CN103339147A - 抗il-18抗体和其用途 - Google Patents

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Abstract

本发明提供具有针对白细胞介素-18的特异性结合亲和力的人、人源化和/或嵌合抗体以及其片段、衍生物/偶联物和组合物。本发明包括这些抗体用于诊断和治疗与IL-18活性增加相关的疾病的用途，后者呈一种药用组合物形式。

Description

抗IL-18抗体和其用途
发明领域
本发明涉及结合白细胞介素18（IL-18）并且抑制其生物效应的抗体分子。抗IL-18抗体可适用于例如诊断和治疗与IL-18水平升高相关的病症，包括炎症性、心血管性以及自身免疫性疾病。
发明背景
白细胞介素-18（IL-18）是在先天性和获得性免疫应答中发挥作用的一种有效的细胞因子。IL-18首先因其能够诱导IFN-γ的产生而被鉴别，该IFN-γ是T辅助细胞（Th）1型免疫应答的其中一种主要效应分子（冈村（Okamura）等人（1995）自然（Nature）378:88-91）。后来证明，在某些环境下，IL-18还可造成发展另外的应答如Th2（中西（Nakanishi）等人（2001）免疫学年评（Annu Rev Immunol.）19:423-74)。除了其对于分化簇（CD）4+和CD8+T细胞的刺激效应以外，IL-18已被证明对于各种细胞类型包括嗜中性粒细胞、单核细胞/巨噬细胞、自然杀伤细胞（NK）细胞、上皮和内皮细胞具有广泛范围的炎症相关效应。
IL-18属于白细胞介素-1（IL-1）超家族，并且如同IL-1β（IL-1β），它首先作为无活性细胞内多肽，pro-IL-18（24kDa）来加以合成。该前肽的酶促切割释放生物活性成熟形式的IL-18（18kDa）。IL-18是由巨噬细胞和免疫应答中所涉及到的其他细胞产生。除了其生理作用以外，IL-18还造成严重的炎症反应，提供了其在某些炎症性病症例如自身免疫性疾病中的作用的指示。IL-18部分地由内源性IL-18结合蛋白（IL-18BP）来调控，该IL-18结合蛋白结合至IL-18并且阻断其结合至IL-18受体（IL-18R），从而中止IL-18活性。然而，在某些情况下，此负反馈回路不足以充分地中止IL-18的生物效应，而仍然提供启始先天性免疫应答的足够IL-18生物活性。
IL-18的生物活性在IL-18结合至细胞结合的IL-18R时产生，从而启始导致表达其他细胞因子的细胞信号传导。IL-18R是包含两个IgG样多肽链的一种异二聚体，这些多肽链形成一种功能性复合物，其中β链含有IL-18结合基序并且α链含有细胞内信号传导域（TIR）（鸟越（Torigoe）等人（1997）生物化学杂志（J Biol Chem）272:25737）。IL-18似乎首先结合IL-18Rα并且然后β链被募集以形成该功能性异二聚体。IL-18与α/β复合物的结合导致活化细胞内信号传导级联。因此，阻断IL-18与IL-18Rα的结合可适用于中止不需要的IL-18。
IL-18已经涉及许多人疾病，主要为自身免疫性或炎症性疾病和癌症。牛皮癣患者在皮肤病变和循环两者中具有增加的IL-18（弗里斯克（Flisiak）等人（2006）11:194)。已经在患有多发性硬化的患者的脑脊液和血浆中观察到升高的血浆IL-18水平（法斯宾德（Fassbender）等人（1999）神经学（Neurology）53:1104；尼可利提（Nicoletti）等人（2001）神经学57:342）。患有炎症性肠病（例如克罗恩氏病（Crohn’s disease）、溃疡性结肠炎）的患者在循环中具有升高的IL-18水平（路德维茲可（Ludwiczek）等人（2005）欧洲细胞因子网络（Eur.Cytokine Netw.）16:27；威尔辛斯基-德拉帕罗（Wiercinska-Drapalo）等人（2005）世界胃肠病学杂志（World JGastroenterol.）11:605）。患有类风湿性关节炎（RA）的患者在滑液中具有升高的IL-18水平（格蕾茜（Gracie）等人（1999）临床研究杂志（J ClinInvest）104:1393）。IL-18也已经被证明在患有具有全身表现的其他关节炎疾病例如斯提耳氏病（Still’sdisease）（川岛（Kawashima）等人（2001）类风湿性关节炎（Arthritis Rheum.）44(3):550-60）和全身性幼年特发性关节炎（sJIA）（前野（Maeno）等人（2002）类风湿性关节炎46(9):2539-41；清水（Shimizu）等人（2010）风湿病学（Rheumatology）49(9):1645-53）的患者的血清中增加并且已经被建议为疾病严重性的标记（川口（Kawagushi）等人（2001）类风湿性关节炎44(7):1716-7；洛蒂托(Lotito)等人（2007）风湿病学杂志（J Rheumatol.）34(4):823-30)。在这些自身炎症性病症中，已证明循环的IL-18在疾病的活动期期间以及在显现并发症例如巨噬细胞活化综合征的患者的子集中进一步增加（清水等人（2010）风湿病学49(9):1645-53）。也已证明IL-18水平全身性地以及在慢性阻塞性肺病（COPD）患者的肺组织这二者中增加，其中IL-18与肺泡巨噬细胞、CD8+T细胞以及气道上皮细胞相关（今冈（Imaoka）等人（2009）欧洲呼吸杂志（Eur Respir J.）31:287-97；康（Kang）等人（2007）免疫学杂志178(3):1948-59；彼得森（Petersen）等人（2007）肺（Lung）185:161-71；罗维纳（Rovina）等人（2009）呼吸道医学（Respir Med.）103:1056-62）。IL-18还可造成COPD共病（彼得森等人（2007）肺185:161；拉森（Larsen）等人（2008）心血管研究（CardiovascRes）80:47）。
在心血管疾病中，在急性冠状动脉综合征、心肌梗塞、冠状动脉粥样硬化以及不稳定性心绞痛中测量出循环IL-18的升高的血浆或血清水平（马拉特（Mallat）等人（2002）心脏（Heart）88:467；哈尔泽（Hulthe）等人（2006）动脉粥样硬化（Atherosclerosis）188:450；马拉特等人（2001）循环（Circulation）104:1598）。血清IL-18水平还与颈动脉的内膜-中层厚度相关（山上（Yamagami）等人（2004）动脉粥样硬化、血栓和血管生物学（Arterioscler Thromb Vasc Biol）25:1458）。
一些类型的癌症也与升高的IL-18表达水平相关。然而，IL-18的作用在恶性疾病中可为双重的（迪那雷罗（Dinarello）（2008）癌症与转移综述（Cancer&Metastasis Rev）25:307）。一方面，IL-18可为促血管生成的并且从而可促进肿瘤发生，另一方面它可刺激细胞免疫应答，例如NK细胞介导的细胞毒性并且从而充当抗肿瘤发生剂（金（Kim）等人（2007）致癌基因（Oncogene）26:1468）。
许多这些临床观察结果也在人类疾病的动物模型中得到佐证。这些研究已经确定依赖于IL-18的疾病机制以及将IL-18作为干预的潜在目标。已证明实验性自身免疫性脑炎（EAE）中的CNS病变的发生取决于IL-18Rα的参与，这些实验性自身免疫性脑炎是多发性硬化的最广泛使用的动物模型（古彻（Gutcher）等人（2006）自然—免疫学（Nat Immunol）7:946）。已证明将IL-18给予动物增强了RA的胶原诱导性关节炎模型中的疾病（格蕾茜等人（1999）临床研究杂志104:1393），而缺乏IL-18或IL-18中和疗法减弱疾病的严重性（班达（Banda）等人（2003）免疫学杂志170:2100）。IL-18敲除小鼠对于实验诱导的结肠炎具有抵抗力（霍沃（Hovet）等人（2001）胃肠病学（Gastroenterol）121:1372），而过表达IL-18的转基因动物更易患病（石仓（Ishikura）等人（2003）胃肠病学与肝脏病学杂志（J Gastroenterol Hepatol）18:960）。IL-18中和治疗减弱了肠道炎症（洛克纳（Lochner）和福斯特（Foster）（2002）病理生物学（Pathobiol）70:164）。
在针对COPD开发的动物模型中，已证明香烟烟雾增加肺组织中的IL-18局部表达（康等人（2008）临床调查研究118:2771，康等人（2007）免疫学杂志178:1948）。在此模型中，经由破坏IL-18Rα基因来减少IL-18信号传导导致了肺炎症、细胞凋亡以及肺气肿降低（Kang等人（2007）免疫学杂志178:1948）。相反地，小鼠肺中的IL-18过表达与肺部炎症相关，该肺部炎症的特征为CD8+T细胞、巨噬细胞、嗜中性粒细胞和嗜曙红细胞的募集以及具有肺气肿表型的肺（星野（Hoshino）等人（2007）美国呼吸与重症护理医学（Am J Respir Crit Care Med）176:49）。除了慢性肺炎症以外，IL-18可与病毒或细菌触发的恶化相关。在香烟烟雾小鼠模型中，已证明IL-18水平通过用聚(I:C)治疗小鼠或感染流感而进一步增强并且造成炎症、肺泡重构以及细胞凋亡（康等人（2008）上述）。
许多实验动物模型已经确定IL-18在心血管性疾病、尤其在发生动脉粥样硬化中的作用。将重组IL-18给予ApoE-/-小鼠导致了动脉粥样硬化病变尺寸增加和血浆IFNγ水平升高（滕格（Tenger）等人（2005）动脉粥样硬化、血栓和血管生物学25:791）。天然产生IL-18抑制剂IL-18BP在ApoE-/-小鼠中的过表达导致动脉粥样硬化减少和斑块表型的较大变化，指示了更“稳定”的病变（马拉特等人（2001）循环研究（Circ Res）89:E41）。双重敲除ApoE-/-x IL-18-/-小鼠的表型与过表达IL-18BP的ApoE-/-小鼠的相似之处在于病变更小并且其表型更“稳定”（埃尔哈吉（Elhage）等人（2003）心血管研究59:234）。在大鼠血管损伤模型中给予一种中和性抗IL-18抗体显著减少了新内膜形成，这对应于减少的内膜内细胞增殖，以及IFNγ和IL-6基因表达（马菲亚（Maffia）等人（2006）循环114:430）。另外，IL-18-/-小鼠易患饮食过多、肥胖症以及胰岛素抵抗（娜塔（Netea）等人（2006）自然—医学（Nat.Med.）12:650）。
如上所述，IL-18可被认为是介导疾病的促炎症性细胞因子，以及对于宿主防御感染和癌症来说重要的免疫刺激性细胞因子。
与细胞表面受体一起竞争IL-18并且中和IL-18活性的高亲和力的、构成性表达的、和循环的IL-18结合蛋白（IL-18BP）可充当一种天然抗炎症性以及免疫抑制性分子。在人类中，已经鉴别通过选择性剪接产生的IL-18BP的四个不同的同种型（a、b、c以及d）。仅IL-18BPa和IL-18BPc已被证明结合并且中和人IL-18的生物活性，与同种型c相比，同种型a具有高10倍的亲和力（金等人（2000）PNAS971190-1195）。人IL-18的计算机模拟鉴别了两个带电荷的残基，Glu-42和Lys-89，它们与埋藏在IL-18BP的较大疏水袋中的带相反电荷的氨基酸残基相互作用。细胞表面IL-18受体α链与IL-18BP竞争进行IL-18结合，尽管IL-18受体α链与IL-18BP不共有显著同源性。
可溶性IL-18的结构已经通过NMR光谱确定并且由形成β-三叶形构造的12条链组成（加藤（Kato）等人（2003）自然—结构与生物学（Nat.Struct.Biol.）10:966）。已经鉴别了三个具体表面区域。部位I是由位于核心筒一侧上的五个残基（Arg13、Asp17、Met33、Asp35以及Asp132）形成并且负责结合至IL-18Rα。部位II是由位于β-筒顶部上的六个残基（Lys4、Leu5、Lys8、Arg58、Met60以及Arg104）形成并且对于IL-18Rα结合也是重要的。与部位II相反位于β-筒底部上的部位III（Lys79、Lys89、asp98）是结合至IL-18Rβ（加藤等人（2003）上述）。
结合IL-18的抗体在本领域中为已知的（参见例如US6706487、WO2001/058956、EP1621616、US2005/0147610；EP0974600；以及WO0158956）。然而，仍然需要在治疗情形下减少IL-18的生物活性的抗IL-18抗体。
发明概述
本发明的多个方面提供白细胞介素-18（IL-18）的分离的结合成员，这些分离的结合成员抑制IL-18结合至IL-18R和IL-18BP中的一个或两个并且从而减少IL-18活性。
本发明的结合成员可结合至Il-18分子上的与IL-18BP结合部位全部或部分重叠的一个表位。IL-18分子上的IL-18BP结合部位示于图13中。
例如，本发明的结合成员可结合至人IL-18的一个表位，该表位包含以下残基中的一个或多个：Tyr1、Gly3、Leu5、Glu6、Lys8、Met51、Lys53、Asp54、Ser55、Gln56、Pro57、Arg58、Gly59、Met60、Arg104、Ser105以及Pro107。
本发明的结合成员可适用于诊断和治疗与IL-18活性增加相关的疾病，例如急性冠状动脉综合征（ACS）；动脉粥样硬化；以及慢性阻塞性肺病（COPD）。
本发明的结合成员还可适用于测量样本中的游离IL-18的量。
附图简述
图1示出了由增加浓度的抗体1scFv（三角形）对人IL-18、IL-18受体α以及IL-18受体β复合物的形成的抑制。Y轴代表作为在不存在任何scFv的情况下所观察到的总结合的百分比的IL-18与IL-18受体复合物的特异性结合。数据代表具有SEM的重复点的平均值。
图2在图A中示出了由增加浓度的抗体1IgG2（三角形）对人IL-18、IL-18受体α以及IL-18受体β复合物的形成的抑制并且在图B中示出了由增加浓度的抗体1IgG2（三角形）对恒河猴IL-18、IL-18受体α以及IL-18受体β复合物的形成的抑制。Y轴代表作为在不存在任何IgG的情况下所观察到的总结合的百分比的IL-18与IL-18受体复合物的特异性结合。数据代表具有SEM的重复点的平均值。
图3示出了由增加浓度的抗体1IgG2（圆形）对人IL-18BPa-Fc结合至人IL-18-FH的抑制。Y轴代表作为在不存在任何IgG的情况下所观察到的总结合的百分比的IL-18与IL-18BPa-Fc的特异性结合。数据代表具有SEM的重复点的平均值。
图4示出了由增加浓度的抗体9scFv（圆形）和抗体10scFv（方形）对抗体6GL结合至人IL-18的抑制。Y轴代表作为在不存在任何scFv的情况下所观察到的总结合的百分比的IL-18与抗体6GL的特异性结合。数据代表具有SEM的重复点的平均值。
图5示出了在增加浓度的抗体9scFv（方形）、抗体10scFv（圆形）以及抗体7scFv（三角形）的存在下以外源性人IL-18和TNFα刺激的KG-1细胞的IFNγ释放的抑制。Y轴代表作为在不存在中和抗体的情况下获得的最大应答的百分比的IFNγ释放。数据代表具有SEM的重复孔的平均值。
图6示出了在增加浓度的种系化抗IL-18IgG的存在下以外源性人IL-18和TNFα刺激的KG-1细胞的IFNγ释放的抑制。全部转换为IgG2的抗体11GL（圆形）、抗体12GL（方形）、抗体8GL（菱形），和对照IgG（三角形）的中和效应示于图A中。转换为IgG1TM的抗体12GL（空心方形）和对照IgG（空心三角形）的中和效应示于图B中。Y轴代表作为在不存在中和抗体的情况下获得的最大应答的百分比的IFNγ释放。数据代表具有SEM的重复孔的平均值。
图7示出了在增加浓度的种系化抗体12IgG1TM（方形）和对照IgG（三角形）的存在下以LPS和人IL-12刺激的人（图A）和食蟹猴（图B）来源的PBMC的IFNγ释放的抑制。Y轴代表作为在不存在中和抗体的情况下获得的最大应答的百分比的IFNγ释放。数据代表具有SEM的3个供体的平均值。
图8示出了在增加浓度的种系化抗体12IgG1TM（圆形）或对照IgG（三角形）的存在下在以人IL-18刺激的人嗜中性粒细胞上的CD11b上调的抑制。Y轴代表在减除未处理细胞中的表达水平之后CD11b表达的几何平均值。数据代表具有SEM的重复孔的平均值。
图9示出了在增加浓度的种系化抗体12IgG1TM（方形）或对照IgG（三角形）的存在下以人IL-18和fMLFF刺激的人嗜中性粒细胞的活性氧物质（ROS）产生的抑制。Y轴代表在减除未处理的细胞中观察到的水平之后对于ROS产生为阳性（在FL-2通道中）的细胞的百分比。数据代表具有SEM的重复孔的平均值。
图10示出了在增加量的抗体12GL IgG1TM的存在下由人IL-18刺激的KG-1细胞的IFNγ释放的剂量依赖性诱导（图A）和用于确定抗体的KD的对应希尔德（Schild）绘图（图B）。
图11示出了由增加浓度的抗体12GL IgG2（圆形）对人IL-18BPa-Fc结合至人IL-18-FH的抑制。Y轴代表作为在不存在任何IgG的情况下所观察到的总结合的百分比的IL-18与IL-18BPa-Fc的特异性结合。数据代表具有SEM的重复点的平均值。
图12示出了IL-18:抗体12GL的复合物，其中IL-18的多肽链（灰色）与抗体12GL（黑色）复合。
图13示出了IL-18序列内的、与抗体12GL（上）和IL-18BP（下）相互作用的残基（灰色，加下划线）（即表位）。
图14示出了抗体12GL序列内的、与IL-18相互作用的残基（灰色；加下划线）（即互补位）。
图15示出了pCLD-1128质粒的图谱。
图16示出了在关于使用重组IL-18BP的游离IL-18的测定中来自重组IL-18的信号的浓度依赖性抑制。
图17示出了在关于游离IL-18的测定中由重组IL-18BP和抗体12GL对来自三个人唾液样本中的内源性游离IL-18的信号的抑制。
详细说明
本发明提供了结合至IL-18的结合成员，包括人、人源化和/或嵌合抗体，以及其片段、衍生物/偶联物和组合物。在此描述的结合成员可调节IL-18与IL-18BP和/或IL-18R的结合并且可适用于降低IL-18的生物活性，例如在体内、离体或在体外。结合至IL-18的结合成员还可适用于例如检测样本中的IL-18的存在。
本发明的一个方面提供了一种对于IL-18的分离的结合成员，该分离的结合成员抑制IL-18结合至IL-18R和IL-18BP中的一个或两个并且从而减少IL-18活性。
分离的结合成员可结合至Il-18分子上的与IL-18BP结合部位全部或部分重叠的一个表位。
IL-18BP结合部位示于图13中。
例如，一种对于IL-18的分离的结合成员可特异性地结合至IL-18的一个表位，该表位包含人IL-18的残基Tyr1、Gly3、Leu5、Glu6、Lys8、Met51、Lys53、Asp54、Ser55、Gln56、Pro57、Arg58、Gly59、Met60、Arg104、Ser105以及Pro107中的一个或多个、或来自其他物种（例如灵长类动物，如恒河猴）的IL-18的对应残基。
对于IL-18的结合成员可结合至一个IL-18表位，该表位包含选游离人IL-18的Tyr1、Gly3、Leu5、Glu6、Lys8、Met51、Lys53、Asp54、Ser55、Gln56、Pro57、Arg58、Gly59、Met60、Arg104、Ser105以及Pro107组成的组中的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16或所有17个残基。
例如，IL-18表位可包含残基Tyr1、Gly3、Leu5、Met51、Lys53、Asp54、Ser55、Gln56、Pro57、Arg58、Gly59、Met60、Arg104以及Ser105。可任选地，该表位可进一步包含残基Glu6、Lys8以及Pro107。
在一些优选实施例中，对于IL-18的结合成员可结合至由Tyr1、Gly3、Leu5、Met51、Lys53、Asp54、Ser55、Gln56、Pro57、Arg58、Gly59、Met60、Arg104以及Ser105组成的一个IL-18表位。
表位残基得以展示的IL-18的序列在图13中阐明。
被鉴别为IL-18表位一部分的Il-18残基在此展示为定位于结合的IL-18/抗体复合物中的抗体可变域的一个或多个残基的0.5nm
Figure BDA00003372980800091
内。在一些实施例中，也位于结合的IL-18/抗体复合物中的抗体可变域的一个另外残基的附近（例如在0.75nm内或在1nm内）的其他Il-18残基也可被认为是IL-18表位的一部分。
除非另外规定，否则IL-18为人IL-18。人IL-18的许多多态性变体是已知的。两个最常见多态性变体在SNP数据库中具有登录号rs2854746（A32G）和rs9282734（H158P）。人IL-18的序列可在公用数据库上获得（基因ID：3606；NCBI NP_001553.1GI：4504653；Uniprot Q14116-1）并且成熟人IL-18序列示于SEQ ID NO：169中。非人IL-18是指IL-18的一种直系同源物，它天然地出现于除人类以外的物种中，例如啮齿动物或非人灵长类动物。来自其他物种，包括恒河猴的IL-18序列在本领域中为已知的并且可在公用数据库例如Genbank上获得。对应于人IL-18中的具体残基的来自其他物种的IL-18序列中的残基可容易地使用序列比对工具来鉴别。
重组表达的成熟人和恒河猴IL-18被用于选择和筛选在此描述的抗体分子。非人直系同源物，例如啮齿动物和恒河猴IL-18，用于在此针对物种交叉反应性分析所描述的实验中。
如所描述的结合成员结合至人IL-18。结合成员还可结合至来自其他物种的IL-18中的目标表位。例如，在此描述的结合成员可结合至来自非人灵长类动物，例如恒河猴和/或食蟹猴的IL-18。在一些实施例中，结合成员可显示不结合或大致上不结合至啮齿动物IL-18，例如小鼠或大鼠IL-18。
在此描述的结合成员对于在此描述的目标IL-18表位具有特异性并且相对于非目标表位，例如来自除IL-18以外的蛋白质的表位，以高亲和力结合至此目标表位。例如，结合成员可显示比其他人细胞因子，例如IL-1β和IL-1F7大至少10倍、至少100倍、至少500倍、至少1000倍或至少2000倍的对于IL-18的结合亲和力。
结合成员可对于人IL-18以及可任选地恒河猴IL-18展现以下解离常数（kd）：小于10-2s-1、优选地小于10-3s-1、更优选地小于10-4s-1，例如9×10-5或更小，并且通常为2至9×10-5s-1（例如，如通过在此描述的Biacore测量，对于抗体12GL IgG1TM为2.9×10-5s-1）。
结合成员可对于人IL-18展现以下亲和力（kD）：小于10nM（例如，如在此描述的Biacore测定中测量的抗体1，KD=9.96nM）；优选地小于1nM、更优选地小于500pM、更优选地小于100pM、仍进一步优选地优选地小于70pM（例如，如在此描述的Biacore测定中测量的抗体12GL IgG1TM，KD=63pM）。结合成员的结合动力学和亲和力（表达为平衡解离常数KD）可使用在此描述的标准技术来确定，例如表面等离子体共振，例如使用BIAcoreTM分析或在药理上使用基于细胞的测定（希尔德绘图/pA2分析）。
在此描述的结合成员可抑制IL-18结合至IL-18受体（IL-18R）和/或IL-18结合蛋白（IL-18BP）。例如，结合成员可与IL-18R（IL-18Rα，Uniprot登录#Q13478；IL-18Rβ，Uniprot登录#O95256）和/或IL-18BP，例如IL-18BP同种型a（Uniprot登录#O95998）竞争结合至IL-18。
竞争可使用标准技术来测量，例如，如在实例中描述的IL-18/IL-18BP均相时间分辨荧光（HTRFTM）竞争测定。例如，结合成员可展现IL-18BP结合至IL-18的至少70%、至少75%、至少80%、最小85%或至少90%抑制，如例如在合适测定中以10nM来测量，该合适测定例如为HTRFTMIL-18/Il-18BP竞争测定。
在此描述的结合成员可抑制IL-18的生物活性。例如在在此描述的测定中结合成员对IL-18活性的抑制指示结合成员结合并且抑制IL-18。IL-18活性的抑制可便利地通过IFNγ产生的降低来测量。抑制还可例如通过ELISA测定的其他可溶性介体例如IL-8、MCP-1、CXCL16、GM-CSF、sICAM-1以及MMP的释放来测量。
用于测量IFNγ和其他可溶性介体的产生和释放的技术在本领域中为熟知的并且包括基于细胞的测定，例如KG-1测定和PBMC测定；免疫技术，例如ELISA、蛋白质印迹和免疫沉淀反应；亲和色谱和其他生化测定。
IL-18活性的抑制还可通过细胞上的活化标记物例如CD11b的表达的减少或氧化应激介体例如活性氧物质（ROS）产生的减少来测量。用于测量CD11b或ROS的调节的技术在本领域中为熟知的并且包括基于细胞的测定，例如嗜中性粒细胞刺激测定；免疫技术，例如流式细胞术的免疫染色以及其他生化测定。
IL-18活性的抑制可为部分或完全的（即中和）。例如，相对于不存在结合成员时的活性，结合成员可抑制IL-18活性达100%，或至少95%、至少90%、至少85%、至少80%、至少75%、至少70%、至少60%或至少50%。
可确定结合成员的中和效力。除非另外说明，否则效力通常表达为以nM计的IC50值。在功能性测定中，IC50是抗体分子的浓度，此浓度减少生物应答达其最大值的50%。在配体结合研究中，IC50是减少受体结合达最大特异性结合水平的50%的浓度。可计算IC50，方法是作为结合成员浓度的对数的函数将最大生物应答的%作图，并且使用软件程序，例如Prism（GraphPad）或Origin（Origin Labs）来将S形函数拟合至数据以便产生IC50值。用于测量或确定效力的合适测定在本领域中是熟知的。
如例如通过IL-18触发的IFNγ释放来测量，在此描述的结合成员对于IL-18可展现小于260nM、小于100nM、小于10nM、小于5nM、小于1nM或小于0.5nM的IC50值（表达为效力的几何平均值）。用于IFNγ释放的合适测定包括KG-1和PBMC测定，如在此描述。
如在使用来自第一物种（例如人）的IL-18的测定中计算的一种结合成员的中和效力可与在使用来自第二物种的IL-18（例如恒河猴IL-18）的相同测定中的该结合成员的中和效力相比，以便评估该结合成员对于两个物种的IL-18的交叉反应性的程度。与在非人IL-18测定中相比，在此描述的结合成员可在人IL-18测定中具有更大的中和效力。例如，结合成员对于人IL-18的中和效力可大于对于恒河猴IL-18的中和效力。
结合成员可包含一种抗体分子，该抗体分子具有处于抗体框架（即抗体抗原结合域）内的一个或多个CDR，例如一组CDR。例如，抗体分子可包含一个抗体VH和/或VL域。抗体分子的VH域和VL域也作为本发明的一部分来提供。如熟知的，VH域和VL域包含互补决定区（“CDR”）和框架区（“FW”）。VH域包含一组HCDR并且VL域包含一组LCDR。抗体分子可包括包含VH CDR1、CDR2和CDR3的一个抗体VH域和/或包含VL CDR1、CDR2和CDR3的一个抗体VL域。VH域或VL域可进一步包含一个框架。一个VH域或VL域框架典型地包含四个框架区，FW1、FW2、FW3和FW4，它们在以下结构中穿插有CDR：FW1-CDR1-FW2-CDR2-FW3-CDR3-FW4。
根据本发明的多个方面的抗体VH域和VL域、FW以及CDR的实例在表10和11以及形成本披露的一部分的附加序列表中列出。在此披露的所有VH和VL序列、CDR序列、CDR的集合、HCDR的集合和LCDR的集合、以及这些元件的组合代表本发明的多个方面。如在此描述，“CDR集合”包含CDR1、CDR2以及CDR3。因此，一组HCDR是指HCDR1、HCDR2以及HCDR3，并且一组LCDR是指LCDR1、LCDR2以及LCDR3。除非另外说明，否则“CDR集合”包括HCDR和LCDR。典型地本发明的抗体分子为单克隆抗体。
在其他实施例中，结合成员可包含处于非抗体分子内的一个抗原结合部位，该抗原结合部位通常由非抗体蛋白质支架中的一个或多个CDR例如一组CDR来提供，如以下进一步讨论。
在此描述了具有如表10、11和序列表中所示的一组CDR序列和框架序列的指定为抗体1的亲本抗体分子的分离。通过优化过程，已经从抗体1产生一组抗体克隆，将它们指定为抗体1GL、抗体2、抗体3、抗体4、抗体5、抗体6、抗体6GL、抗体7、抗体7GL、抗体8_GL、抗体9、抗体10、抗体11、抗体11GL以及抗体12GL。这些优化克隆的CDR序列和可变域序列在表10和11中提及并且阐明于序列表中。例如，表11展示抗体1具有一组CDR，其中HCDR1为SEQ ID NO：3（Kabat残基31-35b），HCDR2为SEQ ID NO：4（Kabat残基50-65），HCDR3为SEQ ID NO：5（Kabat残基95-102），LCDR1为SEQ ID NO：8（Kabat残基24-34），LCDR2为SEQ ID NO：9（Kabat残基50-56）并且LCDR3为SEQ ID NO：10（Kabat残基89-97）。抗体2具有分别为SEQ ID NO：23、24、25、28、29和30的HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2以及LCDR3序列。其他优化抗体克隆以类似方式展示于表11中并且也作为本发明的方面来提供。
根据本发明的对于IL-18的结合成员可包含在此描述的一个或多个CDR，例如CDR3，并且可任选地还包含CDR1和CDR2以便形成一组CDR。该CDR或该组CDR可为抗体1CDR或抗体1CDR集合，或可为抗体1GL、抗体2、抗体3、抗体4、抗体5、抗体6、抗体6GL、抗体7、抗体7GL、抗体8GL、抗体9、抗体10、抗体11、抗体11GL以及抗体12GL中任何一个的CDR或CDR集合，或可为其变体，如在此描述。
在一些实施例中；
HCDR1可为7个氨基酸长，由Kabat残基31-35b组成；
HCDR2可为16个氨基酸长，由Kabat残基50-65组成；
HCDR3可为15个氨基酸长，由Kabat残基95-102组成；
HCDR1可为11个氨基酸长，由Kabat残基24-34组成；
HCDR2可为7个氨基酸长，由Kabat残基50-56组成；且/或
HCDR3可为9个氨基酸长，由Kabat残基89-97组成。
结合成员可包含表11中列出的任何抗体的HCDR1、HCDR2和/或HCDR3和/或LCDR1、LCDR2和/或LCDR3，例如表11中列出的任何抗体的一组CDR。结合成员可包含这些抗体中的任何一个的一组VH CDR。可任选地，它还可包含这些抗体中的一个的一组VL CDR。VL CDR可来自与VH CDR相同或不同的抗体。还在此提供了包含表11中列出的任何抗体的一组HCDR的一个VH域，和/或包含表11中列出的任何抗体的一组LCDR的一个VL域。
在此描述的特异性结合至白细胞介素-18（IL-18）的结合成员可包含：
(a)HCDR1，具有与SEQ ID NO：153一致或相对于此包含1、2或3个氨基酸残基取代的氨基酸序列；
(b)HCDR2，具有与SEQ ID NO：154一致或相对于此包含1、2、3或4个氨基酸残基取代的氨基酸序列；
(c)HCDR3，具有与SEQ ID NO：155一致或相对于此包含1、2、3、4或5个氨基酸残基取代的氨基酸序列；
(d)LCDR1，具有与SEQ ID NO：158一致或相对于此包含1、2、3或4个氨基酸残基取代的氨基酸序列；
(e)LCDR2，具有与SEQ ID NO：159一致或相对于此包含1、2、3或4个氨基酸残基取代的氨基酸序列；以及
(f)LCDR3，具有与SEQ ID NO：160一致或相对于此包含1、2、3、4、5、6、7、8或9个氨基酸残基取代的氨基酸序列。
结合成员可包含亲本抗体抗体1或表11中列出的任何抗体的一组H和/或LCDR，其中在所披露的该组H和/或L CDR内具有一个或多个取代，例如多达15、多达16或多达17个取代。例如，本发明的抗体分子可包含来自抗体1、抗体1GL、抗体2、抗体3、抗体4、抗体5、抗体6、抗体6GL、抗体7、抗体7GL、抗体8GL、抗体9、抗体10、抗体11、抗体11GL以及抗体12GL中任何一个的该组H和/或L CDR，其中具有17、16或15或更少个取代，例如14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2或1个取代。取代可潜在地在该组CDR内的任何残基处形成。
例如，合适抗体分子可包含一组CDR：HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2以及LCDR3，其中该组CDR具有从以下各项中的17、16或15或更少个氨基酸取代；
(i)一组抗体1CDR，其中：
HCDR1为氨基酸序列SEQ ID NO：3；
HCDR2为氨基酸序列SEQ ID NO：4；
HCDR3为氨基酸序列SEQ ID NO：5；
LCDR1为氨基酸序列SEQ ID NO：8；
LCDR2为氨基酸序列SEQ ID NO：9；并且
LCDR3为氨基酸序列SEQ ID NO：10，
(ii)一组抗体11GL CDR，其中：
HCDR1为氨基酸序列SEQ ID NO：143；
HCDR2为氨基酸序列SEQ ID NO：144；
HCDR3为氨基酸序列SEQ ID NO：145；
LCDR1为氨基酸序列SEQ ID NO：148；
LCDR2为氨基酸序列SEQ ID NO：149；并且
LCDR3为氨基酸序列SEQ ID NO：150；或
(iii)一组抗体12GL CDR，其中：
HCDR1为氨基酸序列SEQ ID NO：153；
HCDR2为氨基酸序列SEQ ID NO：154；
HCDR3为氨基酸序列SEQ ID NO：155；
LCDR1为氨基酸序列SEQ ID NO：158；
LCDR2为氨基酸序列SEQ ID NO：159；并且
LCDR3为氨基酸序列SEQ ID NO：160。
在一些实施例中，可在位于离IL-18/mAb复合物中的IL-18残基超过0.5nm的多个残基处产生取代。（参见图14）。例如，HCDR3可包含选自Kabat残基95、96、100A、100B、100C、100f、100g、101以及102的1、2、3、4或5个位置处的取代。HCDR2可包含选自Kabat残基50、51、54-57以及59-65的1、2、3或4个位置处的取代。HCDR1可包含选自Kabat残基31-34、35a以及35b的1、2或3个位置处的取代。合适的LCDR3可包含选自Kabat残基89、90、95以及97的1、2、3或4个位置处的取代。LCDR2可包含选自Kabat残基50至56的1、2、3或4个位置处的取代。LCDR1可包含选自Kabat残基24至29、31、33以及34的1、2、3或4个位置处的取代。
在一些实施例中，取代可在如表11所示的抗体1GL、抗体2、抗体3、抗体4、抗体5、抗体6、抗体6GL、抗体7、抗体7GL、抗体8GL、抗体9、抗体10、抗体11、抗体11GL以及抗体12GL中的任何一个中取代的位置处产生。因此，该一个或多个取代可在以下残基中的一个或多个处：
HCDR3中的Kabat残基99、100a、100b以及100d；
LCDR3中的Kabat残基89、90、91、92、93、94、95以及97。
结合成员可包含一个HCDR3，其中：
Kabat残基95为Thr；
Kabat残基96为Pro；
Kabat残基97为Ala；
Kabat残基98为Tyr；
Kabat残基99为Asp或Phe；
Kabat残基100为Gly；
Kabat残基100A为Asp或Gln；
Kabat残基100B为Ala或Asp；
Kabat残基100C为Arg；
Kabat残基100D为Ala或Thr；
Kabat残基100E为Asp；
Kabat残基100F为Phe；
Kabat残基100G为Phe；
Kabat残基101为Asp；且/或
Kabat残基102为Val。
例如，Kabat残基99可为Phe；Kabat残基100a可为Gln；Kabat残基100b可为Asp；且/或HCDR3中的Kabat残基100d可为Thr。
结合成员可包含一个LCDR3，其中：
Kabat残基92为Tyr、Ser、Leu、His或Ala；
Kabat残基93为Ser、Phe、Tyr、His或Ile；且/或
Kabat残基94为Thr或Pro。
例如，结合成员可包含一个LCDR3，其中；
Kabat残基89为Gln或Ala；
Kabat残基90为Gln、Asp或Asn；
Kabat残基91为Ser或Ile；
Kabat残基92为Tyr、Ser、Leu、His或Ala；
Kabat残基93为Ser、Phe、Tyr、His或Ile；
Kabat残基94为Thr或Pro；
Kabat残基95为Pro、Asn或Gln，
Kabat残基96为Trp，且/或
Kabat残基97为Thr或Asp。
在一些优选实施例中，LCDR3中的Kabat残基92可为His；Kabat残基93可为His；且/或Kabat残基94可为Pro。
在结合成员的一些实例中，HCDR1可为SEQ ID NO：3、103、113或153之一；并且HCDR2可为SEQ ID NO：4、104、124或134之一。例如，HCDR1可为SEQ ID NO：153；并且HCDR2可为SEQ ID NO：154。
HCDR3可为SEQ ID NO：5、15、25、35、45、55、65、75、85、95、105、115、125、135、145或155之一。例如，HCDR3可为SEQ ID NO：155。
LCDR1可为SEQ ID NO158；并且LCDR2可为氨基酸序列SEQ ID NO：159。
LCDR3可为SEQ ID NO：10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150或160之一。例如，LCDR3可为SEQ ID NO：160。
如上所述，结合成员可包含抗体分子，该分离抗体分子在抗体框架内具有一个或多个CDR，例如一组CDR。例如，一个或多个CDR或一组CDR抗体可枝接至框架（例如人框架）中以便提供抗体分子。框架区可为人种系基因节段序列。因此，框架可为种系的，其中框架内的一个或多个残基改变以便匹配最相似人种系框架中的相等位置处的残基。本领域技术人员可在种系化之前选择在序列上与抗体的框架序列最接近的种系节段并且在在此描述的测定中测试抗体的亲和力或活性以便证实种系化不显著减少抗原结合或效力。人种系基因节段序列为本领域技术人员已知的并且可例如从VBASE编译（VBASE,MRCCentre of Protein Engineering,UK,1997,http//mrc-cpe.cam.ac.uk）获得。
在此描述的结合成员可为分离人抗体分子，该分离抗体分子具有包含人种系框架中的一组HCDR的VH域，例如Vh4DP66(4-61)。因此，VH域框架区FW1、FW2和/或FW3可包含人种系基因节段Vh4DP66(4-61)的框架区且/或可种系化，方法是使框架残基突变以便匹配此人种系基因节段的框架残基。FW4可包含人种系j节段JH2的框架区。VHFW1的氨基酸序列可为SEQ ID NO：161。VHFW2的氨基酸序列可为SEQ ID NO：162。VHFW3的氨基酸序列可为SEQ ID NO：163。VHFW4的氨基酸序列可为SEQ ID NO：164。正常地结合成员也具有包含例如人种系框架中的一组LCDR的VL域，例如Vκ1L12。因此，VL域框架区可包含人种系基因节段Vκ1L12的框架区FW1、FW2和/或FW3且/或可种系化，方法是使框架残基突变以便匹配此人种系基因节段的框架残基。FW4可包含人种系j节段JK2的框架区。VL FW1的氨基酸序列可为SEQ ID NO：165。VLFW2的氨基酸序列可为SEQ ID NO：166。VLFW3的氨基酸序列可为SEQ ID NO：167。VLFW4的氨基酸序列可为SEQ ID NO：168。种系化VH域或VL域可在一个或多个维尼尔（Vernier）残基处种系化或可未种系化，但是通常未种系化。
本发明的抗体分子可包含重链FW1，其中
Kabat残基6可为Gln或Glu；
Kabat残基10可为Arg或Gly；
Kabat残基13可为Lys或Glu；且/或
Kabat残基16可为Gln或Glu。
本发明的抗体分子可包含其中Kabat残基41Ala或Pro的重链FW2和/或其中Kabat残基74为Pro或Ser的重链FW3。
本发明的抗体分子可包含其中Kabat残基3为Val或Gln的轻链FW1；其中Kabat残基42为Arg、Lys或Gly的轻链FW2；其中Kabat残基70为Asp或Glu且/或Kabat残基81为Glu或Asp的轻链FW3；和/或其中Kabat残基99为Gly或Ser的轻链FW4。
例如，在此描述的抗体分子或VH域可包含以下重链框架区集合：
FW1SEQ ID NO：161；
FW2SEQ ID NO：162；
FW3SEQ ID NO：163；
FW4SEQ ID NO：164；
或可包含具有1、2、3、4、5、6或7个氨基酸改变例如取代的所述重链框架区集合。
在此描述的抗体分子或VL域可包含以下轻链框架区集合：
FW1SEQ ID NO：165；
FW2SEQ ID NO：166；
FW3SEQ ID NO：167；
FW4SEQ ID NO：168；
或可包含具有1、2、3、4、5或6个氨基酸改变例如取代的所述轻链框架区集合。
氨基酸改变可为取代、插入或缺失。
例如，抗体分子可包含一组重链和轻链框架区，其中
重链FW1为SEQ ID NO：161；
重链FW2为SEQ ID NO：162；
重链FW3为SEQ ID NO：163；
重链FW4为SEQ ID NO：164；
轻链FW1为SEQ ID NO：165；
轻链FW2为SEQ ID NO：166；
轻链FW3为SEQ ID NO：167；
轻链FW4为SEQ ID NO：168；
或可包含具有11或更少，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个氨基酸改变例如取代的所述重链和轻链框架区集合。例如在所述重链和轻链框架区集合中可具有一个或两个氨基酸取代。
与种系化抗体分子相比，非种系化抗体分子具有相同CDR，但是不同框架。在此于附加序列表中展示的抗体序列中，抗体1、抗体6、抗体7、抗体8、抗体11和抗体12的序列经过种系化。可产生抗体2、抗体3、抗体4、抗体5以及抗体9和抗体10的种系化抗体，方法是使在此对于其他抗体展示的VH域和VL域序列的框架区种系化。
典型地，VH域与VL域配对以便提供抗体抗原结合部位，但是如以上讨论，VH域或VL域可单独用于结合抗原。例如，抗体12GLVH域（SEQ IDNO：152）可与抗体12GLVL域（SEQ ID NO：157）配对，以使得形成包含抗体12GL VH域和VL域的抗体抗原结合部位。提供在此披露的其他抗体的VH域和VL域的类似实施例。在其他实施例中，抗体12GLVH与除抗体抗体12GLVL以外的VL域配对。轻链混杂在本领域中为沿用已久的。另外，本发明提供在此披露的其他VH域和VL域的类似实施例。因此，亲本抗体1或优化克隆抗体1GL、抗体2、抗体3、抗体4、抗体5、抗体6、抗体6GL、抗体7、抗体7GL、抗体8GL、抗体9、抗体10、抗体11、抗体11GL和抗体12GL中任何一个抗体的VH可与来自不同抗体的VL域配对，例如VH域和VL域可来自选自抗体1、抗体1GL、抗体2、抗体3、抗体4、抗体5、抗体6、抗体6GL、抗体7、抗体7GL、抗体8GL、抗体9、抗体10、抗体11、抗体11GL和抗体12GL的不同抗体。
分离结合成员可包含VH域和VL域，其中；
(i)VH域氨基酸序列展示于SEQ ID NO：142中并且VL域氨基酸序列展示于SEQ ID NO：147中。
(ii)与SEQ ID NO：142比较，VH域氨基酸序列具有1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15个氨基酸取代并且与SEQ ID NO：147比较，VL域氨基酸序列具有8、9、10、11、12或13个氨基酸取代；或
(iii)VH域氨基酸序列具有与SEQ ID NO：142的至少80%、至少85%、至少90%或至少95%序列一致性并且VL域氨基酸序列具有与SEQ ID NO：147的至少80%、至少85%、至少90%或至少95%序列一致性。
分离结合成员可包含VH域和VL域，其中；
(i)VH域氨基酸序列展示于SEQ ID NO：152中并且VL域氨基酸序列展示于SEQ ID NO：157中，
(ii)与SEQ ID NO：152比较，VH域氨基酸序列具有1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15个氨基酸取代并且与SEQ ID NO：157比较，VL域氨基酸序列具有1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12或13个氨基酸取代；或
(iii)VH域氨基酸序列具有与SEQ ID NO：152的至少80%、至少85%、至少90%或至少95%序列一致性并且VL域氨基酸序列具有与SEQ ID NO：157的至少80%、至少85%、至少90%或至少95%序列一致性。
分离结合成员可包含VH域和VL域，其中；
(i)VH域氨基酸序列展示于SEQ ID NO：102中并且VL域氨基酸序列展示于SEQ ID NO：107中，
(ii)与SEQ ID NO：102比较，VH域氨基酸序列具有1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15个氨基酸取代并且与SEQ ID NO：107比较，VL域氨基酸序列具有1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12或13个氨基酸取代；或
(iii)VH域氨基酸序列具有与SEQ ID NO：102的至少80%、至少85%、至少90%或至少95%序列一致性并且VL域氨基酸序列具有与SEQ ID NO：107的至少80%、至少85%、至少90%或至少95%序列一致性。
在一些实施例中，抗体分子可缺乏抗体恒定区，例如scFv。
在其他实施例中，抗体分子可包含抗体恒定区。抗体分子可为完整抗体例如IgG，即IgG1、IgG2或IgG4，或可为如下所述的抗体片段或衍生物。抗体分子还可具有其他格式，例如具有YTE的IgG1（Dall’Acqua等人（2002）J.Immunology,169:5171-5180；Dall’Acqua等人（2006）J Biol.Chem.281(33):23514-24）和/或Fc区域中的TM突变（Oganesyan等人（2008）ActaCryst D64:700-4）。
含有编码抗体12_GL的VH域和VL域的载体的大肠杆菌TOP10细胞根据布达佩斯（Budapest）条约的条款在2010年11月23日以登录号NCIMB41786保藏于国家工业、食品和海洋细菌保藏中心（NCIMB）（NCIMB Ltd，Aberdeen UK）。保藏的VH域和VL域的核苷酸序列展示于SEQ ID NO：152和157。
在此描述的结合成员可包含CDR、VH域、VL域、抗体-抗原结合部位或由核酸序列编码的抗体分子和/或保藏登录号NCIMB41786的载体。
在此描述的结合成员可由保藏登录号NCIMB41786的核酸、载体或细胞系来产生或可产生。例如，结合成员可由保藏登录号NCIMB41786的细胞系的核酸或载体的表达来产生。核酸或载体可表达于任何便利的表达系统。或者，结合成员可由保藏登录号NCIMB41786的细胞系来表达。
本发明的多个方面还提供编码VH和/或VL域的核酸，该核酸包含于登录号NCIMB41786的细胞系中；包含所述核酸的载体，该载体包含于登录号NCIMB41786的细胞系中；以及登录号NCIMB41786的细胞或细胞系。
本发明的另一个方面提供包含在此描述的抗体抗原结合部位或抗体分子的结合成员，该结合成员与如下所述的任何抗体分子竞争结合至IL-18，即：
(i)结合至IL-18并且
(ii)包含表10和11中列出的抗体分子、VH和/或VL域、CDR例如HCDR3，和/或CDR集合。
例如，例如抗体分子的结合成员可与包含以下各项的抗体分子竞争：
(i)具有序列SEQ ID NO.152的VH域和具有序列SEQ ID NO.157的VL域；
(ii)VH域，与SEQ ID NO.152比较具有具备15或更少氨基酸取代例如14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2或1个取代的序列；和VL域，与SEQ ID NO.157比较具有具备13或更少氨基酸取代例如12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2或1个取代的序列，或；
(iii)具有分别与SEQ ID NO.152和SEQ ID NO.157具有至少90%序列一致性的序列的VH域和VL域。
结合成员之间的竞争可容易地在体外来测定，例如使用ELISA和/或通过生化竞争测定，例如将具体报道分子标记于可在一个或多个其他未标记化结合成员的存在下检测的一个结合成员的生化竞争测定，使得能够鉴别结合相同表位或重叠表位的结合成员。这些方法容易为本领域普通技术人员所知，并且在此更详细地描述。
在其他方面，本发明提供包含编码根据本发明的结合成员、VH域和/或VL域的序列的分离核酸，和制备本发明的结合成员、VH域和/或VL域的方法，这些方法包括在引起产生所述结合成员、VH域和/或VL域的条件下表达所述核酸，并且将其回收。
例如，本发明的多个方面提供SEQ ID NO：1、11、21、31、41、51、61、71、81、91、101、111、121、131、141、151和170的分离VH域核酸序列；SEQ ID NO：6、16、26、36、46、56、66、76、86、96、106、116、126、136、146、156和171的分离VL域核酸序列；以及包含所述VH和VL核酸序列的配对的分离核酸、构建体和载体。
本发明的另一个方面提供编码在此例如在表10和11或序列表中披露的VHCDR或VLCDR序列的分离核酸。
本发明的另一个方面提供载体，例如质粒或噬菌体载体，该载体包含例如可操作连接至调控元件上的如上所述的分离核酸。
另一个方面提供含有本发明的核酸和/或载体或以其转化的宿主细胞。
本发明的另外方面提供本发明的结合成员在测量IL-18，优选地游离IL-18（即未结合至IL-18BP的IL-18）中的用途，以及测量例如从个体获得的样本中的游离IL-18的测定方法。
本发明的另外方面提供含有本发明的结合成员的组合物，和其在抑制和/或中和IL-18的方法中的用途，包括通过疗法来治疗人类或动物体的方法。
根据本发明的结合成员可用于治疗或诊断方法，例如治疗（可包括预防性治疗）人类或动物体（例如人类患者）的疾病或病症的方法，该方法包括将有效量的本发明的结合成员给予所述患者。可根据本发明来治疗的病状包括IL-18发挥作用的任何病状，如在此在别处详细地讨论，例如与升高IL-18水平相关的病状。
下文更详细地描述本发明的这些和其他方面。
结合成员
术语结合成员描述彼此结合的一对分子的一个成员。结合对的成员可天然地衍生或全部或部分合成产生。分子对的一个成员在其表面上具有一个区域、或腔穴，该区域或腔穴结合至分子对的另一个成员的特定空间和极性组织并且由此与其互补。结合对的类型的实例为抗原-抗体、生物素-抗生物素蛋白、激素-激素受体、受体-配体、酶-底物。本发明涉及抗原-抗体类型反应。
结合成员通常包含具有抗原结合部位的分子。例如，结合成员可为抗体分子或包含抗原结合部位的非抗体蛋白。
抗原结合部位可通过以下方式来提供：在非抗体蛋白支架上排列CDR，例如纤连蛋白或细胞色素B等人[Haan&Maggos(2004)BioCentury,12(5):A1-A6;Koide等人(1998)Journal of Molecular Biology,284:1141-1151;Nygren等人(1997)Current Opinion in Structural Biology,7:463-4691]，或通过使蛋白支架内的环的氨基酸残基随机化或突变以便赋予所需目标的结合特异性。用于工程化蛋白质中的新颖结合部位的支架已经由Nygren等详细地评论[上述]。抗体模拟物的蛋白质支架披露于以其全部内容通过引用结合在此的WO/0034784中，其中发明人描述包括具有至少一个随机环的纤连蛋白类型III域的蛋白质（抗体模拟物）。其中移植一个或多个CDR，例如一组HCDR或HCDR3和/或LCDR3的合适支架可由免疫球蛋白基因超家族的任何域成员来提供。支架可为人或非人蛋白质。非抗体蛋白支架的优势是它可在支架分子中提供比至少一些抗体分子更小且/或更容易制造的抗原结合部位。结合成员的小尺寸可赋予有用的生理性质，例如能够进入细胞，穿透组织深处或到达其他结构内的目标，或结合于目标抗原的蛋白腔穴内。非抗体蛋白支架中的抗原结合部位的用途探讨于Wess,2004[Wess,L.In:BioCentury,The Bernstein Report on BioBusiness,12(42),A1-A7,2004]。典型的为具有稳定骨架和一个或多个可变环的蛋白质，其中一个或多个环的氨基酸序列特定或随机地突变以便产生结合目标抗原的抗原结合部位。这些蛋白质包括来自金黄色葡萄球菌的蛋白A的IgG结合域、运铁蛋白、四连接素、纤连蛋白（例如第10个纤连蛋白类型III域）、脂笼蛋白以及γ-结晶和其他AffilinTM支架（Scil Proteins）。其他方法的实例包括基于环蛋白的合成“微体”-具有分子内二硫键的小蛋白质、微生物蛋白（VersabodiesTM，Amunix）和锚蛋白重复蛋白质（DARPins，分子搭配物）。
除了抗体序列和/或抗原结合部位以外，结合成员可包含其他氨基酸，例如形成肽或多肽，例如折叠域，或赋予分子除了结合抗原能力以外的另一种功能特性。结合成员可带有可检测标志，或可偶联至毒素或靶向部分或酶（例如经由肽键或连接物）。例如，结合成员可包含催化部位（例如酶域）以及抗原结合部位，其中抗原结合部位结合至抗原并且因而将催化部位靶向输送至抗原。催化部位可例如通过切割来抑制抗原的生物功能。
虽然，如所提及，CDR可由非抗体支架承载，但是承载本发明的CDR例如CDR3，或一组CDR的结构总体上为抗体重链或轻链序列或其实质性部分，其中CDR或CDR集合位于与由重新排列的免疫球蛋白基因编码的天然产生VH和VL抗体可变域的CDR或CDR集合对应的位置处。免疫球蛋白可变域的结构和位置可参考Kabat等1987[Kabat,E.A.等人，免疫学关注的蛋白质的序列（Sequences of Proteins of Immunological Interest）第4版，US Department ofHealth and Human Services.1987]和其更新来确定。许多学术和商业网上资源可用于查询此数据库。例如，参见马丁,A.C.R.（Martin,A.C.R.）通过计算机来访问Kabat抗体序列数据库蛋白质：结构、功能和遗传学（Accessing the KabatAntibody Sequence Database by Computer PROTEINS:Structure,Function andGenetics），25（1996）130-133和当前在以下网址处的相关网上资源：http://www.bioinf.org.uk/abs/simkab.html。
CDR区域或CDR用来指示如Kabat等1991[卡巴特E.A.（Kabat，E.A.）等人（1991）免疫学关注的蛋白质的序列（Sequences of Proteins ofImmunological Interest）第5版，US Department of Health and Human Services,Public Service,NIH,Washington]和后来版本所定义的免疫球蛋白的重链和轻链的高变区域。抗体通常含有3个重链CDR和3个轻链CDR。术语CDR或CDR在此用于根据情况来指示这些区域中的一个或这些区域中的几个或甚至全部，这些区域含有负责通过抗体的亲和力来结合抗原或其所识别的表位的大部分氨基酸残基。
在六个短CDR序列之中，重链的第三个CDR（HCDR3）具有较大尺寸变化性（较大变异性基本上归因于产生变异的基因的排列机制）。它可短至2个氨基酸，但是已知的最长尺寸是26。CDR长度还可根据可由特定潜在框架容纳的长度而变化。在功能上，HCDR3部分地在确定抗体的特异性中发挥作用（西格尔（Segal）等人，PNAS,71:4298-4302,1974；艾米特（Amit）等人，科学（Science），233:747-753,1986；乔西亚（Chothia）等人，分子生物学杂志，196:901-917,1987；乔西亚（hothia）等人，自然，342:877-883,1989；卡顿（Caton）等人，免疫学杂志，144:1965-1968,199；莎伦（Sharon）等人，PNAS,87:4814-4817,1990；莎伦等人，免疫学杂志，144:4863-4869,1990；以及Kabat等人，免疫学杂志，147:1709-1719,1991）。
抗体分子
此描述免疫球蛋白，不论天然或部分或全部合成产生。术语也涵盖包含抗体抗原结合部位的任何多肽或蛋白。在此必须了解本发明不涉及自然形式的抗体，也就是说其不处于其自然环境中而是其已经能够通过从自然来源纯化来分离或获得，或通过基因重组，或通过化学合成来获得，并且其然后可含有非自然的氨基酸，如稍后所描述。包含抗体抗原结合部位的抗体片段包括但不限于以下分子：例如Fab、Fab’、Fab’-SH、scFv、Fv、dAb和Fd。包括一个或多个抗体抗原结合部位的各种其他抗体分子已经经过工程化，包括例如Fab2、Fab3、双抗体、三抗体、四抗体和小体。抗体分子和其构建和使用方法描述于霍利格尔&哈得孙（Holliger&Hudson），自然—生物技术（NatureBiotechnology）23(9):1126-11362005。
可采用单克隆和其他抗体并且使用重组DNA技术的技术来产生结合目标抗原的其他抗体或嵌合分子。这些技术可涉及将编码抗体的免疫球蛋白可变区或CDR的DNA引入不同免疫球蛋白的恒定区，或恒定区加框架区中。参见例如EP-A-184187、GB2188638A或EP-A-239400和大量后续文献。杂交瘤细胞或产生抗体的其他细胞可经受基因突变或其他变化，这些基因突变或其他变化可以或不可以改变所产生的抗体的结合特异性。
因为抗体可以许多方式来修饰，所以术语“抗体分子”应理解为涵盖具有针对抗原的所需特异性和/或结合的抗体抗原结合部位的任何结合成员或物质。因此，此术语涵盖抗体片段和衍生物，包括包含抗体抗原结合部位的任何多肽，不论自然或全部或部分合成。因此包括嵌合分子，该分离抗体分子包含融合至另一个多肽（例如源自另一个物种或属于另一个抗体类别或子类）的抗体抗原结合部位或同等物。嵌合抗体的克隆和表达描述于EP-A-0120694和EP-A-0125023，和大量后续文献中。
可在抗体工程化领域中获得的其他技术已经使得可分离人和人源化抗体。例如，人杂交瘤细胞可如以下描述来产生：科特曼&迪贝尔（Kontermann&Dubel）[Kontermann,R&Dubel,S,抗体工程化（AntibodyEngineering）,纽约施普林格出版公司（Springer-Verlag New York）,LLC;2001,ISBN:3540413545]。噬菌体展示，另一种用于产生结合成员的既定技术已经在许多公开物中详细描述，例如科特曼&迪贝尔[上述]和WO92/01047（以下进一步讨论），和美国专利US5969108、US5565332、US5733743、US5858657、US5871907、US5872215、US5885793、US5962255、US6140471、US6172197、US6225447、US6291650、US6492160、US6521404。
其中小鼠抗体基因经过钝化并且在功能上以人抗体基因替换而保持小鼠免疫系统的其他组件完整的转基因小鼠可用于分离人抗体[Mendez，M.等人（1997）自然—遗传学（Nature Genet），15(2):146–156]。人源化抗体可使用在本领域中已知的技术来产生，例如那些在例如WO91/09967、US5,585,089、EP592106、US565,332和WO93/17105中披露的技术。此外，WO2004/006955描述基于选择来自人抗体基因的可变区框架序列来人源化抗体的方法，方法是将非人抗体的可变区的CDR序列的典型CDR结构类型与来自人抗体序列例如种系抗体基因片段的文库的相应CDR的典型CDR结构类型比较。具有非人CDR类似的典型CDR结构类型的人抗体可变区形成用于选择人框架序列的成员人抗体序列的子集。子集成员可进一步通过人与非人CDR序列之间的氨基酸相似性来排序。在WO2004/006955的方法中，选择最高级人序列以便提供用于构建嵌合抗体的框架序列，该嵌合抗体使用所选择的子集成员人框架在功能上以非人CDR对应物来置换人CDR序列，从而提供高亲和力和低免疫原性的人源化抗体而不需要在非人与人抗体之间比较框架序列。也披露根据方法产生的嵌合抗体。
合成抗体分子可通过从基因表达来产生，这些基因借助于在合适表达载体内合成并且组装的寡核苷酸来产生，例如如以下所描述：克纳皮克（Knappik）等人[克纳皮克等人分子生物学杂志（2000）296，57-86]或克雷布斯（Krebs）等人[克雷布斯等人免疫学方法杂志（Journal of Immunological Methods）254200167–84]。
已经证明完整抗体的片段可执行结合抗原的功能。结合片段的实例为(i)由VL、VH、CL和CH1域组成的Fab片段；(ii)由VH和CH1域组成的Fd片段；(iii)由单一抗体的VL和VH域组成的Fv片段；(iv)dAb片段[沃德,E.S.（Ward,E.S.）等人，自然341，544-546（1989）；麦卡弗蒂（McCafferty）等人（1990）自然，348,552-554；霍尔特（Holt）等人（2003）生物技术趋势（Trends in Biotechnology）21,484-490]，它由VH域或VL域组成；(v)分离CDR区域；(vi)F(ab')2片段，它为包含两个连接Fab片段的二价片段(vii)单链Fv分子（scFv），其中VH域和VL域由允许两个域相联以便形成抗原结合部位的肽连接物来连接[伯德（Bird）等人，科学，242,423-426,1988；休斯顿（Huston）等人，PNAS USA,85,5879-5883,1988]；(viii)双特异性单链Fv二聚体（PCT/US92/09965）和(ix)“双抗体”，通过基因融合构建的多价或多特异性片段（WO94/13804；霍利格尔P.（Holliger,P.）等人，美国国家科学院院刊（Proc.Natl.Acad.Sci.USA）906444-6448,1993）。Fv、scFv或双体分子可通过并入连接VH域和VL域的二硫桥键来稳定[赖特尔Y.（Reiter,Y.）等人，自然—生物技术，14,1239-1245,1996]。还可产生包含连接至CH3域的scFv的小体[胡,S.（Hu,S.）等人，癌症研究（Cancer Res.），56,3055-3061,1996]。结合片段的其他实例是Fab’，它与Fab片段的不同之处在于重链CH1域的羧基末端添加少许残基，包括来自抗体铰链区的一个或多个半胱氨酸，以及Fab’-SH，它为恒定域的半胱氨酸残基带有游离硫醇基的Fab’片段。
Qui等人[Qui等人，自然—生物技术25:921-9292007]描述仅含有两个通过框架区域连接的CDR的抗体分子。来自VH域或VL域的CDR3连接至其他域的CDR1或CDR2环。键合经由所选择的CDR1或CDR2的C末端至CDR3的N末端，经过FR区域。Qui等选择具有最少疏水性贴片的FR区域。所测试抗体的最好的组合发现为通过VH FR2连接至VH CDR3的VL CDR1（VHCDR1-VHFR2-VLCDR3）。与完整免疫球蛋白（大约150kDa）或scFv（大约28kDa）比较，在约3kDa的分子量下，这些抗体分子提供在经过改进的组织渗透方面的优势。
本发明的抗体片段可从在此列出的任何抗体开始来获得，方法例如为通过例如胃蛋白酶或木瓜蛋白酶的酶来消化和/或通过化学还原来切割二硫桥键。在另一个方式中，包含于本发明中的抗体片段可通过同样为本领域技术人员熟知的基因重组技术或通过借助于例如自动肽合成器，例如由Applied Biosystems公司等供应的那些合成器的肽合成，或通过核酸合成和表达来获得。
根据本发明的功能抗体片段包括其半衰期通过化学修饰，尤其通过聚乙二醇化，或通过并入脂质体中来增加的任何功能片段。
dAb（域抗体）为抗体的小单体抗原结合片段，即抗体重链或轻链的可变区。VH dAbs天然地出现于骆驼科（例如骆驼、美洲驼）中并且可通过用目标抗原来免疫接种骆驼科，分离抗原特异性B细胞并且直接克隆来自个别B细胞的dAb基因而产生。dAbs也可在细胞培养物中产生。其小尺寸、良好溶解性和温度稳定性使得其尤其在生理上适用并且适合于选择和亲和力成熟。骆驼科VHdAbs在名称“nanobodiesTM”下开发用于治疗用途。本发明的结合成员可为dAb，它包含大致上如在此阐明的VH域或VL域，或包含大致上如在此阐明的一组CDR的VH域或VL域。
双特异性或双功能抗体形成第二代单克隆抗体，其中两个不同可变区组合于同一分子中[霍利格尔和波伦（Bohlen）1999癌症与转移综述18:411-419]。其用途已经在诊断领域和治疗领域中得到证明，这是由于其能够募集新的效应功能或将多种分子靶向输送于肿瘤细胞的表面上。当使用双特异性抗体时，这些抗体可为可以各种方法来制造的常规双特异性抗体[霍利格尔，P.和温特G.（Winter G.）生物技术新见（Current Opinion Biotechnol）4,446-4491993]，例如以化学方法来制备或来自杂种杂交瘤细胞，或可为以上提到的任何双特异性抗体片段。这些抗体可通过化学方法[格伦尼M J（Glennie M J）等人，1987免疫学杂志139,2367-2375；利普R.（Repp R.）等人,1995血液学杂志（J.Hemat.）377-382]或体细胞方法[施特茨U.D.（Staerz U.D.）和贝文M.J.（Bevan M.J.）1986PNAS83；苏雷什M.R.（Suresh M.R.）等人,1986酶学方法（Method Enzymol.）121:210-228]来获得但是同样地并且优选地通过遗传工程技术来获得，这允许强迫进行异源二聚化，由此促进所寻求的抗体的纯化过程[梅尔昌德（Merchand）等人，1998自然—生物技术16:677-681]。双特异性抗体的实例包括BiTETM技术的那些抗体，其中具有不同特异性的两个抗体的结合域可使用并且经由短柔性肽来直接连接。这将两个抗体组合于短单一多肽连上。可仅使用可变域来构建没有Fc区域的双抗体和scFv，从而潜在地减少抗-独特型反应的影响。
双特异性抗体可构建为整个IgG、双特异性Fab'2、Fab'PEG、双抗体或另外构建为双特异性scFv。此外，两个双特异性抗体可使用在本领域中已知用于形成四价抗体的常规方法来连接。
与双特异性完整抗体形成对照，双特异性双抗体也可为尤其适用的，因为其可容易地构建并且表达于大肠杆菌中。具有合适结合特异性的双抗体（和许多其他多肽，例如抗体片段）可使用噬菌体展示（WO94/13804）来从文库中容易地选择。如果双体的一个臂保持恒定，例如，具有针对IL-18的特异性，那么可产生其中另一个臂可变化的文库并且选择合适特异性的抗体。双特异性完整抗体可通过替代工程化方法来产生，如里奇韦（Ridgeway）等人，1996[里奇韦J.B.B.（Ridgeway,J.B.B.）等人，蛋白质工程化（Protein Eng.）,9,616-621,1996]中所描述。
在本领域中可利用获得针对IL-18的抗体的各种方法。抗体可为尤其人、鼠科、嵌合或人源化来源的单克隆抗体，这些单克隆抗体可根据本领域技术人员熟知的标准方法来获得。
总体上，为了制备尤其来自鼠科的单克隆抗体或其功能性片段，可参考尤其描述于手册“抗体”中的技术[哈洛（Harlow）和雷恩（Lane），抗体：实验室手册（Antibodies:A Laboratory Manual），纽约冷泉港冷泉港实验室（ColdSpring Harbor Laboratory,Cold Spring Harbor N.Y.），第726页，1988]或柯勒
Figure BDA00003372980800291
和米尔斯坦（Milstein）描述的从杂交瘤细胞制备的技术[柯勒和米尔斯坦，自然，256:495-497，1975]。
单克隆抗体可例如从一种动物细胞获得，该细胞用IL-18，或其含有由所述单克隆抗体辨识的表位的一个片段来免疫。合适片段和包含其的肽或多肽在此描述，并且可用于使动物免疫以便产生针对IL-18的抗体。所述IL-18或其一个片段可尤其根据通常的工作方法来产生，以包含于编码IL-18或其片段的cDNA序列中的核酸序列开始通过基因重组，从包含于肽序列IL-18和/或其片段中的氨基酸序列开始通过肽合成。
单克隆抗体可例如在亲和柱上纯化，IL-18或其含有由所述单克隆抗体辨识的表位的一个片段以前已经固定于该柱上。更具体地说，单克隆抗体可通过蛋白A和/或G上的色谱法来纯化，随后进行或随后不进行旨在消除残留蛋白污染物以及DNA和LPS的离子交换色谱，其本身随后进行或随后不进行琼脂糖凝胶上的排阻色谱法以便消除由于存在二聚体或其他多聚体而引起的潜在聚合体。在一个实施例中，全部这些技术可同时或连续地使用。
抗原结合部位
这描述结合至并且与目标抗原的全部或一部分互补的分子部分。在抗体分子中，它被称为抗体抗原结合部位，并且包含结合至并且与目标抗原的全部或一部分互补的分子部分。当抗原较大时，抗体可只结合至抗原的特定部分，此部分被称为表位。抗体抗原结合部位可由一个或多个抗体可变域来提供。抗体抗原结合部位可包含抗体轻链可变区（VL）和抗体重链可变区（VH）。
WO2006/072620描述在免疫球蛋白域的β链之间延伸的结构（非CDR）环中来工程化抗原结合部位。抗原结合部位可工程化于与CDR的天然位置分开的抗体分子区域中，例如在VH域或VL域的框架区域中，或在抗体恒定域例如CH1和/或CH3中。工程化于结构区域中的抗原结合部位可附加于或代替由VH域和VL域的CDR集合形成的抗原结合部位。当多个抗原结合部位存在于抗体分子中时，它们可结合同一抗原（目标抗原），从而增加结合成员的效价。或者，多个抗原结合部位可结合不同抗原（目标抗原和一个或多个其他抗原），并且这可用于增加效应功能、延长半衰期或改进抗体分子的体内输送。
分离
这是指本发明的结合成员，或编码这些结合成员的核酸总体上根据本发明的状态。因此，根据本发明的结合成员、VH和/或VL域和编码核酸分子和载体可在以下状态下提供：例如从其自然环境中分离和/或纯化、呈大致上纯或均质形式，或在核酸的情况下，不含或大致上不含除编码具有所需功能的多肽的序列以外的来源核酸或基因。分离成员和分离核酸不含或大致上不含在天然状态下与其相关联的材料，例如在其天然环境下，或在此制备是通过在体外或在体内实施的重组DNA技术时在其制备环境（例如细胞培养物）中与其一起存在的其他多肽或核酸。成员和核酸可与稀释剂或佐剂一起配制并且仍然出于实际目的来分离—例如如果用于涂布在免疫测定中使用的微量滴定板，则成员通常与明胶或其他载体混合、或在用于诊断或治疗时，与药学上可接受的载体或稀释剂混合。结合成员可在天然状态下或通过异源真核细胞系统（例如CHO或NS0（ECACC85110503）细胞来糖基化，或它们可以是（例如如果通过在原核细胞中表达来产生）未糖基化的。
包含抗IL-18抗体分子的异质制剂也形成本发明的一部分。例如，这些制剂可为抗体与全长重链和没有C-末端赖氨酸的重链的混合物，具有不同程度的糖基化和/或具有衍生的氨基酸，例如N-末端谷氨酸的环化以便形成焦谷氨酸残基。
如本文使用，短语“大致上如阐明”是指在此描述的结合成员的VH域或VL域的相关CDR的特性与序列在此阐明的规定区域或者一致或者高度类似。如在此描述，相对于一个或多个可变域的规定区域的短语“高度类似”，涵盖可在CDR和/或VH域或VL域中产生1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15个氨基酸取代。
如以上提及，根据本发明的结合成员调节并且可中和IL-18的生物活性。如在此描述，本发明的IL-18结合成员可针对中和效力来优化。总体上，效力优化涉及使所选择的结合成员的序列（通常抗体的可变域序列）突变以便产生结合成员的文库，然后测定效力并且选择更有效的结合成员。因此，与产生文库的结合成员相比，所选择的“效力优化”结合成员倾向于具有更高效力。然而，高效力结合成员还可在不优化的情况下获得，例如高效力结合成员可通过初始筛选例如生化中和测定来直接获得。“效力优化”结合成员是指IL-18的特定活性或下游功能的中和效力经过优化的结合成员。检定和效力在此在别处更详细地描述。本发明提供效力优化和/或未优化结合成员，以及所选择的结合成员的效力优化的方法。因而，本发明允许本领域技术人员产生具有高效力的结合成员。
另一个方面，本发明提供了一种获得能够结合抗原的一种或多种结合成员的方法，该方法包括使根据本发明的结合成员的文库与所述抗原接触，并且选择该文库的能够结合所述抗原的一个或多个结合成员。
文库可展示于颗粒或分子复合物上，例如可复制遗传包，例如酵母、细菌或噬菌体（例如T7）颗粒、病毒、细胞或共价、核糖体或其他体外展示系统，每个颗粒或分子复合物含有编码展示于其上的抗体VH可变域的核酸，以及编码可任选地也展示的VL域的核酸，如果存在的话。噬菌体展示描述于WO92/01047和例如美国专利US5969108、US5565332、US5733743、US5858657、US5871907、US5872215、US5885793、US5962255、US6140471、US6172197、US6225447、US6291650、US6492160和US6521404，其每一个以其全部内容通过引用结合在此。核糖体展示描述于黑尼斯J（Hanes J）和普吕克通A.（Plückthun A.）（1997）美国国家科学院院刊1997年5月13;94(10):4937-42；WO01/75097和WO2006/072773，其每一个以其全部内容通过引用结合在此。
在选择能够结合抗原的结合成员并且展示于噬菌体或其他文库颗粒或分子复合物上之后，核酸可从展示所述选定结合成员的噬菌体或其他颗粒或分子复合物来获得。这类核酸可用于随后通过从核酸表达来产生结合成员或抗体VH或VL可变域，核酸序列从展示所述选定结合成员的噬菌体或其他颗粒或分子复合物来获得。
所述选定结合成员的抗体VH可变域的氨基酸序列的抗体VH可变域可以分离形式来提供，此提供方式可与包含这种VH域的结合成员一样。
可进一步测试结合IL-18的能力，以及与例如如在此列出的任何抗体（例如呈scFv格式和/或IgG格式，例如IgG2或IgG1）竞争结合IL-18的能力。可如在此在别处进一步讨论来测试中和IL-18的能力。
结合成员可以表10和11中列出的任何抗体，例如scFv、IgG2、IgG1TM或IgG1的亲和力，或以更好的亲和力来结合IL-18。抗体结合亲和力展示于表5。
结合成员可以在此列出的任何抗体例如scFv、IgG2IgG1的效力，或以增加的效力来中和IL-18的生物活性。
不同结合成员的结合亲和力和中和效力可在合适条件下比较。
在此描述的VH域和VL域和CDR的变体，包括其氨基酸序列在此阐明，并且可用于IL-18的结合成员中的那些变体可通过序列改变或突变并且筛选具有所需特性的抗原结合成员的方法来获得。所需特性的实例包括但不限于：
·相对于对于抗原具有特异性的已知抗体，抗原的结合亲和力增加
·相对于对于抗原具有特异性的已知抗体，抗原活性的中和增加，如果活性是已知的
·在具体摩尔比下，与已知抗体或配体针对抗原的规定竞争能力
·使复合物免疫沉淀的能力
·结合至规定表位的能力
o线性表位，例如使用在此描述的肽结合扫描来鉴别的肽序列，例如使用在线性和/或受限构象中筛选的肽
o由不连续的残基形成的构象表位
·调节IL-18，或下游分子的新的生物活性的能力。
这些方法也在此提供。
在此披露的抗体分子的变体可被产生并且用于本发明中。遵循计算化学在将多元数据分析技术应用于结构/性质-活性关系中的指引[参见例如伍德（Wold）等在化学中的多元数据分析。化学计量学–化学中的数学和统计学（Multivariate data analysis in chemistry.Chemometrics-Mathematics andStatistics in Chemistry）（编：B.科瓦尔斯基（B.Kowalski））；雷代尔出版公司（D.Reidel Publishing Company），荷兰多德雷赫特（Dordrecht，Holland），1984(ISBN90-277-1846-6]，可使用熟知数学技术例如统计回归、模式识别和分类来产生抗体的定量活性-性质关系[参见例如诺曼（Norman）等人应用回归分析（Applied Regression Analysis）Wiley-Interscience；第3版（1998年4月）ISBN:0471170828；坎德尔（Kandel），亚伯拉罕（Abraham）等人群集分析中的计算机辅助推理（Computer-Assisted Reasoningin Cluster Analysis）Prentice Hall PTR（1995年5月11日），ISBN:0133418847；克扎诺夫斯基（Krzanowski），Wojtek多元分析原则：用户观点（Principles of Multivariate Analysis:A User’s Perspective）（牛津统计科学系列（Oxford Statistical Science Series），第22期（论文））牛津大学出版社（Oxford University Press）；（2000年12月），ISBN:0198507089；威滕（Witten），伊恩H.（Ian H.）等数据挖掘技术：实用机器学习工具和Java实施技术（Data Mining:Practical Machine Learning Tools and Techniques with JavaImplementations）Morgan Kaufmann；（1999年10月11日），ISBN:1558605525；丹尼森（Denison）戴维G.T.（David G.T.）（编辑）等非线性分类和回归的贝叶斯方法（Bayesian Methods for Nonlinear Classification andRegression）（概率统计威利系列（Wiley Series in Probability and Statistics）).约翰威利出版有限公司（John Wiley&Sons））（2002年7月），ISBN:0471490369；高斯（Ghose），阿勒普K.（Arup K.）等人药物发现中的组合厍设计和评估原则、软件、工具以及应用（Combinatorial Library Design andEvaluation Principles,Software,Tools,and Applications in Drug Discovery）ISBN:0-8247-0487-8]。抗体的性质可从抗体序列、功能和三维结构的经验和理论模型（例如，分析可能接触残基或计算物理化学性质）来得到并且这些性质可个别地和组合地考虑。
主要由VH域和VL域组成的抗体抗原结合部位通常由六个多肽环形成：三个来自轻链可变域（VL）并且三个来自重链可变域（VH）。已知原子结构的抗体的分析已经阐明抗体组合部位的序列与三维结构之间的关系[乔西亚C.（Chothia C.）等人分子生物学杂志（1992）227,799-817；Al-Lazikani等人分子生物学杂志（1997）273(4),927-948]。这些关系暗示，除了VH域中的第三区域（环），结合部位环具有少量主链构象之一：典型结构。在特定环中形成的典型结构已被证明由其尺寸和在环和框架区中的关键部位存在某些残基来确定。
序列-结构关系的此研究可用于预测具有已知序列，但是具有未知三维结构的抗体中的那些残基，这对于维持其CDR环的三维结构并且由此保持结合特异性为至关重要的。这些预测可通过将预测与来自前导优化实验的输出比较来获得支持。在结构方法中，可使用任何可自由获得或商业包，例如WAM[怀特勒格N.R.u.（Whitelegg,N.R.u.）和里斯A.R（Rees,A.R）（2000）.蛋白质工程化，12,815-824]来建立抗体分子的模型[乔西亚等人科学，223,755-758(1986)]。然后，蛋白可视化和分析软体包，例如Insight II（Accelrys公司）或Deep View[盖（Guex,N.）和派奇M.C.（Peitsch，M.C.）电泳（Electrophoresis）（1997）18，2714-2723]可用于评估CDR中的每个位置处的可能取代。然后，此信息可用于使取代可能对于活性具有最小或有利效应。
产生CDR、抗体VH域或VL域和结合成员的氨基酸序列内的取代所需的技术总体上在本领域中为可获得的。可产生具有取代的变体序列，可预测或不可预测所述取代对于活性具有最小或有利效应，并且针对结合且/或中和IL-18的能力和/或任何其他所需性质来测试。
其序列特别在此披露的任何VH域和VL域的可变域氨基酸序列变体可根据本发明来使用，如所讨论。
如上所述，本发明的多个方面提供结合成员，例如抗体分子，该分离抗体分子所包含的VH域与VH域序列展示于以下附加序列表中的在此列出的任何抗体的VH域具有至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少93%、至少95%、至少96%、至少95%、至少97%、至少98%或至少99%氨基酸序列一致性；且/或其所包含的VL域与VL域序列展示于附加序列表中的表11中列出的任何抗体的VL域具有至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少93%、至少95%、至少96%、至少95%、至少97%、至少98%或至少99%氨基酸序列一致性。
本发明的多个方面提供结合成员，例如抗体分子，该分离抗体分子包含的VH域所具有的一组VH CDR与VH CDR序列在此展示的任何在此列出的抗体的VH CDR集合具有至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少93%、至少95%、至少96%、至少95%、至少97%、至少98%或至少99%氨基酸序列一致性；且/或其包含的VL域所具有的一组VLCDR与VL CDR序列在此展示的任何在此列出的抗体的VL CDR集合具有至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少93%、至少95%、至少96%、至少95%、至少97%、至少98%或至少99%氨基酸序列一致性。
可用于计算两个氨基酸序列的一致性%的算法包括例如BLAST[阿特休尔（Altschul）等人（1990）分子生物学杂志215:405-410]、FASTA[皮尔森（Pearson）和李普曼（Lipman）（1988）PNAS USA85:2444-2448]或Smith-Waterman算法[史密斯（Smith）和华特曼（Waterman）（1981）分子生物学杂志.147:195-197]，例如使用默认参数。
特定可变域可包括一个或多个氨基酸序列改变（氨基酸残基的取代、缺失和/或插入），并且小于约15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3或2。
可在一个或多个框架区和/或一个或多个CDR中产生改变。改变通常不产生功能损失，因此包含如此改变的氨基酸序列的结合成员可保持结合且/或中和IL-18的能力。它可保持与未产生改变的结合成员相同的定量结合和/或中和能力，例如如在此描述的测定中测量。包含如此改变的氨基酸序列的结合成员可具有结合且/或中和IL-18的改进的能力。
改变可包含以非天然产生或非标准氨基酸替换一个或多个氨基酸残基、将一个或多个氨基酸残基修饰成非天然产生或非标准形式，或将一个或多个非天然产生或非标准氨基酸插入至序列中。本发明的序列中的改变的数量和位置的实例在此在别处描述。天然产生的氨基酸包括20个“标准”L-氨基酸，它们通过其标准单一字母编码来鉴别为G、A、V、L、I、M、P、F、W、S、T、N、Q、Y、C、K、R、H、D、E。非标准氨基酸包括可并入多肽骨架中或由现有氨基酸残基的修饰来产生的任何其他残基。非标准氨基酸可为天然产生或非天然产生的。几个天然产生的非标准氨基酸本领域中已知的，例如4-羟基脯氨酸、5-羟基赖氨酸、3-甲基组氨酸、N-乙酰丝氨酸等人[富特&富特（Voet&Voet），生物化学（Biochemistry），第2版,（威利公司（Wiley））1995]。在其N-α位置衍生的那些氨基酸残基只位于氨基酸序列的N-末端。正常地在本发明中氨基酸为L-氨基酸，但是它可为D-氨基酸。因此，改变可包含将L-氨基酸以D-氨基酸来修饰，或用它来替换。甲基化、乙酰化和/或磷酸化形式的氨基酸也是已知的，并且本发明中的氨基酸可经受这种修饰。
本发明的抗体域和结合成员中的氨基酸序列可包含如上所述的非天然或非标准氨基酸。非标准氨基酸（例如D-氨基酸）可在合成期间，或在合成氨基酸序列之后通过修饰或替换“原始”标准氨基酸来并入氨基酸序列中。
使用非标准和/或非天然产生的氨基酸增加结构和功能变异性，并且因而可增加在本发明的结合成员中实现所需IL-18结合以及中和性质的潜力。另外，D-氨基酸和类似物已被证明与标准L-氨基酸相比具有不同的药代动力学概况，这是由于具有L-氨基酸的多肽在给予动物例如人之后在体内降解，从而意味着D-氨基酸有利于一些体内应用。
可产生承载本发明的CDR衍生序列的新颖VH或VL区域，方法是使用一个或多个选定VH和/或VL基因的随机诱变以便产生整个可变域内的突变。这类技术由格兰（Gram）等人描述[格兰等人,1992,美国国家科学院院刊,89:3576-3580]，使用容易出错的PCR。在一些实施例中，一个或两个氨基酸取代在整个可变域或CDR集合内产生。
可使用的另一个方法是将诱变引导至VH或VL基因的CDR区域。这些技术由巴巴斯（Barbas）等人[巴巴斯等人，1994，美国国家科学院院刊,91:3809-3813]和希尔（Schier）等人[希尔等人，1996，分子生物学杂志263:551-567]披露。
所有上述技术在本领域中为本身已知的并且本领域技术人员能够使用这些技术以便使用本领域中的常规方法来提供本发明的结合成员。
另一个方面本发明提供了一种获得IL-18的抗体抗原结合部位的方法，该方法包括：经由将一个或多个氨基酸取代、缺失或插入于在此阐明的VH域的氨基酸序列中来提供作为VH域的氨基酸序列变体的VH域，可任选地将由此提供的VH域与一个或多个VL域组合，以及测试VH域或一种或多种VH/VL组合以便鉴别针对IL-18并且可任选地具有一个或多个所需性质，例如中和IL-18活性的能力的结合成员或抗体抗原结合部位。所述VL域可具有大致上如在此阐明的氨基酸序列。可使用类似方法，其中在此披露的VL域的一个或多个序列变体与一个或多个VH域组合。
如以上提及，大致上如在此阐明的CDR氨基酸序列可作为CDR并入人抗体可变域或其实质性部分中。大致上如在此阐明的HCDR3序列代表本发明的实施例并且这些序列中的每一个可作为HCDR3并入人重链可变域或其实质性部分中。
用于本发明的可变域可从任何种系或重新排列的人可变域获得或得到，或可为基于已知人可变域的共同或实际序列的合成可变域。可变域可从非人抗体得到。可使用重组DNA技术将本发明的CDR序列（例如CDR3）引入缺乏CDR（例如CDR3）的可变域组库中。例如，Marks等人[玛尔柯斯（Marks）等人生物技术（Bio/Technology），1992，10:779-783]描述产生抗体可变域组库的方法，其中定向于或相邻于可变域区域的5'末端的共同引物结合人VH基因的第三框架区域的共同引物来使用以便提供缺乏CDR3的VH可变域的组库。玛尔柯斯等人进一步描述此组库可与特定抗体的CDR3组合的方法。使用类似技术，本发明的CDR3衍生序列可与缺乏CDR3的VH域或VL域的组库混洗，并且混洗完成与同源VL或VH域组合的VH域或VL域以便提供本发明的结合成员。然后，该组库可展示于合适宿主系统中，例如以其全部内容通过引用结合在此的WO92/01047，或任何后续大量文献，包括凯、温特&麦卡弗蒂（Kay,Winter&McCafferty）[凯,B.K.（Kay,B.K.）,温特,J.（Winter,J.）和麦卡弗蒂,J.（McCafferty,J.）（1996）肽和蛋白质的噬菌体展示：实验室手册（Phage Display of Peptides and Proteins:A Laboratory Manual）,圣地亚哥：学术出版社（San Diego:Academic Press）]的噬菌体展示系统，以使得可选择合适结合成员。一个组库可由104个个别成员以上的任何成员组成，例如至少105、至少106、至少107、至少108、至少109或至少1010个成员或更多个。其他合适宿主系统包括但不限于酵母展示、细菌展示、T7展示、病毒展示、细胞展示、核糖体展示和共价展示。
提供了一种制备对于IL-18的结合成员的方法，该方法包括：
(a)提供编码一个VH域的核酸的起始组库，该VH域包括一个有待置换的CDR3或一个缺乏CDR3编码区域；
(b)将所述组库与编码大致上如在此对于VH CDR3阐明的氨基酸序列的供体核酸组合，例如表11展示的VH CDR3，这样使得所述供体核酸插入组库中的CDR3区域中，以便提供编码VH域的核酸的产物组库；
(c)表达所述产物组库的核酸；
(d)选择IL-18的结合成员；和
(e)回收所述结合成员或编码它的核酸。
另外，可使用类似方法，其中本发明的VL CDR3与编码一个VL域的核酸的组库组合，该VL域包括一个有待置换的CDR3或缺乏一个CDR3编码区域。
类似地，一个或多个或所有三个CDR可枝接至VH域或VL域的组库中，然后针对IL-18的一个或多个结合成员对其进行筛选。
例如，可使用来自表11列出的一个或多个抗体的HCDR1、HCDR2和/或HCDR3，例如一组HCDR，且/或可使用来自在此列出的一个或多个抗体的LCDR1、LCDR2和/或LCDR3，例如LCDR集合。
类似地，可使用在此披露的其他VH域和VL域、CDR集合和HCDR集合和/或LCDR集合。
免疫球蛋白可变域的实质性部分可包含至少三个CDR区域，连同其介入框架区。部分还可包括第一和第四框架区中一个或两个的至少约50%，该50%为第一框架区域的C-末端50%和第四框架区域的N-末端50%。可变域的实质性部分的N-末端或C-末端的另外残基可为通常不与天然产生的可变域区域相关联的那些残基。例如，通过重组DNA技术产生的本发明的结合成员的构建可导致引入由所引入的连接物编码的N-或C-末端残基以便促进克隆或其他操纵步骤。其他操纵步骤包括引入将本发明的可变域连接至包括抗体恒定区的其他蛋白序列的连接物、其他可变域（例如在产生双抗体中）或可检测/功能性标志，如在此在别处更详细地讨论。
虽然在本发明的一些方面，结合成员包含一对VH域和VL域，但是基于VH域或VL域序列的单一结合域形成本发明的另外方面。已知单一免疫球蛋白域，尤其VH域，能够以特异性方式结合目标抗原。例如，参见上述dAbs的讨论。
在任一单一结合域的情况下，这些域可用于筛选能够形成能够结合IL-18的两域结合成员的互补域。这可通过噬菌体展示筛选方法使用如在以其全部内容通过引用结合在此的WO92/01047中披露的所谓分级双重组合方法来获得，其中含有H或L链克隆的个别集落用于感染编码另一种链（L或H）的克隆的完整文库并且根据噬菌体展示技术，例如在所述参考文献中描述的那些技术来选择所得两链结合成员。此技术也披露于玛尔柯斯（Marks）等人生物技术，1992,10:779-783中。
本发明的结合成员可进一步包含抗体恒定区或其部分，例如人抗体恒定区或其部分。例如，VL域可在其C-末端连接至抗体轻链恒定域，包括人Cκ或Cλ链。类似地，基于VH域的结合成员可在其C-末端连接至源自任何抗体同种型，例如IgG、IgA、IgE和IgM和任何同种型子类，尤其IgG2、IgG1和IgG4的免疫球蛋白重链的全部或一部分（例如CH1域）。IgG2由于其缺乏效应功能而在一些实施例中可为有利的。在其他实施例中，IgG1可归因于其效应功能和易于制造而为有利的。具有这些性质并且使可变区稳定的任何合成或其他恒定区变体也可适用于本发明中。
结合成员可用可检测或功能标志来标志化。因此，结合成员或抗体分子可以免疫偶联物形式存在以便获得可检测且/或可定量的信号。免疫偶联物可包含与可检测或功能标志偶联的本发明的抗体分子。标志可为产生或可诱导以便产生信号的任何分子，包括但不限于荧光标志、放射性同位素标志、酶、化学发光标志或光敏剂。因此，结合可通过检测荧光或发光、放射性、酶的活性或光吸收率来检测和/或测量。
合适标志包括作为说明而非限制地
-酶，例如碱性磷酸酶、葡萄糖-6-磷酸盐脱氢酶（“G6PDH”）、α-D-半乳糖苷酶、葡萄糖氧化酶、葡萄糖淀粉酶、碳酸酐酶、乙酰胆碱酯酶、溶菌酶、苹果酸脱氢酶以及过氧化物酶例如辣根过氧物酶；
-染料；
-荧光标志或荧光剂，例如荧光素和其衍生物、荧光色素、若丹明化合物和衍生物、GFP（GFP“绿色荧光蛋白”）、丹酰、伞形酮、藻红蛋白、藻蓝蛋白、别藻蓝蛋白、o-苯二甲醛以及荧光胺；荧光团例如镧化物穴状化合物和螯合物例如铕等（珀金埃尔默（Perkin Elmer）和Cis Biointernational），
-化学发光标志或化学发光剂，例如异鲁米诺、鲁米诺和二氧杂环丁烷类；
-生物-发光标志，例如荧光素酶和荧光素；
-敏化剂；
-辅酶；
-酶底物；
-放射性同位素标志，包括但不限于溴77、碳14、钴57、氟8、钾67、钾68、氢3（氚）、铟111、铟113m、碘123m、碘125、碘126、碘131、碘133、汞107、汞203、磷32、铼99m、铼101、铼105、钌95、钌97、钌103、钌105、钪47、硒75、硫35、锝99、锝99m、碲121m、碲122m、碲125m、铥165、铥167、铥168、钇199以及在此提到的其他放射性同位素标志；
-颗粒，例如乳胶或碳颗粒；金属溶胶；雏晶；脂质体；细胞等，它们可以用染料、催化剂或其他可检测基团来进一步标志化；
-分子，例如生物素、地高辛或5-溴脱氧尿苷；
-毒素部分，例如选自以下群组的毒素部分：假单胞菌外毒素（PE或其细胞毒性片段或突变型）、白喉毒素或其细胞毒性片段或突变型、肉毒杆菌毒素A、B、C、D、E或F、蓖麻毒素或其细胞毒性片段例如蓖麻毒素A、相思豆毒素或其细胞毒性片段、皂素或其细胞毒性片段、美洲商陆抗病毒毒素或其细胞毒性片段、以及异株腹泻毒蛋白1或其细胞毒性片段。
合适酶和辅酶的实例披露于US4275149，和US4318980中。合适荧光剂和化学发光剂也披露于US4275149中。标志进一步包括化学部分，例如可经由结合至具体同源可检测部分来检测的生物素，例如标志化的抗生物素蛋白或链霉抗生物素蛋白。可检测标志可使用在本领域中已知的常规化学来连接至本发明抗体。
免疫偶联物或其功能片段可通过本领域技术人员已知的方法来制备。其可直接或经由间隔基团或连接基团来连接至酶或荧光标志，该间隔基团或连接基团例如聚醛如戊二醛、乙二胺四醋酸（EDTA）、二乙烯-三胺五醋酸（DPTA）或在连接剂的存在下，例如以上关于治疗偶联物所提到的那些连接剂。含有荧光素类型的标志的偶联物可通过与异硫氰酸酯反应来制备。
在本领域中已知用于直接或经由以上提到的螯合剂例如EDTA、DTPA将治疗放射性同位素连接至抗体的方法也可用于可在诊断使用中的放射性元素。同样可通过氯胺T方法来执行以钠125加标志[亨特W.M.（Hunter W.M.）和格林伍德F.C.（Greenwood F.C.）（1962）自然194:495]或另外通过US4424200的技术用锝99m标志化或如US4479930描述经由DTPA来连接。
存在标志可藉以产生信号的许多方法，该信号可通过外部手段，例如肉眼检查、电磁辐射、热和化学试剂来检测。标志还可结合至结合本发明抗体的另一个结合成员，或结合至支撑物。
标志可直接产生信号，并且因此不需要另外组分来产生信号。许多有机分子，例如荧光剂，能够吸收紫外线和可见光，其中光吸收将能量转移至这些分子并且将其提高至激发能量状态。然后，此吸收能量通过第二波长下的光发射来耗散。此第二波长发射也可将能量转移至标志化的受体分子，并且所得能量通过光发射例如荧光共振能量转移（FRET）而从受体分子耗散。直接产生信号的其他标志包括放射性同位素和染料。
或者，标志可需要其他组分来产生信号，并且然后信号产生系统包括产生可测量信号所需要的所有组分，这些组分可包括底物、辅酶、增强剂、另外酶、与以下各项反应的物质：酶产物、催化剂、活化剂、辅助因子、抑制剂、清除剂、金属离子，以及用于结合信号产生物质所需要的具体结合物质。合适信号产生系统的详细讨论可发现于US5185243中。
本发明的一个方面提供一种包含引起或允许如在此提供的结合成员结合至IL-18的方法。如提及，这种结合可在体内，例如在给予结合成员，或编码结合成员的核酸之后发生，或它可在体外发生，例如在ELISA、蛋白质印迹、免疫细胞化学、免疫沉淀反应、亲和色谱和生化或基于细胞的测定例如KG-1或PBMC细胞测定中。
本发明也提供例如在生物传感器系统中使用根据本发明的结合成员来直接测量抗原水平。例如，检测和/或测量与IL-18的结合的方法可包括(i)将所述结合成员暴露于IL-18和(ii)检测所述结合成员与IL-18的结合，其中结合使用在此描述的任何方法或可检测标志来检测。在此所述的此和任何其他结合检测方法可直接由执行方法的个人，例如通过在视觉上观察可检测标志来解释。或者，此方法，或在此描述的任何其他结合检测方法可产生呈以下形式的报告：自动射线摄影、照片、计算机打印输出、流式细胞术报告、曲线图、图表、含有结果的试管或容器或孔或方法结果的任何其他视觉或实体表达。
在一些实施例中，由结合成员结合的IL-18可为游离IL-18（即未结合至IL-18BP的IL-18）。游离IL-18为IL-18的生物活性形式。
可确定结合成员与IL-18结合的量。定量可与试样中的抗原的量相关，它可以具有诊断重要性。筛选IL-18结合和/或其定量可适用于例如针对本文提到的疾病或病症和/或涉及异常IL-18表达和/或活性的任何其他疾病或病症来筛选患者。
诊断方法可包括(i)从受试者获得组织或液体样本，(ii)使所述组织或液体样本暴露于本发明的一种或多种结合成员；并且(iii)与对照样品比较来检测结合的IL-18，其中与对照比较IL-18结合量的增加可指示IL-18表达或活性的异常水平。将要测试的组织或液体样本包括血液、血清、尿、活检材料、肿瘤或疑似含有异常IL-18水平的任何组织。对于异常IL-18水平或活性测试为阳性受试者还可受益于在此稍后披露的治疗方法。
本领域技术人员能够鉴于在此披露的方法，根据其偏好和常识来选择确定结合成员与抗原结合的合适方式。
样本中的结合成员的反应性可通过任何合适手段来确定。放射免疫检定（RIA）为一个可能。放射性标志化的抗原与未标志化的抗原（试样）混合并且允许结合至结合成员。将结合抗原与未结合抗原在实体上分离并且确定结合至结合成员的放射性抗原的量。试样中的抗原越多，结合至结合成员的放射性抗原越少。竞争结合测定还可用于非放射性的抗原，使用连接至报道分子的抗原或类似物。报道分子可为具有光谱分离吸收或发射特性的荧光色素、磷光体或激光染料。合适荧光染料包括荧光素、若丹明、藻红蛋白和得克萨斯红，以及镧系元素螯合物或穴状化合物.合适发色染料包括二氨基联苯胺。
其他报道物包括大分子胶状颗粒或颗粒材料，例如有色、磁性或顺磁性的乳胶珠粒，以及可直接或间接地导致在视觉上观察、以电子方式检测或以其他方式记录可检测信号的生物学或化学活性剂。这些分子可为催化反应的酶，这些反应使颜色显现或改变或引起例如电性质变化。其可为分子可激发的，这样使得能量状态之间的电子跃迁产生特有光谱吸收或发射。其可包括结合生物传感器使用的化学实体。可使用生物素/抗生物素蛋白或生物素/链霉抗生物素蛋白和碱性磷酸酶检测系统。
个别结合成员-报道物偶联物产生的信号可用于得出样本（正常和测试）中的相关结合成员结合的可定量的绝对或相对数据。
如在此描述的白细胞介素-18（IL-18）的分离结合成员可与IL-18BP竞争结合至IL-18并且因此可适用于在结合至IL-BP的IL-18与游离IL-18（即未结合至IL-18BP的IL-18）之间区分。
本发明的分离结合成员可适用于检测和/或测量游离IL-18。检测和/或测量游离IL-18的方法可包括(i)将根据本发明的结合成员暴露于游离IL-18并且(ii)检测和/或测量所述结合成员与游离IL-18的结合。结合成员与游离IL-18的结合可使用任何便利的方法，例如，在此描述的方法来检测和/或测量。
本发明方法可适用于确定样本中的游离IL-18的量。
测量样本中的游离IL-18的方法可包括；
使样本与本发明的结合成员接触并且
确定结合成员与样本的结合。
结合成员与样本的结合指示样本中的游离IL-18的存在。结合成员与样本的结合量可指示样本中的游离IL-18的量。
测定可涉及使用结合IL-18的第一结合成员和第二结合成员，该第二结合成员也结合IL-18但是结合至IL-18上的、与第一结合成员不同的表位。第一或第二结合成员之一为本发明的结合成员，第一或第二结合成员的另一个可为已知IL-18结合成员，例如抗IL-18抗体。合适的已知IL-18结合成员可在本领域中获得。
在一些便利的测定方式中，所述第一或所述第二结合成员之一可固定于固体衬底上并且另一个未固定。
结合成员可以在本领域中已知的许多不同方式固定于固体支撑物。例如，结合成员可例如经由静电和/或疏水性相互作用来直接吸附至固体支撑物，例如在塑料固体支撑物的情况下。或者，结合成员可共价连接至固体支撑物。在这种情况下，固体支撑物可化学修饰以便引入或活化支撑物表面上的官能化学基团，例如羟基或胺基团，并且支撑物使用交联剂例如戊二醛来交联，以便促进第一成员共价结合至固体支撑物。在另外替代方案中，结合成员可通过特异性结合相互作用来间接地连接至固体支撑物，例如通过生物素与抗生物素蛋白之间的相互作用，或通过将蛋白A或蛋白G固定至固体支撑物，随后特异性结合至结合成员本身。
适合于检测游离IL-18的许多不同测定方式在本领域中为已知的，包括非竞争和竞争测定和免疫测定。
非竞争测定方式可涉及，例如，将结合至IL-18的第一结合成员固定至固体支撑物。然后，固定的结合成员可与所感兴趣的样本接触。如果样本含有IL-18，它与固定的结合成员结合。然后添加结合至IL-18的第二结合成员并且允许结合。在一些实施例中，固定的第一结合成员可为本发明的结合成员。在其他实施例中，第二结合成员可为本发明的结合成员。
为了允许检测，第二结合成员可用可检测标志来标志化。或者，第二结合成员的结合可使用特异性结合至第二结合成员并且用可检测标志标志化的第三结合成员，例如抗体来确定。样本中的游离IL-18分子由固定的第一结合成员捕获并且从而固定于支撑物上。第二结合成员结合至捕获的游离IL-18并且本身固定于支撑物。在一些实施例中，标志化的第三结合成员可结合至第二结合成员并且也固定于支撑物上。
第三结合成员可例如直接结合至第二结合成员（例如抗-IgG抗体）或可结合至连接或融合至第二结合成员的亲和标记物。
合适亲和力标记物包括生物素或肽基序列，例如MRGS(H)6、DYKDDDDK（FLAGTM）、T7-、S-(KETAAAKFERQHMDS)、聚-Arg(R5-6)、聚-His(H2-10)、聚-Cys(C4)聚-Phe(F11)聚-Asp(D5-16)、Strept-标记物II(WSHPQFEK)、c-myc(EQKLISEEDL)、流感-HA标记物（默里P.J.（Murray,P.J.）等人（1995）Anal Biochem229,170-9）、Glu-Glu-Phe标记物（Stammers,D.K.等人（1991）FEBS Lett283,298-302）、Tag.100（Qiagen；从哺乳动物MAP激酶2衍生的12aa标记物）、Cruz标记物09TM（MKAEFRRQESDR,圣克鲁斯生物技术公司（Santa Cruz BiotechnologyInc.））以及Cruz标记物22TM（MRDALDRLDRLA,圣克鲁斯生物技术公司）。
然后测量直接或间接地结合至固体支撑物的标志化第二或第三结合成员的量，其中检测到的标志化的结合成员的量与存在于样本中的游离IL-18的量成正比例。
例如，测量样本中的游离IL-18的方法可包括；
使样本与结合至IL-18的第一结合成员接触，并且；
使用结合至IL-18的第二结合成员来确定所述第一结合成员与样本中的IL-18的结合，
其中所述第一或第二结合成员之一是本发明的结合成员并且所述第一或第二结合成员中的另一个是不与本发明的结合成员竞争结合至IL-18的抗IL-18结合成员。
如上所述，第一结合成员可为本发明的结合成员并且第二结合成员可为不与本发明的结合成员竞争结合至IL-18的抗IL-18结合成员；或第二结合成员可为本发明的结合成员并且第一结合成员可为不与本发明的结合成员竞争结合至IL-18的抗IL-18结合成员。
确定所感兴趣的样本中的游离IL-18的存在的竞争性测定可涉及将本发明的结合成员固定于固体支撑物。然后添加标志化的IL-18并且允许其结合至本发明的固定结合成员，随后添加样本。如果样本含有游离IL-18，它与标志化的IL-18竞争结合至本发明的固定结合成员。然后测量结合至固体支撑物的标志化的IL-18的量。在这种情况下，检测到的标志化的IL-18的量与存在于样本中的游离IL-18的量成反比例。
合适样本包括生物液体样本，例如脑脊液（CSF）、胆汁、尿、皮脂唾液或血清。
样本可使用标准技术从个体，例如灵长类例如人类或猴子获得。
如本文提到的可检测标志可为产生或可诱导产生信号的任何标志，包括但不限于荧光剂、化学发光剂（例如辣根过氧物酶）、有色标志（例如乳胶[蓝色]或胶体金[红色]）、放射性同位素标志、酶和磁性标志。因此，结合于表面，例如毛细管孔的表面的标志的量可通过检测荧光或发光、颜色、放射性、酶的活性或磁场变化来检测和/或测量。可检测标志可使用常规化学来连接至结合成员。优选地，可检测标志为可通过光学解调，例如以数字摄像机或平台式扫描仪来检测的标志。可通过光学解调来检测的标志包括荧光剂、化学发光剂和有色标志。可藉以产生信号以便光学检测的机制包括（但不一定限于）：光吸收、光散射、光衍射、光反射、荧光或发光。
如在此描述的游离IL-18的测量允许精确地确定样本中的生物活性IL-18的水平。
游离IL-18的测量可适用于诊断且/或预测疾病病状，包括炎症疾病、自身免疫疾病例如继发性噬血综合征、巨噬细胞活化综合征、类风湿性关节炎和I型糖尿病，以及心血管疾病，例如冠状动脉疾病，例如慢性阻塞性肺病（COPD）和急性冠状动脉综合征。
测量游离IL-18还可适用于评估疾病病状对于治疗的应答性。
评估个体中的疾病病状对于治疗的应答性的方法可包括：
在所述治疗之前和之后使用本发明的结合成员来测量从个体获得的样本中的游离IL-18的量，如上所述，
其中游离IL-18的水平的降低指示个体应答于治疗。
游离IL-18的水平或量可在所述给予之前使用如在此描述的本发明的结合成员在从个体获得第一样本中测量并且在所述给予之后在从个体获得的第二样本中测量，第一和第二样本中的游离IL-18的水平或量之间的差异，例如降低，指示疾病病状应答所述治疗。
监测个体中的疾病病状的治疗的方法可包括：
(a)使个体经受治疗方案；并且
(b)在所述治疗期间，使用如上所述的方法来监测从个体获得的样本中的游离IL-18的水平或量，
其中在治疗期间获得的样本中的游离IL-18的水平或量的减少指示方案有效治疗个体中的疾病病状。
不存在治疗期间从患者获得的样本中的游离IL-18的水平或量的持续变化的情况下，方法可进一步包括；
(c)改变治疗方案并且使个体经受改变的方案；
(d)使用在此描述的方法来监测从个体获得的样本中的游离IL-18的水平，并且
(e)重复步骤c)和d)直到观察到游离IL-18水平的持续变化为止。
其中治疗期间维持的游离IL-18的水平或量的变化，例如减少，指示改变的方案有效治疗个体中的疾病病状。
在存在治疗期间游离IL-18的水平或量的持续变化的情况下，方法可进一步包括；
(c)改变治疗方案并且使个体经受改变的方案；
(d)使用在此描述的方法来监测从个体获得的样本中的游离IL-18的水平，并且
(e)重复步骤c)和d)直到观察到游离IL-18水平的最大变化为止。
其中治疗期间维持的游离IL-18的水平或量的最大变化指示改变的方案有效治疗个体中的疾病病状。
游离IL-18的测量还可适用于鉴别临床试验的患者群组。
鉴别患者群组的方法可包括：
(a)鉴别患有疾病病状的患者群体，
(b)使用本发明的结合成员来测量从群体中的个体获得的样本中的游离IL-18的量，如上所述；
(c)鉴别含有高于或低于临界值的游离IL-18的量的样本，并且；
(d)从所鉴别的样本中鉴别患者群组。
所鉴别的患者群组可全部具有较高或较低水平的游离IL-18（即高于或低于临界值的水平）。
疾病病状可包括炎症和自身免疫疾病例如继发性噬血综合征、巨噬细胞活化综合征、类风湿性关节炎和I型糖尿病，以及冠状动脉疾病，例如慢性阻塞性肺病（COPD）和急性冠状动脉综合征。
可如上所述在患者中监测且/或评估的合适治疗在本领域中是熟知的。
包含在此描述的结合成员的试剂盒也作为本发明的一个方面来提供。在试剂盒中，结合成员可标志化以便允许确定其在样本中的反应性，例如如以下进一步描述。此外，结合成员可连接或可不连接至固体支撑物。试剂盒的组件总体上为无菌的并且处于密封小瓶或其他容器中。试剂盒可用于诊断分析或结合成员适用的其他方法中。试剂盒可用于如上所述的方法。试剂盒可含有在方法，例如根据本发明的方法中使用组件的说明书。帮助或实现执行这种方法的辅助材料可包括于本发明的试剂盒中。辅助材料包括第二、不同的结合成员，该第二、不同的结合成员结合至第一结合成员并且偶联至可检测标志（例如，荧光标志、放射性同位素或酶）。基于抗体的试剂盒还可包含用于进行免疫沉淀反应的珠粒。试剂盒的每个组件总体上在其自己的合适容器中。因此，这些试剂盒总体上包含适合于每个结合成员的独特容器。此外，试剂盒可包含执行测定的说明书和解释并且分析由执行测定所产生的数据的方法。
本发明也提供如上述的结合成员在竞争测定中测量抗原水平的用途，也就是说使用如本发明提供的结合成员在竞争测定中测量样本中的抗原水平的方法。在此情况下，不需要结合与未结合抗原的实体分离。将报道分子连接至结合成员以使得在结合时发生物理或光学变化为一个可能。报道分子可直接或间接地产生可检测信号，这些可检测信号可以是可定量的。报道分子的键合可直接或间接地、共价例如经由肽键或非共价地。经由肽键的键合可为编码抗体和报道分子的基因融合的重组表达的结果。
如上所述，本发明延伸至与在此定义的任何结合成员竞争结合至IL-18的结合成员，例如表11中列出的任何抗体，例如呈IgG2、IgG1或IgG1三重突变（TM；奥加涅相（Oganesyan）等人（2008）Acta Crystallogr D BiolCrystallogr.64(Pt6):700-4）格式。结合成员之间的竞争可容易地在体外测定，方法例如为将具体报道分子标记至可在其他未标记化结合成员的存在下加以检测的一个结合成员，以便能够鉴别结合相同表位或重叠表位的结合成员。竞争可例如使用ELISA来确定，其中IL-18固定至板并且第一标记化或标志化的结合成员与一个或多个其他未标记化或未标志化的结合成员添加至板。与标记化结合成员竞争的未标记化结合成员的存在通过标记化结合成员发出的信号的减少来观察。
例如，本发明包括鉴别IL-18结合化合物的方法，该方法包括(i)将IL-18固定至支撑物，(ii)将所述固定IL-18同时或以逐步方式与根据本发明的至少一种标记化或标志化的结合成员和一种或多种未标记化或未标志化的测试结合化合物接触，并且(iii)通过观察到来自标记化结合成员的结合标记物的量的降低来鉴别新的IL-18结合化合物。这些方法可使用多孔或阵列格式以高通量方式来执行。这些测定还可溶液中执行（参见例如U.S.5,814,468）。如上所述，结合的检测可由执行方法的个人，例如通过在视觉上观察可检测标志，或其存在的减少来直接解释。或者，本发明的结合方法可产生呈以下形式的报告：自动射线摄影、照片、计算机打印输出、流式细胞术报告、曲线图、图表、含有结果的试管或容器或孔或方法结果的任何其他视觉或实体表达。
竞争测定也可用于表位作图。在一个实例中，表位作图可用于鉴别可任选地可具有优化的中和和/或调节特性的IL-18结合成员所结合的表位。这类表位可为线性或构象的。构象表位可包含IL-18的至少两个不同片段，其中当IL-18在其三级或四级结构中折叠时，所述片段彼此邻近定位以便形成由IL-18的抑制剂，例如IL-18结合成员辨识的构象表位。在竞争测试中，可使用抗原的肽片段，尤其包括或基本上由所感兴趣的表位组成的肽。可使用具有表位序列加上任一末端处的一个或多个氨基酸的肽。根据本发明的结合成员可使得其与抗原的结合由具有或包括给定序列的肽来抑制。
本发明进一步提供编码在此描述的结合成员的分离核酸序列。核酸可包括DNA和/或RNA。在一例中，本发明提供编码如在此定义的本发明的CDR或CDR集合或VH域或VL域或抗体抗原结合部位或抗体分子，例如scFv或IgG（例如IgG2、IgG1或IgG1）的核酸。
本发明也提供呈包含如上述的至少一个多核苷酸的质粒、载体、转录或表达盒形式的构建体。
本发明也提供包含如上述的一种或多种构建体的重组宿主细胞系。所提供的编码任何CDR或CDR集合或VH域或VL域或抗体抗原结合部位或抗体分子例如scFv或IgG（例如IgG2、IgG1或IgG1TM）的核酸序列与产生编码产物的方法一起形成本发明的一个方面，该方法包括从其编码核酸序列来表达。表达可通过在合适条件下培养含有核酸的重组宿主细胞来便利地获得。在通过表达来产生之后，VH域或VL域，或结合成员可使用任何合适技术来分离且/或纯化，然后视情况使用。
根据本发明的核酸序列可包含DNA或RNA并且可全部或部分合成。提及如在此阐明的核苷酸序列涵盖具有规定序列的DNA分子，并且涵盖具有规定序列的RNA分子，其中U取代T，除非上下文另外要求。
另一个方面提供产生抗体VH可变域的方法，该方法包括导致从编码核酸序列来表达。这类方法可包括在产生所述抗体VH可变域的条件下培养宿主细胞。
产生VL可变域和包含VH和/或VL域的结合成员的类似方法作为本发明的另一个方面来提供。
产生方法可包括分离和/或纯化产物的步骤。产生方法可包括将产物配制成包括至少一种另外组分（例如药学上可接受的赋形剂）的组合物。
在各种不同的宿主细胞中克隆并且表达多肽的系统为熟知的。合适宿主细胞包括细菌、哺乳动物细胞、植物细胞、丝状真菌、酵母和杆状病毒系统以及转基因植物和动物。在原核细胞中表达抗体和抗体片段在本领域中为沿用已久的。关于评论，参见例如Plückthun[Plückthun,A.生物技术（Bio/Technology）9:545-551(1991)]。常见细菌宿主为大肠杆菌。
在培养物中的真核细胞中的表达也可由本领域技术人员用作产生结合成员的选择方案[查德HE（Chadd HE）和Chamow SM（2001）生物技术新见12:188-194；安徒生DC（Andersen DC）和克鲁曼L（Krummen L）（2002）生物技术新见13:117；拉里克JW（Larrick JW）和托马斯DW（Thomas）DW（2001）生物技术新见12:411-418]。
可在本领域中用于表达异源多肽的哺乳动物细胞系包括中国仓鼠卵巢（CHO）细胞、HeLa细胞、幼仓鼠肾细胞、NS0小鼠黑素瘤细胞、YB2/0大鼠骨髓瘤细胞、人胚胎肾细胞、人胚胎视网膜细胞和许多其他细胞。
可选择或构建合适载体，它们含有合适调控序列，包括启动子序列、终止子序列、多聚腺苷酸化序列、增强子序列、标记基因以及视情况的其他序列。载体可视情况为质粒如噬菌粒，或病毒如噬菌体[萨姆布鲁克（Sambrook）和拉塞尔（Russell），分子克隆：实验室手册（Molecular Cloning:a LaboratoryManual）：第3版，2001，冷泉港实验室出版社（Cold Spring HarborLaboratory Press）]。例如在制备核酸构建体、诱变、测序、将DNA引入细胞中和基因表达以及分析蛋白质中用于操纵核酸的许多已知技术和方案详细描述于奥苏伯尔（Ausubel）等人[奥苏伯尔等人编，分子生物学短方案：分子生物学当前方案方法的概要（Short Protocols in Molecular Biology:A Compendium ofMethods from Current Protocols in Molecular Biology），约翰威利出版有限公司，第4版1999]。
本发明的另一个方面提供含有如在此披露的核酸的宿主细胞。这类宿主细胞可在体外并且可在培养物中。这类宿主细胞可在体内。在体内存在宿主细胞可使得本发明的结合成员细胞内表达为“胞内抗体”或细胞内抗体。胞内抗体可用于基因疗法。
另一个方面提供包含将本发明的核酸引入宿主细胞中的方法。引入可使用任何可获得的技术。对于真核细胞，合适技术可包括磷酸钙转染、DEAE-葡聚糖、电穿孔、使用逆转录病毒或其他病毒例如牛痘的脂质体介导转染和转换，或对于昆虫细胞，使用杆状病毒。将核酸引入宿主细胞，尤其真核细胞中可使用病毒或基于质粒的系统。质粒系统可保持游离或可并入宿主细胞或人工染色体中。并入可通过将一个或多个拷贝随机或靶向整合至单一或多个基因座来完成。对于细菌细胞，合适技术可包括氯化钙转化、电穿孔和使用噬菌体来转染。
在引入之后可例如通过在表达基因的条件下培养宿主细胞来导致或允许从核酸中表达。表达产物的纯化可通过本领域技术人员已知的方法来获得。
本发明的核酸可整合至宿主细胞的基因组（例如染色体）中。整合可根据标准技术通过将促进与基因组重组的序列包含在内来促成。
本发明还提供一种方法，该方法包括将如上所述的构建体用于表达系统中以便表达如上述的结合成员或多肽。
在此描述的结合成员可用于在人类或动物受试者，例如人类中诊断或治疗的方法。IL-18的结合成员可用于治疗与IL-18相关的病症和/或降低IL-18活性可有益的病症。
IL-18的结合成员可用于降低个体中的IL-18活性。因此，本发明提供降低个体中的IL-18活性的方法，该方法包括将有效量的一种或多种本发明结合成员单独或在具有本领域中已知或在此描述的另一种合适药物的组合治疗方案中给予有需要的个体，这样使得降低IL-18的活性。
在此描述的结合成员可用于治疗以下列出的病状：
1.骨骼和关节：与骨关节炎/骨关节病相关或包括这些疾病的关节炎，均为原发性和例如先天性髋发育不良所继发；颈部和腰部脊椎炎，和背下部和颈部疼痛；类风湿性关节炎；斯提耳氏病（Still’s disease）；血清阴性脊柱关节病包括强直性脊柱炎；牛皮癣性关节炎；反应性关节炎；未分化脊柱关节病；脓毒性关节炎和其他感染相关关节病和骨骼病症例如结核病，包括波特氏疾病（Potts’disease）和蓬塞氏综合征（Poncet’s syndrome）；急性和慢性结晶诱导滑膜炎包括尿酸痛风、焦磷酸钙沉积疾病，和钙磷灰石相关肌腱、法氏囊和滑液炎症；贝切特氏疾病（Behcet’s disease）；原发和继发舍格伦氏综合征（Sjogren’s syndrome）；全身硬化和有限硬皮病；全身性红斑狼疮、混合结缔组织疾病，和未分化结缔组织疾病；炎症肌病，包括皮肌炎和多肌炎；风湿性多肌痛；川崎疾病（Kawasaki disease）；幼年型关节炎，包括全身幼年特发性关节炎（sJIA）和特发性炎症关节炎，无论什么关节分布和相关综合征；巨噬细胞活化综合征；风湿病和其全身并发症；噬血细胞综合征；噬血细胞淋巴组织细胞增多病；CAP综合征；血管炎，包括巨细胞动脉炎、高安氏动脉炎（Takayasu’s arteritis）、许尔-斯特劳斯综合征（Churg-Strauss syndrome）、结节性多动脉炎、微观多动脉炎和与病毒感染、过敏反应、冷球蛋白和副蛋白相关的血管炎；背下部疼痛；家族性地中海热；穆-韦二氏综合征（Muckle-Wellssyndrome）；和家族性爱尔兰热（Familial Hibernian Fever）；菊池疾病（Kikuchi disease）；药物诱导的关节痛、腱炎和肌病；
2.肌肉骨骼病症的疼痛和结缔组织重塑，归因于损伤[例如体育损伤]或疾病：关节炎（例如类风湿性关节炎、骨关节炎、痛风或结晶性关节病）、其他关节病（例如椎间盘退化或颞下颌关节退化）、骨骼重塑疾病（例如骨质疏松症、佩吉特氏疾病（Paget's disease）或骨坏死）、多软骨炎、硬皮病、混合结缔组织病症、脊柱关节病或牙周疾病（例如牙周炎）；
3.心血管：肾缺血；中风；动脉粥样硬化；动脉硬化；腹部主动脉瘤；外周动脉疾病；心绞痛；急性冠状动脉综合征；心肌梗塞；充血性心力衰竭；血管再生程序之后的再狭窄；脑血管病，包括多发梗塞性痴呆；外周血管疾病，包括勃起功能障碍；影响冠状动脉和外周循环的病症；心包炎；心肌炎、炎症性和自身免疫性心肌病，包括心肌肉样瘤；缺血再灌注损伤；心内膜炎、瓣炎和主动脉炎，包括感染性（例如梅毒）；血管炎；近端和外周静脉的病症，包括静脉炎和血栓形成，包括深处血管血栓形成和静脉曲张并发症；
4.内分泌疾病：糖尿病，包括2型糖尿病和糖尿病并发症例如糖尿病性肾病、神经病和视网膜病。
5.呼吸道：气道阻塞性疾病包括：哮喘，包括支气管性、过敏性、内因性、外因性、锻炼诱发、药物诱发（包括阿斯匹林和NSAID诱发）和粉尘诱发哮喘，均为间歇性和持续性以及所有严重程度，以及其他由气道高应答性引起的哮喘；慢性阻塞性肺病（COPD）；支气管炎，包括传染性和嗜酸粒细胞性支气管炎；肺气肿；支气管扩张；囊性纤维化；肉状瘤病；农民肺和相关疾病；过敏性肺炎；肺纤维化，包括隐发性纤维化肺泡炎、特发性间质性肺炎、纤维化并发抗肿瘤治疗和慢性感染，包括结核病和曲霉病和其他真菌感染；肺移植的并发症；肺血管的血管炎性和血栓性病症，和肺动脉高压；镇咳活性，包括治疗与气道炎症和分泌病状相关的慢性咳嗽，和医源性咳嗽；急性和慢性鼻炎包括药物性鼻炎，和血管舒缩性鼻炎；常年性和季节性过敏性鼻炎包括神经性鼻炎（花粉热）；鼻息肉病；急性病毒感染包括常见感冒，和归因于呼吸道合胞体病毒、流感、冠状病毒（包括SARS）和腺病毒的感染；
6.皮肤：牛皮癣、特应性皮炎、接触性皮炎或其他湿疹皮肤病，和延迟型过敏反应；植物性和光照性皮炎；脂溢性皮炎、疱疹样皮炎、扁平苔藓、硬化性萎缩性苔藓、坏疽性脓皮症、皮肤肉样瘤、盘状红斑狼疮、天疱疮、类天疱疮、大疱性表皮松解、风疹、血管性水肿、血管炎、毒性红斑、皮肤嗜曙红细胞增多、斑秃、男性型秃发、斯威特氏综合征（Sweet’s syndrome）、韦伯-克里斯迁综合征（Weber-Christian syndrome）、多形性红斑；蜂窝组织炎，感染性和非感染性；脂膜炎；皮肤淋巴瘤、非黑素瘤皮肤癌和其他发育异常病变；药物诱发的病症包括固定药疹；
7.眼睛：眼睑炎；结膜炎，包括常年性和春季过敏结膜炎；虹膜炎；前和后葡萄膜炎；脉络膜炎；自身免疫；影响视网膜的退行性或炎症性病症；眼炎包括交感性眼炎；肉状瘤病；感染，包括病毒、真菌和细菌性感染；
8.胃肠道：舌炎、齿龈炎、牙周炎；食管炎，包括回流性；嗜酸粒细胞性胃肠炎、肥大细胞增多症、克罗恩氏病（Crohn’s disease）、结肠炎包括溃疡性结肠炎、直肠炎、肛门瘙痒；腹腔疾病、肠易激综合症，和可具有远离消化道的影响的食物相关过敏症（例如偏头痛、鼻炎或湿疹）；
9.腹部：肝炎，包括自身免疫性、酒精性和病毒性；纤维化和肝硬化；胆囊炎；胰腺炎，急性和慢性；
10.生殖泌尿：肾炎，包括间质性和肾小球性肾炎；肾变病综合征；膀胱炎，包括急性和慢性（间质性）膀胱炎和杭纳氏溃疡（Hunner’s ulcer）；急性和慢性尿道炎、前列腺炎、附睾炎、卵巢炎和输卵管炎；外阴阴道炎；佩罗尼氏疾病（Peyronie’s disease）；勃起功能障碍（男性和女性）；
11.同种异体移植物排斥反应：在例如移植肾、心、肝、肺、骨髓、皮肤或角膜之后或在输血之后急性和慢性；或慢性移植物抗宿主疾病；
12.CNS：阿兹海默病（Alzheimer’s disease）和其他痴呆病症包括CJD和nvCJD；淀粉样变性；多发性硬化和其他脱髓鞘性综合征；大脑动脉粥样硬化和脉管炎；颞动脉炎；重症肌无力；急性和慢性疼痛（急性、间歇或持续，不论中央或外周来源）包括内脏痛、头痛、偏头痛、三叉神经痛、非典型面部疼痛、关节和骨骼疼痛，由癌症和肿瘤侵入引起的疼痛、神经性疼痛综合征包括糖尿病、疱疹后和HIV相关神经病；神经类肉瘤病；具有恶性、传染性或自身免疫过程的中央和外周神经系统并发症；
13.其他自身免疫和过敏病症，包括桥本氏甲状腺炎（Hashimoto’sthyroiditis）、格雷夫斯氏疾病（Graves’disease）、艾迪生氏疾病（Addison’sdisease）、特发性血小板减少性紫癜、嗜酸粒细胞性筋膜炎、高IgE综合征、抗磷脂综合征；
14.具有炎症或免疫组成部分的其他病症；包括获得性免疫缺损综合症（AIDS）、麻风、塞扎莱综合征（Sezary syndrome）和旁瘤综合征。
15.癌症，包括任何类型的转移性或非转移性实体癌症或恶性淋巴瘤，例如白血病、肉瘤、皮肤癌、膀胱癌、乳腺癌、子宫癌、卵巢癌、前列腺癌、肺癌、结直肠癌、颈部癌、肝癌、头部和颈部癌症、食管癌、胰腺癌、肾癌、胃癌和大脑癌。
在此描述的结合成员可用于治疗这些病症，包括预防性治疗和降低病症的严重程度或其症状中的一个或多个，或延缓或降低发作风险。
因此，本发明提供治疗或降低在此提到的任何病症的至少一个症状的严重程度的方法，该方法包括将有效量的一种或多种本发明结合成员单独或在具有在本领域中已知或在此描述的另一种合适药物的组合治疗方案中给予有需要的患者，这样使得降低任何上述病症的至少一个症状的严重程度。
本发明的结合成员可用于动物和疾病的动物模型中，例如灵长类动物模型，例如恒河猴或食蟹猴模型。合适动物模型还可包括免疫功能低下的非人哺乳动物，例如小鼠或大鼠，它们已经以人细胞来重构。
因此，在此描述的结合成员适用于在涉及IL-18，例如IL-18表达和/或活性，尤其异常表达/活性的疾病或病症的治疗中作为治疗剂。治疗方法可包括将有效量的在此描述的结合成员给予有需要的患者，其中异常表达和/或活性IL-18得以减少。治疗方法可包括(i)例如使用如上所述的诊断方法来鉴别显示异常IL-18水平或活性的患者，和(ii)将有效量的在此描述的结合成员给予患者，其中异常表达和/或活性IL-18得以减少。有效量是减少IL-18的异常表达和/或活性以便减少或减轻所治疗的特定疾病或病症的至少一个症状的严重程度，但是不一定治愈疾病或病症的量。
本发明还提供拮抗IL-18的至少一个影响的方法，该方法包括接触或给予有效量的一种或多种本发明结合成员，这样使得IL-18的所述至少一个影响受到拮抗。可由本发明方法来拮抗的IL-18的影响包括结合至其受体和/或IL-18BP，以及由于这些结合反应而出现的任何下游影响。
因此，本发明的另外方面提供包含给予如所提供的结合成员的治疗方法、包含这种结合成员的药用组合物，和这种结合成员在制造用于给予的药物中，例如在制造药物或药用组合物的方法中的用途，包含将结合成员与药学上可接受的赋形剂一起配制。药学上可接受的赋形剂可为进入药用组合物中的化合物或化合物组合，该化合物或化合物组合不招致次级反应并且允许例如促进结合成员的给予、增加其寿命和/或其在体内的疗效、增加其在溶液中的溶解性或另外改进其保存。这些药学上可接受的媒介物为熟知的并且由本领域技术人员随着所选择的活性化合物的性质和给予模式而变化来调适。
在此描述的结合成员通常以药用组合物形式给予，该组合物可包含至少一种除了结合成员以外的组分。因此根据本发明，以及根据本发明来使用的药用组合物可包含除了结合成员以外的药学上可接受的赋形剂、载体、缓冲剂、稳定剂或本领域技术人员的熟知的其他材料。这些材料应无毒并且不应干扰活性成分的疗效。载体或其他材料的确切性质取决于给予途径，该给予途径可为口服、吸入、气管内、外用、关节内、小囊内或通过注射，如下讨论。
在本发明中也设想用于口腔给予的药用组合物，例如单域抗体分子（例如“nanobodiesTM”）等。这些口服制剂可为片剂、胶囊、粉末、液体或半固体形式。片剂可包含固体载体，例如明胶或佐剂。液体药用组合物总体上包含液体载体，例如水、石油、动物或植物油、矿物油或合成油。可包含生理盐水溶液、葡萄糖或其他糖类溶液或二醇，例如乙二醇、丙二醇或聚乙二醇。
对于静脉内注射，或病痛部位的注射（例如关节内注射），活性成分将是呈肠胃外可接受水溶液形式，该水溶液为无热原的并且具有合适pH、等渗性以及稳定性。本领域技术人员完全能够使用例如等渗媒介物，例如氯化钠注射液、林格氏注射液、乳酸盐林格氏注射液来制备合适溶液。可按需要来使用防腐剂、稳定剂、缓冲剂、抗氧化剂和/或其他添加剂，包括缓冲剂例如磷酸盐、柠檬酸盐和其他有机酸；抗氧化剂，例如抗坏血酸和甲硫氨酸；防腐剂（例如十八烷基二甲基苄基氯化铵；氯化六烃季铵；苯扎氯铵；苄索氯铵；苯酚、丁基醇或苯甲醇；烷基对羟基苯甲酸酯类，例如甲基或丙基对羟基苯甲酸酯；儿茶酚；间苯二酚；环己醇；3’-戊醇；和间甲酚）；低分子量多肽；蛋白质，例如血清白蛋白、明胶或免疫球蛋白；亲水性聚合物，例如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸，例如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、组氨酸、精氨酸或赖氨酸；单糖、双糖和其他碳水化合物包括葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合剂，例如EDTA；糖，例如蔗糖、甘露糖醇、海藻糖或山梨糖醇；盐形成反离子，例如钠；金属复合物（例如Zn-蛋白复合物)；和/或非离子表面活性剂，例如TWEENTM、PLURONICSTM或聚乙二醇（PEG）。
在此描述的结合成员可取决于分子的物理化学性质和输送途径而以液体、半固体或固体形式来配制。制剂可包括赋形剂或赋形剂的组合，例如：糖、氨基酸和表面活性剂。液体制剂可包括广泛范围的抗体浓度和pH。固体制剂可通过冻干、喷雾干燥或经由例如超临界射流技术而干燥来产生。抗IL-18制剂取决于意图输送途径：例如，用于肺部输送的制剂可具有确保在吸入后渗透至肺部深处的物理性质的颗粒组成；外用制剂可包括粘度改善剂，该粘度改善剂延长药物驻留于作用部位的时间。结合成员可被制备成具有保护结合成员避免快速释放的载体，例如控制释放制剂，包括植入物、经皮贴片和微囊化输送系统。可以使用可生物降解的、生物相容的聚合物，例如乙烯-醋酸乙烯酯、聚酐、聚乙醇酸、胶原、聚原酸酯以及聚乳酸。制备这些制剂的许多方法为本领域技术人员已知的[罗宾逊,J.R.（Robinson,J.R.）编,持续和控制释放药物输送系统（Sustained and Controlled Release Drug Delivery Systems）,马塞尔·德克尔公司（Marcel Dekker,Inc.）,纽约,1978]。
抗IL-18治疗可口服给予（例如单域抗体分子（例如“nanobodiesTM”））通过注射（例如，皮下、关节内、静脉内、腹膜内、动脉内或肌肉内）、通过吸入、气管内、通过小囊内途径（注入膀胱中）、或局部（例如眼内、鼻内、直肠、至伤口中、在皮肤上）。治疗可通过脉冲输注，尤其以下降剂量的结合成员来给予。给予途径可通过治疗的物理化学特性、对于疾病的特殊考虑因素或优化疗效或最小化副作用的要求来确定。一个特定给予途径为静脉内。给予本发明的药用组合物的另一个途径为皮下。设想抗IL-18治疗不限于临床使用。因此，使用无针装置的皮下注射也是有利的。
取决于所治疗的病状，组合物可单独或与其他治疗组合，同时或依序来给予。
IL-18的结合成员可结合另外医药组分来用作组合疗法的一部分。组合治疗可用于提供显著协同效应，尤其抗IL-18结合成员与一种或多种其他药物的组合。IL-18的结合成员可同时或依序或作为具有另一种治疗剂或药剂的组合制剂来给予，以便治疗在此列出的一种或多种病状。
根据本发明的结合成员可组合或添加有一种或多种以下药剂来提供：
-细胞因子或细胞因子功能的促效剂或拮抗剂（例如作用于细胞因子信号转导途径上的药剂，例如SOCS系统的调节剂），例如α-、β-和/或γ-干扰素；胰岛素样生长因子类型I（IGF-1）、其受体和相关结合蛋白质；白细胞介素（IL），例如IL-1的IL-37中的一个或多个，和/或白细胞介素拮抗剂或抑制剂，例如阿那白滞素（anakinra）；白细胞介素家族成员的受体的抑制剂或这些受体的具体亚单位的抑制剂（例如托珠单抗（tocilizumab）（ActemraTM；Roche），针对人IL-6受体的人源化IgG1单克隆抗体）、肿瘤坏死因子α（TNF-α）抑制剂，例如抗TNF单克隆抗体（例如英利昔单抗（infliximab）、阿达木单抗（adalimumab）和/或CDP-870）和/或TNF受体拮抗剂，例如免疫球蛋白分子（例如依那西普（etanercept））和/或低分子量剂，例如己酮可可碱（pentoxifylline）；
-B细胞的调节剂，例如靶向B-淋巴细胞的单克隆抗体（例如CD20（利妥昔单抗（rituximab））或MRA-aILl6R）或T-淋巴细胞（例如CTLA4-Ig、HuMaxIl-15或阿巴西普（Abatacept））；
-抑制破骨细胞活性的调节剂，例如RANKL的抗体；
-趋化因子或趋化因子受体功能的调节剂，例如针对以下的拮抗剂：CCR1、CCR2、CCR2A、CCR2B、CCR3、CCR4、CCR5、CCR6、CCR7、CCR8、CCR9、CCR10和CCR11（对于C-C家族）；CXCR1、CXCR2、CXCR3、CXCR4和CXCR5和CXCR6（对于C-X-C家族）和对于C-X3-C家族的CX3CR1；
-基质金属蛋白酶（MMPs）的抑制剂，即以下中的一种或多种：溶基质蛋白、胶原酶和明胶酶以及聚蛋白多糖酶，尤其胶原酶-1（MMP-1）、胶原酶-2（MMP-8）、胶原酶-3（MMP-13）、溶基质蛋白-1（MMP-3）、溶基质蛋白-2（MMP-10）和/或溶基质蛋白-3（MMP-11）和/或MMP-9和/或MMP-12，例如诸如脱氧土霉素的药剂；
-白三烯生物合成抑制剂、5-脂氧合酶（5-LO）抑制剂或5-脂氧合酶活化蛋白（FLAP）拮抗剂，例如齐留通（zileuton）；ABT-761；芬留顿（fenleuton）；替泊沙林（tepoxalin）；Abbott-79175；Abbott-85761；N-(5-取代)-噻吩-2-烷基磺酰胺；2,6-二-叔-丁基苯酚腙；甲氧基四氢吡喃例如ZenecaZD-2138；化合物SB-210661；吡啶基-取代2-氰基萘化合物，例如L-739,010；2-氰基喹啉化合物，例如L-746,530；吲哚和/或喹啉化合物，例如MK-591，MK-886和/或BAY x1005；
-白三烯（LT）B4、LTC4、LTD4和LTE4的受体拮抗剂，选自由以下组成的组：吩噻嗪-3-1s，例如L-651,392；脒化合物，例如CGS-25019c；benzoxalamines，例如昂唑司特（ontazolast）；苄胺肟（benzenecarboximidamide），例如BIIL284/260；和化合物，例如扎鲁司特（zafirlukast）、阿鲁司特（ablukast）、孟鲁司特（montelukast）、普鲁司特（pranlukast）、维鲁司特（verlukast；MK-679）、RG-12525、Ro-245913、伊拉司特（iralukast；CGP45715A）和BAY x7195；
-磷酸二酯酶（PDE）抑制剂，例如甲基黄嘌呤，例如茶碱和/或氨茶碱；和/或选择性PDE同工酶抑制剂，例如PDE4抑制剂和/或同种型PDE4D的抑制剂和/或PDE5的抑制剂；
-组胺类型1受体拮抗剂，例如西替利嗪（cetirizine）、氯雷他定（loratadine）、地氯雷他定（desloratadine）、非索非那定（fexofenadine）、阿伐斯汀（acrivastine）、特非那定（terfenadine）、阿司咪唑（astemizole）、氮卓斯汀（azelastine）、卡巴斯汀（levocabastine）、扑尔敏（chlorpheniramine）、异丙嗪（promethazine）、赛克利嗪（cyclizine）和/或咪唑斯汀（mizolastine）（总体上口服、局部或肠胃外来应用）；
-质子泵抑制剂（例如奥美拉唑（omeprazole））或胃肠道保护性组胺类型2受体拮抗剂；
-组胺类型4受体的拮抗剂；
-α-1/α-2肾上腺素受体促效血管收缩拟交感神经剂，例如丙己君（propylhexedrine）、苯福林（phenylephrine）、苯丙醇胺（phenylpropanolamine）、麻黄碱、伪麻黄碱、萘唑啉盐酸盐、羟甲唑啉盐酸盐、四氢唑啉盐酸盐、赛洛唑啉盐酸盐（xylometazoline hydrochloride）、曲马唑啉盐酸盐（tramazoline hydrochloride）和乙基去甲肾上腺素盐酸盐；
-抗胆碱能剂，例如蕈毒碱受体（M1、M2和M3）拮抗剂，例如阿托品（atropine）、东莨菪碱（hyoscine）、胃长宁（glycopyrrolate）、异丙托溴铵（ipratropium bromide）、噻托溴铵（tiotropium bromide）、氧托溴铵（oxitropium bromide）、哌仑西平（pirenzepine）和替仑西平（telenzepine）；
-β-肾上腺素受体促效剂（包括β受体亚型1-4），例如异丙肾上腺素（isoprenaline）、沙丁胺醇（salbutamol）、福莫特罗（formoterol）、沙美特罗（salmeterol）、特布他林（terbutaline）、奥西那林（orciprenaline）、比托特罗甲磺酸（bitolterol mesylate）和/或吡布特罗（pirbuterol），例如其手性对映异构体；
-色酮，例如色甘酸钠和/或奈多罗米钠（nedocromil sodium）；
-PDE-4抑制剂，例如罗氟司特（roflumilast）
-糖皮质激素，例如氟尼缩松（flunisolide）、曲安奈德（triamcinoloneacetonide）、二丙酸倍氯米松（beclomethasone dipropionate）、布地奈德（budesonide）、丙酸氟替卡松（fluticasone propionate）、环索奈德（ciclesonide）和/或糠酸莫米他松（mometasone furoate）；
-调节核激素受体的药剂，例如PPAR；
-免疫球蛋白（Ig）或Ig制剂或调节Ig功能的拮抗剂或抗体，例如抗-IgE（例如奥马珠单抗（omalizumab））；
-其他全身或局部应用抗炎症剂，例如沙立度胺（thalidomide）或其衍生物、类视黄醇、蒽三酚（dithranol）和/或卡泊三醇（calcipotriol）；
-氨基水杨酸和磺胺吡啶的组合，例如柳氮磺胺吡啶（sulfasalazine）、美沙拉嗪（mesalazine）、巴柳氮（balsalazide）和奥沙拉嗪（olsalazine）；和免疫调节剂，例如硫嘌呤；和皮质类固醇，例如布地奈德（budesonide）；
-抗菌剂，例如青霉素衍生物、四环素、大环内酯、β-内酰胺、氟喹诺酮、甲硝哒唑（metronidazole）和/或吸入氨基糖苷；和/或抗病毒剂，例如阿昔洛韦（acyclovir）、泛昔洛韦（famciclovir）、伐昔洛韦（valaciclovir）、更昔洛韦（ganciclovir）、西多福韦（cidofovir）；金刚胺（amantadine）、金刚乙胺（rimantadine）；利巴韦林（ribavirin）；扎那米韦（zanamavir）和/或奥塞米韦（oseltamivir）；蛋白酶抑制剂，例如茚地那韦（indinavir）、奈非那韦（nelfinavir）、利托那韦（ritonavir）和/或沙奎那韦（saquinavir）；核苷逆转录酶抑制剂，例如去羟肌苷（didanosine）、拉米夫定（lamivudine）、司他夫定（stavudine）、扎西他滨（zalcitabine）、齐多夫定（zidovudine）；非核苷逆转录酶抑制剂，例如奈韦拉平（nevirapine）或依非韦伦（efavirenz）；或抗体，例如帕利珠单抗（palivizumab；SynagisTM）；
-心血管剂，例如噻嗪或髓袢利尿剂；血管扩张剂例如硝酸甘油、钙通道阻滞剂、α-肾上腺素受体阻滞剂、β-肾上腺素受体阻滞剂或组合α和β-肾上腺素受体阻滞剂、血管紧张素转化酶（ACE）抑制剂、血管紧张素-2受体拮抗剂；醛固酮拮抗剂或保钾利尿剂；脂质降低剂，例如斯达汀（statin）、胆固醇吸收抑制剂和/或贝特（fibrate）；血细胞形态的调节剂，例如己酮可可碱；溶栓和/或抗凝血剂，例如血小板聚集抑制剂；
-CNS剂，例如抗抑郁剂（例如舍曲林（sertraline））、抗帕金森氏病药物（例如丙炔苯丙胺（deprenyl）、左旋多巴、罗匹尼罗（ropinirole）、普拉克索（pramipexole）；MAOB抑制剂，例如selegine和雷沙吉兰（rasagiline）；comp抑制剂，例如答是美（tasmar）；A-2抑制剂、多巴胺再摄取抑制剂、NMDA拮抗剂、烟碱促效剂、多巴胺促效剂和/或抑制剂神经元氧化氮合成酶）和抗阿兹海默病药物，例如多奈哌齐（donepezil）、卡巴拉汀（rivastigmine）、他克林（tacrine）、COX-2抑制剂、丙戊茶碱或美曲磷酯（metrifonate）；
-治疗急性和慢性疼痛的药剂，例如中央或外围作用止痛药，例如类鸦片类似物或衍生物、卡马西平（carbamazepine）、苯妥英（phenytoin）、丙戊酸钠（sodium valproate）、阿米替林（amitryptiline）或其他抗抑郁剂、醋氨酚（paracetamol）或非类固醇抗炎症剂；
-肠胃外或表面应用（包括吸入）局部麻醉剂，例如利诺卡因（lignocaine）或其类似物；
-抗骨质疏松症剂，例如荷尔蒙剂，例如雷洛昔芬（raloxifene）或二膦酸盐，例如阿仑膦酸盐（alendronate）；
-(i)类胰蛋白酶抑制剂；(ii)血小板活化因子（PAF）拮抗剂；(iii)白细胞介素转化酶（ICE）抑制剂；(iv)IMPDH抑制剂；(v)粘附分子抑制剂包括VLA-4拮抗剂；(vi)组织蛋白酶；(vii)激酶抑制剂，例如酪氨酸激酶的抑制剂（例如Btk、Itk、Jak3MAP抑制剂的实例可以包括吉非替尼（Gefitinib）、伊马替尼甲磺酸（Imatinib mesylate））、丝氨酸/苏氨酸激酶（例如MAP激酶的抑制剂，例如p38、JNK、蛋白激酶A、B和C和IKK），或涉及细胞周期调控的激酶（例如周期蛋白依赖性激酶）；(viii)葡萄糖-6磷酸盐脱氢酶抑制剂；(ix)激肽-B1.-和/或B2.-受体拮抗剂；(x)抗痛风剂，例如秋水仙碱；(Xi)黄嘌呤氧化酶抑制剂，例如别嘌醇；(xii)排尿酸剂，例如丙磺舒、苯磺唑酮和/或苯溴马隆（benzbromarone）；(xiii)生长激素促分泌素；(xiv)转化生长因子（TGFβ）；(xv)血小板衍生生长因子（PDGF）；(xvi)成纤维细胞生长因子，例如碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）；(xvii)粒细胞巨噬细胞集落刺激因子（GM-CSF）；(xviii)辣椒素乳膏；(xix)速激肽NK.sub1.和/或NK.sub3.受体拮抗剂，例如NKP-608C、SB-233412（他奈坦（talnetant））和/或D-4418；(xx)弹性蛋白酶抑制剂，例如UT-77和/或ZD-0892；(xxi)TNF-α转化酶抑制剂（TACE）；(xxii)诱导氧化氮合成酶（iNOS）抑制剂或(xxiii)表达于TH2细胞上的化学引诱物受体同源分子（例如CRTH2拮抗剂）；(xxiv)P38的抑制剂(xxv)调控Toll样受体（TLR）功能的药剂(xxvi)调节活性嘌呤能受体的药剂，例如P2X7；(xxvii)转录因子活化的抑制剂，例如NFkB、API和/或STATS或(xxviii)胱冬酶抑制剂，例如Boc-Asp-FMK、z-VAD-FMK、YVAD-FMK、Ac-WEHD-CHO、Ac-DEVD-CHO、Ac-YVADCHO、t-丁氧羰基-IETD-CHO和t-丁氧羰基-AEVD-CHO。
抑制剂可为特异性或可为混合抑制剂，例如靶向以上提到的超过一种分子（例如受体）或分子类别的抑制剂。
结合成员还可在共同给予中或以免疫偶联物形式来结合化学治疗剂或另一种酪氨酸激酶抑制剂使用。所述抗体的片段还可用于通过重组机制或生化连接然后将以上描述的抗体的特异性与其他抗体的特异性相关联来获得的双特异性抗体中，这些其他抗体能够辨识涉及与IL-18相关的活性的其他分子。
对于治疗炎症疾病，例如如上所述的炎症病状，例如类风湿性关节炎、骨关节炎、哮喘、过敏症、过敏性鼻炎、慢性阻塞性肺病（COPD）、牛皮癣、全身性红斑狼疮、全身幼年特发性关节炎、自身免疫疾病、粉刺、脉管炎和斯提耳氏病，本发明的结合成员可与一种或多种药剂组合，例如非类固醇抗炎症剂（以下NSAID），包括非选择性环加氧酶(COX)-1/COX-2抑制剂不论局部或全身应用，例如吡罗昔康（piroxicam）、双氯芬酸（diclofenac）、丙酸，例如萘普生（naproxen）、氟比洛芬（flurbiprofen）、非诺洛芬（fenoprofen）、酮洛芬（ketoprofen）和布洛芬（ibuprofen）、芬那酯，例如甲灭酸（mefenamicacid）、吲哚美辛（indomethacin）、舒林酸（sulindac）、阿扎丙酮（azapropazone）、吡唑啉酮，例如苯基丁氮酮、水杨酸酯，例如阿斯匹林（aspirin）；选择性COX-2抑制剂（例如美洛昔康（meloxicam）、塞来昔布（celecoxib）、罗非昔布（rofecoxib）、伐地考昔（valdecoxib）、罗美昔布（lumiracoxib）、帕瑞昔布（parecoxib）和依托考昔（etoricoxib））；环加氧酶抑制氧化氮供体（CINODs）；糖皮质激素（不论通过表面、口服、肌内、静脉内或关节内途径来给予）；甲氨喋呤（methotrexate）、来氟米特（leflunomide）；羟氯喹、d-青霉胺、金诺芬（auranofin）或其他肠胃外或口服金制剂；镇痛药；双醋瑞因（diacerein）；关节内疗法，例如透明质酸衍生物；和营养补充物，例如葡糖胺。
在此描述的结合成员还可与治疗癌症的现有治疗剂组合使用。组合使用的合适药剂包括：
(i)抗增殖/抗肿瘤药物和其组合，如用于内科肿瘤学，例如格列卫（Gleevec）（伊马替尼甲磺酸（imatinib mesylate）），烷化剂（例如顺铂、卡波铂（carboplatin）、环磷酰胺、氮芥、美法仑（melphalan）、苯丁酸氮芥、白消安（busulphan）和亚硝基脲）；抗代谢药物（例如叶酸拮抗剂、例如氟尿嘧啶如5-氟尿嘧啶和喃氟啶（tegafur）、雷替曲赛（raltitrexed）、甲氨喋呤、胞嘧啶阿糖胞苷（cytosine arabinoside）、羟基脲、吉西他宾（gemcitabine）和紫杉醇（paclitaxel））；抗肿瘤抗生素（例如蒽环类药物如阿霉素（adriamycin）、博来霉素（bleomycin）、多柔比星（doxorubicin）、柔红霉素（daunomycin）、表柔比星（epirubicin）、伊达比星（idarubicin）、丝裂霉素-C、更生霉素（dactinomycin）和光神霉素（mithramycin））；抗有丝分裂剂（例如长春花生物碱如长春新碱（vincristine）、长春碱（vinblastine）、长春地辛（vindesine）和长春瑞宾（vinorelbine）和紫杉化合物如紫杉醇和泰索帝（taxotere））；和拓扑异构酶抑制剂（例如表鬼臼毒素如依托泊苷（etoposide）和替尼泊苷（teniposide）、安吖啶（amsacrine）、拓扑替康（topotecan）和喜树碱（camptothecins））；
(ii)抑制细胞生长剂，例如抗雌激素（例如它莫西芬（tamoxifen）、托瑞米芬（toremifene）、雷洛昔芬（raloxifene）、屈洛昔芬（droloxifene）和碘昔芬（iodoxyfene））、雌激素受体下调剂（例如氟维司群（fulvestrant））、抗雄激素（例如比卡鲁胺（bicalutamide）、氟他胺（flutamide）、尼鲁米特（nilutamide）和环丙孕酮醋酸酯（cyproterone acetate））、LHRH拮抗剂或LHRH激动剂（例如戈舍瑞林（goserelin）、亮丙瑞林（leuprorelin）和布舍瑞林（buserelin））、孕激素（例如甲地孕酮（megestrol acetate））、芳香酶抑制剂（例如如阿那曲唑（anastrozole）、来曲唑（letrozole）、病毒唑（virazole）和依西美坦（exemestane））和5α-还原酶有抑制剂，例如非那雄胺（finasteride）；
(iii)抑制癌细胞侵入的药剂（例如金属蛋白酶抑制剂如马立马司他（marimastat）和尿激酶纤溶酶原活化剂受体功能的抑制剂）；
(iv)生长因子功能的抑制剂，例如这些抑制剂包括生长因子抗体、生长因子受体抗体（例如抗-erbb2抗体曲司珠单抗（trastuzumab）和抗-erbb1抗体西妥昔单抗（cetuximab）[C225]）、法尼基转移酶抑制剂、酪氨酸激酶抑制剂和丝氨酸/苏氨酸激酶抑制剂，例如表皮生长因子家族的抑制剂（例如EGFR家族酪氨酸激酶抑制剂，例如N-(3-氯基-4-氟苯基)-7-甲氧基-6-(3-吗啉代丙氧基)喹唑啉-4-胺（吉非替尼（gefitinib），AZD1839）、N-(3-乙炔基苯基)-6,7-双(2-甲氧基乙氧基)喹唑啉-4-胺（厄洛替尼（erlotinib），OSI-774）和6-丙烯酰胺基-N-(3-氯基-4-氟苯基)-7-(3-吗啉代丙氧基)喹唑啉-4-胺（CI1033)），例如血小板衍生生长因子家族的抑制剂和例如肝细胞生长因子家族的抑制剂；
(v)抗血管生成剂，例如抑制血管内皮生长因子影响的那些药剂（例如抗血管内皮细胞生长因子抗体贝伐单抗（bevacizumab）、化合物，例如国际专利申请WO97/22596，WO97/30035，WO97/32856和WO98/13354披露的那些化合物）和通过其他机制起作用的化合物（例如利诺胺（linomide）、整联蛋白αvβ3功能的抑制剂和血管稳定蛋白）；
(vi)血管破坏剂，例如考布他汀（combretastatin）A4和国际专利申请WO99/02166、WO00/40529、WO00/41669、WO01/92224、WO02/04434以及WO02/08213披露的化合物（其每一个全部结合在此）；
(vii)反义疗法，例如针对以上列出的目标的那些疗法，例如ISIS2503，抗-ras反义；
(viii)基因治疗方法，包括例如替换异常基因的方法，例如异常p53或异常BRCA1或BRCA2、GDEPT（基因定向酶前药物治疗）方法，例如使用胞嘧啶脱氨酶、胸苷激酶或细菌硝基还原酶酶的那些方法和增加对于化学疗法或放射疗法患者耐受性的方法，例如多抗药性基因疗法；以及
(ix)免疫治疗方法，包括例如增加患者肿瘤细胞的免疫原性的离体和体内方法，例如用细胞因子例如白细胞介素2、白细胞介素4或粒细胞巨噬细胞集落刺激因子来转染、降低T-细胞无反应性的方法、使用转染免疫细胞例如细胞因子转染树突状细胞的方法、使用细胞因子转染肿瘤细胞系的方法、以及使用抗独特型抗体的方法。
IL-18的结合成员和一种或多种上述另外医药组分可用于制造药物。药物可单独或组合给予个体，并且相应地可包含呈组合制剂形式或单独制剂形式的结合成员和另外组分。单独制剂可用于促进单独和依序或同时给予，并且允许通过不同途径例如口服和肠胃外给予来给予组分。
所提供的组合物可给予哺乳动物。给予通常以“治疗有效量”，此量足以向患者展示效果。此效果可至少为至少一个症状的改善。所给予的实际量，以及给予速率和时间过程取决于所治疗疾病的性质和严重程度、所治疗的特定哺乳动物、个体患者的临床病状、病症的原因、组合物的输送部位、结合成员的类型、给予方法、给予排程以及开业医生已知的其他因素。治疗处方，例如关于剂量的决定等在普通医生和其他医师的责任范围内并且可取决于症状严重程度和/或所治疗的疾病的进展。抗体的适当剂量在本领域中是熟知的。可使用在此或在医师桌面参考（Physician's Desk Reference）（2005）中视情况针对所给予的药物的类型所指示的具体剂量。本发明的结合成员的治疗有效量或合适剂量可通过在动物模型中比较其体外活性和体内活性来确定。将测试动物中的有效剂量外推至人类的方法是已知的。确切剂量取决于许多因素，包括是否抗体用于诊断、预防或治疗，所治疗的区域的大小和位置，抗体的确切性质（例如完整抗体、片段或双体）和任何可检测标志或连接至抗体的其他分子的性质。对于全身应用，典型抗体剂量在100μg至1g范围内并且对于表面应用，为1μg至1mg。可给予初始较高负载剂量，随后一个或多个较低剂量。典型地，抗体为完整抗体，例如IgG1同种型。这是用于成人患者的单一治疗的剂量，它可针对儿童和婴幼儿来按比例调整，并且也针对其他抗体格式与分子量成比例来调整。在医师判别下，治疗可以每日、每周两次、每周或每月间隔来重复。治疗可每两至四周用于皮下给予并且每四至八周用于静脉内给予。治疗可为周期性的，并且给予之间的周期为约两周或更长、例如约三周或更长、约四周或更长或约每月一次。处理可在手术之前和/或之后给出，且/或可直接给予或应用于外科治疗的解剖部位。
本发明的各种另外方面和实施例鉴于本披露为本领域技术人员显而易知的。
本说明书提到的所有文件，包括数据库参考和登录号、专利、专利申请以及公开物出于所有目的以其全部内容通过引用结合在此。
“和/或”在在此使用时应理解为具体披露两个规定特征或组分中的每一个而有或没有另一个。例如，“A和/或B”应理解为具体披露(i)A、(ii)B、以及(iii)A和B中的每一个，正如同每一个个别地在此阐明一样。
除非上下文另外规定，否则以上阐明的特征的描述和定义不限于本发明的任何特定方面或实施例并且相等地适用于所描述的所有方面和实施例。
本发明的某些方面和实施例现在举例并且参照附图和表来说明。
实例
实例1
抗-18抗体产生和前导选择
1.1表达和纯化重组人IL-18抗原
用于细菌表达的人IL-18（Uniprot条目Q14116-1；SEQ ID NO：169）克隆至pET21a载体（Novagen）中并且表达于大肠杆菌BL21DE3*中。构建体内部（in-house）产生以便包括N-末端GST标记物、组氨酸标记物（8xHis）连同因子Xa切割部位。在可溶性表达之后，蛋白质经历使用标准亲和色谱的纯化，随后因子Xa切割和尺寸排阻纯化以便产生生物活性人IL-18。
对于人IL-18的杆状病毒表达，将构建体设计成具有N-末端Flag标记物和组氨酸标记物。根据制造商说明书，将构建体克隆至pDONR221（英杰公司（Invitrogen），英国佩斯里（Paisley,UK））中并且转移至目的载体pDEST8（英杰公司，英国佩斯里）以便在昆虫细胞中来表达。蛋白质通过标准亲和和尺寸排阻色谱技术来纯化。
IL-18的生物素化是经由游离半胱氨酸上的SH基团来完成，使用EZ-连接生物素-BMCC试剂（赛默飞世尔科学仪器公司（Thermo Fisher Scientific)，纽约罗彻斯特（Rochester）；cat.#21900）。
1.2选择
将克隆至基于丝状噬菌体M13的噬菌粒载体中的雏期人单链Fv（scFv）噬菌体展示文库用于选择（沃恩（Vaughan）等人（1996）自然—生物技术14(3):309-14；劳埃德（Lloyd）等人（2009）蛋白质工程化、设计与选择（Protein Eng Des Sel.）(3):159-68；哈钦斯（Hutchings）等人（2001）抗体工程化中的雏期人抗体库的产生（Generation of Naive Human Antibody Libraries,in Antibody Engineering），R.科特曼（R.Kontermann）&S.迪贝尔（S.Dubel）编，柏林斯普林格实验室手册（Springer Laboratory Manuals,Berlin），第93页；格罗夫斯（Groves）等人（2006）免疫学方法杂志.313(1-2):129-39）。使用重组人IL-18上的一系列选择循环将抗IL-18特异性scFv抗体从噬菌体展示文库分离（医学与生物实验室公司（Medical and BiologicalLaboratories Co.），日本名古屋（Nagoya,Japan）），基本上如以前沃恩等人（（1996）自然—生物技术14(3):309-14）和霍金斯（Hawkins）等人（（1992）分子生物学杂志226,889-896）所述。简要地说，对于第一轮淘洗选择，将杜尔贝科氏磷酸盐缓冲盐水（DPBS，7.4）中的人IL-18由大鼠抗IL-18单克隆抗体，克隆159-12B（医学与生物学实验室，日本；cat.#D045-3）来捕获，该抗体先前在4°C吸附于NuncTMmaxisorp微量滴定板（赛默飞世尔科学仪器公司，罗彻斯特纽约；Cat.#439454）上过夜。孔以PBS清洗然后以PBS-Marvel（3%w/v）阻断1小时。将含有4倍过量捕获抗体，大鼠抗IL-18单克隆抗体的PBS-Marvel（3%w/v）中的纯化噬菌体添加至取消选择板的孔（大鼠抗IL-18单克隆抗体吸附至maxisorp微量滴定板的孔），1小时后，允许结合涂布的抗原（重组人IL-18）持续1小时。未结合的噬菌体通过使用PBS-吐温（0.1%v/v）和PBS的一系列清洗循环来除去。将结合噬菌体颗粒洗脱，感染至大肠杆菌TG1细菌中并且获救用于下一轮选择（Vaughan等人（1996）自然—生物技术14(3):309-314）。通过孵育噬菌体颗粒与100nM生物素化IL-18在溶液中执行第二轮选择，随后如前所述进行第三轮大鼠抗IL-18单克隆抗体捕获选择。
1.3未纯化的scFv对IL-18结合至IL-18受体α和β链的抑制
来自周质制剂的未纯化scFv在均质时间分辨荧光（HTRFTM,Cis BioInternational）受体-配体结合测定中使用EnVision板读取器（珀金埃尔默，马萨诸塞州波士顿）来筛选。人IL-18Rα链（[IL-18Rα]；安迪生物科技公司（R&D Systems），明尼苏达州明尼阿波利斯（Minneapolis,MN）；cat.#816-LR）的铕穴状化合物标志化遵循制造商说明书通过使用pH8的PBS中的三联吡啶-Eu3+-穴状化合物-NHS（CIS bio International,Bagnols-sur-Ceze,法国；cat.#65EUSABA）来实现。人IL-18Rβ链（[IL-18Rβ]；安迪生物科技公司，明尼苏达州明尼阿波利斯；cat.#118-AP）使用pH8的PBS中的EZ连接磺基-NHS-LC-生物素（赛默飞世尔科学仪器公司，罗彻斯特纽约；cat.#21335）经由游离胺来生物素化。在HTRFTM测定中，未纯化scFv样本竞争人重组IL-18与其受体、铕穴状化合物标志化的人IL-18Rα和生物素化人IL-18Rβ的结合相互作用。选择输出被筛选为含有scFv的未纯化细菌周质提取物，这些提取物在50mM MOPS缓冲液pH7.4、0.5mM EDTA和0.5M山梨糖醇中制备。将五微升未纯化scFv样本添加至
Figure BDA00003372980800681
384孔测定板（康宁公司（Corning）；马萨诸塞州洛厄尔（Lowell,MA）；cat.#77776-818)。在此之后添加5μl6nM重组人IL-18（内部、大肠杆菌衍生），然后添加含有10nM生物素化IL-18Rβ、2.5nM铕穴状化合物标志化的IL-18Rα和30nM链霉抗生物素蛋白Xlent!（CisBio International,Bagnols-sur-Ceze,法国；cat.#611SAXLB）的10μl混合物。非特异性结合使用5nM最终浓度的对照小鼠单克隆抗人IL-18抗体（医学与生物实验室公司，日本名古屋；克隆125-2H）代替周质提取物来确定。所有稀释在含有0.4M KF和0.1%BSA（测定缓冲液）的PBS中执行。将测定板在室温孵育4小时，然后读取时间分辨荧光，方法是使用EnVision板读取器（珀金埃尔默，马萨诸塞州沃尔瑟姆（Waltham））在320nm激发铕分子并且在620nm测量铕分子的发射并且测量XL665分子的665nm发射波长。
数据通过计算每个样本的%Delta F值来分析。Delta F根据方程1来确定。
方程1：
Figure BDA00003372980800682
%Delta F值随后用于计算%特异性结合，如方程2描述。
方程2：
Figure BDA00003372980800683
1.4纯化的scFv对IL-18结合至IL-18受体α和β链的抑制
以未纯化周质提取物形式展示对于IL-18受体α和受体β结合相互作用的显著抑制效应的ScFv提取物经受DNA测序（沃恩等人（1996）自然—生物技术14:309-314；奥斯本（Osbourn）等人（1996）免疫技术（Immunotechnology）.2,181-196)。具有独特序列的scFv表达于大肠杆菌中并且通过亲和色谱来纯化（如班尼斯特（Bannister）等人（2006）生物技术与生物工程化（Biotechnology and bioengineering），94.931-937描述）。确定avscFv的效力，方法是在部分1.3中描述的HTRFTM测定中测试纯化scFv的稀释系列，用纯化scFv来替换未纯化scFv周质制剂。
数据通过如部分1.3中描述计算%Delta F值和%特异性结合来分析。IC50值使用GraphPad Prism软件通过使用四参数逻辑斯谛方程（方程3）的曲线拟合来确定。
方程3：
Y=底部+(顶部-底部)/(1+10exp((LogEC50-X)*HillSlope))
X为浓度的对数。
Y为特异性结合
如图1说明，抗体1的纯化scFv制剂以12nM（n=1）的IC50值来抑制IL-18受体复合物的形成。
1.5将抗体1scFv重新格式化为IgG2
将抗体1scFv重新格式化为IgG2，方法是将可变重链（VH）和可变轻链（VL）域亚克隆至分别表达完整人抗体重链和轻链的载体中。将可变重链克隆至含有人重链恒定域和调控元件的哺乳动物表达载体（pEU9.2）中以便在哺乳动物细胞中表达完整IgG2重链。类似地，将可变轻链域克隆至用于表达人κ轻链恒定域和调控元件的哺乳动物表达载体（pEU3.4）中以便在哺乳动物细胞中表达完整IgG轻链。用于表达重链和轻链的载体最初描述于Persic等人（1997）基因（Gene）187:9-18中。为了获得作为IgG2的抗体1，重链和轻链IgG表达载体瞬时转染至HEK293-EBNA哺乳动物细胞中，其中抗体表达并且分泌至培养基中。收获的培养基通过在纯化之前离心来净化。IgG使用蛋白质A（通用电气医疗集团（GE Healthcare））来纯化。将培养物上清液装载至在50mM Tris、0.15M NaCl pH8缓冲液中预平衡的1ml管柱上。使用0.1M柠檬酸盐pH3将IgG从管柱直接洗脱至1M Tris pH10中。使用NAP-10缓冲液交换管柱（通用电气医疗集团）使洗脱液经历缓冲液交换至1×DPBS中。将纯化的IgG进行0.2微米无菌过滤、分析内毒素、通过SDS PAGE来表征并且通过280nm的吸光率来确定浓度。
1.6抗体1IgG2对IL-18结合至IL-18受体α和β的抑制
如上所述，将防止形成IL-18、IL-18Rα和IL-18Rβ复合物的纯化的抗体1scFv转换为重组IgG2。将纯化抗体1IgG2连续稀释并且在部分1.3中描述的HTRFTMIL-18配体-受体测定中测试。抗体1的IgG2制剂以2.9nM的IC50值（几何平均值（Geomean），n=2；图2A）抑制人IL-18/人IL-18受体复合物的形成。
在一些实验中，重组人IL-18以1.5nM最终浓度的重组恒河猴IL-18（安迪生物科技公司，明尼苏达州明尼阿波利斯；Cat.#2548-RM；登录#AAK13416）来取代。恒河猴IL-18的氨基酸序列呈现与食蟹猴IL-18的100%同源性。标志化的人IL-18受体、检测试剂以及测定参数与部分1.3中描述的相同。抗体1IgG2的制剂以5.4nM的IC50值（几何平均值，n=2；图2B）抑制重组恒河猴IL-18/人IL-18受体复合物的形成。
1.7抗体1IgG2对用IL-18刺激的KG-1细胞的IFNγ产生的抑制
抗体1IgG2中和重组人IL-18的生物活性的效力使用KG-1细胞测定来确立。KG-1细胞（人髓性白血病细胞系）已被证明应答于外源性重组人IL-18来表达IL-18Rα和IL-18Rβ链并且产生干扰素-γ（IFNγ）（小西（Konishi）等人（1997）免疫学方法杂志209(2):187-191）。培养基（IMDM[英杰公司（Invitrogen Corp.），英国佩斯里；Cat.#21980-032]，含有5%v/v热灭活FBS、100U/ml青霉素和100μg/ml链霉素[英杰公司，英国佩斯里；Cat.#15140-122]）中的KG-1细胞（ECACC，英国；cat.#86111306）以105个细胞/100微升/孔涂覆于
Figure BDA00003372980800701
孔平底组织培养物处理板（康宁公司，马萨诸塞州洛厄尔；Cat.#3596）。展示为与IL-18协同诱导IFNγ产生的重组肿瘤坏死因子α（TNFα）（安迪生物科技公司，明尼苏达州明尼阿波利斯；Cat.#210-TA）以1.1nM的最终浓度添加。为了确定抗体1IgG2的效力，通过在U形底96孔聚丙烯板中（葛莱娜第一生化有限公司（Greiner Bio-One），奥地利克雷姆斯明斯特（Kremsmunster,Austria）；Cat.#650201)连续稀释在培养基中的抗体（细胞测定中的最终浓度在700nM与0.1nM之间）来制备测试溶液。将重组人IL-18（内部、大肠杆菌衍生）添加至每个孔以便给出3ng/ml至8ng/ml的细胞测定中的最终浓度。浓度将基于在最终浓度和在1.1nM TNFα的存在下给出最大IFNγ分泌方面的近似50%增加的剂量进行选择。抗体1/IL-18混合物在室温孵育30-45分钟，然后将100μl样本转移至如上所述制备的KG-1细胞。在加湿气氛中在37°C/5%CO2下孵育细胞22-24小时之后，从每个孔收集150μl上清液并且IFNγ的浓度如以下指示来确定。
简单地说，NuncTM黑色96-孔Maxisorp板（赛默飞世尔科学仪器公司，罗彻斯特纽约；Cat.#437111）以4μg/ml捕获抗-IFNγ抗体（BD BiosciencesPharmingen，新泽西州富兰克林湖；Cat.#551221;clone NIB42）涂布过夜。然后，将板用PBS清洗并且非特异性结合通过在每个孔中用200μl含有3%奶粉（Marvel）的PBS阻断来防止。将板在室温孵育1小时并且以PBS清洗3次。然后，孔以100μl的1/2稀释的实验样本或用于建立标准曲线（浓度范围为40000-39pg/mL）的连续稀释的重组人IFNγ（安迪生物科技公司，明尼苏达州明尼阿波利斯；Cat.#285-IF）来填充。这些样本在室温孵育1小时并且然后将板在含有0.01%吐温-20的PBS中清洗3次。为了检测IFNγ结合至板，将100μl生物素化抗-IFNγ抗体（BD Biosciences Pharmingen，新泽西州富兰克林湖；Cat.#554550；克隆4S.B3）以1μg/ml的最终浓度添加并且在室温孵育1小时。在含有0.01%吐温-20的PBS中将板清洗3次之后，添加在DELFIA测定缓冲液（珀金埃尔默（PerkinElmer），马萨诸塞州波士顿（Boston MA）；Cat.#4002-0010）中1/1000稀释的100μl
Figure BDA00003372980800711
Eu-标志化的链霉抗生物素蛋白（珀金埃尔默，马萨诸塞州波士顿；Cat.#1244-360）。板在室温进一步孵育1小时，然后清洗7次，使用DELFIA洗涤液（珀金埃尔默，马萨诸塞州波士顿；Cat.#1244-114)。将一百微升DELFIA增强溶液（珀金埃尔默，马萨诸塞州波士顿；Cat.#4001-0010）添加至每个孔并且将板在黑暗中在室温孵育10分钟。然后，每个孔中的应答使用测量解离增强时间分辨荧光的EnVision板读取器（珀金埃尔默，马萨诸塞州波士顿）来确定。
实验数据使用不存在抗体时对于用IL-18刺激的KG-1细胞而言获得的铕计数来标准化并且确定抑制50%IFNγ释放的抗体的浓度（IC50）。IC50值使用GraphPad Prism软件通过使用四参数逻辑斯谛方程（部分1.4中的方程3）的曲线拟合来计算。
在以纯化IgG2形式测试时的抗体1的IC50为258nM（几何平均值,n=4,95%CI:121-550nM）。
1.8使用表面等离子体共振来确定抗体1IgG2与IL-18的结合亲和力
BIAcore2000（通用电气医疗集团）生物传感器仪器用于评估抗体1与重组表达的人IL-18之间相互作用的动力学参数。这些实验基本上如卡尔松（Karlsson）等人（1991）免疫学方法杂志145(1-2):229-240描述来执行。
生物传感器使用表面等离子体共振（SPR）的光学效应来研究在共价连接至生物传感器芯片的葡聚糖层的配体分子上流过的分析物分子的相互作用所产生的表面浓度的变化。典型地，定义浓度的分析物质在连接配体上通过并且任何结合被检测为局部SPR信号的增加（缔合相）。在这之后为缓冲液流动期，在此期间分析物质与表面固定配体的解离可被观察为信号的减少（解离相）。然后，可将剩余分析物从芯片结合配体上剥离并且该程序在多种不同分析物浓度下重复。实验被设计成使得连接配体的绝对结合能力和动力学概况在整个实验期间都不显著改变和可使用在整个实验中采用的一系列对照来监测。含有EDTA的专利性HEPES缓冲盐水（HBS-EP+；通用电气医疗集团）通常用作分析物样本的稀释缓冲液并且在解离相期间作为流动缓冲液。实验数据以“共振单位”（RU）形式来记录，这些共振单位是随着时间的推移直接与SPR信号对应的任意单位。这些RU与芯片表面上的折射率的变化直接成正比例，该折射率进而为所结合分析物的质量的近似测量。然后，专利性BIAevaluation软体包可用于处理数据并且将结合模型拟合至数据集。返回的缔合（ka；M-1s-1）和解离（kd；s-1）速率常数允许计算解离（KD；M）亲和力常数。
抗体1IgG2与IL-18分析物之间的结合亲和力使用测定来估计，其中抗体通过胺键共价连接至专利性CM3芯片表面至近似600RU的最终表面密度。芯片表面在循环之间再生，方法是10mM甘氨酸pH2的成对15s注射以便除去结合至抗体的IL-18。再生不产生抗体结合活性的显著损失。
一系列稀释的重组人IL-18（0.4–200nM）依序在抗体1IgG2上通过足够量的时间以便观察可置信地拟合至1:1结合模型的传感图。将空白参考流动细胞数据从每个IgG数据集减去并且零浓度缓冲液空白从主要数据集双重参考减去以便减少任何缓冲液假象或（最小化）非特异性结合影响。然后使用BIAevaluation软件将1:1朗缪尔模型同时拟合至来自每个分析物滴定的数据。
数据的有效性使用计算的Chi2和T值（参数值/偏离）来评估，其最小接受值分别限制为<2和>100并且使用剩余值针对拟合的总体成功进行评估（<2RU）。
使用重组人IL-18作为分析物，抗体1IgG2缔合速率（Ka）、解离速率（Kd）和亲合常数（KD）分别为7.35×105M-1s-1、7.32×10-3s-1和9.96nM。
1.9使用表面等离子体共振生物传感器来分析抗体1IgG2的结合特异性.
BIAcore2000生物传感器仪器（通用电气医疗集团）用于评估具有一系列重组表达IL-18蛋白质的抗体1IgG2与IL-18生物学相关蛋白质之间的相互作用的特异性。
抗体1与分析物蛋白之间的结合相互作用使用测定来分析，其中抗体1通过胺键共价连接至CM3芯片表面至近似600RU的最终表面密度。将稀释于运行缓冲液中的重组人IL-18、恒河猴IL-18（安迪生物科技公司，明尼苏达州明尼阿波利斯；Cat.#2548-RM）、大鼠IL-18（安迪生物科技公司，明尼苏达州明尼阿波利斯；Cat.#521-RL-025）、人IL-1β（安迪生物科技公司，明尼苏达州明尼阿波利斯；Cat.#201-LB）或人IL-1F7/FIL1ζ（安迪生物科技公司，明尼苏达州明尼阿波利斯；Cat.#1975-IL-025）两百纳摩尔溶液注射于芯片表面上。然后，芯片表面在循环之间再生，方法是10mM甘氨酸pH2的成对注射以便除去结合至抗体的IL-18。
在呈递至抗体1的蛋白质中，观察到IgG只选择性结合至人和恒河猴IL-18。未观察到与重组大鼠IL-18、人IL-1β以及人IL-1F7/FIL1ζ的显著结合。
1.10抗体1在IL-18结合蛋白表位竞争测定中的表征
为了确定是否抗体1可抑制人IL-18结合蛋白（IL-18BP）与人IL-18的结合，开发表位竞争测定。制备呈纯化scFv或IgG2形式的抗体1的稀释系列，对于scFv，其范围为从4893nM至41.4pM并且对于IgG2，为987nM至16.8pM。将十微升的每个稀释液转移至
Figure BDA00003372980800731
384孔测定板（康宁公司，马萨诸塞州洛厄尔；cat.#3676)。单独地，1.73nM穴状化合物标志化的抗-FLAG抗体（Cis Bio International,Bagols-sur-Ceze,法国；cat.#61FG2KLB）与含有FLAG和His标记物的杆状病毒产生的3.2nM IL-18（内部）组合。将五微升此混合物添加至具有抗体1scFv或IgG2的测定板。人IL-18BPa-Fc（安迪生物科技公司，明尼苏达州明尼阿波利斯；cat.#119BP）使用pH8的PBS中的EZ连接磺基-NHS-LC-生物素（赛默飞世尔科学仪器公司，罗彻斯特纽约；Cat.#21335）经由游离胺来生物素化。将0.8nM的生物素化IL-18BPa-Fc与20nM链霉亲和素Xlent!（Cis Bio International.cat.#611SAXLB）组合并且将5μl此溶液添加至测定板。
使用25nM最终浓度的人IL-18（内部产生）来定义非特异性结合。所有稀释在含有0.4M KF和0.1%BSA（测定缓冲液）的磷酸盐缓冲盐水（PBS）中执行。
测定板在室温孵育4小时然后在4°C孵育过夜，然后使用EnVision板读取器（珀金埃尔默，马萨诸塞州波士顿）在620nm和665nm发射波长读取时间分辨荧光。结果使用部分1.3和1.4中描述的方程来计算。
纯化scFv抗体1制剂在2446nM产生86%的平均抑制。抗体1的IgG2制剂在此测定中在493nM产生68%的平均抑制（图3）。
实例2
抗体优化
2.1通过靶向诱变来优化抗体1
抗体1使用靶向诱变方法和基于亲和力的噬菌体展示选择来针对与人和恒河猴IL-18的改进亲和力进行优化。源自抗体1的大scFv-噬菌体文库可使用如克拉克森（Clackson）和洛曼（Lowman）（2004）实用方法（A PracticalApproach），2004.牛津大学出版社描述的标准分子生物学技术通过可变重链（VH）和轻链（VL）互补决定区3（CDR3）的寡核苷酸的定向诱变来建立。
文库经受基于亲和力的噬菌体展示选择以便选择具有针对重组人和恒河猴形式的IL-18的更高亲和力的变体。选择基本上如先前描述（汤普逊（Thompson）（1996）分子生物学杂志256：77-88）来执行。简要地说，scFv噬菌体颗粒与溶液中的重组的生物素化的重组人IL-18（bio-huIL-18，内部，大肠杆菌衍生）一起孵育。然后，遵循制造商建议将结合至抗原的ScFv-噬菌体捕获于链霉抗生物素蛋白涂布的顺磁性珠粒（英杰公司，英国佩斯里；
Figure BDA00003372980800741
M280）。然后，所选择的scFv-噬菌体颗粒如先前描述（奥斯本（Osbourn）等人（1996）免疫技术，2(3)；181-96）获救，并且该选择过程在递减浓度的生物素化人IL-18存在下重复（在3轮中25nM至500pM）。此过程导致在生化表位竞争测定（部分2.3）和KG-1细胞测定（表1）中具有改进效力的抗体2、抗体3、抗体4和抗体5的分离。
在完成三轮基于亲和力的选择之后，然后将VH和VL随机文库重组以便形成单一文库，其中克隆包含随机配对的个别地随机化的VH和VL序列。然后在递减浓度的生物素化人IL-18的存在下（在另外的3轮中500pM至20pM），选择如前所述继续，导致改进的克隆抗体6和抗体7的分离。
2.2通过随机诱变来优化前导抗体
抗体6和抗体7使用随机诱变方法来进一步优化以便鉴别scFv可变域中的可改进与重组人和恒河猴IL-18的结合的关键残基。大scFv-核糖体展示文库通过将随机突变引入抗体6和7的整个可变区来产生。此实现方法是两轮诱变，这两轮诱变遵循制造商说明书，使用A DiversifyTMPCR随机诱变试剂盒（BDbiosciences，新泽西州富兰克林湖；Cat.#630703），以便每轮诱变在核酸序列中平均并入每千碱基8.1个突变。这些选择基本上如先前描述（黑尼斯等人（2000）酶学方法328：404-430）来执行。简要地说，从靶向性CDR3随机策略鉴别的2个前导克隆（抗体6和抗体7）的随机诱变文库转录成mRNA并且随后池化以便产生一个文库。使用停滞翻译过程，形成mRNA-核糖体-scFv复合物（黑尼斯J（Hanes J）和普吕克通A.（Plückthun A.）（1997）美国国家科学院院刊1997年5月13日；94(10):4937-42）。然后，这些复合物经受在递减浓度的生物素化人IL-18或生物素化恒河猴IL-18存在下孵育的三轮选择（在3轮中1nM至30pM）以便选择具有对于人和恒河猴形式的IL-18的更高亲和力的变体。然后，结合至抗原的那些复合物捕获于链霉抗生物素蛋白涂布的顺磁性珠粒（DynabeadsTM）。将非特异性核糖体复合物清洗掉，并且mRNA从结合核糖体复合物上分离，逆转录为cDNA然后通过PCR来扩增。此DNA用于下一轮选择和/或克隆用于筛选。通过核糖体展示分离的ScFv通过核糖体展示构建体的Nco1/Not1限制性内切酶消化（新英格兰生物实验室（New EnglandBiolabs），马萨诸塞州伊普斯威奇（Ipswich MA））来克隆至噬菌粒载体pCANTAB6中，随后使用T4DNA连接酶（新英格兰生物实验室，马萨诸塞州伊普斯威奇）连接至Nco1/Not1消化的pCANTAB6中（麦卡弗蒂等人（1994）生物化学与生物技术应用（Appl.Biochem.Biotech.）47:157-171）。
此优化策略导致改进的克隆抗体9和抗体10的分离。
另外的点突变通过定位诱变来引入抗体7、抗体9和抗体10中，产生抗体8GL、抗体11、抗体11GL和抗体12GL。这些点突变在HCDR1（Ser31Ala）和HCDR2（Ile51Leu，Ser65Gly）中。
2.3使用表位竞争测定来鉴别改进的克隆
随机选自部分2.1中描述的靶向诱变方法的选择循环2和3的八百八十个scFv表达于细菌中并且未纯化的scFv以表位竞争HTRFTM测定格式来筛选。在此测定中，未纯化的scFv与抗体1IgG2竞争结合至铕穴状化合物标志化的人IL-18（内部）。重组人IL-18的铕穴状化合物标志化使用中性pH的PBS中的三联吡啶-Eu3+-穴状化合物-4-羧基-4’-(马来酰亚胺丙酰胺基-2-氨基乙基-氨基羰基)（Cis bio International,Bagnols-sur-Ceze，法国；cat.#65EUMABA）来实现。选择输出以含有未纯化scFv的未稀释或稀释周质提取物来筛选，该scFv在50mM MOPS缓冲液pH7.4，0.5mM EDTA和0.5M蔗糖中制备并且在含有0.4M KF和0.1%BSA（测定缓冲液）的磷酸盐缓冲盐水（PBS）中稀释。二十四纳摩尔的抗体1IgG2和30nM的抗-人Fc XL665（Cis Bio International,Bagnols-sur-Ceze，法国；cat.#61HFCXLA）一起在测定缓冲液中稀释。将十微升的此溶液转移至
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384孔测定板（康宁公司，马萨诸塞州洛厄尔；cat.#3676)。将五微升未纯化的scFv添加至测定板，随后添加稀释至1.2nM的铕穴状化合物标志化的重组人IL-18。非特异性结合使用20nM最终浓度的单克隆小鼠抗-人IL-18克隆125-2H（安迪生物科技公司，明尼苏达州明尼阿波利斯；）来确定。测定板在室温孵育3小时，然后如部分1.3描述使用EnVision板读取器（珀金埃尔默，马萨诸塞州波士顿）在620nm和665nm发射波长读取时间分辨荧光。数据使用部分1.3描述的方程以特异性结合%来计算。展示防止抗体1IgG2结合至IL-18的显著抑制性质的ScFv经受DNA测序并且具有独特序列的scFv制备为纯化制剂。
确定纯化scFv抗体的效力，方法是在如上所述的抗体1IgG2表位竞争测定中使用相同条件来测试稀释系列的纯化scFv制剂。抗体2、抗体3、抗体4和抗体5的纯化scFv制剂分别以0.5、0.6、0.6和0.17nM（n=1）的IC50值来抑制抗体1IgG2与铕穴状化合物标志化的IL-18之间的相互作用。
后期重组靶向诱变选择的筛选使用与如上所述相同的表位竞争测定，除铕穴状化合物标志化的IL-18浓度减少至0.2nM最终测定浓度以外。经过改进的克隆使用此测定来鉴别并且这些克隆进一步在如部分2.4描述的KG-1功能性细胞测定中进行直接分析。以此方法，抗体6和抗体7被鉴别为改进的scFv。为了进一步优化这些前导抗体，遵循如部分2.2描述的随机诱变方法。
来自随机诱变选择的ScFv表达于细菌中并且未纯化的scFv以HTRFTM表位竞争测定格式来筛选。此测定测试未纯化的scFv抑制铕穴状化合物标志化的IL-18结合至种系化（GL）抗体6IgG2（部分2.7描述的IgG的种系化）的能力。使用如上所述的相同格式，除了抗体1IgG2置换为12nM最终浓度的抗体6GLIgG2并且使用0.2nM最终浓度的铕穴状化合物标志化的重组人IL-18。为了定义此测定中的非特异性结合，抗体6GL IgG2从对照孔中省去。
将从随机诱变选择的筛选中鉴别的选中物排序并且将最佳scFv测序并且纯化。为了确定scFv的效力，将稀释系列的纯化的scFv在如上所述的抗体6GLIgG2表位竞争测定中测试。抗体9和抗体10的纯化制剂分别以5.2和5.7nM（n=1）的IC50值（图4）抑制抗体6GL IgG2与铕穴状化合物标志化的重组人IL-18之间的相互作用。
2.4优化的克隆（scFv）对用IL-18刺激的KG-1细胞的IFNγ产生的抑制
由靶向诱变和随机诱变产生的纯化优化scFv抗体的效力也在使用人和恒河猴IL-18作为促效剂的IFNγ释放KG-1细胞测定中来确定。测定如部分1.7描述来建立。在一些实验中，人IL-18置换为重组恒河猴IL-18（安迪生物科技公司，明尼苏达州明尼阿波利斯；cat.#2548-RM/CF），它以4ng/ml的最终浓度来使用。scFv以100nM与0.03nM之间的最终浓度范围来测试。纯化的scFv抗体的示例性效力提供于表1中。抗体7、抗体9和抗体10scFv的代表性数据展示于图5中。
2.5scFv重新格式化为IgG2和IgG1TM
将scFv重新格式化为IgG2，方法是将可变重链（VH）和可变轻链（VL）域亚克隆至分别表达完整人抗体重链和轻链的载体中。将可变重链克隆至含有人重链恒定域和调控元件的哺乳动物表达载体（pEU9.2）中以便在哺乳动物细胞中表达完整IgG2重链。类似地，将可变轻链域克隆至用于表达人κ轻链恒定域和调控元件的哺乳动物表达载体（载体pEU3.4）中以便在哺乳动物细胞中表达完整IgG轻链。为了获得作为IgG2的抗体，重链和轻链IgG表达载体瞬时转染至HEK293-EBNA哺乳动物细胞中，其中抗体表达并且分泌至培养基中。收获的培养基通过在纯化之前离心来净化。IgG使用蛋白质A（通用电气医疗集团）来纯化。将培养物上清液装载至在50mM Tris、0.15M NaCl pH8缓冲液中预平衡的1ml管柱上。使用0.1M柠檬酸盐pH3将IgG从管柱直接洗脱至1M Tris pH10中。使用NAP-10缓冲液交换管柱（通用电气医疗集团）使洗脱液经历缓冲液交换至1×DPBS中。将纯化的IgG进行0.2微米无菌过滤、分析内毒素、通过SDS PAGE来表征并且通过280nm的吸光率来确定浓度。
抗体12GL也转换为在恒定域内含有三个单一氨基酸取代（TM）的人IgG1同种型（[IgG1TM]；Oganesyan等人（2008）Acta Crystallogr D BiolCrystallogr.64(Pt6):700-4）。简单地说，IgG轻链基因由融合至抗体可变域序列和人κKm3恒定域序列的分泌前导序列制得。IgG重链基因由融合至连同具有TM修饰的人γ1（f）恒定域序列的抗体可变域的分泌前导序列制得。将编码这些轻链和重链基因的DNA序列优化（参见SEQ ID NO：170和171)（Geneart AG，德国雷根斯堡（Regensburg，Germany））以便在中国仓鼠卵巢（CHO）细胞中高水平表达，然后分别DNA克隆至表达组件载体，pEE12.4和pEE6.4（隆察生物制品公司（Lonza Biologics），英国斯劳（Slough,UK））中。然后将包括其侧接转录调控序列的抗体重链基因插入抗体轻链质粒中以便产生双重抗体基因，串联载体（pCLD-1128）（参见图15）。将pCLD-1128质粒线性化并且转染至CHO宿主细胞系CHOK1SV（隆察生物制品公司）中，该细胞系已经被预调适成在化学成分已定义的培养基（CD-CHO；英杰公司，英国佩斯里）中的悬浮培养物中生长。含有整合至CHO基因组中的pCLD-1128质粒拷贝的转染子通过在含有甲硫氨酸砜亚胺的无谷氨酰胺CD-CHO培养基中生长来进行选择。
选择表达高产率抗体的池并且扩增以便接种分批补料生产培养物。在接种后近似14天，培养收获物通过离心和/或过滤来净化以便除去细胞和细胞碎片。然后将抗体从所得培养上清液中回收，方法是蛋白A亲和色谱，随后PD10缓冲液交换至合适缓冲液中。
2.6优化的克隆（IgG）对用IL-18刺激的KG-1细胞的IFNγ产生的抑制
KG-1细胞测定中的最有效的scFv克隆转换为如上（部分2.5）所述的IgG，并且在此细胞测定中以20nM与0.002nM之间的最终浓度范围来重新测试。纯化的IgG抗体的示例性效力提供于表2中。
2.7种系化
抗体1和亲和力优化的抗IL-18抗体的VH域和VL域的氨基酸序列与VBASE数据库中的已知人种系序列比对（Tomlinson(1997)Journal ofMolecular biology224:487-499），并且最接近的种系通过序列相似性来鉴别。对于优化的抗体谱系的VH域，此为Vh4_DP-66_(4-61)。对于VL域，它为Vκ1_L12。除了保持未改变的维尼尔残基（Foote&Winter(1992)J Mol Biol.224(2):487-99）以外，种系化过程包括将VH域和VL域中的框架残基回复至最接近的种系序列以便完全匹配人抗体。所产生的所有抗体的VH域和VL域序列展示于表12和13。这些氨基酸残基的种系化使用标准定位诱变技术以合适诱变引物来执行。然后将通过随机诱变策略引入CDR的变化引入完全种系化的骨架中。然后，IgG2或IgG1TM格式的种系化抗体在KG-1细胞测定中重新评估以便证实效力没有显著减少。种系化（GL）抗体的示例性效力提供于表3中。抗体8GL、抗体11GL和抗体12GL IgG的代表性数据展示于图6。
2.8种系化优化的克隆（IgG）对用LPS和IL-12刺激的人PBMC的IFNγ产生的抑制
对种系化IgG中和内源性产生的IL-18的能力以及其抑制重组人和恒河猴IL-18的效力进行测试。将外周血单核细胞（PBMC）从人血沉棕黄层血液或食蟹猴血液中纯化并且以LPS（西格玛-奥德里奇（Sigma-Aldrich），密苏里州圣路易斯（St Louis MO）；cat.#L-6143）和重组人IL-12（安迪生物科技公司，明尼苏达州明尼阿波利斯；cat.#219-IL）来刺激以便经由IL-18依赖性机制触发IFNγ释放。优化的种系化IgG拮抗内源性IL-18并且从而阻断IFNγ产生的能力在此测定中加以评估。简单地说，PBMC通过在培养基中以300g离心10分钟来进行清洗（RPMI-1640[英杰公司，英国佩斯里；cat.#61870-010]，该培养基含有10%v/v热灭活FBS[SAFC Biosciences；cat.#12076C]、100U/ml青霉素以及100μg/ml链霉素[英杰公司，英国佩斯里；cat.#15140-122])。将PBMC重新悬浮于培养基中并且以4×105细胞/100微升/孔（对于评估抗体8GL IgG2、抗体11GL IgG2和抗体12GL IgG2）或以2×105细胞/100微升/孔（对于抗体12GL IgG1TM）涂覆于
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96-孔平底组织培养物处理板（康宁公司，马萨诸塞州洛厄尔；Cat.#3596）。为了确定优化的种系化IgG的效力，通过在U形底96孔聚丙烯板中（葛莱娜第一生化有限公司，奥地利克雷姆斯明斯特；Cat.#650201)连续稀释在培养基中的IgG（细胞测定中的最终浓度在2.5pM与16.7nM之间）来制备测试溶液。将五十微升的这些溶液转移至含有PBMC的板的孔。为了触发内源性IL-18的产生，然后刺激细胞，方法是添加LPS（西格玛-奥德里奇，密苏里州圣路易斯；cat.#L-6143）和重组人IL-12（安迪生物科技公司，明尼苏达州明尼阿波利斯；cat.#219-IL）的50μl混合物，均为1ng/ml最终浓度。在加湿气氛中在37°C/5%CO2下孵育细胞24小时之后，从每个孔收集150μl上清液并且IFNγ的浓度如部分1.7中指示来确定。
实验数据使用对于不存在抗体时用LPS和IL-12刺激的PBMC而言获得的铕计数来标准化并且确定抑制50%IFNγ释放的抗体的浓度（IC50）。IC50值使用GraphPad Prism软件通过使用四参数逻辑斯谛方程（部分1.4中的方程3）的曲线拟合来计算。
此测定中的种系化（GL）抗体的示例性效力提供于表4中。基于人和食蟹猴PBMC的测定中的抗体12GL IgG1TM的代表性数据展示于图7。
2.9抗体12GL IgG1TM对IL-18诱导的原代嗜中性粒细胞上的CD11b上调的抑制
CD11b已被证明在活化期间在嗜中性粒细胞上得到上调。这些细胞在许多炎症性病症中发挥关键作用并且抗体12GL IgG1TM抑制体外IL-18诱导的CD11b上调的能力通过流式细胞术来确定。
新鲜的外周血从健康人志愿者获得并且相等体积的2.4%葡聚糖（通用电气医疗集团，Cat.#17-0320-01）添加至血液并且通过倒置来完全混合。然后允许红细胞沉淀1小时。然后制备不连续Percoll梯度（通用电气医疗集团，Cat.#17-0891-01），方法是以10x PBS（英杰公司，英国佩斯里；Cat.#14200059）来9:1稀释Percoll以便制得100%储备溶液。此储备溶液进一步以1×PBS（英杰公司，英国佩斯里；Cat.#14190）稀释以便形成72%溶液和67%溶液。然后将三毫升72%溶液添加至15ml
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试管（BDBiosciences，新泽西州富兰克林湖；Cat.#352096）并且将3ml的62%溶液层积至72%溶液上。在红细胞耗尽之后，红细胞耗尽的细胞悬浮液层积于15ml试管中的62%溶液顶部。这些试管在解除制动的情况下以1138×g离心20分钟。粒细胞层从72%和62%Percoll的界面移除至含有PBS的新鲜50ml试管（BD Biosciences，新泽西州富兰克林湖；Cat.#352070）中，然后以300×g离心10分钟。将上清液丢弃并且粒细胞重新悬浮于50ml PBS中并且使用台盼蓝排除染料来计数。然后将粒细胞以200×g来团粒化5分钟并且以1-2×106/ml重新悬浮于刺激缓冲液（RPMI-1640[英杰公司，英国佩斯里；Cat.#61870]和2%BSA[西格玛-奥德里奇，密苏里州圣路易斯；Cat.#A9576]）中。将一百微升细胞悬浮液分配至圆底96孔聚苯乙烯组织培养物处理板的孔中（科斯塔（Costar），奥地利克雷姆斯明斯特；Cat.#650201)。然后将细胞以100μl溶液处理，该溶液含有滴定抗体12GL IgG1TM（范围为从2.55pM至16.7nM）和2.78nM重组人IL-18（内部、大肠杆菌衍生），它们在添加之前已经预混合5分钟。板在37°C于加湿的5%CO2气氛中孵育2小时。
然后将细胞通过在300×g在4°C离心3分钟来团粒化并且将上清液去掉。细胞重新悬浮于150μl PBS中并且再次离心。然后将细胞重新悬浮于含有0.1μg的FITC偶联抗人CD11b（eBioscience Inc.,San Diego CA;Cat.#11-0118，克隆ICRF44）的100μl FACS缓冲液（具有2%FBS的PBS）并且在冰上孵育30分钟。然后，细胞在150μl冰冷PBS中通过在300×g在4°C离心3分钟清洗两次，然后在150μl的3.7%甲醛（西格玛-奥德里奇，密苏里州圣路易斯；Cat.#F1635-1GA）（在PBS中）中固定。CD11b表达的调节使用FACSCanto II流式细胞仪（BD Biosciences,Franklin Lakes NJ）来确定。嗜中性粒细胞通过其特征前向散射（FSC）和侧向散射（SSC）性质来鉴别。将相应群体门控并且在FL-1通道（激发波长488nm，过滤器530/30）中分析荧光以便评估CD11b表达水平。
抗体12GL IgG1TM能够以2.032nM的几何平均值IC50（95%CI:1.021-4.046nM；n=7）来抑制人嗜中性粒细胞上的IL-18诱导的CD11b上调（图8）。
2.10抗体12GL IgG1TM对IL-18诱导的原代嗜中性粒细胞的活性氧物质产生的抑制
在合适辅助刺激因子例如甲酰肽的存在下，IL-18证明促进嗜中性粒细胞产生许多促炎症性介体包括活性氧物质（ROS）（Elbin等人（2005）Clin DiagnLab Immunol.12(3):436-46)。通过流式细胞术来评估抗体12GL IgG1TM在体外抑制IL-18诱导的增强甲酰肽诱导的嗜中性粒细胞产生ROS的能力。
在如部分2.9中描述从人血液分离嗜中性粒细胞之后，细胞以1×106/ml重新悬浮于含有1.5μg/ml ROS敏感染料二氢乙锭（英杰公司，英国佩斯里；Cat.#D11347）的RPMI-1640中并且在37°C在加湿的5%CO2气氛中孵育15分钟。然后细胞通过在300×g离心5分钟来团粒化，将上清液除去并且重新悬浮于具有2%BSA的50ml RPMI-1640中。在进一步离心之后，最后将细胞以3-5×106/ml的浓度重新悬浮于具有2%BSA的RPMI-1640中。将五十微升此细胞悬浮液涂覆于96孔聚苯乙烯组织培养物处理板中（科斯塔，奥地利克雷姆斯明斯特；Cat.#650201)。然后将细胞以100μl溶液处理，该溶液含有滴定抗体12GL IgG1TM（范围为从2.55pM至16.7nM）和2.78nM重组人IL-18（内部、大肠杆菌衍生），它们在添加之前已经预混合5分钟。板在37°C于加湿的5%CO2气氛中孵育2小时。然后，将细胞以含有400nM fMLFF（巴赫姆（Bachem），德国；Cat.#H-4294）的具有2%BSA的50μl RPMI1640来刺激。细胞在37°C在加湿的5%CO2气氛中再孵育10分钟。然后，细胞在150μl冰冷PBS中通过在300×g在4°C离心3分钟清洗两次，然后在150μl的3.7%甲醛（西格玛-奥德里奇，密苏里州圣路易斯；Cat.#F1635-1GA）（在PBS中）中固定。ROS的产生使用FACSCanto II流式细胞仪（BD Biosciences，新泽西州富兰克林湖）来确定。嗜中性粒细胞通过其特征前向散射（FSC）和侧向散射（SSC）性质来鉴别。将相应群体门控并且在FL-2通道（激发波长488nm，过滤器585/42）中分析荧光以便评估ROS水平。
抗体12GL IgG1TM能够以0.200nM（n=2）的几何平均IC50来抑制IL-18介导的增强fMLFF诱导的人嗜中性粒细胞中的ROS产生（图9）。
2.11使用表面等离子体共振来确定抗体8GL和抗体12GL IgG与IL-18的结合亲和力
使用BIAcore2000或T-100（通用电气医疗集团）生物传感器仪器评估抗IL-18抗体、抗体8GL和抗体12GL与重组表达人IL-18（内部、大肠杆菌衍生）或恒河猴IL-18（安迪生物科技公司，明尼苏达州明尼阿波利斯；cat.#2548-RM）之间的相互作用的动力学参数，如以前部分（部分1.8）中详述。
基本上，评估每个IgG与IL-18分析物之间的结合亲和力，方法是通过胺键将IgG共价连接至CM3或CM5芯片并且稀释的重组IL-18（0.4–200nM）依序在芯片表面上通过（参见部分1.8）。所得数据拟合至1:1朗缪尔模型（同时kakd）并且平均值报告于表5中。
2.12使用基于细胞的测定来药理学确定抗体12GL IgG1TM亲和力：pA2分析
量化竞争拮抗剂的亲和力的主要药理学工具是希尔德分析。使用此方法，可确定评估功能性测定中的拮抗剂亲和力的系统独立性手段。该方法基于以下概念：拮抗剂浓度和其亲和力确定促效剂应答的拮抗作用。因为拮抗作用可量化并且拮抗剂的浓度是已知的，所以可确定拮抗剂的亲和力。此拮抗作用通过测量被称为剂量比率（DR）的在存在和不存在拮抗剂时测量的促效剂的等活性浓度的比率来量化。
剂量比率可通过获得不存在结合成员时的促效剂（通常IL-18）的EC50与存在单一浓度的结合成员时的促效剂的EC50的比率来计算。然后，表达为log(DR-1)的剂量比率可用于有关log[结合成员]的线性回归以便产生希尔德回归。因此，对于结合成员的每一个浓度，存在相应DR值；这些值以关于log[结合成员]的log(DR-1)的回归来作图。如果拮抗作用为竞争性的，根据希尔德方程，在log(DR-1)与log[结合成员]之间存在线性关系，其中方程如下：
log(DR-1)=log[B]–log KB
[B]为结合成员的摩尔浓度。
在这些情况下，纵坐标的零值给出x轴的截距，其中log[B]=log KB。因此，产生log(DR-1)=0的结合成员的浓度等于log KB，结合成员-受体复合物的平衡解离常数。这是用于估计结合成员亲和力的系统独立性量化。传统上，此方法用于确定受体拮抗剂的亲和力，然而基于对于配体中和而言的类似假设，剂量比率的计算也应能够估计中和细胞上的IL-18活性的结合成员亲和力。因为KB值由对数绘图获得，所以其为对数正态分布的。此特定浓度的负对数在经验上被称为pA2，产生促效剂剂量应答曲线的两倍位移的拮抗剂的浓度。可量化拮抗剂效力，方法是从一个单一浓度的拮抗剂来计算pA2，该单一浓度的拮抗剂根据方程产生剂量比率的一个单一值，其中
pA2=log(DR-1)-log[B]
[B]=使得必需加倍促效剂浓度以便引出原始次最大应答的拮抗剂的摩尔浓度。
DR=剂量比率通过测量在存在和不存在拮抗剂时测量的促效剂的等活性浓度的比率来量化。
pA2可由剂量-应答测定数据来计算。
为了使用pA2方法来确定对于人IL-18的抗体12GL IgG1TM亲和力，KG-1细胞如部分1.7描述来涂覆。连续稀释的抗体12GL IgG1TM（细胞测定中的最终浓度为20nM、6.66nM、2.22nM、0.74nM、0.25nM和0）在培养基中制备并且添加至细胞。连续稀释的重组人IL-18（细胞测定中的最终浓度在42nM与0.25pM之间）也在培养基中制备并且添加至细胞以使得对于每个抗体12GL IgG1TM浓度，测试IL-18的剂量范围。在加湿气氛中在37°C/5%CO2下孵育细胞22-24小时之后，从每个孔收集150μl上清液并且IFNγ的浓度如部分1.7中指示来确定。在一些实验中，在抗体12GL IgG1TM的不同浓度（最终浓度为60nM、20nM、6.66nM、2.22nM、0.74nM、0.25nM和0）存在下，人IL-18置换为以125nM与0.25nM之间的最终浓度使用的恒河猴IL-18。
将实验数据作图以便对于每个抗体浓度来确定触发KG-1细胞的IFNγ产生增加50%（EC50）所需要的IL-18的量。EC50值使用GraphPad Prism软件通过使用四参数逻辑斯谛方程的曲线拟合来计算。然后，使用EC50值和抗体浓度在GraphPad Prism中产生希尔德绘图并且如上所述来确定pA2和KD值。图10展示抗体12GL IgG1TM对于KG-1细胞上的人IL-18效应的剂量依赖性抑制的实例和允许确定pA2和KD值的相应希尔德绘图。
使用基于KG-1细胞的测定获得的抗体12GL IgG1TM的pA2和KD值汇总于表6中。
2.13使用表面等离子体共振（SPR）生物传感器来分析抗体8GL和抗体12GL的结合特异性
使用BIAcore2000或T-100（通用电气医疗集团）生物传感器仪器评估抗IL-18抗体、抗体8GL和抗体12GL，与一系列重组表达的IL-18和相关蛋白质之间的相互作用的特异性。
如以前（部分1.9）详述，每个IgG与不同分析物之间的结合相互作用使用测定来估计，其中IgG通过胺键来共价连接至CM5芯片并且重组蛋白质在芯片表面上通过。
发现抗体8GL和抗体12GL结合至人和恒河猴Il-18但是展示不结合至小鼠IL-18、大鼠IL-18、人IL-1F7或人IL-1β（表7）。
2.14在IL-18BP表位竞争测定中的抗体12GL的表征
制备稀释系列的纯化抗体12GL IgG2以便确定是否该抗体可抑制IL-18与IL-18BP之间的结合相互作用并且因而指示抗体12GL结合至重组人IL-18上的与IL-18BP相同的构象表位。测定如部分1.10中描述来建立。
结果使用部分1.3和1.4中描述的相同方程来计算。
如图11中例示，抗体12GL IgG2产生0.2nM的IC50（95%CI:0.1-0.4nM，n=4）。
2.15抗体12GL IgG1TM对IL-18结合至IL-18BP的抑制
抗体12GL IgG1TM与IL-18BP之间竞争结合至人IL-18的评定进一步使用ProteOn XPR仪器（Bio-Rad，Hercules CA）来评估，该仪器以类似于Biacore2000或T100方式来操作。在此实验中，允许抗体12GL IgG1TM或IL-18BPa-Fc（安迪生物科技公司，明尼苏达州明尼阿波利斯；cat.#119-BP）的3种不同密度（范围为230-6340RUs）的胺连接表面从100nM溶液（最终密度在10RUs与330RUs之间）中捕获人IL-18（内部、大肠杆菌衍生），然后稳定化。然后，将100nM的另外抗体12GL IgG1TM和IL-18BP在捕获的IL-18上通过并且检查所得传感图以便确定是否存在与IL-18的任何结合。在抗体12GLIgG1TM或IL-18BPa-Fc的任何组合中未观察到另外的结合。这提供抗体12GLIgG1TM与IL-18BPa具有有关IL-18的重叠表位的指示。
实例3
晶体学研究
3.1人IL-18和抗体12GL Fab片段的纯化
部分1.1中提到的人IL-18构建体His-GST-IL-18经历大肠杆菌中的可溶性表达。蛋白质通过标准亲和色谱来纯化随后进行因子Xa切割。然后，切割的蛋白通过阴离子交换色谱和标准亲和色谱来纯化以便除去任何污染性切割标记物，然后该蛋白使用晶体学的离心浓缩装置来浓缩。
抗体12GL IgG通过吸附至并且从MabSelect SuRe蛋白质A（通用电气医疗集团）洗脱而从条件性培养基纯化。纯化的抗体12GL（+30mM半胱氨酸）以5mg木瓜蛋白酶与100mg IgG的比率在含有30mM半胱氨酸的磷酸盐缓冲盐水，pH7.2中的木瓜蛋白酶（西格玛-奥德里奇，密苏里州圣路易斯）中孵育以便产生Fab片段。在孵育96分钟之后，该消化通过添加碘乙酰胺至50mM的最终浓度来终止。Fab片段通过在pH7.2将该消化应用至MabSelectSuRe蛋白质A（通用电气医疗集团）来纯化，随后收集未结合的Fab片段。在浓缩之后，使用脱盐PD-10管柱（通用电气医疗集团）将Fab进行缓冲液交换至50mM乙酸钠、30mM氯化钠+2%w/v山梨糖醇，pH5.50中。
3.2IL-18和抗体12GL Fab复合物形成
抗体12GL Fab和人IL-18（内部、大肠杆菌衍生）以1:1摩尔比混合（具有轻微过量的IL-18）并且在+4°C轻轻地搅拌过夜。形成的复合物在20mM HEPES，pH7.5、150mM NaCl中平衡的HiLoad Superdex75PG26/60管柱（通用电气医疗集团）上以2.5mL/min通过尺寸排阻色谱来与过量IL-18分离。复合物洗脱为单一峰并且收集并且使用具有10kDa的MWCO的Amicon离心机装置来浓缩至10mg/mL。
3.3结晶、数据收集和结构确定
以蛋白缓冲液（20mM HEPES pH7.5，150mM NaCl）中的15mg/mL浓度的IL-18：抗体12GL Fab复合物来建立广泛蒸气扩散结晶试验以便鉴别结晶条件。将蛋白离心，然后以100nL蛋白溶液和100nL孔溶液在Intelli-plateFlat ledge（Art Robbins公司）中建立静置滴首次晶体在两周内出现于含有乙醇、3-甲基-1,5-戊二醇（MPD）或两种物质的滴中。这些晶体以不适用于衍射实验的针或针束形式出现。这些晶体通过UV显微镜术证实为蛋白。
引晶种用于结晶条件的整个优化中。为了获得针对衍射进行测试的晶体，执行好几轮的微观和宏观引晶种。用于微观引晶种的晶种储备物通过将晶体压碎于30μL孔溶液中来获得。将晶种储备物稀释并且将不同稀释物添加至结晶滴，例如10nL稀释的晶种储备物添加至200nL滴。也使用宏观引晶种，将针状晶体的束分解成较小碎片并且将其转移至新鲜的结晶滴。
用于数据收集的晶体从Nextal板（Qiagen）中的悬挂滴获得，其中500μL孔溶液在+20°C含有35%-40%乙醇。使用宏观引晶种，将晶体碎片转移至含有1:1比率的蛋白和孔溶液的新鲜3μL结晶滴。最佳晶体出现于宏观引晶种的滴中，但是可能是小核而非较大碎片的结果。将近似200μm的所得杆形晶体发送至欧洲同步加速辐射机构（European Synchrotron Radiation Facility；ESRF）（Grenoble，France）以便远程数据收集。数据在ESRF处的ID23-1光束线的ADSC Q315R检测器上从100K的单晶收集至
Figure BDA00003372980800871
数据从100K的单晶收集。数据集使用MOSFLM（莱斯利，A（1991）晶体学计算（Crystallographic computing）V第27-38页）来整合并且以Scala（CCP4套件）来扩展。数据收集统计资料展示于表8。结晶属于空间群P3121，其中细胞尺寸a=b=95.1、c=316.9、α=β=90、γ=120。不对称的单元含有IL-18-Fab复合物的2个拷贝，其给出3.1的马修系数和60%的溶剂含量。
IL-18：抗体12GL Fab复合物的结构通过分子置换方法使用程序Phaser（CCP4套件1994）来确定，该程序具有分别来源于蛋白质数据库条目3F62（克鲁姆（Krumm）等人（2008）PNAS105(52):20711-20715）和1AQK（法伯尔（Faber）等人（1998）免疫技术3:253-370）的IL-18和抗体12GL Fab的搜索模型。
初始搜索模型（1AQK_可变）包含来自1AQK（重链残基2-122、轻链2-111）的Fab可变域，其中以下环除去：LC93-99、HC27-32、51-58、73.76和101-107。Phaser给出空间群P3121中的单一解。发现此模型的一个拷贝，并且在保持此解固定的同时，从一个环被除去（54-61）的3F62（IL-18：IL-18BP复合物）提取的IL-18搜索模型被放置在下一步。将此解锁定并且针对来自1AQK（LC残基112-216和HC123-226）的抗体12GL Fab恒定域进行了成功搜索。IL-18：抗体12GL Fab（1AQK_可变）复合物的第二拷贝放置于不对称的单元中。搜索并且发现来自1AQK HC（重链123-226）的恒定域。然而，Phaser未能鉴别Fab LC恒定的位置。该模型在autobuster（Global phasing）刚体细化中运行。所得图谱具有良好质量并且抗体12GL Fab侧链在程序Coot（埃姆斯利P.（Emsley P.）等人（2010）晶体学报（Acta Cryst）D66:486-501）中重构为序列并且缺失的环通过手动使用Coot程序来重建以便匹配抗体12GL序列。在Coot中，将缺失的环建立至差异密度图谱中。在autobuster细化的另外的循环之后，第二分子中的最后一个LC恒定域应手动放置于Coot中。Fab链根据Kabat编号来编号（Kabat等人（1991）免疫学关注的蛋白质的序列（Sequences of Proteins of Immunological Interest）第5版马里兰州贝塞斯达（Bethesda,Md.）：国家生物技术信息中心（National Center forBiotechnology Information），国家医学图书馆（National Library ofMedicine））。完整模型以程序Refmac5（CCP4套件1994）被细化至24.5%的最终R因子和28.6%的自由R因子。
3.4IL-18:抗体12GL Fab复合物的晶体结构
人IL-18：抗体12GL复合物的晶体在空间群P3121中获得。电子密度图谱的综合质量良好并且允许97%残基的明确模拟。尤其是表位区和互补位区得以明确定义。IL-18的最终模型含有残基1-156。两个环区在电子密度中是无序的（残基33-41和131-132）并且部分这些区域被从模型中排除。相同环从与来自艾柯病毒（PDB登录代码3F62；Krumm等2008上述）的IL-18BP复合的IL-18的披露晶体结构的模型中排除并且报告为在处于未结合IL-18的溶液结构时具有高度柔性（PDB代码1J0S；加藤等人（2003）自然—结构生物学（NatStruct Biol）10(11):966-971）。抗体12GL Fab的最终模型由轻链（LC）残基1-213（1-212针对不对称单元中的第二分子）和重链（HC）1-226构成。最终模型含有IL-18-抗体12GL Fab复合物的两个拷贝和79个水分子。
晶体结构展示每个IL-18分子结合至一个抗体12GL Fab片段（图12）。此晶体结构允许在原子细节上检查IL-18与抗体12GL之间的表位相互作用。这些捕获于表9中，其中残基编号含有链指示符（H：抗体12GL重链，L：抗体12GL轻链）。距离使用CCP4程序CONTACT（CCP4，1994）来获得。只需要描述两个复合物之一，因为其为相等的。相互作用涉及来自抗体片段的重链和轻链的互补决定区（CDR）。形成表位一部分的IL-18中的氨基酸残基为Tyr1、Gly3、Leu5、Glu6、Lys8、Met51、Lys53、Asp54、Ser55、Gln56、Pro57、Arg58、Gly59、Met60、Arg104、Ser105以及Pro107。抗体12GL轻链贡献的残基为Gly28、Ser30、Trp32、Ser91、His92、His93以及Pro94。轻链框架1贡献单一氨基酸，残基Asp1。重链贡献的残基为Tyr35、Tyr52、Tyr53、Tyr58、Ala97、Tyr98、Phe99、Gly100、Thr100D以及Asp100E。
IL-18的总体结构与来自IL-18：IL-18BP复合物的IL-18高度类似（3F62；克鲁姆等人2008上述），其中总体Cα均方根偏差为
Figure BDA00003372980800881
然而，与IL-18：IL-18BP复合物比较，存在一个环（残基55-59）的
Figure BDA00003372980800882
位置移位。尽管此移位，带有大量与互补位相互作用的点的该环的总体构象仍然是相当类似的。相比之下，环（55-59）的构象与报告的未结合IL-18的NMR溶液结构（加藤等2003如上述）以及IL-18：125-2H复合物的晶体结构（Argiriadi,M.A.等人（2009）JBC284:24478-24489）偏差很大，其中最大移位分别为
Figure BDA00003372980800891
和
Figure BDA00003372980800892
抗体12GL的结合模式与来自艾柯病毒的IL-18BP几乎完全重叠，如最近披露的晶体结构所示（克鲁姆等人2008上述）。IL-18:抗体12GL Fab复合物的晶体结构揭示125-2H（2VXT；Argiriadi等2009如上述）与抗体12GL表位之间基本上没有重叠。
关于物种交叉反应性，抗体12GL与小鼠IL-18没有交叉反应但是与食蟹猴IL-18有交叉反应。食蟹猴和人IL-18表位为100%一致的。
实例4
游离IL-18测定
游离IL-18的浓度以电发光（ECL）免疫测定来确定。
0.625μg/ml的浓度的抗体12GL过夜涂布至96孔板（标准板（StandardPlate），Mesoscale Discovery）的碳电极上。将孔清洗并且随后以I-Block缓冲液（Tropix）孵育1至3小时。标准和QC浓度从I-Block缓冲液中的重组人IL-18（安迪生物科技公司）制备。将孔清洗并且标准、QC和未稀释试样在室温孵育30分钟。将孔清洗并且将0.5μg/ml生物素化检测抗体（MBL International）添加至孔。在1小时孵育之后，将孔清洗并且将链霉亲和素-SulfoTag（Mesoscale Discovery）添加至每个孔。30分钟的孵育时间之后，将孔清洗并且将Read Buffer（Mesoscale Discovery）添加至每个孔。ECL信号在SectorImmager2400（Mesoscale Discovery）上读取。结果展示于图16和17中。
表1；改进的scFv克隆在IFNγ释放KG-1细胞测定中测试时的示例性效力。
数据表达为几何平均值（95%置信区间；n）
表2；改进的IgG2在IFNg释放KG-1细胞测定中测试时的示例性效力。
Figure BDA00003372980800902
数据表达为几何平均值（95%置信区间；n）
表3；种系化的优化克隆在IFNγ释放KG-1细胞测定中评估时的示例性效力数据。
Figure BDA00003372980800911
数据表达为几何平均值（95%置信区间；n）
表4；种系化的优化克隆在IFNγ释放PBMC细胞测定中评估时的示例性效力数据。
Figure BDA00003372980800912
数据表达为几何平均值（95%置信区间；所测试的PBMC供体的数目）
表5；抗体8GL和抗体12GL与重组人和恒河猴IL-18的动力学分析。
表6；在使用人IL-18或恒河猴IL-18的KG-1细胞测定中的示例性抗体12GLIgG1TM pA2和KD值。
Figure BDA00003372980800922
数据表达为几何平均值（95%置信区间；实验数目）
表7；使用SPR对抗IL-18IgG抗体8GL和抗体12GL的特异性分析。所得观察应答与单独缓冲液的应答比较并且评估为或指示结合（+）或不结合（-）。
Figure BDA00003372980800931
表8；IL-18：抗体12GL的晶体学和细化细节。
Figure BDA00003372980800941
表9；IL-18：抗体12GL晶体结构的详情。
Figure BDA00003372980800951
表10；以下序列表中的序列与在此描述的抗体的VH域、VL域、CDR和框架区之间的对应性。
Figure BDA00003372980800961
Figure BDA00003372980800971
Figure BDA00003372980800981
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Figure BDA00003372980801001
Figure BDA00003372980801011
表11；在此描述的mAb的VH域和VL域以及CDR的SEQ ID NO
Figure BDA00003372980801012
Figure BDA00003372980801021
Figure BDA00003372980801031
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打印输出（原件为电子形式）
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Claims (95)

1.一种针对人Il-18的分离抗体分子，该分离抗体分子特异性地结合至人IL-18上的与IL-18BP结合部位全部或部分重叠的一个人IL-18表位。
2.根据权利要求1所述的抗体分子，其中该抗体分子特异性地结合至包含以下残基中的一个或多个的一个人IL-18表位：Tyr1、Gly3、Leu5、Glu6、Lys8、Met51、Lys53、Asp54、Ser55、Gln56、Pro57、Arg58、Gly59、Met60、Arg104、Ser105以及Pro107。
3.根据权利要求2所述的抗体分子，其中该表位包含残基Tyr1、Gly3、Leu5、Glu6、Lys8、Met51、Lys53、Asp54、Ser55、Gln56、Pro57、Arg58、Gly59、Met60、Arg104、Ser105以及Pro107。
4.根据以上权利要求中任一项所述的抗体分子，该抗体分子抑制IL-18结合至IL-18受体（IL-18R）和/或IL-18结合蛋白（IL-18BP）。
5.根据以上权利要求中任一项所述的抗体分子，该抗体分子与IL-18BP竞争结合至IL-18。
6.根据权利要求5所述的抗体分子，该抗体分子表现出对IL-18BP结合至IL-18的至少90%抑制。
7.根据以上权利要求中任一项所述的抗体分子，该抗体分子以小于1nM的IC50值结合人IL-18。
8.根据以上权利要求中任一项所述的抗体分子，该抗体分子表现出小于910-5s-1的对于人IL-18的解离速率（kd）。
9.根据以上权利要求中任一项所述的抗体分子，该抗体分子表现出小于10nM、优选小于100pM的对于人IL-18的亲和力（kD）。
10.根据以上权利要求中任一项所述的抗体分子，该抗体分子包含所定义的一组亲本CDR：HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2以及LCDR3，其中：
HCDR1具有氨基酸序列SEQ ID NO：153；
HCDR2具有氨基酸序列SEQ ID NO：154；
HCDR3具有氨基酸序列SEQ ID NO：155；
LCDR1具有氨基酸序列SEQ ID NO：158；
LCDR2具有氨基酸序列SEQ ID NO：159；并且
LCDR3具有氨基酸序列SEQ ID NO：160；
或包含具有一个或多个氨基酸取代、缺失或插入的该亲本CDR组。
11.根据权利要求9所述的抗体分子，该抗体分子包含：
(a)一个HCDR1，其具有与SEQ ID NO：153一致或相对于SEQ IDNO：153包含3个或更少个氨基酸残基取代的氨基酸序列；
(b)一个HCDR2，其具有与SEQ ID NO：154一致或相对于SEQ IDNO：154包含4个或更少个氨基酸残基取代的氨基酸序列；
(c)一个HCDR3，其具有与SEQ ID NO：155一致或相对于SEQ IDNO：155包含5个或更少个氨基酸残基取代的氨基酸序列；
(d)一个LCDR1，其具有与SEQ ID NO：158一致或相对于SEQ IDNO：158包含4个或更少个氨基酸残基取代的氨基酸序列；
(e)一个LCDR2，其具有与SEQ ID NO：159一致或相对于SEQ IDNO：159包含4个或更少个氨基酸残基取代的氨基酸序列；以及
(f)一个LCDR3，其具有与SEQ ID NO：160一致或相对于SEQ IDNO：160包含9个或更少个氨基酸残基取代的氨基酸序列。
12.根据权利要求10或权利要求11所述的抗体分子，其中在HCDR3中：
Kabat残基97为Ala；
Kabat残基98为Tyr；
Kabat残基99为Asp或Phe；
Kabat残基100为Gly；
Kabat残基100D为Ala或Thr；并且
Kabat残基100E为Asp。
13.根据权利要求10至12中任一项所述的抗体分子，其中在HCDR3中：
Kabat残基95为Thr；
Kabat残基96为Pro；
Kabat残基97为Ala；
Kabat残基98为Tyr；
Kabat残基99为Asp或Phe；
Kabat残基100为Gly；
Kabat残基100A为Asp或Gln；
Kabat残基100B为Ala或Asp；
Kabat残基100C为Arg；
Kabat残基100D为Ala或Thr；
Kabat残基100E为Asp；
Kabat残基100F为Phe；
Kabat残基100G为Phe；
Kabat残基101为Asp；且/或
Kabat残基102为Val。
14.根据权利要求10至13中任一项所述的抗体分子，其中在HCDR3中：其中：
HCDR3中的Kabat残基99为Phe；
HCDR3中的Kabat残基100a为Gln；
HCDR3中的Kabat残基100b为Asp；且/或
HCDR3中的Kabat残基100d为Thr。
15.根据权利要求10至14中任一项所述的抗体分子，其中HCDR3为以下中的任何一个：SEQ ID NO：5、15、25、35、45、55、65、75、85、95、105、115、125、135、145或155。
16.根据权利要求15所述的抗体分子，其中HCDR3为氨基酸序列SEQ IDNO：155。
17.根据权利要求10至16中任一项所述的抗体分子，其中在HCDR2中：
Kabat残基52为Tyr；
Kabat残基53为Tyr；并且
Kabat残基58为Tyr。
18.根据权利要求10至17中任一项所述的抗体分子，其中在HCDR1中：
Kabat残基35为Tyr。
19.根据权利要求10至18中任一项所述的抗体分子，其中：
LCDR3中的Kabat残基92为Tyr、Ser、Leu、His或Ala；
LCDR3中的Kabat残基93为Ser、Phe、Tyr、His或Ile；且/或
LCDR3中的Kabat残基94为Thr或Pro。
20.根据权利要求10至19中任一项所述的抗体分子，其中：
LCDR3中的Kabat残基91为Ser或Ile；
LCDR3中的Kabat残基92为His；
LCDR3中的Kabat残基93为His；且/或
LCDR3中的Kabat残基94为Pro。
21.根据权利要求10至20中任一项所述的抗体分子，其中：
LCDR3中的Kabat残基89为Gln或Ala；
LCDR3中的Kabat残基90为Gln、Asp或Asn；
LCDR3中的Kabat残基91为Ser或Ile；
LCDR3中的Kabat残基95为Pro、Asn或Gln，
LCDR3中的Kabat残基96为Trp且/或
LCDR3中的Kabat残基97为Thr或Asp。
22.根据权利要求10至21中任一项所述的抗体分子，其中LCDR3为SEQ IDNO：10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150或160。
23.根据权利要求21所述的抗体分子，其中LCDR3为氨基酸序列SEQ IDNO：160。
24.根据权利要求9至21中任一项所述的抗体分子，其中HCDR1为SEQ IDNO：3、103、113或153；并且HCDR2为SEQ ID NO：4、124、134、144或154。
25.根据权利要求22所述的抗体分子，其中HCDR1为氨基酸序列SEQ IDNO：153；且/或HCDR2为氨基酸序列SEQ ID NO：154。
26.根据权利要求10至25中任一项所述的抗体分子，其中在LCDR1中：
Kabat残基30为Ser；并且
Kabat残基32为Trp。
27.根据权利要求10至26中任一项所述的抗体分子，其中：
LCDR1为氨基酸序列SEQ ID NO：158；且/或
LCDR2为氨基酸序列SEQ ID NO：159。
28.根据以上权利要求中任一项所述的抗体分子，该抗体分子包含对于以下抗体中任何一个的如表11中所示的一组CDR：抗体1、抗体1GL、抗体2、抗体3、抗体4、抗体5、抗体6、抗体6GL、抗体7、抗体7GL、抗体8GL、抗体9、抗体10、抗体11、抗体11_GL以及抗体12GL。
29.根据以上权利要求中任一项所述的抗体分子，该抗体分子包含一个抗体VH域和一个抗体VL域，
其中该VH域包含分别具有SEQ ID NO：153、154和155的氨基酸序列的HCDR1、HCDR2、HCDR3；并且
该VL域包含分别具有SEQ ID NO：158、159和160的氨基酸序列的LCDR1、LCDR2、LCDR3。
30.根据以上权利要求中任一项所述的抗体分子，其中这些重链和/或轻链框架区种系化为人种系基因节段序列。
31.根据以上权利要求中任一项所述的抗体分子，其中在VL FW1中，kabat残基1为Asp。
32.根据以上权利要求中任一项所述的抗体分子，该抗体分子包含一个VH域，该VH域具有与选自以下中的一个序列至少90%一致的氨基酸序列：SEQ IDNO：2、12、22、32、42、52、62、72、82、92、102、112、122、132、142以及152。
33.根据权利要求32所述的抗体分子，其中该VH域选自SEQ ID NO：2、12、22、32、42、52、62、72、82、92、102、112、122、132、142以及152。
34.根据以上权利要求中任一项所述的抗体分子，该抗体分子包含一个VL域，该VL域具有与选自以下中的一个序列至少90%一致的氨基酸序列：SEQ IDNO：7、17、27、37、47、57、67、77、87、97、107、117、127、137、147以及157。
35.根据权利要求34所述的抗体分子，其中该VL域选自SEQ ID NO：7、17、27、37、47、57、67、77、87、97、107、117、127、137、147以及157。
36.根据权利要求1至31中任一项所述的抗体分子，其中该抗体分子包含一个抗体VH域和一个抗体VL域，其中该抗体VH域和该抗体VL域的氨基酸序列分别与SEQ ID NO：2和7、分别与SEQ ID NO：12和17、分别与SEQ ID NO：22和27、分别与SEQ ID NO：32和37、分别与SEQ ID NO：42和47、分别与SEQ IDNO：52和57、分别与SEQ ID NO：62和67、分别与SEQ ID NO：72和77、分别与SEQ ID NO：82和87、分别与SEQ ID NO：92和97、分别与SEQ ID NO：102和107、分别与SEQ ID NO：112和117、分别与SEQ ID NO：122和127、分别与SEQID NO：132和137、分别与SEQ ID NO：142和147、或分别与SEQ ID NO：152和157至少90%一致。
37.根据权利要求36所述的抗体分子，其中该抗体分子包含一个抗体VH域和一个抗体VL域，其中该抗体VH域和该抗体VL域的氨基酸序列分别为SEQ IDNO：2和7、分别为SEQ ID NO：12和17、分别为SEQ ID NO：22和27、分别为SEQ ID NO：32和37、分别为SEQ ID NO：42和47、分别为SEQ ID NO：52和57、分别为SEQ ID NO：62和67、分别为SEQ ID NO：72和77、分别为SEQ IDNO：82和87、分别为SEQ ID NO：92和97、分别为SEQ ID NO：102和107、分别为SEQ ID NO：112和117、分别为SEQ ID NO：122和127、分别为SEQ ID NO：132和137、分别为SEQ ID NO：142和147、或分别为SEQ ID NO：152和157。
38.根据权利要求1至29中任一项所述的抗体分子，其中该抗体VH域的氨基酸序列与SEQ ID NO：152至少90%一致并且其中该抗体VL域的氨基酸序列与SEQ ID NO：157至少90%一致。
39.根据权利要求38所述的抗体分子，其中该抗体VH域的氨基酸序列为SEQ ID NO：152并且该抗体VL域序列的氨基酸序列为SEQ ID NO：157。
40.一种抗体分子，该抗体分子与包含具有SEQ ID NO：152的氨基酸序列的抗体VH域和抗体VL域序列SEQ ID NO：157的抗体分子竞争结合至IL-18。
41.一种抗体分子，该抗体分子包含由保藏登录号NCIMB41786的核酸序列编码的VH域和VL域。
42.根据以上权利要求中任一项所述的抗体分子，其中该抗体分子为一种scFv。
43.根据权利要求1至41中任一项所述的抗体分子，其中该抗体分子包含一个抗体恒定区。
44.根据权利要求43所述的抗体分子，其中该抗体分子为一种单克隆抗体。
45.根据权利要求44所述的抗体分子，其中该抗体分子为一种嵌合抗体、人源化抗体或完全人抗体。
46.根据权利要求43至45中任一项所述的抗体分子，其中该抗体分子为一种IgG。
47.根据权利要求46所述的抗体分子，其中该抗体分子为一种IgG1或IgG4。
48.根据权利要求47所述的抗体分子，其中该抗体分子为在Fc区中具有YTE和TM突变的一种IgG1。
49.一种根据以上权利要求中任一项所述的抗体分子的分离VH域。
50.一种根据权利要求1至48中任一项所述的抗体分子的分离VL域。
51.一种组合物，包含根据权利要求1至48中任一项所述的分离抗体分子和一种药学上可接受的赋形剂。
52.一种包含根据权利要求1至48中任一项所述的抗体分子的组合物，该组合物用于在治疗人类或动物体的方法中使用。
53.根据权利要求52所述的组合物，该组合物用于在降低个体中的IL-18活性中使用。
54.根据权利要求52或权利要求53所述的组合物，该组合物用于在治疗个体中的与IL-18表达或活性增加相关的疾病中使用。
55.根据权利要求54所述的组合物，其中该疾病为一种炎症性、心血管性或自身免疫性疾病。
56.根据权利要求55所述的组合物，其中该疾病选自急性冠状动脉综合征（AVS）；动脉粥样硬化；以及慢性阻塞性肺病（COPD）。
57.根据权利要求1至48中任一项所述的抗体分子的用途，该抗体分子用于制造供降低个体中的IL-18活性的药物。
58.根据权利要求1至46中任一项所述的抗体分子的用途，该抗体分子用于制造供治疗个体中的与IL-18表达或活性增加相关的疾病的药物。
59.根据权利要求58所述的用途，其中该疾病为一种炎症性、心血管性或自身免疫性疾病。
60.根据权利要求59所述的用途，其中该疾病选自急性冠状动脉综合征（AVS）；动脉粥样硬化；以及慢性阻塞性肺病（COPD）。
61.一种治疗个体的方法，该方法包括对该个体给予根据权利要求1至48中任一项所述的抗体分子。
62.根据权利要求61所述的方法，其中该抗体分子降低该个体中的IL-18活性。
63.根据权利要求61或62所述的方法，其中该方法是用于治疗个体中的与IL-18表达或活性增加相关的疾病。
64.根据权利要求63所述的方法，其中该疾病为一种炎症性、心血管性或自身免疫性疾病。
65.根据权利要求64所述的方法，其中该疾病选自急性冠状动脉综合征（ACS）；动脉粥样硬化；以及慢性阻塞性肺病（COPD）。
66.一种分离核酸分子，该分离核酸分子包含编码根据权利要求1至48中任一项所述的抗体分子、根据权利要求49所述的VH域、或根据权利要求50所述的VL域的一种核苷酸序列。
67.一种在体外用根据权利要求66所述的核酸转化的宿主细胞。
68.一种产生抗体VH域或VL域的方法，该方法包括在用于产生该抗体分子VH域或VL域的条件下培养根据权利要求67所述的宿主细胞。
69.根据权利要求68所述的方法，进一步包括分离和/或纯化该抗体分子VH域或VL域。
70.根据权利要求69所述的方法，进一步包括将该抗体分子VH域或VL域配制成包含至少一种另外组分的一种组合物。
71.一种用于产生对于人IL-18的抗体抗原结合域的方法，该方法包括
经由在包含HCDR1、HCDR2和HCDR3的一个亲本VH域的氨基酸序列中添加、缺失、取代或插入一个或多个氨基酸来提供作为该亲本VH域的氨基酸序列变体的一个VH域，其中该亲本VH域HCDR1、HCDR2和HCDR3为如表11中所示的一组HCDR，并且可任选地将由此提供的该VH域与一个或多个VL域组合以便提供一个或多个VH/VL组合；并且
测试作为该亲本VH域的氨基酸序列变体的所述VH域或该VH/VL组合或这些VH/VL组合以便鉴别针对IL-18的一个抗体抗原结合域。
72.根据权利要求71所述的方法，其中该亲本VH域为根据SEQ ID NO.152的一个VH域。
73.根据权利要求71或权利要求72所述的方法，其中所述一个或多个VL域是经由在包含LCDR1、LCDR2以及LCDR3的一个亲本VL域的氨基酸序列中添加、缺失、取代或插入一个或多个氨基酸来提供，从而产生各自为该亲本VL域的氨基酸序列变体的一个或多个VL域，其中该亲本VL域LCDR1、LCDR2以及LCDR3为如表11中所示的CDR的VL组。
74.根据权利要求73所述的方法，其中该亲本VL域为根据SEQ ID NO.157的一个VL域。
75.根据权利要求71至74中任一项所述的方法，其中作为该亲本VH域的氨基酸序列变体的所述VH域是通过CDR诱变来提供的。
76.根据权利要求71至75中任一项所述的方法，进一步包括产生作为一种IgG、scFv或Fab抗体分子的组分的该抗体抗原结合域。
77.一种用于产生结合人IL-18的结合成员的方法，该方法包括：
提供编码一个VH域的起始核酸或各自编码一个VH域的核酸的起始组库，其中该VH域或这些VH域或者包含有待被置换的一个HCDR1、HCDR2和/或HCDR3或者缺乏一个HCDR1、HCDR2和/或HCDR3编码区；
将所述起始核酸或起始组库与编码在表11中所示的HCDR1、HCDR2和/或HCDR3的氨基酸序列的一种或多种供体核酸或通过其突变产生的一种或多种供体核酸进行组合，这样使得所述一种或多种供体核酸被插入该起始核酸或起始组库中的CDR1、CDR2和/或CDR3区中，以便提供编码VH域的核酸的一个产物组库；
表达所述产物组库的这些核酸以便产生产物VH域；
可任选地将所述产物VH域与一个或多个VL域进行组合；
选择针对IL-18的一个结合成员，该结合成员包含一个产物VH域和可任选地一个VL域；并且
回收所述结合成员或编码它的核酸。
78.根据权利要求77所述的方法，其中这些供体核酸是通过所述HCDR1和/或HCDR2的突变来产生的。
79.根据权利要求77所述的方法，其中该供体核酸是通过HCDR3的突变来产生的。
80.根据权利要求77所述的方法，包括通过核酸的随机突变来提供该供体核酸。
81.根据权利要求77至80中任一项所述的方法，进一步包括将包含于所回收的结合成员内的一个产物VH域连接至一个抗体恒定区上。
82.根据权利要求77至80中任一项所述的方法，包括提供包含该产物VH域和一个VL域的一种IgG、scFv或Fab抗体分子。
83.根据权利要求77至82中任一项所述的方法，进一步包括针对抑制人IL-18结合至IL-18R的能力来测试结合IL-18的该抗体抗原结合域或结合成员。
84.根据权利要求77至83所述的方法，其中获得了包含一种抗体分子的一个结合成员，该抗体分子结合人IL-18并且抑制人IL-18结合至IL-18R。
85.根据权利要求77至84所述的方法，其中该抗体分子为一种scFv。
86.根据权利要求77至84所述的方法，其中该抗体分子为一种IgG。
87.一种用于产生抗体分子组合物的方法，该方法包括使用根据权利要求84至86中任一项所述的方法来获得一种抗体分子，并且将该抗体分子配制成包含至少一种另外组分的一种组合物。
88.根据权利要求1至48中任一项所述的抗体分子在测量样本中的IL-18的方法中的用途。
89.根据权利要求88所述的用途，其中IL-18为游离IL-18。
90.一种检测和/或测量IL-18的方法，该方法包括；
(i)使根据权利要求1至48中任一项所述的抗体分子暴露于IL-18并且
(ii)检测和/或测量所述结合成员与IL-18的结合。
91.一种测量样本中的IL-18的方法，该方法包括；
(i)使一个样本与根据权利要求1至48中任一项所述的抗体分子接触并且
(ii)确定该抗体分子与该样本的结合，
其中该抗体分子与该样本的结合指示该样本中的IL-18的量。
92.一种测量样本中的IL-18的方法，该方法包括；
使该样本与结合IL-18的一种第一抗体分子接触，并且；
使用结合IL-18的一种第二抗体分子来确定所述第一抗体分子与该样本中的IL-18的结合，
其中所述第一或第二抗体分子之一为根据权利要求1至48中任一项所述的抗体分子并且所述第一或第二结合成员中的另一个为不与根据权利要求1至48中任一项所述的抗体分子竞争结合至IL-18的一种抗IL-18抗体分子。
93.根据权利要求91或权利要求92所述的方法，其中该样本为一个脑脊液（CSF）、胆汁、尿液、皮脂、唾液或血清样本。
94.根据权利要求90至93中任一项所述的方法，其中该IL-18为游离IL-18。
95.根据权利要求91至94中任一项所述的方法，其中该IL-18为游离IL-18。
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