CN117986360A - Il18蛋白的特异性抗体及其制备方法与应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种用IL18蛋白免疫骆驼科动物所得的抗原结合蛋白、抗体或抗体活性片段。本发明依靠骆驼科动物的免疫系统筛选、鉴定并制备特异性识别、结合IL18蛋白的抗体，所得到的抗体特异性强，可用于目标抗原检测，有潜在临床诊断和治疗价值；且本发明提供的抗体结构简单，容易进行基因工程改造，也容易实现人源化，稳定性高，量产成本低，有利于实现规模化生产。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体涉及IL18蛋白的特异性抗体及其制备方法与应用。
背景技术
白介素18(IL-18，也称为干扰素-γ诱导因子)是一种免疫反应的调节因子，也是一种炎症性细胞因子，其在免疫系统的抗病毒和抗细菌等反应中起着重要作用。IL-18的功能十分复杂多样。一方面，IL-18能够刺激免疫系统的自然杀伤细胞(NK细胞)和T细胞的活性，增强机体的抗病毒和抗肿瘤能力。另一方面，IL-18还能够促进炎症反应的过程，进一步激活促炎细胞因子如IL-1β和TNF-α的分泌，加重机体炎症反应和疾病的发展。
随着对IL-18作用机制的研究不断深入，人们发现它在人类疾病中的作用越来越受到重视。研究表明，IL-18可能与多种疾病的发生和发展有关。首先，IL-18与一些细胞因子异常分泌所引起的炎症反应相关，如关节炎、肝炎和慢性阻塞性肺病等。这些疾病往往伴随着白细胞介素异常高水平的存在，导致机体炎症反应持续过度，进一步加重病情。其次，IL-18也与某些肿瘤的形成和发展有关，它可以激活NK细胞对肿瘤细胞的攻击力，因此可以作为一种抗肿瘤的治疗手段被应用于临床。在一些实验室研究中，发现对IL-18的靶向治疗，可以有效地抑制某些恶性肿瘤的生长和扩散。IL-18也与一些自身免疫性疾病有关。如类风湿性关节炎和狼疮等疾病的患者血清中IL-18的含量明显升高。因此研究人员认为IL-18在自身免疫反应的调节中起着至关重要的作用。
虽然IL-18的功能多样，但激活IL-18通路可能会导致机体的过度炎症反应，引发一些炎症性疾病的发生和发展。因此，对IL-18通路的调控成为一些新型药物研究的重点，有望为多种疾病的治疗提供新思路。总之，IL-18是一种复杂的免疫调节分子，它在人类疾病的发生和发展中的作用越来越受到重视。对IL-18通路的深入研究，不仅有助于阐明机体免疫反应的调节机制，还能为疾病的治疗提供新思路和方案。
在研究IL-18过程中，抗体是一个非常重要的研究工具，尤其对于疾病患者具有重大的价值和意义。然而，传统的鼠、兔等动物仅能识别抗原表面平展的多肽。
因此，需要开发一种能够识别抗原表面复杂的空间结构，产生高度特异性、高亲和力的抗体。
发明内容
为了解决现有技术中存在的上述技术问题之一，本发明提供了一种IL18蛋白的特异性抗体及其制备方法与应用。
第一方面，本发明提供用IL18蛋白免疫骆驼科动物所得的抗原结合蛋白、抗体或抗体活性片段。
在一些实施方案中，所述骆驼科动物选自单峰驼、双峰驼、美洲驼、骆马、羊驼和小羊驼，优选为羊驼。
在一些实施方案中，所述抗体为纳米抗体，所述抗体活性片段为纳米抗体活性片段。
在一些实施方案中，所述抗体为单克隆抗体或者多克隆抗体。
在一些实施方案中，所述抗原结合蛋白、抗体或抗体活性片段与所述IL18蛋白结合的kd值在1000nM以下，优选在800nM以下，更优选在600nM以下，更优选在500nM以下，更优选在300nM以下。
在一些实施方案中，所述IL18蛋白具有如SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列。进一步优选地，所述IL18蛋白由包括如下步骤的方法制备而成：将编码所述IL18蛋白的核苷酸序列构建至载体质粒；将所述载体质粒转染至真核细胞系中表达，纯化。
在一些实施方案中，所述IL18蛋白可通过商业渠道获得。
第二方面，本发明提供一种构建抗体文库的方法，所述方法包括如下步骤：
(1)将IL18蛋白作为抗原免疫骆驼科动物，采集被免疫动物的静脉外周血，分离得到淋巴细胞；
(2)提取所述淋巴细胞的总mRNA，反转录为cDNA并进行扩增；
(3)将所述扩增得到的DNA插入病毒表达载体，转化入细菌，收集菌落，得抗体文库。
在一些实施方案中，所述骆驼科动物选自单峰驼、双峰驼、美洲驼、骆马、羊驼和小羊驼，优选为羊驼。
在一些实施方案中，步骤(1)所述免疫采用皮下注射方式。所述免疫的次数优选为3～5次。所述静脉外周血优选在最后一次免疫之前和之后分别采集。
在一些实施方案中，步骤(3)所述病毒表达载体为噬菌体表达载体。
在一些实施方案中，步骤(3)所述细菌为TG1感受态细菌。
第三方面，本发明提供上述构建抗体文库的方法获得的抗体文库，或由所述抗体文库表达产生的多克隆抗体。
第四方面，本发明提供一种构建抗原特异性抗体文库的方法，所述方法包括如下步骤：对第三方面所述的抗体文库进行筛选，获得抗原特异性抗体文库。
在一些实施方案中，所述构建抗原特异性抗体文库的方法包括如下步骤：
(i)对所述抗体文库进行培养，释放病毒；
(ii)将所述病毒与抗原进行孵育，去掉与抗原非特异性结合的病毒，保留与抗原特异性结合的病毒；
(iii)用所述与抗原特异性结合的病毒侵染细菌，收集菌落，获得抗原特异性抗体文库。
在一些实施方案中，步骤(iii)所述细菌为大肠杆菌。
第五方面，本发明提供上述构建抗原特异性抗体文库的方法获得的抗原特异性抗体文库，或由所述抗原特异性抗体文库表达产生的与抗原特异性结合的多克隆抗体。
第六方面，本发明提供一种制备抗原结合蛋白、抗体或抗体活性片段的方法，所述方法包括如下步骤：对第三方面所述的抗体文库进行筛选，获得与抗原特异性结合的抗原结合蛋白、抗体或抗体活性片段。
在一些实施方案中，所述制备抗原结合蛋白、抗体或抗体活性片段的方法包括如下步骤：
(a)对所述抗体文库进行培养，释放病毒；
(b)将所述病毒与抗原进行孵育，去掉与抗原非特异性结合的病毒，保留与抗原特异性结合的病毒；
(c)用所述与抗原特异性结合的病毒侵染细菌，将被侵染的细菌涂抹至平板培养基培养，挑选单一菌落。
在一些实施方案中，步骤(c)所述细菌为大肠杆菌。
在一些实施方案中，可以对所述单一菌落进行扩大培养，之后进行抗原特异性结合鉴定。
在一些实施方案中，可以对所述单一菌落进行扩大培养，然后进行步骤(d)：提取DNA，转化至宿主细胞并表达，以获得单克隆抗体。
第七方面，本发明提供采用上述制备抗原结合蛋白、抗体或抗体活性片段的方法获得的抗原结合蛋白、抗体或抗体活性片段。
第八方面，本发明提供特异性识别IL18蛋白的抗原结合蛋白、抗体或抗体活性片段；所述抗原结合蛋白、抗体或抗体活性片段包含至少一个重链可变区；所述重链可变区具有：
如SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:5所示的CDR1；
如SEQ ID NO:6或SEQ ID NO:7或SEQ ID NO:8所示的CDR2；和
如SEQ ID NO:9或SEQ ID NO:10或SEQ ID NO:11所示的CDR3。
在一些实施方案中，所述重链可变区具有：如SEQ ID NO:3所示的CDR1、如SEQ IDNO:6所示的CDR2和如SEQ ID NO:9所示的CDR3。
在一些实施方案中，所述重链可变区具有：如SEQ ID NO:4所示的CDR1、如SEQ IDNO:7所示的CDR2和如SEQ ID NO:10所示的CDR3。
在一些实施方案中，所述重链可变区具有：如SEQ ID NO:5所示的CDR1、如SEQ IDNO:8所示的CDR2和如SEQ ID NO:11所示的CDR3。
在一些实施方案中，所述重链可变区具有：如SEQ ID NO:12所示的氨基酸序列，或与SEQ ID NO:12具有至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列一致性的氨基酸序列。
在一些实施方案中，所述重链可变区具有：如SEQ ID NO:13所示的氨基酸序列，或与SEQ ID NO:13具有至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列一致性的氨基酸序列。
在一些实施方案中，所述重链可变区具有：如SEQ ID NO:14所示的氨基酸序列，或与SEQ ID NO:14具有至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列一致性的氨基酸序列。
在一些实施方案中，所述抗原结合蛋白、抗体或抗体活性片段包含一个所述重链可变区且缺失轻链。
在一些实施方案中，所述抗体为纳米抗体，所述抗体活性片段为纳米抗体活性片段。
第九方面，本发明提供核酸分子，其编码SEQ ID NO:3～SEQ ID NO:14任意一条序列所示氨基酸序列或上文所述抗原结合蛋白、抗体或抗体活性片段。
在一些实施方案中，编码所述抗原结合蛋白、抗体或抗体活性片段的核酸分子具有如SEQ ID NO:15所示的核苷酸序列。
在一些实施方案中，编码所述抗原结合蛋白、抗体或抗体活性片段的核酸分子具有如SEQ ID NO:16所示的核苷酸序列。
在一些实施方案中，编码所述抗原结合蛋白、抗体或抗体活性片段的核酸分子具有如SEQ ID NO:17所示的核苷酸序列。
第十方面，本发明提供含有上文所述核苷分子的表达载体。
在一些实施方案中，所述表达载体为噬菌体表达载体，优选为噬菌体表面展示筛选载体。
在一些实施方案中，所述表达载体中还含有编码噬菌体包膜蛋白pIII的核苷酸序列。
第十一方面，本发明提供外源转入了上文所述表达载体的病毒。
在一些实施方案中，所述病毒为噬菌体。
第十二方面，本发明提供宿主细胞，其包括上文所述的核酸分子，或者所述宿主细胞被上文所述病毒侵染。
在一些实施方案中，所述宿主细胞为大肠杆菌。
第十三方面，本发明提供利用上文所述宿主细胞表达抗原结合蛋白、抗体或抗体活性片段的方法。
第十四方面，本发明提供利用上文所述宿主细胞表达获得的抗原结合蛋白、抗体或抗体活性片段。
第十五方面，本发明提供所述上文所述抗原结合蛋白、抗体或抗体活性片段经人源化后获得的人源化抗原结合蛋白、抗体或抗体活性片段。
第十六方面，本发明提供一种蛋白偶联物，其包含上文所述抗原结合蛋白、抗体或抗体活性片段或者上文所述人源化抗原结合蛋白、抗体或抗体活性片段以及配体。
在一些实施方案中，所述配体选自放射性同位素、荧光基团和递送载体。
第十七方面，本发明提供检测样品中IL18蛋白的试剂盒，其包含上文所述抗原结合蛋白、抗体或抗体活性片段或者上文所述人源化抗原结合蛋白、抗体或抗体活性片段。
在一些实施方案中，所述抗原结合蛋白、抗体或抗体活性片段经标记物标记。优选地，所述标记物选自酶、化学发光基团和同位素基团。
在一些实施方案中，所述样品为动物血清，优选为人血清。
第十八方面，本发明提供上文所述抗原结合蛋白、抗体或抗体活性片段、上文所述人源化抗原结合蛋白、抗体或抗体活性片段、上文所述蛋白偶联物或者上文所述试剂盒在检测样品中IL18蛋白中的应用。
在一些实施方案中，所述样品为动物血清，优选为人血清。
第十九方面，本发明提供上文所述抗原结合蛋白、抗体或抗体活性片段、上文所述人源化抗原结合蛋白、抗体或抗体活性片段在制备检测样品中IL18蛋白的试剂盒中的应用。
在一些实施方案中，所述样品为动物血清，优选为人血清。
与现有技术相比，本发明提供的技术方案具有如下显著优势：本发明提供的抗体可用于检测血清中目标抗原，进一步用于检测原癌基因，判断病变，有潜在临床诊断和治疗价值。本发明提供的抗体结构简单，容易进行基因工程改造，具有成熟的优化策略用于增强纳米抗体亲和力、延长体内半衰期以及与其它分子偶联用于药物开发，如连接放射性同位素，偶联传递药物、CART和荧光标记高分辨成像等。本发明提供的抗体序列与人IgG的VH区域序列同源性高，少数氨基酸突变即可以实现单域抗体的人源化。且本发明提供的抗体稳定性高，能避免常规抗体需要低温储存和运输的要求，有利于大规模普及应用，量产成本较低，易于大规模重组制备。本发明所设计的单克隆纳米抗体在成本低廉的大肠杆菌表达系统就可以很好的重组表达，量产成本低、产量可以高达数十毫克/升大肠杆菌。大肠杆菌重组表达系统技术成熟，质量控制简单，有利于降低生产成本、实现规模化生产。
开发IL-18靶向性单克隆抗体可为研究人员提供有力的工具，有助于深入研究IL18R1在免疫调节、炎症、感染等多个生物学过程中的功能和调控机制，有助于可以更好地理解这些生物学过程的机制，为相关疾病的治疗策略提供新的方向和靶点，同时也为基础生物学研究提供了丰富的材料。
相比于传统的从鼠、兔等动物血清或淋巴细胞中分离得到抗体的方法，本发明的技术方案能够长期保存持有羊驼的全部纳米抗体片段(即文库)，能够持续地支撑后续不断地进行纳米抗体的筛选与开发。
附图说明
图1为单抗IL18_4G7与抗原亲和力检测结果示意图。
图2为单抗IL18_4D1与抗原亲和力检测结果示意图。
图3为单抗IL18_4H1与抗原亲和力检测结果示意图。
具体实施方式
为使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步的详细说明。此处所描述的具体实施例仅用于解释本发明，并不用于构成对本发明的任何限制。此外，在以下说明中，省略了对公知结构和技术的描述，以避免不必要地混淆本公开的概念。这样的结构和技术在许多出版物中也进行了描述。
定义
除非另有定义，否则本发明使用的所有技术术语和科技术语都具有如在本发明所属领域中通常使用的相同含义。出于解释本说明书的目的，将应用以下定义，并且在适当时，以单数形式使用的术语也将包括复数形式，反之亦然。
除非上下文另有明确说明，否则本文所用的表述“一种”和“一个”包括复数指代。例如，提及“一个细胞”包括多个这样的细胞及本领域技术人员可知晓的等同物等等。
本文所用的术语“约”表示其后的数值的±20％的范围。在一些实施方式中，术语“约”表示其后的数值的±10％的范围。在一些实施方式中，术语“约”表示其后的数值的±5％的范围。
白介素18(IL-18，也称为干扰素-γ诱导因子)：IL-18是一种免疫反应的调节因子，也是一种炎症性细胞因子，其在免疫系统的抗病毒和抗细菌等反应中起着重要作用。IL-18的功能十分复杂多样：一方面，IL-18能够刺激免疫系统的自然杀伤细胞(NK细胞)和T细胞的活性，增强机体的抗病毒和抗肿瘤能力；另一方面，IL-18还能够促进炎症反应的过程，进一步激活促炎细胞因子如IL-1β和TNF-α的分泌，加重机体炎症反应和疾病的发展。
kd值：解离常数(dissociation constant，kd)是一种特定类型的平衡常数，用于衡量一较大物体与另一较小组分分开(解离)的倾向，是缔合常数的倒数，单位为mol/L(M)或nmol/L(nM)。kd值越小说明两个物质的结合能力越强。
纳米抗体：在骆驼科动物外周血液中存在的天然缺失轻链的抗体，该抗体只包含一个重链可变区(VHH)和两个常规的CH2区与CH3区，但却不像人工改造的单链抗体片段那样容易相互沾粘，甚至聚集成块；单独克隆并表达出来的VHH结构具有与原重链抗体相当的结构稳定性以及与抗原的结合活性，是已知的可结合目标抗原的最小单位；VHH晶体为2.5nm，长4nm，分子量只有约15kD，因此也被称作纳米抗体(Nanobody，Nb)。相比于传统的鼠、兔等动物仅能识别抗原表面平展的多肽，骆驼科动物体内的免疫系统能够识别抗原表面复杂的空间结构，能够产生高度特异性、高亲和力的纳米抗体。
不同于传统技术依赖于鼠、兔、猴、羊等经典的模式动物，本发明的技术方案是依靠羊驼的免疫系统产生的抗体，被称为“纳米抗体”。纳米抗体是从骆驼等动物体内免疫球蛋白分离出的微小抗体片段，它具有与完整抗体相同的抗原结合能力和结构稳定性，是现有可结合目标抗原的最小的单位，相对分子质量仅约15kD。相比于传统的鼠、兔等动物仅能识别抗原表面平展的多肽，羊驼等动物体内的免疫系统能够识别抗原表面复杂的空间结构，能够产生高度特异性、高亲和力的纳米抗体。
根据本发明的技术方案，在不改变蛋白的活性或功能的情况下，可以对氨基酸序列中的某些氨基酸进行保守取代，参见下表1：
表1
| 残基 | 保守性替换 | 残基 | 保守性替换 |
| Ala | Ser | Leu | Ile；Val |
| Arg | Lys | Lys | Arg；Gln |
| Asn | Gln；His | Met | Leu；Ile |
| Asp | Glu | Phe | Met；Leu；Tyr |
| Gln | Asn | Ser | Thr；Gly |
| Cys | Ser | Thr | Ser；Val |
| Glu | Asp | Trp | Tyr |
| Gly | Pro | Tyr | Trp；Phe |
| His | Asn；Gln | Val | Ile；Leu |
| Ile | Leu；Val |
此外，因为碱基的简并性，在不改变多核苷酸序列的活性或功能的情况下，可以对多核苷酸序列的碱基进行取代，参见下表2：
表2
下面提供实施例和附图以帮助理解本发明。但应理解，这些实施例和附图仅用于说明本发明，但不构成任何限制。本发明的实际保护范围在权利要求书中进行阐述。应理解，在不脱离本发明精神的情况下，可以进行任何修改和改变。
实施例1.制备抗原
(1)构建编码N端带有His标签的重组人IL-18蛋白的DNA序列至pet-28a大肠杆菌表达载体，形成IL-18重组表达质粒；
(2)将IL-18重组表达质粒转染至BL21(DE3)感受态细胞，培养得到表达IL-18蛋白的单克隆菌株；
(3)于37℃培养该菌株，后于27℃条件下加入合适的诱导物(IPTG，异丙基-β-D-硫代半乳糖苷)诱导表达IL-18蛋白；
(4)收集全部细菌，经过裂解、离心、亲和层析、凝胶过滤层析，得到重组人IL-18蛋白。
完整表达的重组IL-18蛋白的氨基酸序列如下：
其对应的核苷酸序列如下：
实施例2.羊驼免疫注射
本实施例将实施例1的抗原重组人IL-18蛋白免疫羊驼。具体步骤如下：
(1)将实施例1中的抗原平均分装成4份，每份0.5mg；累计对羊驼进行4次免疫，将抗原经皮下注射至动物体内，记第一次免疫为第1天，后续的免疫分别于第11天、第21天、第31天；
(2)第30天，于第四次免疫注射前，采集约200mL羊驼静脉外周血液；
(3)第45天，即第四次免疫之后14天，采集约200mL羊驼静脉外周血液。
相比于传统鼠、兔等动物抗体的免疫技术方案，本技术优势在于采集大量的羊驼静脉外周血液，有利于后续筛选得到高度多样性的纳米抗体。
实施例3.构建羊驼的纳米抗体文库
以实施例2中采集的两批次羊驼静脉外周血液为原料，构建高多样性的纳米抗体文库。两批次羊驼静脉外周血液的处理方法相同，具体步骤如下：
(1)使用密度梯度离心等方法，从羊驼静脉外周血液中分离得到淋巴细胞；
(2)提取淋巴细胞的总mRNA，并反转录为cDNA；
(3)以cDNA为模板，使用引物1与等摩尔比混合的引物2、引物3、引物4和引物5，PCR扩增得到羊驼免疫球蛋白IgG1的VH-CH1-CH2片段，以及IgG2和IgG3的VHH-CH2片段；
(4)回收上述的VHH-CH2基因片段，并以之为模板，使用引物6与等摩尔比混合的引物2、引物3、引物4和引物5，PCR扩增得到IgG2和IgG3的VHH基因片段；构建纳米抗体文库所用引物如表3所示；
表3.构建纳米抗体文库所用引物
(5)回收上述的VHH基因片段，使用限制性内切酶SfiI(New England Biolabds,Cat.#R0123L)和NotI(New England Biolabds,Cat.#R0189L)分别切割片段的5’端和3’端；
(6)使用限制性内切酶SfiI和NotI切割噬菌体载体质粒pHen1，使载体质粒线性化；
(7)使用T4 DNA连接酶(New England Biolabds,Cat.#M0202S)将切割后的VHH片段连接至切割后的噬菌体载体质粒pHen1，构成VHH-pIII融合蛋白表达载体质粒库。其中，pIII是存在于噬菌体表面鞭毛上的蛋白质，编码该蛋白的基因位于pHen1载体质粒NotI酶切位点的下游；
(8)将DNA连接产物经电转化方法，转化至TG1感受态细菌，适当培养后收集全部菌落，即为羊驼的纳米抗体文库。
实施例4.噬菌体表面展示筛选特异性纳米抗体
本实施例以实施例3得到的纳米抗体文库为来源，经噬菌体表面展示筛选得到抗原特异性的纳米抗体。具体步骤如下：
(1)取适量冻存的纳米抗体文库，接种至细菌培养基，经适当培养后加入适量的辅助噬菌体M13KO7(New England Biolabds,Cat.#N0315S)，继续于适量条件下培养；
(2)以PEG-NaC法提取细菌培养上清中扩增的噬菌体；
(3)将噬菌体与抗原适当孵育，IL18抗原预先固定于免疫试管(Maxisorp免疫试管，ThermoFisher Scientific)；
(4)淘洗：弃去噬菌体，再以PBS缓冲液润洗抗原适当次数，淘洗、除去与抗原非特异性结合的噬菌体，保留与抗原特异性结合的噬菌体；
(5)洗脱：使用甘氨酸溶液洗脱噬菌体，使噬菌体与抗原解离并保留。
至此，得到表达有特异性纳米抗体的噬菌体，将得到的这些噬菌体进行下述操作：
(6)转变为特异性的纳米抗体文库：将噬菌体再次侵染培养至合适状态的大肠杆菌，但不再加入辅助噬菌体，待噬菌体侵染完全后，特异性的纳米抗体即以DNA质粒的形式存在于大肠杆菌中。收集这些全部的大肠杆菌，即成为抗原特异性的纳米抗体文库，可以此文库为原料，返回步骤(1)进行下一轮的噬菌体表面展示筛选；
(7)转变为单克隆纳米抗体菌落：取约0.5％总体积步骤(5)得到的噬菌体，稀释后再次侵染培养至合适状态的大肠杆菌，但不再加入辅助噬菌体，待噬菌体侵染完全后，将这些大肠杆菌均匀涂抹于细菌培养皿，于37℃下静置培养过夜，得到含有纳米抗体DNA质粒的单克隆菌落。以这些单克隆菌落为原料，进行阳性单克隆纳米抗体的鉴定。
实施例5.鉴定阳性单克隆纳米抗体
本实施例利用实施例4步骤(7)得到长有单克隆菌落的细菌培养皿，进行阳性单克隆纳米抗体的鉴定。具体步骤如下：
(1)挑取单克隆菌落于微孔板进行培养；
(2)加入IPTG诱导VHH-pIII(即含有纳米抗体的融合蛋白质)表达；
(3)收集含有纳米抗体的细菌培养上清，与抗原IL18孵育，抗原预先固定于96微孔板(Maxisorp透明微孔板，ThermoFisher Scientific)；
(4)利用酶联免疫吸附检测(ELISA)，检测单克隆纳米抗体是否与IL18抗原结合，主要实验步骤如下：
I.于96微孔板中加入诱导表达的VHH-pIII蛋白，室温震荡孵育；
II.加入cmyc-tag特异性鼠单克隆抗体(金斯瑞生物科技，Cat.#A00863)，室温、避光震荡孵育；
III.加入HRP显色底物ABTS(Sigma-Aldrich,Cat.#A9941)，室温、避光震荡孵育；
IV.使用光吸收酶标仪测量OD405。
(5)对于可以与抗原结合的单克隆纳米抗体微生物菌落，再次适当培养后，提取DNA质粒，经测序获得纳米抗体的核苷酸序列和氨基酸序列，如表4-表6所示。
表4：单抗IL18_4G7的氨基酸序列和核苷酸序列
表5：单抗IL18_4D1的氨基酸序列和核苷酸序列
表6：单抗IL18_4H1的氨基酸序列和核苷酸序列
实施例6.小批量单克隆纳米抗体重组表达与纯化
(1)实施例5得到了能够特异性识别并结合IL18的单克隆纳米抗体，将编码纳米抗体的DNA质粒转化至BL21(DE3)感受态细胞，借助大肠杆菌表达系统进行小批量表达、纯化单克隆纳米抗体。
(2)利用ELISA方法，孵育不同浓度的纳米抗体，根据纳米抗体与IL18的结合能力测量纳米抗体与抗原的亲和力大小。
得到两组单克隆菌落对应抗体，与IL18蛋白抗原的亲和力大小的检测结果如图1～3所示，亲和力数值KD的结果如下表7所示。
表7：亲和力测试结果
| KD(nM) | |
| IL18_4G7 | 561.1 |
| IL18_4D1 | 225.6 |
| IL18_4H1 | 459.2 |
由以上结果可知，本实施例挑选得到单克隆菌落所得抗体与所述IL18蛋白结合的kd值在1000nM以下，优选在800nM以下，更优选在600nM以下，更优选在500nM以下，更优选在300nM以下。
本发明的技术方案不限于上述具体实施例的限制，凡是根据本发明的技术方案做出的技术变形，均落入本发明的保护范围之内。
Claims (10)
1.特异性识别IL18蛋白的纳米抗体或其活性片段。
2.根据权利要求1所述的纳米抗体或其活性片段，其特征在于，所述纳米抗体或其活性片段包含重链可变区，所述重链可变区具有：
如SEQ ID NO:3所示的CDR1、如SEQ ID NO:6所示的CDR2和如SEQ ID NO:9所示的CDR3；或，
如SEQ ID NO:4所示的CDR1、如SEQ ID NO:7所示的CDR2和如SEQ ID NO:10所示的CDR3；或，
如SEQ ID NO:5所示的CDR1、如SEQ ID NO:8所示的CDR2和如SEQ ID NO:11所示的CDR3；
优选地，所述重链可变区具有：
如SEQ ID NO:12所示的氨基酸序列，或与SEQ ID NO:12具有至少85％序列一致性的氨基酸序列；或，如SEQ ID NO:13所示的氨基酸序列，或与SEQ ID NO:13具有至少85％序列一致性的氨基酸序列；或，如SEQ ID NO:14所示的氨基酸序列，或与SEQ ID NO:14具有至少85％序列一致性的氨基酸序列。
3.核酸分子，其编码权利要求1或2所述的纳米抗体或其活性片段。
4.表达载体，其含有权利要求3所述核酸分子；
优选地，所述表达载体为噬菌体表达载体。
5.宿主细胞，其包括权利要求3所述的核酸分子，优选为大肠杆菌。
6.利用所述权利要求5所述宿主细胞表达纳米抗体或其活性片段的方法。
7.权利要求1或2所述纳米抗体或其活性片段经人源化后获得的人源化纳米抗体或其活性片段。
8.蛋白偶联物，其特征在于，包含权利要求1或2所述纳米抗体或其活性片段或权利要求7所述人源化纳米抗体或其活性片段；
优选地，所述蛋白偶联物还包括配体，其中所述配体选自放射性同位素、荧光基团和递送载体。
9.检测样品中IL18蛋白的试剂盒，其特征在于，包含权利要求1或2所述纳米抗体或其活性片段或权利要求7所述人源化纳米抗体或其活性片段；
优选地，所述抗原结合蛋白、抗体或抗体活性片段经标记物标记；所述标记物优选为酶、化学发光基团或同位素基团；
更优选地，所述样品为动物血清，优选为人血清。
10.权利要求1或2所述纳米抗体或其活性片段，或权利要求7所述人源化纳米抗体或其活性片段在制备检测样品中IL18蛋白的试剂盒中的应用；
优选地，所述样品为动物血清，优选为人血清。
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