JP2001509009A - 二機能性レトロウイルス／アデノウイルス系 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 本発明は血管投与後に細胞への非常に効率的な伝達と、形質導入後の細胞の安定したゲノム修正のための異種遺伝子配列の統合能力を有する二機能性ウイルス系に関するものである。この二機能性ベクターにおいては、レトロウイルス性『組み込み』機能か（レトロウイルス性ｇａｇ、ｐｏｌ、及びｎｅｖ）、レトロウイルス性『ベクター』機能（『治療用』遺伝子が側鎖したレトロウイルス性ＬＴＲ配列）のいずれかを含む複製不全アデノウイルス性ベクターを構成することによって細胞内での局所的、本来の場所でのレトロウイルス粒子産出のために、その細胞にレトロウイルス機能を提供するためにアデノウイルス性ベクターが用いられる。

Description

【発明の詳細な説明】 発明の名称 二機能性レトロウイルス／アデノウイルス系 発明の背景関連出願 本願は１９９６年１１月１９日出願の仮出願６０／０３１，３２３及び１９９ ７年２月４日出願の仮出願６０／０３７，０８１に基づくものである。発明の分野 本願は一般的にはベクターの分子生物学及び遺伝子治療の分野に関するもので ある。より具体的には、本発明は二機能性アデノウイルス・ベクター系及びその 利用法に関する。関連技術の説明 心臓、肺、及び血液の疾患に対する多数の遺伝子治療は関連柔組織細胞の安定 した遺伝子修正に基づいている。多くの場合、これはそれによって安定した形質 導入が特定の箇所で達成される直接のイン・ビボ遺伝子伝達によってのみ達成す ることができる。この目的のために、種々のウイルス性ベクターが、安定した遺 伝子性形質導入を達成するための手段としてその結合能力を向上させるために開 発されている。このタイプのベクターとしては遺伝子組換えレトロウイルス及び アデノ関連ウイルス（ＡＡＶ）などがあり、標的細胞の安定 した遺伝子性修正を達成するためにイクス・ビボ遺伝子伝達方式によって用いら れている。 これらのイクス・ビボ例でのレトロウイルス及びＡＡＶベクターの利用性にも 拘らず、直接イン・ビボ遺伝子伝達のためにこれらのベクターを用いるにはいく つかの問題がある。これに関連して、有効な力価及びイン・ビボでの安定性とい う問題が柔組織の直接特定箇所形質導入が必要となる多くの方式のためのこれら のベクターの利用性に限られたものにしている。一方、遺伝子組換えアデノウイ ルス性ベクターは高力価に調製することが可能で、イン・ビボでの安定性を有し ており、両方の要素とも種々の標的細胞に対する直接イン・ビボ遺伝子伝達のた めにそれらを用いることを可能にしている。しかしながら、アデノウイルス性ベ クターの制約は誘導される異種遺伝子表現が一過性に過ぎないことである。これ は、部分的にはアデノウイルス性ベクターによって形質導入された細胞が免疫的 に宿主によって根絶されてしまうという事実に基づいている。加えて、親のアデ ノウイルスがそのゲノムを宿主ルロモソームに結合させる能力を有していない。 先行技術は直接のイン・ビボでのベクター投与後の安定した遺伝子による細胞 の修正を可能にしてくれるような有効なベクター系を欠いている点で不十分であ る。本発明はこの技術分野における長年望まれていたニーズと望みに応えるもの である。 発明の要約 イン・ビボでの標的細胞の効率的で安定した形質導入を行うことができる系を 誘導するために、アデノウイルス性ベクターで、レトロウイルス性結合機能をつ くりだすことができる。本発明はレトロウイルス性ベクターの組み込み及びレト ロウイルス性ベクター機能がアデノウイルス性ベクター構成物の中で機能するこ とができ、結合性の子孫レトロウイルス性ベクターをうまく誘導することを示す ものである。この方式においては、標的細胞はアデノウイルス性ベクターが媒介 するレトロウイルス性ベクター配列の伝達とレトロウイスル性組み込み機能のア デノウイルス性ベクター表現との組み合わせによる一過性レトロウイルス性『プ ロデューサ細胞』とし機能するように誘導される。このイン・ビボ状況では、レ トロウイルス組み込み及びベクター機能の高効率な伝達は本来の場所でこれを達 成するアデノウイルス性ベクターを介して柔組織個所で達成されるであろう。従 って、その場所でつくりだされるレトロウイルス性ベクターは隣接細胞には二次 的な影響を及ぼすだけで暗転した遺伝子性形質導入を達成することができるであ ろう。従って、各成分ベクターの好ましい性質をつくりだす『二機能性』ベクタ ー系が開発されたのである。 本発明の目的はレトロウイルス性結合機能を含むアデノウイルス性ベクターを 開発して、標的細胞の安定した形質導入のためにイン・ビトロでのその利用を最 適化することである。 本発明の他の目的はこれらの二機能性ベクターを用いて心臓、肺、及び血液の 疾患に関連した柔組織細胞の安定したイン・ビボでの遺伝子修正を行うことであ る。 結合能力を有するアデノウイルス性ベクターの開発はこれらのベクターがイン ・ビボで導入遺伝子の安定した結合を可能にしてくれるであろう。こうした戦略 は、従って、柔組織標的個所での安定した遺伝子表現を可能にする上で好ましい 特性をつくりだし、心臓、肺及び血液の病気のための遺伝子治療に応用する上で 効果的な遺伝子補正を行う可能性を大幅に改善してくれるであろう。 本発明のひとつの実施の形態においては、レトロウイルス性配列を含む少なく とも１つのアデノウイルス性ベクターで構成される二機能性のアデノウイルス性 ／レトロウイルス性ベクターが提供される。 本発明のひとつの実施の形態においては、本発明による上記の二機能性のアデ ノウイルス性／レトロウイルス性ベクターをそうした治療を必要とする個人に投 与するステップを含む標的細胞に安定して形質導入する方法が提供される。 本発明の他の、そしてさらなる側面、特徴、及び利点は開示の目的で提供され る本発明の現段階で好ましい実施の形態についての以下の説明を参照することで 明らかになるであろう。 図面の説明 上に述べた、およびこれから明らかになる本発明の特徴、 利点、及び目的を詳細に理解できるように、上に要約して述ベた発明について、 添付図面に示すそのいくつかの実施の形態を参照して、以下に具体的に説明する 。これらの図面は明細書の一部を構成する。なお、添付図面は本発明の好ましい 実施の形態を示すものであって、その範囲を限定することは意図していない。 図１は標的器官個所でのレトロウイルス性ベクターの局所的発生の図を示して いる。レトロウイルス性ベクター及び組み込み機能をコード表現するアデノウイ ルス性ベクターは標的柔組織細胞に対するイン・ビボでの遺伝子伝達を高効率で 達成して、それらを一過性のレトロウイルス性プロデューサ細胞にしてしまう。 局所的につくりだされるレトロウイルス性粒子は従って隣接細胞に直接影響を及 ぼす場合がある。 図２Ａはレトロウイルス性組み込み機能を含むアデノウイルス性シャトル・プ ラスミドのマップを示し、図２Ｂはレトロウイルス性ベクター機能を含むアデノ ウイルス性シャトル・プラスミドのマップを示す。 図３は分子分析を介してのアデノウイルス性ベクターの構造的検証を示す。 図４はイン・ビボでの標的細胞増殖を誘発するためのＨＧＦ及びＫＧＦをコー ド表現する構成化アデノウイルス性ベクターのマップを示す。 図５は上記アデノウイルス性／レトロウイルス性の二機能性ベクター系を介し て達成された持続性のある遺伝子表現を 示す。標的細胞はＡｄＬＮＣＭＶＧＦＰ＋ＡｄＣＭＶｍｐｇあるいはＡｄＬＮＣ ＭＶＧＦＰだけで感染されて、安定した遺伝子性形質導入が行われたかどうかに ついての分析が行われた。Ｗ１２６細胞におけるＧＦＰ表現はアデノウイルス性 ベクターの感染後示されている時点で蛍光顕微鏡で分析された。 図６はい持続性のある遺伝子表現を示している。標的細胞はＡｄＬＮＣＭＶＧ ＦＰ＋ＡｄＣＭＶｍｐｇあるいはＡｄＬＮＣＭＶＧＦＰだけで感染されて、安定 した遺伝子性形質導入が行われたかどうかについての分析が行われた。図６Ａは 感染後の示された時点でのＷ１２６細胞におけるＧＦＰ表現のＦＡＳＣ分析を示 している。図６Ｂは感染後３０日目に取り出されたＷ１２６細胞から抽出された ゲノム性ＤＮＡの分析を示している。細胞のＨＭＷＤＮＡをＭｕｎＩで消化して 、レトロウイルス性ベクター部分でプローブした。レーン１のＤＮＡはＡｄＬＮ ＣＭＶＧＦＰ＋ＡｄＣＭＶｍｐｇで感染した細胞から取り出したもので、レーン ２のＤＮＡはＡｄＬＮＣＭＶＧＦＰだけで感染された細胞から抽出されたもので あり、そしてレーン３はＭｕｎＩで消化したＡｄＬＮＣＭＶＧＦＰゲノム性ＤＮ Ａを含む比較例である。 図７はアデノウイルス／レトロウイルス二機能性ベクターを介しての形質導入 レトロウイルス粒子の誘導を示している。図に示されている細胞はＡｄＬＮＣＭ ＶＧＦＰだけか、あるいはＡｄＬＮＣＭＶＧＦＰ＋ＡｄＣＭＶｍｐｇで処理さ れ、上澄液をＮＩＨ−３Ｔ３細胞上に滴下してレトロウイルス性ベクターについ て調べた。上澄液を処理した細胞は蛍光顕微鏡で２０日目に分析した。 図８はアデノウイルス／レトロウイルス二機能性ベクターを介してのイン・ビ ボでの遺伝子伝達を示している。ＳＫＯＶ３_ipl細胞を腹膜内に移植した。図６ Ａはヘマトサイクリンで染色した腹膜内腫瘍塊である。供試動物は図６Ｂに示す ようにＡｄＬＮＣＭＶＧＦＰだけか、あるいは（図６Ｃに示すように）ＡｄＬＮ ＣＭＶＧＦＰとＡｄＣＭＶｍｐｇで刺激を与えて、１６日目にＧＦＰが表現され ているかどうかを蛍光顕微鏡で分析した。 図９はアデノウイルス／レトロウイルス二機能性ベクターを介してのイン・ビ ボ遺伝子伝達を示している。ＳＫＯＶ_ipl細胞をＡｄＬＮＣＭＶＧＦＰ（図９Ｂ ）又はＡｄＬＮＣＭＶＧＦＰ＋ＡｄＣＭＶｍｐｇ（図９Ｃ）で感染させて、バー ジン腫瘍細胞と混合し、ヌード・マウスの皮下に移植した。２０日目に、腫瘍を 取り出して、蛍光顕微鏡で分析した。（図９Ａ）ヘマトサイクリンで染色された 部分を２つのウイルス皮下塊から取り出した。ＳＫＯＶ３_iplを腹膜内に移植し て、動物にＡｄＬＮＣＭＶＧＦＰだけか（図９Ｅ）、あるいはＡｄＬＮＣＭＶＧ ＦＰ＋ＡｄＣＭＶｍｐｇ（図９Ｆ）で刺激を与えた。１６日目にＧＦＰの表現が あるかどうかを蛍光顕微鏡で分析した。（図９Ｄ）ヘマトサイクリンで染色した 腹膜内腫瘍塊。 発明の詳細な説明 本発明は血管投与後に効率的にイン・ビボ遺伝子伝達を行うと同時に異種遺伝 子配列を結合して、形質導入後の安定したた細胞の遺伝子的修正を行う能力を有 するベクター系に関するものである。本発明の二機能性ベクターにおいては、細 胞内にレトロウイルス性粒子を局所的に、本来の場所でつくりだす目的で、レト ロウイルス性機能を伝達するためにアデノウイルス性ベクターが用いられる。こ れはレトロウイルス性『組み込み』機能（レトロウイルス性遺伝子 ｇａｇ．ｐ ｏｌ．ｅｎｖ）かレトロウイルス性『ベクター』機能（『治療用』遺伝子を側鎖 しているレトロウイルス性ＬＴＲ配列）のいずれかを含んでいる複製不全アデノ ウイルス性・ベクターの構成によって達成される。これらのアデノウイルス性ベ クターは血管を通じてのベクター投与後に効率的なイン・ビボ形質導入を達成す ることが知られているアデノウイルス性ベクターの能力に基づいて非常に効率的 に細胞に対して遺伝子生成物を共伝達することができる。 これらのアデノウイルス性ベクターによって形質導入された肝臓細胞などの細 胞は、その後、一過性のレトロウイルス性ベクター『プロデューサ』細胞にされ る。これらの細胞はレトロウイルス性ベクターの機能を一過性的に表現する。従 って、これらの細胞は治療用遺伝子を含んだレトロウイルス性粒子とつくりだす ことができる。レトロウイルス性粒子の『局所的』で本来の場所での産出のおか げで、このつくりだ されたレトロウイルス性粒子によって、隣接細胞の効率的な形質導入が達成され る。従ってこうした方法は『遠位』血管投与に伴って起きるレトロウイルス性ベ クターの損失を克服することができる。加えて、形質導入された『隣接』細胞は レトロウイルス性ベクターが形質導入を行うという事実のせいで、安定して修正 される。この方法は、従って結合による形質導入イベントを可能にすることによ ってアデノウイルス性ベクターの重要な限界性を克服するものでもある。 この二機能性ウイルス・ベクター系の１つのユニークな特性は、有効な、本来 の場所でのレトロウイルス性形質導入を達成するためのアデノウイルス性ベクタ ー伝達要素をつくりだす点である。こうした考え方は『局所的に』つくりだされ たレトロウイルス性ベクターに対して細胞をさらに敏感にしてしまう可能性のあ る他の遺伝子の伝達にも拡張して適用することができる。 本発明は少なくとも１つの、レトロウイルス性配列を含んだ二アデノウイルス 性ベクターで構成される二機能性アデノウイルス性／レトロウイルス性ベクター に関するものである。好ましくは、この二機能性アデノウイルス性／レトロウイ ルス性ベクターは、（ａ）レトロウイルス性ベクター機能を含む複製不全アデノ ウイルス性ベクターと、そして（ｂ）少なくとも１つのレトロウイルス性組み込 み機能を含む複製不全アデノウイルス性ベクターとを含んでいる。好ましくは、 このレトロウイルス性ベクター機能は異種遺伝子を含んでお り、そうした遺伝子がレトロウイルスの長い末端反復によって側鎖されている。 一般的に、このレトロウイルス性組み込み機能はｇａｇ，ｐｏｌ，及びｅｎｖ、 あるいはそれらの組み合わせで構成されるグループから選択される。当業者であ れば、ひとつの細胞により具体的に狙いをつけるために別のｅｎｖ遺伝子を用い ることができることは容易に分かるであろう。例えば、以下に詳細に述べるよう な小水泡性口内炎ウイルスＧ−糖蛋白は利用が可能なｅｎｖ遺伝子である。好ま しくは、異種遺伝子は治療用蛋白質をコード表現する遺伝子、選択可能なマーカ ー、そしてレポータ遺伝子で構成されるグループから選択される。当業者であれ ば、そうした蛋白質を置換したり、あるいは特定の生化学活性を増強したり抑制 するために、例えば治療用蛋白質などの蛋白質をコード表現するいろいろな遺伝 子を用いることができよう。 本発明は又、そうした治療を必要とする個人に対して本発明による二機能性ア デノウイルス性／レトロウイルス性ベクターを投与するステップを含む標的細胞 を安定して形質導入する方法にも関連している。好ましくは、この二機能性アデ ノウイルス性／レトロウイルス性ベクターは、（ａ）レトロウイルス性ベクター 機能を含む複製不全アデノウイルス性ベターと、そして（ｂ）少なくとも１つの レトロウイルス性組み込み機能を含む複製不全アデノウイルス性ベクターとを含 んでいる。好ましくは、レトロウイルス性ベクター機能は異種遺伝子を含んでお り、そうした遺伝子はレトロウイルス 性の長い末端反復によって側鎖されている。一般的に、レトロウイルス性組み込 み機能はｇａｐ、ｐｏｌ、及びｅｎｖ、あるいはそれらの組み合わせで構成され るグループから選択される。当業者であれば、ひとつの細胞により具体的に狙い をつけるために別のｅｎｖ遺伝子を用いることができることは容易に分かるであ ろう。例えば、以下に詳細に述べるような小水泡性口内炎ウイルスＧ−糖蛋白は 利用が可能なｅｎｖ遺伝子である。好ましくは、異種遺伝子は治療用蛋白質をコ ード表現する遺伝子、選択可能なマーカー、そしてレポータ遺伝子で構成される グループから選択される。当業者であれば、そうした蛋白質を置換したり、ある いは特定の生化学活性を増強したり抑制するために、例えば治療用蛋白質などの 蛋白質をコード表現するいろいろな遺伝子を用いることができよう。以下に述べ るような方法を用いて、レトロウイルス性ベクター機能を含む複製不全アデノウ イルス性ベクターを投与することができ、そうしたレトロウイルス性組み込み機 能を含む複製不全アデノウイルス性ベクターは宿主細胞内に形質導入されて、そ の内部でそうしたアデノウイルス・シャトル・ベクターによってコード表現され た遺伝子の表現は上に述べた治療用遺伝子を含むレトロウイルス性粒子の産出を たらし、さらにそのレトロウイルス性粒子は隣接細胞に感染し、その内部でレト ロウイルス性粒子は上記宿主細胞のゲノム性ＤＮＡ内にその治療遺伝子を結合さ せる。 当業者であれば種々の操作によって本発明による二機能性 アデノウイルス性／レトロウイルス性ベクターを標的により特殊的に向かわせる ことができることは分かるであろう。例えば、細胞表面受容体を個別的に認識す るリガンドを組み込むことによって、アデノウイルス性ベクターの繊維あるいは ノブ成分を遺伝子的に修正することができる。又、この技術分野で知られている Ｆａｂフラグメントの単鎖抗体を用いて免疫的にアデノウイルスを標的に向かわ せることも可能であろう。 以下の実施例は本発明の種々の実施の形態を示すために提供されるものであっ て、いかなる意味でも本発明を限定することは意図していない。 実施例１ 標的細胞の安定した形質導入のための、レトロウイルス性結合機能を含んだアデ ノウイルス性ベクターの利用 効率的なイン・ビボ遺伝子伝達の結果としての長期にわたる異種遺伝子表現を 達成するために、レトロウイルスの結合特性をアデノウイルス性ベクター系に結 合することができる。これは、複製不全アデノウイルス性ベクターを用いて細胞 にその場所でレトロウイルスの組み込み機能とレトロウイルス性ベクター配列の 両方を伝達することによって行うことができる。そうすると、共形質導入された 細胞はレトロウイルス性プロデューサ細胞として機能する。こうした方式におい ては、局所的につくりだされるレトロウイルス性粒子がそれを取り囲んでいる柔 組織内の『隣接細胞』を安定して形質 導入し、従って、遺伝子治療のために関連標的器官の超遺伝子配列の効率的な統 合を達成する。アデノウイルス性ベクターが標的遺伝子の効率的な形質導入のた めの適切なレトロウイルス性機能を伝達してレトロウイルス性プロデューサ細胞 として機能する能力が示されている。 実施例２ プラスミド・ベクター及び細胞 アデノウイルス／レトロウイルス・キメラをつくりだすために、レトロウイル スのゲノム成分の個々の要素を最初にｐＣＡＡｍｐｇ及びｐΔＥ１ＬＮＣＸと命 名されている２つの別のアデノウイルス性シャトル・ベクターに組み込んだ。シ ャトル・ベクターはレポータ遺伝子も含むようにつくられ、ｐΔＥ１ＬＮＣＭＶ ＧＦＰとなったが、これは緑色蛍光蛋白質（ＧＦＰ）ｃＤＮＡとエスケリチア・ コリβ−ガラクトシダーゼ（ＬａｃＺ）をコード表現するｐΔＥ１ＬＮＣＭＶＬ ａｃＺをコード表現する。 ｐＣＡＡｍｇｐの場合，レトロウイルス性ｇａｇ／ｐｏｌと両性ｅｎｖ遺伝子 をコード表現するＤＮＡフラグメントをｐＰＡＭ３（Ｄｕｓｔｙ Ａ．Ｍｉｌｌ ｅｒ博士、Ｆｒｅｄ Ｈｕｔｃｈｉｎｓｏｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｅｎｔｅｒ，Ｓｅａｔｔｌｅ，ＷＡ提供）から、以下のような二段階手順で 単離した。つまり、ｇａｇ／ｐｏｌ転写開始箇所を含む１３３ｂｐ ＰＣＲフラ グメントを、ＨｉｎｄＩＩＩサイトを含む上流プライマ、５’−ｇｇｇａａｇｃ ｔ ｔａｔｇｇｇｃｃａｇａｃｔｇｔｔａｃｃａｃ（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．１）と、 内部ＰｓｔＩサイトにまたがる下流プライマー，５’−ｃａａｇｇｃｔｔｃｃｃ ａｇｇｔｃａｃｇａｔｇａｔｇｇ（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．２）を用いてｐＲＡＭ ３から増幅した。このフラグメントをＨｉｎｄＩＩＩとＰｓｔＩとを用いて消化 してからクローニングを行った。残りの７．０Ｋｂのｇａｇ／ｐｏｌ／ｅｎｖセ グメントはＰｓｔＩ−ＨｐａＩ消化によってｐＰＡＭ３から得た。これら２つの レトロウイルス性フラグメントをＨｉｎｄＩＩＩ−ＥｃｏＲＢサイトでアデノウ イルス性シャトル・ベクターｐＣＡ１３（Ｍｉｃｒｏｂｉｘ Ｂｉｏｓｙｓｔｅ ｍｓ Ｉｎｃ．，Ｏｎｔａｒｉｏ，Ｃａｎａｄａ）に三重結紮させた。 レトロウイルス性統合配列、ネオマイシン抵抗性ｃＤＮＡ、ＣＭＶプロモータ 、及び多重クローニング・サイトを含んだアデノウイルス性シャトル・ベクター を構成するために、レトロウイルス性ベクターｐＬＣＮＸ（Ａ．Ｄｕｓｔｙ Ｍ ｉｌｌｅｒ博士提供）をＥｃｏＲＩとＨｉｎｄＩＩＩサイトで部分的に消化して 、３．６Ｋｂフラグメントを得た。このフラグメントをその後、ｐＺｅｒｏ−Ｉ^TM （Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｌａ Ｊｏｌｌａ，ＣＡ，ＵＳＡ）の修正版にサブ クローンしたところ、ＥｃｏＲＶサイトとＮｏｔＩサイトの間に沈黙突然変異に よってＣｌａＩサイトが導入された。得られた構成物はｐＥ３．６と標識された 。残りのレトロウイルス性ベクター配列はＡｐａｌ及びＨｉｎｄＩＩＩ消化で 得、得られたフラグメントをＨｉｎｄＩＩＩ及びＥｃｏＲＶサイトでサブクロー ンしてｐＨＡ０．９を得た。ｐＥＨ３．６からのこの３．６ＫｂのＣｌａＩ−Ｈ ｉｎｄＩＩＩフラグメントとｐＨＡ０．９からの１．０ＫｂのＨｉｎｄＩＩＩ− ＸｈｏｌフラグメントをＣｌａＩ及びＸｈｏｌサイトでｐΔＥｌＳＰｌＡ（Ｍｉ ｃｒｏｂｉｘ，Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ Ｉｃ．）に三重結紮してｐΔＥ１ＬＮＣ Ｘをつくった。０．９ＫｂのＧＦＰ ｃＤＮＡセグメントをＨｉｎｄＩＩＩ−Ｈ ｐａＩ消化でｐＥＧＦＰ−ＮＩ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ Ｉｎｃ．，Ｐａｌｏ Ａｌ ｔｏ，ＣＡ，ＵＳＡ）から切り出して、ＨｉｎｄＩＩＩ及びＨｐａＩサイトでｐ ΔＥ１ＬＮＣＸにサブクローンした。ｐΔＥ１ＬＮＣＸからｐΔＥ１ＬＮＣＭＶ ＬａｃＺを構成するだめに同様の方式を用いた。制限酵素分析によってシャトル ・ベクター、ｐＣＡＡｍｐｇ，ｐΔＥ１ＬＮＣＸ、ｐΔＥ１ＬＮＣＭＶＧＦＰ、 ｐΔＥ１ＬＮＣＭＶＬａｃＺが確認され、ＵＳＢ７０７７０配列キット（Ａｍｅ ｒｓｈａｍ，Ｃｌｅｖｅｌａｎｄ，Ｏｈｉｏ，ＵＳＡ）を用いて部分的に配列決 定を行った。 ＮＩＨ−３Ｔ３線維芽腫、２９３細胞、ＥＪ膀胱癌細胞（ＡＴＣＣ，Ｒｏｃｋ ｖｉｌｌｅ，Ｍａｒｙｌａｎｄ）、Ｗ１６２（Ｇａｒｙ Ｋｅｔｎｅｒ，Ｐｒｉ ｎｃｅｔｏｎ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ）及びＳＫＯＶ_ipl細胞（Ｊａｎｃｔ Ｐ ｒｉｃｅ博士、Ｍ．Ｄ．Ａｎｄｅｒｓｏｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｃｅｎｔｅｒ，Ｈｏ ｕｓｔｏｎ，ＴＸ）を、１０％仔ウシ 血清（ＦＢＳ、Ｈｙｃｌｏｎｅ；Ｌｏｇａｎ，ＵＴ）、２ｍＭグルタミン（Ｍｅ ｄｉａｔｅｃｈ）、及びペニシリン／ストレプトマイシン（Ｃｅｌｌｇｒｏ Ｍ ｅｄｉａｔｅｃｈ）で補強したダルベッコの修正イーグルＭｅｄｉｕｍ／Ｈａｍ ’ｓ Ｆ１２（ＤＭＥＭ／Ｆ１２、Ｍｅｄｉａｔｅｃｈ，Ｉｎｃ．；Ｗａｓｈｉ ｎｇｔｏｎ，Ｄ．Ｃ）で構成された完全培養液内に保持した。すべての細胞は５ ％ＣＯ₂下で３７℃の温度で保持された。 実施例３ 遺伝子組換えアデノウイルス性ベクターの生成 イン・ビトロ同種遺伝子組換え法によてＥ１Ａ／Ｂ及びＥ３消去複製不全遺伝 子組換えアデノウイルス性ベクターと作成した。これらの研究で、ｐＣＡＡｍｐ ｇ、ｐΔＥ１ＬＮＣＭＶＬａｃＺ、あるいはｐΔＥ１ＬＮＣＭＶＧＦＰシャトル ・プラスミドをｐＢＧＨ１１（Ｍｉｃｒｏｂｉｘ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ Ｉｎ ｃ．）と共に２９３細胞内に共感染させてそれぞれＡｄＣＭＶＡｍｐｇ、ＡｄＬ ＮＣＭＶＬａｃＺ、あるいはＡｄＬＮＣＭＶＧＦＰをつくりだした。各アデノウ イルスをプラーク精製を三回通過させて、その後、ＰＣＲ分析及び制限酵素マッ ピングで確認した。遺伝子組換えアデノウイルスを許容２９３細胞株上で増殖さ せて、ＣｓＣｌ勾配遠心分離で二度精製して、標準的な方法でプラーク滴定した 。 実施例４ 細胞を１０％ＦＢＳを含む完全培養液内で１００−ｍｍ組織培養プレートに置 いて、５％ＣＯ₂下で３７℃の温度で一昼夜培養した。プラスミド構成物を最初 にテストするために、２９３細胞をｐΔＥ１ＬＮＣＭＣＬａｃＺ＋ｐＣＡＡｍｇ ｐか、あるいはｐＬＣＮＸ及びｐＰＡＭ３のいずれかを用いて燐酸カルシウム沈 殿によってトランスフェクトさせた。翌日、細胞に新鮮な完全培養液を与えた。 トランスフェクションから４８時間後に、上澄液を取り出して、ＮＩＨ−３Ｔ３ 細胞上でレトロウイルスの力価を判定するために用いた。アデノウイルス感染を 行うために、培養液を抜き取って、ＤＭＥＭ／Ｆ１２＋ＡｄＣＭＶＡｍｇｐとＭ ＡｄＬＮＣＭＶＧＦＰ、あるいはＡｄＬＮＣＭＶＧＦＰだけを含んだ２％ＦＢＳ で、各グループあたり５０プラーク形成単位（ｐｆｕ）／細胞の割合で置換した 。３時間培養した後、培養液を抜き取って、細胞をＰＢＳで数回洗浄してから、 完全培養液を与えた。感染４８時間後に上澄液を滴下することによって直接的に 、あるいはレトロウイルス感染に関して隣接細胞を観察することで間接的に判定 した。安定した統合を行わせるための長期培養は８日間の間隔をおいて行われた 。レトロウイルスの滴定はＮＩＨ−３Ｔ３細胞上で行われた。この分析のために 、レトロウイルスプロデューサ細胞からの培養上澄液を取り出して、ろ過し（０ ．４５μｍ）、受容細胞に１：１の割合で完全培養液＋１０ｍｇ／ｍｌポリブレ ンに加えた。４８時間後、ＬａｃＺを表現している細胞をＸ−ｇａｌ組織化学 で視覚化し、総青色細胞／皿の定量で力価を判定した。 実施例５ ＬａｃＺ、ＧＦＰ、及び複製可能レトロウイルス（ＲＣＲ）アッセイ ＬａｃＺの細胞表現についてＸ−ｇａｌ（５−ブロモ−４−コロル−３−イン ドリリル−β−Ｄ−ガラクトシド）で染色して定量分析を行った。細胞を０．２ ５％グルタルアルデヒド／０．１Ｍリン酸ナトリウムで１５分間室温で固定して から、ＰＢＳで洗浄して、Ｘ−ｇａｌ染色溶液（０。２％Ｘ−ｇａｌ／２ｍＭ ＭｇＣｌ₂／４ｍＭ Ｋ₄Ｆｅ（ＣＮ）₆／４ｍＭ Ｋ₄Ｆｅ（ＣＮ）₆３Ｈ₂ＯをＰ ＢＳに溶解したもの）で室温で一昼夜培養した。Ｘ−ｇａｌ陽性（青色）の細胞 を光学顕微鏡で数えた。細胞のＧＦＰ表現ＦＡＣＳ分析及びメーカー（Ｃｌｏｎ ｔｅｃｈ，ＣＡ，ＵＳＡ）の指示する手順で蛍光顕微鏡を用いて視覚化すること で定量的に分析した。 フェリンＳ⁺Ｌ^-（ＰＧ−４）細胞をＭｃＣｏｙの５Ａ培養液（ＢｉｏＷｈａｔ ｋｋｅｒ，Ｗａｌｋｅｒｓｖｉｌｌｅ，ＭＤ）＋１５％ＦＢＳ内に蒔種し、６０ ｍｍ培養皿で約２４時間培養してから接種した。５つの複製皿にサンプル希釈液 を０．２ｍｌづつ入れ、ポジティブ・コントロールとして両性ネズミ・レトロウ ィルス４０７０Ａを１及び１０核形成単位として用い、そして培養液はネガティ ブ・コントロールとして機能した。３６＋２°Ｃで２時間吸収させ、新鮮 な培養液を加えた後、必要に応じて４−５日培養すると、形質変換された細胞の 核がポジティブ・コントロールの皿には十分に形成された。これらの皿を顕微鏡 で調べて、核を数えた。ネガティブ・コントロールに核が観察されず、ポジティ ブ・コントロール希釈液がポジティブ・コントロール・ウイルス・ロットの有効 平均力価の１ログ以内で平均力価を持つている場合に、アッセイは有効と考えら れた。 実施例６ イン・ビボ実験及びプロウイルス統合 雌のヌード・マウス（生後４−６週間）に１ｘ１０⁷ＳＫＯＶ３_ipl細胞の割合 で腹膜接種した。５日後、供試動物にＡｃＣＭＶＡｍｐｇ＋ＡｄＬＣＮＭＶＧＦ Ｐか、あるいはＡｄＬＣＮＭＶＧＦＰだけを腹膜内接種した（各ウイルスあたり メズミ一匹につき１ｘ１０⁹）。動物はアデノウイルス接種から１６日目に致死 させた。腫瘍結節を取り出して、４％パラホルムアルデヒド／ＰＢＳ内で固定し て、分解し、蛍光顕微鏡で分析した。皮下での混合を調べるために、ＳＫＯＶ_{ip l} 細胞を細胞１個あたり５０ｐｆｕの割合でイクス・ビボで感染させた。感染か ら１６時間後に、細胞をＰＢＳで二度洗浄してから、トリプシン化し、取り出し て、数え、そして感染していないＳＫＯＶ_ipl細胞と１：４の割合で混合した。 全部で５ｘ１０⁶の混合細胞がヌード・マウスのわき腹に皮下接種された。動物 は接種後２０日目に致死された。腫瘍結節を取り出して蛍光顕微鏡で分析した。 プロウイルス統合を検出するために、アデノウイルスで処理した細胞から高分 子量画分ＤＮＡを取り出した。このＤＮＡをＭｕｎＩで消化して、０．８％アガ ロース・ゲルに溶解し、４．８ｋｂから６．２ｋｂのＡｄＬＮＣＭＶＧＦＰのＰ ＣＲ増幅によって得たレトロウィルス性ベクター配列を含む³²Ｐでラベルした１ ．４ｋｂフラグメントでプローブした。メーカー（Ａｍｅｒｓｈａｍ）の決めた 手順に従って、ＤＮＡラベリング、薄膜透過、交雑、そして洗浄手順を行った。 実施例７ 隣接細胞を安定して形質導入するための柔組織でのレトロウィルス粒子の作成 本発明は遺伝子組換えアデノウイルス性ベクターの高効率イン・ビボ遺伝子伝 達とレトロウィルスから誘導される結合能力とを合わせ持った『複合』ベクター 系を開発した。これはアデノウイルス性ベクターに感染された標的細胞をアデノ ウイルス性ベクターに媒介されたレトロウィルスの組み込み機能とレトロウィル ス・ベクター配列の伝達を介して一過性の『レトロウィルス・プロデューサ細胞 』内に送り込むことによって達成される。こうした方法で、局所的につくりださ れたレトロウィルス性ベクターは結合性ベクターを介して隣接柔組織細胞に感染 することができる。こうした方式の概念的基礎を図１に示す。 こうした方式を実施するための最初のステップとして、レトロウィルス性ベク ター配列とレトロウィルス性組み込み機 能をコード表現するアデノウイルス性ベクターを誘導した。これらのアデノウイ ルス性ベクターの誘導は、その超遺伝子を含んだアデノウイルス『シャトル』ベ クターをアデノウイルス性組み込みプラスミドｐＪＭ１７と共感染させる方法に 基づいている。これらのプラスミド内部の同種領域の遺伝子組換えによって複製 不全、ＦＩＡ／Ｂ消去、アデノウイルス性ベクターがもたらされる。アデノウイ ルス・シャトル・プラスミドはアデノウイルス性ベクターの組み込み特性を有し ている無傷の表現カセットを含んでいるので、それらはアプリオリな超遺伝子配 列の機能的有用性検証を行うための手段を提供してくれる。こうした考え方に基 づいて、適切なレトロウィルス性超遺伝子配列を含んだ一連のアデノウイルス性 シャトル・ベクターが誘導された。このようにして、アデノウイルス性シャトル ・ベクターｐＣＡ１３（図２）のポリリンカーにクローンされたレトロウィルス 性機能ｇａｇ／ｐｏｌ／ｅｎｖ．ｇａｇ／ｐｏｌ、あるいはｅｎｖを有する一連 のプラスミドが誘導された。 これらのベクターは従ってＣＭＶ中間／初期エンハンサー−プロモータを介し てレトロウィルス性組み込み機能の表現を可能にしてくれるであろう。加えて、 レトロウィルス性ベクター配列をコード表現するアデノウイルス性シャトル・プ ラスミドが誘導された。この例では、その表現されたアデノウイルス性ベクター はコード表現された超遺伝子配列の高効率伝達媒体としての機能を果たすであろ う。これらのレトロ ウィルス性ベクター配列はその場合レトロウィルス性粒子内に組み込まれ、その プロセスには標的細胞内でのベクター表現は必要とされないであろう。従って、 これらの例においては、ネオマイシン選択可能マーカーと組み合わされたＥ．Ｃ ｏｌｉ β−ガラクトシダーゼ（ＬａｃＺ）か、あるいはこれもネオマイシン選 択可能なマーカーと組み合わされたレポータ遺伝子緑色蛍光蛋白質（ＧＦＰ）の いずれかをコード表現するレトロウィルス性ベクター配列が『プロモータを持た ない』アデノウイルス性シャトル・ベクター（図２）のポリリンカーにクローン された。 これらのレトロウィルス性ベクター遺伝子構成物は完全なレトロウィルス性超 末端側面（ＬＴＲ）で側鎖されたマーカー／レポータ配列を含んでいる。これが 達成されたのは、これらの機能がレトロウィルス性ベクターの統合にｉｎ ｃｉ ｓで必要となる最低限の配列だからである。これらのプラスミドはすべて構成後 に制限エンドヌクレアーゼ消化による間接的分析と、ジデオキシ鎖末端配列決定 による直接的分析の両方で確認された。 アデノウイルス性シャトル・プラスミドでのレトロウィルス性組み込み機能が 発揮されることを確認するために、機能分析が行われた。この調査のために、レ トロウィルス性組み込み機能を含むアデノウイルス性シャトル・プラスミド（ｐ ＣＡＡｍｐｇ）の利用可能性を、マロニー白血病ウイルス（ＭＬＶ）ＬＴＲの制 御下でエコトロピックはレトロウィルス 遺伝子ｇａｇ／ｐｏｌ／ｅｎｖを含む標準組み込みプラスミド、ｐＰＡＭ３と比 較した。これらのプラスミドをそれによってＬａｃＺレポータ遺伝子がレトロウ ィルス性ＬＴＲによって側鎖されるレトロウィルス性ベクター・カセットを含む コントロールのレトロウィルス性ベクター・プラスミドｐＬＮＣＬＺからレトロ ウィルス性ベクター配列を取り出す能力があるかどうかについての分析を行った 。これらのプラスミドの２９３細胞への共感染後、上澄液を取り出して標準的な 方法でネズミ線維芽腫細胞株を感染するために用いた。これらの細胞は、その後 、Ｘ−ｇａｌ免疫化学的方法でＬａｃＺ生成物に対する染色を行ってから、感染 後４８時間で視覚化された。 レトロウィルス性組み込み機能を含んでいるアデノウイルス性シャトル・プラ スミドの機能性検証を行ったところ、２９３細胞がＣａｐＯ₄によってそのプラ スミドで形質導入されたことが示され、上澄液を用いて標的ＮＩＨ−３Ｔ３細胞 を感染し、ＬａｃＺ遺伝子の生成物を調べるために４８時間後にＸ−ｇａｌ染色 を行った。トランスフェクションはａ）ｐＰＡＭ３及びｐＬＮＣＬＺ，ｂ）ｐＰ ＡＭ３、ｃ）ｐＬＮＣＬＺ、及びｄ）ｐＣＡＡｍｐｇ及びｐＬＮＣＬＺで行われ た。ｐＲＡＭ３及びｐＬＮＣＬＺによるトランスフェクションの結果はポジティ ブであった。ｐＰＡＭ３及びｐＬＮＣＬＡによるトランスフェクションの結果は ネガティブであった。ｐＣＡＡｍｐｇ及びｐＬＮＣＬＺによるトランスフェク ションの結果はネガティブであった。 コントロールのｐＰＡＭ３及びｐＬＮＣＲＺの共トランスフェクションはＬａ ｃＺポジティブＮＩＨ−３Ｔ３細胞の存在で示されるように、レトロウィルス性 形質導入性粒子をつくりだした。対照的に、これらのプラスミドのどちらか一方 だけでトランスフェクションを行った場合には形質導入性レトロウィルス性粒子 はつくりだされなかった。次に、レトロウィルス性組み込み機能をコード表現す るアデノウイルス性シャトル・ベクターとレトロウィルス性ベクター・プラスミ ドｐＬＮＣＬＺによる共トランスフェクションを行った。コントロール・プラス ミド（ｐＰＡＭ３及びｐＬＮＣＬＺ）の両方を用いた共トランスフェクションに 関しては、この分析でＬａｃＺレトロウィルス性粒子が誘導された。従って、レ トロウィルス性組み込み機能をアデノウイルス性シャトル・ベクターの存在下で のレトロウィルス性粒子誘導のためにつくりだすことができる。 レトロウィルス性ベクター配列をアデノウイルス性シャトル・ベクターから取 り出すことができるかどうかについての研究が行われた。この分析のために、レ トロウィルス性粒子が誘導され、形質導入性粒子を上に述べた方法で分析した。 この分析のために用いられた組み込みプラスミドはｐＲＡＭ３である。これは、 レトロウィルス性ＬＴＲで側鎖されたＬａｃＺ遺伝子を含む通常のレトロウィル ス性ベクター・プラスミドか、あるいは同じＬＴＲ−ｎｅｏ−ＣＭＶ−ＬａｃＺ −ＬＴＲセグメント（ｐΔＥ１ＬＮＣＭＶＶＬａｃＺ）を含むアデノウイルス性 シャトル・プラスミドのいずれかからレトロウィルス性粒子を取り出すために用 いられた。上にも述べたように、ｐＰＡＭ３とｐＬＮＣＬＡによる２９３の共ト ランスフェクションはＮＩＨ−３Ｔ３インジケータ細胞のＸ−ｇａｌ細胞によっ て示されるように、ＬａｃＺ形質導入性レトロウィルス性粒子を発生させた。さ らに、いずれのプラスミドも単独ではこの能力を示さなかった。重要なことは、 レトロウィルス性ベクター配列を含んだアデノウイルス性シャトル・プラスミド 、ｐΔＥ１ＬＮＣＭＶＬａｃＺとコントロールのレトロウィルス性組み込みプラ スミド，ｐＰＡＭ３による共トランスフェクションがＬａｃＺ形質導入性レトロ ウィルス性粒子を発生させることが実証できたことである。 レトロウィルス性ベクター機能を含んだアデノウイルス性シャトル・プラスミ ドの機能検証が行われた。この分析の目的のために、２９３細胞をＣａＰＯ₄に よって示されたプラスミドでトランスフェクトし、上澄液を用いて標的のＮＩＨ −３Ｔ３細胞を感染して、48時間後にＬａｃＺ遺伝子の存在を確認するためにＸ −ｇａｌ染色を行った。トランスフェクションはａ）ｐＰＡＭ３及びｐＬＮＣＬ Ｚ，ｂ）ｐＰＡＭ３、ｃ）ｐＬＮＣＬＺ、及びｄ）ｐＰＡＭ３及びｐΔＥ１ＬＮ ＣＭＶＬａｃＺのいずれかで行った。ｐＰＡＭ３とｐＬＮＮＣＬＺによるトラン スフェクションの結果はポジティブであり、ｐＰＡＭ３によるトランスフェクシ ョンの結果はネガ ティブであり、ｐＬＮＣＬＡによるトランスフェクションの結果はネガティブで あり、そしてｐＰＡＭ３及びｐΔＥ１ＬＮＣＭＶＬａｃＺによるトランスフェク ションの結果はポジティブであった。従って、形質導入性粒子の誘導のためにレ トロウィルス性ベクターをレトロウィルス性シャトル・プラスミドから誘導する ことができる。 これらの研究はそれぞれ個別的に、レトロウィルス性組み込み及びベクター機 能がアデノウイルス性シャトル・プラスミドの存在下で発揮されてイン・ビボの レトロウィルス性粒子の発生を可能にしてくれる。これらの機能が、両方ともア デノウイルス性シャトル・プラスミドの存在下で存在している場合に、これらの 機能がレトロウィルス粒子を生み出す機能も発揮することは実証できたことは重 要である。この分析のために、アデノウイルス性シャトル・ベクター・プラスミ ド、ｐΔＥ１ＬＮＣＭＶＬａｃＺの存在下でレトロウィルス性ベクター機能を取 り出すレトロウィルス性組み込み機能の能力を評価した。ｐＰＡＭ３及びｐＬＮ ＣＬＺによるコントロール（比較）実験はこのアッセイで粒子を誘導する能力を 実証した。さらに、ｐＣＡＡｍｐｇとｐΔＥ１ＬＮＣＭＶＬａｃＺによる比較の ためのトランスフェクションも独立で粒子を生み出すことはできなかった。しか しながら、これら２つのプラスミドの共トランスフェクションはポジティブ・コ ントロール研究で示されたように、ＬａｃＺ形質導入性レトロウィルス性粒子を つくりだした。 レトロウィルス性ベクター機能を含んだアデノウイルス性シャトル・プラスミ ドの機能的検証を行った。トランスフェクション及び上澄液アッセイは上に述べ た通りである。トランスフェクションは、ａ）ｐＰＡＭ３とｐＬＮＣＬＡ、ｂ） ｐＣＡＡｍｐｇ、ｃ）ｐΔＥ１ＰＬＣＭＶＬａｃＺ、及びｄ）ｐＣＡＡｍｐｇ及 びｐΔＥ１ＬＮＣＭＶＬａｃＺによって行われた。ｐＰＡＭ３とｐＬＮＣＬＡに よるトランスフェクションの結果はポジティブであり、ｐΔＥ１ＰＬＣＭＶＬａ ｃＺによるトランスフェクションの結果はネガティブであり、そしてｐＣＡＡｍ ｐｇとｐΔＥ１ＰＬＣＭＶＬａｃＺによるトランスフェクションの結果はネガテ ィブであった。従って、この実験は必要最小限のレトロウィルス性機能を含んだ アデノウイルス性シャトル・プラスミドからアデノウイルス性粒子が発生される ことを確認した。この知見は従って、これをベースとして構成されるアデノウイ ルス性ベクターを誘導できる根拠を実証している。 こうした結果に基づいて、組み込み機能あるいはレトロウィルス性ベクター機 能をコード表現するアデノウイルス性ベクターが構成された。これらのベクター は、上に述べたようなアデノウイルス性組み込みプラスミドｐＪＭ１７で示され たシャトル・プラスミドを共トランスフェクションすることを介して通常の方法 で発生された。取り出されたプラークを拡大して、ポリメラーゼ鎖反応（ＰＣＲ ）でその同一性を確認した後、３つのシリアル・パッセージでプラーク精製を行 った。拡大後、ベクターの同一性をアデノウイルス性ゲノムのＥ１Ａ領域の異種 ＤＮＡセグメントの制限酵素による消化及びＰＣＲ分析で確認した。この確認の 一例を図４に示す。これらのベクターはすべてＥ１Ａ／Ｂ消去、複製不能アデノ ウイルス性ベクターであった。これらのベクターがレトロウィルス性組み込み及 びベクター機能に関して利用できるかどうかを調べるために対応するシャトル・ プラスミドに対して行ったのと同様にイン・ビトロで特徴付けを行った。アデノ ウイルス性ベクターの存在下でのこれらレトロウィルス性ベクターの機能的利用 性の実証はイン・ビボ研究の実行を可能にしてくれる。 こうした考え方に基づき、本発明は増殖を誘発させるために関連する標的柔組 織に成長因子を提供するためにアデノウイルス性ベクターが用いられる戦略を開 示する。こうした方法はレトロウィルス性ベクター及び／又は組み込み機能のア デノウイルス媒介遺伝子伝達を介してのレトロウィルス性ベクターのその場所で の発生と組み合わせて用いることができる。この方法では、アデノウイルスは適 切な成長因子遺伝子の標的柔組織に対しての高効率のイン・ビボ遺伝子伝達を達 成する。関連のあるサイトでの高効率伝達は成長因子の高い局所的濃縮を可能に してくれ、標的細胞の増殖をさらに誘発してくれる。 アデノウイルス／レトロウィルス二機能性ベクターを構成して、その機能につ いて検証した。レトロウィルス性ベクタ ー配列、ＡｄＬＮＣＭＶＬａｃＺを含む遺伝子組換えアデノウイルスを構成して 、機能的な検証を行った。アデノウイルス性ゲノムからレトロウィルス性ベクタ ー配列を取り出せたかどうかを判定するためにレトロウィルス性組み込み機能を 有する非２９３細胞の高度の、そして一過性のトランスフェクションを達成する ための方針が考えられた。この必要性のために、アデノウイルス−ポリリシン・ ベクタ（ＡｄｐＬ９を用いた。この研究のために、Ｈｅｌｌａ細胞をプラスミド ｐＰＡＭ３を含むＡｄｐＬ複合体でトランスフェクトしたところ、レトロウィル ス性組み込み機能の表現がもたらされ、その後、ＡｄＬＮＣＣＭＬａｃＺで感染 された。比較のための実験は、ＡｄｐＬを介してのｐＰＡＭ３とＰＬＮＣＬＺで のＨｅＬａの共トランスフェクションはレトロウィルス性粒子の産出をもたらし た。対照的に、プラスミドＰＬＣＣＬＺのＡｄｐＬ−トランスフェクションは何 の結果ももたらさなかった。ｐＰＡＭ３によるＡｄｐＬトランスフェクションの 後にＡｄＬＮＣＭＶＬａｃＺでの感染を行ったところ、ＬａｃＺ形質導入性レト ロウィルス性粒子を得ることができた。ＨｅＬａ細胞をＡｄｐＬ／ｐＰＡＭ３で 前処理しない場合は、そうしたレトロウィルス性粒子を得ることができなかった ことは注目に値する。従って、標的細胞へのプロデユーサ細胞からのＬａｃＺコ ード表現アデノウイルスの『キャリー・オーバー』（譲り渡し）はこの結果を説 明することにはならない。従って、レトロウィルス性ベクター配列をアデノウ イルス性ベクターから取り出して、形質導入性レトロウィルス性粒子をうまく誘 導することができる。 ＡｄＬＮＣＭＶＬａｃＺの機能的検証を行った。この分析を行うために、Ｈｅ Ｌａ細胞をＡｄｐＬ法でレトロウィルス性組み込み及び／又はベクター・プラス ミドでトランスフェクトした。いくつかの例で、細胞はＡｄＬＮＣＭＶＬａｃＺ で感染させた。その後、上澄液を取り出して、前に述べたのと同様に、ＬａｃＺ 形質導入性レトロウィルス性粒子の存在に関する分析を行った。形質導入／感染 条件は、ａ）ｐＰＡＭ３及びＰＬＮＣＬＺでの’ＡｄｐＬトランスフェクション 、ｂ）ＰＬＮＣＮＺでのＡｄｐＬトランスフェクション、ｃ）ｐＰＡＭ３でＡｄ ｐＬ感染に続いてのＡｄＬＮＣＭＶＬａｃＺによる感染、ｄ）ＡｄＬＮＣＭＶＬ ａｃＺだけでのＡｄ感染であった。ｐＰＡＭ３及びＰＬＣＬＺでのＡｄｐＬトラ ンスフェクションによる形質導入／感染の結果はポジティブであり、ＰＬＮＣＬ ＺでのＡｄｐＬトランスフェクションの結果はネガティブ、ＰＬＮＬＺによるＡ ｄｐＬトランスフェクションはネガティブ、ｐＰＭＡ３でＡｄｐＬ感染を行い続 いてＡｄＬＮＣＭＶＬａｃＺによる感染を行った結果はネガティブ、そしてＡｄ ＬＮＣＭＶＬａｃＺのみによるＡｄ感染の結果はネガティブであった。これらの 研究に用いられたすべてのベクターはＥ１ Ａ／Ｂ消去、複製不能アデノウイル ス性ベクターであった。 実施の形態８ アデノウイルス性ベクターで媒介された伝達で誘発されたレトロウィルス性プロ デューサ細胞内での遺伝子表現のパター ン この戦略の基礎は、アデノウイルス性ベクター粒子からのレトロウィルス性ベ クター排列の取り出しを可能にするための標的細胞内でのレトロウィルス性組み 込み機能の効率的な表現である。レトロウィルス性組み込み機能ｇａｇ／ｐｏｌ ／ｅｎｖの遺伝子表現のパターンを種々の『従来の』組み込みシステムで評価し て、これらの機能をコード表現するアデノウイルス性ベクターＡｄＣＭＶＡｍｐ ｇによって達成されたパターンとの比較を行った。この点で、組み込み細胞株Ｇ Ｐ１Ａｍ１２は安定して形質導入され、両性レトロウィルス性機能を表現し、レ トロウィルス性ベクター組み込みのための効率的な媒体として確認されている。 加えて、ＣａＰＯ₄微結晶粒子を介してのヒト胎仔腎臓細胞２９３のｋａｔ組み 込みプラスミドｐＫａｔ２ａｍｐａｃ及びＰＬＣＬＺによる一過性トランスフェ クションは共形質導入されたレトロウィルス性ベクター・プラスミドを効率的に 組み込むことが示されている。これら２つの細胞系をアデノウイルス性ベクター ＡＣＭＶＡｍｐｇで形質導入されたＨｅＬａ細胞と比較して、達成された組み込 み機能の強度とパターンの分析を行った。 これらの分析のために、組み込み細胞株ＧＰ＋Ａｍ１２、プラスミドｐＫａｔ ２ａｍｐａｃでＣａＰＯ₄を介して形質導入された２９３細胞、及びアデノウイ ルス性ベクターＡｄＣＭＶＡｍｐｇで感染されたＨｅＬａ細胞に対して誘導後の いろいろな時点でノーザン・ブロット分析を行った。比較可能な量の抽出総細胞 ＲＮＡをニトロセルロース薄膜上に移して、得られたプロットをレトロウィルス ｇａｇ、ｐｏｌ、あるいはｅｎｖ遺伝子に対応する³²Ｐでラベルしたオリゴヌク レオチドでプローブした。得られたブロットはアデノウイルス伝達を介して達成 されたレトロウィルス性組み込み遺伝子機能の強度及びパターンと従来の組み込 み技術で達成されたレベルとの比較を可能にしてくれる。このデータを用いるこ とによって、アデノウイルス性媒体を介しての標的細胞の一過性トランスフェク ションからのレトロウィルス性ベクター産出を最適化することが可能になる。 実施の形態９ アデノウイルス性ベクターの媒介による遺伝子伝達によって誘発される一過性プ ロデューサ細胞を介してのレトロウィルス性ベクターの産出 レトロウィルスの遺伝子ｇａｇ／ｐｏｌ／ｅｎｖをコード表現するアデノウイ ルス性ベクターから適切なレベルとパターンのレトロウィルス性組み込み機能を 引き出すことができることを確認した後、形質導入性レトロウィルス粒子の産出 を行った。プラスミドｐｌＮＣＬＺによる両性レトロウィルス・プロデューサ株 ＧＰ＋Ａｍ１２の形質導入によってつくられた安定したレトロウィルス性プロデ ューサ細胞株を含む『従来の』レトロウィルス性組み込み系との比較が行われた 。この株はＬａｃＺ／ネオマイシンをコード表現するレト ロウィルス粒子を安定してつくりだす。さらに、レトロウィルス性ベクターが両 性レトロウィルス性組み込みプラスミドｐＰＭＡ３をレトロウィルス性ベクター ・プラスミドＰＬＮＣＬＺと組み合わせて用いるＣａＰＯ₄手順での２９３細胞 の一過性共トランスフェクションを介してつくりだされた。比較のために、Ｈｅ Ｌａ細胞を正規の量のレトロウィルス性組み込み機能かレトロウィルス性ベクタ ー機能（ＡｄＬＮＣＭＶＬａｃＺ）をコード表現するアデノウイルス性ベクター （ＡｄＣＭＶｍｐｇ）を用いて共形質導入した。 導入４８時間後に、標的細胞から上澄液を取り出して、つくられたレトロウ ィルス性粒子の中身を分析した。つくられたレトロウィルス性粒子の力価と機能 を判定するために多数の分析が行われた。つくられた粒子の強度はノーザン・ブ ロットで直接判定してレトロウィルス性ベクター配列を調べるためにｃＤＮＡを 介してプローブで上澄液の分析を行った。各上澄液のシリアル希釈液を公知の量 のレトロウィルス性ベクター・プラスミドを含んだ標準と比較した。このアッセ イは従って各組み込み系で産出されたレトロウィルス性粒子に組み込まれたレト ロウイルス性ベクター配列のレベルに関する情報をつくりだす。さらに、つくり だされたレトロウィルス性ベクターの力価は２つの方法で直接判定された。第一 に、上澄液を標準的な方法でインジケータ細胞株ＮＩＨ−３Ｔ３に移した。４８ 時間後に、これらの細胞を染色して、ＦＤＧによるＬａｃＺ遺伝子の生成物につ いて調べ、形質導 入頻度にうちてＦＡＣＳで分析した。さらに、同様に感染されたＮＩＨ−３Ｔ３ 細胞をネオマイシン類似物Ｇ４１８の存在下で安定した選択にかけた。２１日後 、生き残っているコロニーを結晶性バイオレットで染色してスコアをとった。加 えて、それらコロニーの一部を拡大して宿主ゲノム内でのレトロウィルス性ベク ターＤＮＡセグメントの状態を分析した。限定分析でＤＮＡが統合しているか、 あるいはエピソームとして存在しているかについて調べた。 これらの研究は従って一過性レトロウィルス性プロデューサ細胞がレトロウィ ルス性組み込み及びベクター機能のアデノウイルス性ベクターの媒介による伝達 で誘導され得ることを裏づけている。さらに、プロウイルス性配列を含む超遺伝 子に基づいて標的細胞内に長期的な遺伝子表現を達成することができる形質導入 能力を有するレトロウィルス性粒子をつくりだすことができる。加えて、レトロ ウィルス性組み込み株のアデノウイルス性ベクターが媒介する誘導を介して多数 の機能性形質導入レトロウィルス性ベクターの比較を標準的な方法で行うことが できる。 実施の形態１０ 組み込み細胞からのレトロウィルス生産に影響を及ぼすパラメータは宿主細胞 の因子、及び達成可能なレトロウィルス性組み込み／ベクター機能などである。 この点で、アデノウイルス性ベクターが媒介する異種遺伝子表現のレベルは一般 的には入力粒子数の線形関数である。この関係はアデノウイ ルス性ベクターに関連する毒性が形質導入された細胞によってつくられる異種遺 伝子を減衰するまで続く。アデノウイルス／レトロウィルス二機能性システムの 介しての最適化されたレトロウィルス産出の決定因子が示される。ＨｅＬａ細胞 は等分子量のレトロウィルス性組み込み機能（ＡｄＣＭＶＡｍｐｇ）とレトロウ ィルス性ベクター機能（ＡｄＬＮＣＭＶＬａｃＺ）をコード表現するアデノウイ ルス性ベクターによって共形質導入された。前にも述べたのと同様に、上澄液を 取り出してレトロウィルス性粒子が産出されているかどうかを調べた。レトロウ ィルス性ベクター産出との関連を調べるために入力アデノウイルス性ベクターの 量は変えることができる。従って、ＨｅＬａ細胞は細胞１個あたり、１、１０、 １００、５００、及び１０００個の割合でアデノウイルス性ベクターによって感 染された。レトロウィルス性プロデューサ細胞（ＨｅＬａ）におけるアデノウイ ルス媒介細胞毒性は細胞増殖に関するＭＴＴアッセイを用いて直接判定された。 この分析に基づいて、毒性の制限及び／又は反応の線形性から示されるような入 力アデノウイルス性ベクターと出力レトロウィルス性ベクターとの関係が判定さ れた。 ウイルス粒子の出力に影響を及ぼす可能性のある別の要因はレトロウィルス性 組み込み機能とレトロウィルス性プロデューサ細胞内につくりだされるレトロウ ィルス性ベクター配列の比率である。これは最高のレトロウィルス性力価を有す るプロデューサ細胞を判定することで安定したレトロウィル ス性プロデューサ細胞の存在下で経験的に達成される。この系の両方の成分を独 立に調節することができるので、レトロウィルス性ベクター産出を可能にする組 み込み及びベクター機能の最適の比率を判定することができる。ＨｅＬａ細胞を レトロウィルス性組み込み機能（ＡｄＣＭＶＡｍｐｇ）をコード表現するアデノ ウイルス性ベクターとレトロウィルス性ベクター機能（ＡｄＬＮＣＭＶＬａｃＺ ）をコード表現するアデノウイルス性ベクターの両方を用いて共感染し、生成物 のレトロウィルス性粒子の分析を行った。二つの粒子の線形比率（１：１、１： ２、１：４など）で共感染を行って、形質導入性レトロウィルス性粒子の最終的 な分析を行った。これらの研究はアデノウイルス／レトロウィルス二機能性シス テムの存在下でのベクター産出に最も適合したレトロウィルス性機能の正確な比 率の判定を可能にした。 実施例１１ マウス細胞株内でのアデノウイルス／レトロウィルス二機能性システムを介して のレトロウィルス産出 長期間の遺伝子表現をもたらす細胞固有伝達を行うための方法が気道上皮（肺 ）、血管上皮（心臓）、及び肝臓（代謝血液、血友病）に関して調べられた。レ トロウィルス・プロデューサ細胞として機能するマウス肝臓細胞の能力について 判定した。この分析のために、安定したレトロウィルス・プロデューサ細胞、レ トロウィルス組み込み及びベクター・プラスミドで一過性的にトランスフェクト された２９３細胞、 及び組み込み及びベクター機能を有する等量のアデノウイルス・レトロウィルス ・ベクターによって感染されたＨｅＬａ細胞及びマウス肝癌細胞の両方との間の 直接的な比較が行われた。誘導されたレトロウィルス性粒子を分析した。この分 析は関連する柔組織器官標的からのマウス細胞が一過性のレトロウィルス・プロ デューサ細胞として機能できるレベルに関する直接の判定を示している。 マウス細胞は自己指向性及び両性レトロウィルス性ベクターによって感染させ ることができる。しかしながら、マウス細胞が自己指向性レトロウィルス性ベク ターと両性レトロウィルス性ベクターに対してそれぞれ違って機能するのかどう かについてはまだはっきり分かっていない。本発明による方法はマウス柔組織細 胞の存在下でのレトロウィルスの局所的産出を伴うので、アデノウイルス／レト ロウィルス二機能性戦略による自己指向性レトロウィルス性ベクターと両性レト ロウィルス性ベクターを産出するマウス肝臓癌細胞の能力が示された。これを達 成するために、レトロウィルス粒子内のエンベロープ糖蛋白質を変性するための 柔軟な方式が開発された。レトロウィルス組み込み機能ｇａｇ及びｐｏｌ（Ａｄ ＣＭＶＧＰ）をコード表現するアデノウイルス性ベクターを開発した。さらに、 自己指向性あるいは両性ｅｎｖ糖蛋白質のいずれかをコード表現する別のアデノ ウイルス性ベクターを開発した。従って、ＡｄＬＮＣＭＶＬａｃＺとｇａｇ／ｐ ｏｌ（ＡｄＣＭＢＧＰ）及び両性ｅｎｖ（ＡｄＣＭＶＥｎｖ^a ）をコード表現するアデノウイルス性ベクターによる標的細胞の共トランスフ ェクションによって両性レトロウィルス粒子を誘導したり、あるいはＡｄＬＮＣ ＭＶＬａｃＺとｇａｇ／ｐｏｌ（ＡｄＣＭＶＧＰ）及び自己指向性ｅｎｖ（Ａｎ ＣＭＶＥｎｖ^e）をコード表現するアデノウイルス性ベクターによる標的細胞の 共トランスフェクションによって本発明によるアデノウイルス／レトロウィルス 二機能性システムを介して自己指向性レトロウィルス粒子を誘導することは実行 可能である。 この分析のために、マウス肝臓癌細胞株をアデノウイルス性ベクターの適切な 組み合わせで感染させて、遺伝子組換え自己指向性あるいは両性レトロウィルス 性ベクターのいずれかの一過性プロデューサとして機能させた。誘導されたベク ターはＮＩＨ−３Ｔ３に対する力価で分析して、ＬａｃＺ遺伝子表現および新し い選択可能なクローンをスコアした。この分析はレトロウィルス・プロデューサ 細胞として機能するマウス細胞に関する細胞の制約因子を明らかにする。この分 析は自己指向性及び両性レトロウィルス性ベクターの生産に関連する具体的な問 題の直接的判定についても寄与するであろう。 実施例１２ マウス一次細胞でのアデノウイルス／レトロウィルス二機能性システムを介して のレトロウィルス性ベクター産出 肝臓細胞のマウス一次培養体をコラーゲナーゼ消化及び精 製という標準的な方法でつくりだした。これらの細胞のレトロウィルス産出に関 連するパラメータ、つまり、１）アデノウイルス／レトロウィルス二機能性シス テムによって誘発されるレトロウィルス組み込み機能のパターンと強度；２）ア デノウイルス／レトロウィルス二機能性システムによって誘発されるレトロウィ ルス性ベクターの産出の強度、３）アデノウイルス／レトロウィルス二機能性シ ステムによって誘発されるレトロウィルス性ベクターの産出に関するパラメータ の最適化、４）アデノウイルス／レトロウィルス二機能性システムを介しての自 己指向性及び両性レトロウィルス性ベクターの異なった産出などについての評価 を行った。これらの研究は末端アッセイとしてＬａｃＺ組織化学陽性及びネオマ イシン抵抗で評価される形質導入性レトロウィルス粒子の産出を用いる。これに よって、イン・ビボ状況と最高度の類似性を有する適切な標的細胞の存在下のレ トロウィルス性ベクター産出に関連した最適パラメータの判定が可能になる。 実施例１３ アデノウイルス／レトロウィルス二機能性システムを介してのレトロウィルス形 質導入を補強する手段としてのレトロウィルス受容体の誘導 隣接柔組織細胞を形質導入するレトロウィルス性ベクターをその場所で発生さ せることはその安定した遺伝子修正を可能にしてくれる。一度アデノウイルス／ レトロウィルス二機能性方式でアデノウイルス性ベクターの高度の局所的発生が 行われると、他の印紙が周辺の標的細胞の実際の形質導入に関与してくる。この 点に関して、標的器官サイトでの安定したプロデューサ細胞がレトロウィルス性 ベクターを介して起きるようにするためには、形質導入される細胞が増殖状態に あることが必要である。つくられるレトロウィルスに対する受容体の局所集中も 隣接細胞が形質導入される有効性を示す因子であろう。自己指向性あるいは両性 ベクターのための受容体レベルはこのベクターによる感染に対する標的細胞の全 体的な感受性を示す限定的な因子である。さらに、同族レトロウィルス受容体の 異種表現は、１）受容体−ｅｎｖ相互作用に基づく有効な形質導入イベントの数 を増大することにより標的細胞の感受性を増大し、そして／又は２）受容体−ｅ ｎｖ相互作用を可能にする従来は不全であった機能を提供することによって、レ トロウィルス感染に従来は抵抗性を示していた細胞をそれに対して感受性を示す ようにしてくれる。レトロウィルス受容体群の調節はこれらのベクターによる形 質導入の有効性の重要な決定因子であろう。 自己指向性レトロウィルス（ｅｃｏ−Ｒ）のエンベロープ糖蛋白質に対応する 受容体と両性レトロウィルス（ａｍｐｈｏ−Ｒ）のエンベロープ糖蛋白質に対す るｃＤＮＡクローンを得た。これらはアデノウイルス性ベクター内に組み入れら れ、それによってレトロウィルス性ベクターがＥ１Ａ／Ｂ消去、複製不能アデノ ウイルス性ベクターの存在下でＣＭＶ中間初期プロモータ／エンハンサを介して 表現された。これら のベクターを用いて標準的な手順で一次マウス肝臓細胞に感染させた。これらの 標的肝臓細胞は、その後、ＬａｃＺ／ｎｅｏカセットをコード表現する自己指向 性及び両性ベクターによって感染させられた。レトロウィルスがコード表現した ｃＤＮＡによって形質導入されていないマウス一次肝臓細胞との比較が行われた 。上にも述べた通り、インジケータ細胞をスコアしてＬａｃＺ組織化学活性とネ オマイシン抵抗性にのレトロウィルスによる誘発について調べた。さらに評価可 能なパラメータとしてはレトロウィルス性ベクターの感受性に対する標的レトロ ウィルス受容体数の影響がある。加えて、ｅｃｏＲとａｍｐｈｏＲ誘発のそれぞ れの能力の比較が可能である。これらの調査はレトロウィルス受容体誘発が関連 標的細胞のレトロウィルス形質導入を強化することが可能かどうかについて明ら かにしてくれる。この戦略はその場所でのレトロウィルス受容体誘発を達成する ためのアデノウイルス性ベクターの効率的なイン・ビボ遺伝子伝達特性をもたし てくれる。従って、アデノウイルス性ベクターはつくりだされたレトロウィルス 粒子を介して隣接細胞を感染させるために標的器官サイトでプロデューサ細胞を 発生させるために用いられる。隣接細胞でのレトロウィルス受容体の誘導を介し てこのプロセスを強化することもアデノウイルス性ベクターが媒介する遺伝子伝 達を可能にしてくれる。 実施例１４ アデノウイルス／レトロウィルス二機能性システムによるＶ ＳＶ−Ｇ偽型化レトロウィルス性ベクターの産出 レトロウィルス性ベクターを介しての効率的な遺伝子伝達を達成するという流 れのなかでの標的細胞レトロウィルス受容体の制約を克服するために偽型化レト ロウィルスをつくりだした。この点で、最も一般的には小水泡性口内炎ウイルス Ｇ−糖蛋白質（ＶＳＶ−Ｇ）から誘導されるされる、交互に繰り返されるｅｎｖ 糖蛋白質を含む二機能性レトロウィルス粒子を発生させることができる。交互細 胞侵入を可能にするこの手段は両性あるいは自己指向性ｅｎｖ糖蛋白質に対する 標的受容体の欠如を回避してくれる。こうしたやり方はレトロウィルス抵抗性細 胞を感染させる目的と、形質導入効率を向上させるのとの両方の目的で用いられ ている。さらに、これら偽型化ベクターはイン・ビボでのより高いレベルの安定 性を有しており、イン・ビボ伝達状況でのその場所でのより高いレベルの形質導 入を可能にしてくれであろう。これらのＶＳＶ−Ｇ偽型化レトロウィルスは両性 あるいは自己指向性ｇａｇ／ｐｏｌとＶＳＶ−Ｇ糖蛋白質との協調表現によって 発生される。集合レトロウィルス粒子は両性あるいは自己指向性ｅｎｖ対応物の 代わりにＶＳＶ−Ｇを取り込む。この目的を達成するひとつの手段はレトロウィ ルス性ｇａｇ／ｐｏｌをコード表現するプラスミド及びＶＳＶ−Ｈ＋レトロウィ ルス性ベクター・プラスミドによる細胞の共トランスフェクションである。形質 導入された細胞はレトロウィルス性偽型の一過性プロデューサにされる。この方 法は望ましい偽型化 レトロウィルス粒子をつくりだすことができるが、ＶＳＶ−Ｇ糖蛋白質に関連し た毒性がプロデューサ細胞内で示され、このことは産出量の低下、ひいては全体 的な力価の低下という結果をもたらす。組み込み細胞株方式は調節可能な表現単 位をつくりだすことで開発されてきている。構成的にレトロウィルスｇａｇａ／ ｐｏｌを表現し、同時に誘導可能な表現カセットにＶＳＶ−Ｇを含んだ安定した 細胞が開発されている。レトロウィルス性ベクター・プラスミドによるこれらの 細胞の形質導に続いて、偽型化ベクターの誘導を可能にすべくＶＳＶ−Ｇ表現が 誘発された。こうしたやり方は偽型化粒子を発生できる細胞株の安定した維持と 向上されたレベルのベクター産出を可能にしてくれる。 標的細胞をＶＳＶ−Ｇ偽型の一過性プロデューサ内に入れるためにアデノウイ ルス／レトロウィルス二機能性システムを用いた。こうしたやり方はイン・ビボ で隣接細胞を感染させる際に利点を有している。そうした補強された形質導入効 率性は改良された標的細胞感染効率に反映する可能性がある。それとは別に、そ うしたことは偽型化レトロウィルス粒子のより大きなイン・ビボ安定性に反映す る可能性もある。この分析のために、標的細胞をより厳密さを向上させたモデル ・システムとして用いた。従って、ＨｅＬａ細胞、マウス肝臓細胞株ＢＮＬ Ｃ Ｌ．２、そして最終的にマウス一次細胞をアデノウイルス／レトロウィルス二機 能性システムによって一過性ＶＳＶ−Ｇ偽型化レトロウィルス・プロデューサ として誘発した。 偽型化レトロウィルスの発生のために、細胞をレトロウィルス性ｇａｇ／ｐｏ ｌを含むアデノウイルス性ベクター、ＣＡｄＣＭＶＧＰ、レトロウィルス性ベク ター配列をコード表現するアデノウイルス（ＡｄＬＮＣＭＶＬａｃＺ）＋ＶＳＶ −Ｇ糖蛋白質をコード表現するアデノウイルスで共感染した。この後者のベクタ ーはＬ．Ｐｒｅｖｅｃ（ＭａｃＭａｓｔｅｒ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｏｎｔａ ｒｉｏ，Ｃａｎａｄａ）から入手した。これは種々の高レベルの真核性標的細胞 でＶＳＶ−Ｇを表現することはできるＥ１Ａ／Ｂ消去、複製不能アデノウイルス 性ベクターである。これらの細胞はそれぞれＡｄＣＭＶＥ^e及びＡｄＣＭＶＥｎ ｖ^aを用いてアデノウイルス／レトロウィルス二機能性システムを介しての自己 指向性及び両性レトロウィルス性ベクターの発生のためにも誘発された。感染後 、細胞上澄液を取り出して、標的細胞を感染するために用いられた。最初に、Ｎ ＩＨ ３Ｔ３細胞を感染して、ＬａｃＺ誘発及びネオマイシン選択可能性クロー ンをスコアした。この分析は、ＶＳＶ−Ｇ偽型化に対して相対的な力価指数をつ くりだして、それを両性及び自己指向性ベクターと比較する方法を可能にしてく れる。さらに、上澄液を用いてマウス肝臓一次細胞を感染させてＬａｃＺをスコ アした。この分析は、偽型化方式がＶＳＶ−Ｇ標的細胞受領体相互作用に基づい て柔組織標的の感染性を増大させるかどうかを明らかにする。相関的研究は、Ｖ ＳＶ−Ｇ形質導入 がベクターのプロウイルス性の統合に関連しているのかどうかについて反転した 。ＶＳＶ−Ｇは『偽形質導入』と関連づけられており、そのことによって異種遺 伝子生成物の移送が標的細胞の安定した遺伝子修正の過程で起きるのであるから 、これは重要なことである。さらに、ＶＳＶ−Ｇ糖蛋白質の誘発された表現がア デノウイルス／レトロウィルス二機能性システムを介してベクター産出をさらに 最適化することができるかどうかについて調べられた。この誘発性がより高い力 価のＶＳＶ−Ｇ偽型の誘導を可能にするかどうかについての評価が行われた。こ れらの研究は、従ってアデノウイルス／レトロウィルス二機能性システムがＶＳ Ｖ−Ｇ偽型化レトロウィルス粒子を生み出すように機能できるのかどうかについ ての判断を可能にしてくれる。さらに、これらの粒子がイン・ビトロでの関連柔 組織標的のより増強された形質導入能力を有しているかどうかにについても調べ られた。 実施例１５ イン・ビボで柔組織細胞を修正するアデノウイルス／レトロウィルス二機能性ベ クター 本発明は標的細胞をアデノウイルス・プロデューサ細胞として機能させるため にアデノウイルス性ベクターを用いる方法を提供する。さらにこの方法は心臓、 肺、及び血液の病気のモデルに関連した標的組織に対して最適化することができ る。この方式をイン・ビボで用いて、標的柔組織サイトでの長期間の安定した統 合を達成することができる。１）全身血 管伝達による肝臓細胞形質導入と、そして２）内腔気道伝達による気道上皮の２ つの状況で、イン・ビボ研究が行われた。これらのルーティング方式は関連柔組 織の高効率のイン・ビボ形質導入が達成できる伝達ルートを示している。従って 、イン・ビボでの遺伝子機能のレトロウィルスによる伝達効率は人をまごつかせ るような要因ではない。標的細胞をレトロウィルス・プロデューサとして機能さ せるためにアデノウイルス性ベクターが用いられた。つくりだされたレトロウィ ルスは周囲の柔組織細胞に形質導入するように機能した。 実施例１６ 柔組織サイトでのレトロウィルス産出のイン・ビボ誘発後の標的細胞のその場所 でのレトロウィルス感染 レトロウィルスがイン・ビボでつくりだされる程度及び範囲について調べた。 つくりだされるウイルス粒子はその場所では発生後に実際的な方法で検出するこ とはできないので、この分析では隣接細胞がレトロウィルス性ベクターによって 安定的に形質導入された程度を強化することで、その結果を間接的に判定した。 これらの研究のために、気道上皮か、あるいは肝臓細胞上皮のいずれかでの伝達 を実現するためにレトロウィルス性ベクター機能をコード表現するアデノウイル ス性ベクターとレトロウィルス性ベクター配列をコード表現するアデノウイルス 性ベクターの両方でマウスに刺激を与えた。誘導されたレトロウィルス性ベクタ ー（ＬａｃＺ／ｎｅｏ）の表現と、誘導されたレトロウィルス性ベクター（Ｌａ ｃＺ／ｎｅｏ）の表現された生成物はｍＲＮＡトランスクリプト（ｇａｇ／ｐｏ ｌ／ｅｎｖ）の定量的ポリメラーゼ鎖反応及び／又はＤＮＡコピー数（ＬＴＲＬ ａｃＺ／ｎｅｏ）によってそれぞれ独立に確認された。さらに、特にこれらのレ トロウィルス性成分をつくりだす標的細胞は肺及び肝臓から誘導されるこれらの 部分のその本来の場所での雑種形成によって判定された。これらの研究はアデノ ウイルス性ベクターの伝達が標的器官サイトでレトロウィルス組み込み機能の表 現を達成することができることを裏づけている。さらに、レトロウィルス・プロ デューサ細胞として強力に機能する特定の細胞サブセットも識別することができ る。 つくりだされるレトロウィルスによる標的細胞の形質導入によって統合が行わ れる程度の判定は宿主器官ゲノム性ＤＮＡの存在下でのプロウイルス性ＤＮＡの 状態の分析によって行われる。レトロウィルス粒子の局所的な産出の後、周辺の 細胞の形質導入はレトロウィルス・プロウイルス性ゲノムの統合化コピーを発生 された。総ＤＮＡはアデノウイルス／レトロウィルス二機能性システムによる誘 発の後に抽出されて、プロウイルス性ＤＮＡの状態の分析にかけられた。最初、 組織物質に対してＨｉｒｔＤＮＡ抽出が行われた。誘導されたＤＮＡがサザン・ ブロットで分析されて、アデノウイルス誘導配列の存在とその状態について調べ られた。レトロウィルス性ベクターＤＮＡの大部分はＨｉｒｔ画分内で非統合エ ピソームとして検出されるはずである。これはＡｄＣＭ ＶＡｍｐｇゲノムと、少なくともＡｄＬＮＣＭＶＬａｃＺゲノムの一部にも当て はまるであろう。次に、高分子量ＤＮＡを同様の方法で分析した。２つのアデノ ウイルス性ベクターのゲノムは、それらがエピソーム性で、Ｈｉｒｔ抽出可能な ＤＮＡの存在する場所に移行するので、ＨＭＷ ＤＮＡ画分で検出されるはずで ある。対照的に、統合がいずれかの程度で行われるのであれば、ＡｄＬＮＣＭＶ ＬａｃＺのプロウイルス性成分はサザン・ブロット分析で高分子量画分で検出さ れる。このことは、これら２つの標的器官サイトから誘導されたＤＮＡのＨｉｒ ｔ画分及びＨＭＷ画分のサザン・ブロットと組み合わせた制限エンドヌクレアー ゼ消化によって確認された。比較対照との比較が行われ、それによってレトロウ ィルス組み込み機能、あるいはレトロウィルス・ベクター機能のいずれか１つだ けのアデノウイルスを介しての伝達が行われた。この分析は統合イベントがアデ ノウイルス／レトロウィルス二機能性システムによるその本来の場所でのレトロ ウィルス性ベクター形質導入の結果として起きたのかどうかを判定する感受性『 スクリーン』として機能する。 その本来の場所でのレトロウィルス感染の追加的アッセイを標的サイトでのベ クター・プロウイルス性ＤＮＡあるいはＤＮＡコード表現配列の長さである。安 定して、長期間の表現がこれらの表現の器官からその本来の場所でのレトロウィ ルス感染から誘導される。最初の例で、標的器官の柔組織細胞でのベクター・プ ロウイルスＤＮＡの統合は宿主ゲノムＤ ＮＡの存在下でのＤＮＡ配列の長期的持続として示されるであろう。従って、ベ クター・プロウイルスＤＮＡの一時的パターンについて検査した。この点で、前 にも述べたのと同様、肺及び肝臓の形質導入についてＡｄＣＭＶＡｍｐｇ及びＡ ｄＬＮＣＭＶＬａｃＺによって動物を検査した。処理後特定の時間的間隔をおい て、その器官を取り出して、Ｈｉｒｔ ＤＮＡ抽出及びＨＭＷ ＤＮＡ抽出の両 方を行った。アデノウイルス性ベクター・ゲノム性ＤＮＡとレトロウィルス性プ ロウイルスＤＮＡの両方の分析を定量性ＰＣＲを用いて行って、各時点での宿主 ＨＭＷゲノムン性ＤＮＡ内の統合レトロウィルス性ベクターＤＮＡの絶対量を判 定した。ＨＭＷ画分内部の持続性プロウイルス性ベクター配列を示す一時的な特 徴は安定した統合が起きた程度を示す。ベクター・プロウイルス統合に基づく持 続性の別の指数が組織化学レポータを用いて求められた。ＬａｃＺとＧＦＰの両 方を、その表現が適切に処理された組織部分の組織化学分析によって消去するこ とができるレポータとして用いられた。レトロウィルス性ベクターの形質導入後 に気道上皮及び肝臓に存在するこれらレポータ遺伝子の一過性表現特性について はかなり資料として発表されている。従って、レポータ遺伝子の一時的パターン はその本来の場所でのレトロウィルス発生及びその結果としてのベクター・プロ ウイルス性ＤＮＡを示すものである。動物に肝臓及び肺での形質導入を行うため にＡｄＬＮＣＭＶＬａｃＺ、又はＡｄＬＮＣＭＶＧＦＰを用いて実験を行った。 処理後のいろいろな時点で、関連する器官を取り出して、コード表現されたＬａ ｃＺ及びＧＦＰ遺伝子の生成物に関する組織化学分析を行った。この分析を補強 するために、これらレポータ遺伝子のｍＲＮＡ産出を調べるために組織部分の、 その本来の場所での雑種形成を行って、追加的な定量的指数を得た。この分析で は、アデノウイルスだけをコード表現するレポータとは比べて、その本来の場所 のレトロウィルス性ベクター・グループ内で持続性パターンの違いが明らかにさ れるであろう。 実施例１７ レトロウィルス組み込み及びベクター機能のイン・ビボでのアデノウイルスによ る伝達を介しての、その本来の場所でのレトロウィルス感染の増強 局所的につくられたレトロウィルス性ベクターが標的細胞に安定して形質導入 できる能力は局所的な細胞因子によって影響を受ける。これらの因子には標的細 胞の増殖状態と、その局所的につくりだされたレトロウィルス性ベクターに対す る受容体の数などがある。細胞増殖を調節するために、成長因子に基づく戦略が 用いられた。標的細胞の増殖を強化するために成長因子誘発の戦略が用いられた が、成長因子ＫＦＧ及び肝臓細胞成長因子（ＨＧＦ）をコード表現する遺伝子成 長物の肺及び肝臓に対する効率的なイン・ビボ伝達を達成するためにアデノウイ ルス性ベクターが用いられた。この方法によって達成されたこれら成長因子の高 い局所的濃度はこれ らの器官サイトで柔組織増殖の最適化された誘発をもたらし、これらの増殖誘発 は局所的につくられたレトロウィルス性ベクターによる標的細胞の形質導入強化 を可能にしてくれる。 動物に対して、初めに、その肺あるいは肝臓に対してＫＧＦあるいはＨＧＦを コード表現するアデノウイルス性ベクターを伝達することで刺激を与えた。増殖 の最適な誘発のための一時的な特性が確立した後、動物に対してその本来の場所 でのレトロウィルス発生のためにアデノウイルス／レトロウィルス二機能性ベク ターＡｄＣＭＶＡｍｐｇ及びＡｄＬＮＣＭＶＬａｃＺを与えた。その後、これら の動物を分析して統合されたプロウイルス性ベクター配列を判定した。これらの 調査には肺と肝臓のＨＭＷＤＮＡ画分内での統合プロウイルス配列の定量と、安 定して形質導入された細胞の数を判定するための、その本来の場所での雑種形成 とが含まれていた。相関的な研究は誘発された増殖がどの程度に本来の場所での レトロウィルス形質導入の成功に寄与するかについて判定するものである。これ らの研究をまとめると、成長因子遺伝子のアデノウイルス・ベクターに媒介され た伝達を介して誘発される増殖が柔組織標的の安定した形質導入を達成する上で 本来の場所で発生されたレトロウィルス性ベクターの能力にどの程度好ましい影 響を及ぼすかを明らかにしてくれる。 実施例１８ アデノウイルス性ベクターは標的細胞をアデノウイルス・プ ロデューサとして機能させることができる 標的細胞をアデノウイルス・ベクター、ＡｄＣＭＶＡｍｐｇ及びＡｄＬＮＣＭ ＶＧＦＰの組み合わせ、あるいはＡｄＬＮＣＭＶＧＦＰだけで感染させた。標的 細胞はサル・ベロ細胞株Ｗ１６２、マウス腺維芽細胞株ＮＩＨ−３Ｔ３、ヒト膀 胱癌細胞株ＥＪ，あるいはヒト卵巣癌細胞株ＳＫＯＶ３_ipl（図示せず）であっ た。細胞は３時間適切なアデノウイルス性ベクターで感染させてから、洗浄して すべての遊離アデノウイルスを取り除いた。これらの細胞をいろいろな期間組織 培養に入れて、蛍光活性化細胞ソーティング（ＦＡＣＳ）あるいは蛍光顕微鏡で 緑色蛍光蛋白質（ＧＦＰ）の表現について分析した。 感染２日目のアデノウイルス性ベクター感染細胞の分析の結果、比較対称と推 定されるレトロウィルス・プロデューサは高い頻度でＧＦＰレポータ遺伝子の表 現を示した（図５）。これは両方のグループで起きたＡｄＬＮＣＭＶＧＦＰ感染 の初期の高い頻度とも一致しており、その後のＧＦＰ遺伝子表現も両方のグルー プで同様に発生した。各グループのサブセットを８日間毎に通過させて、３０日 目と６０日目に分析した。アデノウイルス性ベクター（ＡｄＣＭＶＡｍｐｇ及び ＡｄＬＮＣＭＶＧＦＰ）の両方に露出させた細胞グループのＦＡＣＳ分析はＡｄ ＬＮＣＭＶＧＦＰだけに露出させた細胞と比較してかなり多い数のＧＦＰ−ポジ ティブ細胞を示した。両方のウイルスに感染させたグループからのＧＦＰ− ポジティブ細胞は密集した状態で成長しており、これはレトロウィルスが局所的 に分布していること、及び／又はクローンの発生原点を示している（図５）。こ れはＧＦＰ表現を失ってしまったＡｄＬＮＣＭＶＧＦＰだけで感染された細胞と 著しい対称を示しており、標準的なアデノウイルス方式（図５及び６Ａ）で伝達 される遺伝子の公知の一過性表現と一致した傾向を示している。高分子量細胞Ｄ ＮＡのレトロウィルス配列が示されたことでプロウイルス統合が確認された（図 ６Ｂ）。 実施例１９ 形質導入性レトロウィルス粒子の産出 ＮＩＨ−３Ｔ３あるいはＷ１６２細胞をＡｄＣＭＶＡｍｐｇとＡｄＬＮＣＭＢ ＧＦＰ、あるいはＡｄＬＮＣＭＢＧＦＰだけで感染させて、その後、上に述べた ような手順で洗浄した。上澄液を感染後４８時間で取り出して、その後、レトロ ウィルスの力価を調べるためにＮＩＨ−３Ｔ３細胞を感染するために用いた。上 澄液で感染された細胞を培養内に２０日間保持して、ＧＦＰ表現に関する分析を 行った。ＡｄＬＮＣＭＶＧＦＰウイルスから誘導された上澄液は標的細胞内で長 期ＧＦＰ表現を誘発することはできなかった（図７）。対称的に、ＡｄＣＭＶＡ ｍｐｇ及びＡｄＬＮＣＭＶＧＦＰ上澄液で感染された細胞は２０日目で高い割合 のＧＦＰ表現を示した。この研究はＧＦＰ誘発が最初のアデノウイルスで感染さ れた標的細胞から誘導されたレトロウィルスによる感染から もたらされたことを裏づけるものである。これら長期的なＧＦＰ表現に関する調 査はレトロウィルス産出によって媒介される安定した形質導入からの移転アデノ ウイルス一過性遺伝子表現（＜２週間）を明確にするために考案されたものであ る。これらの結果は形質導入性レトロウィルス粒子が実際に標的内のアデノウイ ルス性ベクター伝達遺伝子によって発生されたことを示している。 こうした方法が複製能力を有するレトロウィルス（ＲＣＲ）の有意な産出に関 連しているかどうかについて判定するため、プラスミドに基づくトランスフェク ション方法を介して誘導されるＲＣＲ発生とアデノウイルス／レトロウィルス二 機能性ベクターの使用との比較が行われた。従って、ＨｅＬａ細胞をｐＰＡＭ３ ＋ｐＬＮＣＬＺでトランスフェクトするか、あるいはＡｄＣＭＶＡｍｐｇ又はＡ ｄＬＮＣＶＧＦＰ、又はＡｄＣＭＶＡｍｐｇ＋ＡｄＬＮＣＭＶＧＦＰによって感 染された。これらの上澄液はその後複製能力を有するレトロウィルスがあるかど うかについて調べた。アデノウイルス／レトロウィルス二機能性によっては複製 能力を有するレトロウィルスは検出されなかった（データ示さず）。従って、こ の方法による複製能力を有するレトロウィルスの発生は通常の方法を上回ってい るとは思われない。 実施例２０ 安定した統合によるイン・ビボ遺伝子伝達 こうした基本的な考え方を確立した後、安定した統合をも たらすイン・ビボ遺伝子伝達を行うためにこの方法を用いた。これは最も厳しい 伝達状況でのこの方式の全体的な実用性について判定したために行われた。この 分析のために、ヒト卵巣癌のマウス・モデルを用いた。無胸腺ヌード・マウスを ヒト卵巣癌細胞株ＳＫＯＶ_iplによってオルソトピックな方法で異種間移植した 。腹膜腫瘍プラークを確立した後、動物に腹膜ルートでベクターを与えた。動物 のいくつかのグループにアデノウイルス／レトロウィルス二機能性ベクターかこ のベクター＋アデノウイルス／レトロウィルス二機能性組み込み機能のいずれか を与えた。前者のグループでは、用いられたベクター、ＡｄＬＮＣＭＶＧＦＰは ＧＦＰレポータ遺伝子を含むレトロウィルス性ベクター配列を含んでいた。後者 のグループでは、ｐＣＡＡｍｐｇから誘導されたアデノウイルス性ベクタ−Ａｄ ＣＭＶＡｍｐｇは、機能的に検証された組み込み機能を含んでいた。一方のウイ ルス・グループでは、ＧＦＰ表現カセットのアデノウイルス性ベクター媒介伝達 はイン・ビボ遺伝子表現をもたらし、非統合性異種遺伝子伝達に基づく急速な消 滅という一時的な特性を有している。対称的に、これら２つのウイルスは腫瘍細 胞の本来の場所での誘発を達成してレトロウィルス・プロデューサ細胞として機 能させることが予想された。局所的につくられたレトロウィルス性ベクターは増 殖性の隣接細胞、この場合にはＳＫＯＶ_ipl腫瘍標的の安定した形質導入を行う ことが予想されるであろう。これらの考察に基づけば、２つのオリジナル・グ ループは安定した形質導入を達成する別の能力に基づいてＧＦＰレポータ遺伝子 の表現の明確に異なった一時的特性を示すことが予想されるであろう。アデノウ イルス／レトロウィルス二機能性ベクターＡｄＬＮＣＭＶＧＦＰによって処理さ れた動物を伝達後の早い時点と時間が経ってからＧＦＰ表現を示す腫瘍細胞があ るかどうかを示すために蛍光顕微鏡で分析した。この分析で、単一のベクターを 受けた動物のグループは図８に示すように遅い時点では稀にしかポジテイィブ細 胞を示さなかった。対称的に、アデノウイルス／レトロウィルス二機能性ベクタ ー＋アデノウイルス／レトロウィルス二機能性組み込み機能を与えられた動物は 遅い時点ではっきりと異なったパターンを示した。この点で、このグループの分 析はクラスター内でポジティブな細胞はより多く検出されている点が注目に値す る。この知見は標的細胞の安定した形質導入がクローン表現で起きたとする考え 方と一致している。 実施例２１ アデノウイルス／レトロウィルス二機能体のイン・ビボでの有効性 卵巣癌細胞株ＳＫＯＶ_iplをＡｄＣＭＶＡｍｐｇ＋ＡｄＬＮＣＭＶＧＦＰ、あ るいはＡｄＬＮＣＭＶＧＦＰだけのいずれかでイン・ビトロで感染させた。感染 されたレトロウィルス粒子のイン・ビボでの発生と隣接細胞の感染を確認するた めに、感染された細胞を未感染の細胞と、アデノウイルス性ベクターによって感 染された細胞２５％、そして未処理ＳＫ ＯＶ_ipl細胞７５％の割合で混合して、腫瘍形成が行われるように無胸腺ヌード ・マウス内に皮下接種した。移植から２０日目に、両方の動物グループとも明白 な腫瘍を有しており、この腫瘍を取り出してＧＦＰレポータ遺伝子の持続性およ び表現を分析した。ＡｄＬＮＣＭＶＧＦＰだけで感染されたグループは、稀に、 孤立した蛍光細胞だけを有していた（図９Ｂ）。対照的に、２−ウイルス・グル ープから誘導された腫瘍はＧＦＰポジティブ細胞の大きな膨張性クラスターを持 っていた（図９Ｃ）。複数のフィールドでのポジティブ細胞を数えることによっ て、１−ウイルス・グループが８０％以上のＧＦＰ−ポジティブ細胞を有してい るという形質導入された細胞の推定を可能にしてくれた。従って、このグループ では、ポジティブ細胞の数は最初の移植混合体内のアデノウイルスで感染された 細胞の割合よりかなり大きかった。２−ウイルス・グループでのＧＦＰ−ポジテ ィブ細胞がかなり広く分布していることは、本来の場所のレトロウィルス性ベク ターによる隣接細胞の安定した遺伝子修正を示唆している。 イン・ビボでのアデノウイルス性ベクター形質導入と本来の場所でのレトロウ ィルス・プロデューサ発生と結合させる可能性について検査した。ヌード・マウ スにオルソトピックな方法でヒト卵巣癌細胞株ＳＫＯＶ_iplを移植した。移植後 ５日目に動物にＡｄＬＮＣＭＶＧＦＰだけか、あるいはＡｄＬＮＣＭＶＧＦＰ＋ ＡｄＣＭＶＡｍｐｇのいずれかで腹膜内接種した。アデノウイルス接種１６日後 、動物を致死させ て、腫瘍を分析した。１−ウイルス・グループではＧＦＰ−ポジティブ細胞は検 出されなかった（図９Ｅ）。対照的に、両方のアデノウイルス性ベクターを受け たグループではＧＦＰ−ポジティブ細胞の島が検出された（図９Ｆ）。複数の顕 微鏡フィールドの分析は１−ウイルス・グループの場合全体的な形質導入率が１ ％以下、そして２−ウイルス・グループの場合１０−１５％であることが示され た。レトロウィルス組み込みの十分な誘発を可能にする２つのアデノウイルス性 ベクターを受けたグループでのイン・ビボでのＧＦＰ表現の持続性は二次的につ くりだされるレトロウィルス性ベクターに基づいて発生する安定した形質導入に 関するイン・ビトロでの知見と一貫している。実施例２２ 要約 イン・ビボで標的細胞の効率的で安定した遺伝子修正を行うための新しいベク ター方式が開発された。これはアデノウイルスをレトロウイルス性ベクター及び 組み込み成分のための伝達システムとして用い、それによって標的細胞に一過性 の、本来の場所でのレトロウイルス性ベクターの一過性プロデューサとして機能 させることによって達成された。従ってこの方式は、隣接細胞を感染させ、安定 した形質導入を達成することができるレトロウイルス性ベクター粒子の発生を可 能にした。この方式においては、２つの重要な要因がこのレベルの安定したイン ・ビボでの形質導入を可能にしてくれ た。第一に、標的細胞のサイトでのレトロウイルス性ベクターの局所的産出がレ トロウイルス粒子の、その不活性化につながるような体液因子への露出による不 都合な影響を克服してくれる。第二に、アデノウイルス性ベクターの能力を利用 して本来の場所でのレトロウイルス・プロデューサ細胞の効率的なアデノウイル ス性ベクターに標的細胞への有効なイン・ビボ伝達を達成させた。この戦略は成 分ベクター系の望ましい諸側面を遺伝子伝達という目的のために結合させるとい う新しい概念に基づく方式を示している。 本明細書で述べられている特許あるいは出版物は本発明が関連する技術分野の 当業者のレベルを示している。これらの特許及び出版物はそれらを参照すること によって、個々の出版物が具体的、個別的に組み込まれるのと同じ程度に、全体 として本明細書に組み込まれる。 当業者であれば、本発明がここで述べられている目的や利点や、それと本質的 に関連している目的や利点を実行、達成するのによく適合していることは容易に 理解できるであろう。ここに述べられた実施例は、その方法、手順、処理、分子 、及び具体的な化合物も含めて好ましい実施の形態を示すものであり、具体例で あって、本発明の範囲の限定を意図するものではない。その変更やその他の利用 法は、権利請求の範囲で述べられるような本発明の範囲に含まれる技術分野の当 業者なら容易に想起できるであろう。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｃ１２Ｒ 1:92） (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ， ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，Ｌ Ｕ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ， ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，Ｋ Ｚ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，Ａ Ｕ，ＡＺ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ， ＨＵ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，Ｋ Ｚ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ， ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，Ｔ Ｍ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＺ，ＶＮ

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １． レトロウイルス性配列を含む少なくともひとつのアデノウイルス性ベ クターによって構成される二機能性アデノウイルス／レトロウイルス性配列 ２． 上記二機能性アデノウイルス／レトロウイルス性ベクターが （ａ）レトロウイルス性ベクター機能を含んだ複製不全アデノウイルス性ベ クターと、そして （ｂ）レトロウイルス組み込み機能を含む少なくともひとつの複製不全アデ ノウイルス・ベクターとで構成される請求項１のベクター。 ３． 上記レトロウイルス性ベクター機能がレトロウイルス性長端末反復で 側鎖された異種遺伝子によって構成される請求項２のベクター。 ４． 上記レトロウイルス組み込み機能がｇａｇ、ｐｏｌ及びｅｎｖ，ある いはそれらの組み合わせによって構成されるグループから選択される請求項２の ベクター。 ５． ｅｎｖ遺伝子が小水泡性口内炎ウイルス糖蛋白質である請求項４のベ クター。 ６． 上記異種遺伝子が治療用蛋白質、選択可能なマーカー、及びレポータ 遺伝子 ７． 請求項１による二機能性アデノウイルス／レトロウイルス性ベクター をそうした処理を必要とする個人に投与するステップを含む標的細胞を安定して 形質導入する方法。 ８． 上記二機能性アデノウイルス／レトロウイルス性ベクターが、 （ａ）レトロウイルス性ベクター機能を含んだ複製不全アデノウイルス性ベ クターと、そして （ｂ）レトロウイルス組み込み機能を含む少なくともひとつの複製不全アデ ノウイルス・ベクターとで構成される請求項７の方法。 ９． 上記レトロウイルス性ベクター機能がレトロウイルス性長末端反復で 構成されている請求項８の方法。 １０．上記レトロウイルス性組み込み機能がｇａｇ、ｐｏｌ、及びｅｎｖで 構成される請求項８の方法。 １１．上記ｅｎｖ遺伝子が小水泡性口内炎ウイルスＧ糖蛋白質である請求項 １０の方法。 １２．上記異種遺伝子が治療用蛋白質をコード表現する遺伝子、治療用蛋白 質、選択可能マーカー、レポータ遺伝子で構成される請求項９の方法。 １３．上記レトロウイルス性ベクター機能を含んだ複製不全アデノウイルス 性ベクターと上記レトロウイルス性組み込み機能を含んだ複製不能アデノウイル ス・ベクターが宿主細胞に共トランスフェクションされ、上記アデノウイルス・ シャトル・ベクターによってコード表現される遺伝子の表現が上記治療用遺伝子 を含むレトロウイルス粒子の産出をもたらし、上記レトロウイルス粒子が隣接細 胞に感染し、上記レトロウイルス粒子が上記治療用遺伝子を上記宿主のゲノム性 ＤＮＡ内に安定して統合させる請求項７の方法。