CN117624325A - 能促进大基因表达且致瘤性低的Bcl2突变体及应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开能促进大基因表达且致瘤性低的Bcl2突变体及应用,由人Bcl2的突变体Bcl2T69A/S70A/S87A基因的第177位密码子由ATG突变为AAG,第193位密码子由GGA突变为终止密码子TGA,第69位的苏氨酸残基T密码子ACC突变为丙氨酸残基A密码子GCC,第70位的丝氨酸残基S密码子TCG突变为丙氨酸残基A密码子GCT,第87位的丝氨酸残基S密码子AGC突变为丙氨酸残基A密码子GCC后得到。本发明突变体既能促进大于4.3kb基因表达又能极大地降低致瘤性,把该经过突变的模拟去磷酸化的Bcl2与目的基因构建于双顺反子的表达载体上,有利于在基因治疗中的应用。
Description
技术领域
本发明属于基因治疗和基因表达领域,具体能促进大基因表达且致瘤性低的Bcl2突变体及应用。
背景技术
Bcl-2基因,即B淋巴细胞瘤-2基因,具有明显抑制细胞凋亡的作用,也是细胞凋亡研究中最受重视的癌基因之一。Bcl-2蛋白家族非常庞大,按功能可分为促凋亡蛋白和抗凋亡(促存活)蛋白,前者由BH1、BH2、BH3(含有多个BH同源区域)蛋白和BH3-only(仅含BH3结构同源域)蛋白这两个亚家族组成,后者由Bcl-2(含有BH1、BH2、BH3和BH4)以及它的近亲蛋白组成。相比于正常细胞,Bcl-2蛋白在癌细胞中的表达高度上调,使它成为癌症治疗中的理想靶点。
基因突变(genic mutation)是指基因组DNA分子发生的突然的、可遗传的变异现象,从分子水平上看,基因突变是指基因在结构上发生碱基对组成或排列顺序的改变。研究表明,第60位、第70位、第87位发生突变的模拟磷酸化人Bcl2蛋白可以显著增加目标重组蛋白的表达。然而,对于较大的目标重组蛋白基因(大于4.3kb,如凝血因子VIII基因),其mRNA不稳定性导致表达水平较低。即使将其基因与模拟磷酸化的Bcl2构建在同一表达载体中进行共表达,也无法显著增强其表达效果。
申请人此前的专利申请201911369828.3中披露,在小鼠Bcl2T69E/S70E/S84E(人类Bcl2为Bcl2T69E/S70E/S87E)突变体的基础上,通过将第568位G碱基突变为T碱基,可以极大地增加较大基因重组蛋白的表达量。然而,在体内用于大基因的基因治疗方面受到限制,因为磷酸化的Bcl2具有致瘤性。研究表明,小鼠Bcl2的第69位苏氨酸(T)、第70位和84位丝氨酸(S)位置突变为谷氨酸(E)的Bcl2T69E/S70E/S84E突变体(人类Bcl2为Bcl2T69E/S70E/S87E)存在诱发肿瘤的风险(WangYY等,Gene Therapy 2018,25(3):220-233)。尽管在这三个位点引入丙氨酸突变(Bcl2T69A/S70A/S87A)可以降低Bcl2的致瘤风险,但研究发现在Bcl2T69A/S70A/S87A的基础上,引入第568位G碱基(对应人类Bcl2的第577位)变为T的突变并不能极大地增强其促进大基因表达的能力。
因此,需要探索其他途径,赋予Bcl2T69A/S70A/S87A促进大基因表达的能力,以便将其应用于大基因的基因治疗。
发明内容
本发明的第一个目的是针对现有技术的不足,提供一种既能促进大于4.3kb基因表达又能极大地降低致瘤性的Bcl2突变体,以使其能用于体内的大基因的基因治疗。
本发明提供的技术方案:
本发明所述能促进大基因表达且致瘤性低的Bcl2突变体为在人Bcl2的突变体Bcl2T69A/S70A/S87A基因的第193位密码子由GGA突变为终止密码子TGA的基础上,第177位密码子由ATG(甲硫氨酸Met)突变为AAG(赖氨酸Lys)。
即在人Bcl2的突变体Bcl2T69A/S70A/S87A基因的第577位碱基G突变为T从而使得193位密码子由GGA变为终止密码子TGA的基础上,把第530碱基由野生型的T突变为A,从而使得177位密码子由ATG变为AAG,即可使Bcl2的突变体Bcl2T69A/S70A/S87A获得既促进大于4.3kb基因表达又降低致瘤性的能力。当该Bcl2突变体与大于4.3kb目的基因构建于同一表达质粒共表达时,就可大大促进目的基因的表达,同时降低致瘤性。
人Bcl2的突变体Bcl2T69A/S70A/S87A由第69位的苏氨酸残基T密码子ACC突变为丙氨酸残基A密码子GCG,第70位的丝氨酸残基S密码子TCG突变为丙氨酸残基A密码子GCT,第87位的丝氨酸残基S密码子AGC突变为丙氨酸残基A密码子GCC后得到。
本发明的第二个目的是提供上述能促进大基因表达且致瘤性低的Bcl2突变体与目的基因构建在能同时表达双基因的载体质粒上的应用。上述目的基因大于4.3kb。
作为优选,新型Bcl2突变体连接在内部核糖体进入位点(internal ribosomeentry site,IRES)下游,把目的基因连接在IRES上游。
所述的大于4.3kb目的基因包括B区域删除的凝血因子VIII(BDD FVIII)、全长凝血因子VIII(FVIII)。
本发明的第三个目的是提供一种核酸,所述核酸编码上述能促进大基因表达且致瘤性低的Bcl2突变体。
本发明的第四个目的是提供一种载体,所述载体包括上述核酸。
本发明的第五个目的是提供一种宿主细胞,其用于表达上述能促进大基因表达且致瘤性低的Bcl2突变体、上述核酸和/或上述载体。
本发明的有益效果是:
本发明通过在人Bcl2的突变体Bcl2T69A/S70A/S87A基因的第577位碱基G突变为T从而使得193位密码子由GGA变为终止密码子TGA的基础上,再把第530位T碱基变为A碱基,把该经过突变的模拟去磷酸化的Bcl2与目的基因构建于双顺反子的表达载体上,就可以既促进大于4.3kb的目的基因的表达又降低致瘤性,以利于在基因治疗中的应用。
附图说明
图1为逆转录病毒和慢病毒载体质粒示意图。其中:A为构建有GFP-BDD FVIII、BDDFVIII或FVIII基因和人Bcl2突变体基因的逆转录病毒载体质粒示意图;B为仅构建有GFP-BDD FVIII、BDD FVIII或FVIII基因的逆转录病毒载体质粒示意图;C为构建有GFP基因和人Bcl2突变体基因的慢病毒载体质粒示意图。
图2为在HEK293细胞转染pMigR1-GFP-BDD FVIII-IRES-△193Bcl2AAAM177K、pMigR1-GFP-BDD FVIII-IRES-△193Bcl2AAA、pMigR1-GFP-BDD FVIII-IRES-△193Bcl2EEE和pMigR1-△GFP-GFP-BDD FVIII逆转录病毒表达载体质粒后54小时的GFP荧光显微图。其中A、B分别为转染pMigR1-GFP-BDD FVIII-IRES-△193Bcl2AAAM177K逆转录病毒表达载体质粒后54小时的细胞生长图和GFP荧光显微图;C、D分别为转染pMigR1-GFP-BDD FVIII-IRES-△193Bcl2AAA逆转录病毒表达载体质粒后54小时的细胞生长图和GFP荧光显微图;E、F分别为转染pMigR1-GFP-BDD FVIII-IRES-△193Bcl2EEE逆转录病毒表达载体质粒后54小时的细胞生长图和GFP荧光显微图;G、H分别为转染pMigR1-△GFP-GFP-BDD FVIII逆转录病毒表达载体质粒后54小时的细胞生长图和GFP荧光显微图。
图3为在HEK293细胞转染pMigR1-BDD FVIII-IRES-△193Bcl2AAAM177K、pMigR1-BDDFVIII-IRES-△193Bcl2AAA、pMigR1-BDD FVIII-IRES-△193Bcl2EEE、pMigR1-△GFP-BDDFVIII、pMigR1-FVIII-IRES-△193Bcl2AAAM177K、pMigR1-FVIII-IRES-△193Bcl2AAA、pMigR1-FVIII-IRES-△193Bcl2EEE、pMigR1-△GFP-FVIII逆转录病毒表达载体质粒后54小时的细胞上清液中的FVIII含量。
具体实施方式
下面结合附图对本发明做进一步的分析。
实施例1:点突变Bcl2
人Bcl2 cDNA分别克隆于pMigR1质粒的Nco I和Sal I之间,即在内部核糖体进入位点(IRES)下游,见图1A。利用点突变试剂盒(Transformer,CLONTECH),把第530位碱基T突变成A,使对应于第177位的甲硫氨酸残基密码子ATG换成赖氨酸残基密码子AAG。第530位碱基T突变为A的人Bcl2突变体序列,如SEQ ID NO.1所示。
SEQ ID NO.1:
ATGGCGCACGCTGGGAGAACAGGGTACGATAACCGGGAGATAGTGATGAAGTACATCCATTATAAGCTGTCGCAGAGGGGCTACGAGTGGGATGCGGGAGATGTGGGCGCCGCGCCCCCGGGGGCCGCCCCCGCACCGGGCATCTTCTCCTCCCAGCCCGGGCACACGCCCCATCCAGCCGCATCCCGGGACCCGGTCGCCAGGACCTCGCCGCTGCAGACCCCGGCTGCCCCCGGCGCCGCCGCGGGGCCTGCGCTCAGCCCGGTGCCACCTGTGGTCCACCTGACCCTCCGCCAGGCCGGCGACGACTTCTCCCGCCGCTACCGCCGCGACTTCGCCGAGATGTCCAGCCAGCTGCACCTGACGCCCTTCACCGCGCGGGGACGCTTTGCCACGGTGGTGGAGGAGCTCTTCAGGGACGGGGTGAACTGGGGGAGGATTGTGGCCTTCTTTGAGTTCGGTGGGGTCATGTGTGTGGAGAGCGTCAACCGGGAGATGTCGCCCCTGGTGGACAACATCGCCCTGTGGAAGACTGAGTACCTGAACCGGCACCTGCACACCTGGATCCAGGATAACGGAGGCTGGGATGCCTTTGTGGAACTGTACGGCCCCAGCATGCGGCCTCTGTTTGATTTCTCCTGGCTGTCTCTGAAGACTCTGCTCAGTTTGGCCCTGGTGGGAGCTTGCATCACCCTGGGTGCCTATCTGGGCCACAAGTGA
通过对cDNA测序进行验证突变点,验证正确无误后,即得到所需要的甲硫氨酸残基变为赖氨酸残基的突变Bcl2(Bcl2M177K)的基因序列,包含有该Bcl2M177K质粒为pMigR1-Bcl2M177K。再通过同样的方法把对应于第69位的苏氨酸残基T密码子和第70位、第87位的丝氨酸残基S密码子突变成丙氨酸残基A密码子,再把第193位的密码子由GGA突变为终止密码子TGA,每个突变点通过对cDNA测序进行验证,验证正确无误后,即得到所需要的第177位的甲硫氨酸残基密码子ATG换成赖氨酸残基密码子AAG、T69A/S70A/S87A模拟去磷酸化并去掉尾部47个氨基酸残基的突变Bcl2(△193Bcl2AAAM177K)的基因序列,包含有该△193Bcl2AAAM177K的质粒为pMigR1-△193Bcl2AAAM177K。通过同样方法获得包含有第193位甘氨酸残基密码子GGA突变为TGA的、T69A/S70A/S87A模拟去磷酸化的Bcl2突变体质粒pMigR1-△193Bcl2AAA或T69E/S70E/S87E模拟磷酸化的Bcl2突变体质粒pMigR1-△193Bcl2EEE。第530位碱基T突变为A和第577位碱基G突变为T、第69、70、87位氨基酸残基突变为丙氨酸残基的人Bcl2突变体序列,如SEQ ID NO.2所示。
SEQ ID NO.2:
ATGGCGCACGCTGGGAGAACAGGGTACGATAACCGGGAGATAGTGATGAAGTACATCCATTATAAGCTGTCGCAGAGGGGCTACGAGTGGGATGCGGGAGATGTGGGCGCCGCGCCCCCGGGGGCCGCCCCCGCACCGGGCATCTTCTCCTCCCAGCCCGGGCACACGCCCCATCCAGCCGCATCCCGGGACCCGGTCGCCAGGGCGGCTCCGCTGCAGACCCCGGCTGCCCCCGGCGCCGCCGCGGGGCCTGCGCTCGCCCCGGTGCCACCTGTGGTCCACCTGACCCTCCGCCAGGCCGGCGACGACTTCTCCCGCCGCTACCGCCGCGACTTCGCCGAGATGTCCAGCCAGCTGCACCTGACGCCCTTCACCGCGCGGGGACGCTTTGCCACGGTGGTGGAGGAGCTCTTCAGGGACGGGGTGAACTGGGGGAGGATTGTGGCCTTCTTTGAGTTCGGTGGGGTCATGTGTGTGGAGAGCGTCAACCGGGAGATGTCGCCCCTGGTGGACAACATCGCCCTGTGGAAGACTGAGTACCTGAACCGGCACCTGCACACCTGGATCCAGGATAACTGAGGCTGGGATGCCTTTGTGGAACTGTACGGCCCCAGCATGCGGCCTCTGTTTGATTTCTCCTGGCTGTCTCTGAAGACTCTGCTCAGTTTGGCCCTGGTGGGAGCTTGCATCACCCTGGGTGCCTATCTGGGCCACAAGTGA
实施例2:构建含有上述点突变Bcl2和大于4.3kb基因的双顺反子逆转录病毒表达载体
取pMigR1质粒进行BglII/SalI酶切,酶切完再用琼脂糖凝胶电泳分离提纯pMigR1酶切片段;合成5’GATCTCTCGAGGCGGCCGCCAATTGG3’和5’TCGACCAATTGGCGGCCGCCTCGAGA3’,退火后与pMigR1酶切片段进行连接,以导入多克隆酶切位点BglII-XhoI-NotI-MunI-SalI,连接好后转化大肠杆菌JM109,在含有氨苄青霉素的琼脂糖培养皿中进行筛选培养,对阳性大肠杆菌克隆进行扩增培养,然后提取纯化质粒。然后进行测序验证序列是否正确,验证后即得到切除了GFP的pMigR1-△GFP质粒。
以pMigR1质粒为模板,PCR扩增绿色荧光蛋白(GFP)基因,在5’端引物中引入BglII酶切位点和Kozak序列GCCACC,在3’端引物中保留SalI酶切位点。PCR后提纯PCR产物,然后用BglII/SalI进行酶切,酶切完再用琼脂糖凝胶电泳分离提纯GFP片段。另以HSQ/AvrII/RENEO质粒为模板,PCR扩增B区域删除的凝血因子八(BDD FVIII)基因,5’端引物保留XhoI酶切位点,3’端引物引入MunI酶切位点。PCR后提纯PCR产物,然后用XhoI/MunI进行酶切,酶切完再用琼脂糖凝胶电泳分离提纯BDD FVIII片段。全长人凝血因子八(FVIII)通过合成获得,两端引入XhoI/MunI酶切位点,用XhoI/MunI酶切,酶切完再用琼脂糖凝胶电泳分离提纯FVIII片段。pMigR1-△193Bcl2AAAM177K、pMigR1-△193Bcl2AAA、pMigR1-△193Bcl2EEE用BglII/EcoRI和XhoI/EcoRI切开多克隆酶切位点,pMigR1-△GFP用BglII/MunI和XhoI/MunI切开多克隆酶切位点,琼脂糖胶电泳进行分离纯化。把上述分离纯化好的GFP基因片段先与BDDFVIII基因片段混合,再分别与BglII/EcoRI切开的三个质粒片段和BglII/MunI切开的pMigR1-△GFP混合在一起进行连接反应(三片段一起连接);把上述分离纯化好的BDDFVIII或FVIII基因片段分别与XhoI/EcoRI切开的三个质粒片段以及XhoI/MunI切开的pMigR1-△GFP质粒片段放在一起进行连接反应。连接好后转化大肠杆菌JM109,在含有氨苄青霉素的琼脂糖培养皿中进行筛选培养,对阳性大肠杆菌克隆进行扩增培养,然后提取纯化质粒。然后进行测序验证序列是否正确,验证后即得pMigR1-GFP-BDD FVIII-IRES-△193Bcl2AAAM177K、pMigR1-GFP-BDD FVIII-IRES-△193Bcl2AAA、pMigR1-GFP-BDD FVIII-IRES-△193Bcl2EEE、pMigR1-△GFP-GFP-BDD FVIII、pMigR1-BDD FVIII-IRES-△193Bcl2AAAM177K、pMigR1-BDD FVIII-IRES-△193Bcl2AAA、pMigR1-BDD FVIII-IRES-△193Bcl2EEE、pMigR1-△GFP-BDD FVIII、pMigR1-FVIII-IRES-△193Bcl2AAAM177K、pMigR1-FVIII-IRES-△193Bcl2AAA、pMigR1-FVIII-IRES-△193Bcl2EEE、pMigR1-△GFP-FVIII逆转录病毒表达载体质粒(见图1A、B),其中pMigR1-GFP-BDD FVIII-IRES-△193Bcl2EEE、pMigR1-BDD FVIII-IRES-△193Bcl2EEE、pMigR1-FVIII-IRES-△193Bcl2EEE逆转录病毒表达载体质粒为阳性对照,pMigR1-△GFP-GFP-BDD FVIII、pMigR1-△GFP-BDD FVIII、pMigR1-△GFP-FVIII逆转录病毒表达载体质粒为阴性对照,其目的基因大小均超过4.3kb。
实施例3:转染HEK293细胞并表达大于5kb的融合基因GFP
取二块六孔细胞培养板,进行人胚肾来源的HEK293细胞培养,具体培养基为DMEM添加15%胎牛血清、2mM L-谷氨酰胺、100单位/毫升青霉素、100微克/毫升链霉素(配好的培养基为完全培养基)。把HEK293细胞培养于该培养基中,在37℃、5%二氧化碳浓度的培养箱中培养,等到细胞在培养皿中70-80%汇合(confluent)后,用仅含有5%胎牛血清的DMEM培养基洗两遍,然后每孔加入2毫升仅含5%胎牛血清的DMEM培养基,放在培养箱中待用。分别取上述提纯好的pMigR1-GFP-BDD FVIII-IRES-△193Bcl2AAAM177K、pMigR1-GFP-BDD FVIII-IRES-△193Bcl2AAA、pMigR1-GFP-BDD FVIII-IRES-△193Bcl2EEE、pMigR1-△GFP-GFP-BDDFVIII逆转录病毒表达载体质粒各15微克,分别溶解于装于4个1.5毫升eppendof管的750微升的OPTI-MEM培养基中,混匀;另取4个1.5毫升的eppendof管,每管加750微升的OPTI-MEM培养基,然后在每管OPTI-MEM培养基加入invitrogen公司的lipofactamine2000脂质体30微升,混匀。室温放置五分钟。然后把溶有DNA的OPTI-MEM溶液与溶有脂质体的OPTI-MEM溶液混合在一起,混匀,室温放置20分钟。从培养箱中取出细胞,每三孔重复转染一种DNA质粒,即每孔细胞中加入已经混匀室温放置20分钟的DNA脂质体混合液500微升,轻轻摇匀,置于细胞培养箱中进行培养。六小时后,每孔换新鲜的完全培养基2.5毫升,继续培养24小时,再换新鲜完全培养基2.5毫升/孔,培养24小时后上荧光显微镜观察GFP蛋白表达量。GFP表达量见附图2,从图中可以看出,转染pMigR1-GFP-BDD FVIII-IRES-△193Bcl2AAAM177K和转染了pMigR1-GFP-BDD FVIII-IRES-△193Bcl2EEE的细胞中GFP阳性细胞和GFP表达量(荧光强度)差不多,都能有最多阳性细胞和最强的荧光强度,而转染pMigR1-GFP-BDD FVIII-IRES-△193Bcl2AAA的细胞中GFP阳性细胞和荧光强度显著减低了,阴性对照pMigR1-△GFP-GFP-BDD FVIII的细胞中GFP阳性细胞和荧光强度最低。
由图2可知,经过了第530位核苷酸T突变成A,使对应于第177位的甲硫氨酸残基密码子ATG换成赖氨酸残基密码子AAG后,△193Bcl2AAAM177K与连接了BDD FVIII基因的GFP在一个mRNA链共表达后,能极大促进该GFP的表达(与阳性对照△193Bcl2EEE促进的表达量相似),而△193Bcl2AAA与连接了BDD FVIII基因的GFP在一个mRNA链共表达后,却只能比阴性对照有限促进该GFP的表达(比转染无Bcl2突变体的pMigR1-△GFP-GFP-BDD FVIII的阴性对照的GFP阳性细胞略多荧光强度略强,而比阳性对照的GFP阳性细胞数和荧光强度要极大地减低),说明试图只在Bcl2的第193位密码子突变为终止密码子而在第69、70、87位突变为丙氨酸A模拟去磷酸化,并不能实现既能降低致瘤性又能增加大基因的表达量的目的,而必须寻求新突变点第177位突变位赖氨酸残基才可达到此目的。
实施例4转染HEK293细胞并表达BDD FVIII和FVIII基因
取四块六孔细胞培养板,进行人胚肾来源的HEK293细胞培养,具体培养基为DMEM添加15%胎牛血清、2mM L-谷氨酰胺、100单位/毫升青霉素、100微克/毫升链霉素(配好的培养基为完全培养基)。把HEK293细胞培养于该培养基中,在37℃、5%二氧化碳浓度的培养箱中培养,等到细胞在培养皿中70-80%汇合(confluent)后,用仅含有5%胎牛血清的DMEM培养基洗两遍,然后每孔加入2毫升仅含5%胎牛血清的DMEM培养基,放在培养箱中待用。分别取上述提纯好的pMigR1-BDD FVIII-IRES-△193Bcl2AAAM177K、pMigR1-BDD FVIII-IRES-△193Bcl2AAA、pMigR1-BDD FVIII-IRES-△193Bcl2EEE、pMigR1-△GFP-BDD FVIII、pMigR1-FVIII-IRES-△193Bcl2AAAM177K、pMigR1-FVIII-IRES-△193Bcl2AAA、pMigR1-FVIII-IRES-△193Bcl2EEE、pMigR1-△GFP-FVIII逆转录病毒表达载体质粒各15微克,分别溶解于装于8个1.5毫升eppendof管的750微升的OPTI-MEM培养基中,混匀;另取8个1.5毫升的eppendof管,每管加750微升的OPTI-MEM培养基,然后在每管OPTI-MEM培养基加入invitrogen公司的lipofactamine2000脂质体30微升,混匀,室温放置五分钟。然后把溶有DNA的OPTI-MEM溶液与溶有脂质体的OPTI-MEM溶液混合在一起,混匀,室温放置20分钟。从培养箱中取出细胞,每三孔重复转染一种DNA质粒,即每孔细胞中加入已经混匀室温放置20分钟的DNA脂质体混合液500微升,轻轻摇匀,置于细胞培养箱中进行培养。六小时后,每孔换新鲜的完全培养基2.5毫升,继续培养48小时,取上清液,用Coatest FVIII试剂盒(Chromogenix)根据试剂盒操作说明书来测试不同细胞上清液中的FVIII含量。结果如下:转染pMigR1-BDD FVIII-IRES-△193Bcl2AAAM177K、pMigR1-BDD FVIII-IRES-△193Bcl2AAA、pMigR1-BDD FVIII-IRES-△193Bcl2EEE、pMigR1-△GFP-BDD FVIII、pMigR1-FVIII-IRES-△193Bcl2AAAM177K、pMigR1-FVIII-IRES-△193Bcl2AAA、pMigR1-FVIII-IRES-△193Bcl2EEE、pMigR1-△GFP-FVIII的细胞上清液中的FVIII含量分别为79.01±17.56mU/ml、25.46±7.92mU/ml、82.88±19.14mU/ml、2.97±0.92mU/ml、10.59±2.79mU/ml、3.71±1.11mU/ml、11.07±3.26mU/ml、0.83±0.30mU/ml(见图3)。从结果可知,经过了第530位核苷酸T突变成A,使对应于第177位的甲硫氨酸残基密码子ATG换成赖氨酸残基密码子AAG后,与目的基因BDD FVIII或FVIII在一个mRNA链共表达后,△193Bcl2AAAM177K与△193Bcl2EEE相似,但比△193Bcl2AAA和阴性对照,能显著促进该目的基因的表达(pMigR1-BDD FVIII-IRES-△193Bcl2AAAM177K与pMigR1-BDD FVIII-IRES-△193Bcl2AAA及pMigR1-△GFP-BDD FVIII对比,p<0.01;pMigR1-BDD FVIII-IRES-△193Bcl2AAAM177K与pMigR1-BDD FVIII-IRES-△193Bcl2EEE对比,p>0.05;pMigR1-FVIII-IRES-△193Bcl2AAAM177K与pMigR1-FVIII-IRES-△193Bcl2AAA及pMigR1-△GFP-FVIII对比,p<0.01;pMigR1-FVIII-IRES-△193Bcl2AAAM177K与pMigR1-FVIII-IRES-△193Bcl2EEE对比,p>0.05)。上述结果说明试图在原有193位密码子突变为终止密码子TGA的基础上只用T69A/S70A/S87A突变代替T69E/S70E/S87E突变来既保持Bcl2突变体促进大目的基因的表达量又降低Bcl2突变体的致瘤性是不可行的,而必须寻求新突变点第177位突变为赖氨酸残基才可达到此目的。
实施例5慢病毒载体构建及慢病毒制备
为了在致瘤性实验中避免逆转录病毒的潜在致瘤性干扰Bcl2突变体的致瘤性的测定,我们在致瘤性实验中采用慢病毒载体进行实验。
通过合成获得在5’端含有NcoI酶切位点、3’端含有BglII-SalI的△193Bcl2AA AM177K、△193Bcl2AAA与△193Bcl2EEE片段(NcoI-△193Bcl2AAAM177K-BglII-SalI、Nco I-△193Bcl2AAA-BglII-SalI、NcoI-△193Bcl2EEE-BglII-SalI),用限制性内切酶NcoI/SalI进行酶切并纯化,分别把这些片段插入经NcoI/SalI酶切的pMigR1逆转录病毒质粒中,得到pMigR1-IRES-△193Bcl2AAAM177K、pMigR1-IRES-△193Bcl2AAA、pMigR1-IRES-△193Bcl2EEE。为了得到小鼠干细胞病毒启动子(MSCV启动子)片段,以pMigR1质粒为模板,以5’-AGACTAGTTGAAAGACCCCACCTGTAGG-3’和5’-AGCCATGGTGGCACGGGTACCCGGGCGACGCAGTCTAT-3’为引物,通过PCR获得MSCV片段,经SpeI/NcoI酶切,纯化后插入经SpeI/NcoI酶切的pMigR1质粒中。插入MSCV片段的pMigR1质粒再经过SpeI/SalI酶切,纯化后获得MSCV-GFP片段。该MSCV-GFP片段分别插入到经SpeI/XhoI酶切的pMi gR1-IRES-△193Bcl2AAAM177K、pMigR1-IRES-△193Bcl2AAA、pMigR1-IRES-△193Bcl2EEE逆转录病毒质粒中,分别得到pMigR1-MSCV-GFP-IRES-△193Bcl2AAAM177K、pMigR1-MSCV-GFP-IRES-△193Bcl2AAA、pMigR1-MSCV-GFP-IRES-△193Bcl2EEE质粒。再用SpeI/SalI酶切pMigR1-MSCV-GFP-IRES-△193Bcl2AAAM177K、pMigR1-MSCV-GFP-IRES-△193Bcl2AAA、pMigR1-MSCV-GFP-IRES-△193Bcl2EEE质粒,获得MSCV-GFP-IRES-△193Bcl2AAAM177K、MSCV-GFP-IRES-△193Bcl2AAA、MSCV-GFP-IRES-△193Bcl2EEE片段,把这三个片段分别插入到经SpeI/SalI酶切的、购自系统生物科学公司(System Biosciences,SBI)的pCDF1-MCS2-EF1-Puro慢病毒质粒中,获得pCDF1-MSCV-GFP-IRES-△193Bcl2AAAM177K、pCDF1-MSCV-GFP-IRES-△193Bcl2AAA、pCDF1-MSCV-GFP-IRES-△193Bcl2EEE慢病毒载体质粒(见图1C)。
慢病毒制备:参照实施例3,常规培养293T/17细胞于六孔细胞培养板中。慢病毒制备根据Lipofectamine-2000脂质体和慢病毒载体产品说明书操作。利用Lipofectamine-2000脂质体,分别共转染慢病毒载体pCDF1-MSCV-GFP-IRES-△193Bcl2AAAM177K与混合包装质粒(packaging plasmid mix,购自System Biosciences,SBI)、pCDF1-MSCV-GFP-IRES-△193Bcl2AAA与混合包装质粒、pCDF1-MSCV-GFP-IRES-△193Bcl2EEE与混合包装质粒。6小时候,换培养基以去除Lipofectamine 2000,再过36小时,收集细胞培养上清液,经500g离心5分钟,取上清液,得到三种pCDF1-MSCV-GFP-IRES-△193Bcl2AAAM177K、pCDF1-MSCV-GFP-IRES-△193Bcl2AAA、pCDF1-MSCV-GFP-IRES-△193Bcl2EEE慢病毒液,分装病毒液,储藏于-80度冰箱备用。病毒液同时进行病毒滴度的测定。
实施例6致瘤性验证
小鼠骨髓细胞分离、慢病毒转导、移植方法、致瘤性验证参考我们之前发表的论文(Wang et al.Gene Therapy,2018,25:220-233)。取8周龄雄性C57BL/6小鼠作为供体小鼠,在第5天,眼眶后注射5-氟尿嘧啶(150毫克/千克体重)。在第0天,C57BL/6通过吸入异氟烷麻醉后杀死小鼠,并通过用冷的含1%胎牛血清(FBS)和1mM乙二胺四乙酸(EDTA)的磷酸盐缓冲液(PBS)冲洗胫骨和股骨获得骨髓细胞。根据制造商提供的说明,使用磁活化细胞分离法(MACS,Miltenyi Biotec公司,Gladbach市,德国;抗Sca-1微珠,130-091-176)分离sca-1+骨髓细胞。富集的sca-1+骨髓细胞培养在含有50纳克/毫升干细胞因子(SCF)、20纳克/毫升的白介素3和50纳克/毫升的白介素6的干细胞培养基中。48小时后,开始慢病毒感染过程:sca-1+骨髓细胞【细胞数量随着预设的感染复数(multiplicity ofinfection,MOI)而变动】悬浮在六孔板中2毫升含有4微克/毫升凝聚胺的实施例5制备的慢病毒上清液中,然后将该培养板于室温下900g离心50分钟。离心后,慢病毒上清液被替换为新鲜的培养基。24小时后,慢病毒感染过程再次重复。24小时后,将转导好(transduced)慢病毒的sca-1+骨髓细胞经眼眶后移植到致死剂量(950cGy)照射的8周龄雌性C57BL/6小鼠。来自10只供体小鼠的转导的sca-1+骨髓细胞可以移植10-15只受体小鼠。每个独立实验的每次感染,感染复数MOI都调整为一致。经骨髓移植的小鼠用含有抗生素【1.1克/升新霉素硫酸盐和0.227克/升硫酸粘杆菌素(大连美伦,中国)】的饮用水饲养1个月。血液系统重建后,从每个受体小鼠取外周血或骨髓细胞进行流式细胞仪分析。当发现小鼠奄奄一息时,或已经达到预定的终点,进行肿瘤发生分析。
为了能及时发现肿瘤发生,在预定时间点(移植后六个月)进行后续三次系列移植:在预定的时间点,来自每个初次骨髓细胞移植小鼠的骨髓被移植到2个致命辐射的次级骨髓接受者(950cGy),是为第二次移植小鼠。第三次移植在预定时间点重复第二次移植过程。每次移植时,来自单个供体小鼠的骨髓细胞不合并,每个受体小鼠接受来自单个供体小鼠的细胞,以便更好地量化肿瘤细胞转化率。如果移植的小鼠在移植后3周内死亡,则死亡原因被认为是移植物衰竭引起的。系列移植后,每天监测受体小鼠,如果小鼠有疾病或血液恶性肿瘤的迹象并且变得奄奄一息,或者已经到达预定的终点,麻醉并杀死这些小鼠进行肿瘤发生分析。
实验结果显示,初次移植pCDF1-MSCV-GFP-IRES-△193Bcl2AAAM177K、pCDF1-MSCV-GFP-IRES-△193Bcl2AAA、pCDF1-MSCV-GFP-IRES-△193Bcl2EEE慢病毒感染的sca-1+骨髓细胞的小鼠各15个(分别命名为“△193AAAM177K初次小鼠、△193AAA初次小鼠、△193EEE初次小鼠”),均移植成功。移植后六个月检测,所有小鼠均未发现肿瘤发生。第二次移植前检测了所有移植小鼠绿色荧光蛋白阳性(GFP+)外周白细胞,其GFP+外周白细胞百分比均大于80%,说明所有初次移植的小鼠均成功重建了病毒转导的骨髓细胞来源的血液系统。第二次移植时以初次移植成功的小鼠为骨髓供体小鼠,每个供体小鼠骨髓移植给二个受体小鼠,共移植小鼠90个(命名为“△193AAAM177K二次小鼠、△193AAA二次小鼠、△193EEE二次小鼠”),移植失败12个,分别有25个△193AAAM177K二次小鼠、27个△193AAA二次小鼠、26个△193EEE二次小鼠移植成功。在移植后6个月内,分别有3个△193AAAM177K二次小鼠、4个△193AAA二次小鼠、3个△193EEE二次移植小鼠死亡,均死于非肿瘤原因。移植后六个月后,存活小鼠均未发现肿瘤发生。第三次移植前检测了所有小鼠GFP+外周白细胞,其GFP+外周白细胞百分比依然均大于80%。第三次移植以二次移植成功小鼠为骨髓供体小鼠,每个供体小鼠的骨髓移植给二个受体小鼠。共移植成功121个小鼠(命名为“△193AAAM177K三次小鼠、△193AAA三次小鼠、△193EEE三次小鼠”),分别是42个△193AAAM177K三次小鼠、38个△193AAA三次小鼠、41个△193EEE三次小鼠移植成功。在移植后6个月内,有43个三次小鼠死亡,分别是11个△193AAAM177K三次小鼠、13个△193AAA三次小鼠、19个△193EEE三次小鼠,检测发现有2个△193EEE三次小鼠发生了白血病,其余死亡小鼠均死于非肿瘤原因。进一步检测脾脏细胞发现上述2个白血病△193EEE三次小鼠的白血病细胞均为GFP+细胞,说明可能缘于Bcl2的三个磷酸化位点的模拟磷酸化突变T69E/S70E/S87E。其余存活小鼠在移植后6个月后麻醉处死,未检测到肿瘤发生,并且外周血GFP+白细胞百分比还在70%以上。从以上结果可知,Bcl2的T69A/S70A/S87A/M177K突变和T69A/S70A/S87A突变一样,在致瘤性上是安全的。
上述实施例并非是对于本发明的限制,本发明并非仅限于上述实施例,只要符合本发明要求,均属于本发明的保护范围。
Claims (8)
1.一种能促进大基因表达且致瘤性低的Bcl2突变体,所述Bcl2突变体第69位的苏氨酸残基T密码子ACC突变为丙氨酸残基A密码子GCG,第70位的丝氨酸残基S密码子TCG突变为丙氨酸残基A密码子GCT,第87位的丝氨酸残基S密码子AGC突变为丙氨酸残基A密码子GCC,第193位密码子由GGA突变为终止密码子TGA,其特征在于,所述Bcl2突变体还包括第177位密码子由ATG突变为AAG。
2.权利要求1所述的能促进大基因表达且致瘤性低的Bcl2突变体与目的基因构建在能同时表达双基因的载体质粒上的应用。
3.根据权利要求2所述的应用,其特征在于,所述目的基因大于4.3kb。
4.根据权利要求2或3所述的应用,其特征在于,Bcl2突变体连接在内部核糖体进入位点IRES下游,把目的基因连接在IRES上游。
5.根据权利要求4所述的应用,其特征在于,大于4.3kb目的基因包括B区域删除的凝血因子VIII、全长凝血因子VIII。
6.一种核酸,其特征在于,所述核酸编码权利要求1所述的能促进大基因表达且致瘤性低的Bcl2突变体。
7.一种载体,其特征在于,所述载体包括权利要求6所述的核酸。
8.一种宿主细胞,其特征在于,所述宿主细胞用于表达权利要求1所述的能促进大基因表达且致瘤性低的Bcl2突变体、权利要求6所述的核酸或权利要求7所述的载体。
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