 있다.
본 발명의 내용에서, (인간) cripto에 결합하는/(인간) cripto에 대해 유도된/(인간) cripto와 상호작용하는 제1 결합 도메인, 및 (인간) EpCAM에 결합하는/(인간) EpCAM에 대해 유도된/(인간) EpCAM과 상호작용하는 제2 결합 도메인을 포함하는 이중특이적 항체가 기재되어 있다.
본원에서 제공된 분자 또는 구축물(즉, 본원에 기재된 이중특이적 항체 분자)은 의료 현장에서 특히 유용하다. 예를 들면, 악성 질환이 본원에 기재된 이중특이적 구축물로 치료될 수 있다. 본 발명의 내용에서, 악성 질환은 상피, 내피 또는 중피 유래의 암/암종, 또는 혈액암일 수 있다. 본 발명의 내용에서, 암/암종은 위장암, 췌장암, 담관세포암, 폐암, 유방암, 난소암, 피부암, 구강암, 위암, 자궁경부암, B 세포 및 T 세포 림프종, 골수성 백혈병, 난소암, 백혈병, 림프성 백혈병, 비인두암종, 결장암, 전립선암, 신장세포암, 두경부암, 피부암(흑색종), 비뇨생식관암, 예를 들면, 정소암, 난소암, 내피암, 자궁암 및 신장암, 담관암, 식도암, 타액선암 및 갑상선암, 및 다른 종양성 질환, 예컨대, 혈액 종양, 신경아교종, 육종 및 골육종으로 구성된 군으로부터 선택된다.
본원에서 제공된 분자 또는 구축물(즉, 본원에 기재된 이중특이적 항체 분자)은 의료 현장에서 특히 유용하다. 예를 들면, 종양성 질환 및/또는 림프종이 이들 의학 징후(들)에 대해 유도된 이중특이적 구축물로 치료될 수 있다. 이중특이적 항체(분자)로 치료될 수 있는 징후는 종양 항원의 발현에 의해 제공된다. 독립체로 발현된 종양 항원은 (종양 세포의 표면 상에서 천연적으로 발생하는/내생적으로 발현되는 항원을 대표하는) 임의의 상기 언급된 T 세포 마커와 사실상 조합될 수 있다. 예를 들며, 위장암, 췌장암, 담관세포암, 폐암, 유방암, 난소암, 피부암 및/또는 구강암이 (종양 세포의 표면 상에서 천연적으로 발생하는 종양 특이적 항원인) (인간) EpCAM에 대해 유도된 제2 결합 도메인, 및 T 세포(CD8+ T 세포) 내에서 및/또는 상에서 천연적으로 발생하지 않는 본원에서 정의된 항원들 중 한 항원에 대해 유도된/이러한 항원에 결합하는/이러한 항원과 상호작용하는 제1 결합 도메인을 포함하는 이중특이적 분자 또는 구축물(즉, 본원에 기재된 이중특이적 항체 분자)로 치료될 수 있다. 따라서, 본 발명의 내용에서, (인간) EpCAM에 대해 유도된 결합 도메인을 (제2 결합 도메인으로서) 포함하고 cripto에 대해 유도된/cripto에 결합하는/cripto와 상호작용하는 제1 결합 도메인을 포함하는 이중특이적 항체 구축물은 위장암, 예를 들면, 위장 유래의 선암종의 치료에 사용될 수 있다. 위장암, 췌장암, 담관세포암, 폐암, 유방암, 난소암, 피부암 및/또는 구강암이 (종양 세포의 표면 상에서 천연적으로 발생하는 종양 특이적 항원인) (인간) HER1에 대해 유도된 제2 결합 도메인, 및 T 세포(CD8+ T 세포) 내에서 및/또는 상에서 천연적으로 발생하지 않는 본원에서 정의된 항원들 중 한 항원에 대해 유도된/이러한 항원에 결합하는/이러한 항원과 상호작용하는 제1 결합 도메인을 포함하는 이중특이적 분자 또는 구축물(즉, 본원에 기재된 이중특이적 항체 분자)로 치료될 수 있다. 위암, 유방암 및/또는 자궁경부암이 (종양 세포의 표면 상에서 천연적으로 발생하는 종양 특이적 항원인) (인간) HER2에 대해 유도된 제2 결합 도메인, 및 T 세포(CD8+ T 세포) 내에서 및/또는 상에서 천연적으로 발생하지 않는 본원에서 정의된 항원들 중 한 항원에 대해 유도된/이러한 항원에 결합하는/이러한 항원과 상호작용하는 제1 결합 도메인을 포함하는 이중특이적 분자 또는 구축물(즉, 본원에 기재된 이중특이적 항체 분자)로 치료될 수 있다. 위암 및/또는 폐암이 (종양 세포의 표면 상에서 천연적으로 발생하는 종양 특이적 항원인) (인간) HER3에 대해 유도된 제2 결합 도메인, 및 T 세포(CD8+ T 세포) 내에서 및/또는 상에서 천연적으로 발생하지 않는 본원에서 정의된 항원들 중 한 항원에 대해 유도된/이러한 항원에 결합하는/이러한 항원과 상호작용하는 제1 결합 도메인을 포함하는 이중특이적 분자 또는 구축물(즉, 본원에 기재된 이중특이적 항체 분자)로 치료될 수 있다. B 세포 림프종 및/또는 T 세포 림프종이 (종양 세포의 표면 상에서 천연적으로 발생하는 종양 특이적 항원인) (인간) CD20에 대해 유도된 제2 결합 도메인, 및 T 세포(CD8+ T 세포) 내에서 및/또는 상에서 천연적으로 발생하지 않는 본원에서 정의된 항원들 중 한 항원에 대해 유도된/이러한 항원에 결합하는/이러한 항원과 상호작용하는 제1 결합 도메인을 포함하는 이중특이적 분자 또는 구축물(즉, 본원에 기재된 이중특이적 항체 분자)로 치료될 수 있다. B 세포 림프종 및/또는 T 세포 림프종이 (종양 세포의 표면 상에서 천연적으로 발생하는 종양 특이적 항원인) (인간) CD22에 대해 유도된 제2 결합 도메인, 및 T 세포(CD8+ T 세포) 내에서 및/또는 상에서 천연적으로 발생하지 않는 본원에서 정의된 항원들 중 한 항원에 대해 유도된/이러한 항원에 결합하는/이러한 항원과 상호작용하는 제1 결합 도메인을 포함하는 이중특이적 분자 또는 구축물(즉, 본원에 기재된 이중특이적 항체 분자)로 치료될 수 있다. 골수성 백혈병이 (종양 세포의 표면 상에서 천연적으로 발생하는 종양 특이적 항원인) (인간) CD33에 대해 유도된 제2 결합 도메인, 및 T 세포(CD8+ T 세포) 내에서 및/또는 상에서 천연적으로 발생하지 않는 본원에서 정의된 항원들 중 한 항원에 대해 유도된/이러한 항원에 결합하는/이러한 항원과 상호작용하는 제1 결합 도메인을 포함하는 이중특이적 구축물로 치료될 수 있다. 난소암, 폐암, 유방암 및/또는 위장암이 (종양 세포의 표면 상에서 천연적으로 발생하는 종양 특이적 항원인) (인간) CA12-5에 대해 유도된 제2 결합 도메인, 및 T 세포(CD8+ T 세포) 내에서 및/또는 상에서 천연적으로 발생하지 않는 본원에서 정의된 항원들 중 한 항원에 대해 유도된/이러한 항원에 결합하는/이러한 항원과 상호작용하는 제1 결합 도메인을 포함하는 이중특이적 분자 또는 구축물(즉, 본원에 기재된 이중특이적 항체 분자)로 치료될 수 있다. 위장암, 백혈병 및/또는 비인두암종이 (종양 세포의 표면 상에서 천연적으로 발생하는 종양 특이적 항원인) (인간) HLA-DR에 대해 유도된 제2 결합 도메인, 및 T 세포(CD8+ T 세포) 내에서 및/또는 상에서 천연적으로 발생하지 않는 본원에서 정의된 항원들 중 한 항원에 대해 유도된/이러한 항원에 결합하는/이러한 항원과 상호작용하는 제1 결합 도메인을 포함하는 이중특이적 분자 또는 구축물(즉, 본원에 기재된 이중특이적 항체 분자)로 치료될 수 있다. 결장암, 유방암, 난소암, 폐암 및/또는 췌장암이 (종양 세포의 표면 상에서 천연적으로 발생하는 종양 특이적 항원인) (인간) MUC-1에 대해 유도된 제2 결합 도메인, 및 T 세포(CD8+ T 세포) 내에서 및/또는 상에서 천연적으로 발생하지 않는 본원에서 정의된 항원들 중 한 항원에 대해 유도된/이러한 항원에 결합하는/이러한 항원과 상호작용하는 제1 결합 도메인을 포함하는 이중특이적 분자 또는 구축물(즉, 본원에 기재된 이중특이적 항체 분자)로 치료될 수 있다. 결장암이 (종양 세포의 표면 상에서 천연적으로 발생하는 종양 특이적 항원인) (인간) A33에 대해 유도된 제2 결합 도메인, 및 T 세포(CD8+ T 세포) 내에서 및/또는 상에서 천연적으로 발생하지 않는 본원에서 정의된 항원들 중 한 항원에 대해 유도된/이러한 항원에 결합하는/이러한 항원과 상호작용하는 제1 결합 도메인을 포함하는 이중특이적 분자 또는 구축물(즉, 본원에 기재된 이중특이적 항체 분자)로 치료될 수 있다. 전립선암이 (종양 세포의 표면 상에서 천연적으로 발생하는 종양 특이적 항원인) (인간) PSMA에 대해 유도된 제2 결합 도메인, 및 T 세포(CD8+ T 세포) 내에서 및/또는 상에서 천연적으로 발생하지 않는 본원에서 정의된 항원들 중 한 항원에 대해 유도된/이러한 항원에 결합하는/이러한 항원과 상호작용하는 제1 결합 도메인을 포함하는 이중특이적 분자 또는 구축물(즉, 본원에 기재된 이중특이적 항체 분자)로 치료될 수 있다. 위장암, 췌장암, 담관세포암, 폐암, 유방암, 난소암, 피부암 및/또는 구강암이 (종양 세포의 표면 상에서 천연적으로 발생하는 종양 특이적 항원인) (인간) 트랜스페린 수용체에 대해 유도된 제2 결합 도메인, 및 T 세포(CD8+ T 세포) 내에서 및/또는 상에서 천연적으로 발생하지 않는 본원에서 정의된 항원들 중 한 항원에 대해 유도된/이러한 항원에 결합하는/이러한 항원과 상호작용하는 제1 결합 도메인을 포함하는 이중특이적 분자 또는 구축물(즉, 본원에 기재된 이중특이적 항체 분자)로 치료될 수 있다. 췌장암, 폐암 및/또는 유방암이 (종양 세포의 표면 상에서 천연적으로 발생하는 종양 특이적 항원인) (인간) 트랜스페린 수용체에 대해 유도된 제2 결합 도메인, 및 T 세포(CD8+ T 세포) 내에서 및/또는 상에서 천연적으로 발생하지 않는 본원에서 정의된 항원들 중 한 항원에 대해 유도된/이러한 항원에 결합하는/이러한 항원과 상호작용하는 제1 결합 도메인을 포함하는 이중특이적 분자 또는 구축물(즉, 본원에 기재된 이중특이적 항체 분자)로 치료될 수 있다. 신장암이 (종양 세포의 표면 상에서 천연적으로 발생하는 종양 특이적 항원인) (인간) CA-IX에 대해 유도된 제2 결합 도메인, 및 T 세포(CD8+ T 세포) 내에서 및/또는 상에서 천연적으로 발생하지 않는 본원에서 정의된 항원들 중 한 항원에 대해 유도된/이러한 항원에 결합하는/이러한 항원과 상호작용하는 제1 결합 도메인을 포함하는 이중특이적 분자 또는 구축물(즉, 본원에 기재된 이중특이적 항체 분자)로 치료될 수 있다.
첨부된 실시예에도 예시되어 있는 바와 같이, 본 발명의 개념의 증거로서, 본 발명의 특정 이중특이적 항체 분자는 (인간) EGFR에 결합하는/(인간) EGFR에 대해 유도된/(인간) EGFR과 상호작용하는 상기 정의된 (Ig 유래의) 제1 결합 도메인, 및 (인간) EpCAM에 결합하는/(인간) EpCAM에 대해 유도된/(인간) EpCAM과 상호작용하는 (Ig 유래의) 제2 도메인을 포함한다.
상피 세포 부착 분자(17-1A 항원, KSA, EGP40, GA733-2, ks1-4 또는 esa로도 지칭되는 EpCAM)는 특정 상피 내에서 및 다수의 인간 암종 상에서 특이적으로 발현되는 314개 아미노산들로 구성된 40 kDa 막 일체형 당단백질이다(문헌(Balzar, J. Mol. Med. (1999), 77, 699-712)에서 검토됨). EpCAM은 발견된 후 뮤린 단일클론 항체 17-1A/에드레콜로맙에 의한 그의 인식을 통해 클로닝되었다(Goettlinger, Int J Cancer 38 (1986), 47-53 and Simon, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87 (1990), 2755-2759). EpCAM은 배향되고 고도로 정렬된 방식으로 상피 세포를 부착하는 데에 기여한다(Litvinov. J Cell Biol. 139 (1997), 1337-1348). 상피 세포의 악성 형질전환 시, 신속히 생장하는 종양 세포는 상피의 고도 세포 정렬을 포기한다. 결과적으로, EpCAM의 표면 분포는 덜 제한되게 되고, 상기 분자는 종양 세포 상에 더 잘 노출되어 종양 세포의 표면 상에서 항체, 항체 단편 또는 항체 유도체의 결합을 위해 더 잘 접근될 수 있게 된다. 대다수의 암종의 종양 세포들은 상피 세포로부터 유래하기 때문에 그들의 표면 상에서 EpCAM을 여전히 발현한다.
생체내에서 EpCAM의 발현은 증가된 상피 증식과 관련되어 있고 세포 분화와 음의 상관관계를 갖는다(검토를 위해서는 문헌(Balzar, J. Mol. Med. 77 (1999), 699-712) 참조). EpCAM의 발현은 모든 주요 암종들에서 본질적으로 관찰된다(문헌(Balzar, J. Mol. Med. 77 (1999), 699-712)에서 검토되어 있고, 특히 문헌(De Bree, Nucl Med Commun. 15 (1994), 613-27) 및 문헌(Zhang, Clin Cancer Res. 4 (1998), 295-302)에 기재되어 있음). EpCAM은 그의 널리 분포된 발현 때문에 "범-암종" 항원으로서 지칭된다. 많은 경우, 종양 세포는 그들의 모 상피 또는 상기 암들의 덜 공격적인 형태보다 훨씬 더 높은 정도로 EpCAM을 발현한다는 것이 관찰되었다. 예를 들면, 증가된 EpCAM 발현은 전립선암의 발달에 있어서 초기 사건을 대표한다(Poczatek. J. Urol. 162 (1999), 1462-1644). 추가로, 자궁경부의 대다수 편평세포암종 및 선암종 둘다에서 강한 EpCAM 발현은 증가된 증식, 및 말기 분화를 위한 마커의 사라짐과 상관관계를 갖는다(Litvinov, Am. J. Pathol. 148 (1996), 865-75). 유방암에서, 종양 세포 상에서의 EpCAM의 과다발현은 생존의 예측자이다(Gastl, Lancet 356 (2000), 1981-1982). EpCAM은 머리, 목 및 폐의 편평세포암종을 앓고 있는 환자에서 산재된 종양 세포의 검출을 위한 마커이다(Chaubal, Anticancer Res. 19 (1999), 2237-2242 and Piyathilake, Hum. Pathol. 31 (2000), 482-487). 표피, 구강, 후두개, 인두, 후두 및 식도에서 발견되는 정상 편평 상피는 EpCAM을 유의하게 발현하지 않았다(Quak, Hybridoma 9 (1990), 377-387). EpCAM은 대다수의 일차, 전이성 및 산재성 NSCLC(비-소세포 폐암 세포(Passlick, Int J Cancer 87 (2000), 548-552)), 위 및 위식도 연접부 선암종(Martin, J. Clin. Pathol. 52 (1999), 701-4), 및 결장직장암종, 췌장암종 및 유방암종으로부터 유래된 세포주(Szala, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87 (1990), 3542-6 and Packeisen, Hybridoma 18 (1999), 37-40)에서 발현되는 것으로 밝혀졌다.
첨부된 실시예에 예시적으로 제시된 바와 같이, 본 발명의 개념의 증거로서, (인간) 항-EGFR 항체는 이중특이적 구축물 MAb225_scFv_G8.8을 형성하기 위해 (뮤린) 항-EpCAM(G8.8)과 조합되었다. (인간) 항-EGFR 항체의 경쇄의 아미노산 서열은 하기 제시되어 있다(서열번호 1로 지칭됨):
Figure pct00001
(인간) 항-EGFR 항체의 중쇄의 아미노산 서열은 하기 제시되어 있다(서열번호 2로 지칭됨):
Figure pct00002
(뮤린) 항-EpCAM(G8.8) 항체의 경쇄의 아미노산 서열은 하기 제시되어 있다(서열번호 3으로 지칭됨):
Figure pct00003
Figure pct00004
(뮤린) 항-EpCAM(G8.8) 항체의 중쇄의 아미노산 서열은 하기 제시되어 있다(서열번호 4로 지칭됨):
Figure pct00005
이중특이적 생성물(MAb225_scFv_G8.8)의 경쇄의 아미노산 서열은 하기 제시되어 있다(서열번호 5로 지칭됨):
Figure pct00006
이중특이적 생성물(MAb225_scFv_G8.8)의 중쇄의 아미노산 서열은 하기 제시되어 있다(서열번호 6으로 지칭됨):
Figure pct00007
나아가, 도 20 및 21에 예시된 바와 같이, 본 발명의 개념의 (추가) 증거로서, 한 아암 상에서 del-(인간) hEGFRvIII에 대한 항원 결합 부위 및 다른 아암 상에서 (뮤린) EpCAM에 대한 항원 결합 부위를 갖는 이중특이적 항체(BiAb) "BsAb EpCAM-EGFRvIII, MR1.1"을 구축하였다(실시예 4 참조). 이중특이적 생성물(BsAb EpCAM-EGFRvIII, MR1.1)의 경쇄의 아미노산 서열은 도 23의 A에 제시되어 있다(서열번호 15로 지칭됨). 이중특이적 생성물(BsAb EpCAM-EGFRvIII, MR1.1)의 중쇄의 아미노산 서열은 도 23의 B에 제시되어 있다(서열번호 16으로 지칭됨).
본 발명은 본 발명의 이중특이적 항체 분자를 코딩하는 핵산 서열도 제공한다.
조절 서열이 본 발명의 핵산 분자에 추가될 수 있다는 것은 당업자에게 자명하다. 예를 들면, 프로모터, 전사 인핸서, 및/또는 본 발명의 폴리뉴클레오티드의 유도된 발현을 가능하게 하는 서열이 사용될 수 있다. 적합한 유도성 시스템은 예를 들면, 문헌(Gossen and Bujard Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89 (1992), 5547-5551) 및 문헌(Gossen et al. Trends Biotech. 12 (1994), 58-62)에 기재된 테트라사이클린 조절 유전자 발현 시스템, 또는 예를 들면, 문헌(Crook EMBO J. 8 (1989), 513-519)에 기재된 덱사메타손 유도성 유전자 발현 시스템이다.
나아가, 핵산 분자가 예를 들면, 티오에스터 결합 및/또는 뉴클레오티드 유사체를 함유할 수 있다는 것이 추가 목적을 위해 예상된다. 상기 변경은 세포 내의 엔도뉴클레아제 및/또는 엑소뉴클레아제에 대한 핵산 분자의 안정화에 유용할 수 있다. 상기 핵산 분자는 세포 내에서의 상기 핵산 분자의 전사를 가능하게 하는 키메라 유전자를 함유하는 적절한 벡터에 의해 전사될 수 있다. 이와 관련하여, 이러한 폴리뉴클레오티드가 "유전자 표적화" 또는 "유전자 치료" 방법을 위해 사용될 수도 있다고 생각된다. 또 다른 실시양태에서, 상기 핵산 분자는 표지된다. 핵산의 검출 방법, 예를 들면, 서던 및 노던 블롯팅, PCR 또는 프라이머 연장이 당분야에서 잘 공지되어 있다. 이 실시양태는 유전자 치료 방법 동안 전술된 핵산 분자의 성공적인 도입을 입증하는 스크리닝 방법에 유용할 수 있다.
상기 핵산 분자(들)는 전술된 핵산 분자들 중 임의의 핵산 분자를 단독으로 또는 조합으로 포함하는 재조합적으로 제조된 키메라 핵산 분자일 수 있다. 본 발명의 내용에서, 핵산 분자는 벡터의 부분이다.
따라서, 본 발명은 본 발명에서 기재된 핵산 분자를 포함하는 벡터에 관한 것이기도 하다.
많은 적합한 벡터들이 분자생물학 분야의 당업자에게 공지되어 있고, 이들의 선택은 원하는 기능에 의해 좌우될 것이고 플라스미드, 코스미드, 바이러스, 박테리오파지, 및 유전공학에서 통상적으로 사용되는 다른 벡터를 포함한다. 당업자에게 잘 공지된 방법, 예를 들면, 문헌(Sambrook el al. (인용 문헌)) 및 문헌(Ausubel. Current Protocols in Molecular Biology, Green Publishing Associates and Wiley Interscience, N.Y. (1989), (1994))에 기재된 기법을 이용하여 다양한 플라스미드들 및 벡터들을 구축할 수 있다. 대안적으로, 본 발명의 폴리뉴클레오티드 및 벡터는 표적 세포로의 전달을 위해 리포좀으로 재구성될 수 있다. 하기에 더 상세히 논의된 바와 같이, 클로닝 벡터를 사용하여 DNA의 개별 서열들을 단리하였다. 관련 서열을 특정 폴리펩티드의 발현이 요구되는 발현 벡터 내로 전달할 수 있다. 전형적인 클로닝 벡터는 pBluescript SK, pGEM, pUC9, pBR322, pGA18 및 pGBT9를 포함한다.
전형적인 발현 벡터는 pTRE, pCAL-n-EK, pESP-1 및 pOP13CAT를 포함한다.
또한, 본 발명은 본원에서 정의된 이중특이적 항체 구축물(분자)을 코딩하는 핵산 분자에 작동가능하게 연결된 조절 서열인 핵산 서열을 포함하는 벡터에 관한 것이다.
이러한 조절 서열(조절 요소)은 당업자에게 공지되어 있고, 프로모터, 스플라이스 카세트, 번역 개시 코돈, 벡터 내로의 삽입물의 도입을 위한 번역 및 삽입 부위를 포함할 수 있다. 본 발명의 내용에서, 상기 핵산 분자는 진핵 세포 또는 원핵 세포에서의 발현을 가능하게 하는 상기 발현 조절 서열에 작동가능하게 연결된다.
상기 벡터가 본원에서 정의된 이중특이적 항체 구축물(분자)을 코딩하는 핵산 분자를 포함하는 발현 벡터라는 것이 예상된다.
용어 "조절 서열"은 그들이 결찰되어 있는 코딩 서열의 발현을 달성하는 데에 필수적인 DNA 서열을 지칭한다. 이러한 조절 서열의 성질은 숙주 유기체에 따라 상이하다. 원핵생물에서, 조절 서열은 일반적으로 프로모터, 리보좀 결합 부위 및 종결요소를 포함한다. 진핵생물에서 일반적으로 조절 서열은 프로모터, 종결요소 및 일부 경우 인핸서, 트랜스활성화제 또는 전사 인자를 포함한다. 용어 "조절 서열"은 최소한 그의 존재가 발현을 위해 필요한 모든 성분들을 포함하기 위한 것이고 추가 유리한 성분도 포함할 수 있다.
용어 "작동가능하게 연결된"은 이처럼 기재된 성분들이 그들의 의도된 방식으로 그들을 작용할 수 있게 하는 관계로 존재하는 병렬을 지칭한다. 코딩 서열에 "작동가능하게 연결된" 조절 서열은 코딩 서열의 발현이 조절 서열과 상용가능한 조건 하에서 달성되는 방식으로 결찰된다. 조절 서열이 프로모터인 경우, 이중 가닥 핵산이 바람직하게 사용된다는 것은 당업자에게 자명하다.
본 발명의 내용에서, 언급된 벡터는 발현 벡터이다. "발현 벡터"는 선택된 숙주를 형질전환시키는 데에 사용될 수 있고 선택된 숙주에서의 코딩 서열의 발현을 제공하는 구축물이다. 발현 벡터는 예를 들면, 클로닝 벡터, 이원 벡터 또는 삽입 벡터일 수 있다. 발현은 바람직하게는 번역가능한 mRNA로의 핵산 분자의 전사를 포함한다. 원핵 세포 및/또는 진핵 세포에서의 발현을 보장하는 조절 요소는 당업자에게 잘 공지되어 있다. 진핵 세포의 경우, 조절 요소는 통상적으로 전사의 개시를 보장하는 프로모터, 및 임의적으로 전사체의 전사 종결 및 안정화를 보장하는 폴리-A 신호를 포함한다. 원핵 숙주 세포에서의 발현을 허용하는 가능한 조절 요소는 예를 들면, 에셔리키아 콜라이 내의 PL, lac, trp 또는 tac 프로모터를 포함하고, 진핵 숙주 세포에서의 발현을 허용하는 조절 요소의 예는 효모 내의 AOX1 또는 GAL1 프로모터, 또는 포유동물 및 다른 동물 세포 내의 CMV 프로모터, SV40 프로모터, RSV(라우스 육종 바이러스) 프로모터, CMV 인핸서, SV40 인핸서 또는 글로빈 인트론이다.
이러한 조절 요소는 전사의 개시를 담당하는 요소들 이외에 폴리뉴클레오티드의 하류에 위치하는 전사 종결 신호, 예컨대, SV40-폴리-A 부위 또는 tk-폴리-A 부위도 포함할 수 있다. 나아가, 사용된 발현 시스템에 따라, 폴리펩티드를 세포 구획으로 향하게 할 수 있거나 배지 내로 분비할 수 있는 리더 서열이 언급된 핵산 서열의 코딩 서열에 추가될 수 있고 당분야에서 잘 공지되어 있다(예를 들면, 첨부된 실시예도 참조).
리더 서열(들)은 번역, 개시 및 종결 서열과 적절한 상(phase)으로 조립되고, 바람직하게는 리더 서열은 원형질막주위공간 또는 세포외 배지 내로의 번역된 단백질 또는 이의 부분의 분비를 유도할 수 있다. 임의적으로, 이종 서열은 발현된 재조합 생성물의 원하는 특징, 예를 들면, 안정화 또는 단순화된 정제를 부여하는 N-말단 확인 펩티드를 포함하는 융합 단백질을 코딩할 수 있다(상기 참조). 이와 관련하여, 적합한 발현 벡터, 예컨대, 오카야마-베르그(Okayama-Berg) cDNA 발현 벡터 pcDV1(파마시아(Pharmacia)), pCDM8, pRc/CMV, pcDNA1, pcDNA3(인비트로겐(In-vitrogen)), pEF-DHFR, pEF-ADA 또는 pEF-neo(Raum et al. Cancer Immunol Immunother 50 (2001), 141-150) 또는 pSPORT1(깁코 비알엘(GIBCO BRL))이 당분야에서 공지되어 있다.
본 발명의 내용에서, 발현 조절 서열은 진핵 숙주 세포를 형질전환시킬 수 있거나 형질감염시킬 수 있는 벡터 내의 진핵 프로모터 시스템일 것이지만, 원핵 숙주를 위한 조절 서열도 사용될 수 있다. 일단 벡터가 적절한 숙주 내로 도입되면, 숙주는 뉴클레오티드 서열의 고도 발현에 적합한 조건 하에서 유지되고, 원하는 경우 본 발명의 폴리펩티드의 수집 및 정제가 후속적으로 수행될 수 있다(예를 들면, 첨부된 실시예 참조).
세포 주기 상호작용 단백질을 발현하는 데에 사용될 수 있는 대안적인 발현 시스템은 곤충 시스템이다. 한 이러한 시스템에서, 오토그라파 캘리포르니카(Autographa californica) 핵 폴리헤드로시스 바이러스(AcNPV)가 스포도프테라 프루기페르다(Spodoptera frugiperda) 세포 또는 트라이코플루시아 라바(Trichoplusia larvae)에서 외래 유전자를 발현하기 위한 벡터로서 사용된다. 언급된 핵산 분자의 코딩 서열은 바이러스의 비-필수 영역, 예컨대, 폴리헤드린 유전자 내로 클로닝될 수 있고 폴리헤드린 프로모터의 조절 하에 놓일 수 있다. 상기 코딩 서열의 성공적인 삽입은 폴리헤드린 유전자를 불활성 상태로 만들 것이고 코트 단백질 코트를 결여하는 재조합 바이러스를 생성할 것이다. 그 다음, 상기 재조합 바이러스는 본 발명의 단백질이 발현되는 스포도프테라 프루기페르다 세포 또는 트라이코플루시아 라바를 감염시키는 데에 사용된다(Smith, J. Virol. 46 (1983), 584; Engelhard. Proc. Nat. Acad. Sci. USA 91 (1994), 3224-3227).
추가 조절 요소는 전사 인핸서뿐만 아니라 번역 인핸서도 포함할 수 있다. 유리하게는, 본 발명의 전술된 벡터들은 선별가능한 및/또는 점수화가능한 마커를 포함한다.
형질전환된 세포 및 예를 들면, 식물 조직 및 식물의 선별에 유용한 선별가능한 마커 유전자는 당업자에게 잘 공지되어 있고, 예를 들면, 메토트렉세이트에 대한 내성을 부여하는 dhfr에 대한 선별의 근거로서 항대사물질 내성(Reiss, Plant Physiol. (Life Sci. Adv.) 13 (1994), 143-149), 아미노글리코사이드 네오마이신, 카나마이신 및 파로마이신에 대한 내성을 부여하는 npt(Herrera-Estrella, EMBO J. 2 (1983), 987-995), 및 하이그로마이신에 대한 내성을 부여하는 hygro(Marsh, Gene 32 (1984), 481-485)를 포함한다. 추가 선별가능한 유전자, 즉 세포가 트립토판 대신에 인돌을 사용할 수 있게 하는 trpB; 세포가 히스티딘 대신에 히스티놀을 사용할 수 있게 하는 hisD(Hartman, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85 (1988), 8047); 세포가 만노스를 사용할 수 있게 하는 만노스-6-포스페이트 이소머라제(국제 특허출원 공개 제WO 94/20627호), 및 오르니틴 데카복실라제 억제제인 2-(다이플루오로메틸)-DL-오르니틴(DFMO)에 대한 내성을 부여하는 ODC(오르니틴 데카복실라제)(McConlogue, 1987, In: Current Communications in Molecular Biology, Cold Spring Harbor Laboratory ed.); 또는 블라스티시딘(Blasticidin) S에 대한 내성을 부여하는 아스퍼길러스 테레우스(Aspergillus terreus)로부터의 데아미나제(Tamura, Biosci. Biotechnol. Biochem. 59 (1995), 2336-2338)가 기재되어 있다.
유용한 점수화가능한 마커도 당업자에게 공지되어 있고 상업적으로 입수될 수 있다. 유리하게는, 상기 마커는 루시퍼라제(Giacomin, Pl. Sci. 116 (1996), 59-72; Scikantha, J. Bact. 178 (1996), 121), 녹색 형광 단백질(Gerdes, FEBS Lett. 389 (1996), 44-47) 또는 β-글루쿠로니다제(Jefferson, EMBO J. 6 (1987), 3901-3907)를 코딩하는 유전자이다. 이 실시양태는 언급된 벡터를 함유하는 세포, 조직 및 유기체의 단순하고 신속한 스크리닝에 특히 유용하다.
전술된 바와 같이, 언급된 핵산 분자는 바람직하게는 형질도입된 CD8+ T 세포와 함께 예를 들면, 정제뿐만 아니라 유전자 치료 목적을 위해 코딩된 이중특이적 구축물을 세포 내에서 발현하는 데에 단독으로 또는 벡터의 부분으로서 사용될 수 있다. 전술된 이중특이적 구축물들 중 어느 하나를 코딩하는 DNA 서열(들)을 함유하는 핵산 분자 또는 벡터는 세포 내로 도입되고, 그 후 상기 세포는 관심 있는 폴리펩티드를 생성한다. 생체외 또는 생체내 기법에 의한 세포 내로의 치료 유전자의 도입에 근거한 유전자 치료는 유전자 전달의 가장 중요한 적용 중 하나이다. 시험관내 또는 생체내 유전자 치료를 위한 방법 또는 유전자 전달 시스템에 적합한 벡터, 방법 또는 유전자 전달 시스템은 문헌에 기재되어 있고 당업자에게 공지되어 있다(예를 들면, 문헌(Giordano, Nature Medicine 2 (1996), 534-539); 문헌(Schaper, Circ. Res. 79 (1996), 911-919); 문헌(Anderson, Science 256 (1992), 808-813); 문헌(Verma, Nature 389 (1994), 239); 문헌(Isner, Lancet 348 (1996), 370-374); 문헌(Muhlhauser, Circ. Res. 77 (1995), 1077-1086); 문헌(Onodera, Blood 91 (1998), 30-36); 문헌(Verma, Gene Ther. 5 (1998), 692-699); 문헌(Nabel, Ann. N.Y. Acad. Sci. 811 (1997), 289-292); 문헌(Verzeletti, Hum. Gene Ther. 9 (1998), 2243-51); 문헌(Wang, Nature Medicine 2 (1996), 714-716); 국제 특허출원 공개 제WO 94/29469호; 국제 특허출원 공개 제WO 97/00957호; 미국 특허 제5,580,859호; 미국 특허 제5,589,466호; 또는 문헌(Schaper, Current Opinion in Biotechnology 7 (1996), 635-640) 참조). 언급된 핵산 분자 및 벡터는 세포 내로의 직접적인 도입, 또는 리포좀 또는 바이러스 벡터(예를 들면, 아데노바이러스 벡터, 레트로바이러스 벡터)를 통한 세포 내로의 도입을 위해 디자인될 수 있다. 본 발명의 내용에서, 상기 세포는 생식세포주, 배아세포 또는 난세포, 또는 이들로부터 유래된 세포이고, 가장 바람직하게는 상기 세포는 줄기세포이다. 배아줄기세포에 대한 일례는 특히 문헌(Nagy, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90 (1993), 8424-8428)에 기재된 줄기세포일 수 있다.
전술된 바에 따라, 본 발명은 본원에서 정의된 이중특이적 항체 구축물의 폴리펩티드 서열을 코딩하는 핵산 분자를 포함하는, 유전공학에서 통상적으로 사용되는 벡터, 특히 플라스미드, 코스미드 및 박테리오파지를 유도하는 방법에 관한 것이다. 본 발명의 내용에서, 상기 벡터는 발현 벡터 및/또는 유전자 전달 또는 표적화 벡터이다. 바이러스, 예컨대, 레트로바이러스, 백시니아 바이러스, 아데노 관련 바이러스, 헤르페스 바이러스 또는 소 파필로마 바이러스로부터 유도된 발현 벡터가 표적화된 세포 집단 내로의 언급된 폴리뉴클레오티드 또는 벡터의 전달을 위해 사용될 수 있다.
당업자에게 잘 공지된 방법을 이용하여 재조합 벡터를 구축할 수 있다(예를 들면, 문헌(Sambrook et al. (인용 문헌)), 문헌(Ausubel (1989, 인용 문헌)) 또는 다른 표준 교재에 기재된 기법 참조). 대안적으로, 언급된 핵산 분자 및 벡터는 표적 세포로의 전달을 위해 리포좀으로 재구성될 수 있다. 본 발명의 핵산 분자를 함유하는 벡터는 숙주 세포의 종류에 따라 변경되는 잘 공지된 방법에 의해 숙주 세포 내로 전달될 수 있다. 예를 들면, 염화칼슘 형질감염은 원핵 세포를 위해 통상적으로 이용되는 반면, 인산칼슘 처리 또는 전기천공은 다른 숙주 세포를 위해 이용될 수 있다(상기 문헌(Sambrook) 참조). 언급된 벡터는 특히 pEF-DHFR, pEF-ADA 또는 pEF-neo일 수 있다. 벡터 pEF-DHFR, pEF-ADA 및 pEF-neo는 당분야, 예를 들면, 문헌(Mack et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92 (1995), 7021-7025) 및 문헌(Raum et al. Cancer Immunol Immunother 50 (2001), 141-150)에 기재되어 있다.
본 발명은 본원에 기재된 벡터로 형질전환된 또는 형질감염된 숙주도 제공한다. 상기 숙주는 전술된 벡터들 중 하나 이상의 벡터 또는 전술된 핵산 분자들 중 하나 이상의 핵산 분자를 숙주 내로 도입함으로써 생성될 수 있다. 숙주에서의 상기 하나 이상의 벡터 또는 하나 이상의 핵산 분자의 존재는 전술된 이중특이적 항체 분자 또는 구축물(즉, 본원에 기재된 이중특이적 항체 분자)을 코딩하는 유전자의 발현을 매개할 수 있다.
숙주 내로 도입되는 기재된 핵산 분자 또는 벡터는 숙주의 게놈 내로 삽입될 수 있거나 염색체 외부에서 유지될 수 있다.
숙주는 임의의 원핵 세포 또는 진핵 세포일 수 있다.
용어 "원핵생물"은 본 발명의 단백질의 발현을 위해 DNA 또는 RNA 분자로 형질전환될 수 있거나 형질도입될 수 있거나 형질감염될 수 있는 모든 세균들을 포함하기 위한 것이다. 원핵 숙주는 그람 음성 세균뿐만 아니라 그람 양성 세균, 예컨대, 에셔리키아 콜라이(Escherichia coli), 살모넬라 티피뮤리움(Salmonella typhimurium), 세라티아 마르세센스(Serratia marcescens) 및 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis)를 포함할 수 있다. 용어 "진핵생물"은 효모, 고등 식물, 곤충 및 바람직하게는 포유동물 세포를 포함하기 위한 것이다. 재조합 제조 절차에서 사용된 숙주에 따라, 본 발명의 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩된 단백질은 글리코실화될 수 있거나 글리코실화되지 않을 수 있다. 본 발명의 폴리펩티드의 코딩 서열을 함유하고 N-말단 FLAG 태그 및/또는 C-말단 His 태그에 유전적으로 융합된 플라스미드 또는 바이러스의 사용이 특히 바람직하다. 바람직하게는, 상기 FLAG 태그의 길이는 약 4개 내지 8개 아미노산, 가장 바람직하게는 8개 아미노산이다. 전술된 폴리뉴클레오티드는 당분야에서 통상의 기술을 가진 자에게 통상적으로 공지된 기법들 중 임의의 기법을 사용하여 숙주를 형질전환시키거나 형질감염시키는 데에 사용될 수 있다. 나아가, 융합되어 있고 작동가능하게 연결되어 있는 유전자들을 제조하고 이들을 예를 들면, 포유동물 세포 및 세균에서 발현하는 방법은 당분야에서 잘 공지되어 있다(인용된 문헌(Sambrook) 참조).
본 발명의 내용에서, 숙주(세포)는 세균, 곤충, 진균, 식물 또는 동물 세포이다.
언급된 숙주가 포유동물 세포, 보다 바람직하게는 인간 세포 또는 인간 세포주일 수 있다는 것이 특히 예상된다.
특히 바람직한 숙주 세포는 HEK293, CHO 세포, COS 세포, 골수종 세포주, 예컨대, SP2/0 또는 NS/0을 포함한다. 첨부된 실시예에 예시된 바와 같이, HEK293 세포가 숙주로서 특히 바람직하다.
따라서, 추가 실시양태에서, 본 발명은 이중특이적 항체 분자 또는 구축물(즉, 본원에 기재된 이중특이적 항체 분자)의 발현을 허용하는 조건 하에서 본 발명의 세포 및/또는 숙주 세포를 배양하는(생장시키는) 단계, 및 상기 세포 및/또는 배양 배지로부터 상기 분자 또는 구축물(즉, 본원에 기재된 이중특이적 항체 분자)을 회수하는 단계를 포함하는, 이중특이적 항체 분자 또는 구축물(즉, 본원에 기재된 이중특이적 항체 분자)을 제조하는 방법에 관한 것이다.
형질전환된 숙주를 발효기에서 생장시킬 수 있고 당분야에서 공지된 기법에 따라 배양하여 최적 세포 생장을 달성할 수 있다. 그 다음, 본 발명의 폴리펩티드를 생장 배지로부터 단리할 수 있다. 예를 들면, 미생물에 의해 발현된 본 발명의 폴리펩티드의 단리 및 정제는 임의의 통상적인 수단, 예를 들면, 분취 크로마토그래피 분리 및 면역학적 분리, 예컨대, 본 발명의 폴리펩티드의 태그에 대해 유도된 단일클론 또는 다중클론 항체의 사용을 수반하는 분리에 의해 달성될 수 있거나 첨부된 실시예에 기재된 바와 같이 달성될 수 있다.
나아가, 본 발명은 본원에서 정의된 이중특이적 (단일클론) 항체 분자 또는 상기 개시된 방법에 의해 제조된 (인간) 이중특이적 항체 분자, 본 발명의 핵산 분자, 벡터 또는 본 발명의 형질도입된 CD8+ T 세포의 숙주를 포함하는 조성물(약제)을 제공한다. 본 발명의 내용에서, 상기 조성물은 임의적으로 담체, 안정화제 및/또는 부형제의 적합한 제제를 추가로 포함하는 약학 조성물이다.
나아가, 본 발명은 약제로서 사용되는, 본원에서 상기 정의된 이중특이적 항체 분자를 제공하고, 이때 상기 이중특이적 항체 분자는 CD8+ T 세포 내에서 또는 상에서 천연적으로 발생하지 않는 항원을 포함하는 형질도입된 CD8+ T 세포의 투여 전에, 투여와 동시에 또는 투여 후에 투여되고, 상기 CD8+ T 세포는 치료되는 대상체로부터 수득되었다.
본 발명의 내용에서, CD8+ T 세포 내에서 또는 상에서 천연적으로 발생하지 않는 항원을 포함하는 형질도입된 CD8+ T 세포와 함께 투여되는, 본원에서 상기 정의된 이중특이적 항체 분자를 포함하는 약학 조성물/약제가 제공되고, 이때 상기 이중특이적 항체 분자는 CD8+ T 세포 내에서 또는 상에서 천연적으로 발생하지 않는 항원을 포함하는 형질도입된 CD8+ T 세포의 투여 전에, 투여와 동시에 또는 투여 후에 투여되고, 상기 CD8+ T 세포는 치료되는 대상체로부터 수득되었다.
본 발명의 내용에서, T 세포는 본원에서 상기 정의된 바와 같이 T 세포 내에서 및/또는 상에서 천연적으로 발생하지 않는/내생적으로 발현되지 않는 항원으로 형질도입된다. 또한, 본 발명은 본원에서 상기 정의된 바와 같이 CD8+ T 세포 내에서 및/또는 상에서 천연적으로 발생하지 않는/내생적으로 발현되지 않는 항원으로 형질도입된 CD8+ T 세포에 관한 것이다. 본 발명의 내용에서, 이들 형질도입된 T 세포(CD8+ T 세포)는 T 세포 수용체(TCR)를 추가로 포함한다. 이들 형질도입된 T 세포(CD8+ T 세포)는 이들 T 세포가 천연 자가 T 세포 풀로부터 단리되었고 종양 세포를 용해시킬 수 있기 때문에, 또는 이들 T 세포가 종양 특이적 T 세포 수용체(TCR)로 공-형질도입되었기 때문에 종양 특이적이다. 본 발명의 내용에서, T 세포(CD8+ T 세포)는 주조직적합성 항원 분자(MHC 분자; 인간의 경우, "인간 백혈구 항원"(HLA)으로서 지칭됨)를 코딩하는 주조직적합성 유전자 복합체(이하 단순히 "MHC"로서 지칭됨)와 T 세포 수용체 특이적 항원 펩티드(본원에서 상기 정의된 바와 같이 CD8+ T 세포 내에서 천연적으로 발생하지 않는 항원과 (구조적으로) 상이함)의 접합체인 복합체를 T 세포 수용체로 인식할 수 있는 T 세포도 포함한다. 따라서, 본 발명의 내용에서, 세포독성 반응을 확립하기 위해, (i) (치료되는 대상체의 종양 세포를 지칭하는) 표적 세포의 HLA 종류에 대해 특이적인 T 세포 수용체를 갖는 T 세포(CD8+ T 세포)가 존재하고 (ii) HLA 분자에 결합함으로써 형성된 복합체가 TCR에 의해 인식될 수 있도록 항원 펩티드가 존재할 필요가 있을 수 있다.
본원에서 사용된 용어 "T 세포 수용체"는, 하기 3가지 기준이 충족되는 한, 임의의 T 세포 수용체를 지칭한다: (i) 종양 특이성, (ii) 표적의 항원이 (대다수의) 종양 세포에서 발현되어야 한다는 것을 의미하는, (대다수의) 종양 세포의 인식, 및 (iii) 치료되는 대상체의 HLA 종류에 일치하는 TCR.
이와 관련하여, 상기 언급된 3가지 기준을 충족시키는 적합한 T 세포 수용체, 예컨대, WT1(윌름스 종양 특이적 항원 1; 서열 정보(들)에 대하여 예를 들면, 문헌(Sugiyama H., Japanese Journal of Clinical Oncology 40 (2010), 377-87) 참조), MAGE(서열에 대하여 예를 들면, 국제 특허출원 공개 제WO 2007/032255호 및 국제 특허출원 제PCT/US2011/57272호 참조), SSX(미국 가출원 제61/388,983호), NY-ESO-1(서열 정보(들)에 대하여 예를 들면, 국제 특허출원 제PCT/GB2005/001924호 참조) 및/또는 HER2neu(서열 정보(들)에 대하여 국제 특허출원 공개 제WO 2011/0280894호 참조)가 당분야에서 공지되어 있다.
본 발명의 내용에서, T 세포(CD8+ T 세포)는 대상체로부터 단리/수득된다. 환자로부터 T 세포(CD8+ T 세포)를 단리/수득하는 방법은 당분야에서 잘 공지되어 있고, 환자로부터의 백혈구분리반출, FACSort 장치를 이용한 세포의 단리/수득, 및 생존 세포를 보유하는 신선한 생검 표본으로부터 손으로 또는 미세조작기를 이용하여 사멸 세포를 선발 생존시키는 방법을 포함하나 이들로 한정되지 않는다(Dudley et al., J. Immunother. 26 (2003), 332-342; Robbins et al., J. Clin. Oncol. 29 (2011), 917-924 and Leisegang, J. Mol. Med. 86 (2008), 573-58). 용어 "신선한 환자 생검"은 수술 또는 임의의 다른 공지된 수단에 의해 대상체로부터 제거된 종양 조직뿐만 아니라 종양 조직/종양 세포로부터 유래된 종양 세포주 또는 (단리된) 세포를 지칭한다. 그 후, 단리된/수득된 T 세포를 배양하고, 항-CD3 항체를 사용하고/하거나, 항-CD3 단일클론 항체 및 항-CD28 단일클론 항체를 사용하고/하거나, 항-CD3 항체, 항-CD28 항체 및 IL-2를 사용하여 증폭시킨다(Dudley et al., J. Immunother. 26 (2003), 332-342; Dudley et al., J. Clin. Oncol. 26 (2008), 5233-5239).
본 발명의 내용에서, 이들 단리된/수득된 T 세포는 CD8+ T 세포이다. 표면 상에서 천연적으로 발생하는/내생적으로 발현된 항원/마커를 확인하는 방법은 당분야에서 공지되어 있고, 유세포측정(Koch et al., Immunity & Ageing 5 (2008), 6), 중합효소 연쇄 반응(Fernandes S., Clinical and Diagnostic Laboratory Immunology 12 (2005), 477-483) 및 공초점 현미경관찰(Kenny E. et al.. Immunology 101 (2000), 178-184)을 포함하나 이들로 한정되지 않는다.
후속 단계에서, T 세포는 당분야에서 공지된 방법에 의해 인위적으로/유전적으로 변경/형질도입된다(Francois M. Lemoine et al., J Gene Med 6 (2004), 374-386). T 세포를 형질도입하는 방법은 당분야에서 공지되어 있고, 핵산 또는 재조합 핵산이 형질도입되는 경우 예를 들면, 전기천공 방법, 인산칼슘 방법, 양이온성 지질 방법 또는 리포좀 방법을 포함하나 이들로 한정되지 않는다. 상업적으로 입수될 수 있는 형질감염 시약, 예를 들면, 리포펙타민(인비트로겐에 의해 제조됨)을 사용함으로써 형질도입될 핵산을 통상적으로 및 고효율적으로 형질도입할 수 있다. 벡터가 사용되는 경우, 벡터가 플라스미드 벡터인 한, 상기 벡터는 전술된 핵산과 동일한 방식으로 형질도입될 수 있다. 본원의 내용에서, T 세포를 형질도입하는 방법은 레트로바이러스 또는 렌티바이러스 T 세포 형질도입뿐만 아니라 mRNA 형질감염도 포함한다.
이와 관련하여, (인간) T 세포 형질도입에 적합한 (레트로바이러스) 벡터, 예컨대, SAMEN CMV/SRa(Clay et al.. J. Immunol. 163 (1999), 507-513), LZRS-id3-IHRES(Heemskerk et al.. J. Exp. Med. 186 (1997), 1597-1602), FeLV(Neil et al., Nature 308 (1984), 814-820), SAX(Kantoff et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83 (1986), 6563-6567), pDOL(Desiderio, J. Exp. Med. 167 (1988), 372-388), N2(Kasid et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87 (1990), 473-477), LNL6(Tiberghien et al., Blood 84 (1994), 1333-1341), pZipNEO(Chen et al., J. Immunol. 153 (1994), 3630-3638), LASN(Mullen et al., Hum. Gene Ther. 7 (1996), 1123-1129), pG1XsNa(Taylor et al., J. Exp. Med. 184 (1996), 2031-2036), LCNX 및 LXSN(Sun et al., Hum. Gene Ther. 8 (1997), 1041-1048), SFG(Gallardo et al., Blood 90 (1997), 952-957), HMB-Hb-Hu(Vieillard et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94 (1997), 11595-11600), pMV7(Cochlovius et al., Cancer Immunol. Immunother. 46 (1998), 61-66), pSTITCH(Weitjens et al., Gene Ther 5 (1998), 1195-1203), pLZR(Yang et al., Hum. Gene Ther. 10 (1999), 123-132), pBAG(Wu et al., Hum. Gene Ther. 10 (1999), 977-982), rKat.43.267bn(Gilham et al., J. Immunother. 25 (2002), 139-151), pLGSN(Engels et al., Hum. Gene Ther. 14 (2003), 1155-1168), pMP71(Engels et al., Hum. Gene Ther. 14 (2003), 1155-1168), pGCSAM(Morgan et al., J. Immunol. 171 (2003), 3287-3295), pMSGV(Zhao et al., J. Immunol. 174 (2005), 4415-4423), 및 pMX(de Witte et al., J. Immunol. 181 (2008), 5128-5136)가 당분야에서 공지되어 있다.
본 발명에 따라, 용어 "약제"는 용어 "약학 조성물"과 상호교환적으로 사용되고 환자, 바람직하게는 인간 환자에게의 투여를 위한 조성물을 지칭한다. 본 발명의 내용에서, 상기 약제/약학 조성물은 CD8+ T 세포가 단리/수득된 환자에게 투여된다. 본 발명의 내용에서, 환자는 인간 환자를 지칭한다. 나아가, 본 발명의 내용에서, 상기 환자는 질환을 앓고 있고, 이때 상기 질환은 악성 질환, 특히 상피, 내피 또는 중피 유래의 암/암종 또는 혈액암이다. 본 발명의 내용에서, 암/암종은 위장암, 췌장암, 담관세포암, 폐암, 유방암, 난소암, 피부암, 구강암, 위암, 자궁경부암, B 세포 및 T 세포 림프종, 골수성 백혈병, 난소암, 백혈병, 림프성 백혈병, 비인두암종, 결장암, 전립선암, 신장세포암, 두경부암, 피부암(흑색종), 비뇨생식관암, 예를 들면, 정소암, 내피암, 자궁암 및 신장암, 담관암, 식도암, 타액선암 및 갑상선암, 및 다른 종양성 질환, 예컨대, 혈액 종양, 신경아교종, 육종 및 골육종으로 구성된 군으로부터 선택된다.
바람직한 실시양태에서, 약학 조성물/약제는 비경구 투여, 경피 투여, 내강내 투여, 동맥내 투여, 경막내 투여, 또는 조직 또는 종양 내로의 직접적인 주사를 위해 본원에서 정의된 이중특이적 항체 분자를 포함한다. 본 발명의 내용에서, 조성물/약제는 CD8+ T 세포의 표면 내에서 및/또는 상에서 내생적으로 발현되지 않는/천연적으로 발생하지 않는 항원을 포함하는 형질도입된 CD8+ T 세포의 투여 전에, 투여와 동시에 또는 투여 후에 투여되는, 본원에서 정의된 이중특이적 항체 분자를 포함한다. 본 발명의 내용에서, 본원에서 정의된 이중특이적 항체 분자를 포함하는 약학 조성물/약제는 CD8+ T 세포 내에서 또는 상에서 천연적으로 발생하지 않는 항원을 포함하는 형질도입된 CD8+ T 세포와 함께 투여되고, 이때 상기 CD8+ T 세포는 치료되는 대상체로부터 수득되었다.
용어 "함께"의 사용은 치료 요법의 성분들이 대상체에게 투여되는 순서를 한정하지 않는다. 따라서, 본원에 기재된 약학 조성물/약제는 CD8+ T 세포 내에 또는 상에 천연적으로 존재하지 않는/내생적으로 발현되지 않는 항원을 포함하는 형질도입된 CD8+ T 세포의 투여 전에, 투여와 동시에 또는 투여 후에 본원에서 정의된 이중특이적 항체 분자를 투여하는 것을 포괄한다. 본원에서 사용된 "함께"는 본원에서 상기 정의된 이중특이적 항체 분자의 투여와 CD8+ T 세포 내에서 또는 상에서 천연적으로 발생하지 않는/내생적으로 발현되지 않는 항원을 포함하는 형질도입된 CD8+ T 세포의 투여 사이의 시간 간격을 한정하지 않는다. 따라서, 2개의 성분들이 동시적으로/동시에 투여되지 않는 경우, 투여는 1분, 5분, 15분, 30분, 45분, 1시간, 2시간, 4시간, 6시간, 12시간, 24시간, 48시간 또는 72시간, 또는 당업자에 의해 용이하게 결정되고/되거나 본원에 기재된 임의의 적합한 시간 차이에 의해 분리될 수 있다.
본 발명의 내용에서, 용어 "함께"는 본원에서 정의된 이중특이적 항체 분자, 및 CD8+ T 세포 내에서 및/또는 상에서 천연적으로 발생하지 않는/내생적으로 발현되지 않는 항원을 포함하는 형질도입된 CD8+ T 세포가 대상체에게 투여되기 전에 함께 예비항온처리되는 상황도 포괄한다. 따라서, 상기 2개의 성분들은 투여 전에 예를 들면, 1분, 5분, 10분, 15분, 30분, 45분 또는 1시간, 또는 당업자에 의해 용이하게 결정되는 임의의 적합한 시간 동안 예비항온처리될 수 있다. 또 다른 바람직한 실시양태에서, 본 발명은 본원에서 정의된 이중특이적 항체 분자, 및 CD8+ T 세포 내에서 및/또는 상에서 천연적으로 발생하지 않는/내생적으로 발현되지 않는 항원/마커를 포함하는 형질도입된 CD8+ T 세포가 동시적으로/동시에 투여되는 치료 요법에 관한 것이다. 본 발명의 내용에서, 본원에서 정의된 이중특이적 항체 분자는 CD8+ T 세포 내에서 및/또는 상에서 천연적으로 발생하지 않는/내생적으로 발현되지 않는 항원을 포함하는 형질도입된 CD8+ T 세포가 투여된 후에 투여될 수 있다.
또한, 본원에서 사용된 "함께"는 개시된 치료 요법을, 본원에서 정의된 이중특이적 항체 분자, 및 CD8+ T 세포 내에서 또는 상에서 천연적으로 발생하지 않는/내생적으로 발현되지 않는 항원을 포함하는 형질도입된 CD8+ T 세포를 즉각적인 순서로 투여하는 것(즉, 상기 2개의 성분들 중 하나를 투여한 다음, (특정 시간 간격 후) 중간에 임의의 다른 치료 프로토콜의 투여 및/또는 실시 없이 다른 성분을 투여하는 것)으로 한정하지 않는다. 따라서, 본 치료 요법은 본원에서 정의된 이중특이적 항체 분자와 CD8+ T 세포 내에서 또는 상에서 천연적으로 발생하지 않는/내생적으로 발현되지 않는 항원을 포함하는 형질도입된 CD8+ T 세포의 분리 투여도 포괄하고, 이때 상기 투여는 질환 또는 이의 증상의 치료 또는 예방에 필요한 및/또는 적합한 하나 이상의 치료 프로토콜에 의해 분리된다. 이러한 개재 치료 프로토콜의 예에는 통증 약물의 투여; 화학치료제의 투여; 및 질환 또는 이의 증상의 수술적 처리가 포함되나 이들로 한정되지 않는다. 따라서, 본원에 개시된 치료 요법은 본원에서 정의된 이중특이적 항체 분자, 및 CD8+ T 세포 내에서 또는 상에서 천연적으로 발생하지 않는/내생적으로 발현되지 않는 항원을 포함하는 형질도입된 CD8+ T 세포를 본원에 기재된 바와 같이 또는 당분야에서 공지된 바와 같이 질환 또는 이의 증상의 치료 또는 예방에 적합한 0개, 1개 또는 1개 초과의 치료 프로토콜과 함께 투여하는 것을 포괄한다.
상기 약학 조성물/약제가 관주 또는 주사를 통해 환자에게 투여될 것이 특히 예상된다. 본 발명의 내용에서, CD8+ T 세포 내에서 또는 상에서 천연적으로 발생하지 않는 항원을 포함하는 형질도입된 CD8+ T 세포는 관주 또는 주사를 통해 환자에게 투여될 것이다. 적합한 조성물/약제의 투여는 상이한 방식, 즉 정맥내, 복강내, 피하, 근육내, 국소 또는 피내 투여에 의해 달성될 수 있다.
본 발명의 약학 조성물/약제는 약학적으로 허용가능한 담체를 추가로 포함할 수 있다. 적합한 약학 담체의 예는 당분야에서 잘 공지되어 있고, 포스페이트 완충 식염수 용액, 물, 유화액, 예컨대, 오일/물 유화액, 다양한 종류의 습윤화제, 멸균 용액 등을 포함한다. 이러한 담체를 포함하는 조성물은 잘 공지된 통상적인 방법에 의해 제제화될 수 있다. 이들 약학 조성물은 적합한 용량으로 대상체에게 투여될 수 있다. 투약 요법은 주치의 및 임상 요인에 의해 결정될 것이다. 의학 분야에서 잘 공지된 바와 같이, 어느 한 환자에 대한 용량은 환자의 신장, 신체 표면적, 연령, 투여되는 구체적인 화합물, 성별, 투여 시간 및 경로, 일반적인 건강 및 병행 투여되는 다른 약물을 포함하는 많은 요인에 의해 좌우된다. 일반적으로, 약학 조성물의 규칙적인 투여로서의 요법은 1일 당 1 ㎍ 내지 5 g 유닛의 범위 내에 있어야 한다. 그러나, 연속 관주를 위한 보다 바람직한 용량은 시간 당 체중 kg 당 0.01 ㎍ 내지 2 mg, 바람직하게는 0.01 ㎍ 내지 1 mg, 보다 바람직하게는 0.01 ㎍ 내지 100 ㎍, 훨씬 더 바람직하게는 0.01 ㎍ 내지 50 ㎍, 가장 바람직하게는 0.01 ㎍ 내지 10 ㎍ 유닛의 범위 내에 있을 것이다. 특히 바람직한 용량은 본원에서 하기 언급되어 있다. 진행은 주기적 평가에 의해 모니터링될 수 있다. 용량은 변경될 것이지만, DNA의 정맥내 투여에 바람직한 용량은 대략 106개 내지 1012개 카피의 DNA 분자이다. 본 발명의 조성물은 국소 또는 전신 투여될 수 있다. 투여는 일반적으로 비경구, 예를 들면, 정맥내 투여일 것이고; DNA도 표적 부위, 예를 들면, 생물학적 전달에 의해 내부 또는 외부 표적 부위, 또는 카테터에 의해 동맥 내의 부위로 향하도록 투여될 수도 있다. 비경구 투여용 제제는 멸균 수성 또는 비-수성 용액, 현탁액 및 유화액을 포함한다. 비-수성 용매의 예는 프로필렌 글리콜, 폴리에틸렌 글리콜, 식물성 오일, 예컨대, 올리브유, 및 주사가능한 유기 에스터, 예컨대, 에틸 올레에이트이다. 수성 담체는 식염수 및 완충된 매질을 비롯한 물, 알코올성/수성 용액, 유화액 또는 현탁액을 포함한다. 비경구 비히클은 염화나트륨 용액, 링거 덱스트로스, 덱스트로스 및 염화나트륨, 젖산 첨가된 링거, 또는 고정된 오일을 포함한다. 정맥내 비히클은 유체 및 영양분 보충제, 전해질 보충제(예컨대, 링거 덱스트로스에 근거한 전해질 보충제) 등을 포함한다. 보존제 및 다른 첨가제, 예를 들면, 항미생물제, 항산화제, 킬레이팅제 및 불활성 기체 등도 존재할 수 있다. 추가로, 본 발명의 약학 조성물은 바람직하게는 인간 유래의 단백질성 담체, 예컨대, 혈청 알부민 또는 면역글로불린을 포함할 것이다. 본 발명의 약학 조성물이 (본 발명에 기재된) 단백질성 이중특이적 항체 구축물, 또는 이를 코딩하는 핵산 분자 또는 벡터 이외에 상기 약학 조성물의 의도된 용도에 따라 추가 생물학적 활성 물질을 포함할 것으로 예상된다. 이러한 물질은 위장 시스템에 작용하는 약물, 세포증식억제제(cytostatica)로서 작용하는 약물, 과다요산혈증을 예방하는 약물, 면역반응을 억제하는 약물(예를 들면, 코르티코스테로이드), 순환계에 작용하는 약물, 및/또는 당분야에서 공지된 물질, 예컨대, T 세포 보조자극 분자 또는 사이토카인일 것이다.
본 발명의 조성물(들)/약제(들)의 투여를 위한 가능한 징후는 악성 질환, 특히 상피암/암종, 예컨대, 유방암, 결장암, 전립선암, 두경부암, 피부암(흑색종), 비뇨생식관암, 예를 들면, 난소암, 정소암, 내피암, 자궁암 및 신장암, 폐암, 위암, 담관암, 식도암, 타액선암 및 갑상선암, 또는 다른 종양성 질환, 예컨대, 혈액 종양, 신경아교종, 육종 또는 골육종이다.
본 발명은 다른 화합물, 예를 들면, 면역 이펙터 세포, 세포 증식 또는 세포 자극에 대한 활성화 신호를 제공할 수 있는 분자를 사용한 공-투여 프로토콜도 예상한다. 상기 분자는 예를 들면, T 세포에 대한 추가 일차 활성화 신호(예를 들면, 추가 보조자극 분자: B7 패밀리의 분자, Ox40L, 4.1 BBL, CD40L, 항-CTLA-4, 항-PD-1), 또는 추가 사이토카인 인터류킨(예를 들면, IL-2)일 수 있다.
전술된 본 발명의 조성물은 임의적으로 검출 수단 및 방법을 추가로 포함하는 진단 조성물일 수도 있다.
본원에서 제공된 이중특이적 결합 분자 또는 구축물(즉, 본원에 기재된 이중특이적 항체 분자)은 이들이 액체상으로 사용될 수 있거나 고체상 담체에 결합될 수 있는 면역분석에서 사용되기에도 적합하다. 본 발명의 폴리펩티드를 사용할 수 있는 면역분석의 예는 직접적인 또는 간접적인 포맷으로의 경쟁 또는 비-경쟁 면역분석이다. 이러한 면역분석의 예는 효소 연결 면역흡착 분석(ELISA), 효소 면역분석(EIA), 방사성 면역분석(RIA), 샌드위치(면역측정 분석) 및 웨스턴 블롯 분석이다.
본 발명의 이중특이적 결합 분자 또는 구축물(즉, 본원에 기재된 이중특이적 항체 분자)은 많은 상이한 담체들에 결합될 수 있고 상기 폴리펩티드에 특이적으로 결합된 세포를 단리하는 데에 사용될 수 있다. 잘 공지된 담체의 예에는 유리, 폴리스티렌, 폴리비닐 클로라이드, 폴리프로필렌, 폴리에틸렌, 폴리카보네이트, 덱스트란, 나일론, 아밀로스, 천연 셀룰로스 및 변경된 셀룰로스, 폴리아크릴아미드, 아가로스 및 마그네이트가 포함된다. 담체의 성질은 본 발명의 목적을 위해 가용성 또는 불용성 담체, 예를 들면, 비드일 수 있다.
당분야에서 통상의 기술을 가진 자에게 공지된 많은 상이한 표지들 및 표지 부착 방법들이 존재한다. 본 발명에서 사용될 수 있는 표지의 종류의 예에는 효소, 방사성 동위원소, 콜로이드성 금속, 형광 화합물, 화학발광 화합물 및 생체발광 화합물이 포함된다.
본 발명의 가장 바람직한 실시양태에서, 약제로서 사용되는 본 발명의 이중특이적 항체 구축물/분자가 예상된다. 본 발명의 내용에서, 약제로서 사용되는 이중특이적 항체 분자가 기재되고, 이때 상기 이중특이적 항체 분자는 CD8+ T 세포 내에서 또는 상에서 천연적으로 발생하지 않는 항원을 포함하는 형질도입된 CD8+ T 세포의 투여 전에, 투여와 동시에 또는 투여 후에 투여되고, 상기 CD8+ T 세포는 치료되는 대상체로부터 수득되었다. 상기 약제는 악성 질환, 특히 상피, 내피 또는 중피 유래의 암/암종 또는 혈액암/암종의 치료 방법에서 사용될 수 있다. 본 발명의 내용에서, 상기 암/암종은 위장암, 췌장암, 담관세포암, 폐암, 유방암, 난소암, 피부암, 구강암, 위암, 자궁경부암, B 세포 및 T 세포 림프종, 골수성 백혈병, 난소암, 백혈병, 림프성 백혈병, 비인두암종, 결장암, 전립선암, 신장세포암, 두경부암, 피부암(흑색종), 비뇨생식관암, 예를 들면, 정소암, 난소암, 내피암, 자궁암 및 신장암, 담관암, 식도암, 타액선암 및 갑상선암, 및 다른 종양성 질환, 예컨대, 혈액 종양, 신경아교종, 육종 및 골육종으로 구성된 군으로부터 선택된다.
나아가, 본 발명의 내용에서, (i) CD8+ T 세포 내에서 또는 상에서 천연적으로 발생하지 않는 CD8+ T 세포 상의 항원에 결합하는 제1 결합 도메인; 및 (ii) 종양 세포의 표면 상에서 천연적으로 발생하는 종양 특이적 항원에 결합하는 제2 결합 도메인을 포함하는 본원에 기재된 이중특이적 항체 분자가 악성 질환의 치료 방법에서 사용될 것이 예상되고, 이때 상기 이중특이적 항체 분자는 CD8+ T 세포 내에서 또는 상에서 천연적으로 발생하지 않는 항원을 포함하는 형질도입된 CD8+ T 세포의 투여 전에, 투여와 동시에 또는 투여 후에 투여되고, 상기 CD8+ T 세포는 치료되는 대상체로부터 수득되었다.
나아가, 본 발명의 내용에서, (i) CD8+ T 세포 내에서 또는 상에서 천연적으로 발생하지 않는 CD8+ T 세포 상의 항원에 결합하는 제1 결합 도메인; 및 (ii) 종양 세포의 표면 상에서 천연적으로 발생하는 종양 특이적 항원에 결합하는 제2 결합 도메인을 포함하는 본 발명의 이중특이적 항체 분자를 악성 질환의 치료가 필요한 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 악성 질환의 치료 방법이 제공되고, 이때 상기 이중특이적 항체 분자는 CD8+ T 세포 내에서 또는 상에서 천연적으로 발생하지 않는 항원을 포함하는, 상기 대상체로부터의 형질도입된 CD8+ T 세포의 투여 전에, 투여와 동시에 또는 투여 후에 투여된다. 본 발명의 내용에서, 암/암종은 위장암, 췌장암, 담관세포암, 폐암, 유방암, 난소암, 피부암, 구강암, 위암, 자궁경부암, B 세포 및 T 세포 림프종, 골수성 백혈병, 난소암, 백혈병, 림프성 백혈병, 비인두암종, 결장암, 전립선암, 신장세포암, 두경부암, 피부암(흑색종), 비뇨생식관암, 예를 들면, 정소암, 난소암, 내피암, 자궁암 및 신장암, 담관암, 식도암, 타액선암 및 갑상선암, 및 다른 종양성 질환, 예컨대, 혈액 종양, 신경아교종, 육종 및 골육종으로 구성된 군으로부터 선택된다.
나아가, 본 발명에 따라, (종양 세포의 표면 상에서 천연적으로 발생하는 종양 특이적 항원으로서) (인간) EpCAM, 및 T 세포(CD8+ T 세포) 내에서 및/또는 상에서 천연적으로 발생하지 않는 본원에서 정의된 항원들 중 한 항원에 결합하는 분자 또는 구축물(즉, 본원에 기재된 이중특이적 항체 분자)은 위장암, 췌장암, 담관세포암, 폐암, 유방암, 난소암, 피부암 및/또는 구강암의 치료 방법에서 사용될 수 있다. 본 발명의 내용에서, (인간) EpCAM에 대해 유도된 결합 도메인을 (제2 결합 도메인으로서) 포함하고 cripto에 대해 유도된/cripto에 결합하는/cripto와 상호작용하는 제1 결합 도메인을 포함하는 이중특이적 항체 분자는 위장암, 예를 들면, 위장 유래의 선암종의 치료에서 사용될 수 있다. (종양 세포의 표면 상에서 천연적으로 발생하는 종양 특이적 항원인) (인간) HER1, 및 T 세포(CD8+ T 세포) 내에서 및/또는 상에서 천연적으로 발생하지 않는 본원에서 정의된 항원들 중 한 항원에 결합하는 분자 또는 구축물(즉, 본원에 기재된 이중특이적 항체 분자)은 위장암, 췌장암, 담관세포암, 폐암, 유방암, 난소암, 피부암 및/또는 구강암의 치료 방법에서 사용될 수 있다. (종양 세포의 표면 상에서 천연적으로 발생하는 종양 특이적 항원인) (인간) HER2, 및 T 세포(CD8+ T 세포) 내에서 및/또는 상에서 천연적으로 발생하지 않는 본원에서 정의된 항원들 중 한 항원에 결합하는 분자 또는 구축물(즉, 본원에 기재된 이중특이적 항체 분자)은 위암, 유방암 및/또는 자궁경부암의 치료 방법에서 사용될 수 있다. (종양 세포의 표면 상에서 천연적으로 발생하는 종양 특이적 항원인) (인간) HER3, 및 T 세포(CD8+ T 세포) 내에서 및/또는 상에서 천연적으로 발생하지 않는 본원에서 정의된 항원들 중 한 항원에 결합하는 분자 또는 구축물(즉, 본원에 기재된 이중특이적 항체 분자)은 위암 및/또는 폐암의 치료 방법에서 사용될 수 있다. (종양 세포의 표면 상에서 천연적으로 발생하는 종양 특이적 항원인) (인간) CD20, 및 T 세포(CD8+ T 세포) 내에서 및/또는 상에서 천연적으로 발생하지 않는 본원에서 정의된 항원들 중 한 항원에 결합하는 분자 또는 구축물(즉, 본원에 기재된 이중특이적 항체 분자)은 B 세포 림프종 및/또는 T 세포 림프종의 치료 방법에서 사용될 수 있다. (종양 세포의 표면 상에서 천연적으로 발생하는 종양 특이적 항원인) (인간) CD22, 및 T 세포(CD8+ T 세포) 내에서 및/또는 상에서 천연적으로 발생하지 않는 본원에서 정의된 항원들 중 한 항원에 결합하는 분자 또는 구축물(즉, 본원에 기재된 이중특이적 항체 분자)은 B 세포 림프종 및/또는 T 세포 림프종의 치료 방법에서 사용될 수 있다. (종양 세포의 표면 상에서 천연적으로 발생하는 종양 특이적 항원인) (인간) CD33, 및 T 세포(CD8+ T 세포) 내에서 및/또는 상에서 천연적으로 발생하지 않는 본원에서 정의된 항원들 중 한 항원에 결합하는 분자 또는 구축물(즉, 본원에 기재된 이중특이적 항체 분자)은 골수성 백혈병의 치료 방법에서 사용될 수 있다. (종양 세포의 표면 상에서 천연적으로 발생하는 종양 특이적 항원인) (인간) CA12-5, 및 T 세포(CD8+ T 세포) 내에서 및/또는 상에서 천연적으로 발생하지 않는 본원에서 정의된 항원들 중 한 항원에 결합하는 분자 또는 구축물(즉, 본원에 기재된 이중특이적 항체 분자)은 난소암, 폐암, 유방암 및/또는 위장암의 치료 방법에서 사용될 수 있다. (종양 세포의 표면 상에서 천연적으로 발생하는 종양 특이적 항원인) (인간) HLA-DR, 및 T 세포(CD8+ T 세포) 내에서 및/또는 상에서 천연적으로 발생하지 않는 본원에서 정의된 항원들 중 한 항원에 결합하는 분자 또는 구축물(즉, 본원에 기재된 이중특이적 항체 분자)은 위장암, 백혈병 및/또는 비인두암종의 치료 방법에서 사용될 수 있다. (종양 세포의 표면 상에서 천연적으로 발생하는 종양 특이적 항원인) (인간) MUC-1, 및 T 세포(CD8+ T 세포) 내에서 및/또는 상에서 천연적으로 발생하지 않는 본원에서 정의된 항원들 중 한 항원에 결합하는 분자 또는 구축물(즉, 본원에 기재된 이중특이적 항체 분자)은 결장암, 유방암, 난소암, 폐암 및/또는 췌장암의 치료 방법에서 사용될 수 있다. (종양 세포의 표면 상에서 천연적으로 발생하는 종양 특이적 항원인) (인간) A33, 및 T 세포(CD8+ T 세포) 내에서 및/또는 상에서 천연적으로 발생하지 않는 본원에서 정의된 항원들 중 한 항원에 결합하는 분자 또는 구축물(즉, 본원에 기재된 이중특이적 항체 분자)은 결장암의 치료 방법에서 사용될 수 있다. (종양 세포의 표면 상에서 천연적으로 발생하는 종양 특이적 항원인) (인간) PSMA, 및 T 세포(CD8+ T 세포) 내에서 및/또는 상에서 천연적으로 발생하지 않는 본원에서 정의된 항원들 중 한 항원에 결합하는 분자 또는 구축물(즉, 본원에 기재된 이중특이적 항체 분자)은 전립선암의 치료 방법에서 사용될 수 있다. (종양 세포의 표면 상에서 천연적으로 발생하는 종양 특이적 항원인) (인간) 트랜스페린 수용체, 및 T 세포(CD8+ T 세포) 내에서 및/또는 상에서 천연적으로 발생하지 않는 본원에서 정의된 항원들 중 한 항원에 결합하는 분자 또는 구축물(즉, 본원에 기재된 이중특이적 항체 분자)은 위장암, 췌장암, 담관세포암, 폐암, 유방암, 난소암, 피부암 및/또는 구강암의 치료 방법에서 사용될 수 있다. (종양 세포의 표면 상에서 천연적으로 발생하는 종양 특이적 항원인) (인간) CA-IX, 및 T 세포(CD8+ T 세포) 내에서 및/또는 상에서 천연적으로 발생하지 않는 본원에서 정의된 항원들 중 한 항원에 결합하는 분자 또는 구축물(즉, 본원에 기재된 이중특이적 항체 분자)은 신장암의 치료 방법에서 사용될 수 있다.
또한, 본 발명은 형질도입된 CD8+ T 세포를 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 질환, 특히 악성 질환, 예컨대, 상피, 내피 또는 중피 유래의 암, 및/또는 혈액암의 치료 방법에 관한 것이다. 이러한 질환은 특히, 식도암, 위암, 결장암, 소장암, 간암, 췌장암, 유방암, 폐암, 뇌암, 신장암, 정소암, 피부암, 백혈병 및/또는 림프종일 것이다. 본 발명의 내용에서, 상기 대상체는 인간이다.
본 발명의 내용에서, 하기 단계들을 포함하는 질환의 치료 방법이 기재된다:
(a) 대상체로부터 CD8+ T 세포를 단리하는 단계;
(b) 상기 단리된 CD8+ T 세포를 본원에서 전술된 바와 같이 CD8+ T 세포 내에서 천연적으로 발생하지 않는 항원으로 형질도입하는 단계; 및
(c) 상기 형질도입된 CD8+ T 세포를 상기 대상체에게 투여하는 단계.
본 발명의 내용에서, 상기 형질도입된 CD8+ T 세포는 정맥내 관주에 의해 상기 대상체에게 투여된다.
나아가, 본 발명은 하기 단계들을 포함하는 질환의 치료 방법을 제공한다:
(a) 대상체로부터 CD8+ T 세포를 단리하는 단계;
(b) 상기 단리된 CD8+ T 세포를 본원에서 전술된 바와 같이 CD8+ T 세포 내에서 천연적으로 발생하지 않는 항원으로 형질도입하는 단계;
(c) 상기 단리된 CD8+ T 세포를 T 세포 수용체로 공-형질도입하는 단계;
(d) CD8+ T 세포를 항-CD3 및 항-CD28 항체로 증폭시키는 단계; 및
(e) 형질도입된 CD8+ T 세포를 상기 대상체에게 투여하는 단계.
본 발명은 단리된 CD8+ T 세포 상에서 천연적으로 발생하는 (종양) 항원이, 본원에 기재된 이중특이적 항체가 그의 제2 결합 도메인을 통해 결합하는 종양 항원과 동일하다는 것을 확인하기 위해 방법에 의해 분석되는 단리된 CD8+ T 세포에 관한 것이다. 본 발명의 내용에서, (단리된 CD8+ T 세포의 표면 상에서 천연적으로 발생하는 항원을 포함하는) 단리된/수득된 CD8+ T 세포는 CD8+ T 세포 내에서 및/또는 상에서 천연적으로 발생하지 않는/천연적으로 발현되지 않는 항원/마커를 도입함으로써 인위적으로 변경된다. 본 발명의 내용에서, 단리된/수득된 CD8+ T 세포의 인위적 변경은 본원에 기재된 형질도입 방법과 관련된다. 따라서, 본 발명의 내용에서, 치료되는 대상체는 본원에서 전술된 바와 같이 종양 세포의 표면 상에서 천연적으로 발생하는 종양 특이적 항원을 갖는 것을 특징으로 하는 질환을 앓고 있는 것을 특징으로 하는 대상체를 지칭한다. 본 발명의 내용에서, 치료되는 대상체로부터 수득된/단리된 형질도입된 CD8+ T 세포의 투여는 정맥내 관주에 의해 수행될 것이다.
추가 실시양태에서, 본 발명은 하기 단계들을 포함하는, 질환의 치료 방법에 관한 것이다:
(a) 환자로부터 절제된 종양으로부터 종양 침습된 림프구(TIL)를 단리하는 단계;
(b) TIL을 배양하고 본원에서 전술된 바와 같이 CD8+ T 세포 내에서 천연적으로 발생하지 않는 항원으로 형질도입하는 단계;
(c) 기능성 종양 인식 분석에 근거하여 TIL 배양물을 선별하는 단계;
(d) TIL을 항-CD3 및/또는 항-CD28 항체로 증폭시키는 단계; 및
(e) 형질도입된 CD8+ T 세포를 상기 대상체에게 투여하는 단계.
용어 "기능성 종양 인식" 분석은 TIL을 동일한 HLA 종류의 자가, 예를 들면, 환자의 종양 세포 또는 세포주와 함께 공-배양하는 것을 의미한다. 판독은 종양 세포에 대한 세포독성 활성(LDH, 칼세인 방출)이다. 추가 판독은 사이토카인 분비, 세포내 사이토카인의 존재에 대한 T 세포의 유세포측정, 또는 ELISPOT 분석일 수 있다.
상기 언급된 단계 (d)(TIL을 항-CD3 및/또는 항-CD28 항체로 증폭시키는 단계를 지칭함)는 (자극) 사이토카인, 예컨대, 인터류킨-2 및/또는 인터류킨-15(IL-15)의 존재 하에서 수행될 수도 있다. 본 발명의 내용에서, 상기 언급된 단계 (d)(TIL을 항-CD3 및/또는 항-CD28 항체로 증폭시키는 단계를 지칭함)는 인터류킨-12(IL-12), 인터류킨-7(IL-7) 및/또는 인터류킨-21(IL-21)의 존재 하에서 수행될 수도 있다.
추가로, 상기 치료 방법은 본 발명의 이중특이적 (단일클론) 항체를 투여하는 단계도 포함할 수 있다. 상기 이중특이적 (단일클론) 항체는 형질도입된 CD8+ T 세포의 투여 전에, 투여와 동시에 또는 투여 후에 투여될 수 있다. 본 발명의 내용에서, 형질도입된 CD8+ T 세포의 투여는 정맥내 관주에 의해 수행될 것이다. 본 발명의 내용에서, 형질도입된 CD8+ T 세포는 치료되는 대상체로부터 단리/수득된다.
본 발명은 본 발명의 이중특이적 (단일클론) 항체, 핵산 분자, 벡터 또는 숙주를 포함하는 키트를 제공한다. 상기 키트는 본 발명의 약학 조성물의 제조에 특히 유용하고, 특히 주사 또는 관주에 유용한 용기로 구성될 수 있다. 유리하게는, 본 발명의 키트는 임의적으로 완충제(들), 저장 용액, 및/또는 의학적 또는 과학적 목적의 달성을 위해 요구되는 잔존 시약 또는 물질을 추가로 포함한다. 본 발명은 (A) (i) CD8+ T 세포 내에서 또는 상에서 천연적으로 발생하지 않는 CD8+ T 세포 상의 항원에 결합하는 제1 결합 도메인, 및 (ii) 종양 세포의 표면 상에서 천연적으로 발생하는 종양 특이적 항원에 결합하는 제2 결합 도메인을 포함하는 이중특이적 항체 분자; 및 (B) 치료받을 대상체로부터 단리/수득된 CD8+ T 세포를 상기 CD8+ T 세포 내에서 또는 상에서 천연적으로 발생하지 않는 항원으로 형질도입하는 데에 요구되는 물질을 포함하는 키트에 관한 것이다.
본 발명의 내용에서, 치료되는 대상체로부터 단리/수득된 "CD8+ T 세포를 형질도입하는 데에 요구되는 물질"은 CD8+ T 세포 내에서 및/또는 상에서 천연적으로 발생하지 않는/내생적으로 발현되지 않는 항원을 코딩하는 하나 이상의 핵산이다. CD8+ T 세포 내에서 및/또는 상에서 천연적으로 발생하지 않는/내생적으로 발현되지 않는 항원을 코딩하는 핵산은 세균에서의 벡터의 시험관내 선별 및 증폭을 위해 필요한 서열을 포함하는 상기 백터(예를 들면, 플라스미드 또는 바이러스 DNA) 내에 통상적으로 보유되어 있는 조절 서열(들)에 작동가능하게 연결될 수 있다. CD8+ T 세포 내에서 천연적으로 발생하지 않는/내생적으로 발현되지 않는 항원의 발현을 가능하게 하는 벡터는 본원에서 "발현 벡터"로서 지칭된다. 따라서, 치료되는 대상체로부터 단리/수득된 "CD8+ T 세포를 형질도입하는 데에 요구되는 또 다른 유용한 물질"은 CD8+ T 세포 내에서 및/또는 상에서 천연적으로 발생하지 않는 항원을 코딩하는 하나 이상의 핵산을 포함하는 벡터/발현 벡터일 수 있다. 이와 관련하여, T 세포/CD8+ T 세포 형질도입에 적합한 벡터는 하기 벡터들로 구성된 군으로부터 선택된 벡터를 포괄한다: SAMEN CMV/SRa(Clay et al., J. Immunol. 163 (1999), 507-513), LZRS-id3-IHRES(Heemskerk et al., J. Exp. Med. 186 (1997), 1597-1602), FeLV(Neil et al., Nature 308 (1984), 814-820), SAX(Kantoff et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83 (1986), 6563-6567), pDOL(Desiderio, J. Exp. Med. 167 (1988), 372-388), N2(Kasid et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87 (1990), 473-477), LNL6(Tiberghien et al., Blood 84 (1994), 1333-1341), pZipNEO(Chen et al., J. Immunol. 153 (1994), 3630-3638), LASN(Mullen et al., Hum. Gene Ther. 7 (1996), 1123-1129), pG1XsNa(Taylor et al., J. Exp. Med. 184 (1996), 2031-2036), LCNX 및 LXSN(Sun et al., Hum. Gene Ther. 8 (1997), 1041-1048), SFG(Gallardo et al., Blood 90 (1997), 952-957), HMB-Hb-Hu(Vieillard et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94 (1997), 11595-11600), pMV7(Cochlovius et al., Cancer Immunol. Immunother. 46 (1998), 61-66), pSTITCH(Weitjens et al., Gene Ther 5 (1998), 1195-1203), pLZR(Yang et al., Hum. Gene Ther. 10 (1999), 123-132), pBAG(Wu et al., Hum. Gene Ther. 10 (1999), 977-982), rKat.43.267bn(Gilham et al., J. Immunother. 25 (2002), 139-151), pLGSN(Engels et al., Hum. Gene Ther. 14 (2003), 1155-1168), pMP71(Engels et al., Hum. Gene Ther. 14 (2003), 1155-1168), pGCSAM(Morgan et al., J. Immunol. 171 (2003), 3287-3295), pMSGV(Zhao et al., J. Immunol. 174 (2005), 4415-4423) 및 pMX(de Witte et al., J. Immunol. 181 (2008), 5128-5136). "CD8+ T 세포를 형질도입하는 데에 요구되는 물질"은 CD8+ T 세포 내에서 및/또는 상에서 천연적으로 발생하지 않는/내생적으로 발현되지 않는 항원의 발현을 위한 수단으로서의 벡터로 형질전환된 또는 형질감염된 숙주 세포도 포괄할 수 있다. 상기 숙주 세포는 CD8+ T 세포 내에서 및/또는 상에서 천연적으로 발생하지 않는/내생적으로 발현되지 않는 항원을 코딩하는 하나 이상의 전술된 벡터 또는 하나 이상의 핵산 분자를 숙주 세포 내로 도입함으로써 제조될 수 있다. 숙주 세포에서의 상기 하나 이상의 벡터 또는 하나 이상의 핵산의 존재는 CD8+ T 세포 내에서 및/또는 상에서 천연적으로 발생하지 않는/내생적으로 발현되지 않는 본원에 기재된 항원을 코딩하는 유전자의 발현을 매개할 수 있다.
CD8+ T 세포를 형질도입하는 데에 요구되는 물질은 이들 단리/수득된 CD8+ T 세포의 유전적/인위적 변경/형질도입과 관련하여 필요한 상세한 정보 및/또는 장치도 포괄할 수 있다. CD8+ T 세포 내에서 및/또는 상에서 천연적으로 발생하지 않는/내생적으로 발현되지 않는 항원을 코딩하는 핵산 또는 재조합 핵산이 CD8+ T 세포의 형질도입을 위해 사용되는 경우, 전기천공 방법, 인산칼슘 방법, 양이온성 지질 방법 또는 리포좀 방법에 필요한 정보 및/또는 장치, 예컨대, 형질감염 시약(들), 완충제(들), 및/또는 형질도입을 위해 요구되는 잔존 시약이 상기 키트 내에 제공될 수 있다.
CD8+ T 세포를 형질도입하는 데에 요구되는 물질은 단리/수득된 CD8+ T 세포의 배양 및 증폭과 관련하여 필요한 정보 및/또는 장치, 예컨대, 항-CD3 항체, 항-CD3 및 항-CD28 단일클론 항체, 및/또는 항-CD3 항체, 항-CD28 항체 및 IL-2도 추가로 포괄할 수 있다.
따라서, 요약하건대, 치료되는 대상체로부터 단리/수득된 "CD8+ T 세포를 형질도입하는 데에 요구되는 물질"은 CD8+ T 세포 내에서 및/또는 상에서 천연적으로 발생하지 않는 항원을 코딩하는 하나 이상의 핵산, CD8+ T 세포 내에서 및/또는 상에서 천연적으로 발생하지 않는 항원을 코딩하는 하나 이상의 핵산을 포함하는 벡터/발현 벡터, 형질감염 시약(들), 완충제(들), 및/또는 치료되는 대상체로부터 단리/수득된 CD8+ T 세포를 상기 CD8+ T 세포 내에서 및/또는 상에서 천연적으로 발생하지 않는 항원으로 형질도입하고/하거나 배양하는 데에 요구되는 물질이다.
나아가, 본 발명의 키트의 부분들은 바이알 또는 병에 개별적으로 포장될 수 있거나 용기 또는 다중용기 유닛으로 조합되어 포장될 수 있다. 더욱이, 본 발명의 키트는 환자 세포, 바람직하게는 본원에서 전술된 T 세포가 GMP(사이트(http://ec.europa.eu/health/documents/eudralex/index_en.htm) 하에서 유럽 위원회에 의해 공개된 우수 제조 관리 기준에 기재된 우수 제조 관리) 조건 하에서 형질도입되고 항온처리될 수 있는 (폐쇄된) 백(bag) 세포 항온처리 시스템을 포함한다. 나아가, 본 발명의 키트는 단리/수득된 환자 CD8+ T 세포가 GMP 하에서 형질도입되고 항온처리될 수 있는 (폐쇄된) 백 세포 항온처리 시스템을 포함한다. 나아가, 본 발명의 내용에서, 상기 키트는 본원에서 전술된 바와 같이 CD8+ T 세포 내에서 천연적으로 발생하지 않는 항원을 코딩하는 핵산 분자, 및/또는 본원에서 전술된 바와 같이 T 세포 수용체를 코딩하는 핵산 분자도 포함할 수 있다. 본 발명의 키트는 특히 본 발명의 방법을 실시하는 데에 유리하게 사용될 수 있고, 본원에서 언급된 다양한 적용에서, 예를 들면, 연구 수단 또는 의학적 수단으로서 사용될 수 있다. 키트의 제조는 바람직하게는 당업자에게 공지되어 있는 표준 절차를 따른다.
이들 실시양태 및 다른 실시양태가 개시되고 본 발명의 설명 및 실시예에 의해 포괄된다. 본 발명에 따라 사용되는 항체, 방법, 용도 및 화합물 중 어느 하나에 관한 추가 문헌은 예를 들면, 전자 장치의 이용을 통해 공용 도서관 및 데이터베이스로부터 검색될 수 있다. 예를 들면, 인터넷 상에서 입수가능한 공용 데이터베이스 "Medline"은 예를 들면, 웹사이트(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/PubMed/medline.html) 하에서 이용될 수 있다. 추가 데이터베이스 및 주소, 예컨대, 웹사이트(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/), 웹사이트(http://www.infobiogen.fr/), 웹사이트(http://www.fmi.ch/biology/research_tools.html), 웹사이트(http://www.tigr.org/)가 당업자에게 공지되어 있고 예를 들면, 웹사이트(http://www.lycos.com)의 이용을 통해 입수될 수도 있다.
실시예
하기 실시예는 본 발명을 예시한다:
예시적으로, 개념의 증거로서, 하기 실시예에서 인간 항-EGFR 항체(MAb225; 서열번호 1 및 2)를 뮤린 항-EpCAM(G8.8; 서열번호 3 및 4)과 조합하여 이중특이적 생성물(MAb225_scFv_G8.8; 서열번호 5 및 6)을 형성하였다. 나아가, 도 20 및 21에 예시된 바와 같이, 한 아암 상에 del-hEGFRvIII(서열번호 17 및 18)에 대한 항원 결합 부위 및 다른 아암 상에 (뮤린) EpCAM에 대한 항원 결합 부위를 갖는 이중특이적 항체 "BsAb EpCAM-EGFRvIII, MR1.1"(서열번호 15 및 16)을 구축하였다(실시예 4 참조).
실시예 1: 이중특이적 항체 MAb225_scFv_G8.8의 클로닝 및 발현
재조합 DNA 기법
표준 방법을 이용하여 문헌(Sambrook, J. et al., Molecular cloning: A laboratory manual; Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York, 1989)에 기재된 바와 같이 DNA를 조작하였다. 분자생물학 시약을 제조자의 설명서에 따라 사용하였다.
DNA 및 단백질 서열 분석 및 서열 데이터 관리
인간 면역글로불린 경쇄 및 중쇄의 뉴클레오티드 서열에 관한 일반 정보는 문헌(Kabat, E.A. et al., (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Ed.. NIH Publication No 91-3242)에 제공되어 있다. 항체 쇄의 아미노산은 EU 넘버링에 따라 넘버링된다(Edelman, G.M., et al., PNAS 63 (1969) 78-85; Kabat, E.A., et al., (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Ed., NIH Publication No 91-3242). GCG(제네틱스 컴퓨터 그룹(Genetics Computer Group), 미국 위스콘신주 매디슨 소재)의 소프트웨어 팩키지 버전 10.2 및 인포맥스의 벡터 NTI 어드밴스 스위트(Infomax's Vector NTI Advance suite) 버전 11.5를 서열 생성, 맵핑, 분석, 해석 및 도해를 위해 사용하였다.
DNA 서열결정
DNA 서열은 세퀴서브(SequiServe)(독일 바터스테텐 소재) 및 진아트 아게(Geneart AG)(독일 레겐스부르그 소재)에서 수행된 이중 가닥 서열결정에 의해 확인되었다.
유전자 합성
원하는 유전자 분절은 자동화된 유전자 합성에 의해 합성 올리고뉴클레오티드 및 PCR 생성물로부터 진아트 아게(독일 레겐스부르그 소재)에 의해 제조되었다. 단일 제한 엔도뉴클레아제 절단 부위에 의해 플랭킹되어 있는 유전자 분절을 pGA18(ampR) 플라스미드 내로 클로닝하였다. 플라스미드 DNA를 형질전환된 세균으로부터 정제하였고 농도를 UV 분광법으로 측정하였다. 서브클로닝된 유전자 단편의 DNA 서열을 DNA 서열결정으로 확인하였다. 플랭킹 5' NarI 및 3' NheI 제한 엔도뉴클레아제 부위를 갖는 가변 경쇄 영역 및 불변 경쇄 영역을 포괄하는 경쇄를 코딩하는 DNA 서열을 주문하였다. 플랭킹 5' KpnI 및 3' BamHI 제한 부위를 갖는 가변 중쇄 영역 및 CH1 영역의 단편을 코딩하는 DNA 서열을 주문하였다. 플랭킹 5' BsrGI 및 3' XbaI 제한 엔도뉴클레아제 부위를 갖는 CH3 도메인의 단편을 함유하는 scFv 구축물을 코딩하는 DNA 서열을 주문하였다. 뮤린 EpCAM(서열번호 7(cDNA 서열) 및 8(아미노산 서열))의 아미노산 1 내지 267을 코딩하는 DNA 서열을, 5' BamHI 및 3' NotI 부위를 갖는 유전자 합성물로서 주문하였다. 모든 구축물들은 진핵 세포에서의 분비를 위해 단백질을 표적화하는 리더 펩티드를 코딩하는 5'-말단 DNA 서열을 갖도록 디자인되었다.
1.1 발현 플라스미드의 구축
발현 벡터를 모든 항체 쇄의 구축을 위해 사용하였다. 상기 벡터는 (MAb225의 경쇄(서열번호 1)에 대해 도 18에 예시적으로 나타낸 바와 같이) 하기 요소들로 구성된다:
- 엡스테인-바 바이러스(EBV)의 복제기점 oriP,
- 에셔리키아 콜라이에서의 이 플라스미드의 복제를 위한 벡터 pUC18의 복제기점,
- 에셔리키아 콜라이에서 앰피실린 내성을 부여하는 베타-락타마제 유전자,
- 인간 사이토메갈로바이러스(HCMV)의 즉시 초기 인핸서 및 프로모터,
- 소 성장 호르몬 폴리아데닐화("폴리 A") 신호 서열, 및
- 유일한 KpnI, BamHI, BsrGI 및 XbaI 제한 엔도뉴클레아제 부위(중쇄 벡터), 또는
- 유일한 NarI 및 NheI 제한 엔도뉴클레아제 부위(경쇄).
중쇄 구축물의 제조를 위한 코딩 발현 벡터는 (G8.8 scFv 융합을 갖는 중쇄 MAb225(서열번호 6)에 대해 도 19에 개략적으로 나타낸 바와 같이) 추가 하기 요소들을 함유하였다:
- 네오마이신 내성 카세트(neor),
- 원숭이 바이러스 40 초기 프로모터, 및
- 원숭이 바이러스 40 폴리아데닐화("폴리 A") 신호 서열.
합성된 항체 코딩 DNA 분절을 보유하는 pG18(ampR) 플라스미드 및 발현 벡터를 중쇄 발현 벡터의 경우 KpnI 및 BamHI, 또는 경쇄 벡터의 경우 NarI 및 NheI 제한 효소로 절단하였다. 유사하게, scFv 단편을 보유하는 pG18 플라스미드를 중쇄 벡터인 경우 BsrGI 및 XbaI로 절단하였다. 모든 수득된 단편들을 아가로스 겔 전기영동으로 분리하였다. 그 다음, 정제된 DNA 분절을 단리된 발현 벡터 KpnI/BamHI, NarI/NheI 또는 BsrGI/XbaI 단편에 결찰시켜 최종 발현 벡터를 발생시켰다. 최종 발현 벡터를 에셔리키아 콜라이 세포 내로 형질전환시키고, 발현 플라스미드 DNA를 단리하고(미니프렙(Miniprep)) 제한 효소 분석 및 DNA 서열결정으로 분석하였다. 정확한 클론을 150 ㎖ LB-Amp 배지에서 생장시키고, 플라스미드 DNA를 다시 단리하고(맥시프렙(Maxiprep)) 후속 실험을 위해 사용하였다.
발현 벡터를 (서열번호 9에 나타낸 cDNA 서열에 의해 코딩된) (서열번호 10의 아미노산 서열을 지칭하는) 재조합 뮤린 EpCAM 엑토도메인의 구축을 위해 사용한 반면, 원래의 서열은 PubMed 엔트리 NM_008532(NM_008532.2, GI: 112293274)로부터 유래되었다. 상기 벡터(도 17 참조)는 하기 요소들로 구성된다:
- 엡스테인-바 바이러스(EBV)의 복제기점 oriP,
- 에셔리키아 콜라이에서의 이 플라스미드의 복제를 위한 벡터 pUC18의 복제기점,
- 에셔리키아 콜라이에서 앰피실린 내성을 부여하는 베타-락타마제 유전자,
- 하이그로마이신-b-포스포트랜스퍼라제 카세트,
- 원숭이 바이러스 40 초기 프로모터,
- 원숭이 바이러스 40 폴리아데닐화("폴리 A") 신호 서열,
- 인간 사이토메갈로바이러스(HCMV)의 즉시 초기 인핸서 및 프로모터,
- 프레시전 플러스(PreScission Plus) 부위에 이어서 관심 있는 cDNA의 N-말단 융합을 위한 His Avitag,
- 소 성장호르몬 폴리아데닐화("폴리 A") 신호 서열, 및
- 유일한 BamHI 및 NotI 제한 엔도뉴클레아제 부위.
합성된 EpCAM 엑토도메인 코딩 DNA 분절을 보유하는 pG18(ampR) 플라스미드 및 발현 벡터(도 17 참조)를 BamHI 및 NotI로 절단하였다. 모든 수득된 단편들을 아가로스 겔 전기영동으로 분리하였다. 그 다음, 정제된 DNA 분절을 단리된 로슈 발현 벡터 BamHI/NotI 단편에 결찰시켜 최종 발현 벡터를 발생시켰다. 최종 발현 벡터를 에셔리키아 콜라이 세포 내로 형질전환시키고, 발현 플라스미드 DNA를 단리하고(미니프렙) 제한 효소 분석 및 DNA 서열결정으로 분석하였다. 정확한 클론을 150 ㎖ LB-Amp 배지에서 생장시키고, 플라스미드 DNA를 다시 단리하고(맥시프렙) 후속 실험을 위해 사용하였다.
실시예 2: 높은 결합 친화성을 보이는 EpCAM 엑토도메인의 발현 및 정제
2.1 인간 배아 신장 293(HEK293) 세포에서 면역글로불린 변이체의 일시적인 발현
프리스타일(FreeStyle)™ 293 발현 시스템을 제조자(인비트로겐(Invitrogen), 미국 소재)의 설명서에 따라 사용하여 재조합 면역글로불린 변이체들(MAb225, MAb225_scFv_G8.8 및 G8.8)을 인간 배아 신장 293-F 세포의 일시적인 형질감염으로 발현하였다. 요약하건대, 현탁액 프리스타일™ 293-F 세포를 37℃/8% CO2에서 프리스타일™ 293 발현 배지에서 배양하였다. 세포를 형질감염 전날 1x106개 생존 세포/㎖의 밀도로 새로운 배지에 접종하였다. 500 ㎖ 최종 형질감염 부피를 위해 665 ㎕의 293-프리(Free)™ 형질감염 시약(노바겐(Novagen), EMD, 미국 소재) 및 500 ㎍의 총 DNA(1:1 몰비로 경쇄 플라스미드 DNA 및 중쇄 플라스미드 DNA를 포함함)를 사용하여 DNA-293펙틴™ 복합체를 Opti-MEM® I 배지(인비트로겐, 미국 소재)에서 제조하였다. 형질감염으로부터 6일 후 실온(RT)에서 15분 동안 3500 rpm에서 원심분리하여 항체 함유 세포 배양 상청액을 수거하고 멸균 필터(0.22 ㎛)를 통해 여과하였다. 상청액을 정제할 때까지 -80℃에서 저장하였다. 뮤린 EpCAM 엑토도메인의 제조 절차는 면역글로불린 변이체의 제조 절차와 유사하였고, 500 ㎍의 DNA를 500 ㎖ 최종 형질감염 부피를 위해 사용하였다.
2.2 항체의 정제
단백질 A-세파로스™(지이 헬쓰케어(GE Healthcare), 스웨덴 소재)를 사용한 친화성 크로마토그래피 및 수퍼덱스200 크기 배제 크로마토그래피로 세포 배양 상청액으로부터 항체를 정제하였다. 요약하건대, 멸균 여과된 세포 배양 성청액을 PBS 완충제(10 mM Na2HPO4, 1 mM KH2PO4, 137 mM NaCl 및 2.7 mM KC1, pH 7.4)로 평형화된 5 ㎖ 맙셀렉트 엑스트라(MabSelect Xtra)(지이 헬쓰케어) 컬럼 상에 적재하였다. 결합되지 않은 단백질을 평형화 완충제로 세척하여 제거하였다. 항체 및 항체 변이체를 0.1 M 시트레이트 완충제(pH 3.0)로 용출하고 단백질 함유 분획을 0.2 M 트라이스(pH 9.0)로 중화시켰다. 그 다음, 용출된 단백질 분획을 모아 아미콘 울트라(Amicon Ultra) 원심분리 필터 장치(MWCO: 30 K, 밀리포어(Millipore))로 3 ㎖의 부피까지 농축하고, 완충제(20 mM 히스티딘, 140 mM NaCl,pH 6.0)로 평형화된 수퍼덱스200 하이로드 120 ㎖ 16/60 또는 26/60 겔 여과 컬럼 상에 적재하였다. 5% 미만의 고분자량 응집체와 함께 정제된 항체를 함유하는 분획을 모아 -80℃에서 약 1.0 mg/㎖ 분취물로서 저장하였다.
Ni-킬레이트 크로마토그래피를 사용한 친화성 크로마토그래피로 세포 배양 상청액으로부터 뮤린 EpCAM 엑토도메인(서열번호 9)을 정제하였다. 요약하건대, 멸균 여과된 세포 배양 상청액을 완충제(20 mM "NaPO4", 0.5 M NaCl, 20 mM 이미다졸, pH 7.40)로 평형화된 히스트랩 FF(지이 헬쓰케어, 스웨덴 소재) 상에 적재하였다. 결합되지 않은 단백질을 평형화 완충제로 세척하여 제거하였다. EpCAM 엑토도메인(서열번호 9)을, 20 mM "NaPO4", 0.5 M NaCl 및 500 mM 이미다졸을 함유하는 완충제(pH 7.40)로 용출하였다. 피크 분획을 모으고 20 mM 히스티딘 및 140 mM NaCl을 함유하는 완충제(pH 6.70)에 대하여 밤새 투석하였다. 단백질을 -80℃에서 17.5 mg/㎖ 분취물로서 저장하였다.
2.3 정제된 단백질의 분석
아미노산 서열에 근거하여 계산된 몰 흡광 계수를 이용하여 280 nm에서 광학 밀도(OD)를 측정함으로써 정제된 단백질 샘플의 단백질 농도를 측정하였다. 항체의 순도 및 분자량을 환원제(5 mM 1,4-다이티오트레이톨)의 존재 및 부재 하에서 SDS-PAGE로 분석하고 쿠마시 브릴리언트 블루로 염색하였다. NuPAGE® 프리-캐스트(Pre-Cast) 겔 시스템(인비트로겐, 미국 소재)을 제조자의 설명서에 따라 사용하였다(4% 내지 12%의 비스-트라이스 겔). 25℃에서 50 mM "KPO4"(pH 7.5) 및 300 mM NaCl 함유 런닝 완충제에서 TSKgel G3000SW 컬럼(토소 바이오사이언스(TOSOH Bioscience), 미국 소재)을 사용한 고성능 SEC로 항체 샘플의 응집체 함량을 분석하였다. 25 ㎍ 단백질을 0.8 ㎖/분의 유속으로 상기 컬럼 상에 주입하고 20분에 걸쳐 등용매 용출하였다. 환원된 면역글로불린 변이체 쇄의 아미노산 골격의 통합성을, 펩티드-N-글리코시다제 F(로슈 몰레큘라 바이오케미칼스(Roche Molecular Biochemicals))를 사용한 효소 처리에 의한 N-글리칸의 제거 후 나노전기분무 Q-TOF 질량 분광측정으로 검증하였다.
2.4 뮤린 재조합 EpCAM의 면역침전
항체 G8.8(서열번호 3 및 4) 및 이중특이적 MAb225_G8.8 항체(서열번호 5 및 6)가 뮤린 EpCAM 재조합 엑토도메인(ECD)(서열번호 10)에 결합하는 지를 확인하기 위해 IP를 수행하였다. 약 15 ㎍ EpCAM ECD 및 10 ㎍ 항체를 TBS 트윈(Tween) 0.1%로 1.5 ㎖ 총 부피까지 희석하고 실온에서 10분 동안 항온처리하였다. EpCAM을 갖지 않는 항체를 중쇄 및 경쇄 밴드를 구별하기 위한 음성 대조군으로서 동시에 제조하였다. 50 ㎕의 50% 단백질 A 슬러리를 첨가하고 샘플을 실온에서 교반 하에서 40분 동안 항온처리하고 TBS-T로 세척하고 pH 3.0의 시트레이트 완충제로 용출하고 4% 내지 12% 비스-트라이스 겔 상에 적재하였다. 4 ㎍의 재조합 EpCAM ECD를 대조군으로서 적재하였다. 겔을 쿠마시 브릴리언트 블루로 염색하였다.
2.5 질량 분광측정
항체의 총 탈글리코실화된 질량을 측정하고 전기분무 이온화 질량 분광측정(ESI-MS)을 통해 확인하였다. 요약하건대, 100 ㎍의 정제된 항체를 최대 2 mg/㎖의 단백질 농도에서 12시간 내지 24시간 동안 37℃에서 100 mM KH2PO4/K2HPO4(pH 7) 중의 50 mU N-글리코시다제 F(PNGaseF, 프로자임(ProZyme))로 탈글리코실화한 후, 세파덱스 G25 컬럼(지이 헬쓰케어) 상에서 HPLC를 통해 탈염시켰다. 각각의 항체 쇄의 질량을 탈글리코실화 및 환원 후 ESI-MS로 측정하였다. 요약하건대, 115 ㎕의 50 ㎍ 항체를 60 ㎕의 1 M TCEP 및 50 ㎕의 8 M 구아니딘-하이드로클로라이드와 함께 항온처리한 후 탈염시켰다. 총 질량 및 환원된 항체 쇄의 질량을, 나노메이트(NanoMate) 공급원을 갖춘 Q-스타 엘리트(Q-Star Elite) MS 시스템 상에서 ESI-MS를 통해 측정하였다. 기록된 질량 범위는 샘플 분자량에 의해 좌우된다. 일반적으로, 질량 범위는 환원된 항체의 경우 600 m/z 내지 2000 m/z로 설정되었고 비-환원된 항체의 경우 1000 m/z 내지 3600 m/z로 설정되었다.
2.6 표면 플라스몬 공명
EGFR 특이적 MAb225(서열번호 1 및 2) 및 EpCAM 특이적 G8.8 항체(서열번호 3 및 4)의 결합 성질뿐만 아니라 이중특이적 MAb225_scFv_G8.8 항체의 결합 성질도 비아코어 기계(비아코어, 지이 헬쓰케어, 업살라 소재)를 이용하여 표면 플라스몬 공명(SPR) 기술로 분석하였다. 이 시스템은 분자 상호작용의 연구에 대해 잘 확립되어 있다. 상기 시스템은 리간드/분석물 결합의 연속적인 실시간 모니터링을 가능하게 함으로써, 다양한 분석 환경에서 결합 속도 상수(ka), 해리 속도 상수(kd) 및 평형 상수(KD)의 측정을 가능하게 한다. SPR 기술은 금으로 코팅된 바이오센서 칩의 표면에 가까운 굴절 지수의 측정에 근거한다. 굴절 지수의 변화는 용액에서 고정된 리간드와 주입된 분석물의 상호작용에 의해 야기된 표면 상의 질량 변화를 표시한다. 분자가 표면 상의 고정된 리간드에 결합하는 경우 질량은 증가하고 해리되는 경우 질량은 감소한다. 포획을 위해, 아민-커플링 화학반응을 제조자의 설명서에 따라 이용하여 염소 항-마우스 IgG 항체를 CM5 바이오센서 칩의 표면 상에 고정시켰다. 유동 셀을 25℃에서 5 ㎕/분의 유속으로 0.1 M N-하이드록시석신이미드와 0.4 M 1-에틸-3-(3-다이메틸아미노프로필)-카보다이이미드 하이드로클로라이드의 1:1 혼합물로 활성화시켰다. 10 mM 나트륨 아세테이트(pH 4.5) 중의 항-마우스 IgG 항체를 10 ㎍/㎖의 유속으로 주입하였다. 포획 항체 대신에 비히클 완충제만을 사용한다는 점을 제외하고 동일한 방식으로 기준 대조군 유동 셀을 처리하였다. 1 M 에탄올아민/HCl(pH 8.5)을 주입하여 표면을 차단하였다. 평가될 항체를 PBS-T+0.1% BSA(희석 완충제)로 희석하고(30 nM MAb225_scFv_G8.8, 5 nM MAb225, 8 nM G8.8), 60초 동안 5 ㎕/분의 유속으로 주입하여 별도의 주기에서 리간드로서 포획하였다. PBS-T를 런닝 완충제로서 사용하여 37℃에서 모든 상호작용을 수행하였다. 50 ㎕/분의 유속, 180초 결합 및 1200초 해리를 이용하여 분석물을 일련의 3배 증가하는 농도(PBS-T + 0.1% BSA 중의 EGFR BCD 4.12 nM 내지 1000 nM 및 EpCAM ECD 0.91 nM 내지 2000 nM)로 주입하였다. 포획 항체를 각각의 주기 후 60초 동안 30 ㎕/분의 유속에서 10 mM 글리신(pH 2.0)으로 재생시켰다. 신호를 초 당 1개 신호의 속도로 검출하였다.
예시적인 이중특이적 항체 MAb225_scFv_G8.8뿐만 아니라 개별 모항체 MAb225 및 G8.8의 생화학적 특징규명의 요약이 표 1에 제공되어 있고, 이 표는 모든 항체들이 그들 각각의 표적에 대한 고친화성으로 결합된다는 것을 보여준다.
Figure pct00008
실시예 3: CD8+ T 세포의 형질도입 및 세포독성 사멸 분석
3.1 세포 배양
비장을 하기 항목 3.2에 기재된 마우스로부터 채취하였다. 상기 비장을 40 μM 세포 여과기(strainer)(비디 팔콘(BD Falcon), 독일 소재)를 통해 으깨어 단일 세포 현탁액을 수득하였다. 여과기를 평범한 T 세포 배지로 3회 세척하고 90초 동안 적혈구용해 용액(비디 파밍겐(BD Pharmingen), 독일 소재)으로 세포 펠렛으로부터 적혈구를 제거하였다. 일차 뮤린 T 세포를 RPMI, 1% L-글루타민, 1% 페니실린 및 스트렙토마이신, 1% 나트륨 피루베이트, 1 mM HEPES(모두 피에이에이(PAA), 독일 소재) 및 10% FBS(깁코(Gibco), 미국 소재)로 구성된 T 세포 배지에서 유지하였다. T 세포주 B3Z(Leisegang et al., J Mol Med (2008), 86(5), 573-583)를 동일한 배지에서 유지하였다. Plat E 팩키징 세포주(셀 바이오랩스 인코포레이티드(Cell Biolabs, Inc.), 미국 소재(www.cellbiolabs.com))를 DMEM, 1% L-글루타민, 1% 페니실린-스트렙토마이신(모두 피에이에이, 독일 소재), 10 ㎍/㎖ 퓨로마이신 및 1 ㎍/㎖ 블라스티시딘(시그마, 독일 소재)으로 구성된 배지에서 유지하였다. 뮤린 위암 세포주를 제공받아(W. Zimmermann, 독일 뮌헨) DMEM, 1% L-글루타민, 1% 페니실린 및 스트렙토마이신, 1% 나트륨 피루베이트, 1% 비-필수 아미노산 및 10% FBS로 구성된 배지에서 배양하였다. 뮤린 유선 암종 세포주 4T1(ATCC 번호: CRL-2539)을 RPMI, 1% L-글루타민, 1% 페니실린 및 스트렙토마이신, 1% 나트륨 피루베이트, 1% 비-필수 아미노산 및 10% FBS로 구성된 배지에서 계대배양하였다. 뮤린 흑색종 세포주 B16(ATCC 번호: CRL-6322)을 DMEM, 1% L-글루타민, 1% 페니실린 및 스트렙토마이신, 및 10% FBS로 구성된 배지에서 유지하였다.
3.2 마우스
야생형 C57B1/6 마우스를 할란(Harlan) 연구소(네덜란드 소재)로부터 구입하였다. 큰 T 항원의 면역우성 에피토프 I에 대해 특이적인 T 세포 수용체에 대한 형질전환 마우스를 잭슨 연구소(미국 소재)(B6.Cg-Tg(TcraY1,TcrbY1)416Tev/J)로부터 구입하였다. OVA(오브알부민)에 대해 특이적인 T 세포 수용체에 대한 형질전환 마우스를 잭슨 연구소(미국 소재)(C57B1/6-Tg(TcraTcrb)1100Mjb/j)로부터 구입하였다.
3.3 T 세포: 형질도입 벡터 및 클로닝
T 세포 형질도입을 위한 벡터는 pMP71(Schambach et al.. Mol Ther (2000), 2(5), 435-45)이었다. 제한 부위 NotI 및 EcoRI에 의해 플랭킹된 절두된 인간 표피 성장인자 수용체(막 내로 삽입된 면역학적 불활성 단백질의 원형 예로서 del-EGFR; cDNA 서열로서 서열번호 11 및 (코딩된) 아미노산 서열로서 서열번호 12 참조)를 유전자 합성으로 생성하였다. 이들 2개의 재조합 부위를 이용하여 del-EGFR을 결찰(T4 리가제, 써모 사이언티픽, 독일 소재)으로 pMP71 내로 클로닝하였다. del-EGFR-pMP71을 에셔리키아 콜라이(DH5α)에서 증폭시키고, 하기 프라이머 서열을 사용한 서열결정으로 서열을 검증하였다: 정방향 프라이머: CAGCATCGTTCTGTGTTGTCT(서열번호 13), 역방향 프라이머: CATTTAAATGTATACCCAAATCAA(서열번호 14). 퀴아젠 플라스미드 맥시 키트(퀴아젠(Qiagen), 독일 소재)를 사용하여 DNA를 추출하였다. 모든 단계들을 제조자의 설명서에 따라 수행하였다.
3.4 일차 T 세포 및 T 세포주 형질도입
형질도입을 약간 변경된, 문헌(Leisegang et al., J Mol Med, (2008) 86, 573-83)에 기재된 방법에 따라 수행하였다. 요약하건대, 팩키징 세포주 Plat E(문헌(Morita et al., Gene Ther (2000), 7, 1063-6)에 기재됨)를 6웰 플레이트에 시딩하고 70% 내지 80% 전면생장률까지 밤새 생장시켰다. 1일째 날, 16 ㎍의 DNA를 100 mM CaCl2(머크, 독일 소재) 및 126.7 μΜ 클로로퀸(시그마, 미국 소재)과 함께 혼합하였다. Plat E 세포를 저혈청 배지(3%)에서 30분 동안 굶긴 후 침전된 DNA와 함께 6시간 동안 항온처리하였다. 그 다음, 배지를 제거하고 배양 배지로 교체하였다. 2일째 날, 일차 비장세포를 C57B1/6 마우스(할란 연구소, 네덜란드 소재)로부터 채취하였다. 비장세포의 단일 세포 현탁액을 T 세포 배지에서 밤새 항-CD3(클론 145-2c11, 비디 파밍겐, 미국 소재), 항-CD28(클론 37.51, 비디 파밍겐, 미국 소재) 및 재조합 뮤린 IL-2(펩프로텍, 독일 소재)로 자극하였다. 3일째 날, 24웰 플레이트를 실온에서 2시간 동안 12.5 ㎍/㎖의 재조합 레트로넥틴(타카라 바이오텍(Takara Biotech), 일본 소재)으로 코팅하고 37℃에서 30분 동안 2% 소 혈청 알부민(로쓰(Roth), 독일 소재)으로 차단하고 PBS로 세척하였다. Plat E의 상청액을 수거하고 필터(40 ㎛, 밀리포어, 미국 소재)에 통과시켰다. 그 다음, 새로운 T 세포 배지를 Plat E 세포에 첨가하였다. 1 ㎖의 여과된 상청액을 각각의 웰에 분배하고 4℃에서 2시간 동안 회전접종하였다. 그 다음, 상청액을 24웰 플레이트로부터 제거하였다. 웰 당 106개의 T 세포를 10 U의 IL-2 및 400000개의 항-CD3 및 항-CD28 비드(인비트로겐, 독일 소재)로 보충된 1 ㎖의 T 세포 배지에 시딩하고 32℃에서 30분 동안 800 g에서 회전접종하였다. 4일째 날, Plat E 상청액을 다시 수거하고 여과하였다. 1 ㎖를 24웰 플레이트의 각각의 웰에 첨가하고 32℃에서 90분 동안 800 g에서 회전접종하였다. 그 후, 세포를 37℃에서 추가 6시간 동안 항온처리하였다. 1 ㎖ 상청액을, IL-2를 갖는 T 세포 배지로 교체하였다. 5일째 날, 세포를 수거하고 카운팅하고 ㎖ 당 10 ng의 IL-15로 보충된 T 세포 배지(펩프로텍, 독일 소재)에서 106개 세포/㎖ 밀도로 재시딩하였다. 세포 분석 또는 기능 분석을 수행하였을 때인 10일째 날까지 T 세포를 이 밀도에서 유지하였다.
3.5 항체 가교연결 분석
EpCAM 발현 4T1을 6웰 플레이트 상에 시딩하고 전면생장 상태까지 생장시켰다. del-EGFR로 형질도입된 T 세포를 제조자의 설명서에 따라 칼세인(인비트로겐, 독일 소재)으로 표지하고 37℃에서 30분 동안 20 ㎍/㎖ EpCAM x EGFR 이중특이적 항체(MAb225_scFv_G8.8)로 예비적재하였다. 세포를 37℃에서 2시간 동안 4T1 배양물에 첨가하였다. 상청액을 완전히 제거하고 플레이트를 PBS로 철저히 세척하였다. 그 다음, 세포를 형광 현미경관찰로 가시화하거나 용해하고 칼세인 체류를 다중표지 판독기(버쏠드(Berthold), 독일 소재)로 측정하였다.
3.6 사멸 분석
mGC8 세포(Nockel et al., BMC (2006), 14, 6:57) 또는 B16 세포를 제조자의 설명서에 따라 칼세인으로 표지하였다. (야생형, OT-1 또는 TCR-I 마우스로부터 수득된) del-EGFR로 형질도입된 T 세포를 37℃에서 30분 동안 20 ㎍/㎖의 항체(이중특이적 또는 대조군 항체)로 예비적재하였다. 그 다음, T 세포를 37℃에서 밤새 상이한 표적 대 이펙터 세포 비로 표적 세포와 함께 항온처리하였다. 6% 트라이톤 X(퍼마(Firma))를 첨가하여 표적 세포의 총 용해를 유도하였다. % 용해를 하기 식에 따라 계산하였다:
(MFI관심있는 - MFI배경)/(MFI총 용해 - MFI배경) * 100
3.7 생체내 치료
야생형 C57B1/6 마우스를 5x106개의 mGC8 세포로 피하 접종하였다. 종양이 촉진될 수 있게 되었을 때(15일째 날까지), T 세포 형질도입을 시작하였고, 10일 후 치료를 복강내로(항체의 경우 10 mg/kg의 용량으로) 또는 정맥내로(T 세포 또는 예비적재된 T 세포의 경우 마우스 당 5x106개 세포의 용량으로) 제공하였다. 1주 후 치료를 반복하였다. 피하 종양을 측정함으로써 마우스를 2일 또는 3일마다 모니터링하였다. 마우스를 예정된 시점에서 규정에 따라 또는 GV SOLAS(Morton, Vet Rec (1985) 116, 431-436)에 의해 공개된 기준에 따라 사멸하였다.
3.8. 통계학적 분석
군들 사이의 비교를 위해, 비대응 T 검정을 적용하였다. 이원 아노바(ANOVA)로 종양 부피를 비교하였고, 로그 등급 검정을 이용하여 생존 차이를 평가하였다. 그래프패드 프리즘 소프트웨어(그래프패드 소프트웨어 인코포레이티드(GraphPad software Inc.))를 이용하여 모든 통계학적 분석을 수행하였다. 결과는 p가 0.05 미만일 때 유의한 것으로 간주되었다.
실시예 4: 이중특이적 항체 BsAb EpCAM-EGFRvIII, MR1.1의 클로닝 및 발현
실시예 1 및 2와 유사하게, (A) (인간) EGFRvIII 및 (뮤린) EpCAM을 표적화하는 이중특이적 항체 BsAb EpCAM-EGFRvIII, MR1.1의 분석 크기 배제 크로마토그래피를 준비하고 정제하고 특징규명하였다(도 20 참조; 상기 이중특이적 항체의 (A) 분석 크기 배제 크로마토그래피 및 (B) 비-환원(NR) 및 환원(R) SDS-PAGE 분석; 쿠마시 블루로 염색됨).
실시예 5: 이중특이적 항체 BsAb EpCAM-EGFRvIII, MR1.1을 통한 형질도입된 T 세포와 B16 흑색종 세포의 가교연결(도 21의 반응식 참조)
EpCAM 발현 B16 흑색종 세포(GFP로 표지됨)(B16-OVA-mEpCAM 세포)를 12웰 플레이트에 시딩하고 전면생장 상태까지 밤새 생장시켰다. 다음 날, del-hEGFRvIII으로 형질도입된(삽입된 del-hEGFRvIII; DNA 서열로서 서열번호 17 및 (코딩된) 아미노산 서열로서 서열번호 18 참조) B3Z T 세포(영구적인 세포주)를 37℃에서 1시간 동안 이중특이적 항체 BsAb EpCAM-EGFRvIII, MR1.1(20 ㎍)과 함께 예비항온처리하였다. 그 후, 결합되지 않은 잔존 이중특이적 항체를 세척하여 제거하였다. 이중특이적 항체(BiAb)로 예비적재된 B3Z T 세포를 37℃에서 부착 B16 종양 세포와 함께 항온처리하였다(컬럼 번호 5). PBS로 4회 철저히 세척한 후(컬럼 번호 1 내지 4), 잔존 세포를 트립신으로 처리하고, 형광 세포 및 비-형광 세포를 유세포측정으로 측정하였다. 대조군으로서 B16 흑색종 세포를 del-EGFRvIII으로 형질도입된 B3Z T 세포만(항체 BsAb EpCAM-EGFRvIII을 사용하지 않음; 컬럼 번호 2 참조)으로 처리하였거나; 세척을 수행하거나 수행하지 않으면서, 비형질도입된 B3Z T 세포만(항체 BsAb EpCAM-EGFRvIII을 사용하지 않음; 컬럼 번호 3 참조)으로 처리하였거나; 이중특이적 항체 BsAb EpCAM-EGFRvIII과 함께 비형질도입된 B3Z T 세포(컬럼 번호 4)로 처리하였다. 이중특이적 항체(BiAb) BsAb EpCAM-EGFRvIII(컬럼 번호 1)은 세척을 수행하였을 때 플라스크에서 임의의 대조군(컬럼 번호 2 내지 4)보다 더 많은 형질도입된 세포를 보유하였다. 결과는 도 22에 제시되어 있다.
<110> F. Hoffmann-La Roche AG Ludwig-Maximilians-Universitat Munchen <120> Bispecific antibody molecules with antigen-transfected T-cells and their use in medicine <130> T2753 PCT S3 <140> PCT/EP2013/051351 <141> 2013-01-24 <150> EP 12153786.4 <151> 2012-02-03 <160> 18 <170> BiSSAP 1.0 <210> 1 <211> 234 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> SOURCE <222> 1..234 <223> /mol_type="protein" /note="MAb 225 (human EGFR-specific antibody) light chain" /organism="Homo sapiens" <400> 1 Met Arg Cys Leu Ala Glu Phe Leu Gly Leu Leu Val Leu Trp Ile Pro 1 5 10 15 Gly Ala Ile Gly Asp Ile Leu Leu Thr Gln Ser Pro Val Ile Leu Ser 20 25 30 Val Ser Pro Gly Glu Arg Val Ser Phe Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser 35 40 45 Ile Gly Thr Asn Ile His Trp Tyr Gln Gln Arg Thr Asn Gly Ser Pro 50 55 60 Arg Leu Leu Ile Lys Tyr Ala Ser Glu Ser Ile Ser Gly Ile Pro Ser 65 70 75 80 Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Ser Ile Asn 85 90 95 Ser Val Glu Ser Glu Asp Ile Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Gln Asn Asn 100 105 110 Asn Trp Pro Thr Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys Arg 115 120 125 Ala Asp Ala Ala Pro Thr Val Ser Ile Phe Pro Pro Ser Ser Glu Gln 130 135 140 Leu Thr Ser Gly Gly Ala Ser Val Val Cys Phe Leu Asn Asn Phe Tyr 145 150 155 160 Pro Lys Asp Ile Asn Val Lys Trp Lys Ile Asp Gly Ser Glu Arg Gln 165 170 175 Asn Gly Val Leu Asn Ser Trp Thr Asp Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr 180 185 190 Tyr Ser Met Ser Ser Thr Leu Thr Leu Thr Lys Asp Glu Tyr Glu Arg 195 200 205 His Asn Ser Tyr Thr Cys Glu Ala Thr His Lys Thr Ser Thr Ser Pro 210 215 220 Ile Val Lys Ser Phe Asn Arg Asn Glu Cys 225 230 <210> 2 <211> 468 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> SOURCE <222> 1..468 <223> /mol_type="protein" /note="MAb 225 (human EGFR-specific antibody) heavy chain" /organism="Homo sapiens" <400> 2 Met Ala Val Leu Ala Leu Leu Phe Cys Leu Val Thr Phe Pro Ser Cys 1 5 10 15 Val Leu Ser Gln Val Gln Leu Lys Gln Ser Gly Pro Gly Leu Val Gln 20 25 30 Pro Ser Gln Ser Leu Ser Ile Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu 35 40 45 Thr Asn Tyr Gly Val His Trp Val Arg Gln Ser Pro Gly Lys Gly Leu 50 55 60 Glu Trp Leu Gly Val Ile Trp Ser Gly Gly Asn Thr Asp Tyr Asn Thr 65 70 75 80 Pro Phe Thr Ser Arg Leu Ser Ile Asn Lys Asp Asn Ser Lys Ser Gln 85 90 95 Val Phe Phe Lys Met Asn Ser Leu Gln Ser Asn Asp Thr Ala Ile Tyr 100 105 110 Tyr Cys Ala Arg Ala Leu Thr Tyr Tyr Asp Tyr Glu Phe Ala Tyr Trp 115 120 125 Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ala Ala Lys Thr Thr Ala Pro 130 135 140 Ser Val Tyr Pro Leu Ala Pro Val Cys Gly Asp Thr Thr Gly Ser Ser 145 150 155 160 Val Thr Leu Gly Cys Leu Val Lys Gly Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr 165 170 175 Leu Thr Trp Asn Ser Gly Ser Leu Ser Ser Gly Val His Thr Phe Pro 180 185 190 Ala Val Leu Gln Ser Asp Leu Tyr Thr Leu Ser Ser Ser Val Thr Val 195 200 205 Thr Ser Ser Thr Trp Pro Ser Gln Ser Ile Thr Cys Asn Val Ala His 210 215 220 Pro Ala Ser Ser Thr Lys Val Asp Lys Lys Ile Glu Pro Arg Gly Pro 225 230 235 240 Thr Ile Lys Pro Cys Pro Pro Cys Lys Cys Pro Ala Pro Asn Leu Leu 245 250 255 Gly Gly Pro Ser 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agctgcccat gagaaattta 420 caggaaatcc tgcatggcgc cgtgcggttc agcaacaacc ctgccctgtg caacgtggag 480 agcatccagt ggcgggacat agtcagcagt gactttctca gcaacatgtc gatggacttc 540 cagaaccacc tgggcagctg ccaaaagtgt gatccaagct gtcccaatgg gagctgctgg 600 ggtgcaggag aggagaactg ccagaaactg accaaaatca tctgtgccca gcagtgctcc 660 gggcgctgcc gtggcaagtc ccccagtgac tgctgccaca accagtgtgc tgcaggctgc 720 acaggccccc gggagagcga ctgcctggtc tgccgcaaat tccgagacga agccacgtgc 780 aaggacacct gccccccact catgctctac aaccccacca cgtaccagat ggatgtgaac 840 cccgagggca aatacagctt tggtgccacc tgcgtgaaga agtgtccccg taattatgtg 900 gtgacagatc acggctcgtg cgtccgagcc tgtggggccg acagctatga gatggaggaa 960 gacggcgtcc gcaagtgtaa gaagtgcgaa gggccttgcc gcaaagtgtg taacggaata 1020 ggtattggtg aatttaaaga ctcactctcc ataaatgcta cgaatattaa acacttcaaa 1080 aactgcacct ccatcagtgg cgatctccac atcctgccgg tggcatttag gggtgactcc 1140 ttcacacata ctcctcctct ggatccacag gaactggata ttctgaaaac cgtaaaggaa 1200 atcacagggt ttttgctgat tcaggcttgg cctgaaaaca ggacggacct ccatgccttt 1260 gagaacctag aaatcatacg cggcaggacc aagcaacatg gtcagttttc tcttgcagtc 1320 gtcagcctga acataacatc cttgggatta cgctccctca aggagataag tgatggagat 1380 gtgataattt caggaaacaa aaatttgtgc tatgcaaata caataaactg gaaaaaactg 1440 tttgggacct ccggtcagaa aaccaaaatt ataagcaaca gaggtgaaaa cagctgcaag 1500 gccacaggcc aggtctgcca tgccttgtgc tcccccgagg gctgctgggg cccggagccc 1560 agggactgcg tctcttgccg gaatgtcagc cgaggcaggg aatgcgtgga caagtgcaac 1620 cttctggagg gtgagccaag ggagtttgtg gagaactctg agtgcataca gtgccaccca 1680 gagtgcctgc ctcaggccat gaacatcacc tgcacaggac ggggaccaga caactgtatc 1740 cagtgtgccc actacattga cggcccccac tgcgtcaaga cctgcccggc aggagtcatg 1800 ggagaaaaca acaccctggt ctggaagtac gcagacgccg gccatgtgtg ccacctgtgc 1860 catccaaact gcacctacgg atgcactggg ccaggtcttg aaggctgtcc aacgaatggg 1920 cctaagatcc cgtccatcgc cactgggatg gtgggggccc tcctcttgct gctggtggtg 1980 gccctgggga tcggcctctt catgcgaagg cgccacatcg ttcggaagcg ctga 2034 <210> 12 <211> 677 <212> PRT <213> artificial sequences <220> <221> SOURCE <222> 1..677 <223> /mol_type="protein" /note="Recombinant human EGFR ectodomain + transmembrane domain" /organism="artificial sequences" <400> 12 Met Arg Pro Ser Gly Thr Ala Gly Ala Ala Leu Leu Ala Leu Leu Ala 1 5 10 15 Ala Leu Cys Pro Ala Ser Arg Ala Leu Glu Glu Lys Lys Val Cys Gln 20 25 30 Gly Thr Ser Asn Lys Leu Thr Gln Leu Gly Thr Phe Glu Asp His Phe 35 40 45 Leu Ser Leu Gln Arg Met Phe Asn Asn Cys Glu Val Val Leu Gly Asn 50 55 60 Leu Glu Ile Thr Tyr Val Gln Arg Asn Tyr Asp Leu Ser Phe Leu Lys 65 70 75 80 Thr Ile Gln Glu Val Ala Gly Tyr Val Leu Ile Ala Leu Asn Thr Val 85 90 95 Glu Arg Ile Pro Leu Glu Asn Leu Gln Ile Ile Arg Gly Asn Met Tyr 100 105 110 Tyr Glu Asn Ser Tyr Ala Leu Ala Val Leu Ser Asn Tyr Asp Ala Asn 115 120 125 Lys Thr Gly Leu Lys Glu Leu Pro Met Arg Asn Leu Gln Glu Ile Leu 130 135 140 His Gly Ala Val Arg Phe Ser Asn Asn Pro Ala Leu Cys Asn Val Glu 145 150 155 160 Ser Ile Gln Trp Arg Asp Ile Val Ser Ser Asp Phe Leu Ser Asn Met 165 170 175 Ser Met Asp Phe Gln Asn His Leu Gly Ser Cys Gln Lys Cys Asp Pro 180 185 190 Ser Cys Pro Asn Gly Ser Cys Trp Gly Ala Gly Glu Glu Asn Cys Gln 195 200 205 Lys Leu Thr Lys Ile Ile Cys Ala Gln Gln Cys Ser Gly Arg Cys Arg 210 215 220 Gly Lys Ser Pro Ser Asp Cys Cys His Asn Gln Cys Ala Ala Gly Cys 225 230 235 240 Thr Gly Pro Arg Glu Ser Asp Cys Leu Val Cys Arg Lys Phe Arg Asp 245 250 255 Glu Ala Thr Cys Lys Asp Thr Cys Pro Pro Leu Met Leu Tyr Asn Pro 260 265 270 Thr Thr Tyr Gln Met Asp Val Asn Pro Glu Gly Lys Tyr Ser Phe Gly 275 280 285 Ala Thr Cys Val Lys Lys Cys Pro Arg Asn Tyr Val Val Thr Asp His 290 295 300 Gly Ser Cys Val Arg Ala Cys Gly Ala Asp Ser Tyr Glu Met Glu Glu 305 310 315 320 Asp Gly Val Arg Lys Cys Lys Lys Cys Glu Gly Pro Cys Arg Lys Val 325 330 335 Cys Asn Gly Ile Gly Ile Gly Glu Phe Lys Asp Ser Leu Ser Ile Asn 340 345 350 Ala Thr Asn Ile Lys His Phe Lys Asn Cys Thr Ser Ile Ser Gly Asp 355 360 365 Leu His Ile Leu Pro Val Ala Phe Arg Gly Asp Ser Phe Thr His Thr 370 375 380 Pro Pro Leu Asp Pro Gln Glu Leu Asp Ile Leu Lys Thr Val Lys Glu 385 390 395 400 Ile Thr Gly Phe Leu Leu Ile Gln Ala Trp Pro Glu Asn Arg Thr Asp 405 410 415 Leu His Ala Phe Glu Asn Leu Glu Ile Ile Arg Gly Arg Thr Lys Gln 420 425 430 His Gly Gln Phe Ser Leu Ala Val Val Ser Leu Asn Ile Thr Ser Leu 435 440 445 Gly Leu Arg Ser Leu Lys Glu Ile Ser Asp Gly Asp Val Ile Ile Ser 450 455 460 Gly Asn Lys Asn Leu Cys Tyr Ala Asn Thr Ile Asn Trp Lys Lys Leu 465 470 475 480 Phe Gly Thr Ser Gly Gln Lys Thr Lys Ile Ile Ser Asn Arg Gly Glu 485 490 495 Asn Ser Cys Lys Ala Thr Gly Gln Val Cys His Ala Leu Cys Ser Pro 500 505 510 Glu Gly Cys Trp Gly Pro Glu Pro Arg Asp Cys Val Ser Cys Arg Asn 515 520 525 Val Ser Arg Gly Arg Glu Cys Val Asp Lys Cys Asn Leu Leu Glu Gly 530 535 540 Glu Pro Arg Glu Phe Val Glu Asn Ser Glu Cys Ile Gln Cys His Pro 545 550 555 560 Glu Cys Leu Pro Gln Ala Met Asn Ile Thr Cys Thr Gly Arg Gly Pro 565 570 575 Asp Asn Cys Ile Gln Cys Ala His Tyr Ile Asp Gly Pro His Cys Val 580 585 590 Lys Thr Cys Pro Ala Gly Val Met Gly Glu Asn Asn Thr Leu Val Trp 595 600 605 Lys Tyr Ala Asp Ala Gly His Val Cys His Leu Cys His Pro Asn Cys 610 615 620 Thr Tyr Gly Cys Thr Gly Pro Gly Leu Glu Gly Cys Pro Thr Asn Gly 625 630 635 640 Pro Lys Ile Pro Ser Ile Ala Thr Gly Met Val Gly Ala Leu Leu Leu 645 650 655 Leu Leu Val Val Ala Leu Gly Ile Gly Leu Phe Met Arg Arg Arg His 660 665 670 Ile Val Arg Lys Arg 675 <210> 13 <211> 21 <212> DNA <213> artificial sequences <220> <221> source <222> 1..21 <223> /mol_type="DNA" /note="forward primer" /organism="artificial sequences" <400> 13 cagcatcgtt ctgtgttgtc t 21 <210> 14 <211> 24 <212> DNA <213> artificial sequences <220> <221> source <222> 1..24 <223> /mol_type="DNA" /note="primer" /organism="artificial sequences" <400> 14 catttaaatg tatacccaaa tcaa 24 <210> 15 <211> 214 <212> PRT <213> artificial sequences <220> <221> SOURCE <222> 1..214 <223> /mol_type="protein" /note="“BsAb EpCAM-EGFRvIII, MR1.1” light chain without leader se quence" /organism="artificial sequences" <400> 15 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ser Ala Ser Leu Gly 1 5 10 15 Glu Thr Val Ser Ile Glu Cys Leu Ala Ser Glu Gly Ile Ser Asn Asp 20 25 30 Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Ser Gly Lys Ser Pro Gln Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Ala Thr Ser Arg Leu Gln Asp Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Arg Tyr Ser Leu Lys Ile Ser Gly Met Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Phe Cys Gln Gln Ser Tyr Lys Tyr Pro Trp 85 90 95 Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys Arg Ala Asp Ala Ala 100 105 110 Pro Thr Val Ser Ile Phe Pro Pro Ser Ser Glu Gln Leu Thr Ser Gly 115 120 125 Gly Ala Ser Val Val Cys Phe Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Lys Asp Ile 130 135 140 Asn Val Lys Trp Lys Ile Asp Gly Ser Glu Arg Gln Asn Gly Val Leu 145 150 155 160 Asn Ser Trp Thr Asp Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Met Ser 165 170 175 Ser Thr Leu Thr Leu Thr Lys Asp Glu Tyr Glu Arg His Asn Ser Tyr 180 185 190 Thr Cys Glu Ala Thr His Lys Thr Ser Thr Ser Pro Ile Val Lys Ser 195 200 205 Phe Asn Arg Asn Glu Cys 210 <210> 16 <211> 703 <212> PRT <213> artificial sequences <220> <221> SOURCE <222> 1..703 <223> /mol_type="protein" /note="“BsAb EpCAM-EGFRvIII, MR1.1” heavy chain without leader se quence" /organism="artificial sequences" <400> 16 Glu Val Gln Leu Ala Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Arg 1 5 10 15 Ser Met Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asn Phe 20 25 30 Pro Met Ala Trp Val Arg Gln Ala Pro Thr Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Thr Ile Ser Thr Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Arg Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Ser Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys 85 90 95 Thr Arg Thr Leu Tyr Ile Leu Arg Val Phe Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly 100 105 110 Gln Gly Val Met Val Thr Val Ser Ser Ala Lys Thr Thr Ala Pro Ser 115 120 125 Val Tyr Pro Leu Ala Pro Val Cys Gly Asp Thr Thr Gly Ser Ser Val 130 135 140 Thr Leu Gly Cys Leu Val Lys Gly Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Leu 145 150 155 160 Thr Trp Asn Ser Gly Ser Leu Ser Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala 165 170 175 Val Leu Gln Ser Asp Leu Tyr Thr Leu Ser Ser Ser Val Thr Val Thr 180 185 190 Ser Ser Thr Trp Pro Ser Gln Ser Ile Thr Cys Asn Val Ala His Pro 195 200 205 Ala Ser Ser Thr Lys Val Asp Lys Lys Ile Glu Pro Arg Gly Pro Thr 210 215 220 Ile Lys Pro Cys Pro Pro Cys Lys Cys Pro Ala Pro Asn Leu Leu Gly 225 230 235 240 Gly Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Lys Ile Lys Asp Val Leu Met 245 250 255 Ile Ser Leu Ser Pro Ile Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Glu 260 265 270 Asp Asp Pro Asp Val Gln Ile Ser Trp Phe Val Asn Asn Val Glu Val 275 280 285 His Thr Ala Gln Thr Gln Thr His Arg Glu Asp Tyr Asn Ser Thr Leu 290 295 300 Arg Val Val Ser Ala Leu Pro Ile Gln His Gln Asp Trp Met Ser Gly 305 310 315 320 Lys Glu Phe Lys Cys Lys Val Asn Asn Lys Asp Leu Pro Ala Pro Ile 325 330 335 Glu Arg Thr Ile Ser Lys Pro Lys Gly Ser Val Arg Ala Pro Gln Val 340 345 350 Tyr Val Leu Pro Pro Pro Glu Glu Glu Met Thr Lys Lys Gln Val Thr 355 360 365 Leu Thr Cys Met Val Thr Asp Phe Met Pro Glu Asp Ile Tyr Val Glu 370 375 380 Trp Thr Asn Asn Gly Lys Thr Glu Leu Asn Tyr Lys Asn Thr Glu Pro 385 390 395 400 Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Tyr Phe Met Tyr Ser Lys Leu Arg Val 405 410 415 Glu Lys Lys Asn Trp Val Glu Arg Asn Ser Tyr Ser Cys Ser Val Val 420 425 430 His Glu Gly Leu His Asn His His Thr Thr Lys Ser Phe Ser Arg Thr 435 440 445 Pro Gly Lys Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln Val Lys 450 455 460 Leu Gln Gln Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Ala Ser Leu Lys 465 470 475 480 Leu Ser Cys Val Thr Ser Gly Phe Thr Phe Arg Lys Phe Gly Met Ser 485 490 495 Trp Val Arg Gln Thr Ser Asp Lys Arg Leu Glu Trp Val Ala Ser Ile 500 505 510 Ser Thr Gly Gly Tyr Asn Thr Tyr Tyr Ser Asp Asn Val Lys Gly Arg 515 520 525 Phe Thr Ile Ser Arg Glu Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met 530 535 540 Ser Ser Leu Lys Ser Glu Asp Thr Ala Leu Tyr Tyr Cys Thr Arg Gly 545 550 555 560 Tyr Ser Pro Tyr Ser Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr 565 570 575 Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly 580 585 590 Gly Gly Gly Ser Asp Ile Glu Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ser 595 600 605 Val Ala Thr Gly Glu Lys Val Thr Ile Arg Cys Met Thr Ser Thr Asp 610 615 620 Ile Asp Asp Asp Met Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Glu Pro Pro 625 630 635 640 Lys Phe Leu Ile Ser Glu Gly Asn Thr Leu Arg Pro Gly Val Pro Ser 645 650 655 Arg Phe Ser Ser Ser Gly Thr Gly Thr Asp Phe Val Phe Thr Ile Glu 660 665 670 Asn Thr Leu Ser Glu Asp Val Gly Asp Tyr Tyr Cys Leu Gln Ser Trp 675 680 685 Asn Val Pro Leu Thr Phe Gly Asp Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 690 695 700 <210> 17 <211> 1253 <212> DNA <213> artificial sequences <220> <221> source <222> 1..1253 <223> /mol_type="DNA" /note="del-hEGFRvIII" /organism="artificial sequences" <400> 17 gcggccgcgc caccatgcga ccctccggga cggccggggc agcgctcctg gcgctgctgg 60 ctgcgctctg cccggcgagt cgggctctgg aggaaaagaa aggtaattat gtggtgacag 120 atcacggctc gtgcgtccga gcctgtgggg ccgacagcta tgagatggag gaagacggcg 180 tccgcaagtg taagaagtgc gaagggcctt gccgcaaagt gtgtaacgga ataggtattg 240 gtgaatttaa agactcactc tccataaatg ctacgaatat taaacacttc aaaaactgca 300 cctccatcag tggcgatctc cacatcctgc cggtggcatt taggggtgac tccttcacac 360 atactcctcc tctggatcca caggaactgg atattctgaa aaccgtaaag gaaatcacag 420 ggtttttgct gattcaggct tggcctgaaa acaggacgga cctccatgcc tttgagaacc 480 tagaaatcat acgcggcagg accaagcaac atggtcagtt ttctcttgca gtcgtcagcc 540 tgaacataac atccttggga ttacgctccc tcaaggagat aagtgatgga gatgtgataa 600 tttcaggaaa caaaaatttg tgctatgcaa atacaataaa ctggaaaaaa ctgtttggga 660 cctccggtca gaaaaccaaa attataagca acagaggtga aaacagctgc aaggccacag 720 gccaggtctg ccatgccttg tgctcccccg agggctgctg gggcccggag cccagggact 780 gcgtctcttg ccggaatgtc agccgaggca gggaatgcgt ggacaagtgc aaccttctgg 840 agggtgagcc aagggagttt gtggagaact ctgagtgcat acagtgccac ccagagtgcc 900 tgcctcaggc catgaacatc acctgcacag gacggggacc agacaactgt atccagtgtg 960 cccactacat tgacggcccc cactgcgtca agacctgccc ggcaggagtc atgggagaaa 1020 acaacaccct ggtctggaag tacgcagacg ccggccatgt gtgccacctg tgccatccaa 1080 actgcaccta cggatgcact gggccaggtc ttgaaggctg tccaacgaat gggcctaaga 1140 tcccgtccat cgccactggg atggtggggg ccctcctctt gctgctggtg gtggccctgg 1200 ggatcggcct cttcatgcga aggcgccaca tcgttcggaa gcgctgagaa ttc 1253 <210> 18 <211> 410 <212> PRT <213> artificial sequences <220> <221> SOURCE <222> 1..410 <223> /mol_type="protein" /note="del-hEGFRvIII" /organism="artificial sequences" <400> 18 Met Arg Pro Ser Gly Thr Ala Gly Ala Ala Leu Leu Ala Leu Leu Ala 1 5 10 15 Ala Leu Cys Pro Ala Ser Arg Ala Leu Glu Glu Lys Lys Gly Asn Tyr 20 25 30 Val Val Thr Asp His Gly Ser Cys Val Arg Ala Cys Gly Ala Asp Ser 35 40 45 Tyr Glu Met Glu Glu Asp Gly Val Arg Lys Cys Lys Lys Cys Glu Gly 50 55 60 Pro Cys Arg Lys Val Cys Asn Gly Ile Gly Ile Gly Glu Phe Lys Asp 65 70 75 80 Ser Leu Ser Ile Asn Ala Thr Asn Ile Lys His Phe Lys Asn Cys Thr 85 90 95 Ser Ile Ser Gly Asp Leu His Ile Leu Pro Val Ala Phe Arg Gly Asp 100 105 110 Ser Phe Thr His Thr Pro Pro Leu Asp Pro Gln Glu Leu Asp Ile Leu 115 120 125 Lys Thr Val Lys Glu Ile Thr Gly Phe Leu Leu Ile Gln Ala Trp Pro 130 135 140 Glu Asn Arg Thr Asp Leu His Ala Phe Glu Asn Leu Glu Ile Ile Arg 145 150 155 160 Gly Arg Thr Lys Gln His Gly Gln Phe Ser Leu Ala Val Val Ser Leu 165 170 175 Asn Ile Thr Ser Leu Gly Leu Arg Ser Leu Lys Glu Ile Ser Asp Gly 180 185 190 Asp Val Ile Ile Ser Gly Asn Lys Asn Leu Cys Tyr Ala Asn Thr Ile 195 200 205 Asn Trp Lys Lys Leu Phe Gly Thr Ser Gly Gln Lys Thr Lys Ile Ile 210 215 220 Ser Asn Arg Gly Glu Asn Ser Cys Lys Ala Thr Gly Gln Val Cys His 225 230 235 240 Ala Leu Cys Ser Pro Glu Gly Cys Trp Gly Pro Glu Pro Arg Asp Cys 245 250 255 Val Ser Cys Arg Asn Val Ser Arg Gly Arg Glu Cys Val Asp Lys Cys 260 265 270 Asn Leu Leu Glu Gly Glu Pro Arg Glu Phe Val Glu Asn Ser Glu Cys 275 280 285 Ile Gln Cys His Pro Glu Cys Leu Pro Gln Ala Met Asn Ile Thr Cys 290 295 300 Thr Gly Arg Gly Pro Asp Asn Cys Ile Gln Cys Ala His Tyr Ile Asp 305 310 315 320 Gly Pro His Cys Val Lys Thr Cys Pro Ala Gly Val Met Gly Glu Asn 325 330 335 Asn Thr Leu Val Trp Lys Tyr Ala Asp Ala Gly His Val Cys His Leu 340 345 350 Cys His Pro Asn Cys Thr Tyr Gly Cys Thr Gly Pro Gly Leu Glu Gly 355 360 365 Cys Pro Thr Asn Gly Pro Lys Ile Pro Ser Ile Ala Thr Gly Met Val 370 375 380 Gly Ala Leu Leu Leu Leu Leu Val Val Ala Leu Gly Ile Gly Leu Phe 385 390 395 400 Met Arg Arg Arg His Ile Val Arg Lys Arg 405 410

Claims (28)

  1. (A) (i) CD8+ T 세포 내에서 또는 상에서 천연적으로 발생하지 않는 CD8+ T 세포 상의 항원에 결합하는 제1 결합 도메인, 및
    (ii) 종양 세포의 표면 상에서 천연적으로 발생하는 종양 특이적 항원에 결합하는 제2 결합 도메인
    을 포함하는 이중특이적 항체 분자; 및
    (B) 치료되는 대상체로부터 수득된 CD8+ T 세포를 상기 CD8+ T 세포 내에서 또는 상에서 천연적으로 발생하지 않는 항원으로 형질도입하는 데에 요구되는 물질
    을 포함하는 키트.
  2. 제1항에 있어서,
    CD8+ T 세포를 형질도입하는 데에 요구되는 물질이 상기 CD8+ T 세포 내에서 또는 상에서 천연적으로 발생하지 않는 항원을 코딩하는 핵산인, 키트.
  3. (i) CD8+ T 세포 내에서 또는 상에서 천연적으로 발생하지 않는 CD8+ T 세포 상의 항원에 결합하는 제1 결합 도메인, 및
    (ii) 종양 세포의 표면 상에서 천연적으로 발생하는 종양 특이적 항원에 결합하는 제2 결합 도메인
    을 포함하는, 약제로서 사용되는 이중특이적 항체 분자로서, 이때 상기 이중특이적 항체 분자가 CD8+ T 세포 내에서 또는 상에서 천연적으로 발생하지 않는 항원을 포함하는 형질도입된 CD8+ T 세포의 투여 전에, 투여와 동시에 또는 투여 후에 투여되고, 상기 CD8+ T 세포가 치료되는 대상체로부터 수득되는, 이중특이적 항체 분자.
  4. CD8+ T 세포 내에서 또는 상에서 천연적으로 발생하지 않는 항원을 포함하는 형질도입된 CD8+ T 세포와 함께 투여되는,
    (i) CD8+ T 세포 내에서 또는 상에서 천연적으로 발생하지 않는 CD8+ T 세포 상의 항원에 결합하는 제1 결합 도메인, 및
    (ii) 종양 세포의 표면 상에서 천연적으로 발생하는 종양 특이적 항원에 결합하는 제2 결합 도메인
    을 포함하는 이중특이적 항체 분자를 포함하는 약학 조성물로서, 이때 상기 이중특이적 항체 분자가 상기 형질도입된 CD8+ T 세포의 투여 전에, 투여와 동시에 또는 투여 후에 투여되고, 상기 CD8+ T 세포가 치료되는 대상체로부터 수득되는, 약학 조성물.
  5. (i) CD8+ T 세포 내에서 또는 상에서 천연적으로 발생하지 않는 CD8+ T 세포 상의 항원에 결합하는 제1 결합 도메인, 및
    (ii) 종양 세포의 표면 상에서 천연적으로 발생하는 종양 특이적 항원에 결합하는 제2 결합 도메인
    을 포함하는, 악성 질환의 치료 방법에서 사용되는 이중특이적 항체 분자로서, 이때 상기 이중특이적 항체 분자가 CD8+ T 세포 내에서 또는 상에서 천연적으로 발생하지 않는 항원을 포함하는 형질도입된 CD8+ T 세포의 투여 전에, 투여와 동시에 또는 투여 후에 투여되고, 상기 CD8+ T 세포가 치료되는 대상체로부터 수득되는, 이중특이적 항체 분자.
  6. (i) CD8+ T 세포 내에서 또는 상에서 천연적으로 발생하지 않는 CD8+ T 세포 상의 항원에 결합하는 제1 결합 도메인, 및
    (ii) 종양 세포의 표면 상에서 천연적으로 발생하는 종양 특이적 항원에 결합하는 제2 결합 도메인
    을 포함하는 이중특이적 항체 분자를 악성 질환의 치료가 필요한 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는 악성 질환의 치료 방법으로서, 이때 상기 이중특이적 항체 분자가 CD8+ T 세포 내에서 또는 상에서 천연적으로 발생하지 않는 항원을 포함하는 상기 대상체로부터의 형질도입된 CD8+ T 세포의 투여 전에, 투여와 동시에 또는 투여 후에 투여되는, 치료 방법.
  7. 제5항 또는 제6항에 있어서,
    악성 질환이 상피, 내피 또는 중피 유래의 암 및 혈액암으로부터 선택되는, 이중특이적 항체 분자 또는 치료 방법.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서,
    이중특이적 항체 분자가 전체 항체, F(ab) 단편, Fab'-SH 단편, Fv 단편, Fab' 단편, F(ab')2 단편, 키메라 항체, CDR-이식된 항체, 전체 인간 항체, 2가 항체 구축물, 항체-융합 단백질, 합성 항체, 2가 항체, 3가 항체, 4가 항체, 2가 단일 쇄 항체, 3가 단일 쇄 항체 및 다가 단일 쇄 항체로 구성된 군으로부터 선택되는, 키트, 약학 조성물, 이중특이적 항체 분자 또는 치료 방법.
  9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서,
    CD8+ T 세포 내에서 또는 상에서 천연적으로 발생하지 않는 항원이 cripto(크립틱 패밀리 단백질), CD(분화의 클러스터) 패밀리(비-T 세포)의 구성원, EGFR 및 TSH-R로 구성된 군으로부터 선택되는, 키트, 약학 조성물, 이중특이적 항체 분자 또는 치료 방법.
  10. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서,
    종양 세포의 표면 상에서 천연적으로 발생하는 항원이 EpCAM, HER-1, HER-2, HER-3, CD20, CD22, CD33, CD52, CA-12-5, HLA-DR, MUC-1(뮤신), A33-항원, PSMA(전립선 특이적 막 항원), 트랜스페린 수용체, 테나신(Tenascin) 및 CA-IX로 구성된 군으로부터 선택되는, 키트, 약학 조성물, 이중특이적 항체 분자 또는 치료 방법.
  11. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서,
    제1 결합 도메인 및/또는 제2 결합 도메인이 인간 및/또는 인간화된 결합 도메인인, 키트, 약학 조성물, 이중특이적 항체 분자 또는 치료 방법.
  12. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서,
    형질도입된 CD8+ T 세포가 상기 T 세포 상에서 천연적으로 발생하는 T 세포 수용체 및/또는 상기 T 세포 내로 유전적으로 도입되어 있는 T 세포 수용체를 추가로 포함하는, 키트, 약학 조성물, 이중특이적 항체 분자 또는 치료 방법.
  13. 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서,
    이중특이적 항체 분자가 핵산 서열에 의해 코딩되는, 키트, 약학 조성물, 이중특이적 항체 분자 또는 치료 방법.
  14. 제13항의 핵산 서열을 포함하는 벡터.
  15. 제14항에 있어서,
    제13항의 핵산 서열에 작동가능하게 연결된 조절 서열을 추가로 포함하는 벡터.
  16. 제14항 또는 제15항에 있어서,
    발현 벡터인 벡터.
  17. 제14항 내지 제16항 중 어느 한 항에서 정의된 벡터로 형질전환된 숙주 세포.
  18. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에서 정의된 이중특이적 항체 분자를 제조하는 방법으로서,
    (a) 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에서 정의된 이중특이적 항체 분자의 발현을 허용하는 조건 하에서 제17항에서 정의된 숙주 세포를 배양하는 단계; 및
    (b) 제조된 이중특이적 항체 분자를 배양물로부터 회수하는 단계
    를 포함하는 방법.
  19. (i) CD8+ T 세포 내에서 또는 상에서 천연적으로 발생하지 않는 CD8+ T 세포 상의 항원에 결합하는 제1 결합 도메인; 및
    (ii) 종양 세포의 표면 상에서 천연적으로 발생하는 종양 특이적 항원에 결합하는 제2 결합 도메인
    을 포함하는, 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에서 정의된 이중특이적 항체 분자로서, 제18항의 방법에 의해 제조된 이중특이적 항체 분자.
  20. (a) 대상체로부터 CD8+ T 세포를 단리하는 단계;
    (b) 상기 단리된 CD8+ T 세포를 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에서 정의된 바와 같이 CD8+ T 세포 내에서 및/또는 상에서 천연적으로 발생하지 않는 항원으로 형질도입하는 단계; 및
    (c) 상기 형질도입된 CD8+ T 세포를 상기 대상체에게 투여하는 단계
    를 포함하는, 대상체에서 질환을 치료하는 방법.
  21. 제20항에 있어서,
    형질도입된 CD8+ T 세포가 정맥내 관주에 의해 상기 대상체에게 투여되는, 방법.
  22. 제20항 또는 제21항에 있어서,
    형질도입된 CD8+ T 세포가 T 세포 수용체로 공-형질도입되는, 방법.
  23. 제20항 내지 제22항 중 어느 한 항에 있어서,
    형질도입된 CD8+ T 세포가 항-CD3 및 항-CD28 항체에 의해 증폭되는, 방법.
  24. 제23항에 있어서,
    형질도입된 CD8+ T 세포의 증폭이 사이토카인, 바람직하게는 인터류킨-2(IL-2) 및/또는 인터류킨-15(IL-15)의 존재 하에서 수행되는, 방법.
  25. 제20항 내지 제24항 중 어느 한 항에 있어서,
    (d) 제1항 내지 제11항 및 제19항 중 어느 한 항에서 정의된 이중특이적 항체 분자를 대상체에게 투여하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  26. 제20항 내지 제25항 중 어느 한 항에 있어서,
    이중특이적 항체 분자가 형질도입된 CD8+ T 세포의 투여 전에, 투여와 동시에 또는 투여 후에 투여되는, 방법.
  27. 제20항 내지 제26항 중 어느 한 항에 있어서,
    질환이 악성 질환인, 방법.
  28. 제27항에 있어서,
    악성 질환이 상피, 내피 또는 중피 유래의 암 및 혈액암으로부터 선택되는, 방법.
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