CN113039271A - 靶向黏结蛋白聚糖-1和成纤维细胞生长因子受体的双特异性结合剂 - Google Patents

靶向黏结蛋白聚糖-1和成纤维细胞生长因子受体的双特异性结合剂 Download PDF

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Abstract

提供了双特异性结合剂，其包含(a)与黏结蛋白聚糖‑1(CD138)特异性结合的抗体或其抗原结合部分；以及(b)与成纤维细胞生长因子受体3(FGFR3)特异性结合的Fynomer，其中所述Fynomer包含具有与SEQ ID NO：99或SEQ ID NO：113的氨基酸序列具有至少90％同一性的氨基酸序列的多肽。还提供了与抗赘生物剂缀合的双特异性结合剂。

Description

靶向黏结蛋白聚糖-1和成纤维细胞生长因子受体的双特异性 结合剂
技术领域
本发明的一些实施方案涉及包含与CD138(黏结蛋白聚糖-1(Syndecan-1))特异性结合的抗体部分和与成纤维细胞生长因子受体3(Fibroblast Growth Factor Receptor3，FGFR3)特异性结合的Fynomer部分的双特异性结合剂，以及其药物缀合物、其组合物及其用途。本文中公开的双特异性结合剂可单独使用或与其他药剂组合使用以有效治疗赘生物(neoplasm)。
背景技术
黏结蛋白聚糖(syndecan)家族包括主要存在于细胞表面上的四种跨膜硫酸乙酰肝素蛋白聚糖(heparan sulfate proteoglycan，HSPG)。这些不同黏结蛋白聚糖的结构在脊椎动物和无脊椎动物中显示出高度同源性。所有四种黏结蛋白聚糖由装饰有不同数量的糖胺聚糖(Glycosaminoglycan，GAG)侧链的核心蛋白构建。黏结蛋白聚糖主要通过这些GAG链发挥其功能，但核心蛋白的不同结构域也具有不同的作用。黏结蛋白聚糖-1和黏结蛋白聚糖-3携带硫酸乙酰肝素(heparan sulfate，HS)和硫酸软骨素(chondroitin sulfate，CS)链二者，而黏结蛋白聚糖-2和黏结蛋白聚糖-4仅携带HS链。黏结蛋白聚糖参与广泛的生物学过程，包括生长和分化、细胞扩散、细胞黏附、细胞迁移、细胞骨架组织、浸润和血管生成。
黏结蛋白聚糖-1是跨膜(1型)硫酸乙酰肝素蛋白聚糖，其包含N端胞外结构域、跨膜结构域和C端胞内信号传导结构域。在人中，黏结蛋白聚糖-1(CD138)包含长度为310个氨基酸的核心蛋白，并且由SDC1基因编码。SDC1基因由五个外显子组成，并且位于人2号染色体上。第一个外显子编码信号肽，第二个外显子编码硫酸乙酰肝素的附着位点，第三和第四个外显子编码硫酸软骨素的结合位点，并且第五个外显子编码跨膜和胞质结构域。
黏结蛋白聚糖-1在成人组织上皮细胞的基底外侧表面上、在发育过程中在间充质细胞上以及在不同分化阶段期间在淋巴样细胞上表达。黏结蛋白聚糖-1可以结合肝细胞生长因子(hepatocyte growth factor，HGF)，可以与多种生长因子相互作用并且充当共受体，导致影响细胞迁移、细胞-基质相互作用、生长、增殖和存活的多种信号传导途径的活化。数项研究涉及黏结蛋白聚糖-1和/或其在多种赘生物发病机制中的功能异常的信号传导活性或过表达。
成纤维细胞生长因子受体(Fibroblast Growth Factor Receptor，FGFR)是高度保守的跨膜酪氨酸激酶受体家族，其参与多种胞内信号传导途径。FGFR由包含二至三个免疫球蛋白样结构域(D1、D2和D3)的胞外配体结合区、单程跨膜区和具有酪氨酸激酶活性的胞质区构成。有4种主要的FGF受体(FGFR1-4)，其具有多种剪接变体，其中大多数出现在受体的外显子III(对应于结构域D3)中(例如，参见Holzmann et al.(2012)J.of NucleicAcids 2012：950508)。D3结构域包含由3个外显子(IIIa、IIIb和IIIc)编码的两个部分，并且基因剪接事件导致从与IIIb或IIIc部分组合的基因恒定IIIa部分转录的D3结构域。这些剪接变异产生了七种高度同源的人FGFR：FGFR1b、FGFR1c、FGFR2b、FGFR2c、FGFR3b、FGFR3c和FGFR4，其具有不同的组织分布和配体特异性。
在人中，FGFR可以通过过表达或通过结合22种已知成纤维细胞生长因子(fibroblast growth factor，FGF)配体中的一种或更多种来活化。FGFR3活化在胚胎发生、发育、细胞增殖、细胞存活、迁移、分化和生长停滞中发挥关键作用。FGFR3的活化可导致与致癌信号传导有关的数个关键途径(包括丝分裂原活化蛋白激酶(MAPK)和PI3K-AKT途径)的活化。
本文中提供了包含与黏结蛋白聚糖-1结合的抗体部分和与FGFR3结合的Fynomer部分的双特异性结合剂，及其用于治疗赘生物的用途。
发明内容
在一些方面，本文中提供了双特异性结合剂，其包含抗体部分(例如，抗体或其抗原结合部分)和一个或更多个Fynomer，其中所述抗体部分与黏结蛋白聚糖-1(CD138)特异性结合，并且所述一个或更多个Fynomer与成纤维细胞生长因子受体3(FGFR3)特异性结合。因此，在某些实施方案中，本文中提供了与黏结蛋白聚糖-1特异性结合并且与FGFR3或者FGFR3的一种或更多种同种型特异性结合的双特异性结合剂。在一些实施方案中，双特异性结合剂的Fynomer部分与FGFR3b和/或FGFR3c特异性结合。在某些方面，双特异性结合剂包含与黏结蛋白聚糖-1(CD138)特异性结合的抗体部分(例如，抗体或其抗原结合部分)、与成纤维细胞生长因子受体3(FGFR3)特异性结合的Fynomer，以及抗赘生物剂(anti-neoplastic agent)或毒素。
在一些实施方案中，双特异性结合剂的抗体部分包含选自以下的一个或更多个互补决定区(CDR)：(i)包含与选自SEQ ID NO：2至15的氨基酸序列具有至少90％同一性的氨基酸序列的CDR-L1(轻链CDR1)；(ii)包含与选自SEQ ID NO：16至26的氨基酸序列具有至少90％同一性的氨基酸序列的CDR-L2(轻链CDR2)，(iii)包含与选自SEQ ID NO：27至33的氨基酸序列具有至少90％同一性的氨基酸序列的CDR-L3(轻链CDR3)，(iv)包含与选自SEQ IDNO：45至59的氨基酸序列具有至少90％同一性的氨基酸序列的CDR-H1(重链CDR1)；(ii)包含与选自SEQ ID NO：60至71的氨基酸序列具有至少90％同一性的氨基酸序列的CDR-H2(重链CDR2)；以及(iii)包含与选自SEQ ID NO：72至81的氨基酸序列具有至少90％同一性的氨基酸序列的CDR-H3(重链CDR3)，其中所述抗体或其结合部分与人黏结蛋白聚糖-1特异性结合。双特异性结合剂的抗体部分可包含选自表1的任何合适的CDR-L1、选自表2的任何合适的CDR-L2、选自表3的任何合适的CDR-L3、选自表6的任何合适的CDR-H1、选自表7的任何合适的CDR-H2，以及选自表8的任何合适的CDR-H3，其中所述抗体或其结合部分与人黏结蛋白聚糖-1特异性结合。在一些实施方案中，双特异性结合剂的抗体部分包含：包含SEQ ID NO：2的氨基酸序列的CDR-L1、包含SEQ ID NO：18的氨基酸序列的CDR-L2、包含SEQ ID NO：28的氨基酸序列的CDR-L3、包含SEQ ID NO：47的氨基酸序列的CDR-H1、包含SEQ ID NO：60的氨基酸序列的CDR-H2，以及包含SEQ ID NO：73的氨基酸序列的CDR-H3。在一些实施方案中，抗体或其结合部分包含分别包含SEQ ID NO：2、17、27、47、61和73的氨基酸序列的CDR-L1、CDR-L2、CDR-L3、CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3。在一些实施方案中，抗体或其结合部分包含分别包含SEQ ID NO：2、16、27、45、60和72的氨基酸序列的CDR-L1、CDR-L2、CDR-L3、CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3。在一些实施方案中，抗体或其结合部分包含分别包含SEQ ID NO：2、16、27、45、61和72的氨基酸序列的CDR-L1、CDR-L2、CDR-L3、CDR-HI、CDR-H2和CDR-H3。在一些实施方案中，抗体或其结合部分包含分别包含SEQ ID NO：2、17、27、47、61和73的氨基酸序列的CDR-L1、CDR-L2、CDR-L3、CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3。在一些实施方案中，抗体或其结合部分包含分别包含SEQ ID NO：5、21、30、50、64和75的氨基酸序列的CDR-L1、CDR-L2、CDR-L3、CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3。在一些实施方案中，抗体或其结合部分包含分别包含SEQ ID NO：4、20、29、50、63和75的氨基酸序列的CDR-L1、CDR-L2、CDR-L3、CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3。在一些实施方案中，抗体或其结合部分包含分别包含SEQ ID NO：4、19、29、48、63和74的氨基酸序列的CDR-L1、CDR-L2、CDR-L3、CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3。在一些实施方案中，双特异性结合剂的抗体部分包含人抗体(例如，IgG)的一个或更多个恒定区。在一些实施方案中，双特异性结合剂的抗体部分包含人源化单克隆抗体或其人源化抗原结合部分，其中可变区序列是人源化的。
在一些实施方案中，双特异性结合剂的Fynomer包含多肽，所述多肽选自具有与以下氨基酸序列具有至少80％同一性的氨基酸序列的多肽：
Figure BPA0000302829100000041
其中氨基酸(X1)、(X2)、(X3)、(X4)、(X5)和(X6)是任何氨基酸，
Figure BPA0000302829100000042
其中(X7)是任何氨基酸，
Figure BPA0000302829100000051
在一些实施方案中，双特异性结合剂的Fynomer包含具有与SEQ ID NO：107的氨基酸序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或100％同一性的氨基酸序列的多肽或由其组成。在一些实施方案中，双特异性结合剂的Fynomer包含具有SEQ ID NO：107的氨基酸序列的多肽或由其组成。
在一些实施方案中，双特异性剂包含选自以下的抗赘生物剂：尾海兔素(dolastatin)、澳瑞他汀(auristatin)、美登素(maytansine)、微管溶素(tubulysin)、加利车霉素(calicheamicin)、吡咯并苯并二氮
Figure BPA0000302829100000053
(pyrrolobenzodiazepine，PBD)、倍癌霉素(duocarmycin)、多柔比星(doxorubicin)、假单胞菌外毒素-A(PE38)、伊立替康(doxorubicin)及其衍生物。在某些实施方案中，双特异性结合剂包含吡咯并苯并二氮
Figure BPA0000302829100000054
毒素，所述吡咯并苯并二氮
Figure BPA0000302829100000055
毒素包含化学式I的结构：
[化1]
Figure BPA0000302829100000052
其中
Z1和Z2均为N；
Z3和Z4均为C；
[化2]
双虚线
Figure BPA0000302829100000061
表示单键或双键；
n为1至10；
R3和R4各自独立地为H或C1-4烷氧基；并且
R1和R2各自独立地选自H、C1-5烷基、C3-6环烷基、C2-5烯基和任选地被R5取代的苯基，其中
R5选自-NH2、-NHR6和具有以下结构的被R7取代的哌嗪基
[化3]
Figure BPA0000302829100000062
其中R6包含连接基(linking group)，并且
R7为H或C1-5烷基；
X1为空、保护基或者包含连接基；
X2为空、保护基或者包含连接基；
X1、X2、R1和R2中仅一个包含连接基；并且Y1和Y2各自独立地为空、OH或SO3H；
前提是：
[化4]
(i)当X1包含连接基时，
Figure BPA0000302829100000063
为N-C，
(ii)当X2包含连接基时，
Figure BPA0000302829100000064
为N-C，
(iii)当X1为保护基时，
Figure BPA0000302829100000065
为N-C，并且
(iv)当X2为保护基时，
Figure BPA0000302829100000066
为N-C
其中空表示不存在该部分或存在一个或更多个氢以完成所需的化合价。
在某些实施方案中，抗赘生物剂包含式I的吡咯并苯并二氮
Figure BPA0000302829100000067
毒素和连接基，其中所述吡咯并苯并二氮
Figure BPA0000302829100000068
毒素与所述连接基连接，并且所述连接基与本文中所述的双特异性剂连接。在某些实施方案中，所述连接基包含选自以下的结构：化学式(A)的结构：
[化5]
Figure BPA0000302829100000071
其中星号表示与吡咯并苯并二氮
Figure BPA0000302829100000073
毒素的连接点；波浪线表示与结合剂的连接点；
m为1至20；
q为1至10；并且
E为连接基团(connecting group)，以及化学式(B)的结构：
[化6]
Figure BPA0000302829100000072
其中
星号表示与吡咯并苯并二氮
Figure BPA0000302829100000074
毒素的连接点；
波浪线表示与结合剂的连接点；
E包含连接基团；
v为0至10；并且
u为0或1；其中当u为1时，t为1至10。
在一些实施方案中，抗赘生物剂包含选自以下的结构：以下式II：
[化7]
Figure BPA0000302829100000081
其中m为8；以下式III：
[化8]
Figure BPA0000302829100000082
其中m为8，p为3，并且X2为保护基；以下式V：
[化9]
Figure BPA0000302829100000083
其中m为8；以下式VI：
[化10]
Figure BPA0000302829100000084
其中t为8，并且v为1；以及以下式VII：
[化11]
Figure BPA0000302829100000091
其中波浪线表示与结合剂的连接点。
在一些实施方案中，本文中提供了包含本文中所述的双特异性结合剂以及可药用赋形剂、稀释剂、添加剂或载体的药物组合物。
在一些方面，本文中提供了治疗患有或怀疑患有赘生物的对象的方法，其包括向所述对象施用治疗有效量的本文中所述的双特异性结合剂或药物组合物。在某些实施方案中，所述赘生物选自上皮癌(carcinoma)、肉瘤、神经母细胞瘤、胶质母细胞瘤、骨髓瘤、淋巴瘤、黑素瘤或者实体或软组织肿瘤，其中所述赘生物表达黏结蛋白聚糖-1和/或FGFR3。在一些实施方案中，患有或怀疑患有赘生物的对象是具有或含有赘生性细胞(neoplasticcell)的人，所述赘生性细胞在所述赘生性细胞的细胞表面上表达人黏结蛋白聚糖-1和/或人FGFR3。
在以下描述、实施例、所附权利要求书和附图中进一步描述了本技术的某些方面。
附图说明
附图举例说明了本技术的一些实施方案，并且不是限制性的。为了清楚和易于图示，附图未按比例绘制，并且在一些情况下，多个方面可能被夸大或放大示出以有助于理解特定实施方案。
[图1]图1示出了来源于人、食蟹猴(cynomolgus monkey，cyno)和小鼠的黏结蛋白聚糖-1蛋白质的比对。用于免疫接种的肽来源于方框区域。
[图2]图2示出了与H929细胞上的CD138结合的F12P16F6(图2A)和另一代表性阳性杂交瘤克隆F12P16G3(图2B)的荧光激活细胞分选(Fluorescence-activated cellsorting，FACS)直方图。
[图3]图3示出了对于代表性杂交瘤F12P16F6(在图中指示为“12P16F6”)以167nM(L1A1)至10.4nM(L1A4)与人CD138结合的动力学结合分析(即，SPR传感图)的结果。
[图4]图4示出了代表性嵌合抗体12P16F6 hIgG1(“chF6”，图4A)和13P30A7 hIgG1(“chP30A7”，图4B)与人CD138表达细胞(人)和食蟹猴CD138表达细胞(cyno)的结合。对照抗体(“Sec”，即苏金单抗(Secukinumab))显示出与CD138几乎没有或没有特异性结合。Y轴表示抗体chF6、13P30A7或苏金单抗的浓度。
[图5A]图5A示出了与亲本小鼠F12P16F6的那些(“P16F6 VH”)相比的人源化重链。名称cdr表示CDR移植方法，名称abb表示缩短CDR移植方法，名称sdr表示SDR转移方法，名称fra表示Frankenstein方法，名称ven表示镶饰(Veneering)方法。名称修复(repair)表示对可变区进行第二轮人源化。
[图5B]图5B示出了与亲本小鼠F12P16F6的那些(“P16F6 VH”)相比的人源化轻链。
[图6]图6示出了在还原条件下运行的SDS-PAGE凝胶的图片，其示出了11种代表性人源化抗体的分子量(千达尔顿，kDa)和纯度。泳道1＝12P16F6 hIgG1(chF6)，泳道2＝F6aka-rep，泳道3＝F6 aks-rep，泳道4＝F6 akf-rep，泳道5＝F6 cka-rep，泳道6＝F6 ckf-rep(hF6)，泳道7＝F6 f2ka-rep，泳道8＝F6 f2ks-rep，泳道9＝F6 f2kf-rep，泳道10＝F6f1ka-rep，泳道11＝F6 f1ks-rep，泳道12＝F6 f1kf-rep，并且MW＝分子量标记。分子量标记被标记在凝胶的右侧。
[图7]图7示出了十一种代表性人源化抗体与多发性骨髓瘤细胞系KMS-11(图7B)和膀胱癌系RT112/84(图7A)的表面上人CD138的细胞表面结合的FACS分析。苏金单抗用作阴性对照。
[图8]图8示出了来源于与抗体Fab片段复合的人黏结蛋白聚糖-1肽的X-射线晶体结构的图示，其以
Figure BPA0000302829100000101
的分辨率辨析。每个不对称单位黏结蛋白聚糖-1肽和Fab各有一个拷贝。图8示出了黏结蛋白聚糖-1-Fab结合界面。Fab重链以带状侧链碳原子的形式显示在图的左侧。Fab轻链以带状侧链碳原子的形式显示在图的右侧。黏结蛋白聚糖-1肽碳原子显示为夹在Fab重链与轻链之间。黏结蛋白聚糖-1肽的某些氨基酸和Fab片段的某些侧链用其相应的3字母氨基酸缩写和位置标记。
[图9]图9示出了SEQ ID NO：101、109、103、105、107和111的抗FGFR3 Fynomer的比对。
[图10]图10示出了定名为FF2L4C3(SEQ ID NO：101)、FF2L4D4、FF3L6G2、FF5L7D3、FF5L7D4、FF15L31B1和FynSH3(阴性对照)的抗FGFR3 Fynomer的内化性质。
[图11]图11示出了与FGFR3阳性KMS-11细胞表面上的FGFR3特异性结合的Fynomer多肽的FACS结合谱。图11A示出了FF2L4C3(SEQ ID NO：101)、FF43L65D5(SEQ ID NO：109)、FF44L65B7(SEQ ID NO：111)、FF44L65G7(SEQ ID NO：105)、FF44L65G12(SEQ ID NO：103)、FF48L66G7(SEQ ID NO：107)和抗FGFR3单克隆抗体(阳性对照)与FGFR3阳性KMS-11细胞的特异性结合，而图11B显示所示的Fynomer与FGFR3阴性对照细胞系N87没有结合。
[图12-1]图12-1示出了与以下结合的FGFR3-Fynomer FF2L4C3-SEQ ID NO：101(图12A)和FF43L65D5-SEQ ID NO：109(图12B)的ELISA：铺板的人FGFR3b(huFGFR3b)、人FGFR3c(huFGFR3c)、食蟹猴FGFR3c(cyFGFR3c)、鼠FGFR3c(muFGFR3c)、人FGFR3D1结构域(huFGFR3-D1)、人FGFR3c D2结构域(huFGFR3-D2)、人FGFR3 D1和D2结构域(huFGFR3-D1D2)、阴性对照多克隆抗体(IgG)以及未铺的板(PBS)，如在x轴上指示的。
[图12-2]图12-2示出了与以下结合的FF44L65B7-SEQ ID NO：111(图12C)和FF44L65G7-SEQ ID NO：105(图12D)的ELISA：铺板的人FGFR3b(huFGFR3b)、人FGFR3c(huFGFR3c)、食蟹猴FGFR3c(cyFGFR3c)、鼠FGFR3c(muFGFR3c)、人FGFR3 D1结构域(huFGFR3-D1)、人FGFR3c D2结构域(huFGFR3-D2)、人FGFR3 D1和D2结构域(huFGFR3-D1D2)、阴性对照多克隆抗体(IgG)以及未铺的板(PBS)，如在x轴上指示的。
[图12-3]图12-3示出了与以下结合的FF44L65G12-SEQ ID NO：103(图12E)和FF48L66G7-SEQ ID NO：107(图12F)的ELISA：铺板的人FGFR3b(huFGFR3b)、人FGFR3c(huFGFR3c)、食蟹猴FGFR3c(cyFGFR3c)、鼠FGFR3c(muFGFR3c)、人FGFR3 D1结构域(huFGFR3-D1)、人FGFR3c D2结构域(huFGFR3-D2)、人FGFR3 D1和D2结构域(huFGFR3-D1D2)、阴性对照多克隆抗体(IgG)以及未铺的板(PBS)，如在x轴上指示的。
[图13]图13示出了内化测定，其证明了毒素缀合的Fynomer FF2L4C3(图13A、B和C)、FF43L65D5(图13B)、FF44L65G7(图13B)、FF44L65G12(图13B)、FF48L66G7(图13B)和FF44L65B7(图13C)的细胞毒性作用。包含结合细胞溶质myc蛋白的小鼠单克隆抗体9E10、FynSH3和没有试剂(仅细胞)作为阴性对照。
[图14]图14示出了双特异性结合剂的四个实施方案的图示，每个实施方案均包含具有两个Ig重链和两个Ig轻链多肽的抗体部分以及Fynomer部分，其中Fynomer(表示为球体)与抗体的不同部分连接。图14A示出了与抗体重链的C末端连接的Fynomer。图14B示出了与抗体重链的N末端连接的Fynomer。图14C示出了与抗体轻链的C末端连接的Fynomer。图14D示出了与抗体轻链的N末端连接的Fynomer。
[图15]图15示出了制备并且在还原条件下进行SDS PAGE的四种代表性双特异性结合剂。泳道7负载有与黏结蛋白聚糖-1特异性结合的全长抗CD138单克隆抗体P16F6。泳道7提供了在不存在连接的Fynomer的情况下重链(上带)和轻链(下带)的分子量的参考。泳道2至6示出了双特异性结合剂的一个实施方案，所述双特异性结合剂包含P16F6抗体，以及与抗体重链的N端连接(泳道2和6)、与抗体重链的C端连接(泳道4)、与抗体轻链的N端连接(泳道5)和与抗体轻链的C端连接(泳道3)的结合FGFR3的Fynomer G7(SEQ ID NO：107)。泳道2、4和6中重链分子量的提高证明存在连接的Fynomer(与对照泳道7中的重链相比)。泳道3和5中轻链分子量的提高证明存在连接的Fynomer(与对照泳道7中的轻链相比)。
[图16]图16示出了FAC直方图，其示出了代表性双特异性结合剂“hF6-HN-G7”和人源化单克隆抗体“hF6”与在经转染CHO细胞表面上表达的FGFR3c(图16A)和FGFR3b(图16B)的细胞表面结合。hF6包含SEQ ID NO：44的轻链和SEQ ID NO：93的重链。hF6-HN-G7包含SEQID NO：44的轻链和融合蛋白，该融合蛋白包含SEQ ID NO：107的Fynomer(G7)和SEQ ID NO：93的重链，其中G7的C端通过肽键与重链的N端连接。
[图17]图17示出了对未转染的CHO细胞(图17A)、表达FGFR3b的CHO细胞(图17B)和表达FGFR3c的CHO细胞(图17C)进行的体外细胞毒性测定。y轴上示出了细胞生存力，并且x轴上示出了结合剂的浓度。受试试剂包括与式II的PBD毒素随机缀合的苏金单抗(特异性结合白介素17A的单克隆抗体)(苏金单抗-II)、在重链N端与G7 Fynomer融合表达并且与式II的PBD毒素位点特异性地缀合的苏金单抗融合体(苏金单抗-S119C-HN-G7-II)，以及与式II的PBD毒素位点特异性地缀合的代表性双特异性结合剂hF6-S119C-HN-G7(hF6-S119C-HN-G7-II)。双特异性结合剂hF6-S119C-HN-G7的hF6抗体部分包含SEQ ID NO：44的轻链和SEQID NO：93的重链。因此，hF6-S119C-HN-G7是hF6抗体，其中SEQ ID NO：107的Fynomer(G7)与SEQ ID NO：93的重链被表达为融合蛋白，其中G7的C端通过肽键与重链的N端连接。S119C表示hF6重链恒定区第119位的丝氨酸突变为半胱氨酸，以用于PBD毒素(即，抗赘生物剂)的共价连接。在该实验中使用的代表性PBD毒素是式II的毒素。使用马来酰亚胺化学法将毒素与第119位的半胱氨酸的巯基连接。
[图18]图18示出了式II的示例性抗赘生物剂。
[图19]图19示出了利用与式II的抗赘生物剂随机缀合的全长hF6抗CD138单克隆抗体(“hF6-II”)、与式II的抗赘生物剂随机缀合的hF6-HN-G7(hF6-HN-G7-II)以及与式II的抗赘生物剂随机缀合的hF6-LN-G7(hF6-LN-G7-II)在细胞系KMS-11(图19A)、OPM-2(图19B)和ARH-77(图19C)上进行的体外细胞毒性测定。
[图20-1]图20-2示出了利用与式II的抗赘生物剂位点特异性地缀合的hF6-T289C-HN-G7(hF6-T289C-HN-G7-II)、与式II的抗赘生物剂位点特异性地缀合的hF6-S119C-HN-G7(hF6-S119C-HN-G7-II)、与式II的抗赘生物剂位点特异性地缀合的hF6-V282C-HN-G7(hF6-V282C-HN-G7-II，仅图20C和20D)、hF6-II(仅图20A和20B)以及与式II的PBD毒素缀合的对照抗体苏金单抗(苏金单抗-II)在细胞系KMS-11(图20A)和RT-112(图20B)上进行的体外细胞毒性测定。
[图20-1]图20-2示出了利用与式II的抗赘生物剂位点特异性地缀合的hF6-T289C-HN-G7(hF6-T289C-HN-G7-II)、与式II的抗赘生物剂位点特异性地缀合的hF6-S119C-HN-G7(hF6-S119C-HN-G7-II)、与式II的抗赘生物剂位点特异性地缀合的hF6-V282C-HN-G7(hF6-V282C-HN-G7-II，仅图20C和20D)、hF6-II(仅图20A和20B)以及与式II的PBD毒素缀合的对照抗体苏金单抗(苏金单抗-II)在细胞系AN3CA(图20C)和HCC1806(图20D)上进行的体外细胞毒性测定。
[图21A]图21A示出了体内异种移植研究的图示结果，该研究测试了所示的双特异性结合剂杀伤植入小鼠中的AN3CA细胞(图21A)或抑制其生长的能力。
[图21B]图21B示出了体内异种移植研究的图示结果，该研究测试了所示的双特异性结合剂杀伤植入小鼠中的HCC1807细胞或抑制其生长的能力。
具体实施方式
许多赘生性细胞在其细胞表面上表达成纤维细胞生长因子受体3(FGFR3，包括其一种或更多种同种型)和黏结蛋白聚糖-1(CD138)。本文中提供了以高亲和力与黏结蛋白聚糖-1和FGFR3结合的双特异性结合剂。已确定这些双特异性结合剂可以以高亲和力和高选择性与表达两种靶受体的赘生性细胞结合。在一些实施方案中，本文中所述的双特异性结合剂在与一种或两种靶受体(即，CD138和FGFR3)结合时诱导结合剂的内化。此外，通过使双特异性结合剂与毒性有效载荷缀合，双特异性结合剂可以特异性地杀伤表达一种或两种靶受体的赘生性细胞。同样，通过在毒性有效载荷与双特异性结合剂之间并入蛋白酶可切割的连接基，可以显著降低脱靶细胞毒性，以使得毒素只在内化并且通过胞质蛋白酶切割连接基之后才从结合剂释放。本文中的双特异性结合剂代表了下一代生物制剂，其提供了对赘生性细胞更高效和选择性的杀伤，同时减少了不良事件。
在一些实施方案中，本文中提出的双特异性结合剂包含抗体部分(例如，抗体或其抗原结合部分)和Fynomer部分(即，Fynomer)，其中Fynomer与抗体部分连接。在一些实施方案中，Fynomer通过共价键与抗体部分连接。在一些实施方案中，抗体部分包含与黏结蛋白聚糖-1(即，黏结蛋白聚糖-1多肽；例如，CD138)或其胞外部分特异性结合的抗体或其抗原结合部分。在某些实施方案中，Fynomer部分包含与FGFR3(例如，FGFR3或其一种或更多种同种型)特异性结合的Fynomer。在一些实施方案中，双特异性结合剂包含细胞毒性有效载荷。
在一些实施方案中，本文中提出的双特异性结合剂用于在对象中治疗、预防和/或诊断赘生物。
黏结蛋白聚糖
人黏结蛋白聚糖-1(例如，SEQ ID NO：1)通常包含310个氨基酸的未成熟多肽序列，其包含从氨基酸1至22的N端单序列、从约氨基酸23至254的胞外结构域、从约氨基酸255至275的跨膜结构域，以及从约氨基酸276至310的胞质结构域(从N端到C端编号)。鉴定黏结蛋白聚糖-1受体的前导序列、胞外结构域、跨膜结构域和胞质结构域的方法是已知的，并且可以使用任何合适的方法来鉴定来源于合适的哺乳动物物种的黏结蛋白聚糖-1多肽序列中的这样的结构域或区。
在一些实施方案中，黏结蛋白聚糖-1是哺乳动物黏结蛋白聚糖-1。黏结蛋白聚糖-1可来源于任何哺乳动物物种。在一些实施方案中，黏结蛋白聚糖-1多肽是人黏结蛋白聚糖-1。在某些实施方案中，黏结蛋白聚糖-1的胞外结构域包含通常在完整哺乳动物细胞的细胞表面上表达的黏结蛋白聚糖-1多肽的N端部分。在某些实施方案中，黏结蛋白聚糖-1的胞外结构域以缺乏细胞质和/或跨膜结构域的可溶或非膜结合形式表达。在某些实施方案中，黏结蛋白聚糖-1和/或黏结蛋白聚糖-1的胞外结构域包含一个或更多个氨基酸添加、缺失或替换。黏结蛋白聚糖-1多肽可包含与SEQ ID NO：1的黏结蛋白聚糖-1多肽具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％或100％同一性的氨基酸序列。在某些实施方案中，黏结蛋白聚糖-1多肽包含黏结蛋白聚糖-1蛋白的一部分(例如子序列)。在一些实施方案中，黏结蛋白聚糖-1的一部分包含黏结蛋白聚糖-1的胞外结构域或其一部分。
抗体及其Ag结合部分
在一些实施方案中，双特异性结合剂包含与黏结蛋白聚糖-1(CD138)特异性结合的抗体或其一部分(例如，其结合部分，或其抗原结合部分)。与黏结蛋白聚糖-1(CD138)特异性结合的抗体或其结合部分在本文中有时称为抗CD138抗体。预期用于本文中所述的双特异性结合剂中的抗CD138抗体及其结合部分在国际专利申请No.PCT/JP2018/016847中详细描述，其通过引用整体并入本文。
在一些实施方案中，抗体是单克隆抗体或其结合部分。抗体的某些非限制性实例包括单克隆抗体、嵌合抗体、CDR移植抗体、人源化抗体和人抗体。人抗体可以通过合适的方法获得。例如，人抗体可以从改造成产生完全人抗体的转染色体动物获得。在某些实施方案中，抗体不是多克隆的，和/或不是多克隆抗体。
抗体或其结合部分可以通过合适的方法产生、制备或生产。在一些实施方案中，抗体或其结合部分是从合适的物种来源、产生、获得、分离和/或纯化的。在一些实施方案中，抗体或其结合部分是从例如兔、山羊、马、牛、大鼠、小鼠、鱼、鸟或美洲驼来源、产生、获得、分离和/或纯化的。在一些实施方案中，抗体是从鸟(例如，鸡或鸟蛋)来源、产生、获得、分离和/或纯化的。在一些实施方案中，抗体或其结合部分是从植物来源、产生、获得、分离和/或纯化的(例如，由经遗传改造植物产生的重组抗体或其结合部分)。在一些实施方案中，抗体或其结合部分是从合适的哺乳动物来源、产生、获得、分离和/或纯化的。在某些实施方案中，合适的哺乳动物是改造成产生包含人重链和/或人轻链或其一部分的抗体的经遗传改变的哺乳动物(例如，转染色体的或转基因的哺乳动物)。在一些实施方案中，抗体或其结合部分是从原核或真核细胞产生、获得、分离或纯化的(例如，由经遗传改造细胞产生的重组抗体或其结合部分)。在一些实施方案中，抗体或其结合部分是从病毒产生、获得、分离或纯化的(例如，由经遗传改造病毒产生的重组抗体或其结合部分)。
可以从合适的表达系统表达、分离和/或纯化抗体或其结合部分或双特异性剂，所述表达系统的非限制性实例包括合适的细菌、噬菌体、昆虫、病毒、植物或哺乳动物表达系统。例如，可以将编码抗体的核酸引入合适的哺乳动物细胞系中，该哺乳动物细胞系表达抗体并将其分泌到细胞培养基中。任何合适的哺乳动物细胞系都可以用于产生抗体或双特异性结合剂。产生抗体或双特异性结合剂或其一部分的方法可以包括以下中的一种或更多种：(i)将一种或更多种核酸引入合适的细胞系中，其中所述核酸指导抗体、双特异性结合剂或其一部分的表达；(ii)使用合适的培养方法培养细胞系一段时间，以允许抗体或双特异性结合剂的表达；(iii)收获细胞系(例如，通过产生裂解物)或收获从细胞系产生的条件培养基(例如，其中抗体或双特异性结合剂被分泌到培养基中)；以及(iv)使用合适的方法分离和/或纯化抗体或双特异性结合剂。
修饰语“单克隆”不应解释为要求通过任何特定方法产生抗体或其结合部分。单克隆抗体或其结合部分可以通过任何合适的方法产生。例如，在某些实施方案中，通过杂交瘤方法(例如，如Kohler et al.，Nature，256：495(1975)所述)或其变化形式制备单克隆抗体。在一些实施方案中，通过重组DNA方法制备单克隆抗体或其结合部分。例如，可以通过使用合适的表达系统(例如，噬菌体展示表达系统)筛选重组文库来制备单克隆抗体或其结合部分。在一些实施方案中，从噬菌体文库分离单克隆抗体或其结合部分，例如通过使用Clackson et al.，Nature，352：624-628(1991)和/或Marks et al.，J.Mol.Biol.，222：581-597(1991)中描述的技术或其变化形式。
在某些实施方案中，抗体或其结合部分包含哺乳动物抗体的一个或更多个结构部分。在某些实施方案中，抗体或其结合部分包含一个或更多个恒定区(例如，来源于抗体例 如哺乳动物抗体的恒定区)。抗体或其结合部分可包含抗体的任何合适的恒定区，或其一个或更多个部分。在某些实施方案中，抗体或其结合部分包含抗体轻链的恒定区和/或抗体重链的恒定区。在一些实施方案中，抗体或其结合部分包含lambda(λ)轻链恒定区或其一部分。在一些实施方案中，抗体或其结合部分包含kappa(κ)轻链恒定区或其一部分。在一些实施方案中，抗体或其结合部分包含与哺乳动物抗体的轻链恒定区或其一部分的多肽序列具有至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少99％同一性的多肽。在一些实施方案中，抗体或其结合部分包含与人抗体的轻链恒定区的多肽序列具有至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少99％同一性的多肽。在一些实施方案中，抗体的结合部分不包含轻链恒定区。在一些实施方案中，抗体或其结合部分不包含轻链恒定区的一个或更多个部分。
抗体或其结合部分可包含任何合适的重链恒定区或其一部分。在哺乳动物中，抗体可以具有至少五种类型/类别的Ig重链，表示为IgA、IgD、IgE、IgG和IgM，其通过不同的重链恒定区或其一部分(例如，CH1、CL、CH2、CH3结构域)的存在进行确定。在一些实施方案中，抗体或其结合部分包含IgM、IgD、IgA或IgE同种型的一个或更多个重链恒定区或其一部分。在一些实施方案中，抗体或其结合部分包含IgG1、IgG2、IgG3或IgG4的重链恒定区，或其一个或更多个部分。在一些实施方案中，抗体或其结合部分包含与哺乳动物抗体的重链恒定区的多肽序列具有至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少99％同一性或100％同一性的多肽。在一些实施方案中，抗体或其结合部分包含与人抗体的重链恒定区的多肽序列具有至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少99％同一性或100％同一性的多肽。在一些实施方案中，抗体或其结合部分包含对恒定区的一个或更多个添加、缺失和/或修饰。有时对抗体或其结合部分进行修饰以改变抗体类别，或抗体的同种型。在一些实施方案中，抗体或其结合部分包含一个或更多个添加、缺失和/或修饰(一个或更多个氨基酸替换、缺失或添加)，以修饰抗体或其结合部分的一种或更多种功能，例如以消除、提高或降低血清半衰期、Fc受体结合、补体结合(例如，C1q结合)、糖基化、唾液酸化、细胞毒性、抗体依赖性细胞介导的吞噬作用(ADCP)、抗体依赖性细胞毒性(ADCC)等。在一些实施方案中，抗体的结合部分不包含重链恒定区。在一些实施方案中，抗体或其结合部分不包含重链恒定区的一个或更多个部分。
在一些实施方案中，抗体或其结合部分包含抗体的一个或更多个可变区或其一部分，或者由它们组成。在一些实施方案中，抗体或其结合部分包含一个或更多个轻链可变区或其一部分。在一些实施方案中，抗体或其结合部分包含一个或更多个重链可变区或其一部分。在某些实施方案中，抗体或其结合部分包含至少一个轻链可变区和至少一个重链可变区。轻链可变区和重链可变区可以在相同或不同的多肽上。
在哺乳动物中，抗体的重链可变区和轻链可变区各自贡献三个CDR(互补决定区)，通常称为CDR1、CDR2和CDR3，它们被框架区(例如，FR1、FR2、FR3和FR4)隔开和/或侧接。如本文中所用，术语“CDR”是指被鉴定为互补决定区的多肽的氨基酸序列。在某些实施方案中，CDR多肽序列的确定性描述和包含抗体或其结合部分的结合位点的残基的鉴定是通过辨析抗体或其结合部分的结构和/或辨析抗体-抗原复合物的结构等实现的。在某些实施方案中，这通过任何合适的方法来实现，例如X射线晶体学和/或计算机建模。在某些实施方案中，采用多种分析方法来鉴定或估计抗体或其结合部分的CDR序列。例如，使用合适的方法鉴定抗体、其结合部分或其可变区的多肽序列中的CDR的氨基酸序列和/或位置，所述方法的非限制性实例包括Kabat或EU系统(例如，参见Kabat，E.A.，et al.，1991；Sequences ofProteins of Immunological Interest，Fifth Edition，NIH公开号91-3242，以及Johnson，G.and Wu，T.T.2000，Nucleic Acids Research)，和/或Chothia编号方案(例如，Chothia&Lesk，(1987)J.Mol.Biol.，196：901-917；Chothia et al.，Nature，(1989)342：878-883；和Al-Lazikani et al.，(1997)JMB 273，927-948)。在一些实施方案中，使用AbM方法和/或接触方法鉴定抗体的CDR的氨基序列和/或位置。“AbM”定义使用由OxfordMolecular Group生产的对抗体结构进行建模的集成计算机程序套件(参见例如，Martinet al.，Proc.Natl.Acad.Sci.(USA)，86：9268-9272(1989)；“AbM(Trademark)，A ComputerProgram for Modeling Variable Regions of Antibodies，”Oxford，UK；OxfordMolecular，Ltd.)。AbM定义使用知识数据库和从头算方法(ab initio method)的组合(例如由Samudrala et al.，“Ab Initio Protein Structure Prediction Using a CombinedHierarchical Approach，”in PROTEINS，Structure，Function and Genetics Suppl.，3：194-198(1999)所述的那些)从一级序列对抗体的三级结构进行建模。在某些实施方案中，接触定义基于对可用的复杂晶体结构的分析(参见，例如，MacCallum et al.，J.Mol.Biol，5：732-45(1996))。
在一些实施方案中，抗体包含至少6个不同的CDR(例如，3个不同的重链CDR和3个不同的轻链CDR)。在某些实施方案中，抗体的结合部分包含至少2个、至少3个、至少4个、至少5个或至少6个不同的CDR。在一些实施方案中，抗体的结合部分包含3至6个不同的CDR。
在某些实施方案中，抗体或其结合部分包含轻链可变区的一个、两个或三个CDR。在一些实施方案中，抗体或其结合部分的轻链可变区包含一个或更多个CDR(例如，一个、两个、三个或更多个CDR)。表示抗体轻链可变区中CDR的氨基酸序列称为CDR-L1(轻链CDR1)、CDR-L2(轻链CDR2)和CDR-L3(轻链CDR3)，其在从轻链可变区的氨基末端(N端)到羧基末端(C端)的方向上顺序编号(即，L1、L2和L3)。例如，在表示抗体或其结合部分的轻链可变区的多肽中，CDR-L1(当存在时)是最N端的轻链CDR；CDR-L3(当存在时)是最C端的轻链CDR；并且CDR-L2(当存在时)位于抗体的轻链可变区或结合部分的(i)CDR-L1和CDR-L3之间，(ii)CDR-L3的N端侧，或(iii)CDR-L1的C端侧。术语“CDR-L1”、“CDR-L2”和“CDR-L3”部分地指被鉴定为或在本文中公开为抗体的互补决定区的多肽的氨基酸序列(例如，轻链可变区的CDR)。表1至3中分别提供了CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3的氨基酸序列的非限制性实例。抗体的轻链可变区或抗原结合部分可包含本文中公开的CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3的任何组合，其中抗体的结合部分保留与黏结蛋白聚糖-1或其一部分的特异性结合。在某些实施方案中，抗体的轻链可变区或抗原结合部分包含单个轻链CDR，其包含与选自表3的CDR-L3具有至少70％同一性的氨基酸序列。在某些实施方案中，抗体的轻链可变区或抗原结合部分包含与选自表3的CDR-L3具有至少70％同一性的氨基酸序列，和/或另外的合适的CDR-L2和/或CDR-L1多肽序列，其中抗体或其结合部分保留与黏结蛋白聚糖-1或其一部分的特异性结合。在某些实施方案中，抗体的轻链可变区或抗原结合部分的轻链CDR由CDR-L3和CDR-L2组成，其中CDR-L3包含与选自表3的CDR-L3具有至少70％同一性的氨基酸序列，并且CDR-L2包含与选自表2的CDR-L2具有至少70％同一性的氨基酸序列。在某些实施方案中，抗体的轻链可变区或抗原结合部分包含与选自表3的CDR-L3具有至少70％同一性的氨基酸序列，和与选自表2的CDR-L2具有至少70％同一性的氨基酸序列，以及任何其他合适的CDR-L1多肽序列，其中抗体或其结合部分保留与黏结蛋白聚糖-1或其一部分的特异性结合。在某些实施方案中，抗体的轻链可变区或抗原结合部分包含三个轻链CDR，其由与选自表3的CDR-L3具有至少70％同一性的氨基酸序列、与选自表2的CDR-L2具有至少70％同一性的氨基酸序列和与选自表1的CDR-L1具有至少70％同一性的氨基酸序列组成。在某些实施方案中，抗体的轻链可变区或抗原结合部分包含与选自表3的CDR-L3具有至少70％同一性的氨基酸序列、与选自表2的CDR-L2具有至少70％同一性的氨基酸序列和与选自表1的CDR-L1具有至少70％同一性的氨基酸序列，其中抗体或其结合部分保留与黏结蛋白聚糖-1或其一部分的特异性结合。
在一些实施方案中，抗体或其结合部分包含与表1、2或3中所列的任一个CDR序列具有至少70％、75％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％同一性的一个或更多个轻链CDR。在一些实施方案中，抗体或其结合部分包含与表1中所示的任一个序列具有至少70％、75％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％同一性的CDR-L1。在一些实施方案中，抗体或其结合部分包含表1中所示的任一个序列的CDR-L1。
[表1]
CDR-L1序列
Figure BPA0000302829100000211
*指示CDR通过Kabat方法进行定义。
在一些实施方案中，黏结蛋白聚糖-1抗体或其结合部分包含与表2中所示的任一个序列具有至少70％、75％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％同一性的CDR-L2。在一些实施方案中，黏结蛋白聚糖-1抗体或其结合部分包含表2中所示的任一个序列的CDR-L2。
[表2]
CDR-L2序列
Figure BPA0000302829100000221
*指示CDR通过Kabat方法进行定义。
在一些实施方案中，黏结蛋白聚糖-1抗体或其结合部分包含与表3中所示的任一个序列具有至少70％、75％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％同一性的CDR-L3。在一些实施方案中，黏结蛋白聚糖-1抗体或其结合部分包含表3中所示的任一个序列的CDR-L3。
[表3]
CDR-L3序列
Figure BPA0000302829100000222
*指示CDR通过Kabat方法进行定义。
在一些实施方案中，黏结蛋白聚糖-1抗体或其结合部分包含与表4的氨基酸序列具有至少70％、75％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％同一性的轻链可变区。在一些实施方案中，黏结蛋白聚糖-1抗体或其结合部分包含表4的轻链可变区序列。
[表4]
小鼠可变轻链序列
Figure BPA0000302829100000231
在一些实施方案中，黏结蛋白聚糖-1抗体或其结合部分包含与表5的序列具有至少70％、75％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％同一性的人源化轻链可变区。在一些实施方案中，黏结蛋白聚糖-1抗体或其结合部分包含表5的人源化轻链可变区序列。
[表5]
人源化轻链可变区
Figure BPA0000302829100000241
在某些实施方案中，黏结蛋白聚糖-1抗体或其结合部分包含重链可变区的一个、两个或三个CDR。在一些实施方案中，重链可变区包含一个或更多个不同的CDR(例如，一个、两个、三个或更多个不同的CDR)。表示抗体重链可变区中CDR的氨基酸序列称为CDR-H1(重链CDR1)、CDR-H2(重链CDR2)和CDR-H3(重链CDR3)，其在从重链可变区的氨基末端(N端)到羧基末端(C端)的方向上顺序编号(即，H1、H2和H3)。例如，在表示黏结蛋白聚糖-1抗体或其结合部分的重链可变区的多肽中，CDR-H1(当存在时)是最N端的CDR；CDR-H3(当存在时)是最C端的CDR；并且CDR-H2(当存在时)位于重链可变区的(i)CDR-H1和CDR-H3之间，(ii)CDR-H3的N端侧，或(iii)CDR-H的C端侧。术语“CDR-H1”、“CDR-H2”和“CDR-H3”部分地指被鉴定为或在本文中公开为黏结蛋白聚糖-1抗体或其结合部分的互补决定区的多肽的氨基酸序列(例如，黏结蛋白聚糖-1抗体的重链链可变区的CDR)。CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3的氨基酸序列的非限制性实例分别在表6至8中提供。黏结蛋白聚糖-1抗体的重链可变区或抗原结合部分可包含CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3的任何组合，其中黏结蛋白聚糖-1抗体或其结合部分保留与黏结蛋白聚糖-1或其一部分的特异性结合。在某些实施方案中，黏结蛋白聚糖-1抗体或其结合部分的重链可变区或抗原结合部分包含单个重链CDR，其由与选自表8的CDR-H3具有至少70％同一性的氨基酸序列组成。在某些实施方案中，黏结蛋白聚糖-1抗体的重链可变区或抗原结合部分包含与选自表8的CDR-H3具有至少70％同一性的氨基酸序列，以及任何其他合适的CDR-H2和/或CDR-H1多肽序列，其中黏结蛋白聚糖-1抗体或其结合部分保留与黏结蛋白聚糖-1或其一部分的特异性结合。在某些实施方案中，黏结蛋白聚糖-1抗体的重链可变区或抗原结合部分的重链CDR由CDR-H3和CDR-H2组成，其中CDR-H3包含与选自表8的CDR-H3具有至少70％同一性的氨基酸序列，并且CDR-H2包含与选自表7的CDR-H2具有至少70％同一性的氨基酸序列。在某些实施方案中，黏结蛋白聚糖-1抗体的重链可变区或抗原结合部分包含与选自表8的CDR-H3具有至少70％同一性的氨基酸序列和与选自表7的CDR-H2具有至少70％同一性的氨基酸序列，以及任何其他合适的CDR-H1多肽序列，其中黏结蛋白聚糖-1抗体或其结合部分保留与黏结蛋白聚糖-1或其一部分的特异性结合。在某些实施方案中，黏结蛋白聚糖-1抗体的重链可变区或抗原结合部分包含三个重链CDR，其由与选自表8的CDR-H3具有至少70％同一性的氨基酸序列、与选自表7的CDR-H2具有至少70％同一性的氨基酸序列和与选自表6的CDR-H1具有至少70％同一性的氨基酸序列组成。在某些实施方案中，黏结蛋白聚糖-1抗体的重链可变区或抗原结合部分包含与选自表8的CDR-H3具有至少70％同一性的氨基酸序列、与选自表7的CDR-H2具有至少70％同一性的氨基酸序列和与选自表6的CDR-H1具有至少70％同一性的氨基酸序列，其中黏结蛋白聚糖-1抗体保留与黏结蛋白聚糖-1或其一部分的特异性结合。
在一些实施方案中，黏结蛋白聚糖-1抗体或其结合部分包含与表6、7或8的任一个CDR具有至少70％、75％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％同一性的一个或更多个重链CDR。在一些实施方案中，黏结蛋白聚糖-1抗体或其结合部分包含与表6中所示的任一个序列具有至少70％、75％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％同一性的CDR-H1。在一些实施方案中，黏结蛋白聚糖-1抗体或其结合部分包含表6中所示的任一个序列的CDR-H1。
[表6]
CDR-H1序列
Figure BPA0000302829100000261
*指示CDR通过Kabat方法进行定义。
在一些实施方案中，黏结蛋白聚糖-1抗体或其结合部分包含与表7中所示的任一个序列具有至少70％、75％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％同一性的CDR-H2。在一些实施方案中，黏结蛋白聚糖-1抗体或其结合部分包含表7中所示的任一个序列的CDR-H2。
[表7]
CDR-H2序列
Figure BPA0000302829100000271
*指示CDR通过Kabat方法进行定义。
在一些实施方案中，黏结蛋白聚糖-1抗体或其结合部分包含与表8中所示的任一个序列具有至少70％、75％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％同一性的CDR-H3。在一些实施方案中，黏结蛋白聚糖-1抗体或其结合部分包含表8中所示的任一个序列的CDR-H3。
[表8]
CDR-H3序列
Figure BPA0000302829100000272
*指示CDR通过Kabat方法进行定义。
在一些实施方案中，抗体或其结合部分包含以下或由以下组成：包含与表1的任一个氨基酸序列具有至少90％、至少95％或100％同一性的氨基酸序列的CDR-L1，包含与表2的任一个氨基酸序列具有至少90％、至少95％或100％同一性的氨基酸序列的CDR-L2，包含与表3的任一个氨基酸序列具有至少90％、至少95％或100％同一性的氨基酸序列的CDR-L3，包含与表6的任一个氨基酸序列具有至少90％、至少95％或100％同一性的氨基酸序列的CDR-H1，包含与表7的任一个氨基酸序列具有至少90％、至少95％或100％同一性的氨基酸序列的CDR-H2，以及包含与表8的任一个氨基酸序列具有至少90％、至少95％或100％同一性的氨基酸序列的CDR-H3。
在一些实施方案中，抗体或其结合部分包含以下或由以下组成：包含与SEQ IDNO：2或3的氨基酸序列具有至少70％、至少75％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性的氨基酸序列的CDR-L1，包含与SEQ ID NO：16、17或18的氨基酸序列具有至少70％、至少75％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性的氨基酸序列的CDR-L2，包含与SEQ ID NO：27或28的氨基酸序列具有至少70％、至少75％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性的氨基酸序列的CDR-L3，包含与SEQ ID NO：45、46或47的氨基酸序列具有至少70％、至少75％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性的氨基酸序列的CDR-H1，包含与SEQ ID NO：60或61的氨基酸序列具有至少70％、至少75％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性的氨基酸序列的CDR-H2，以及包含与SEQ ID NO：72或73的氨基酸序列具有至少70％、至少75％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性的氨基酸序列的CDR-H3。
在一些实施方案中，抗体或其结合部分包含以下或由以下组成：包含与SEQ IDNO：3的氨基酸序列具有至少80％、至少85％、至少90％或100％同一性的氨基酸序列的CDR-L1，包含与SEQ ID NO：18的氨基酸序列具有至少80％、至少85％、至少90％或100％同一性的氨基酸序列的CDR-L2，包含与SEQ ID NO：28的氨基酸序列具有至少80％、至少85％、至少90％或100％同一性的氨基酸序列的CDR-L3，包含与SEQ ID NO：47的氨基酸序列具有至少80％、至少85％、至少90％或100％同一性的氨基酸序列的CDR-H1，包含与SEQ ID NO：60的氨基酸序列具有至少80％、至少85％、至少90％或100％同一性的氨基酸序列的CDR-H2，以及包含与SEQ ID NO：73的氨基酸序列具有至少80％、至少85％、至少90％或100％同一性的氨基酸序列的CDR-H3。
在一些实施方案中，抗体或其结合部分包含：包含与SEQ ID NO：2的氨基酸序列具有至少80％、至少85％、至少90％或100％同一性的氨基酸序列的CDR-L1，包含与SEQ IDNO：17的氨基酸序列具有至少80％、至少85％、至少90％或100％同一性的氨基酸序列的CDR-L2，包含与SEQ ID NO：27的氨基酸序列具有至少80％、至少85％、至少90％或100％同一性的氨基酸序列的CDR-L3，包含与SEQ ID NO：47的氨基酸序列具有至少80％、至少85％、至少90％或100％同一性的氨基酸序列的CDR-H1，包含与SEQ ID NO：61的氨基酸序列具有至少80％、至少85％、至少90％或100％同一性的氨基酸序列的CDR-H2，以及包含与SEQ IDNO：73的氨基酸序列具有至少80％、至少85％、至少90％或100％同一性的氨基酸序列的CDR-H3。在一些实施方案中，抗体或其结合部分包含：包含与SEQ ID NO：2的氨基酸序列具有至少80％、至少85％、至少90％或100％同一性的氨基酸序列的CDR-L1，包含与SEQ IDNO：16的氨基酸序列具有至少80％、至少85％、至少90％或100％同一性的氨基酸序列的CDR-L2，包含与SEQ ID NO：27的氨基酸序列具有至少80％、至少85％、至少90％或100％同一性的氨基酸序列的CDR-L3，包含与SEQ ID NO：45的氨基酸序列具有至少80％、至少85％、至少90％或100％同一性的氨基酸序列的CDR-H1，包含与SEQ ID NO：60的氨基酸序列具有至少80％、至少85％、至少90％或100％同一性的氨基酸序列的CDR-H2，以及包含与SEQ IDNO：72的氨基酸序列具有至少80％、至少85％、至少90％或100％同一性的氨基酸序列的CDR-H3。在一些实施方案中，抗体或其结合部分包含CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3，其分别包含SEQ ID NO：2、16和27的氨基酸序列，以及CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3，其分别包含SEQ ID NO：45、60和72的氨基酸序列。在一些实施方案中，抗体或其结合部分包含CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3，其分别包含SEQ ID NO：2、16和27的氨基酸序列，以及CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3，其分别包含SEQ ID NO：46、61和72的氨基酸序列。在一些实施方案中，抗体或其结合部分包含CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3，其分别包含SEQ ID NO：2、16和27的氨基酸序列，以及CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3，其分别包含SEQ ID NO：45、61和72的氨基酸序列。
在一些实施方案中，抗体或其结合部分包含以下或由以下组成：包含与SEQ IDNO：4或5的氨基酸序列具有至少70％、至少75％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性的氨基酸序列的CDR-L1，包含与SEQ ID NO：19、20或21的氨基酸序列具有至少70％、至少75％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性的氨基酸序列的CDR-L2，包含与SEQ ID NO：29或30的氨基酸序列具有至少70％、至少75％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性的氨基酸序列的CDR-L3，包含与SEQ ID NO：48、49或50的氨基酸序列具有至少70％、至少75％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性的氨基酸序列的CDR-H1，包含与SEQ ID NO：62、63或64的氨基酸序列具有至少70％、至少75％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性的氨基酸序列的CDR-H2，以及包含与SEQ ID NO：74或75的氨基酸序列具有至少70％、至少75％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性的氨基酸序列的CDR-H3。
在一些实施方案中，抗体或其结合部分包含以下或由以下组成：包含与SEQ IDNO：5的氨基酸序列具有至少80％、至少90％或100％同一性的氨基酸序列的CDR-L1，包含与SEQ ID NO：21的氨基酸序列具有至少80％、至少90％或100％同一性的氨基酸序列的CDR-L2，包含与SEQ ID NO：30的氨基酸序列具有至少80％、至少90％或100％同一性的氨基酸序列的CDR-L3，包含与SEQ ID NO：50的氨基酸序列具有至少80％、至少90％或100％同一性的氨基酸序列的CDR-H1，包含与SEQ ID NO：62或64的氨基酸序列具有至少80％、至少90％或100％同一性的氨基酸序列的CDR-H2，以及包含与SEQ ID NO：75的氨基酸序列具有至少80％、至少90％或100％同一性的氨基酸序列的CDR-H3。
在一些实施方案中，抗体或其结合部分包含：包含与SEQ ID NO：4的氨基酸序列具有至少80％、至少90％或100％同一性的氨基酸序列的CDR-L1，包含与SEQ ID NO：20的氨基酸序列具有至少80％、至少90％或100％同一性的氨基酸序列的CDR-L2，包含与SEQ ID NO：29的氨基酸序列具有至少80％、至少90％或100％同一性的氨基酸序列的CDR-L3，包含与SEQ ID NO：50的氨基酸序列具有至少80％、至少90％或100％同一性的氨基酸序列的CDR-H1，包含与SEQ ID NO：63的氨基酸序列具有至少80％、至少90％或100％同一性的氨基酸序列的CDR-H2，以及包含与SEQ ID NO：75的氨基酸序列具有至少80％、至少90％或100％同一性的氨基酸序列的CDR-H3。在一些实施方案中，抗体或其结合部分包含CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3，其分别包含SEQ ID NO：4、19和29的氨基酸序列，以及CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3，其分别包含SEQ ID NO：48、63和75的氨基酸序列。在一些实施方案中，抗体或其结合部分包含CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3，其分别包含SEQ ID NO：4、19和29的氨基酸序列，以及CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3，其分别包含SEQ ID NO：49、63和75的氨基酸序列。在一些实施方案中，抗体或其结合部分包含CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3，其分别包含SEQ ID NO：4、19和29的氨基酸序列，以及CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3，其分别包含SEQ ID NO：49、63和74的氨基酸序列。在一些实施方案中，抗体或其结合部分包含CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3，其分别包含SEQ ID NO：4、19和29的氨基酸序列，以及CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3，其分别包含SEQ ID NO：48、63和74的氨基酸序列。
在一些实施方案中，抗体或其结合部分包含以下或由以下组成：包含与SEQ IDNO：6或7的氨基酸序列具有至少70％、至少75％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性的氨基酸序列的CDR-L1，包含与SEQ ID NO：22的氨基酸序列具有至少70％、至少75％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性的氨基酸序列的CDR-L2，包含与SEQ ID NO：29或30的氨基酸序列具有至少70％、至少75％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性的氨基酸序列的CDR-L3，包含与SEQ ID NO：50或51的氨基酸序列具有至少70％、至少75％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性的氨基酸序列的CDR-H1，包含与SEQ ID NO：62、63或64的氨基酸序列具有至少70％、至少75％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性的氨基酸序列的CDR-H2，以及包含与SEQ ID NO：76的氨基酸序列具有至少70％、至少75％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性的氨基酸序列的CDR-H3。
在一些实施方案中，抗体或其结合部分包含以下或由以下组成：包含与SEQ IDNO：7的氨基酸序列具有至少80％、至少90％或100％同一性的氨基酸序列的CDR-L1，包含与SEQ ID NO：22的氨基酸序列具有至少80％、至少90％或100％同一性的氨基酸序列的CDR-L2，包含与SEQ ID NO：30的氨基酸序列具有至少80％、至少90％或100％同一性的氨基酸序列的CDR-L3，包含与SEQ ID NO：50的氨基酸序列具有至少80％、至少90％或100％同一性的氨基酸序列的CDR-H1，包含与SEQ ID NO：63的氨基酸序列具有至少80％、至少90％或100％同一性的氨基酸序列的CDR-H2，以及包含与SEQ ID NO：76的氨基酸序列具有至少80％、至少90％或100％同一性的氨基酸序列的CDR-H3。
在一些实施方案中，抗体或其结合部分包含：包含与SEQ ID NO：6的氨基酸序列具有至少80％、至少90％或100％同一性的氨基酸序列的CDR-L1，包含与SEQ ID NO：22的氨基酸序列具有至少80％、至少90％或100％同一性的氨基酸序列的CDR-L2，包含与SEQ ID NO：29的氨基酸序列具有至少80％、至少90％或100％同一性的氨基酸序列的CDR-L3，包含与SEQ ID NO：50的氨基酸序列具有至少80％、至少90％或100％同一性的氨基酸序列的CDR-H1，包含与SEQ ID NO：63的氨基酸序列具有至少80％、至少90％或100％同一性的氨基酸序列的CDR-H2，以及包含与SEQ ID NO：76的氨基酸序列具有至少80％、至少90％或100％同一性的氨基酸序列的CDR-H3。在一些实施方案中，抗体或其结合部分包含CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3，其分别包含SEQ ID NO：6、22和29的氨基酸序列，以及CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3，其分别包含SEQ ID NO：51、63和76的氨基酸序列。
在一些实施方案中，抗体或其结合部分包含以下或由以下组成：包含与SEQ IDNO：8或9的氨基酸序列具有至少70％、至少75％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性的氨基酸序列的CDR-L1，包含与SEQ ID NO：23的氨基酸序列具有至少70％、至少75％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性的氨基酸序列的CDR-L2，包含与SEQ ID NO：31的氨基酸序列具有至少70％、至少75％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性的氨基酸序列的CDR-L3，包含与SEQ ID NO：52或53的氨基酸序列具有至少70％、至少75％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性的氨基酸序列的CDR-H1，包含与SEQ ID NO：65或66的氨基酸序列具有至少70％、至少75％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性的氨基酸序列的CDR-H2，以及包含与SEQ ID NO：77的氨基酸序列具有至少70％、至少75％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性的氨基酸序列的CDR-H3。
在一些实施方案中，抗体或其结合部分包含以下或由以下组成：包含与SEQ IDNO：9的氨基酸序列具有至少80％、至少90％或100％同一性的氨基酸序列的CDR-L1，包含与SEQ ID NO：23的氨基酸序列具有至少80％、至少90％或100％同一性的氨基酸序列的CDR-L2，包含与SEQ ID NO：31的氨基酸序列具有至少80％、至少90％或100％同一性的氨基酸序列的CDR-L3，包含与SEQ ID NO：53的氨基酸序列具有至少80％、至少90％或100％同一性的氨基酸序列的CDR-H1，包含与SEQ ID NO：66的氨基酸序列具有至少80％、至少90％或100％同一性的氨基酸序列的CDR-H2，以及包含与SEQ ID NO：77的氨基酸序列具有至少80％、至少90％或100％同一性的氨基酸序列的CDR-H3。
在一些实施方案中，抗体或其结合部分包含：包含与SEQ ID NO：8的氨基酸序列具有至少80％、至少90％或100％同一性的氨基酸序列的CDR-L1，包含与SEQ ID NO：23的氨基酸序列具有至少80％、至少90％或100％同一性的氨基酸序列的CDR-L2，包含与SEQ ID NO：31的氨基酸序列具有至少80％、至少90％或100％同一性的氨基酸序列的CDR-L3，包含与SEQ ID NO：53的氨基酸序列具有至少80％、至少90％或100％同一性的氨基酸序列的CDR-H1，包含与SEQ ID NO：65的氨基酸序列具有至少80％、至少90％或100％同一性的氨基酸序列的CDR-H2，以及包含与SEQ ID NO：77的氨基酸序列具有至少80％、至少90％或100％同一性的氨基酸序列的CDR-H3。在一些实施方案中，抗体或其结合部分包含CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3，其分别包含SEQ ID NO：8、23和31的氨基酸序列，以及CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3，其分别包含SEQ ID NO：52、65和77的氨基酸序列。
在一些实施方案中，抗体或其结合部分包含以下或由以下组成：包含与SEQ IDNO：10或11的氨基酸序列具有至少70％、至少75％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性的氨基酸序列的CDR-L1，包含与SEQ ID NO：24的氨基酸序列具有至少70％、至少75％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性的氨基酸序列的CDR-L2，包含与SEQ ID NO：29或30的氨基酸序列具有至少70％、至少75％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性的氨基酸序列的CDR-L3，包含与SEQ ID NO：50或54的氨基酸序列具有至少70％、至少75％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性的氨基酸序列的CDR-H1，包含与SEQ ID NO：62、64或67的氨基酸序列具有至少70％、至少75％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性的氨基酸序列的CDR-H2，以及包含与SEQ ID NO：78或79的氨基酸序列具有至少70％、至少75％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性的氨基酸序列的CDR-H3。
在一些实施方案中，抗体或其结合部分包含以下或由以下组成：包含与SEQ IDNO：11的氨基酸序列具有至少80％、至少90％或100％同一性的氨基酸序列的CDR-L1，包含与SEQ ID NO：24的氨基酸序列具有至少80％、至少90％或100％同一性的氨基酸序列的CDR-L2，包含与SEQ ID NO：30的氨基酸序列具有至少80％、至少90％或100％同一性的氨基酸序列的CDR-L3，包含与SEQ ID NO：50的氨基酸序列具有至少80％、至少90％或100％同一性的氨基酸序列的CDR-H1，包含与SEQ ID NO：62或64的氨基酸序列具有至少80％、至少90％或100％同一性的氨基酸序列的CDR-H2，以及包含与SEQ ID NO：79的氨基酸序列具有至少80％、至少90％或100％同一性的氨基酸序列的CDR-H3。
在一些实施方案中，抗体或其结合部分包含：包含与SEQ ID NO：10的氨基酸序列具有至少80％、至少90％或100％同一性的氨基酸序列的CDR-L1，包含与SEQ ID NO：24的氨基酸序列具有至少80％、至少90％或100％同一性的氨基酸序列的CDR-L2，包含与SEQ IDNO：29的氨基酸序列具有至少80％、至少90％或100％同一性的氨基酸序列的CDR-L3，包含与SEQ ID NO：50的氨基酸序列具有至少80％、至少90％或100％同一性的氨基酸序列的CDR-H1，包含与SEQ ID NO：67的氨基酸序列具有至少80％、至少90％或100％同一性的氨基酸序列的CDR-H2，以及包含与SEQ ID NO：79的氨基酸序列具有至少80％、至少90％或100％同一性的氨基酸序列的CDR-H3。在一些实施方案中，抗体或其结合部分包含CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3，其分别包含SEQ ID NO：10、24和29的氨基酸序列，以及CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3，其分别包含SEQ ID NO：54、67和78的氨基酸序列。
在一些实施方案中，抗体或其结合部分包含以下或由以下组成：包含与SEQ IDNO：12或13的氨基酸序列具有至少70％、至少75％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性的氨基酸序列的CDR-L1，包含与SEQ ID NO：25的氨基酸序列具有至少70％、至少75％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性的氨基酸序列的CDR-L2，包含与SEQ ID NO：32的氨基酸序列具有至少70％、至少75％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性的氨基酸序列的CDR-L3，包含与SEQ ID NO：55或56的氨基酸序列具有至少70％、至少75％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性的氨基酸序列的CDR-H1，包含与SEQ ID NO：68或69的氨基酸序列具有至少70％、至少75％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性的氨基酸序列的CDR-H2，以及包含与SEQ ID NO：80的氨基酸序列具有至少70％、至少75％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性的氨基酸序列的CDR-H3。
在一些实施方案中，抗体或其结合部分包含以下或由以下组成：包含与SEQ IDNO：13的氨基酸序列具有至少80％、至少90％或100％同一性的氨基酸序列的CDR-L1，包含与SEQ ID NO：25的氨基酸序列具有至少80％、至少90％或100％同一性的氨基酸序列的CDR-L2，包含与SEQ ID NO：32的氨基酸序列具有至少80％、至少90％或100％同一性的氨基酸序列的CDR-L3，包含与SEQ ID NO：56的氨基酸序列具有至少80％、至少90％或100％同一性的氨基酸序列的CDR-H1，包含与SEQ ID NO：69的氨基酸序列具有至少80％、至少90％或100％同一性的氨基酸序列的CDR-H2，以及包含与SEQ ID NO：80的氨基酸序列具有至少80％、至少90％或100％同一性的氨基酸序列的CDR-H3。
在一些实施方案中，抗体或其结合部分包含：包含与SEQ ID NO：12的氨基酸序列具有至少80％、至少90％或100％同一性的氨基酸序列的CDR-L1，包含与SEQ ID NO：25的氨基酸序列具有至少80％、至少90％或100％同一性的氨基酸序列的CDR-L2，包含与SEQ IDNO：32的氨基酸序列具有至少80％、至少90％或100％同一性的氨基酸序列的CDR-L3，包含与SEQ ID NO：56的氨基酸序列具有至少80％、至少90％或100％同一性的氨基酸序列的CDR-H1，包含与SEQ ID NO：68的氨基酸序列具有至少80％、至少90％或100％同一性的氨基酸序列的CDR-H2，以及包含与SEQ ID NO：80的氨基酸序列具有至少80％、至少90％或100％同一性的氨基酸序列的CDR-H3。在一些实施方案中，抗体或其结合部分包含CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3，其分别包含SEQ ID NO：12、25和32的氨基酸序列，以及CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3，其分别包含SEQ ID NO：55、68和80的氨基酸序列。
在一些实施方案中，抗体或其结合部分包含以下或由以下组成：包含与SEQ IDNO：14或15的氨基酸序列具有至少70％、至少75％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性的氨基酸序列的CDR-L1，包含与SEQ ID NO：26的氨基酸序列具有至少70％、至少75％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性的氨基酸序列的CDR-L2，包含与SEQ ID NO：33的氨基酸序列具有至少70％、至少75％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性的氨基酸序列的CDR-L3，包含与SEQ ID NO：57、58或59的氨基酸序列具有至少70％、至少75％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性的氨基酸序列的CDR-H1，包含与SEQ ID NO：70或71的氨基酸序列具有至少70％、至少75％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性的氨基酸序列的CDR-H2，以及包含与SEQ ID NO：81的氨基酸序列具有至少70％、至少75％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性的氨基酸序列的CDR-H3。
在一些实施方案中，抗体或其结合部分包含以下或由以下组成：包含与SEQ IDNO：15的氨基酸序列具有至少80％、至少90％或100％同一性的氨基酸序列的CDR-L1，包含与SEQ ID NO：26的氨基酸序列具有至少80％、至少90％或100％同一性的氨基酸序列的CDR-L2，包含与SEQ ID NO：33的氨基酸序列具有至少80％、至少90％或100％同一性的氨基酸序列的CDR-L3，包含与SEQ ID NO：59的氨基酸序列具有至少80％、至少90％或100％同一性的氨基酸序列的CDR-H1，包含与SEQ ID NO：70的氨基酸序列具有至少80％、至少90％或100％同一性的氨基酸序列的CDR-H2，以及包含与SEQ ID NO：81的氨基酸序列具有至少80％、至少90％或100％同一性的氨基酸序列的CDR-H3。在一些实施方案中，抗体或其结合部分包含以下或由以下组成：CDR-L1、CDR-L2、CDR-L3、CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3，其分别包含与SEQ ID NO：15、26、33、57、70和81的氨基酸序列具有至少80％、至少90％或100％同一性的氨基酸序列。
在一些实施方案中，抗体或其结合部分包含：包含与SEQ ID NO：14的氨基酸序列具有至少80％、至少90％或100％同一性的氨基酸序列的CDR-L1，包含与SEQ ID NO：26的氨基酸序列具有至少80％、至少90％或100％同一性的氨基酸序列的CDR-L2，包含与SEQ IDNO：33的氨基酸序列具有至少80％、至少90％或100％同一性的氨基酸序列的CDR-L3，包含与SEQ ID NO：59的氨基酸序列具有至少80％、至少90％或100％同一性的氨基酸序列的CDR-H1，包含与SEQ ID NO：71的氨基酸序列具有至少80％、至少90％或100％同一性的氨基酸序列的CDR-H2，以及包含与SEQ ID NO：81的氨基酸序列具有至少80％、至少90％或100％同一性的氨基酸序列的CDR-H3。在一些实施方案中，抗体或其结合部分包含CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3，其分别包含SEQ ID NO：14、26和33的氨基酸序列，以及CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3，其分别包含SEQ ID NO：58、71和81的氨基酸序列。在一些实施方案中，抗体或其结合部分包含CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3，其分别包含SEQ ID NO：14、26和33的氨基酸序列，以及CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3，其分别包含SEQ ID NO：57、71和81的氨基酸序列。
在一些实施方案中，黏结蛋白聚糖-1抗体或其结合部分包含与表9的序列具有至少70％、75％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％同一性的重链可变区。在一些实施方案中，黏结蛋白聚糖-1抗体或其结合部分包含表9的重链可变区序列。
[表9]
小鼠可变重链序列
Figure BPA0000302829100000391
在一些实施方案中，黏结蛋白聚糖-1抗体或其结合部分包含与表10的序列具有至少70％、75％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％同一性的人源化重链可变区。在一些实施方案中，黏结蛋白聚糖-1抗体或其结合部分包含表10的人源化重链可变区序列。
[表10]
人源化重链
Figure BPA0000302829100000401
在一些实施方案中，抗体或其结合部分包含以下或由以下组成：包含与SEQ IDNO：82至92的任一个氨基酸序列具有至少70％、至少75％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性的氨基酸序列的重链可变区，和/或包含与SEQ ID NO：34至43的任一个氨基酸序列具有至少70％、至少75％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性的氨基酸序列的轻链可变区。在一些实施方案中，抗体或其结合部分包含：包含与SEQ ID NO：89至92的任一个氨基酸序列具有至少80％、至少85％、至少90％或100％同一性的氨基酸序列的重链可变区，以及包含与SEQ ID NO：41至43的任一个氨基酸序列具有至少80％、至少85％、至少90％或100％同一性的氨基酸序列的轻链可变区。在一些实施方案中，抗体或其结合部分包含：包含与SEQ ID NO：90的氨基酸序列具有至少80％、至少85％、至少90％或100％同一性的氨基酸序列的重链可变区，以及包含与SEQ ID NO：41的氨基酸序列具有至少80％、至少85％、至少90％或100％同一性的氨基酸序列的轻链可变区。
在一些实施方案中，抗体或其结合部分包含选自表4和5的轻链可变区的一个或更多个CDR。在一些实施方案中，抗体或其结合部分包含选自表9和10的重链可变区的一个或更多个CDR。在一些实施方案中，抗体或其结合部分包含选自表4和5的轻链可变区的一个或更多个CDR，以及选自表9和10的重链可变区的一个或更多个CDR。在某些实施方案中，抗体或其结合部分包含CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3，其各自选自表4和5的任一个轻链可变区，以及CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3，其各自选自表9和10的任一个重链可变区。可以通过本文中所述的或本领域技术人员已知的任何合适的方法鉴定本文中公开的重链或轻链可变区内的CDR(例如，CDR-L1、CDR-L2、CDR-L3、CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3)的氨基酸序列。
在一些实施方案中，抗体包含：包含与SEQ ID NO：93的氨基酸序列具有至少80％、至少85％、至少90％或100％同一性的氨基酸序列的重链，以及包含与SEQ ID NO：44的氨基酸序列具有至少80％、至少85％、至少90％或100％同一性的氨基酸序列的轻链。
在一些实施方案中，抗体或其结合部分包含选自表1至10的一个或更多个合适的序列，其中所选择的多肽序列包含0至5、1至5、0至10、1至10、0至15或1至12个氨基酸修饰、添加、缺失和/或替换。在一些实施方案中，氨基酸替换是保守替换，其中一个氨基酸被替换为具有相似结构或具有相似生化特性的其他氨基酸。保守替换的非限制性实例包括将亲水性氨基酸替换为其他亲水性氨基酸，将疏水性氨基酸替换为其他疏水性氨基酸，将酸性氨基酸替换为其他酸性氨基酸，将碱性氨基酸替换为其他碱性氨基酸，以及将中性电荷氨基酸替换为其他中性电荷氨基酸。在一些实施方案中，抗体或其结合部分包含一个或更多个氨基酸类似物、非天然氨基酸或氨基酸衍生物。
在某些实施方案中，抗体或其结合部分包含一个或更多个框架区(frameworkregion，FR)。框架区通常位于抗体或其结合部分的重链或轻链可变区的CDR之间和/或侧接CDR序列。在哺乳动物中，重链可变区通常包含四个框架区，并且轻链可变区通常包含四个框架区。可以使用任何合适的方法来鉴定抗体中的、抗体或其结合部分的可变区中的一个或更多个框架区。抗体或其结合部分可包含合成或天然存在的框架区，其如下所述是未经修饰或经修饰的(例如，经优化的)。
在一些实施方案中，抗体或其结合部分是嵌合的、移植的和/或人源化的。嵌合抗体、移植抗体和/或人源化抗体通常包含经修饰的或替换的恒定区和/或框架区，同时保持对黏结蛋白聚糖-1或其一部分的结合特异性。在一些实施方案中，抗体或其结合部分包含来源于人抗体的恒定区、框架区或其一部分。在一些实施方案中，抗体或其结合部分包含未在天然抗体分子中发现的完全合成的部分、一个或更多个氨基酸、或氨基酸的序列。
天然存在的框架区或其一部分可以从任何合适的物种获得。在某些实施方案中，抗体或其结合部分的轻链和重链可变区的互补决定区(CDR)被移植到来自相同或其他物种的框架区中。例如，抗体或其结合部分的一个或更多个框架区可以来源于啮齿动物物种(例 如，小鼠或大鼠)或灵长类物种(例如，人)。
在某些实施方案中，将抗体或其结合部分的轻链和/或重链可变区的CDR移植至共有序列人框架区。为了产生共有序列人框架区，在某些实施方案中，将来自数个人重链或轻链氨基酸序列的框架区进行比对以鉴定共有序列。在某些实施方案中，将抗体或其结合部分的重链或轻链框架区替换为来自不同重链或轻链可变区的一个或更多个框架区或其一部分。在一些实施方案中，抗体或其结合部分包含一个或更多个人框架区。在某些实施方案中，抗体或其结合部分包含至少1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个人框架区。在一些实施方案中，抗体或其结合部分包含一个或更多个小鼠框架区。在某些实施方案中，抗体或其结合部分包含至少1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个小鼠框架区。在某些实施方案中，抗体或其结合部分包含一个或更多个人框架区和一个或更多个小鼠框架区。
产生嵌合、人源化和/或优化的抗体或其结合部分的方法(例如通过对框架区或其一部分进行修饰、替换或者使之缺失)是已知的。CDR移植的非限制性实例描述于例如以下中：美国专利No.6,180,370、6,054,297、5,693,762、5,859,205、5,693,761、5,565,332、5,585,089和5,530,101，以及Jones et al.，Nature，321：522-525(1986)；Verhoeyen et al.，Science，239：1534-1536(1988)和Winter，FEBS Letts.，430：92-94(1998)。产生嵌合、移植和/或人源化的抗体的另一些非限制性实例包括美国专利No.5,530,101；美国专利No.5,707,622；美国专利No.5,994,524；美国专利No.6,245,894；Queen et al.，(1988)PNAS 86：10029-10033；Riechmann et al.，Nature(1988)332：323-327；AntibodyEngineering：Methods and Protocols，Methods in molecular biology的第248卷，BennyK.C.Lo编辑，Springer Science&Business Media，(2004)；以及Antibody Engineering，Vol.1，Roland E.Kontermann，Stefan Dübel，Edition 2，Publisher Springer Science&Business Media，(2010)。在一些实施方案中，通过将一个或更多个框架区或其一部分(例 如，一个或更多个氨基酸)与来自人抗体的一个或更多个框架区或其一部分进行交换来对抗体或其结合部分进行人源化(例如，参见″Humanization of Antibodies″by EduardoA.Padlan Publ.Landes BioScience 2002)。在某些实施方案中，通过将来自供体抗体(例 如，小鼠单克隆抗体)的一个或更多个CDR(例如，1、2、3、4、5或全部6个CDR)转移至接受体抗体(例如，人抗体)同时保留供体抗体的结合特异性来对抗体或其结合部分进行人源化或移植。在某些实施方案中，制备嵌合、移植或人源化抗体的方法包括在抗体或其结合部分的恒定区或框架区中进行一个或更多个氨基酸替换、添加或缺失。在某些实施方案中，使用技术例如“重塑(reshaping)”、“过度嵌合(hyperchimerization)”或“镶饰/表面再塑(resurfacing)”来产生人源化抗体或其结合部分(例如，参见Vaswamiet al.，Annals ofAllergy，Asthma，&Immunol.81：105(1998)；Roguska et al.，Prot.Engin.，9：895-904(1996)；和美国专利No.6,072,035)。在一些方面，通过上述方法或通过另外合适的方法对抗体或其结合部分进行修饰以降低免疫原性(例如，参见Gilliland et al.，J.Immunol，62(6)：3663-71(1999))。
在某些实施方案中，对抗体或其结合部分的氨基酸序列进行修饰以优化对靶标(例如，黏结蛋白聚糖-1)的结合亲和力、物种交叉反应性、溶解度和/或功能(例如，激动剂活性，或其缺乏)。在一些实施方案中，对本文中公开的CDR的特定组合进行优化以与黏结蛋白聚糖-1结合，和/或优化抗体或其结合部分的功能或特征。例如，可以使用合适的表达系统将本文中公开的特征化轻链可变区(例如，SEQ ID NO：34至43中任一个的轻链可变区)与包含特征化重链可变区(例如，选自表6或7的重链可变区)的CDR-H1和CDR-H2的重链可变区文库共表达，其中CDR-H3替换为CDR-H3序列的文库，其可以包括例如表8的一个或更多个CDR-H3区。可以对所得的轻链/重链抗体进行筛选以用于与黏结蛋白聚糖-1结合和/或以用于特定功能。可以鉴定优化的抗体，并且可以通过合适的方法鉴定CDR-H3的氨基酸序列。以上筛选方法可用于鉴定包含特定的CDR组合或特定的经优化CDR序列(例如，包含氨基酸替换、添加或缺失的CDR序列)的抗体或其结合部分，其提供了具有改善的结合特异性、结合亲和力和/或功能的抗体或其结合部分。这样的筛选和优化抗体或其结合部分的方法是已知的(例如，参见Portolano et al.，(1993)Journal of Immunology 150：880-887；和Clarkson et al.，(1991)Nature 352：624-628)。这样的参考文献教导了通过使用已知的可变轻链、已知的可变重链或其一部分(例如，其CDR)通过筛选互补可变区的文库来产生结合特定抗原的抗体的方法。
在某些实施方案中，对抗体或其结合部分进行修饰以消除或添加糖基化位点，以便优化抗体或其结合部分的亲和力和/或功能(例如，参见Co et al.，Mol.Immunol，30：1361-1367(1993))。在一些实施方案中，对抗体或其结合部分中糖基化位点的数量和/或类型进行修饰或改变。N-连接的糖基化位点通常以序列Asn-X-Ser或Asn-X-Thr为特征，其中定名为X的氨基酸残基是除脯氨酸以外的任何氨基酸残基。产生该序列的氨基酸残基的替换为添加N-连接的碳水化合物链提供了潜在的新位点。或者，消除该序列的替换将除去现有的N-连接的碳水化合物链。在某些实施方案中还提供了N-连接的碳水化合物链的重排，其中消除了一个或更多个N-连接的糖基化位点(通常是天然存在的那些)，并产生了一个或更多个新的N-连接的位点。在一些实施方案中，与未经修饰的抗体或其结合部分相比，通过缺失一个或更多个半胱氨酸残基或将一个或更多个半胱氨酸残基替换为其他氨基酸(例 如，丝氨酸)来对抗体或其结合部分进行修饰。在某些实施方案中，半胱氨酸变体可用于优化表达、分泌和/或溶解度。
在某些实施方案中，对抗体或其结合部分进行修饰以包含某些氨基酸添加、替换或缺失，其被设计为或旨在例如降低抗体或其结合部分对蛋白水解的易感性，降低抗体或其结合部分对氧化的易感性，提高血清半衰期和/或赋予或改变抗体或其结合部分的其他物理化学、药代动力学或功能特性。
本文中所述的双特异性结合剂的抗体部分可以包含与CD138特异性结合的抗体的抗原结合部分(例如，结合部分)。抗体的结合部分是指抗体的抗原结合部分。在某些实施方案中，抗体的结合部分至少包含足以与抗原(例如，黏结蛋白聚糖-1或其一部分)特异性结合的抗体的最小部分。在某些实施方案中，抗体的结合部分包含抗体的一个或更多个互补决定区(CDR)，其对于指导与CD138特异性结合是必需的和足够的。在某些实施方案中，抗体的结合部分包含抗体的重链和轻链可变区。在某些实施方案中，抗体的结合部分包含单个多肽或由其组成(例如，单链抗体)。单链抗体可包含来自抗体重链和/或轻链的一个或更多个CDR。在一些实施方案中，抗体的结合部分包含两个多肽(例如，重链可变区和轻链可变区)或由其组成。在一些实施方案中，抗体的结合部分包含一个或更多个结构部分(例如，骨架、结构多肽、恒定区和/或框架区)。在一些实施方案中，抗体或抗体的结合部分与载体或基底(例如，聚合物、非有机材料、硅、珠、颗粒等)连接。
双特异性结合剂可包含一个抗体结合部分或多个抗体结合部分。当双特异性结合剂包含多个抗体结合部分时，每个结合部分与相同的抗原(例如，黏结蛋白聚糖-1或其一部分)特异性结合。在一些实施方案中，双特异性结合剂包含1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个或更多个抗体结合部分。
抗体结合部分的非限制性实例包括单链抗体、Fab、Fab’、F(ab’)2、Fv片段、单链Fv(scFv)、scFv-Fc、(scFv)2-Fc、二硫键连接的Fvs(sdFv)、VL(可变轻链)、VH(可变重链)、双抗体(Dab)、三抗体(三价)、四抗体(四价)、微抗体((scFV-CH3)2)、IgGdeltaCH2、纳米抗体、scFv-Ig、SVD-Ig等及其组合。
可以使用合适的克隆程序对编码双特异性结合剂、抗体或其结合部分的一种或更多种多肽的核酸或其一部分进行克隆、亚克隆、重排或修饰以进行重组表达，并随后通过本领域技术人员已知的方法使用合适的表达系统进行表达(例如，参见Maniatis et al.，Molecular Cloning：A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory，1982；Antibody Engineering：Methods and Protocols，Methods in molecular biology的第248卷，Benny K.C.Lo编辑，Springer Science&Business Media，2004；AntibodyEngineering，Vol.1，Roland E.Kontermann，Stefan Dübel，Edition 2，PublisherSpringer Science&Business Media，2010；Antibody Phage Display：Methods andProtocols，Biomed Protocols，Methods in molecular biology的第178卷，EditorsPhilippa M.O’Brien，Robert Aitken，Springer Science&Business Media，2004)。
在一些实施方案中，抗体或其结合部分与哺乳动物黏结蛋白聚糖-1或其一部分特异性结合。在某些实施方案中，抗体或其结合部分以10-5M或更小、10-6M或更小、10-7M或更小、10-8M或更小、50nM或更小、10nM或更小或者1nM或更小的结合亲和力(KD)与哺乳动物黏结蛋白聚糖-1或其一部分特异性结合。在某些实施方案中，抗体或其结合部分以约10-5至10-15M、10-6至10-15M、10-7至10-15M、10-9至10-15M、10-9至10-14M、10-9至10-13M、或10-9至约10-12M的结合亲和力(KD)与哺乳动物黏结蛋白聚糖-1或其一部分特异性结合。在一些实施方案中，抗体或其结合部分与哺乳动物黏结蛋白聚糖-1或其一部分的胞外结构域或胞外区特异性结合。在某些方面，抗体或其结合部分与由自然界中发现的未经改变的(非基因修饰的)哺乳动物的细胞产生的野生型黏结蛋白聚糖-1特异性结合。在某些方面，抗体或其结合部分与天然存在的黏结蛋白聚糖-1变体特异性结合。在某些方面，抗体或其结合部分与包含一个或更多个氨基酸替换、添加或缺失的黏结蛋白聚糖-1特异性结合。在某些实施方案中，抗体或其结合部分与在人、非人灵长类、狗、猫或啮齿动物(例如，小鼠或大鼠)的细胞表面上产生和/或表达的黏结蛋白聚糖-1特异性结合。在某些实施方案中，抗体或其结合部分与包含SEQ ID NO：1和126至130中任一个的氨基酸序列的一种或更多种黏结蛋白聚糖-1多肽或其一部分(例如，胞外结构域)特异性结合。在某些实施方案中，抗体或其结合部分以50nM或更小、10nM或更小、或者1nM或更小的结合亲和力(KD)与具有SEQ ID NO：1和126至130中任一个的氨基酸序列的一种或更多种黏结蛋白聚糖-1多肽或其一部分特异性结合。在某些实施方案中，抗体或其结合部分与人黏结蛋白聚糖-1特异性结合。在某些实施方案中，抗体或其结合部分与人黏结蛋白聚糖-1的胞外结构域特异性结合。在某些实施方案中，抗体或其结合部分与人黏结蛋白聚糖-1和/或其胞外结构域特异性结合。
在某些实施方案中，抗体或其结合部分与包含AGEGPKEGEAVVLP(SEQ ID NO：94)或GPKEGEAVVLP(SEQ ID NO：95)的氨基酸序列或由该氨基酸序列组成的多肽序列特异性结合。在某些实施方案中，抗体或其结合部分以10-5M或更小、10-6M或更小、10-7M或更小、10-8M或更小、50nM或更小、10nM或更小或者1nM或更小的结合亲和力(KD)与包含AGEGPKEGEAVVLP(SEQ ID NO：94)或GPKEGEAVVLP(SEQ ID NO：95)的氨基酸序列或由该氨基酸序列组成的多肽序列特异性结合。在某些实施方案中，抗体或其结合部分与包含GX1KEX2EAX3VLP(SEQ IDNO：96)的氨基酸序列或由该氨基酸序列组成的多肽序列特异性结合，其中X1、X2和X3选自任何氨基酸。在一些实施方案中，X1选自脯氨酸、丙氨酸、半胱氨酸、甘氨酸、丝氨酸、苏氨酸和缬氨酸，和/或X2选自脯氨酸、丙氨酸、半胱氨酸、甘氨酸、丝氨酸、苏氨酸和缬氨酸，和/或X3选自脯氨酸、丙氨酸、半胱氨酸、甘氨酸、丝氨酸、苏氨酸、缬氨酸、甲硫氨酸、亮氨酸、异亮氨酸和苯丙氨酸。在某些实施方案中，抗体或其结合部分以50nM或更小、10nM或更小或者1nM或更小的结合亲和力(KD)与包含GX1KEX2EAX3VLP(SEQ ID NO：96)的氨基酸序列或由该氨基酸序列组成的多肽序列特异性结合，其中X1选自脯氨酸、丙氨酸、半胱氨酸、甘氨酸、丝氨酸、苏氨酸和缬氨酸，X2选自脯氨酸、丙氨酸、半胱氨酸、甘氨酸、丝氨酸、苏氨酸和缬氨酸，并且X3选自脯氨酸、丙氨酸、半胱氨酸、甘氨酸、丝氨酸、苏氨酸、缬氨酸、甲硫氨酸、亮氨酸、异亮氨酸和苯丙氨酸。在某些实施方案中，X1是脯氨酸，X2选自丙氨酸、甘氨酸或丝氨酸，并且X3选自丙氨酸、甘氨酸和缬氨酸。
FGFR
异常活化的FGFR与数种人恶性肿瘤有关，并且FGFR3的过表达足以在数种动物模型中诱导致癌性转化。已经进行了数种尝试来产生靶向FGFR的抗体和抗体药物缀合物(ADC)。然而，这些抗体通常仅识别FGFR的一种同种型或在不同的FGFR同种型之间显示出结合亲和力的显著差异。
本文中提供了双特异性结合剂，其包含以高亲和力和特异性结合FGFR3的一种或更多种剪接形式的Fynomer。在一些实施方案中，双特异性结合剂在结合后能够被内在化到靶细胞中。
Fynomer
在一些实施方案中，Fynomer是小的抗原结合多肽(例如，5至10kDa，在一些实施方案中约7kDa)，其包含来源于人原癌基因酪氨酸蛋白激酶Fyn(p59-FYN、Slk、Syn、MGC45350，基因ID 2534)的SH3结构域的非免疫球蛋白支架。因此，在某些实施方案中，Fynomer是包含N端(N端氨基酸)和C端(C端氨基酸)的单链多肽，其可以使用重组技术由核酸序列表达或可以化学合成(例如，通过使用合适的固相化学)。Fyn SH3来源的Fynomer在本领域中是已知的，并且已经在例如Grabulovski et al.(2007)JBC，282，p.3196-3204；WO 2008/022759；Bertschinger et al.(2007)Protein Eng.Des.Sel.20(2)：57-68；以及Gebauer andSkerra(2009)Curr.Opinion in Chemical Biology 13：245-255中进行了描述。Fynomer可包含长度为50至80个氨基酸的多肽。在一些实施方案中，Fynomer包含长度为50至70或60至70个氨基酸的多肽。在一些实施方案中，Fynomer包含长度为60、61、62、63、64、65、66、67、68、69或70个氨基酸的多肽。通常可以通过两个可变环(RT环和src环)的随机突变来将Fynomer改造成以高亲和力和特异性与选择的抗原靶标结合，而Fynomer的周围序列提供了在Fynomer序列之间基本上保守的结构支架。据信这两个可变环的氨基酸序列，并且有时紧邻可变环的氨基酸在很大程度上有助于Fynomer对选择的抗原靶标的特异性和结合亲和力。尽管可变环外的Fynomer序列主要提供了结构支架，但应理解，支架区域内的某些氨基酸可以被替换而不会大幅损失结构或结合特异性。
本文中给出的Fynomer的氨基酸序列与FGFR3或者其一种或更多种特定同种型或变体特异性结合。在一些实施方案中，本文中所述的Fynomer与FGFR3或者其一种或更多种特定同种型或变体特异性结合。在一些实施方案中，本文中所述的Fynomer与成纤维细胞生长因子受体3同种型3b(FGFR3b)特异性结合。在一些实施方案中，本文中所述的Fynomer与成纤维细胞生长因子受体3同种型3c(FGFR3c)特异性结合。在一些实施方案中，本文中所述的Fynomer与FGFR3b和FGFR3c二者特异性结合。在一些实施方案中，FGFR3是哺乳动物FGFR3。在一些实施方案中，FGFR3是人、小鼠、大鼠或猴的FGFR3蛋白或其同种型。在一些实施方案中，FGFR3是人FGFR3或其同种型。人FGFR3b的氨基酸序列示于SEQ ID NO：97，并且人FGFR3c的氨基酸序列示于SEQ ID NO：98。在一些实施方案中，本文中所述的Fynomer与人FGFR3b和/或人FGFR3c特异性结合。
在一些实施方案中，Fynomer(例如，本文中公开的双特异性结合剂的Fynomer部分)以1×10-7M或更小的KD、1×10-8M或更小的KD、1×10-9M或更小的KD或以1×10-10M或更小的KD与FGFR3或其同种型结合。在一些实施方案中，Fynomer(例如，本文中公开的双特异性结合剂的Fynomer部分)以1×10-7M或更小的KD、1×10-8M或更小的KD、1×10-9M或更小的KD或以1×10-10M或更小的KD与一种或两种同种型FGFR3b和/或FGFR3c结合。在一些实施方案中，Fynomer以10-7至10-12M的KD、10-8至10-12M的KD或10-9至10-12M的KD与两种同种型FGFR3b和FGFR3c结合。在一些实施方案中，Fynomer与一种或两种同种型FGFR3b和/或FGFR3c特异性结合，并且基本上不与其他相关蛋白(例如FGFR1、FGFR2或FGFR4)结合。在一些实施方案中，基本上不与FGFR结合的Fynomer是不表现出任何可检测的特异性结合或以大于5×10-6M的KD与FGFR结合的Fynomer。
在一些实施方案中，本文中公开的双特异性结合剂的Fynomer部分在存在受体结合配体(例如，FGF1)的情况下与FGFR3或其同种型结合。因此，在一些实施方案中，本文中公开的双特异性结合剂的Fynomer部分不阻断、消除或抑制FGFR3配体(例如，FGF1)与FGFR3的结合。在一些实施方案中，本文中公开的双特异性结合剂的Fynomer部分不阻断、消除或抑制FGFR3配体(例如，FGF1)与FGFR3的结合。在一些实施方案中，本文中公开的双特异性结合剂不阻断、消除或抑制FGFR3配体(例如，FGF1)与FGFR3的结合。在一些实施方案中，本文中公开的双特异性结合剂的Fynomer部分和/或本文中公开的双特异性结合剂在存在受体结合配体(例如，FGF1)的情况下与FGFR3或其同种型结合。
在某些实施方案中，Fynomer包含具有与氨基酸序列
GVTLFVALYDYEVYGPTPMLSFHKGEKFQIL(X1)(X2)(X3)(X4)GPYWEARSL(X5)TGETG(X6)IPSNYVAPVDSIQ(SEQ ID NO：99)具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或100％同一性的氨基酸序列的多肽，其中氨基酸X1至X6独立地选自任何氨基酸，并且Fynomer与FGFR3特异性结合。在一些实施方案中，具有与SEQ ID NO：99的氨基酸序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或100％同一性的序列的Fynomer与FGFR3(例如，人FGFR3)特异性结合。在一些实施方案中，具有与SEQ ID NO：99的氨基酸序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或100％同一性的序列的Fynomer与FGFR3b和FGFR3c二者特异性结合。出于图示目的，通常仅对本文中提供的Fynomer序列的N端RT环和C端src环用下划线标出。在某些实施方案中，Fynomer包含具有与SEQ ID NO：99的氨基酸序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或100％同一性的氨基酸序列的多肽，其中(i)氨基酸X1至X6独立地选自任何氨基酸，并且(ii)SEQ ID NO：99的第12至19位氨基酸处的氨基酸序列EVYGPTPM(SEQ ID NO：100)和SEQ ID NO：99的第37和38位氨基酸处的氨基酸P和Y是保守的。
在某些实施方案中，X1选自N、R、H和K。在某些实施方案中，X1是N、R或K。在某些实施方案中，X2选自S、G、A、V和P。在某些实施方案中，X2选自S、G、A、V、P和任何碱性氨基酸。在某些实施方案中，X2是S、G、K或R。在某些实施方案中，X3是S、G、A、V或P。在某些实施方案中，X3是S或G。在某些实施方案中，X4选自任何带电荷的碱性或酸性氨基酸。在某些实施方案中，X4选自S、G、A、V和P。在某些实施方案中，X4是E、Q、D、S或K。在某些实施方案中，X5选自S、G、A、V、P、S和T。在某些实施方案中，X5是T或A。在某些实施方案中，X6选自任何疏水性氨基酸。在某些实施方案中，X6选自任何极性氨基酸。在某些实施方案中，X6选自Q、N、H、S、T、Y、C、W、A、L、V和I。在某些实施方案中，X6是Y、W或L。
在某些实施方案中，X1是N、R或K；X2是S、G、K或R；X3是S或G；X4是E、Q、D、S或K；X5是T或A；和/或X6是Y、W或L。
在一些实施方案中，Fynomer包含与SEQ ID NO：99的氨基酸序列具有至少95％同一性的氨基酸序列，其中(i)氨基酸位置X1至X6可以是任何氨基酸序列，(ii)同一性确定不包括氨基酸位置X1至X6，(iii)并且SEQ ID NO：99的第12至19位氨基酸中的氨基酸序列EVYGPTPM(SEQ ID NO：100)和SEQ ID NO：99的第37和38位氨基酸中的氨基酸P和Y是保守的，并且(iv)Fynomer与FGFR3特异性结合。
在一些实施方案中，Fynomer包含与SEQ ID NO：99的氨基酸序列具有至少95％同一性的氨基酸序列，其中(i)X1是N、R或K；X2是S、G、K或R；X3是S或G；X4是E、Q、D、S或K；X5是T或A；并且X6是Y、W或L，(ii)同一性确定不包括氨基酸位置X1至X6，(iii)并且SEQ ID NO：99的第12至19位氨基酸中的氨基酸序列EVYGPTPM(SEQ ID NO：100)和SEQ ID NO：99的第37和38位氨基酸中的氨基酸P和Y是保守的，并且(iv)Fynomer与FGFR3特异性结合。
在某些实施方案中，Fynomer包含具有与GVTLFVALYDYEVYGPTPMLSFHKGEKFQILNSS EGP YWEARSLTTGETGLIPSNYVAPVDSIQ(SEQ ID NO：101；在本文中有时称为FF2L4C3)的氨基酸序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或100％同一性的氨基酸序列的多肽，其中Fynomer与FGFR3特异性结合。在某些实施方案中，Fynomer包含具有与SEQ ID NO：101的氨基酸序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或100％同一性的氨基酸序列的多肽，其中SEQ ID NO：101的第12至19位氨基酸处的氨基酸序列EVYGPTPM(SEQ ID NO：100)和SEQ ID NO：101的第37和38位氨基酸处的氨基酸P和Y是保守的，并且Fynomer与FGFR3特异性结合。在某些实施方案中，Fynomer包含具有与SEQ ID NO：101的氨基酸序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或100％同一性的氨基酸序列的多肽，其中SEQID NO：101的第12至19位氨基酸处的氨基酸序列EVYGPTPM(SEQ ID NO：100)和SEQ ID NO：101的第32至38位氨基酸处的氨基酸序列NSSEGPY(SEQ ID NO：102)是保守的，并且Fynomer与FGFR3特异性结合。在一些实施方案中，具有与SEQ ID NO：101的氨基酸序列具有至少80％、至少85％、至少90％或至少95％同一性的氨基酸序列的Fynomer(其中Fynomer与FGFR3(例如，FGFR3b和/或FGFR3c)特异性结合)是包含不会消除或显著降低Fynomer与FGFR3特异性结合的能力的0至12、0至8、0至5、或1至2个氨基酸替换、添加和/或缺失的Fynomer。特异性结合的显著降低是结合亲和力(即，KD)的降低超过SEQ ID NO：101的Fynomer与人FGFR3b或FGFR3c的结合亲和力的20％。本领域技术人员可以使用常规方法容易地确定Fynomer与FGFR3b或FGFR3c的结合亲和力，并且这样的确定将不需要过度的实验。因此，本领域技术人员可容易地确定如何制备具有与SEQ ID NO：101的氨基酸序列具有至少80％、至少85％、至少90％或至少95％同一性的氨基酸序列的Fynomer，其中Fynomer与FGFR3特异性结合。在某些实施方案中，Fynomer包含SEQ ID NO：101的氨基酸序列或由其组成。
在某些实施方案中，Fynomer包含具有与GVTLFVALYDYEVYGPTPMLSFHKGEKFQILRGG QGP YWEARSLTTGETGLIPSNYVAPVDSIQ(SEQ ID NO：103；在本中有时称为FF44L65G12)的氨基酸序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或100％同一性的氨基酸序列的多肽，并且Fynomer与FGFR3特异性结合。在某些实施方案中，Fynomer包含具有与SEQ ID NO：103的氨基酸序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或100％同一性的氨基酸序列的多肽，其中SEQ ID NO：103的第12至19位氨基酸处的氨基酸序列EVYGPTPM(SEQ ID NO：100)和SEQ ID NO：103的第37和38位氨基酸处的氨基酸P和Y是保守的，并且Fynomer与FGFR3特异性结合。在某些实施方案中，Fynomer包含具有与SEQ ID NO：103的氨基酸序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或100％同一性的氨基酸序列的多肽，其中SEQID NO：103的第12至19位氨基酸处的氨基酸序列EVYGPTPM(SEQ ID NO：100)和SEQ ID NO：103的第32至38位氨基酸处的氨基酸序列RGGQGPY(SEQ ID NO：104)是保守的，并且Fynomer与FGFR3特异性结合。在一些实施方案中，具有与SEQ ID NO：103的氨基酸序列具有至少80％、至少85％、至少90％或至少95％同一性的氨基酸序列的Fynomer(其中Fynomer与FGFR3(例如，FGFR3b和/或FGFR3c)特异性结合)是包含不会消除或显著降低Fynomer与FGFR3特异性结合的能力的0至12、0至8、0至5、或1至2个氨基酸替换、添加和/或缺失的Fynomer。特异性结合的显著降低是结合亲和力(即，KD)的降低超过SEQ ID NO：103的Fynomer与人FGFR3b或FGFR3c的结合亲和力的20％。本领域技术人员可以使用常规方法容易地确定Fynomer与FGFR3b或FGFR3c的结合亲和力，并且这样的确定将不需要过度的实验。因此，本领域技术人员可容易地确定如何制备具有与SEQ ID NO：103的氨基酸序列具有至少80％、至少85％、至少90％或至少95％同一性的氨基酸序列的Fynomer，其中Fynomer与FGFR3特异性结合。在某些实施方案中，Fynomer包含SEQ ID NO：103的氨基酸序列或由其组成。
在某些实施方案中，Fynomer包含具有与GVTLFVALYDYEVYGPTPMLSFHKGEKFQILRGG DGP YWEARSLTTGETGLIPSNYVAPVDSIQ(SEQ ID NO：105；在本文中有时称为FF44L65G7)的氨基酸序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或100％同一性的氨基酸序列的多肽，并且Fynomer与FGFR3特异性结合。在某些实施方案中，Fynomer包含具有与SEQ ID NO：105的氨基酸序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或100％同一性的氨基酸序列的多肽，其中SEQ ID NO：105的第12至19位氨基酸处的氨基酸序列EVYGPTPM(SEQ ID NO：100)和SEQ ID NO：105的第37和38位氨基酸处的氨基酸P和Y是保守的，并且Fynomer与FGFR3特异性结合。在某些实施方案中，Fynomer包含具有与SEQ ID NO：105的氨基酸序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或100％同一性的氨基酸序列的多肽，其中SEQID NO：105的第12至19位氨基酸处的氨基酸序列EVYGPTPM(SEQ ID NO：100)和SEQ ID NO：105的第32至38位氨基酸处的氨基酸RGGDGPY(SEQ ID NO：106)是保守的，并且Fynomer与FGFR3特异性结合。在一些实施方案中，具有与SEQ ID NO：105的氨基酸序列具有至少80％、至少85％、至少90％或至少95％同一性的氨基酸序列的Fynomer(其中Fynomer与FGFR3(例 如，FGFR3b和/或FGFR3c)特异性结合)是包含不会消除或显著降低Fynomer与FGFR3特异性结合的能力的0至12、0至8、0至5、或1至2个氨基酸替换、添加和/或缺失的Fynomer。特异性结合的显著降低是结合亲和力(即，KD)的降低超过SEQ ID NO：105的Fynomer与人FGFR3b或FGFR3c的结合亲和力的20％。本领域技术人员可以使用常规方法容易地确定Fynomer与FGFR3b或FGFR3c的结合亲和力，并且这样的确定将不需要过度的实验。因此，本领域技术人员可容易地确定如何制备具有与SEQ ID NO：105的氨基酸序列具有至少80％、至少85％、至少90％或至少95％同一性的氨基酸序列的Fynomer，其中Fynomer与FGFR3特异性结合。在某些实施方案中，Fynomer包含SEQ ID NO：105的氨基酸序列或由其组成。
在某些实施方案中，Fynomer包含具有与GVTLFVALYDYEVYGPTPMLSFHKGEKFQILKGG SGP YWEARSLTTGETGLIPSNYVAPVDSIQ(SEQ ID NO：107；在本文中有时称为FF48L66G7或“G7”)的氨基酸序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或100％同一性的氨基酸序列的多肽，并且Fynomer与FGFR3特异性结合。在某些实施方案中，Fynomer包含具有与SEQID NO：107的氨基酸序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或100％同一性的氨基酸序列的多肽，其中SEQ ID NO：107的第12至19位氨基酸处的氨基酸序列EVYGPTPM(SEQID NO：100)和SEQ ID NO：107的第37和38位氨基酸处的氨基酸P和Y是保守的，并且Fynomer与FGFR3特异性结合。在某些实施方案中，Fynomer包含具有与SEQ ID NO：107的氨基酸序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或100％同一性的氨基酸序列的多肽，其中SEQ ID NO：107的第12至19位氨基酸处的氨基酸序列EVYGPTPM(SEQ ID NO：100)和SEQ IDNO：107的第32至38位氨基酸处的氨基酸KGGSGPY(SEQ ID NO：108)是保守的，并且Fynomer与FGFR3特异性结合。在一些实施方案中，具有与SEQ ID NO：107的氨基酸序列具有至少80％、至少85％、至少90％或至少95％同一性的氨基酸序列的Fynomer(其中Fynomer与FGFR3(例如，FGFR3b和/或FGFR3c)特异性结合)是包含不会消除或显著降低Fynomer与FGFR3特异性结合的能力的0至12、0至8、0至5、或1至2个氨基酸替换、添加和/或缺失的Fynomer。特异性结合的显著降低是结合亲和力(即，KD)的降低超过SEQ ID NO：107的Fynomer与人FGFR3b或FGFR3c的结合亲和力的20％。本领域技术人员可以使用常规方法容易地确定Fynomer与FGFR3b或FGFR3c的结合亲和力，并且这样的确定将不需要过度的实验。因此，本领域技术人员可容易地确定如何制备具有与SEQ ID NO：107的氨基酸序列具有至少80％、至少85％、至少90％或至少95％同一性的氨基酸序列的Fynomer，其中Fynomer与FGFR3特异性结合。在某些实施方案中，Fynomer包含SEQ ID NO：107的氨基酸序列或由其组成。
在某些实施方案中，Fynomer包含具有与GVTLFVALYDYEVYGPTPMLSFHKGEKFQILRKG KGP YWEARSLATGETGLIPSNYVAPVDSIQ(SEQ ID NO：109；在本文中有时称为FF43L65D5)的氨基酸序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或100％同一性的氨基酸序列的多肽，并且Fynomer与FGFR3特异性结合。在某些实施方案中，Fynomer包含具有与SEQ ID NO：109的氨基酸序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或100％同一性的氨基酸序列的多肽，其中SEQ ID NO：109的第12至19位氨基酸处的氨基酸序列EVYGPTPM(SEQ ID NO：100)和SEQ ID NO：109的第37和38位氨基酸处的氨基酸P和Y是保守的，并且Fynomer与FGFR3特异性结合。在某些实施方案中，Fynomer包含具有与SEQ ID NO：109的氨基酸序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或100％同一性的氨基酸序列的多肽，其中SEQID NO：109的第12至19位氨基酸处的氨基酸序列EVYGPTPM(SEQ ID NO：100)和SEQ ID NO：109的第32至38位氨基酸处的氨基酸RKGKGPY(SEQ ID NO：110)是保守的，并且Fynomer与FGFR3特异性结合。在一些实施方案中，具有与SEQ ID NO：109的氨基酸序列具有至少80％、至少85％、至少90％或至少95％同一性的氨基酸序列的Fynomer(其中Fynomer与FGFR3(例 如，FGFR3b和/或FGFR3c)特异性结合)是包含不会消除或显著降低Fynomer与FGFR3特异性结合的能力的0至12、0至8、0至5、或1至2个氨基酸替换、添加和/或缺失的Fynomer。特异性结合的显著降低是结合亲和力(即，KD)的降低超过SEQ ID NO：109的Fynomer与人FGFR3b或FGFR3c的结合亲和力的20％。本领域技术人员可使用常规方法容易地确定Fynomer与FGFR3b或FGFR3c的结合亲和力，并且这样的确定将不需要过度的实验。因此，本领域技术人员可容易地确定如何制备具有与SEQ ID NO：109的氨基酸序列具有至少80％、至少85％、至少90％或至少95％同一性的氨基酸序列的Fynomer，其中Fynomer与FGFR3特异性结合。在某些实施方案中，Fynomer包含SEQ ID NO：109的氨基酸序列或由其组成。
在某些实施方案中，Fynomer包含具有与GVTLFVALYDYEVYGPTPMLSFHKGEKFQILRRG SGP YWEARSLTrGETGLIPSNYVAPVDSIQ(SEQ ID NO：111；在本文中有时称为FF44L65B7)的氨基酸序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或100％同一性的氨基酸序列的多肽，并且Fynomer与FGFR3或其同种型(例如，FGFR3b和/或FGFR3c)特异性结合。在某些实施方案中，Fynomer包含具有与SEQ ID NO：111的氨基酸序列具有至少80％、至少85％、至少90％或至少95％同一性的氨基酸序列的多肽，其中SEQ ID NO：111的第12至19位氨基酸处的氨基酸序列EVYGPTPM(SEQ ID NO：100)和SEQ ID NO：111的第37和38位氨基酸处的氨基酸P和Y是保守的，并且Fynomer与FGFR3(例如，FGFR3b和/或FGFR3c)特异性结合。在某些实施方案中，Fynomer包含具有与SEQ ID NO：111的氨基酸序列具有至少80％、至少85％、至少90％或至少95％同一性的氨基酸序列的多肽，其中SEQ ID NO：111的第12至19位氨基酸处的氨基酸序列EVYGPTPM(SEQ ID NO：100)和SEQ ID NO：111的第32至38位氨基酸处的氨基酸RRGSGPY(SEQ ID NO：112)是保守的，并且Fynomer与FGFR3(例如，FGFR3b和/或FGFR3c)特异性结合。在一些实施方案中，具有与SEQ ID NO：111的氨基酸序列具有至少80％、至少85％、至少90％或至少95％同一性的氨基酸序列的Fynomer(其中Fynomer与FGFR3(例如，FGFR3b和/或FGFR3c)特异性结合)是包含不会消除或显著降低Fynomer与FGFR3特异性结合的能力的0至12、0至8、0至5、或1至2个氨基酸替换、添加和/或缺失的Fynomer。特异性结合的显著降低是结合亲和力(即，KD)的降低超过SEQ ID NO：111的Fynomer与人FGFR3b或FGFR3c的结合亲和力的20％。本领域技术人员可使用常规方法容易地确定Fynomer与FGFR3b或FGFR3c的结合亲和力，并且这样的确定将不需要过度的实验。因此，本领域技术人员可容易地确定如何制备具有与SEQ ID NO：111的氨基酸序列具有至少80％、至少85％、至少90％或至少95％同一性的氨基酸序列的Fynomer，其中Fynomer与FGFR3特异性结合。在某些实施方案中，Fynomer包含SEQ ID NO：111的氨基酸序列或由其组成。
在某些实施方案中，Fynomer包含具有与GVTLFVALYDYEVMSTTALSFHKGEKFQILSQSP HGQ YWEARSLTTGETG(X7)IPSNYVAPVDSIQ(SEQ ID NO：113)的氨基酸序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或100％同一性的氨基酸序列的多肽，其中氨基酸(X7)选自任何氨基酸。在某些实施方案中，X7选自任何疏水性氨基酸。在某些实施方案中，X7选自任何极性氨基酸。在某些实施方案中，X7选自Q、N、H、S、T、Y、C、W、A、L、V和I。在某些实施方案中，X7是Y、W或L。在某些实施方案中，X7是W。
在某些实施方案中，Fynomer包含具有与SEQ ID NO：113的氨基酸序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或100％同一性的氨基酸序列的多肽，其中(i)位置X7处的氨基酸可以是任何氨基酸；(ii)同一性确定不包括氨基酸X7，(iii)SEQ ID NO：113的第12至18位氨基酸处的氨基酸序列EVMSTTA(SEQ ID NO：114)和SEQ ID NO：113的第31至35位氨基酸处的SQSPH(SEQ ID NO：115)是保守的，(iv)SEQ ID NO：113的第37和38位氨基酸处的氨基酸Q和Y是保守的，并且(v)Fynomer与FGFR3(例如，FGFR3b和/或FGFR3c)特异性结合。
在某些实施方案中，Fynomer包含具有与GVTLFVALYDYEVMSTTALSFHKGEKFQILSQSP HGQ YWEARSLTTGETGWIPSNYVAPVDSIQ(SEQ ID NO：116；在本文中有时称为FF40L54A5)的氨基酸序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或100％同一性的氨基酸序列的多肽，并且Fynomer与FGFR3特异性结合。在某些实施方案中，Fynomer包含具有与SEQ ID NO：116的氨基酸序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或100％同一性的氨基酸序列的多肽，其中(i)SEQ ID NO：116的第12至18位氨基酸处的氨基酸序列EVMSTTA(SEQ IDNO：114)，(ii)SEQ ID NO：116的第31至35位氨基酸处的氨基酸序列SQSPH(SEQ ID NO：115)是保守的，(iii)SEQ ID NO：116的第37和38位氨基酸处的氨基酸Q和Y是保守的，并且Fynomer与FGFR3特异性结合。在某些实施方案中，Fynomer包含具有与SEQ ID NO：116的氨基酸序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或100％同一性的氨基酸序列的多肽，其中(i)SEQ ID NO：116的第12至18位氨基酸处的氨基酸序列EVMSTTA(SEQ ID NO：114)是保守的，(ii)SEQ ID NO：116的第31至38位氨基酸处的氨基酸序列SQSPHGQY(SEQ ID NO：117)是保守的，并且Fynomer与FGFR3特异性结合。在一些实施方案中，具有与SEQ ID NO：116的氨基酸序列具有至少80％、至少85％、至少90％或至少95％同一性的氨基酸序列的Fynomer(其中Fynomer与FGFR3(例如，FGFR3b和/或FGFR3c)特异性结合)是包含不会消除或显著降低Fynomer与FGFR3特异性结合的能力的0至12、0至8、0至5、或1至2个氨基酸替换、添加和/或缺失的Fynomer。特异性结合的显著降低是结合亲和力(即，KD)的降低超过SEQ IDNO：116的Fynomer与人FGFR3b或FGFR3c的结合亲和力的20％。本领域技术人员可使用常规方法容易地确定Fynomer与FGFR3b或FGFR3c的结合亲和力，并且这样的确定将不需要过度的实验。因此，本领域技术人员可容易地确定如何制备具有与SEQ ID NO：116的氨基酸序列具有至少80％、至少85％、至少90％或至少95％同一性的氨基酸序列的Fynomer，其中Fynomer与FGFR3特异性结合。在某些实施方案中，Fynomer包含具有SEQ ID NO：116的氨基酸序列的多肽或由其组成。
可使用任何合适的方法在任何合适的位置将双特异性结合剂的Fynomer部分与双特异性结合剂的抗体部分连接。Fynomer可与抗体或其结合部分共价或非共价连接。Fynomer可与抗体或其抗原结合部分的N端(N端氨基酸)和/或C端(C端氨基酸)连接。在一些实施方案中，Fynomer与抗体或其抗原结合部分的重链的N端和/或轻链的N端连接。在一些实施方案中，Fynomer与抗体或其抗原结合部分的重链C端和/或轻链C端连接。在一些实施方案中，Fynomer与抗体或其抗原结合部分的恒定结构域内的合适位置连接。
在某些实施方案中，Fynomer通过肽键与抗体连接或在抗体内。在一些实施方案中，双特异性结合剂包含含有Fynomer和抗体多肽(例如，重链、轻链或单链)的融合蛋白，其中Fynomer和抗体多肽通过肽键连接。因此，在一些实施方案中，双特异性结合剂使用重组技术制备，其中核酸配置成将包含Fynomer和抗体或其一部分(例如，轻链或重链)的多肽表达为单个多肽。在一些实施方案中，双特异性结合剂包含Fynomer和抗体或其抗原结合部分，其中Fynomer的C端氨基酸通过肽键与抗体的N端氨基酸(例如，重链的N端氨基酸或轻链的N端氨基酸)连接。在一些实施方案中，双特异性结合剂包含Fynomer和抗体或其抗原结合部分，其中Fynomer的N端氨基酸通过肽键与抗体的C端氨基酸(例如，重链的C端氨基酸或轻链的C端氨基酸)连接。在某些实施方案中，Fynomer肽被整合在抗体的多肽内。
在一些实施方案中，双特异性结合剂包含与FGFR3特异性结合的一个或更多个Fynomer。例如，双特异性结合剂可包含具有两条重链和两条轻链的抗体以及与抗体的一条或两条重链的N端连接的Fynomer、与抗体的一条或两条轻链的N端连接的Fynomer、与抗体的一条或两条重链的C端连接的Fynomer和/或与抗体的一条或两条轻链的C端连接的Fynomer。因此，在某些实施方案中，双特异性结合剂包含1至12、1至8或1至4个Fynomer。在一些实施方案中，双特异性结合剂包含1、2、3、4、5、6、7或8个Fynomer。
在一些实施方案中，双特异性结合剂在Fynomer与抗体之间包含接头。合适的接头的一些非限制性实例包括氨基酸、肽(例如，2个或更多个氨基酸)、任选经取代的C1-C50烷基、任选经取代的C2-C50烯基、炔基、酰基、酰氧基、烷氧基、芳氧基、环烷基、环烯基、环烷氧基、芳基、氨基羰基、叠氮基、羧基、硅烷、硫醇、亚砜、砜、磺酸酯、氰基、酰胺、氨基、酯、膦酸、聚乙二醇(PEG)等，其衍生物、其聚合物及其组合。使用接头连接两个或更多个分子的方法是本领域技术人员已知的，并且这样的方法有时被称为“交联”。
在一些实施方案中，接头包含含有两个或更多个氨基酸、2至100个氨基酸、5至100个氨基酸、2至50个氨基酸、5至50个氨基酸、2至25个氨基酸、5至25个氨基酸、2至20个氨基酸、5至20个氨基酸、2至10个氨基酸或5至10个氨基酸的肽。在一些实施方案中，接头包含含有2、3、4或5个氨基酸的肽。在一些实施方案中，接头包含(GGGGS)X(X＝1、2、3、4、5、6、7、8、9或10)或GGGGSGGGGSGGGGS的基序。
术语“百分比同一”或“百分比同一性”是指两个氨基酸序列之间的序列同一性。在一些实施方案中，可通过比较每个序列中的位置来确定同一性，所述位置可出于比较目的而比对。当比较的序列中的等同位置被相同氨基酸占据时，则分子在该位置相同。当等同位点被相同或相似的氨基酸残基(例如，空间和/或电子性质相似)占据时，则该分子可被称为在该位置同源(相似)。作为同源性、相似性或同一性的百分比的表达是指在比较序列共有的位置上相同或相似氨基酸数目的函数。作为同源性、相似性或同一性的百分比的表达是指在比较序列共有的位置上相同或相似氨基酸数目的函数。可使用多种比对算法和/或程序，包括FASTA、BLAST或ENTREZ。FASTA和BLAST可作为GCG序列分析包(University ofWisconsin，Madison，Wis)的一部分获得，并且可利用例如缺省设置使用。ENTREZ可通过以下获得：国家生物技术信息中心(National Center for Biotechnology Information，国家医学图书馆(National Library ofMedicine)，国立卫生研究院(National Institutesof Health)，Bethesda，Md。在一个实施方案中，两个序列的百分比同一性可通过GCG程序以1的空位权重确定，例如，每个氨基酸空位被加权，如同其是两个序列之间的单个氨基酸或核苷酸错配。
另一些比对技术描述在以下中：Methods in Enzymology，vol.266：ComputerMethods for Macromolecular Sequence Analysis(1996)，ed.Doolittle，AcademicPress，Inc.，a division of Harcourt Brace&Co.，San Diego，Califf.，USA。在一些实施方案中，利用允许在序列中存在空位的比对程序来比对序列。Smith-Waterman是允许在序列比对中存在空位的一种算法。参见Meth.Mol.Biol.70：173-187(1997)。另外，使用Needleman和Wunsch比对方法的GAP程序可用于比对序列。替代的检索策略使用在MASPAR计算机上运行的MPSRCH软件。MPSRCH使用Smith-Waterman算法在大型并行计算机上对序列进行评分。这种方法提高了获取远距离相关的匹配的能力，并且特别是容许小的空位和核苷酸序列错误。核酸编码的氨基酸序列可用于检索蛋白质和DNA数据库二者。
术语“特异性结合”是指结合靶蛋白、肽或表位优先于结合其他分子或其他肽的双特异性结合剂、Fynomer、抗体或其一部分，如通过例如合适的体外测定(例如，ELISA、免疫印迹、流式细胞术等)确定的。特异性结合相互作用区别于非特异性结合相互作用约2倍或更多，通常约10倍或更多，并且有时约100倍或更多、1000倍或更多、10,000倍或更多、100,000倍或更多、或者1,000,000倍或更多。
在一些实施方案中，与黏结蛋白聚糖-1或其一部分特异性结合的抗体或其结合部分是以以下结合亲和力常数(KD)结合黏结蛋白聚糖-1或其一部分(例如，黏结蛋白聚糖-1的胞外结构域)的抗体或其结合部分：等于或小于100nM、等于或小于50nM、等于或小于25nM、等于或小于10nM、等于或小于5nM、等于或小于1nM、等于或小于900pM、等于或小于800pM、等于或小于750pM、等于或小于700pM、等于或小于600pM、等于或小于500pM、等于或小于400pM、等于或小于300pM、等于或小于200pM、或等于或小于100pM。在一些实施方案中，与黏结蛋白聚糖-1或其一部分特异性结合的抗体或其结合部分是以以下结合亲和力常数(KD)结合人黏结蛋白聚糖-1或其一部分(例如，人黏结蛋白聚糖-1的胞外结构域)的抗体或其结合部分：等于或小于100nM、等于或小于50nM、等于或小于25nM、等于或小于10nM、等于或小于5nM、等于或小于1nM、等于或小于900pM、等于或小于800pM、等于或小于750pM、等于或小于700pM、等于或小于600pM、等于或小于500pM、等于或小于400pM、等于或小于300pM、等于或小于200pM、或等于或小于100pM。在一些实施方案中，与黏结蛋白聚糖-1或其一部分特异性结合的抗体或其结合部分是以以下结合亲和力常数(KD)与来源于非人物种(例如，非人灵长类、或啮齿动物；例如，小鼠或大鼠)的黏结蛋白聚糖-1或其一部分特异性结合的抗体或其结合部分：等于或小于100nM、等于或小于50nM、等于或小于25nM、等于或小于10nM、等于或小于5nM、等于或小于1nM、等于或小于900pM、等于或小于800pM、等于或小于750pM、等于或小于700pM、等于或小于600pM、等于或小于500pM、等于或小于400pM、等于或小于300pM、等于或小于200pM、或等于或小于100pM。在某些实施方案中，本文中公开的抗体或其结合部分与人黏结蛋白聚糖-1或其一部分特异性结合，并且与来源于非人灵长类的黏结蛋白聚糖-1或其一部分特异性结合。在某些实施方案中，本文中公开的抗体或其结合部分与人黏结蛋白聚糖-1或其一部分特异性结合，并且与来源于啮齿动物(例如，小鼠或大鼠)的黏结蛋白聚糖-1或其一部分特异性结合。在某些实施方案中，抗体或其结合部分(i)以10nM或更小、或者1nM或更小的结合亲和力(KD)与人黏结蛋白聚糖-1或其一部分(例如，人黏结蛋白聚糖-1的胞外结构域)特异性结合，以及(ii)以100nM或更小、90nM或更小、80nM或更小、70nM或更小、60nM或更小、50nM或更小、40nM或更小、30nM或更小、20nM或更小或者10nM或更小的结合亲和力(KD)与大鼠或小鼠黏结蛋白聚糖-1或其一部分(例如，大鼠或小鼠黏结蛋白聚糖-1的胞外结构域)特异性结合。
在某些实施方案中，双特异性结合剂包含与本文中所述的抗黏结蛋白聚糖-1抗体竞争与黏结蛋白聚糖-1或者包含SEQ ID NO：94、95或96的氨基酸序列的多肽结合的抗体或其结合部分。在某些实施方案中，双特异性结合剂包含与本文中所述的抗黏结蛋白聚糖-1抗体竞争与黏结蛋白聚糖-1结合的抗体部分，其中本文中所述的抗黏结蛋白聚糖-1抗体包含表1至10中所示的一个或更多个CDR或者与表1至10中所示的那些基本相似的一个或更多个CDR。在某些实施方案中，双特异性结合剂包含与本文中所述的抗黏结蛋白聚糖-1抗体竞争与黏结蛋白聚糖-1结合的抗体部分，其中本文中所述的抗黏结蛋白聚糖-1抗体包含选自表1的CDR-L1、选自表2的CDR-L2、选自表3的CDR-L3、选自表6的CDR-H1、选自表7的CDR-H2和选自表8的CDR-H3。在某些实施方案中，双特异性结合剂包含与本文中所述的抗黏结蛋白聚糖-1抗体竞争与黏结蛋白聚糖-1结合的抗体部分，其中本文中所述的抗黏结蛋白聚糖-1抗体包含分别包含SEQ ID NO：2、17、27、47、61和73的氨基酸序列的CDR-L1、CDR-L2、CDR-L3、CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3。在某些实施方案中，双特异性结合剂包含与本文中所述的抗黏结蛋白聚糖-1抗体结合相同的黏结蛋白聚糖-1表位的抗体或抗体部分。在某些实施方案中，双特异性结合剂包含与本文中所述的抗黏结蛋白聚糖-1抗体特异性结合相同的黏结蛋白聚糖-1表位的抗体或抗体部分。在某些实施方案中，双特异性结合剂包含与SEQ ID NO：94、95或96的氨基酸序列特异性结合的抗体或抗体部分。
在某些实施方案中，双特异性剂包含具有区别于和/或不同于本文中所述的抗黏结蛋白聚糖-1抗体的一个或更多个CDR序列的抗体部分，其中双特异性剂与本文中所述的抗黏结蛋白聚糖-1抗体竞争与黏结蛋白聚糖-1的结合。
鉴定竞争与抗原结合的抗体的方法是已知的。可使用任何合适的方法来确定双特异性剂或其抗体部分是否与本文中所述的抗黏结蛋白聚糖-1抗体竞争与黏结蛋白聚糖-1的结合。例如，可使用基于ELISA的方法，其中将黏结蛋白聚糖-1抗原或其一部分包被在96孔板上。添加双特异性剂并使其与包被的抗原结合。然后洗涤板，并向该板添加本文中所述的抗黏结蛋白聚糖-1抗体并使其结合。在存在或不存在双特异性剂的情况下测量本文中所述的抗黏结蛋白聚糖-1抗体的结合量，以确定该双特异性剂是否与本文中所述的抗黏结蛋白聚糖-1抗体竞争结合。也可使用本领域已知的其他合适的方法。
在一些实施方案中，双特异性结合剂包含标记。本文中使用的术语“标记”或“经标记的”是指并入可检测的标记物(maker)，例如，通过并入经标记的氨基酸，或与生物素部分的多肽连接，所述生物素部分可通过经标记的亲和素(例如，包含可通过光学或比色方法检测的荧光标记物或酶活性的链霉亲和素)进行检测。在某些实施方案中，标记或标记物可与双特异性结合剂连接以产生诊断剂。双特异性结合剂可与任何合适的标记或标记物共价或非共价连接。标记多肽和糖蛋白的多种方法是本领域技术人员已知的并且可被使用。用于多肽的标记的一些非限制性实例包括但不限于：荧光标记、酶标记(例如，辣根过氧化物酶、β-半乳糖苷酶、萤光素酶、碱性磷酸酶)、化学发光标记、金属标记、生色团、电化学发光标记、磷光标记、猝灭剂(例如，荧光团猝灭剂)、荧光共振能量转移(fluorescence resonanceenergy transfer，FRET)对(例如，供体和接纳体)、染料、酶底物、小分子、质量标签、量子点、纳米粒、生物素基团、由第二报道子识别的预定多肽表位(例如，亮氨酸拉链对序列、二抗的结合位点、金属结合结构域、表位标签)等，或其组合。
在一些实施方案中，双特异性结合剂包含合适的载体。双特异性结合剂可与合适的载体共价或非共价连接。在一些实施方案中，双特异性剂的Fynomer部分与载体连接。在一些实施方案中，双特异性结合剂的抗体部分与载体连接。载体的一些非限制性实例包括改变或延长双特异性结合剂的体内半衰期的试剂或分子，包括聚乙二醇、糖原和/或碳水化合物(例如，如通过多肽的糖基化引入的)、右旋糖酐、美国专利No.6,660,843中描述的载体或载剂等，或其组合。在某些实施方案中，双特异性剂或其一部分是糖基化的。在一些实施方案中，标记或载体通过使用合适的接头与双特异性结合剂结合。
在一些实施方案中，标记、载体、抗赘生物剂、毒素或接头与双特异性结合剂的合适巯基(例如，半胱氨酸残基的巯基)连接。在一些实施方案中，标记、载体、抗赘生物剂、毒素或接头与双特异性结合剂的氨基的合适反应性氮连接。出于连接标记、载体、抗赘生物剂、毒素或接头的目的，双特异性结合剂的任何合适的氨基酸残基均可用包含巯基(例如，半胱氨酸)或反应性氮(例如，赖氨酸)的氨基酸残基替换。可用包含巯基的氨基酸残基或游离氨基替换的双特异性结合剂的抗体部分中的氨基酸的一些非限制性实例包括IgG2或IgG1的A118、S119、S239、V282、T289、N361和V422(对应于EU编号系统)，或IgG3或IgG4中的相应位置。因此，在一些实施方案中，本文中所述的双特异性结合剂包含含有人重链恒定区的抗体，其中所述抗体的IgG重链的重链恒定区包含A118C(第118位的丙氨酸替换为半胱氨酸)、S119C(第119位的丝氨酸替换为半胱氨酸)、S239C(第239位的丝氨酸替换为半胱氨酸)、V282C(第282位的缬氨酸替换为半胱氨酸)、T289C(第289位的苏氨酸替换为半胱氨酸)、N361C(第361位的天冬酰胺替换为半胱氨酸)和/或V422C(第422位的缬氨酸替换为半胱氨酸)替换，其中抗赘生物剂或毒素与所示半胱氨酸残基的巯基共价连接。在一些实施方案中，本文中所述的双特异性结合剂包含含有人重链恒定区的抗体，其中所述抗体的IgG重链的恒定区包含A118K(第118位的丙氨酸替换为赖氨酸)、S119K(第119位的丝氨酸替换为赖氨酸)、S239K(第239位的丝氨酸替换为赖氨酸)、V282K(第282位的缬氨酸替换为赖氨酸)、T289K(第289位的苏氨酸替换为赖氨酸)、N361K(第361位的天冬酰胺替换为赖氨酸)和/或V422K(第422位的缬氨酸替换为赖氨酸)替换，其中抗赘生物剂或毒素与所示赖氨酸残基的游离氨基的反应性氮共价连接。将标记、载体、抗赘生物剂、毒素和/或接头与双特异性结合剂连接的另一些非限制性实例包括：使胺与琥珀酰亚胺酯(例如，N-羟基琥珀酰亚胺(N-hydroxysuccinimide，NHS)酯)、亚氨酸酯、五氟苯基(pentafluorophenyl，PFP)酯、羟甲基膦、环氧乙烷、异硫氰酸酯、磺酰卤化物、卤代乙酰基衍生物或任何其他羰基化合物反应；使羧基与碳二亚胺反应；使巯基与马来酰亚胺、卤代乙酰基衍生物、吡啶基二硫化物或乙烯基砜反应；使醛与肼反应；使任何非选择性基团与双吖丙啶(diazirine)或芳基叠氮化物反应；使羟基与异氰酸酯反应；使羟胺与羰基化合物反应；等，及其组合。
抗赘生物剂、毒素和连接基
在某些实施方案中，本文中公开的双特异性结合剂包含抗赘生物剂。在一些实施方案中，抗体或其结合部分包含抗赘生物剂。在一些实施方案中，Fynomer包含抗赘生物剂。在一些实施方案中，双特异性结合剂、抗体或Fynomer包含一种或更多种(例如，1至20、1至10或1至5种)抗赘生物剂。在一些实施方案中，双特异性结合剂、抗体或Fynomer包含1、2、3、4或5种抗赘生物剂。
任何合适的抗赘生物剂可与本文中公开的双特异性结合剂、抗体或Fynomer连接。在一些实施方案中，抗赘生物剂是对赘生性细胞具有毒性的试剂。在一些实施方案中，抗赘生物剂包含毒性化合物、毒性分子或毒性载荷。抗赘生物剂的一些非限制性实例包括尾海兔素、澳瑞他汀、美登素、微管溶素、加利车霉素、吡咯并苯并二氮
Figure BPA0000302829100000631
(PBD)、倍癌霉素、多柔比星、假单胞菌外毒素-A(PE38)、伊立替康和类似物或其衍生物。在一些实施方案中，抗赘生物剂包含单甲基澳瑞他汀E(monomethyl auristatin E，MMAE)或单甲基澳瑞他汀F(monomethyl auristatin F，MMAF)。在一些实施方案中，抗赘生物剂包含吡咯并苯并二氮
Figure BPA0000302829100000632
(PBD)毒素和/或连接基。
在一些实施方案中，抗赘生物剂与双特异性结合剂的抗体部分或Fynomer部分连接。抗赘生物剂可与双特异性结合剂、抗体或Fynomer共价或非共价连接。抗赘生物剂可与双特异性结合剂、抗体或Fynomer直接或间接连接(例如，通过接头或连接基)。例如，在一些实施方案中，抗赘生物剂通过接头或连接基与双特异性结合剂、抗体或Fynomer共价连接。
抗赘生物剂可在双特异性结合剂的任何合适位置与双特异性结合剂连接。在一些实施方案中，抗赘生物剂与双特异性结合剂的Fynomer部分和/或与双特异性结合剂的抗体部分连接。在一些实施方案中，抗赘生物剂与双特异性结合剂的抗体部分的恒定区(例如，抗体恒定区)连接。在一些实施方案中，抗赘生物剂与双特异性结合剂抗体部分的恒定区的合适半胱氨酸残基直接或间接连接(例如，通过接头或连接基)。
在一些实施方案中，抗赘生物剂包含吡咯并苯并二氮
Figure BPA0000302829100000642
(PBD)毒素。在一些实施方案中，抗赘生物剂包含连接基或合适的接头。在一些实施方案中，抗赘生物剂包含吡咯并苯并二氮
Figure BPA0000302829100000643
(PBD)毒素和连接基。在某些实施方案中，吡咯并苯并二氮
Figure BPA0000302829100000644
毒素与连接基共价连接，并且该连接基与本文中所述的双特异性结合剂共价连接。
PBD毒素和制备PBD毒素的方法的一些非限制性实例描述于以下专利申请公布中：US2011/0256157、WO2015/052322、US2016/0106861、US2007/0072846、US2011/0201803、US2010/0113425、US2008/0167293、US2014/0127239、US2015/0158869、US2015/0344482、US2015/0111880、US2015/0315196、US2016/0015828、US2014/0088089、US2013/0035484、US2011/0196148、US2013/0028919、US2013/0059800、US2014/0274907、US2014/0275522、US2014/0234346、US2013/0266595、US2014/0302066、US2014/0286970、US2014/0294868、US2016/0144052、US2016/0031887、US2014/0120118、US2016/0250344、WO2017/137553、WO2017/137555和WO2017/186894，其全部内容通过引用整体并入本文。
在一些实施方案中，吡咯并苯并二氮
Figure BPA0000302829100000645
毒素包含化学式I的结构：
[化12]
Figure BPA0000302829100000641
其中Z1和Z2均为N；Z3和Z4均为C；
[化13]
双虚线
Figure BPA0000302829100000646
表示单键或双键；
n为1至12；R3和R4各自独立地为H或C1-4烷氧基；并且R1和R2各自独立地选自H、C1-5烷基、C3-6环烷基、C2-5烯基和任选地被R5取代的苯基，其中R5选自-NH2、-NHR6和具有以下结构的被R7取代的哌嗪基，
[化14]
Figure BPA0000302829100000651
其中R6包含连接基，并且R7为空或C1-5烷基；X1为空、保护基或者包含连接基；X2为空、保护基或者包含连接基；X1、X2、R1和R2中仅一个包含连接基；并且Y1和Y2各自独立地为空、OH或SO3；前提是：
[化15]
(i)当X1包含连接基时，
Figure BPA0000302829100000652
为N-C，(ii)当X2包含连接基时，
Figure BPA0000302829100000653
为N-C，(iii)当X1包含保护基时，
Figure BPA0000302829100000654
为N-C，并且(iv)当X2包含保护基时，
Figure BPA0000302829100000655
为N-C。
其中空意指不存在该部分或存在一个或更多个氢以完成所需的化合价。
在某些实施方案中，PBD毒素包含仅一个连接基。例如，在化学式I中，X1、X2、R1和R2中仅一个可包含连接基。例如，在X1包含连接基的情况下，X2、R1和R2不包含连接基。
在化学式I的PBD毒素的某些实施方案中，n为1至12。在化学式I的PBD毒素的某些实施方案中，n为1至10、1至9、1至7、1至5或1至3。在化学式I的PBD毒素的某些实施方案中，n为1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12。在一些实施方案中，n为1、3或5。在一些实施方案中，n为3或5。
在化学式I的PBD毒素的某些实施方案中，R3和R4独立地为C1-4烷氧基。在化学式I的PBD毒素的某些实施方案中，R3和R4独立地选自-O-CH2CH3或-O-CH3。在化学式I的PBD毒素的某些实施方案中，R3和R4均为-O-CH3。
在化学式I的PBD毒素的某些实施方案中，R1和R2独立地选自H、C1-5烷基、C3-C6环烷基和C2-5烯基。R1和R2可相同或不同。在一些实施方案中，R1和R2独立地选自C1-C3烷基和C2-C3烯基。在某些实施方案中，R1和R2独立地选自-CH2CH2CH3和-CH3。在某些实施方案中，R1和R2二者均为-CH2CH2CH3或-CH3。
在化学式I的PBD毒素的某些实施方案中，R1和R2独立地选自C3-C6环烷基和任选地被R5取代的苯基，其中R5选自-NH2、-NHR6和具有以下结构的被R7取代的哌嗪基
[化16]
Figure BPA0000302829100000661
其中R6包含连接基，并且R7为空或C1-5烷基。在某些实施方案中，R1和R2不同并且独立地选自：(i)C3-C6环烷基，以及(ii)任选地被R5取代的苯基，其中R5选自-NH2和-NHR6，其中R6包含连接基。在某些实施方案中，R1和R2不同并且独立地选自：(i)C3环烷基，以及(ii)被-NH2或-NHR6取代的苯基，其中R6包含连接基。在某些实施方案中，R1和R2不同并且独立地选自：(i)任选地被R5取代的苯基，其中R5选自-NH2和-NHR6，其中R6包含连接基，以及(ii)具有以下结构的被R7取代的哌嗪基，其中R7为空或C1-C2烷基。在某些实施方案中，R1和R2不同并且独立地选自：(i)被R5取代的苯基，其中R5为-NH2和-NHR6，其中R6包含连接基，以及(ii)具有以下结构的被R7取代的哌嗪基，
[化17]
Figure BPA0000302829100000662
其中R7为-CH3。在某些实施方案中，R2为被4-甲基哌嗪-1-基取代的苯基。
在化学式I的PBD毒素的某些实施方案中，X1为空，Y1为空，
[化18]
Figure BPA0000302829100000663
为N＝C，X2为空，Y2为空，并且
Figure BPA0000302829100000664
为N＝C。在化学式I的PBD毒素的某些实施方案中，X1包含连接基，Y1为OH，
Figure BPA0000302829100000665
为N＝C，X2为空，并且Y2为空。在化学式I的PBD毒素的某些实施方案中，X1包含连接基，Y1为OH，
Figure BPA0000302829100000666
为N-C，X2为保护基，并且Y2为OH。
在一些实施方案中，PBD毒素包含以下所示的化学式VII的结构：
[化19]
Figure BPA0000302829100000671
其中X1包含连接基。
在一些实施方案中，PBD毒素包含以下所示的化学式VIII的结构：
[化20]
Figure BPA0000302829100000672
其中X1包含连接基。
在一些实施方案中，PBD毒素包含以下所示的化学式IX的结构：
[化21]
Figure BPA0000302829100000673
其中R6包含连接基。
在一些实施方案中，PBD毒素包含以下所示的化学式X的结构：
[化22]
Figure BPA0000302829100000674
其中R6包含连接基。
在一些实施方案中，PBD毒素通过合适的键、部分或基团与连接基连接(例如，共价连接)。在一些实施方案中，PBD毒素通过羰基键联或酰胺键联与连接基连接(例如，共价连接)。在一些实施方案中，PBD毒素通过氨基甲酸酯基团与连接基连接(例如，共价连接)。在一些实施方案中，PBD毒素通过酰胺基团与连接基连接(例如，共价连接)。将PBD毒素与连接基连接的一些非限制性实例描述于：US2017/0002096、US2016/0331842、US2015/0250896、US2017/0080103、US2016/0136300、US2017/0152274、US2015/0209444、US2013/0274091、US2017/0095570、US2017/0157264、US2015/0125474、US2011/0256157、WO2015/052322、US2016/0106861、US2007/0072846、US2011/0201803、US2010/0113425、US2008/0167293、US2014/0127239、US2015/0158869、US2015/0344482、US2015/0111880、US2015/0315196、US2016/0015828、US2014/0088089、US2013/0035484、US2011/0196148、US2013/0028919、US2013/0059800、US2014/0274907、US2014/0275522、US2014/0234346、US2013/0266595、US2014/0302066、US2014/0286970、US2014/0294868、US2016/0144052、US2016/0031887、US2014/0120118、US2016/0250344、WO2017/137553、WO2017/137555和WO2017/186894，其全部内容通过引用整体并入本文。
本文中使用的术语“空”意指结构中不存在所指出部分，但是，所指出部分可被一个或更多个氢原子替代或占据以完成所需的化合价。此外，参考本文中所示的任何结构，可存在一个或更多个氢以完成结构中所示的碳、氮或氧原子所需的化合价。因此，在没有明确指出的情况下，可存在一个或更多个氢原子。
在一些实施方案中，抗赘生物剂包含合适的连接基。在一些实施方案中，连接基有助于双特异性结合剂与毒素(例如，PBD毒素)之间的连接。在一些实施方案中，连接基是可切割的。例如，在某些实施方案中，连接基包含被细胞内肽酶识别的内肽酶切割位点。内肽酶切割位点提供了在双特异性结合剂被内化进入赘生性细胞中之后从双特异性结合剂分离和/或释放抗赘生物剂的手段。连接基和制备连接基的方法的一些非限制性实例描述于：WO2015/052322、US2015/0158869、US2015/0344482、US2014/0127239、US2017/0002096、US2016/0331842、US2015/0250896、US2017/0080103、US2016/0136300、US2017/0152274、US2015/0209444、US2013/0274091、US2017/0095570、US2017/0157264和US2015/0125474中，其通过引用整体并入本文。在一些实施方案中，连接基包含C1-C20烷基、C1-C20烯基、C1-C20烷氧基、一个或更多个氨基酸或氨基酸衍生物、含有1至20个氨基酸的肽、苯基、合适的聚合物(例如，聚乙二醇)、或其组合。
在一些实施方案中，连接基包含化学式A的结构：
[化23]
Figure BPA0000302829100000691
其中星号指示连接基与吡咯并苯并二氮
Figure BPA0000302829100000693
毒素的连接点，波浪线指示连接基与双特异性结合剂的连接点，m为0至20，q为0至10，并且E为连接基团。在化学式A的连接基的一些实施方案中，m为1至20、1至10、1至8、1至6、1至4、2至8或4或8。在化学式A的连接基的一些实施方案中，m选自1、2、3、4、5、6、7、8、9或10。在化学式A的连接基的一些实施方案中，q为1至10、1至8、1至6或1至4。在化学式A的连接基的一些实施方案中，q选自0、1、2、3、4、5、6、7、8、9或10。在化学式A的连接基的一些实施方案中，q为0、1或2。18。在化学式A的连接基的一些实施方案中，m为8且q为2。
在一些实施方案中，连接基包含化学式B的结构：
[化24]
Figure BPA0000302829100000692
其中星号指示连接基与吡咯并苯并二氮
Figure BPA0000302829100000694
毒素的连接点，波浪线指示连接基与双特异性结合剂的连接点，v为0至10，并且u为0或1，其中当u为1时，t为1至10，并且E为连接基团。在化学式B的连接基的一些实施方案中，v为1至10、1至8、1至4或0至4。21。在化学式B的连接基的一些实施方案中，v选自0、1、2、3、4、5、6、7或8。在化学式B的连接基的一些实施方案中，当u为1时，t为1至8、1至5、1至4或2至5。在化学式B的连接基的一些实施方案中，当u为1时，t选自0、1、2、3、4、5、6、7、8、9或10。在化学式B的连接基的一些实施方案中，t为8，u为1，并且v为2。在化学式B的连接基的一些实施方案中，u为0，并且v为4。
化学式A和B的连接基团E可包含任何合适的键、接头或部分，其一些非限制性实例包括二硫键、硫醚键、硫酯键、酰胺键、胺、酮、羧酸酯醚、氨基甲酸酯、酯、硫代酯等，或其组合。在某些实施方案中，E包含连接基与双特异性结合剂之间的共价键联。在一些实施方案中，E包含共价键。在一些实施方案中，E包含在进行合适的缀合反应之后保留的反应部分。多种缀合反应在本领域中是已知的，其中的任一种可用于将本文中公开的连接基与本文中公开的双特异性结合剂共价连接。可使用任何合适的缀合化学方法将连接基与双特异性结合剂随机地或位点特异性地共价连接，其一些非限制性实例包括以下中所述的缀合反应：Shan S.Wong(1991年6月18日出版)Chemistry of Protein Conjugation and Cross-Linking，CRC Press；Greg T.Hermanson(版权2013)Bioconjugate Techniques，第三版，Elsevier Inc.；以及Thiol-X Chemistries in Polymer and Materials Science，RSCPolymer Chemistry Series No.6(2013)Andrew B.Lowe和Christopher N.Bowman编辑，RCS出版；WO2015/052322；US2015/0158869；US2015/0344482；US2014/0127239；US2017/0002096；US2016/0331842；US2015/0250896；US2017/0080103；US2016/0136300；US2017/0152274；US2015/0209444；US2013/0274091；US2017/0095570；US2017/0157264和US2015/0125474，其全部内容通过引用整体并入本文。将抗赘生物剂或连接基与双特异性结合剂缀合的另一些非限制性实例包括：使胺或氨基与N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)酯、琥珀酰亚胺基琥珀酸酯、琥珀酰亚胺基琥珀酰胺、琥珀酰亚胺基丙酸酯、琥珀酰亚胺基碳酸酯、氧羰基咪唑、硝基苯基碳酸酯、三氯苯基碳酸酯、tresylate、顺丁烯二酸酐、甲基顺丁烯二酸酐、亚氨酸酯、五氟苯基(PFP)酯、羟甲基膦、环氧乙烷或任何其他羰基部分反应；使羧基部分与碳二亚胺反应；使巯基部分与马来酰亚胺、卤代乙酰基、吡啶基二硫化物、邻吡啶基二硫化物和/或乙烯基砜反应；使醛部分与肼或酰肼反应；使任何非选择性基团与双吖丙啶和/或芳基叠氮化物反应；使羟基部分与异氰酸酯反应；使羟胺部分与羰基部分反应；等，及其组合。
因此，E通常由用于使连接基与双特异性结合剂缀合的化学定义。在一些实施方案中，E包含配置成将连接基与双特异性结合剂连接的合适部分。在一些实施方案中，连接基通过合适的巯基-巯基反应，例如通过使用马来酰亚胺或吡啶基二硫醇反应性基团(其与还原的半胱氨酸反应以形成稳定的硫醚键)与双特异性结合剂共价连接。反应性巯基反应性部分的另外的非限制性实例包括：卤代乙酰基、吖丙啶、丙烯酰、芳基化剂、乙烯基砜、吡啶基二硫化物和TNB-巯基。在某些实施方案中，双特异性结合剂通过双特异性结合剂的半胱氨酸巯基残基(例如，巯基)与E之间所形成的硫醚键与E连接。因此，在某些实施方案中，E包含二硫键或硫醚键。在一些实施方案中，例如在使用马来酰亚胺反应将双特异性结合剂与连接基共价连接的情况下，E包含化学式C的结构：
[化25]
Figure BPA0000302829100000711
其中波浪线指示与结合剂的连接点，并且双星号(**)指示与连接基的连接点。在某些实施方案中，化学式C的双星号表示硫醚键。
抗赘生物剂、毒素、连接基或连接基团可随机地或位点特异性地与双特异性结合剂的任何合适的氨基酸缀合。在一些实施方案中，抗赘生物剂、毒素、连接基或连接基团与双特异性结合剂的一个或更多个合适的半胱氨酸残基缀合。在一些实施方案中，抗赘生物剂、毒素、连接基或连接基团与双特异性结合剂的一个或更多个合适的赖氨酸残基缀合。在某些实施方案中，双特异性结合剂的一个或更多个氨基酸用适合于与抗赘生物剂、毒素、连接基或连接基团缀合的氨基酸替换。可用包含硫基的氨基酸残基或赖氨酸残基替换的氨基酸的一些非限制性实例包括IgG1或IgG2恒定结构域的A118、S119、S239、V282、T289、N361和V422(对应于EU编号系统)或IgG3或IgG4恒定结构域中的相应位置。通过诱变将半胱氨酸并入双特异性结合剂或抗体中允许例如通过二硫键或硫醚键将抗赘生物剂、毒素、连接基或连接基团与双特异性结合剂或抗体上的特定位点直接缀合。例如，双特异性结合剂的一个或更多个氨基酸可被半胱氨酸替换，其中半胱氨酸可使用合适的化学反应用于抗赘生物剂、毒素、连接基或连接基团的位点特异性缀合。抗体恒定区的任何合适的氨基酸可突变为半胱氨酸或赖氨酸以用于与抗赘生物剂、毒素、连接基或连接基团的位点特异性缀合。
在一些实施方案中，连接基包含合适的酶切割位点。在某些实施方案中，酶切割位点包含哺乳动物蛋白酶的酶识别位点。因此，在一些实施方案中，连接基或其一部分可被哺乳动物蛋白酶切割。连接基可被存在于靶位点处或其附近(例如，在FGFR3或CD138蛋白处或其附近)的酶切割。存在于靶位点处或其附近的酶可以是胞内的、膜结合的、膜缔合的或胞外的(例如，分泌的)。例如，连接基可配置成被细胞表面蛋白酶、分泌的蛋白酶或胞内蛋白酶(例如，溶酶体蛋白酶)切割。酶切割位点的一些非限制性实例包括溶酶体半胱氨酸蛋白酶和/或溶酶体天冬氨酸蛋白酶的蛋白酶识别位点。溶酶体蛋白酶的一些非限制性实例包括组织蛋白酶B、C、H、I、J、K、L、M、N、O、P、S、T和X以及组织蛋白酶D、E、F、G和/或组织蛋白酶A(羧肽酶A)。
保护基
在一些实施方案中，PBD毒素包含合适的保护基。保护基和制备保护基的方法的一些非限制性实例描述于以下专利申请公布中：US2011/0256157、WO2015/052322、US2011/0201803、US2008/0167293、US2014/0127239、US2015/0158869、US2015/0344482、US2015/0315196、US2015/0315196、US2014/0302066、US2006/0264622和US2015/0133435，其全部内容通过引用整体并入本文。
在一些实施方案中，保护基包含以下化学式D的结构：
[化26]
Figure BPA0000302829100000721
其中星号指示与吡咯并苯并二氮
Figure BPA0000302829100000722
毒素的连接点；并且w为0至10。在一些实施方案中，w为0至8、0至6、0至4、1至10、1至8、1至5或1至4。在某些实施方案中，w选自0、1、2、3、4、5、6、7、8、9和10。在一些实施方案中，w为2。
在一些实施方案中，保护基是可去除的。在某些实施方案中，保护基可使用合适的化学方法切割。
在一些实施方案中，抗赘生物剂包含化学式II的结构：
[化27]
Figure BPA0000302829100000731
其中m为8，并且波浪线指示与结合剂的连接点。
在一些实施方案中，抗赘生物剂包含化学式III的结构：
[化28]
Figure BPA0000302829100000732
其中m为8，p为1或3，X2为空或为保护基，并且波浪线指示与结合剂的连接点。在某些实施方案中，抗赘生物剂包含化学式IV的结构：
[化29]
Figure BPA0000302829100000733
其中波浪线指示与结合剂的连接点。
在一些实施方案中，抗赘生物剂包含化学式V′的结构
[化30]
Figure BPA0000302829100000741
其中m为8，E为合适的连接基团，并且波浪线指示与结合剂的连接点。在一些实施方案中，E包含结构C的琥珀酰胺部分：
[化31]
Figure BPA0000302829100000742
其中波浪线指示与结合剂的连接点，并且双星号指示与化学式V的抗赘生物剂的连接点。包含结构C的连接基团的化学式V的抗赘生物剂在本文中有时称为化学式XI。
在一些实施方案中，抗赘生物剂包含化学式VI的结构：
[化32]
Figure BPA0000302829100000743
其中t为8，v为1，并且波浪线指示与结合剂的连接点。
在一些实施方案中，抗赘生物剂包含化学式VII的结构：
[化33]
Figure BPA0000302829100000751
其中波浪线指示与结合剂的连接点。
在一些实施方案中，双特异性结合剂包含抗赘生物剂，所述抗赘生物剂包含选自化学式II、III、IV、V′、VI、VII和XI中任一项的结构。
药物组合物
在一些实施方案中，组合物或药物组合物包含本文中所述的双特异性结合剂(例 如，包含抗赘生物剂的双特异性结合剂)。在一些实施方案中，药物组合物包含双特异性结合剂以及可药用赋形剂、稀释剂、添加剂或载体。
药物组合物可配制成用于合适的施用途径。在一些实施方案中，药物组合物配制成用于皮下(subcutaneous，s.c.)、皮内、肌内、腹膜内和/或静脉内(intravenous，i.v.)施用。在某些实施方案中，药物组合物可包含用于改变、维持或保持组合物的例如pH、渗量(osmolarity)、黏度、澄清度、颜色、等张性、气味、无菌性、稳定性、溶出或释放速率、吸附或渗透的配制材料。在某些实施方案中，合适的配制材料包括但不限于：氨基酸(例如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、精氨酸或赖氨酸)；抗微生物剂；抗氧化剂(例如抗坏血酸、亚硫酸钠或亚硫酸氢钠)；缓冲剂(例如硼酸盐、碳酸氢盐、Tris-HCl、柠檬酸盐、磷酸盐(例如，磷酸缓冲盐水)或合适的有机酸)；填充剂(例如甘露糖醇或甘氨酸)；螯合剂(例如乙二胺四乙酸(ethylenediamine tetraacetic acid，EDTA))；复合剂(complexing agent)(例如咖啡因、聚乙烯吡咯烷酮、β-环糊精或羟丙基-β-环糊精)；蛋白质(例如血清白蛋白、明胶或免疫球蛋白)；着色剂、矫味剂和稀释剂；乳化剂；亲水性聚合物(例如聚乙烯吡咯烷酮)；低分子量多肽；成盐反荷离子(例如钠)；溶剂(例如甘油、丙二醇或聚乙二醇)；稀释剂；赋形剂和/或药用辅料。特别地，药物组合物可包含如以下中列出的任何合适的载体、制剂或成分等，或其组合：“Remington：The Science And Practice Of Pharmacy”Mack Publishing Co.，Easton，PA，第19版，(1995)(下文称为，“Remington’95”)，或者“Remington：The ScienceAnd Practice Of Pharmacy”，Pharmaceutical Press，Easton，PA，第22版，(2013)(下文称为，“Remington2013”)，其内容通过引用整体并入本文。本文中列出的多种材料，单独或组合地，可被并入到Remington’95或Remington 2013中所述的材料中或与其一起使用。可使用任何合适的技术、载体和赋形剂，包括本领域中理解的那些，例如，如Remington’95或Remington 2013中所述的。
在某些实施方案中，药物组合物包含合适的赋形剂，其一些非限制性实例包括抗黏剂(例如，硬脂酸镁)、黏合剂(binder)、填充剂、单糖、二糖、其他碳水化合物(例如，葡萄糖、甘露糖或糊精)、糖醇(例如，甘露糖醇或山梨糖醇)、包衣(例如，纤维素、羟丙基甲基纤维素(hydroxypropyl methylcellulose，HPMC)、微晶纤维素、合成聚合物、虫胶(shellac)、明胶、玉米蛋白玉米醇溶蛋白、肠溶物(enteric)或其他多糖)、淀粉(例如，马铃薯、玉蜀黍或小麦淀粉)、二氧化硅、颜料(color)、崩解剂、香料、润滑剂、防腐剂、吸着剂、甜味剂、载剂、助悬剂、表面活性剂和/或润湿剂(例如，普朗尼克类(pluronic)、PEG、山梨聚糖酯、聚山梨酯(例如聚山梨酯20、聚山梨酯80)、triton、氨丁三醇、卵磷脂、胆固醇、泰洛沙泊(tyloxapal))、稳定性增强剂(例如蔗糖或山梨糖醇)和张力增强剂(例如碱金属卤化物、氯化钠或氯化钾、甘露糖醇、山梨糖醇)、和/或Remington’95或Remington 2013中公开的任何赋形剂。本文中使用的术语“黏合剂”是指有助于使药物混合物保持合并的化合物或成分。用于制备药物制剂并且通常用于制备药物片剂、胶囊剂和颗粒剂的合适黏合剂是本领域技术人员已知的。
在一些实施方案中，药物组合物包含合适的可药用添加剂和/或载体。合适的添加剂的一些非限制性实例包括合适的pH调节剂、安抚剂(soothing agent)、缓冲剂、含硫还原剂、抗氧化剂等。含硫还原剂的一些非限制性实例包括具有巯基的那些，例如N-乙酰基半胱氨酸、N-乙酰基高半胱氨酸、硫辛酸、硫代二甘醇、硫代乙醇胺、硫代甘油、硫代山梨糖醇、硫代乙醇酸及其盐、硫代硫酸钠、谷胱甘肽、以及C1-C7硫代烷酸。抗氧化剂的一些非限制性实例包括异抗坏血酸、二丁基羟基甲苯、丁基羟基茴香醚、α-生育酚、生育酚乙酸酯、L-抗坏血酸及其盐、L-抗坏血酸棕榈酸酯、L-抗坏血酸硬脂酸酯、亚硫酸氢钠、亚硫酸钠、没食子酸三戊酯和没食子酸丙酯、以及螯合剂例如乙二胺四乙酸(EDTA)二钠、焦磷酸钠和偏磷酸钠。此外，稀释剂、添加剂和赋形剂可包含其他常用成分，例如，无机盐例如氯化钠、氯化钾、氯化钙、磷酸钠、磷酸钾和碳酸氢钠，以及有机盐例如柠檬酸钠、柠檬酸钾和乙酸钠。
本文中使用的药物组合物可以是在长时间段(例如约数月或数年)内稳定的。在一些实施方案中，药物组合物包含一种或更多种合适的防腐剂。防腐剂的一些非限制性实例包括苯扎氯铵、苯甲酸、水杨酸、硫柳汞、苯乙醇、对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸丙酯、氯己定、山梨酸、过氧化氢等，和/或其组合。防腐剂可包含季铵化合物，例如苯扎氯铵、苯佐氯铵、苄索氯铵、西曲溴铵、氯化三苯唑(sepazonium chloride)、氯化十六烷基吡啶或溴化度米芬(BRADOSOL(注册商标))。防腐剂可包含硫代水杨酸的烷基汞盐，例如硫柳汞、硝酸苯汞、乙酸苯汞或硼酸苯汞。防腐剂可包含对羟基苯甲酸酯，例如对羟基苯甲酸甲酯或对羟基苯甲酸丙酯。防腐剂可包含醇，例如氯丁醇、苄醇或苯乙醇。防腐剂可包含双胍衍生物，例如氯己定或聚六亚甲基双胍。防腐剂可包含过硼酸钠、咪唑烷基脲和/或山梨酸。防腐剂可包含稳定的氧氯复合物，例如已知的和可以以商品名PURITE(注册商标)商购获得的。防腐剂可包含聚乙二醇-聚胺缩合树脂，例如已知的和来自Henkel KGaA的可以以商品名POLYQUART(注册商标)商购获得的。防腐剂可包含稳定的过氧化氢。防腐剂可以是苯扎氯铵。在一些实施方案中，药物组合物不含防腐剂。
在一些实施方案中，组合物、药物组合物或双特异性结合剂基本上不含血液或血液产品污染物(例如，血细胞、血小板、多肽、矿物质、经血液传播的化合物或化学物等)。在一些实施方案中，组合物、药物组合物或双特异性结合剂基本上不含血清和血清污染物(例 如，血清蛋白、血清脂质、血清碳水化合物、血清抗原等)。在一些实施方案中，组合物、药物组合物或双特异性结合剂基本上不含病原体(例如，病毒、寄生物或细菌)。在一些实施方案中，组合物、药物组合物或双特异性结合剂基本上不含内毒素。在一些实施方案中，组合物、药物组合物或双特异性结合剂是无菌的。在某些实施方案中，组合物或药物组合物包含双特异性结合剂和稀释剂(例如，磷酸缓冲盐水(phosphate buffered saline，PBS))。在某些实施方案中，组合物或药物组合物包含双特异性结合剂和赋形剂(例如，脱水柠檬酸钠或聚氧乙烯-山梨聚糖-20单油酸酯(聚山梨酯80))。
本文中所述的药物组合物可配置成用于根据在其中使用它们的治疗以任何合适的形式和/或量施用于对象。例如，配置成用于肠胃外施用(例如，通过注射或输注)的药物组合物可采用在油性或水性载剂中的混悬剂、溶液剂或乳剂的形式，并且其可包含配制剂、赋形剂、添加剂和/或稀释剂，例如水性或非水性溶剂、共溶剂、助悬溶液剂、防腐剂、稳定剂和/或分散剂。在一些实施方案中，适合于肠胃外施用的药物组合物可包含一种或更多种赋形剂。在一些实施方案中，药物组合物被冻干成干粉形式。在一些实施方案中，药物组合物被冻干成干粉形式，其适合于用合适的药用溶剂(例如，水、盐水、等张缓冲溶液(例如，PBS)等)进行重构。在某些实施方案中，冻干的药物组合物的重构形式适合于肠胃外施用(例如，静脉内施用)于哺乳动物。
在某些实施方案中，药物组合物配置成用于经口施用，并且可被配制成片剂、微片剂、迷你片剂、微丸剂、粉末颗粒剂、胶囊剂(例如，填充有微片、微丸、粉末或颗粒的胶囊剂)、乳剂或溶液剂。配置成用于经口施用的药物组合物可包含合适的包衣以延迟或持续释放活性成分(例如，双特异性结合剂)，其一些非限制性实例包括肠溶包衣，例如脂肪酸、蜡、虫胶、塑料、丙烯酸甲酯-甲基丙烯酸共聚物、乙酸邻苯二甲酸纤维素(cellulose acetatephthalate，CAP)、乙酸琥珀酸纤维素、邻苯二甲酸羟丙基甲基纤维素、乙酸琥珀酸羟丙基甲基纤维素(乙酸琥珀酸羟丙甲纤维素)、聚乙酸乙烯邻苯二甲酸酯(polyvinyl acetatephthalate，PVAP)、甲基丙烯酸甲酯-甲基丙烯酸共聚物、偏苯三酸乙酸纤维素酯、藻酸钠、玉米醇溶蛋白、植物纤维等，及其组合。
在一些实施方案中，本文中所述的药物组合物可配置成用于表面(topical)施用，并且可包含结合剂和/或润滑剂、聚合二醇、明胶、可可脂或其他合适的蜡或脂肪中的一种或更多种。在一些实施方案中，将本文中所述的药物组合物并入到包含通常适于表面药物施用的表面载体并且包含本领域技术人员已知的任何合适材料的表面制剂中。在某些实施方案中，药物组合物的表面制剂配制成用于从表面贴剂施用双特异性结合剂。
在某些实施方案中，最佳的药物组合物将由本领域技术人员根据例如预期的施用途径、递送形式和期望剂量来确定(参见例如，Remington’95或Remington 2013，同上)。在某些实施方案中，这样的组合物可影响本发明抗体药物缀合物的物理状态、稳定性、体内释放速率和体内清除速率。药物组合物可通过任何合适的方式，包括例如，通过常规混合、溶解、制粒(granulating)、制备糖衣丸、磨细、乳化、包封、包埋或制片(tableting)过程来制备(例如，参见Remington’95或Remington 2013中描述的方法)。
在一些实施方案中，本文中提供了用作用于在对象中治疗赘生物之药物的组合物或药物组合物，其中所述组合物或药物组合物包含本文中所述的双特异性结合剂(例如，包含抗赘生物剂的双特异性结合剂)。在一些实施方案中，本文中提供了包含双特异性结合剂，或与抗赘生物剂或PBD毒素缀合(例如，共价连接)的双特异性结合剂的组合物或药物组合物，其用于治疗赘生物。
在一些实施方案中，本文中所述的组合物、药物组合物或双特异性结合剂(例如，包含抗赘生物剂的双特异性结合剂)用于治疗患有或怀疑患有赘生物的对象。在一些实施方案中，向患有或怀疑患有赘生物的对象施用本文中所述的组合物、药物组合物或双特异性结合剂(例如，包含抗赘生物剂的双特异性结合剂)。在一些实施方案中，本文中提供了治疗患有或怀疑患有赘生物的对象的方法。在某些实施方案中，治疗患有或怀疑患有赘生物的对象的方法包括向该对象施用治疗有效量的本文中所述的组合物或双特异性结合剂。在某些实施方案中，向对象施用双特异性结合剂或包含双特异性结合剂的药物组合物，其中所述双特异性结合剂与人黏结蛋白聚糖-1的胞外结构域和/或FGFR3(例如，FGFR3、FGFR3b和/或FGFR3c)特异性结合。
在某些实施方案中，治疗对象的方法包括使对象的细胞(例如，一种或更多种细胞)与治疗有效量的本文中所述的组合物、药物组合物或双特异性结合剂接触。在某些实施方案中，治疗方法包括使对象的细胞(例如，一种或更多种细胞)与治疗有效量的与人黏结蛋白聚糖-1或其变体的胞外部分和/或FGFR3(例如，FGFR3、FGFR3b和/或FGFR3c)特异性结合的双特异性结合剂接触。对象的细胞通常是表达黏结蛋白聚糖-1的胞外部分的细胞。对象的细胞可见于对象体内部(例如，体内)或对象外部(例如，体外或离体)。
可通过本文中所述的方法治疗的赘生物的一些非限制性实例包括：上皮癌、肉瘤、神经系统赘生物形成(neoplasia)(神经系统的赘生物形成)、淋巴瘤、骨髓瘤、白血病、黑素瘤、间皮瘤、实体或软组织肿瘤、以及继发性癌症(例如，来源于原发性部位)。癌的一些非限制性实例包括呼吸系统癌、胃肠系统癌、泌尿生殖系统癌、睾丸癌、前列腺癌、内分泌系统癌、皮肤基底细胞癌、未知原发性癌(carcinoma of unknown primary)、胆管癌、原位导管癌(ductal carcinoma in situ，DCIS)、梅克尔细胞癌(Merkel cell carcinoma)、肺癌、胸腺瘤和胸腺癌、中线道癌(midline tract carcinoma)、肺小细胞癌、甲状腺癌、肝的肝细胞癌、鳞状细胞癌、头颈部鳞癌、乳腺癌、上皮癌、肾上腺皮质癌、卵巢表面上皮癌等，还包括子宫癌、宫颈癌、结肠癌、胰腺癌、肾癌、食管癌、胃癌和卵巢癌。肉瘤的一些非限制性实例包括：尤因肉瘤(Ewing sarcoma)、淋巴肉瘤、脂肪肉瘤、骨肉瘤、乳腺肉瘤、软组织肉瘤、卡波西肉瘤(Kaposi sarcoma)、横纹肌肉瘤、子宫肉瘤、软骨肉瘤、平滑肌肉瘤、纤维肉瘤等。神经系统赘生物形成的一些非限制性实例包括：胶质瘤、胶质母细胞瘤、脑脊膜瘤、神经母细胞瘤、视网膜母细胞瘤、星形细胞瘤、少突胶质细胞瘤(oligodendrocytoma)等。淋巴瘤、骨髓瘤和白血病的一些非限制性实例包括：急性和慢性淋巴细胞白血病、粒细胞白血病、多发性骨髓瘤、低分化型急性白血病(例如，成红细胞白血病和急性原巨核细胞白血病)、急性早幼粒细胞白血病(acute promyeloid leukemia，APML)、急性髓细胞性白血病(acutemyelogenous leukemia，AML)、慢性髓细胞性白血病(chronic myelogenous leukemia，CML)、急性淋巴细胞白血病(acute lymphoblastic leukemia，ALL)(其包括B谱系ALL和T谱系ALL)、慢性淋巴细胞白血病(chronic lymphocytic leukemia，CLL)、幼淋巴细胞白血病(prolymphocytic leukemia，PLL)、毛细胞白血病(hairy cell leukemia，HLL)、华氏巨球蛋白血症(Waldenstrom’s macroglobulinemia，WM)、非霍奇金淋巴瘤(non-Hodgkinlymphoma)及变体、外周T细胞淋巴瘤、成人T细胞白血病/淋巴瘤(adult T-cell leukemia/lymphoma，ATL)、皮肤T细胞淋巴瘤(cutaneous T-cell lymphoma，CTCL)、大颗粒淋巴细胞白血病(LGF)、霍奇金病(Hodgkin’s disease)和里-施病(Reed-Sternberg disease)。软组织或实体组织肿瘤的一些非限制性实例包括：内脏肿瘤、精原细胞瘤、肝细胞瘤以及另外的以下的肿瘤：乳房、肝、肺、胰腺、子宫、卵巢、睾丸、头、颈、眼、脑、口、咽、声带、耳、鼻、食管、胃、肠、结肠、肾上腺、肾、骨、膀胱、尿道、上皮癌、肺、肌、皮肤、足、手和软组织。在一些实施方案中，可通过本文中公开的药物组合物或双特异性结合剂治疗的赘生物选自：膀胱癌、乳腺癌、结直肠癌、宫颈癌、胃癌、肝癌、肝细胞癌、下咽癌、肺癌、腺癌、卵巢癌和肾癌。在一些实施方案中，可通过本文中公开的药物组合物或双特异性结合剂治疗的赘生物选自：胰腺癌(例如，胰腺腺癌、外分泌胰腺癌或神经内分泌胰腺癌)、结直肠癌(例如，结直肠腺癌)、小肠恶性肿瘤、胆管癌、非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer，NSCLC)、甲状腺癌、食管或食管胃交界部(esophagogastric junction，EGJ)癌、胃腺癌、肝的肝细胞癌、头颈部鳞癌、女性生殖道恶性肿瘤、乳腺癌、肺小细胞癌、卵巢表面上皮癌、腹膜后或腹膜肉瘤、前列腺腺癌、神经内分泌肿瘤、胃肠道间质瘤、胶质母细胞瘤或非上皮性卵巢癌。在一些实施方案中，可通过本文中公开的药物组合物或双特异性结合剂治疗的赘生物是乳腺癌，其一些非限制性实例包括：原位导管癌(DCIS)、侵袭性导管癌(invasive ductal carcinoma，IDC)(例如，乳腺导管癌、乳腺髓样癌、乳腺黏液癌、乳腺乳头状癌和乳腺筛状癌)、侵袭性小叶癌(invasive lobular carcinoma，ILC)、炎性乳腺癌、原位小叶癌(lobular carcinoma insitu，LCIS)、男性乳腺癌、乳腺癌分子亚型(例如，管腔B型乳腺癌或激素受体阳性乳腺癌、三阴性乳腺癌、富HER2乳腺癌和正常样乳腺癌)、佩吉特乳头病(Paget’s disease of thenipple)、乳腺叶状肿瘤和转移性乳腺癌。在一些实施方案中，可通过本文中公开的药物组合物或双特异性结合剂治疗的赘生物是三阴性乳腺癌。
在一些实施方案中，本文中所述治疗的有效性可部分地通过赘生物或赘生性细胞所表达的CD138和/或FGFR3(例如，FGFR3或其同种型)的量来确定或预测。例如，在不受限于理论的情况下，具有表达高水平的CD138和/或FGFR3的赘生物或赘生性细胞的对象可比具有几乎不表达或不表达CD138或FGFR3的赘生物或赘生性细胞的其他对象更好的响应于用本文中所述的双特异性结合剂进行的治疗。可使用合适的抗CD138抗体和合适的免疫测定(例如，全细胞ELISA、FAC等)快速测定赘生性细胞或癌细胞以确定CD138的表达水平。同样，可使用合适的抗FGFR3抗体和合适的免疫测定快速测定赘生性细胞或癌细胞的FGFR3的表达。因此，在一些实施方案中，治疗患有或怀疑患有赘生物的对象的方法包括施用治疗有效量的本文中所述的双特异性结合剂，其中所述赘生物或其赘生性细胞表达可检测水平的CD138和/或FGFR3(例如，FGFR3或其同种型)。在某些实施方案中，表达可检测水平的CD138和/或FGFR3的赘生物是已知或被报道表达CD138和/或FGFR3的赘生物。在某些实施方案中，赘生物被怀疑表达CD138和/或FGFR3(例如，通过具有与已知表达CD138和/或FGFR3的其他赘生性细胞类型相似的基因型或表型)。在一些实施方案中，表达或被怀疑表达CD138和/或FGFR3的赘生物是表达编码CD138和/或FGFR3或其一部分的RNA转录物的赘生物。在一些实施方案中，表达或被怀疑表达CD138和/或FGFR3的赘生物是在其细胞表面上表达CD138和/或FGFR3的赘生物。已证实表达CD138和/或FGFR3的癌症的一些非限制性实例包括：肾上腺皮质癌、膀胱尿路上皮癌、乳腺侵袭性癌、宫颈鳞状细胞癌、宫颈内腺癌、胆管癌、结肠腺癌、结直肠腺癌、淋巴样赘生物弥漫性大B细胞淋巴瘤、食管癌、多形性胶质母细胞瘤、胶质瘤、头颈部鳞状细胞癌、肾嫌色细胞癌(kidney chromophobe)、混合肾癌(pan-kidney cohort)(KICH+KIRC+KIR)、肾的肾透明细胞癌(kidney renal clear cell carcinoma)、肾的肾乳头状细胞癌、急性髓性白血病、脑低级别胶质瘤(brain lower grade glioma)、肝的肝细胞癌、肺腺癌、肺鳞状细胞癌、间皮瘤、卵巢浆液性囊腺癌、胰腺腺癌、嗜铬细胞瘤和副神经节瘤、前列腺腺癌、直肠腺癌、肉瘤、皮肤的皮肤黑素瘤、胃腺癌、胃和食管癌、睾丸生殖细胞肿瘤、甲状腺癌、胸腺瘤、子宫体子宫内膜癌、子宫癌肉瘤、以及葡萄膜黑素瘤。
在一些实施方案中，治疗患有或怀疑患有赘生物的对象的方法包括施用与其他抗癌治疗组合的治疗有效量的本文中所述双特异性结合剂，所述其他抗癌治疗的一些非限制性实例包括：T-细胞活化剂、佐剂、抗癌疫苗、放射治疗、免疫治疗(例如，抗HER2或抗CD20)、化学治疗等，或其组合。在一些实施方案中，T细胞活化剂是与CD3、OX40、GITR、CD137(41BB)、CD27、HVEM、LAG-3、TIM3、VISTA或BTLA结合的抗体。
任何合适的化学治疗剂均可用于本文中所述的方法。在一些实施方案中，化学治疗剂包含以下或由以下组成：烷化剂、蒽环类、细胞骨架破坏剂、埃博霉素类(例如，埃博霉素)、组蛋白去乙酰化酶抑制剂(例如，伏立诺他(vorinostat)、罗米地辛(romidepsin))、拓扑异构酶I的抑制剂(例如，伊立替康、拓扑替康)、拓扑异构酶II的抑制剂(例如，依托泊苷、替尼泊苷、他氟泊苷(tafluposidean))、激酶抑制剂、肽抗生素类(例如，博来霉素、放线菌素)、基于铂的试剂(例如，卡铂、顺铂、奥沙利铂)、靶向DNA修复酶聚ADP核糖聚合酶-1的化合物(例如，Parp抑制剂)、类视黄醇(例如，维甲酸、阿利维A酸、贝沙罗汀)、长春花生物碱和化合物(例如，长春碱、长春新碱、长春地辛、长春瑞滨)、抗代谢物、植物提取物、植物生物碱、亚硝基脲、激素、核苷或核苷酸类似物及其组合。烷基化抗赘生物剂的一些非限制性实例包括：六甲密胺(六甲基三聚氰胺(hexamethylmelamine)、HEXALEN(注册商标))、白消安、卡莫司汀(BCNU)、苯丁酸氮芥、环磷酰胺、达卡巴嗪(DTIC)、福莫司汀、异环磷酰胺、洛莫司汀(CCNU)、氮芥、美法仑、丙卡巴肼、司莫司汀(MeCCNU)、链脲菌素、替莫唑胺、噻替哌(三乙撑硫代磷酰胺)、卡铂、顺铂、奥沙利铂、单官能烷基化剂(monofunctional alkylator)、亚硝基脲、替莫唑胺等或其组合。DNA嵌入剂的一些非限制性实例包括：丙烯醛、蒽环类、磷酰胺、放线菌素D、博来霉素、伊达比星、柔红霉素、多柔比星、elsamicin A、表柔比星、乙锭、m-AMSA、米托蒽醌、多柔比星(阿霉素、Doxil、Myocet、羟基柔红霉素(hydroxydaunorubicin)、羟基道诺霉素(hydroxydaunomycin))、表柔比星、伊达比星、戊柔比星、TAS-103、MLN944(XR5944)、奥巴克拉(Obatoclax)、氮芥、甲氨蝶呤、6-巯基嘌呤、硫鸟嘌呤、5-氟尿嘧啶、阿糖胞苷、5-氮杂胞苷(5-AZC)和5-氮杂胞苷相关化合物、光辉霉素、丝裂霉素C、羟基脲、卡铂、奥沙利铂、米托坦(mitotane)、紫杉烷、长春碱、长春新碱、二溴甘露醇、吉西他滨、培美曲塞等或其组合。细胞骨架破坏剂(例如，紫杉烷类)的一些非限制性实例包括紫杉醇、紫杉酚和多西他塞。激酶抑制剂的一些非限制性实例包括硼替佐米、厄洛替尼、吉非替尼、伊马替尼、维莫非尼、维莫德吉等，其类似物和化合物。核苷酸类似物的一些非限制性实例包括阿扎胞苷、硫唑嘌呤、卡培他滨、阿糖胞苷、多西氟尿啶、氟尿嘧啶、吉西他滨、羟基脲、巯基嘌呤、甲氨蝶呤、硫鸟嘌呤(tioguanine)(之前为硫鸟嘌呤(thioguanine))等，其类似物和化合物。PARP抑制剂的一些非限制性实例是奥拉帕尼、卢卡帕尼(rucaparib)、尼拉帕尼(niraparib)、维利帕尼(veliparib)、他拉唑帕尼(talazoparib)等，其类似物和化合物。
术语“对象”是指哺乳动物。任何合适的哺乳动物均可通过本文中所述的方法或组合物进行治疗。哺乳动物的一些非限制性实例包括人、非人灵长类(例如，猿、长臂猿、黑猩猩、猩猩、猴、猕猴等)、家养动物(例如，狗和猫)、农场动物(例如，马、牛、山羊、绵羊和猪)和实验动物(例如，小鼠、大鼠、兔和豚鼠)。在一些实施方案中，哺乳动物是人。哺乳动物可以为任何年龄或处于任何发育阶段(例如，成年、青少年、儿童、婴儿或在子宫内的哺乳动物)。哺乳动物可以是雄性或雌性的。在一些实施方案中，有需要的对象是患有或怀疑患有赘生物的对象。
可使用向对象施用组合物、药物组合物或双特异性结合剂的任何合适方法。根据本文中描述的本发明方法使用的组合物的准确制剂和施用途径可由个体医生根据患者的病情来选择。参见例如，Fingl et al.1975，在“The Pharmacological Basis ofTherapeutics，”Ch.1，p.1中，其通过引用整体并入本文。任何合适的施用途径均可用于施用本文中所述的药物组合物或双特异性结合剂。施用途径的一些非限制性实例包括表面或局部(例如，皮下、透皮或经皮肤，(例如，在皮肤或表皮上)、在眼中或眼上、鼻内、经黏膜、在耳中、在耳内(例如，在鼓膜(ear drum)后面))、肠内(例如，通过胃肠道递送，例如，经口(例 如，作为片剂、胶囊剂、颗粒剂、液体剂、乳化作用、锭剂，或其组合)、舌下、通过胃饲管、经直肠等)、通过肠胃外施用(例如，肠胃外，例如，静脉内、动脉内、肌内、腹膜内、皮内、皮下、腔内、颅内、关节内、进入关节间隙、心内(进入心脏)、阴茎海绵体注射(intracavernousinjection)、病灶内(进入皮肤病灶)、骨内输注(进入骨髓)、鞘内(进入椎管)、子宫内、阴道内、膀胱内输注、玻璃体内)等，或其组合。
在一些实施方案中，向对象提供本文中的组合物。有时将向对象提供的组合物提供给对象用于自施用或用于通过他人(例如，非医疗专业人员)施用于对象。例如，本文中所述的组合物可按照由医务人员书写的指示(例如，处方)提供，该指示允许向患者提供本文中所述的组合物或治疗。在另一实例中，可向对象提供组合物，其中所述对象例如经口、静脉内或通过吸入器自施用组合物。
或者，可以以局部方式而非全身方式施用根据本发明方法使用的组合物，例如，通过直接施加于皮肤、黏膜或目的治疗区域，包括使用贮库或持续释放制剂。
在一些实施方案中，包含双特异性结合剂的药物组合物被单独施用(例如，作为单一活性成分(AI(active ingredient)或例如作为单一活性药物成分(activepharmaceutical ingredient，API))。在另一些实施方案中，包含双特异性结合剂的药物组合物与一种或更多种另外的AI/API组合(例如，作为两种独立的组合物或者作为其中所述一种或更多种另外的AI/API与双特异性结合剂一起在药物组合物中混合或配制的单一组合物)施用。
在某些实施方案中，双特异性结合剂被递送至细胞(例如，哺乳动物细胞)。可使用任何合适的方法将双特异性结合剂递送至细胞。在某些实施方案中，将双特异性结合剂递送至细胞包括在允许双特异性结合剂与细胞结合的条件下，使哺乳动物细胞在体外或体内与包含双特异性结合剂的组合物接触。
药物组合物可通过任何合适的方式制备，包括例如，通过常规的混合、溶解、制粒、制备糖衣丸、磨细、乳化、包封、包埋或制片过程。
在一些实施方案中，在对象中治疗赘生物的方法包括向对象施用治疗有效量的双特异性结合剂或治疗有效量的包含双特异性结合剂的药物组合物。“治疗有效量”意指足以获得有效治疗结果的量和/或预防、终止、阻断、抑制、改善、消除、减慢、阻抑、杀伤或降低赘生物的生长、生存力、转移、严重程度、发作或症状所必需和/或足够的量。在一些实施方案中，有效的治疗结果可通过在治疗之前和/或之后在对象中测量和/或监测赘生物或赘生性细胞的数目、尺寸、生存力、生长、有丝分裂或转移来确定。因此，在一些实施方案中，向对象施用治疗有效量的双特异性结合剂或治疗有效量的包含双特异性结合剂的药物组合物预防、终止、阻断、抑制、改善、消除、减慢、阻抑、杀伤或降低了赘生物的生长、生存力、转移、严重程度、发作或症状。在某些实施方案中，向对象施用治疗有效量的双特异性结合剂或治疗有效量的包含双特异性结合剂的药物组合物诱导了一些或全部赘生物癌细胞的死亡、坏死或凋亡。治疗有效量的确定完全在本领域技术人员的能力内，尤其是根据本文中提供的详细公开内容。
在一些实施方案中，组合物中双特异性结合剂的量是作为至少治疗有效量的量和足够低以使不期望的不良反应最小化的量。双特异性结合剂的确切量将因对象而异，这取决于对象的年龄、体重和一般状况，所治疗病症的严重程度和/或所施用的其他治疗性药物的量。因此，并不总是能够指定可被施用以在不同对象群体中治疗赘生物的双特异性结合剂的确切治疗有效量。公知的是，用于特定条件下给定患者和用于特定疾病的具体剂量将常规地变化，但是在每种情况下最佳量的确定可通过简单的常规程序容易地完成。因此，用于治疗赘生物的双特异性结合剂的治疗有效量可由本领域普通技术人员使用常规实验来确定。
在某些实施方案中，组合物中双特异性结合剂的治疗有效量包含以下剂量：约.01mg/kg(例如，每千克对象体重)至500mg/kg、0.1mg/kg至500mg/kg、0.1mg/kg至400mg/kg、0.01mg/kg至300mg/kg、0.1mg/kg至300mg/kg、0.1mg/kg至200mg/kg、0.1mg/kg至150mg/kg、0.1mg/kg至100mg/kg、0.1mg/kg至75mg/kg、0.1mg/kg至50mg/kg、0.1mg/kg至25mg/kg、0.1mg/kg至10mg/kg、0.1mg/kg至5mg/kg或0.1mg/kg至1mg/kg。在一些方面中，双特异性结合剂的量可为：约10mg/kg、9mg/kg、8mg/kg、7mg/kg、6mg/kg、5mg/kg、4mg/kg、3mg/kg、2mg/kg、1mg/kg、0.9mg/kg、0.8mg/kg、0.7mg/kg、0.6mg/kg、0.5mg/kg、0.4mg/kg、0.3mg/kg、0.2mg/kg、或0.1mg/kg。在一些实施方案中，双特异性结合剂的治疗有效量为约0.1mg/kg至500mg/kg，或约1mg/kg至约300mg/kg。适合于多种施用途径的体积是本领域中已知的。
在一些实施方案中，根据需要以合适的频率和/或间隔施用双特异性结合剂或包含双特异性结合剂的药物组合物以获得有效的治疗结果。在一些实施方案中，包含双特异性结合剂的药物组合物如下施用：每小时、一天一次、一天两次、一天三次、一天四次、一天五次和/或以规律的间隔，例如每天、每隔一天、一周三次、每周、每隔一周、一月一次和/或简单地以根据需要的或由医疗专业人员推荐的频率或间隔。
药盒(kit)
在一些实施方案中，包含一定量或剂量的双特异性结合剂的药物组合物提供在药盒、包装或分配装置中，其可包含一个或更多个剂量的双特异性结合剂。药盒或包装可例如包含一个或更多个合适的容器、小瓶或泡罩包装以及一个或更多个合适的分配装置。在一些实施方案中，药盒或包装附有施用说明和/或由监管药品的制造、使用或销售的政府机构规定的通知，该通知反映了该机构批准该药物形式用于人或兽医施用。这样的通知例如可以是美国食品和药品管理局(U.S.Food and Drug Administration)批准的用于处方药的标签或经批准产品插页。
在一些实施方案中，药盒或包装包含足以治疗患者1天至1年、1天至180天、1天至120天、1天至90天、1天至60天、1天至30天、或其间的任何天或天数、1至4小时、1至12小时或1至24小时的双特异性结合剂的量。
药盒任选地包括产品标签和/或包装插页，其包含对组分的描述或者用于其中的组分在体外、体内或离体使用的说明。示例性的说明包括用于诊断方法、处理方案或治疗方案的说明。在某些实施方案中，药盒包含包装材料，其是指容纳药盒组分的物理结构。包装材料可使组分维持无菌，并且可由通常用于这样的目的的材料制成(例如，纸、瓦楞纤维(corrugated fiber)、玻璃、塑料、箔、安瓿、小瓶、管等)。产品标签或插页包括“印刷物”，例 如，纸或纸板，或者单独的或固定于组分、药盒或包装材料(例如，盒)，或者附着于包含药盒组分的安瓿、管或小瓶。标签或插页可另外包括计算机可读介质、光盘(例如CD-或DVD-ROM/RAM、DVD)、MP3、磁带、或电子存储介质(例如RAM和ROM)或这些的混合体例如磁性/光学存储介质、FLASH介质或记忆型卡。产品标签或插页可包含其中的一种或更多种组分、剂量量、活性成分的临床药理学(包括作用机制、药动学(pharmacokinetics，PK)和药效学(pharmacodynamics，PD))的标示信息。产品标签或插页可包含标示以下的信息：制造商信息，批号，制造商位置，日期，关于可使用药盒组分所针对的指定病症、障碍、疾病或症状的信息。产品标签或插页可包含对于临床医生或对于对象在方法、处理方案或治疗方案中使用一种或更多种药盒组分的说明。说明可包含剂量量、频率或持续时间，以及用于实施本文中所述的任何方法、处理方案或治疗方案的说明。因此，本发明的药盒可另外地包含用于实施本文中所述的本发明的任何方法和用途的标签或说明。产品标签或插页可包含关于潜在不良副作用和/或警告的信息。
在某些实施方案中，药盒包含一种或更多种具有已知量的黏结蛋白聚糖-1和/或FGFR3的对照。在一些实施方案中，药盒包含表达黏结蛋白聚糖-1和/或FGFR3的细胞。药盒中的细胞可在适当的储存条件下维持，直至准备好使用该细胞。
在一些实施方案中，药盒是包含双特异性结合剂的诊断试剂盒(diagnostickit)。诊断试剂盒中包含的双特异性结合剂可采用任何合适的形式。在一些实施方案中，诊断剂包含双特异性结合剂和可检测标记。在某些实施方案中，例如，诊断试剂盒包含测试棒(stick test)或由其组成，所述测试棒包含实施本发明的方法和产生例如可与彩色图表或标准曲线进行比较的比色结果所必需的试剂。诊断试剂盒还可包含用于检测与细胞特异性结合的双特异性结合剂所必需的组分，例如二抗。
实施例
实施例1-抗CD138抗体的产生
产生针对人CD138的单克隆抗体，其(i)以高亲和力和特异性结合，(ii)表现出迅速内化，和/或(iii)显示与食蟹猴来源的CD138的交叉反应性。为了产生抗体，用CD138肽1至3(融合12)或肽4至6(融合13)的混合物对小鼠(Balb/C小鼠；雌性6至8周龄)进行免疫接种和加强，参见表11。
这些肽设计成远离糖基化位点，并且位于在人与小鼠之间较不保守但是在人与食蟹猴物种之间强烈保守的区域中。根据免疫接种方案用与KLH载体蛋白缀合的指定肽对小鼠进行免疫接种，初次注射使用完全弗氏佐剂(Complete Freund’s Adjuvant，CFA)并且所有后续加强使用不完全弗氏佐剂。通过人CD138和CD138-Fc结合ELISA的结合评估经免疫接种小鼠的抗体血清滴度。选择具有高滴度的小鼠用于融合。使用优化的方法通过小鼠B细胞和SP2/O骨髓瘤细胞的电融合产生杂交瘤。
[表11]
用于免疫接种的CD138肽。
Figure BPA0000302829100000881
与传统方法不同，在单个步骤中同时进行杂交瘤的克隆，其中通过HAT选择来选择融合细胞，并将单细胞集落转移到含有HT培养基的96孔板中，在有限选择下培养并筛选上清液的抗原结合。将阳性杂交瘤扩增成更大的体积，并将细胞冷冻储存。
CD138阳性细胞(H929)上的初次杂交瘤FACS筛选
使用每孔含有20,000个H929细胞的96孔板通过荧光激活细胞分选(FACS)筛选来自融合12(板12至19)的杂交瘤上清液。H929细胞是在其细胞表面上表达CD138的人B淋巴细胞细胞系。在4℃下持续1小时向H929细胞添加杂交瘤上清液。洗涤细胞，随后添加AlexaFluro 647抗小鼠抗体，并且再次洗涤以去除未结合的抗体。通过FACS对细胞进行分析以检测结合。通过Flowjo软件分析FACS数据。如果上清液抗体以高于板平均信号≥3个标准偏差的水平与细胞结合，则选择它们用于确认FACS和进一步表征。来自融合12的总共5013个杂交瘤接受了该初次FACS筛选，其中134个阳性命中(hit)；初次筛选中的总命中率为2.7％。来自融合12板16的阳性杂交瘤克隆的样品在下表12中示出。两个代表性阳性杂交瘤克隆的FACS直方图在图2中示出。
[表12]
表12：来自代表性H929FACS筛选的示出来自融合12板16的代表性阳性杂交瘤的表
Figure BPA0000302829100000891
*几何平均值指示图2中所示的指定象限内细胞的平均荧光强度；Q1指示抗体与H929细胞的阳性结合，而Q4指示未结合的细胞。
融合12杂交瘤的二次FACS筛选
选择在初次FACS筛选中显示阳性结合的杂交瘤并进一步表征。对于二次筛选，通过FACS测定杂交瘤上清液与H929(表达CD138)的阳性结合和与ARH-77(阴性CD138表达)细胞的阴性结合。对阴性细胞进行CSFE染色以帮助更好地区分阳性和阴性细胞系。然后将上清液的非特异性结合与特异性CD138结合进行比较。代表性二次FACS筛选的结果总结在表13中。
[表13]
显示出在CD138阳性H292细胞上阳性结合且在CD138阴性ARH77细胞上阴性结合的代表性杂交瘤克隆F12P16F6(12P16F6)的FACS数据总结
Figure BPA0000302829100000892
*几何平均值指示细胞的平均荧光强度；Q1％指示被抗体结合的H929细胞的百分比。
融合12杂交瘤上的二次ELISA筛选
在二次筛选之后还进行CD138和IgG1同种型ELISA，以帮助确认结合特异性和IgG类型。使用重组CD138-Flag进行CD138结合ELISA。数据表明所有FACS阳性杂交瘤通过ELISA也结合CD138。IgG ELISA鉴定IgG阳性抗体。将IgM抗体从进一步的研究中去除。到目前为止的选择过程的总结在表14中示出。
[表14]
初次和二次筛选结果总结
筛选特征描述 杂交瘤克隆的数目
筛选的总杂交瘤 5013
初次筛选命中 134
未表达 39
IgM阳性 23
无二次结合 60
IgG阳性 72
二次FACS结合物 12
通过SPR的代表性抗体的动力学结合
从杂交瘤上清液中纯化鼠IgG，并对IgG进行SPR(表面等离子体共振)以进行动力学结合测量。将人或小鼠CD138 His在BioRad Proteon上以50μg/mL在GLM芯片上固定。使167nM至10.4nM浓度范围的抗体以30μL/分钟的速率流过结合的芯片以检测动力学结合。使用二价分析物拟合测量KD。动力学结果在表15和图3中示出。
[表15]
代表性抗体的SPR动力学测量
Figure BPA0000302829100000901
*NB＝未结合；NA＝未分析。
**那些标记的NA未通过SPR进行分析，但通过ELISA结合测定显示不与小鼠CD138交叉反应(数据未示出)
抗体表达
评估两种代表性嵌合抗体的表达以确定扩大生产(scale-up production)的可能性。用指导12P16F6 hIgG1(也称为“chF6”)或13P30A7 hIgG1(也称为“chP30a7”)表达的载体瞬时转染Expi293细胞(250mL)。嵌合抗体12P16F6 hIgG1包含F12P16F6的鼠重链可变区(SEQ ID NO：82)和轻链可变区(SEQ ID NO：34)以及人IgG1κ同种型的恒定区。嵌合抗体13P30A7 hIgG1包含F13P30A7的鼠重链可变区(SEQ ID NO：83)和轻链可变区(SEQ ID NO：35)以及人IgG1κ同种型的恒定区。结果总结在下表16中。还通过SDS-PAGE和尺寸排阻色谱对表达的抗体进行分析(数据未示出)。
[表16]
Figure BPA0000302829100000911
代表性抗体的食蟹猴交叉反应性。
测试12P16F6 hIgG1或13P30A7 hIgG1与食蟹猴CD138的交叉反应性。与来自食蟹猴(cyno)的CD138交叉反应的抗体具有以下优点：其可在进行效力试验之前在该非人灵长类品系中测试毒性。简单地说，在Expi293细胞中转染指导人CD138或食蟹猴CD138的细胞表面表达的载体。在以33.3μg/mL开始的3倍稀释下测试12P16F6 hIgG1和13P30A7 hIgG1与经转染Expi293细胞的结合。使用苏金单抗(Sec)作为阴性对照以确保经转染细胞不具有任何背景结合。代表性抗体12P16F6 hIgG1和13P30A7 hIgG1显示出与人和食蟹猴CD138二者的特异性结合(图4)。
[表17]
代表性CD138杂交瘤来源抗体的数据总结
Figure BPA0000302829100000921
*NB＝没有可检测的结合；NA＝未分析。
实施例1中使用的某些试剂和材料的定义
注意，这里的杂交瘤克隆的名称可指杂交瘤细胞或由杂交瘤细胞产生的抗体，这取决于使用该名称的背景。杂交瘤克隆的名称通常是指融合(例如，融合#12或#13，分别缩写为F12和F13)，随后是前面带有字母“P”的板编号，和孔编号。例如，杂交瘤克隆F12P16F6(在本文中也称为12P16F6或P16F6)是指获自来源于融合12、板16和孔F6的杂交瘤的抗体。mBT-062是IgG1，CD138结合对照抗体。
实施例2-人源化
开发了策略以设计和产生本文中所述的鼠抗CD138(抗黏结蛋白聚糖-1)抗体的人源化形式，其中抗体的人源化形式保留了亲本单克隆抗体的特性。本文中提供了使定名为chF6的嵌合单克隆抗CD138抗体人源化的实例，所述chF6包含人IgG1/κ同种型的人恒定区和F12P16F6的小鼠可变区。
通常将本文中产生的chF6的人源化形式相对于亲本chF6嵌合抗体进行基准测试。在适当的情况下也使用其他阳性和阴性对照。
并行使用五种人源化策略，其导致产生三种人源化F12P16F6轻链序列和四种人源化F12P16F6重链序列。在某些实施方案中，该方法涉及将鼠互补决定区(CDR)移植到人框架和恒定区上。所得三种人源化轻链和四种人源化重链中的每一种彼此组合表达，并纯化，其产生总共十二种人源化抗CD138单克隆抗体。对人源化抗体的表达/纯化谱、生物物理特性、与CD138肽抗原的结合、与天然CD138的结合以及特异性进行分析。还评价了代表性人源化抗体的其他生物物理特性。
方法
chP16F6的表达和纯化
使用EXPIFECTAMINE(商标)293转染试剂盒将指导嵌合抗体chP16F6表达的载体以250ml的体积转染到Expi293细胞中。使用pH依赖性蛋白A纯化对上清液进行纯化。使用HiTrap MabSelect SuRe 5ml对嵌合抗体进行纯化。纯化之后，使用Zeba旋转柱将抗体缓冲液更换到1×DPBS中。在2.21mg/mL下，chP16F6的回收为7.1mg。
F12P16F6的人源化。
使用选自以下的方法进行重链和轻链可变结构域的人源化：(i)CDR移植(CDR grafting)(定名为cdr)，其根据Jones et al.(1986)″Replacing the complementaritydetermining regions in a human antibody with those from a mouse″Nature 321：522-525和Verhoeyen et al.(1988)″Reshaping human antibodies：grafting an anti-lysozyme activity″Science 239：1534-1536进行，其中将由Kabat et al.(1991)″Sequences of Proteins of Immunological Interest″5th ed.US Department ofHealth and Human Services，Public Health Service，National Institutes of Health(NIH公开号91-3242)定义的CDR移植到合适的人支架上，同时保留了关键的框架残基；(ii)缩短CDR移植(Grafting of abbreviated CDR)(定名为abb)，其根据Padlan et al.(1995)″Identification of specificity-determining residues in antibodies″FASEBJ 9：133-139进行，将定义为轻链中的残基27D-34、50-55和89-96以及重链中的31-35B、50-58和95-101的缩短CDR移植到合适的人支架上，同时保留了关键的框架残基；(iii)SDR-转 移(SDR-transfer)(定名为sdr)，其根据Padlan et al.(1995)″Identification ofspecificity determining residues in antibodies″FASEB J 9：133-139进行，其中将可能参与抗原结合的残基移植到合适的人序列中，同时保留了关键的框架残基；(iv)Frankenstein方法(定名为fra)，其根据Wu and Kabat(1992)″Possible use of similarframework region amino acid sequences between human and mouse immunoglobulinsfor humanizing mouse antibodies″Mol.Immunol.29：1141-1146进行，其中将CDR移植到由来自合适的人抗体的个体框架区构成的人支架上，同时保留了关键的框架残基；以及(v)镶饰(定名为ven)，其根据Padlan(1991)″A possible procedure for reducing theimmunogenicity of antibody variable domains while preserving their ligand-binding properties″Mol.Immunol.28：489-498进行，其中将非人抗体(如果结构已知)中或同源分子(如果结构未知)中暴露的残基更换为来自合适的人抗体的相应残基，同时保留了CDR和关键的框架残基。在所有描述的方法中，“合适的人抗体”用于表示最接近的人序列(可在GenBank中获得)。术语“关键框架残基”用于表示被认为对于维持三维结构必不可少的残基(来自PDB中相关的高分辨率X射线结构的分析)。有时进行第二轮“修复的”人源化以改善抗体的SEC谱。在第二轮中产生的人源化抗体由名称rep或修复指示。所得人源化重链和轻链可变区的氨基酸序列分别在图10A和10B中示出。
人源化P16F6修复构建体的表达和纯化
将四种人源化重链中的每一种与3种轻链中的每一种配对以产生12种不同的抗体(表18)。使用EXPIFECTAMINE(商标)293转染试剂盒在Expi293细胞中表达12种人源化P16F6抗体。除F6 cks-rep(需要更多以用于另外的研究)和375ml的F6 f2ka-rep(由于低蛋白质表达)之外，所有构建体均以125ml的体积转染。将上清液通过0.22μm滤器过滤，并用蛋白酶抑制剂处理。选择在缓冲液更换之后提供＞5mg/L的表达水平并且能够浓缩高于≥1mg/mL的抗体以用于进一步分析
[表18]
Figure BPA0000302829100000941
*F6和P16F6指示人源化抗体链来源于F12P16F6。
使用pH依赖性蛋白A纯化(HiTrap MabSelect SuRe 5mL)对抗体进行纯化。纯化之后，使用zeba旋转柱将抗体缓冲液更换到1×DPBS中。通过尺寸排阻色谱(SEC)分析确定的回收率和相对稳定性在人源化抗体之间变化(SEC谱未示出)。表19总结了通过SEC确定的回收率、浓度和百分比单体。图6中示出了11种代表性人源化抗体的SDS-PAGE分析。命名法有时采用hF6 xky-rep的形式，其中h代表人源化，F6代表F12P16F6来源的，x代表用于产生人源化重链序列的第一操作的第一个字母(例如，x可以是a＝abb，s＝sdr，f＝fra，或c＝cdr)，k代表κ轻链，并且y代表用于产生人源化轻链序列的第一操作的第一个字母(a＝abb，s＝sdr，f＝fra，c＝cdr)。术语“rep”代表“修复的”，指示进行了至少第二轮人源化，通常使用不同的方法。
[表19]
Figure BPA0000302829100000951
通过FACS的人源化P16F6修复构建体的CD138结合
通过FACS对9种代表性人源化抗CD138抗体进行与人CD138的细胞表面结合的分析(图7)。使用苏金单抗作为阴性对照。使用表达中等水平CD138的两种细胞系测试结合：多发性骨髓瘤细胞系KMS-11和膀胱癌细胞系RT112/84。在先前的实验中，12P16F6 hIgG1在RT-122/84细胞中显示出约9nM的EC50，并且在KMS-11细胞中显示出约3nM的EC50。使用四参数拟合曲线计算EC50(表20)。还针对CD138阴性淋巴母细胞ARH-77细胞对构建体进行测试。NB指示未观察到特异性结合。
[表20]
计算的与内源CD138结合的EC50值
Figure BPA0000302829100000961
*NB＝没有可检测的结合。
人源化P16F6修复构建体的CD138结合ELISA。
用9种代表性人源化抗体进行CD138结合ELISA，以确定与用于免疫接种的线性CD138肽部分的结合(图7)。用hCD138肽(AGEGPKEGEAVVLP；SEQ ID NO：94)和阴性对照肽(QAAVTSHPHGGMQPGLHETSA；SEQ ID NO：124)或F12P16F6不结合的小鼠CD138肽包被板。将包被的板与9种代表性抗体中的每一种的多种稀释液一起孵育过夜，并用山羊抗人IgG(H+L)-HRP检测结合。使用四参数拟合曲线确定EC50(表21)。还进行ELISA以检测与板包被的人CD138-Fc蛋白的结合(表21)。分析和结果类似。
[表21]
Figure BPA0000302829100000962
所选研究结果的总结
表22示出了13种代表性人源化抗CD138单克隆抗体的分析结果的总结。
[表22]
代表性人源化抗体的生物物理特性的总结
Figure BPA0000302829100000971
实施例3-晶体结构的确定
以
Figure BPA0000302829100000972
的分辨率解析与人源化抗CD138抗体Fab片段复合的人黏结蛋白聚糖-1肽的X射线晶体结构。该结构每个不对称单元包含黏结蛋白聚糖-1肽和Fab的各一个拷贝(图8)。
结构描述
人源化抗体Fab包含人源化重链可变区(SEQ ID NO：90)和人源化轻链可变区(SEQID NO：41)。根据PyIgClassify数据库对CDR典型结构进行分析。重链CDR分类如下：H1-13-1(CDR长度簇)、H2-10-1和H3-6-1。轻链CDR分类如下：L1-16-1、L2-8-1和L3-9-cis7-1。黏结蛋白聚糖-1肽与单个Fab结合，并且复合物形成掩埋了黏结蛋白聚糖-1肽和Fab的
Figure BPA0000302829100000989
Figure BPA0000302829100000981
的溶剂可及表面积区域(
Figure BPA0000302829100000982
链A和H；
Figure BPA0000302829100000983
链A和L)。
来自98至108的所有可见的黏结蛋白聚糖-1肽残基均参与与Fab的直接接触(图8)。参与界面的具体Fab残基是来自链H的31至33、35、47、50、52、58、94至96和101至102以及来自链L的27至28、32、34、46、49至50、89至94和96。这意味着来自CDR H1的四个残基，以及来自CDR H2的三个残基和来自CDR H3的五个残基参与界面。另外，来自CDR L1的四个残基、来自CDR L2的两个残基和来自CDR L3的七个残基参与界面。
将5.88mg/mL(约125μM)Fab的1mL等分试样与250μM黏结蛋白聚糖-1肽(AGEGPKEGEAVVLP；SEQ ID NO：94)混合，并在4℃下孵育2小时。将该复合物在S200尺寸排阻柱上分级，该柱已用包含20mM Tris pH 7.5和150mM NaCl的缓冲液预平衡。合并峰值级分并浓缩用于结晶。通过Bradford测定确定的最终蛋白质浓度为3mg/mL。
使用蚊机器人(mosquito robot)(TTP Labtech)以96孔格式通过蒸气扩散的悬滴法(hanging drop method)筛选约400个结晶条件。在20℃下在两种条件：2.1M DL-苹果酸pH 7.0和60％Tacsimate pH 7.0下观察到晶体生长。以24孔格式进一步优化结晶。
晶体冷却和数据收集
在具有包含1.7M DL-苹果酸pH 7.0的沉淀剂溶液的24孔板中，使用蒸汽扩散的悬滴法使所述晶体生长。内部X射线衍射筛选表明，通过将晶体预先浸泡在包含3.0M DL-苹果酸pH 7.0的溶液中24小时，可提高分辨率。通过将晶体直接从浸泡液滴中捕获到环中并放入液氮中来将晶体低温冷却。在ESRF光束线ID30A-1处收集同步加速器数据集。
结构解析和细化
MOSFLM(CCP4)和AIMLESS(CCP4)中的数据处理表明最可能的空间群是P212121，晶胞尺寸
Figure BPA0000302829100000984
并且
Figure BPA0000302829100000985
得到总晶胞体积为
Figure BPA0000302829100000986
马修斯系数(Matthews coefficient)(
Figure BPA0000302829100000987
Figure BPA0000302829100000988
和42.7％溶剂含量)的计算表明每个不对称单元最可能有一个完整的Fab-黏结蛋白聚糖-1复合物。通过BLAST检索针对PDB的每种组分(Fab重链和轻链)的序列来选择用于分子置换(molecular replacement，MR)的模型。具有最高序列同一性的模型是3sqo(Fab重链)和4ojf(Fab轻链)。沉积在PDB中的大量Fab晶体结构揭示了在可变结构域与恒定结构域之间存在广泛的肘角(elbow angle)变化。这种肘角变化可导致两个本来高度同源的Fab片段的整体三级结构显著不同，这反过来导致MR失败。为此，移除重链和轻链的可变区与恒定区之间的铰链区以产生四个单独的MR检索系综(ensemble)(VH、VL、CH和CL)。在COOT中目视检查之后，从重和轻可变结构域模型的CDR中修剪氨基酸残基，以防止也可导致MR失败的任何潜在冲突。使用PHASER(McCoy et al.，2007)(CCP4)通过MR正确定位构建完整Fab所需的所有四个输入检索系综(VH、VL、CH和CL)。使用REFMAC5(CCP4)对MR输出模型进行了20个循环的果冻体细化(jelly bodyrefinement)。使用CHAINSAW(CCP4)使蛋白质序列突变以匹配Fab的蛋白质序列。通过模型构建和细化的连续循环迭代地改进模型，直至在电子密度图中可见的Fab的所有有序区域都是完整的。根据Kabat抗体编号规则对重链和轻链氨基酸重新编号。对应于黏结蛋白聚糖-1肽的电子密度清晰可见。在COOT中手动添加黏结蛋白聚糖-1氨基酸残基并对其应用正确的编号。使用COOT中的水放置选项添加水分子，并使用REFMAC5(CCP4)细化完整模型。最终的Fab模型包含重链残基1至216(链H)和轻链残基1至212(链L)，其中在任一链中没有断裂。最终的黏结蛋白聚糖-1模型包含残基98至108(链A)。最终模型还包含205个水分子。最终Rwork＝21.2％，Rfree＝26.1％。
[表23]
数据收集、处理和细化统计
Figure BPA0000302829100001001
实施例4-FGFR3 Fynomer产生
人Fyn激酶的SH3结构域被成功用作支架来改造Fynomer多肽，该多肽以高亲和力和特异性与FGFR3靶蛋白结合。包含多于8.5×1010个单Fynomer克隆的专有噬菌体展示文库用于选择不同的重组FGFR3抗原。使用了不同的选择和筛选策略。在一种策略中，使用来源于人和/或猴(例如，食蟹猴、食蟹猕猴(Macaca fascicularis))的重组FGFR3同种型3B和FGFR3同种型3C用于选择表达与至少两种FGFR3剪接同种型(例如，3B和3C)特异性结合的Fynomer的噬菌体克隆。使用不同的FGFR3抗原和/或FGFR3抗原的组合进行数轮选择。Fynomer选择过程的一个目标是分离具有以下的Fynomer：(i)与FGFR3b和FGFR3c二者的选择性结合，(ii)与人和猴以及可能地小鼠的交叉反应性，以及(iii)内化结合受体的能力。该代表性实例描述了选择这样的Fynomer的过程。
使用重组人FGFR3b-Fc和FGFR3c-Fc作为靶标，我们成功地选择并分离了数个FynSH3来源结合蛋白家族，其能够与人FGFR3的两种剪接变体(FGFR3b和FGFR3c)结合。我们继续用最有前景的候选家族以进行进一步研究。
有趣的是，携带有RT环序列“EVYGPTPM”(SEQ ID NO：100)的Fyn SH3来源的多肽(称为FF2L4C3(SEQ ID NO：101))在选择过程期间富集并在29种受试抗FGFR3 Fynomer中显示出非常有前景的内化特性(参见图10)。更详细地，将5个其他序列家族排除在进一步分析之外。属于最有前景的序列家族的Fynomer显示出最好的亲和力和内化特性。
为了获得具有更高亲和力和改善的内化特性的Fyn SH3来源的FGFR3结合物，将FF2L4C3(SEQ ID NO：101)用作亲和力成熟的模板。RT环序列“EVYGPTP”(SEQ ID NO：131)保持恒定，并与随机n-src环库(repertoire)(其中在SEQ ID NO：99中的位置(X1)至(X4)处引入了4至6个随机氨基酸残基的段(stretch))组合。亲和力成熟文库生成过程与对于用随机n-src环克隆初始文库(如[25]中所述的“文库0”)所述的过程基本相同。
在初始和亲和力成熟选择之后，通过裂解物ELISA筛选富集的Fyn SH3来源多肽与FGFR3的结合。将编码Fyn SH3来源的结合蛋白质的DNA克隆到细菌表达载体pQE12(Qiagen)中，从而使所得构建体携带有C端myc-六组氨酸标签，如Grabulovski et al.[26]中所述。多肽以96孔格式在大肠杆菌(E.coli)细菌的胞质中表达并且制备200μL澄清裂解液/每孔，如Bertschinger et al.[27]中所述。简单地说，从琼脂板中挑选经转化的细菌菌落，并将其在圆底96孔板(Nunc，目录号163320)中在含100μg/mL氨苄青霉素和0.1％(w/v)葡萄糖的200μL 2xYT培养基中培养。在37℃下培养3小时并在200r.p.m下旋转振荡之后，通过添加1mM IPTG(Applichem，Germany)诱导蛋白质表达。蛋白质在旋转振荡器(200r.p.m.，30℃)中过夜表达。随后，将96孔板以1800g离心10分钟，并弃去上清液。使用BugBuster(注册商标)加Benzonase(注册商标)(Millipore 70750-3)裂解细菌沉淀物，并随后通过以1800×g离心10分钟来使裂解物澄清。将60μL裂解物与170μL PBS混合，并通过0.45μm Multiscreen滤板(Millipore MSHVN4510)过滤，以消除任何残余的细菌碎片。
将单克隆细菌裂解物用于ELISA。对于ELISA，将Maxisorp板用5μg/mL huFGFR3b-Fc、5μg/mL huFGFR3c-Fc或5μg/mL聚IgG包被过夜，并用2％MPBS封闭至少1小时。将包含具有C端myc-和六组氨酸肽标签的可溶性Fynomer的澄清裂解物添加在包含鼠单克隆抗myc标签抗体克隆9E10(Roche Applied Science 11 667 203 001)的2％MPBS中，添加至maxisorp板。通过抗小鼠IgG-辣根过氧化物酶缀合物(Sigma-Aldrich A2554)通过9E10来检测结合的Fynomer。通过添加BM蓝色POD底物(Roche)进行过氧化物酶活性的检测，并通过添加1M H2SO4终止反应。
通过DNA测序验证特异性结合物的DNA序列。
结果
与FGFR3b和FGFR3c特异性结合的代表性ELISA阳性Fyn SH3来源多肽的氨基酸序列以SEQ ID NO：101、103、105、107、109和111表示。Fyn-SH3来源的多肽SEQ ID NO：103、105、107和109是对来自在FF2L4C3(SEQ ID NO：101)亲和力成熟之后获得的大量分子中的结合物的选择，并且由于其改善的亲和力和内化特性而在此呈现(如本文中所示)。
获得并表征了多于80种来源于SEQ ID NO：101的Fynomer，每种均表现出与FGFR3b和FGFR3c的特异性结合，并表现出可期望的生物物理特性、亲和力和内化特性。具有SEQ IDNO：103、105、107、109和111的氨基酸序列的Fynomer是这些结合物的代表。
实施例5：本发明的Fyn SH3来源的多肽以高亲和力与人FGFR3b和FGFR3c结合。
该实施例示出了通过表面等离子体共振和流式细胞术实验对优选的Fyn SH3来源的FGFR3结合多肽的表征。
方法
a)通过BIAcore的亲和力测量
使用BIAcore T200仪器测量亲和力。使用氨基偶联试剂盒(GE HealthcareBR100633)用抗myc抗体9E10(Roche 11 667 203 001；包被密度为6000至8000RU)包被CM5系列S芯片(GE Healthcare BR-1005-30)上的一个流动池。
浓度为500nM的亲本Fynomer FF2L4C3(SEQ ID NO：101)和浓度为100nM的具有SEQID NO：103、105、107、109和111的Fynomer被捕获在9E10表面上随后注射不同浓度的huFGFR3b-Fc、huFGFR3c-Fc或cynoFGFR3c-Fc(0nM、3.9nM、7.8nM、15.6nM、31.25nM、62.5nM、125nM、250nM和500nM用于测量亲本Fynomer FF2L4C3，0nM、0.046nM、0.14nM、0.41nM、1.2nM、3.7nM、11.1nM、33.3nM和100nM用于具有SEQ ID NO：103、105、107、109和111的Fynomer)。记录传感图并使用BIAevaluation 2.1软件中的1.1朗缪尔相互作用(Langmuirinteraction)模型通过曲线拟合确定表观动力学常数。
b)通过流式细胞术的亲和力测量
使用KMS-11细胞(JCRB1179)作为FGFR3阳性细胞以及N87(ATCC，CRL-5822)作为FGFR3阴性对照细胞系，通过流式细胞术对Fynomer与细胞上huFGFR3的结合进行分析。KMS-11细胞和N87细胞二者均维持在RPMI1640培养基(Invitrogen 52400-25)中。所有培养基均补充有25U/mL青霉素、25μg/mL链霉素和10％FCS。为了从T150烧瓶中收获半黏附的KMS-11细胞，将上清液移至50mL falcon管中，并且将细胞用10ml PBS洗涤，也添加至falcon管中。向烧瓶添加2ml Accutase(Sigma A6964)，并在37℃下孵育10分钟。通过添加10ml培养基使Accutase失活并将其添加至falcon管，然后将其离心(250×g，5分钟)以使细胞沉淀。将细胞重悬于FACS缓冲液(PBS+1％FCS+0.2％叠氮化钠)中至细胞浓度为1×106个细胞/mL，并在96孔圆底板(Nunc 163320)中每孔使用100μL(1×105个细胞/孔)用于流式细胞术染色。对于黏附的N87细胞，弃去上清液和洗涤液，并且仅收集Accutase分离的细胞并制备。
将Fynomer与小鼠抗myc抗体(克隆9E10；Roche 11667149001)共孵育以允许细胞结合之前的myc标记的Fynomer的交联。将Fynomer稀释至1μM并在冰上与667nM 9E10抗myc抗体(摩尔比为3∶2)在FACS缓冲液中共孵育约10分钟。
将该混合物四分之一连续稀释低至Fynomer浓度为0.06nM(总共8个浓度)。对照包括浓度为10nM的：仅二抗9E10(无Fynomer；667nM 9E10)、仅细胞(仅FACS缓冲液)和抗FGFR3抗体(R&D系统；目录号MAB766)。将细胞在96孔板中离心(250×g，5分钟)并用上述样品重悬，然后在冰上孵育1小时。将板离心并洗涤(PBS+0.2％叠氮化钠)，然后再次离心。然后将50μL二抗抗mIgG Alexa488(Life Technologies A21202)以4μg/mL的浓度添加至细胞，然后在黑暗中于冰上孵育45分钟。将板离心并用PBS+0.2％叠氮化钠洗涤两次，然后重悬于FACS缓冲液中并进行FACS分析(Millipore Guava easyCyte 8HT)。
使用Prism 6进行FACS数据分析。转换数据(X＝logX)并使用非线性拟合，log(激动剂)vs.响应-可变斜率(4个参数)进行分析。
结果
a)通过BIAcore的亲和力测量
通过在BIAcore芯片上的实时相互作用分析对结合特性进行分析，揭示了所选FGFR3结合多肽的以下解离常数(KD)：
[表24]
FGFR 3结合的Fynomer与重组人FGFR3b、人FGFR3c和食蟹猴FGFR3c的结合的表观动力学常数。
Figure BPA0000302829100001041
考虑到在仅一轮亲和力成熟之后获得亚纳摩尔值的事实，与FGFR3b和FGFR3c结合的Fyn SH3来源的多肽(SEQ ID NO：101、103、105、107、109和111)的测量的表观亲和力(表24)出乎意料地高。此外，这些测量证实了Fyn SH3来源的多肽(SEQ ID NO：101、103、105、107、109和111)与两种人FGFR3同种型(FGFR3b和FGFR3c)和与食蟹猴FGFR3c(未测试与食蟹猴FGFR3b的结合)具有相当的结合特性。
b)通过流式细胞术的亲和力测量
使用FGFR3阳性KMS-11细胞和FGFR3阴性N87细胞作为阴性对照通过流式细胞术对结合特性进行分析。如表25和图11中所示，测量到所选FGFR3结合多肽的以下EC50值。
[表25]
在FGFR3阳性KMS-11细胞上确定的Fyn SH3来源的FGFR3结合多肽的EC50值。
Figure BPA0000302829100001051
在表达FGFR3的细胞系(图11A，KMS-11)上测量的低纳摩尔范围内的EC50值(表25)证实了通过表面等离子体共振测量的高表观亲和力(表24)，并表明了在细胞表面的自然环境下与FGFR3的结合。与FGFR3结合的所有Fyn SH3来源的多肽(SEQ ID NO：101、103、105、107、109和111)在不表达FGFR3的细胞系上未显示出非特异性结合(图11B)。
实施例6：对FGFR3具有特异性的本发明的Fyn SH3来源的多肽不干扰配体结合
如果用于结合同种型FGFR3b和FGFR3c二者的Fyn SH3来源的多肽不干扰配体(例 如，FGF1)结合，则是优选的，因为配体结合位点位于产生FGFR3b或FGFR3c的剪接位点附近。
出于验证Fyn SH3来源的多肽在存在其一个配体的情况下与FGFR3结合的能力的目的，建立了BIAcore实验以测量在存在或不存在FGF1(成纤维细胞生长因子1是FGFR3的主要配体之一)的情况下Fynomer与FGFR3的亲和力。
与用于测量亲和力的方法(如实施例5中所述)类似，在9E10表面上捕获浓度为100nM的Fynomer(以500nM的浓度使用的FF2L4C3-SEQ ID NO：101的情况除外)随后在存在或不存在200nM FGF1(R&D系统232-FA-025/CF)的情况下注射不同浓度的huFGFR3c-Fc(0nM、11nM、33nM、100nM)。记录传感图并使用BIAevaluation 2.1软件计算表观动力学常数。
结果
与溶液中存在或不存在200nM FGF1无关，Fyn SH3来源的多肽与huFGFR3c的结合没有改变，表明Fynomer与FGFR3的结合不干扰配体结合。表27示出了在存在或不存在200nMFGF1的情况下获得的动力学常数。
[表26]
Figure BPA0000302829100001061
虽然由于测定的可变性，在不存在FGF1的情况下的KDapp值与在实施例2中所示实验中获得的值(表24)略有不同，但是该实验表明，即使配体(在该情况下为FGF1)与配体结合位点结合，Fyn SH3来源的多肽也能够与FGFR3结合。由此我们得出结论，由在此描述的Fyn SH3来源的多肽结合的表位位于FGFR3的恒定区。
实施例7：本发明的Fyn SH3来源的多肽与FGFR3的结构域D1-D2结合。
通过ELISA测试Fyn-SH3来源的多肽与FGFR3结合的特异性。
将不同的抗原包被在板(Maxisorp板；Nunc 439454)上：huFGFR3b-Fc、huFGFR3c-Fc、cyFGFR3c-Fc、muFGFR3c-His、huD1-Fc、huD2-Fc、huD1-D2-Fc。
用100μL 5μg/mL(0.5μg/孔)的抗原包被板，并在4℃下孵育过夜。将孔用PBS洗涤3次，然后在RT下用200μL 4％MPBS封闭1小时。再次洗涤孔，并添加20μL包含15μg/mL 9E10的10％MPBS，然后添加80μl 250nM的Fynomer(200nM最终Fynomer浓度)。将孔在RT下孵育45分钟，然后洗涤，并添加100μL在2％MPBS中1∶1000稀释的抗小鼠IgG-HRP(Sigma A2554)。将孔在RT下孵育30分钟，然后用PBS中的0.1％Tween-20洗涤3次，并随后用PBS洗涤3次。向每孔添加100μL BM POD蓝色底物(Roche 11 484 281 001)，随后添加50μL 1M H2SO4以终止反应。使用Tecan M1000装置记录450nm至650nm的吸光度。
结果
如图12A至12F中所示，Fyn SH3来源的多肽均与食蟹猴和鼠FGFR3c具有交叉反应性。有趣的是，仅当结构域D1和D2物理连接时所有结合物才对存在的表位具有特异性(参见图12A至12F条huFGFR3-D1D2)，事实上，如果单结构域D1或D2(hFGFR3-D1或huFGFR3-D2)被固定在ELISA板上，则未观察到结合。
实施例8：本发明的Fyn SH3来源的多肽导致FGFR3的有效内化内化是在此描述的Fyn SH3来源的多肽的中心特征，并提供了使用这些结合物在胞内递送毒性载荷和/或融合蛋白(例如抗体)的机会。
为了评估与FGFR3结合的Fyn SH3来源的多肽在与靶标结合之后内化的能力，建立了基于细胞毒性剂胞内递送的内化测定。
该测定测量了与MMAF(单甲基澳瑞他汀F)缀合的9E10交联的抗FGFR3 Fynomer对KMS-11细胞的细胞毒性作用。MMAF是抗有丝分裂剂(阻断微管蛋白聚合)并且仅在内化进入细胞之后具有活性。因此，该测定表明了Fynomer如何良好地促进MMAF的内化。将50μL 2×105个细胞/mL的KMS-11细胞接种到96孔平底板(Coming Costar 3610)中，每孔给予10,000个细胞。将细胞孵育4小时以允许细胞黏附(37℃，5％CO2)。以3∶1的比例将Fynomer和9E10-MMAF混合。在RPMI培养基中制备4×Fynomer储液(4μM)和4×9E10-MMAF储液(1.33μM)(参见5.4.1节)并1∶1(40μl+40μL)混合。然后将该混合物三分之一系列稀释至1000nM至50pM的浓度范围。将50μL样品添加至50μL细胞(如上所接种的)，并孵育5天(37℃，5％CO2)。包括适当的对照、野生型Fynomer FynSH3、不含Fynomer的MMAF-9E10以及未添加任何试剂的细胞。所有样品均一式两份制备。5天之后，向每孔添加100μL Cell titer glo(Promega G7573)，并在黑暗中在轻轻振荡的情况下孵育10分钟。作为细胞生存力的读出，使用Tecan M1000装置测量发光。使用Prism 6进行分析。转换数据(X＝logX)，并使用非线性拟合，log(抑制剂)vs.响应-可变斜率(4个参数)进行分析。
结果
与用仅MMAF标记的二抗(图13A中的9E10)或在所有3个实验中所示的与MMAF-标记的9E10组合的野生型Fynomer FynSH3(图13A至13C，表示为FynSH3)处理的细胞相比，在此描述的所有Fyn SH3来源的FGFR3结合多肽均显示出细胞毒性(例如内化)的提高，仅在最高测试浓度下显示出细胞毒性，这可能是由于MMAF本身的毒性所致。图13示出了在不同实验中获得的细胞毒性谱，并且表27示出了针对不同FynSH3来源的FGFR3结合多肽获得的EC50。
[表27]
在内化测定中使用FGFR3+KMS-11细胞确定的Fyn SH3来源的FGFR3结合多肽的EC50值。
Figure BPA0000302829100001081
*注意：对于FF2L4C3，示出了在图13中所示的3个实验中获得的3个值。
图13和表27中所示的数据表明，亲和力提高也导致更有效的内化。
实施例9：显示出优异的结合和内化特性并来源于不同家族的替代Fyn-SH3来源的多肽
除来源于SEQ ID NO：99序列的家族之外，我们还鉴定了替代的Fynomer，FF40L54A5(GVTLFVALYDYEVMSTTALSFHKGEKFQILSQSPHGQYWEARSLTTGETGWIPSNYVAPVDSIQ；SEQ ID NO：116)，其还出乎意料地显示出优异的结合和内化特性，并与来源于SEQ ID NO：99的Fynomer共有可制造性和交叉反应性特性(参见表28)。Fynomer FF40L54A5预期不具有优异的内化特性，因为其序列来源于仅显示出非常差的内化特性的Fynomer。
表28总结了Fynomer FF40L54A5的特性。
[表28]
-部分1
Figure BPA0000302829100001091
-部分2
Figure BPA0000302829100001092
*：由于实验可变性的差异
-部分3
Figure BPA0000302829100001101
实施例10-Fynomer-抗体双特异性结合剂(Fynomab)
以下提供了制备双特异性结合剂的一个非限制性实例，其包含FGFR3结合Fynomer的一个实施方案和抗CD138单克隆抗体的一个实施方案。本文中公开的Fynomer的任何实施方案均可与本文中公开的抗CD138抗体或其结合部分的任何实施方案连接，以产生与FGFR3和与CD138特异性结合的双特异性结合剂。在该实施例中使用的FGFR3结合Fynomer被定名为FF48L66G7(“G7”，(SEQ ID NO：107))，其与定名为hF6的人源化抗CD138单克隆抗体连接。hF6抗体是人源化的IgG1/κ抗体，其包含SEQ ID NO：93的重链可变区和SEQ ID NO：44的轻链可变区。G7 Fynomer与小鼠FGFR3和人FGFR3二者特异性结合。G7 Fynomer还与FGFR3b和FGFR3c二者特异性结合。使用重组技术在hF6单克隆抗体的四个不同位置处通过接头GGGGSGGGGSGGGGS将G7 Fynomer共价连接。所述位置包括重链或轻链N端(分别表示为HN和LN)，以及重链或轻链C端(分别表示为HC和LC)(例如，参见图14)。简单地说，为了表达包含与重链N端融合的G7的hF6，产生了这样的核酸构建体，其包含指导位于编码接头之序列的5’并与该序列在框内的G7的表达的编码区以及指导hF6重链表达的编码区。然后将hF6-HN-G7构建体与指导hF6轻链表达的核酸构建体共转染到CHO细胞中。从细胞培养物上清液中分离所得包含IgG1/κ同种型的全长hF6抗体和G7 Fynomer的双特异性结合剂(hF6-HN-G7)并对其进行纯化。
类似地，为了表达包含与重链C端融合的G7的hF6，产生了这样的核酸构建体，其包含指导位于编码接头之序列的5’并与该序列在框内的hF6重链的表达的编码区以及指导G7表达的编码区。为了表达包含与轻链N端融合的G7的hF6，产生了这样的核酸构建体，其包含指导位于编码接头之序列的5’并与该序列在框内的G7的表达的编码区以及指导hF6轻链表达的编码区。为了表达包含与轻链C端融合的G7的hF6，产生了这样的核酸构建体，其包含指导位于编码接头之序列的5’并与该序列在框内的hF6轻链的表达的编码区以及指导G7表达的编码区。然后将指定的构建体与指导hF6相应重链或轻链表达的核酸构建体共转染到CHO细胞中。从细胞培养物上清液中分离所得包含IgG1/κ同种型的全长hF6抗体和G7 Fynomer的双特异性结合剂(即，hF6-HC-G7、hF6-LC-G7和hF6-LN-G7)并对其进行纯化。通过ELISA测定每种所得双特异性结合剂与CD138和FGFR3的结合，其结果在表29中示出。
[表29]
Figure BPA0000302829100001111
*NB＝未结合。
在表28中，定名为hF6-LC-G7的双特异性构建体指示G7 Fynomer与hF6抗体的轻链C末端的连接(例如，参见图14C的实施方案)，hF6-LN-G7指示G7 Fynomer与hF6抗体的轻链N末端的连接(例如，参见图14D的实施方案)，hF6-HC-G7指示G7 Fynomer与hF6抗体的重链C末端的连接(例如，参见图14A的实施方案)，以及hF6-HN-G7指示G7 Fynomer与hF6抗体的重链N末端的连接(例如，参见图14B的实施方案)。表28示出了所得双特异性结合剂保留了对小鼠FGFR3c和人CD138的特异性结合亲和力，如通过ELISA确定的。
转染CHO细胞(Chinese Hamster Ovary cell，中国仓鼠卵巢细胞)以在细胞表面上表达人FGFR3c(图16A)或人FGFR3b(图16B)。然后通过FAC分析示出代表性双特异性结合剂hF6-HN-G7与在经转染CHO细胞的细胞表面上表达的人FGFR3b(图16B)和人FGFR3c(图16A)二者的特异性结合。
表28和图16的代表性结合数据证明了双特异性结合剂保留了G7 Fynomer的结合特异性以及hF6抗CD138抗体的结合特异性。
实施例11-Fynomer/抗体(Fynomab)药物缀合物
将代表性双特异性结合剂hF6-S119C-HN-G7与式II的PBD毒素位点特异性地缀合以产生定名为hF6-S119C-HN-G7-II的代表性双特异性结合剂药物缀合物。hF6-S119C-HN-G7-II对表达人FGFR3b(图17B)和人FGFR3c(图17C)的CHO细胞表现出特异性细胞毒性，但在低于10000pM浓度下未表现出对未转染的CHO细胞的特异性杀伤(图17A)。在高浓度的药物缀合结合剂(即，＞10000pM)下观察到的细胞毒性最可能是由于高浓度毒素本身的非特异性杀伤所致，而与结合无关。
代表性双特异性结合剂药物缀合物hF6-HN-G7-II和hF6-LN-G7-II也表现出针对细胞系KMS-11(高CD138表达细胞系)和OPM-2(中等CD138表达细胞系)而不是针对ARH-77(阴性对照细胞系)的特异性细胞毒性(例如，参见图19)。
双特异性结合剂hF6-HN-G7的抗体部分(即，hF6)改造成在hF6抗体重链恒定区中的五个位置(即，S119、V282、T289、N361和V422)之一处并入半胱氨酸氨基酸替换，从而提供经半胱氨酸替换的抗体，定名为hF6-S119C、hF6-V282C、hF6-T289C、hF6-N361C和hF6-V422C。相应的双特异性结合剂分别被定名为hF6-S119C-HN-G7、hF6-V282C-HN-G7、hF6-T289C-HN-G7、hF6-N361C-HN-G7和hF6-V422C-HN-G7，其中“G7”指示存在与hF6的重链的N端连接的FF48L66G7 Fynomer。经改造的半胱氨酸残基为抗赘生物剂与每种双特异性结合剂的位点特异性缀合(site-specific conjugation，SSC)提供了缀合点。亲本hF6-HN-G7的代表性序列如下所示。虚下划线指示信号传导序列，单下划线表示Fynomer部分，双下划线表示任选的接头区，其后是hF6抗体的重链。指示了独立突变为半胱氨酸的每种氨基酸(即，A118、S119、S239、V282、T289、N361和V422)。
SEQ ID NO：125
[化34]
Figure BPA0000302829100001131
SEQ ID NO：125(续)
[化35]
Figure BPA0000302829100001141
将具有A118C、S119C、S239C、V282C、T289C、N361C和V422C的重链恒定区突变的双特异性结合剂(即双特异性结合剂hF6-A118C-HN-G7、hF6-S119C-HN-G7、hF6-S239C-HN-G7、hF6-V282C-HN-G7、hF6-T289C-HN-G7、hF6-N361C-HN-G7和hF6-V422C-HN-G7)的氨基酸序列提供为SEQ ID NO：135至141。
将每种代表性双特异性结合剂与式II的示例性毒性吡咯并苯并二氮
Figure BPA0000302829100001142
(PBD)缀合(另见图18)。使用修改的DHAA还原方案内部缀合随机缀合的双特异性结合剂。简单地说，将抗体试剂在dPBS中稀释至1.1mg，并在25至37℃下在偶尔旋转下用2×至20×稳定化的TCEP(键断裂剂(bond breaker))还原1至3小时。然后将样品用1mM EDTA缓冲液更换至dPBS中以去除TCEP，并使用2.5X DHAA在室温下氧化2.5小时。将抗体缓冲液更换至dPBS中以去除DHAA，并在室温下与8X毒素II一起孵育1.5小时。然后将缀合的试剂缓冲液更换至dPBS中，并通过nanodrop测定浓度。在较不严格的还原条件下实现了位点特异性缀合。将所得的位点特异性缀合的药物缀合双特异性结合剂定名为hF6-S119C-HN-G7-II、hF6-V282C-HN-G7-II、hF6-T289C-HN-G7-II、hF6-N361C-HN-G7-II和hF6-V422C-HN-G7-II。
使用“高CD138”表达细胞系(KMS11)、“中等CD138”细胞系(RT112)和阴性对照细胞系(ARH77)进行5天细胞毒性测定(N＝3)。细胞毒性测定的结果在以下表中和图20中示出。
[表30]
Figure BPA0000302829100001151
在体外毒性测定中针对KMS-11细胞(高表达CD138细胞系)、RT-112细胞、AN3CA细胞(CD138/FGFR3阳性细胞系)、HCC1806细胞(CD138/FGFR3阳性细胞系)(例如，参见图20)和其他细胞类型对定名为hF6-S119C-HN-G7-II、hF6-V282C-HN-G7-II和hF6-T289C-HN-G7-II的代表性药物缀合双特异性结合剂进行了测试。在下表中总结了细胞细胞毒性结果。
[表31]
Figure BPA0000302829100001161
在体内异种移植研究中以不同剂量对定名为hF6-S119C-HN-G7-II、hF6-V282C-HN-G7-II和hF6-T289C-HN-G7-II的代表性药物缀合双特异性结合剂进行了测试(图21)。简单地说，用5×106个An3CA或HCC1806细胞皮下接种免疫缺陷的雌性小鼠(品系：Nu/Nu)。使用数字卡尺测量肿瘤，并根据式0.5236*L*W2确定肿瘤体积。当肿瘤达到平均175mm3(AN3CA)或195mm3(HCC1806)时，将小鼠随机化并用指定的双特异性结合剂静脉内给药。结果总结在下表32(AN3CA)和33(ACC1806)中。
[表32]
(AN3CA异种移植总结表)
Figure BPA0000302829100001162
[表33]
(HCC1806异种移植总结表)
Figure BPA0000302829100001171
实施例12-某些代表性序列
人黏结蛋白聚糖-1(黏结蛋白聚糖-1)-UniProtKB-P18827
SEQ ID NO：1
Figure BPA0000302829100001172
小鼠黏结蛋白聚糖-1(黏结蛋白聚糖-1)-UniProtKB-P18828
SEQ ID NO：126
Figure BPA0000302829100001173
大鼠黏结蛋白聚糖-1(黏结蛋白聚糖-1)-UniProtKB-P26260
SEQ ID NO：127
Figure BPA0000302829100001174
Figure BPA0000302829100001181
恒河猴(Macaca mulatta)(猕猴(Rhesus macaque))黏结蛋白聚糖-1-UniProtKB-A0A1D5RIX8
SEQ ID NO：128
Figure BPA0000302829100001182
家犬(狗)(Canis familiaris)黏结蛋白聚糖-1-UniProtKB-E2RT70
SEQ ID NO：129
Figure BPA0000302829100001183
食蟹猕猴(食蟹猴)黏结蛋白聚糖-1
SEQ ID NO：130
Figure BPA0000302829100001184
人FGFR3同种型b(SEQ ID NO：97)
Figure BPA0000302829100001191
人FGFR3同种型c(SEQ ID NO：98)
Figure BPA0000302829100001192
实施例13-某些实施方案
A1.双特异性结合剂，其包含(a)与黏结蛋白聚糖-1(CD138)特异性结合的抗体或其抗原结合部分；以及(b)与成纤维细胞生长因子受体3(FGFR3)特异性结合的Fynomer。
A1.1.实施方案A1所述的双特异性结合剂，其中所述黏结蛋白聚糖-1是哺乳动物黏结蛋白聚糖-1。
A1.2.实施方案A1或A1.1所述的双特异性结合剂，其中所述黏结蛋白聚糖-1选自人黏结蛋白聚糖-1、小鼠黏结蛋白聚糖-1和猴黏结蛋白聚糖-1。
A1.3.实施方案A1至A1.2中任一项所述的双特异性结合剂，其中所述双特异性剂和/或所述抗体或其抗原结合部分与人黏结蛋白聚糖-1和小鼠黏结蛋白聚糖-1特异性结合。
A1.4.实施方案A1至A1.3中任一项所述的双特异性结合剂，其中所述双特异性剂和/或所述抗体或其抗原结合部分与人黏结蛋白聚糖-1和猴黏结蛋白聚糖-1特异性结合。
A1.5.实施方案A1至A1.4中任一项所述的双特异性结合剂，其中所述双特异性剂和/或所述抗体或其抗原结合部分与人黏结蛋白聚糖-1、小鼠黏结蛋白聚糖-1和猴黏结蛋白聚糖-1特异性结合。
A1.6.实施方案A1.2、A1.4或A1.5所述的双特异性结合剂，其中所述猴黏结蛋白聚糖-1包含在猕猴属的猴中表达、从其获得或从其分离的黏结蛋白聚糖-1。
A1.7.实施方案A1.6所述的双特异性结合剂，其中所述猴黏结蛋白聚糖-1是在食蟹猕猴(食蟹猴)物种的猴中表达、从其获得或从其分离的黏结蛋白聚糖-1。
A1.8.实施方案A1.6所述的双特异性结合剂，其中所述猴黏结蛋白聚糖-1包含SEQID NO：128或130的氨基酸序列或由其组成。
A2.实施方案A1.2至A1.8中任一项所述的双特异性结合剂，其中所述双特异性剂和/或所述抗体或其抗原结合部分以50nM或更低的KD与所述人黏结蛋白聚糖-1、所述猴黏结蛋白聚糖-1和/或所述小鼠黏结蛋白聚糖-1特异性结合。
A3.实施方案A1至A2中任一项所述的双特异性结合剂，其中所述抗体或其抗原结合部分与所述Fynomer共价连接。
A4.实施方案A1至A3中任一项所述的双特异性结合剂，其中所述抗体或其抗原结合部分与所述黏结蛋白聚糖-1的胞外区特异性结合。
A5.实施方案A1至A4中任一项所述的双特异性结合剂，其中所述抗体或其抗原结合部分与包含AGEGPKEGEAVVLP(SEQ ID NO：94)的氨基酸序列的多肽特异性结合。
A5.1.实施方案A1至A5中任一项所述的双特异性结合剂，其中所述抗体或其抗原结合部分与其他结合剂竞争结合，所述其他结合剂与包含AGEGPKEGEAVVLP(SEQ ID NO：94)的氨基酸序列或由其组成的多肽特异性结合。
A5.2.实施方案A1至A5.1中任一项所述的双特异性结合剂，其中所述抗体或其抗原结合部分与第二结合剂竞争与黏结蛋白聚糖-1的结合，所述第二结合剂包含以下或由以下组成：选自表1的CDR-L1、选自表2的CDR-L2、选自表3的CDR-L3、选自表6的CDR-H1、选自表7的CDR-H2和选自表8的CDR-H3。
A5.3.实施方案A5.2所述的双特异性结合剂，其中所述第二结合剂包含：具有与SEQ ID NO：3的氨基酸序列具有至少85％、至少90％、至少95％或100％同一性的氨基酸序列的CDR-L1，具有与SEQ ID NO：18的氨基酸序列具有至少85％、至少90％、至少95％或100％同一性的氨基酸序列的CDR-L2，具有与SEQ ID NO：28的氨基酸序列具有至少85％、至少90％、至少95％或100％同一性的氨基酸序列的CDR-L3，具有与SEQ ID NO：47的氨基酸序列具有至少85％、至少90％、至少95％或100％同一性的氨基酸序列的CDR-H1，具有与SEQID NO：60的氨基酸序列具有至少85％、至少90％、至少95％或100％同一性的氨基酸序列的CDR-H2，以及具有与SEQ ID NO：73的氨基酸序列具有至少85％、至少90％、至少95％或100％同一性的氨基酸序列的CDR-H3。
A5.4.实施方案A5.2所述的双特异性结合剂，其中所述第二结合剂包含：具有与SEQ ID NO：2的氨基酸序列具有至少85％、至少90％、至少95％或100％同一性的氨基酸序列的CDR-L1，具有与SEQ ID NO：17的氨基酸序列具有至少85％、至少90％、至少95％或100％同一性的氨基酸序列的CDR-L2，具有与SEQ ID NO：27的氨基酸序列具有至少85％、至少90％、至少95％或100％同一性的氨基酸序列的CDR-L3，具有与SEQ ID NO：47的氨基酸序列具有至少85％、至少90％、至少95％或100％同一性的氨基酸序列的CDR-H1，具有与SEQID NO：61的氨基酸序列具有至少85％、至少90％、至少95％或100％同一性的氨基酸序列的CDR-H2，以及具有与SEQ ID NO：73的氨基酸序列具有至少85％、至少90％、至少95％或100％同一性的氨基酸序列的CDR-H3。
A5.5.实施方案A5.4所述的双特异性结合剂，其中所述第二结合剂包含：具有与SEQ ID NO：16的氨基酸序列具有至少85％、至少90％、至少95％或100％同一性的氨基酸序列的CDR-L2，具有与SEQ ID NO：45或46的氨基酸序列具有至少85％、至少90％、至少95％或100％同一性的氨基酸序列的CDR-H1，以及具有与SEQ ID NO：72的氨基酸序列具有至少85％、至少90％、至少95％或100％同一性的氨基酸序列的CDR-H3。
A5.6.实施方案A5.2所述的双特异性结合剂，其中所述第二结合剂包含人源化轻链可变区和人源化重链可变区。
A5.7.实施方案A5.6所述的双特异性结合剂，其中所述第二结合剂包含：人源化轻链可变区，其具有与SEQ ID NO：41的氨基酸序列具有至少85％、至少90％、至少95％或100％同一性的氨基酸序列，以及人源化重链可变区，其具有与SEQ ID NO：90的氨基酸序列具有至少85％、至少90％、至少95％或100％同一性的氨基酸序列。
A5.8.实施方案A5.6所述的双特异性结合剂，其中所述第二结合剂包含：人源化轻链，其具有与SEQ ID NO：44的氨基酸序列具有至少85％、至少90％、至少95％或100％同一性的氨基酸序列，以及人源化重链，其具有与SEQ ID NO：93的氨基酸序列具有至少85％、至少90％、至少95％或100％同一性的氨基酸序列。
A6.实施方案A1至A5.1中任一项所述的双特异性结合剂，其中所述抗体或其抗原结合部分包含以下轻链互补决定区(CDR)：(i)CDR-L1(轻链CDR1)，其包含与选自SEQ IDNO：2至15的氨基酸序列具有90％同一性的氨基酸序列；(ii)CDR-L2(轻链CDR2)，其包含与选自SEQ ID NO：16至26的氨基酸序列具有至少85％或至少90％同一性的氨基酸序列；以及(iii)CDR-L3(轻链CDR3)，其包含与选自SEQ ID NO：27至33的氨基酸序列具有至少85％或至少90％同一性的氨基酸序列。
A6.1.实施方案A1至A5.1中任一项所述的双特异性结合剂，其中所述抗体或其抗原结合部分包含以下轻链互补决定区(CDR)：(i)包含选自SEQ ID NO：2至15的氨基酸序列或由其组成的CDR-L1(轻链CDR1)；(ii)包含选自SEQ ID NO：16至26的氨基酸序列或由其组成的CDR-L2(轻链CDR2)；以及(iii)包含选自SEQ ID NO：27至33的氨基酸序列或由其组成的CDR-L3(轻链CDR3)。
A7.实施方案A1至A5.1和A6至A6.1中任一项所述的双特异性结合剂，其中所述抗体或其抗原结合部分包含以下重链互补决定区(CDR)：包含与选自SEQ ID NO：45至59的氨基酸序列具有至少85％或至少90％同一性的氨基酸序列或由其组成的CDR-H1(重链CDR1)；(ii)包含与选自SEQ ID NO：60至71的氨基酸序列具有至少85％或至少90％同一性的氨基酸序列或由其组成的CDR-H2(重链CDR2)；(iii)包含与选自SEQ ID NO：72至81的氨基酸序列具有至少85％或至少90％同一性的氨基酸序列或由其组成的CDR-H3(重链CDR3)。
A7.1.实施方案A1至A5.1和A6至A6.1中任一项所述的双特异性结合剂，其中所述抗体或其抗原结合部分包含以下重链互补决定区(CDR)：包含选自SEQ ID NO：45至59的氨基酸序列或由其组成的CDR-H1(重链CDR1)；(ii)包含选自SEQ ID NO：60至71的氨基酸序列或由其组成的CDR-H2(重链CDR2)；(iii)包含选自SEQ ID NO：72至81的氨基酸序列或由其组成的CDR-H3(重链CDR3)。
A8.实施方案A6至A7.1中任一项所述的双特异性结合剂，其中所述CDR-L3选自SEQID NO：27或SEQ ID NO：29；所述CDR-L2选自SEQ ID NO：17或SEQ ID NO：20；并且所述CDR-L1选自SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：4。
A9.实施方案A6至A8中任一项所述的双特异性结合剂，其中所述CDR-H3选自SEQID NO：73或SEQ ID NO：75；所述CDR-H2选自SEQ ID NO：61或SEQ ID NO：63；并且所述CDR-H1选自SEQ ID NO：47或SEQ ID NO：50。
A10.实施方案A1至A9中任一项所述的双特异性结合剂，其中所述CDR-L1包含SEQID NO：2的氨基酸序列或由其组成，所述CDR-L2包含SEQ ID NO：17的氨基酸序列或由其组成，所述CDR-L3包含SEQ ID NO：27的氨基酸序列或由其组成，所述CDR-H1包含SEQ ID NO：47的氨基酸序列，所述CDR-H2包含SEQ ID NO：61的氨基酸序列或由其组成，并且所述CDR-H3包含SEQ ID NO：73的氨基酸序列或由其组成。
A10.1.实施方案A10所述的双特异性结合剂，其中所述抗体或其抗原结合部分包含：轻链可变区和重链可变区，所述轻链可变区包含与SEQ ID NO：41的氨基酸序列具有至少85％、至少90％、至少95％或100％同一性的氨基酸序列或由其组成，所述重链可变区包含与SEQ ID NO：90的氨基酸序列具有至少85％、至少90％、至少95％或100％同一性的氨基酸序列或由其组成。
A10.2.实施方案A10.1所述的双特异性结合剂，其中所述抗体或其抗原结合部分包含：轻链和重链，所述轻链包含与SEQ ID NO：44的氨基酸序列具有至少85％、至少90％、至少95％或100％同一性的氨基酸序列或由其组成，所述重链包含与SEQ ID NO：93的氨基酸序列具有至少85％、至少90％、至少95％或100％同一性的氨基酸序列或由其组成。
A11.实施方案A1至A9中任一项所述的双特异性结合剂，其中所述CDR-L1包含SEQID NO：4的氨基酸序列或由其组成，所述CDR-L2包含SEQ ID NO：20的氨基酸序列或由其组成，所述CDR-L3包含SEQ ID NO：29的氨基酸序列或由其组成，所述CDR-H1包含SEQ ID NO：50的氨基酸序列或由其组成，所述CDR-H2包含SEQ ID NO：63的氨基酸序列或由其组成，并且所述CDR-H3包含SEQ ID NO：75的氨基酸序列或由其组成。
A12.实施方案A1至A11中任一项所述的双特异性结合剂，其中所述抗体包含IgG、IgD、IgE、IgA或IgM的恒定区。
A13.实施方案A1至A12中任一项所述的双特异性结合剂，其中所述抗体或其抗原结合部分是嵌合抗体和/或人源化抗体。
A13.1.实施方案A13所述的双特异性结合剂，其中所述嵌合抗体包含人IgG1恒定结构域。
A13.2.实施方案A13或A13.1所述的双特异性结合剂，其中所述人源化抗体包含一个或更多个人框架区，或者1、2、3、4、5或更多个框架区，所述框架区包含与相应的人框架区具有至少85％、至少90％同一性、至少95％同一性或至少100％同一性的氨基酸序列或由其组成。
A14.实施方案A1至A13.2中任一项所述的双特异性结合剂，其中所述抗体或其抗原结合部分与人黏结蛋白聚糖-1的胞外结构域、猴黏结蛋白聚糖-1的胞外结构域和/或小鼠黏结蛋白聚糖-1的胞外结构域特异性结合。
A15.实施方案A1至A13中任一项所述的双特异性结合剂，其中所述抗体或其抗原结合部分以50nM或更小的结合亲和力(KD)与所述人黏结蛋白聚糖-1、所述猴黏结蛋白聚糖-1和/或所述小鼠黏结蛋白聚糖-1的胞外结构域特异性结合。
A16.实施方案A1至A15中任一项所述的双特异性结合剂，其中所述FGFR3是人成纤维细胞生长因子受体3(FGFR3)。
A17.实施方案A1至A16中任一项所述的双特异性结合剂，其中所述人FGFR3包含FGFR3同种型3b或FGFR3同种型3c。
A18.实施方案A16或A17所述的双特异性结合剂，其中所述Fynomer与人FGFR3同种型3b和FGFR3同种型3c特异性结合。
A19.实施方案A1至A18中任一项所述的双特异性结合剂，其中所述Fynomer包含：包含氨基酸序列EVMSTTA(SEQ ID NO：114)或由其组成的RT环和包含氨基酸序列SQSPH(SEQID NO：115)或由其组成的SRC环。
A20.实施方案A1至A19中任一项所述的双特异性结合剂，其中所述Fynomer包含具有与以下氨基酸序列具有至少85％、至少90％或至少95％同一性的氨基酸序列的多肽或由其组成：GVTLF-VALYDYEVMSTTALSFHKGEKFQILSQSPHGQYWEARSLTTGETG(X7)IPSNYV(SEQ IDNO：113)，其中在位置(X7)处的氨基酸是任何氨基酸。
A20.1.实施方案A1至A19中任一项所述的双特异性结合剂，其中所述Fynomer包含具有以下氨基酸序列的多肽或由其组成：GVTLFVALYDYEVMSTTALSFHKGEKFQILSQSPHGQYWEARSLTTGETG(X7)IPSNYVAPVDSIQ(SEQ ID NO：113)，其中在位置(X7)处的氨基酸是任何氨基酸。
A21.实施方案A20或A20.1所述的双特异性结合剂，其中(X7)选自N、R、W和K。
A22.实施方案A1至A18中任一项所述的双特异性结合剂，其中所述Fynomer包含含有氨基酸序列EVYGPTPM(SEQ ID NO：100)或由其组成的RT环。
A23.实施方案A1至A18或A22中任一项所述的双特异性结合剂，其中所述Fynomer包含与以下氨基酸序列具有至少85％、至少90％、至少95％或100％同一性的氨基酸序列的多肽或由其组成：GVTLFVALYDYEVYGPTPMLSFHKGEKFQIL(X1)(X2)(X3)(X4)GPYWEARSL(X5)TGETG(X6)IPSNYVAPVDSIQ(SEQ ID NO：99)，其中氨基酸(X1)、(X2)、(X3)、(X4)、(X5)和(X6)选自任何氨基酸。
A23.1.A23所述的双特异性结合剂，其中所述Fynomer包含以下氨基酸序列或由其组成：GVTLFVALYDYEVYG-PTPMLSFHKGEKFQIL(X1)(X2)(X3)(X4)GPYWEARSL(X5)TGETG(X6)IPSNYVAP VDSIQ(SEQ ID NO：99)，其中氨基酸(X1)、(X2)、(X3)、(X4)、(X5)和(X6)选自任何氨基酸。
A24.实施方案A23或A23.1所述的双特异性结合剂，其中
(X1)是N、R或K；
(X2)是S、G、K或R；
(X3)是S或G；
(X4)是E、Q、D、S或K；
(X5)是T或A；并且
(X6)是Y、W或L。
A25.实施方案A1至A18中任一项所述的双特异性结合剂，其中所述Fynomer包含含有与选自以下的氨基酸序列具有至少85％同一性、至少90％同一性、至少95％同一性或100％同一性的氨基酸序列的多肽：
Figure BPA0000302829100001261
A25.1.实施方案A1至A18中任一项所述的双特异性结合剂，其中所述Fynomer包含含有与SEQ ID NO：107的氨基酸序列具有至少85％同一性、至少90％同一性、至少95％同一性或100％同一性的氨基酸序列的多肽，其中在SEQ ID NO：107的第12至19位氨基酸处的氨基酸序列EVYGPTPM(SEQ ID NO：100)以及在SEQ ID NO：107的第37和38位氨基酸处的氨基酸P和Y是保守的，并且所述Fynomer与FGFR3特异性结合。
A25.2.实施方案A1至A18中任一项所述的双特异性结合剂，其中所述Fynomer包含含有与SEQ ID NO：107的氨基酸序列具有至少85％同一性、至少90％同一性、至少95％同一性或100％同一性的氨基酸序列的多肽，其中在SEQ ID NO：107的第12至19位氨基酸处的氨基酸序列EVYGPTPM(SEQ ID NO：100)以及在SEQ ID NO：107的第32至38位处的氨基酸是保守的，并且所述Fynomer与FGFR3特异性结合。
A25.3.实施方案A1至A18中任一项所述的双特异性结合剂，其中所述Fynomer包含多肽或由其组成，所述多肽包含SEQ ID NO：107的氨基酸序列或由其组成。
A25.4.实施方案A1至A25.3中任一项所述的双特异性结合剂，其中所述Fynomer与人FGFR3同种型b和FGFR3同种型c二者特异性结合。
A26.实施方案A1至A25.4中任一项所述的双特异性结合剂，其中所述Fynomer与所述FGFR3、FGFR3b或FGFR3c的胞外区特异性结合。
A27.实施方案A1至A26中任一项所述的双特异性结合剂，其中所述Fynomer以约10-5M至约10-15M的结合亲和力(KD)与所述FGFR3、FGFR3b、FGFR3c或其一部分特异性结合。
A28.实施方案A1至A27中任一项所述的双特异性结合剂，其中所述Fynomer以10-8M或更小的结合亲和力(KD)与所述FGFR3、FGFR3b、FGFR3c或其一部分特异性结合。
A29.实施方案A1至A28中任一项所述的双特异性结合剂，其中所述Fynomer为糖基化的。
A30.实施方案A1至A29中任一项所述的双特异性结合剂，其中所述Fynomer通过接头与所述抗体或其抗原结合部分共价连接。
A30.1实施方案A30所述的双特异性结合剂，其中所述接头包含肽键或由其组成。
A31.实施方案A30或A30.1所述的双特异性结合剂，其中所述接头包含肽或由其组成，所述肽包含一个或更多个氨基酸、5至100个氨基酸、5至50个氨基酸、5至25个氨基酸、5至20个氨基酸或5至10个氨基酸或由其组成。
A32.实施方案A30、A30.1或A31所述的双特异性结合剂，其中所述接头包含以下或由以下组成：任选经取代的C1-C50烷基、任选经取代的C2-C50烯基、任选经取代的C2-C50炔基、酰基、酰氧基、烷氧基羰氧基、芳氧基羰氧基、环烷基、环烯基、烷氧基、环烷氧基、芳基、杂芳基、芳基烷氧基羰基、烷氧基羰基酰基、氨基羰基、氨基羰基氧基、叠氮基、苯基、环烷基酰基、烷硫基、芳硫基、氧磺酰基、羧基、硫代、亚砜、砜、磺酸酯、硫氰基、酰胺、氨基、酯、卤化烷基，或其组合。
A33.实施方案A1至A29中任一项所述的双特异性结合剂，其中所述抗体或其抗原结合部分通过结合对与所述Fynomer非共价连接。
A34.实施方案A1至A33中任一项所述的双特异性结合剂，其中所述Fynomer与所述抗体或其抗原结合部分的重链或轻链的N末端连接。
A35.1.实施方案A1至A33中任一项所述的双特异性结合剂，其中所述Fynomer通过肽键与所述抗体的重链的N末端共价连接。
A35.2.实施方案A35.1所述的双特异性结合剂，其中所述Fynomer的C端氨基酸通过肽键与所述抗体的重链的N端氨基酸共价连接。
A35.3.实施方案A35.1所述的双特异性结合剂，其中所述Fynomer的C端氨基酸通过肽键与所述抗体的轻链的N端氨基酸共价连接。
A35.4.实施方案A1至A33中任一项所述的双特异性结合剂，其中所述Fynomer与所述抗体或其抗原结合部分的重链或轻链的羧基末端连接。
A35.5.实施方案A35.4所述的双特异性结合剂，其中所述Fynomer的N端氨基酸通过肽键与所述抗体的重链的羧基末端氨基酸共价连接。
A35.6.实施方案A35.4所述的双特异性结合剂，其中所述Fynomer的N端氨基酸通过肽键与所述抗体的轻链的羧基末端氨基酸共价连接。
A35.7.权利要求A1至A29中任一项所述的双特异性结合剂，其包含(i)所述Fynomer和SEQ ID NO：125的重链氨基酸序列，以及(ii)SEQ ID NO：44的轻链氨基酸序列。
A35.8.权利要求A1至A29中任一项所述的双特异性结合剂，其包含以下或由以下组成：(i)所述Fynomer和SEQ ID NO：125的重链氨基酸序列，其中在SEQ ID NO：125的第213位氨基酸处的丝氨酸突变为半胱氨酸，(ii)SEQ ID NO：44的轻链氨基酸序列，以及(iii)与所述半胱氨酸共价连接的赘生物剂。
A36.实施方案A1至A35.7中任一项所述的双特异性结合剂，其还包含抗赘生物剂。
A37.实施方案A35.8或A36所述的双特异性结合剂，其中所述抗赘生物剂选自：澳瑞他汀、尾海兔素、美登素、微管溶素、加利车霉素、吡咯并苯并二氮
Figure BPA0000302829100001281
(PBD)、倍癌霉素、多柔比星、假单胞菌外毒素-A(PE38)、伊立替康、以及前述任一种的衍生物。
A38.实施方案A35.8、A36或A37所述的双特异性结合剂，其中所述抗赘生物剂与所述双特异性结合剂共价或非共价连接。
A39.实施方案A38所述的双特异性结合剂，其中所述抗赘生物剂与所述抗体或其抗原结合部分连接。
A40.实施方案A38所述的双特异性结合剂，其中所述抗赘生物剂与所述Fynomer连接。
A41.实施方案A35.8至A40中任一项所述的双特异性结合剂，其中所述抗赘生物剂通过结合对与所述双特异性结合剂非共价连接。
A42.实施方案A35.8至A40中任一项所述的双特异性结合剂，其中所述抗赘生物剂通过接头与所述双特异性结合剂共价连接。
A43.实施方案A35.8至A42中任一项所述的双特异性结合剂，其中所述抗赘生物剂包含单甲基澳瑞他汀E(MMAE)或单甲基澳瑞他汀F(MMAF)。
A44.实施方案A35.8至A40和A42中任一项所述的双特异性结合剂，其中所述抗赘生物剂包含吡咯并苯并二氮
Figure BPA0000302829100001292
毒素和连接基或由其组成；
其中所述吡咯并苯并二氮
Figure BPA0000302829100001293
毒素与所述连接基共价连接，并且所述连接基与所述双特异性结合剂共价连接。
A45.实施方案A44所述的双特异性结合剂，其中所述吡咯并苯并二氮
Figure BPA0000302829100001294
毒素包含化学式I的结构或由其组成：
[化36]
Figure BPA0000302829100001291
其中
Z1和Z2均为N；
Z3和Z4均为C；
[化37]
双虚线
Figure BPA0000302829100001295
表示单键或双键；
n为1至10；R3和R4各自独立地为H或C1-4烷氧基；并且R1和R2各自独立地选自H、C1-5烷基、C3-6环烷基、C2-5烯基和任选地被R5取代的苯基，
其中R5选自-NH2、-NHR6和具有以下结构的被R7取代的哌嗪基，
[化38]
Figure BPA0000302829100001301
其中R6包含连接基，并且R7为H或C1-5烷基；
X1为空、保护基或者包含连接基；X2为空、保护基或者包含连接基；X1、X2、R1和R2中仅一个包含连接基；并且Y1和Y2各自独立地为空、OH或SO3；前提是：
[化39]
(i)当X1包含所述连接基或由其组成时，
Figure BPA0000302829100001302
为N-C，
(ii)当X2包含所述连接基或由其组成时，
Figure BPA0000302829100001303
为N-C，
(iii)当X1为所述保护基时，
Figure BPA0000302829100001304
为N-C，并且
(iv)当X2为所述保护基时，
Figure BPA0000302829100001305
为N-C，
其中空意指化学式I的结构中不存在指定部分或者指示存在一个或更多个氢，或者在没有明确指明的情况下，可存在一个或更多个氢以完成所需的化合价。
A46.实施方案A45所述的双特异性结合剂，其中n为3、4或5。
A47.实施方案A45或A46所述的双特异性结合剂，其中R3和R4均为-O-CH3。
A48.实施方案A45至A47中任一项所述的双特异性结合剂，其中R1和R2均为甲基。
A49.实施方案A45至A47中任一项所述的双特异性结合剂，其中R1和R2均为-CH＝CH-CH3。
A50.实施方案A45至A47中任一项所述的双特异性结合剂，其中R2为环丙基。
A51.实施方案A45至A47中任一项所述的双特异性结合剂，其中R2为被4-甲基哌嗪-1-基取代的苯基。
A52.实施方案A50或A51所述的双特异性结合剂，其中R1为任选地被R5取代的苯基，R5为-NHR6并且R6包含所述连接基或由其组成。
A53.实施方案A45至A47和A50至A52中任一项所述的双特异性结合剂，其中X1为空，Y1为空，
[化40]
Figure BPA0000302829100001311
为N＝C，X2为空，Y2为空，并且
Figure BPA0000302829100001312
为N＝C。
A54.实施方案A45至A51中任一项所述的双特异性结合剂，其中X1包含所述连接基或由其组成，Y1为OH，
[化41]
Figure BPA0000302829100001313
为N＝C，X2为空，并且Y2为空。
A55.实施方案A45至A51中任一项所述的双特异性结合剂，其中X1包含所述连接基或由其组成，Y1为OH，
[化42]
Figure BPA0000302829100001314
为N-C，X2为保护基，并且Y2为OH。
A56.实施方案A44至A55中任一项所述的双特异性结合剂，其中所述连接基通过氨基甲酸酯基团与所述吡咯并苯并二氮
Figure BPA0000302829100001316
毒素连接。
A57.实施方案A44至A55中任一项所述的双特异性结合剂，其中所述连接基通过酰胺基团与所述吡咯并苯并二氮
Figure BPA0000302829100001317
毒素连接。
A58.实施方案A44至A57中任一项所述的双特异性结合剂，其中所述连接基包含化学式A的结构或由其组成：
[化43]
Figure BPA0000302829100001315
其中星号表示与所述吡咯并苯并二氮
Figure BPA0000302829100001318
毒素的连接点；
波浪线表示与所述结合剂的连接点；
m为1至20；
q为0至10；并且
E为连接基团。
A59.实施方案A58所述的双特异性结合剂，其中m为4或8。
A60.实施方案A58或A59所述的双特异性结合剂，其中q为0、1或2。
A61.实施方案A58所述的双特异性结合剂，其中m为8且q为2。
A62.实施方案A44至A57中任一项所述的双特异性结合剂，其中所述连接基包含化学式B的结构或由其组成：
[化44]
Figure BPA0000302829100001321
其中
星号表示与所述吡咯并苯并二氮
Figure BPA0000302829100001322
毒素的连接点；
波浪线表示与所述结合剂的连接点；
E为连接基团；
v为0至10；并且
u为0或1；其中当u为1时，t为1至10。
A63.实施方案A62所述的双特异性结合剂，其中v为1。
A64.实施方案A62或A63所述的双特异性结合剂，其中u为1，并且t为8。
A65.实施方案A62所述的双特异性结合剂，其中u为0，并且v为4。
A66.实施方案A58至A65中任一项所述的双特异性结合剂，其中所述结合剂通过在所述结合剂的半胱氨酸巯基残基与E之间所形成的硫醚键与E连接。
A67.实施方案A58至A66中任一项所述的双特异性结合剂，其中E包含化学式C的结构或由其组成：
[化45]
Figure BPA0000302829100001331
其中波浪线表示与所述结合剂的连接点，并且双星号表示与所述连接基的连接点。
A68.实施方案A45至A67中任一项所述的双特异性结合剂，其中所述保护基具有以下结构(D)：
[化46]
Figure BPA0000302829100001332
其中星号表示与所述吡咯并苯并二氮
Figure BPA0000302829100001334
毒素的连接点；并且
w为1至5。
A69.实施方案A68所述的双特异性结合剂，其中w为2。
A70.实施方案A45至A69中任一项所述的双特异性结合剂，其中所述保护基是可切割的保护基。
A71.实施方案A44所述的双特异性结合剂，其中所述抗赘生物剂包含选自以下的结构或由其组成：
[化47]
Figure BPA0000302829100001333
其中m为8；
[化48]
Figure BPA0000302829100001341
其中m为8，p为3，并且X2为保护基；
[化49]
Figure BPA0000302829100001342
其中m为8；
[化50]
Figure BPA0000302829100001343
其中t为8，并且v为1；以及
[化51]
Figure BPA0000302829100001344
其中波浪线表示与所述结合剂的连接点。
A72.实施方案A71所述的双特异性结合剂，其中保护基X2具有以下结构(D)：
[化52]
Figure BPA0000302829100001351
其中星号表示与所述抗赘生物剂或PBD毒素的连接点；并且w为1至5。
A73.实施方案A44至A72中任一项所述的双特异性结合剂，其中所述结合剂的至少一个氨基酸突变为半胱氨酸，并且所述半胱氨酸通过硫醇醚键与所述连接基共价连接。
A73.1.实施方案A73所述的双特异性结合剂，其中所述抗体包含人IgG1或IgG2重链恒定区，并且所述抗体的重链恒定区的第119位处的丝氨酸突变为半胱氨酸，并且所述半胱氨酸通过硫醇醚键与所述连接基共价连接。
A73.2.实施方案A44至A72中任一项所述的双特异性结合剂，其中所述结合剂的至少一个氨基酸突变为赖氨酸，并且所述赖氨酸的游离氨基与所述连接基共价连接。
A74.实施方案A44或A73.2所述的双特异性结合剂，其中所述抗赘生物剂包含化学式(II)的结构或由其组成：
[化53]
Figure BPA0000302829100001352
其中m为8，并且波浪线表示与所述结合剂的巯基的连接点。
A75.药物组合物，其包含实施方案A1至A74中任一项所述的双特异性结合剂以及可药用赋形剂、稀释剂、添加剂或载体。
A76.实施方案A75所述的药物组合物，其中所述药物组合物配制成无菌冻干粉末。
A77.实施方案A75或A76所述的药物组合物，其中所述药物组合物配制成用于静脉内施用于哺乳动物。
A77.1.实施方案A75至A77中任一项所述的药物组合物，其用于治疗赘生物。
A77.2.实施方案A77.1所述的药物组合物，其中所述赘生物包含表达黏结蛋白聚糖-1的赘生性细胞或癌细胞。
A77.3.实施方案A77.1至A77.2中任一项所述的药物组合物，其中所述赘生物选自：上皮癌、肉瘤、神经系统赘生物形成、淋巴瘤、骨髓瘤、白血病、黑素瘤、间皮瘤、实体或软组织肿瘤和继发性癌症。
A77.4.实施方案A77.1至A77.3中任一项所述的药物组合物，其中所述赘生物选自：膀胱癌、乳腺癌、结直肠癌、胃癌、胰腺癌、食管癌、肝癌、肝细胞癌、下咽癌、肺癌、腺癌、卵巢癌和肾癌。
A77.5.实施方案A77.1至A77.3中任一项所述的药物组合物，其中所述赘生物选自：胰腺腺癌、胰腺神经内分泌癌、结直肠腺癌、小肠恶性肿瘤、胆管癌、非小细胞肺癌(NSCLC)、甲状腺癌、食管或食管胃交界部(EGJ)癌、胃腺癌、肝的肝细胞癌、头颈部鳞癌、女性生殖道恶性肿瘤、乳腺癌、三阴性乳腺癌、肺小细胞癌、卵巢表面上皮癌、腹膜后或腹膜肉瘤、前列腺腺癌、神经内分泌肿瘤、胃肠道间质瘤、胶质母细胞瘤和非上皮性卵巢癌。
A77.6.实施方案A77.1至A77.3中任一项所述的药物组合物，其中所述赘生物选自：多发性骨髓瘤、卵巢癌、宫颈癌、子宫内膜癌、甲状腺癌、睾丸癌、肾癌、胆囊癌、移行细胞膀胱癌、胃癌、前列腺癌、前列腺腺癌、乳腺癌、肺癌、结肠癌、霍奇金淋巴瘤和非霍奇金淋巴瘤和多发性骨髓瘤、慢性淋巴细胞白血病(CLL)、急性淋巴细胞白血病(ALL)、T细胞急性淋巴细胞白血病(T-ALL)、-细胞恶性肿瘤、-细胞急性淋巴细胞白血病(-ALL)、急性粒细胞白血病(AML)、实体组织肉瘤、结肠癌、非小细胞肺癌、鳞状细胞肺癌、结直肠癌、肝癌、胰腺癌、脑癌(例如，神经母细胞瘤或脑脊膜瘤)、皮肤癌(例如，黑素瘤、基底细胞癌或鳞状细胞癌)以及头颈癌。
A78.治疗患有或怀疑患有赘生物的对象的方法，其包括：
a)提供患有或怀疑患有赘生物的对象；以及
b)向所述对象施用治疗有效量的实施方案A1至A74中任一项所述的双特异性结合剂，或实施方案A75至A77中任一项所述的药物组合物。
A79.实施方案A78所述的方法，其中在所述施用之后，所述双特异性结合剂阻断、抑制、改善、消除或阻抑癌症的生长、生存力或转移。
A80.实施方案A78至A79中任一项所述的方法，其中在所述施用之后，所述双特异性结合剂诱导所述癌症中的一些或全部的死亡、坏死或凋亡。
A81.实施方案A78至A80中任一项所述的方法，其中所述赘生物包含以下或由以下组成：上皮癌、肉瘤、神经系统赘生物形成、淋巴瘤、骨髓瘤、白血病、黑素瘤、间皮瘤、实体或软组织肿瘤，或者继发性癌症。
A82.实施方案A81所述的方法，其中所述赘生物包含以下或由以下组成：膀胱癌、乳腺癌、结直肠癌、胃癌、胰腺癌、食管癌、肝癌、肝细胞癌、下咽癌、肺癌、腺癌、卵巢癌或肾癌。
A83.实施方案A81或A82所述的方法，其中所述赘生物包含以下或由以下组成：胰腺腺癌、胰腺神经内分泌癌、结直肠腺癌、小肠恶性肿瘤、胆管癌、非小细胞肺癌(NSCLC)、甲状腺癌、食管或食管胃交界部(EGJ)癌、胃腺癌、肝的肝细胞癌、头颈部鳞癌、女性生殖道恶性肿瘤、乳腺癌、三阴性乳腺癌、肺小细胞癌、卵巢表面上皮癌、腹膜后或腹膜肉瘤、前列腺腺癌、神经内分泌肿瘤、胃肠道间质瘤、胶质母细胞瘤或非上皮性卵巢癌。
A84.实施方案A81所述的方法，其中所述赘生物选自：多发性骨髓瘤、卵巢癌、宫颈癌、子宫内膜癌、甲状腺癌、睾丸癌、肾癌、胆囊癌、移行细胞膀胱癌、胃癌、前列腺癌、前列腺腺癌、乳腺癌、肺癌、结肠癌、霍奇金淋巴瘤和非霍奇金淋巴瘤和多发性骨髓瘤、慢性淋巴细胞白血病(CLL)、急性淋巴细胞白血病(ALL)、T细胞急性淋巴细胞白血病(T-ALL)、B细胞恶性肿瘤、B细胞急性淋巴细胞白血病(B-ALL)、急性粒细胞白血病(AML)、实体组织肉瘤、结肠癌、非小细胞肺癌、鳞状细胞肺癌、结直肠癌、肝癌、胰腺癌、脑癌(例如，神经母细胞瘤或脑脊膜瘤)、皮肤癌(例如，黑素瘤、基底细胞癌或鳞状细胞癌)以及头颈癌。
A85.实施方案A78至A84中任一项所述的方法，其还包括向所述对象施用化学治疗剂。
A86.实施方案A78至A85中任一项所述的方法，其中所述对象是人。
A87.实施方案A1至A74中任一项所述的双特异性结合剂，或实施方案A75至A77中任一项所述的药物组合物，其用于治疗患有或怀疑患有赘生物的对象。
A88.实施方案A78至A87中任一项所述的方法或用途，其中所述赘生物包含表达黏结蛋白聚糖-1或FGFR3的赘生性细胞或癌细胞。
A89.实施方案A78至A87中任一项所述的方法或用途，其中所述FGFR3是人FGFR3。
A90.实施方案A1至A89中任一项所述的双特异性结合剂，其中所述双特异性结合剂在与细胞表面上表达的黏结蛋白聚糖-1结合之后和/或在与细胞表面上表达的FGFR3结合之后被内化进入所述细胞中。
A91.权利要求A1至A90中任一项所述的双特异性结合剂，其包含(i)所述Fynomer和SEQ ID NO：125的重链氨基酸序列，以及(ii)SEQ ID NO：44的轻链氨基酸序列。
A92.权利要求A1至A90中任一项所述的双特异性结合剂，其包含(i)所述Fynomer和SEQ ID NO：125的重链氨基酸序列，其中在SEQ ID NO：125的第213位氨基酸处的丝氨酸突变为半胱氨酸，以及(ii)SEQ ID NO：44的轻链氨基酸序列，其中所述吡咯并苯并二氮
Figure BPA0000302829100001381
毒素与所述半胱氨酸的巯基共价连接。
B0.结合剂，其包含(a)与黏结蛋白聚糖-1(CD138)特异性结合的抗体或其抗原结合部分；以及(b)抗赘生物剂。
B1.实施方案B0所述的结合剂，其中所述抗体或其抗原结合部分与所述抗赘生物剂共价或非共价连接。
B2.实施方案B0或B1所述的结合剂，其中所述抗体或其抗原结合部分与所述黏结蛋白聚糖-1的胞外区特异性结合。
B3.实施方案B0至B2中任一项所述的结合剂，其中所述黏结蛋白聚糖-1是哺乳动物黏结蛋白聚糖-1。
B4.实施方案B0至B3中任一项所述的结合剂，其中所述抗体或其抗原结合部分与包含AGEGPKEGEAVVLP(SEQ ID NO：94)的氨基酸序列或由其组成的多肽特异性结合。
B5.实施方案B0至B4中任一项所述的结合剂，其中所述抗体或其抗原结合部分包含以下轻链互补决定区(CDR)：(i)包含与选自SEQ ID NO：2至15的氨基酸序列具有至少85％同一性或至少90％同一性的氨基酸序列或由其组成的CDR-L1(轻链CDR1)；(ii)包含与选自SEQ ID NO：16至26的氨基酸序列具有至少85％同一性或至少90％同一性的氨基酸序列或由其组成的CDR-L2(轻链CDR2)；以及(iii)包含与选自SEQ ID NO：27至33的氨基酸序列具有至少85％同一性或至少90％同一性的氨基酸序列或由其组成的CDR-L3(轻链CDR3)。
B6.实施方案B5所述的结合剂，其中所述CDR-L1选自SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：4；所述CDR-L2选自SEQ ID NO：17和SEQ ID NO：20；并且所述CDR-L3选自SEQ ID NO：27和SEQID NO：29。
B7.实施方案B0至B6中任一项所述的结合剂，其中所述抗体或其抗原结合部分包含以下重链互补决定区(CDR)：(i)包含与选自SEQ ID NO：45至59的氨基酸序列具有至少85％同一性或至少90％同一性的氨基酸序列或由其组成的CDR-H1(重链CDR1)；(ii)包含与选自SEQ ID NO：60至71的氨基酸序列具有至少85％同一性或至少90％同一性的氨基酸序列或由其组成的CDR-H2(重链CDR2)；以及(iii)包含与选自SEQ ID NO：72至81的氨基酸序列具有至少85％同一性或至少90％同一性的氨基酸序列或由其组成的CDR-H3(重链CDR3)。
B8.实施方案B0至B7中任一项所述的结合剂，其中所述CDR-H3选自SEQ ID NO：73和SEQ ID NO：75；所述CDR-H2选自SEQ ID NO：61和SEQ ID NO：63；并且所述CDR-H1选自SEQID NO：47和SEQ ID NO：50。
B9.实施方案B0至B8中任一项所述的结合剂，其中所述CDR-L1包含SEQ ID NO：2的氨基酸序列或由其组成，所述CDR-L2包含SEQ ID NO：17的氨基酸序列或由其组成，所述CDR-L3包含SEQ ID NO：27的氨基酸序列或由其组成，所述CDR-H1包含SEQ ID NO：47的氨基酸序列或由其组成，所述CDR-H2包含SEQ ID NO：61的氨基酸序列或由其组成，并且所述CDR-H3包含SEQ ID NO：73的氨基酸序列或由其组成。
B10.实施方案B0至B8中任一项所述的结合剂，其中所述CDR-L1包含SEQ ID NO：4的氨基酸序列或由其组成，所述CDR-L2包含SEQ ID NO：20的氨基酸序列或由其组成，所述CDR-L3包含SEQ ID NO：29的氨基酸序列或由其组成，所述CDR-H1包含SEQ ID NO：50的氨基酸序列或由其组成，所述CDR-H2包含包含SEQ ID NO：63的氨基酸序列或由其组成，并且所述CDR-H3包含SEQ ID NO：75的氨基酸序列或由其组成。
B11.实施方案B0至B10中任一项所述的结合剂，其中所述抗体包含IgG、IgD、IgE、IgA或IgM的恒定区。
B12.实施方案B0至B11中任一项所述的结合剂，其中所述抗体或其抗原结合部分是人源化的。
B13.实施方案B0至B12中任一项所述的结合剂，其中所述抗体或其抗原结合部分以50nM或更小的结合亲和力(KD)与人黏结蛋白聚糖-1特异性结合。
B14.实施方案B0至B13中任一项所述的结合剂，其中所述抗赘生物剂通过接头与所述抗体或其抗原结合部分共价连接。
B15.实施方案B14所述的结合剂，其中所述接头包含肽或由其组成，所述肽包含一个或更多个氨基酸、5至100个氨基酸、5至50个氨基酸、5至25个氨基酸、5至20个氨基酸或5至10个氨基酸。
B16.实施方案B14所述的结合剂，其中所述接头包含：任选经取代的C1-C50烷基、任选经取代的C2-C50烯基、任选经取代的C2-C50炔基、酰基、酰氧基、烷氧基羰氧基、芳氧基羰氧基、环烷基、环烯基、烷氧基、环烷氧基、芳基、杂芳基、芳基烷氧基羰基、烷氧基羰基酰基、氨基羰基、氨基羰基氧基、叠氮基、苯基、环烷基酰基、烷硫基、芳硫基、氧磺酰基、羧基、硫代、亚砜、砜、磺酸酯、硫氰基、酰胺、氨基、酯、卤化烷基，或其组合。
B17.实施方案B0至B16中任一项所述的结合剂，其中所述抗体或其抗原结合部分通过结合对与所述抗赘生物剂非共价连接。
B18.实施方案B0至B17中任一项所述的结合剂，其中所述抗赘生物剂与所述抗体或其抗原结合部分的重链或轻链的氨基末端连接。
B19.实施方案B0至B18中任一项所述的结合剂，其中所述抗赘生物剂与所述抗体或其抗原结合部分的重链或轻链的羧基末端连接。
B20.实施方案B0至B19中任一项所述的结合剂，其中所述抗赘生物剂选自：澳瑞他汀、尾海兔素、美登素、微管溶素、加利车霉素、倍癌霉素、多柔比星、假单胞菌外毒素-A(PE38)、伊立替康、以及前述任一种的衍生物。
B21.实施方案B0至B20中任一项所述的结合剂，其中所述抗赘生物剂包含单甲基澳瑞他汀E(MMAE)或单甲基澳瑞他汀F(MMAF)。
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除非上下文另有明确说明，否则本文中使用的所有数值或数值范围包括在这样的范围内的整数和在范围内的值或整数的分数。此外，当本文中描述了值的列表(例如，约50％、60％、70％、80％、85％或86％)时，该列表包括其所有中间值和分数值(例如，54％、85.4％)。因此，为了举例说明，提及80％或更高的同一性包括81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％等，以及81.1％、81.2％、81.3％、81.4％、81.5％等，82.1％、82.2％、82.3％、82.4％、82.5％等，如此等等。
提及带有“多于(大于)或小于”的整数分别包括大于或小于所提及数字的任何数字。因此，例如，提及小于100包括99、98、97等，一直向下至数字一(1)；并且小于10包括9、8、7等，一直向下至数字一(1)。
除非上下文另有明确说明，否则本文中使用的所有数值或范围包括在这样的范围内的值的分数和整数，以及在这样的范围内的整数的分数。因此，为了举例说明，提及数值范围，例如1至10，包括1、2、3、4、5、6、7、8、9、10，以及1.1、1.2、1.3、1.4、1.5等，如此等等。因此，提及1至50的范围包括1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20等，直至50并且包括50，以及1.1、1.2、1.3、1.4、1.5等，2.1、2.2、2.3、2.4、2.5等，如此等等。
提及范围系列包括将该系列内不同范围的边界的值进行组合的范围。因此，为了举例说明，提及范围系列，例如，1至10、10至20、20至30、30至40、40至50、50至60、60至75、75至100、100至150、150至200、200至250、250至300、300至400、400至500、500至750、750至1,000、1,000至1,500、1,500至2,000、2,000至2,500、2,500至3,000、3,000至3,500、3,500至4,000、4,000至4,500、4,500至5,000、5,500至6,000、6,000至7,000、7,000至8,000或8,000至9,000，包括范围10至50、50至100、100至1,000、1,000至3,000、2,000至4,000等。
可对前述内容进行修改而不脱离本技术的基本方面。虽然已参照一个或更多个具体实施方案相当详细地描述了本技术，但是本领域普通技术人员将认识到可对本申请中具体公开的实施方案进行改变，而这些修改和改进都在本技术的范围和精神内。
本文中使用肯定语言描述多个实施方案和方面来一般性地公开本发明。本发明还特别地包括其中排除(全部或部分地)特定主题(例如物质或材料、方法步骤和条件、方案或操作)的实施方案。例如，在本发明的某些实施方案或方面中，排除了材料和/或方法步骤。因此，即使本文中通常未在本发明不包含的内容方面对本发明进行表述，本文中也仍公开了在本发明中未明确排除的方面。
本文中举例说明性描述的技术适当地可在不存在本文中未具体公开的任何要素的情况下实施。因此，例如，在本文中的每种情况下，术语“包含/包括”、“基本上由......组成”和“由...组成”中任一个可用其他两个术语中的任一个替代。已使用的术语和表述用作描述性而不是限制性的术语，并且这样的术语和表述的使用不排除所示和所描述特征或其一部分的任何等同物，并且可在要求保护的技术的范围内进行多种修改。除非在上下文中清楚地描述了一个要素或多于一个要素，否则没有数量词修饰的名词可指其修饰的要素的一个/种或更多个/种(例如，“试剂”可意指一种或更多种试剂)。本文中使用的术语“约”是指在基础参数的10％内(即，加或减10％)的值，并且在一串值的开始使用术语“约”修饰每个值(即，“约1、2和3”是指约1、约2和约3)。例如，“约100克”的重量可包括90克至110克的重量。本文中使用的术语“基本上”是指值修饰语，意指“至少95％”、“至少96％”、“至少97％”、“至少98％”或“至少99％”并且可包括100％。例如，基本上不含X的组合物可包含少于5％、少于4％、少于3％、少于2％或少于1％的X，和/或X在该组合物中可不存在或检测不到。
因此，应理解，尽管已通过一些代表性实施方案和任选的特征具体公开了本技术，但是本领域技术人员可诉诸本文中公开的概念的修改和变化，并且这样的修改和变化被认为在该技术的范围内。
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Claims (147)

1.双特异性结合剂，其包含(a)与黏结蛋白聚糖-1(CD138)特异性结合的抗体或其抗原结合部分；以及(b)与成纤维细胞生长因子受体3(FGFR3)特异性结合的Fynomer，其中所述Fynomer包含具有与以下的氨基酸序列具有至少90％同一性的氨基酸序列的多肽：
(i)GVTLFVALYDYEVYGPTPMLSFHKGEKFQIL(X1)(X2)(X3)(X4)GPYWEARSL(X5)TGETG(X6)IPSNYVAPVDSIQ(SEQ ID NO：99)或(ii)GVTLFVALYDYEVMSTTALSFHKGEKFQIL-SQSPHGQYWEARSLTTGETG(X7)IPSNYVAPVDSIQ(SEQ ID NO：113)
其中氨基酸(X1)、(X2)、(X3)、(X4)、(X5)、(X6)和(X7)选自任何氨基酸。
2.权利要求1所述的双特异性结合剂，其中所述抗体或其抗原结合部分与所述Fynomer共价连接。
3.权利要求1或2所述的双特异性结合剂，其中所述抗体或其抗原结合部分与所述黏结蛋白聚糖-1的胞外区特异性结合。
4.权利要求1至3中任一项所述的双特异性结合剂，其中所述抗体或其抗原结合部分与包含AGEGPKEGEAVVLP(SEQ ID NO：94)的氨基酸序列的多肽特异性结合。
5.权利要求1至4中任一项所述的双特异性结合剂，其中所述抗体或其抗原结合部分与其他结合剂竞争结合，所述其他结合剂与包含AGEGPKEGEAVVLP(SEQ ID NO：94)的氨基酸序列的多肽特异性结合。
6.权利要求1至5中任一项所述的双特异性结合剂，其中所述抗体或其抗原结合部分包含以下轻链互补决定区(CDR)：(i)包含与选自SEQ ID NO：2至15的氨基酸序列具有至少85％同一性的氨基酸序列的CDR-L1(轻链CDR1)；(ii)包含与选自SEQ ID NO：16至26的氨基酸序列具有至少85％同一性的氨基酸序列的CDR-L2(轻链CDR2)，以及(iii)包含与选自SEQID NO：27至33的氨基酸序列具有至少85％同一性的氨基酸序列的CDR-L3(轻链CDR3)。
7.权利要求1至6中任一项所述的双特异性结合剂，其中所述抗体或其抗原结合部分包含以下重链互补决定区(CDR)：(i)包含与选自SEQ ID NO：45至59的氨基酸序列具有至少85％同一性的氨基酸序列的CDR-H1(重链CDR1)；(ii)包含与选自SEQ ID NO：60至71的氨基酸序列具有至少85％同一性的氨基酸序列的CDR-H2(重链CDR2)；以及(iii)包含与选自SEQID NO：72至81的氨基酸序列具有至少85％同一性的氨基酸序列的CDR-H3(重链CDR3)。
8.权利要求7所述的双特异性结合剂，其中
(i)所述CDR-L1包含与SEQ ID NO：3的氨基酸序列具有至少85％同一性的氨基酸序列或由其组成。
(ii)所述CDR-L2包含与SEQ ID NO：18的氨基酸序列具有至少85％同一性的氨基酸序列或由其组成；
(iii)所述CDR-L3包含与SEQ ID NO：28的氨基酸序列具有至少85％同一性的氨基酸序列或由其组成；
(iv)所述CDR-H1包含与SEQ ID NO：47的氨基酸序列具有至少85％同一性的氨基酸序列或由其组成；
(v)所述CDR-H2包含与SEQ ID NO：60的氨基酸序列具有至少85％同一性的氨基酸序列或由其组成；并且
(vi)所述CDR-H3包含与SEQ ID NO：73的氨基酸序列具有至少85％同一性的氨基酸序列或由其组成。
9.权利要求7或8所述的双特异性结合剂，其中
(i)所述CDR-L1包含与SEQ ID NO：2的氨基酸序列具有至少85％同一性的氨基酸序列或由其组成；
(ii)所述CDR-L2包含与SEQ ID NO：17的氨基酸序列具有至少85％同一性的氨基酸序列或由其组成；
(iii)所述CDR-L3包含与SEQ ID NO：27的氨基酸序列具有至少85％同一性的氨基酸序列或由其组成；
(iv)所述CDR-H1包含与SEQ ID NO：47的氨基酸序列具有至少85％同一性的氨基酸序列或由其组成；
(v)所述CDR-H2包含与SEQ ID NO：61的氨基酸序列具有至少85％同一性的氨基酸序列或由其组成；并且
(vi)所述CDR-H3包含与SEQ ID NO：73的氨基酸序列具有至少85％同一性的氨基酸序列或由其组成。
10.权利要求7至9中任一项所述的双特异性结合剂，其中所述CDR-L2包含与SEQ IDNO：16的氨基酸序列具有至少85％同一性的氨基酸序列或由其组成；所述CDR-H1包含与SEQID NO：46或SEQ ID NO：45的氨基酸序列具有至少85％同一性的氨基酸序列或由其组成；并且所述CDR-H3包含与SEQ ID NO：72的氨基酸序列具有至少85％同一性的氨基酸序列或由其组成。
11.权利要求7或8所述的双特异性结合剂，其中
(i)所述CDR-L1包含与SEQ ID NO：2的氨基酸序列具有至少85％同一性的氨基酸序列或由其组成；
(ii)所述CDR-L2包含与SEQ ID NO：16的氨基酸序列具有至少85％同一性的氨基酸序列或由其组成；
(iii)所述CDR-L3包含与SEQ ID NO：27的氨基酸序列具有至少85％同一性的氨基酸序列或由其组成；
(iv)所述CDR-H1包含与SEQ ID NO：45的氨基酸序列具有至少85％同一性的氨基酸序列或由其组成；
(v)所述CDR-H2包含与SEQ ID NO：60的氨基酸序列具有至少85％同一性的氨基酸序列或由其组成；并且
(vi)所述CDR-H3包含与SEQ ID NO：72的氨基酸序列具有至少85％同一性的氨基酸序列或由其组成。
12.权利要求7至11中任一项所述的双特异性结合剂，其中所述抗体或其抗原结合部分是人源化的。
13.权利要求1至12中任一项所述的双特异性结合剂，其中所述抗体或其抗原结合部分包含：包含选自SEQ ID NO：41、42和43的氨基酸序列的人源化轻链可变区，和/或包含选自SEQ ID NO：89、90、91和92的氨基酸序列的人源化重链可变区。
14.权利要求1至13中任一项所述的双特异性结合剂，其中所述抗体或其抗原结合部分包含：包含与SEQ ID NO：41的氨基酸序列具有至少85％同一性的氨基酸序列或由其组成的人源化轻链可变区，和/或包含与SEQ ID NO：90的氨基酸序列具有至少85％同一性的氨基酸序列或由其组成的人源化重链可变区。
15.权利要求14所述的双特异性结合剂，其中所述抗体或其抗原结合部分包含：包含与SEQ ID NO：44的氨基酸序列具有至少85％同一性的氨基酸序列或由其组成的人源化轻链，和/或包含与SEQ ID NO：93的氨基酸序列具有至少85％同一性的氨基酸序列或由其组成的人源化重链。
16.权利要求7所述的双特异性结合剂，其中
(i)所述CDR-L1包含与SEQ ID NO：5的氨基酸序列具有至少85％同一性的氨基酸序列或由其组成；
(ii)所述CDR-L2包含与SEQ ID NO：21的氨基酸序列具有至少85％同一性的氨基酸序列或由其组成；
(iii)所述CDR-L3包含与SEQ ID NO：30的氨基酸序列具有至少85％同一性的氨基酸序列或由其组成；
(iv)所述CDR-H1包含与SEQ ID NO：50的氨基酸序列具有至少85％同一性的氨基酸序列或由其组成；
(v)所述CDR-H2包含与SEQ ID NO：64或62的氨基酸序列具有至少85％同一性的氨基酸序列或由其组成；并且
(vi)所述CDR-H3包含与SEQ ID NO：75的氨基酸序列具有至少85％同一性的氨基酸序列或由其组成。
17.权利要求7或16所述的双特异性结合剂，其中
(i)所述CDR-L1包含与SEQ ID NO：4的氨基酸序列具有至少85％同一性的氨基酸序列或由其组成；
(ii)所述CDR-L2包含与SEQ ID NO：20的氨基酸序列具有至少85％同一性的氨基酸序列或由其组成；
(iii)所述CDR-L3包含与SEQ ID NO：29的氨基酸序列具有至少85％同一性的氨基酸序列或由其组成；
(iv)所述CDR-H1包含与SEQ ID NO：50的氨基酸序列具有至少85％同一性的氨基酸序列或由其组成；
(v)所述CDR-H2包含与SEQ ID NO：63的氨基酸序列具有至少85％同一性的氨基酸序列或由其组成；并且
(vi)所述CDR-H3包含与SEQ ID NO：75的氨基酸序列具有至少85％同一性的氨基酸序列或由其组成。
18.权利要求7、16和17中任一项所述双特异性结合剂，其中
所述CDR-L2包含与SEQ ID NO：19的氨基酸序列具有至少85％同一性的氨基酸序列或由其组成；所述CDR-HI包含与SEQ ID NO：48或49的氨基酸序列具有至少85％同一性的氨基酸序列或由其组成，并且所述CDR-H3包含与SEQ ID NO：74的氨基酸序列具有至少85％同一性的氨基酸序列或由其组成。
19.权利要求7所述的双特异性结合剂，其中
(i)所述CDR-L1包含与SEQ ID NO：7的氨基酸序列具有至少85％同一性的氨基酸序列或由其组成；
(ii)所述CDR-L2包含与SEQ ID NO：22的氨基酸序列具有至少85％同一性的氨基酸序列或由其组成；
(iii)所述CDR-L3包含与SEQ ID NO：30的氨基酸序列具有至少85％同一性的氨基酸序列或由其组成；
(iv)所述CDR-H1包含与SEQ ID NO：50的氨基酸序列具有至少85％同一性的氨基酸序列或由其组成；
(v)所述CDR-H2包含与SEQ ID NO：64或62的氨基酸序列具有至少85％同一性的氨基酸序列或由其组成；并且
(vi)所述CDR-H3包含与SEQ ID NO：76的氨基酸序列具有至少85％同一性的氨基酸序列或由其组成。
20.权利要求7或19所述的双特异性结合剂，其中
所述CDR-L1包含与SEQ ID NO：6的氨基酸序列具有至少85％同一性的氨基酸序列或由其组成；
所述CDR-L3包含与SEQ ID NO：29的氨基酸序列具有至少85％同一性的氨基酸序列或由其组成；
所述CDR-H1包含与SEQ ID NO：51的氨基酸序列具有至少85％同一性的氨基酸序列或由其组成；并且
所述CDR-H2包含与SEQ ID NO：63的氨基酸序列具有至少85％同一性的氨基酸序列或由其组成。
21.权利要求7所述的双特异性结合剂，其中：
(i)所述CDR-L1包含与SEQ ID NO：9的氨基酸序列具有至少85％同一性的氨基酸序列或由其组成；
(ii)所述CDR-L2包含与SEQ ID NO：23的氨基酸序列具有至少85％同一性的氨基酸序列或由其组成；
(iii)所述CDR-L3包含与SEQ ID NO：31的氨基酸序列具有至少85％同一性的氨基酸序列或由其组成；
(iv)所述CDR-H1包含与SEQ ID NO：53的氨基酸序列具有至少85％同一性的氨基酸序列或由其组成；
(v)所述CDR-H2包含与SEQ ID NO：66的氨基酸序列具有至少85％同一性的氨基酸序列或由其组成；并且
(vi)所述CDR-H3包含与SEQ ID NO：77的氨基酸序列具有至少85％同一性的氨基酸序列或由其组成。
22.权利要求7或21所述的双特异性结合剂，其中
(i)所述CDR-L1包含与SEQ ID NO：8的氨基酸序列具有至少85％同一性的氨基酸序列或由其组成；
(ii)所述CDR-L2包含与SEQ ID NO：23的氨基酸序列具有至少85％同一性的氨基酸序列或由其组成；
(iii)所述CDR-L3包含与SEQ ID NO：31的氨基酸序列具有至少85％同一性的氨基酸序列或由其组成；
(iv)所述CDR-H1包含与SEQ ID NO：53的氨基酸序列具有至少85％同一性的氨基酸序列或由其组成；
(v)所述CDR-H2包含与SEQ ID NO：65的氨基酸序列具有至少85％同一性的氨基酸序列或由其组成；并且
(vi)所述CDR-H3包含与SEQ ID NO：77的氨基酸序列具有至少85％同一性的氨基酸序列或由其组成。
23.权利要求7、21或22所述的双特异性结合剂，其中所述CDR-H1包含与SEQ ID NO：52的氨基酸序列具有至少85％同一性的氨基酸序列或由其组成。
24.权利要求7所述的双特异性结合剂，其中
(i)所述CDR-L1包含与SEQ ID NO：11的氨基酸序列具有至少85％同一性的氨基酸序列或由其组成；
(ii)所述CDR-L2包含与SEQ ID NO：24的氨基酸序列具有至少85％同一性的氨基酸序列或由其组成；
(iii)所述CDR-L3包含与SEQ ID NO：30的氨基酸序列具有至少85％同一性的氨基酸序列或由其组成；
(iv)所述CDR-H1包含与SEQ ID NO：50的氨基酸序列具有至少85％同一性的氨基酸序列或由其组成；
(v)所述CDR-H2包含与SEQ ID NO：64或62的氨基酸序列具有至少85％同一性的氨基酸序列或由其组成；并且
(vi)所述CDR-H3包含与SEQ ID NO：79的氨基酸序列具有至少85％同一性的氨基酸序列或由其组成。
25.权利要求7或24所述的双特异性结合剂，其中
(i)所述CDR-L1包含与SEQ ID NO：10的氨基酸序列具有至少85％同一性的氨基酸序列或由其组成；
(ii)所述CDR-L2包含与SEQ ID NO：24的氨基酸序列具有至少85％同一性的氨基酸序列或由其组成；
(iii)所述CDR-L3包含与SEQ ID NO：29的氨基酸序列具有至少85％同一性的氨基酸序列或由其组成；
(iv)所述CDR-H1包含与SEQ ID NO：50的氨基酸序列具有至少85％同一性的氨基酸序列或由其组成；
(v)所述CDR-H2包含与SEQ ID NO：67的氨基酸序列具有至少85％同一性的氨基酸序列或由其组成；并且
(vi)所述CDR-H3包含与SEQ ID NO：79的氨基酸序列具有至少85％同一性的氨基酸序列或由其组成。
26.权利要求7、24或25所述的双特异性结合剂，其中
所述CDR-H1包含与SEQ ID NO：54的氨基酸序列具有至少85％同一性的氨基酸序列或由其组成；
所述CDR-H3包含与SEQ ID NO：78的氨基酸序列具有至少85％同一性的氨基酸序列或由其组成。
27.权利要求7所述的双特异性结合剂，其中
(i)所述CDR-L1包含与SEQ ID NO：13的氨基酸序列具有至少85％同一性的氨基酸序列或由其组成；
(ii)所述CDR-L2包含与SEQ ID NO：25的氨基酸序列具有至少85％同一性的氨基酸序列或由其组成；
(iii)所述CDR-L3包含与SEQ ID NO：32的氨基酸序列具有至少85％同一性的氨基酸序列或由其组成；
(iv)所述CDR-H1包含与SEQ ID NO：56的氨基酸序列具有至少85％同一性的氨基酸序列或由其组成；
(v)所述CDR-H2包含与SEQ ID NO：69的氨基酸序列具有至少85％同一性的氨基酸序列或由其组成；并且
(vi)所述CDR-H3包含与SEQ ID NO：80的氨基酸序列具有至少85％同一性的氨基酸序列或由其组成。
28.权利要求7或27所述的双特异性结合剂，其中
(i)所述CDR-L1包含与SEQ ID NO：13的氨基酸序列具有至少85％同一性的氨基酸序列或由其组成；
(ii)所述CDR-L2包含与SEQ ID NO：25的氨基酸序列具有至少85％同一性的氨基酸序列或由其组成；
(iii)所述CDR-L3包含与SEQ ID NO：32的氨基酸序列具有至少85％同一性的氨基酸序列或由其组成；
(iv)所述CDR-H1包含与SEQ ID NO：56的氨基酸序列具有至少85％同一性的氨基酸序列或由其组成；
(v)所述CDR-H2包含与SEQ ID NO：68的氨基酸序列具有至少85％同一性的氨基酸序列或由其组成；并且
(vi)所述CDR-H3包含与SEQ ID NO：80的氨基酸序列具有至少85％同一性的氨基酸序列或由其组成。
29.权利要求7、27或28所述的双特异性结合剂，其中
所述CDR-H1包含与SEQ ID NO：55的氨基酸序列具有至少85％同一性的氨基酸序列或由其组成。
30.权利要求7所述的双特异性结合剂，其中
(i)所述CDR-L1包含与SEQ ID NO：15的氨基酸序列具有至少85％同一性的氨基酸序列或由其组成；
(ii)所述CDR-L2包含与SEQ ID NO：26的氨基酸序列具有至少85％同一性的氨基酸序列或由其组成；
(iii)所述CDR-L3包含与SEQ ID NO：33的氨基酸序列具有至少85％同一性的氨基酸序列或由其组成；
(iv)所述CDR-H1包含与SEQ ID NO：57或59的氨基酸序列具有至少85％同一性的氨基酸序列或由其组成；
(v)所述CDR-H2包含与SEQ ID NO：70的氨基酸序列具有至少85％同一性的氨基酸序列或由其组成；并且
(vi)所述CDR-H3包含与SEQ ID NO：81的氨基酸序列具有至少85％同一性的氨基酸序列或由其组成。
31.权利要求7或30所述的双特异性结合剂，其中，
(i)所述CDR-L1包含与SEQ ID NO：14的氨基酸序列具有至少85％同一性的氨基酸序列或由其组成；
(ii)所述CDR-L2包含与SEQ ID NO：26的氨基酸序列具有至少85％同一性的氨基酸序列或由其组成；
(iii)所述CDR-L3包含与SEQ ID NO：33的氨基酸序列具有至少85％同一性的氨基酸序列或由其组成；
(iv)所述CDR-H1包含与SEQ ID NO：59的氨基酸序列具有至少85％同一性的氨基酸序列或由其组成；
(v)所述CDR-H2包含与SEQ ID NO：71的氨基酸序列具有至少85％同一性的氨基酸序列或由其组成；并且
(vi)所述CDR-H3包含与SEQ ID NO：81的氨基酸序列具有至少85％同一性的氨基酸序列或由其组成。
32.权利要求7、30或31所述的双特异性结合剂，其中，
所述CDR-H1包含与SEQ ID NO：58的氨基酸序列具有至少85％同一性的氨基酸序列或由其组成。
33.权利要求1至7和16至32中任一项所述的双特异性结合剂，其中所述抗体或其抗原结合部分包含人源化轻链可变区和/或人源化重链可变区。
34.权利要求1至33中任一项所述的双特异性结合剂，其中所述抗体是包含人轻链恒定区和/或人重链恒定区的嵌合抗体。
35.权利要求1至34中任一项所述的双特异性结合剂，其中所述抗体或其抗原结合部分以50nM或更小的结合亲和力(KD)与人黏结蛋白聚糖-1特异性结合。
36.权利要求1至35中任一项所述的双特异性结合剂，其中所述FGFR3是FGFR3同种型3b或FGFR3同种型3c。
37.权利要求36所述的双特异性结合剂，其中所述Fynomer与人FGFR3同种型3b和所述FGFR3同种型3c特异性结合。
38.权利要求1至37中任一项所述的双特异性结合剂，其中所述Fynomer包含与SEQ IDNO：99的氨基酸序列具有至少95％同一性的氨基酸序列，其中同一性确定不包括位置(X1)至(X6)处的氨基酸，并且前提是SEQ ID NO：99的第12至19位氨基酸处的氨基酸序列EVYGPTPM(SEQ ID NO：100)是保守的并且SEQ ID NO：99的第37和38位氨基酸处的氨基酸P和Y是保守的。
39.权利要求1至37中任一项所述的双特异性结合剂，其中所述Fynomer包含与SEQ IDNO：113的氨基酸序列具有至少95％同一性的氨基酸序列，其中同一性确定不包括位置(X7)处的氨基酸，并且前提是SEQ ID NO：113的第12至18位氨基酸处的氨基酸序列EVMSTTA(SEQID NO：114)是保守的并且SEQ ID NO：113的第37和38位氨基酸处的氨基酸Q和Y是保守的。
40.权利要求1至37和39中任一项所述的双特异性结合剂，其中(X7)是Y、W或L。
41.权利要求40所述的双特异性结合剂，其中(X7)是W或L。
42.权利要求38所述的双特异性结合剂，其中
(X1)是N、R或K；
(X2)是S、G、K或R；
(X3)是S或G；
(X4)是E、Q、D、S或K；
(X5)是T或A；并且
(X6)是Y、W或L。
43.权利要求42所述的双特异性结合剂，其中，
(X1)是R或K；
(X2)是G、K或R；
(X3)是S；
(X4)是Q、D、S或K；
(X5)是T或A；并且
(X6)是W或L。
44.权利要求1至37中任一项所述的双特异性结合剂，其中所述Fynomer包含含有与选自以下的氨基酸序列具有至少90％同一性的氨基酸序列的多肽：
(SEQ ID NO：101；FF2L4C3)GVTLFVALYDYEVYGPTPMLSFHKGEKFQILNSSEGPYWEARSLTTGETGLIPSNYVAPVDSIQ；
(SEQ ID NO：103；FF44L65G12)GVTLFVALYDYEVYGPTPMLSFHKGEKFQILRGGOGPYWEARSLTTGETGLIPSNYVAPVDSIQ；
(SEQ ID NO：105；FF44L65G7)GVTLFVALYDYEVYGPTPMLSFHKGEKFQILRGGDGPYWEARSLTTGETGLIPSNYVAPVDSIQ；
(SEQ ID NO：107；FF48L66G7；“G7”)GVTLFVALYDYEVYGPTPMLSFHKGEKFQILKGGSGPYWEARSLTTGETGLIPSNYVAPVDSIQ；
(SEQ ID NO：109；FF43L65D5)GVTLFVALYDYEVYGPTPMLSFHKGEKFQILRKGKGPYWEARSLATGETGLIPSNYVAPVDSIQ；
(SEQ ID NO：111；FF44L65B7)GVTLFVALYDYEVYGPTPMLSFHKGEKFQILRRGSGPYWEARSLTTGETGLIPSNYVAPVDSIQ；以及
(SEQ ID NO：116；FF40L54A5)GVTLFVALYDYEVMSTTALSFHKGEKFQILSQSPHGQYWEARSLTTGETGWIPSNYVAPVDSIQ。
45.权利要求1至44中任一项所述的双特异性结合剂，其中所述Fynomer与FGFR3的胞外区特异性结合。
46.权利要求1至45中任一项所述的双特异性结合剂，其中所述Fynomer与FGFR3或其一部分以约10-5M至约10-15M的结合亲和力(KD)特异性结合。
47.权利要求1至46中任一项所述的双特异性结合剂，其中所述Fynomer与FGFR3或其一部分以约10-8M或更小的结合亲和力(KD)特异性结合。
48.权利要求1至47中任一项所述的双特异性结合剂，其中所述Fynomer是糖基化的。
49.权利要求1至48中任一项所述的双特异性结合剂，其中所述Fynomer通过接头与所述抗体或其抗原结合部分共价连接。
50.权利要求49所述的双特异性结合剂，其中所述接头包含肽键。
51.权利要求49或50所述的双特异性结合剂，其中所述接头包含含有一个或更多个氨基酸、5至100个氨基酸、5至50个氨基酸、5至25个氨基酸、5至20个氨基酸或5至10个氨基酸的肽。
52.权利要求49、50或51所述的双特异性粘合剂，其中所述接头包含任选经取代的C1-C50烷基、任选经取代的C2-C50烯基、炔基、酰基、酰氧基、烷氧基、芳氧基、环烷基、环烯基、环烷氧基、芳基、氨基羰基、叠氮基、羧基、硫代、亚砜、砜、磺酸酯、氰基、酰胺、氨基、酯或其组合。
53.权利要求1至52中任一项所述的双特异性结合剂，其中所述Fynomer与所述抗体或其抗原结合部分的重链或轻链的氨基末端连接。
54.权利要求1至52中任一项所述的双特异性结合剂，其中所述Fynomer与所述抗体或其抗原结合部分的重链或轻链的羧基末端连接。
55.权利要求1至54中任一项所述的双特异性结合剂，其还包含抗赘生物剂。
56.权利要求55所述的双特异性结合剂，其中所述抗赘生物剂选自尾海兔素、澳瑞他汀、美登素、微管溶素、加利车霉素、吡咯并苯并二氮
Figure FPA0000302829090000132
(PBD)、倍癌霉素、多柔比星、假单胞菌外毒素-A(PE38)、伊立替康、以及前述任一种的衍生物。
57.权利要求55或56所述的双特异性结合剂，其中所述抗赘生物剂与所述双特异性结合剂共价连接。
58.权利要求55至57中任一项所述的双特异性结合剂，其中所述抗赘生物剂与所述抗体或其抗原结合部分连接。
59.权利要求55至57中任一项所述的双特异性结合剂，其中所述抗赘生物剂与所述Fynomer连接。
60.权利要求55至59中任一项所述的双特异性结合剂，其中所述抗赘生物剂通过接头与所述双特异性结合剂共价连接。
61.权利要求55至60中任一项所述的双特异性结合剂，其中所述抗赘生物剂包含单甲基澳瑞他汀E(MMAE)或单甲基澳瑞他汀F(MMAF)。
62.权利要求55至61中任一项所述的双特异性结合剂，其中所述抗赘生物剂包含吡咯并苯并二氮
Figure FPA0000302829090000133
毒素。
63.权利要求62所述的双特异性结合剂，其中所述抗赘生物剂包含连接基，其中所述吡咯并苯并二氮
Figure FPA0000302829090000134
毒素与所述连接基共价连接，并且所述连接基与所述双特异性结合剂共价连接。
64.权利要求62或63所述的双特异性结合剂，其中所述吡咯并苯并二氮
Figure FPA0000302829090000135
毒素包含化学式I的结构：
[化1]
Figure FPA0000302829090000131
其中
Z1和Z2均为N；
Z3和Z4均为C；
[化2]
双虚线
Figure FPA0000302829090000141
表示单键或双键；
n为1至10；
R3和R4各自独立地为H或C1-4烷氧基；并且
R1和R2各自独立地选自H、C1-5烷基、C3-6环烷基、C2-5烯基和任选地被R5取代的苯基，其中
R5选自-NH2、-NHR6和具有以下结构的被R7取代的哌嗪基
[化3]
Figure FPA0000302829090000142
其中R6包含连接基，并且
R7为H或C1-5烷基；
X1为空、保护基或者包含连接基；
X2为空、保护基或者包含连接基；
X1、X2、R1和R2中仅一个包含连接基；并且Y1和Y2各自独立地为空、OH或SO3H；
前提是：
[化4]
(i)当X1包含连接基时，
Figure FPA0000302829090000143
为N-C，
(ii)当X2包含连接基时，
Figure FPA0000302829090000144
为N-C，
(iii)当X1为所述保护基时，
Figure FPA0000302829090000145
为N-C，并且
(iv)当X2为所述保护基时，
Figure FPA0000302829090000146
为N-C
其中空表示不存在该部分或存在一个或更多个氢以完成所需的化合价。
65.权利要求64所述的双特异性结合剂，其中n为3、4或5。
66.权利要求64或65所述的双特异性结合剂，其中R3和R4均为-O-CH3。
67.权利要求64至66中任一项所述的双特异性结合剂，其中R1和R2均为甲基。
68.权利要求64至66中任一项所述的双特异性结合剂，其中R1和R2均为-CH＝CH-CH3。
69.权利要求64至66中任一项所述的双特异性结合剂，其中R2为环丙基。
70.权利要求64至66中任一项所述的双特异性结合剂，其中R2为被4-甲基哌嗪-1-基取代的苯基。
71.权利要求69或70所述的双特异性结合剂，其中R1为任选地被R5取代的苯基，R5为-NHR6，并且R6包含所述连接基。
72.权利要求64至66和69至71中任一项所述的双特异性结合剂，其中X1为空，Y1为空，
[化5]
Figure FPA0000302829090000151
为N＝C，X2为空，Y2为空，并且
Figure FPA0000302829090000152
为N＝C。
73.权利要求64至70中任一项所述的双特异性结合剂，其中X1包含连接基，Y1为OH，
[化6]
Figure FPA0000302829090000153
为N＝C，X2为空，并且Y2为空。
74.权利要求64至70中任一项所述的双特异性结合剂，其中X1包含所述连接基，Y1为OH，
[化7]
Figure FPA0000302829090000154
为N-C，X2为保护基，并且Y2为OH。
75.权利要求64至74中任一项所述的双特异性结合剂，其中所述连接基通过氨基甲酸酯基团与所述吡咯并苯并二氮
Figure FPA0000302829090000155
毒素连接。
76.权利要求64至74中任一项所述的双特异性结合剂，其中所述连接基通过酰胺基团与所述吡咯并苯并二氮
Figure FPA0000302829090000156
毒素连接。
77.权利要求634至76中任一项所述的双特异性结合剂，其中所述连接基包含化学式(A)的结构：
[化8]
Figure FPA0000302829090000161
其中
星号表示与所述吡咯并苯并二氮
Figure FPA0000302829090000164
毒素的连接点；
波浪线表示与所述结合剂的连接点；
m为1至20；
q为0至10；并且
E为连接基团。
78.权利要求77所述的双特异性结合剂，其中m为4或8。
79.权利要求77或78所述的双特异性结合剂，其中q为0、1或2。
80.权利要求77所述的双特异性结合剂，其中m为8并且q为2。
81.权利要求64至76中任一项所述的双特异性结合剂，其中所述连接基包含化学式(B)的结构
[化9]
Figure FPA0000302829090000162
其中
星号表示与所述吡咯并苯并二氮
Figure FPA0000302829090000163
毒素的连接点；
波浪线表示与所述结合剂的连接点；
E为连接基团；
v为0至10；并且
u为0或1；其中当u为1时，t为1至10。
82.权利要求81所述的双特异性结合剂，其中v为1。
83.权利要求81或82所述的双特异性结合剂，其中u为1，并且t为8。
84.权利要求81所述的双特异性结合剂，其中u为0，并且v为4。
85.权利要求77至84中任一项所述的双特异性结合剂，其中所述结合剂通过在所述结合剂的半胱氨酸巯基残基与E之间所形成的硫醚键与E连接。
86.权利要求77至85中任一项所述的双特异性结合剂，其中E包含化学式(C)的结构：
[化10]
Figure FPA0000302829090000171
其中波浪线表示与所述结合剂的连接点，并且双星号表示与所述连接基的连接点。
87.权利要求64至86中任一项所述的双特异性结合剂，其中所述保护基具有以下结构(D)：
[化11]
Figure FPA0000302829090000172
其中星号表示与所述吡咯并苯并二氮
Figure FPA0000302829090000173
毒素的连接点；并且
w为1至5。
88.权利要求87所述的双特异性结合剂，其中w为2。
89.权利要求64至88中任一项所述的双特异性结合剂，其中所述保护基是可切割的保护基。
90.权利要求64所述的双特异性结合剂，其中所述抗赘生物剂包含选自以下的结构
[化12]
Figure FPA0000302829090000181
其中m为8；
[化13]
Figure FPA0000302829090000182
其中m为8，p为3，并且X2为保护基；[化14]
Figure FPA0000302829090000183
其中m为8；
[化15]
Figure FPA0000302829090000184
其中t为8，并且v为1；以及
[化16]
Figure FPA0000302829090000191
其中波浪线表示与结合剂的连接点。
91.权利要求90所述的双特异性结合剂，其中保护基X2具有以下结构(D)：
[化17]
Figure FPA0000302829090000192
其中星号表示与赘生物剂的连接点；并且w为1至5。
92.权利要求64至91中任一项所述的双特异性结合剂，其中所述结合剂的至少一个氨基酸突变为半胱氨酸，并且所述半胱氨酸通过硫醇醚键与所述连接基共价连接。
93.权利要求64或92所述的双特异性结合剂，其中所述抗赘生物剂包含化学式(II)的结构：
[化18]
Figure FPA0000302829090000193
其中m为8，并且波浪线表示与所述结合剂的巯基的连接点。
94.权利要求1至93中任一项所述的双特异性结合剂，其中所述抗体或其抗原结合部分与第二结合剂竞争与黏结蛋白聚糖-1的结合，所述第二结合剂包含：具有与选自SEQ IDNO：2至15的氨基酸序列具有至少85％、至少90％、至少95％或100％同一性的氨基酸序列的CDR-L1，具有与选自SEQ ID NO：16至26的氨基酸序列具有至少85％、至少90％、至少95％或100％同一性的氨基酸序列的CDR-L2，具有与选自SEQ ID NO：27至33的氨基酸序列具有至少85％、至少90％、至少95％或100％同一性的氨基酸序列的CDR-L3，具有与选自SEQ IDNO：45至59的氨基酸序列具有至少85％、至少90％、至少95％或100％同一性的氨基酸序列的CDR-H1，具有与选自SEQ ID NO：60至71的氨基酸序列具有至少85％、至少90％、至少95％或100％同一性的氨基酸序列的CDR-H2，以及具有与选自SEQ ID NO：72至81的氨基酸序列具有至少85％、至少90％、至少95％或100％同一性的氨基酸序列的CDR-H3。
95.权利要求94所述的双特异性结合剂，其中所述第二结合剂包含：具有与SEQ ID NO：3的氨基酸序列具有至少85％、至少90％、至少95％或100％同一性的氨基酸序列的CDR-L1，具有与SEQ ID NO：18的氨基酸序列具有至少85％、至少90％、至少95％或100％同一性的氨基酸序列的CDR-L2，具有与SEQ ID NO：28的氨基酸序列具有至少85％、至少90％、至少95％或100％同一性的氨基酸序列的CDR-L3，具有与SEQ ID NO：47的氨基酸序列具有至少85％、至少90％、至少95％或100％同一性的氨基酸序列的CDR-H1，具有与SEQ ID NO：60的氨基酸序列具有至少85％、至少90％、至少95％或100％同一性的氨基酸序列的CDR-H2，以及具有与SEQ ID NO：73的氨基酸序列具有至少85％、至少90％、至少95％或100％同一性的氨基酸序列的CDR-H3。
96.权利要求94所述的双特异性结合剂，其中所述第二结合剂包含：具有与SEQ ID NO：2的氨基酸序列具有至少85％、至少90％、至少95％或100％同一性的氨基酸序列的CDR-L1，具有与SEQ ID NO：17的氨基酸序列具有至少85％、至少90％、至少95％或100％同一性的氨基酸序列的CDR-L2，具有与SEQ ID NO：27的氨基酸序列具有至少85％、至少90％、至少95％或100％同一性的氨基酸序列的CDR-L3，具有与SEQ ID NO：47的氨基酸序列具有至少85％、至少90％、至少95％或100％同一性的氨基酸序列的CDR-H1，具有与SEQ ID NO：61的氨基酸序列具有至少85％、至少90％、至少95％或100％同一性的氨基酸序列的CDR-H2，以及具有与SEQ ID NO：73的氨基酸序列具有至少85％、至少90％、至少95％或100％同一性的氨基酸序列的CDR-H3。
97.权利要求95所述的双特异性结合剂，其中所述第二结合剂包含：具有与SEQ ID NO：16的氨基酸序列具有至少85％、至少90％、至少95％或100％同一性的氨基酸序列的CDR-L2，具有与SEQ ID NO：45或46的氨基酸序列具有至少85％、至少90％、至少95％或100％同一性的氨基酸序列的CDR-H1，以及具有与SEQ ID NO：72的氨基酸序列具有至少85％、至少90％、至少95％或100％同一性的氨基酸序列的CDR-H3。
98.权利要求94至97中任一项所述的双特异性结合剂，其中所述第二结合剂包含人源化轻链可变区和人源化重链可变区。
99.权利要求98所述的双特异性结合剂，其中所述第二结合剂包含：人源化轻链可变区，其具有与SEQ ID NO：41的氨基酸序列具有至少85％、至少90％、至少95％或100％同一性的氨基酸序列，以及人源化重链可变区，其具有与SEQ ID NO：90的氨基酸序列具有至少85％、至少90％、至少95％或100％同一性的氨基酸序列。
100.权利要求98或99所述的双特异性结合剂，其中所述第二结合剂包含：人源化轻链，其具有与SEQ ID NO：44的氨基酸序列具有至少85％、至少90％、至少95％或100％同一性的氨基酸序列，以及人源化重链，其具有与SEQ ID NO：93的氨基酸序列具有至少85％、至少90％、至少95％或100％同一性的氨基酸序列。
101.药物组合物，其包含权利要求1至100中任一项所述的双特异性结合剂以及可药用赋形剂、稀释剂、添加剂或载体。
102.权利要求101所述的药物组合物，其用于治疗赘生物。
103.权利要求102所述的药物组合物，其中所述赘生物包含表达黏结蛋白聚糖-1的赘生性细胞或癌细胞。
104.权利要求102或103所述的药物组合物，其中所述赘生物选自上皮癌、肉瘤、神经系统赘生物形成、淋巴瘤、骨髓瘤、白血病、黑素瘤、间皮瘤、实体或软组织肿瘤和继发性癌症。
105.治疗患有或怀疑患有赘生物的对象的方法，其包括：
a)提供患有或怀疑患有赘生物的对象；以及
b)向所述对象施用治疗有效量的权利要求1至100中任一项所述的双特异性结合剂或权利要求101至104中任一项所述的药物组合物。
106.权利要求105所述的方法，其中在所述施用之后，所述双特异性结合剂阻断、抑制、改善、消除或阻抑所述赘生物的生长、生存力或转移。
107.权利要求105至106中任一项所述的方法，其中在所述施用之后，所述双特异性结合剂诱导所述赘生物中的一些或全部的死亡、坏死或凋亡。
108.权利要求105至107中任一项所述的方法，其中所述赘生物包含上皮癌、肉瘤、神经母细胞瘤、胶质母细胞瘤、骨髓瘤、淋巴瘤、黑素瘤或者实体或软组织肿瘤。
109.权利要求108所述的方法，或权利要求102至104中任一项所述的药物组合物，其中所述赘生物包含膀胱癌、乳腺癌、结直肠癌、胃癌、胰腺癌、食管癌、肝癌、肝细胞癌、下咽癌、肺癌、腺癌、卵巢癌或肾癌。
110.权利要求108或109所述的方法，或者权利要求101至104中任一项所述的药物组合物，其中所述赘生物包含胰腺腺癌、胰腺神经内分泌癌、结直肠腺癌、小肠恶性肿瘤、胆管癌、非小细胞肺癌(NSCLC)、甲状腺癌、食管或食管胃交界部(EGJ)癌、胃腺癌、肝的肝细胞癌、头颈部鳞癌、女性生殖道恶性肿瘤、乳腺癌、三阴性乳腺癌、肺小细胞癌、卵巢表面上皮癌、腹膜后或腹膜肉瘤、前列腺腺癌、神经内分泌肿瘤、胃肠道间质瘤、胶质母细胞瘤或者非上皮性卵巢癌。
111.权利要求108所述的方法，或权利要求101至104中任一项所述的药物组合物，其中所述赘生物选自多发性骨髓瘤、卵巢癌、宫颈癌、子宫内膜癌、甲状腺癌、睾丸癌、肾癌、胆囊癌、移行细胞膀胱癌、胃癌、前列腺癌、前列腺腺癌、乳腺癌、肺癌、结肠癌、霍奇金淋巴瘤和非霍奇金淋巴瘤、慢性淋巴细胞白血病(CLL)、急性淋巴细胞白血病(ALL)、急性粒细胞白血病(AML)、T细胞急性淋巴细胞白血病(T-ALL)、实体组织肉瘤、结肠癌、非小细胞肺癌、鳞状细胞肺癌、结直肠癌、肝癌、胰腺癌、脑癌(例如，神经母细胞瘤或脑脊膜瘤)、皮肤癌(例如，黑素瘤、基底细胞癌或鳞状细胞癌)以及头颈癌。
112.权利要求105至111中任一项所述的方法，其还包括向所述对象施用化学治疗剂。
113.权利要求105至112中任一项所述的方法，其中所述对象是人。
114.权利要求1至100中任一项所述的双特异性结合剂或权利要求101至104中任一项所述的药物组合物，其用于治疗患有或怀疑患有赘生物的对象。
115.权利要求105至114中任一项所述的方法或用途，其中所述赘生物包含表达黏结蛋白聚糖-1或FGFR3的赘生性细胞或癌细胞。
116.权利要求101至104中任一项所述的药物组合物，其中所述赘生物选自膀胱癌、乳腺癌、结直肠癌、胃癌、胰腺癌、食管癌、肝癌、肝细胞癌、下咽癌、肺癌、腺癌、卵巢癌和肾癌。
117.权利要求101至104中任一项所述的药物组合物，其中所述赘生物选自胰腺腺癌、胰腺神经内分泌癌、结直肠腺癌、小肠恶性肿瘤、胆管癌、非小细胞肺癌(NSCLC)、甲状腺癌、食管或食管胃交界部(EGJ)癌、胃腺癌、肝的肝细胞癌、头颈部鳞癌、女性生殖道恶性肿瘤、乳腺癌、三阴性乳腺癌、肺小细胞癌、卵巢表面上皮癌、腹膜后或腹膜肉瘤、前列腺腺癌、神经内分泌肿瘤、胃肠道间质瘤、胶质母细胞瘤和非上皮性卵巢癌。
118.权利要求101至104中任一项所述的药物组合物，其中所述赘生物选自多发性骨髓瘤、卵巢癌、宫颈癌、子宫内膜癌、甲状腺癌、睾丸癌、肾癌、胆囊癌、移行细胞膀胱癌、胃癌、前列腺癌、前列腺腺癌、乳腺癌、肺癌、结肠癌、霍奇金淋巴瘤和非霍奇金淋巴瘤和多发性骨髓瘤、慢性淋巴细胞白血病(CLL)、急性淋巴细胞白血病(ALL)、T细胞急性淋巴细胞白血病(T-ALL)、急性粒细胞白血病(AML)、实体组织肉瘤、结肠癌、非小细胞肺癌、鳞状细胞肺癌、结直肠癌、肝癌、胰腺癌、脑癌(例如，神经母细胞瘤或脑脊膜瘤)、皮肤癌(例如，黑素瘤、基底细胞癌或鳞状细胞癌)以及头颈癌。
119.权利要求105至113中任一项所述的方法，或权利要求101至104中任一项所述的药物组合物，其中所述赘生物选自肾上腺皮质癌、膀胱尿路上皮癌、乳腺侵袭性癌、宫颈鳞状细胞癌、宫颈内腺癌、胆管癌、结肠腺癌、结直肠腺癌、淋巴样赘生物弥漫性大B细胞淋巴瘤、食管癌、多形性胶质母细胞瘤、胶质瘤、头颈部鳞状细胞癌、肾嫌色细胞癌、混合肾癌(KICH+KIRC+KIR)、肾的肾透明细胞癌、肾的肾乳头状细胞癌、急性髓性白血病、脑低级别胶质瘤、肝的肝细胞癌、肺腺癌、肺鳞状细胞癌、间皮瘤、卵巢浆液性囊腺癌、胰腺腺癌、嗜铬细胞瘤和副神经节瘤、前列腺腺癌、直肠腺癌、肉瘤、皮肤的皮肤黑素瘤、胃腺癌、胃和食管癌、睾丸生殖细胞肿瘤、甲状腺癌、胸腺瘤、子宫体子宫内膜癌、子宫癌肉瘤、以及葡萄膜黑素瘤。
120.权利要求105至113中任一项所述的方法，其中所述赘生物是膀胱癌。
121.权利要求104至113中任一项所述的方法，其中所述赘生物是多发性骨髓瘤。
122.权利要求105至113中任一项所述的方法，其中所述赘生物是食管癌。
123.双特异性结合剂，其包含
(a)抗体或其抗原结合部分，其包含以下互补决定区(CDR)：
(i)CDR-L1，所述CDR-L1包含与SEQ ID NO：3的氨基酸序列具有至少85％同一性的氨基酸序列或由其组成；
(ii)CDR-L2，所述CDR-L2包含与SEQ ID NO：18的氨基酸序列具有至少85％同一性的氨基酸序列或由其组成；
(iii)CDR-L3，所述CDR-L3包含与SEQ ID NO：28的氨基酸序列具有至少85％同一性的氨基酸序列或由其组成；
(iv)CDR-H1，所述CDR-H1包含与SEQ ID NO：47的氨基酸序列具有至少85％同一性的氨基酸序列或由其组成；
(v)CDR-H2，所述CDR-H2包含与SEQ ID NO：60的氨基酸序列具有至少85％同一性的氨基酸序列或由其组成；和
(vi)CDR-H3，所述CDR-H3包含与SEQ ID NO：73的氨基酸序列具有至少85％同一性的氨基酸序列或由其组成，其中所述抗体或其抗原结合部分与黏结蛋白聚糖-1(CD138)特异性结合；以及
(b)Fynomer，所述Fynomer包含具有与SEQ ID NO：107的氨基酸序列具有至少85％同一性的氨基酸序列的多肽或由其组成，其中所述Fynomer与成纤维细胞生长因子受体3(FGFR3)特异性结合。
124.权利要求123所述的双特异性结合剂，其中
(i)所述CDR-L1包含与SEQ ID NO：2的氨基酸序列具有至少85％同一性的氨基酸序列或由其组成；
(ii)所述CDR-L2包含与SEQ ID NO：17的氨基酸序列具有至少85％同一性的氨基酸序列或由其组成；
(iii)所述CDR-L3包含与SEQ ID NO：27的氨基酸序列具有至少85％同一性的氨基酸序列或由其组成；
(iv)所述CDR-H1包含与SEQ ID NO：47的氨基酸序列具有至少85％同一性的氨基酸序列或由其组成；
(v)所述CDR-H2包含与SEQ ID NO：61的氨基酸序列具有至少85％同一性的氨基酸序列或由其组成；并且
(vi)所述CDR-H3包含与SEQ ID NO：73的氨基酸序列具有至少85％同一性的氨基酸序列或由其组成。
125.权利要求123所述的双特异性结合剂，其中
(i)所述CDR-L1包含与SEQ ID NO：2的氨基酸序列具有至少85％同一性的氨基酸序列或由其组成；
(ii)所述CDR-L2包含与SEQ ID NO：16的氨基酸序列具有至少85％同一性的氨基酸序列或由其组成；
(iii)所述CDR-L3包含与SEQ ID NO：27的氨基酸序列具有至少85％同一性的氨基酸序列或由其组成；
(iv)所述CDR-H1包含与SEQ ID NO：45的氨基酸序列具有至少85％同一性的氨基酸序列或由其组成；
(v)所述CDR-H2包含与SEQ ID NO：60的氨基酸序列具有至少85％同一性的氨基酸序列或由其组成；并且
(vi)所述CDR-H3包含与SEQ ID NO：72的氨基酸序列具有至少85％同一性的氨基酸序列或由其组成。
126.权利要求123、124或125所述的双特异性结合剂，其中所述抗体或其抗原结合部分包含：包含与SEQ ID NO：41的氨基酸序列具有至少85％同一性的氨基酸序列或由其组成的人源化轻链可变区，和/或包含与SEQ ID NO：90的氨基酸序列具有至少85％同一性的氨基酸序列或由其组成的人源化重链可变区。
127.权利要求126所述的双特异性结合剂，其中所述抗体或其抗原结合部分包含：包含与SEQ ID NO：44的氨基酸序列具有至少85％同一性的氨基酸序列或由其组成的人源化轻链，和/或包含与SEQ ID NO：93的氨基酸序列具有至少85％同一性的氨基酸序列或由其组成的人源化重链。
128.权利要求123至127中任一项所述的双特异性结合剂，其中所述抗体或其抗原结合部分与猴黏结蛋白聚糖-1的胞外结构域特异性结合。
129.权利要求123至128中任一项所述的双特异性结合剂，其中所述抗体或其抗原结合部分与人黏结蛋白聚糖-1、猴黏结蛋白聚糖-1和小鼠黏结蛋白聚糖-1以50nM或更小的结合亲和力(KD)特异性结合。
130.权利要求123至129中任一项所述的双特异性结合剂，其中所述抗体包含人IgG的重链恒定区，并且所述重链恒定区包含选自以下的氨基酸替换：A118C(第118位的丙氨酸替换为半胱氨酸)、S119C(第119位的丝氨酸替换为半胱氨酸)、S239C(第239位的丝氨酸替换为半胱氨酸)、V282C(第282位的缬氨酸替换为半胱氨酸)、T289C(第289位的苏氨酸替换为半胱氨酸)、N361C(第361位的天冬酰胺替换为半胱氨酸)、V422C(第422位的缬氨酸替换为半胱氨酸)、A118K(第118位的丙氨酸替换为赖氨酸)、S119K(第119位的丝氨酸替换为赖氨酸)、S239K(第239位的丝氨酸替换为赖氨酸)、V282K(第282位的缬氨酸替换为赖氨酸)、T289K(第289位的苏氨酸替换为赖氨酸)、N361K(第361位的天冬酰胺替换为赖氨酸)和V422K(第422位的缬氨酸替换为赖氨酸)。
131.权利要求123至129中任一项所述的双特异性结合剂，其中所述抗体包含人IgG的重链恒定区，并且所述重链恒定区包含在所述重链恒定区的第119位的丝氨酸至半胱氨酸的氨基酸替换。
132.权利要求123至131中任一项所述的双特异性结合剂，其中所述Fynomer与人FGFR3同种型3b和人FGFR3同种型3c特异性结合。
133.权利要求123至132中任一项所述的双特异性结合剂，其中所述Fynomer的羧基末端(C端)与所述抗体或其结合部分的重链可变区的氨基末端(N端)连接，其中所述Fynomer通过肽键与所述抗体重链可变区连接。
134.根据权利要求123至133中任一项所述的双特异性结合剂，其中所述双特异性结合剂包含抗赘生物剂。
135.权利要求134所述的双特异性结合剂，其中所述抗赘生物剂包含吡咯并苯并二氮
Figure FPA0000302829090000261
毒素。
136.权利要求135所述的双特异性结合剂，其中所述吡咯并苯并二氮
Figure FPA0000302829090000273
毒素包含以下所示的化学式VIII的结构：
[化19]
Figure FPA0000302829090000271
其中X1包含连接基。
137.权利要求135或136所述的双特异性结合剂，其中所述吡咯并苯并二氮
Figure FPA0000302829090000274
毒素包含以下所示的化学式II的结构：
[化20]
Figure FPA0000302829090000272
其中m为8，所述吡咯并苯并二氮
Figure FPA0000302829090000275
毒素与所述抗体或其抗原结合部分的重链共价连接，并且波浪线表示所述吡咯并苯并二氮
Figure FPA0000302829090000276
毒素与所述结合剂的巯基的连接点。
138.权利要求137所述的双特异性结合剂，其中(i)所述抗体包含人IgG的重链恒定区，(ii)所述重链恒定区包含在所述重链恒定区的第119位的丝氨酸至半胱氨酸的氨基酸替换，并且(iii)所述吡咯并苯并二氮
Figure FPA0000302829090000277
毒素与位于所述重链恒定区的第119位的所述半胱氨酸的巯基共价连接。
139.权利要求123至138中任一项所述的双特异性结合剂，其包含Fynomer以及SEQ IDNO：125的重链氨基酸序列和SEQ ID NO：44的轻链氨基酸序列。
140.权利要求135至138中任一项所述的双特异性结合剂，其包含：(i)所述Fynomer和SEQ ID NO：125的重链氨基酸序列，其中SEQ ID NO：125的第213位氨基酸处的丝氨酸突变为半胱氨酸，以及(ii)SEQ ID NO：44的轻链氨基酸序列，其中所述吡咯并苯并二氮
Figure FPA0000302829090000281
毒素与所述半胱氨酸的巯基共价连接。
141.治疗患有或怀疑患有赘生物的对象的方法，其包括：
a)提供患有或怀疑患有赘生物的对象；以及
b)向所述对象施用治疗有效量的权利要求123至140中任一项所述的双特异性结合剂。
142.权利要求141所述的方法，其中所述赘生物包含上皮癌、肉瘤、神经母细胞瘤、胶质母细胞瘤、骨髓瘤、淋巴瘤、黑素瘤或者实体或软组织肿瘤。
143.权利要求141所述的方法，其中所述赘生物包含膀胱癌、乳腺癌、结直肠癌、胃癌、胰腺癌、食管癌、肝癌、肝细胞癌、下咽癌、肺癌、腺癌、卵巢癌或肾癌。
144.权利要求141所述的方法，其中所述赘生物包含胰腺腺癌、胰腺神经内分泌癌、结直肠腺癌、小肠恶性肿瘤、胆管癌、非小细胞肺癌(NSCLC)、甲状腺癌、食管或食管胃交界部(EGJ)癌、胃腺癌、肝的肝细胞癌、头颈部鳞癌、女性生殖道恶性肿瘤、乳腺癌、三阴性乳腺癌、肺小细胞癌、卵巢表面上皮癌、腹膜后或腹膜肉瘤、前列腺腺癌、神经内分泌肿瘤、胃肠道间质瘤、胶质母细胞瘤或非上皮性卵巢癌。
145.权利要求141所述的方法，其中所述赘生物选自多发性骨髓瘤、卵巢癌、宫颈癌、子宫内膜癌、甲状腺癌、睾丸癌、肾癌、胆囊癌、移行细胞膀胱癌、胃癌、前列腺癌、前列腺腺癌、乳腺癌、肺癌、结肠癌、霍奇金淋巴瘤和非霍奇金淋巴瘤、慢性淋巴细胞白血病(CLL)、急性淋巴细胞白血病(ALL)、急性粒细胞白血病(AML)、T细胞急性淋巴细胞白血病(T-ALL)、实体组织肉瘤、结肠癌、非小细胞肺癌、鳞状细胞肺癌、结直肠癌、肝癌、胰腺癌、脑癌(例如，神经母细胞瘤或脑脊膜瘤)、皮肤癌(例如，黑素瘤、基底细胞癌或鳞状细胞癌)以及头颈癌。
146.权利要求141所述的方法，其中所述赘生物是膀胱癌、多发性骨髓瘤或食管癌。
147.权利要求139至146中任一项所述的方法，其中所述赘生物包含表达黏结蛋白聚糖-1和/或FGFR3的赘生性细胞或癌细胞。
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Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2013082254A1 (en) * 2011-12-02 2013-06-06 Ibc Pharmaceuticals, Inc. Multivalent antibody complexes targeting igf-1r show potent toxicity against solid tumors
CN103842383A (zh) * 2011-05-16 2014-06-04 法比翁医药有限公司 多特异性fab融合蛋白及其使用方法
CN104379601A (zh) * 2012-02-03 2015-02-25 霍夫曼-拉罗奇有限公司 双特异性抗体分子和抗原-转染的t-细胞以及它们在医药中的用途
US20150315193A1 (en) * 2012-08-22 2015-11-05 Immunogen, Inc. Cytotoxic benzodiazepine derivatives
CN106211782A (zh) * 2014-03-17 2016-12-07 田边三菱制药株式会社 抗体‑fynomer缀合物
WO2018141964A1 (en) * 2017-02-06 2018-08-09 Orionis Biosciences Nv Targeted chimeric proteins and uses thereof

Family Cites Families (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CA2595398A1 (en) * 2004-11-04 2006-05-11 Fibron Limited Treatment of b-cell malignancies
RU2547939C2 (ru) * 2007-12-26 2015-04-10 Биотест Аг Иммуноконъюгаты, направленные на cd138, и их применение
RU2632108C2 (ru) * 2011-12-08 2017-10-02 Биотест Аг Применения иммуноконъюгатов, мишенью которых является cd138
WO2014089354A1 (en) * 2012-12-07 2014-06-12 The Regents Of The University Of California Cd138-targeted interferon demonstrates potent apoptotic and anti-tumor activities
RU2611685C2 (ru) * 2015-07-20 2017-02-28 Илья Владимирович Духовлинов Гуманизированное моноклональное антитело, специфичное к синдекану-1
US10722589B2 (en) * 2017-04-03 2020-07-28 Covagen Ag FGFR3 binding molecules
US11242403B2 (en) * 2017-04-26 2022-02-08 Mitsubishi Tanabe Pharma Corporation Syndecan-1 (CD138) binding agents and uses thereof
JP2021165268A (ja) * 2020-04-07 2021-10-14 田辺三菱製薬株式会社 シンデカン−１および線維芽細胞増殖因子受容体を標的とする二重特異性結合物質を含む医薬組成物

Patent Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN103842383A (zh) * 2011-05-16 2014-06-04 法比翁医药有限公司 多特异性fab融合蛋白及其使用方法
WO2013082254A1 (en) * 2011-12-02 2013-06-06 Ibc Pharmaceuticals, Inc. Multivalent antibody complexes targeting igf-1r show potent toxicity against solid tumors
CN104379601A (zh) * 2012-02-03 2015-02-25 霍夫曼-拉罗奇有限公司 双特异性抗体分子和抗原-转染的t-细胞以及它们在医药中的用途
US20150315193A1 (en) * 2012-08-22 2015-11-05 Immunogen, Inc. Cytotoxic benzodiazepine derivatives
CN106211782A (zh) * 2014-03-17 2016-12-07 田边三菱制药株式会社 抗体‑fynomer缀合物
WO2018141964A1 (en) * 2017-02-06 2018-08-09 Orionis Biosciences Nv Targeted chimeric proteins and uses thereof

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