CN116640209A - Rab11蛋白的特异性抗体及其制备方法与应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种用Rab11蛋白免疫骆驼科动物所得的抗原结合蛋白、抗体或抗体活性片段。本发明依靠骆驼科动物的免疫系统筛选、鉴定并制备特异性识别、结合Rab11蛋白的抗体，所得到的抗体特异性强，可用于目标抗原检测，有潜在临床诊断和治疗价值；且本发明提供的抗体结构简单，容易进行基因工程改造，也容易实现人源化，稳定性高，量产成本低，有利于实现规模化生产。

Description

Rab11蛋白的特异性抗体及其制备方法与应用
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体涉及Rab11蛋白的特异性抗体及其制备方法与应用。
背景技术
抗体是一种主要由浆细胞分泌，被免疫系统用来鉴别与中和外来物质如细菌、病毒等外来物的蛋白质，该外来物被称为抗原。抗体和抗原的结合完全依靠非共价键的相互作用，这种特异性的结合机制使得抗体可以捕获外来微生物以及受感染的细胞，进一步诱导其他免疫机制对其进行攻击，或直接中和其目标。抗体及抗体相关产品已经被广泛应用于生命科学与医学等研究领域，基于抗原-抗体特异性结合而衍生的诸多实验技术奠定了科学研究与临床治疗的重要基础，例如免疫诊断、免疫印迹、酶联免疫吸附、流式细胞分析等等。
Rab11(Ras-related protein 11)是Ras超家族的成员，是细胞内膜运输的关键调节剂，参与从运输囊泡的形成到它们与膜的融合。Rab家族蛋白质成员在非活性GDP结合形式和活性GTP结合形式之间循环，能够将不同组的下游效应子募集到膜上，直接负责囊泡的形成、运动、束缚和融合。Rab11主要参与调节细胞内吞循环，同时在胞质分裂过程中作为膜传递的主要调节剂。Rab11还与Rab8等多种蛋白质一起参与上皮细胞极化、促进细胞的转胞吞作用，同时参与多种重要细胞膜蛋白从高尔基体至细胞膜的转运和分选。
在研究Rab11过程中，抗体是一个非常重要的研究工具，对于患者诊断、病毒分析与研究等都具有重大的价值和意义。然而，传统的鼠、兔等动物仅能识别抗原表面平展的多肽。因此，需要开发一种能够识别抗原表面复杂的空间结构，产生高度特异性、高亲和力的纳米抗体。
发明内容
为了解决现有技术中存在的上述技术问题之一，本发明提供了一种Rab11蛋白的特异性抗体及其制备方法与应用。
第一方面，本发明提供用Rab11蛋白免疫骆驼科动物所得的抗原结合蛋白、抗体或抗体活性片段。
在一些实施方案中，所述骆驼科动物选自单峰驼、双峰驼、美洲驼、骆马、羊驼和小羊驼，优选为羊驼。
在一些实施方案中，所述抗体为纳米抗体，所述抗体活性片段为纳米抗体活性片段。
在一些实施方案中，所述抗体为单克隆抗体或者多克隆抗体。
在一些实施方案中，所述抗原结合蛋白、抗体或抗体活性片段与所述Rab11蛋白结合的kd值在500nM以下，优选在300nM以下，更优选在200nM以下，更优选在100nM以下，更优选在50nM以下。
在一些实施方案中，所述Rab11蛋白具有如SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列。进一步优选地，所述Rab11蛋白由包括如下步骤的方法制备而成：将编码所述Rab11蛋白的核苷酸序列构建至载体质粒；将所述载体质粒转染至真核细胞系中表达，纯化。
在一些实施方案中，所述Rab11蛋白可通过商业渠道获得。
第二方面，本发明提供一种构建抗体文库的方法，所述方法包括如下步骤：
(1)将Rab11蛋白作为抗原免疫骆驼科动物，采集被免疫动物的静脉外周血，分离得到淋巴细胞；
(2)提取所述淋巴细胞的总mRNA，反转录为cDNA并进行扩增；
(3)将所述扩增得到的DNA插入病毒表达载体，转化入细菌，收集菌落，得抗体文库。
在一些实施方案中，所述骆驼科动物选自单峰驼、双峰驼、美洲驼、骆马、羊驼和小羊驼，优选为羊驼。
在一些实施方案中，步骤(1)所述免疫采用皮下注射方式。所述免疫的次数优选为3～5次。所述静脉外周血优选在最后一次免疫之前和之后分别采集。
在一些实施方案中，步骤(3)所述病毒表达载体为噬菌体表达载体。
在一些实施方案中，步骤(3)所述细菌为TG1感受态细菌。
第三方面，本发明提供上述构建抗体文库的方法获得的抗体文库，或由所述抗体文库表达产生的多克隆抗体。
第四方面，本发明提供一种构建抗原特异性抗体文库的方法，所述方法包括如下步骤：对第三方面所述的抗体文库进行筛选，获得抗原特异性抗体文库。
在一些实施方案中，所述构建抗原特异性抗体文库的方法包括如下步骤：
(i)对所述抗体文库进行培养，释放病毒；
(ii)将所述病毒与抗原进行孵育，去掉与抗原非特异性结合的病毒，保留与抗原特异性结合的病毒；
(iii)用所述与抗原特异性结合的病毒侵染细菌，收集菌落，获得抗原特异性抗体文库。
在一些实施方案中，步骤(iii)所述细菌为大肠杆菌。
第五方面，本发明提供上述构建抗原特异性抗体文库的方法获得的抗原特异性抗体文库，或由所述抗原特异性抗体文库表达产生的与抗原特异性结合的多克隆抗体。
第六方面，本发明提供一种制备抗原结合蛋白、抗体或抗体活性片段的方法，所述方法包括如下步骤：对第三方面所述的抗体文库进行筛选，获得与抗原特异性结合的抗原结合蛋白、抗体或抗体活性片段。
在一些实施方案中，所述制备抗原结合蛋白、抗体或抗体活性片段的方法包括如下步骤：
(a)对所述抗体文库进行培养，释放病毒；
(b)将所述病毒与抗原进行孵育，去掉与抗原非特异性结合的病毒，保留与抗原特异性结合的病毒；
(c)用所述与抗原特异性结合的病毒侵染细菌，将被侵染的细菌涂抹至平板培养基培养，挑选单一菌落。
在一些实施方案中，步骤(c)所述细菌为大肠杆菌。
在一些实施方案中，可以对所述单一菌落进行扩大培养，之后进行抗原特异性结合鉴定。
在一些实施方案中，可以对所述单一菌落进行扩大培养，然后进行步骤(d)：提取DNA，转化至宿主细胞并表达，以获得单克隆抗体。
第七方面，本发明提供采用上述制备抗原结合蛋白、抗体或抗体活性片段的方法获得的抗原结合蛋白、抗体或抗体活性片段。
第八方面，本发明提供特异性识别和/或结合Rab11蛋白的抗原结合蛋白、抗体或抗体活性片段；所述抗原结合蛋白、抗体或抗体活性片段包含至少一个重链可变区；所述重链可变区具有：
如SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5或SEQ ID NO:6所示的CDR1；
如SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10或SEQ ID NO:11所示的CDR2；和
如SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:15或SEQ ID NO:16所示的CDR3；
在一些实施方案中，所述重链可变区具有：如SEQ ID NO:2所示的CDR1、如SEQ IDNO:7所示的CDR2和如SEQ ID NO:12所示的CDR3。
在一些实施方案中，所述重链可变区具有：如SEQ ID NO:3所示的CDR1、如SEQ IDNO:8所示的CDR2和如SEQ ID NO:13所示的CDR3。
在一些实施方案中，所述重链可变区具有：如SEQ ID NO:4所示的CDR1、如SEQ IDNO:9所示的CDR2和如SEQ ID NO:14所示的CDR3。
在一些实施方案中，所述重链可变区具有：如SEQ ID NO:5所示的CDR1、如SEQ IDNO:10所示的CDR2和如SEQ ID NO:15所示的CDR3。
在一些实施方案中，所述重链可变区具有：如SEQ ID NO:6所示的CDR1、如SEQ IDNO:11所示的CDR2和如SEQ ID NO:16所示的CDR3。
在一些实施方案中，所述重链可变区具有：如SEQ ID NO:17所示的氨基酸序列，或SEQ ID NO:17所示的氨基酸序列经过一个或多个氨基酸添加、删除、替换或修饰获得的保守性变异体。
在一些实施方案中，所述重链可变区具有：如SEQ ID NO:18所示的氨基酸序列，或SEQ ID NO:18所示的氨基酸序列经过一个或多个氨基酸添加、删除、替换或修饰获得的保守性变异体。
在一些实施方案中，所述重链可变区具有：如SEQ ID NO:19所示的氨基酸序列，或SEQ ID NO:19所示的氨基酸序列经过一个或多个氨基酸添加、删除、替换或修饰获得的保守性变异体。
在一些实施方案中，所述重链可变区具有：如SEQ ID NO:20所示的氨基酸序列，或SEQ ID NO:20所示的氨基酸序列经过一个或多个氨基酸添加、删除、替换或修饰获得的保守性变异体。
在一些实施方案中，所述重链可变区具有：如SEQ ID NO:21所示的氨基酸序列，或SEQ ID NO:21所示的氨基酸序列经过一个或多个氨基酸添加、删除、替换或修饰获得的保守性变异体。
在一些实施方案中，所述抗原结合蛋白、抗体或抗体活性片段包含一个所述重链可变区且缺失轻链。
在一些实施方案中，所述抗体为纳米抗体，所述抗体活性片段为纳米抗体活性片段。
第九方面，本发明提供编码SEQ ID NO:2～SEQ ID NO:21任意一条序列所示氨基酸序列或上文所述抗原结合蛋白、抗体或抗体活性片段的核苷酸序列。
在一些实施方案中，编码所述抗原结合蛋白、抗体或抗体活性片段的核苷酸序列如SEQ ID NO:22所示。
在一些实施方案中，编码所述抗原结合蛋白、抗体或抗体活性片段的核苷酸序列如SEQ ID NO:23所示。
在一些实施方案中，编码所述抗原结合蛋白、抗体或抗体活性片段的核苷酸序列如SEQ ID NO:24所示。
在一些实施方案中，编码所述抗原结合蛋白、抗体或抗体活性片段的核苷酸序列如SEQ ID NO:25所示。
在一些实施方案中，编码所述抗原结合蛋白、抗体或抗体活性片段的核苷酸序列如SEQ ID NO:26所示。
第十方面，本发明提供含有上文所述核苷酸序列的表达载体。
在一些实施方案中，所述表达载体为噬菌体表达载体，优选为噬菌体表面展示筛选载体。
在一些实施方案中，所述表达载体中还含有编码噬菌体包膜蛋白pIII的核苷酸序列。
第十一方面，本发明提供外源转入了上文所述表达载体的病毒。
在一些实施方案中，所述病毒为噬菌体。
第十二方面，本发明提供外源转入了上文所述表达载体的宿主细胞，或者被上文所述病毒侵染的宿主细胞。
在一些实施方案中，所述宿主细胞为大肠杆菌。
第十三方面，本发明提供利用上文所述宿主细胞表达抗原结合蛋白、抗体或抗体活性片段的方法。
第十四方面，本发明提供利用上文所述宿主细胞表达获得的抗原结合蛋白、抗体或抗体活性片段。
第十五方面，本发明提供所述上文所述抗原结合蛋白、抗体或抗体活性片段经人源化后获得的人源化抗原结合蛋白、抗体或抗体活性片段。
第十六方面，本发明提供一种蛋白偶联物，其包含上文所述抗原结合蛋白、抗体或抗体活性片段或者上文所述人源化抗原结合蛋白、抗体或抗体活性片段以及配体。
在一些实施方案中，所述配体选自放射性同位素、荧光基团和递送载体。
第十七方面，本发明提供检测样品中Rab11蛋白含量的试剂盒，其包含上文所述抗原结合蛋白、抗体或抗体活性片段或者上文所述人源化抗原结合蛋白、抗体或抗体活性片段。
在一些实施方案中，所述抗原结合蛋白、抗体或抗体活性片段经标记物标记。优选地，所述标记物选自酶、化学发光基团和同位素基团。
在一些实施方案中，所述样品为动物血清，优选为人血清。
第十八方面，本发明提供上文所述抗原结合蛋白、抗体或抗体活性片段、上文所述人源化抗原结合蛋白、抗体或抗体活性片段、上文所述蛋白偶联物或者上文所述试剂盒在检测样品中Rab11蛋白含量中的应用。
在一些实施方案中，所述样品为动物血清，优选为人血清。
第十九方面，本发明提供利用上文所述抗原结合蛋白、抗体或抗体活性片段、上文所述人源化抗原结合蛋白、抗体或抗体活性片段、上文所述蛋白偶联物或者上文所述试剂盒检测样品中Rab11蛋白含量的方法。
在一些实施方案中，所述样品为动物血清，优选为人血清。
与现有技术相比，本发明提供的技术方案具有如下显著优势：本发明提供的抗体可用于检测血清中目标抗原的含量，进一步用于检测原癌基因，判断病变，有潜在临床诊断和治疗价值；本发明提供的抗体结构简单，容易进行基因工程改造，具有成熟的优化策略用于增强纳米抗体亲和力、延长体内半衰期以及与其它分子偶联用于药物开发，如连接放射性同位素，偶联传递药物、CART和荧光标记高分辨成像等；本发明提供的抗体序列与人IgG的VH区域序列同源性高，少数氨基酸突变即可以实现单域抗体的人源化；且本发明提供的抗体稳定性高，能避免常规抗体需要低温储存和运输的要求，有利于大规模普及应用，量产成本较低，易于大规模重组制备。本发明所设计的单克隆纳米抗体在成本低廉的大肠杆菌表达系统就可以很好的重组表达，量产成本低、产量可以高达数十毫克/升大肠杆菌。大肠杆菌重组表达系统技术成熟，质量控制简单，有利于降低生产成本、实现规模化生产。
不同于传统技术依赖于鼠、兔、猴、羊等经典的模式动物，本发明的技术方案是依靠羊驼的免疫系统产生的抗体，被成为“纳米抗体”。纳米抗体是从骆驼、鲨鱼等动物体内免疫球蛋白分离出的微小抗体片段，它具有与完整抗体相同的抗原结合能力和结构稳定性，是现有可结合目标抗原的最小的单位，相对分子质量仅为15kD。相比于传统的鼠、兔等动物仅能识别抗原表面平展的多肽，羊驼等动物体内的免疫系统能够识别抗原表面复杂的空间结构，能够产生高度特异性、高亲和力的纳米抗体。
附图说明
图1为单抗Rab11_5C8与抗原亲和力检测结果示意图。
图2为单抗Rab11_5A10与抗原亲和力检测结果示意图。
图3为单抗Rab11_5H11与抗原亲和力检测结果示意图。
图4为单抗Rab11_6H3与抗原亲和力检测结果示意图。
图5为单抗Rab11_6G1与抗原亲和力检测结果示意图。
具体实施方式
为使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步的详细说明。此处所描述的具体实施例仅用于解释本发明，并不用于构成对本发明的任何限制。此外，在以下说明中，省略了对公知结构和技术的描述，以避免不必要地混淆本公开的概念。这样的结构和技术在许多出版物中也进行了描述。
定义
除非另有定义，否则本发明使用的所有技术术语和科技术语都具有如在本发明所属领域中通常使用的相同含义。出于解释本说明书的目的，将应用以下定义，并且在适当时，以单数形式使用的术语也将包括复数形式，反之亦然。
除非上下文另有明确说明，否则本文所用的表述“一种”和“一个”包括复数指代。例如，提及“一个细胞”包括多个这样的细胞及本领域技术人员可知晓的等同物等等。
本文所用的术语“约”表示其后的数值的±20％的范围。在一些实施方式中，术语“约”表示其后的数值的±10％的范围。在一些实施方式中，术语“约”表示其后的数值的±5％的范围。
Rab11：Rab11(Ras-related protein 11)是Ras超家族的成员，在蛋白质转运和膜重组中发挥作用。Rab家族蛋白质在非活性GDP结合形式和活性GTP结合形式之间循环，能够将不同组的下游效应子募集到膜上，直接负责囊泡的形成、运动、束缚和融合。Rab11的细胞生理功能包括参与极化囊泡运输和神经递质释放、与多种重要蛋白质共同促进转胞吞作用、调节高尔基体的紧凑形态、参与上皮细胞极化、参与膜运输到纤毛和纤毛发生、调节粘附连接组件等。
kd值：解离常数(dissociation constant，kd)是一种特定类型的平衡常数，用于衡量一较大物体与另一较小组分分开(解离)的倾向，是缔合常数的倒数，单位为mol/L(M)或nmol/L(nM)。kd值越小说明两个物质的结合能力越强。
纳米抗体：在骆驼科动物外周血液中存在的天然缺失轻链的抗体，该抗体只包含一个重链可变区(VHH)和两个常规的CH2与CH3区，但却不像人工改造的单链抗体片段那样容易相互沾粘，甚至聚集成块；单独克隆并表达出来的VHH结构具有与原重链抗体相当的结构稳定性以及与抗原的结合活性，是已知的可结合目标抗原的最小单位；VHH晶体为2.5nm，长4nm，分子量只有15KDa，因此也被称作纳米抗体(Nanobody，Nb)。相比于传统的鼠、兔等动物仅能识别抗原表面平展的多肽，骆驼科动物体内的免疫系统能够识别抗原表面复杂的空间结构，能够产生高度特异性、高亲和力的纳米抗体。
根据本发明的技术方案，在不改变蛋白的活性或功能的情况下，可以对氨基酸序列中的某些氨基酸进行保守取代，参见下表1：
表1
残基 保守性替换 残基 保守性替换
Ala Ser Leu Ile；Val
Arg Lys Lys Arg；Gln
Asn Gln；His Met Leu；Ile
Asp Glu Phe Met；Leu；Tyr
Gln Asn Ser Thr；Gly
Cys Ser Thr Ser；Val
Glu Asp Trp Tyr
Gly Pro Tyr Trp；Phe
His Asn；Gln Val Ile；Leu
Ile Leu；Val
此外，因为碱基的简并性，在不改变多核苷酸序列的活性或功能的情况下，可以对多核苷酸序列的碱基进行取代，参见下表2：
表2
下面提供实施例和附图以帮助理解本发明。但应理解，这些实施例和附图仅用于说明本发明，但不构成任何限制。本发明的实际保护范围在权利要求书中进行阐述。应理解，在不脱离本发明精神的情况下，可以进行任何修改和改变。
实施例1.制备抗原
重组人Rab11蛋白购于PROSPEC(货号：PRO-826)。
所述重组人Rab11蛋白抗原具有如SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列，具体为：
MRGSHHHHHHGMASMTGGQQMGRDLYDDDDKDRWGSMGTRDDEYDYLFKVVLIGDSGVGKSNLLSRFTRNEFNLESKSTIGVEFATRSIQVDGKTIKAQIWDTAGQERYRAITSAYYRGAVGALLVYDIAKHLTYENVERWLKELRDHADSNIVIMLVGNKSDLRHLRAVPTDEARAFAEKNGLSFIETSALDSTNVEAAFQTILTEIYRIVSQKQMSDRRENDMSPSNNVVPIHVPPTTENKPKVQCC(SEQ ID NO:1)。
实施例2.羊驼免疫注射
本实施例将实施例1的抗原免疫羊驼。具体步骤如下：
(1)将实施例1中的抗原平均分装成4份，每份约0.25mg；累计对羊驼进行4次免疫，将抗原经皮下注射至动物体内，记第一次免疫为第一天，后续的免疫分别于第10天、第19天、第28天；
(2)第28天，于第四次免疫注射前，采集约200mL羊驼静脉外周血液；
(3)第42天，即第四次免疫之后14天，采集约200mL羊驼静脉外周血液。
相比于传统鼠、兔等动物抗体的免疫技术方案，本技术优势在于采集大量的羊驼静脉外周血液，有利于后续筛选得到高度多样性的纳米抗体。
实施例3.构建羊驼的纳米抗体文库
以实施例2中采集的两批次羊驼静脉外周血液为原料，构建高多样性的纳米抗体文库。两批次羊驼静脉外周血液的处理方法相同，具体步骤如下：
(1)使用密度梯度离心等方法，从羊驼静脉外周血液中分离得到淋巴细胞；
(2)提取淋巴细胞的总mRNA，并反转录为cDNA；
(3)使用适当的DNA引物，以上述cDNA为模板，经聚合酶链式反应(PCR)扩增得到羊驼免疫球蛋白IgG2和IgG3的VHH片段，即纳米抗体的DNA片段；
(4)将VHH的DNA连接至噬菌体表面展示筛选载体，构成VHH-pIII融合蛋白表达载体质粒库；其中，pIII是存在于噬菌体表面鞭毛上的蛋白质；
(5)将DNA连接产物经电转化方法，转化至TG1感受态细菌，适当培养后收集全部菌落，即为羊驼的纳米抗体文库。
相比于传统的从鼠、兔等动物血清或淋巴细胞中分离得到抗体的方法，本技术方案能够长期保存持有羊驼的全部纳米抗体片段(即文库)，能够持续地支撑后续不断地进行纳米抗体的筛选与开发。
实施例4.噬菌体表面展示筛选特异性纳米抗体
本实施例以实施例3得到的纳米抗体文库为来源，经噬菌体表面展示筛选得到抗原特异性的纳米抗体。具体步骤如下：
(1)取适量冻存的纳米抗体文库，接种至细菌培养基，经适当培养后加入适量的辅助噬菌体，继续于适量条件下培养；
(2)以PEG-NaC法提取细菌培养上清中扩增的噬菌体；
(3)将噬菌体与抗原适当孵育，Rab11抗原预先固定于免疫试管(Maxisorp免疫试管，ThermoFisher Scientific)；
(4)淘洗：弃去噬菌体，再以适当的缓冲液(如PBS等)润洗抗原适当次数，淘洗、除去与抗原非特异性结合的噬菌体，保留与抗原特异性结合的噬菌体；
(5)洗脱：以合适的方法处理与抗原特异性结合的噬菌体(如酸性甘氨酸溶液等)，使噬菌体与抗原解离并保留。
至此，即得到了表达有特异性纳米抗体的噬菌体，这些噬菌体可进行下述操作：
(6)转变为特异性的纳米抗体文库：将噬菌体再次侵染培养至合适状态的大肠杆菌，但不再加入辅助噬菌体，待噬菌体侵染完全后，特异性的纳米抗体即以DNA质粒的形式存在于大肠杆菌中。收集这些全部的大肠杆菌，即成为抗原特异性的纳米抗体文库，可以此文库为原料，返回步骤(1)进行下一轮的噬菌体表面展示筛选；
(7)转变为单克隆纳米抗体菌落：取少量步骤(5)得到的噬菌体(如0.5％)，稀释后再次侵染培养至合适状态的大肠杆菌，但不再加入辅助噬菌体，待噬菌体侵染完全后，将这些大肠杆菌均匀涂抹于细菌培养皿，适当调节下培养即可得到含有纳米抗体DNA质粒的单克隆菌落。以这些单克隆菌落为原料，可进行阳性单克隆纳米抗体的鉴定。
实施例5.鉴定阳性单克隆纳米抗体
本实施例利用实施例4步骤(7)得到长有单克隆菌落的细菌培养皿，进行阳性单克隆纳米抗体的鉴定。具体步骤如下：
(1)挑取单克隆菌落于微孔板进行培养；
(2)加入IPTG诱导VHH-pIII(即含有纳米抗体的融合蛋白质)表达；
(3)收集含有纳米抗体的细菌培养上清，与抗原Rab11孵育，抗原预先固定于96微孔板(Maxisorp透明微孔板，ThermoFisher Scientific)；
(4)利用酶联免疫吸附检测(ELISA)，检测单克隆纳米抗体是否与Rab11抗原结合；
(5)对于可以与抗原结合的单克隆纳米抗体微生物菌落，再次适当培养后，提取DNA质粒并进行DNA测序获得纳米抗体核酸序列，翻译后即可得到纳米抗体的完整氨基酸序列，如表3-7所示。
表3.单抗Rab11_5C8的氨基酸序列和核苷酸序列
表4.单抗Rab11_5A10的氨基酸序列和核苷酸序列
表5.单抗Rab11_5H11的氨基酸序列和核苷酸序列
表6.单抗Rab11_6H3的氨基酸序列和核苷酸序列
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表7.单抗Rab11_6G1的氨基酸序列和核苷酸序列
实施例6.小批量单克隆纳米抗体重组表达与纯化
(1)经实施例5得到了能够特异性识别并结合抗原的单克隆纳米抗体，将纳米抗体的DNA质粒转化至BL21(DE3)感受态细胞，借助大肠杆菌表达系统即可小批量表达、纯化单克隆纳米抗体，批产能约数毫克。
(2)利用ELISA方法，孵育不同浓度的纳米抗体，根据纳米抗体与Rab11的结合能力测量纳米抗体与抗原的亲和力大小。
得到两组单克隆菌落对应抗体，与Rab11蛋白抗原的亲和力大小的检测结果如图1～5所示，亲和力数值kd的结果如下表8所示。
表8.亲和力测试结果
kd(nM)
Rab11_5C8 99.28
Rab11_5A10 145.8
Rab11_5H11 248.4
Rab11_6H3 37.54
Rab11_6G1 36.06
由以上结果可知，本实施例挑选得到单克隆菌落所得抗体与所述Rab11蛋白结合的kd值在500nM以下，优选在300nM以下，更优选在200nM以下，更优选在100nM以下，更优选在50nM以下。
本发明的技术方案不限于上述具体实施例的限制，凡是根据本发明的技术方案做出的技术变形，均落入本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.特异性识别和/或结合Rab11蛋白的纳米抗体或其活性片段。
2.根据权利要求1所述的纳米抗体或其活性片段，其特征在于，所述纳米抗体或其活性片段包含重链可变区，所述重链可变区具有：
如SEQ ID NO:2所示的CDR1、如SEQ ID NO:7所示的CDR2和如SEQ ID NO:12所示的CDR3；或，如SEQ ID NO:3所示的CDR1、如SEQ ID NO:8所示的CDR2和如SEQ ID NO:13所示的CDR3；或，如SEQ ID NO:4所示的CDR1、如SEQ ID NO:9所示的CDR2和如SEQ ID NO:14所示的CDR3；或，如SEQ ID NO:5所示的CDR1、如SEQ ID NO:10所示的CDR2和如SEQ ID NO:15所示的CDR3；或，如SEQ ID NO:6所示的CDR1、如SEQ ID NO:11所示的CDR2和如SEQ ID NO:16所示的CDR3；
优选地，所述重链可变区具有：
如SEQ ID NO:17所示的氨基酸序列，或SEQ ID NO:17所示的氨基酸序列经过一个或多个氨基酸添加、删除、替换或修饰获得的保守性变异体；或，如SEQ ID NO:18所示的氨基酸序列，或SEQ ID NO:18所示的氨基酸序列经过一个或多个氨基酸添加、删除、替换或修饰获得的保守性变异体；或，如SEQ ID NO:19所示的氨基酸序列，或SEQ ID NO:19所示的氨基酸序列经过一个或多个氨基酸添加、删除、替换或修饰获得的保守性变异体；或，如SEQ IDNO:20所示的氨基酸序列，或SEQ ID NO:20所示的氨基酸序列经过一个或多个氨基酸添加、删除、替换或修饰获得的保守性变异体；或，如SEQ ID NO:21所示的氨基酸序列，或SEQ IDNO:21所示的氨基酸序列经过一个或多个氨基酸添加、删除、替换或修饰获得的保守性变异体。
3.核酸分子，其编码权利要求1或2所述纳米抗体或其活性片段。
4.表达载体，其含有权利要求3所述核酸分子；
优选地，所述表达载体为噬菌体表达载体，优选为噬菌体表面展示筛选载体；
更优选地，所述表达载体中还含有编码噬菌体包膜蛋白pIII的核苷酸序列。
5.宿主细胞，其外源转入了权利要求4所述表达载体，优选为大肠杆菌。
6.利用所述权利要求5所述宿主细胞表达纳米抗体或其活性片段的方法。
7.权利要求1或2所述纳米抗体或其活性片段经人源化后获得的人源化纳米抗体或其活性片段。
8.蛋白偶联物，其特征在于，包含权利要求1或2所述纳米抗体或其活性片段或权利要求7所述人源化纳米抗体或其活性片段；
优选地，所述蛋白偶联物还包括配体，其中所述配体选自放射性同位素、荧光基团和递送载体。
9.检测样品中Rab11蛋白含量的试剂盒，其特征在于，包含权利要求1或2所述纳米抗体或其活性片段或权利要求7所述人源化纳米抗体或其活性片段；
优选地，所述抗原结合蛋白、抗体或抗体活性片段经标记物标记；所述标记物优选为酶、化学发光基团或同位素基团；
更优选地，所述样品为动物血清，优选为人血清。
10.权利要求1或2所述纳米抗体或其活性片段、权利要求7所述人源化纳米抗体或其活性片段、权利要求8所述蛋白偶联物在制备检测样品中Rab11蛋白含量的试剂盒中的应用；
优选地，所述样品为动物血清，优选为人血清。
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