JP2002519069A - レトロウイルスベクターを用いた染色体へのターゲッティングされた組込み - Google Patents

レトロウイルスベクターを用いた染色体へのターゲッティングされた組込み

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ギュンツブルク、バルター
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オーストリアン・ノルディック・バイオセラピューティクス・アーゲー
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Abstract

(57)【要約】 本発明は、ＬＴＲ配列に好ましくはアデノ関連ウイルスの配列を含有する、ターゲティングされた組込みのためのレトロウイルスベクターを提供する。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、特に遺伝的欠損症又はウイルス感染の遺伝子治療のための異種遺伝
子をコードするレトロウイルスベクターに関する。
【０００２】
【発明の背景】
レトロウイルスは種々の細胞を感染し、標的細胞に対する遺伝子の輸送のため
の典型的な手段である。さらに、感染性レトロウイルスは、標的細胞のゲノムに
そのＲＮＡゲノムのＤＮＡ型を組込むことが可能であるため、それらは標的細胞
のゲノムに異種配列を安定的に組込むための典型的な手段である。従って、レト
ロウイルスに感染した細胞の全ての娘細胞は、レトロウイルスベクターのＤＮＡ
を担持し、恐らく異種遺伝子を含んでいる。
【０００３】 レトロウイルスゲノムは、Ｒ−Ｕ５−ｇａｇ−ｐｏｌ−ｅｎｖ−Ｕ３−Ｒ構造
を有するＲＮＡ分子から構成される。レトロウイルスベクター（ＲＶ）の開発の
ために、該レトロウイルスゲノムは、ウイルス性タンパク質をコードする遺伝子
ｇａｇ−ｐｏｌ−ｅｎｖを、マーカー遺伝子又は治療用遺伝子のような１以上の
関与する遺伝子で置換することにより修飾され得る。組換え型レトロウイルス粒
子及びパッケージングされたＲＶそれぞれを生成させるために、レトロウイルス
ベクター系の原理が用いられる。この系は、２つの要素：ウイルス性タンパク質
をコードする遺伝子が置換されたＲＶ自体、及び失われたウイルス性タンパク質
を有する修飾ＲＶを提供するパッケージング細胞から構成される。このパッケー
ジング細胞は、修飾ＲＶがパッケージングされることを可能にする遺伝子を担持
する１以上のプラスミドでトランスフェクションされているが、複製能力を有す
るウイルスを生産する能力に欠ける。
【０００４】 パッケージング細胞系にベクターを導入した後に、ＲＶはＲＮＡに転写される
。組換え型レトロウイルスゲノムを表わすこのＲＮＡは、パッケージング細胞に
よって生産されるウイルス性タンパク質によってパッケージングされ、パッケー
ジング細胞から分離され、レトロウイルス粒子を形成する。さらに、これらの粒
子は標的細胞を感染するのに用いられる。標的細胞において、ＲＮＡゲノムは該
粒子から再び放出され、逆転写されて、細胞のゲノムに安定的に組込まれる。
【０００５】 従って、ＲＶｓは一般に、ＵＳＡ及び欧州の両方での種々の公認のプロトコル
において、標的細胞に治療用遺伝子を安定的に運搬するための選択的な方法であ
る。しかしながら、たいていのプロトコルは、治療用遺伝子を運搬するＲＶで標
的細胞をイン・ビトロにて感染させることを必要とする。次に、感染に成功した
細胞を患者に戻す。好都合なことに、そのようなイクス・ビボでの標的細胞の感
染は、使用前に厳密に安全性を試験することができる大量の濃縮ウイルスの投与
を可能にする。さらに、イクス・ビボでの遺伝子治療プロトコルは、標的細胞群
を容易に分離することができる病気の治療に理想的である。
【０００６】 不運なことに、遺伝子治療のために可能な用途のほんの一部が、容易に分離、
培養した後、患者への再導入が可能な標的細胞と関係するに過ぎない。さらに、
イクス・ビボでの有効な遺伝子治療の複雑な技術及び付随する高いコストにより
、その使用の世界中での普及を妨げられている。手軽な将来性及びコスト的に有
用な遺伝子治療には、ＲＶを生産する細胞の注射又は単なる移植の形態で、ＲＶ
、又はＲＶを生産する細胞を患者に直接投与する、イン・ビボでのアプローチが
要求されるであろう。
【０００７】 この種のイン・ビボでのアプローチは、当然ながら種々の新たな問題をもたら
す。まず第一に、安全性を考慮しなくてはならない。１つの深刻な安全性のリス
クは、ウイルスを生産する細胞の移植から、恐らくウイルスが生産されるであろ
うことである。従って、このように生産されるウイルスを予め検査する機会が存
在しないであろう。また別の問題は、レトロウイルスゲノムのプロウイルス型は
、感染した細胞のゲノムにおいてランダムに組込まれることである。このランダ
ムな組込みは、細胞の遺伝子又は細胞の遺伝子近傍に直接組込まれる結果となり
、新たなゲノム配列をもたらす。この結果として、細胞の遺伝子の機能は変質す
るか、または失われる。細胞の遺伝子が成長制御の調節に関与する場合には、制
御されない細胞増殖が生じる可能性がある。従って、ＲＶを用いた遺伝子の治療
学的用途においては、レトロウイルスベクターを用いた１つの遺伝的欠損の修復
と同時に、第二の欠損がもたらされる可能性があり、制御されない増殖、要する
に腫瘍の発生を生じる結果となる、潜在的なリスクが存在する。
【０００８】
【発明の目的】
従って、本発明の目的は、標的細胞の遺伝子又は遺伝子近傍への、組換え型ウ
イルスゲノムのランダムな組込みを防ぎ、従って標的細胞のゲノムのゲノム再配
列を防ぐ、安全なレトロウイルスベクターを提供することである。
【０００９】
【発明の詳細の記述】
本発明の基礎をなす基本的な概念は、標的細胞のゲノムの非コード領域に特異
的に組込まれるレトロウイルスベクターを提供することである。従って、先に述
べた目的及び他の目的を達成するために、本発明は、１以上の異種核酸配列、並
びにゲノムの非コード領域に該異種配列を部位特異的に組込ませる少なくとも１
つの配列を含んでなるレトロウイルスベクター（ＲＶ）を提供する。
【００１０】 該部位特異的に組込ませる配列により、ＲＶは、何れのコード配列又は調節塩
基配列をも含まないゲノム領域と相互作用する。従って、相互作用及びその後の
組込みは、相同組換え又は別の（例えば、タンパク質によって媒介される）組込
み機構によって起こり得る。一般に、レトロウイルスの組込み過程は、組込みを
媒介する酵素（それは、感染性レトロウイルス粒子に含まれる）によって媒介さ
れる。組込みを媒介するタンパク質は、ＲＶによってコードされる部位特異的に
組込ませる配列、並びに標的細胞のゲノム配列の非コード領域内への組込み部位
と相互作用する。従って、該標的細胞は、ＲＶ及び任意に組込みを媒介するタン
パク質を含むレトロウイルス粒子によって感染される。その結果、標的細胞のゲ
ノムの非コード領域にＲＶの部位特異的な組込みが起こる。
【００１１】 非コード領域へのＲＶの部位特異的な組込みの結果、新たなゲノム配列の危険
性（例えば、非調節の遺伝子産物又は制御されない細胞増殖を引き起こす）が回
避される。従って、本発明に従ったＲＶは、イン・ビボにて将来高く適用される
だけでなく、イン・ビトロにてヒトを含む哺乳類の標的細胞に異種核酸配列を運
搬する。
【００１２】 「異種(非相同性)」の用語は、一般的に密接な関係にあることが全く見出され
ていないＤＮＡ配列の何れかの組み合わせに用いられる。従って、上述の少なく
とも１つのＲＶの異種核酸配列は、ウイルス感染、遺伝性、代謝、増殖性若しく
は何れか他の関連疾患又は病気の治療に関連する異種遺伝子である。従って、本
発明に従ったＲＶによって標的細胞に運搬され得る異種遺伝子は、好ましくはマ
ーカー遺伝子、治療用遺伝子、抗ウイルス性遺伝子、抗腫瘍遺伝子、サイトカイ
ン遺伝子及び／又はトキシン遺伝子からなる群の１以上の要素であるが、それら
に限定されない。マーカー遺伝子及び治療用遺伝子は、好ましくはβ−ガラクト
シダーゼ遺伝子、ネオマイシン遺伝子、単純疱疹ウイルスチミジンキナーゼ遺伝
子、プルマイシン遺伝子、シトシンデアミナーゼ遺伝子、ヒグロマイシン遺伝子
、分泌性アルカリホスファターゼ遺伝子、グアニンホスホリボシルトランスフェ
ラーゼ（ｇｐｔ）遺伝子、アルコールデヒドロゲナーゼ遺伝子、ヒポキサンチン
ホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＨＰＲＴ）遺伝子、グリーン蛍光タンパク
質（ｇｆｐ）遺伝子、シトクロムＰ４５０遺伝子及び／又はジフテリア、百日咳
トキシン、破傷風トキソイドのαサブユニットのようなトキシン遺伝子のような
遺伝子から選択されるのが好ましい。
【００１３】 組込み現象の間に、ＲＶによってコードされる異種配列が、ゲノムの非コード
領域に確実に組込まれるために、該異種配列を１以上の部位特異的に組込ませる
配列の隣に配置する。一般に、１つの部位特異的に組込ませる配列を用いて組込
み過程を導入することが可能であり、この場合、これは組込まれる異種配列の一
方の末端のみの隣に配置する。しかしながら、より好ましい態様において、部位
特異的に組込ませる塩基配列は、直接的に又は幾らか離れて、組込まれる異種配
列の両側の隣に配置する。従って、該部位特異的に組込ませる配列は、レトロウ
イルスのＬＴＲのＵ３領域及び／又はＵ５領域に挿入されるのが好ましい。また
代わりとして、該部位特異的に組込ませる配列を、組込まれる異種配列とつなげ
て挿入することも可能である。この場合には、これ以上のレトロウイルスの配列
を有さない組込まれる異種配列のみが、部位特異的に組込まれるであろう。従っ
て、この場合には、ＲＶは標的細胞に組込まれる異種配列の輸送手段としてのみ
作用する。
【００１４】 哺乳類のゲノムの９０％以上が非コード領域から構成されると知られているこ
とから、本発明に従ったＲＶは、特にヒト染色体を含む哺乳類の非コード領域へ
の部位特異的な組込みに有用である。本発明の更なる態様において、ＲＶはヒト
第１９番染色体に位置する非コード領域において、特異的に組込まれる。ヒト第
１９番染色体における該特異的な非コードＤＮＡ領域が、アデノ関連ウイルス（
ＡＡＶ）の組込みのための標的部位として最初に記載された。第１９番染色体に
おける非コード領域への組込みのために、本発明の更なる態様において、部位特
異的にＲＶを組込ませる配列は、ＡＡＶの逆方向末端反復（ＩＴＲｓ）と呼ばれ
る。
【００１５】 これらの形態の系統発生的な種々のウイルスを組み合わせると、本発明に従っ
て得られたＲＶは、さらにゲノムにおける非コード領域を標的とする約８ｋｂの
容量の異種ＤＮＡ配列を収容できることが特に有用であると見出した。比較して
、現存のＡＡＶを基にした全てのベクターは、第１９番染色体へのターゲティン
グされた組込みに必要な全てのコード領域の存在下において、最大約４，５ｋｂ
の異種ＤＮＡを収容することが可能である（Dongら、1996年、「組換え型アデノ
関連ウイルスのパッケージング容量の定量分析」、Hum Gene Ther Nov 10;7(17)
:2101-2112）。不運なことに、これらはあまりに小さいため、たいていの遺伝子
治療において実用的に使用することは不可能である。
【００１６】 本発明の更に好ましい態様において、ＡＡＶ−Ｒｅｐタンパク質が、ＲＶの部
位特異的な組込みのために用いられる。驚くべきことに、ＡＡＶの組込みを媒介
するＲｅｐタンパク質は、これらタンパク質がＡＡＶ組込み過程において標準的
に使用する第１９番染色体の同様の非コード領域へのＲＶのターゲティングされ
た組込みのために使用可能であることを見出した。ＲＶはＲＮＡゲノムを有する
ウイルスに基づき、一方ＡＡＶはＤＮＡゲノムを有するウイルスに属するために
、このことは特に予想されなかった。また、これらゲノム構造における差異に依
存して、調節又は組込み機構は完全に異なる。レトロウイルスゲノムの組込みは
、一般に酵素インテグラーゼ（ＩＮ）に依存するのに対し、部位特異的なＡＡＶ
ゲノムの組込みはＲｅｐタンパク質によって媒介される。このタンパク質はＡＡ
Ｖに特異的であるので、前述のゲノムの組込みがこのタンパク質によって媒介さ
れるであろうことは予想されなかった。さらに、完全に相違する系統発生的な群
に属するＤＮＡウイルスのタンパク質が、ＲＮＡウイルスと組み合わせると、レ
トロウイルスゲノムの組込みを媒介するであろうことは予想されなかった。
【００１７】 標的細胞に組込みを媒介するタンパク質（例えば、該ＡＡＶ−Ｒｅｐタンパク
質）を提供するための一つの選択手段は、ＲＶに該タンパク質をコードする核酸
配列を直接組込むことである。ＲＶで標的細胞を感染させた後に、組込みを媒介
するタンパク質（例えば、ＡＡＶ−Ｒｅｐタンパク質）は、標的細胞にて直接合
成される。次に、ＡＡＶ−Ｒｅｐタンパク質は、ＲＶの部位特異的な組込みを媒
介する。
【００１８】 また代わりとして、パッケージング細胞は、組込みを媒介するタンパク質（例
えば、ＡＡＶ−Ｒｅｐタンパク質）をレトロウイルス粒子（ＲＶＰ）に提供する
。この場合には、組込みを媒介するタンパク質は、パッケージング細胞から合成
され、新たに発生した感染性レトロウイルス粒子（ＲＶＰ）にパッケージングさ
れる。次に、これら粒子は標的細胞を感染するために用いられ、従って標的細胞
に、ＲＶとともに付加的な組込みを媒介するタンパク質を運搬した。
【００１９】 組込みを媒介するタンパク質、特にＡＡＶ−Ｒｅｐタンパク質の発現は、より
高濃度で細胞に毒性効果を引き起こすことが知られている。従って、本発明の更
なる態様において、組込みを媒介するタンパク質、並びにＡＡＶ−Ｒｅｐタンパ
ク質の発現は、誘導性プロモーター及び／又は非常に弱いプロモーターの転写制
御の下にある。該誘導性プロモーター及び／又は非常に弱いプロモーターは、テ
トラサイクリンによって誘導されるプロモーター、ＨＩＶ Ｔａｔ トランスアク
チベーターによって誘導されるプロモーター、ＭＭＴＶプロモーターのようなグ
ルココルチノイドホルモンによって誘導されるプロモーター又はＸ線によって誘
導されるプロモーターからなる群の１以上の要素から選択されるのが好ましいが
、それらに限定されない。
【００２０】 ＲＶＰの発生のために、本発明の更なる態様において、第一の要素としての上
記のＲＶ及びＲＶがパッケージングされるのに必要なタンパク質を提供するパッ
ケージング細胞を含んでなるレトロウイルスベクター系が提供される。パッケー
ジング細胞系は、ｐｓｉ−２、ｐｓｉ−Ｃｒｙｐｔ、ｐｓｉ−ＡＭ、ＧＰ＋Ｅ−
８６、ＰＡ３１７、ＧＰ＋ｅｎｖＡＭ−１２、Ｆｌｙ Ａ１３、ＢＯＳＣ ２３、
ＢＩＮＧ、Ｆｌｙ ＲＤ １８、ＰｒｏＰａｋ−Χ、−Ａ．５２及び−Ａ．６又は
他のエンベロープされたウイルス由来の表面タンパク質を発現させる組換え型の
構築物でスーパートランスフェクションされたこれらの何れかから選択されるの
が好ましいが、それらに限定されない。
【００２１】 ＲＶの部位特異的な組込みの高い有用性を確実にするために、本発明の更なる
態様に従ったパッケージング細胞は、機能性レトロウイルスインテグラーゼ（Ｉ
Ｎ）をコードしないＧａｇ／Ｐｏｌ発現プラスミドを提供する。従って、パッケ
ージング細胞は、ｐｏｌ領域によってコードされる非機能性レトロウイルスＩＮ
が合成され得るような方法で構築される。このため、パッケージング細胞は、ｐ
ｏｌ領域の突然変異体及び／又はｐｏｌ領域を部分的に若しくは完全に欠失した
ものを組込むレトロウイルスのｐｏｌ領域をコードするＤＮＡ構築物を用いて発
生する。非機能性ＩＮを引き起こすｐｏｌ領域における突然変異又は欠失を誘導
するために、好ましくは組換えＰＣＲ技術が用いられる。
【００２２】 更に本発明は、上記の本発明のＲＶを含むレトロウイルス粒子を提供する。こ
れら粒子は、標準的なプロトコルに従って、上記のＲＶで上記のパッケージング
細胞をトランスフェクションすることで得ることができる。
【００２３】 また本発明は、レトロウイルスのプロウイルス、本発明に従ったレトロウイル
スのプロウイルスのｍＲＮＡ、本発明に従ったレトロウイルスベクターから生じ
る何れかのＲＮＡ及びそれらのｃＤＮＡ、並びに本発明に従ったレトロウイルス
粒子で感染させた標的細胞を含む。
【００２４】 本発明の更なる態様は、イン・ビボ及びイン・ビトロにて上記の組換え型レト
ロウイルス粒子で標的細胞群を感染させることを含んでなる、標的細胞に同種及
び／又は異種ヌクレチド配列を導入する方法を提供する。更に、レトロウイルス
ベクター、レトロウイルス粒子、レトロウイルスベクター系及びレトロウイルス
のプロウイルス、並びにそれらのＲＮＡは、ウイルス感染の治療、又は遺伝性、
代謝性、増殖性若しくは何れか他の関連疾患又は病気の治療に用いられる。
【００２５】 レトロウイルスベクター、レトロウイルス粒子、レトロウイルスベクター系及
びレトロウイルスのプロウイルス、並びにそれらのＲＮＡは、ヒトを含む哺乳類
においてイン・ビボ及びイン・ビトロでの遺伝子治療のための薬剤組成物生産の
ために使用される。
【００２６】 更に本発明は、治療学的に有効な量のレトロウイルス粒子及び／又はレトロウ
イルスベクター系及び／又は治療学的に有効な量のレトロウイルスベクター、ベ
クター系若しくは粒子を含有する薬剤組成物を、必要とする個人に投与すること
を含んでなる、ウイルス感染、又は遺伝性、代謝性、増殖性若しくは何れか他の
関連疾患又は病気の治療方法を含む。
【００２７】
【発明の概要】
本発明は、特に単独で又は組み合わせて下記を含有する： １以上の異種核酸配列、並びにゲノムの非コード領域に該異種配列を部位特異
的に組込ませる少なくとも１つの配列を含んでなるレトロウイルスベクター； 該部位特異的に組込ませる配列が、レトロウイルスの長末端反復配列（ＬＴＲ
）のＵ３領域及び／又はＵ５領域に挿入される上記のレトロウイルスベクター； 該部位特異的に組込ませる配列が、アデノ関連ウイルス（ＡＡＶ）の逆方向末
端反復（ＩＴＲ）配列である上記のレトロウイルスベクター； 該ゲノムが、ヒトを含む哺乳類の染色体である上記の何れかのレトロウイルス
； 該染色体が、第１９番染色体である上記のレトロウイルスベクター； 少なくとも１つの該異種核酸配列が、ウイルス感染の治療、又は遺伝性、代謝
性、増殖性若しくは何れか他の関連疾患又は病気に関連する異種遺伝子である上
記の何れかのレトロウイルスベクター； 少なくとも１つの該異種核酸配列が、組込みを媒介するタンパク質をコードす
る配列である上記の何れかのレトロウイルスベクター； 該組込みを媒介するタンパク質が、ＡＡＶ−Ｒｅｐタンパク質である上記の何
れかのレトロウイルスベクター； 該組込みを媒介するタンパク質をコードする配列が、誘導性プロモーターの転
写制御下にある上記のレトロウイルスベクター； 第一の要素としての上記の何れかのベクター、及び該ベクターをパッケージン
グするのに必要なタンパク質をコードする少なくとも１つのＤＮＡ構築物を有す
るパッケージング細胞を含んでなるレトロウイルスベクター系； 該パッケージング細胞が、突然変異したレトロウイルスのインテグラーゼ（Ｉ
Ｎ）又は完全に若しくは部分的に欠失したレトロウイルスのインテグラーゼ（Ｉ
Ｎ）を合成する上記のレトロウイルスベクター系； 上記の何れかのレトロウイルスベクターを含むレトロウイルス粒子； 上記のレトロウイルスベクターで上記のレトロウイルスベクター系のパッケー
ジング細胞をトランスフェクションすることによって得られる上記のレトロウイ
ルス粒子； 上記のレトロウイルス粒子で標的細胞を感染させることにより生産されるレト
ロウイルスのプロウイルス； 上記のレトロウイルスのプロウイルスのｍＲＮＡ； 上記の何れかのレトロウイルスベクターのＲＮＡ； 上記のＲＮＡのｃＲＮＡ； 上記レトロウイルス粒子で感染させた宿主細胞； 上記レトロウイルス粒子で標的細胞を感染させることを含んでなる、標的細胞
に同種及び／又は異種ヌクレオチド配列を導入する方法； ウイルス感染の治療、又は遺伝性、代謝性、増殖性若しくは何れか他の関連疾
患又は病気の治療における使用のための、上記の何れかのレトロウイルスベクタ
ー及び／又は上記のレトロウイルス粒子及び／又は上記のレトロウイルスベクタ
ー系； ウイルス感染の治療、又は遺伝性、代謝性、増殖性若しくは何れか他の関連疾
患又は病気の治療のための薬剤組成物を生産するための、上記の何れかのレトロ
ウイルスベクター及び／又は上記のレトロウイルス粒子及び／又は上記のレトロ
ウイルスベクター系の使用； 治療学的に有効な量の上記の何れかのレトロウイルスベクター及び／又は上記
のレトロウイルス粒子及び／又は上記のレトロウイルスベクター系を含有する薬
剤組成物； 治療学的に有効な量の上記のレトロウイルス粒子及び／又は上記のレトロウイ
ルスベクター系を、それらを必要とする患者に投与することを含んでなる、ウイ
ルス感染、又は遺伝性、代謝性、増殖性若しくは何れか他の関連疾患又は病気の
治療方法。
【００２８】
【実施例】
下記の例は、本発明をさらに説明するであろう。提供する例は如何なる意味で
も、限定されると解釈されるべきではなく、本発明は、特許請求の範囲全てによ
ってのみ限定されることは、何れの当業者によっても十分理解されるであろう。
【００２９】 例１：ＲＶのターゲティングされた組込み １．ＡＡＶゲノムの逆方向末端反復(ＩＴＲ)モチーフを含有するレトロウイル
スベクター（ＲＶ）の構築 プラスミドｐＡＶ１(Laughlinら、1983年、細菌性プラスミドにおける感染性
アデノ関連ウイルスのゲノムのクローニング、Gene 23:65-73)から得られるＩＴ
Ｒ配列を含むフラグメント及びＲＶベクターｐＬＥＳＮＭＰのバックボーン配列
(identisch zu ｐＬＸＳＮＰＣＥＧＰＦ aus Klein et.al.(1997)、Gene Therap
y 4:1256-1260)の結合により、ＲＶベクターｐＬＥＳＮ１ＩＰを構築した。
【００３０】 このために、プラスミドｐＬＥＳＮＭＰを制限酵素ＳａｃII及びＭｌｕＩで消
化させ、ＭＭＴＶ Ｕ３領域を削除し、７０６５ｂｐのフラグメントを得た。該
消化混合物を、０．８％アガロースゲルで精製し、ＤＮＡバンドを削り取り、Ｑ
ｉａｑｕｉｃｋプロトコル（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて溶出させた。エタノール沈
殿後に、ＤＮＡを水に再懸濁させた。
【００３１】 ＰＣＲ法を用いて、プラスミドｐＡＶ１からＩＴＲ配列を分離した。従って、
左側のプライマー（配列ＩＤ Ｎｏ．１）(5'-GACTCCACGCGTCCAGGAAC-3')は、Ｉ
ＴＲの開始点に特異的であり、また新たなＭｌｕＩ制限部位（下線）を生じさせ
、右側のプライマー（配列ＩＤ Ｎｏ．２）(5'-GACCGCGGATCATCGATAAG-3')は、
ＩＴＲの末端に特異的であり、またＳａｃII制限部位（下線）を生じさせた。Ｐ
ＣＲにより１９８ｂｐフラグメントが得られ、それを制限酵素ＭｌｕＩ及びＳａ
ｃIIで消化し、次に精製した。
【００３２】 調製したｐＬＥＳＮＭＰバックボーンフラグメント５０ｎｇ、及びＭｌｕＩ／
ＳａｃIIで消化したＰＣＲフラグメント３００〜４００ｎｇを混合した。結合の
ために、ＮＥＢリガーゼ（ニューイングランドバイオラボ(New England Biolabs
)）を用い、温度を１０℃から２２℃まで１時間につき１℃ずつ上昇させた。該
リガーゼを６５℃にて１０分間、不活性化させ、ＤＮＡを化学的に処理したコン
ピテントＴＯＰ１０バクテリア（インビトロゲン）にトランスフェクションした
。アンピシリン耐性コロニーを選択し、ＤＮＡを調製し、制限酵素ＨｉｎｄIII
で試験的に消化させた。最終的な適切なプラスミドをｐＬＥＳＮ１ＩＰと称した
。
【００３３】 ２．ＡＡＶゲノムの２つのＩＴＲモチーフを含有する２つのＲＶの構築 プラスミドｐＡＶ１から得られるＩＴＲを含有するフラグメント及び上記１．
のＰｒｏＣｏｎベクターｐＬＥＳＮ１ＩＰバックボーンの結合により、制限部位
の位置のみ異なるＲＶ ｐＬＥＳＮ２ＩＰ１及びｐＬＥＳＮ２ＩＰ６を構築した
。
【００３４】 ベクターを直線状にする制限酵素ＡｇｅＩでｐＬＥＳＮ１ＩＰバックボーンを
消化した。消化させたＤＮＡをアルカリホスファターゼ（ベーリンガー）で脱リ
ン酸化した。フェノール及びクロロホルム抽出の後に、ＤＮＡをエタノール沈殿
させ、水に再懸濁させた。
【００３５】 上記１．に記載のＰＣＲ法を用いて（但し、異なるプライマーの組み合わせを
用いて）、プラスミドｐＡＶ１からＩＴＲモチーフ分離した。この場合には、左
側のプライマー（配列ＩＤ Ｎｏ.:３）(5'-TCACGACTCCACCGGTCCAGGAAC-3')は、
ＩＴＲの開始点に特異的であり、また新たなＡｇｅＩ制限部位（下線）を生じさ
せ、右側のプライマー（配列ＩＤ Ｎｏ.:４）(5'-GTTTGACCGGTTATCATCGATAAG-3
')は、ＩＴＲの末端に特異的であり、また新たなＡｇｅＩ制限部位（下線）を生
じさせた。ＰＣＲにより２０６ｂｐのフラグメントを生じ、それを制限酵素Ａｇ
ｅＩで消化し、精製した。
【００３６】 直線状にしたｐＬＥＳＮ１ＩＰバックボーン５０ｎｇ、及びＡｇｅＩで消化し
たＰＣＲフラグメント３００〜４００ｎｇを混合し、上記１．のように、結合さ
せ、バクテリアにトランスフェクションした。アンピシリン耐性コロニーを選択
し、ＤＮＡを調製し、制限酵素ＥｃｏＲＩ及びＨｉｎｄIIIで試験的に消化させ
た。最終的な適切なＲＶをｐＬＥＳＮ２ＩＰ１及びｐＬＥＳＮ２ＩＰ６と称した
。
【００３７】 ３．ＲＶ ｐＬＥＳＮ１ＩＰ、ｐＬＥＳＮ２ＩＰ１又はｐＬＥＳＮ２ＩＰ６を
用いたレトロウイルス粒子（ＲＶＰ）の生産 パッケージング細胞系のトランスフェクションのために、５×１０5の細胞（
例えば、ＰＡ３１７）を直径３５ｍｍの６−ウェルディッシュにまいた。トラン
スフェクションの際、生産工程説明書に従ってリン酸カルシウムプロトコルセル
フェクトキット（ファルマシア）を用いて、１０ｎｇのｐＬＥＳＮ１ＩＰ、ｐＬ
ＥＳＮ２ＩＰ１又はｐＬＥＳＮ２ＩＰ６をトランスフェクションさせた。
【００３８】 トランスフェクションの１８時間後、培地を変えた。更に２４時間後に、ＲＶ
Ｐｓを含有する培地を取り出し、標的細胞の感染のために使用した。更に、Ｇ４
１８−ジェネティシン(Geneticin)を含有する新しい培地をトランスフェクショ
ンしたパッケージング細胞に添加し、安定的にトランスフェクションした細胞を
選択した。
【００３９】 ４．染色体へのターゲティングされた組込みのための１つ又は２つのＩＴＲモ
チーフを有するＲＶを含有するＲＶＰｓでの標的細胞の感染 標的細胞（例えば、ＨｅＬａ；ＮＩＨ３Ｔ３）の感染のために、１０ｍｌ培地
中の２×１０6の細胞を直径１０ｃｍの培養皿にまいた。感染の際、ベクターウ
イルスを含有する無菌のフィルターを通した上澄み液２ｍｌ及びポリブレン２μ
ｌ（最終濃度８μｇ／ｍｌ）を細胞に添加した。６時間後に、新鮮な培養培地を
細胞に添加した。感染の２４時間後に、Ｇ４１８−ジェネティシンを含有する新
しい培地を添加し、安定的に感染した細胞を選択した。染色体において非コード
領域へのターゲティングされた組込みを分析するために、細胞のゲノムＤＮＡを
分離し、サザンブロットで分析した。幾つかのクローンに、相同組込みパターン
が見られることが確認された。さらに組込み位置を確認するために、ＦＩＳＨ染
色体アッセイを該クローンに実施した。
【００４０】 例２：ＡＡＶ Ｒｅｐタンパク質を用いたＲＶのターゲティングされた組込み １．プラスミドｐＳＶｏｒｉＡＡＶ(Chioriniら、1995年、Human Gene Therap
y 6:1531-1541)にてコードされるＡＡＶ Ｒｅｐタンパク質を合成するパッケー
ジング細胞系における１つ又は２つのＡＡＶのＩＴＲモチーフを有するＲＶを含
有するＲＶＰの生産 パッケージング細胞系のリポフェクションのために、２×１０5の細胞（例え
ば、ＰＡ３１７）を直径３５ｍｍの６−ウェルディッシュにまいた。トランスフ
ェクション際、例１のＲＶ２μｇ、及びｒｅｐ遺伝子をコードするｐＳＶｏｒｉ
ＡＡＶ０．１〜０．２μｇを、生産過程説明書に従ってリポフェクションプロト
コル（Ｇｉｂｃｏ）を用いて同時トランスフェクションさせた。
【００４１】 トランスフェクションの５時間後に、培地を変えて、トランスフェクションの
４８時間後に、ＲＶＰｓを含有する培地を取り出し、標的細胞の感染に用いた。
さらに、Ｇ４１８−ジェネティシンを含有する新たな培地をトランスフェクショ
ンした細胞に添加し、安定的にトランスフェクションした細胞を選択した。
【００４２】 また代わりとして、生産過程説明書に従ってリン酸カルシウムプロトコル（セ
ルフェクトキット、ファルマシア）を用いて、パッケージング細胞系をトランス
フェクションした。この場合には、例１のＲＶ１０μｇ、及びｒｅｐ遺伝子をコ
ードするｐＳＶｏｒｉＡＡＶ０．５〜１μｇを同時トランスフェクションさせた
。
【００４３】 ２．例１の４．に記載するようなＲＶＰでの標的細胞の感染 感染のために、例２の２．に記載されるプロトコルに従って、ＲＶ及びＡＡＶ
Ｒｅｐタンパク質を含有するＲＶＰで、標的細胞（例えば、ＨｅＬａ；ＮＩＨ
３Ｔ３）を感染させ、選択した。選択後に染色体における非コード領域へのター
ゲティングされた組込みを分析するために、細胞のゲノムＤＮＡを分離し、サザ
ンブロットを行い、ＦＩＳＨ染色体アッセイで分析した。
【００４４】 例３：インテグラーゼ欠失のパッケージング細胞系の構築 １．ｐｏｌ−領域の１つの塩基対突然変異によるＭＬＶインテグラーゼの不活性
化 ＭＬＶインテグラーゼ遺伝子を有する発現プラスミドｐＧａｇＰｏｌ．ｇｐｔ
(Markowitzら(1988年)、Virology 167(2):400-406)を、特定部位の突然変異のた
めに用いた。ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）法を用いて、この酵素の触媒部位
内にあるアミノ酸１８４における特定部位の突然変異を導入した。このために、
１つのヌクレオチド（下線）を交換した組換え型プライマーを用い、従って触媒
部位内において、アスパラギン酸をアスパラギンで置換した。
【００４５】 このために、第一のＰＣＲにおいて、プライマー（配列ＩＤ Ｎｏ.:５）(5'-
ACA AGT CAA CGC CAG CAA GT-3')及びセンスＤＮＡ株と相補的なＣからＴに交換
したヌクレオチド（下線）を含有するプライマー（配列ＩＤ Ｎｏ.:６）(5'-CC
C ATT GTT AGT TCC CAA TAC CTG AG-3')を用いた。
【００４６】 第二のＰＣＲにおいて、ＧからＡに交換したヌクレオチド（下線）を含有する
プライマー（配列ＩＤ Ｎｏ.:７）(5'-TGG GAA CTA ACA ATG GGC CTG CCT-3')
及びアンチセンスＤＮＡ株に相補的なプライマー（配列ＩＤ Ｎｏ.:８）(5'-CG
T TGA ACG CGC CAT GTC AG-3')を用いた。両反応から得られたＰＣＲフラグメン
トを精製し、次に第三のＰＣＲにおいて鋳型として使用した。４５℃での最初の
３回のサイクルの後に、温度を５５℃に上昇させ、プライマー（配列ＩＤ Ｎｏ
.:５）及び（配列ＩＤ Ｎｏ.:８）を添加した。３２回のサイクルの後に、ＰＣ
Ｒフラグメントを精製し、制限酵素ＮｄｅＩ及びＳａｃIIで消化させ、４５０ｂ
ｐのフラグメントが生じ、再度精製した。
【００４７】 ２つのＮｄｅＩ制限部位（１つはインテグラーゼ遺伝子内、１つはインテグラ
ーゼ遺伝子の外）及び１つのＳａｃII制限部位（インテクラーゼ遺伝子内）を含
有するプラスミドｐＧａｇＰｏｌ．ｇｐｔを制限酵素ＮｄｅＩ及びＳａｃIIで消
化させ、９４６７ｂｐのＮｄｅＩ／ＳａｃIIベクターバックボーン、２９４８ｂ
ｐのＮｄｅＩ／ＮｄｅＩ及び４５０ｂｐのＮｄｅＩ／ＳａｃIIＤＮＡフラグメン
トを生じた。該バックボーンフラグメントを分離し、精製した。
【００４８】 それぞれｐＧａｇＰｏｌ．ｇｐｔバックボーン２０ｎｇ及び突然変異させたＮ
ｄｅＩ／ＳａｃIIＰＣＲフラグメント２０ｎｇを混合し、Ｔ４-リガーゼ（ベー
リンガー）を用いて４℃にて１２時間、結合させた。該リガーゼを、６５℃にて
２０分間不活性化させ、１０倍量のブタノールを用いて、ＤＮＡをブタノール沈
殿させた。沈殿させたＤＮＡを水に再懸濁させ、ＤＨ１０Ｂバクテリア（Ｇｉｂ
ｃｏ）に電気穿孔させた。アンピシリン耐性コロニーを選択し、ＤＮＡを調製し
、制限酵素ＸｈｏＩ及びＮｄｅＩで試験的に消化させた。生じたプラスミドの塩
基配列決定により、更に確認した。該中間の適切なプラスミドをｐＩＮ１−２６
４ｎｅｗと称した。
【００４９】 該中間のプラスミドｐＩＮ１−２６４ｎｅｗにおいて、１つのＮｄｅＩ制限部
位が欠損した。失われた２９４８ｂｐのＮｄｅＩ／ＮｄｅＩフラグメントを回復
させるために、ｐＩＮ１−２６４ｎｅｗを制限酵素ＸｈｏＩ及びＮｄｅＩで消化
させ、３８４２ｂｐ及び６０７５ｂｐのフラグメント（消化物１）を得た。また
発現ベクターｐＧａｇＰｏｌ．ｇｐｔを制限酵素ＸｈｏＩ及びＮｄｅＩで消化さ
せ、２９４８ｂｐ、３８４２ｂｐ及び６０７５ｂｐのフラグメント（消化物２）
を得た。全てのＤＮＡフラグメントを精製した。次に、消化物１の３８４２ｂｐ
のＮｄｅＩ／ＸｈｏＩフラグメント４０ｎｇ、及び消化物２の２９４８ｂｐのＮ
ｄｅＩ／ＮｄｅＩ３０ｎｇ及び６０７５ｂｐのＮｄｅＩ／ＸｈｏＩフラグメント
３７．５ｎｇを混合し、Ｔ４-リガーゼ（ベーリンガー）を用いて、６℃から１
６℃まで温度を１時間に１℃上昇させて結合させた。該リガーゼを６５℃にて２
０分間、不活性化させ、１０倍量のブタノールを用いて、ＤＮＡをブタノール沈
殿させた。沈殿させたＤＮＡを水に再懸濁させ、ＤＨ１０Ｂバクテリア（Ｇｉｂ
ｃｏ）に電気穿孔させた。アンピシリン耐性コロニーを選択し、ＤＮＡを調製し
、制限酵素ＸｈｏＩ、ＮｄｅＩ及びＨｉｎｄIIIで試験的に消化させ、塩基配列
決定した。最終的な適切なプラスミドをｐＩＮＤ１８４Ｎと称した。
【００５０】 ２．ｐｏｌ領域における１つの塩基対の突然変異、フレームシフト突然変異の
導入及び人工終止コドンによるＭＬＶインテグラーゼの不活性化 上述のように、発現プラスミドｐＧａｇＰｏｌ．ｇｐｔを、種々のＰＣＲセッ
トアップに用いた。従って、第一のＰＣＲにおいて、プライマー（配列ＩＤ Ｎ
ｏ.:５）及びセンスＤＮＡ株に相補的なＣからＴに交換したヌクレオチド（下線
）を含有するプライマー（配列ＩＤ Ｎｏ.:９）(5'-GGC CCA TTG TTA GTT CCC
AAT ACC TGA G-3')を用いた。第二のＰＣＲにおいて、ＧからＡに交換したヌク
レオチド（下線）及び追加のＣ（小文字）を含有するプライマー（配列ＩＤ Ｎ
ｏ.:１０）(5'-TGG GAA CTA ACA ATG GGC CcT GC-3')、並びにアンチセンスＤＮ
Ａ株に相補的なプライマー（配列ＩＤ Ｎｏ.:８）を用いた。このプライマーを
用いて導入されるヌクレオチドの交換により、触媒部位内においてアスパラギン
酸はアスパラギンで置換される。さらに、追加のＣが挿入され、フレームシフト
突然変異を引き起こす。該ＰＣＲフラグメントを精製し、例３の１．に記載され
るように実行される第三のＰＣＲにおいて、鋳型として使用した。
【００５１】 得られたフラグメントを制限酵素ＮｄｅＩ及びＳａｃIIで消化させ、４５１ｂ
ｐのフラグメントを生じ、それを精製した。次に、突然変異させたＮｄｅＩ／Ｓ
ａｃIIＰＣＲフラグメント５ｎｇを、例３の１．で調製されるｐＧａｇＰｏｌ．
ｇｐｔバックボーン２０ｎｇにＴ４-リガーゼ（ベーリンガー）を用いて、結合
させた。１２℃にて１８時間たった後に、該リガーゼを６５℃にて２０分間、不
活性化させ、該ＤＮＡを１０倍量のブタノールを用いてブタノール沈殿させ、沈
殿したＤＮＡをＤＨ１０Ｂバクテリア（Ｇｉｂｃｏ）に電気穿孔させた。アンピ
シリン耐性コロニーを選択し、ＤＮＡを調製し、制限酵素ＸｈｏＩ及びＮｄｅＩ
で試験的に消化させ、塩基配列決定した。該中間のプラスミドをｐＩＮ１-２６
４Ｍと称した。
【００５２】 プラスミドｐＩＮ１-２６４Ｍにおいて失われた２９４８ｂｐのＮｄｅＩ／Ｎ
ｄｅＩフラグメントを回復させるために、制限酵素ＸｈｏＩ及びＮｄｅＩで消化
させ、３８４３ｂｐ及び６０７５ｂｐのフラグメント（消化物３）を得た。発現
ベクターｐＧａｇＰｏｌ．ｇｐｔを制限酵素ＸｈｏＩで消化させ、ＮｄｅＩで部
分的に消化させ、９０２３ｂｐ及び３８４２ｂｐのフラグメント（消化物４）を
得た。両方の消化物から得られるフラグメントを上述のように精製した。消化物
３の３８４３ｂｐのＮｄｅＩ／ＸｈｏＩフラグメント２０ｎｇ、及び消化物４の
９０２３ｂｐのＮｄｅＩ／ＸｈｏＩバックボーン２６ｎｇを、Ｔ４-リガーゼ（
ベーリンガー）を用いて、１２℃にて１８時間、結合させた。上述のように精製
及び電気穿孔の後に、アンピシリン耐性コロニーを選択し、制限酵素ＰｍａＣＩ
で試験的に消化させた。塩基配列分析により、アミノ酸１８４の特定部位の突然
変異に成功し、６４６５ｂｐにて追加のＣが正確に導入され、ＡＡ１８７からＡ
Ａ２０３までフレームシフトを引き起こし、続く人工終止コドンが生じることが
確認された。最終的な適切なプラスミドをｐＩＮ１-２０３Ｍ１５と称した。
【００５３】 ３．ｐｏｌ領域の欠失突然変異誘発によるＭＬＶインテグラーゼの不活性化 インテグラーゼの触媒部位以外のＣ末端における欠失突然誘発のために、発現
プラスミドｐＧａｇＰｏｌ．ｇｐｔを用いた。従って、ｐｏｌ遺伝子内のインテ
グラーゼ領域に特異的な９つの異なるＰＣＲプライマー（表１、配列ＩＤＮｏ.:
１１〜１９）を、天然に存在するＳｆｉＩ制限部位の下流のインテグラーゼ領域
内のｐｏｌ遺伝子に特異的なプライマー（配列番号 Ｎｏ.:２０）(5'-GTCAGCAA
CCAGGTGTGGAA-3')と組み合わせて、別個のＰＣＲに用いた。該プライマーは、増
幅生成物に新たなＳｆｉＩ部位（下線）を導入した。
【００５４】 また９つの異なる先述のプライマーを用いて得られたＰＣＲ増幅生成物の種々
の長さも表１に示す。
【００５５】
【表１】
【００５６】 精製した増幅生成物を制限酵素ＳｆｉＩで消化させ、再度精製した。 従って、クローニングベクターｐＧａｇＰｏｌ．ｇｐｔを制限酵素ＳｆｉＩで
消化させ、１０４０８ｂｐ及び２４５７ｂｐのフラグメントを生じた。精製した
１０４０８ｂｐのバックボーンフラグメントを、種々のＳｆｉＩ ＰＣＲで生じ
たフラグメントに結合させた。
【００５７】 下記の量のｐＧａｇＰｏｌ．ｇｐｔバックボーン及びＳｆｉＩ ＰＣＲで生じ
たフラグメントを結合反応のために混合した。
【００５８】 PCRフラグメントサイズ pGagPol.gptバックボーン SfiIフラグメント ２２４６ｂｐ： ３ｎｇ ５ｎｇ ２２８８ｂｐ： ３ｎｇ ７．５ｎｇ ２３２４ｂｐ： ３ｎｇ ５ｎｇ ２３７５ｂｐ： ４ｎｇ １０ｎｇ ２５３３ｂｐ： １０ｎｇ ６０ｎｇ ２５５１ｂｐ： ５０ｎｇ ２５ｎｇ ２５６８ｂｐ： １０ｎｇ ３０ｎｇ ２５９８ｂｐ： １０ｎｇ １５ｎｇ ２６３０ｂｐ： １０ｎｇ ４５ｎｇ。
【００５９】 結合は、Ｔ４-リガーゼ（ベーリンガー）を用いて、１２℃にて１４時間行っ
た。上述のように不活性化、沈殿及び電気穿孔の後に、アンピシリン耐性コロニ
ーを選択し、制限酵素ＮｄｅＩで試験的に消化させ、塩基配列決定をした。ＭＶ
Ｌインテグラーゼ遺伝子において種々の欠失突然変異を表わす最終的なプラスミ
ドを、ｐＩＮ２６３、ｐＩＮ２７７、ｐＩＮ２８９、ｐＩＮ３０６、ｐＩＮ３６
０、ｐＩＮ３６４、ｐＩＮ３７１、ｐＩＮ３８１及びｐＩＮ３９２と称した。
【００６０】 ４ａ．ＭｏＭＬＶｅｎｖを発現するパッケージング細胞の構築のためのＭｏＭ
ＬＶｅｎｖ発現ベクター プラスミドｐＧＲ１０２(Salmonら、1985年、Virol 144:101-114）から得られ
るＭｏＭＬＶｅｎｖ遺伝子を含有するフラグメント及びｐＳＶ２ｎｅｏ(Souther
n and Berg、1982年)バックボーンそれぞれの結合により、発現ベクターｐＳＶ
−Ｍｅｎｖを構築した。
【００６１】 従って、ベクターｐＳＶ２ｎｅｏを、制限酵素ＨｉｎｄIII及びＢＳＳＨIIで
消化させた。４８３１ｂｐのバックボーンフラグメントを精製した。更に、ＰＣ
Ｒ法を用いて、プラスミドｐＧＲ１０２からＭｏＭＬＶｅｎｖ遺伝子を分離した
。従って、ｅｎｖ遺伝子の開始点に特異的で、また新たなＨｉｎｄIII制限部位
（下線）を生じさせるプライマーＭｅｎｖｒ（配列ＩＤ Ｎｏ.:２１）(5'-GCGA
AGCTTTCCACAGGATGCCGAATCACC-3')、及びｅｎｖ遺伝子の末端に特異的で、また新
たなＢｓｓＨII制限部位（下線）を導入するプライマーＭｅｎｖｒ（配列ＩＤ
Ｎｏ.:２２）(5'-ATAGCGCGCCCAAGTTTGCAGCAGAGAATG-3')を用いた。増幅生成物は
２１８６ｂｐのフラグメントを生じ、それを制限酵素ＨｉｎｄIII／ＢｓｓＨII
で消化させ、再度精製した。
【００６２】 次に、ｐＳＶ２ｎｅｏバックボーン１０ｎｇ及びＨｉｎｄIII／ＢｓｓＨIIフ
ラグメント１０ｎｇを、Ｔ４-リガーゼ（ＢＲＬ）を用いて、１６℃にて１２時
間、結合させた。上述のように結合、電気穿孔した後に、アンピシリン耐性コロ
ニーを試験した。適切なプラスミドをｐＳＶ−Ｍｅｎｖと称した。
【００６３】 ４ｂ．もう１つのＭｏＭＬＶｅｎｖ発現ベクター 例３の４ａ．に記載されるように、プラスミドｐＭＯＶ１-(Mannら、1983年、
Cell 33:153-159)から得られるＭｏＭＬＶｅｎｖ遺伝子を含むフラグメント及び
ｐＳＶ−Ｍｅｎｖバックボーンの結合により、発現ベクターｐＭＯＶｅｎｖを構
築した。
【００６４】 このために、ベクターｐＭＯＶ１-及びｐＳＶ−Ｍｅｎｖを、制限酵素Ｈｉｎ
ｄIII及びＢｓｓＨIIで消化させ、それぞれ３３１８ｂｐ及び１４５３５ｂｐ及
び４８３１ｂｐ及び２１８６ｂｐのフラグメントを得た。３３１８ｂｐ及び４８
３１ｂｐのフラグメントを精製した。
【００６５】 次に、３３１８ｂｐのＭｏＬＶｅｎｖ遺伝子を含むｐＭＯＶ１-のＨｉｎｄIII
／ＢｓｓＨIIフラグメント５０ｎｇを、４８３１ｂｐのｐＳＶ−Ｍｅｎｖバック
ボーン６０ｎｇと混合し、Ｔ４-リガーゼ（ＢＲＬ）を用いて１６℃にて１２時
間、結合させた。上述のように、結合、電気穿孔の後に、アンピシリン耐性コロ
ニーを、制限酵素ＢａｍＨＩ、ＣＩａＩ、ＸｂａＩ、ＢｓｓＨII及びＨｉｎｄII
Iで試験した。適切なプラスミドをｐＭＯＶｅｎｖと称した。
【００６６】 ５ａ．突然変異したインテグラーゼ遺伝子又は部分的に欠失したインテグラー
ゼ遺伝子を含むＭＬＶｇａｇ−ｐｏｌコード領域を担持する安定なセミパッケー
ジング細胞系の構築 細胞系の安定的なトランスフェクションのために、５×１０5の細胞（例えば
、ＣＯＳ７、ＨＴ１００８０、２９３Ｔ、２９３）を、直径１００ｍｍのディッ
シュにまいた。トランスフェクションの際、１０μｇのｐＧＡＧＰＯＬ．ｇｐｔ
、ｐＩＮＤ１８４Ｎ、ｐＩＮ１−２０３Ｍ１５、ｐＩＮ２６３、ｐＩＮ２７７、
ｐＩＮ２８９、ｐＩＮ３０６、ｐＩＮ３６０、ｐＩＮ３６４、ｐＩＮ３７１、ｐ
ＩＮ３８１又はｐＩＮ３９２を、生産過程説明書に従ってリン酸カルシウムプロ
トコルセルフェクトキット（ファルマシア）を用いてトランスフェクションさせ
た。トランスフェクションの１４時間後に、培地を変え、トランスフェクション
の２４時間後に、細胞をトリプシンで処理し、２２５ｃｍ2のフラスコに移し換
え、ヒポキサンチン１５μｇ／ｍｌ、キサンチン２５０μｇ／ｍｌ、ミコフェノ
ール酸(mycophenolic acid)２５ｍｇ／ｍｌを含む培地を添加し、安定的にトラ
ンスフェクションした細胞を選択した。安定なセミパッケージング細胞系を、２
９３の場合には２９ＧＡＧ、２９１８４、２９２０３、２９２６３、２９２７７
、２９２８９、２９３０６、２９３６４、２９３７１、２９３８１及び２９３９
２と称した。他の細胞も同様に、２９３Ｔ（２ＴＧＡＧ−２Ｔ３９２）、ＣＯＳ
７（ＣＯＧＡＧ−Ｃ３９２）及びＨＴ１０８０（ＨＴＧＡＧ−ＨＴ３９２）と称
した。
【００６７】 ５ｂ．突然変異したインテグラーゼ遺伝子又は部分的に欠失したインテグラー
ゼ遺伝子を含むＭＬＶｇａｇ−ｐｏｌコード領域、ＭｏＭＬＶｅｎｖ領域及びＭ
ｏＭＬＶに基づくウイルスベクターを担持する、安定なウイルスベクターを産生
する細胞系の構築 細胞系の安定的なトランスフェクションのために、５×１０5の細胞（例えば
、２９ＧＡＧ、２９１８４、２９２０３、２９２６３、２９２７７、２９２８９
、２９３０６、２９３６０、２９３６４、２９３７１、２９３８１及び２９３９
）を、直径１００ｍｍのディッシュにまいた。トランスフェクションの際、ｐＬ
ＸＳＮＥＧＦＰ(Kleinら、1997年、Gene Therapy 4:1256-1260）１０μｇ、及び
ｐＡＬＦ(Cossetら、1995年、J.Virol.69:7430-7436)１０μｇを、生産過程説明
書に従ってリン酸カルシウムプロトコルセルフェクトキット（ファルマシア）を
用いてトランスフェクションさせた。トランスフェクションの１４時間後に、培
地を変え、トランスフェクションの２４時間後に、細胞をトリプシンで処理し、
２２５ｃｍ2のフラスコに移し替え、フレオマイシン５０μｇ／ｍｌを含む培地
を添加し、安定的にトランスフェクションした細胞を選択した。この２週間の最
初の選択後、培地を４４０μｇ／ｍｌのＧ４１８を含む培地に変更し、更に２週
間の選択を行った。該群を、２９ＧＡＧＶＰＣ、２９１８４ＶＰＣ、２９２０３
ＶＰＣ、２９２６３ＶＰＣ、２９２７７ＶＰＣ、２９２８９ＶＰＣ、２０３０６
ＶＰＣ、２０３６０ＶＰＣ、２９３６４ＶＰＣ、２９３７１ＶＰＣ、２９３８１
ＶＰＣ及び２９３９２ＶＰＣと称した。
【００６８】 ５ｃ．突然変異したインテグラーゼ遺伝子又は部分的に欠失したインテグラー
ゼ遺伝子を含むＭＬＶｇａｇ−ｐｏｌコード領域、ＶＳＶ Ｇタンパク質遺伝子
及びＭＬＶに基づくウイルスベクターを担持する、一時的にウイルスベクターを
産生する細胞系の構築 細胞系の安定的なトランスフェクションのために、５×１０5の細胞（例えば
、２９ＧＡＧ、２９１８４、２９２０３、２９２６３、２９２７７、２９２８９
、２９３０６、２９３６４、２９３７１、２９３８１及び２９３９）を、直径１
００ｍｍのディッシュにまいた。トランスフェクションの際、ｐＬＸＳＮＥＧＦ
Ｐ(Kleinら、1997年、Gene Therapy 4:1256-1260)１０μｇ及びｐＨＣＭＶ−Ｇ(
Burnsら、1993年、Proc.Natl.Acad.Sci USA 90:8033-8037)１０μｇを、生産過
程説明書に従ってリン酸カルシウムプロトコルセルフェクトキット（ファルマシ
ア）を用いて、トランスフェクションさせた。トランスフェクションの１４時間
後に、培地を変え、トランスフェクションの２４時間後に細胞からの上澄み液を
収集した。
【００６９】
【配列表】
【手続補正書】特許協力条約第３４条補正の翻訳文提出書
【提出日】平成１２年１０月１８日（２０００．１０．１８）
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】特許請求の範囲
【補正方法】変更
【補正内容】
【特許請求の範囲】
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｃ１２Ｎ 7/00 Ｃ１２Ｎ 5/00 (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，Ｅ Ａ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ， ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，Ｇ Ｅ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ， ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，Ｍ Ｎ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ， ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，Ｚ Ａ，ＺＷ (72)発明者 ゴラー、ザビーネ オーストリア国、アー−1030 ウィーン、 ホフマンシュタールガッセ ６／５／８ (72)発明者 クライン、ディーター オーストリア国、アー−3430 トゥルン、 モラースドルフ 50

Claims (23)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 １以上の異種核酸配列、並びに前記異種配列をゲノムの非コ
    ード領域に部位特異的に組込ませる少なくとも１つの配列を含んでなるレトロウ
    イルスベクター。
  2. 【請求項２】 前記部位特異的に組込ませる配列が、レトロウイルスの長末
    端反復配列（ＬＴＲ）のＵ３領域及び／又はＵ５領域にて挿入される請求項１に
    記載のレトロウイルスベクター。
  3. 【請求項３】 前記部位特異的に組込ませる配列が、アデノ関連ウイルス（
    ＡＡＶ）の逆方向末端反復（ＩＴＲ）配列である請求項１又は２に記載のレトロ
    ウイルスベクター。
  4. 【請求項４】 前記ゲノムが、ヒトを含む哺乳類の染色体である請求項１〜
    ３の何れか１項に記載のレトロウイルスベクター。
  5. 【請求項５】 前記染色体が、第１９番染色体である請求項４に記載のレト
    ロウイルスベクター。
  6. 【請求項６】 少なくとも１つの異種核酸配列が、ウイルス感染の治療、又
    は遺伝性、代謝性、増殖性若しくは何れか他の関連疾患又は病気の治療に関連す
    る異種遺伝子である請求項１〜５の何れか１項に記載のレトロウイルスベクター
    。
  7. 【請求項７】 少なくとも１つの異種核酸配列が、組込みを媒介するタンパ
    ク質をコードする配列である請求項１〜６の何れか１項に記載のレトロウイルス
    ベクター。
  8. 【請求項８】 前記組込みを媒介するタンパク質が、ＡＡＶ Ｒｅｐタンパ
    ク質である請求項７に記載のレトロウイルスベクター。
  9. 【請求項９】 前記組込みを媒介するタンパク質をコードする配列が、誘導
    性プロモーターの転写調節下にある請求項７又は８に記載のレトロウイルスベク
    ター。
  10. 【請求項１０】 第一の要素としての請求項１〜９の何れか１項に記載のベ
    クター、及び前記ベクターをパッケージングするのに必要なタンパク質をコード
    する少なくとも１つのＤＮＡ構築物を有するパッケージング細胞を含んでなるレ
    トロウイルスベクター系。
  11. 【請求項１１】 前記パッケージング細胞が、突然変異したレトロウイルス
    インテグラーゼ（ＩＮ）又は完全に若しくは部分的に欠失したレトロウイルスイ
    ンテグラーゼ（ＩＮ）を合成する請求項１０に記載のレトロウイルスベクター系
    。
  12. 【請求項１２】 請求項１〜９の何れか１項に記載のレトロウイルスベクタ
    ーを含有するレトロウイルス粒子。
  13. 【請求項１３】 請求項１〜９の何れか１項に記載のレトロウイルスベクタ
    ーで、請求項１０又は１１に記載のレトロウイルスベクター系のパッケージング
    細胞をトランスフェクションさせることによって得られる請求項１２に記載のレ
    トロウイルス粒子。
  14. 【請求項１４】 請求項１２又は１３に記載のレトロウイルス粒子で標的細
    胞を感染させることにより生産されるレトロウイルスのプロウイルス。
  15. 【請求項１５】 請求項１４に記載のレトロウイルスのプロウイルスのｍＲ
    ＮＡ。
  16. 【請求項１６】 請求項１〜９の何れか１項に記載のレトロウイルスベクタ
    ーのＲＮＡ。
  17. 【請求項１７】 請求項１６に記載のＲＮＡのｃＲＮＡ。
  18. 【請求項１８】 請求項１２又は１３に記載のレトロウイルス粒子で感染さ
    せた宿主細胞。
  19. 【請求項１９】 請求項１２又は１３に記載のレトロウイルス粒子で標的細
    胞を感染させることを含んでなる、標的細胞への同種及び／又は異種ヌクレオチ
    ド配列を導入する方法。
  20. 【請求項２０】 ウイルス感染の治療、又は遺伝性、代謝性、増殖性若しく
    は何れか他の関連疾患又は病気の治療における使用のための、請求項１〜９の何
    れか１項に記載のレトロウイルスベクター及び／又は請求項１２又は１３に記載
    のレトロウイルス粒子及び／又は請求項１０又は１１に記載のレトロウイルスベ
    クター系。
  21. 【請求項２１】 ウイルス感染の治療、又は遺伝性、代謝性、増殖性若しく
    は何れか他の関連疾患又は病気の治療のための薬剤組成物を生産するための、請
    求項１〜９の何れか１項に記載のレトロウイルスベクター及び／又は請求項１２
    又は１３に記載のレトロウイルス粒子及び／又は請求項１０又は１１に記載のレ
    トロウイルスベクター系の使用。
  22. 【請求項２２】 治療学的に有効な量の請求項１〜９の何れか１項に記載の
    レトロウイルスベクター及び／又は請求項１２又は１３に記載のレトロウイルス
    粒子及び／又は請求項１０又は１１に記載のレトロウイルスベクター系を含有す
    る薬剤組成物。
  23. 【請求項２３】 治療学的に有効な量の請求項１２又は１３に記載のレトロ
    ウイルス粒子及び／又は請求項１０又は１１に記載のレトロウイルスベクター系
    を、必要とする患者に投与することを含んでなる、ウイルス感染、又は遺伝性、
    代謝性、増殖性若しくは何れか他の関連疾患又は病気の治療方法。
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