JP2017190352A - 汎用性抗体フレームワークを用いたイエウサギ抗体のヒト化 - Google Patents
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Abstract
【解決手段】本発明は、汎用性抗体アクセプターフレームワークと、汎用性抗体アクセプターフレームワークを用いて、非ヒト抗体、例えばイエウサギ抗体を融合させるための方法とに関する。本発明の方法によって生成された抗体は、様々な診断上および治療上の適用に有用である。本発明は、本発明に開示の可溶性かつ安定的な軽鎖および/または重鎖ヒト抗体フレームワーク配列中に、イエウサギCDRおよび他の非ヒトCDRを融合させ、それによって、優れた生物物理特性を有するヒト化抗体を生成する方法を提供する。特に、本発明の方法によって生成されたイムノバインダーは、溶解性および安定性などの優れた機能特性を示す。
【選択図】図1
Description
この出願は、2008年6月25日に出願されたUS61/075,697への優先権を主張し、さらに2009年2月24日に出願されたUS61/155,041および2009年2月24日のUS61/155,105への優先権を主張する。
モノクローナル抗体、それらの結合体および誘導体は、治療剤および診断剤として商業的に非常に重要である。非ヒト抗体は、通常、単一の低用量注射後、患者において強い免疫応答を誘発する(Schroff、1985年、Cancer Res、45巻、879〜85頁、Shawler、J Immunol、1985年、135巻、1530〜5頁、Dillman、Cancer Biother、1994年、9巻、17〜28頁)。したがって、マウスおよび他の齧歯動物の抗体の免疫原性を低減するためのいくつかの方法、ならびに、完全ヒト抗体を、例えば、トランスジェニックマウスまたはファージディスプレイを用いて生成する技術が開発された。齧歯動物の可変領域をヒト定常領域と共に併せ持つキメラ抗体(例えば、Boulianne Nature、1984年、312巻、643〜6頁)が遺伝子工学的に構築され、免疫原性の問題をかなり低減させた(例えば、LoBuglio、Proc Natl Acad Sci、1989年、86巻、4220〜4頁;Clark、Immunol Today、2000年、21巻、397〜402頁)。ヒト化抗体も構築された。ヒト化抗体では、可変領域自体の齧歯動物配列が、少なくとも元のCDRを保存しながら、できるだけヒト配列に近くなるように遺伝子工学的に操作されたか、あるいは齧歯動物抗体のCDRがヒト抗体のフレームワーク中に融合させられた(例えば、Riechmann、Nature、1988年、332巻、323〜7頁;特許文献1)。イエウサギ(rabbit)ポリクロナール抗体は、ELISAまたはウエスタンブロットなどの生物学的アッセイに広く用いられている。ポリクローナルイエウサギ抗体は、それらが通常はるかに高い親和性を有するので、ポリクローナル齧歯動物抗体よりもしばしば好まれる。さらに、イエウサギはしばしば、マウスでは免疫原性が乏しい抗原、および/またはファージディスプレイで用いた場合に良好なバインダーをもたらさない抗原に対して良好な抗体反応を誘発できる。イエウサギ抗体のこれらの周知の利点のため、イエウサギ抗体は、治療用抗体の発見および開発での使用に理想的である。これが一般的になされない理由は、主に、モノクローナルイエウサギ抗体の生成における技術的困難にある。骨髄腫様の腫瘍は、イエウサギでは知られておらず、モノクローナル抗体を生成する従来のハイブリドーマ技術は、イエウサギ抗体には適用できない。イエウサギ抗体発現細胞の融合細胞系パートナーを提供する先駆的仕事は、Knightらによって行われ(Spieker−Poletら、PNAS、1995年、92巻、9348〜52頁)、改善された融合パートナー細胞系が2005年にPytelaらによって記載された(例えば、特許文献2参照)。しかし、対応するノウハウが基本的に単一の研究グループによって制御されているため、この技術は広範に普及していない。RT−PCRを介した、選択された抗体発現細胞からの抗体のクローニングを伴うモノクローナル抗体の生成のための代替方法は文献に記載されているが、イエウサギ抗体については一度も成功の報告がなされていない。
驚いたことに、(WO0148017およびAuf der Maurら(2001年)、FEBS Lett、508巻、407〜412頁に開示のような)品質管理(QC)アッセイによって同定された高可溶性かつ安定的なヒト抗体フレームワークが、他の非ヒト動物種由来のCDRを、例えばイエウサギのCDRを、収容するのに特に適することが見出された。したがって、第1の態様において、本発明は、特定のヒト抗体(いわゆる「FW1.4」抗体)の軽鎖および重鎖可変領域を提供する。該抗体は、CDR中にジスルフィド架橋が存在しているか否かに依存せず、様々な結合特異性の種々の抗体、特にイエウサギ抗体からのCDRのための汎用性アクセプターとして特に適している。さらに、本発明は、前記特定のヒト抗体フレームワークの2つの変異体配列、すなわちrFW1.4およびrFW1.4(V2)を提供する。両者ともイエウサギCDRの融合のための汎用性アクセプターフレームワークとして特に適したフレームワークである。別の態様において、本発明は、他の非ヒト動物種由来のCDR、特にイエウサギのCDRを収容するのに適したヒトフレームワークをもたらす、フレームワーク残基のモチーフを提供する。
本発明は、例えば以下の項目を提供する。
(項目1)
(i)ウサギの可変軽鎖CDR、および
(ii)配列番号4に少なくとも50%の同一性を有するヒト可変重鎖フレームワークを含む、所望の抗原に特異的なイムノバインダー。
(項目2)
前記可変重鎖フレームワークが配列番号4および配列番号6からなる群より選択される、項目1に記載のイムノバインダーアクセプターフレームワーク。
(項目3)
配列番号2に少なくとも85%の同一性を有する可変軽鎖フレームワークをさらに含む、前述の項目のいずれか一項に記載のイムノバインダーアクセプターフレームワーク。
(項目4)
前記軽鎖可変フレームワークの位置87(AHoナンバリング)にスレオニン(T)を含む、項目3に記載のイムノバインダーアクセプターフレームワーク。
(項目5)
可変重鎖フレームワークおよび可変軽鎖フレームワークを含み、両者がリンカー、特に配列番号8のリンカーで連結されている、前述の項目のいずれか一項に記載のイムノバインダーアクセプターフレームワーク。
(項目6)
配列番号3、配列番号5もしくは配列番号7に少なくとも70%の同一性を有するフレームワーク、特に、配列番号3、配列番号5もしくは配列番号7を含むかまたは配列番号3、配列番号5もしくは配列番号7であるフレームワークを含む、前述の項目のいずれか一項に記載のイムノバインダーアクセプターフレームワーク。
(項目7)
位置24のスレオニン(T)、位置25のバリン(V)、位置56のアラニン(A)またはグリシン(G)、位置82のリジン(K)、位置84のスレオニン(T)、位置89のバリン(V)および位置108のアルギニン(R)(AHoナンバリング)からなる群のうち少なくとも3つのアミノ酸を含む、ヒトまたはヒト化イムノバインダー可変重鎖アクセプターフレームワーク。
(項目8)
位置12、103および/または144(AHoナンバリング)のアミノ酸が親水性アミノ酸に置換された、前述の項目のいずれか一項に記載のイムノバインダーアクセプターフレームワーク。
(項目9)
前記重鎖フレームワーク中に
(a)位置12のセリン(S)、
(b)位置103のセリン(S)もしくはスレオニン(T)、および/または
(c)位置144のセリン(S)もしくはスレオニン(T)
(AHoナンバリング)を有する、項目8に記載のイムノバインダーアクセプターフレームワーク。
(項目10)
前記可変軽鎖フレームワークにおいて位置1のグルタミン酸(E)、位置3のバリン(V)、位置4のロイシン(L)、位置10のセリン(S)、位置47のアルギニン(R)、位置57のセリン(S)、位置91のフェニルアラニン(F)および/または位置103のバリン(V)(AHoナンバリング)を有する、前述の項目のいずれか一項に記載のイムノバインダーアクセプターフレームワーク。
(項目11)
ドナーイムノバインダー、特に哺乳動物イムノバインダー、好ましくはイエウサギイムノバインダー由来の重鎖CDR1、CDR2およびCDR3、ならびに/または軽鎖CDR1、CDR2、およびCDR3をさらに含む、前述の項目のいずれか一項に記載のイムノバインダーアクセプターフレームワーク。
(項目12)
抗原結合に関与するドナーフレームワーク残基をさらに含む、項目11に記載のイムノバインダーアクセプターフレームワーク。
(項目13)
前記可変重鎖の位置141にグリシン(G)(AHoナンバリング)をさらに含む、前述の項目のいずれか一項に記載のイムノバインダーアクセプターフレームワーク。
(項目14)
イエウサギCDRの融合のための、項目1〜13のいずれか一項に記載のイムノバインダーアクセプターフレームワークの使用。
(項目15)
項目1〜13のいずれか一項に記載のイムノバインダーアクセプターフレームワークを含むイムノバインダー。
(項目16)
scFv抗体である、項目15に記載のイムノバインダー。
(項目17)
1つまたは複数の結合分子、特に、細胞毒性剤、サイトカイン、ケモカイン、増殖因子もしくは他のシグナル伝達分子などの治療剤、造影剤、または第2のタンパク質、特に転写活性化因子もしくはDNA結合ドメインをさらに含む、項目15〜16のいずれか一項に記載のイムノバインダー。
(項目18)
診断適用、治療適用、標的評価または遺伝子療法における、項目15〜17のいずれか一項に記載のイムノバインダーの使用。
(項目19)
項目1〜13のいずれか一項に記載のイムノバインダーアクセプターフレームワークまたは項目15〜17のいずれか一項に記載のイムノバインダーをコードする核酸、特に単離された核酸。
(項目20)
項目19に記載の核酸を含むベクター。
(項目21)
項目20に記載のベクターを含む宿主細胞。
(項目22)
遺伝子療法における、項目19に記載の核酸または項目20に記載のベクターの使用。(項目23)
項目1〜13のいずれか一項に記載のイムノバインダーアクセプターフレームワーク、項目15〜17のいずれか一項に記載のイムノバインダー、項目19に記載の核酸、または項目20に記載のベクターを含む組成物。
(項目24)
イエウサギイムノバインダーをヒト化する方法であって、前記イエウサギイムノバインダーが重鎖CDR1、CDR2およびCDR3配列、ならびに/または軽鎖CDR1、CDR2およびCDR3配列を含み、前記方法が、
(i)配列番号1に少なくとも50%の同一性を有するヒト重鎖アクセプターフレームワーク内に、CDR H1、CDR H2およびCDR H3配列からなる群の少なくとも1つの重鎖CDRを融合させる工程、ならびに/または
(ii)配列番号2に少なくとも50%の同一性を有するヒト軽鎖アクセプターフレームワーク、すなわちヒト軽鎖フレームワーク内に、CDR L1、CDR L2およびCDR L3配列からなる群の少なくとも1つの軽鎖CDRを融合させる工程
を含む、方法。
(項目25)
(i)前記ヒト重鎖フレームワークが、配列番号1、配列番号4または配列番号6のフレームワークアミノ酸配列を含み、
(ii)前記ヒト軽鎖フレームワークが、配列番号2または配列番号9のフレームワークアミノ酸配列を含む、
項目24に記載の方法。
(項目26)
抗原結合に関与する前記イエウサギイムノバインダーのフレームワーク残基で、フレームワーク残基を置換する工程をさらに含む、項目24または25に記載の方法。
(項目27)
重鎖アミノ位置12、103、および144(AHoナンバリング)の少なくとも1つにおける置換で、特に親水性アミノ酸に置換することによって、好ましくは、(a)位置12のセリン(S)、(b)位置103のスレオニン(T)、および(c)位置144のスレオニン(T)からなる群より選択される置換によって、重鎖アクセプターフレームワークのフレームワーク残基を置換する工程をさらに含む、項目24から26のいずれか一項に記載の方法。
(項目28)
AHoナンバリングシステムによる、軽鎖可変領域の位置1、3、4、10、47、57、91および103の少なくとも1つにおける安定性強化置換で、特に、(a)位置1のグルタミン酸(E)、(b)位置3のバリン(V)、(c)位置4のロイシン(L)、(d)位置10のセリン(S)、(e)位置47のアルギニン(R)、(e)位置57のセリン(S)、(f)位置91のフェニルアラニン(F)、および(g)位置103のバリン(V)からなる群より選択される置換で、軽鎖アクセプターフレームワークのフレームワーク残基を置換する工程をさらに含む、項目24から27のいずれか一項に記載の方法。
(項目29)
項目24〜28のいずれか一項に記載の方法によるヒト化イムノバインダー。
(項目30)
前記標的抗原がVEGFまたはTNFαである、項目29に記載のイムノバインダー。(項目31)
a)イエウサギB細胞を標的抗原と共にインキュベートする工程、b)前記標的抗原に結合するイエウサギB細胞を選択する工程、およびc)前記B細胞によって生成された抗体可変ドメインのCDRを同定する工程による、B細胞によって生成される抗体可変ドメインのドナーCDRの同定をさらに含む、項目24から28のいずれか一項に記載の方法。
(項目32)
前記B細胞が、好ましくはDNAワクチン接種によって、前記標的抗原に対して免疫化されたイエウサギから単離される、項目31に記載の方法。
(項目33)
前記B細胞および前記標的抗原が異なって染色され、前記2種の染色の共在が、フローサイトメトリーベースの単一細胞選別によってポジティブ選択される、項目31または32のいずれか一項に記載の方法。
(項目34)
前記標的抗原が可溶性タンパク質である、項目31から33のいずれか一項に記載の方法。
(項目35)
前記標的抗原が細胞の表面に発現され、特に、前記標的抗原が膜貫通タンパク質、特に複数回膜貫通タンパク質である、項目31から33のいずれか一項に記載の方法。
(項目36)
細胞内の蛍光色素による、前記標的抗原を発現する細胞の染色によって、前記標的抗原が間接的に染色される、項目35に記載の方法。
(項目37)
前記B細胞が、B細胞表面マーカーに特異的な1種または複数種の標識抗体で染色される、項目31から36のいずれか一項に記載の方法。
(項目38)
B細胞が、標識された抗IgG抗体で染色される、項目31から37のいずれか一項に記載の方法。
(項目39)
B細胞が、標識された抗IgG抗体および異なって標識されている抗IgM抗体で染色される、項目38に記載の方法。
(項目40)
前記標識された抗IgM抗体で染色されたB細胞がネガティブに選択される、項目39に記載の方法。
(項目41)
前記生成した抗体が、特にヘルパー細胞系の存在下で、培地中に分泌されるように、項目31に記載の工程b)で選択された前記B細胞を培養する工程をさらに含む、項目31から40のいずれか一項に記載の方法。
(項目42)
前記標的抗原への特異的な結合について、前記分泌された抗体を試験する工程をさらに含む、項目41のいずれか一項に記載の方法。
(項目43)
前記抗体のCDRが、特にRT−PCRによって、増幅させられ、イムノバインダーを産生するためにアクセプターフレームワーク中に融合させられ、続いて前記標的抗原への特異的な結合について試験される、項目42に記載の方法。
(項目44)
配列番号1に対して少なくとも90%の同一性を有する配列および/または配列番号2に対して少なくとも85%の同一性を有する配列を含むイムノバインダーアクセプターフレームワークの、イエウサギCDRの融合のための使用。
(項目45)
前記フレームワークが配列番号1および配列番号2を含み、両者がリンカーで、特に配列番号8を有するリンカーによって接続されている、項目44に記載の使用。
(定義)
本発明がより容易に理解され得ることを目的として、特定の用語を以下の通りに定義する。さらなる定義は、この詳細な説明全体にわたって記載される。
cerevisiae、Pichia pastoris、CHO(チャイニーズハムスター卵巣細胞系)またはNS0細胞が挙げられる。
(i)配列番号4に少なくとも70%、好ましくは少なくとも75%、80%、85%、90%、より好ましくは少なくとも95%の同一性を有する可変重鎖フレームワーク、および/または
(ii)配列番号2に少なくとも70%、好ましくは少なくとも75%、80%、85%、90%、より好ましくは少なくとも95%の同一性を有する可変軽鎖フレームワークを含むイムノバインダーアクセプターフレームワークを提供する。
(i)配列番号1、配列番号4および配列番号6からなる群より選択される可変重鎖フレームワーク、および/または
(ii)配列番号2もしくは配列番号9の可変軽鎖フレームワーク
を含む。
(i)ウサギの可変軽鎖CDRと、
(ii)配列番号4に少なくとも50%、より好ましくは少なくとも55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、最も好ましくは100%の同一性を有するヒト可変重鎖フレームワークと
を含む、所望の抗原に特異的なイムノバインダーを提供する。
(i)それぞれの生殖細胞系前駆体配列を同定すること、またはその代わりに、高い相同性のフレームワーク配列の場合にはコンセンサス配列を用いること、
(ii)工程(i)の生殖細胞系前駆体配列またはコンセンサス配列とドナー可変ドメイン配列との配列アラインメントを生成すること、および
(iii)相違している残基を同定すること
によって同定され得る。
(i)重鎖上、配列番号1に少なくとも50%、好ましくは少なくとも55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、より好ましくは少なくとも95%の同一性を有するヒト重鎖アクセプターフレームワーク中に、CDR1、CDR2およびCDR3配列からなる群のうち少なくとも1つ、好ましくは2つ、より好ましくは3つのCDRを融合させる工程、および/または
(ii)軽鎖上、配列番号2に少なくとも50%、好ましくは少なくとも55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、より好ましくは少なくとも95%の同一性を有するヒト軽鎖アクセプターフレームワーク中に、CDR1、CDR2、およびCDR3配列からなる群のうち少なくとも1つ、好ましくは2つ、より好ましくは3つのCDRを融合させる工程を含む。
Immunol. Methods、302巻、116〜124頁) またはインテグリン(Gawazら、1991年、J. Clin. Invest、88巻、1128〜1134頁)によって媒介される接着を調査するために、サイトメーターを使用している。したがって(ii)の場合、選択した標的を発現する細胞を細胞内蛍光色素(例えば、カルセイン)で染色する。細胞表面特異的マーカーに結合する蛍光抗体でB細胞を染色する。したがって、B細胞受容体−標的相互作用を介して相互に接着している2つの細胞に存する2色「イベント」を選択できる(図2参照)。
Immunol.、134(6)巻、3662〜3668頁参照)。例えば、標的タンパク質以外の細胞表面で発現されているタンパク質に対して産生される抗体を除くために、標的に特異的に結合する抗体の生成を試験する検証工程が行われることが好ましい。例えば、CELISA、すなわち、コーティング工程が細胞全体で行われる改変酵素結合イムノソルベント検定法(ELISA)が前記目的に適している。前記方法は、リガンドと競合する抗体の選択性および能力の評価を可能にする。
Single Chain Antibodies」という名称のPCT出願番号PCT/EP2008/001958に開示されている「機能的なコンセンサス」法に従って最適化される。
(b)アミノ酸位置6のQまたはE;
(c)アミノ酸位置7の、T、S、またはA、より好ましくはTまたはA、さらにより好ましくはT;
(d)アミノ酸位置10の、A、T、P、V、またはD、より好ましくはT、P、V、またはD、
(e)アミノ酸位置12の、LまたはV、より好ましくはL、
(f)アミノ酸位置13の、V、R、Q、M、またはK、より好ましくはV、R、Q、またはM;
(g)アミノ酸位置14の、R、M、E、Q、またはK、より好ましくはR、M、EまたはQ、さらにより好ましくはRまたはE;
(h)アミノ酸位置19の、LまたはV、より好ましくはL;
(i)アミノ酸位置20の、R、T、K、またはN、より好ましくはR、T、またはN、さらにより好ましくはN;
(j)アミノ酸位置21の、I、F、L、またはV、より好ましくはI、F、またはL、さらにより好ましくはIまたはL;
(k)アミノ酸位置45の、RまたはK、より好ましくはK;
(l)アミノ酸位置47の、T、P、V、AまたはR、より好ましくはT、P、V、またはR、さらにより好ましくはR;
(m)アミノ酸位置50の、K、Q、H、またはE、より好ましくはK、H、またはE、さらにより好ましくはK;
(n)アミノ酸位置55の、MまたはI、より好ましくはI;
(o)アミノ酸位置77の、KまたはR、より好ましくはK;
(p)アミノ酸位置78の、A、V、L、またはI、より好ましくはA、L、またはI、さらにより好ましくはA;
(q)アミノ酸位置82の、E、R、T、またはA、より好ましくはE、T、またはA、さらにより好ましくはE;
(r)アミノ酸位置86の、T、S、I、またはL、より好ましくはT、S、またはL、さらにより好ましくはT;
(s)アミノ酸位置87の、D、S、N、またはG、より好ましくはD、N、またはG、さらにより好ましくはN;
(t)アミノ酸位置89の、A、V、L、またはF、より好ましくはA、V、またはF、さらにより好ましくはV;
(u)アミノ酸位置90の、F、S、H、D、またはY、より好ましくはF、S、H、またはD;
(v)アミノ酸位置92の、D、Q、またはE、より好ましくはDまたはQ、さらにより好ましくはD;
(w)アミノ酸位置95の、G、N、T、またはS、より好ましくはG、N、またはT、さらにより好ましくはG;
(x)アミノ酸位置98の、T、A、P、F、またはS、より好ましくはT、A、P、またはF、さらにより好ましくはF;
(y)アミノ酸位置103の、R、Q、V、I、M、F、またはL、より好ましくはR、Q、I、M、F、またはL、さらにより好ましくはY、さらにより好ましくはL;および(z)アミノ酸位置107の、N、S、またはA、より好ましくはNまたはS、さらにより好ましくはN。
(aa)アミノ酸位置1の、Q、D、L、E、S、またはI、より好ましくはL、E、S、またはI、さらにより好ましくはLまたはE;
(bb)アミノ酸位置2の、S、A、Y、I、P、またはT、より好ましくはA、Y、I、P、またはT、さらにより好ましくはPまたはT;
(cc)アミノ酸位置3の、Q、V、T、またはI、より好ましくはV、T、またはI、さらにより好ましくはVまたはT;
(dd)アミノ酸位置4の、V、L、I、またはM、より好ましくはVまたはL;
(ee)アミノ酸位置7の、S、E、またはP、より好ましくはSまたはE、さらにより好ましくはS;
(ff)アミノ酸位置10の、TまたはI、より好ましくはI;
(gg)アミノ酸位置11の、AまたはV、より好ましくはA;
(hh)アミノ酸位置12の、SまたはY、より好ましくはY;
(ii)アミノ酸位置14の、T、S、またはA、より好ましくはTまたはS、さらにより好ましくはT;
(jj)アミノ酸位置18の、SまたはR、より好ましくはS;
(kk)アミノ酸位置20の、TまたはR、より好ましくはR;
(ll)アミノ酸位置24の、RまたはQ、より好ましくはQ;
(mm)アミノ酸位置46の、HまたはQ、より好ましくはH;
(nn)アミノ酸位置47の、K、R、またはI、より好ましくはRまたはI、さらにより好ましくはR;
(oo)アミノ酸位置50の、R、Q、K、E、T、またはM、より好ましくはQ、K、E、TまたはM;
(pp)アミノ酸位置53の、K、T、S、N、Q、またはP、より好ましくはT、S、N、Q、またはP;
(qq)アミノ酸位置56の、IまたはM、より好ましくはM;
(rr)アミノ酸位置57の、H、S、F、またはY、より好ましくはH、S、またはF;
(ss)アミノ酸位置74の、I、V、またはT、より好ましくはVまたはT、R、さらにより好ましくはT;
(tt)アミノ酸位置82の、R、Q、またはK、より好ましくはRまたはQ、さらにより好ましくはR;
(uu)アミノ酸位置91の、LまたはF、より好ましくはF;
(vv)アミノ酸位置92の、G、D、T、またはA、より好ましくはG、D、またはT、さらにより好ましくはT;
(xx)アミノ酸位置94の、SまたはN、より好ましくはN;
(yy)アミノ酸位置101の、F、Y、またはS、より好ましくはYまたはS、さらにより好ましくはS;および
(zz)アミノ酸位置103の、D、F、H、E、L、A、T、V、S、G、またはI、より好ましくはH、E、L、A、T、V、S、G、またはI、さらにより好ましくはAまたはV。
Publishers、N.Y., N.Y(1987年)を参照されたい。異種タンパク質(例えば、インタクトな免疫グロブリン)を分泌できる多くの適した宿主細胞系が当該分野で開発されているので、真核細胞が事実上好ましく、それらには、CHO細胞系、様々なCos細胞系、HeLa細胞、293細胞、骨髄腫細胞系、形質転換B細胞およびハイブリドーマが挙げられる。これらの細胞のための発現ベクターは、複製開始点、プロモーターおよびエンハンサーなどの発現制御配列(Queenら、Immunol. Rev.、89巻、49頁(1986年))、ならびにリボソーム結合部位、RNAスプライシング部位、ポリアデニル化部位、転写ターミネータ配列などの必要なプロセシング情報部位を含むことができる。好ましい発現制御配列は、免疫グロブリン遺伝子、SV40、アデノウイルス、ウシ乳頭腫ウイルス、サイトメガロウイルスなどから得られたプロモーターである。Coら、J. Immunol.、148巻、1149頁(1992年)を参照されたい。
Radioligand Assay Techniques、The Endocrine Society、1986年3月を参照されたい)。放射性同位元素を、γ線計数器、もしくはシンチレーションカウンターの使用などの手段によって、またはオートラジオグラフィーによって検出することができる。
Biological And Clinical Applications、Pincheraら(編集)、475〜506頁(1985年)における、Thorpe、「Antibody Carriers Of Cytotoxic Agents In
Cancer Therapy: A Review」;Monoclonal Antibodies For Cancer Detection And Therapy、Baldwinら(編集)、303〜16頁(Academic Press 1985年)における、「Analysis, Results, And Future Prospective Of The Therapeutic Use Of Radiolabeled Antibody In Cancer Therapy」、およびThorpeら、「The Preparation And Cytotoxic
Properties Of Antibody−Toxin Conjugates」、Immunol. Rev.、62巻、119〜58頁(1982年)を参照されたい。
Biotechnological and Biomedical Applications」、1992年、J. Milton Harris(編)、Plenum Press、New York、および「Bioconjugation Protein Coupling Techniques for the Biomedical
Sciences」、1998年、M. Aslam and A. Dent、Grove Publishers、New Yorkを参照されたい。
本開示を、さらに限定するものと解釈すべきではない以下の実施例によってさらに説明する。全ての図ならびにこの出願全体にわたって引用される全ての参考文献、特許および公開された特許出願の内容は、それらの全体が参照により本明細書に明示的に援用される。
一般的に、本発明の実施では、特に示さない限り、化学、分子生物学、組換えDNA技術、免疫学(特に、例えば抗体技術)の従来技法、およびポリペプチド調製の標準技法を採用する。例えば、Sambrook、FritschおよびManiatis、Molecular Cloning: Cold Spring Harbor Laboratory Press(1989年);Antibody Engineering Protocols(Methods in Molecular Biology)、510巻、Paul, S.、Humana Pr(1996年);Antibody Engineering: A Practical Approach(Practical Approach Series、169巻)、McCafferty編、Irl Pr(1996年);Antibodies: A Laboratory Manual、Harlowら、C.S.H.L. Press, Pub.(1999年);およびCurrent Protocols in Molecular Biology、Ausubelら編、John Wiley & Sons(1992年)を参照されたい。イエウサギおよび他の非ヒトモノクローナル抗体からの、選択されたヒト抗体フレームワークへのCDRの融合の方法は、上に詳細に記載されている。そのような融合実験の実施例を以下に示す。
(1.1.一次配列分析およびデータベース探索)
(1.1.1.イエウサギ免疫グロブリン配列の収集)
イエウサギの成熟抗体の可変ドメインおよび生殖系列の配列を様々なオープンソースデータベース(例えば、KabatデータベースおよびIMGT)から収集し、1文字コードアミノ酸配列として、カスタマイズされたデータベースに入力した。全分析について、本発明者らはV(可変)領域に対応するアミノ酸部分のみを用いた。70%未満の完全性、またはフレームワーク領域内に複数の未決定残基を含有する、KDBデータベース中の配列は捨てた。データベース中の任意の他の配列に95%超の同一性を有する配列も、分析におけるランダムノイズを避けるために除いた。
イエウサギ抗体配列は、Needleman−WunschアルゴリズムおよびBlossumマトリックスに基づく従来の配列アライメントツールを用いてアライメントさせた。ギャップの導入および残基位置の命名法は、免疫グロブリン可変ドメインのAHoナンバリングシステムに従って行った(HoneggerおよびPluckthun、2001年)。Kabatナンバリングスキームは、抗体中の残基をナンバリングするのに最も広く採用されている標準法であるので、これも併用した。Kabatナンバリングは、SUBIMプログラムを用いて割り当てた。このプログラムは、抗体配列の可変領域を分析して、Kabatらによって確立されたシステムに従って配列をナンバリングする(Deretら、1995年)。
kabatデータベースから得た423のイエウサギ配列のセットを用いてアミノ酸配列の多様性を分析した。成熟イエウサギ配列中の各位置iの残基頻度f(r)は、特定の残基がデータセット中で観察される回数を配列の総数で割ることによって計算した。各位置iの保存の程度は、存在する異なったアミノ酸の数と、各残基の相対存在量とを考慮に入れて、Simpsonの指標を用いて計算した。
系統学的分析ツールを用いて、イエウサギレパートリーを調査した。クラスターおよび位相的アルゴリズムの両方を用いて、V領域のアミノ酸配列をクラスタリングした。アレイ全体について距離行列を計算し、生殖系列使用の指標として用いた。各クラスターのコンセンサス配列を計算し、最も近いイエウサギ生殖系列配列対応物を同定した。総合的コンセンサス配列も、セット全体の配列から得た。
様々なクラスターのそれぞれのイエウサギ代表配列について、配列分析アルゴリズムのEXCELインプリメンテーションおよびヒト抗体レパートリーの分析に基づいた分類法(Knappikら、2000年)を用いて、最も相同的なヒトサブグループを同定した。
上述の配列分析からのイエウサギレパートリーの青写真を用いて、イエウサギCDRの位置決定に一般的に関与する、フレームワーク中の残基を同定した。イエウサギレパートリーに対して高い相同性を有するフレームワークおよびそれぞれのクラスターのなかから、良好な生物物理特性を有するものを1つ完全ヒト配列のプールから選択した。アクセプターフレームワークとして用いるために選択されたフレームワークは、ESBATechのID KI27、a43に対応する、可変軽鎖サブグループカッパ1および可変重鎖サブグループIIIに属する。この安定的かつ可溶性の抗体フレームワークは、「品質管理」システムと名付けられた酵母ベースのスクリーニング法(Auf der Maurら、2004年)を用いて、ヒト脾臓scFvライブラリーのスクリーニングによって同定され、「FW1.4」と名付けられた。安定的かつ可溶性のフレームワーク配列FW1.4は高い相同性を示すが、それは利用可能な最も高い相同性の配列ではなかった。同定された残基を前記アクセプターフレームワーク中に組み込み、rFW1.4を生成した。
i.ループ構造の基準配列の一部である残基
ii.VL/VH境界面に位置するフレームワーク残基
iii.CDRのすぐ下の残基のプラットフォーム
iv.上側および下側コア残基v.サブタイプを定義するフレームワーク残基。
融合片は、1抗体からのCDR配列(上記の定義による)をFW1.4またはrFW1.4のフレームワーク配列と単純に結合させることによって生成させた。潜在的に結合に関与する残基を同定した。イエウサギ可変ドメイン配列それぞれについて、最も近いイエウサギの生殖系列対応物を同定した。最も近い生殖系列が確立できなかった場合、配列は、サブグループのコンセンサスまたは高いパーセント値の類似性を有するイエウサギ配列のコンセンサスに対して比較した。希少なフレームワーク残基は、体細胞超変異の結果であり得、それゆえ、結合における役割を果たしていると考えた。したがって、そのような残基をアクセプターフレームワークに融合させた。
イエウサギ抗体レパートリーを構造、アミノ酸配列多様性および生殖系列使用に関して分析することによって、イエウサギCDRのループコンフォメーションを維持するために改変された、FW1.4の軽鎖中の5箇所の残基位置を見出した。これらの位置はイエウサギ抗体で高度に保存されている。これら5箇所の位置のコンセンサス残基をイエウサギレパートリーから推論し、ヒトアクセプターフレームワーク1.4中に導入した。これらの保存位置の改変によって、前記フレームワークは、事実上、任意のイエウサギCDRの6つの相補性決定領域(CDR)すべてと適合性となった。様々なイエウサギCDRを含有するマスターrFW1.4は、野生型の単一鎖とは反対に良好に発現され、よく産生された。このフレームワークとイエウサギCDRとの組合せから得られた16のメンバーが作製され、詳細な特徴付けによって機能性が示された。
目的とする標的にそれらのB細胞受容体(BCR)を介して結合するB細胞を選択するためのFACS(フローサイトメトリーベースの単一細胞選別)ベースのスクリーニング系がESBATechで確立されている。1つの標的は、例えば、可溶性タンパク質、すなわち、蛍光色素(PEおよびPerCP)で標識された単一鎖抗体(ESBA903)であった。リンパ球懸濁物は、組換え体標的で免疫化されたイエウサギの脾臓から調製した。次いで、細胞を、PEおよびPerCP標識されたESBA903ならびにIgGに特異的な抗体(APC標識)またはIgMに特異的な抗体(FITC標識)と共にインキュベートした。それらの表面にIgGを発現するが、IgMを発現しないESBA903陽性B細胞を96穴プレート中に選別した(図3;表2)。胸線腫ヘルパー細胞系(EL4−B5:Zublerら、1985年、J. Immunol、134(6)巻、3662〜3668頁を参照)によって、増殖し、形質細胞に分化し、抗体を分泌したB細胞を選択した。標的に対するこれらのIgGの親和性は、ELISAおよびBiacore測定によって評価した。7株の選択されたクローンの動態パラメータを表1に示す。約200の選別細胞のプールから得られた、これらのクローンは、低ナノモルからピコモル範囲にある結合親和性を示す。最後に、目的の6クローンからmRNAを単離し、単鎖フレームワークFW1.4にCDRを融合させた。
フローサイトメトリーストリーム中の高圧によって2つの細胞間の非共有結合が壊れるか否かを評価するために、以下の実験を行った。膜結合TNFαで安定的にトランスフェクトされたCHO細胞(B−220細胞)を、PE標識された抗TNFα抗体でコーティングされたビーズと共にインキュベートした。このセットアップにおいて、ビーズは記憶B細胞を模倣する(それらはほぼ同じサイズを有する)。陰性対照として、非トランスフェクトCHO細胞およびAPC標識された無関係の抗体(抗CD19)でコーティングされたビーズを用いた。撹拌を伴った4℃で2時間のインキュベーションの後に、細胞ビーズ懸濁物をFACS(130μmのノズルを用いた)によって分析した。図4は、抗TNFαビーズとTNFαトランスフェクトCHO細胞との間の特異的な結合がFACSで明確に検出可能であることを示す。実際、この試料(上側パネル)では、ビーズの約2/3が細胞に結合している(585が結合し、対して267が非結合であった)。対照的に、対照試料(中央および下側パネル)では、ほとんどのビーズがCHO細胞に結合しない。さらに、両方のビーズ集団(抗TNFα−PEおよび抗CD19−APC)をTNFαトランスフェクトCHO細胞と混合した。図5および表4は、抗TNFαビーズの約半分がCHO細胞に結合し、一方、抗CD19ビーズの大部分が非結合のままであることを示す。各試料中における細胞結合のビーズのパーセントを表5に詳細に示す。したがって、それらのB細胞受容体を介して膜内在標的タンパク質に結合する単一B細胞の特異的選択がフローサイトメトリーを用いて可能であることを実証する。
4種の抗TNFαイエウサギ抗体「Rabmab」(EPI−1、EPI−15、EP−34、EP−35およびEP−42)をCDR融合用に選択した。ヒト化イエウサギドナー抗体のCDR融合、ヒト化、および予備的特徴付けの一般的実験スキームは、詳細な説明で概説した通りに行った。非ヒトドナー抗体と最大の配列相同性を共有するヒト抗体アクセプターフレームワークを利用する伝統的なヒト化法とは異なり、品質管理アッセイ(WO0148017)を用いて、所望の機能特性(溶解性および安定性)について事前選択されたヒトフレームワーク(FW1.4)にイエウサギCDRを融合させた。これらの安定的かつ可溶性のフレームワーク配列はRabMabに高い相同性を示した。
抗TNFαバインダーの中和活性をL929 TNFα媒介細胞毒性アッセイで評価した。アクチノマイシンで処理されたマウスL929線維芽細胞の毒性を組換型ヒトTNF(hTNF)で誘導した。最大hTNF誘導細胞毒性の90%を、1000pg/mlのTNF濃度であると決定した。ウシ胎仔血清(10%v/v)を補ったL−グルタミン培地で、フェノールレッドを含むRPMI 1640ですべてのL929細胞を培養した。抗TNFαバインダーの中和活性は、フェノールレッドなし、5%ウシ胎仔血清のRPMI 1640中で評価した。アンタゴニスト作用が最大半量阻害(EC50%)に達する濃度を決定するために、様々な濃度(0〜374ng/mL)の抗TNFバインダーを1000pg/ml hTNFの存在下でL929細胞に添加する。可変勾配を有する非線形S字型回帰に用量反応曲線をフィットさせ、EC50を計算した。
結合親和性測定のために、BIAcoreTM−T100を用いた表面プラズモン共鳴測定を、NTAセンサーチップおよびHisタグ付きのTNF(ESBATechにて生成)を用いて利用した。NTAセンサーチップの表面は、Ni2+NTAキレート化を介してヒスチジンタグ付き分子を捕捉するために、ニトリロ三酢酸(NTA)で前固定(pre−immobilize)されたカルボキシメチル化デキストランマトリックスからなる。ヒトTNFα N−his三量体(5nM)を、それらのN末端hisタグを介して、ニッケルによって捕捉し、3倍系列希釈ステップにおいて、30nMから0.014nMまで及ぶいくつかの濃度でESBA105(分析物)を注入する。再生工程で、ニッケル、リガンドおよび分析物によって形成された複合体を洗い流す。これは、様々な試料に同じ再生条件を用いるのを可能にする。表面プラズモン共鳴法(SPR)技術によって反応シグナルを生成させ、共鳴単位(RU)で測定する。すべての測定を25℃で行う。インライン参照セル補正およびそれに続き緩衝液試料を引いた後、それぞれの抗TNF scFv試料についてセンサーグラムを作成した。見かけの解離速度定数(kd)、見かけの会合速度定数(ka)、および見かけの解離平衡定数(KD)を、BIAcore T100評価ソフトウェアバージョン1.1を用いて、1対1のLangmuir結合モデルを使用して計算した。
8種の抗VEGF Rabmab(375、435、509、511、534、567、578および610)をCDR融合用に選択した。非ヒトドナー抗体と最大の配列相同性を共有するヒト抗体アクセプターフレームワークを利用する伝統的なヒト化法とは異なり、品質管理アッセイ(WO0148017)を用いて、所望の機能特性(溶解性および安定性)について事前選択されたヒトアクセプターフレームワークFW1.4(配列番号1および2)にイエウサギCDRを融合させた。
scFvのBiacore結合能を試験し、結合親和性を、BIAcoreTM−T100による、例示的な表面プラズモン共鳴法を用いて測定した。この実施例および後の実施例において、これらのscFv候補による結合を試験したVEGFタンパク質には、精製したEscherichia coli発現の組換えヒトVEGF165(PeproTech EC Ltd.)、組換えヒトVEGF121(PeproTech EC Ltd.)、組換えヒトVEGF110(ESBATech AG)、組換えマウスVEGF164(PeproTech EC Ltd.)、組換えラットVEGF164(Biovision)、組換えイエウサギVEGF110(ESBATech AG)、および組換えヒトPLGF(PeproTech EC Ltd.)が挙げられる。表面プラズモン共鳴実験のために、カルボキシメチル化デキストランのバイオセンサーチップ(CM4、GE Healthcare)を、供給業者の説明書に従って、N−エチル−N’−(3−ジメチルアミノプロピル)カルボジイミドヒドロクロリドおよびN−ヒドロキシスクシンイミドを用いて活性化した。上記に例示された6つの異なる各VEGF形態を、標準的なアミンカップリング手順を用いて、CM4センサーチップ上の4つの異なるフローセルのうちの1つに結合させた。カップリングおよびブロッキング後に、これらの固定されたVEGF分子で得られた応答の範囲は、hVEGF165では約250〜500応答単位(RU)、hVEGF110、hVEGF121、マウスVEGF164、ラットVEGF164、およびイエウサギVEGF110では約200RU、PLGFでは約400RUであった。タンパク質をブロッキングの前に固定化しなかったことを除き、各チップの第4のフローセルを同様に処理し、このフローセルをインラインの参照として使用した。HBS−EP緩衝液(0.01MのHEPES、pH7.4、0.15MのNaCl、3mMのEDTA、0.005%界面活性剤P20)中の様々な濃度の抗VEGF
scFv(例えば、90nM、30nM、10nM、3.33nM、1.11nM、0.37nM、0.12nMおよび0.04nM)を、5分間、30μl/分の流速でフローセルに注入した。CM4チップ上のVEGFからの抗VEGF scFvの解離を、25℃で10分間進行させることができた。インライン参照セル補正に続いて緩衝試料を差し引いた後、センサーグラムを各抗VEGF scFv試料に関して作成した。見かけの解離速度定数(kd)、見かけの会合速度定数(ka)、および見かけの解離平衡定数(KD)を、BIAcoreT100評価ソフトウェアバージョン1.1を用いて、1対1のLangmuir結合モデルを使用して計算した。
HUVECアッセイは、開示の抗VEGF scFv候補の、VEGFインヒビターとしての効能を測定する方法である。
前述の記載を考慮すると、本発明の多くの修正および代替の実施例が、当業者に明らかである。したがって、この記載は、単なる例示として解釈すべきであり、本発明を実行するのに最良の様式を当業者に教示するためのものである。構造の詳細は、本発明の精神から逸脱することなく実質的に変えることができ、添付の特許請求の範囲内となるすべての修正の独占的使用権を保有する。本発明は、添付の特許請求の範囲および適用可能な法律の規則によって要求される程度にのみ制限されるものであると意図する。
Claims (20)
- (i)ドナーウサギ抗体またはその抗原結合フラグメント由来の軽鎖CDR1、CDR2およびCDR3ならびにドナーウサギ抗体またはその抗原結合フラグメント由来の重鎖CDR1、CDR2およびCDR3;
(ii)ヒト可変軽鎖フレームワーク;ならびに
(iii)以下のアミノ酸:位置24のスレオニン(T)、位置56のアラニン(A)またはグリシン(G)、位置84のスレオニン(T)、位置89のバリン(V)および位置108のアルギニン(R)(AHoナンバリング)のうちの少なくとも4つを含むヒト可変重鎖フレームワーク
を含む、抗体またはその抗原結合フラグメント。 - 前記可変重鎖領域フレームワークのアミノ酸配列が、配列番号4の配列に少なくとも90%同一であり、以下のアミノ酸:位置24のスレオニン(T)、位置56のアラニン(A)またはグリシン(G)、位置84のスレオニン(T)、位置89のバリン(V)および位置108のアルギニン(R)(AHoナンバリング)のうちの少なくとも4つを含む、請求項1に記載の抗体またはその抗原結合フラグメント。
- 前記可変重鎖フレームワークが、
(a)位置24のスレオニン(T)(AHoナンバリング);
(b)位置84のスレオニン(T)(AHoナンバリング);または
(c)位置89のバリン(V)(AHoナンバリング)
を含む、請求項1に記載の抗体またはその抗原結合フラグメント。 - 前記可変重鎖フレームワークが、以下のアミノ酸:位置12のセリン(S)、位置103のセリン(S)またはスレオニン(T)、および位置144のセリン(S)またはスレオニン(T)(AHoナンバリング)のうちの少なくとも1つをさらに含む、請求項1に記載の抗体またはその抗原結合フラグメント。
- 前記可変重鎖フレームワークが位置141のグリシン(G)(AHoナンバリング)をさらに含む、請求項1に記載の抗体またはその抗原結合フラグメント。
- 前記可変重鎖フレームワークが、配列番号4および配列番号6からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項1に記載の抗体またはその抗原結合フラグメント。
- 前記可変軽鎖フレームワークが配列番号2の配列に少なくとも90%同一であるアミノ酸配列を含む、請求項1に記載の抗体またはその抗原結合フラグメント。
- 前記可変軽鎖フレームワークが配列番号2を含む、請求項7に記載の抗体またはその抗原結合フラグメント。
- 前記可変軽鎖フレームワークが位置87のスレオニン(T)(AHoナンバリング)を含む、請求項7に記載の抗体またはその抗原結合フラグメント。
- 前記可変軽鎖フレームワークが配列番号9を含む、請求項9に記載の抗体またはその抗原結合フラグメント。
- 前記可変重鎖フレームワークおよび前記可変軽鎖フレームワークが配列番号8を含むリンカー配列によって連結されている、請求項7に記載の抗体またはその抗原結合フラグメント。
- 配列番号3、配列番号5または配列番号7の配列に少なくとも90%同一であるアミノ酸配列を含む、請求項7に記載の抗体またはその抗原結合フラグメント。
- 配列番号3、配列番号5または配列番号7からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項12に記載の抗体またはその抗原結合フラグメント。
- 前記可変軽鎖フレームワークが以下のアミノ酸;位置1のグルタミン酸(E)、位置3のバリン(V)、位置4のロイシン(L)、位置10のセリン(S)、位置47のアルギニン(R)、位置57のセリン(S)、位置91のフェニルアラニン(F)および位置103のバリン(V)(AHoナンバリング)のうちの少なくとも1つをさらに含む、請求項7に記載の抗体またはその抗原結合フラグメント。
- 前記抗体またはその抗原結合フラグメントがscFvである、請求項7に記載の抗体またはその抗原結合フラグメント。
- 請求項1に記載の抗体またはその抗原結合フラグメントおよび薬学的に許容される賦形剤を含む薬学的組成物。
- 前記ヒト可変重鎖フレームワークが、位置25のバリン(V)および/または位置82のリジン(K)(AHoナンバリング)をさらに含む、請求項1に記載の抗体またはその抗原結合フラグメント。
- 請求項1〜15または17のいずれか一項に記載の抗体またはその抗原結合フラグメントを含む二重特異性分子。
- 少なくとも2つの異なる結合部位または標的分子に結合する、請求項18に記載の二重特異性分子。
- 前記抗体またはその抗原結合フラグメントが、抗体、抗体フラグメント(Fab、Fab’、F(ab’) 2 、Fv、または単鎖Fvを含む)、腫瘍特異的もしくは病原体特異的な抗原、ペプチド、または結合性模倣物に連結される、請求項18または19に記載の二重特異性分子。
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