KR20210097819A - 보편적 항체 프레임워크를 사용한 래빗 항체의 인간화 - Google Patents

보편적 항체 프레임워크를 사용한 래빗 항체의 인간화 Download PDF

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Abstract

본 발명은 보편적인 항체 수용체 프레임워크 및 비인간 항체, 예를 들면 래빗 항체를 보편적인 항체 수용체 프레임워크를 사용하여 그래프팅하는 방법에 관한 것이다. 본 발명의 방법에 의해 생산된 항체는 다양한 진단 및 치료 방법에 유용하다.

Description

보편적 항체 프레임워크를 사용한 래빗 항체의 인간화{HUMANIZATION OF RABBIT ANTIBODIES USING A UNIVERSAL ANTIBODY FRAMEWORK}
관련 출원
본 출원은 2008년 6월 25일에 출원된 미국 특허출원 제61/075,697호; 또한 2009년 2월 24일에 출원된 미국 특허출원 제61/155,041호 및 2009년 2월 24일에 출원된 미국 특허출원 제61/155,105호에 대하여 우선권을 주장한다.
본 발명의 배경
모노클로날 항체, 그의 컨쥬게이트 및 유도체는 치료제와 진단제에서 상업적으로 대단히 중요하다. 비인간 항체는, 통상적으로 일회 소량 주사 후에 환자에게서 심각한 면역반응을 유발한다(Schroff, 1985 Cancer Res 45:879-85, Shawler. J Immunol 1985 135:1530-5; Dillman, Cancer Biother 1994 9:17-28). 따라서, 유전자이식 마우스 또는 파아지(phage) 디스플레이를 사용하여 완전히 인간 항체를 제조하는 기술뿐만 아니라 마우스와 다른 설치류 항체의 면역원성을 감소시키는 일반적 방법들이 개발되었다. 키메릭 항체를 조작하여 설치류 가변영역과 인간 정상영역을 결합(예를 들면, Boulianne Nature 1984 312:643-6)하여 면역원성 문제를 상당히 감소시켰다(예를 들면, LoBuglio, Proc Natl Acad Sci 1989 86:4220-4; Clark, Immunol Today 2000 21 :397-402). 또한, 인간화된 항체를 조작하여서 가변영역의 자체의 설치류 서열을 적어도 원래의 CDR을 보존하면서 가능한 인간 서열에 근접하도록 조작하거나 또는 설치류 항체의 CDR 형태를 인간 항체의 프레임워크에 그래프트하였다(예를 들면, Riechmann, Nature 1988 332:323-7; 미국 특허 제5,693,761호). 래빗 폴리클로날 항체는 ELISA 또는 웨스턴 블롯과 같은 생물학적 에세이에서 널리 사용된다. 폴리클로날 래빗 항체는 일반적으로 그의 매우 높은 친화성으로 인하여 폴리클로날 설치류 항체 중에서 주로 선호된다. 게다가, 래빗은 마우스에서 면역원성이 불량한 항원 및/또는 파아지 디스플레이에 사용되었을 때 양호한 결합제를 생성하지 않는 항원에 대해 양호한 항체 반응을 유도할 수 있다. 래빗 항체의 공지된 이점으로 인하여 이들은 치료 항체의 발굴과 개발에 사용하는데 이상적이다. 통상적으로 실시되지 않는다는 이유는 주로 모노클로날 래빗 항체의 생성에서의 기술적 어려움 때문이다. 골수종과 같은 종양이 래빗에서는 알려져 있지 않기 때문에 모노클로날 항체를 제조하는 일반적인 하이브리도마 기술은 래빗 항체에 적용할 수 없다. 래빗 항체 발현 세포에 융합 세포주 파트너를 제공하는 선구적 작업이 Knight와 그의 동료들에 의해 수행(Spieker-Polet et al., PNAS 1995, 92:9348-52)되었으며, 개선된 융합 파트너 세포주가 Pytela 등에 의해 2005년에 기술되었다(미국 특허 제7,429,487호). 그러나 이 방법은 상응하는 노하우가 기본적으로 단일 검색군에 의해 관리되었으므로 광범위하게 확산되지 않는다. 선택된 항체 발현 세포로부터의 항체를 RT-PCR에 의해 클로닝하는 것과 관련한 모노클로날 항체의 선택적인 제조방법이 문헌에 기술되어 있지만, 래빗 항체에 대해 결코 성공적으로 보고하고 있지는 않다.
래빗 항체는, 마우스 항체와 마찬가지로 인간의 치료에 사용될 경우 강력한 면역반응을 유발할 것으로 예상되므로, 래빗 항체는 임상적으로 사용되기 전에 인간화하는 것이 필요하다. 그러나, 인간화된 설치류 항체를 제조하는데 사용되는 방법은 래빗과 마우스 및, 개별적으로 래빗과 인간 항체 간의 구조적 차이로 인하여 래빗 항체에 용이하게 추정될 수 없다. 예를 들면, 경쇄 CDR3(CDRL3)는 대개 이전에 알려진 인간 또는 마우스 항체의 CDRL3 보다 훨씬 더 길다.
소수의 래빗 항체 인간화 방법이 선행 기술에 기술되어 있으나, 비인간 공여체의 CDR을 인간 수용체 항체 상에 이식하는 전통적 그래프팅 방법은 아니다. PCT 공개 제WO04/016740호에서는 일명 "리서페이싱(resurfacing)" 전략을 기술하고 있다. "리서페이싱(resurfacing)" 전략의 목적은 비인간 프레임워크의 용매 접근성 잔기를 리모델링하여 이들이 보다 인간화되게 하는 것이다. PCT 공개 제WO04/016740호에 기술된 래빗 항체에 대한 유사한 인간화 기술이 당 분야에 알려져 있다. PCT 공개 제WO08/144757호와 PCT 공개 제WO05/016950호는 모(母) 래빗 항체의 아미노산 서열을 유사한 인간 항체의 아미노산 서열 비교를 포함하는 래빗 모노클로날 항체를 인간화하는 방법을 기술하고 있다. 이어서, 모 래빗 항체의 아미노산 서열을 변경하여 그의 프레임워크 영역이 유사한 인간 항체의 동등한 프레임워크 영역에 대해 서열 내에서 보다 유사하였다. 양호한 결합 능력을 얻기 위해서는 각각의 면역결합제에 대해 개별적으로 고된 개발 노력들이 필요하다.
상기한 접근 방법들이 가지는 잠재적인 문제점은 인간 프레임워크를 사용하는 것이 아니라 래빗 프레임워크를 조작하여 인간과 보다 유사하게 보이도록 하는 것이다. 이러한 접근 방법은 단백질의 중심부에 묻혀있는 아미노산 스트레치가 여전히 면역원성 T 세포 에피토프를 포함할 수 있는 위험성을 불러 일으킨다.
이제까지 상기 출원인들은 래빗 항체를 확인하지 않았으며, 최신식 그래프팅 접근 방법을 적용하여 인간화되었다. 이것은 래빗 CDR이 인간 또는 설치류의 CDR과는 상당히 다를 수 있다는 사실을 설명하는 것이다. 당 분야에서 알려진 바와 같이, 많은 래빗 VH 사슬은 마우스와 인간의 대응물과 관련하여 가외의 짝을 이룬 시스테인을 가진다. cys22와 cys92 사이에 형성된 보존된 디설파이드 가교 이외에, 일부 래빗 사슬 내의 CDRHl의 최종 잔기와 CDRH2의 최초 잔기 사이에 형성된 내부 CDR S-S 가교뿐만 아니라 cys21-cys79 가교가 있다. 또한, 시스테인 잔기쌍은 주로 CDR-L3에서 발견된다. 게다가, 많은 래빗 항체 CDR이 이전에 알려진 어떤 표준 구조에도 속하지 않는다. 특히 CDR-L3는 인간 또는 마우스 대응물의 CDR-L3 보다 훨씬 더 길다.
그러므로, 비인간 CDR 항체의 인간 프레임워크로의 그래프팅은 단백질 조작의 중요한 과제이다. 자연적으로 발달된 프레임워크에서 상이한 인공적으로 선택된 인간 프레임워크로 항원 결합 루프를 전이를 수행하여야만 원형의 루프 입체구조가 항원 결합에 대해 유지된다. 대개 항원 결합 친화성은 루프 그래프팅 후에 상당히 감소되거나 소멸된다. 주의깊게 선택된 인간 프레임워크를 항원 결합 루프를 그래프팅하는데 사용하는 것은 인간화된 분자 내에서 결합 친화성을 유지하는 가능성을 최대화한다(Roguzka et al 1996). 문헌에서 입수되는 수많은 그래프팅 실험들이 CDR 그래프팅에 대한 대략적인 가이드를 제공하기는 하지만, 패턴을 일반화할 수는 없다. 전형적인 문제는 CDR 루프를 그래프팅한 후에 특이성, 안정성 또는 생성능이 손실된다는 것이다.
따라서, 치료제 및 진단제로 사용하기 위한 래빗 항체를 용이하고 신속하게 인간화하는 개선된 방법이 시급히 요구된다. 약물과 같은 생체물리학적 특성을 가지는 작용성 항체 및/또는 항체 절편을 제공하는, 래빗 항체를 신뢰성 있게 인간화하는 인간 수용체 프레임워크도 또한 필요하다.
발명의 요약
놀라웁게도, 품질관리(QC) 에세이에 의해 확인된 높은 가용성의 안정한 인간 항체 프레임워크(PCT 국제 공개 제WO 0148017호 및 Auf der Maur et al (2001), FEBS Lett 508, p. 407-412 참조)가 인간 이외의 동물종으로부터의 CDR, 예를 들면 래빗 CDR을 수용하는데 특히 적합한 것을 발견하였다. 따라서, 첫 번째 양태에서 본 발명은 디설파이드 가교가 CDR 내에 존재하는 지의 여부와는 별개로, 상이한 결합 특이성의 다양한 항체, 특히 래빗 항체로부터 유래한 CDR의 보편적 수용체로서 특히 적합한 특정한 인간 항체(소위 "FW 1.4" 항체라 함.)의 경쇄 및 중쇄 가변 영역을 제공한다. 또한, 본 발명은 상기한 특정한 인간 항체 프레임워크의 2개 돌연변이 서열, 즉 rFW1.4 및 rFW1.4(V2)을 제공하는 것으로, 이들은 래빗 CDR의 그래프팅에 대한 보편적 수용체 프레임워크로 특히 적합한 프레임워크이다. 다른 양태에서, 본 발명은 인간 프레임워크를 인간이 아닌 다른 동물 종의 CDR, 특히 래빗 CDR을 수용하는데 적합하게 하는 프레임워크 잔기의 모티프를 제공한다.
래빗 CDR을 상기한 고도의 상용성 가변 경쇄 및 중쇄 프레임워크에 그래프팅하여 생성되는 인간화된 면역결합제는 공여체 CDR이 유도되는 래빗 항체의 공간적 배열을 일관되고 신뢰성 있게 유지한다. 그러므로, 공여체 면역결합제의 구조적으로 연관된 어떠한 위치도 수용체 프레임워크에 삽입될 필요가 없다. 이러한 이점으로 인하여 결합능의 최적화가 전혀 없거나 거의 없는 래빗 항체의 고 효율 인간화가 얻어질 수 있다.
따라서, 다른 양태에서, 본 발명은 래빗 및, 인간이 아닌 다른 동물 CDR을 여기에 기술된 가용성이고 안정한 경쇄 및/또는 중쇄 인간 항체 프레임워크 서열에 그래프팅하는 방법을 제공하여 우수한 생체물리학적 특성을 가지는 인간화된 항체를 생성한다. 특히 본 발명의 방법에 의해 생성된 면역결합제는 용해도와 안정성 등의 우월한 작용 특성을 나타낸다.
발명의 상세한 설명
정 의
본 발명을 보다 용이하게 이해할 수 있도록, 임의의 용어들을 다음과 같이 정의한다. 추가의 정의는 상세한 설명에 열거하였다.
"항체"라는 용어는 전체 항체와 항원과 결합하는 절편을 지칭한다. "항원과 결합하는 폴리펩티드" 및 "면역결합제"는 여기에서 동시에 사용된다. "항체"는 임의로 글리코실레이트된, 디설파이드 결합에 의해 서로 연결된 2개 이상의 중(H)쇄 및 2개 경(L)쇄를 포함하는 단백질 또는 그의 항원 결합 부분을 지칭한다. 각각의 중쇄는 중쇄 가변영역(여기에서는 VH로 약칭함.)과 중쇄 정상영역을 포함한다. 중쇄 정상영역은 3개의 도메인, CH1, CH2, 및 CH3를 포함한다. 각각의 경쇄는 경쇄 가변영역(여기서는 VL로 약칭함.)과 경쇄 정상영역을 포함한다. 경쇄 정상영역은 하나의 도메인, CL을 포함한다. VH와 VL 영역은 프레임워크 영역(FR)이라고 지칭되는, 보다 더 보존되는 영역으로 산재된, 상보성결정영역(CDR)이라고 지칭되는 초가변성 영역으로 세분화될 수 있다. 각각의 VH와 VL은 3개의 CDR과 4개의 FR로 이루어지며 다음 순서로 아미노 말단에서 카르복시 말단으로 배열된다: FRl, CDRl, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4. 중쇄 및 경쇄의 가변영역은 항원과 상호작용하는 결합 도메인을 포함한다. 항체의 정상영역은 숙주 조직 또는 팩터, 예를 들면 다양한 면역 시스템 세포(예를 들면, 이펙터 세포) 및 클래식 보체계의 제1 성분(Clq) 등에 면역글로불린의 결합을 매개할 수 있다.
항체의 "항원-결합 부위"(또는 간단히 "항체 부위")는 항원(예를 들면, TNF)에 특이적으로 결합하는 능력을 보유하는 항체의 하나 이상의 절편을 지칭한다. 항체의 항원 결합 작용은 전체 길이 항체의 절편에 의해 수행될 수 있는 것으로 나타났다. 항체의 "항원 결합 부위" 내에 포함된 결합 절편의 예로는, (i) VL, VH, CL 및 CH1 도메인으로 구성되는 1가 절편인 Fab 절편; (ii) 힌지 영역에서 디설파이드 결합에 의해 연결된 2개의 Fab 절편을 포함하는 2가 절편인 F(ab')2 절편; (iii) VH 및 CH1 도메인으로 구성되는 Fd 절편; (iv) 항체의 싱글 암의 VL과 VH 도메인으로 구성되는 Fv 절편; (v) VH 도메인으로 구성되는, 단일 도메인 또는 dAb 절편 (Ward et al, (1989) Nature 341 :544-546); 및 (vi) 단리된 상보성결정영역(CDR) 또는 (vii) 합성 링커에 의해 임의로 결합될 수 있는 2개 이상의 단리된 CDR의 조합물. 또한, Fv 절편의 2개 도메인, VL과 VH는 별개 유전자에 의해서 코딩되지만, 이들은 재조합 방법을 사용하여 VL과 VH 영역이 짝을 이루어 일가의 분자를 형성하는 단일 단백질 사슬이 되게 하는 합성 링커에 의해 결합될 수 있다(단일 사슬 Fv(scFv);Bird et al. (1988) Science 242:423-426; and Huston et al. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-5883 참조). 이러한 단일 사슬 항체도 항체의 "항원 결합 부위"의 범위에 포함된다. 이러한 항체 절편은 당업자에게 알려진 일반적인 기술을 사용하여 얻어지며, 이 절편을 완전한 항체와 같은 방법으로 이용성에 대해 스크린한다. 항원 결합 부위는 재조합 DNA 기술에 의해서 또는 완전한 면역글로불린의 효소적 또는 화학적 분해에 의해 생산될 수 있다. 항체는 상이한 이소형태일 수 있으며, 예를 들면 IgG (예를 들면, IgGl, IgG2, IgG3, 또는 IgG4 서브타입), IgAl, IgA2, IgD, IgE, 또는 IgM 항체 등이다.
"면역결합제(immunobinder)"는 항체의 항원 결합부위의 일부 또는 전체, 예를 들면, 중쇄 및/또는 경쇄 가변 도메인의 전체 또는 일부를 포함하는 분자를 지칭하며, 이러한 면역결합제는 특이적으로 목적 항원을 인식한다. 면역결합제의 비제한적 실시예는 항체 절편뿐만 아니라 전체 길이의 면역글로불린 분자 및 scFv를 포함하며, 예를 들면 제한적인 것은 아니나 (i) VL, VH, CL 및 CH1 도메인으로 이루어지는 일가 절편인 Fab 절편; (ii) 힌지 영역에서 디설파이드 결합에 의해 연결되는 2개의 Fab를 포함하는 2가 절편인 F(ab')2 절편; (iii) 힌지 영역의 일부를 가지는 본질적으로 Fab인 Fab' 절편(Fundamental Immunology (Paul ed., 3.sup.rd ed. 1993) 참조); (iv) VH 및 CH1 도메인으로 이루어진 Fd 절편; (v) 항체의 싱글 암(single arm)의 VL 및 VH 도메인을 포함하는 Fv 절편; (vi) VH 또는 VL 도메인으로 이루어지는 Dab 절편(Ward et al, (1989) Nature 341 :544-546), Camelid(Hamers-Casterman, et al., Nature 363:446-448 (1993), and Dumoulin, et al., Protein Science 11:500-515 (2002)), 또는 Shark 항체(예를 들면, shark Ig-NARs Nanobodies®) 등의 단일 도메인 항체; 및 (vii) 단일 가변 도메인과 2개의 정상 도메인을 함유하는 중쇄 영역인 나노바디(nanobody) 등이 있다.
"단일 사슬 항체", "단일 사슬 Fv" 또는 "scFv"는 링커에 의해 연결된 항체 중쇄 가변 도메인(또는 영역; VH) 및 항체 경쇄 가변 도메인(또는 영역; VL)을 포함하는 분자를 지칭한다. 이러한 scFv 분자는 다음과 같은 일반 구조를 가질 수 있다: NH2-VL-링커-VH-COOH 또는 NH2-VH-링커-VL-COOH. 공지된 링커(art linker)의 적합한 상태는 반복 GGGGS 아미노산 서열 또는 이들의 변이체로 이루어진다. 본 발명의 바람직한 구현예에서, 서열 번호 8에 예시된 아미노산 서열의 (GGGGS)4 링커를 사용할 수 있으며, 1 내지 3회 반복의 변이체 또한 가능하다(Holliger et al. (1993), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:6444-6448). 본 발명에서 사용가능한 다른 링커들은 Alfthan et al. (1995), Protein Eng. 8:725-731, Choi et al. (2001), Eur. J. Immunol. 31:94-106, Hu et al. (1996), Cancer Res. 56:3055-3061, Kipriyanov et al. (1999), J. Mol. Biol. 293:41-56 및 Roovers et al. (2001), Cancer Immunol. 에 의해 기술되었다.
여기에서 사용된 "작용 특성"이란, 예를 들면 폴리펩티드의 제조 특성 또는 치료 효능을 개선하기 위해서 당업자들에게 개선(예를 들면, 종래의 폴리펩티드와 관련하여)이 바람직하거나 및/또는 유리한 폴리펩티드(예를 들면, 면역결합제)의 특성이다. 일 구현예에서, 작용 특성은 안정성(예를 들면, 열적 안정성)이다. 다른 구현예에서, 작용 특성은 용해도(예를 들면, 세포 조건 하)이다. 다른 구현예에서, 작용 특성은 응집성이다. 또다른 구현예에서, 작용 특성은 단백질 발현(예를 들면, 원핵 세포 내)이다. 또다른 구현예에서, 작용 특성은 제조공정에서 봉입체 용해 이후의 리폴딩 작용이다. 임의의 구현예에서, 항원 결합 친화도의 개선은 작용 특성이 아니다. 또다른 바람직한 구현예에서, 하나 이상의 작용 특성의 개선은 면역결합제의 결합 친화성에 대해 실질적인 효과가 없다.
"CDR"이란 주로 항원 결합에 기여하는 항체의 가변 도메인 내의 6개 초가변영역 중 하나를 지칭한다. 6개 CDR에 대하여 가장 통상적으로 사용되는 정의 중 하나는 Kabat E.A. et al., (1991) Sequences of proteins of immunological interest. NIH Publication 91-3242에 의해 제공되었다. 여기서 사용된, Kabat의 CDR 정의만이 중쇄 가변 도메인의 CDR2 및 CDR3(CDR H2, CDR H3, 또는 H2, H3)뿐만 아니라 경쇄 가변 도메인의 CDRl, CDR2 및 CDR3(CDR Ll, CDR L2, CDR L3, 또는 Ll, L2, L3)에 적용한다. 그러나 여기에서 사용된 중쇄 가변 도메인의 CDR1(CDR Hl 또는 Hl)은 위치 26으로 개시하고 위치 36 전에 종료하는 잔기 위치(Kabat 넘버링)에 의해 정의된다. 이러한 정의는 기본적으로 Kabat와 Chotia에 의해 상이하게 정의된 CDR H1의 융합이다(예시를 위한 도 1 참조).
여기에서 사용된 "항체 프레임워크"는 가변 도메인의 일부, VL 또는 VH를 지칭하며, 상기 가변 도메인의 항원 결합 루프(CDR)에 대해 스캐폴드(scaffold)로서 작용한다. 기본적으로 이것은 CDR이 없는 가변도메인이다.
"에피토프" 또는 "항원성 결정인자"는 면역글로불린 또는 항체가 특이적으로 결합하는 항원의 부위(예를 들면, TNF 분자 상의 특이적 부위)를 지칭한다. 에피토프는 전형적으로 독특한 공간적 입체구조 내에 적어도 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 또는 15의 연속 또는 비연속 아미노산을 포함한다. Epitope Mapping Protocols in Methods in Molecular Biology, Vol. 66, G. E. Morris, Ed. (1996) 참조.
"특이적 결합", "선택적 결합", "선택적으로 결합하다" 및 "특이적으로 결합하다"라는 용어는 미리 결정된 항원 상의 에피토프에 결합하는 항체를 지칭한다. 전형적으로, 항체는 약 10-7 M 미만의 친화도(KD), 예를 들면 약 10-8 M 미만, 10-9 M 또는 10-10 M 이하의 친화도로 결합한다.
"KD" 또는 "Kd"는 특정한 항체-항원 상호작용의 해리 평형상수를 지칭한다. 전형적으로, 본 발명의 항체는, 예를 들면 BIACORE 장치에서 표면 플라스몬 공명(SPR) 방법을 사용하여 측정하였을 때 약 10-7 M 미만, 예를 들면 약 10-8 M 미만, 10-9 M 또는 10-10 M 이하의 해리 평형상수(KD)를 가지는 TNF와 결합한다.
여기서 사용된 "핵산 분자"는 DNA 분자와 RNA 분자를 지칭한다. 핵산 분자는 단일가닥 또는 이중가닥일 수 있으며, 바람직하게는 이중가닥 DNA이다. 핵산은 다른 핵산 서열과 작용적인 관계에 있을 때 "작동가능하게 연결"된다. 예를 들면, 프로모터 또는 인핸서는 서열의 전사에 영향을 줄 경우 코딩 서열에 작동가능하게 연결된다.
"벡터"는 연결되어 있는 다른 핵산을 수송할 수 있는 핵산 분자를 지칭한다. 일 구현예에서, "플라스미드"는 일종의 벡터이며, 추가의 DNA 세그먼트가 결찰될 수 있는 원형 이중가닥 DNA 루프를 지칭한다. 다른 구현예에서, 벡터로는 바이러스성 벡터가 있으며, 여기에서 추가 DNA 세그먼트는 바이러스 게놈에 결찰될 수 있다. 여기에 기술된 벡터들은 이들이 삽입된 숙주 세포 내에서 자가복제할 수 있거나(예를 들면, 복제의 박테리아 기원을 가지는 박테리아 벡터와 에피솜 포유동물 벡터) 또는 숙주 세포에 삽입되어서 숙주 세포의 게놈(예를 들면, 에피솜이 아닌 포유동물 벡터)에 결합되어 숙주 게놈과 함께 복제될 수 있다.
"숙주 세포"란 발현 벡터가 삽입되어 있는 세포를 지칭한다. 숙주 세포는 박테리아, 미생물, 식물 또는 동물 세포를 포함할 수 있으며, 바람직하게는 대장균(Escherichia coli), 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis), 사카로마이세스 세리비지에(Saccharomyces cerevisiae), 피키아 파스토리스(Pichia pastoris), CHO 또는 NSO 세포 등이다.
"토끼목(lagomorphs)"이란 Leporidae과(예를 들면, 허스(hares) 및 래빗)와 Ochotonidae과(피카스)를 포함하는 분류체계상 Lagomorpha 목의 동물을 지칭한다. 가장 바람직한 구현예에서 토끼목은 래빗이다. 여기에서 사용된 "래빗"이란 용어는 토끼과에 속하는 동물을 지칭한다.
여기에서 사용된 "동일성"이란 2개 폴리펩티드, 분자간 또는 2개 핵산 간의 서열 매칭(matching)을 지칭한다. 2개의 비교 서열 모두에서 한 위치에 동일한 염기 또는 아미노산 모노머 서브유니트가 있으면(예를 들면, 2개의 폴리펩티드 각각의 한 위치를 라이신이 차지하고 있다면), 각각의 분자는 그 위치에서 동일하다. 2개 서열 간의 "동일성 백분율"은 서열에 의해 공유된 일치하는 위치의 수의 함수이며, 갭의 숫자와 갭의 길이를 고려하여 2개 서열의 최적 배열에 삽입되는 것이 필요하다. 일반적으로 2개 서열이 나란히 정렬된 경우의 비교에서 동일성이 최대가 된다. 이러한 정렬은, 예를 들면 Needleman과 Wunsch, J Mol. Biol. (48) 443-453(1970)의 방법을 사용하여 제공되며, 상기 알고리즘은 Blossum 62 매트릭스 또는 PAM250 매트릭스, 및 16, 14, 12, 10, 8, 6, 또는 4의 갭 중량 및 1, 2, 3, 4, 5, 또는 6의 길이 중량을 사용하는 GCG 소프트웨어 패키지의 GAP 프로그램에 포함되어 있다.
달리 정의되지 않는 한, 여기에서 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어는 본 발명이 속하는 분야의 일반적인 기술의 하나로 통상적으로 이해되는 것과 같은 의미를 가진다. 여기에 기술된 것과 유사하거나 동등한 방법과 물질이 본 발명의 실제 또는 시험에서 사용될 수 있으나 적합한 방법과 물질을 이하에 기술하였다. 충돌이 있을 경우, 정의들을 포함하는 본 명세서가 조절하게 된다. 또한, 물질, 방법 및 실시예는 예시일 뿐으로 제한을 의미하지는 않는다.
본 발명의 다양한 양태를 이하에서 보다 상세하게 기술하였다. 다양한 구현예, 참조 및 범위가 임의로 결합될 수 있음을 이해하여야 한다. 또한, 특정한 구현예에 따라서 선택된 정의, 구현예 또는 범위를 적용하지 않는다.
다른 설명이 없다면, 아미노산 위치는 AHo 넘버링 체계에 따라 표시된다. AHo 넘버링 시스템은 다음 문헌에 상세히 기술되어 있다: Honegger, A. and Pluckthun, A. (2001) J Mol. Biol. 309:657-670. 선택적으로, Kabat 등의 문헌(Kabat, E. A., et al (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication No. 91-3242)에 상세히 기술된 Kabat 넘버링 시스템을 사용할 수 있다. 항체 중쇄 및 경쇄 가변 영역에서 아미노산 잔기 위치를 식별하는데 사용된 2개의 상이한 넘버링 시스템에 대한 전환표는 A. Honegger, J.Mol.Biol. 309 (2001) 657-670에 제공되어 있다.
첫 번째 양태에서, 본 발명은 다른 동물 종(species), 예를 들면 래빗으로부터의 CDR을 그래프팅하기 위한 보편적 수용체 프레임워크를 제공한다. 소위 "품질관리" 스크린(PCT 공개 번호 제WOO148017호)에서 식별된 인간 프레임워크를 포함하는 항체 또는 항체 유도체를 일반적으로 높은 안정성 및/또는 용해도로 특성화하는 것을 이전에 기술하였다. 인간 단일사슬 프레임워크 FW1.4 (서열 번호 1 (PCT 공개 번호 제WO03/097697호에서 a43으로 명명)와 서열 번호 2 (PCT 공개 번호 제WO03/097697호에서 KI27로 명명)의 조합물)가 품질관리 에세이에서 분명히 제기능을 발휘하지 못하였지만, 놀라웁게도 고유의 높은 열 안정성을 가지며, 또한 여러 가지 상이한 CDR과의 조합으로 생산가능한 것을 발견하였다. 이 분자의 안정성은 대개 그의 프레임워크 영역 때문이라고 할 수 있다. 또한 FW1.4는 본질적으로 래빗 항체의 항원 결합 부위와 높은 상용성이 있는 것으로 나타났다. 그러므로, FW1.4는 래빗 루프의 그래프팅에서 유도된 안정한 인간화된 scFv 항체 절편을 구성하는 적합한 스캐폴드이다. 따라서, 일 양태에서, 본 발명은 SEQ ID No. 1에 대하여 90% 이상의 동일성을 가지는 VH 서열 및/또는 SEQ ID No. 2에 대하여 85% 이상의 동일성을 가지는 VL 서열을 포함하는, 바람직하게는 래빗 CDR의 그래프팅을 위한 FWl.4 (서열 번호 3)의 서열 또는, 서열 번호 3에 대하여 60% 이상의 동일성, 바람직하게는 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 이상의 동일성을 가지는 서열을 포함하는, 면역결합체 수용체 프레임워크를 제공한다.
또한, FW1.4는 FW1.4의 중쇄에서 몇 개의 잔기 위치를 치환하거나 및/또는 FW1.4의 경쇄에서 1개 위치를 치환하여 최적화될 수 있는 것을 발견하였다. 그리하여, 놀라웁게도 VH 내의 다양한 래빗 CDR의 루프 입체구조가 공여체 프레임워크의 서열과는 별개로 잘 유지될 수 있는 것을 발견하였다. FW1.4의 경쇄 중의 1개 위치뿐만 아니라 중쇄 중의 상기 잔기는 래빗 항체에서 보존된다. 경쇄 중 1개 위치에서 뿐만 아니라 중쇄 중의 위치들에 대한 컨센서스 잔기는 래빗 레퍼토리에서 추론되었고 인간 수용체 프레임워크의 서열에 삽입되었다.
그 결과, 변성된 프레임워크 1.4(이하에서는 rFW1.4라 칭함.)는 사실상의 어느 래빗 CDR과도 상용될 수 있다. 또한, 상이한 래빗 CDR을 함유하는 rFW1.4는 래빗의 야생형 단일 사슬 보다 잘 발현되고 제조되며, 거의 완전하게 원래의 공여체 래빗 항체의 친화성을 보유한다.
따라서, 본 발명은 일반적으로 래빗 면역결합제에서 유도된 CDR의 입체구조를 지지하는 하나 이상의 아미노산 잔기를 추가로 포함하는, 서열 번호 1의 가변 중쇄 프레임워크를 제공한다. 특히, 상기 잔기는 24H, 25H, 56H, 82H, 84H, 89H 및 108H (AHo 넘버링)로 구성되는 군에서 선택된 하나 이상의 아미노산 위치에 존재한다. 이러한 위치들은 CDR 입체구조에 영향을 미치는 것이 입증되었으며, 따라서 공여체 CDR을 수용하는 돌연변이를 위한 것으로 생각된다. 바람직하기로는, 상기한 잔기 하나 이상이 다음으로 구성되는 군에서 선택된다: 위치 24의 트레오닌(T), 위치 25의 발린(V), 위치 56의 글리신 또는 알라닌(G 또는 A), 위치 82의 라이신(K), 위치 84의 트레오닌(T), 위치 89의 발린(V) 및 위치 108의 아르기닌(R)(AHo 넘버링). 바람직하기로는 3개 이상, 더욱 바람직하게는 4개, 5개, 6개 및 가장 바람직하게는 모두 7개 잔기가 존재한다. 놀라웁게도, 상기한 잔기들이 면역결합제의 안정성을 개선하는 것을 발견하였다.
바람직한 일 구현예에서, 본 발명은 서열 번호 4와 50% 이상의 동일성, 더욱 바람직하게는 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 이상, 보다 더 바람직하게는 100%의 동일성을 가지는 VH를 포함하는 면역결합제 수용체 프레임워크를 제공하며, 다만 위치 24의 트레오닌(T), 위치 25의 발린(V), 위치 56의 글리신 또는 알라닌(G 또는 A), 위치 84의 트레오닌(T), 위치 82의 라이신(K), 위치 89의 발린(V) 및 위치 108의 아르기닌(R)(AHo 넘버링)으로 구성된 군 중의 잔기 1개 이상, 더욱 바람직하게는 3개 이상, 더욱 바람직하게는 4개, 5개, 6개 및 가장 바람직하게는 7개 존재하는 것을 전제로 한다. 바람직한 일 구현예에서, 면역결합제 수용체 프레임워크는 래빗 CDR의 면역결합제 수용체 프레임워크이다.
바람직한 일 구현예에서, 상기 가변 중쇄 프레임워크는 서열 번호 4 또는 서열 번호 6이거나 이를 포함한다. 상기 가변 중쇄 프레임워크는 모두, 예를 들면 적합한 경쇄 프레임워크에 결합될 수 있다.
따라서, 본 발명은 다음을 포함하는 면역결합제 수용체 프레임워크를 제공한다:
(i) 서열 번호 4와 70% 이상, 바람직하게는 75%, 80%, 85%, 90% 이상, 더욱 바람직하게는 95% 이상의 동일성을 가지는 가변 중쇄 프레임워크; 및/또는
(ii) 서열 번호 2와 70% 이상, 바람직하게는 75%, 80%, 85%, 90% 이상, 더욱 바람직하게는 95% 이상의 동일성을 가지는 가변 경쇄 프레임워크.
보다 바람직한 일 구현예에서, 가변 중쇄 프레임워크는 위치 24에 트레오닌(T), 위치 56에 글리신(G), 위치 84에 트레오닌(T), 위치 89에 발린(V) 및 위치 108에 아르기닌(R)(AHo 넘버링)을 포함한다.
바람직한 일 구현예에서, 가변 경쇄는 위치 87(AHo 넘버링)에 트레오닌(T)을 포함한다.
바람직한 일 구현예에서, 상기 면역결합제 수용체 프레임워크는
(i) 서열 번호 1, 서열 번호 4 및 서열 번호 6으로 구성되는 군에서 선택된 가변 중쇄 프레임워크; 및/또는
(ii) 서열 번호 2 또는 서열 번호 9의 가변 경쇄 프레임워크를 포함한다.
바람직한 구현예에서, 가변 중쇄 프레임워크는 링커에 의해 가변 경쇄 프레임워크에 연결된다. 상기 링커는 적당한 링커일 수 있으며, 예를 들면 서열 GGGGS의 1 내지 4 반복물, 바람직하게는 (GGGGS)4 펩티드 (서열 번호 8)를 포함하는 링커이거나, 또는 Alfthan et al. (1995) Protein Eng. 8:725-731에 기술된 링커일 수 있다.
다른 바람직한 구현예에서, 면역결합제 수용체 프레임워크는 서열 번호 5와 70%, 75%, 80%, 85%, 90% 이상, 더욱 바람직하게는 95% 이상의 동일성을 가지는 서열이지만, 상기 서열이, 바람직하게는 서열 번호 3은 아니다. 더욱 바람직하게는 면역결합제 수용체 프레임워크는 서열 번호 5이거나 이를 포함한다.
다른 바람직한 구현예에서, 면역결합제 수용체 프레임워크는 서열 번호 7과 70%, 75%, 80%, 85%, 90% 이상, 더욱 바람직하게는 95% 이상의 동일성을 가지는 서열이지만, 상기 서열이, 바람직하게는 서열 번호 3은 아니다. 더욱 바람직하게는 면역결합제 수용체 프레임워크는 서열 번호 7이거나 이를 포함한다.
또한, 놀라웁게도 상기한 아미노산 모티프의 존재가 프레임워크, 바람직하게는 인간 프레임워크가 인간이 아닌 동물종의 CDR, 특히 래빗 CDR의 수용에 적합하게 하는 것을 발견하였다. 상기한 모티프는 면역결합제의 안정성에 부정적인 영향을 주지는 않는다. CDR은 래빗 면역결합제에서 이들의 원래 공간 배향과 유사한 입체구조로 주어진다; 그러므로 구조적으로 관련된 어떤 위치도 수용체 프레임워크 상에 그래프트될 필요가 없다. 따라서, 인간 또는 인간화된 면역결합제 수용체 프레임워크는 3개 이상의 아미노산, 바람직하게는 4개, 5개, 6개 및 더욱 바람직하게는 7개 아미노산을 다음으로 구성되는 군 중에서 포함한다: 위치 24의 트레오닌(T), 위치 25의 발린(V), 위치 56의 글리신 또는 알라닌(G 또는 A), 위치 84의 트레오닌(T), 위치 82의 라이신(K), 위치 89의 발린(V) 및 위치 108의 아르기닌(R)(AHo 넘버링).
여기에 기술된 면역결합제 수용체 프레임워크는 중쇄 프레임워크, 바람직하게는 위치 12, 103 및 144(AHo 넘버링)에 용해도를 강화하는 치환을 포함할 수 있다. 바람직하게는 소수성 아미노산을 보다 친수성인 아미노산에 의해 치환한다. 친수성 아미노산으로는, 예를 들면 아르기닌(R), 아스파라긴(N), 아스파르트산(D), 글루타민(Q), 글리신(G), 히스티딘(H), 라이신(K), 세린(S) 및 트레오닌(T)이 있다. 더욱 바람직하게, 중쇄 프레임워크는 (a) 위치 12의 세린(S); (b) 위치 103의 세린(S) 또는 트레오닌(T); 및/또는 (c) 위치 144의 세린(S) 또는 트레오닌(T)을 포함한다.
또한, 안정성 강화 아미노산은 가변 경쇄 프레임워크의 위치 1, 3, 4, 10, 47, 57, 91 및 103(AHo 넘버링)에서 하나 이상에 존재할 수 있다. 더욱 바람직하게, 가변 경쇄 프레임워크는 위치 1의 글루탐산(E), 위치 3의 발린(V), 위치 4의 루이신(L), 위치 10의 세린(S); 위치 47의 아르기닌(R), 위치 57의 세린(S), 위치 91의 페닐알라닌(F) 및/또는 위치 103의 발린(V)을 포함한다.
글루타메이트(Q)는 탈아미노화하기 쉽기 때문에, 다른 바람직한 구현예에서, VH는 위치 141에 글리신(G)을 포함한다. 이러한 치환은 단백질의 장기 저장을 개선할 수 있다.
예를 들면, 여기에 기술된 수용체 프레임워크는 비인간 CDR이 유도되는 비인간 항체의 결합 특성을 보유하는 인간 또는 인간화된 항체를 생성하는데 사용될 수 있다. 따라서, 바람직한 일 구현예에서, 본 발명은 여기에 기술된 면역결합제 수용체 프레임워크를 포함하며, 상기 프레임워크는 공여체 면역결합제, 바람직하게는 포유동물의 면역결합제, 더욱 바람직하게는 토끼목 면역결합제, 가장 바람직하게는 래빗의 중쇄 CDRl, CDR2 및 CDR3 및/또는 경쇄 CDRl, CDR2 및 CDR3를 추가로 포함한다. 그러므로, 일 구현예에서, 본 발명은
(i) 토끼목의 가변 경쇄 CDR; 및
(ii) 서열 번호 4와 50% 이상, 더욱 바람직하게는 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 이상, 가장 바람직하게는 100%의 동일성을 가지는 인간 가변 중쇄 프레임워크를 포함하는 목적하는 항원에 특이적인 면역결합제를 제공한다.
바람직한 일 구현예에서는, 위치 24의 트레오닌(T), 위치 25의 발린(V), 위치 56의 글리신 또는 알라닌(G 또는 A), 위치 84의 트레오닌(T), 위치 82의 라이신(K), 위치 89의 발린(V) 및 위치 108의 아르기닌(R)(AHo 넘버링)으로 구성되는 군에서 하나 이상의 아미노산이 상기 인간 가변 중쇄 프레임워크 서열에 존재하는 것을 조건으로 한다.
바람직하게, 상기 토끼목은 래빗이다. 더욱 바람직하게, 상기 면역결합제는 공여체 면역결합제의 중쇄 CDRl, CDR2 및 CDR3 및 경쇄 CDRl, CDR2 및 CDR3를 포함한다.
당분야에서 알려진 바와 같이, 많은 래빗 VH 사슬은 마우스와 인간 대응물과 관련한 추가의 쌍을 이루는 시스테인을 가진다. cys22와 cys92 사이에 형성된 보존된 디설파이드 결합 이외에 일부 래빗 사슬에서 CDRH1의 최종 잔기와 CDRH2의 최초 잔기 사이에 형성된 CDR간의 S-S 결합 뿐만 아니라 cys21-cys79 결합이 있다. 뿐만 아니라, CDR-L3 내에서 시스테인 잔기 쌍이 종종 발견된다. 또한, 많은 래빗 항체 CDR은 이미 알려진 표준 구조에 속하지 않는다. 특히 CDR-L3는 인간 또는 마우스 대응물의 CDR-L3 보다 훨씬 더 길다.
이전에 언급된 바와 같이, 비인간 CDR이 여기에 기술된 프레임워크에 그래프트되어 CDR이 적절한 입체구조로 나타내어지는 분자를 얻는다. 필요하다면, 면역결합제의 친화성은 비인간 공여체 면역결합제의 항원과 상호작용하는 프레임워크 잔기를 그래프팅하여 개선될 수 있다. 상기한 위치는, 예를 들면 다음과 같은 방법으로 식별할 수 있다:
(i) 각각의 생식세포계열 전구 서열을 확인하거나, 또는 선택적으로 고도로 상동인 프레임워크 서열의 경우에 컨센서스 서열을 사용하고;
(ii) 생식세포계열 전구 서열 또는 단계 (i)의 컨센서스 서열을 가지는 공여체 가변 도메인 서열의 서열 정렬을 생성하고; 및
(iii) 상이한 잔기를 식별한다.
분자 표면 상의 상이한 잔기들은 많은 경우에서 생체 내에서 친화성 생성 과정 동안 돌연변이되어서 항원에 대한 친화성을 생성하는 것으로 보인다.
다른 양태에서, 본 발명은 여기에 기술된 면역결합제 수용체 프레임워크를 포함하는 면역결합제를 제공한다. 상기 면역결합제는, 예를 들면 scFv 항체, 전체 길이 면역글로불린, Fab 절편, Dab 또는 Nanobody이다.
바람직한 일 구현예에서, 면역결합제는 하나 이상의 분자, 예를 들면 세포독성제, 사이토카인, 케모카인, 성장인자 또는 다른 시그널링 분자 등의 치료제, 조영제 또는, 전사활성인자 또는 DNA-결합 도메인 등의 2차 단백질에 결합된다.
여기에 기술된 면역결합제는, 예를 들면 진단방법, 치료방법, 타겟 확인 또는 유전자 요법에 사용될 수 있다.
본 발명은 또한 여기에 기술된 면역결합제 수용체 프레임워크 또는 여기에 기술된 면역결합제를 코딩하는 단리된 핵산을 제공한다.
다른 구현예에서, 여기에 기술된 핵산을 포함하는 벡터가 제공된다.
여기에 기술된 상기 핵산 또는 벡터는, 예를 들면 유전자 요법에 사용될 수 있다. 본 발명은 또한 여기에 기술된 벡터 및/또는 핵산을 포함하는 숙주 세포를 포함한다.
또한, 여기에 기술된 면역결합제 수용체 프레임워크, 여기에 기술된 면역결합제, 여기에 기술된 단리된 핵산 또는 여기에 기술된 벡터를 포함하는 조성물을 제공한다.
여기에 기술된 서열들은 다음과 같다(X 잔기는 CDR 삽입 부위이다.):
*
Figure pat00001
Figure pat00002
다른 양태에서, 본 발명은 비인간 공여체 항체의 CDR을 안정하고 가용성인 항체 프레임워크에 그래프팅하여 비인간 항체를 인간화하는 방법을 제공한다. 특히 바람직한 구현예에서, 래빗 항체와 프레임워크의 CDR 스템은 상기한 것들이다.
CDR을 인간 수용체 프레임워크에 그래프팅하는 일반적인 방법은 Winter의 미국 특허 제5,225,539호와 Queen 등의 PCT 공개 번호 제WO9007861 Al호에 기술되어 있으며, 이들 전체는 참조를 위해 여기에 포함되어 있다. 래빗 모노클로날 항체의 CDR을 선택된 프레임워크에 그래프팅하는 일반적 전략은 Winter 등 및 Queen 등과 연관되어 있지만, 핵심 관점은 달리한다. 특히, 본 발명의 방법은 여기에 기술된 인간 항체 프레임워크가 인간 또는 비인간 공여체 항체에 대한 보편적인 수용체로서 특히 적합한 당분야에서 알려진 전형적인 Winter 및 Queen 방법과는 다르다. 그러므로, Winter 및 Queen의 일반적인 방법과는 달리, 본 발명의 인간화 방법에 사용되는 프레임워크 서열은 공여체 CDR이 유도되는 비인간(예를 들면, 래빗) 항체의 서열에 대하여 가장 큰 서열 유사성을 나타내는 프레임워크 서열일 필요는 없다. 또한 CDR 입체구조를 지지하는 공여체 서열로부터의 프레임워크 잔기 그래프팅을 필요로 하지 않는다. 기껏해야 프레임워크 내에 위치한 항원 결합 아미노산 또는 체세포 초돌연변이 동안 발생한 다른 돌연변이가 삽입될 수 있다.
높은 용해도와 안정성을 가지는 인간화된 래빗에서 유도된 항체를 생성하는 그래프팅 방법을 이하에서 상세하게 기술하였다.
따라서, 본 발명은 중쇄 CDRl, CDR2 및 CDR3 서열 및/또는 경쇄 CDRl, CDR2 및 CDR3 서열을 포함하는 래빗 CDR 공여체 면역결합제의 인간화 방법을 제공한다. 상기 방법은 다음 단계를 포함한다:
(i) CDRl, CDR2 및 CDR3 서열로 구성되는 군 중의 중쇄 CDR 1개 이상, 바람직하게는 2개, 더욱 바람직하게는 3개를 서열 번호 1과 50% 이상, 바람직하게는 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90% 이상, 더욱 바람직하게는 95% 이상의 동일성을 가지는 인간 중쇄 수용체 프레임워크에 그래프팅하는 단계; 및/또는
(ii) CDRl, CDR2 및 CDR3 서열로 구성되는 군 중의 경쇄 CDR 1개 이상, 바람직하게는 2개, 더욱 바람직하게는 3개를 사람 경쇄 수용체 프레임워크에 그래프팅하는 단계(여기에서 상기 사람 경쇄 프레임워크는 서열 번호 2와 50% 이상, 바람직하게는 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90% 이상, 더욱 바람직하게는 95% 이상의 동일성을 가진다.).
바람직한 일 구현예에서, 가변 사슬 수용체 프레임워크는 (i) 서열 번호 1, 서열 번호 4 및 서열 번호 6으로 구성되는 군에서 선택된 프레임워크 아미노산 서열을 포함하는 인간 중쇄 프레임워크 및 (ii) 서열 번호 2 또는 서열 번호 9의 프레임워크 아미노산 서열을 포함하는 인간 경쇄 프레임워크를 포함한다.
특히 바람직한 구현예에 있어서, 본 발명은 (i) 중쇄 CDRl, CDR2 및 CDR3 서열을 중쇄에 그래프팅하는 단계; 및 (ii) 경쇄 CDRl, CDR2 및 CDR3 서열을 서열 번호 3, 서열 번호 5 또는 서열 번호 7과 75%, 80%, 85%, 90% 이상, 더욱 바람직하게는 95% 이상의 동일성을 가지는 면역결합제의 경쇄에 그래프팅하는 단계를 포함한다. 더욱 바람직하게는 상기 면역결합제는 서열 번호 3, 서열 번호 5 또는 서열 번호 7이거나 또는 이를 포함한다.
다른 구현예에서, 항원 결합을 개선하기 위해서 본 발명의 방법은 수용체 프레임워크 잔기를 항원 결합과 연관된 공여체 잔기로 치환하는 단계를 추가로 포함한다.
본 발명의 방법에 대한 예시적인 구현예에서, CDR 공여체 항체의 아미노산 서열을 먼저 확인하고 상기 서열을 종래의 서열 정렬 수단(예를 들면, Needleman-Wunsch 알고리즘 및 Blossum 매트릭스)을 사용하여 정렬한다. 갭의 삽입과 잔기 위치의 명명은 종래의 항체 넘버링 시스템을 사용하여 실시할 수 있다. 예를 들면, 면역글로불린 가변 도메인에 대하여는 AHo 넘버링 시스템을 사용할 수 있다. Kabat 넘버링 체계를 적용할 수도 있으며, 이 체계는 항체의 잔기를 넘버링하는데 있어서 가장 널리 적용되는 기준이다. Kabat 넘버링은, 예를 들면 SUBIM 프로그램을 사용하여 부여될 수 있다. 이 프로그램은 항체 서열의 가변영역을 분석하고 Kabat 및 공동작업자들이 구축한 시스템(Deret et al 1995)에 따라 상기 서열에 번호를 매긴다. 프레임워크와 CDR 영역의 정의는 서열의 가변성에 기초하고 가장 보편적으로 사용되는 Kabat 정의에 따라 일반적으로 실시된다. 그러나, CDR-H1에 대하여는 Kabat의 정의, 3D 컴플렉스 구조 서브세트 중의 항체와 항원 간의 접촉을 분석하여 생성되는 평균 접촉 데이터(MacCallum et al., 1996) 및 구조적 루프 영역의 위치에 기초하는 Chotia의 정의를 조합하여 지정하는 것이 바람직하다(도 1 참조). 항체 중쇄 및 경쇄 가변영역의 아미노산 잔기 위치를 식별하는데 사용되는 2개의 상이한 넘버링 시스템에 대한 변환표는 A. Honegger, J.Mol.Biol. 309 (2001) 657-670에 제공되어 있다. Kabat 넘버링 시스템은 Kabat 등의 문헌(Kabat, E. A., et al. (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication No. 91-3242)에 상세히 기술되어 있다. AHo 넘버링 시스템은 Honegger, A. and Pluckthun, A. (200I) J. Mol. Biol. 309:657-670)에 상세히 기술되어 있다.
래빗 모노클로날 항체의 가변 도메인은, 예를 들면 서열 분석 알고리즘의 EXCEL 실행과 인간 항체 레퍼토리(Knappik et al., 2000, J. Mol. Biol. Feb 11 ;296(l):57-86)의 분석에 기초한 분류 방법을 사용하여 상응하는 인간 서브그룹으로 분류될 수 있다.
CDR 입체구조는 공여체 항원 결합 영역에 주어진 다음, 상이한 표준구조를 유지하는데 필요한 잔기 위치를 확인할 수 있다. 래빗 항체의 6개 항체 초가변영역 중 5개(Ll, L2, L3, Hl and H2)에 대한 CDR 표준구조를 Chothia (1989) 정의를 사용하여 결정하였다.
바람직한 일 구현예에서, CDR을 다음 방법에 따라 생성하고 확인하여 단리하였다: B-세포, 바람직하게는 래빗 B-세포를 (i) 표적 항원(바람직하게는 정제된)과 또는 (ii) 표면에서 표적 항원을 발현하는 세포와 인큐베이션한다.
상기 (ii)의 경우에, 표적 항원을 발현하는 상기 세포는, 예를 들면 포유동물 세포, 바람직하게는 CHO 또는 HEK293 세포, 효모 세포, 바람직하게는 효모 스페로블라스트(spheroblast), 또는 선택된 표적을 자연적으로 발현하거나 또는 그 표면에서 표적 단백질을 발현하기 위해 변성된 박테리아 세포일 수 있다. 발현시, 표적 항원은 세포막에 통합되거나 부착된 세포 표면에서 발현될 수 있다. 상기 세포들은, 예를 들면 세포 배양액 내에서 단리된 균주로서 배양되거나, 또는 이들의 자연적 환경, 예를 들면 조직, 기관 또는 개체로부터 단리될 수 있다.
표적 항원이 세포 표면 상에서 발현되면, 즉 케이스(ii)는 막통과 단백질에 대해 특히 바람직하며, GPCR (G 단백질 결합 리셉터) 또는 이온 채널 등의 다중막 스패닝 단백질 또는 원래의 입체구조가 재조합 발현 및 정제 시에 유지되는 것이 어려운 다른 단백질에 보다 더 바람직하다. 재조합 단백질을 사용하는 전통적인 면역화방법은 정제 과정에서 완전 막 단백질/복합체의 원래 입체구조를 상실하고 순수 단백질 양이 부족하기 때문에 상기한 경우들에 있어서는 권장할 수 없거나 불가능하다. 본 발명의 바람직한 일 구현예에서, 포유동물, 바람직하게 래빗은 재조합 단백질 대신에 DNA로, 예를 들면 PCT 국제 공개 제WO2004/087216호에 기술된 DNA 접종 전략에 의해 면역화된다. DNA 접종은 원래 항원에 대해 급속한 면역반응을 유발한다. 재조합 단백질이 필요없기 때문에, 이 방법은 비용면에서 매우 효율적이고, 다른 한편으로 또한 중요한 측면으로 이 방법은 완전 막 복합체 및/또는 다중막 스패닝 막 단백질의 자연적 발현이 가능하다. B-세포를 상기한 면역된 포유동물, 바람직하게 상기 래빗에서 단리할 수 있으며, 또는 선택적으로 나이브(naive) B-세포이다.
상기 방법의 다음 단계에서, B-세포, 바람직하게는 메모리 B-세포는 면역화된 동물, 바람직하게는 면역된 래빗의 림프 기관(비장 또는 림프절 등)에서 단리된다. B-세포를 그 표면에서 항원을 발현하는 세포 또는 형광물질로 표지된 가용성 항원과의 혼합물로 인큐베이션 한다. 그 표면에서 표적 특이적 항체를 발현하고, 그 결과 표적 항원 또는 세포 표면에서 발현된 표적 항원과 결합하는 B-세포를 단리한다. 보다 더 바람직한 구현예에서, B-세포 및/또는 표적 세포를 염색하여 B-세포/표적 세포 또는 B-세포/항원 복합체의 소팅(sorting)에 기초한 유동세포분석법에 의해 단리한다. 유동세포분석법(Flow cytometry)은 일반적으로 단일 세포들이 레이저 광선을 통과할 때 단일 세포에 의해 방출되는 형광물질을 측정한다. 그러나, 일부 연구원들은 세포-세포 상호작용, 예를 들면 cadherins (Panorchan et al, 2006, J. Cell Science, 1 19, 66-74; Leong et Hibma, 2005, J. Immunol. Methods, 302, 116-124) 또는 integrins (Gawaz et al, 1991, J. Clin. Invest, 88, 1128-1134)에 의해 매개된 접착을 연구하기 위해 이미 세포측정기를 사용하였다. 따라서, (ii)의 경우에, 선택 표적을 발현하는 세포는 세포내 형광염료(예를 들면, calcein)로 염색된다. B-세포는 세포 표면 특이적 마커와 결합하는 형광성 항체로 염색된다. 그러므로, 이중 색상 "이벤트"를 선택할 수 있으며, B-세포 리셉터-표적물의 상호작용을 통해서 서로 접착되어 있는 2개의 세포로 구성되어 있다(도 2 참조).
IgG가 일반적으로 IgM 보다 친화성이 더 높기 때문에, 바람직하게, 표면상에서 IgM이 아니라 IgG를 발현하는 양성 B-세포(메모리 B-세포의 특징)가 선택된다. 상기한 목적으로 다중색상 염색이 바람직하게 사용되며, IgG와 IgM에 특이적인 항체는, 예를 들면 APC와 FITC 각각으로 별도로 표지된다.
특정한 일 구현예에서, B-세포 소팅의 판독은 이러한 상호작용 능력에 대해 선택하여 리셉터 시그널링을 작용적으로 차단/활성화할 수 있다. 예를 들면, B-세포를 GPCR(G 단백질과 결합된 리셉터)을 작용적으로 발현하는 세포와 인큐베이션할 수 있다. GPCR을 통해서 신호를 보내는 아고니스트는 상기 혼합물에 첨가되어 GPCR과 매개된 Ca2+ 유출을 소포체로부터 유발할 수 있다. B-세포 상에 나타난 항체가 아고니스트 시그널링을 작용적으로 차단하게 되는 경우, 결과적으로 Ca2+ 유출은 이러한 세포-세포 상호작용에 의해 차단된다. Ca2+ 유출을 유동세포분석법에 의해 정량적으로 측정할 수 있다. 그러므로, Ca2+ 유출에서 증가 또는 감소를 보이는 B-세포/표적 세포 집괴만을 분류해 낼 수 있다.
적당한 조건 하에서 B-세포를 배양하여 항체가 배지에 분비된 후 선택 단계를 수행한다. 생산된 항체는 모노클로날 항체이다. 배양은 흉선종(thymoma) 헬퍼 세포주와 같은 헬퍼 세포주 사용(예를 들면, EL4-B5, Zubler et al, 1985, J. Immunol., 134(6): 3662-3668 참조)을 포함할 수 있다. 바람직하게, 확인 단계는 생성된 항체를 표적물과의 특이적 결합, 예를 들면 표적 단백질 이외의 세포 표면에서 발현되는 단백질에 특이적인 항체를 배제하는 것을 시험하여 수행된다. 예를 들면, CELISA, 즉 코팅 단계를 전체 세포로 수행하는 변성된 효소면역측정법(ELISA)이 이러한 목적에 적합하다. 이러한 방법으로 리간드와 경쟁하는 항체의 선택성과 능력을 평가할 수 있다.
상기한 단계에서 생성된 항체를 분석하여 상기 항체의 CDR을 식별한다. 여기에는 항체를 정제하고 이들의 아미노산 서열 및/또는 핵산 서열을 밝히는 단계가 포함될 수 있다.
최종적으로, 상기 CDR은 수용체 프레임워크에, 예를 들면 올리고 연장방법을 포함하는 유전자 합성에 의해, 바람직하게는 상기한 수용체 프레임워크 상에 그래프트될 수 있다. 일 구현예에서, CDR을 그래프팅하는 공지된 방법을 사용하여 수용체 프레임워크에 공여체 CDR을 전달할 수 있다. 대부분의 경우에, 중쇄로부터 유래한 3개 CDR 모두를 공여체 항체에서 단일 수용체 프레임워크로 이식하고 경쇄에서 유래하는 CDR 모두를 상이한 수용체 프레임워크에 이식한다. 일부 CDR은 항원과의 결합에 연관되지 않을 수도 있고 상이한 서열(및 동일한 길이)을 가지는 CDR은 동일한 폴딩을 가질 수 있으므로(따라서 항원에서 주쇄 컨택트까지의 접촉이 상이한 서열에도 불구하고 유지될 수 있으므로) 모든 CDR을 이식하는 것이 항상 필요하지는 않을 것으로 예상된다. 실제로 단일 도메인(Ward et al, 1989, Nature 341, pp.544-546) 또는 단일 CDR(R. Taub et al, 1989, J. Biol Chem 264, pp.259-265)도 항원 결합활성만을 가질 수 있다. 그러나, CDR 모두가 또는 일부만이 이식되든지 간에 CDR 그래프팅의 목적은 동물에서 인간 항체에 CDR, 또는 더 많은 CDR 항원 결합부위를 이식하는 것이다(예를 들면, 미국 특허 제5,225,539호 (Winter) 참조).
다른 구현예에 있어서, 공여체 항체의 CDR은 수용체 프레임워크에 이들을 결합하기 전 또는 후에 변경될 수 있다.
선택적으로, 항체의 특성화는 이들의 최종 면역결합제 형태에서만 수행된다. 이러한 방법에 있어서, 소팅된 B-세포 상에서 발현된 항체의 CDR 서열은 배양된 소팅된 B-세포 또는 소팅된 단일 B-세포에서 직접 RT-PCR로 회수된다. 이러한 목적을 위해서는 B-세포의 증식 및/또는 상기한 확인 단계 및/또는 상기한 분석이 필요하지 않을 수도 있다. 하나의 올리고뉴클레오티드 풀이 상기 CDR을 코딩하고 두 번째 풀이 적당한 면역결합제 스캐폴드의 프레임워크 영역을 코딩하는 부분적으로 오버래핑되는 올리고뉴클레오티드 2개 풀을 합하여 원스텝 PCT 방법에서 인간화된 면역결합제를 제조한다. 대량 시퀀싱, 클로닝 및 생산이 세포 배양물 상징액 중에서 분비된 IgG를 특성화하는 대신에 인간화된 정제 면역결합제의 실시에 기초한 클론 선택을 수행할 수 있다. 이들의 바람직한 일 구현예에서, 면역결합제는 scFv이다.
그러나, 항원과 접촉하는 프레임워크 잔기로 인하여 CDR의 그래프팅이 생성된 면역결합제의 항원에 대한 손상된 친화성을 유발할 수 있다. 이러한 상호작용은 체세포초돌연변이의 결과일 수 있다. 따라서 여전히 이러한 공여체 프레임워크 아미노산을 인간화된 항체의 프레임워크에 그래프트하는 것이 필요할 수 있다. 항원 결합과 연관된 비인간 면역결합제로부터의 아미노산 잔기를 래빗 모노클로날 항체 가변영역 서열과 구조를 시험하여 확인할 수 있다. 생식세포와는 다른 CDR 공여체 프레임워크 내의 각 잔기들은 관련이 있는 것으로 간주된다. 가장 가까운 생식세포를 구축할 수 없다면, 서열들을 서브그룹의 컨센서스 또는 유사성 비율이 높은 래빗 서열의 컨센서스에 대해 비교할 수 있다. 극소 프레임워크 잔기는 체세포 초돌연변이의 가능한 결과로, 따라서 결합 내에서 어떤 역할을 하는 것으로 생각된다.
본 발명의 항체는 강화된 작용 특성, 예를 들면 강화된 용해도 및/또는 안정성을 나타내도록 추가로 최적화될 수 있다. 임의의 구현예에서, 본 발명의 항체는 2008년 3월 12일자로 출원된, "단일 사슬 항체의 서열에 기초한 조작 및 최적화(Sequence Based Engineering and Optimization of Single Chain Antibodies)"을 발명의 명칭으로 하는, 참조를 위해 그 내용이 여기에 포함된 PCT 출원 제PCT/EP2008/001958호에 기술된 "작용성 컨센서스" 방법에 따라 최적화된다.
예를 들면, 본 발명의 면역결합제를 면역결합제의 상응하는 위치 보다 가변성에 대한 내성이 더 많거나 적은 아미노산 잔기를 확인하는데 사용되는 작용적으로 선택된 scFv의 데이터베이스로 비교하므로써 이러한 확인된 잔기 위치가 안정성 및/또는 용해도 등의 작용성을 개선하는 조작에 적합한 것임을 나타낸다.
치환에 대한 예시적인 프레임워크 잔기 위치와 예시적인 프레임워크 치환은 2008년 6월 25일자로 출원된, "항체의 변성방법, 및 작용 특성이 개선된 변성 항체 (Methods of Modifying Antibodies, and Modified Antibodies with Improved Functional Properties)"를 발명의 명칭으로 하는 PCT 출원 제PCT/CH2008/000285호와 2008년 6월 25일자로 출원된, "단일 사슬 항체의 서열에 기초한 조작 및 최적화(Sequence Based Engineering and Optimization of Single Chain Antibodies)"를 발명의 명칭으로 하는 PCT 출원 제PCT/CH2008/000284호에 기술되어 있다. 예를 들면, 본 발명의 면역결합제의 중쇄 가변영역의 아미노산 위치(이하에 열거된 각각의 아미노산 위치에 대하여는 AHo 넘버링을 참조한다.)에 하기한 치환의 하나 이상을 삽입할 수 있다:
(a) 아미노산 위치 1에 Q 또는 E;
(b) 아미노산 위치 6에 Q 또는 E;
(c) 아미노산 위치 7에 T, S 또는 A, 더욱 바람직하게는 T 또는 A, 보다 더 바람직하게는 T;
(d) 아미노산 위치 10에 A, T, P, V 또는 D, 더욱 바람직하게는 T, P, V 또는 D;
(e) 아미노산 위치 12에 L 또는 V, 더욱 바람직하게는 L;
(f) 아미노산 위치 13에 V, R, Q, M 또는 K, 더욱 바람직하게는 V, R, Q 또는 M;
(g) 아미노산 위치 14에 R, M, E, Q 또는 K, 더욱 바람직하게는 R, M, E 또는 Q, 보다 더 바람직하게는 R 또는 E;
(h) 아미노산 위치 19에 L 또는 V, 더욱 바람직하게는 L;
(i) 아미노산 위치 20에 R, T, K 또는 N, 더욱 바람직하게는 R, T 또는 N, 보다 더 바람직하게는 N;
(j) 아미노산 위치 21에 I, F, L 또는 V, 더욱 바람직하게는 I, F 또는 L, 보다 더 바람직하게는 I 또는 L;
(k) 아미노산 위치 45에 R 또는 K, 더욱 바람직하게는 K;
(1) 아미노산 위치 47에 T, P, V, A 또는 R, 더욱 바람직하게는 T, P, V 또는 R, 보다 더 바람직하게는 R;
(m) 아미노산 위치 50에 K, Q, H 또는 E, 더욱 바람직하게는 K, H 또는 E, 보다 더 바람직하게는 K;
(n) 아미노산 위치 55에 M 또는 I, 더욱 바람직하게는 I;
(o) 아미노산 위치 77에 K 또는 R, 더욱 바람직하게는 K;
(p) 아미노산 위치 78에 A, V, L 또는 I, 더욱 바람직하게는 A, L 또는 I, 보다 더 바람직하게는 A;
(q) 아미노산 위치 82에 E, R, T 또는 A, 더욱 바람직하게는 E, T 또는 A, 보다 더 바람직하게는 E;
(r) 아미노산 위치 86에 T, S, I 또는 L, 더욱 바람직하게는 T, S 또는 L, 보다 더 바람직하게는 T;
(s) 아미노산 위치 87에 D, S, N 또는 G, 더욱 바람직하게는 D, N 또는 G, 보다 더 바람직하게는 N;
(t) 아미노산 위치 89에 A, V, L 또는 F, 더욱 바람직하게는 A, V 또는 F, 보다 더 바람직하게는 V;
(u) 아미노산 위치 90에 F, S, H, D 또는 Y, 더욱 바람직하게는 F, S, H 또는 D;
(v) 아미노산 위치 92에 D, Q 또는 E, 더욱 바람직하게는 D 또는 Q, 보다 더 바람직하게는 D;
(w) 아미노산 위치 95에 G, N, T 또는 S, 더욱 바람직하게는 G, N 또는 T, 보다 더 바람직하게는 G;
(x) 아미노산 위치 98에 T, A, P, F 또는 S, 더욱 바람직하게는 T, A, P 또는 F, 보다 더 바람직하게는 F;
(y) 아미노산 위치 103에 R, Q, V, I, M, F, 또는 L, 더욱 바람직하게는 R, Q, I, M, F 또는 L, 보다 더 바람직하게는 Y, 보다 더 바람직하게는 L; 및
(z) 아미노산 위치 107에 N, S 또는 A, 더욱 바람직하게는 N 또는 S, 보다 더 바람직하게는 N.
추가로 또는 선택적으로, 다음 치환 중 하나 이상을 본 발명의 면역결합제의 경쇄 가변영역에 삽입할 수 있다:
(aa) 아미노산 위치 1에 Q, D, L, E, S, 또는 I, 더욱 바람직하게는 L, E, S 또는 I, 보다 더 바람직하게는 L 또는 E;
(bb) 아미노산 위치 2에 S, A, Y, I, P 또는 T, 더욱 바람직하게는 A, Y, I, P 또는 T, 보다 더 바람직하게는 P 또는 T;
(cc) 아미노산 위치 3에 Q, V, T 또는 I, 더욱 바람직하게는 V, T 또는 I, 보다 더 바람직하게는 V 또는 T;
(dd) 아미노산 위치 4에 V, L, I 또는 M, 더욱 바람직하게는 V 또는 L;
(ee) 아미노산 위치 7에 S, E 또는 P, 더욱 바람직하게는 S 또는 E, 보다 더 바람직하게는 S;
(ff) 아미노산 위치 10에 T 또는 I, 더욱 바람직하게는 I;
(gg) 아미노산 위치 11에 A 또는 V, 더욱 바람직하게는 A;
(hh) 아미노산 위치 12에 S 또는 Y, 더욱 바람직하게는 Y;
(ii) 아미노산 위치 14에 T, S 또는 A, 더욱 바람직하게는 T 또는 S, 보다 더 바람직하게는 T;
(jj) 아미노산 위치 18에 S 또는 R, 더욱 바람직하게는 S;
(kk) 아미노산 위치 20에 T 또는 R, 더욱 바람직하게는 R;
(11) 아미노산 위치 24에 R 또는 Q, 더욱 바람직하게는 Q;
(mm) 아미노산 위치 46에 H 또는 Q, 더욱 바람직하게는 H;
(nn) 아미노산 위치 47에 K, R 또는 I, 더욱 바람직하게는 R 또는 I, 보다 더 바람직하게는 R;
(oo) 아미노산 위치 50에 R, Q, K, E, T, 또는 M, 더욱 바람직하게는 Q, K, E, T 또는 M;
(pp) 아미노산 위치 53에 K, T, S, N, Q 또는 P, 더욱 바람직하게는 T, S, N, Q 또는 P;
(qq) 아미노산 위치 56에 I 또는 M, 더욱 바람직하게는 M;
(rr) 아미노산 위치 57에 H, S, F 또는 Y, 더욱 바람직하게는 H, S 또는 F;
(ss) 아미노산 위치 74에 I, V 또는 T, 더욱 바람직하게는 V 또는 T, R, 보다 더 바람직하게는 T;
(tt) 아미노산 위치 82에 R, Q 또는 K, 더욱 바람직하게는 R 또는 Q, 보다 더 바람직하게는 R;
(uu) 아미노산 위치 91에 L 또는 F, 더욱 바람직하게는 F;
(vv) 아미노산 위치 92에 G, D, T 또는 A, 더욱 바람직하게는 G, D 또는 T, 보다 더 바람직하게는 T;
(xx) 아미노산 위치 94에 S 또는 N, 더욱 바람직하게는 N;
(yy) 아미노산 위치 101에 F, Y 또는 S, 더욱 바람직하게는 Y 또는 S, 보다 더 바람직하게는 S; 및
(zz) 아미노산 위치 103에 D, F, H, E, L, A, T, V, S, G 또는 I, 더욱 바람직하게는 H, E, L, A, T ,V, S, G 또는 I. 보다 더 바람직하게는 A 또는 V.
다른 구현예에서, 본 발명의 면역결합제는 2008년 6월 25일자로 출원된, "면역결합제의 용해도 최적화(Solubility Optimization of Immunobinder)"를 발명의 명칭으로 하는 미국 가특허출원 제61/075,692호에 기술된 안정성 강화 돌연변이를 하나 이상 포함한다. 임의의 바람직한 구현예에서, 상기 면역결합제는 중쇄 아미노산 위치 12, 103 및 144(AHo 넘버링)로 구성되는 군으로부터 선택되는 아미노산 위치에서의 용해도 강화 돌연변이를 포함한다. 바람직한 일 구현예에서, 상기 면역결합제는 (a) 중쇄 아미노산 위치 12에 세린(S) ; (b) 중쇄 아미노산 위치 103에 세린(S) 또는 트레오닌(T); 및 (c) 중쇄 아미노산 위치 144에 세린(S) 또는 트레오닌(T)으로 구성되는 군으로부터 선택되는 하나 이상의 치환을 포함한다. 다른 구현예에서, 상기 면역결합제는 다음 치환을 포함한다: (a) 중쇄 아미노산 위치 12에 세린(S) ; (b) 중쇄 아미노산 위치 103에 세린(S) 또는 트레오닌(T); 및 (c) 중쇄 아미노산 위치 144에 세린(S) 또는 트레오닌(T).
임의의 바람직한 구현예에서, 면역결합제는 AHo 넘버링 시스템에 따라 경쇄 가변영역의 위치 1, 3, 4, 10, 47, 57, 91 및 103 중 하나 이상에서 경쇄 수용체 프레임워크의 프레임워크 잔기에 용해도 강화 돌연변이를 포함한다. 바람직한 일 구현예에서, 경쇄 수용체 프레임워크는 (a) 위치 1에 글루탐산(E), (b) 위치 3에 발린(V), (c) 위치 4에 루이신(L); (d) 위치 10에 세린(S); (e) 위치 47에 아르기닌(R); (e) 위치 57에 세린(S); (f) 위치 91에 페닐알라닌(F); 및 (g) 위치 103에 발린(V)으로 구성되는 군에서 선택된 하나 이상의 치환을 포함한다.
상기한 돌연변이를 포함하는 인간화된 항체를 제조하기 위한 다양한 방법을 사용할 수 있다.
따라서, 본 발명은 상기한 방법에 따라 인간화된 면역결합제를 제공한다.
임의의 바람직한 구현예에서 상기 면역결합제의 표적 항원은 VEGF 또는 TNFα이다.
본 발명에 기술된 또는 본 발명의 방법에 의해 생성되는 폴리펩티드는, 예를 들면 당분야에서 알려진 기술을 사용하여 합성될 수 있다. 선택적으로, 목적하는 가변영역을 코딩하는 핵산 분자를 합성하고 폴리펩티드를 재조합 방법에 의해 제조한다.
예를 들면, 인간화된 가변영역의 서열을 결정하면, 그 가변영역 또는 이를 포함하는 폴리펩티드를 분자 생물학 분야에서 알려진 기술에 의해 제조할 수 있다. 보다 상세하게는, 재조합 DNA 기술을 사용하여 숙주 세포를 핵산 서열(예를 들면, 목적하는 가변영역을 코딩하는 DNA 서열(예를 들면, 변성된 중쇄 또는 경쇄; 이들의 가변 도메인, 또는 이들의 다른 항원 결합 절편))로 형질전환하여 다양한 폴리펩티드를 제조할 수 있다.
일 구현예에서, VH 또는 VL 중 하나 이상을 코딩하는 DNA 서열에 작동가능하게 연결된 프로모터를 포함하는 발현벡터를 제조할 수 있다. 필요하다면 또는 원한다면, 상보성 가변 도메인을 코딩하는 DNA 서열에 작동가능하게 연결된 프로모터를 포함하는 2차 발현벡터를 제조할 수 있다(즉, 모발현벡터는 VH를 코딩하고, 2차 발현벡터는 VL을 코딩하고 그 반대로도 할 수 있다). 세포주(예를 들면, 불멸화된 포유동물 세포주)는 하나 또는 2개의 상기 발현벡터로 형질전환될 수 있으며 키메릭 가변 도메인 또는 키메릭 항체의 발현을 허용하는 조건 하에서 배양된다(예를 들면, PCT 출원 제PCT/GB85/00392호(Neuberger 등) 참조).
일 구현예에서, 공여체 CDR 및 수용체 FR 아미노산 서열을 포함하는 가변영역을 제조하고, 이후 변화를 핵산 분자에 삽입하여 CDR 아미노산 치환을 생성한다.
폴리펩티드의 아미노산 서열 변이체를 코딩하는 핵산 분자를 제조하는 공지된 방법의 예로는, 제한적인 것은 아니나, 부위 특이적(또는 올리고뉴클레오티드와 매개된) 돌연변이, PCR 돌연변이, 및 폴리펩티드를 코딩하는 미리 준비된 DNA의 카세트 돌연변이 등이 있다.
부위 특이적 돌연변이가 치환 변이체를 제조하는 바람직한 방법이다. 이 방법은 당분야에서 잘 알려져 있다(예를 들면, Carter et al. Nucleic Acids Res. 13:4431-4443 (1985) and Kunkel et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:488 (1987) 참조). 요약하면, DNA의 부위 특이적 돌연변이를 실시하는데 있어서, 모DNA는 목적하는 돌연변이를 코딩하는 올리고뉴클레오티드를 상기한 DNA의 단일 가닥에 먼저 혼성화하여 변성된다. 혼성화한 후, DNA 폴리머라제를 사용하여 전체 2차 가닥을 합성하고 혼성된 올리고뉴클레오티드를 프라이머로, 모DNA의 단일 가닥을 템플레이트로 사용한다. 따라서, 목적하는 돌연변이를 코딩하는 올리고뉴클레오티드는 생성된 이중가닥 DNA에 포함된다.
PCR 돌연변이도 폴리펩티드의 아미노산 서열 변이체를 만드는데 적당하다. 이 방법은 문헌, Higuchi, in PCR Protocols, pp.177- 183 (Academic Press, 1990); and Vallette et al., Nuc. Acids Res. 17:723-733 (1989)를 참조할 수 있다. 요약하면, 소량의 템플레이트 DNA를 PCR의 출발물질로 사용하였을 때, 템플레이트 DNA 내의 상응하는 영역과 서열이 약간 다른 프라이머를 사용하여 프라이머가 템플레이트와 다른 위치에서만 템플레이트 서열이 다른 특이적 DNA 절편의 상대적으로 많은 양을 제조할 수 있다.
변이체를 제조하는 다른 방법인 카세트 돌연변이는 Wells 등의 기술(Gene 34:315-323 (1985))에 기초하고 있다. 출발물질은 돌연변이될 DNA를 포함하는 플라스미드(또는 다른 벡터)이다. 돌연변이될 모DNA에서 코돈(들)을 식별한다. 식별된 돌연변이 부위(들)의 각 면에 독특한 제한 엔도뉴클레아제 부위가 있어야만 한다. 이러한 제한부위가 없다면, 이들은 폴리펩티드를 코딩하는 DNA의 적절한 위치에 이들을 삽입하는 상기한 올리고뉴클레오티드와 매개된 돌연변이를 사용하여 생성될 수 있다. 플라스미드 DNA를 상기 부위에서 절단하여 선형화한다. 목적하는 돌연변이(들)를 함유하지만 제한부위 사이의 DNA 서열을 코딩하는 이중가닥 올리고뉴클레오티드는 표준 방법을 사용하여 합성될 수 있으며, 여기에서 올리고뉴클레오티드의 두 가닥은 별도로 합성된 다음 표준 방법으로 동시에 혼성화된다. 이러한 이중가닥 올리고뉴클레오티드를 카세트라 칭한다. 이 카세트는 선형화된 플라스미드의 말단과 호환될 수 있는 5'와 3' 말단을 가지도록 설계되어 플라스미드에 직접 결찰될 수 있다. 이 플라스미드는 이제 돌연변이된 DNA 서열을 포함한다.
본 발명의 방법으로 생성된 가변영역은 리모델링될 수 있고, 추가로 변성되어 항원 결합이 더 증가될 수 있다. 따라서 상기한 단계는, 예를 들면 친화성 돌연변이 등의 추가 단계에 선행하거나 후속될 수 있다. 또한 실험적 결합 데이터를 추가 최적화에 사용할 수 있다.
본 발명의 폴리펩티드가 추가로 변성되어 이들이 목적하는 활성은 아니나 아미노산 서열이 달라질 수 있음을 당업자라면 이해할 것이다. 예를 들면, "비필수" 아미노산 잔기에서 아미노산 치환을 유도하는 추가의 뉴클레오티드 치환은 단백질로 제조될 수 있다. 예를 들면, 면역글로불린 폴리펩티드에서 비필수 아미노산 잔기를 동일한 측쇄 종류에서 다른 아미노산 잔기로 대체할 수 있다. 다른 구현예에서, 아미노산의 줄을 측쇄 종류 구성요소들과는 순서 및/또는 조성이 다른 구조적으로 유사한 줄로 대체될 수 있으며, 즉 아미노산 잔기가 유사한 측쇄를 가지는 아미노산 잔기로 대체되는 보존적 치환을 만들 수 있다.
유사한 측쇄를 가지는 아미노산의 종류는 당분야에서 정의되어 있으며, 예를 들면 염기성 측쇄(라이신, 아르기닌, 히스티딘 등), 산성 측쇄(아스파르트산, 글루탐산 등), 전하를 띠지 않는 극성 측쇄(글리신, 아스파라긴, 글루타민, 세린, 트레오닌, 티로신, 시스테인 등), 비극성 측쇄(알라닌, 발린, 루이신, 이소루이신, 프롤린, 페닐알라닌, 메티오닌, 트립토판 등), 베타-분지된 측쇄(트레오닌, 발린, 이소루이신 등) 및 방향족 측쇄(티로신, 페닐알라닌, 트립토판, 히스티딘 등)이 있다.
아미노산 치환 이외에, 본 발명은, 예를 들면 변경된 이펙터 작용을 가지는 Fc 영역 변이체를 생성하기 위해 Fc 영역 아미노산 서열에 대하여 다른 변성을 고려할 수 있다. 예를 들면, FcR에 대한 결합을 감소하거나 강화하기 위해서 Fc 영역의 하나 이상의 아미노산 잔기를 결실할 수 있다. 일 구현예에서, 하나 이상의 Fc 영역 잔기를 상기한 Fc 영역 변이체를 생성하기 위해 변성할 수 있다. 일반적으로 1 내지 약 10개 이하의 Fc 잔기를 본 발명의 이 구현예에 따라 결실한다. 여기에서 하나 이상의 아미노산 결실을 포함하는 Fc 영역은 약 80% 이상, 바람직하게는 약 90% 이상, 더욱 바람직하게는 약 95% 이상의 출발 Fc 영역 또는 천연 서열 인간 Fc 영역을 유지하는 것이 바람직하다.
또한 아미노산 삽입 Fc 영역 변이체를 제조할 수 있으며, 변이체는 이펙터 작용을 변경한다. 예를 들면, FcR 결합에 영향을 주는, 하나 이상의 여기에서 식별된 Fc 영역 위치에 이웃한 하나 이상의 아미노산 잔기(예를 들면, 1 내지 2개 아미노산 잔기 및 일반적으로 10개 이하의 잔기)를 삽입할 수 있다. "이웃한"이란 여기에서 식별된 Fc 영역 잔기의 1 내지 2개 아미노산 잔기 이내를 의미한다. 이러한 Fc 영역 변이체는 강화된 또는 감소된 FcRn 결합을 나타낼 수 있다.
이러한 Fc 영역 변이체는 일반적으로 Fc 영역에서 하나 이상의 아미노산 변성을 포함할 수 있다. 일 구현예에서, 아미노산 변성을 조합할 수 있다. 예를 들면, 변이체 Fc 영역은 그 안에서 2, 3, 4, 5 등의 치환을 포함할 수 있으며, 예를 들면 여기에서 식별된 특이적 Fc 영역 위치이다. 다른 구현예에서, 폴리펩티드는 FcRn에 대한 그리고 다른 Fc 리셉터에 대한 결합을 변경할 수 있다.
일 구현예에서, 본 발명에서 기술된 또는 본 발명의 방법으로 생성된 폴리펩티드, 예를 들면 인간화된 Ig 가변영역 및/또는 인간화된 Ig 가변영역을 포함하는 폴리펩티드는 재조합 방법에 의해 제조될 수 있다. 예를 들면, 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열은 재조합 발현을 위한 적합한 발현벡터에 삽입될 수 있다. 폴리펩티드가 항체일 경우, 추가의 경쇄 및 중쇄 가변영역을 코딩하는 폴리뉴클레오티드는, 임의로 정상영역에 연결되고 동일한 또는 상이한 발현벡터에 삽입될 수 있다. 친화성 tag 서열(예를 들면, His(6) tag)은 폴리펩티드 서열 내에 임의로 부착되거나 포함되어 하부 정제를 촉진할 수 있다. 면역글로불린 사슬을 코딩하는 DNA 세그먼트는 면역글로불린 폴리펩티드의 발현을 보장하는 발현벡터 내의 조절 서열에 작동적으로 연결된다. 발현 조절 서열은, 제한적인 것은 아니나 프로모터(예를 들면, 자연적으로 결합된 또는 이종 프로모터), 시그널 서열, 인핸서 및 전사종료서열 등이다. 바람직하게, 발현 조절 서열은 진핵 숙주 세포를 형질전환하거나 트랜스펙팅할 수 있는 벡터 내의 진핵 프로모터 시스템이다. 벡터를 적절한 숙주에 포함시키면, 숙주는 고농도의 뉴클레오티드 서열 발현, 및 폴리펩티드 수집 및 정제에 적합한 조건 하에 유지된다.
이러한 발현벡터는 전형적으로 숙주 염색체 DNA의 에피솜 또는 통합 부분과 같은 숙주 개체에서 복제될 수 있다. 통상적으로 발현벡터는 선택 마커(암피실린 내성, 하이그로마이신 내성, 테트라사이클린 내성 또는 네오마이신 내성 등)를 포함하며 목적하는 DNA 서열로 형질전환된 상기한 세포들을 검출한다(미국 특허 제4,704,362호 참조)
E. coli는 본 발명의 폴리뉴클레오티드(예를 들면, DNA 서열)를 클로닝하는데 특히 유용한 원핵 숙주이다. 사용하기에 적합한 다른 미생물 숙주로는, 예를 들면 Bacillus subtilus 등의 bacilli속, Salmonella, Serratia, 및 다양한 Pseudomonas 종 등의 기타 장내세균(enterobacteriaceae) 등이 있다.
효모와 같은 다른 미생물들은 발현에 유용하다. Saccharomyces와 Pichia는 효모 숙주의 예이며, 적합한 벡터는 목적에 따라 발현 조절 서열(프로모터 등), 복제 기원, 및 종료 서열 등을 포함한다. 일반적인 프로모터들은 3-포스포글리세레이트 키나제와 다른 당분해효소를 포함한다. 유도 효모 프로모터들은, 특히 알코올 데히드로게나제, 이소사이토크롬 C, 및 메탄올, 말토스 및 갈락토스 이용에 반응하는 효소의 프로모터이다.
본 발명의 범위 내에서 바람직한 숙주 세포는 E. coli와 S. cerevisiae이다.
미생물 이외에, 포유동물 조직 배양물도 본 발명의 폴리펩티드(면역글로불린을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 또는 그의 절편 등)를 발현하고 제조하는데 사용될 수 있다(Winnacker, From Genes to Clones, VCH Publishers, N. Y., N. Y. (1987) 참조). 진핵세포가 실질적으로 바람직한데, 왜냐하면 이종 단백질(예를 들면, 온전한 면역글로불린)을 분비할 수 있는 수많은 적합한 숙주 세포주들이 이 분야에 개발되어 있고, 예를 들면 CHO 세포주, 다양한 Cos 세포주, HeLa 세포, 293 세포, 골수종 세포주, 형질전환된 B-세포 및 하이브리도마 등이 있다. 상기한 세포들의 발현벡터는 복제 기원, 프로모터 및 인핸서(Queen et al., Immunol. Rev. 89:49 (1986)) 등의 발현 조절 서열 및 리보솜 결합 부위, RNA 스플라이스 부위, 폴리아데닐레이션화 부위 및 전사 터미네이터 서열과 같은 필요한 프로세싱 정보 부위를 포함할 수 있다. 바람직한 발현 조절 서열은 면역글로불린 유전자, SV40, 아데노바이러스, 소유두종바이러스, 사이토메갈로바이러스 등이 있다. Co et al., J. Immunol. 148:1 149 (1992) 참조.
관심있는 폴리뉴클레오티드 서열을 함유하는 벡터(중쇄와 경쇄를 코딩하는 서열 및 발현 조절 서열 등)를 숙주 세포에 공지된 방법으로 트랜스퍼할 수 있으며, 이것은 세포 숙주의 종류에 따라 달라진다. 예를 들면, 염화칼슘 트랜스펙션은 일반적으로 원핵세포에 이용되는 반면, 칼슘 포스페이트 처리, 전기천공법, 리포펙션, 바이오리스틱스 또는 바이러스에 기초한 트랜스팩션을 다른 세포 숙주에 사용할 수 있다(일반적으로 Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Press, 2nd ed., 1989)을 참조한다.). 포유동물 세포를 형질전환하기 위해 사용되는 다른 방법은 폴리브렌의 사용, 원형질 융합, 리포좀, 전기천공법, 및 미세주사(상기한 Sambrook 등 참조)를 포함한다. 유전자이식된 동물을 얻기 위해 전이유전자를 수정 난모세포에 미세 주사하거나 또는 배아줄기세포의 게놈에 결합하여 상기 세포의 핵을 제핵 난모세포에 트랜스퍼한다.
대상 폴리펩티드는 또한 유전자이식된 동물과 후속 발현의 게놈에 삽입하기 위한 전이유전자, 예를 들면 유전자이식된 동물의 젖에 포함될 수 있다(Deboer et al. 5,741,957; Rosen 5,304,489; 및 Meade 5,849,992 참조). 적합한 전이유전자는 카제인이나 베타 락토글로불린 등의 포유동물 선(gland) 특이적 유전자로부터의 프로모터 및 인핸서와 작동적 결합 내의 경쇄 및/또는 중쇄의 코딩 서열을 포함한다.
폴리펩티드는 단일 벡터 또는 2개 벡터를 사용하여 발현될 수 있다. 예를 들면, 항체 중쇄 및 경쇄는 개별 발현 벡터에서 클론되어 세포에 코트랜스펙트될 수 있다.
일 구현예에서, 시그널 서열을 사용하여 본 발명의 폴리펩티드의 발현을 촉진할 수 있다.
발현이 되면, 폴리펩티드는 당분야의 표준 방법에 따라 정제될 수 있으며, 정제방법으로는 암모늄 설페이트 침전법, 친화성 컬럼(단백질 A 또는 단백질 G 등), 컬럼크로마토그래피, HPLC 정제, 겔 전기영동 등(일반적으로, Scopes, Protein Purification (Springer-Verlag, N.Y., (1982) 참조)이 있다.
인간화된 Ig 가변영역 또는 이들을 포함하는 폴리펩티드는 숙주세포 또는 세포주들에 의해 배양액에서 발현시킬 수 있다. 이들은 또한 생체내 세포에서 발현될 수 있다. 변성된 항체를 제조하기 위해 형질전환(예를 들면, 트랜스펙트)된 세포주는 림프계 기원의 세포주(예를 들면, 골수종, 하이브리도마, 트리오마(trioma) 또는 쿼드로마(quadroma) 세포주) 등과 같이 불멸화 포유동물 세포주일 수 있다. 상기 세포주는 또한 B-세포 등의 정상 림프계 세포를 포함할 수 있으며, 이들은 바이러스(예를 들면, Epstein-Barr 바이러스)로 형질전환하여 불멸화된다.
전형적으로 폴리펩티드를 제조하는데 사용되는 세포주가 포유동물 세포주이긴 하지만 다른 기원(예를 들면, 박테리아와 효모)의 세포주도 사용될 수 있다. 특히, E.coli에서 유도된 박테리아 균주, 특히 파지 디스플레이를 사용할 수 있다.
일부 불멸화된 림프계 세포주, 골수종 세포주 등은 그의 정상 상태에서 단리된 Ig 경쇄 또는 중쇄를 분비한다. 이러한 세포주가 변성된 항체를 발현하는 벡터로 형질전환되어 본 발명의 방법에서 제조되면, 정상적으로 분비된 사슬이 미리 준비된 벡터에 의해 코딩되는 Ig 사슬의 가변 도메인에 상보할 경우, 본 발명의 방법의 나머지 단계는 수행할 필요가 없게 된다.
불멸화된 세포주가 분비하지 않거나 또는 상보성 사슬을 분비하지 않으면, 세포에 적절한 상보성 사슬 또는 이들의 절편을 코딩하는 벡터를 삽입하여야 한다.
불멸화된 세포주가 상보성 경쇄 또는 중쇄를 분비하는 경우에, 형질전환된 세포주는, 예를 들면 적합한 박테리아 세포를 벡터로 형질전환한 다음 박테리아 세포를 불멸화된 세포주(스페로플라스트 융합 등)로 융합하여 제조할 수 있다. 선택적으로, DNA는 불멸화된 세포주에 전기천공법에 의해 직접 삽입될 수 있다.
일 구현예에서, 본 발명에서 기술된 또는 본 발명의 방법에 의해 제조된 인간화된 Ig 가변영역은 항체의 항원 결합 절편 내에 존재할 수 있다. 상기 절편은 재조합적으로 제조 및 가공, 합성 또는 항체를 단백질 분해효소로 분해하여 제조할 수 있다. 예를 들면, 상기 절편은 Fab 절편일 수 있으며; 파파인으로 분해하여 2개 중쇄를 결합하는 사슬 간(즉, VH-VH) 디설파이드 결합 이전에 영역에서 항체를 절단한다. 그 결과, 경쇄와 중쇄의 VH 및 CH1 도메인을 함유하는 2개의 동일한 절편을 생성한다. 선택적으로 상기 절편은 F(ab')2 절편일 수 있다. 이러한 절편들은 항체를 사슬 사이의 디설파이드 결합 이후에 중쇄를 절단하는 펩신으로 분해하여 제조할 수 있으며, 그 결과 양쪽 항원 결합 사이트를 함유하는 절편을 생성한다. 또다른 방법으로, "단일 사슬" 항체를 사용할 수 있다. 단일 사슬 Fv (scFv) 절편은 다양한 방법으로 구성될 수 있다. 예를 들면, VH의 C-터미널은 VL의 N-터미널에 연결될 수 있다. 전형적으로 링커(예를 들면, (GGGGS)4)를 VH와 VL 사이에 위치시킨다. 그러나, 사슬이 결합될 수 있는 순서는 보존되며, 검출 또는 정제를 돕는 태그(예를 들면, Myc-, His-, 또는 FLAG-태그)를 포함시킬 수 있다(본 발명의 항체 또는 항체 절편에 결합될 수 있는 태그; 이들의 용도는 scFv에 제한되지 않는다.). 따라서, 이하에서 언급된 바와 같이, 태그된 항체는 본 발명의 범위 내에 있다. 선택적인 구현예에서, 여기에 기술된 또는 여기에 기술된 방법에 의해 제조된 항체는 중쇄 다이머 또는 경쇄 다이머일 수 있다. 또한, 항체 경쇄 또는 중쇄, 또는 이들의 일부, 예를 들면 단일 도메인 항체(DAb)가 사용될 수 있다.
다른 구현예에서, 본 발명에서 기술되거나 또는 본 발명의 방법에 의해 제조된 인간화된 Ig 가변영역은 단일 사슬 항체(ScFv) 또는 미니바디(minibody)(미국 특허 제5,837,821호 또는 PCT 공개 번호 제94/09817Al호 등 참조) 내에 존재한다. 미니바디는 각각 ScFv 분자를 포함하는 2개의 폴리펩티드 사슬로 만들어진 다이머 분자이다(하나 이상의 항원 결합부위를 포함하는 단일 폴리펩티드, 예를 들면 연결 펩티드에 의해 CH3 도메인에 융합된 VH 도메인에 신축성 링커에 의해 결합된 VL 도메인). ScFv 분자는 VH-링커-VL 배열 또는 VL-링커-VH 배열로 구성될 수 있다. 항원결합부위를 만드는 VL과 VH 도메인을 연결하는 신축성 힌지는 약 10 내지 약 50개 아미노산 잔기를 포함할 수 있다. 이러한 용도의 연결 펩티드의 예로는 (Gly4Ser)3 (Huston et al. (1988). PNAS, 85:5879)가 있다. 다른 연결 펩티드 또한 공지되어 있다.
단일 사슬 항체를 제조하는 방법은 당분야에서 공지되어 있다(Ho et al. (1989), Gene, 77:51 ; Bird et al. (1988), Science 242:423; Pantoliano et al. (1991), Biochemistry 30:10117; Milenic et al. (1991), Cancer Research, 51:6363; Takkinen et al. (1991), Protein Engineering 4:837 참조). 미니바디는 ScFv 성분을 구성하고 펩티드-CH3 성분을 연결하여 공지된 방법을 사용하여 제조할 수 있다(미국 특허 제5,837,821호, 또는 PCT 공개번호 제94/09817Al호 참조). 이러한 성분들은 별도의 플라스미드에서 제한 절편으로 단리한 다음 적절한 벡터에 결찰하여 리클론된다. 적절한 어셈블리를 제한 분해 및 DNA 서열 분석으로 확인할 수 있다. 일 구현예에서, 본 발명의 미니바디는 연결 펩티드를 포함한다. 일 구현예에서, 상기 연결 펩티드는 Gly/Ser 링커, 예를 들면, GGGSSGGGSGG를 포함한다.
다른 구현예에서, 4가의 미니바디를 구성할 수 있다. 4가의 미니바디를 2개의 ScFv 분자를, 예를 들면 아미노산 서열 (G4S)4G3AS를 가지는 신축성 링커를 사용하여 연결한 것을 제외하고, 미니바디와 동일한 방법으로 구성할 수 있다.
다른 구현예에서, 본 발명에서 기술된 또는 본 발명의 방법으로 제조되는 인간화된 가변영역은 디아바디(diabody)로 존재할 수 있다. 디아바디는 scFv 분자와 유사하지만, 일반적으로 양 가변 도메인을 연결하는 짧은(10개 미만, 바람직하게는 1 내지 5) 아미노산 잔기 링커를 가지므로 동일한 폴리펩티드 서열 상의 VL과 VH 도메인은 상호작용할 수 없다. 대신 하나의 폴리펩티드 사슬의 VL과 VH 도메인은 두 번째 폴리펩티드 상의 VH과 VL 도메인(각각)과 상호작용한다(PCT 공개 번호 제WO 02/02781호).
다른 구현예에서, 본 발명의 인간화된 가변영역은 FcR 결합 부위에 작동적으로 연결된 면역반응성 절편 또는 항체 일부(예를 들면, scFv 분자, 미니바디, 4가 미니바디 또는 디아바디) 내에 존재할 수 있다. 예시적인 구현예에서 FcR 결합 부위는 완전한 Fc 영역이다.
바람직하게, 여기에 기술된 인간화 방법은 항원의 친화성을 공여체 항체와 비교하여 실질적으로 변화시키지 않는 Ig 가변영역을 생성한다.
일 구현예에서 본 발명의 가변 도메인을 포함하는 폴리펩티드는 약 105M-1, 106M-1, 107M-1, 108M-1, 109M-1, 1010M-1, 1011M-1, 또는 1012M-1, (상기 값의 중간 친화성을 포함)의 해리 상수 Ka 이상(또는 동등한)의 결합 친화성을 가지는 항원에 결합한다.
친화성, 결합활성 및/또는 특이성은 다양한 방법으로 측정될 수 있다. 일반적으로, 또한 친화도를 규정하거나 측정하는 정확한 방법과는 상관없이, 본 발명의 방법은 제조된 항체(또는 항체들)에 대한 그의 임상적 적용 측면에서 우월한 항체를 생성할 경우, 본 발명의 방법은 항체 친화도를 개선한다(예를 들면, 본 발명의 방법은 변성된 항체가 저투여량 또는 극히 낮은 빈도로, 또는 제조된 항체(또는 항체들) 보다 더 편리한 경로에 의해 투여될 수 있을 때 유효하거나 성공적인 것으로 생각된다).
보다 구체적으로는, 항체와 여기에 결합하고 있는 항원은 다양한 에세이에 의해 측정될 수 있으며, 예를 들면 ELISA 에세이, BiaCore 에세이 또는 KinExA™ 3000 에세이(Sapidyne Instruments (Boise, ID)에서 판매) 등이 있다. 요약하면, 세파로스 비즈를 공유 결합에 의해 항원(본 발명의 방법에서 사용된 항원은 관심있는 어떠한 항원(예를 들면, 암 항원, 세포 표면 단백질 또는 분비 단백질; 병원균의 항원(예를 들면, 박테리아성 또는 바이러스성 항원(예를 들면, HIV 항원, 인플루엔자 항원, 또는 간염 항원)), 또는 알레르겐)도 가능하다.)으로 코팅한다. 시험될 항체의 희석물을 제조하고 각 희석물을 플레이트의 지정된 웰에 첨가한다. 각 웰에 검출 항체(예를 들면, 안티-인간 IgG-HRP 컨쥬게이트)를 첨가한 다음 크로마제닉 기질(예를 들면, HRP)을 첨가한다. 상기 플레이트를 ELISA 플레이트 판독기로 450 nM에서 판독하여 EC50 값을 계산하였다.(하지만 여기에 기술된 방법은 일반적으로 적용가능한 것이고; 특정 항원 또는 항원 종류와 결합하는 항체의 생산을 제한하지는 않는 것임을 이해하여야 한다.)
당업자라면 친화성을 결정하는 것이 항상 한 자리 숫자를 보는 것처럼 간단하지 않은 것을 알고 있을 것이다. 항체는 2개의 팔을 가지므로, 이들의 겉보기 친화성은 일반적으로 가변영역과 항원 사이 고유의 친화성 보다 훨씬 더 높다(결합활성 때문인 것으로 보임.). 고유 친화성은 scFv 또는 Fab 절편을 사용하여 측정할 수 있다.
다른 양태에서, 본 발명은, 본 발명에 따른 인간화된 래빗 항체, 또는 이들의 절편을 포함하는 이중특이성 분자를 특징으로 한다. 본 발명의 항체 또는 이들의 항원 결합 부위는 다른 작용분자, 예를 들면, 다른 펩티드 또는 단백질(예를 들면, 다른 항체 또는 리셉터에 대한 리간드)로 유도되거나 결합될 수 있어서 2개 이상의 상이한 결합 부위 또는 표적 분자에 결합하는 이중특이성 분자를 생성한다. 본 발명의 항체는 하나 이상의 작용성 분자로 유도되거나 또는 결합되어 2개 이상의 결합 부위 및/또는 표적 분자와 결합하는 다중특이성 분자를 생성하며; 이러한 다중특이성 분자는 또한 여기서 사용된 "이중특이성 분자"라는 용어에 포함된다. 본 발명의 이중특이성 분자를 제조하기 위해서, 본 발명의 항체를 하나 이상의 다른 결합 분자, 예를 들면 다른 항체, 항체 절편, 종양 특이적 또는 병원균 특이적 항원, 펩티드 또는 결합 의태물과 작용적으로 결합(예를 들면, 화학적 커플링, 유전적 융합, 비공유적 결합 등)시켜서 이중특이성 분자를 얻는다. 따라서, 본 발명은 제1 표적물에 대한 특이성을 가지는 하나 이상의 제1 결합 분자와 하나 이상의 추가 표적 에피토프에 특이성을 가지는 제2 결합분자를 포함하는 이중특이성 분자를 포함한다.
일 구현예에서, 본 발명의 이중특이성 분자는 결합 특이성 항체 하나 이상, 또는, 예를 들면 Fab, Fab', F(ab')2, Fv, 또는 단일 사슬 Fv 등과 같은 그의 항체 절편을 포함한다. 상기 항체는 또한 경쇄 또는 중쇄 다이머이거나, 또는 Ladner et al의 미국 특허 제4,946,778호에 기술된 Fv 또는 단일 사슬 구조물과 같은 그의 미니멀 절편일 수 있으며, 상기 특허의 내용은 참조용으로 포함되었다.
사람 모노클로날 항체가 바람직하지만, 본 발명의 이중특이성 분자에서 사용될 수 있는 다른 항체로는 마우스, 키메릭 및 인간화된 모노클로날 항체가 있다.
본 발명의 이중특이성 분자는 당분야의 공지된 방법을 사용하여 구성성분 결합 특이성을 컨쥬게이트하여 제조할 수 있다. 예를 들면, 이중특이성 분자의 결합 특이성 각각을 별도로 생성한 다음, 서로에게 컨쥬게이트시킨다. 결합 특이성들이 단백질 또는 펩티드일 경우, 다양한 커플링제 또는 가교제를 공유 컨쥬게이트에 사용할 수 있다. 가교제의 예로는, 프로테인 A, 카르보디이미드, N-숙신이미딜-S-아세틸-티오아세테이트(SATA), 5,5'-디티오비스(2-니트로벤조산)(DTNB), o-페닐렌디말레이미드(oPDM), N-숙신이미딜-3-(2-피리딜디티오)프로피오네이트(SPDP), 및 설포숙신이미딜 4-(N-말레이미도메틸)시클로헥산-1-카르복실레이트(sulfo-SMCC)(예를 들면, Karpovsky et al. (1984) J. Exp. Med. 160:1686; Liu, MA et al. (1985) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:8648 참조) 등이 있다. 다른 방법으로는 Paulus (1985) Behring Ins. Mitt. No. 78, 118-132; Brennan et al. (1985) Science 229:81-83, 및 Glennie et al. (1987) J. Immunol. 139: 2367-2375에 기술된 방법들이 있다. 바람직한 컨쥬게이팅제로는 SATA와 sulfo-SMCC가 있으며, 이들은 모두 Pierce Chemical Co.(Rockford, IL, USA)가 판매하고 있다.
결합 특이성이 항체일 때, 이들은 2개 중쇄의 C-터미널 힌지영역의 설프히드릴 결합에 의해 컨쥬게이트될 수 있다. 특히 바람직한 구현예에서는, 힌지영역을 변성하여 컨쥬게이션하기 전에 홀수의 설프히드릴 잔기, 바람직하게는 하나를 포함시킬 수 있다.
선택적으로, 2개의 결합 특이성 모두를 동일한 벡터에서 코딩하여 동일한 숙주세포에서 발현시키고 조립하였다. 이 방법은 이중특이성 분자가 mAb x mAb, mAb x Fab, Fab x F(ab')2 또는 리간드 x Fab 융합 단백질일 때 특히 유용하다. 본 발명의 이중특이성 분자는 하나의 단일 사슬 항체와 결합 결정인자를 포함하는 단일 사슬 분자이거나, 또는 2개의 결합 결정인자를 포함하는 단일 사슬 이중특이성 분자일 수 있다. 이중특이성 분자는 2개 이상의 단일 사슬 분자를 포함할 수 있다. 이중특이성 분자를 제조하는 방법은, 예를 들면 미국 특허 제5,260,203호; 미국 특허 제5,455,030호; 미국 특허 제4,881,175호; 미국 특허 제5,132,405호; 미국 특허 제5,091,513호; 미국 특허 제5,476,786호; 미국 특허 제5,013,653호; 미국 특허 제5,258,498호; 및 미국 특허 제5,482,858호 등에 기술되어 있다.
이중특이성 분자와 이들의 특이적 표적의 결합은 다음과 같은 방법에 의해 확인할 수 있다: 효소결합 면역흡착 에세이(ELISA), 방사면역측정법(RIA), FACS 분석, 유동세포계측법에 기초한 단일 사슬 소팅(예를 들면, FACS 분석), 생체분석(예를 들면, 성장 억제), 또는 웨스턴 블로트 에세이. 이러한 분석법 각각은 일반적으로 특별히 관심있는 단백질-항체 복합체의 존재를 관심있는 복합체에 특이적인, 표지된 시료(예를 들면, 항체)를 사용하여 검출한다. 예를 들면, 항체 복합체는, 항체-VEGF 복합체를 인식하여 특이적으로 결합하는 효소결합 항체 또는 항체 절편 등을 사용하여 검출할 수 있다. 선택적으로, 상기 복합체는 다양한 다른 면역에세이를 사용하여 검출할 수 있다. 예를 들면, 상기 항체를 방사능적으로 표지시켜서 방사면역측정법(RIA)에서 사용한다(예를 들면, 참조를 위해 여기에 통합된, Weintraub, B., Principles of Radioimmunoassays, Seventh Training Course on Radioligand Assay Techniques, The Endocrine Society, March, 1986 참조). 방사능 동위원소는 γ-카운터 또는 섬광 카운터 또는 방사능사진촬영을 사용하는 장치에 의해 검출될 수 있다.
다른 양태에서, 본 발명은 세포독소, 약물(면역억제제 등) 또는 방사성 독물 등의 치료 물질에 컨쥬게이트된, 인간화된 래빗 항체 또는 그의 절편을 특징으로 한다. 이러한 접합물들을 여기에서는 "면역컨쥬게이트"라 지칭한다. 하나 이상의 세포독소를 포함하는 면역컨쥬게이트를 "면역독소(immunotoxin)"라 지칭한다. 세포독소 또는 세포독성제는 세포에 해로운(예를 들면, 죽이는) 제제를 포함한다. 예를 들면, 탁솔, 사이토칼라신 B, 그래미시딘 D, 에티듐 브로마이드, 에메틴, 미토마이신, 에토포사이드, 테노포사이드, 빈크리스틴, 빈블라스틴, 콜키신, 독소루비신, 다우노루비신, 디히드록시 안트라신 디온, 미톡산트론, 미트라마이신, 액티노마이신 D, 1-데히드로테스토스테론, 글루코코르티코이드, 프로카인, 테트라카인, 리도카인, 프로프라놀롤, 푸로마이신 및 이들의 유사체 또는 동족체 등이 있다. 또한, 치료제로는, 예를 들면 대사길항물질(예를 들면, 메토트렉세이트, 6-머캅토퓨린, 6-티오구아닌, 시타라빈, 5-플루오로유라실 데카바진), 알킬화제(예를 들면, 메클로레타민, 티오에파 클로람부실, 멜팔란, 카무스틴(BSNU) 및 로무스틴(CCNU), 사이클로토스파미드, 부설판, 디브로모만니톨, 스트렙토조톡신, 미토마이신 C, 및 시스-디클로로디아민 플래티넘(II)(DDP) 시스플라틴), 안트라사이클린(예를 들면, 다우노루비신(이전의 다우노마이신) 및 독소루비신), 항생제(예를 들면, 닥티노마이신(이전의 액티노마이신), 블레오마이신, 미트라마이신 및 안트라마이신(AMC)), 및 항유사분열제(예를 들면, 빈크리스틴 및 빈블라스틴) 등이 있다.
본 발명의 항체와 컨쥬게이트될 수 있는 치료용 세포독소의 다른 바람직한 실시예로는 듀오카마이신, 칼리케마이신, 메이탄신 및 오리스타틴, 및 이들의 유도체가 있다. 칼리케마이신 항체 컨쥬게이트의 예는 시판되고 있다(Mylotarg™; Wyeth-Ayerst).
세포독소는 본 발명의 항체에 당분야에서 입수할 수 있는 링커 방법을 사용하여 컨쥬게이트시킬 수 있다. 세포독소를 항체에 컨쥬게이트하는데 사용되는 링커 종류의 예로는, 제한적인 것은 아니나, 히드라존, 티오에테르, 에스테르, 디설파이드 및 펩티드를 함유하는 링커 등이 있다. 링커는, 예를 들면 리소좀 구역 내에서 낮은 pH에 의한 분해에 감수성이 있거나, 또는 카텝신(예를 들면, 카텝신 B, C, D)과 같은, 종양 조직 내에서 유리하게 발현되는 프로테아제 등의, 프로테아제에 의한 분해에 감수성이 있는 것을 선택할 수 있다.
치료제를 항체에 컨쥬게이팅하기 위한 세포독소의 종류, 링커 및 방법에 대한 추가 논의는 다음 문헌을 참조할 수 있다: Saito, G. et al. (2003) Adv. Drug Deliv. Rev. 55:199-215; Trail, P.A. et al. (2003) Cancer Immunol. Immunother. 52:328-337; Payne, G. (2003) Cancer Cell 3:207-212; Allen, T.M. (2002) Nat. Rev. Cancer 2:750-763; Pastan, I. and Kreitman, R. J. (2002) Curr. Opin. Investig. Drugs 3:1089-1091; Senter, P.D. and Springer, CJ. (2001) Adv. Drug Deliv. Rev. 53:247-264.
본 발명의 항체는 또한 방사능 동위원소와 컨쥬게이트되어, 방사능면역컨쥬게이트(radioimmunoconjugate)라고 지칭되는, 세포독소 방사능의약품을 생성할 수 있다. 진단적으로 또는 치료적으로 사용되는 항체에 컨쥬게이트시킬 수 있는 방사능 동위원소의 예로는, 제한적인 것은 아니나 요오드131, 인듐111, 이트륨90 및 루테튬177 등이 있다. 방사능면역컨쥬게이트를 제조하는 방법은 당분야에서 공지되어 있다. 방사능면역컨쥬게이트의 예는 시판되고 있으며, 예를 들면 Zevalin™(IDEC Pharmaceuticals) 및 Bexxar™ (Corixa Pharmaceuticals) 등이 있고, 유사한 방법을 사용하여 본 발명의 항체를 사용하는 방사능면역컨쥬게이트를 제조할 수 있다.
본 발명의 항체 컨쥬게이트를 사용하여 주어진 생물학적 반응을 변성할 수 있으며, 그 약물 부분은 종래의 화학적 치료제에 제한되는 것은 아니다. 예를 들면, 상기 약물 부분은 단백질 또는 바람직한 생물학적 활성을 포함하는 폴리펩티드일 수 있다. 이러한 단백질은, 예를 들면 효소적으로 활성인 독소 또는 그의 활성 절편(예를 들면, 아브린, 리신 A, 슈도모나스 외독소, 또는 디프테리아 독소 등); 종양괴사인자 또는 인터페론-γ 등의 단백질; 또는 림포카인, 인터루킨-1("IL-1"), 인터루킨-2("IL-2"), 인터루킨-6("IL-6"), 과립구대식세포 콜로니자극인자 ("GM-CSF"), 과립구 콜로니 자극인자("G-CSF") 또는 다른 성장 인자와 같은 생물학적반응 조절제 등이 있다.
상기한 치료용 부분을 항체에 컨쥬게이팅하는 방법들은 이미 알려져 있으며, 다음 문헌들을 참고할 수 있다: Arnon et al, "Monoclonal Antibodies For Immunotargeting Of Drugs In Cancer Therapy", in Monoclonal Antibodies And Cancer Therapy, Reisfeld et al. (eds.), pp. 243-56 (Alan R. Liss, Inc. 1985); Hellstrom et al, "Antibodies For Drug Delivery", in Controlled Drug Delivery (2nd Ed.), Robinson et al. (eds.), pp. 623-53 (Marcel Dekker, Inc. 1987); Thorpe, "Antibody Carriers Of Cytotoxic Agents In Cancer Therapy: A Review", in Monoclonal Antibodies '84: Biological And Clinical Applications, Pinchera et al. (eds.), pp. 475-506 (1985); "Analysis, Results, And Future Prospective Of The Therapeutic Use Of Radiolabeled Antibody In Cancer Therapy", in Monoclonal Antibodies For Cancer Detection And Therapy, Baldwin et al. (eds.), pp. 303-16 (Academic Press 1985), and Thorpe et al, "The Preparation And Cytotoxic Properties Of Antibody-Toxin Conjugates", Immunol. Rev., 62:119-58 (1982).
일 양태에서, 본 발명은 질병의 치료를 위한 인간화된 래빗 항체를 포함하는 약학적 제제를 제공한다. "약학적 제제"란 용어는 상기 항체 또는 항체 유도체의 생물학적 활성이 명백하게 유효하도록 하는 형태이고, 상기 제제가 투여되는 대상에게 독성인 추가 성분을 함유하지 않는 조제물을 지칭한다. "약학적으로 허용가능한" 첨가제(비히클, 부가물)는 사용된 활성 성분의 유효량을 제공하기 위해서 대상 포유동물에게 합리적으로 투여될 수 있는 것들이다.
"안정한" 제제는 포함된 항체 또는 항체 유도체가 본질적으로 그의 물리적 안정성 및/또는 화학적 안정성 및/또는 생물학적 활성을 저장시에 유지하는 것이다. 단백질 안정성을 측정하기 위한 다양한 분석방법은 당분야에서 얻어질 수 있으며, 예를 들면 Peptide and Protein Drug Delivery, 247-301, Vincent Lee Ed., Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., Pubs. (1991) and Jones, A. Adv. Drug Delivery Rev. 10: 29-90 (1993)에서 확인된다. 안정성은 선택된 온도에서 선택된 시간(기간) 동안 측정할 수 있다. 바람직하게, 상기 제제는 실온(약 30 ℃) 또는 40 ℃에서 1개월 이상 안정하고 및/또는 약 2 내지 8 ℃에서 적어도 1년 내지 2년 동안 안정하다. 또한, 상기 제제는 바람직하게 제제의 동결(예를 들면 -70 ℃까지) 및 융해 후에 안정하다.
항체 또는 항체 유도체가 색상 및/또는 투명성의 시각적 검사, 또는 UV 광 산란 또는 크기 배제 크로마토그래피에 의해 측정되었을 때 응집, 침전 및/또는 변성의 표시가 없을 경우, 항체 또는 항체 유도체는 약학적 제제 내에서 "그의 물리학적 안정성을 유지한다."
주어진 시간에서 화학적 안정성이 단백질이 하기에 정의된 바와 같이 그의 생물학적 활성을 여전히 유지한 것으로 간주되는 정도라면 항체 또는 항체 유도체는 약학적 제제 내에서 "그의 물리학적 안정성을 유지한다." 화학적 안정성은 화학적으로 변성된 형태의 단백질을 검출하고 정량하여 평가될 수 있다. 화학적 변성은 크기 변형(클리핑 등)과 관련될 수 있으며, 예를 들면 크기 변형은 크기 배제 크로마토 그래피, SDS-PAGE 및/또는 매트릭스로 보조되는 레이저 탈착(desorption)/흐름시간(time-of-flight) 질량 분광법(MALDI/TOP MS)을 사용하여 평가될 수 있다. 다른 종류의 화학적 변성은, 예를 들면 이온-교환 크로마토그래피에 의해 평가될 수 있는 전하 변경(예를 들면, 탈아미드화(deamidation)의 결과로서 일어남)을 포함한다.
주어진 시간에서 항체의 생물학적 활성이, 예를 들면 항원 결합 에세이에서 측정된 바와 같이 약학적 제제가 제조된 시점에 나타난 생물학적 활성의 약 10％ 이내(상기 에세이의 오차 이내)라면, 항체 또는 항체 유도체는 약학적 제제 중에서 "그의 생물학적 활성을 보유한다." 항체에 대한 다른 "생물학적 활성" 에세이는 여기에서 이하에 상세히 설명하였다.
"등장성"이란 관심 제제가 사람 혈액과 본질적으로 동일한 삼투압을 가지는 것을 의미한다. 등장성 제제는 일반적으로 약 250 내지 350 mOsm의 삼투압을 가진다. 등장성은, 예를 들면 증기압 또는 얼음-동결 타입의 삼투압계를 사용해서 측정할 수 있다.
"폴리올"은 다수의 히드록실기를 갖는 물질이며, 당(환원 및 비환원 당), 당 알코올 및 당 산을 포함한다. 여기에서 바람직한 폴리올은 약 600 kD (예를 들어 약 120 내지 약 400 kD의 범위) 미만의 분자량을 갖는다. "환원 당"은 금속 이온을 환원시키거나 단백질에서 라이신 및 다른 아미노기와 공유적으로 반응할 수 있는 헤미아세탈기를 함유하는 당이며, "비환원 당"은 환원 당의 이러한 성질을 갖지 않는 당이다. 환원 당의 예로는 프룩토스, 만노스, 말토스, 락토스, 아라비노스, 자일로스, 리보스, 람노스, 갈락토스 및 글루코스가 있다. 비-환원 당으로는 수크로스, 트레할로스, 소르보스, 멜레지토스 및 라피노스를 들 수 있다. 만니톨, 자일리톨, 에리쓰리톨, 쓰레이톨, 소르비톨 및 글리세롤은 당 알코올의 예이다. 당 산의 경우, 이들은 L-글루코네이트 및 그의 금속 염을 포함한다. 제제가 동결-해동에 대해 안정적인 것이 바람직한 경우, 폴리올은 그가 제제 중의 항체를 불안정화하도록 동결 온도 (예를 들어 -20℃)에서 결정화하지 않는 것이 바람직하다. 본원에서 비-환원 당, 예를 들면 수크로스 및 트레할로스가 바람직한 폴리올이며, 트레할로스는 수크로스에 비해 트레할로스의 용액 안정성이 더 우수하기 때문에 바람직하다.
여기에서 사용된 바와 같이, "완충제"는 그의 산-염기 컨쥬게이트 성분의 작용에 의해 pH에서의 변화에 저항하는 완충된 용액을 지칭한다. 본 발명의 완충제는 약 4.5 내지 약 6.0, 바람직하게는 약 4.8 내지 약 5.5; 특히 바람직하게는 약 5.0의 pH를 갖는다. pH를 상기 범위에서 조절하는 완충제의 예로는 아세테이트 (예를 들면, 아세트산나트륨), 숙시네이트 (예를 들면, 소듐 숙시네이트), 글루코네이트, 히스티딘, 시트레이트 및 다른 유기산 완충제를 들 수 있다. 동결-해동 안정적 제제가 바람직한 경우, 완충제는 바람직하게는 포스페이트가 아니다.
약리학적 의미로, 본 발명의 상황에서, 항체 또는 항체 유도체의 "치료 유효량"은 항체 또는 항체 유도체가 치료상 효과적인 장애의 예방 또는 치료에 있어서 효과적인 양을 지칭한다. "질환/장애"는 항체 또는 항체 유도체를 사용한 치료가 유익한 임의의 상태이다. 이는 포유동물을 해당 장애에 걸리기 쉽게 만드는 병리 상태를 비롯한 만성 및 급성 장애 또는 질환을 포함한다.
"보존제"는 제제 내의 박테리아 작용을 본질적으로 감소시킴으로써 예를 들어 다수회-사용 제제의 제조를 용이하게 하는 제제에 포함될 수 있는 화합물이다. 잠재적인 보존제의 예로는 옥타데실디메틸벤질 암모늄 클로라이드, 헥사메토늄 클로라이드, 벤즈알코늄 클로라이드 (알킬기가 장쇄 화합물인 알킬벤질디메틸암모늄 클로라이드의 혼합물), 및 벤즈에토늄 클로라이드를 들 수 있다. 다른 유형의 보존제로는 방향족 알코올, 예를 들면 페놀, 부틸 및 벤질 알코올, 알킬 파라벤, 예를 들면 메틸 또는 프로필 파라벤, 카테콜, 레소르시놀, 시클로헥산올, 3-펜탄올, 및 m-크레졸을 들 수 있다. 여기에서 가장 바람직한 보존제는 벤질 알코올이다.
본 발명은 또한 하나 이상의 항체 또는 항체 유도체 화합물을 하나 이상의 생리적으로 허용가능한 담체 또는 첨가제와 함께 포함하는 약학 조성물을 제공한다. 약학 조성물은 예를 들어 물, 완충제 (예를 들면, 중성 완충 염수 또는 포스페이트 완충 염수), 에탄올, 미네랄 오일, 식물성 오일, 디메틸술폭시드, 탄수화물 (예를 들면, 글루코스, 만노스, 수크로스 또는 덱스트란), 만니톨, 단백질, 보조제, 폴리펩티드 또는 아미노산, 예를 들면 글리신, 항산화제, 킬레이트화제, 예를 들면 EDTA 또는 글루타티온 및/또는 보존제 중 하나 이상을 포함할 수 있다. 상기 언급된 바와 같이, 다른 활성 성분이 여기에 제공된 약학 조성물 중에 포함될 수 있다 (꼭 필요하지는 않음).
담체는 환자에게 투여하기에 앞서 흔히 화합물의 안정성 또는 생체이용성을 조절할 목적으로 항체 또는 항체 유도체와 결합될 수 있는 물질이다. 이러한 제제 내에 사용하기 위한 담체는 일반적으로 생체적합성이며, 또한 생분해성일 수 있다. 담체로는 예를 들어 1가 또는 다가 분자, 예를 들면 혈청 알부민 (예를 들어 사람 또는 소), 난 알부민, 펩티드, 폴리라이신 및 폴리사카라이드, 예를 들면 아미노덱스트란 및 폴리아미도아민을 들 수 있다. 또한 담체로는 예를 들면 폴리락테이트 폴리글리콜레이트, 폴리(락티드-코-글리콜리드), 폴리아크릴레이트, 라텍스, 전분, 셀룰로스 또는 덱스트란을 포함하는 비드 및 미세입자와 같은 고체 지지 물질을 들 수 있다. 담체는 공유 결합 (직접 공유 결합 또는 링커기를 통한 공유 결합), 비공유 상호작용 또는 혼합물을 비롯한 다양한 방식으로 화합물을 보유할 수 있다.
약학 조성물은 예를 들면 국소, 경구, 비강, 직장 또는 비경구 투여를 비롯한 임의의 적절한 투여 방식을 위해 제제화될 수 있다. 임의의 구현예에서, 경구 사용에 적합한 형태의 조성물이 바람직하다. 이러한 형태로는, 예를 들면 환제, 정제, 트로키제, 로젠지제, 수성 또는 유성 현탁액제, 분산성 분말 또는 과립제, 에멀젼제, 경질 또는 연질 캡슐제, 또는 시럽제 또는 엘릭서제를 들 수 있다. 또 다른 구현예 내에서, 여기에서 제공된 조성물은 동결건조물로서 제제화될 수 있다. 여기에서 사용된 바와 같은 비경구라는 용어는 피하, 피내, 혈관내 (예를 들어 정맥내), 근육내, 척추, 두개내, 경막내 및 복강내 주사, 및 임의의 유사한 주사 또는 주입 기술을 포함한다.
경구용 목적의 조성물은 약학 조성물을 제조하는 분야에서 알려진 방법에 따라 제조될 수 있으며, 조제물의 맛과 모양을 위해 하나 이상의 제제, 예를 들면 감미제, 풍미제, 착색제 및 보존제를 포함할 수 있다. 정제는 정제를 제조하는데 적합한 생리학적으로 허용가능한 첨가제와의 혼합물 중에 활성 성분을 포함한다. 상기한 첨가제로는, 예를 들면 불활성 희석제(예를 들면, 탄산칼슘, 탄산나트륨, 락토스, 인산칼슘 또는 인산나트륨), 그래뉼화제 및 붕해제(예를 들면, 옥수수 전분 또는 알긴산), 결합제(예를 들면, 전분, 젤라틴 또는 아카시아) 및 윤활제(예를 들면, 마그네슘 스테아레이트, 스테아린산 또는 탈크) 등이다. 정제는 코팅되지 않거나 또는, 위장관 내에서 분해 및 흡수를 지연하여 장기간 동안 활성을 유지하기 위해 공지의 방법으로 피복될 수 있다. 예를 들면, 글리세릴 모노스테아레이트 또는 글리세릴 디스테아레이트 등의 시간 지연물질을 사용할 수 있다.
경구용 제제는 또한 경질 젤라틴 캡슐로 제공될 수 있으며, 여기에서 활성성분은 불활성 고체 희석제(탄산칼슘, 인산칼슘 또는 카올린 등)와 혼합되고, 또는 연질 젤라틴 캡슐로 제공될 수 있으며, 여기에서 활성성분은 물 또는 오일매질(땅콩오일, 액상 파라핀 또는 올리브 오일 등)과 혼합된다. 수성 현탁액은 항체 또는 항체 유도체를 수성 현탁액의 제조에 적합한 첨가제와의 혼합물 중에 함유한다. 이러한 첨가제의 예로는, 현탁제(소듐 카르복시메틸셀룰로스, 메틸셀룰로스, 히드로프로필메틸셀룰로스, 소듐 알기네이트, 폴리비닐피롤리돈, 검 트라가칸트 및 검 아카시아 등), 및 분산 또는 습윤제(레시틴과 같은 천연 포스파티드, 폴리옥시에틸렌 스테아레이트 등의 지방산과 알킬렌 옥사이드의 축합물, 헵타데카에틸렌옥시세탄올 등의 장쇄 지방족 알코올과 에틸렌 옥사이드의 축합물, 폴리옥시에틸렌 소르비톨 모노올리에이트 등의 헥시톨 및 지방산에서 유도된 부분 에스테르와 에틸렌 옥사이드의 축합물, 폴리에틸렌 소르비탄 모노올리에이트 등의 헥시톨 무수물과 지방산에서 유도된 부분 에스테르와 에틸렌 옥사이드의 축합물 등)이 있다. 수성 현탁액은 또한 하나 이상의 보존제, 예를 들면 에틸 또는 n-프로필 p-히드록시벤조에이트, 하나 이상의 착색제, 하나 이상의 풍미제, 및 하나 이상의 감미제, 예를 들면 슈크로스 또는 사카린 등을 포함할 수 있다. 시럽과 엘릭서는 글리세롤, 프로필렌 글리콜, 소르비톨 또는 슈크로스 등의 감미제로 제형화될 수 있다. 이러한 제형들은 또한 하나 이상의 완화제, 보존제, 풍미제 및/또는 착색제를 포함할 수 있다.
오일성 현탁액은 식물성 오일(아라키스 오일, 올리브 오일, 참깨 오일, 또는 코코넛 오일 등), 또는 액상 파라핀 등의 미네랄 오일 중에 활성 성분을 현탁하여 제형화될 수 있다. 오일성 현탁액은 밀납, 경질 파라핀 또는 세틸 알코올 등의 증점제를 포함할 수 있다. 상기에 기재한 바와 같은 감미제, 및/또는 풍미제를 첨가하여 구미에 맞는 경구 조제물을 제공할 수 있다. 이러한 현탁액은 아스코르브산 등의 항산화제를 첨가하여 보존될 수 있다.
물을 첨가하는 수성 현탁액 제조에 적합한 분산성 분말과 그래뉼은 활성 성분을 분산 또는 습윤제, 현탁제 및 하나 이상의 보존제와의 혼합물로 제공한다. 적합한 분산 또는 습윤제와 현탁제는 앞서 예시한 바와 같다. 추가의 첨가제로는, 예를 들면 감미제, 풍미제 및 착색제가 있다. 약학 조성물은 또한 수중유 에멀젼 형태일 수 있다. 오일상은 식물성 오일(올리브 오일 또는 아라키스 오일 등), 미네랄 오일(액상 파라핀 등) 또는 이들의 혼합물일 수 있다. 적합한 에멀젼화제는, 예를 들면 천연 검(검 아카시아 또는 검 트라가칸트 등), 천연 포스파티드(콩, 레시틴 및 에스테르 또는 지방산과 헥시톨에서 유도된 부분 에스테르 등), 무수물(소르비탄 모노올리에이트), 및 지방산 및 헥시톨에서 유도된 부분 에스테르와 에틸렌 옥사이드의 축합물(폴리옥시에틸렌 소르비탄 모놀리에이트 등) 등이 있다. 에멀젼은 또한 하나 이상의 감미제 및/또는 풍미제를 포함할 수 있다.
상기 약학 조성물은 사용된 비히클 및 농도에 따라 조절제가 비히클 중에 현탁 또는 용해된 멸균의 주사가능한 수성 또는 유성 현탁액으로 제조할 수 있다. 이러한 조성물은 적합한 분산제, 습윤제 및/또는 현탁화제, 예를 들면 상기 언급된 것들을 사용해서 공지된 기술에 따라 제제화할 수 있다. 사용될 수 있는 허용가능한 비히클 및 용매 중에는 물, 1,3-부탄디올, 링거(Ringer)액 및 등장성 염화나트륨 용액이 있다. 또한, 멸균의 고정 오일을 용매 또는 현탁화 매질로서 사용할 수 있다. 이러한 목적을 위해 합성 모노- 또는 디-글리세라이드를 비롯한 임의의 온화한 고정 오일을 사용할 수 있다. 또한, 올레산과 같은 지방산을 주사가능한 조성물의 약제 중에 사용할 수 있으며, 보조제, 예를 들면 국소 마취제, 보존제 및/또는 완충제를 비히클 중에 용해시킬 수 있다.
약학 조성물은 지연 방출 제제 (즉, 투여 후 조절제의 느린 방출을 수행하는 캡슐제와 같은 제제)로서 제제화될 수 있다. 이러한 제제는 일반적으로 잘 알려진 기술을 이용해서 제제화할 수 있으며, 예를 들어 경구, 직장 또는 피하 이식에 의해 또는 원하는 표적 부위에서의 이식에 의해 투여할 수 있다. 이러한 제제 중에 사용하기 위한 담체는 생체적합성이며 또한 생분해성일 수 있으며, 바람직하게는 제제는 상대적으로 일정한 수준의 조절제를 방출한다. 지연 방출 제제 중에 함유된 항체 또는 항체 유도체의 양은 예를 들어 이식 부위, 방출 속도 및 예상 방출 기간, 및 치료 또는 예방될 질환/장애의 특성에 따라 달라진다.
여기에서 제공된 항체 또는 항체 유도체는 일반적으로, VEGF 등의 표적물과검출가능하게 결합하고 상기 표적과 매개된 질환/장애를 예방 또는 억제하기에 충분한 체액 (예를 들어 혈액, 혈장, 혈청, CSF, 활액, 림프, 세포내 간질 유액, 눈물 또는 뇨) 중의 농도를 얻기위한 양으로 투여된다. 투여량은 여기에 기재된 인식가능한 환자 이점을 나타내는 경우 효과적인 것으로 고려된다. 바람직한 전신적 투여량은 하루에 체중 1 kg 당 약 0.1 mg 내지 약 140 mg 범위(하루에 환자 당 약 0.5 mg 내지 약 7 g)이며, 경구 투여량은 일반적으로 정맥내 투여량보다 약 5 내지 20 배 더 높다. 단일 투여 형태를 제조하기 위한 담체 물질과 조합될 수 있는 항체 또는 항체 유도체의 양은 치료될 숙주 및 특정 투여 방식에 따라 달라질 것이다. 투여 단위 형태는 일반적으로 약 1 mg 내지 약 500 mg의 활성 성분을 함유할 것이다.
약학 조성물은, 예를 들면 VEGF에 특이적인 항체 또는 항체 유도체에 반응성인 상태를 치료하기 위해 패키지화될 수 있다. 패키지화된 약학 조성물은 여기에 기술된 유효량의 하나 이상의 항체 또는 항체 유도체를 보유하는 용기 및 함유된 조성물이 환자에서의 투여 후에 하나의 항체 또는 항체 유도체에 반응성인 질환/장애를 치료하기 위해 사용되는 것임을 나타내는 지시서(예를 들면, 라벨)를 포함할 수 있다.
본 발명의 항체 또는 항체 유도체는 또한 화학적으로 변성될 수 있다. 바람직한 변성 그룹은 폴리머이며, 예를 들면 임의로 치환된 직쇄 또는 분지쇄 폴리알켄, 폴리알케닐렌 또는 폴리옥시알킬렌 폴리머 또는 분지된 또는 분지되지 않은 폴리사카라이드이다. 이러한 이펙터(effector) 그룹은 생체 내에서 항체의 반감기를 증가시킬 수 있다. 합성 폴리머의 특정한 예로는, 임의로 치환된 직쇄 또는 분지쇄 폴리(에틸렌글리콜)(PEG),폴리(프로필렌글리콜), 폴리(비닐알코올) 또는 그의 유도체 등이 있다. 특히 자연적으로 발생하는 폴리머는 락토스, 아밀로스, 덱스트란, 글리코겐 또는 이들의 유도체 등이 있다. 폴리머의 크기는 원하는 바대로 변화시킬 수 있지만 일반적으로 500 Da 내지 50000 Da 범위의 평균 분자량 내에 있게 된다. 항체가 조직을 투과하도록 설계되는 국소 용도에 있어서, 폴리머의 바람직한 분자량은 약 5000 Da이다. 폴리머 분자는 항체에 결합될 수 있으며, 특히 PCT 공개번호 제WO0194585호에 기재된 바와 같은 공유 결합된 힌지 펩티드를 통해 Fab 절편 중쇄의 C-말단부에 부착될 수 있다. PEG 잔기의 부착에 대해서는, 문헌 ["Poly (ethyleneglycol) Chemistry, Biotechnological and Biomedical Applications", 1992, J. Milton Harris (ed), Plenum Press, New York] 및 ["Bioconjugation Protein Coupling Techniques for the Biomedical Sciences", 1998, M. Aslam and A. Dent, Grove Publishers, New York]을 참조한다.
상기 기재된 바와 같은 관심 항체 또는 항체 유도체의 제조 후, 이를 포함하는 약학 제제를 제조한다. 제제화될 항체는 사전 동결건조 처리를 하지 않았으며, 여기에서 관심 제제는 수성 제제이다. 바람직하게는 제제 중의 항체 또는 항체 유도체는 항체 절편, 예를 들면 scFv이다. 제제 중에 존재하는 항체의 치료 유효량은 예를 들면 원하는 투여 부피 및 투여 방식(들)을 고려해서 결정한다. 제제 중의 예시적인 항체 농도는 약 0.1 mg/mL 내지 약 50 mg/mL, 바람직하게는 약 0.5 mg/mL 내지 약 25 mg/mL, 가장 바람직하게는 약 2 mg/mL 내지 약 10 mg/mL이다.
pH 완충 용액 중에 항체 또는 항체 유도체를 포함하는 수성 제제를 제조한다. 본 발명의 완충제는 약 4.5 내지 약 6.0, 바람직하게는 약 4.8 내지 약 5.5, 가장 바람직하게는 약 5.0의 pH를 가진다. 상기 범위 내에서 pH를 조절하는 완충제의 예로는 아세테이트 (예를 들어 아세트산나트륨), 숙시네이트(예를 들면, 소듐 숙시네이트), 글루코네이트, 히스티딘, 시트레이트 및 다른 유기산 완충제를 들 수 있다. 완충제 농도는, 예를 들면 제제의 원하는 등장성 및 완충제에 따라 달라지며 약 1 mM 내지 약 50 mM, 바람직하게는 약 5 mM 내지 약 30 mM일 수 있다. 바람직한 완충액은 pH 5.0의 소듐 아세테이트(약 10 mM)이다.
등장화제(tonicifier)로 작용하며 항체를 안정화시킬 수 있는 폴리올이 제제 중에 포함된다. 바람직한 구현예에서, 제제는 등장화 양의 염, 예를 들면 염화나트륨을 함유하지 않는데, 이는 상기 염이 항체 또는 항체 유도체의 침전을 유발할 수 있고/있거나 낮은 pH에서 산화를 일으킬 수 있기 때문이다. 바람직한 구현예에서, 폴리올은 비환원 당, 예를 들면 수크로스 또는 트레할로스이다. 폴리올은 제제의 원하는 등장성에 따라 달라질 수 있는 양으로 제제에 첨가된다. 바람직하게는 수성 제제는 등장성이며, 이 경우 제제 중 폴리올의 적합한 농도는 예를 들면 약 1％ 내지 약 15％ (w/v)의 범위, 바람직하게는 약 2％ 내지 약 10％ (w/v)의 범위이다. 그러나, 고등장성 또는 저등장성 제제가 적합할 수도 있다. 폴리올의 양은 폴리올의 분자량에 따라 변경될 수 도 있다. 예를 들어 디사카라이드 (예를 들면 트레할로스)에 비해 적은 양의 모노사카라이드 (예를 들어 만니톨)를 첨가할 수 있다.
계면활성제가 또한 항체 또는 항체 유도체 제제에 첨가된다. 예시적인 계면활성제로는 비이온성 계면활성제, 예를 들면 폴리소르베이트(폴리소르베이트 20, 80 등) 또는 폴록사머 (폴록사머 188 등)를 들 수 있다. 첨가되는 계면활성제의 양은 계면활성제가 제제화된 항체/항체 유도체의 응집을 감소시키고/시키거나 제제 중의 미립자의 형성을 최소화하고/하거나 흡수를 감소시키는 양이다. 예를 들어 계면활성제는 제제 중에 약 0.001％ 내지 약 0.5％, 바람직하게는 약 0.005％ 내지 약 0.2％, 가장 바람직하게는 약 0.01％ 내지 약 0.1％의 양으로 존재할 수 있다.
일 구현예에서, 제제는 상기 언급된 물질 (즉, 항체 또는 항체 유도체, 완충제, 폴리올 및 계면활성제)을 함유하며, 하나 이상의 보존제, 예를 들면 벤질 알코올, 페놀, m-크레졸, 클로로부탄올 및 벤즈에토늄 Cl을 본질적으로 함유하지 않는다. 또다른 구현예에서, 특히 제제가 다중투여 제제인 경우에 보존제가 제제 중에 포함될 수 있다. 보존제의 농도는 약 0.1％ 내지 약 2％, 가장 바람직하게는 약 0.5％ 내지 약 1％의 범위일 수 있다. 하나 이상의 다른 제약상 허용가능한 담체, 첨가제 또는 안정화제, 예를 들면, Remington's Pharmaceutical Sciences 21st edition, Osol, A. Ed. (2006)에 기재된 것들이 제제 중에 포함될 수 있으며, 단 이들은 제제의 원하는 특성에 불리한 영향을 주지 않는다. 허용가능한 담체, 첨가제 또는 안정화제는 사용되는 투여량 및 농도에서 수용자에게 비독성이며, 추가의 완충제, 공용매, 아스코르브산 및 메티오닌을 비롯한 항산화제, EDTA와 같은 킬레이트화제, 금속 복합체 (예를 들어 Zn-단백질 복합체), 생분해성 중합체, 예를 들면 폴리에스테르, 및/또는 염-형성 카운터이온, 예를 들면 나트륨이 포함된다.
생체내 투여에 사용될 제제는 멸균된 것이어야 한다. 이는 제제의 제조 이전 또는 이후에 멸균 여과막을 통한 여과에 의해 쉽게 달성된다.
제제는 항체를 사용한 치료를 필요로 하는 포유동물, 바람직하게는 사람에게, 공지된 방법, 예를 들면 볼러스로서의 정맥내 투여에 따라 또는 소정의 시간 동안 지속적인 주입에 의해, 근육내, 복강내, 뇌척수내, 피하, 관절내, 윤활막내, 경막내, 경구, 국소 또는 흡입 경로에 의해 투여된다. 바람직한 구현예에서, 제제는 포유동물에게 정맥내 투여에 의해 투여된다. 이러한 목적을 위해, 예를 들면 상기 제제를 시린지 또는 IV 라인에 의해 주사할 수 있다.
항체의 적절한 투여량 ("치료 유효량")은 예를 들어 치료될 증상, 증상의 중증도 및 경과, 항체가 예방 또는 치료 목적을 위해 투여되는지와 상관 없이, 선행 요법, 환자의 임상적 이력 및 항체에 대한 반응, 사용되는 항체의 유형 및 주치의의 고려에 따라 달라질 것이다. 항체 또는 항체 유도체는 한 시점 또는 일련의 치료 동안 환자에게 적합하게 투여되며, 진단 이후로부터 임의의 시점에서 환자에게 투여될 수 있다. 항체 또는 항체 유도체는 단일 치료로서 또는 당해 증상을 치료하는 데 있어서 유용한 다른 약물 또는 요법과 함께 투여될 수 있다.
일반적인 제안으로서, 투여되는 항체 또는 항체 유도체의 치료 유효량은 1회 이상의 투여에 의해 환자의 체중 kg 당 약 0.1 내지 약 50 mg의 범위이고, 사용되는 항체의 전형적인 범위는 예를 들어 매일 투여로서 약 0.3 내지 약 20 mg/kg이며, 더욱 바람직하게는 약 0.3 내지 약 15 mg/kg이다. 그러나, 다른 투여 요법이 유용할 수 있다. 이러한 요법의 진행은 통상의 기술에 의해 쉽게 관찰된다.
본 발명의 또다른 구현예에서, 본 발명의 약학 제제, 바람직하게는 수성 제제를 보유하며 임의로 그의 사용 지시서를 제공하는 용기를 포함하는 제조 용품이 제공된다. 적합한 용기로는 예를 들면 병, 바이알, 및 시린지를 들 수 있다. 용기는 다양한 물질, 예를 들면 유리 또는 플라스틱으로부터 형성될 수 있다. 예시적인 용기는 3 내지 20 cc 1회용 유리 바이알이다. 선택적으로, 다중투여 제제의 경우, 용기는 3 내지 100 cc 유리 바이알일 수 있다. 용기는 제제, 및 용기 상의 또는 용기와 결합된 라벨을 보유하며, 용기는 사용 지시사항을 나타낼 수 있다. 제조 용품은 상업적 및 사용자 입장에서 바람직한 다른 물질, 예를 들면 다른 완충제, 희석제, 필터, 바늘, 주사기, 및 사용 지침을 갖는 패키지 삽입물을 비롯한 다른 물질을 추가로 포함할 수 있다.
임의의 바람직한 구현예에서, 제조 용품은 여기에서 기술된 또는 여기에 기술된 방법에 의해 제조된 동결건조된 면역결합제를 포함한다.
도 1은 래빗 모노클로날 항체로부터의 항원 결합 부위를 고가용성이고 안정한 인간 항체 프레임워크에 그래프팅하기 위해 여기에서 사용된 CDR H1 정의를 나타낸 것이다.
도 2는 세포내 염료 4로 염색된 표적 발현 세포 3과 상호작용하는 형광 항체 2로 표지된 B-세포를 도식적으로 나타낸 것이다. 선택 표적: 5; BCR: 6.
도 3: ESBA903 가용성 표적과 결합하는 래빗 B 세포의 FACS 선택 과정. 도 3A: 림프구가 전방과 측면 스캐터에 따라 게이트된다. 도 3B: 이들 중에서, IgG+ IgM- 세포(추측컨대 메모리 B 세포)가 선택된다(레드 게이트). 도 3C: ESBA903-PE와 ESBA903-PerCP로 이중 염색된 세포(그린 게이트)는 ESBA903에 대해 높은 친화성 IgG를 코딩할 것으로 예상된다. 가장 밝은 형광을 띠는 세포를 96-웰 플레이트에 분류하였다.
도 4: 안티-TNFα 항체로 코팅된 비즈(beads)(PE 표지된)가 TNFα로 트랜스펙트된 CHO 세포에 결합한다(상부 패널). 안티-CD19 항체로 코팅된 대조용 비즈(APC 표지된)는 TNFα 트랜스펙트된 CHO 세포를 결합하지 않는다(중간 패널). 안티-TNFα 항체로 코팅된 비즈(PE 표지된)는 야생형(wt) CHO 세포와 결합하지 않는다(하부 패널). 왼쪽의 도트 플롯은 전방과 측방 스캐터를 나타내며, 이들은 각각 이 건의 크기와 입도를 나타낸다. 싱글 비즈(~3um) 군집은 P2에 게이트된다. 비즈(~30um)에 실질적으로 결합된 CHO 세포는 P1에 게이트된다. 중간의 도트 플롯은 이들의 PE 또는 APC 염색에 대하여 P1 경우(CHO 세포)를 나타낸다. 따라서, 세포가 안티-TNFα 비즈와 상호작용하면, 이들은 P3 게이트에 나타날 것이고, 이들이 안티-CD19 비즈와 상호작용하면 이들은 P4 게이트에 나타날 것이다. 오른쪽에 각 샘플에 대한 통계를 상세하였다.
도 5. 안티-TNFα-PE로 코팅된 비즈와 안티-CD19-APC로 코팅된 비즈를 TNFα로 트랜스펙트된 CHO 세포와 함께 혼합하였다. CHO 세포가 게이트(P1)되었고, 이들 중에서 안티-TNFαPE 코팅된 비즈 또는 안티-CD19-APC 코팅된 비즈와 결합하는 세포가 게이트 P3와 P4 각각에 나타났다. 결합되지 않은 비즈는 게이트 P2에서 보인다.
도 6. 가변 중쇄의 CDR3가 전형적으로 그의 마우스 대응물 보다 3개 아미노산이 더 긴 것을 Kabat 데이터베이스에서 추출된 래빗 항체 서열을 분석하여 확인하였다.
실시예
본 발명은 다음 실시예에 의해 보다 상세히 예시되었으며, 이들 실시예는 제한적인 것으로 이해되지 않아야 한다. 본원에서 인용된 모든 도면과 모든 참조문헌, 특허 및 공개된 특허출원의 내용은 그 전체가 참조를 위해 여기에 포함되어 있다.
일반적인 재료와 방법
일반적으로, 본 발명의 실시는, 다른 지시가 없는 한, 화학, 분자 생물학, 재조합 DNA 기술, 면역학(특히, 예를 들면, 항체 기술)의 공지된 방법, 및 폴리펩티드 제조의 표준 기술을 적용한다. 예를 들면, Sambrook, Fritsch and Maniatis, Molecular Cloning: Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989); Antibody Engineering Protocols (Methods in Molecular Biology), 510, Paul, S., Humana Pr (1996); Antibody Engineering: A Practical Approach (Practical Approach Series, 169), McCafferty, Ed., Irl Pr (1996); Antibodies: A Laboratory Manual, Harlow et al, C.S.H.L. Press, Pub. (1999); 및 Current Protocols in Molecular Biology, eds. Ausubel et al, John Wiley & Sons (1992) 등의 문헌을 참조할 수 있다. 래빗과 다른 비인간 모노클로날 항체의 CDR을 선택된 사람 항체 프레임워크에 그래프팅하는 방법을 상세하게 기술하였다. 이러한 그래프팅의 실험예는 하기한 바와 같다.
이해를 돕기 위하여, "min"으로 명명된 그래프트는 CDR이 프레임워크 1.4 또는 그의 가변 도메인에 그래프트된 것이며, "max"로 명명된 그래프트는 CDR이 프레임워크 1.4 또는 그의 가변 도메인에 그래프트된 것으로, 여기에서 상기 프레임워크는 항원과 상호작용하는 공여체 프레임워크 잔기를 추가로 포함한다.
실시예 1: rFW1.4의 설계
1.1 프라이머리 서열 분석과 데이터베이스 검색
1.1.1. 래빗 면역글로불린 서열의 수집
래빗의 성숙한 항체와 생식 계열의 가변 도메인의 서열을 상이한 오픈 소스 데이터베이스(예를 들면, Kabat database 및 IMGT)로부터 수집하고 한 글자 코드 아미노산 서열로서 상용화된 데이터베이스에 입력하였다. 전체 분석에 있어서, V(가변) 영역에 상응하는 아미노산 부위 만을 사용하였다. KDB 데이터베이스와 70% 미만으로 일치하거나 또는 프레임워크 영역 내에 다수의 결정되지 않은 잔기를 함유하는 서열을 폐기하였다. 데이터베이스 내의 다른 서열과 95% 이상의 동일성을 가지는 서열도 분석의 불규칙한 잡음을 피하기 위해 배제하였다.
1.1.2. 래빗 서열의 정렬 및 넘버링
래빗 항체 서열을 Needleman-Wunsch 알고리즘과 Blossum 매트릭스에 기초한 종래의 서열 정렬 도구를 사용하여 정렬하였다. 갭의 삽입과 잔기 위치의 명명을 면역글로불린 가변 도메인을 위한 AHo 넘버링 시스템에 따라 실시하였다 (Honegger and Pluckthun, 2001). Kabat 넘버링 체계는 항체의 잔기를 넘버링하는 가장 널리 사용되는 표준이므로 이 방법도 동시에 적용하였다. Kabat 넘버링은 SUBIM 프로그램을 사용하여 주어졌다. 이 프로그램은 항체 서열의 가변영역을 분석하고 Kabat과 그의 공동작업자들이 구축한 시스템(Deret et al 1995)에 따라 서열을 숫자화하였다.
서열 가변성에 기초하고 가장 일반적으로 사용되는 Kabat 정의에 따라 프레임워크와 CDR 영역을 정의하였다. 그럼에도 불구하고, CDR-Hl 지정은 AbM, kabat, 3D 컴플렉스 구조 서브세트의 항원과 항체 간의 접촉 분석으로 생성된 평균 접촉 데이터(MacCallum et al., 1996) 및 구조적 루프 영역(도 1 참조)하는 Chotia 등의 상이한 정의 사이에서 타협하였다.
1.1.3. 잔기 위치의 빈도 및 보존
아미노산 서열 다양성을 kabat 데이터베이스로부터의 423 래빗 서열 세트를 사용하여 분석하였다. 성숙한 래빗 서열에서의 각 위치, i에 대한 잔기 빈도, f(r)를 특정한 잔기가 데이터 내에서 관찰된 횟수를 전체 서열 수로 나누어 계산하였다. 각 위치 i에 대한 보존도는 각 잔기의 상대적 함량뿐만 아니라 상이한 아미노산이 존재하는 수를 고려한 Simpson 인덱스를 사용하여 계산하였다.
Figure pat00003
여기에서, N은 전체 아미노산 수이고, r은 각 위치에 존재하는 상이한 아미노산의 수이며, n은 특정한 아미노산 종류의 잔기 수이다.
1.1.4. 래빗 V 영역의 계보 분석
계통발생 분석 도구를 사용하여 래빗 레퍼토리를 시험하였다. V 영역의 아미노산 서열을 양 클러스터와 토폴로지 알고리즘을 사용하여 클러스터하였다. 거리 매트릭스를 전제 어레이에 대해 계산하고 생식계열 사용의 지표로 사용하였다. 각 클러스터의 컨센서스 서열을 계산하고 가장 가까운 래빗 생식계열 서열 대응물을 확인하였다. 또한 전체 컨센서스 서열을 서열의 전체 세트에 대해 유도하였다.
1.1.5. 인간 서브그룹의 배정
상이한 클러스터들의 각각의 래빗의 대표적인 서열에 있어서, 가장 상동인 인간 서브그룹을 서열 분석 알고리즘의 EXCEL 시행 및 사람 항체 레퍼토리의 분석에 기초한 분류 방법(Knappik et al., 2000)을 사용하여 확인하였다.
1.2. 인간 수용체 프레임워크의 설계
상기한 서열 분석으로부터의 래빗 레퍼토리의 블루프린트로, 래빗 CDR의 위치화와 일반적으로 연관된 프레임워크 내의 잔기를 확인하였다. 래빗 레퍼토리와 각각의 클러스터와 관련하여 높은 상동성을 가지는 프레임워크 중에서 양호한 생체물리학적 특성을 가지는 것을 전체 사람 서열의 풀(pool)로부터 선택하였다. 수용체 프레임워크로서 작용하는 선택된 프레임워크는 가변 경쇄 서브그룹 카파 1과 ESBATech의 ID KI 27, a43를 상응하여 가지는 가변 중쇄 서브그룹 III에 속한다. 이러한 안정하고 가용성인 항체 프레임워크를 인간 비장 scFv 라이브러리의 스크리닝에 의해 "품질 관리" 시스템(Auf der Maur et al., 2004)으로 지칭되는 효모를 포함하는 스크리닝 방법을 사용하여 확인하고 "FWl.4"로 지정하였다. 안정하고 가용성인 프레임워크 서열 FWl.4는 높은 상동성을 나타내지만, 가장 상동인 서열은 얻을 수 없다. 확인된 잔기를 상기 수용체 프레임워크에 포함시켜서, rFWl.4를 생성하였다.
아미노산 서열 다양성, 생식계열 사용 및 래빗 항체의 구조적 특징에 대한 정보를 사용하여 FWl.4를 CDR 입체구조가 새로운 인간 프레임워크에서 보존되는데 필요한 잔기 위치의 적합성에 대해 분석하였다. FWl.4의 가변영역을 다음 특징들의 적합성에 대해 시험하였다:
i. 루프 구조에 대한 정준 서열의 일부인 잔기
ii. VL/VH 경계면에 위치한 프레임워크 잔기
iii. CDR 바로 아래의 잔기 플래트폼
iv. 상부와 하부 코어 잔기
v. 서브타입을 규정하는 프레임워크 잔기
1.3. 래빗 CDR의 그래프팅
하나의 항체로부터의 CDR 서열(상기 정의에 따른)과 FWl.4 또는 rFWl.4의 프레임워크 서열을 간단하게 결합하여 그래프트를 생성하였다. 결합에 잠재적으로 연관된 잔기를 확인하였다. 각각의 래빗 가변 도메인 서열에 대하여 가장 근접한 래빗 생식계열 대응물을 확인하였다. 가장 근접한 생식계열을 구축할 수 없다면, 서열을 서브그룹 컨센서스 또는 유사성 비율이 높은 래빗 서열의 컨센서스에 대해 비교하였다. 희소한 프레임워크 잔기는 체세포 초돌연변이의 가능한 결과로 결합에서 작용하는 것으로 간주되었다. 결과적으로 이러한 잔기는 수용체 프레임워크에 그래프트된다.
1.4 결 과
구조, 아미노산 서열 다양성 및 생식계열 용도에 대하여 래빗 항체 레퍼토리를 분석하여 FWl.4의 경쇄 내의 5개 잔기 위치가 래빗 CDR의 루프 입체구조를 유지하기 위해 변성되는 것을 발견하였다. 이 위치들은 래빗 항체에서 고도로 보존된다. 상기 5개 위치에 대한 컨센서스 잔기를 래빗 레퍼토리에서 추론하여 인간 수용체 프레임워크 1.4에 삽입하였다. 보존된 위치의 변성으로, 상기 프레임워크는 래빗 CDR 중에서 6개 상보성결정영역(CDR) 모두와 실질적으로 상용(compatible)하게 되었다. 상이한 래빗 CDR을 함유하는 마스터 rFWl.4는 야생형 단일 사슬과 비교하여 잘 발현되고 잘 생산된다. 상기 프레임워크와 래빗 CDR의 조합에서 유도된 16개를 작용성을 나타내는 상세한 특성화를 만들었다.
실시예 2: B 세포 스크리닝 시스템
B 세포 리셉터(BCR)에 의해서 관심있는 표적물에 결합하는 B 세포를 선택하기 위해서 FACS(유동세포계측법에 기초한 단일세포 소팅)에 기초한 스크리닝 시스템을 ESBA Tech에서 구축하였다. 예를 들면, 하나의 표적물은 가용성 단백질, 즉 형광성 염료(PE 및 PerCP)로 표지된 단일 사슬 항체(ESBA903)였다. 림프구 현탁액을 재조합 표적물로 면역화된 래빗의 비장으로부터 제조하였다. 그런 다음, 세포를 IgG (APC-표지된) 또는 IgM (FITC 표지된)에 특이적인 항체, 및 PE와 PerCP 표지된 ESBA903과 함께 인큐베이션하였다. 그 표면에서 IgM이 아니라 IgG를 발현하는 ESBA903 양성 B-세포를 96-웰 플레이트에서 소팅하였다(도 3; 표 2). 흉선종 헬퍼 세포주(EL4-B5: Zubler et al, 1985, J. Immunol, 134(6): 3662-3668)를 사용하여 선택된 B-세포를 증식하고 플라스마 세포에 분화시켜 항체를 분비하였다. 상기 IgG의 표적물에 대한 친화성을 ELISA 및 Biacore 측정으로 확인하였다. 운동 매개변수들을 7개의 선택된 클론에 대해서 표 1에 나타내었다. 이들 클론은 ~200 소팅된 세포의 풀로부터 유래하였으며, 나노몰 내지 피코몰 범위의 낮은 결합 친화성을 나타낸다. 마직막으로 mRNA를 관심있는 6개 클론으로부터 단리하고 CDR을 단일 사슬 프레임워크 FW1.4에 그래프트하였다.
Figure pat00004
실시예 3: 막결합 TNFα를 발현하는 TNFα 항체 및 CHO 세포로 코팅된 비즈 간의 상호작용 검출
유동세포계측법 스트림의 고압이 2개 세포 간의 비공유결합을 분해하는지의 여부를 평가하기 위해 다음 실험을 수행하였다. 막결합 TNFα(B-220 세포)로 안정하게 트랜스펙트된 CHO 세포를 PE-표지된 안티-TNFα 항체로 코팅된 비즈와 인큐베이션하였다. 이 단계에서 비즈들은 메모리 B 세포를 모방한다(이들은 같은 크기 내외이다.). 음성 대조군으로, 트랜스펙트되지 않은 CHO 세포를 사용하고 비즈는 APC 표지된 연관되지 않은 항체(anti-CD 19)로 피복되었다. 교반 하에 4 ℃에서 2시간 동안 인큐베이션한 후, 세포-비즈 현탁액을 FACS(130 um 노즐 사용)로 분석하였다. 도 4는 안티-TNFα 비즈와 TNFα로 트랜스펙트된 CHO 세포 사이의 특이적 결합을 FACS로 명백하게 검출할 수 있음을 나타내고 있다. 실제로, 이 샘플(상부 패널)에서 비즈의 약 3/2가 세포와 결합하였다(267 비결합에 대해 585 결합), 반대로, 대조 샘플(중간 및 하부 패널)에서 비즈는 거의 CHO 세포와 결합하지 않았다. 또한, 두 개의 비드 개체군(안티-TNFα-PE 및 안티-CD19-APC)을 TNFα로 트랜스펙트된 CHO 세포와 혼합하였다. 도 5와 표 4는 안티-TNFα 비즈의 약 절반이 CHO 세포와 결합하는 반면, 안티-CD19 비즈의 거의 대부분이 결합하지 않고 남아있는 것을 보여준다. 각 샘플에서 세포에 결합하는 비즈의 비율을 표 5에 상세히 기재하였다. 따라서, B 세포 리셉터를 통해서 막관통 표적 단백질과 결합하는 단일 B 세포의 특이적 선택이 유동세포계측법을 사용하여 가능한 것을 보여주고 있다.
Figure pat00005
Figure pat00006
표 3C 소팅 통계 (도 4c 참조)
Figure pat00007
Figure pat00008
Figure pat00009
실시예 4: 안티-TNFα 래빗 공여체 항체의 CDR 그래프팅과 작용적 인간화
4개의 안티-TNFα 래빗 항체 "Rabmabs"(EPI-1, EPI-15, EP-34, EP-35 및 EP-42)를 CDR 그래프팅을 위해 선택하였다. 인간화된 래빗 공여체 항체의 CDR 그래프팅, 인간화, 및 예비 특성화의 일반적 실험 방법은 상세한 설명에 요약하였다. 비인간 공여체 항체와 가장 큰 서열 상동성을 공유하는 인간 항체 수용체를 사용하는 종래의 면역화 방법과 달리, 래빗 CDR을 목적하는 작용 특성(용해도와 안정성)을 위해 품질관리 에세이(PCT 공개 번호 제WOO 148017호)를 사용하여 미리 선택된 인간 수용체 프레임워크(FW1.4)에 그래프트하였다. 이러한 안정하고 가용성인 프레임워크 서열은 RabMab와 높은 상동성을 나타낸다.
CDR 그래프트를 여기에 기술된 방법을 사용하여 각각의 RabMab에 대하여 제조하였다. "Min" 그래프트에서, 래빗 CDR 만이 래빗 공여체 항체의 VL 및 VH 도메인에서 인간 수용체 프레임워크 FW1.4로 이식되었다. "Max" 그래프트는 래빗 CDR의 rFW1.4에 대한 그래프팅을 지칭한다.
여기에 기술되고 특성화된 scFv는 다음과 같이 제조되었다. 인간화된 VL 서열을 인간화된 VH 서열에 서열 번호 8의 링커에 의해 연결하여 다음과 같은 배열의 scFv를 얻었다: NH2-VL-링커-VH-COOH. 대부분의 경우, 다양한 scFv를 코딩하는 DNA 서열은 관련업체인 Entelechon GmbH (www.entelechon.com)에서 새로 합성하였다. 얻어진 DNA 삽입물을 박테리아 발현벡터 pGMP002 내에 scFv DNA 서열의 5'와 3' 말단에 각각 삽입된 Ncol과 HindIII 제한부위에 의해 클론하였다. VL 도메인과 VH 도메인의 DNA 서열 사이에 BamHI 제한부위가 위치한다. 일부에서, scFv를 코딩하는 DNA를 새로 합성하지 않았지만 scFv를 발현하는 구조물은 도메인 셔플링에 의해 클론되었다. 따라서, VL 도메인을 절단하여 Ncol과 BamHI 제한부위에 의해 새로운 구조물에 삽입하고, VH 도메인은 BamHI과 HindIII 제한부위에 의해 삽입하였다. 다른 경우에서, 포인트 돌연변이는 최첨단 어셈블링 PCR 방법을 사용하여 VH 및/또는 VL 도메인에 삽입되었다. GMP002의 클로닝은 PCT 공개 번호 제WO2008006235호의 실시예 1에 기술되어 있다. scFv는 PCT 공개 번호 제WO2008006235호의 실시예 1의 ESBA105와 유사한 방법으로 제조되었다.
표 3은 4개의 래빗 모노클로날(EP6, EP 19, EP34, EP35 및 EP43)과 이들의 CDR 그래프트된 변이체에 대한 상세한 특성화 데이터의 요약을 나타낸 것이다. CDR 그래프트가 BIACore 결합 에세이와 L929, TNFα와 매개된 세포독성 에세이에서 넓은 범위의 활성을 나타내지만, 4 맥시멀("max") 그래프트 중 3은 치료학적으로 관련있는 활성을 나타낸다. EP43max는 가장 유리한 결합 친화성(Kd 0.25 nM)과 세포독성 에세이에서의 우수한 EC50을 나타내었다. 이러한 데이터는 FW1.4(서열 번호 1과 2)가 래빗 CDR을 그래프팅하는 모범적인 가용성이고 안정한 인간 수용체 프레임워크 영역임을 나타낸다.
역가 에세이
안티-TNFα 결합제의 중화 활성을 L929 TNFα로 매개된 세포독성 에세이로 평가하였다. Actinomycin으로 처리된 마우스 L929 피브로블라스트의 독성을 재조합 인간 TNF (hTNF)로 유도하였다. 90%의 맥시멀 hTNF로 유도된 세포독성을 측정하여 TNF 농도를 1000 pg/ml로 하였다. 모든 L929 세포를 페놀레드를 포함하는 RPMI 1640에서 배양하였고, L-글루타민 배지를 소태아 혈청(10% v/v)으로 보충하였다. 안티-TNFα 결합제의 중화 활성을 페놀레드와 5% 소태아 혈청이 없는 RPMI 1640에서 평가하였다. 안타고니스트 효과가 반최대 억제(EC50%)에 이르는 농도를 측정하기 위해 상이한 농도(0 - 374 ng/mL)의 안티-TNF 결합제를 1000 pg/ml hTNF 존재 하에서 L929 세포를 첨가하였다. 투여 반응 곡선을 가변 슬로프를 가지는 비선형 시그모이달 회귀로 보정하여 EC50을 계산하였다.
안티 TNF scFv의 바이아코어(BIACORE) 결합 분석
결합 친화성을 측정하기 위하여 BIAcore™-T100을 사용하는 표면 플라스몬 공명 측정방법을 NTA 센서 칩과 His-태그된 TNF(ESBA Tech 제조)를 사용하여 적용하였다. NTA 센서 칩의 표면은 Ni2+NTA 킬레이션에 의해 히스티딘 태그된 분자를 캡쳐하기 위해 니트릴로트리아세트산(NTA)으로 미리 고정화된 카복시메틸레이트화 덱스트란 매트릭스로 구성된다. 인간 TNFα N-his 트라이머(5 nM)를 이들의 N-터미널 his-태그에 의해 니켈로 캡쳐하고 ESBA105(피분석물)를 3배 연속 희석 단계로 30 nM 내지 0.014 nM의 범위의 여러 농도로 주사하였다. 재생단계에서, 니켈, 리간드 및 피분석물로 형성된 복합체를 세척하였다. 반응 시그널이 표면 플라스몬 공명(SPR) 기술로 생성되었고 공명 단위(RU)로 측정되었다. 모든 측정은 25℃에서 수행되었다. 센서그램(Sensorgram)을 인라인 대조 셀 보정 후에 각각의 안티-TNF scFv 샘플에 대해 생성하고 완충액 샘플을 감산하였다. 겉보기 해리속도 상수(kd), 겉보기 결합속도 상수(ka), 및 겉보기 해리 평형상수(KD)를 일 대 일 Langmuir 결합 모델을 사용하여 BIAcore TlOO 평가 소프트웨어 1.1 버젼으로 계산하였다.
Figure pat00010
실시예 5: 안티-VEGF 래빗 공여체 항체의 CDR 그래프팅 및 작용적 인간화
8개의 안티-VEGF Rabmabs(375, 435, 509, 511, 534, 567, 578 및 610)을 CDR 그래프팅을 위해 선택하였다. 비인간 공여체 항체와 가장 큰 서열 상동성을 공유하는 사람 항체 수용체를 사용하는 종래의 면역화 방법과 달리, 래빗 CDR을 목적하는 작용 특성(용해도와 안정성)을 위해 품질관리 에세이(PCT 공개 번호 제WOO 148017호)를 사용하여 미리 선택된 인간 수용체 프레임워크 FW1.4(서열 번호 1과 2)에 그래프트하였다.
CDR 그래프트를 여기에 기술된 방법(실시예 4 참조)을 사용하여 각각의 RabMab(래빗 항체)에 대하여 제조하였다. "Min" 그래프트는 미니멀 그래프트를 포함하며, 여기에서 래빗 CDR 만이 래빗 공여체 항체의 VL 및 VH 도메인에서 인간 수용체 프레임워크 FW1.4(서열 번호 1)로 이식되었다. "Max" 그래프트는 VL 및 VH의 래빗 CDR 뿐만 아니라 항원 결합에 중요할 것으로 추정되는 래빗 공여체의 일부 추가적인 프레임워크 잔기를 포함하였다. 578max의 경우에, FW1.4의 중쇄 가변 도메인 프레임워크 영역은 Kabat 위치 23H, 49H, 73H, 78H, 및 94H에서 추가의 아미노산 변성을 가진다.
표 4에는 "Min" 및 "Max" CDR 그래프트된 변이체에 대한 상세한 특성 데이터를 나타내었다. 이들의 VEGF 억제제로서의 역가를 VEGFR 경쟁 ELISA 및/또는 HUVEC 에세이를 사용하여 측정하여 기술하였다. 이 데이터는 FW1.4(서열 번호 1 및 2)가 래빗 CDF을 그래프팅하는 가용성이고 안정한 모범적인 인간 수용체 프레임워크 영역인 것을 나타낸다.
안티 VEGF scFv의 바이아코어(BIACORE) 결합 분석
scFv의 바이아코어-결합능을 시험하고 결합 친화성을 예시적인 표면 플라스몬 공명방법을 사용하여 BIAcore™-T100으로 측정하였다. 이들 scFv 캔디데이트에 의한 결합에 대해 시험된 VEGF 단백질은, 본 실시예와 이후의 실시예에서, 정제된 Escherichia coli로 발현된 재조합 사람 VEGF165(PeproTech EC Ltd.), 재조합 사람 VEGF121(PeproTech EC Ltd.), 재조합 사람 VEGF110(ESBATech AG), 재조합 마우스 VEGF164(PeproTech EC Ltd.), 재조합 래트 VEGF164(Biovision), 재조합 래빗 VEGF110(ESBATech AG), 및 재조합 사람 PLGF (PeproTech EC Ltd.) 등이다. 표면 플라스몬 공명 실험에서, 카복시메틸레이트된 덱스트란 바이오센서 칩(CM4, GE Healthcare)은 제조업체의 지침에 따라 N-에틸-N'-(3-디메틸아미노프로필) 카보디이미드 하이드로클로라이드와 N-히드록시숙신이미드로 활성화된다. 6개의 상이한 VEGF 형태 각각은, 상기에서 예시된 바와 같이, 4개의 상이한 플로우 셀 중 하나에 CM4 센서 칩 상에서 표준 아민-커플링 방법에 의해 결합되었다. 커플링하고 블로킹한 후 상기한 고정화된 VEGF 분자로 얻어진 반응 범위는 hVEGF165에 대하여는 ~250-500 반응 단위(RU), hVEGF110, hVEGF121, 마우스 VEGF164, 래트 VEGF164, 및 래빗 VEGF110에 대하여는 ~200 RU, 그리고 PLGF에 대하여는 400 RU였다. 각 칩의 4번째 플로우 셀은 단백질을 블로킹 전에 고정화하지 않는 것을 제외하고 유사하게 처리되었으며, 플로우 셀은 인라인(in-line) 대조군으로 사용되었다. HBS-EP 완충액(0.01 M HEPES, pH 7.4, 0.15 M NaCl, 3 mM EDTA, 0.005% 계면활성제 P20) 중의 다양한 농도의 안티-VEGF scFv (예를 들면, 90 nM, 30 nM, 10 nM, 3.33 nM, 1.11 nM, 0.37 nM, 0.12 nM 및 0.04 nM)를 플로우 셀에 30μl/분의 유속으로 5분 동안 주사하였다. CM4 칩 상에서 VEGF에서 안티-VEGF scFv의 해리를 10분 동안 25 ℃에서 진행하였다. 센서그램(Sensorgram)을 인라인 대조 셀 보정 후에 각각의 안티-VEGF scFv 샘플에 대해 생성하고 완충액 샘플을 감산하였다. 겉보기 해리속도 상수(kd), 겉보기 결합속도 상수(ka), 및 겉보기 해리 평형상수(KD)를 일 대 일 Langmuir 결합 모델을 사용하여 BIAcore TlOO 평가 소프트웨어 1.1 버젼으로 계산하였다.
VEGF 억제의 HUVEC 에세이
HUVEC 에세이는 VEGF 억제제인, 기술된 안티-VEGF scFv 캔디데이트의 역가를 측정하는 방법이다.
사람의 탯줄정맥 내피세포(HUVECs) (Promocell)를 수 개의 공여체로부터 모아서 패시지 2 내지 패시지 14에서 사용하였다. 세포를 50 μl 완전한 내피세포 성장 배지(ECGM) (Promocell)에 1000 세포/웰 농도로 씨드(seed)하였으며, 상기 배지는 0.4% ECGS/H, 2% 소 태아 혈청, 0.1 ng/ml 표피성장인자, 1 μg/ml 하이드로코르티손(Hydrocortison), 1 ng/ml 베이직 피브로블라스트 인자 및 1% 페니실린/스트렙토마이신(Gibco)을 함유하였다. 7 내지 8시간 후에, 50 μl의 절식 배지(0.5%의 열 불활성화된 FCS와 1%의 페니실린/스트렙토마이신을 함유하는 보충물이 없는 ECGM)를 상기 세포에 첨가하고 이 세포를 15 내지 16 시간 동안 절식시켰다. 안티-VEGF scFvs (0.023-150 nM)와 다음 중 하나-재조합 사람 VEGF165 (0.08 nM), 재조합 마우스 VEGF164 (0.08 nM), 또는 재조합 래트 VEGF164 (0.3 nM)-의 3배 연속 희석물을 절식 배지에서 제조하여 실온에서 30 내지 60분 동안 미리 인큐베이션하였다. VEGF의 상이한 농도를 사용하여 이들의 상이한 상대적 생물학적 활성을 보상하였다. 최대하(submaximal) VEGF로 유발된 증식을 자극하는 농도(EC90)를 사용하였다. 상기 혼합물 100 μl를 HUVEC 현탁액을 함유하는 96-웰 조직 배양물 플레이트에 첨가하고 37 ℃/5% CO2의 부식토화된 인큐베이터에서 4일 동안 인큐베이션하였다. 20 μl/웰 WST-I 세포 증식 시료(Roche)를 첨가하고 Sunrise 마이크로플레이트 판독기(Tecan)를 사용하여 HUVEC의 증식을 450 nm (620 nm 대조 파장으로 사용)에서 흡광도를 측정하여 평가하였다. 4-매개변수 로지스틱 커브 피트를 사용하여 데이터를 분석하였고, HUVEC 증식을 50%까지 억제하는데 필요한 안티-VEGF scFv의 농도(EC50)를 억제 곡선으로부터 유도하였다.
Figure pat00011
동등한 구현예
본 발명에 대한 다양한 변형과 선택적 구현예가 당업자들에게는 이전의 설명에 따라 명백할 것이다. 따라서, 상기한 설명은 예시일 뿐으로 이해되어야 하며 당업자들에게 본 발명을 실시하기 위한 최선의 방법을 제시하는 목적이다. 구조의 상세는 본 발명의 사상을 벗어나지 않고 실질적으로 변경될 수 있으며 첨부된 특허청구범위 내에서의 모든 변형의 배타적 사용은 보호된다. 본 발명은 첨부된 청구항들과 적용 법률에 의해 요구된 범위까지만 한정한다.
본 원에서 인용된 모든 문헌과 유사물, 예를 들면 특허, 특허출원, 기사, 서적, 논문, 학위논문, 웹 페이지, 그림 및/또는 부록 등은 이러한 문헌과 유사물들의 형식과 상관 없이 그 전체가 참조를 위해 통합되었다. 통합된 문헌과 유사물 중 하나 이상이, 예를 들면 정의된 용어, 용어 사용, 기술된 방법 등에서 본 명세서와 다르거나 모순되는 경우, 본 명세서를 따른다.
SEQUENCE LISTING <110> ESBATech AG <120> Humanization of rabbit antibodies using an universal antibody framework <130> Rabbitization <160> 25 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 232 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> variable heavy chain framework of FW1.4 (a43) <220> <221> CDR <222> (26)..(75) <223> CDR1; at least 3 and up to 50 amino acids can be present or absent; Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> CDR <222> (90)..(139) <223> CDR2; at least 3 and up to 50 amino acids can be present or absent; Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> CDR <222> (172)..(221) <223> CDR3; at least 3 and up to 50 amino acids can be present or absent; Xaa can be any naturally occurring amino acid <400> 1 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 20 25 30 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 35 40 45 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 50 55 60 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Trp Val Arg Gln Ala 65 70 75 80 Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ser Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 85 90 95 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 100 105 110 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 115 120 125 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Arg Phe Thr Ile Ser 130 135 140 Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg 145 150 155 160 Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Lys Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 165 170 175 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 180 185 190 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 195 200 205 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Trp Gly Gln 210 215 220 Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 225 230 <210> 2 <211> 231 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> variable light chain framework of FW1.4(KI27) <220> <221> CDR <222> (24)..(73) <223> CDR1; at least 3 and up to 50 amino acids can be present or absent; Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> CDR <222> (89)..(138) <223> CDR2; at least 3 and up to 50 amino acids can be present or absent; Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> CDR <222> (171)..(220) <223> CDR3; at least 3 and up to 50 amino acids can be present or absent; Xaa can be any naturally occurring amino acid <400> 2 Glu Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ser Thr Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Ile Ile Thr Cys Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 20 25 30 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 35 40 45 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 50 55 60 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly 65 70 75 80 Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 85 90 95 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 100 105 110 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 115 120 125 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Gly Val Pro Ser Arg Phe 130 135 140 Ser Gly Ser Gly Ser Gly Ala Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu 145 150 155 160 Gln Pro Asp Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 165 170 175 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 180 185 190 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 195 200 205 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Phe Gly Gln Gly 210 215 220 Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly 225 230 <210> 3 <211> 483 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> framework of FW1.4 <220> <221> CDR <222> (24)..(73) <223> LCDR1; at least 3 and up to 50 amino acids can be present or absent; Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> CDR <222> (89)..(138) <223> LCDR2; at least 3 and up to 50 amino acids can be present or absent; Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> CDR <222> (171)..(220) <223> LCDR3; at least 3 and up to 50 amino acids can be present or absent; Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> CDR <222> (277)..(326) <223> HCDR1; at least 3 and up to 50 amino acids can be present or absent; Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> CDR <222> (341)..(390) <223> HCDR2; at least 3 and up to 50 amino acids can be present or absent; Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> CDR <222> (423)..(472) <223> HCDR3; at least 3 and up to 50 amino acids can be present or absent; Xaa can be any naturally occurring amino acid <400> 3 Glu Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ser Thr Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Ile Ile Thr Cys Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 20 25 30 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 35 40 45 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 50 55 60 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly 65 70 75 80 Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 85 90 95 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 100 105 110 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 115 120 125 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Gly Val Pro Ser Arg Phe 130 135 140 Ser Gly Ser Gly Ser Gly Ala Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu 145 150 155 160 Gln Pro Asp Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 165 170 175 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 180 185 190 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 195 200 205 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Phe Gly Gln Gly 210 215 220 Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly 225 230 235 240 Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu Val 245 250 255 Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser 260 265 270 Cys Ala Ala Ser Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 275 280 285 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 290 295 300 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 305 310 315 320 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu 325 330 335 Glu Trp Val Ser Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 340 345 350 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 355 360 365 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 370 375 380 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys 385 390 395 400 Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala 405 410 415 Val Tyr Tyr Cys Ala Lys Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 420 425 430 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 435 440 445 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 450 455 460 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr 465 470 475 480 Val Ser Ser <210> 4 <211> 232 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> variable heavy chain framework of rFW1.4 <220> <221> CDR <222> (26)..(75) <223> CDR1; at least 3 and up to 50 amino acids can be present or absent; Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> CDR <222> (90)..(139) <223> CDR2; at least 3 and up to 50 amino acids can be present or absent; Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> CDR <222> (172)..(221) <223> CDR3; at least 3 and up to 50 amino acids can be present or absent; Xaa can be any naturally occurring amino acid <400> 4 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Thr Ala Ser Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 20 25 30 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 35 40 45 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 50 55 60 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Trp Val Arg Gln Ala 65 70 75 80 Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Gly Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 85 90 95 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 100 105 110 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 115 120 125 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Arg Phe Thr Ile Ser 130 135 140 Arg Asp Thr Ser Lys Asn Thr Val Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg 145 150 155 160 Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 165 170 175 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 180 185 190 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 195 200 205 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Trp Gly Gln 210 215 220 Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 225 230 <210> 5 <211> 483 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> framework of rFW1.4 <220> <221> CDR <222> (24)..(73) <223> LCDR1; at least 3 and up to 50 amino acids can be present or absent; Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> CDR <222> (89)..(138) <223> LCDR2; at least 3 and up to 50 amino acids can be present or absent; Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> CDR <222> (171)..(220) <223> LCDR3; at least 3 and up to 50 amino acids can be present or absent; Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> CDR <222> (277)..(326) <223> HCDR1; at least 3 and up to 50 amino acids can be present or absent; Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> CDR <222> (341)..(390) <223> LCDR2; at least 3 and up to 50 amino acids can be present or absent; Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> CDR <222> (423)..(472) <223> HCDR3; at least 3 and up to 50 amino acids can be present or absent; Xaa can be any naturally occurring amino acid <400> 5 Glu Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ser Thr Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Ile Ile Thr Cys Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 20 25 30 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 35 40 45 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 50 55 60 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly 65 70 75 80 Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 85 90 95 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 100 105 110 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 115 120 125 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Gly Val Pro Ser Arg Phe 130 135 140 Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu 145 150 155 160 Gln Pro Asp Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 165 170 175 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 180 185 190 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 195 200 205 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Phe Gly Gln Gly 210 215 220 Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly 225 230 235 240 Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu Val 245 250 255 Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser 260 265 270 Cys Thr Ala Ser Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 275 280 285 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 290 295 300 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 305 310 315 320 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu 325 330 335 Glu Trp Val Gly Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 340 345 350 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 355 360 365 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 370 375 380 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Thr Ser Lys 385 390 395 400 Asn Thr Val Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala 405 410 415 Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 420 425 430 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 435 440 445 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 450 455 460 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr 465 470 475 480 Val Ser Ser <210> 6 <211> 232 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> variable heavy chain framework of rFW1.4(V2) <220> <221> CDR <222> (26)..(75) <223> CDR1; at least 3 and up to 50 amino acids can be present or absent; Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> CDR <222> (90)..(139) <223> CDR2; at least 3 and up to 50 amino acids can be present or absent; Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> CDR <222> (172)..(221) <223> CDR3; at least 3 and up to 50 amino acids can be present or absent; Xaa can be any naturally occurring amino acid <400> 6 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Thr Val Ser Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 20 25 30 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 35 40 45 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 50 55 60 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Trp Val Arg Gln Ala 65 70 75 80 Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Gly Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 85 90 95 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 100 105 110 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 115 120 125 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Arg Phe Thr Ile Ser 130 135 140 Lys Asp Thr Ser Lys Asn Thr Val Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg 145 150 155 160 Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 165 170 175 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 180 185 190 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 195 200 205 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Trp Gly Gln 210 215 220 Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 225 230 <210> 7 <211> 483 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> framework of rFW1.4(V2) <220> <221> CDR <222> (24)..(73) <223> LCDR1; at least 3 and up to 50 amino acids can be present or absent; Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> CDR <222> (89)..(138) <223> LCDR2; at least 3 and up to 50 amino acids can be present or absent; Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> CDR <222> (171)..(220) <223> LCDR3; at least 3 and up to 50 amino acids can be present or absent; Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> CDR <222> (277)..(326) <223> HCDR1; at least 3 and up to 50 amino acids can be present or absent; Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> CDR <222> (341)..(390) <223> HCDR2; at least 3 and up to 50 amino acids can be present or absent; Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> CDR <222> (423)..(472) <223> HCDR3; at least 3 and up to 50 amino acids can be present or absent; Xaa can be any naturally occurring amino acid <400> 7 Glu Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ser Thr Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Ile Ile Thr Cys Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 20 25 30 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 35 40 45 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 50 55 60 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly 65 70 75 80 Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 85 90 95 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 100 105 110 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 115 120 125 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Gly Val Pro Ser Arg Phe 130 135 140 Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu 145 150 155 160 Gln Pro Asp Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 165 170 175 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 180 185 190 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 195 200 205 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Phe Gly Gln Gly 210 215 220 Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly 225 230 235 240 Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu Val 245 250 255 Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser 260 265 270 Cys Thr Val Ser Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 275 280 285 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 290 295 300 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 305 310 315 320 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu 325 330 335 Glu Trp Val Gly Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 340 345 350 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 355 360 365 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 370 375 380 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Arg Phe Thr Ile Ser Lys Asp Thr Ser Lys 385 390 395 400 Asn Thr Val Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala 405 410 415 Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 420 425 430 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 435 440 445 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 450 455 460 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr 465 470 475 480 Val Ser Ser <210> 8 <211> 20 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> linker <400> 8 Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly 1 5 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Leu Leu Ile Tyr Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 85 90 95 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 100 105 110 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 115 120 125 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Gly Val Pro Ser Arg Phe 130 135 140 Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu 145 150 155 160 Gln Pro Asp Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 165 170 175 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 180 185 190 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 195 200 205 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Phe Gly Gln Gly 210 215 220 Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly 225 230 <210> 10 <211> 122 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VH 43_FW1.4_mod <400> 10 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Ser Ser Gly 20 25 30 Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Gly Val Ile Ile Ser Ser Gly Ala Thr Tyr Tyr Ala Ser Trp Ala Lys 50 55 60 Gly Arg Phe Thr Ile Ser Lys Asp Thr Ser Lys Asn Thr Val Tyr Leu 65 70 75 80 Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala 85 90 95 Arg Gly Gly Pro Asp Asp Ser Asn Ser Met Gly Thr Phe Asp Pro Trp 100 105 110 Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 11 <211> 111 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VL 43_FW1.4_mod <400> 11 Glu Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ser Thr Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Ile Ile Lys Cys Gln Ala Ser Gln Ser Ile Ser Asp Trp 20 25 30 Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Gly Ala Ser Arg Leu Ala Ser Gly Phe Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Ala Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Gly Leu Glu Pro 65 70 75 80 Ala Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Gly Trp Ser Asp Ser Tyr 85 90 95 Val Asp Asn Leu Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly 100 105 110 <210> 12 <211> 119 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VH 511_FW1.4_mod <400> 12 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Asn Thr Tyr 20 25 30 Tyr Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Gly Ile Ile Ala Pro Asp Asp Thr Thr Tyr Tyr Ala Ser Trp Ala Lys 50 55 60 Ser Arg Ser Thr Ile Ser Arg Asp Thr Ser Lys Asn Thr Val Tyr Leu 65 70 75 80 Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala 85 90 95 Arg Ser Gly Asp Thr Thr Ala Trp Gly Ala Asp Ile Trp Gly Gln Gly 100 105 110 Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 13 <211> 112 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VL 511_FW1.4_mod <400> 13 Glu Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ser Thr Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Ile Ile Thr Cys Gln Ala Ser Gln Ser Ile Asn Ile Trp 20 25 30 Leu Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Arg Ala Ser Thr Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Asp Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Ala Asn Tyr Ala Tyr Ser Ala 85 90 95 Gly Tyr Gly Ala Ala Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly 100 105 110 <210> 14 <211> 120 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VH 578_FW1.4_mod <400> 14 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Thr Ala Ser Gly Phe Ser Leu Thr Asp Tyr 20 25 30 Tyr Tyr Met Thr Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp 35 40 45 Val Gly Phe Ile Asp Pro Asp Asp Asp Pro Tyr Tyr Ala Thr Trp Ala 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Thr Ser Lys Asn Thr Val Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Gly Gly Asp His Asn Ser Gly Trp Gly Leu Asp Ile Trp Gly Gln 100 105 110 Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 15 <211> 111 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VL 578_FW1.4_mod <400> 15 Glu Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ser Thr Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Ile Ile Thr Cys Gln Ala Ser Glu Ile Ile His Ser Trp 20 25 30 Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Leu Ala Ser Thr Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Gln Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Asp Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Asn Val Tyr Leu Ala Ser Thr 85 90 95 Asn Gly Ala Asn Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly 100 105 110 <210> 16 <211> 119 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VH 534_FW1.4_mod <400> 16 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Thr Ala Ser Gly Phe Ser Leu Ser Tyr Tyr 20 25 30 Tyr Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Gly Ile Ile Gly Pro Gly Asp Tyr Thr Asp Tyr Ala Ser Trp Ala Lys 50 55 60 Gly Arg Phe Thr Ile Ser Lys Asp Thr Ser Lys Asn Thr Val Tyr Leu 65 70 75 80 Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala 85 90 95 Arg Gly Asp Asp Asn Ser Gly Trp Gly Glu Asp Ile Trp Gly Gln Gly 100 105 110 Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 17 <211> 110 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VL 534_FW1.4_mod <400> 17 Glu Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ser Thr Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Ile Ile Thr Cys Gln Ala Ser Gln Ser Ile Asn Trp Leu 20 25 30 Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr 35 40 45 Lys Glu Ser Thr Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser 50 55 60 Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Asp 65 70 75 80 Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Asn Asn Tyr Asp Ser Gly Asn Asn 85 90 95 Gly Phe Pro Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly 100 105 110 <210> 18 <211> 119 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VH 509_FW1.4_mod <400> 18 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Thr Ala Ser Gly Phe Ser Leu Ser Ser Tyr 20 25 30 Tyr Met Cys Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Gly Cys Leu Asp Tyr Val Gly Asp Thr Asp Tyr Ala Ser Trp Ala Lys 50 55 60 Gly Arg Phe Thr Ile Ser Lys Asp Ala Ser Lys Asn Thr Val Tyr Leu 65 70 75 80 Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala 85 90 95 Arg Thr Asp Asp Ser Arg Gly Trp Gly Leu Asn Ile Trp Gly Gln Gly 100 105 110 Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 19 <211> 111 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VL 509_FW1.4_mod <400> 19 Glu Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ser Thr Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Ile Ile Thr Cys Gln Ala Ser Gln Asn Ile Arg Ile Trp 20 25 30 Leu Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Lys Ala Ser Thr Leu Glu Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Asp Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Asn Asn Ala His Tyr Ser Thr 85 90 95 Asn Gly Gly Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly 100 105 110 <210> 20 <211> 120 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VH 578rFW1.4 <400> 20 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Thr Ala Ser Gly Phe Ser Leu Thr Asp Tyr 20 25 30 Tyr Tyr Met Thr Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp 35 40 45 Val Gly Phe Ile Asp Pro Asp Asp Asp Pro Tyr Tyr Ala Thr Trp Ala 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Thr Ser Lys Asn Thr Val Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Gly Asp His Asn Ser Gly Trp Gly Leu Asp Ile Trp Gly Gln 100 105 110 Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 21 <211> 111 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VL 578rFW1.4 <400> 21 Glu Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ser Thr Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Ile Ile Thr Cys Gln Ala Ser Glu Ile Ile His Ser Trp 20 25 30 Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Leu Ala Ser Thr Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Ala Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Asp Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Asn Val Tyr Leu Ala Ser Thr 85 90 95 Asn Gly Ala Asn Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly 100 105 110 <210> 22 <211> 119 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VH 511rFW1.4 <400> 22 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Thr Ala Ser Gly Phe Ser Leu Asn Thr Tyr 20 25 30 Tyr Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Gly Ile Ile Ala Pro Asp Asp Thr Thr Tyr Tyr Ala Ser Trp Ala Lys 50 55 60 Ser Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Thr Ser Lys Asn Thr Val Tyr Leu 65 70 75 80 Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala 85 90 95 Arg Ser Gly Asp Thr Thr Ala Trp Gly Ala Asp Ile Trp Gly Gln Gly 100 105 110 Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 23 <211> 112 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VL 511rFW1.4 <400> 23 Glu Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ser Thr Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Ile Ile Thr Cys Gln Ala Ser Gln Ser Ile Asn Ile Trp 20 25 30 Leu Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Arg Ala Ser Thr Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Ala Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Asp Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Ala Asn Tyr Ala Tyr Ser Ala 85 90 95 Gly Tyr Gly Ala Ala Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly 100 105 110 <210> 24 <211> 122 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VH 43rFW1.4 <400> 24 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Thr Ala Ser Gly Phe Ser Leu Ser Ser Gly 20 25 30 Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Gly Val Ile Ile Ser Ser Gly Ala Thr Tyr Tyr Ala Ser Trp Ala Lys 50 55 60 Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Thr Ser Lys Asn Thr Val Tyr Leu 65 70 75 80 Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala 85 90 95 Arg Gly Gly Pro Asp Asp Ser Asn Ser Met Gly Thr Phe Asp Pro Trp 100 105 110 Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 25 <211> 111 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VL 43rFW1.4 <400> 25 Glu Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ser Thr Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Ile Ile Thr Cys Gln Ala Ser Gln Ser Ile Ser Asp Trp 20 25 30 Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Gly Ala Ser Arg Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Ala Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Asp Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Gly Trp Ser Asp Ser Tyr 85 90 95 Val Asp Asn Leu Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly 100 105 110

Claims (45)

  1. (i) 토끼목의 가변 경쇄 CDR; 및
    (ii) 서열 번호 4와 50% 이상의 동일성을 가지는 인간 가변 중쇄 프레임워크를 포함하는 목적하는 항원에 특이적인 면역결합제.
  2. 제1항에 있어서, 가변 중쇄 프레임워크가 서열 번호 4와 서열 번호 6으로 구성되는 군에서 선택되는 면역결합제 수용체 프레임워크.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 서열 번호 2와 85% 이상의 동일성을 가지는 가변 경쇄 프레임워크를 추가로 포함하는 면역결합제 수용체 프레임워크.
  4. 제3항에 있어서, 경쇄 가변 프레임워크(AHo 넘버링)의 위치 87에 트레오닌(T)을 포함하는 면역결합제 수용체 프레임워크.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 하나의 항에 있어서, 가변 중쇄 프레임워크와 가변 경쇄 프레임워크를 포함하고, 이들은 링커, 특히 서열 번호 8의 링커에 의해 연결되는 면역결합제 수용체 프레임워크.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 하나의 항에 있어서, 서열 번호 3, 서열 번호 5 또는 서열 번호 7과 70% 이상의 동일성을 가지는 프레임워크를 포함하고, 특히 프레임워크가 서열 번호 3, 서열 번호 5 또는 서열 번호 7이거나 또는 이를 포함하는 면역결합제 수용체 프레임워크.
  7. 위치 24에 트레오닌(T), 위치 25에 발린(V), 위치 56에 글리신(G) 또는 알라닌(A), 위치 82에 라이신(K), 위치 84에 트레오닌(T), 위치 89에 발린(V) 및 위치 108에 아르기닌(R)(AHo 넘버링)으로 구성되는 군에서 3개 이상의 아미노산을 포함하는 인간 또는 인간화된 면역결합제 가변 중쇄 수용체 프레임워크.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 하나의 항에 있어서, 위치 12, 103 및/또는 144(AHo 넘버링)의 아미노산이 친수성 아미노산으로 치환되는 면역결합제 수용체 프레임워크.
  9. 제8항에 있어서, 중쇄 프레임워크에
    (a) 위치 12에 세린,
    (b) 위치 103에 세린 (S) 또는 트레오닌 (T) 및/또는
    (c) 위치 144에 세린 (S) 또는 트레오닌 (T)을 가지는 면역결합제 수용체 프레임워크.
  10. 제1항 내지 제9항 중 어느 하나의 항에 있어서, 가변 경쇄 프레임워크 내에 위치 1에 글루탐산(E), 위치 3에 발린 (V), 위치 4에 루이신(L), 위치 10에 세린 (S); 위치 47에 아르기닌 (R), 위치 57에 세린 (S), 위치 91에 페닐알라닌 (F) 및/또는 위치 103에 발린(V)(AHo 넘버링)을 가지는 면역결합제 수용체 프레임워크.
  11. 제1항 내지 제10항 중 어느 하나의 항에 있어서, 공여체 면역결합제, 특히 포유동물 면역결합제, 바람직하게는 래빗 면역결합제의 중쇄 CDRl, CDR2 및 CDR3 및/또는 경쇄 CDRl, CDR2 및 CDR3를 추가로 포함하는 면역결합제 수용체 프레임워크.
  12. 제11항에 있어서, 항원 결합에 연관된 공여체 프레임워크 잔기를 추가로 포함하는 면역결합제 수용체 프레임워크.
  13. 제1항 내지 제12항 중 어느 하나의 항에 있어서, 가변 중쇄 위치 141(AHo 넘버링)에 글리신(G)을 추가로 포함하는 면역결합제 수용체 프레임워크.
  14. 제1항 내지 제13항 중 어느 하나의 항에 따른 면역결합제 수용체 프레임워크의 래빗 CDR의 그래프팅을 위한 용도.
  15. 제1항 내지 제13항 중 어느 하나의 항의 면역결합제 수용체 프레임워크를 포함하는 면역결합제.
  16. 제15항에 있어서, scFv 항체인 면역결합제.
  17. 제15항 또는 제16항에 있어서, 하나 이상의 결합된 분자, 특히 세포독성제, 사이토카인, 케모카인, 성장인자 또는 다른 시그널링 분자 등의 치료제, 조영제 또는, 전사활성인자 또는 DNA-결합 도메인 등의 2차 단백질을 추가로 포함하는 면역결합제.
  18. 제15항 내지 제17항 중 어느 하나의 항에 따른 면역결합제의 진단방법, 치료방법, 타겟 확인 또는 유전자 요법에서의 용도.
  19. 제1항 내지 제13항 중 어느 하나의 항의 면역결합제 수용체 프레임워크, 또는 제15항 내지 제17항 중 어느 하나의 면역결합제를 코딩하는 핵산, 특히 단리된 핵산.
  20. 제19항의 핵산을 포함하는 벡터.
  21. 제20항의 벡터를 포함하는 숙주 세포.
  22. 제19항의 핵산 또는 제20항의 벡터의 유전자 요법에서의 용도.
  23. 제1항 내지 제13항 중 어느 하나의 항의 면역결합제 수용체 프레임워크, 제15항 내지 제17항 중 어느 하나의 항의 면역결합제, 제19항의 핵산 또는 제20항의 벡터를 포함하는 조성물.
  24. (i) CDR Hl, CDR H2 및 CDR H3 서열로 구성되는 군의 하나 이상의 중쇄 CDR을 서열 번호 1과 50% 이상의 동일성을 가지는 인간 중쇄 수용체 프레임워크에 그래프팅하고, 및/또는
    (ii) CDR Ll, CDR L2 및 CDR L3 서열로 구성되는 군의 하나 이상의 경쇄 CDR을 서열 번호 2와 50% 이상의 동일성을 가지는 인간 경쇄 수용체 프레임워크에 그래프팅하는 것을 포함하는, 중쇄 CDRl, CDR2 및 CDR3 서열 및/또는 경쇄 CDRl, CDR2 및 CDR3 서열을 포함하는 래빗 면역결합제의 인간화 방법.
  25. 제24항에 있어서,
    (i) 인간 중쇄 프레임워크가 서열 번호 1, 서열 번호 4 또는 서열 번호 6의 프레임워크 아미노산 서열을 포함하고; 및
    (ii) 인간 경쇄 프레임워크가 서열 번호 2 또는 서열 번호 9의 프레임워크 아미노산 서열을 포함하는 방법.
  26. 제24항 또는 제25항에 있어서, 프레임워크 잔기를 항원 결합과 연관된 래빗 면역결합제의 프레임워크 잔기로 치환하는 것을 추가로 포함하는 방법.
  27. 제24항 내지 제26항 중 어느 하나의 항에 있어서, 중쇄 수용체 프레임워크의 프레임워크 잔기를 중쇄 아미노산 위치 12, 103 및 144(AHo 넘버링) 중 하나 이상에서의 치환, 특히 친수성 아미노산에 대한 치환, 바람직하게는 (a) 위치 12에 세린(S); (b) 위치 103에 트레오닌 (T); 및 (c) 위치 144에 트레오닌(T)으로 구성되는 군에서 선택된 치환으로 치환하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  28. 제24항 내지 제27항 중 어느 하나의 항에 있어서, 경쇄 수용체 프레임워크의 프레임워크 잔기를 AHo 넘버링 시스템에 따른 경쇄 가변영역의 위치 1, 3, 4, 10, 47, 57, 91 및 103 중 하나 이상에서 안정성을 강화하는 치환, 특히 (a) 위치 1에 글루탐산(E), (b) 위치 3에 발린(V), (c) 위치 4에 루이신(L); (d) 위치 10에 세린(S); (e) 위치 47에 아르기닌(R); (e) 위치 57에 세린(S); (f) 위치 91에 페닐알라닌 (F); 및 (g) 위치 103에 발린(V)으로 구성되는 군에서 선택된 치환으로 치환하는 것을 추가로 포함하는 방법.
  29. 제24항 내지 제28항 중 어느 하나의 항의 방법에 따라 인간화된 면역결합제.
  30. 제29항에 있어서, 표적 항원이 VEGF 또는 TNFα인 면역결합제.
  31. 제24항 내지 제28항 중 어느 하나의 항에 있어서, 다음 단계에 따라 B-세포에 의해 생성된 항체 가변 도메인의 공여체 CDR의 식별을 추가로 포함하는 방법:
    a) 래빗 B-세포를 표적 항원과 함께 인큐베이션하는 단계;
    b) 표적 항원에 결합하고 있는 상기한 B-세포를 선택하는 단계; 및
    c) B-세포에 의해 생성된 항체 가변 도메인의 CDR을 식별하는 단계.
  32. 제31항에 있어서, B-세포가 상기 표적 항원에 대해서, 바람직하게는 DNA 접종에 의해 면역된 래빗으로부터 단리되는 방법.
  33. 제31항 또는 제32항에 있어서, B-세포와 표적 항원을 별도로 염색하고 2개 염색의 동시 발생을 단일 세포 소팅에 기초한 유동세포분석법에 의해 양성적으로 선택하는 방법.
  34. 제31항 내지 제33항 중 어느 하나의 항에 있어서, 표적 항원이 가용성 단백질인 방법.
  35. 제31항 내지 제33항 중 어느 하나의 항에 있어서, 표적 항원이 세포 표면에서 발현되고, 특히 표적 항원이 막통과 단백질, 특히 다중막-스패닝 단백질인 방법.
  36. 제35항에 있어서, 표적 항원이 세포내 형광염료로 표적 항원을 발현하는 세포를 염색하여 간접적으로 염색되는 방법.
  37. 제31항 내지 제36항 중 어느 하나의 항에 있어서, B-세포가 B-세포 표면 마커에 특이적인 하나 이상의 표지화된 항체로 염색되는 방법.
  38. 제31항 내지 제37항 중 어느 하나의 항에 있어서, B-세포를 표지된 안티-IgG 항체로 염색하는 방법.
  39. 제38항에 있어서, B-세포를 표지된 안티-IgG 항체로 염색하고 별도로 표지된 안티-IgM 항체로 염색하는 방법.
  40. 제39항에 있어서, 표지된 안티-IgM 항체로 염색된 B-세포를 음성적으로 선택하는 방법
  41. 제31항 내지 제40항 중 어느 하나의 항에 있어서, 제31항의 단계 b)에서 선택된 B-세포를 배양하여, 생성된 항체가 배지, 특히 헬퍼 세포주 존재 하의 배지로 분비되는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  42. 제41항에 있어서, 분비된 항체를 표적 항원에 대한 특이적 결합을 시험하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  43. 제42항에 있어서, 항체의 CDR이 특히 RT-PCR에 의해 증폭되고, 수용체 프레임워크에 그래프트되어, 이어서 표적 항원에 대한 특이적 결합이 시험되는 면역결합제를 생산하는 방법.
  44. 서열 번호 1과 90% 이상의 동일성을 가지는 서열과 서열 번호 2와 85% 이상의 동일성을 가지는 서열을 포함하는 면역결합제 수용체 프레임워크의 래빗 CDR의 그래프팅을 위한 용도.
  45. 제44항에 있어서, 프레임워크가 링커에 의해 연결되는 서열 번호 1과 서열 번호 2를 포함하고, 여기에서 상기 링커는 특히 서열 번호 8을 가지는 용도.
KR1020217023841A 2008-06-25 2009-06-25 보편적 항체 프레임워크를 사용한 래빗 항체의 인간화 KR20210097819A (ko)

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